JP3297433B2 - ウイルスで汚染された薬理組成物中のウイルスの不活性化方法 - Google Patents
ウイルスで汚染された薬理組成物中のウイルスの不活性化方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明の分野 本発明は、化学的不活性化および／または物理的方法
を利用して、凝固因子などの、タンパク質成分を含有
し、ウイルスで汚染された薬理組成物中のウイルスを不
活性化する方法に関する。特に、本発明はウイルス感染
性のないものとされる血漿または他の血漿タンパク−含
有組成物に関し、このような血漿またはその画分は有用
な不安定タンパク（labile protein）、例えばIX因子な
どを含んでいる。本発明の特定の方法はチオシアン酸ナ
トリウムおよび限外濾過の利用を必要とする。
を利用して、凝固因子などの、タンパク質成分を含有
し、ウイルスで汚染された薬理組成物中のウイルスを不
活性化する方法に関する。特に、本発明はウイルス感染
性のないものとされる血漿または他の血漿タンパク−含
有組成物に関し、このような血漿またはその画分は有用
な不安定タンパク（labile protein）、例えばIX因子な
どを含んでいる。本発明の特定の方法はチオシアン酸ナ
トリウムおよび限外濾過の利用を必要とする。
2.関連技術の説明 血液は固体（細胞、即ち赤血球、白血球および血小
板）および液体（血漿）で構成されている。これらの細
胞はヘモグロビンなどの潜在的に価値ある物質を含み、
かつこれらは、例えばインタフェロン、成長因子および
他の生物学的応答修飾因子などの他の有用な物質を製造
すべく誘発され得る。血漿は主として、水、塩、脂質お
よびタンパクからなっている。個々のタンパク成分のよ
り詳しい説明がなされる前に、このタンパクは、まず簡
単に“アルブミン”と“グロブリン”とに分類された。
ヒト血漿中に見出された典型的な抗体（免疫血清グロブ
リン）は感染性肝炎、インフルエンザＨなどに対する抗
体を包含する。
板）および液体（血漿）で構成されている。これらの細
胞はヘモグロビンなどの潜在的に価値ある物質を含み、
かつこれらは、例えばインタフェロン、成長因子および
他の生物学的応答修飾因子などの他の有用な物質を製造
すべく誘発され得る。血漿は主として、水、塩、脂質お
よびタンパクからなっている。個々のタンパク成分のよ
り詳しい説明がなされる前に、このタンパクは、まず簡
単に“アルブミン”と“グロブリン”とに分類された。
ヒト血漿中に見出された典型的な抗体（免疫血清グロブ
リン）は感染性肝炎、インフルエンザＨなどに対する抗
体を包含する。
全血は、輸血の際には投与前に、注意深く血液型を決
定し、かつ交叉適合試験を行わねばならない。しかし、
血漿については一般に予備テストを必要としない。いく
つかの用途においては血漿の適当な画分のみ、例えば血
友病またはフォンビルブランド病の治療に対するVIII因
子錯体などが必要とされる。血液の特定の画分の使用に
関する論理的根拠は、多数の別々に形成された要素並び
に血漿タンパクおよび多種の機能を有する成分を血液が
含んでいることにある。かくして、全血１単位の１人に
よる献血から赤血球、血小板、血漿および低温沈殿され
たVIII因子−フィブリノーゲン濃縮物を得ることができ
る。フェレシス（Fheresis）の手続きは一人の献血者か
ら大量の顆粒球、血小板および血漿を得ることを可能と
する。血液成分使用の論理的根拠は、患者が一般に特定
の成分のみの置換を必要とするにすぎないことにある
（グリーンウォルト（Greenwalt）等の“輸血の一般的
原理（General Principles of Blood Tranfusion）、19
78年、A.M.A.エディトリアルボードを参照のこと）。従
って、残りの成分は他の特定の成分を必要としている患
者の治療に用いることができ、かくして献血された各血
液単位からの恩恵を数名の患者にわけ与えることが可能
であり、その結果該血液単位からの恩恵を最大限利用す
ることができる。血液の、その成分への分割および該成
分の後の分画が該タンパクを濃縮することを可能とす
る。極めて重要なことは、該血漿画分が全血よりも一層
長期に亘る貯蔵が可能であり、かつ液状で、凍結または
乾燥状態で配布し得るという事実である。最後に、全血
として投与するには安全性に欠ける古い全血からの血漿
タンパクを、血液銀行から回収して利用することがいく
らかの場合には可能である。
定し、かつ交叉適合試験を行わねばならない。しかし、
血漿については一般に予備テストを必要としない。いく
つかの用途においては血漿の適当な画分のみ、例えば血
友病またはフォンビルブランド病の治療に対するVIII因
子錯体などが必要とされる。血液の特定の画分の使用に
関する論理的根拠は、多数の別々に形成された要素並び
に血漿タンパクおよび多種の機能を有する成分を血液が
含んでいることにある。かくして、全血１単位の１人に
よる献血から赤血球、血小板、血漿および低温沈殿され
たVIII因子−フィブリノーゲン濃縮物を得ることができ
る。フェレシス（Fheresis）の手続きは一人の献血者か
ら大量の顆粒球、血小板および血漿を得ることを可能と
する。血液成分使用の論理的根拠は、患者が一般に特定
の成分のみの置換を必要とするにすぎないことにある
（グリーンウォルト（Greenwalt）等の“輸血の一般的
原理（General Principles of Blood Tranfusion）、19
78年、A.M.A.エディトリアルボードを参照のこと）。従
って、残りの成分は他の特定の成分を必要としている患
者の治療に用いることができ、かくして献血された各血
液単位からの恩恵を数名の患者にわけ与えることが可能
であり、その結果該血液単位からの恩恵を最大限利用す
ることができる。血液の、その成分への分割および該成
分の後の分画が該タンパクを濃縮することを可能とす
る。極めて重要なことは、該血漿画分が全血よりも一層
長期に亘る貯蔵が可能であり、かつ液状で、凍結または
乾燥状態で配布し得るという事実である。最後に、全血
として投与するには安全性に欠ける古い全血からの血漿
タンパクを、血液銀行から回収して利用することがいく
らかの場合には可能である。
ヒト血漿中にみられるタンパクはプレアルブミン、レ
チノール−結合タンパク、アルブミン、α−グロブリ
ン、β−グロブリン、凝固タンパク（II、VII、IX、
Ｘ、Ｖ、VIII、XI、XII、XIIIおよびインヒビタ、例え
ばタンパクＣ、抗トロンビンIIIなど）、フィブロネク
チン、免疫グロブリン（免疫グロブリンG,A,M,Dおよび
Ｅ）および補体成分を含む。既に記載されている血漿タ
ンパクは一般に100を越えている。包括的な例示は“ザ
プラズマプロテインズ（The Plasma Proteins）”、パ
ットナム（Putnam）F.W.編、アカデミックプレス、ニュ
ーヨーク（1975）に見出すことができる。
チノール−結合タンパク、アルブミン、α−グロブリ
ン、β−グロブリン、凝固タンパク（II、VII、IX、
Ｘ、Ｖ、VIII、XI、XII、XIIIおよびインヒビタ、例え
ばタンパクＣ、抗トロンビンIIIなど）、フィブロネク
チン、免疫グロブリン（免疫グロブリンG,A,M,Dおよび
Ｅ）および補体成分を含む。既に記載されている血漿タ
ンパクは一般に100を越えている。包括的な例示は“ザ
プラズマプロテインズ（The Plasma Proteins）”、パ
ットナム（Putnam）F.W.編、アカデミックプレス、ニュ
ーヨーク（1975）に見出すことができる。
血液細胞画分中にみられるタンパクはヘモグロビン、
フィブロネクチン、フィブリノーゲン、炭水化物の酵素
およびタンパク代謝産物などを含む。更に、他のタンパ
クの合成、例えばインタフェロンおよび成長因子などの
合成も誘発し得る。
フィブロネクチン、フィブリノーゲン、炭水化物の酵素
およびタンパク代謝産物などを含む。更に、他のタンパ
クの合成、例えばインタフェロンおよび成長因子などの
合成も誘発し得る。
血漿を化学的に分画して、アルブミンまたは血漿タン
パク画分、VIII因子濃縮物、IX因子複合体および免疫血
清グロブリンを得ることができる。
パク画分、VIII因子濃縮物、IX因子複合体および免疫血
清グロブリンを得ることができる。
血漿分画には、一般に有機溶媒、例えばエタノール、
エーテルおよびポリエチレングリコールなどを低温に
て、かつ調節されたpHにて使用して、１またはそれ以上
の血漿タンパクを含む特定の画分を沈殿させる工程が含
まれる。生成する上澄自体を次に所定の分画の程度に達
するまで沈殿等の操作にかけることができる。極く最近
では、分別はクロマトグラフィー法によっている。血液
分画の概説はカークオスマー（Kirk−Othmer）のエンサ
イクロペディアオブケミカルテクノロジー（Encycloped
ia of Chemical Technology）、第３版、インターサイ
エンスパブリッシャ、第４巻、第25〜62頁にみられる。
エーテルおよびポリエチレングリコールなどを低温に
て、かつ調節されたpHにて使用して、１またはそれ以上
の血漿タンパクを含む特定の画分を沈殿させる工程が含
まれる。生成する上澄自体を次に所定の分画の程度に達
するまで沈殿等の操作にかけることができる。極く最近
では、分別はクロマトグラフィー法によっている。血液
分画の概説はカークオスマー（Kirk−Othmer）のエンサ
イクロペディアオブケミカルテクノロジー（Encycloped
ia of Chemical Technology）、第３版、インターサイ
エンスパブリッシャ、第４巻、第25〜62頁にみられる。
血漿の低温エタノール画分の主成分は以下の通りであ
る。
る。
上述の分画表は更に分画する際の基本となり得る。例
えば、画分IIおよびIIIは、根本的にIgG抗体の混合物で
ある免疫血清グロブリン（ISG）を得るべく更に分画で
きる。
えば、画分IIおよびIIIは、根本的にIgG抗体の混合物で
ある免疫血清グロブリン（ISG）を得るべく更に分画で
きる。
別の分画計画は凍結血漿の使用を含み、該凍結血漿は
解凍するとAHF（抗血友病因子）を含む低温沈殿物と、
フィブロネクチンと、低温上澄とを与える。この低温沈
殿物を次に分画してフィブロネクチンとAHFとを得る。
解凍するとAHF（抗血友病因子）を含む低温沈殿物と、
フィブロネクチンと、低温上澄とを与える。この低温沈
殿物を次に分画してフィブロネクチンとAHFとを得る。
ポリエチレングリコールは高純度AHFおよび非凝集性I
SGを得るのに使用されてきた試薬の一つである。
SGを得るのに使用されてきた試薬の一つである。
ヒト血漿から新しい生成物を開発する際には、常に少
なくとも３つの主な問題に遭遇する。これらは発熱物質
（内毒素）による汚染、ウイルス性肝炎の伝染または他
のウイルス性疾病の伝染および凝固酵素の活性化などで
ある。
なくとも３つの主な問題に遭遇する。これらは発熱物質
（内毒素）による汚染、ウイルス性肝炎の伝染または他
のウイルス性疾病の伝染および凝固酵素の活性化などで
ある。
ヒト（または獣医用途）に腸管外投与される薬理組成
物の溶液は細菌および真菌などの感染性微生物を滅菌す
る必要がある。その一般的方法は該組成物を、100℃を
越える温度にて、大気圧を越える高圧下にて所定の効果
を挙げるに十分な時間蒸気殺菌（オートクレーブ処理）
することである。この処理でウイルスを殺すことができ
るが、血清凝固VIII、IX、II、VII、Ｘ因子などのタン
パク成分を含むものなどの熱に敏感ないくつかの組成物
にとってこの処理は有害もしくは破壊的である。
物の溶液は細菌および真菌などの感染性微生物を滅菌す
る必要がある。その一般的方法は該組成物を、100℃を
越える温度にて、大気圧を越える高圧下にて所定の効果
を挙げるに十分な時間蒸気殺菌（オートクレーブ処理）
することである。この処理でウイルスを殺すことができ
るが、血清凝固VIII、IX、II、VII、Ｘ因子などのタン
パク成分を含むものなどの熱に敏感ないくつかの組成物
にとってこの処理は有害もしくは破壊的である。
発熱物質はグラム−陰性細菌の外部細胞壁由来のリポ
多糖類（LPS）である。これらは有毒物であり、インタ
クト（intact）細菌により合成かつ分泌される毒物と区
別するために内毒素としても知られている。発熱物質は
多くの生物学的活性を有し、これらは発熱、凝固メガニ
ズムの活発化およびショックの誘発を含む。結局、感染
性物質に関る殺菌の必要性に加えて、発熱性物質を除去
すること、および最終的な血漿生成物を殺菌または他の
同様な処理により、病気の原因となる細菌を無毒化する
ことが基本である。
多糖類（LPS）である。これらは有毒物であり、インタ
クト（intact）細菌により合成かつ分泌される毒物と区
別するために内毒素としても知られている。発熱物質は
多くの生物学的活性を有し、これらは発熱、凝固メガニ
ズムの活発化およびショックの誘発を含む。結局、感染
性物質に関る殺菌の必要性に加えて、発熱性物質を除去
すること、および最終的な血漿生成物を殺菌または他の
同様な処理により、病気の原因となる細菌を無毒化する
ことが基本である。
血液凝固因子は正常な凝固メカニズムにおいて極めて
重要な役害を演じている。例えば、IX因子欠乏症にかか
った患者はひどい出血（血友病Ｂ）を示す。治療の目的
で投与し並びに科学的研究のために、大量のIX因子およ
び他のビタミンＫ−依存タンパクを単離し得ることが望
ましい。
重要な役害を演じている。例えば、IX因子欠乏症にかか
った患者はひどい出血（血友病Ｂ）を示す。治療の目的
で投与し並びに科学的研究のために、大量のIX因子およ
び他のビタミンＫ−依存タンパクを単離し得ることが望
ましい。
IX因子複合体は、IV、VII、IXおよびＸ因子に富む凍
結乾燥されプールされた血漿誘導体の一つである。これ
は血漿療法にとって替り得るものである。これは血漿よ
りも一層少量でビタミンＫ−依存凝固因子をもたらす
が、かなり高い肝炎発症の危険性をもつ。
結乾燥されプールされた血漿誘導体の一つである。これ
は血漿療法にとって替り得るものである。これは血漿よ
りも一層少量でビタミンＫ−依存凝固因子をもたらす
が、かなり高い肝炎発症の危険性をもつ。
濃縮物を含むIX因子は独特の高い有用性をもつ血液製
品であって、IX因子欠乏症（血友病Ｂ）をわずらう患者
の出血を抑制するのに使った場合には救命に役立つ。こ
れらの製品は、またインヒビタを有する血友病Ａに悩む
患者を治療するためにも使用されている。ただ、この利
用の臨床的証明は現在行われている際中である。濃縮物
を含むIX因子は、また重度の出血を止めるために、ある
いは先天性の凝固因子欠乏症にかかっている患者におけ
る手術中のあるいは術後の出血を回避するのに、更にワ
ルファリン−型の薬剤、即ち経口抗凝固剤の投与過多に
より誘発される多重因子欠乏症（multiple factor defi
ciency）の治療のためにも利用されている。
品であって、IX因子欠乏症（血友病Ｂ）をわずらう患者
の出血を抑制するのに使った場合には救命に役立つ。こ
れらの製品は、またインヒビタを有する血友病Ａに悩む
患者を治療するためにも使用されている。ただ、この利
用の臨床的証明は現在行われている際中である。濃縮物
を含むIX因子は、また重度の出血を止めるために、ある
いは先天性の凝固因子欠乏症にかかっている患者におけ
る手術中のあるいは術後の出血を回避するのに、更にワ
ルファリン−型の薬剤、即ち経口抗凝固剤の投与過多に
より誘発される多重因子欠乏症（multiple factor defi
ciency）の治療のためにも利用されている。
IX因子の市販の濃縮物は、以前イオン交換樹脂を用い
て、ビタミンＫ−依存凝固因子を結合せしめ、これらタ
ンパクを他の大部分の血漿タンパクから分離することに
より調製していた。次いで、これらの凝固因子濃縮物を
該樹脂から溶出し、さらに精製せずに治療で使用すべく
バイアルビンに詰めていた。このような濃縮物は凝塊形
成能をもつ傾向にあり、これは恐らく該濃縮物が外来の
ビタミンＫ−依存凝固因子および／または燐脂質を含む
ためであると考えられる。更に、このような濃縮物は、
肝炎および後天性免疫不全症候群（AIDS）を含むウイル
ス性疾患の伝染における疑わしい媒介物でもあった。更
に、IX因子の粗濃縮物は溶液中で長期に渡り安定に存在
しないので、定期的な注入療法には使用できず、このこ
とは該濃縮物の慢性交換療法における価値を制限してい
る。
て、ビタミンＫ−依存凝固因子を結合せしめ、これらタ
ンパクを他の大部分の血漿タンパクから分離することに
より調製していた。次いで、これらの凝固因子濃縮物を
該樹脂から溶出し、さらに精製せずに治療で使用すべく
バイアルビンに詰めていた。このような濃縮物は凝塊形
成能をもつ傾向にあり、これは恐らく該濃縮物が外来の
ビタミンＫ−依存凝固因子および／または燐脂質を含む
ためであると考えられる。更に、このような濃縮物は、
肝炎および後天性免疫不全症候群（AIDS）を含むウイル
ス性疾患の伝染における疑わしい媒介物でもあった。更
に、IX因子の粗濃縮物は溶液中で長期に渡り安定に存在
しないので、定期的な注入療法には使用できず、このこ
とは該濃縮物の慢性交換療法における価値を制限してい
る。
細菌の組換えDNA法を用いたIX因子製造に対する努力
は、従来受入れられていた技術による培養上澄からのIX
因子の分離の際に遭遇する困難のために失敗に帰してい
る（アンソン（Anson）,D.S.,オーステン（Austen）、
D.E.G.,およびブラウンレス（Brownless）,G.G.によ
る、“哺乳動物細胞中での、組換えDNAクローンの活性
ヒト凝固IX因子の表現（Expression of Active Human C
lotting Factor IX from Recombinant DNA Clones in M
ammalian Cells）”と題する論文（Nature,1985、315,p
p.683−685）；ドゥラサル（de la Salle）,H.,アルテ
ンバーガー（Altenburger）,W.,エルカイム（Elkaim）,
R.,ドット（Dott）,K.等の“組換えDNA技術を利用して
表現させた活性γ−カルボキシル化ヒトIX因子（Active
γ−carbo−xylated Human Factor IX Expressed Using
Recombinant DNA Techniques）”と題する論文（Natur
e,1985,316,pp.268−270;およびブスビ（Busby）,S.,ク
マー（Kumar）,A.,ジョゼフ（Joseph）,M.,ハーフパッ
プ（Halfpap）,L.,インスレイ（Insley）,M.,等の“移
入細胞内での活性ヒトIX因子の表現（Expression of Ac
tive Human Factor IX in Transfected Cells）”と題
する論文（Nature,1985,316,pp.271−273）参照）。か
くして、ヒト血漿から得られたIX因子の安全な処方物に
対する医学上の需要が依然として残されている。
は、従来受入れられていた技術による培養上澄からのIX
因子の分離の際に遭遇する困難のために失敗に帰してい
る（アンソン（Anson）,D.S.,オーステン（Austen）、
D.E.G.,およびブラウンレス（Brownless）,G.G.によ
る、“哺乳動物細胞中での、組換えDNAクローンの活性
ヒト凝固IX因子の表現（Expression of Active Human C
lotting Factor IX from Recombinant DNA Clones in M
ammalian Cells）”と題する論文（Nature,1985、315,p
p.683−685）；ドゥラサル（de la Salle）,H.,アルテ
ンバーガー（Altenburger）,W.,エルカイム（Elkaim）,
R.,ドット（Dott）,K.等の“組換えDNA技術を利用して
表現させた活性γ−カルボキシル化ヒトIX因子（Active
γ−carbo−xylated Human Factor IX Expressed Using
Recombinant DNA Techniques）”と題する論文（Natur
e,1985,316,pp.268−270;およびブスビ（Busby）,S.,ク
マー（Kumar）,A.,ジョゼフ（Joseph）,M.,ハーフパッ
プ（Halfpap）,L.,インスレイ（Insley）,M.,等の“移
入細胞内での活性ヒトIX因子の表現（Expression of Ac
tive Human Factor IX in Transfected Cells）”と題
する論文（Nature,1985,316,pp.271−273）参照）。か
くして、ヒト血漿から得られたIX因子の安全な処方物に
対する医学上の需要が依然として残されている。
哺乳動物、特にヒトの血漿中の、肝炎Ｂウイルス（HB
V）およびヒト免疫不全症ウイルス（HIV）の脂質−含有
ウイルスなどのウイルスを不活性化する多くの試みがな
されてきた。いくつかの国では、血漿中の肝炎Ｂウイル
スの不活性化を、肝炎Ｂウイルスのタンパク様（protei
naceous）タンパクを架橋するか、あるいは該ウイルス
の核酸と相互作用する型のウイルス不活化試薬と該血漿
とを接触させることにより実施している。例えば、肝炎
Ｂウイルスとアルデヒド（ホルムアルデヒドなど）と接
触させて、タンパクを架橋結合し、該肝炎Ｂウイルスを
不活性化する試みが知られている。また、該ウイルスを
その核酸並びにタンパク成分に作用する薬剤であるβ−
プロピオラクトン（BPL）と接触させることにより、該
ウイルスの不活性化を行うことも公知である。更に、特
にβ−プロピオラクトン処理後に紫外（UV）光を利用す
ることも公知である。これらの方法は、血漿中のウイル
スの不活性化には不向きであると考えられている。とい
うのは、これら不活性化剤（ホルムアルデヒド、β−プ
ロピオラクトンおよび次亜塩素酸ナトリウム）の殆どが
該血漿の有用なタンパク成分、特に血漿のいわゆる“不
安定”血液凝固因子を変質もしくは変性してしまうとい
うことが観察されたからである。
V）およびヒト免疫不全症ウイルス（HIV）の脂質−含有
ウイルスなどのウイルスを不活性化する多くの試みがな
されてきた。いくつかの国では、血漿中の肝炎Ｂウイル
スの不活性化を、肝炎Ｂウイルスのタンパク様（protei
naceous）タンパクを架橋するか、あるいは該ウイルス
の核酸と相互作用する型のウイルス不活化試薬と該血漿
とを接触させることにより実施している。例えば、肝炎
Ｂウイルスとアルデヒド（ホルムアルデヒドなど）と接
触させて、タンパクを架橋結合し、該肝炎Ｂウイルスを
不活性化する試みが知られている。また、該ウイルスを
その核酸並びにタンパク成分に作用する薬剤であるβ−
プロピオラクトン（BPL）と接触させることにより、該
ウイルスの不活性化を行うことも公知である。更に、特
にβ−プロピオラクトン処理後に紫外（UV）光を利用す
ることも公知である。これらの方法は、血漿中のウイル
スの不活性化には不向きであると考えられている。とい
うのは、これら不活性化剤（ホルムアルデヒド、β−プ
ロピオラクトンおよび次亜塩素酸ナトリウム）の殆どが
該血漿の有用なタンパク成分、特に血漿のいわゆる“不
安定”血液凝固因子を変質もしくは変性してしまうとい
うことが観察されたからである。
このような熱に敏感なタンパク含有組成物からの殺菌
および真菌の除去は、一般に細菌を保持し得るフィルタ
を使用して達成される。その典型例はポール社（Pall C
orporation）およびミリポア社（Millipore Corporatio
n）により作られている多孔度0.1〜0.2μ（100〜200n
m）のメンブランフィルタである。一般に、このような
薬理組成物中のタンパク成分は損傷を受けることはな
い。しかし、メンブランフィルタは著しく感染性のかつ
危険な微生物、例えばウイルス粒子を保持し得ないこと
が知られている。フィルタ装置は、有効なフィルタの多
孔度を十分に小さな寸法にすれば、いくつかのウイルス
粒子を保持できるように工夫できる。このような装置
は、例えばウイルス性ワクチンの製造におけるように、
ウイルス粒子を回収するためにしばしば利用されてい
る。しかし、多くのウイルス粒子はメンブランフィルタ
の有効多孔度よりも小さな寸法をもち、これに保持され
ることはない。例えば、ヒト血漿から作られた凝固因子
溶液中に存在する可能性のある肝炎Ｂウイルスは径42nm
を有し、従って100nm（0.1μ）のメンブランフィルタを
容易に通過するであろう。
および真菌の除去は、一般に細菌を保持し得るフィルタ
を使用して達成される。その典型例はポール社（Pall C
orporation）およびミリポア社（Millipore Corporatio
n）により作られている多孔度0.1〜0.2μ（100〜200n
m）のメンブランフィルタである。一般に、このような
薬理組成物中のタンパク成分は損傷を受けることはな
い。しかし、メンブランフィルタは著しく感染性のかつ
危険な微生物、例えばウイルス粒子を保持し得ないこと
が知られている。フィルタ装置は、有効なフィルタの多
孔度を十分に小さな寸法にすれば、いくつかのウイルス
粒子を保持できるように工夫できる。このような装置
は、例えばウイルス性ワクチンの製造におけるように、
ウイルス粒子を回収するためにしばしば利用されてい
る。しかし、多くのウイルス粒子はメンブランフィルタ
の有効多孔度よりも小さな寸法をもち、これに保持され
ることはない。例えば、ヒト血漿から作られた凝固因子
溶液中に存在する可能性のある肝炎Ｂウイルスは径42nm
を有し、従って100nm（0.1μ）のメンブランフィルタを
容易に通過するであろう。
血漿から作られた血漿製剤（blood product）が肝炎
を媒介することは周知である。初めに、ウイルス伝染の
興味は、まず有害な試薬（肝炎Ｂウイルス）の存在の指
標となる肝炎Ｂ抗原（HB8Ag）に集中し、かつこの試薬
除去の試みは、工業的に可能かつ承認された実験室的手
法による、輸血に用いられたあらゆる血漿の広範なスク
リーニングへと導かれた。このような実験室的スクリー
ニングは、全血の輸血を受けた患者における肝炎Ｂの発
生率を見掛け上減じるが、血漿製剤から伝染されたこの
疾病の発生率における大きな改善はみられなかった。血
液製剤の恒常的利用者はワクチンの接種によって免疫状
態に維持されていなければ、この疾病の危険性に露され
ていることになる。このワクチンの利用は有効ではある
が、これに関連した他の臨床上の危険があるかも知れな
い。様々な吸着法または沈殿法、例えばポリエチレング
リコールの使用によるウイルス除去の試みは感染性を十
分に除き得たことが立証されていない。紫外光とβ−プ
ロピオラクトンとの組合せがいくつかの血漿製剤中のウ
イルスの不活性化に役立つ可能性があるとするいくらか
の証拠がある。しかし、β−プロピオラクトンが発癌特
性をもつといういくらかの懸念がある。
を媒介することは周知である。初めに、ウイルス伝染の
興味は、まず有害な試薬（肝炎Ｂウイルス）の存在の指
標となる肝炎Ｂ抗原（HB8Ag）に集中し、かつこの試薬
除去の試みは、工業的に可能かつ承認された実験室的手
法による、輸血に用いられたあらゆる血漿の広範なスク
リーニングへと導かれた。このような実験室的スクリー
ニングは、全血の輸血を受けた患者における肝炎Ｂの発
生率を見掛け上減じるが、血漿製剤から伝染されたこの
疾病の発生率における大きな改善はみられなかった。血
液製剤の恒常的利用者はワクチンの接種によって免疫状
態に維持されていなければ、この疾病の危険性に露され
ていることになる。このワクチンの利用は有効ではある
が、これに関連した他の臨床上の危険があるかも知れな
い。様々な吸着法または沈殿法、例えばポリエチレング
リコールの使用によるウイルス除去の試みは感染性を十
分に除き得たことが立証されていない。紫外光とβ−プ
ロピオラクトンとの組合せがいくつかの血漿製剤中のウ
イルスの不活性化に役立つ可能性があるとするいくらか
の証拠がある。しかし、β−プロピオラクトンが発癌特
性をもつといういくらかの懸念がある。
熱に敏感なタンパク成分を含み、かつ危険なウイルス
粒子を含む恐れのある薬理組成物の安全性を増すために
は、追加の処理が必要とされる。この処理は生物学的能
力を保護するための特定の安定剤と共に該タンパク成分
の溶液を加熱する方法、該タンパク成分の凍結乾燥品を
加熱する方法および該タンパク成分の溶液を有機溶媒ま
たは他の殺ウイルス剤で処理する方法を含む。これら方
法の多くは、厄介で、時間労費で、あるいは処理の厳し
さの故にタンパクを分解する恐れがある。これら方法の
いずれも血漿製剤に単独で適用した場合の有効性につい
ては依然として疑問がある。
粒子を含む恐れのある薬理組成物の安全性を増すために
は、追加の処理が必要とされる。この処理は生物学的能
力を保護するための特定の安定剤と共に該タンパク成分
の溶液を加熱する方法、該タンパク成分の凍結乾燥品を
加熱する方法および該タンパク成分の溶液を有機溶媒ま
たは他の殺ウイルス剤で処理する方法を含む。これら方
法の多くは、厄介で、時間労費で、あるいは処理の厳し
さの故にタンパクを分解する恐れがある。これら方法の
いずれも血漿製剤に単独で適用した場合の有効性につい
ては依然として疑問がある。
肝炎Ｂに対するスクリーニングテストの開発はこの病
気の伝染を減じる上では限られた価値しかもたないが、
このウイルスの同定（並びに肝炎Ａウイルスの同定）
は、血漿誘導体により伝染された肝炎の大部分に対して
見掛け上原因となる第３のウイルスの認識をもたらし
た。このウイルスは“非−A,非−Ｂ肝炎”ウイルス
（“non−A,non−B hepatitis"virus）と呼ばれてい
る。
気の伝染を減じる上では限られた価値しかもたないが、
このウイルスの同定（並びに肝炎Ａウイルスの同定）
は、血漿誘導体により伝染された肝炎の大部分に対して
見掛け上原因となる第３のウイルスの認識をもたらし
た。このウイルスは“非−A,非−Ｂ肝炎”ウイルス
（“non−A,non−B hepatitis"virus）と呼ばれてい
る。
血漿中の肝炎Ｂウイルスの不活性化法は公知である
が、通常は実施できようにない。一つの方法は血漿に抗
体を添加して、免疫複合体を形成することを包含する。
抗体形成およびその精製の費用が血漿生成のコストに大
きく加算され、更にこの方法は肝炎Ｂウイルスに特異的
なものであるから、十分な量の非−A,非−Ｂ肝炎ウイル
スが不活性化されるという何等の保証もない。一般的に
承認された、利用可能な非−A,非−Ｂ抗体またはウイル
スのためのテストはなく、単にこれを達成する途上にあ
るという報告があるにすぎず、従って高力価で抗非−A,
非−Ｂ抗体を含む血漿を選別することは依然として不可
能であり、またこのような解決法が実施可能であること
を示すものも今のところない。
が、通常は実施できようにない。一つの方法は血漿に抗
体を添加して、免疫複合体を形成することを包含する。
抗体形成およびその精製の費用が血漿生成のコストに大
きく加算され、更にこの方法は肝炎Ｂウイルスに特異的
なものであるから、十分な量の非−A,非−Ｂ肝炎ウイル
スが不活性化されるという何等の保証もない。一般的に
承認された、利用可能な非−A,非−Ｂ抗体またはウイル
スのためのテストはなく、単にこれを達成する途上にあ
るという報告があるにすぎず、従って高力価で抗非−A,
非−Ｂ抗体を含む血漿を選別することは依然として不可
能であり、またこのような解決法が実施可能であること
を示すものも今のところない。
ヒト血漿由来の治療薬の開発が進展するにつれて、ウ
イルス殺菌の必要性が明らかとなってきた。安定な血漿
タンパク溶液は殺菌に耐え得るが、不安定な血漿凝固因
子はこのような加熱中に殆どの場合不活性化されるか、
あるいはその能力が著しく減じられてしまう。このこと
は実際の用途を制限してしまう。結果として、VIII因
子、γ−グロブリン、IX因子、フィブリノーゲンなどの
レシピエントは、投与された有用なタンパク成分が肝炎
ウイルス並びに他の感染性ウイルスにより汚染されてい
るかも知れないという危険性をしばしば容認せざるを得
ない。結局、これらのレシピエントはこれらのウイルス
で感染され、かつこれらウイルスの引き起こす器官系の
損傷および結果としての死に至らしめる恐れのある無能
力化および疾病を容認せざるを得ないという危険性に直
面することになる。従って、より一層効果的かつ実施可
能性のある該熱に対して敏感な血漿の精製法、特に熱を
利用することのない殺ウイルス法の開発が望まれてい
る。
イルス殺菌の必要性が明らかとなってきた。安定な血漿
タンパク溶液は殺菌に耐え得るが、不安定な血漿凝固因
子はこのような加熱中に殆どの場合不活性化されるか、
あるいはその能力が著しく減じられてしまう。このこと
は実際の用途を制限してしまう。結果として、VIII因
子、γ−グロブリン、IX因子、フィブリノーゲンなどの
レシピエントは、投与された有用なタンパク成分が肝炎
ウイルス並びに他の感染性ウイルスにより汚染されてい
るかも知れないという危険性をしばしば容認せざるを得
ない。結局、これらのレシピエントはこれらのウイルス
で感染され、かつこれらウイルスの引き起こす器官系の
損傷および結果としての死に至らしめる恐れのある無能
力化および疾病を容認せざるを得ないという危険性に直
面することになる。従って、より一層効果的かつ実施可
能性のある該熱に対して敏感な血漿の精製法、特に熱を
利用することのない殺ウイルス法の開発が望まれてい
る。
かくして、高度に精製されたIX因子の製造並びに単離
手段、即ち方法の開発に対する特別な要求があり、該IX
因子はその後効力のある、速効性の治療用血液製剤に処
方でき、該製品はインビトロで安定であり、しかも重大
な出血にみまわれた患者に効果的な安楽さを与える。
手段、即ち方法の開発に対する特別な要求があり、該IX
因子はその後効力のある、速効性の治療用血液製剤に処
方でき、該製品はインビトロで安定であり、しかも重大
な出血にみまわれた患者に効果的な安楽さを与える。
本発明は３つの目的、即ち（１）安全性、（２）ウイ
ルスを不活性化したタンパク含有組成物、（３）著しい
タンパクの変性を招くことがないという３つの目的を達
成することを意図する。これら３つの目的は必ずしも同
時に成立するものではない。というのは、例えば殺菌は
ウイルス感染性を不活化するが有用な血漿タンパクを実
質的に変性し、β−プロピオラクトンはウイルス感染性
を不活化する一方で安全性に欠け、またホルムアルデヒ
ドなどの物質はウイルスを不活性化する一方で同様に有
用な血漿タンパク、例えばIX因子を著しく変性するから
である。
ルスを不活性化したタンパク含有組成物、（３）著しい
タンパクの変性を招くことがないという３つの目的を達
成することを意図する。これら３つの目的は必ずしも同
時に成立するものではない。というのは、例えば殺菌は
ウイルス感染性を不活化するが有用な血漿タンパクを実
質的に変性し、β−プロピオラクトンはウイルス感染性
を不活化する一方で安全性に欠け、またホルムアルデヒ
ドなどの物質はウイルスを不活性化する一方で同様に有
用な血漿タンパク、例えばIX因子を著しく変性するから
である。
従って、タンパク含有組成物を得る方法であって、そ
こに含まれる有用なタンパク成分を実質上変性すること
がなく、しかも明らかな発癌性物質（例えばβ−プロピ
オラクトン）の使用を含まない上記の如き方法を提供す
ることが望ましい。より詳しくいえば、実質的にすべて
の肝炎ウイルスおよび他の存在するウイルスが不活性化
された血漿タンパク含有組成物を提供することが望まし
い。本発明の更なる目的は癌細胞、正常な細胞からのま
たは所定の組換えDNAを挿入した細胞の発酵過程から得
られる生成物であって、実質的にウイルスを含まず、か
つ血漿の公知の感染性試薬を含むカテゴリーの脂質−含
有ウイルスを含まない該生成物を提供することにある。
こに含まれる有用なタンパク成分を実質上変性すること
がなく、しかも明らかな発癌性物質（例えばβ−プロピ
オラクトン）の使用を含まない上記の如き方法を提供す
ることが望ましい。より詳しくいえば、実質的にすべて
の肝炎ウイルスおよび他の存在するウイルスが不活性化
された血漿タンパク含有組成物を提供することが望まし
い。本発明の更なる目的は癌細胞、正常な細胞からのま
たは所定の組換えDNAを挿入した細胞の発酵過程から得
られる生成物であって、実質的にウイルスを含まず、か
つ血漿の公知の感染性試薬を含むカテゴリーの脂質−含
有ウイルスを含まない該生成物を提供することにある。
発明の概要 タンパク含有組成物、例えば全血、血液細胞タンパ
ク、血漿、血漿分画沈殿物、血漿分画上澄、低温沈殿
物、低温上澄、あるいはこれらの一部もしくはその誘導
体あるいは血清（正常なまたは癌細胞から得られた〔例
えば組換えDNA技術で得た）非−血液製品〕を化学的消
毒剤と、十分な時間接触させると、薬理組成物中に存在
するウイルス（例えば肝炎ウイルスまたはヒト免疫不全
症ウイルス（HIV））が、該組成物中のタンパクを変性
することなしに実際上完全に不活性化されることが今や
見出された。化学的および物理的手段の組合せを血液タ
ンパク混合物またはその濃縮物もしくはその画分に適用
すると、該タンパクを変性することなしに完全かつウイ
ルスを含まないタンパク含有組成物が得られる。
ク、血漿、血漿分画沈殿物、血漿分画上澄、低温沈殿
物、低温上澄、あるいはこれらの一部もしくはその誘導
体あるいは血清（正常なまたは癌細胞から得られた〔例
えば組換えDNA技術で得た）非−血液製品〕を化学的消
毒剤と、十分な時間接触させると、薬理組成物中に存在
するウイルス（例えば肝炎ウイルスまたはヒト免疫不全
症ウイルス（HIV））が、該組成物中のタンパクを変性
することなしに実際上完全に不活性化されることが今や
見出された。化学的および物理的手段の組合せを血液タ
ンパク混合物またはその濃縮物もしくはその画分に適用
すると、該タンパクを変性することなしに完全かつウイ
ルスを含まないタンパク含有組成物が得られる。
本発明は、不安定血液タンパクおよびウイルスを含有
する血液製剤を、好ましくは該タンパクの変性を伴うこ
となしに、ウイルスを含まないものとする、著しく効果
的な化学的手段と物理的手段との組合せを提供する。本
発明は、一般的にいえば血液成分療法に係り、より詳し
くいえばプロトロンビン複合体濃縮物からまたは組換え
DNA技術からのIX因子を含む培養上澄を包含するIX因子
の他の起源からIX因子を精製する独特の手段および方法
に関する。
する血液製剤を、好ましくは該タンパクの変性を伴うこ
となしに、ウイルスを含まないものとする、著しく効果
的な化学的手段と物理的手段との組合せを提供する。本
発明は、一般的にいえば血液成分療法に係り、より詳し
くいえばプロトロンビン複合体濃縮物からまたは組換え
DNA技術からのIX因子を含む培養上澄を包含するIX因子
の他の起源からIX因子を精製する独特の手段および方法
に関する。
本発明の方法は、 （ａ） 血液製剤と、有効量の化学的消毒剤、好ましく
は該血液製剤中のタンパクを変性しない選ばれた化学的
消毒剤と、バッファーとを混合し、 （ｂ） 実質上すべてのウイルスを不活性化するのに十
分な時間該混合物を静置し、 （ｃ） 必要ならば、該化学的消毒剤を除去し、および （ｄ） 該血液製剤から不活性化されたおよび活性なウ
イルスを物理的に除去する工程を含む。
は該血液製剤中のタンパクを変性しない選ばれた化学的
消毒剤と、バッファーとを混合し、 （ｂ） 実質上すべてのウイルスを不活性化するのに十
分な時間該混合物を静置し、 （ｃ） 必要ならば、該化学的消毒剤を除去し、および （ｄ） 該血液製剤から不活性化されたおよび活性なウ
イルスを物理的に除去する工程を含む。
好ましくは、該化学的処理工程は予め精製された血液
製剤について実施する。例えば、該精製および化学的処
理は以下の工程を含むことができる。
製剤について実施する。例えば、該精製および化学的処
理は以下の工程を含むことができる。
（ａ） 血液製剤を、モノクローナル抗体親和性のマト
リックス上でクロマトグラフィー処理してこれを精製
し、 （ｂ） 該クロマト処理した血液製剤を該モノクロナー
ル抗体親和性マトリックスから選ばれた化学的消毒剤の
バッファ溶液で溶出しもしくは消毒剤を含まない別の溶
離剤で溶出した後化学的消毒剤を添加し、 （ｃ） 実質的にすべてのウイルスが不活性化されるに
十分な時間該溶出混合物を静置し、 （ｄ） 必要ならば、透析により該化学的消毒剤を該活
性血液製剤から分離し、および （ｅ） 該血液製剤から、該不活性化されたウイルスお
よび活性なウイルスを物理的に除去する。
リックス上でクロマトグラフィー処理してこれを精製
し、 （ｂ） 該クロマト処理した血液製剤を該モノクロナー
ル抗体親和性マトリックスから選ばれた化学的消毒剤の
バッファ溶液で溶出しもしくは消毒剤を含まない別の溶
離剤で溶出した後化学的消毒剤を添加し、 （ｃ） 実質的にすべてのウイルスが不活性化されるに
十分な時間該溶出混合物を静置し、 （ｄ） 必要ならば、透析により該化学的消毒剤を該活
性血液製剤から分離し、および （ｅ） 該血液製剤から、該不活性化されたウイルスお
よび活性なウイルスを物理的に除去する。
このような手順によって、ウイルスを含まず、かつタ
ンパク変性のない血液タンパク含有組成物が得られる。
本明細書でいう血液タンパク含有組成物とは血液細胞
（例えば、ヘモグロビン、α−インタフェロン、Ｔ−細
胞成長因子、血小板由来の成長因子等）、プラスミノー
ゲン活性化因子、血漿、血漿画分、血漿沈殿物（例え
ば、低温沈殿物、エタノール沈殿物、又はポリエチレン
グリコール沈殿物）、または上澄液（例えば低温上澄
液、エタノール上澄液、またはポリエチレングリコール
上澄液）等を包含する。血液タンパク含有組成物は、IX
因子などの不安定血液タンパクが一種以上存在すること
により特徴付けられる。
ンパク変性のない血液タンパク含有組成物が得られる。
本明細書でいう血液タンパク含有組成物とは血液細胞
（例えば、ヘモグロビン、α−インタフェロン、Ｔ−細
胞成長因子、血小板由来の成長因子等）、プラスミノー
ゲン活性化因子、血漿、血漿画分、血漿沈殿物（例え
ば、低温沈殿物、エタノール沈殿物、又はポリエチレン
グリコール沈殿物）、または上澄液（例えば低温上澄
液、エタノール上澄液、またはポリエチレングリコール
上澄液）等を包含する。血液タンパク含有組成物は、IX
因子などの不安定血液タンパクが一種以上存在すること
により特徴付けられる。
上記方法は、II因子、VII因子、IX因子、Ｘ因子、プ
ロトロンビン、タンパクＣ、タンパクＳなどを包含する
ビタミンＫ−依存性タンパクを含む薬理組成物、特に高
い特異的活性を有する精製IX因子溶液に対してとりわけ
有用である。該不安定血液タンパクは感染性肝炎に対す
る抗体またはヒト免疫不全症ウイルスに対する抗体を含
むことができる。
ロトロンビン、タンパクＣ、タンパクＳなどを包含する
ビタミンＫ−依存性タンパクを含む薬理組成物、特に高
い特異的活性を有する精製IX因子溶液に対してとりわけ
有用である。該不安定血液タンパクは感染性肝炎に対す
る抗体またはヒト免疫不全症ウイルスに対する抗体を含
むことができる。
本発明の方法は、所定のタンパクの高い収率と高い純
度および特に他の凝固因子による比較的低い汚染率との
組合せを与える点で従来の方法に勝るものである。本発
明は取扱いが容易でしかも経済的な化学的手段と物理的
手段との組合せを提供し、かくして容易に利用できる最
終処方物を与える。本発明は、また不必要かつ高価な精
製処理を利用せず、しかも実質的に危険性のない使用の
容易な最終処方物を与える。
度および特に他の凝固因子による比較的低い汚染率との
組合せを与える点で従来の方法に勝るものである。本発
明は取扱いが容易でしかも経済的な化学的手段と物理的
手段との組合せを提供し、かくして容易に利用できる最
終処方物を与える。本発明は、また不必要かつ高価な精
製処理を利用せず、しかも実質的に危険性のない使用の
容易な最終処方物を与える。
発明の詳細な説明 本発明はウイルスで汚染されたタンパク質を含む組成
物、特に、例えばプロトロンビン複合体（第II因子、第
VII因子、第IX因子及び第Ｘ因子）及び寒冷沈降物（第
Ｉ因子及び第VIII因子）の如き血液タンパク質を含むウ
イルスで汚染されたタンパク質を含む組成物中のウイル
スの失活及び除去に関する。また、本発明は、一種以上
の血液タンパク質を含む血清；第II因子、第VII因子、
第IX因子、第Ｘ因子、フィブリノーゲン及び免疫グロブ
リン（例えば、IgG、IgM、等）の如き少なくとも一種の
血液タンパク質を含む血液タンパク質含有部分；並びに
細胞溶解産物または血液細胞中に透導されたタンパク質
に関する。更に特別には、本発明は脂質を含むウイルス
の失活及び除去、優先的にはＢ型肝炎ウイルス並びに非
Ａ型ウイルス、非Ｂ型ウイルスの失活及び除去に関す
る。
物、特に、例えばプロトロンビン複合体（第II因子、第
VII因子、第IX因子及び第Ｘ因子）及び寒冷沈降物（第
Ｉ因子及び第VIII因子）の如き血液タンパク質を含むウ
イルスで汚染されたタンパク質を含む組成物中のウイル
スの失活及び除去に関する。また、本発明は、一種以上
の血液タンパク質を含む血清；第II因子、第VII因子、
第IX因子、第Ｘ因子、フィブリノーゲン及び免疫グロブ
リン（例えば、IgG、IgM、等）の如き少なくとも一種の
血液タンパク質を含む血液タンパク質含有部分；並びに
細胞溶解産物または血液細胞中に透導されたタンパク質
に関する。更に特別には、本発明は脂質を含むウイルス
の失活及び除去、優先的にはＢ型肝炎ウイルス並びに非
Ａ型ウイルス、非Ｂ型ウイルスの失活及び除去に関す
る。
本法により失活、除去されるその他のウイルスは、例
えばサイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイル
ス、乳酸脱水素酵素ウイルス、ヘルペス群ウイルス、ラ
ブドウイルス、ロイコウイルス、ミクソウイルス、アル
ファウイルス、アルボウイルス（群Ｂ）、パラミクソウ
イルス、アレナウイルス、コロナリウイルス（coronari
viruses）及びヒト免疫不全ウイルス（HIV）を含む。
えばサイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイル
ス、乳酸脱水素酵素ウイルス、ヘルペス群ウイルス、ラ
ブドウイルス、ロイコウイルス、ミクソウイルス、アル
ファウイルス、アルボウイルス（群Ｂ）、パラミクソウ
イルス、アレナウイルス、コロナリウイルス（coronari
viruses）及びヒト免疫不全ウイルス（HIV）を含む。
好ましい方法は、タンパク質変性を生じないで、不安
定血液タンパク質及びウイルスを含む血液製剤のウイル
スを失活し除去する。
定血液タンパク質及びウイルスを含む血液製剤のウイル
スを失活し除去する。
それは、 （ａ） 血液製剤をモノクローナル抗体アフィニティー
マトリックスでクロマトグラフィーにかける工程； （ｂ） クロマトグラフィーにかけた血液製剤をモノク
ローナル抗体アフィニティーマトリックスから有効量の
選択された化学消毒剤で溶離する工程； （ｃ） 実質的に全てのウイルスを失活するのに充分な
期間にわたって特別な温度で溶離混合物を放置する工
程； （ｄ） 所望により、透析により活性血液製剤から化学
消毒剤を分離する工程；及び （ｅ） 失活したウイルス及び活性ウイルスを血液製剤
から物理的に除去する工程 を含む。
マトリックスでクロマトグラフィーにかける工程； （ｂ） クロマトグラフィーにかけた血液製剤をモノク
ローナル抗体アフィニティーマトリックスから有効量の
選択された化学消毒剤で溶離する工程； （ｃ） 実質的に全てのウイルスを失活するのに充分な
期間にわたって特別な温度で溶離混合物を放置する工
程； （ｄ） 所望により、透析により活性血液製剤から化学
消毒剤を分離する工程；及び （ｅ） 失活したウイルス及び活性ウイルスを血液製剤
から物理的に除去する工程 を含む。
化学消毒剤は、有機溶剤／洗剤の組合せのような、脂
質を含むウイルスを実質的に失活することが知られてい
る薬剤またはチオシアン酸ナトリウムのような、ウイル
ス型に対して殆ど特異性のない薬剤のリストから選ぶこ
とができる。
質を含むウイルスを実質的に失活することが知られてい
る薬剤またはチオシアン酸ナトリウムのような、ウイル
ス型に対して殆ど特異性のない薬剤のリストから選ぶこ
とができる。
チオシアン酸ナトリウムは本発明に使用するのに好ま
しい化学消毒剤であり、約0.5M〜約6M、好ましくは約0.
5M〜約2M、更に好ましくは約1.5M〜2Mの量で使用され
る。
しい化学消毒剤であり、約0.5M〜約6M、好ましくは約0.
5M〜約2M、更に好ましくは約1.5M〜2Mの量で使用され
る。
血液製剤から失活ウイルス及び活性ウイルスを除去す
るための物理手段は、限外濾過、超遠心分離機及び電気
泳動からなる群から選ばれる。好ましい物理手段は限外
濾過である。
るための物理手段は、限外濾過、超遠心分離機及び電気
泳動からなる群から選ばれる。好ましい物理手段は限外
濾過である。
本発明の好ましい方法の他に、血液製剤をウイルスを
含まないようにする別の方法がある。第一の別法は、物
理手段を使用しないで化学手段のみを使用する。このよ
うな方法は不純な血液製剤を化学消毒剤のみと接触させ
ることを含む。第二の別法はまず物理手段を使用し、続
いて化学消毒剤で失活させ、ついで必要により失活ウイ
ルス及び活性ウイルスの両方を除去するための物理手段
を使用する。
含まないようにする別の方法がある。第一の別法は、物
理手段を使用しないで化学手段のみを使用する。このよ
うな方法は不純な血液製剤を化学消毒剤のみと接触させ
ることを含む。第二の別法はまず物理手段を使用し、続
いて化学消毒剤で失活させ、ついで必要により失活ウイ
ルス及び活性ウイルスの両方を除去するための物理手段
を使用する。
第三の別法は、 （ａ） 血液製剤をモノクローナル抗体アフィニティー
マトリックスでクロマトグラフィーにかけてそれを精製
する工程； （ｂ） クロマトグラフィーにかけた血清製剤を選択さ
れた化学消毒剤でモノクローナルアフィニティマトリッ
クスから溶離する工程； （ｃ） 化学消毒剤との更なる接触を省く工程；及び （ｄ） 精製された活性血液製剤を回収するように失活
ウイルス及び活性ウイルスを物理手段により分離する工
程 を含む。
マトリックスでクロマトグラフィーにかけてそれを精製
する工程； （ｂ） クロマトグラフィーにかけた血清製剤を選択さ
れた化学消毒剤でモノクローナルアフィニティマトリッ
クスから溶離する工程； （ｃ） 化学消毒剤との更なる接触を省く工程；及び （ｄ） 精製された活性血液製剤を回収するように失活
ウイルス及び活性ウイルスを物理手段により分離する工
程 を含む。
第四の別法は、 （ａ） 血液製剤をモノクローナル抗体アフィニティー
マトリックスでクロマトグラフィーにかけてそれを精製
する工程； （ｂ） 非消毒剤溶離剤で溶離し、続いて化学消毒剤を
添加する工程； （ｃ） 溶離した混合物を、実質的に全てのウイルスを
失活させるのに充分な時間にわたって放置する工程；及
び （ｄ） 必要により、血液製剤から失活ウイルス及び活
性ウイルスを物理的に除去する工程 を含む。
マトリックスでクロマトグラフィーにかけてそれを精製
する工程； （ｂ） 非消毒剤溶離剤で溶離し、続いて化学消毒剤を
添加する工程； （ｃ） 溶離した混合物を、実質的に全てのウイルスを
失活させるのに充分な時間にわたって放置する工程；及
び （ｄ） 必要により、血液製剤から失活ウイルス及び活
性ウイルスを物理的に除去する工程 を含む。
化学消毒剤による血液タンパク質を含む組成物の処理
は約４〜25℃、好ましくは４℃の温度で行なわれる。血
液タンパク質を含む組成物と化学消毒剤との接触は約１
〜2.5時間、好ましくは少なくとも約１時間である。
は約４〜25℃、好ましくは４℃の温度で行なわれる。血
液タンパク質を含む組成物と化学消毒剤との接触は約１
〜2.5時間、好ましくは少なくとも約１時間である。
通常、化学処理後に、化学消毒剤は除去されるが、こ
れはウイルス失活剤の性質及び血漿タンパク質を含む組
成物の意図される更なる処理に応じて必ずしも全ての場
合に必要ではない。
れはウイルス失活剤の性質及び血漿タンパク質を含む組
成物の意図される更なる処理に応じて必ずしも全ての場
合に必要ではない。
本発明の最も好ましい実施態様に於いて、血液製剤は
モノクローナル抗体アフィニティマトリックスによるク
ロマトグラフィー分離により精製され、ついでウイルス
を死滅するのに充分な時間にわたってチオシアン酸ナト
リウムで処理され、ついでウイルスを保持するのに有効
な細孔サイズ、例えば約100,000ダルトンの排除限界及
び適切な流量を維持するのに充分な圧力、例えば約0.35
Kg/cm2（5p.s.i.）を有する膜を用いて少なくとも１回
限外濾過される。
モノクローナル抗体アフィニティマトリックスによるク
ロマトグラフィー分離により精製され、ついでウイルス
を死滅するのに充分な時間にわたってチオシアン酸ナト
リウムで処理され、ついでウイルスを保持するのに有効
な細孔サイズ、例えば約100,000ダルトンの排除限界及
び適切な流量を維持するのに充分な圧力、例えば約0.35
Kg/cm2（5p.s.i.）を有する膜を用いて少なくとも１回
限外濾過される。
血液製剤（ここで使用される例は第IX因子である）が
モノクローナル抗体アフィニティーマトリックスによる
クロマトグラフィーにより予備精製される場合、タンパ
ク質1mg当り190単位程度に高い特異的活性を得ることが
できる。チオシアン酸ナトリウム処理はチオシアン酸ナ
トリウム溶液を使用してマトリックスから組成物を溶離
し、ついでウイルスを死滅するのに充分な時間にわたっ
て混合物を放置することにより都合よく行なうことがで
きる。
モノクローナル抗体アフィニティーマトリックスによる
クロマトグラフィーにより予備精製される場合、タンパ
ク質1mg当り190単位程度に高い特異的活性を得ることが
できる。チオシアン酸ナトリウム処理はチオシアン酸ナ
トリウム溶液を使用してマトリックスから組成物を溶離
し、ついでウイルスを死滅するのに充分な時間にわたっ
て混合物を放置することにより都合よく行なうことがで
きる。
夫々のこれらの工程、即ち、予備精製、化学滅菌、及
び保持濾過はウイルス感染性を減少するのに非常に有効
である。一緒に使用される場合、ウイルス安全限外濾過
物が得られるべきである。実質的に不完全なウイルスま
たはウイルス成分は、それらの分子量及び直径に応じて
有効に除去されてもよく、また除去されなくてもよい。
しかしながら、このような不完全粒子または欠損粒子は
宿主中で感染性であるとは予想されない。第IX因子の更
なる精製は、所望により、アミノ−ヘキシルセファロー
スによるクロマトグラフィーにより行なわれてもよい。
び保持濾過はウイルス感染性を減少するのに非常に有効
である。一緒に使用される場合、ウイルス安全限外濾過
物が得られるべきである。実質的に不完全なウイルスま
たはウイルス成分は、それらの分子量及び直径に応じて
有効に除去されてもよく、また除去されなくてもよい。
しかしながら、このような不完全粒子または欠損粒子は
宿主中で感染性であるとは予想されない。第IX因子の更
なる精製は、所望により、アミノ−ヘキシルセファロー
スによるクロマトグラフィーにより行なわれてもよい。
血友病Ｂの治療に有効な薬理組成物である第IX凝固因
子は、じかに関心があるが、排他的な関心があるもので
はない。100Kダルトン未満の分子量を有する第IX因子
は、分子の大きさが60K〜70Kダルトンの範囲内にある第
II因子、第VII因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテ
インＳ等を含むビタミンＫ依存性凝固因子の系統群の一
員である。第IX因子の如き凝固因子はヒト血漿から調製
され、幾つかの潜在的に感染性のウイルス及び有害ウイ
ルスにより汚染されることがある。主に関係するウイル
ス粒子はＢ型肝炎ウイルス及びHIVであり、これらは夫
々42nm及び100nmの直径を有する。示されるように、こ
れらのウイルス粒子の直径は、XM300膜またはXM100膜の
いずれかによる限外濾過が、第IX凝固因子またはその他
の薬理製品からそれらを有効に除去するような直径であ
る。現在の知識によれば、それはまた非Ａ型肝炎ウイル
ス及び非Ｂ型肝炎ウイルスの予想される特性である。
子は、じかに関心があるが、排他的な関心があるもので
はない。100Kダルトン未満の分子量を有する第IX因子
は、分子の大きさが60K〜70Kダルトンの範囲内にある第
II因子、第VII因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテ
インＳ等を含むビタミンＫ依存性凝固因子の系統群の一
員である。第IX因子の如き凝固因子はヒト血漿から調製
され、幾つかの潜在的に感染性のウイルス及び有害ウイ
ルスにより汚染されることがある。主に関係するウイル
ス粒子はＢ型肝炎ウイルス及びHIVであり、これらは夫
々42nm及び100nmの直径を有する。示されるように、こ
れらのウイルス粒子の直径は、XM300膜またはXM100膜の
いずれかによる限外濾過が、第IX凝固因子またはその他
の薬理製品からそれらを有効に除去するような直径であ
る。現在の知識によれば、それはまた非Ａ型肝炎ウイル
ス及び非Ｂ型肝炎ウイルスの予想される特性である。
本法は第VIII因子、γ−グロブリン、第IX因子または
プロトロンビン複合体（第II因子、第VII因子、第IX因
子及び第Ｘ因子）、フィブリノーゲンの如き血液製剤誘
導体並びにこのような規格に適した特性を有するあらゆ
るその他の血液誘導体の調製を可能にし、これらの全て
の誘導体は残留の感染性肝炎ウイルスまたはその他のウ
イルスを殆ど含まないか、または全く含まない。
プロトロンビン複合体（第II因子、第VII因子、第IX因
子及び第Ｘ因子）、フィブリノーゲンの如き血液製剤誘
導体並びにこのような規格に適した特性を有するあらゆ
るその他の血液誘導体の調製を可能にし、これらの全て
の誘導体は残留の感染性肝炎ウイルスまたはその他のウ
イルスを殆ど含まないか、または全く含まない。
上記の同じ操作工程により、正常細胞または癌細胞の
製剤中に存在するウイルスはこのような製剤に於いて不
安定タンパク質活性を保持しながら失活させることがで
きる。例えば、同じ化学失活処理により、正常細胞また
は癌細胞を使用して生成された製剤、正常細胞または癌
細胞からの滲出物、ハイブリドーマ及び遺伝子スプライ
シングにより生成された製剤を失活させることができ
る。このような処理は所望のタンパク質に実質的に悪影
響を及ぼさない。所望のタンパク質の生成に使用される
細胞は、勿論、哺乳類細胞並びに非哺乳類細胞であり得
る。
製剤中に存在するウイルスはこのような製剤に於いて不
安定タンパク質活性を保持しながら失活させることがで
きる。例えば、同じ化学失活処理により、正常細胞また
は癌細胞を使用して生成された製剤、正常細胞または癌
細胞からの滲出物、ハイブリドーマ及び遺伝子スプライ
シングにより生成された製剤を失活させることができ
る。このような処理は所望のタンパク質に実質的に悪影
響を及ぼさない。所望のタンパク質の生成に使用される
細胞は、勿論、哺乳類細胞並びに非哺乳類細胞であり得
る。
本発明は、本発明の精神または必須の特性から逸脱し
ないで、その他の特別な形態に於いて具体化し得る。
ないで、その他の特別な形態に於いて具体化し得る。
本発明の効果を評価する方法 タンパク質を含む巨大分子の大きさは、質量単位に於
ける分子量によりしばしば特定され、その分子量により
表される。また、1000ダルトン（1Kダルトン）の分子量
を有する分子は、１モルの純粋分子が1000gの重量であ
るという記述により説明し得る。（本件出願に関して、
タンパク質分子の分子量よりもむしろそれらの物理寸法
を参照することが更に一層便利である。） タンパク質分子は共有結合アミノ酸の線状の鎖であ
る。溶液中で、これらの鎖は特別な方法でコイル状にな
り、再度折りたたまれ、そして適当な技術により視覚化
される場合、圧密の球体、楕円、棒状体または繊維であ
ると見られる。個々の分子種の形状を予測する科学は造
形的であるが、形状は既知の物理的方法により測定し得
る。強い偏りが正確な測定により決定され、これの影響
が説明されるまで、専門家は分子の形状が球体であると
推定する。ダルトンで表される重量による分子の大きさ
が既知の技術により測定され、且つタンパク質折り重ね
（folding）の密集度（compactness）（密度）が得られ
る場合には、球形粒子の分子寸法の計算が簡単な幾何学
により決定し得る。累積測定に基いて、タンパク質分子
の粒子密度が変化し夫々のタンパク質に関して特有であ
り得ることがわかる。しかしながら、その変化は一般に
は大きくなく、平均値または典型的な値が大きな誤差な
しに使用し得る。これは密度の逆数である部分比容積
（ｖ）として通常表わされる。タンパク質の典型的な比
容積は0.75cc/gmである。こうして、以下の実施例に関
して、ダルトンの単位の定義を用いて、分子量100,000
ダルトンのタンパク質分子は、タンパク質の6.023×10
23個の分子当り155gの重量である。公称の部分比容積0.
75cc/gを用いて、このタンパク質の単一分子により占め
られる容積は0.1245×10-18cm3である。球体の容積に関
する式から、タンパク質の直径6.2nmが計算される。10
0,000ダルトンの排除限界を有する限外濾過膜は、理論
上、100,000ダルトン未満の分子量の成分の薬理組成物
から6.2nmを越える直径を有するウイルス粒子を除去す
べきである。
ける分子量によりしばしば特定され、その分子量により
表される。また、1000ダルトン（1Kダルトン）の分子量
を有する分子は、１モルの純粋分子が1000gの重量であ
るという記述により説明し得る。（本件出願に関して、
タンパク質分子の分子量よりもむしろそれらの物理寸法
を参照することが更に一層便利である。） タンパク質分子は共有結合アミノ酸の線状の鎖であ
る。溶液中で、これらの鎖は特別な方法でコイル状にな
り、再度折りたたまれ、そして適当な技術により視覚化
される場合、圧密の球体、楕円、棒状体または繊維であ
ると見られる。個々の分子種の形状を予測する科学は造
形的であるが、形状は既知の物理的方法により測定し得
る。強い偏りが正確な測定により決定され、これの影響
が説明されるまで、専門家は分子の形状が球体であると
推定する。ダルトンで表される重量による分子の大きさ
が既知の技術により測定され、且つタンパク質折り重ね
（folding）の密集度（compactness）（密度）が得られ
る場合には、球形粒子の分子寸法の計算が簡単な幾何学
により決定し得る。累積測定に基いて、タンパク質分子
の粒子密度が変化し夫々のタンパク質に関して特有であ
り得ることがわかる。しかしながら、その変化は一般に
は大きくなく、平均値または典型的な値が大きな誤差な
しに使用し得る。これは密度の逆数である部分比容積
（ｖ）として通常表わされる。タンパク質の典型的な比
容積は0.75cc/gmである。こうして、以下の実施例に関
して、ダルトンの単位の定義を用いて、分子量100,000
ダルトンのタンパク質分子は、タンパク質の6.023×10
23個の分子当り155gの重量である。公称の部分比容積0.
75cc/gを用いて、このタンパク質の単一分子により占め
られる容積は0.1245×10-18cm3である。球体の容積に関
する式から、タンパク質の直径6.2nmが計算される。10
0,000ダルトンの排除限界を有する限外濾過膜は、理論
上、100,000ダルトン未満の分子量の成分の薬理組成物
から6.2nmを越える直径を有するウイルス粒子を除去す
べきである。
HIVウイルス減少方法を解明するために行なわれる多
くの実験はウイルスに感染されると知られている培養細
胞からの上澄組織培地を（ウイルス接種源）としてしば
しば使用していた。これらの培地はウイルス減少を試験
するために処理されている培地と同じ化学組成をもたな
い。殆どの培地は、実際には、栄養増殖補足物として10
％程度の多量のウシ胎児血清を含む。精製／処理系を接
種するのに直接使用される場合、研究者は（ａ）添加さ
れた組織培養成分のあらゆる効果が接種源対処理系の小
さい比、例えば1:10の使用により最小にされること、ま
たは（ｂ）添加成分の効果が、あらゆる状況で、無視し
得ることを結言するように強要される。この方法が適当
に避け得る場合には、これらの結論のいずれもが容認さ
れない。
くの実験はウイルスに感染されると知られている培養細
胞からの上澄組織培地を（ウイルス接種源）としてしば
しば使用していた。これらの培地はウイルス減少を試験
するために処理されている培地と同じ化学組成をもたな
い。殆どの培地は、実際には、栄養増殖補足物として10
％程度の多量のウシ胎児血清を含む。精製／処理系を接
種するのに直接使用される場合、研究者は（ａ）添加さ
れた組織培養成分のあらゆる効果が接種源対処理系の小
さい比、例えば1:10の使用により最小にされること、ま
たは（ｂ）添加成分の効果が、あらゆる状況で、無視し
得ることを結言するように強要される。この方法が適当
に避け得る場合には、これらの結論のいずれもが容認さ
れない。
感染性HIVの直接源としての細胞培地の使用に関し
て、更に技術上（及び実験設計上）の難点がある。感染
組織培養細胞は感染性ウイルス（上澄増殖培地中）の力
価105〜108TCID50（組織培養アッセイに於ける50％の感
染供与量）を生じることが一般に知られている。殆どの
論文は、この範囲の下限が上限よりも通常であることを
示す。感染力価を検出し測定するのに使用される全ての
アッセイ系は検出感度の下限を有する。プラーク形成性
ではないウイルスに関して普通使用されるTCID50アッセ
イの定義により、最低の陽性アッセイはアッセイ試料の
容積当り1TCID50である。使用される適用に於いて、測
定される試験物質の容積に応じて、あらゆる研究者のア
ッセイの感度は試験試料1m当り100未満から102ID50ま
で変化し得る。（その他の型のアッセイ系がHIVに関し
て記載された。多くの発表論文は、一層低い感度を示
す。上記と比較して、アッセイ試料1m当102ID50に相
当する感度限界は別のアッセイ法に関して異常ではな
い）。
て、更に技術上（及び実験設計上）の難点がある。感染
組織培養細胞は感染性ウイルス（上澄増殖培地中）の力
価105〜108TCID50（組織培養アッセイに於ける50％の感
染供与量）を生じることが一般に知られている。殆どの
論文は、この範囲の下限が上限よりも通常であることを
示す。感染力価を検出し測定するのに使用される全ての
アッセイ系は検出感度の下限を有する。プラーク形成性
ではないウイルスに関して普通使用されるTCID50アッセ
イの定義により、最低の陽性アッセイはアッセイ試料の
容積当り1TCID50である。使用される適用に於いて、測
定される試験物質の容積に応じて、あらゆる研究者のア
ッセイの感度は試験試料1m当り100未満から102ID50ま
で変化し得る。（その他の型のアッセイ系がHIVに関し
て記載された。多くの発表論文は、一層低い感度を示
す。上記と比較して、アッセイ試料1m当102ID50に相
当する感度限界は別のアッセイ法に関して異常ではな
い）。
次に、ウイルス減少機構の有効性に関する実証の有効
限界について考慮する。接種源が105〜108以下の力価で
あり、接種源容積が試験処理組成物の1:10であったなら
ば、減少実験の初期ウイルス力価は104〜107より高くな
いであろう。アッセイ系の選択に用いられる任意に応じ
て、“検出不能”として見られる最終ウイルス力価は10
2個程度に多量の感染性ウイルスを含み得る。適切に表
わして（検出不能値が潜在的に０であったことを不当に
強調しないで）、実証し得る減少は102〜105ID50以下で
ある。
限界について考慮する。接種源が105〜108以下の力価で
あり、接種源容積が試験処理組成物の1:10であったなら
ば、減少実験の初期ウイルス力価は104〜107より高くな
いであろう。アッセイ系の選択に用いられる任意に応じ
て、“検出不能”として見られる最終ウイルス力価は10
2個程度に多量の感染性ウイルスを含み得る。適切に表
わして（検出不能値が潜在的に０であったことを不当に
強調しないで）、実証し得る減少は102〜105ID50以下で
ある。
ここで、設計及び行動の異なる過程は、このウイルス
減少が他者により実証されたものよりはるかに有効であ
ることを実証するように選ばれた。血液製剤の調製の安
全限界が“最悪の場合”のシナリオに概念に対して測定
し得ることが最初に推測された（ペトリチアニ（Petric
ciani）、J.C.ら著、“Case for Concluding That Heat
Treated、Licensed、Antihemophilic Factor is Free
from HTLV−III"、Lancet II:890〜891頁、1985年を参
照のこと）。（註:HTLV−III＝HIV−１）。最悪の場合
には、ウイルス減少処理が使用されなかったならば、凝
固因子濃度は２×105（約5.5log10）の力価をもつこと
ができた。この概算の統計上の処理は、患者が寿命中に
２×105の投与量またはそれに近い投与量を受ける場合
には、更に高い安全限界が必要とされることを示唆す
る。何となれば、凝固因子は慢性使用薬であるからであ
る。こうして、一群の例として、ニューラス（Neurat
h）らの米国特許第4,764,369号、ニューラスらの米国特
許第4,540,573号、及びニューラスらの米国特許第4,82
0,805号（これらの特許の開示が参考として含まれる）
（これらは全て、ペトリチアニらにより記載された安全
限界をかろうじて示す）に記載されたモデルウイルス研
究に関して記載される減少は、慢性使用により必要とさ
れる一層高い安全限界を示すのに不充分である。本願の
場合には、HIVウイルスは超遠心分離により部分精製さ
れ濃縮されて組織培地成分を実質的に含まない。ウイル
スは研究下にある処理液体と適合性であるように選ばれ
た緩衝剤組成物中に懸濁される。本実験をその方法の専
門技術との比較に関して疑わしくする化学的な不安原因
（ウイルス以外）はない。1m当り1010〜1012ID50の濃
縮力価が得られる。この特徴はニューラスらの米国特許
第4,764,369号、ニューラスらの米国特許第4,540,573
号、及びニューラスらの米国特許第4,820,805号に記載
されたウイルスの如きその他のウイルスに容易に適用さ
れる。
減少が他者により実証されたものよりはるかに有効であ
ることを実証するように選ばれた。血液製剤の調製の安
全限界が“最悪の場合”のシナリオに概念に対して測定
し得ることが最初に推測された（ペトリチアニ（Petric
ciani）、J.C.ら著、“Case for Concluding That Heat
Treated、Licensed、Antihemophilic Factor is Free
from HTLV−III"、Lancet II:890〜891頁、1985年を参
照のこと）。（註:HTLV−III＝HIV−１）。最悪の場合
には、ウイルス減少処理が使用されなかったならば、凝
固因子濃度は２×105（約5.5log10）の力価をもつこと
ができた。この概算の統計上の処理は、患者が寿命中に
２×105の投与量またはそれに近い投与量を受ける場合
には、更に高い安全限界が必要とされることを示唆す
る。何となれば、凝固因子は慢性使用薬であるからであ
る。こうして、一群の例として、ニューラス（Neurat
h）らの米国特許第4,764,369号、ニューラスらの米国特
許第4,540,573号、及びニューラスらの米国特許第4,82
0,805号（これらの特許の開示が参考として含まれる）
（これらは全て、ペトリチアニらにより記載された安全
限界をかろうじて示す）に記載されたモデルウイルス研
究に関して記載される減少は、慢性使用により必要とさ
れる一層高い安全限界を示すのに不充分である。本願の
場合には、HIVウイルスは超遠心分離により部分精製さ
れ濃縮されて組織培地成分を実質的に含まない。ウイル
スは研究下にある処理液体と適合性であるように選ばれ
た緩衝剤組成物中に懸濁される。本実験をその方法の専
門技術との比較に関して疑わしくする化学的な不安原因
（ウイルス以外）はない。1m当り1010〜1012ID50の濃
縮力価が得られる。この特徴はニューラスらの米国特許
第4,764,369号、ニューラスらの米国特許第4,540,573
号、及びニューラスらの米国特許第4,820,805号に記載
されたウイルスの如きその他のウイルスに容易に適用さ
れる。
実験設計のこの注意深い先行事情は、依然として実験
限界を表わす。多工程ウイルス減少法のいずれかの工程
がウイルス力価をこの一層高い限界に減少するように著
しく有効である場合（100未満の感度であるアッセイ系
でもって）、多工程系の全有効性は単一の実験で研究し
得ない。最善の科学設計に関して、理想的には、単一の
処理工程を行なう前に測定される初期力価は、残留ウイ
ルスが処理工程後に存在するように充分高いものである
べきである。こうして、減少の良く特定されたインクレ
メントが規定し得る。残留力価がその後の工程に挑戦す
るのに不充分であり、その工程の終了時に残留ウイルス
を再度確保する場合、第二工程の特定される限界は規定
し得ない。この組合せ法に於いて、二つの処理工程の夫
々は、格別濃縮されたウイルス濃厚物を使用という注意
を更に払って、適当に得ることができる最大値に実質的
に相当する力価の減少を与える。本発明者らの実験に於
いて、ウイルス減少潜在能力の本発明者らの研究室内の
実証に使用した初期力価は治療製剤を調製する実際の実
施中にタンパク質組成物の偶発の汚染により予想し得た
ものを越える多くのlog10である（C.F.ペトリチアニ、
らの文献を参照のこと）。これは本発明の実施に於いて
安全の広い限界を示し、慢性薬使用の統計上の分析によ
り必要とされる安全の特別な限界を可能にする。
限界を表わす。多工程ウイルス減少法のいずれかの工程
がウイルス力価をこの一層高い限界に減少するように著
しく有効である場合（100未満の感度であるアッセイ系
でもって）、多工程系の全有効性は単一の実験で研究し
得ない。最善の科学設計に関して、理想的には、単一の
処理工程を行なう前に測定される初期力価は、残留ウイ
ルスが処理工程後に存在するように充分高いものである
べきである。こうして、減少の良く特定されたインクレ
メントが規定し得る。残留力価がその後の工程に挑戦す
るのに不充分であり、その工程の終了時に残留ウイルス
を再度確保する場合、第二工程の特定される限界は規定
し得ない。この組合せ法に於いて、二つの処理工程の夫
々は、格別濃縮されたウイルス濃厚物を使用という注意
を更に払って、適当に得ることができる最大値に実質的
に相当する力価の減少を与える。本発明者らの実験に於
いて、ウイルス減少潜在能力の本発明者らの研究室内の
実証に使用した初期力価は治療製剤を調製する実際の実
施中にタンパク質組成物の偶発の汚染により予想し得た
ものを越える多くのlog10である（C.F.ペトリチアニ、
らの文献を参照のこと）。これは本発明の実施に於いて
安全の広い限界を示し、慢性薬使用の統計上の分析によ
り必要とされる安全の特別な限界を可能にする。
こうして、二つの連続減少工程の合計の減少数値は、
夫々が独立に有効性を測定する本発明者らの能力の限界
にある場合には、規定し得ないが、高い効能のウイルス
減少機構の使用される重剰性が予測し得る。エレクトロ
ニクスの如き、その他の技術に於いて、重剰性の概念が
使用中のフェイルセイフ操作の確保の水準を増大するの
に使用される。この概念は血漿タンパク質治療に於ける
ウイルス伝染からの安全の確保に関して従来認識されて
いなかった。
夫々が独立に有効性を測定する本発明者らの能力の限界
にある場合には、規定し得ないが、高い効能のウイルス
減少機構の使用される重剰性が予測し得る。エレクトロ
ニクスの如き、その他の技術に於いて、重剰性の概念が
使用中のフェイルセイフ操作の確保の水準を増大するの
に使用される。この概念は血漿タンパク質治療に於ける
ウイルス伝染からの安全の確保に関して従来認識されて
いなかった。
実施例１ 限外濾過によるウイルスの除去 第IX因子に対して特異的なモノクローナル抗体アフィ
ニティーマトリックスによるクロマトグラフィーによ
り、精製第IX因子をプロサー（PROTHAR、商標）から得
た。それは溶液1m当り約0.065mgのタンパク質及び８
単位の第IX因子活性を含んでいた。アミコンXM300膜及
び0.35Kg/cm2（5p.s.i.）の圧力を用いて、精製製剤を
限外濾過した。限外濾過は非常に迅速に進行した（約2.
5m／分）。その後、濾液をアミコンXM100膜で再度濾
過した。最終限外濾液中の第IX因子の活性は67％であっ
た。特定の活性が変化されなかったので、損失は第IX因
子の失活の結果ではなかった。
ニティーマトリックスによるクロマトグラフィーによ
り、精製第IX因子をプロサー（PROTHAR、商標）から得
た。それは溶液1m当り約0.065mgのタンパク質及び８
単位の第IX因子活性を含んでいた。アミコンXM300膜及
び0.35Kg/cm2（5p.s.i.）の圧力を用いて、精製製剤を
限外濾過した。限外濾過は非常に迅速に進行した（約2.
5m／分）。その後、濾液をアミコンXM100膜で再度濾
過した。最終限外濾液中の第IX因子の活性は67％であっ
た。特定の活性が変化されなかったので、損失は第IX因
子の失活の結果ではなかった。
実施例２ パートＡ−ウイルス原液の調製 CEM細胞を約１の感染多重度で感染することによりウ
イルス原液濃厚物を調製した。10％のウシ胎児血清、ペ
ニシリン、ストレプトマイシン、及び0.002mg/mのポ
リブレンで補足されるような充分のRPMI1640培地約450m
を含む490cm2のコーニング（Corning）ローラーびん
中で培養を確立した。感染４日後に培養液中得られた最
高細胞密度は１×106個の細胞/mであり、この時点で
培養液を新しい培地で半分に希釈した。培養液の全容量
は180mであった。保温培養を更に３日間続け、その時
広範な細胞病理を観察した。培養液を1.2μＭの酢酸セ
ルロースフィルターで濾過した。ウイルスを、４℃で４
時間にわたって61,000×ｇで遠心分離により濾液からペ
レット化した。ペレット化ウイルスをPBS（食塩加リン
酸緩衝液）で再懸濁した。原液は1m当り10log10より
大きいID50を含んでいた。
イルス原液濃厚物を調製した。10％のウシ胎児血清、ペ
ニシリン、ストレプトマイシン、及び0.002mg/mのポ
リブレンで補足されるような充分のRPMI1640培地約450m
を含む490cm2のコーニング（Corning）ローラーびん
中で培養を確立した。感染４日後に培養液中得られた最
高細胞密度は１×106個の細胞/mであり、この時点で
培養液を新しい培地で半分に希釈した。培養液の全容量
は180mであった。保温培養を更に３日間続け、その時
広範な細胞病理を観察した。培養液を1.2μＭの酢酸セ
ルロースフィルターで濾過した。ウイルスを、４℃で４
時間にわたって61,000×ｇで遠心分離により濾液からペ
レット化した。ペレット化ウイルスをPBS（食塩加リン
酸緩衝液）で再懸濁した。原液は1m当り10log10より
大きいID50を含んでいた。
パートＢ−NaSCN処理によるウイルスの失活 第IX因子を3MのNaSCNでモノクローナル抗体アフィニ
ティーマトリックスから溶離し、その後セファデックス
G10で脱塩した。上記のHIV原液1mを第IX溶液20mと
混合し、得られた混合物2mを、表IIに示される種々の
量の6Mのチオシアン酸ナトリウム（NaSCN）及び緩衝剤
（0.01Mのトリス−HCl及び0.02MのEDTA、pH8.0）に添加
して適当なNaSCN濃度を得た。
ティーマトリックスから溶離し、その後セファデックス
G10で脱塩した。上記のHIV原液1mを第IX溶液20mと
混合し、得られた混合物2mを、表IIに示される種々の
量の6Mのチオシアン酸ナトリウム（NaSCN）及び緩衝剤
（0.01Mのトリス−HCl及び0.02MのEDTA、pH8.0）に添加
して適当なNaSCN濃度を得た。
試料Ａ、Ｂ及びＣを４℃で１時間放置し、試料Ｄを25
℃で１時間放置した。その後、各試料を105,000×ｇで9
0分間遠心分離した。ペレットをPBS1m中で再懸濁し、
CEM細胞に対するウイルスの細胞変性効果の直接観察に
よりHIVに関して分析した。この実施例に使用したアッ
セイ方法は力価をほぼ0.5logインクレメントまで概数で
表わす。結果を表IIIに示す。
℃で１時間放置した。その後、各試料を105,000×ｇで9
0分間遠心分離した。ペレットをPBS1m中で再懸濁し、
CEM細胞に対するウイルスの細胞変性効果の直接観察に
よりHIVに関して分析した。この実施例に使用したアッ
セイ方法は力価をほぼ0.5logインクレメントまで概数で
表わす。結果を表IIIに示す。
（処理前の各試料の初期ウイルス力価は9log10であっ
た。） 結果は、チオシアン酸ナトリウム処理がHIVの8logを
失活したことを示す。更に、結果は、約1.5より高い濃
度がそれ程有効ではなかったこと、緩衝剤の使用が必要
とされなかったこと（試料Ｃを参照のこと）及び４℃、
25℃の両方に於ける処理が有効であったことを示す。
た。） 結果は、チオシアン酸ナトリウム処理がHIVの8logを
失活したことを示す。更に、結果は、約1.5より高い濃
度がそれ程有効ではなかったこと、緩衝剤の使用が必要
とされなかったこと（試料Ｃを参照のこと）及び４℃、
25℃の両方に於ける処理が有効であったことを示す。
実施例３ パートＡ−ウイルス原液の調製 CEM細胞を約１の感染多重度で感染することによりウ
イルス原液濃厚物を調製した。10％のウシ胎児血清、ペ
ニシリン、ストレプトマイシン、及び0.002mg/mのポ
リブレンで補足されるような充分のRPMI1640培地約450m
を含む490cm2のコーニングローラーびん中で培養を確
立した。感染４日後に培養液中に得られた最高細胞密度
は１×106個の細胞/mであり、この時点で培養液を新
しい培地で半分に希釈した。培養液の全容量は1800m
であった。保温培地を更に３日間続け、その時広範な細
胞病理を観察した。培養液を1.2μＭの酢酸セルロース
フィルターで濾過した。ウイルスを、４℃で４時間にわ
たって61,000×ｇで遠心分離により濾液からペレット化
した。ペレット化ウイルスをPBS（食塩加リン酸緩衝
液）で再懸濁した。原液は1m当り11log10より大きいI
D50を含んでいた。
イルス原液濃厚物を調製した。10％のウシ胎児血清、ペ
ニシリン、ストレプトマイシン、及び0.002mg/mのポ
リブレンで補足されるような充分のRPMI1640培地約450m
を含む490cm2のコーニングローラーびん中で培養を確
立した。感染４日後に培養液中に得られた最高細胞密度
は１×106個の細胞/mであり、この時点で培養液を新
しい培地で半分に希釈した。培養液の全容量は1800m
であった。保温培地を更に３日間続け、その時広範な細
胞病理を観察した。培養液を1.2μＭの酢酸セルロース
フィルターで濾過した。ウイルスを、４℃で４時間にわ
たって61,000×ｇで遠心分離により濾液からペレット化
した。ペレット化ウイルスをPBS（食塩加リン酸緩衝
液）で再懸濁した。原液は1m当り11log10より大きいI
D50を含んでいた。
パートＢ−限外濾過によるウイルスの除去 HIV原液（HIV＝ヒト免疫不全ウイルス、LAN−Ｉ株）5
mを、アフィニティー精製されセファデックスG10で脱
塩された第IX因子溶液45mに添加した。その混合物
を、XM100膜（6.2nmの細孔直径）が外側に取りつけられ
たアミコン攪拌セル（180mの容量）に注ぎ、ほぼ乾燥
するまで限外濾過した。その後、そのユニットを0.05M
の塩化ナトリウム（NaCl）、0.0005Mのヒスチジン、pH
7.0で３回洗浄して合計12mの洗浄液を生じた。出発物
質、第IX因子を含む限外濾液及び残留洗浄液をHIVに関
して分析した。
mを、アフィニティー精製されセファデックスG10で脱
塩された第IX因子溶液45mに添加した。その混合物
を、XM100膜（6.2nmの細孔直径）が外側に取りつけられ
たアミコン攪拌セル（180mの容量）に注ぎ、ほぼ乾燥
するまで限外濾過した。その後、そのユニットを0.05M
の塩化ナトリウム（NaCl）、0.0005Mのヒスチジン、pH
7.0で３回洗浄して合計12mの洗浄液を生じた。出発物
質、第IX因子を含む限外濾液及び残留洗浄液をHIVに関
して分析した。
表IV中の結果は、11.7logのHIVウイルスを含む混合物
の限外濾過が第IX因子を含む限外濾液を生成し、ここで
HIV感染性は0.5log減少され11.2logの減少であったこと
を示す。
の限外濾過が第IX因子を含む限外濾液を生成し、ここで
HIV感染性は0.5log減少され11.2logの減少であったこと
を示す。
実施例４ 未精製の第IX因子組成物からの限外濾過によるウイルス
の除去 この実施例は、再構成プロサー（商標）の加圧限外濾
過が低活性の限外濾液を生成したことを示す。アーマー
・ファーマシューティカル（Armour Pharmaceutical）
のこの登録商標により保護される製品は、ヒト第II因
子、第VII因子、第IX因子及び第Ｘ因子の安定な凍結乾
燥濃厚物である。それは、溜めたヒト血漿から調製され
る。再構成後に、それは1m当り約18mgの全タンパク質
及び33単位の第IX因子活性を含む濃厚なタンパク質溶液
である。製剤中の第IX因子の比活性は全タンパク質1mg
当り0.8〜2.0単位の範囲である。
の除去 この実施例は、再構成プロサー（商標）の加圧限外濾
過が低活性の限外濾液を生成したことを示す。アーマー
・ファーマシューティカル（Armour Pharmaceutical）
のこの登録商標により保護される製品は、ヒト第II因
子、第VII因子、第IX因子及び第Ｘ因子の安定な凍結乾
燥濃厚物である。それは、溜めたヒト血漿から調製され
る。再構成後に、それは1m当り約18mgの全タンパク質
及び33単位の第IX因子活性を含む濃厚なタンパク質溶液
である。製剤中の第IX因子の比活性は全タンパク質1mg
当り0.8〜2.0単位の範囲である。
パートＡ−100Kダルトンのカット−オフ（Cut−off）を
有する膜 最初の実験に於いて、プロサー（商標）を0.05Mのト
リス−HCl、pH8.0で1:1に希釈した。得られた溶液を、
1.05Kg/cm2（15p.s.i.）の圧力を用いてアミコンXM100
膜（100Kダルトンの分子量カット−オフ）で限外濾過し
た。限外濾過は非常に遅く進行し（約0.25m／分）、
攪拌セル内のタンパク質が一層濃厚になるにつれて流速
は遅くなった。出発物質中に見られるわずかに約１％の
第IX因子の活性が限外濾液中に現われた。再構成プロサ
ー（商標）の1:6の初期希釈及び0.35Kg/cm2（5p.s.i.）
の圧力を用いるこの実験の反覆は、同様の低い第IX因子
活性を有する現外濾液を与えた。この場合及びその他の
全ての場合の第IX因子活性は、第IX因子欠損血漿のAPTT
の修正度を測定することにより分析する。J.H.レナハン
（Lenahan）、フィリップス・アンド・フィリップス（P
hillips and Phillips）、Clin.Chem.、12巻、269頁（1
966年）を参照のこと。
有する膜 最初の実験に於いて、プロサー（商標）を0.05Mのト
リス−HCl、pH8.0で1:1に希釈した。得られた溶液を、
1.05Kg/cm2（15p.s.i.）の圧力を用いてアミコンXM100
膜（100Kダルトンの分子量カット−オフ）で限外濾過し
た。限外濾過は非常に遅く進行し（約0.25m／分）、
攪拌セル内のタンパク質が一層濃厚になるにつれて流速
は遅くなった。出発物質中に見られるわずかに約１％の
第IX因子の活性が限外濾液中に現われた。再構成プロサ
ー（商標）の1:6の初期希釈及び0.35Kg/cm2（5p.s.i.）
の圧力を用いるこの実験の反覆は、同様の低い第IX因子
活性を有する現外濾液を与えた。この場合及びその他の
全ての場合の第IX因子活性は、第IX因子欠損血漿のAPTT
の修正度を測定することにより分析する。J.H.レナハン
（Lenahan）、フィリップス・アンド・フィリップス（P
hillips and Phillips）、Clin.Chem.、12巻、269頁（1
966年）を参照のこと。
結果は、第IX因子がわずかに60〜70Kダルトンの分子
量を有するが、それは多孔度が限外濾液中へのそれの通
過を可能にしたはずの膜によりかなりの程度で限外濾過
しなかったことを示す。妥当な説明は膜極性化として知
られる現象に基く。膜により排除（保持）されたタンパ
ク質は、濾過されている溶液の本体に直ちに戻して混合
されない場合には、膜表面で薄い溶液層中に濃縮され
る。その層は、それが“ゼラチン状”になり使用中の膜
を覆う新しい形態の膜を構成する程濃厚になることがあ
る。一般に、このタンパク質膜の性質は非常に低い多孔
度を有する機械膜の性質と極めて区別される。
量を有するが、それは多孔度が限外濾液中へのそれの通
過を可能にしたはずの膜によりかなりの程度で限外濾過
しなかったことを示す。妥当な説明は膜極性化として知
られる現象に基く。膜により排除（保持）されたタンパ
ク質は、濾過されている溶液の本体に直ちに戻して混合
されない場合には、膜表面で薄い溶液層中に濃縮され
る。その層は、それが“ゼラチン状”になり使用中の膜
を覆う新しい形態の膜を構成する程濃厚になることがあ
る。一般に、このタンパク質膜の性質は非常に低い多孔
度を有する機械膜の性質と極めて区別される。
パートＢ−300Kダルトンのカット−オフを有する膜 アミコンXM300膜（300Kダルトンの分子量カット−オ
フ）、0.35Kg/cm2（5p.s.i.）の圧力、並びに1:6及1:10
の再構成プロサー（商標）希釈を用いて、実験を続けて
行なった。わずかに約17〜19％の第IX因子活性が限外濾
液中に見られた。限外濾過される溶液への0.1％のトゥ
イーン80（表面活性剤）の添加は結果を改良しなかっ
た。全ての場合、限外濾過した第IX因子は出発物質に対
してわずかに６〜８倍の精製を示した。
フ）、0.35Kg/cm2（5p.s.i.）の圧力、並びに1:6及1:10
の再構成プロサー（商標）希釈を用いて、実験を続けて
行なった。わずかに約17〜19％の第IX因子活性が限外濾
液中に見られた。限外濾過される溶液への0.1％のトゥ
イーン80（表面活性剤）の添加は結果を改良しなかっ
た。全ての場合、限外濾過した第IX因子は出発物質に対
してわずかに６〜８倍の精製を示した。
結果は、その分離が一層多孔性の膜によりほんの適度
に成功したことを示す。
に成功したことを示す。
結果は、限外濾過がアフィニティー精製第IX因子溶液
を更に処理するのにうまく使用し得るが、それが一層純
粋でない出発物質から高収量の第IX因子を得るのには一
様に実用的ではないことを示す。
を更に処理するのにうまく使用し得るが、それが一層純
粋でない出発物質から高収量の第IX因子を得るのには一
様に実用的ではないことを示す。
実施例５ 別の化学消毒剤及びモノクローナル抗体精製 タンパク質1mg当り約１〜３単位の第IX因子を含む第I
X因子濃厚液を、最初にシンドビス（Sindbis）ウイルス
と８〜9log10TCID50の最終力価まで接触し、その後、ニ
ューラスらの米国特許第4,764,369号に記載されるよう
に、0.1％のトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート及び１％
のトゥイーン80（洗剤）と接触させる。この特許の開示
が参考として含まれる。シンドビスウイルス感染性が4l
og10より多いウイルスにより減少されること、及び活性
な第IX因子含量が初期値の80％を越えることが予想され
る。
X因子濃厚液を、最初にシンドビス（Sindbis）ウイルス
と８〜9log10TCID50の最終力価まで接触し、その後、ニ
ューラスらの米国特許第4,764,369号に記載されるよう
に、0.1％のトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート及び１％
のトゥイーン80（洗剤）と接触させる。この特許の開示
が参考として含まれる。シンドビスウイルス感染性が4l
og10より多いウイルスにより減少されること、及び活性
な第IX因子含量が初期値の80％を越えることが予想され
る。
この溶剤／洗剤で処理された第IX因子溶液を、スミス
の米国特許第4,786,726号（その開示が参考として本明
細書に含まれる）に記載されるようなモノクローナル抗
体と接触させる。第IX因子の精製溶液が得られることが
予想される。この溶液は、得られる精製の理由により感
染性シンドビスウイルスが更に減少されること、及びウ
イルスの力価が検出し得ないことが更に予想される。
の米国特許第4,786,726号（その開示が参考として本明
細書に含まれる）に記載されるようなモノクローナル抗
体と接触させる。第IX因子の精製溶液が得られることが
予想される。この溶液は、得られる精製の理由により感
染性シンドビスウイルスが更に減少されること、及びウ
イルスの力価が検出し得ないことが更に予想される。
得られた第IX因子溶液を、更にHIVウイルスと接触さ
せて８〜9log10のウイルスの最終力価を得る。タンパク
質含量を、1m当り約0.025〜0.065mgのタンパク質に調
節する。得られた溶液を、100KD分子量カット−オフに
相当する有効多孔度を有する膜で濾過する。第IX因子の
80〜100％が回収されること、及びHIVウイルス力価が検
出し得ない量まで減少されることが予想される。
せて８〜9log10のウイルスの最終力価を得る。タンパク
質含量を、1m当り約0.025〜0.065mgのタンパク質に調
節する。得られた溶液を、100KD分子量カット−オフに
相当する有効多孔度を有する膜で濾過する。第IX因子の
80〜100％が回収されること、及びHIVウイルス力価が検
出し得ない量まで減少されることが予想される。
第IX因子溶液を、1m当り約100の国際単位の潜在能
まで濃縮し、0.066Mの塩化ナトリウム（NaCl）、0.01M
のヒスチジン、３％のマンニトール、pH7.0±0.2からな
る緩衝液に対して透析する。外因性試験ウイルスを添加
しないで行なう場合、この物質を無菌濾過し（0.1ミク
ロンのフィルター）、凍結乾燥して製薬用に適した製剤
を得る。
まで濃縮し、0.066Mの塩化ナトリウム（NaCl）、0.01M
のヒスチジン、３％のマンニトール、pH7.0±0.2からな
る緩衝液に対して透析する。外因性試験ウイルスを添加
しないで行なう場合、この物質を無菌濾過し（0.1ミク
ロンのフィルター）、凍結乾燥して製薬用に適した製剤
を得る。
実施例６ 化学消毒剤を適用する別法 タンパク質1mg当り約１〜３単位の第IX因子を含む濃
厚溶液を、スミスの米国特許第4,786,726号に記載され
たモノクローナル抗体と接触させる。精製第IX因子をED
TA（エチレンジアミンテトラ酢酸）の如きカオトロピッ
クの薬剤でモノクローナル抗体から溶離する。得られた
第IX因子溶液が高い比活性の精製第IX因子を含むこと、
及び収率が80〜100％であることが予想される。
厚溶液を、スミスの米国特許第4,786,726号に記載され
たモノクローナル抗体と接触させる。精製第IX因子をED
TA（エチレンジアミンテトラ酢酸）の如きカオトロピッ
クの薬剤でモノクローナル抗体から溶離する。得られた
第IX因子溶液が高い比活性の精製第IX因子を含むこと、
及び収率が80〜100％であることが予想される。
得られた第IX因子溶液を、更にHIVウイルスと接触さ
せてウイルスの最終力価８〜9log10を得る。NaSCNの最
終濃度が約1.5Mであるように、チオシアン酸ナトリウム
を第IX因子−HIV混合物に添加し、第IX因子−HIV混合物
を４℃〜25℃の温度で１〜2.5時間の期間にわたって放
置する。第IX因子の潜在能が消毒剤処理により影響され
ないこと、及びHIV感染性の力価が検出し得ない水準に
減少されることが予想される。
せてウイルスの最終力価８〜9log10を得る。NaSCNの最
終濃度が約1.5Mであるように、チオシアン酸ナトリウム
を第IX因子−HIV混合物に添加し、第IX因子−HIV混合物
を４℃〜25℃の温度で１〜2.5時間の期間にわたって放
置する。第IX因子の潜在能が消毒剤処理により影響され
ないこと、及びHIV感染性の力価が検出し得ない水準に
減少されることが予想される。
その後、溶液を透析して化学消毒剤を除去し、ついで
100KD分子量カット−オフに相当する有効多孔度を有す
る膜で濾過する。第IX因子活性の80〜100％が回収され
ること、及びHIV力価が更に減少されることが予想され
る。また、不完全なウイルス粒子または変性されたウイ
ルス粒子が濾過により第IX因子溶液から除去されること
が予想される。
100KD分子量カット−オフに相当する有効多孔度を有す
る膜で濾過する。第IX因子活性の80〜100％が回収され
ること、及びHIV力価が更に減少されることが予想され
る。また、不完全なウイルス粒子または変性されたウイ
ルス粒子が濾過により第IX因子溶液から除去されること
が予想される。
第IX因子溶液を、1m当り約100の国際単位の潜在能
まで濃縮し、0.066Mの塩化ナトリウム（NaCl）、0.01M
のヒスチジン、３％のマンニトール、pH7.0±0.2からな
る緩衝液に対して透析する。外因性試験ウイルスを添加
しないで行なう場合、この溶液を無菌濾過し（0.1ミク
ロンのフィルター）、凍結乾燥して製薬用に適した製剤
を得る。
まで濃縮し、0.066Mの塩化ナトリウム（NaCl）、0.01M
のヒスチジン、３％のマンニトール、pH7.0±0.2からな
る緩衝液に対して透析する。外因性試験ウイルスを添加
しないで行なう場合、この溶液を無菌濾過し（0.1ミク
ロンのフィルター）、凍結乾燥して製薬用に適した製剤
を得る。
本発明の特別な実施態様が示され説明されたが、本発
明の精神及び範囲から逸脱しないで多くの変更がそれら
になし得ることが明らかである。それ故、本発明は、以
上の記載により限定されない。
明の精神及び範囲から逸脱しないで多くの変更がそれら
になし得ることが明らかである。それ故、本発明は、以
上の記載により限定されない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リンダ マイケル イー アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19437 グウィニッド ヴァリー ウッ ド スプリング ロード 100 (72)発明者 ダリーサ ローズ アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 18976 ワーリントン カントリー ク ラブ ドライヴ 94 (72)発明者 ター ジョージ クリスマン アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19403 ジェファーソンヴィル ストー ンリッジ ドライヴ 217 (56)参考文献 特開 昭60−51116（ＪＰ，Ａ) ＰＲＩＮＣＥ Ａ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ, Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，（1986）Ｖｏ ｌ．１，Ｎｏ．8483，ｐｐ．706−710 ＬＩＥＢＭＡＮ，Ｈ．Ａ．ｅｔ．ａ ｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ，（1985）Ｖｏｌ．82，Ｎ ｏ．11，ｐｐ．3879−3883
Claims (19)
- 【請求項１】不安定な血液タンパク質およびウイルスを
含む血液製剤を、タンパクの変性を起こさない有効量の
チオシアン酸ナトリウムと、該ウイルスの実質的すべて
を不活性化するのに十分な時間および温度にて接触させ
ることを含む該血液製剤中のウイルスの不活性化法。 - 【請求項２】不安定な血液タンパクとウイルスとを含有
する血液製剤を、不活性化されたウイルスおよび活性な
ウイルスを含まないものとする方法であって、以下の工
程、 （ａ）該血液製剤と、タンパク質を変性しない有効量の
チオシアン酸ナトリウムとを、該ウイルスの実質的すべ
てを不活性化するのに十分な時間、かつ十分な温度にて
接触させる工程、 （ｂ）物理的手段により、該不活性化されたウイルスお
よび活性なウイルスを該血液製剤から分離する工程、 を含むことを特徴とする上記方法。 - 【請求項３】更に、上記工程（ａ）を経た該血液製剤を
透析して、該不活性化ウイルスおよび活性なウイルスを
分離する前に、該チオシアン酸ナトリウムを除去する工
程を含む請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】不安定な血液タンパクおよびウイルスを含
有する血液製剤を、不活性化ウイルスおよび活性なウイ
ルスを含まない製剤とする方法であって、以下の工程、 （ａ）該血液製剤をモノクローナル抗体親和性マトリッ
クス上でクロマトグラフィー処理する工程、 （ｂ）該モノクローナル抗体親和性マトリックスから該
クロマト処理した血液製剤を、有効量の、タンパクを変
性しないチオシアン酸ナトリウムで溶出する工程、およ
び （ｃ）該溶出混合物を、該ウイルスの実質的にすべてが
不活性化されるのに十分な時間および温度にて静置する
工程、 を含むことを特徴とする上記方法。 - 【請求項５】更に、以下の工程、 （ｄ）該血液製剤から物理的手段によって該不活性化さ
れたウイルスおよび活性なウイルスを分離する工程、 をも含む請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】更に、上記工程（ｃ）を経た該血液製剤を
透析して、該不活性化ウイルスおよび活性なウイルスを
分離する前に、チオシアン酸ナトリウムを除去する工程
をも含む請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】不安定な血液タンパクとウイルスとを含有
する血液製剤を、不活性化ウイルスおよび活性なウイル
スを含まない製剤とする方法であって、 （ａ）該血液製剤を、モノクローナル抗体親和性マトリ
ックス上でクロマトグラフィー処理する工程、 （ｂ）該モノクローナル抗体親和性マトリックスから、
該クロマト処理した血液製剤を、チオシアン酸ナトリウ
ムを含まない溶離剤で溶出する工程、 （ｃ）タンパクを変性しない、有効量のチオシアン酸ナ
トリウムを添加する工程、および （ｄ）該溶出混合物を、該ウイルスの実質的にすべてを
不活性化するのに十分な時間、かつ十分な温度にて静置
する工程、 を含むことを特徴とする上記方法。 - 【請求項８】更に、以下の工程、 （ｅ）物理的手段によって該血液製剤から該不活性化さ
れたウイルスおよび活性なウイルスを分離する工程、 をも含む請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】不安定な血液タンパクとウイルスとを含有
する血液製剤を実質的にウイルスを含まない製剤とする
方法であって、 物理的手段によって、該血液製剤から実質的にすべての
ウイルスを除去する工程、及び、 該血液製剤を、該ウイルスの実質的すべてを不活性化す
るのに十分な時間、かつ十分な温度にて、タンパク質の
変性を生じない有効量のチオシアン酸ナトリウムと接触
させる工程、 を含むことを特徴とする上記方法。 - 【請求項１０】更に、物理的手段によって、該血液製剤
から、該不活性化ウイルスおよび活性なウイルスを分離
する工程をも含む請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】更に、アミノ−ヘキシルセファロース上
でクロマト処理することにより、該血液製剤から該不活
性化ウイルスおよび活性なウイルスを除去する工程をも
含む請求項６または請求項８に記載の方法。 - 【請求項１２】該血液製剤が血漿、血漿濃縮物、該血漿
の任意の分画により得られる沈殿物、該血漿の任意の分
画により得られる上澄、血清、低温沈殿物、細胞溶解物
および血液細胞中で誘発されたタンパクからなる群から
選ばれ、かつ該不安定な血液タンパクがフィブリノーゲ
ン、低温不溶性グロブリン、プロペルジン、IgG、IgM、
IgA、β−リポタンパク、プラスミンインヒビター、Ｖ
因子、トロンビン、抗トロンビン、同種凝集素、セルロ
ブラスミン、プロトロンビン、α−１−リポタンパク、
ペプチダーゼ、トランスフェリン、チロキシン結合グロ
ブリン、血清エステラーゼ、アルカリホスファターゼ、
α−１−酸糖タンパク、II因子、VII因子、VIII因子、I
X因子、Ｘ因子、XIII因子、免疫グロブリン、プレアル
ブミン、レチノール−結合タンパク、アルブミン、α−
グロブリン、タンパクＣ、タンパクＳ、β−グロブリ
ン、γ−グロブリン、III因子、補体成分、フィブロネ
クチン、抗トロンビンIII、ヘモグロビン、インターフ
ェロン、Ｔ−細胞成長因子、プラスミノーゲン活性化因
子、感染性肝炎に対する抗体、およびヒト免疫不全症ウ
イルスに対する抗体からなる群から選ばれる請求項１、
請求項２、請求項４、請求項７または請求項９に記載の
方法。 - 【請求項１３】該ウイルスが肝炎Ｂウイルス（HBV）お
よびヒト免疫不全ウイルス（HIV）からなる群から選ば
れる脂質−含有ウイルスである請求項１、請求項２、請
求項４、請求項７または請求項９に記載の方法。 - 【請求項１４】該物理的手段が限外濾過、超遠心分離お
よび電気泳動からなる群から選ばれる請求項２または請
求項９に記載の方法。 - 【請求項１５】該物理的手段が限外濾過である請求項14
に記載の方法。 - 【請求項１６】該物理的手段が限外濾過、超遠心分離お
よび電気泳動からなる群から選ばれる請求項５、請求項
８または請求項10に記載の方法。 - 【請求項１７】該物理的手段が限外濾過である請求項16
に記載の方法。 - 【請求項１８】該不安定血液タンパクがIX因子、Ｘ因
子、II因子、VIII因子、プロトロンビン、タンパクＣお
よびタンパクＳからなるビタミンＫ−依存タンパク群か
ら選ばれる請求項12に記載の方法。 - 【請求項１９】該不安定血液タンパクが感染性肝炎に対
する抗体またはヒト免疫不全ウイルスに対する抗体を含
む請求項12に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36685589A | 1989-06-15 | 1989-06-15 | |
| US366,855 | 1989-06-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04501429A JPH04501429A (ja) | 1992-03-12 |
| JP3297433B2 true JP3297433B2 (ja) | 2002-07-02 |
Family
ID=23444851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50988190A Expired - Lifetime JP3297433B2 (ja) | 1989-06-15 | 1990-06-13 | ウイルスで汚染された薬理組成物中のウイルスの不活性化方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5300433A (ja) |
| EP (1) | EP0431129B1 (ja) |
| JP (1) | JP3297433B2 (ja) |
| AT (1) | ATE138575T1 (ja) |
| CA (1) | CA2034489C (ja) |
| DE (1) | DE69027187T2 (ja) |
| DK (1) | DK0431129T3 (ja) |
| ES (1) | ES2087156T3 (ja) |
| WO (1) | WO1990015613A1 (ja) |
Families Citing this family (39)
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|---|---|---|---|---|
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| AT408191B (de) * | 1991-08-19 | 2001-09-25 | Haemosan Erzeugung Pharmazeuti | Verfahren zur inaktivierung von prionen |
| US5792835A (en) * | 1991-09-05 | 1998-08-11 | Baxter International Inc. | Method of preparing a topical fibrinogen complex |
| AT399818B (de) * | 1992-04-24 | 1995-07-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer hochgereinigten virussicheren faktor viii-präparation |
| JP3133338B2 (ja) * | 1992-12-16 | 2001-02-05 | イムノ・アクチエンゲゼルシャフト | ウイルス的に安全な生物学的組成物の調製方法 |
| DE4320294A1 (de) * | 1993-06-18 | 1994-12-22 | Immuno Ag | Verwendung von humanem Protein C zur Verhinderung und Behandlung von Thrombozytenablagerungen |
| HRP940645A2 (en) * | 1993-10-06 | 1996-12-31 | Immuno Ag | Process for virus deactivation in the presence of polyalkylene glycol and the pharmaceutical preparation thus obtained |
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