JP3298879B2

JP3298879B2 - 結合タンパク質の最適化

Info

Publication number: JP3298879B2
Application number: JP50374992A
Authority: JP
Inventors: ディー．ヒューズ，ウィリアム
Original assignee: イグジス，インコーポレイテッド
Priority date: 1990-12-20
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 2002-07-08
Anticipated expiration: 2017-07-08
Also published as: WO1992011272A1; NZ241119A; US5955358A; AU9166691A; IL100460A; TW366364B; DE69131017T2; EP0563296A4; EP0563296A1; IL100460A0; JPH06505866A; DE69131017D1; IE914504A1; ATE177782T1; CA2098824A1; EP0563296B1

Description

【発明の詳細な説明】技術背景本発明は、リガンド−タンパク質の結合相互作用一般
に関し、そしてさらに詳細には、抗原−抗体結合アフィ
ニティーの最適化方法に関する。

抗体は、脊椎動物免疫系により産生される、抗原に結
合する混合型（heteromeric）結合タンパク質である。
その分子は、２つのヘビーチェーンとジスルフィド結合
により接続された２つのライトチェーンとから構成され
る。抗体は、そのＹ字の両方の短いアームの末端に位置
する抗原結合部分を有するＹ字形構造を有する。抗原結
合部分に相当するヘビーチェーンおよびライトチェーン
ポリペプチド上のこの領域は、可変領域として知られて
いる。抗体の結合特異性は、抗原とヘビーチェーンおよ
びライトチェーンの可変領域の両方との相互作用が複合
したものである。この領域内の相違が、抗体間の結合特
異性の変化の主な原因である。

免疫系は、殆ど無限といって良い数の異なった抗体を
産生する能力を有する。この様に大きな多様性は主とし
て、各鎖の可変領域を形成する本体論的再結合、およ
び、ヘビーチェーンおよびライトチェーンの異なった対
形成を介して生じる。各鎖の可変領域の骨格構造内に、
非常に多様な超可変領域配列により特徴付けられるドメ
インが存在する。これらの超可変領域の配列は、天然の
タンパク質内の抗原結合ポケットを構成するので、抗体
の多様性の原因の主な部分である。これらの領域内のア
ミノ酸配列の相違が、異なる抗原−抗体結合相互作用の
形成をもたらす。従って超可変領域配列は、抗原の官能
基に相補性であり、これは、相補性決定部位（CDRs）と
して知られている。CDR配列の多様な組合わせの創造に
より天然の免疫系を模倣できるならば、実質的に任意の
所望の抗原に対して高いアフィニティーを有する抗体の
迅速な産生ができるので、非常に価値がある。このよう
な抗体は、種々の診断および治療目的に使用され得る。

最近まで、所望の分子に対する抗体の産生は、天然の
免疫応答の操作のみにより行われていた。この方法に
は、実験用動物の古典的な免疫技法およびモノクローナ
ル抗体の産生等が含まれる。モノクローナル抗体の産生
は、困難であり、かつ時間を要する。モノクローナル抗
体の産生には、一連の異なった技法が含まれ、動物細胞
中でのみ実施される。動物細胞は、比較的世代時間が長
く、そして培養物の生存を保証するために非常な注意が
要求される。

細菌中で広範な種類の多様な抗体分子を産生する方法
も、本明細書では参考文献として援用する、Huseら、Sc
ience 246:1275−1281（1989）に記載されている。この
方法では、ベクターとしてバクテリオファージλを使用
する。このλベクターは、長い直鎖状の二本鎖DNA分子
である。このベクターを用いた抗体産生には、DNA配列
のヘビーチェーンおよびライトチェーンの集合を異なっ
たベクターにクローニングすることが含まれる。次に、
ベクターをランダムに組み合わせ、ヘビーチェーンおよ
びライトチェーンを同時発現させ、抗体フラグメントの
形成を司る単一のベクターを形成する。この方法の欠点
は、抗体アフィニティーがインビボ由来のアフィニティ
ーに制限される点である。このアフィニティーの相違
は、体細胞変異として知られている特異的な免疫学的ア
フィニティーの成熟プロセスに起因する。組換えライブ
ラリー由来の抗体は、このプロセスの恩恵を受けない。
さらに抗体の配列は、ライブラリー内で不均一に発現さ
れ得る。この不均一は、クローニング方法自身に起因す
る。この方法自体の結果は、もし高いアフィニティーの
配列よりも中位のアフィニティーの抗体が主体の場合に
は、中位のアフィニティーの抗体のみの選択を引き起こ
す。

従って、天然の免疫学的プロセスを模倣し、インビボ
由来のものと異なるインビトロ由来の抗原結合アフィニ
ティーを提供する、抗原結合アフィニティーを最適化す
る方法に対する要求が存在する。本発明は、これらの要
求を満たし、そして関連する利点をも提供する。

発明の要旨本発明は、少なくとも１組のスプライシング部位を有
する結合タンパク質をコードする２つあるいはそれ以上
の核酸を提供する工程、ここで、スプライシング部位の
組が１つあるいはそれ以上のコードされた結合ドメイン
の両末端に隣接している；その核酸を混合し、結合タン
パク質をコードする混合核酸の親集合を製造する工程；
および、核酸の間にスプライシング部位の組を介して結
合ドメインをランダムに組み込み、結合タンパク質をコ
ードする核酸の別の集合を製造する工程、ここで、少な
くとも１つの結合タンパク質は、親集合の構成要素と実
質的に異なった結合特性により特徴付けられる；によ
り、コードされた結合タンパク質の結合特性を最適化す
るための核酸操作方法に関する。

図面の簡単な説明図１は、混合型（heteromeric）結合タンパク質由来
の結合ドメインの混合を示すダイアグラムである。上
部：混合型（heteromeric）結合タンパク質は、２つの
ポリペプチド（V_HおよびV_L）によりコードされる。各ポ
リペプチドの結合ポケットは、３つの異なる結合ドメイ
ン、H_CDR1からH_CDR3、およびL_CDR1からL_CDR3より構成さ
れる。（Ａ）は、異なるV_H CDR類と異なるV_L CDR類との
混合を示す。（Ｂ）は、両ポリペプチドのCDR 1とCDR 2
および３との混合を示す。（Ｃ）は、両ポリペプチドの
CDR 3とCDR 1および２との混合を示す。

発明の詳細な説明本発明は、複数の結合タンパク質の間に結合ドメイン
を混合するための、簡単で効率的な方法に関する。この
方法は、所望の結合タンパク質の結合特性を最適化する
ために使用し得、そしてこの方法は、関連する結合ドメ
インをランダムに相互交換することで、特定の抗原に結
合し得る可能性のあるタンパク質の数を増加させるとい
う利点がある。関連する機能を示すドメインの相互交換
は、実質的に異なる結合相互作用を与える結果的な相違
を、抗原の結合相互作用にもたらす可能性を増大させ
る。この結合タンパク質は、無数の診断および治療方法
に有用である。

１つの実施態様では、ヘビーチェーンおよびライトチ
ェーンの抗体フラグメントのクローニングされた集合
を、元のクローニングされた集合とは実質的に異なる結
合特性を有し、特定の抗原に対する結合タンパク質を生
じさせるために使用する。元のクローニングされた集合
内の抗体フラグメントは全て、所望の抗原に対して結合
特異性およびアフィニティーを示し、従って、機能的に
関連している。新規な抗体が、関連する抗体間のCDR配
列の異なる組み合わせをランダムに混合することにより
生成される。例えば、１本鎖核酸に特異的な変異誘発、
あるいは混合される所望の配列に隣接すした位置に、制
限酵素認識部位のような１組の開裂部位の導入の何れか
により、CDR配列は混合される。この組内の各開裂部位
は、混合される配列の両端に存在しなければならず、そ
して１つの部位の開裂後に生ずる末端は、他の部位に生
ずる末端とのライゲーションに非適合性でなければなら
ない。末端の非適合性は、引き続くライゲーションの際
に、混合された配列が適切な配向をすることを保証す
る。コードする核酸の場合は、制限酵素のような開裂試
験で開裂され、そして次に、再度ライゲーションされ、
抗体フラグメント骨格内にCDRのランダムな組み合わせ
を形成する。この様にして、各ヘビーチェーンあるいは
ライトチェーン内の個々のCDRsは混合され得る。あるい
は、ヘビーチェーンからのCDRの完全な組をライトチェ
ーンからの完全な組と混合し、元のクローニングされた
集合内の構成要素と実質的に異なった結合特性を、特定
の抗体に対して示す抗体を産生し得る。

本明細書の用語「結合タンパク質」とは、特定の分子
に対して結合活性を示すタンパク質を指す。この用語
は、結合機能が保持されている限り、ポリペプチドのフ
ラグメントをも含むことが理解される。このような結合
タンパク質は、単一の結合ドメインのタンパク質、およ
び複数の結合ドメインのタンパク質を含み得る。複数の
結合ドメインのタンパク質は、結合活性全体に協同して
寄与する、ポリペプチドの一次構造に沿った２つあるい
はそれ以上の、独立しそして不連続な領域を含むタンパ
ク質を含む。各々の結合活性は、３つの不連続な相補性
決定部位に由来するので、複数の結合ドメインのタンパ
ク質の特定の具体例は、抗体のヘビーチェーンおよびラ
イトチェーンを含む。結合タンパク質は、単一モノマー
種（monomeric）あるいは複合モノマー種（multimeri
c）であり得る。混合型（heteromeic）結合タンパク質
は、複合モノマー種（multimeric）結合タンパク質の１
つの例であり、特定のリガンドに対して協同して結合活
性を示す、少なくとも２つの異なったサブユニットから
構成される。混合型（heteromeric）結合タンパク質と
呼ぶ場合、この用語は、ポリペプチドの集合体（assemb
ly）および集合した複合体の結合機能が保持されている
限り、サブユニットのフラグメントを含むことが理解さ
れる。混合型（heteromeric）結合タンパク質は例え
ば、FabおよびＦ（ab'）_２部分、Ｔ細胞レセプター、イ
ンテグリン、ホルモンレセプター類および伝達物質レセ
プターのような、抗体およびそのフラグメントを含む。

本明細書の用語「結合ドメイン」は、そのアミノ酸配
列が、与えられたタンパク質の特定の領域を表し、そし
てそれ自身あるいは他のドメインとの組合わせで天然の
タンパク質の結合特性と類似した結合特性を示す、ポリ
ペプチドあるいはポリペプチドをコードする核酸を指
す。このドメインの境界は、結合活性が維持される限
り、重要ではない。結合ドメインの具体的な例は、ヘビ
ーチェーンあるいはライトチェーンの抗体配列の可変領
域内の、相補性決定部位を含む。

本明細書の用語「最適化」は、任意の定量的アッセイ
システムで判定した場合に、実質的に異なる結合特性を
有する関連した結合タンパク質を得るための、結合タン
パク質の結合特性の改変を指す。この用語は、アフィニ
ティー、結合活性（avidity）、あるいは特異性の増大
および減少の両方を含む。最適の結合特性は、結合タン
パク質の特定の適応に依存する。例えば、高アフィニテ
ィーの腫瘍抗原結合タンパク質のアフィニティーの減少
は、その結合タンパク質の腫瘍塊への透過を可能にする
最適な方法となり得る。逆に、最適結合特性を得るため
には、特定のリガンドに対して低い特異性を示す結合タ
ンパク質のアフィニティーを増大する必要がある。

本明細書の用語「スプライシング部位」は、第二の核
酸との結合に使用し得る、１つの核酸内の予め定められ
た領域を指す。以後「挿入的変異誘発」と呼ぶ１本鎖核
酸に特異的な変異誘発、および制限開裂／ライゲーショ
ンのような方法を、２つの核酸をそのスプライシング部
位での接続に使用し得る。相補鎖間のハイブリダイゼー
ションを行わせるため一般に、このスプライシング部位
は充分に相同とする。例えば、挿入的変異誘発、およ
び、１本鎖のオーバーハングができる酵素を用いた制限
開裂／ライゲーション法は、２つの相補鎖間のハイブリ
ダイゼーションが可能なスプライシング部位を用いる。
あるいは、２つの核酸内に含まれるスプライシング部位
は、相補鎖間の配列相同性がなくても接続し得る。この
ようなスプライシング部位の例は、平滑な二本鎖末端を
作る制限酵素部位である。

本明細書の用語「スプライシング部位の組」は、２つ
あるいはそれ以上のスプライシング部位を指す。最も単
純な形態では、この組は１対のスプライシング部位であ
る；しかし、組は、核酸セグメントを接続するために使
用される任意の奇数あるいは偶数のスプライシング部位
であり得る。３つのスプライシング部位は、組をつくる
奇数の部位の具体的な例である。この場合には、スプラ
イシング部位の１つは、他の２つの部位の各々と協同し
て、独立あるいは同時に、核酸の接続に使用され得る。
近隣したCDR領域の置換を、例えば、両方のCDR領域に隣
接した２つの構成要素、およびこの２つのCDR領域間の
第三の構成要素を有する１組のスプライシング部位を用
いて実施し得る。

本明細書の用語「開裂部位」は、ホスホジエステル骨
格が特異的に開裂され得る、核酸内の位置を指す。開裂
部位は、例えば、Bst XI、Fok IおよびBgl Iの様な制限
酵素認識部位であり得る。この定義内には、化学的開裂
部位も含まれる。

本明細書の用語「開裂試薬」は、それにより開裂部位
が開裂される手段を指す。例えば、開裂部位が制限酵素
認識部位の場合、開裂試薬は制限酵素である。本明細書
の用語「ライゲーションに非適合」な末端を作る開裂試
薬は、非相補性の１本鎖を含む末端、あるいは二本鎖核
酸の各末端から突き出た非相補性の１本鎖を含むように
改変され得る末端、を製造する試薬である。任意の非均
等分割（non−isoschizomeric）酵素対、および、核酸
内の同じ部位を認識するが、認識配列の外側のホスホジ
エステル結合を開裂、あるいは認識部位内の未確認の配
列を開裂する酵素が、使用され得る。このような酵素の
例には、Bst XI、Fok IおよびBgl Iが含まれる。

本発明は、結合タンパク質の最適化の方法を提供す
る。この方法は：（ａ）少なくとも１組のスプライシン
グ部位を有する結合タンパク質をコードする２つあるい
はそれ以上の核酸を提供する工程、ここで、該スプライ
シング部位の組が１つあるいはそれ以上のコードされた
結合ドメインの両端に隣接している；（ｂ）該２つある
いはそれ以上の核酸を混合し、結合タンパク質をコード
する混合核酸の親集合を製造する工程；および、（ｃ）
該２つあるいはそれ以上の核酸の間に、該スプラシング
部位の組を介して該結合ドメインをランダムに組込み、
結合タンパク質をコードする核酸の別の集合を製造する
工程、ここで、少なくとも１つの結合タンパク質は、該
親集合の構成要素と実質的に異なった結合特性により特
徴づけられる；を包含する。

本発明を、現時点で最も好ましい実施態様:Fabおよび
Fvのような、特定の抗原に対する抗体フラグメントの結
合アフィニティーの最適化に関して記載する。しかし、
原理はすべての結合タンパク質に関して同じであるの
で、本明細書に記載した方法は、本発明の範囲を逸脱す
ることなく、他の抗体以外の結合タンパク質の最適化の
ために使用し得る。抗体フラグメント以外の結合タンパ
ク質は、例えば、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホ
ルモンレセプターおよび伝達物質レセプター、ステロイ
ド様ホルモン、および、DNA結合タンパク質を含み得
る。

抗体分子内の抗原結合ドメインは、相補性決定部位
（CDRs）として知られており、そして、ヘビーチェーン
およびライトチェーンの両方のポリペプチドの可変領域
内に位置する。各可変領域内に３つのCDRsが存在する
（図１、上部）。これらのドメインは、天然の構造に適
切に折り畳まれると、抗原結合相互作用の大部分を構成
する。CDRは、典型的には約10から15アミノ酸残基の長
さであり、そしてポリペプチド骨格の一次構造に沿って
不連続に存在する。

CDRは、抗体と抗原との間の結合相互作用の大部分を
構成するので、これらの配列は、変異、あるいは他の異
なるCDRsと相互交換すると、親分子とは特定の抗原に対
する結合特性が実質的に異なる新しい抗体が生成する。
抗原結合タンパク質内で、異なるが関連するドメインの
相互交換による結合相互作用の最適化は、一連の機能的
に関連のある結合タンパク質が特定の抗原に対して得ら
れるので有利である。この様なドメインの異なる組み合
わせは、ランダムな配列の変化よりも、機能の如何なる
制限も無しに、結合特性に生産的な変化をもたらすよう
である。従って、同様の様式で同じ抗原を認識する結合
ドメイン、および異なる方法で同じ抗原を認識するドメ
インを、同系のドメインとランダムに混合し、実質的に
異なった結合特性をもたらす新しい組合わせを製造し得
る。混合は、共に混合することにより結合ドメインの順
序を変える行為である。

機能的に関連するタンパク質内の結合ドメインの混合
の例は、関連する抗体のヘビーチェーンあるいはライト
チェーンの内あるいはその内のCDRの全ての組合わせの
ランダムな製造である。この様なランダムな混合は、CD
Rの完全な組、CDRのサブセットあるいは個々のCDRsの何
れをその方法に使用するかに依存し、幾つかのレベルで
達成し得る。第一に、ヘビーチェーンあるいはライトチ
ェーン内のCDRsの完全な組（CDR 1から３）は、反対の
鎖のCDRsの完全な組とランダムに混合され得る。この混
合は効果として、異なるヘビーチェーンと異なるライト
チェーンとの対形成により新しい抗体フラグメントを製
造する。第二に、サブセット（例えば、２つのCDRs）あ
るいは個々のCDRは、ランダムに混合して複数結合ドメ
インタンパク質内の結合ドメインの分画の置換による、
異なる結合特性を有する類似の抗体が製造される。第三
に、CDR混合による異なった結合特性に関して選択され
た抗体は、選択的変異誘発によりさらに最適化され得
る。

CDRの混合は、種々の方法により達成し得る。例え
ば、挿入的変異誘発を、２つあるいはそれ以上の核酸の
親集合内で、結合ドメインをランダムに混合するために
使用し得る。その集合内の１つあるいはそれ以上の核酸
を、変異誘発のテンプレートとして使用し得る。テンプ
レートは、M13由来のベクターの様なベクターを使用し
て当業者により製造される１本鎖核酸であり得る。テン
プレート集合とランダムに混合されるドメインは、例え
ば、テンプレート核酸上の結合ドメイン（単数あるいは
複数）に隣接するスプライシング部位に相補的な各末端
のスプライシング部位によるポリメレースチェーンリア
クション（PCR）により、合成され得る。PCR用のテンプ
レート材料源は、例えば、mRNAあるいはcDNAsのクロー
ニングされた集合であり得る。隣接する配列に相補的な
スプライシング部位は、挿入される配列が適切な方向で
あることを保証する。あるいは、混合される結合ドメイ
ン、およびそれらの対応するスプライシング部位を生成
するために、化学合成法を使用し得る。

合成された結合ドメインは、もし二本鎖形態である場
合は、例えば、熱あるいはアルカリで変性され一本鎖を
生成し、テンプレートとアニールされる。相補的配列に
よるハイブリダイゼーションは、非常に特異的であるの
で、２つの核酸を予め決定された部位でともに接続する
のに有利である。スプライシング部位がどこに配置され
るかを決定する基準は、開裂部位であるスプライシング
部位に関連して、以下に記載されている、アニールされ
たスプライシング部位は、二本鎖核酸を生成するための
プライマー伸長用の基質として使用され得る。アニール
されたスプライシング部位が比較的大きくて、安定な二
本鎖を維持し得るならば、核酸のアニールされた集合
は、宿主微生物に直接導入され得る。微生物内の生合成
機構は、二本鎖核酸を生産し得る。このような方法で生
産された、結合タンパク質をコードする核酸集合は、結
合タンパク質のペアレント集合内にランダムに組み込ま
れた結合ドメインを有し、少なくとも１つのコードされ
た結合タンパク質がペアレント集合のメンバーとは本質
的に異なる結合特性により特徴づけられる核酸の異なる
集合を生産する。

CDRの混合はまた、開裂部位のようなスプライシング
部位のセットを、結合タンパク質をコードする核酸内の
予め決定された位置に導入することにより完成され得
る。このことは、図１に図解により示す。図中、開裂部
位のセットは、ＡおよびA'、ＢおよびB'、あるいはＣお
よびC'で示した。開裂部位は、例えば、制限酵素認識配
列であり得る。このような認識配列は、当該分野に公知
の方法により核酸に導入され得る。本明細書に参考文献
として援用する、Kunkleら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,82:488−492（1985）に記載されている部位特異変異
誘発は、その１つの方法である。開裂部位は、開裂後に
２つの端につくられる末端が次の連結に適していないよ
うに選択されるべきである。非適合末端は、そのフラグ
メントがともにCDR配列の混合後に適当な配置になるよ
うにする。例えば、ヘビーチェーン（V_H）およびライト
チェーン（V_L）フラグメント（図１、上部）をコードす
るベクターが、開裂試薬Ａで開裂されるときには、生産
される末端は、ＡおよびA'である。Ａ末端は、A'末端で
はなく他のＡ末端に適合する。次の連結では、Ａのみが
他のＡと接続され、同様にA'は他のA'に接続されて、V_H
およびV_Lフラグメントのもとの配置が再構築される。開
裂部位の組はまた、予め選択された位置に唯一認められ
るように選択されるべきである。ベクター内あるいは結
合タンパク質のコーディング領域内の他の位置にコード
される余分な開裂部位もまた、混合の間に開裂される。
これらの望ましくない余分の部位での開裂は、本質的に
は混合工程の間に除去される余分なフラグメントを生じ
る。

制限酵素認識開裂部位から選択されたスプライシング
部位および相補的な相同性を有する配列は、結合親和性
の最適化のための使用に有利であるが、しかし、別の部
位もまた使用され得る。例えば、予め決定された位置で
特異的に開裂する、当該分野に公知の化学的開裂法が、
使用され得る。しかし、制限酵素認識部位は、十分に特
定されており、それらの開裂試薬である制限酵素は、安
価で商業的に入手可能である。特異的な配列を認識する
が認識配列以外の核酸を開裂するか、あるいは認識部位
内の判明していない配列で開裂する数種の制限酵素が存
在する。このメカニズムは、同じ酵素が２つの異なった
開裂部位で異なる末端を生産し得るという更なる利点を
提供する。例えば、Fok Iは、配列5'−GGATG−3'を認識
するが、二本鎖DNAのホスホジエステル骨格を上および
下側の鎖について、各々９、および下流側の13塩基に開
裂する。従って、末端の開裂部位の配列は、連結の適合
性を決定するが不変認識配列ではない。

結合タンパク質をコードする核酸に導入された開裂部
位は、混合されるべき結合ドメインの反対側の末端に隣
接するように配置されるべきである。この部位はまた、
結合タンパク質、発現配列あるいはベクター配列のいず
れかの機能に必要とされない位置に配置されるべきであ
る。開裂部位が、必要不可欠なコーディング領域内に配
列されるときには、その部位は、アミノ酸残基の保存さ
れるべき置換のみがなされるように選択されなければな
らない。相補的相同配列を用いるスプライシング部位
は、その配列がハイブリダイズできるようにするため
に、集合の全ての構成要素に十分に相同であるように選
択されるべきである。V_H CDRの全組のV_L CORとの混合で
は、開裂部位は、各鎖に対して３つすべてのCDRの外側
に位置するべきである。図１の上部に、開裂部位Ａおよ
びA'の対が、V_HおよびV_L配列の近傍に位置する配置を示
す。Ａ開裂部位は、V_H CDR 3（H_CDR3）とV_L COR 1（L
_CDR1）との間に位置する。A'開裂部位は、H_CDR1とL_LDR3
との間でベクターのもう一方の部位に位置する。開裂部
位の組の厳密な配置は、混合されるべきドメインの構成
に依って変化し得る。開裂部位の組をどこに導入する
か、あるいは結合ドメインに隣接させ、混合し得るため
に適切な相補配列を決定することは当業者は知り得る。

V_HおよびV_L抗体鎖をコードする２つ以上の核酸は、混
合され、混合されるべき全ドメインをコードするランダ
ム集合を生産し得る。スプライシング部位として開裂部
位を用いるV_H CDRのV_L CDRとの混合は、開裂試薬Ａ（図
1A）による核酸の混合集合の開裂、次いでV_H CDRとV_L C
DRとのランダム組み合わせを再形成するように混合物を
連結して実施する。親分子と比較して異なる結合親和性
を示す抗体は、当該分野に公知の方法により、原核発現
系あるいは真核発現系で、コードする核酸の新しい集合
を発現することにより選択され得る。

結合タンパク質をコードする核酸は、当該分野に公知
の種々の任意のベクター中にクローニングされ得る。あ
るいは、その核酸は、最初に、本明細書に記載の最適化
法、および結合タンパク質を構成するポリペプチドの発
現の両方を可能にするベクター中にクローニングされ得
る（図１、上部）。複数の結合タンパク質のために、２
つ以上の核酸配列の同時発現が、一般的に起こり、個別
のポリペプチドを生成する。個別のポリペプチドは、翻
訳後あるいは翻訳と同時に自己会合（selfassemble）し
て機能性分子を形成する。同時発現はまた、例えば共に
結合し、依然複数の結合タンパク質に会合する可能性の
ある１本鎖としてのサブユニットポリペプチドを発現す
ることにより完成され得る。結合したポリペプチドの同
時発現の具体的な例は、ヘビーおよびライトチェーン抗
体フラグメントポリペプチドの、フレキシブルなポリペ
プチドあるいは２つのサブユニットを接続して１本鎖に
するポリペプチドリンカーとの発現である。このリンカ
ーは、ヘビーおよびライトチェーン部分を結合させて機
能性Fabフラグメントにするのに十分フレキシブルであ
る。このことは本明細書に参考文献として援用する米国
特許第4,946,778号に開示されている。

同時発現に使用され得るベクターは公知であるか、ま
たは当業者により構築され得る。同様に、モノマー結合
タンパク質の発現に使用され得るベクターも公知である
か、あるいは当業者により構築され得る。このようなベ
クターは、転写、翻訳、調節およびポリペプチドの選別
に必要な全発現要素を含むべきである。このポリペプチ
ドはタンパク質を作る。このようなベクターはまた、異
なる形態での回収のためのメカニズムを含み得る。ファ
ージミド（Phagemids）は、この特別な例である。なぜ
ならそれらはプラスミドあるいはファージベクターのい
ずれかとして使用され得るからである。ベクターは、原
核あるいは真核宿主系のいずれにおいても、発現要素が
複数起点に適切であるかぎり、使用され得る。どの宿主
系が特定のベクターに適しているかは、当業者は知り得
る。従って、本発明は、ベクター、ベクターにより形質
転換された宿主細胞、および宿主細胞から産生された結
合タンパク質を提供する。これらの宿主細胞は上記の最
適化の方法により生成された結合タンパク質をコードす
る核酸を含む。

個別のCDRあるいはCDRのサブセットの混合のために、
CDRの全組の混合のための上記方法と同じ方法が使用さ
れ得る。例えば、CDR 1は、V_HおよびV_Lの両方のCDR1と
２との間のスプライシング部位を使用して、V_HおよびV_L
の両方のCDR 2および３とランダムに混合され得る。導
入された２つのスプライシング部位は、混合過程に使用
され得る部位の組を構成する。その部位の組は、図1Bに
部位ＢおよびB'として示す。従って、H_CDR1とL_CDRLとの
間にある結合ドメインは混合されるべきドメインである
ので、スプライシング部位の組は、H_CDR1とL_CDR2とに隣
接する。CDR 1とCDR 2との間にスプライシング部位を有
する核酸は、例えば、混合されてランダム集合を生成し
得る。スプライシング部位間の配列は、例えば、挿入変
異誘発あるいは制限開裂／連結により、ランダムに集合
中に組み込まれる。挿入変異誘発には、核酸の集合は、
最初に、選択されたテンプレート分子とアニールされる
べきである。制限開裂／連結には、位置ＢおよびB'での
核酸の最初の開裂で、混合されるべき結合ドメイン（H
_CDR1、H_CDR2、L_CDR1;図1B）が放出される。混合され開
裂された集合の、続く連結は、V_H鎖およびV_L鎖の両方に
対する、CDR₁とCDR 2あるいは３とのランダム組み合わ
せを共にもたらす。結合ドメインの新規組み合わせは、
上記の結合親和性の生産的変化について、発現によりス
クリーニングされ得る。このようなスクリーニングの方
法には、例えば、ELISA、イムノブロット、パニング（p
anning）、プラークリフト（plaquelift）、平衡透析、
および競合アッセイが含まれる。これらの方法は、当業
者には公知であり、例えば、Harlowら、Antibodies:A L
aboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Col
d Spring Harbor（1988）に記載されている。これは、
本明細書に参考文献として援用する。

CDR 1以外の結合ドメインもまた混合され得る。例え
ば、CDR 3は、本明細書に記載の方法によりCDR 1および
２と混合され得る。V_HおよびV_L両配列中のCDR 2と３と
の間のスプライシング部位を使用して、これらの部位の
間の結合ドメインは、混合され得る（図1C）。関連機能
を有する結合タンパク質をコードする核酸の集合は、混
合され、開裂試薬Ｃで処理され、そして次に再連結され
て結合ドメインのランダム組み合わせを生産する。ある
いは、テンプレートおよびＣに位置するスプライシング
部位を有する合成結合ドメインは、挿入変異誘発による
結合ドメインのランダム組み込みで混合され得る。同様
に、CDR 2は、CDR 1および３とランダムに混合され得
る。例えば、３つのメンバーを有するスプライシング部
位の組が使用され得、これは、挿入変異誘発により有効
に行われる。２つのスプライシング部位は、ヘビーおよ
びライトチェーン両配列上のCDR 2の範囲外に位置し得
る。第三のスプライシング部位は、CDR間、例えば、H
_CDR3とL_CDR1との範囲の配列内に位置し得る。同様に、
近隣のDCRは、外部に位置するスプライシング部位、お
よびそれらの間に位置する共通の部位を有することによ
り混合され得る。スプライシング部位を有する核酸の、
上記の構成体とのアニーリングは、例えば、集合内のH
_CDR2およびL_CDR2のランダム組み込みをもたらす。さら
に、DNAの複製前にDNAの修復機能の発生を実証するDH10
B（Life Technologies,Bethesda,MD）のようないくつか
の細菌株が存在する。これらの菌株では、合成核酸およ
びテンプレート核酸に対応する配列がほぼ等しい頻度で
得られる。従って、多くの異なるテンプレートが多くの
異なる合成核酸とともに使用され、互いに独立した、す
べての可能な順列を得る。

混合されていない親分子に比較して最適化された結合
特性を示す選択された結合タンパク質は、選択変異誘発
によりさらに最適化され得る。関連結合ドメインの混合
後に得られた組み合わせは、異なる抗原結合特性による
有益な特性を有する結合タンパク質を提供し得るが、選
択されたそれらの分子は、最適な抗原結合性に要求され
る最善の配列を必ずしもコードし得ない。選択された配
列は、開始親分子から得られ得る、単なる最適配列であ
る。ランダムアミノ酸変化を組み込む選択変異誘発、あ
るいは既知配列に基づくアミノ酸変化の所望の偏向は、
より有益な結合特性を与える生産的変化をさらに提供し
得る。

変異誘発は、当該分野では標準的な方法により実施さ
れ得る。その方法ではコードする核酸内の予め決定され
た位置で特異的な変化を組み込むために設計されたオリ
ゴヌクレオチドを使用する。あるいは、変異誘発に使用
されたオリゴヌクレオチドは、種々のアミノ酸コドンを
生産する方法により合成され得るが、予め決定された配
列に偏向する。そしてこの予め決定された配列は、最適
化された結合タンパク質内の結合ドメインの１つか、あ
るいはすべてでる。相当な数のアミノ酸コドンの位置が
特異的配列であるべきときには、この合成方法は、変異
体オリゴヌクレオチドを作成するための使用に有利であ
る。この方法は、米国特許出願番号第07/573,648号に詳
細に開示されていて、これは本明細書に参考文献として
援用する。簡単には、この方法は、２つの反応カラムを
用いたオリゴヌクレオチド合成を伴う。第一のカラムで
は、特異的コドンのヌクレオチド配列は、連続的に合成
される。第二のカラムでは、縮重コドンが、コドンの第
一および第二のモノマーの位置で、４種のすべてのヌク
レオチドの混合物をカップリングすることにより合成さ
れる。コドンは、第三モノマーの位置で、グアニンとチ
ミン、あるいはシトシンとアデニンのヌクレオチドのい
ずれかの混合物をカップリングすることにより完成され
る。２つのカラムの反応生成物の混合により、予め決定
された配列と、所望の位置でのランダム配列との両方を
含むオリゴヌクレオチドの集合が得られる。合成は、予
め決定された付加される配列をカップリングするため
に、この混合物を使用して進行されるか、あるいは、付
加されるランダム配列の合成のために２つのカラムにさ
らに分けることにより進行され得る。このような変異体
オリゴヌクレオチドの使用により、変化は結合ドメイン
中でなされ得て、得られた結合タンパク質を、上記のよ
うに、標準的な組換え表現法を使用して、最適化された
結合特性のために選択し得る。

以下の実施例は、例を示すことを意図し、本発明を限
定することは意図していない。

実施例Ｉ抗原結合最適化のためのCDRの系統的な混合この実施例は、V_HおよびV_L CDRの継続的な混合操作に
よるFab結合親和性の最適化、および前の操作で得られ
たFabフラグメントによりヒトβ−エンドルフィンに対
して高親和性を示す分子の選択を示す。

CDR混合用の制限部位の組み込み組換え細胞表面発現ライブラリーから選択され、ヒト
β−エンドルフィンペプチドに対して親和性を有するFa
bフラグメントを、最適化のプロトコル用に使用した。
米国特許出願番号第07/590,219号に詳細に記載されてお
り、本明細書に参考文献として援用するこの系では、ヘ
ビーおよびライトチェーン配列を、Lacプロモーター／
オペレーターの転写制御のもとに、ジシストロン性（di
cistronic）オペロン由来のフィラメント状のバクテリ
オファージM13の表面上で同時発現する。その他に述べ
られていなければ、ファージ培養、ベクター単離、DNA
制限開裂、連結および形質転換などのような決まった操
作のために行われたすべての組換え法は、当業者には公
知の標準的な方法であった。このような方法は、SanBro
okら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold S
pring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,1989、
およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Bi
ology,John Wiley and Sons,New York,1989に認められ
る。この両方は、本明細書に参考文献として援用する。

CDRの混合のために使用される制限部位を得るため
に、図１に図示した制限パターンを与えるのに必要なと
ころで、変異誘発を行った。「Ａ」および「A'」制限部
位は、Bst XIに対応し、「Ｂ」および「B'」は、Dra II
Iに対応し、そして「Ｃ」および「C'」は、Fok Iに対応
する。図１中のＡ、A'およびB'に対応する３つの部位の
みが、変異誘発による組み込みに必要であった。なぜな
ら、残りの部位は、天然に、ほとんどのヘビーおよびラ
イトチェーン配列中に認められるからである。しかし、
Dra IIIおよびFok I部位は、変異体オリゴヌクレオチド
5'−CGATGGCCCTCTACGAGAACCATC−3'および5'−ATAATATC
CCAACCTAATTTAC−3'を用いて、ベクターから除去した。
変異誘発を、本明細書に参考文献として援用するKunkel
ら、Meth.Enzymol.154:367−382（1987）の方法で実施
する。試薬、細菌株およびプロトコルを、Bio Rad Muta
genesis Kit（Bio Rad,Richmond,CA）から得、変異誘発
を製造業者の推奨通りに実施する。簡単には、CJ236の
一夜培養物（1ml）を、50ulのSOB−CAPに接種し、OD₆₀₀
＝0.3まで増殖する。変異誘発されるべきテンプレート
を含むファージを、1:100に希釈し、10μｌを培養物に
加えた。インキュベーションを37℃でさらに４時間続け
る。培養物を、４℃で12,000rpmで15分間、２回遠心分
離する。上清を新しいチューブに移す。RNase Aを加え
て（10mg/mlの15μｌ）、次に3.5M NH₄OAc中の20％PEG
8000を7.5ml加える。懸濁液を氷中で30分間インキュベ
ートし、上記のように１回遠心分離する。ペレットを20
0μｌの高塩緩衝液（300mM NaCl、10mMトリス、pH 8.
0、1mM EDTA）中に再懸濁し、XL1−Blue^TM（Stratagen
e,La Jolla,CA）およびCJ236の両方で濾過する。CJ236
ファージのストックを、等容量のフェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（1:1:1/48）で抽出し、そ
の後dH₂Oにより逆抽出する。これらのラウシル含有核酸
をエタノールで沈澱させ、洗浄し、20μｌのdH₂Oに再懸
濁させ、そして定量する。ウラシル含有テンプレート
（233μｇ）を、20ng（１μｌ中）のリン酸化された変
異体オリゴヌクレオチド、および１μｌの10 Xアニーリ
ング緩衝液（200mMトリス、pH 7.4、20mM MgCl₂、500mM
NaCl）と混合して最終容量を10μｌにし、70℃に加熱
し、徐々に室温に冷却する。反応物を氷中に置き、１μ
ｌの10 X合成緩衝液（4mM 各dNTP、7.5mM ATP、175mM
トリス、pH 7.4、37.5mM MgCl₂、215mM DTT）、１μｌ
のT4 DNAリガーゼ（３−５ユニット）、および１μｌの
T4 Dnaポリメラーゼ加える。反応物を５分間、氷中でイ
ンキュベートし、その後、37℃で90分間インキュベート
する。反応を、90μｌの停止乾燥液（10mMトリス、pH
8.0、10mM EDTA）を加えて停止し、XL1−Blue^TM細胞中
に形質転換する。

変異体オリゴヌクレオチド配列を表Ｉに示す。ここ
で、下線をつけた部分は組み込まれた制限酵素部位を示
す。このオリゴヌクレオチドは、V_h、V_lあるいはベクタ
ー配列の非コーディング鎖に対応する。すべての変異
を、制限酵素消化および配列分析により確認する。配列
決定は、Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463
−5467（1977）の方法により、Sequenase^Rバージョン2.
0のDNAシークエンシングキットを製造業者の推奨通りに
使用して実施する。

CDR混合による結合親和性の最適化 Fab結合親和性を最適化するために、CDR混合の３回連
続操作を行う。混合操作のどの回も結合の数を拡張し、
それは新規に生成した抗体を異なるCDRのそれら自身お
よび初期の選択されたFabフラグメントのセットと組み
合わせて用いることにより試験され得る。

最初の結合のセット、ヘビーチェーンCDR類を、ヒト
β−エンドルフィンに対する抗原結合親和性を示す抗体
が異なるライトチェーンCDR類と混合した。この混合に
より、異なるヘビーチェーン抗体結合配列を異なる相補
的ライトチェーン抗原結合配列を用いて有効に試験す
る。

CDR類のヘビーおよびライトチェーンを混合するため
に、上記の抗体配列をコードする変異ベクターをBst XI
で消化した。それぞれのベクターの等量を結合して、最
終的に５から10μｇの間の総DNAを産生する。消化の完
了をアガノース（aganose）ゲル電気泳動により確認し
た。等量のフェノール／クロロホルムで１回、クロロホ
ルムで１回抽出し、次にエタノールで沈澱することによ
り反応を停止する。ペレットを70％エタノールで洗浄
し、減圧乾燥して8.5μｌの蒸留水または脱イオン水（d
H₂O）に再懸濁する。１μｌの10×リガーゼ乾燥液（50m
Mトリス−HCl、pH7.8、10mM MgCl₂、20mM DTT、1mM AT
P、50μg/ml BSA）を加え、次に、0.5μｌのT4 DNAリガ
ーゼ（2 U/μl;Bethesda Research Laboratories,Gaith
ersburg,MD）を加える。適合する宿主株中にエレクトロ
ポレーションする前に、連結物を16℃で一夜または室温
で２時間インキュベートする。

本明細書で参考文献として援用する、Smithら、Focus
12:38−40（1990）に記載されたようにして、E.coli M
K30−３をエレクトロポレーションする。MK30−３の新
鮮なコロニーをマグネシウムを含まない5mlのSOB（20g
のバクト−トリプトン、5gのバクト−イーストエクスト
ラクト、0.584gのNaCl、0.186gのKClをdH₂Oで1,000mlに
する）内に接種して細胞を調製し、37℃で一夜厳しく曝
気して増殖させる。マグネシウムを含まないSOB（500m
l）に、一夜培養物を1:1000の比率で接種し、37℃で激
しく曝気してOD₅₅₀が0.8になるまで（約２から３時間）
増殖させる。GS3ローター（Sorvall,Newtown,CT）内で
４℃で10分間、5,000rpm（2,600×ｇ）で遠心分離して
細胞を回収し、500mlの氷冷10％（体積比）滅菌グリセ
ロール中に再懸濁し、再び同じ方法で遠心分離および再
懸濁する。３回目の遠心分離の後、細胞を10％滅菌グリ
セロール中に再懸濁して最終容量を約2mlとして、懸濁
液のOD₅₅₀が200から300になるようにする。普通、上清
を流し出した後、容器に残った10％グリセロールに再懸
濁する。細胞はマイクロセントリフュージ管に40μｌず
つのアリコートとしてドライアイス−エタノール浴を用
いて凍結し−70℃で凍結保存する。

使用前に凍結細胞を氷上で徐々に解凍し、細胞懸濁液
40μｌにつき約10pgから500ngのベクターと混合してエ
レクトロポレーションする。１つの40μｌアリコートを
0.1cmのエレクトロポレーションチャンバー（Bio−Rad,
Richmond,CA）に入れ、パルス長（τ）^-4msを与える4k
Ωの並列抵抗25μＦ、1.88KVを用いて０℃で１回パルス
をかける。パルスをかけた細胞の10μｌオリコートを12
−×75−mmの培養管に入れて、1mlのSOC（98ml SOBに1m
lの2M MgCl₂および1mlの2Mグルコースを加える）で希釈
し、選択培地中の培養に先立ち37℃で１時間、培養液を
振盪する。簡単には、上記1mlのライブラリー培養液を2
XYT培地（16gトリプトン、10gイーストエクストラク
ト、5g NaCl）中で50倍希釈し、37℃で５−８時間培養
して増殖する。細菌は10,000×ｇで遠心分離することに
よりペレット化する。ファージを含む上清を滅菌管に移
し、４℃で保存する。

表面の膜上に新しく生成されたFabフラグメントを発
現する精製ファージを、XL1 Blue^TM細胞（Stratagene,L
a Jolla,CA）の50mlの液体培養液から調製する。その細
胞は４℃で保存したファージストックを10m.o.i.で感染
させたものである。培養液を2mMのIPTGで誘導する。上
清を２回遠心分離して透明にし、1/7.5容量のPEG溶液
（25％ PEG−8000,2.5M NaCl）を加えてファージを沈澱
させ、次に４℃で一夜インキュベートする。沈澱物を1
0,000×ｇで90分間遠心分離することにより回収する。
ファージペレットを0.01Mトリス−HCl、pH 7.6、1.0mM
EDTAおよび0.1％サルコシルからなる25mlの溶液に再懸
濁し、次に室温で30分間ゆるやかに振盪する。溶液を0.
5M NaClに調整し、最終的には５％ポリエチレングリコ
ール濃度になるようにする。４℃で２時間放置後、ファ
ージを含む沈澱物を15,000×ｇで１時間遠心分離するこ
とにより回収する。沈澱物を10mlのNET緩衝液（0.1M Na
Cl、1.0mM EDTA、および0.01M トリス−HCl、pH 7.6）
中に再懸濁し、よく混合して、そしてファージは170,00
0×ｇで３時間遠心分離することにより再びペレット化
する。ファージペレットを2mlのNET緩衝液に一夜再懸濁
し、110,000×ｇで18時間の塩化セシウム遠心分離（10m
lの緩衝液中に3.86gの塩化セシウム）にかける。ファー
ジのバンドを集め、NET緩衝液で７倍に希釈し、再び17
0,000×ｇで３時間遠心分離し、再懸濁し、0.1mMのアジ
化ナトリウム含有の0.3mlのNET緩衝液中で４℃で保存す
る。

結合親和性は、表面発現ファージをヒトβ−エンドル
フィンで被覆したプレート上にパニングすることにより
評価する。β−エンドルフィンをストレプトアジピン被
覆プレートに結合し、次にビオチン化し、そしてウラシ
ル存在下でRZ1032のようなSup E ung^-dut^-株中で増殖し
たファージを吸収する。このように増殖したファージ
は、阻害後に残存するファージはすべて通常の増殖条件
では生存せず、従ってパニングを妨害しないことを保証
する。その代わりに、標識した抗原を用いる標準逆免疫
スクリーニング法もまた、用い得る。ビオチン化試験を
ジメチルホルムアミドに、1mlの溶媒に対して固体のNHS
−SS−ビオチン（スルホスクシンイミジル２−（ビオチ
ンアミド）エチル−1,3'−ジチオプロピオネート;Pierc
e,Rockford, IL）が2.4mgの割合で溶解し、そして製造
者が指示する通りに使用する。小規模の半応を、溶解し
た試薬１μｌを滅菌した重炭酸塩緩衝液（0.1M NaHCO₃,
pH 8.6）で1mg/mlに希釈したβ−エンドルフィンの43μ
ｌと混合して行う。25℃で２時間放置後、残ったピオチ
ン化試薬を500μｌの1Mエタノールアミン（HClでpH 9に
調整）とさらに２時間反応させる。試料全体を1mg/mlの
BSAを含む1mlのTBSで希釈し、Centricon 30ウルトラ−
フィルター（Amicon）で約50μｌまで濃縮し、同じフィ
ルターを、2mlのTBSで３回および0.02％ NaN₃および７
×20¹²のUV−不活化阻害ファージ（以下を参照）を含む
1mlのTBSで１回洗浄し、最終的な濃縮液（60−80μｌ）
を４℃で保存する。NHS−SS−ビチオン試薬でビチオン
化したβ−エンドルフィンはジスルフィド含有チェーン
を介してビオチンと結合している。

パニングは、ポリスチレンペトリプレート（60×15m
m）に、0.1M NaHCO₃ pH 8.6−0.02％ NaN₃に1mg/mlのス
トレプトアビジン（BRL）を含む溶液1mlを入れ、コール
ドルーム内の小さな気密プラスチック箱中で一夜インキ
ュベートして行う。次の日ストレプトアビジンを除去
し、少なくとも10mlの阻害液（29mg/mlのBSA;3μg/mlの
ストレプトアビジン;0.1M NaHCO₃ pH8.6−0.02％ Na
N₃）に置き換え、そして室温で少なくとも１時間インキ
ュベートする。阻害液を除去し、0.5％ツイーン20を含
むトリス緩衝液添無合整理食塩水（TBS−0.5％ツイーン
20）でプレートをすばやく３回洗浄する。

β−エンドルフィンに結合し、抗体フラグ面取を発現
するファージを、ライブラリーの50μｌ量と反応した阻
害されたビオチン化β−エンドルフィン（2.7μg β−
エンドルフィン）の５μｌを用いて選択する。各混合液
を４℃で一夜インキュベートし、1mlのTBS−0.5％ツイ
ーン20で希釈し、上記のように調製したストレプトアビ
ジン被覆ペトリプレートに移す。室温で10分間振盪した
後、未結合ファージを除去し、プレートをTBS−0.5％ツ
イーン20で30−90分かけて10回洗浄する。結合したファ
ージを、800μｌの滅菌した溶出緩衝液（1mg/ml BSA、
0.1M HCl、グリセロールでpH 2.2に調整）を用いてプレ
ートから15分間溶出させ、溶出液は48μｌの2Mトリス
（pH未調整）で中和する。各溶出液の20μｌ量を、投入
するファージの希釈液により、MK30−３濃縮細胞で力価
を測定する。

２回目のパニングは、ライブラリーからの最初の溶出
液750μｌを5mMのDTTで10分間処理して、残ったピオチ
ン化結合タンパクをビオチン基に結合させているジスル
フィド結合を切断することにより行われる。処理した溶
出液はCentricon 30ウルトラフィルター（Amicon）で濃
縮し、TBS−0.5％ツイーン20で３回洗浄し、濃縮して最
終容量を約50μｌにする。最終的な濃縮液を5.0μｌ
（2.7μg β−エンドルフィン）の阻害されたビオチン
化β−エンドルフィンを含むチューブに移し、一夜イン
キュベートする。溶液を1mlのTBS−0.5％ツイーン20で
希釈し、パンし、新たに調製したストレプトアビジン被
覆ペトリプレートで上記のように溶出する。２回目の溶
出液全体（800μｌ）を48μｌの2Mトリスで中和し、そ
の20μｌを１回目の溶出液および投入ファージの希釈液
で、同時に力価を測定する。必要ならば、均質のファー
ジ集合が得られるまで更にパニングを行い得る。さら
に、検出用の試薬類が入手可能であればファージをプラ
ーク精製し得る。

パニングによって選択されたファージは、配列をコー
ドしたFabのDNA配列決定によって特徴づけられる。配列
決定に用いるテンプレートは、精製した集合から得られ
た個々のプラークを有するXL1の一夜培養物の1:100希釈
液を含む1mlの2XYTの培養液を接触して調製する。プラ
ークは、滅菌したつまようじで採取する。37℃で５−６
時間振盪してインキュベートした後、1.5mlのマイクロ
フュージチューブに移す。200μｌのPEG溶液を加え、次
にボルテックス攪拌し、氷上に10分間静置する。マイク
ロフュージで12,000×ｇで５分間遠心分離してファージ
沈澱物を回収する。上清を捨て、ペレットを230μｌのT
E（10mMトリス−HCl、pH 7.5、1mM EDTA）中に黄色ピペ
ットチップで静かにピペッティングして再懸濁する。フ
ェノール（200μｌ）を加え、次に短かくボルテックス
攪拌し、マイクロフュージで相分離する。水相を別のチ
ューブに移して、上記のフェノール抽出のように、200
μｌのフェノール／クロロホルム（1:1）で、抽出す
る。3M NaOAcの0.1容量を加え、次に2.5容量のエタノー
ルを加えて−20℃で20分間沈澱させる。沈澱したテンプ
レートは、マイクロフュージで12,000×ｇで８分間遠心
分離して回収する。ペレットは70％エタノールで洗浄
し、乾燥後25μｌのTEに再懸濁する。配列決定は、Sequ
enase^TM配列結合キットを製造者（U.S.Biochemical,Cle
veland,OH）が提供するプロトコールに従って行う。

２回目のCDR混合は、選択された抗原結合フラグメン
トのヘビーおよびライトチェーン集合の中でランダムに
結合した異なるCDRの組合せを必要とする。CDR 2および
３配列を異なるCDR 1配列を有するヘビーおよびライト
チェーン集合の中で混合した。ヘビーおよびライトチェ
ーン双方の組合せから、および１回目に選択された抗体
から得られた抗体を、これらの最適化操作に用いた。

最適化の第１回目の操作がすでに行われたが、選択さ
れたFab配列を含むベクターはまだ変異誘発によって組
み込まれた制限酵素部位をコードする。従って、それぞ
れのベクターの等量を組み合わせて（全量５−10μ
ｇ）、Fok Iを用いて完全に消化させる。連結反応の次
の段階、エレクトロポレーションおよびスクリーニング
を上記のように行う。

３回目のCDR混合は、異なるCDR 3配列を有するヘビー
およびライトチェーン集合の中でランダムに結合したCD
R 1および２を必要とする。これ以前に得られたヒトβ
−エンドルフィンに対する結合親和性について選択され
た抗体のすべてを等量ずつ混合し、前記のようにBgl I
により消化した。同様に、連結反応およびスクリーニン
グも、上記のように行った。結合親和性の定量は、標識
したβ−エンドルフィンに対する平衡透析およびSchata
ndプロット分析によって行う。

本発明は現時点で好ましい実施態様を参考として記載
したが、当業者によって種々の修正が本発明から外れる
ことなく行われ得ることが理解されるべきである。従っ
て、本発明は以下のクレームによってのみ限定される。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 - 15/90 C07K 16/00 - 16/46 C07K 19/00 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）少なくとも１組のスプライシング部
位を有する結合タンパク質をコードする２つまたはそれ
以上の核酸を提供する工程、ここで、該スプライシング部位の組が、１つまたはそれ
以上のコードされた結合ドメインの両端に隣接してい
る；（ｂ）該２つまたはそれ以上の核酸を混合し、結合タン
パク質をコードする混合核酸の親集合を製造する工程；
および（ｃ）該２つまたはそれ以上の核酸の間に、該スプライ
シング部位の組を介して該結合ドメインをランダムに組
込み、結合タンパク質をコードする核酸の別の集合を製
造する工程、ここで、少なくとも１つの結合タンパク質は、該親集合
の構成要素と実質的に異なった結合特性によって特徴付
けられる；を包含する、コードされた結合タンパク質の結合特性を
最適化するための、核酸操作方法。
【請求項２】前記工程（ａ）がさらに、結合タンパク質
をコードする少なくとも１つの核酸を、酵素的重合によ
り合成することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記酵素的重合が、ポリメラーゼチェーン
リアクションである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記工程（ａ）がさらに、結合タンパク質
をコードする少なくとも１つの核酸の化学合成を包含す
る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記工程（ｃ）がさらに、（c1）前記混合核酸の親集合の前記スプライシング部位
に、少なくとも１組の開裂部位を導入する工程；（c2）該開裂部位を、開裂試験で切断し、ライゲーショ
ンに適合しない末端を各スプライシング部位に製造し、
そして、結合タンパク質をコードする前記核酸から前記
１つまたはそれ以上のコードされた結合ドメインを切り
出す工程；および（c3）該切り放された結合ドメインを、結合タンパク質
をコードする該核酸に連結する工程；を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記工程（ｃ）がさらに、前記２つまたは
それ以上の核酸の間に存在する前記スプライシング部位
の一本鎖領域をアニーリングすることを包含する、ここで、該スプライシング部位は、特異的なハイブリダ
イゼイションを行うのに十分なヌクレオチド配列の同一
性を相補鎖の間に有する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】前記２つまたはそれ以上の核酸が、一本鎖
である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記工程（ｃ）がさらに、前記２つまたは
それ以上の核酸の間に存在する前記スプライシング部位
の一本鎖領域をアニーリングすることを包含する、ここで、該スプライシング部位は、特異的なハイブリダ
イゼイションを行うのに十分なヌクレオチド配列の同一
性を相補鎖の間に有する、請求項４に記載の方法。
【請求項９】前記２つまたはそれ以上の核酸が、一本鎖
である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記結合タンパク質が、抗体である、請
求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記結合ドメインが、CDR類である、請
求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記開裂部位の組が、制限酵素認識部位
である、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】前記制限酵素認識部位が、Bst XI、Fok
IおよびDra IIIからなる群より選択される、請求項12に
記載の方法。
【請求項１４】前記開裂試薬が、制限酵素である、請求
項５に記載の方法。
【請求項１５】（ａ）少なくとも１組のスプライシング
部位を有する結合タンパク質をコードする２つまたはそ
れ以上の核酸を提供する工程、ここで、該スプライシング部位の組が、１つまたはそれ
以上のコードされた結合ドメインの両端に隣接してい
る；（ｂ）該２つまたはそれ以上の核酸を混合し、結合タン
パク質をコードする混合核酸の親集合を製造する工程；
および（ｃ）該２つまたはそれ以上の核酸の間に、該スプライ
シング部位の組を介して該結合ドメインをランダムに組
込み、結合タンパク質をコードする核酸の、該混合した
集合とは別の集合を製造する工程、ここで、少なくとも１つの結合タンパク質は、該親集合
の構成要素と実質的に異なった結合特性によって特徴付
けられた、異なる結合タンパク質をコードする核酸の集
合を製造する工程；および（ｄ）該結合タンパク質をコードする核酸を、該別の集
合から単離する工程；を包含する方法によって製造される結合タンパク質をコ
ードする、核酸。
【請求項１６】前記結合タンパク質が、抗体である、請
求項15に記載の核酸。
【請求項１７】前記結合ドメインが、CDR類である、請
求項15に記載の核酸。
【請求項１８】（ａ）少なくとも１組のスプライシング
部位を有する結合タンパク質をコードする２つまたはそ
れ以上の核酸を提供する工程、ここで、該スプライシング部位の組が、１つまたはそれ
以上のコードされた結合ドメインの両端に隣接してい
る；（ｂ）該２つまたはそれ以上の核酸を混合し、結合タン
パク質をコードする混合核酸の親集合を製造する工程；
および（ｃ）該２つまたはそれ以上の核酸の間に、該スプライ
シング部位の組を介して該結合ドメインをランダムに組
込み、結合タンパク質をコードする核酸の、該混合した
集合とは別の集合を製造する工程、ここで、少なくとも１つの結合タンパク質は、該親集合
の構成要素と実質的に異なった結合特性によって特徴付
けられた、異なる結合タンパク質をコードする核酸の集
合を製造する工程；（ｄ）該結合タンパク質をコードする核酸を、該別の集
合から単離する工程；および（ｅ）該結合タンパク質をコードする該核酸を、ベクタ
ー内に挿入する工程；を包含する方法によって製造される結合タンパク質をコ
ードする核酸を含む、ベクター。
【請求項１９】前記結合タンパク質が、抗体である、請
求項18に記載のベクター。
【請求項２０】前記結合ドメインが、CDR類である、請
求項18に記載のベクター。
【請求項２１】請求項18に記載のベクターで形質転換さ
れた、宿主細胞。
【請求項２２】前記結合タンパク質が、抗体である、請
求項21に記載の宿主細胞。
【請求項２３】前記結合ドメインが、CDR類である、請
求項21に記載の宿主細胞。
【請求項２４】請求項21に記載の宿主細胞で製造され
る、結合タンパク質。
【請求項２５】前記結合タンパク質が、抗体である、請
求項24に記載の結合タンパク質。
【請求項２６】前記結合ドメインが、CDR類である、請
求項24に記載の結合タンパク質。