JP3294288B2 - 乳酸桿菌由来の新規なプラスミドｐＢＵＬ１ 及びその誘導体 - Google Patents
乳酸桿菌由来の新規なプラスミドｐＢＵＬ１ 及びその誘導体Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヨーグルト製造菌とし
てその有用性と安全性が広く認められている、Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂ
ｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓに由来する、新規な環状二
本鎖ＤＮＡプラスミドｐＢＵＬ１及びその誘導体並びに
これらのプラスミドで形質転換された微生物に関するも
のである。
てその有用性と安全性が広く認められている、Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂ
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これらのプラスミドで形質転換された微生物に関するも
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【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】乳酸菌
は多くの発酵食品の製造に古来用いられてきた極めて有
用な微生物である。近年になって急速に発達してきた遺
伝子組換え技術をこの乳酸菌に対して適用することが可
能になれば、その有用性を一層増大させることが期待さ
れる。実際、一部の乳酸菌、例えばＬａｃｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｌａｃｔｉｓ（文献１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ（文献２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（文献３）、或いはＬａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（文献４）などでは既
にかなり効率の高い宿主・ベクター系が報告されてお
り、産業への応用の試みが行われようとしている段階で
ある。
は多くの発酵食品の製造に古来用いられてきた極めて有
用な微生物である。近年になって急速に発達してきた遺
伝子組換え技術をこの乳酸菌に対して適用することが可
能になれば、その有用性を一層増大させることが期待さ
れる。実際、一部の乳酸菌、例えばＬａｃｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｌａｃｔｉｓ（文献１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
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ｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（文献３）、或いはＬａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（文献４）などでは既
にかなり効率の高い宿主・ベクター系が報告されてお
り、産業への応用の試みが行われようとしている段階で
ある。
【０００３】しかしながら、ヨーグルトなどの乳製品の
製造菌として多用されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａ
ｒｉｃｕｓやＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒ
ｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ（以下それぞ
れＬｂ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌｂ．ｌａｃｔｉｓと
略することがある）においては、数多くの研究者の尽力
にも拘らず、未だに形質転換の報告がないのが現状であ
る。いくつかの種の乳酸菌では形質転換体が得られてい
る広宿主域プラスミド、例えばｐＮＺ１２（文献５）、
ｐＧＫ１２（文献６）、ｐＩＬ２５３（文献７）などの
適用も試みられたのであるが、なお上記二亜種の形質転
換は成功していない。このような状況から、上記二亜種
の宿主・ベクター系の確立が切に求められている。
製造菌として多用されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａ
ｒｉｃｕｓやＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒ
ｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ（以下それぞ
れＬｂ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌｂ．ｌａｃｔｉｓと
略することがある）においては、数多くの研究者の尽力
にも拘らず、未だに形質転換の報告がないのが現状であ
る。いくつかの種の乳酸菌では形質転換体が得られてい
る広宿主域プラスミド、例えばｐＮＺ１２（文献５）、
ｐＧＫ１２（文献６）、ｐＩＬ２５３（文献７）などの
適用も試みられたのであるが、なお上記二亜種の形質転
換は成功していない。このような状況から、上記二亜種
の宿主・ベクター系の確立が切に求められている。
【０００４】また、食品製造に用いられる微生物に対し
て遺伝子組換え技術を適用するためには、その形質転換
に用いるベクターの安全性が確立されていなければなら
ない。そのようなベクターとしては、昔から食されてき
た食品中の微生物が天然に保持していて、歴史的に安全
性が確かめられているものが望ましい。一方ヨーグルト
は長い間食され、安全性が保証されている食品である。
それ故、例えば上記二亜種のようなヨーグルト中の微生
物が有するプラスミドは、食品製造用はもとより各種生
理活性物質製造用の微生物の形質転換体を創製する際に
用いるベクターとして有用である。
て遺伝子組換え技術を適用するためには、その形質転換
に用いるベクターの安全性が確立されていなければなら
ない。そのようなベクターとしては、昔から食されてき
た食品中の微生物が天然に保持していて、歴史的に安全
性が確かめられているものが望ましい。一方ヨーグルト
は長い間食され、安全性が保証されている食品である。
それ故、例えば上記二亜種のようなヨーグルト中の微生
物が有するプラスミドは、食品製造用はもとより各種生
理活性物質製造用の微生物の形質転換体を創製する際に
用いるベクターとして有用である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｌｂ．ｂ
ｕｌｇａｒｉｃｕｓ及びＬｂ．ｌａｃｔｉｓ用の宿主・
ベクター系の開発を目指し、これらの亜種が保持するプ
ラスミドの検索を行ったところ、明治乳業ヘルスサイエ
ンス研究所所有株Ｌｂ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＭ−８７
８株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９７８）から約８．０ｋｂの
長さを持ち、図１の制限酵素地図を有し、ＢａｍＨＩ、
ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ及びＳａｌＩ認識部位
を有せず、１３４４ｂｐのＳｍａＩ断片の塩基配列が下
記の表１で示される配列表の配列番号１で表わされるプ
ラスミドを分離するのにはじめて成功し、このプラスミ
ドをｐＢＵＬ１と命名した。
ｕｌｇａｒｉｃｕｓ及びＬｂ．ｌａｃｔｉｓ用の宿主・
ベクター系の開発を目指し、これらの亜種が保持するプ
ラスミドの検索を行ったところ、明治乳業ヘルスサイエ
ンス研究所所有株Ｌｂ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＭ−８７
８株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９７８）から約８．０ｋｂの
長さを持ち、図１の制限酵素地図を有し、ＢａｍＨＩ、
ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ及びＳａｌＩ認識部位
を有せず、１３４４ｂｐのＳｍａＩ断片の塩基配列が下
記の表１で示される配列表の配列番号１で表わされるプ
ラスミドを分離するのにはじめて成功し、このプラスミ
ドをｐＢＵＬ１と命名した。
【０００６】
【表１】
【０００７】ｐＢＵＬ１が担う形質は不明（ｃｒｙｐｔ
ｉｃ）であったので、選択マーカーとしてエリスロマイ
シン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ；以下Ｅｍと略称する
ことがある）耐性遺伝子を連結し、形質転換を試みたと
ころ、３つの属の微生物、即ち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ及びＬｂ．ｌａｃｔｉｓ
において前記選択マーカーを発現する形質転換株を得る
ことに成功した。これはプラスミドｐＢＵＬ１（以下、
本発明プラスミドということがある）がグラム陽性菌の
中で広い宿主域を持つことを示すものである。本発明は
このような知見に基づいて完成したものである。
ｉｃ）であったので、選択マーカーとしてエリスロマイ
シン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ；以下Ｅｍと略称する
ことがある）耐性遺伝子を連結し、形質転換を試みたと
ころ、３つの属の微生物、即ち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ及びＬｂ．ｌａｃｔｉｓ
において前記選択マーカーを発現する形質転換株を得る
ことに成功した。これはプラスミドｐＢＵＬ１（以下、
本発明プラスミドということがある）がグラム陽性菌の
中で広い宿主域を持つことを示すものである。本発明は
このような知見に基づいて完成したものである。
【０００８】ｐＢＵＬ１の自律複製能に関与する遺伝子
は、他のプラスミドと同様に、本発明プラスミドＤＮＡ
の一部に担われていると考えられるので、本発明プラス
ミドの中で複製に関与しない領域が欠失していたり、或
いはＤＮＡが挿入付加されたようなプラスミド誘導体
も、本発明プラスミドと同様な機能を有すると考えられ
る。例えば、後述の実施例７に記載されているように、
ｐＢＵＬ１から複製に関与しない領域が除去された長さ
約４ｋｂの領域（太線部分）を含むプラスミド（図６、
図７）であれば、複製には何ら支障はない。それ故本発
明は、ｐＢＵＬ１そのもののみに限定されるのではな
く、これを修飾して得られる誘導体プラスミドや、マー
カー例えばＥｍ耐性遺伝子、外来遺伝子例えばＬ−乳酸
脱水素酵素など他の遺伝子あるいはプロモーターやオペ
レーター等を本発明プラスミドに挿入した組換えプラス
ミドをも広く包含するものである。
は、他のプラスミドと同様に、本発明プラスミドＤＮＡ
の一部に担われていると考えられるので、本発明プラス
ミドの中で複製に関与しない領域が欠失していたり、或
いはＤＮＡが挿入付加されたようなプラスミド誘導体
も、本発明プラスミドと同様な機能を有すると考えられ
る。例えば、後述の実施例７に記載されているように、
ｐＢＵＬ１から複製に関与しない領域が除去された長さ
約４ｋｂの領域（太線部分）を含むプラスミド（図６、
図７）であれば、複製には何ら支障はない。それ故本発
明は、ｐＢＵＬ１そのもののみに限定されるのではな
く、これを修飾して得られる誘導体プラスミドや、マー
カー例えばＥｍ耐性遺伝子、外来遺伝子例えばＬ−乳酸
脱水素酵素など他の遺伝子あるいはプロモーターやオペ
レーター等を本発明プラスミドに挿入した組換えプラス
ミドをも広く包含するものである。
【０００９】本発明に係るｐＢＵＬ１の誘導体プラスミ
ドとしては、例えば上記のように約４ｋｂの複製必須領
域を含むプラスミドが挙げられ、その１例としてプラス
ミドｐＸ３Δ１８Ｅ（図６、図７）が例示される。この
プラスミドは、乳酸菌などグラム陽性細菌での複製が可
能であるだけでなく、後記する実施例９からも明らかな
ように、大腸菌での複製も可能であって、このプラスミ
ドそれ自体が当業界において希求されていた広宿主域プ
ラスミドにほかならない。またこのプラスミドは、グラ
ム陽性菌（乳酸菌）のみならずグラム陰性菌（大腸菌）
でも複製できるプラスミドであるので、グラム陽性菌と
グラム陰性菌の双方で使用できるきわめて実用性の高い
新規汎用性シャトルベクターとしても有効である。
ドとしては、例えば上記のように約４ｋｂの複製必須領
域を含むプラスミドが挙げられ、その１例としてプラス
ミドｐＸ３Δ１８Ｅ（図６、図７）が例示される。この
プラスミドは、乳酸菌などグラム陽性細菌での複製が可
能であるだけでなく、後記する実施例９からも明らかな
ように、大腸菌での複製も可能であって、このプラスミ
ドそれ自体が当業界において希求されていた広宿主域プ
ラスミドにほかならない。またこのプラスミドは、グラ
ム陽性菌（乳酸菌）のみならずグラム陰性菌（大腸菌）
でも複製できるプラスミドであるので、グラム陽性菌と
グラム陰性菌の双方で使用できるきわめて実用性の高い
新規汎用性シャトルベクターとしても有効である。
【００１０】更にまた本発明に係るｐＢＵＬ１の誘導体
プラスミドの別の１例としては、上記した複製必須領
域、プラスミドｐＸ３Δ１８ＥのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ
断片等、複製必須領域それ自体又はそれを含有するプラ
スミド断片と他のプラスミド（断片）とを結合してなる
プラスミドが挙げられる。該他のプラスミドとしては、
各種のプラスミドが広く使用できるが、その例としては
ｐＢＲシリーズ、ｐＵＣシリーズ等大腸菌由来のプラス
ミドが挙げられる。
プラスミドの別の１例としては、上記した複製必須領
域、プラスミドｐＸ３Δ１８ＥのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ
断片等、複製必須領域それ自体又はそれを含有するプラ
スミド断片と他のプラスミド（断片）とを結合してなる
プラスミドが挙げられる。該他のプラスミドとしては、
各種のプラスミドが広く使用できるが、その例としては
ｐＢＲシリーズ、ｐＵＣシリーズ等大腸菌由来のプラス
ミドが挙げられる。
【００１１】このようにして得られた結合プラスミド
も、上記したプラスミドｐＸ３Δ１８Ｅの場合と同様
に、乳酸菌でも大腸菌でも複製可能であることが確認さ
れ、当業界において強く希求されていた広宿主域プラス
ミドとしてあるいはグラム陽性菌と陰性菌間でのシャト
ルベクターとして利用することが可能である。結合プラ
スミドの例としては、ｐＢＲ３Δ１８Ｅ１、ｐＢＲ３Δ
１８Ｅ２、ｐ８Ｘ３Δ１８Ｅ１、ｐ８Ｘ３Δ１８Ｅ２
（図８〜図１１）等が挙げられる。
も、上記したプラスミドｐＸ３Δ１８Ｅの場合と同様
に、乳酸菌でも大腸菌でも複製可能であることが確認さ
れ、当業界において強く希求されていた広宿主域プラス
ミドとしてあるいはグラム陽性菌と陰性菌間でのシャト
ルベクターとして利用することが可能である。結合プラ
スミドの例としては、ｐＢＲ３Δ１８Ｅ１、ｐＢＲ３Δ
１８Ｅ２、ｐ８Ｘ３Δ１８Ｅ１、ｐ８Ｘ３Δ１８Ｅ２
（図８〜図１１）等が挙げられる。
【００１２】本発明に係るプラスミドｐＢＵＬ１を調製
するには、まず乳酸菌の培養に用いられている液体培地
例えばＬＣＭ培地（文献８）中で、乳酸菌の通常の培養
方法及び培養条件により、Ｌｂ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ
Ｍ−８７８株を培養する。次いでこれを集菌して、こ
れを乳酸菌を溶菌させる公知の方法、例えばリゾチーム
やムタノリシンなどの酵素を用いてあるいは超音波処理
によって溶菌する。得られた溶菌物からは、例えばフェ
ノール抽出及びエチジウムブロマイド存在下の塩化セシ
ウム密度勾配遠心の如き通常用いられる方法によって、
プラスミドを分離・精製することができる。また、本発
明に係る他のプラスミドであるところの、ｐＢＵＬ１の
誘導体プラスミドを調製するに当っても、常法にしたが
って切断、結合その他の処理をすればよい。
するには、まず乳酸菌の培養に用いられている液体培地
例えばＬＣＭ培地（文献８）中で、乳酸菌の通常の培養
方法及び培養条件により、Ｌｂ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ
Ｍ−８７８株を培養する。次いでこれを集菌して、こ
れを乳酸菌を溶菌させる公知の方法、例えばリゾチーム
やムタノリシンなどの酵素を用いてあるいは超音波処理
によって溶菌する。得られた溶菌物からは、例えばフェ
ノール抽出及びエチジウムブロマイド存在下の塩化セシ
ウム密度勾配遠心の如き通常用いられる方法によって、
プラスミドを分離・精製することができる。また、本発
明に係る他のプラスミドであるところの、ｐＢＵＬ１の
誘導体プラスミドを調製するに当っても、常法にしたが
って切断、結合その他の処理をすればよい。
【００１３】ｐＢＵＬ１に選択マーカー遺伝子を挿入し
た組換えプラスミドを導入することにより微生物を形質
転換させる方法は、対象の微生物の特性に応じて当業者
に公知の塩化カルシウム法、プロトプラスト−ポリエチ
レングリコール法、エレクトロポレーション法などの中
から最善の方法を採用すれば良く、特に限定はないが、
宿主が乳酸菌の場合は、エレクトロポレーション法が好
ましい。形質転換された株を選択するためのマーカー
は、当該分野で用いられている種々の抗生物質耐性など
の遺伝子を適宜用いれば良いが、形質転換微生物が食品
製造や医薬品製造に用いられるものであれば、安全性の
確かめられているマーカーを用いることが望ましい。そ
の他必要に応じてプロモーター等の発現制御に関与する
塩基配列を本発明プラスミドに組み込んでも良い。
た組換えプラスミドを導入することにより微生物を形質
転換させる方法は、対象の微生物の特性に応じて当業者
に公知の塩化カルシウム法、プロトプラスト−ポリエチ
レングリコール法、エレクトロポレーション法などの中
から最善の方法を採用すれば良く、特に限定はないが、
宿主が乳酸菌の場合は、エレクトロポレーション法が好
ましい。形質転換された株を選択するためのマーカー
は、当該分野で用いられている種々の抗生物質耐性など
の遺伝子を適宜用いれば良いが、形質転換微生物が食品
製造や医薬品製造に用いられるものであれば、安全性の
確かめられているマーカーを用いることが望ましい。そ
の他必要に応じてプロモーター等の発現制御に関与する
塩基配列を本発明プラスミドに組み込んでも良い。
【００１４】このようにして得た形質転換微生物は、安
全性が高いので、常法にしたがって培養することによ
り、酵素や生理活性物質等を著量生産することができる
し、各種の食品製造においても常法どおりに使用するこ
とによって高効率で目的を達成することができる。しか
もいずれの場合においても安全性が高いので、バイオハ
ザードや有害物質の副生等をひき起こすことなく、安全
性が特に強く要望される医薬や食品の工業的製造に有利
に利用することができる。
全性が高いので、常法にしたがって培養することによ
り、酵素や生理活性物質等を著量生産することができる
し、各種の食品製造においても常法どおりに使用するこ
とによって高効率で目的を達成することができる。しか
もいずれの場合においても安全性が高いので、バイオハ
ザードや有害物質の副生等をひき起こすことなく、安全
性が特に強く要望される医薬や食品の工業的製造に有利
に利用することができる。
【００１５】
【実施例】以下本発明を実施例により説明する。
【００１６】
【実施例１ （プラスミドｐＢＵＬ１の調製）】脱脂粉
乳培地（１０％脱脂粉乳及び０．１％酵母エキスを蒸留
水に溶かし、１２１℃、７分間滅菌した液体培地）を用
いて３７℃で継代したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄ
ｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃ
ｕｓ Ｍ−８７８株（明治乳業ヘルスサイエンス研究所
保有株；微工研寄託番号ＦＥＲＭＰ−１１９７８；以下
Ｍ−８７８株と略称することがある）をＬＣＭ培地に１
％（Ｗ／Ｖ）グルコースを添加した培地（ＬＣＭＧ培
地）６リットルに０．５％植菌し、３７℃にて１５時間
静置培養した。
乳培地（１０％脱脂粉乳及び０．１％酵母エキスを蒸留
水に溶かし、１２１℃、７分間滅菌した液体培地）を用
いて３７℃で継代したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄ
ｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃ
ｕｓ Ｍ−８７８株（明治乳業ヘルスサイエンス研究所
保有株；微工研寄託番号ＦＥＲＭＰ−１１９７８；以下
Ｍ−８７８株と略称することがある）をＬＣＭ培地に１
％（Ｗ／Ｖ）グルコースを添加した培地（ＬＣＭＧ培
地）６リットルに０．５％植菌し、３７℃にて１５時間
静置培養した。
【００１７】培養終了後、菌体を遠心分離によって集菌
し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２回
洗浄した。次いで細胞を高張緩衝液（０．３Ｍラフィノ
ース、５ｍＭ塩化マグネシウム及び５ｍＭ塩化カルシウ
ムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０））４８０
ｍｌに懸濁した。これにムタノリシン及びリゾチームを
各々最終濃度５μｇ／ｍｌ及び５００μｇ／ｍｌとなる
ように加え、３７℃で１０分間反応させた後、２５０ｍ
ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を５４ｍｌ加えて遠心分離
にかけ、沈澱を集めた。
し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２回
洗浄した。次いで細胞を高張緩衝液（０．３Ｍラフィノ
ース、５ｍＭ塩化マグネシウム及び５ｍＭ塩化カルシウ
ムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０））４８０
ｍｌに懸濁した。これにムタノリシン及びリゾチームを
各々最終濃度５μｇ／ｍｌ及び５００μｇ／ｍｌとなる
ように加え、３７℃で１０分間反応させた後、２５０ｍ
ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を５４ｍｌ加えて遠心分離
にかけ、沈澱を集めた。
【００１８】この沈澱に６．７％（Ｗ／Ｖ）シュークロ
ース及び２５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ８．０）２４０ｍｌを加えて懸濁した。この後
はＡｎｄｅｒｓｏｎとＭｃｋａｙの方法（文献９）に従
って、ＳＤＳによる溶菌からプラスミドＤＮＡの粗精製
までを行った。
ース及び２５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ８．０）２４０ｍｌを加えて懸濁した。この後
はＡｎｄｅｒｓｏｎとＭｃｋａｙの方法（文献９）に従
って、ＳＤＳによる溶菌からプラスミドＤＮＡの粗精製
までを行った。
【００１９】得られた粗プラスミドＤＮＡ標品を常法
（文献１０）によりＲＮａｓｅ処理した後、エチジウム
ブロマイド存在下で塩化セシウム密度勾配遠心を行い、
精製プラスミドとして約１μｇのｐＢＵＬ１プラスミド
を得た。
（文献１０）によりＲＮａｓｅ処理した後、エチジウム
ブロマイド存在下で塩化セシウム密度勾配遠心を行い、
精製プラスミドとして約１μｇのｐＢＵＬ１プラスミド
を得た。
【００２０】
【実施例２ （プラスミドｐＢＵＬ１の構造）】ｐＢＵ
Ｌ１を市販の各種制限酵素で切断し、得られた切断片の
塩基対長をアガロースゲル電気泳動により求めた。その
結果ｐＢＵＬ１は図１に示される制限酵素地図を持ち、
全体の長さが約８ｋｂである環状二本鎖ＤＮＡプラスミ
ドであることが判明した。なお、ｐＢＵＬ１はＢａｍＨ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ及びＳａｌＩ認識
部位を有しない。又、ＳｍａＩで消化したときに生成す
る５つの断片のうち３番目の大きさ（１３４４ｂｐ）の
断片（図１中に太線で位置を示す）の塩基配列を調べた
ところ、表１の配列番号１で表わされる配列を有してい
た。
Ｌ１を市販の各種制限酵素で切断し、得られた切断片の
塩基対長をアガロースゲル電気泳動により求めた。その
結果ｐＢＵＬ１は図１に示される制限酵素地図を持ち、
全体の長さが約８ｋｂである環状二本鎖ＤＮＡプラスミ
ドであることが判明した。なお、ｐＢＵＬ１はＢａｍＨ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ及びＳａｌＩ認識
部位を有しない。又、ＳｍａＩで消化したときに生成す
る５つの断片のうち３番目の大きさ（１３４４ｂｐ）の
断片（図１中に太線で位置を示す）の塩基配列を調べた
ところ、表１の配列番号１で表わされる配列を有してい
た。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【実施例３ （ｐＢＵＬ１への選択マーカーＥｍ耐性遺
伝子の賦与）】まず初めに、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ由来の接合伝達プラスミドｐＡＭβ
１（文献１１）をＨｈａＩで切断してアガロースゲル電
気泳動にかけ、Ｅｍ耐性遺伝子を含む長さ約１．１ｋｂ
の断片を含むゲルの部分を切り出した。切り出したゲル
からＢＩ０１０１社のＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＤＮＡ精製
キットを用いてＤＮＡを単離した。得られた断片を図２
に示すような手順に従って大腸菌のｐＵＣ１１８プラス
ミド（宝酒造（株））に結合させて、Ｅｍ耐性遺伝子を
各種制限酵素で切り出すことが出来るカセットプラスミ
ドｐ８Ｅｍ１を作製した。
伝子の賦与）】まず初めに、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ由来の接合伝達プラスミドｐＡＭβ
１（文献１１）をＨｈａＩで切断してアガロースゲル電
気泳動にかけ、Ｅｍ耐性遺伝子を含む長さ約１．１ｋｂ
の断片を含むゲルの部分を切り出した。切り出したゲル
からＢＩ０１０１社のＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＤＮＡ精製
キットを用いてＤＮＡを単離した。得られた断片を図２
に示すような手順に従って大腸菌のｐＵＣ１１８プラス
ミド（宝酒造（株））に結合させて、Ｅｍ耐性遺伝子を
各種制限酵素で切り出すことが出来るカセットプラスミ
ドｐ８Ｅｍ１を作製した。
【００２３】次に、約０．２５μｇのｐ８Ｅｍ１をＸｂ
ａＩで切断し、ｐＢＵＬ１約０．０２５μｇをＸｂａＩ
で切断したものとライゲーション反応させた。ライゲー
ション反応後の反応液の半分量をＣｈａｎｇらの方法
（文献１２）でＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
２０７−２５株（文献１３）の形質転換に用いた。形質
転換を行った内の３分の１量を、２５μｇ／ｍｌのエリ
スロマイシンを含むＤＭ３培地プレート上に塗布し、３
７℃で２日間培養してＥｍ耐性の形質転換株を得た。
ａＩで切断し、ｐＢＵＬ１約０．０２５μｇをＸｂａＩ
で切断したものとライゲーション反応させた。ライゲー
ション反応後の反応液の半分量をＣｈａｎｇらの方法
（文献１２）でＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
２０７−２５株（文献１３）の形質転換に用いた。形質
転換を行った内の３分の１量を、２５μｇ／ｍｌのエリ
スロマイシンを含むＤＭ３培地プレート上に塗布し、３
７℃で２日間培養してＥｍ耐性の形質転換株を得た。
【００２４】得られた形質転換株よりプラスミドを調製
し、その制限酵素切断パターンを解析した。ＸｂａＩで
結合した場合、解析した９株中５株が図３のＡ、２株が
図３のＢに示される制限酵素地図を有するプラスミドを
含有していた。図３のＡのプラスミドをｐＸ３、図３の
ＢのプラスミドをｐＸ４と命名した。
し、その制限酵素切断パターンを解析した。ＸｂａＩで
結合した場合、解析した９株中５株が図３のＡ、２株が
図３のＢに示される制限酵素地図を有するプラスミドを
含有していた。図３のＡのプラスミドをｐＸ３、図３の
ＢのプラスミドをｐＸ４と命名した。
【００２５】以上のｐ８Ｅｍ１プラスミド、ｐＢＵＬ１
及びＸｂａＩを用いてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ ２０７−２５株を形質転換したのと同様の実験
を、制限酵素としてＳｃａＩを用いて行ったところ、同
じくＥｍ耐性の形質転換株が得られた。この形質転換株
のうち、プラスミドを解析した６株中５株が図３のＣ、
１株が図３のＤで表される制限酵素地図を有するプラス
ミドを含有していた。これらのプラスミドをそれぞれｐ
Ｓ３及びｐＳ４と命名した。
及びＸｂａＩを用いてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ ２０７−２５株を形質転換したのと同様の実験
を、制限酵素としてＳｃａＩを用いて行ったところ、同
じくＥｍ耐性の形質転換株が得られた。この形質転換株
のうち、プラスミドを解析した６株中５株が図３のＣ、
１株が図３のＤで表される制限酵素地図を有するプラス
ミドを含有していた。これらのプラスミドをそれぞれｐ
Ｓ３及びｐＳ４と命名した。
【００２６】以上示したように、ｐＢＵＬ１にｐＡＭβ
１由来のＥｍ耐性遺伝子（長さ約１．１ｋｂ）を賦与し
た組換えプラスミドｐＸ３、ｐＸ４、ｐＳ３及びｐＳ４
（いずれも長さ約９．１ｋｂ）を得ることが出来た。ま
た、ｐＢＵＬ１は枯草菌中でプラスミドレプリコンとし
て機能することが可能であることも示された。
１由来のＥｍ耐性遺伝子（長さ約１．１ｋｂ）を賦与し
た組換えプラスミドｐＸ３、ｐＸ４、ｐＳ３及びｐＳ４
（いずれも長さ約９．１ｋｂ）を得ることが出来た。ま
た、ｐＢＵＬ１は枯草菌中でプラスミドレプリコンとし
て機能することが可能であることも示された。
【００２７】
【実施例４ （Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓの形質転換）】Ｌａｃｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉ
ｓ（以下、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓと略称することがある）
ＩＬ１４０３株（フランスＩＮＲＡのＡｌａｉｎ Ｃｈ
ｏｐｉｎ博士より分与）を用い、これにＥｍ耐性遺伝子
が組み込まれたｐＢＵＬ１を導入することにより、Ｅｍ
耐性を示すＬｃ．ｌａｃｔｉｓの形質転換株を得ること
に成功した。詳細を以下に記載する。
ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓの形質転換）】Ｌａｃｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉ
ｓ（以下、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓと略称することがある）
ＩＬ１４０３株（フランスＩＮＲＡのＡｌａｉｎ Ｃｈ
ｏｐｉｎ博士より分与）を用い、これにＥｍ耐性遺伝子
が組み込まれたｐＢＵＬ１を導入することにより、Ｅｍ
耐性を示すＬｃ．ｌａｃｔｉｓの形質転換株を得ること
に成功した。詳細を以下に記載する。
【００２８】実施例３で得られた形質転換枯草菌から、
ｐＢＵＬ１にＥｍ耐性遺伝子が組み込まれた組換えプラ
スミドｐＸ３等を、文献１５の方法に従って調製した。
ｐＢＵＬ１にＥｍ耐性遺伝子が組み込まれた組換えプラ
スミドｐＸ３等を、文献１５の方法に従って調製した。
【００２９】次いでｐＸ３を文献１の方法に従って、Ｌ
ｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株へ導入した。形質転
換株は２５μｇ／ｍｌのＥｍを含むＢＬ寒天培地（栄研
化学）プレート上で選択して得た。
ｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株へ導入した。形質転
換株は２５μｇ／ｍｌのＥｍを含むＢＬ寒天培地（栄研
化学）プレート上で選択して得た。
【００３０】これらの形質転換株をＬＣＭＧ培地で培養
した菌体よりＡｎｄｅｒｓｏｎらの方法（文献９）によ
りプラスミドを調製した。得られたプラスミドの制限酵
素認識部位を調べたところ、形質転換に用いたプラスミ
ドと同じ制限酵素認識部位を有していた。このことか
ら、ｐＢＵＬ１は枯草菌の他Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ中でも
プラスミドレプリコンとして機能することが可能である
ことが示された。
した菌体よりＡｎｄｅｒｓｏｎらの方法（文献９）によ
りプラスミドを調製した。得られたプラスミドの制限酵
素認識部位を調べたところ、形質転換に用いたプラスミ
ドと同じ制限酵素認識部位を有していた。このことか
ら、ｐＢＵＬ１は枯草菌の他Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ中でも
プラスミドレプリコンとして機能することが可能である
ことが示された。
【００３１】
【実施例５ （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉ
ｓの形質転換）】実施例４で得られたＬａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＩＬ
１４０３株の形質転換株よりｐＸ３及びｐＸ４プラスミ
ドを調製し、これらを用いてＬｂ．ｌａｃｔｉｓ ＡＴ
ＣＣ１２３１５株及びＭ−９０８株（明治乳業ヘルスサ
イエンス研究所保有株）をエレクトロポレーション法で
形質転換した。産業上の有用性の高いＬａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種は、多くの研究
者の研究にも拘らず、今まで形質転換の報告がなかった
が、本発明プラスミドを用いることにより、以下に示す
ようにＬｂ．ｌａｃｔｉｓで初めて成功することが出来
た。
ｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉ
ｓの形質転換）】実施例４で得られたＬａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＩＬ
１４０３株の形質転換株よりｐＸ３及びｐＸ４プラスミ
ドを調製し、これらを用いてＬｂ．ｌａｃｔｉｓ ＡＴ
ＣＣ１２３１５株及びＭ−９０８株（明治乳業ヘルスサ
イエンス研究所保有株）をエレクトロポレーション法で
形質転換した。産業上の有用性の高いＬａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種は、多くの研究
者の研究にも拘らず、今まで形質転換の報告がなかった
が、本発明プラスミドを用いることにより、以下に示す
ようにＬｂ．ｌａｃｔｉｓで初めて成功することが出来
た。
【００３２】脱脂粉乳培地で継代したＬｂ．ｌａｃｔｉ
ｓ ＡＴＣＣ１２３１５株又はＭ−９０８株をＬＣＭＧ
培地に２％接種し、４２℃で２時間培養後、集菌・洗浄
した後、ＥＰ緩衝液（０．４Ｍシュークロース、１ｍＭ
塩化マグネシウム、７ｍＭ燐酸二水素カリウム；ｐＨ
７．４）にＯＤ660＝４．０となるように懸濁し氷冷し
た。菌懸濁液０．８ｍｌをキュベットに入れ、約０．１
〜２μｇのｐＸ３又はｐＸ４プラスミドを加え、Ｇｅｎ
ｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）によって２５μ
Ｆ、２．５ｋＶのパルスを印加した。
ｓ ＡＴＣＣ１２３１５株又はＭ−９０８株をＬＣＭＧ
培地に２％接種し、４２℃で２時間培養後、集菌・洗浄
した後、ＥＰ緩衝液（０．４Ｍシュークロース、１ｍＭ
塩化マグネシウム、７ｍＭ燐酸二水素カリウム；ｐＨ
７．４）にＯＤ660＝４．０となるように懸濁し氷冷し
た。菌懸濁液０．８ｍｌをキュベットに入れ、約０．１
〜２μｇのｐＸ３又はｐＸ４プラスミドを加え、Ｇｅｎ
ｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）によって２５μ
Ｆ、２．５ｋＶのパルスを印加した。
【００３３】印加後、直ちに発現培地（０．２Ｍラフィ
ノース、５ｍＭ塩化マグネシウム及び１％ラクトースを
添加したＬＣＭＧ培地）４ｍｌに懸濁し、３７℃で４時
間静置培養した。その培養液全量を適当量づつプレート
に分注し、Ｅｍ２５μｇ／ｍｌを添加したＢＬ寒天培地
（滅菌後、５０℃に保持）１０〜１５ｍｌを加えて混釈
し、固化後ＧａｓＰａｋ嫌気培養システム（Ｂｅｃｋｔ
ｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で３７℃で２〜４日間培
養し、形質転換株を選択した。この方法で、１μｇプラ
スミドＤＮＡ当たり約１０〜１００株の形質転換株が得
られた。
ノース、５ｍＭ塩化マグネシウム及び１％ラクトースを
添加したＬＣＭＧ培地）４ｍｌに懸濁し、３７℃で４時
間静置培養した。その培養液全量を適当量づつプレート
に分注し、Ｅｍ２５μｇ／ｍｌを添加したＢＬ寒天培地
（滅菌後、５０℃に保持）１０〜１５ｍｌを加えて混釈
し、固化後ＧａｓＰａｋ嫌気培養システム（Ｂｅｃｋｔ
ｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で３７℃で２〜４日間培
養し、形質転換株を選択した。この方法で、１μｇプラ
スミドＤＮＡ当たり約１０〜１００株の形質転換株が得
られた。
【００３４】この様にして得られたＥｍ耐クローンは、
強いＥｍ耐性（＞１ｍｇ／ｍｌ）を示し、かつ、ｐＸ３
又はｐＸ４と同じ制限酵素地図を持つプラスミドを保持
していたことにより、形質転換株であることが確認され
た。更にこれらの形質転換株から得られたｐＸ３又はｐ
Ｘ４プラスミドＤＮＡを用いると、Ｌｂ．ｌａｃｔｉｓ
ＡＴＣＣ １２３１５株での形質転換頻度が約１０倍
上昇した。
強いＥｍ耐性（＞１ｍｇ／ｍｌ）を示し、かつ、ｐＸ３
又はｐＸ４と同じ制限酵素地図を持つプラスミドを保持
していたことにより、形質転換株であることが確認され
た。更にこれらの形質転換株から得られたｐＸ３又はｐ
Ｘ４プラスミドＤＮＡを用いると、Ｌｂ．ｌａｃｔｉｓ
ＡＴＣＣ １２３１５株での形質転換頻度が約１０倍
上昇した。
【００３５】現在までのところ、上記と同じ条件では、
公知のｐＧＫ１２やｐＩＬ２５３など他のプラスミドＤ
ＮＡ（０．１〜１μｇ）を用いてもＬｂ．ｌａｃｔｉｓ
の形質転換体は得られておらず、Ｌｂ．ｌａｃｔｉｓの
ベクターとして、本発明のｐＢＵＬ１が有用であること
は明らかである。
公知のｐＧＫ１２やｐＩＬ２５３など他のプラスミドＤ
ＮＡ（０．１〜１μｇ）を用いてもＬｂ．ｌａｃｔｉｓ
の形質転換体は得られておらず、Ｌｂ．ｌａｃｔｉｓの
ベクターとして、本発明のｐＢＵＬ１が有用であること
は明らかである。
【００３６】
【実施例６ （Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子
を組み込んだｐＢＵＬ１のＬｂ．ｌａｃｔｉｓへの導入
と形質発現）】乳酸球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ Ｍ−１９２株（明治乳業ヘルスサイエンス研
究所保有株）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺
伝子（特願平２−４５９７６参照；以下、ＳＴ−ＬＤＨ
という）を含む制限酵素ＳｓｐＩ断片（約１．２ｋｂ）
を、ｐＵＣ１１８のＳｍａＩ認識部位に挿入することに
より、図４のＡ及び図４のＢに示されるような組換えプ
ラスミドｐＵ８ＳＴ８及びｐＵ８ＳＴ９を作製した。
を組み込んだｐＢＵＬ１のＬｂ．ｌａｃｔｉｓへの導入
と形質発現）】乳酸球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ Ｍ−１９２株（明治乳業ヘルスサイエンス研
究所保有株）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺
伝子（特願平２−４５９７６参照；以下、ＳＴ−ＬＤＨ
という）を含む制限酵素ＳｓｐＩ断片（約１．２ｋｂ）
を、ｐＵＣ１１８のＳｍａＩ認識部位に挿入することに
より、図４のＡ及び図４のＢに示されるような組換えプ
ラスミドｐＵ８ＳＴ８及びｐＵ８ＳＴ９を作製した。
【００３７】これらの組換えプラスミドをＢａｍＨＩと
ＫｐｎＩとで切断してアガロースゲル電気泳動にかけ、
ＳＴ−ＬＤＨを含むＤＮＡ断片が含まれる部分を切り出
し、次いでＢＩ０１０１社のＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＤＮ
Ａ精製キットを用いて単離することにより、約０．０２
μｇのＤＮＡを得た。このＤＮＡと実施例３で得られた
ｐＸ３及びｐＸ４を約０．３μｇをＢａｍＨＩとＫｐｎ
Ｉとで切断したものとをライゲーションさせた。この反
応液を用いてＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株の形
質転換を行ったところ、図５に示されるようなプラスミ
ドを保持する形質転換株が得られた。これらのプラスミ
ドを、それぞれｐＸＬ３８、ｐＸＬ３９、ｐＸＬ４８及
びｐＸＬ４９と命名した。
ＫｐｎＩとで切断してアガロースゲル電気泳動にかけ、
ＳＴ−ＬＤＨを含むＤＮＡ断片が含まれる部分を切り出
し、次いでＢＩ０１０１社のＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＤＮ
Ａ精製キットを用いて単離することにより、約０．０２
μｇのＤＮＡを得た。このＤＮＡと実施例３で得られた
ｐＸ３及びｐＸ４を約０．３μｇをＢａｍＨＩとＫｐｎ
Ｉとで切断したものとをライゲーションさせた。この反
応液を用いてＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株の形
質転換を行ったところ、図５に示されるようなプラスミ
ドを保持する形質転換株が得られた。これらのプラスミ
ドを、それぞれｐＸＬ３８、ｐＸＬ３９、ｐＸＬ４８及
びｐＸＬ４９と命名した。
【００３８】これらのプラスミドを文献９の方法で調製
し、実施例５で示したのと同じ方法でＬａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌ
ａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ１２３１５株への形質転換に用い
た。その結果、Ｅｍ耐性を示す形質転換株が得られた
が、これらは導入したプラスミドと同じ制限酵素地図を
有するプラスミドを保持していた。
し、実施例５で示したのと同じ方法でＬａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌ
ａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ１２３１５株への形質転換に用い
た。その結果、Ｅｍ耐性を示す形質転換株が得られた
が、これらは導入したプラスミドと同じ制限酵素地図を
有するプラスミドを保持していた。
【００３９】これらの形質転換株を脱脂粉乳培地で培養
し、培養液を蒸留水で希釈した後、その遠心上清中の乳
酸を乳酸測定キット（ＦキットＬ−乳酸；ベーリンガー
社）で測定したところ、本宿主菌が本来は全く生産しな
いＬ−乳酸がＤ−乳酸とほぼ等量検出された。
し、培養液を蒸留水で希釈した後、その遠心上清中の乳
酸を乳酸測定キット（ＦキットＬ−乳酸；ベーリンガー
社）で測定したところ、本宿主菌が本来は全く生産しな
いＬ−乳酸がＤ−乳酸とほぼ等量検出された。
【００４０】更に、形質転換株を破砕してその細胞抽出
液を調べたところ、本宿主菌で検出されないＬ−乳酸脱
水素酵素活性が検出された。このＬ−乳酸脱水素酵素を
精製してＮ末端アミノ酸を調べたところ、ＳＴ−ＬＤＨ
と同じであった。以上の結果から、ｐＢＵＬ１をレプリ
コンとしてＬｂ．ｌａｃｔｉｓに異種遺伝子を発現させ
ることが可能であることが示された。
液を調べたところ、本宿主菌で検出されないＬ−乳酸脱
水素酵素活性が検出された。このＬ−乳酸脱水素酵素を
精製してＮ末端アミノ酸を調べたところ、ＳＴ−ＬＤＨ
と同じであった。以上の結果から、ｐＢＵＬ１をレプリ
コンとしてＬｂ．ｌａｃｔｉｓに異種遺伝子を発現させ
ることが可能であることが示された。
【００４１】
【実施例７】（ｐＢＵＬ１の複製に必要な領域のデリー
ション法による推定） ｐＸ３をＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断し、キロシー
クエンス用ＤＮＡデリーションキット（宝酒造（株））
を用いて、図６に示した方向への欠失を行なった。反応
液を実施例４と同様に、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４
０３株へ形質転換し、２５μｇ／ｍｌのＥｍで選択し
た。Ｅｍ耐性を示す形質転換株が保持しているプラスミ
ドを調製して、その制限酵素認識部位を調べたところ、
最短のもので図６に示された位置、ＳｃａＩより時計回
りにおよそ１１００ｂｐ、ＮｄｅＩより反時計回りにお
よそ４５０ｂｐの位置までの欠失体が得られた。これを
ｐＸ３Δ１８と命名した。このように得られたｐＸ３Δ
１８をＰｓｔＩと、さらにＢｇｌII、ＳＰｈＩ、Ｅｃｏ
４７IIIのいずれかで切断後、自己環化ライゲーション
を行なった反応液を実施例４と同様に、Ｌｃ．ｌａｃｔ
ｉｓ ＩＬ１４０３株へ形質転換、選択した結果、いず
れもが予想どおりの制限酵素地図を持つプラスミドを有
していた。図６及び図７においてｐＸ３Δ１８Ｅとして
示されているプラスミド（Ｅｃｏ４７IIIで切断後環化
したもの）はその中で最短のものであり、ｐＢＵＬ１の
複製に必要な領域はｐＸ３Δ１８Ｅの約４ｋｂの領域に
含まれていることが判明した。
ション法による推定） ｐＸ３をＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断し、キロシー
クエンス用ＤＮＡデリーションキット（宝酒造（株））
を用いて、図６に示した方向への欠失を行なった。反応
液を実施例４と同様に、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４
０３株へ形質転換し、２５μｇ／ｍｌのＥｍで選択し
た。Ｅｍ耐性を示す形質転換株が保持しているプラスミ
ドを調製して、その制限酵素認識部位を調べたところ、
最短のもので図６に示された位置、ＳｃａＩより時計回
りにおよそ１１００ｂｐ、ＮｄｅＩより反時計回りにお
よそ４５０ｂｐの位置までの欠失体が得られた。これを
ｐＸ３Δ１８と命名した。このように得られたｐＸ３Δ
１８をＰｓｔＩと、さらにＢｇｌII、ＳＰｈＩ、Ｅｃｏ
４７IIIのいずれかで切断後、自己環化ライゲーション
を行なった反応液を実施例４と同様に、Ｌｃ．ｌａｃｔ
ｉｓ ＩＬ１４０３株へ形質転換、選択した結果、いず
れもが予想どおりの制限酵素地図を持つプラスミドを有
していた。図６及び図７においてｐＸ３Δ１８Ｅとして
示されているプラスミド（Ｅｃｏ４７IIIで切断後環化
したもの）はその中で最短のものであり、ｐＢＵＬ１の
複製に必要な領域はｐＸ３Δ１８Ｅの約４ｋｂの領域に
含まれていることが判明した。
【００４２】
【実施例８ （ｐＸ３Δ１８Ｅプラスミドと大腸菌プラ
スミドとの結合によるシャトルベクターの作製）】実施
例７において得られたｐＸ３Δ１８ＥプラスミドをＬ
ｃ．ｌａｃｔｉｓＩＬ１４０３の形質転換株より文献９
の方法にしたがって調製した。得られたｐＸ３Δ１８Ｅ
をマルチクローニングサイト中のＳｐｈＩで切断し、大
腸菌プラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造（株））あるいは
ｐＵＣ１１８をそれぞれＳｐｈＩで切断したものとライ
ゲーションを行なった後、反応液を大腸菌ＴＧ１株〔Δ
（ｌａｃ−ｐｒｏ）ｓｕｐＥ ｔｈｉ ｈｓｄＤ５／Ｆ
ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ ｌａｃＩｑ ｌａｃ
ＺΔＭ１５〕（アマシャム社）に、周知の方法である塩
化カルシウム法により形質転換した。Ｅｍ ５００μｇ
／ｍｌで選択した形質転換株は、図８〜図１１に示され
るように、ｐＸ３Δ１８ＥプラスミドとｐＢＲ３２２あ
るいはｐＵＣ１１８が結合したプラスミドを有していた
（ｐＢＲ３Δ１８Ｅ１、ｐＢＲ３Δ１８Ｅ２；ｐ８Ｘ３
Δ１８Ｅ１、ｐ８Ｘ３Δ１８Ｅ２）。
スミドとの結合によるシャトルベクターの作製）】実施
例７において得られたｐＸ３Δ１８ＥプラスミドをＬ
ｃ．ｌａｃｔｉｓＩＬ１４０３の形質転換株より文献９
の方法にしたがって調製した。得られたｐＸ３Δ１８Ｅ
をマルチクローニングサイト中のＳｐｈＩで切断し、大
腸菌プラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造（株））あるいは
ｐＵＣ１１８をそれぞれＳｐｈＩで切断したものとライ
ゲーションを行なった後、反応液を大腸菌ＴＧ１株〔Δ
（ｌａｃ−ｐｒｏ）ｓｕｐＥ ｔｈｉ ｈｓｄＤ５／Ｆ
ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ ｌａｃＩｑ ｌａｃ
ＺΔＭ１５〕（アマシャム社）に、周知の方法である塩
化カルシウム法により形質転換した。Ｅｍ ５００μｇ
／ｍｌで選択した形質転換株は、図８〜図１１に示され
るように、ｐＸ３Δ１８ＥプラスミドとｐＢＲ３２２あ
るいはｐＵＣ１１８が結合したプラスミドを有していた
（ｐＢＲ３Δ１８Ｅ１、ｐＢＲ３Δ１８Ｅ２；ｐ８Ｘ３
Δ１８Ｅ１、ｐ８Ｘ３Δ１８Ｅ２）。
【００４３】これら形質転換株は、大腸菌ｐＢＲ３２２
およびｐＵＣ１１８プラスミドに由来するアンピシリン
耐性（５０μｇ／ｍｌ）も有していた。また、大腸菌よ
り分離精製したこれらの組換えプラスミドを実施例４と
同様に、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓＩＬ１４０３株へ形質転換
し、２５μｇ／ｍｌのＥｍで選択した結果、Ｅｍ耐性を
示す形質転換株が得られた。形質転換株が保持している
プラスミドを調製して、その制限酵素認識部位を調べた
ところ、大腸菌より調製した物と同じ制限酵素地図を有
していた。以上により、ｐＢＵＬ１の誘導体の一つであ
るｐＸ３Δ１８Ｅは、大腸菌プラスミドと結合させるこ
とにより、大腸菌をアンピシリンおよびＥｍで、また乳
酸球菌をＥｍでそれぞれ選択可能なシャトルベクターと
して利用できることが判明し、ｐＢＵＬ１の有用性が示
された。
およびｐＵＣ１１８プラスミドに由来するアンピシリン
耐性（５０μｇ／ｍｌ）も有していた。また、大腸菌よ
り分離精製したこれらの組換えプラスミドを実施例４と
同様に、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓＩＬ１４０３株へ形質転換
し、２５μｇ／ｍｌのＥｍで選択した結果、Ｅｍ耐性を
示す形質転換株が得られた。形質転換株が保持している
プラスミドを調製して、その制限酵素認識部位を調べた
ところ、大腸菌より調製した物と同じ制限酵素地図を有
していた。以上により、ｐＢＵＬ１の誘導体の一つであ
るｐＸ３Δ１８Ｅは、大腸菌プラスミドと結合させるこ
とにより、大腸菌をアンピシリンおよびＥｍで、また乳
酸球菌をＥｍでそれぞれ選択可能なシャトルベクターと
して利用できることが判明し、ｐＢＵＬ１の有用性が示
された。
【００４４】
【実施例９ （ｐＸ３Δ１８Ｅプラスミドの大腸菌での
複製）】実施例７において得られたｐＸ３Δ１８Ｅプラ
スミドをＬｃ．ｌａｃｔｉｓＩＬ１４０３の形質転換株
より文献９の方法にしたがって調製し、実施例８と同様
な方法で大腸菌ＴＧ１株への形質転換を行なった。得ら
れたＥｍ耐性（Ｅｍ５００μｇ／ｍｌ）形質転換株は、
形質転換に使用したｐＸ３Δ１８Ｅと同じ制限酵素地図
を持つプラスミドを有していた。以上によりｐＢＵＬ１
の誘導体の一つであるｐＸ３Δ１８Ｅは、大腸菌中でも
プラスミドとして複製可能、かつｐＸ３Δ１８Ｅを保持
する大腸菌をＥｍ耐性で選択可能であり、グラム陽性菌
・陰性菌間でのシャトルベクターとして利用できること
が判明し、ｐＢＵＬ１の有用性が示された。
複製）】実施例７において得られたｐＸ３Δ１８Ｅプラ
スミドをＬｃ．ｌａｃｔｉｓＩＬ１４０３の形質転換株
より文献９の方法にしたがって調製し、実施例８と同様
な方法で大腸菌ＴＧ１株への形質転換を行なった。得ら
れたＥｍ耐性（Ｅｍ５００μｇ／ｍｌ）形質転換株は、
形質転換に使用したｐＸ３Δ１８Ｅと同じ制限酵素地図
を持つプラスミドを有していた。以上によりｐＢＵＬ１
の誘導体の一つであるｐＸ３Δ１８Ｅは、大腸菌中でも
プラスミドとして複製可能、かつｐＸ３Δ１８Ｅを保持
する大腸菌をＥｍ耐性で選択可能であり、グラム陽性菌
・陰性菌間でのシャトルベクターとして利用できること
が判明し、ｐＢＵＬ１の有用性が示された。
【００４５】
１．Ｈｏｌｏ Ｈ．ａｎｄ Ｉ．Ｆ．Ｎｅｓ，（１９８
９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５５（１２）３１１９−３１２３。 ２．Ｍｅｒｃｅｎｉｅｒ，Ａ．，（１９９０）ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，８７，６１−７７。 ３．Ｓｃｈｅｉｒｌｉｎｃｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１
９８９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５５（９）２１３０−２１３７。 ４．Ｃｈａｓｓｙ，Ｂ．Ｍ．ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｆｌｉｃ
ｋｉｎｇｅｒ，（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｌｅｔｔ．，（４４）１７３−１７７。 ５．ｄｅ Ｖｏｓ，Ｗ．Ｎ．，（１９８７ ＦＥＲＭ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，４６，２８１−２９
５。 ６．Ｋｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ａｐｐ
ｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４８，７
２６−７３１。 ７．Ｓｉｍｏｎ Ｄ，ａｎｄ Ａ．Ｃｈｏｐｉｎ，（１
９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７０（４）５５９−５６
６。 ８．Ｅｆｔｈｙｍｉｏｕ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（１９６
２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１１０，２５８−２
６７。 ９．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｄ．ａｎｄ Ｌ．Ｌ．Ｍｃｋａ
ｙ，（１９８３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，４６，５４９−５５２。 １０．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９８
２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。 １１．ＬｅＢｌａｎｃ Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｌ．Ｎ．Ｌｅ
ｅ，（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５７
４４５−４５３。 １２．Ｃｈａｎｇ Ｓ．ａｎｄ Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ，
（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．，１６８，
１１１−１１５。 １３．Ｙａｍａｎｅ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８
４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６，１８４９−１８５８。 １４．安藤忠彦、坂口健二編、（１９８７）微生物学基
礎講座８、遺伝子工学第６章枯草菌、ｐｐ．１６８−２
１５。
９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５５（１２）３１１９−３１２３。 ２．Ｍｅｒｃｅｎｉｅｒ，Ａ．，（１９９０）ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，８７，６１−７７。 ３．Ｓｃｈｅｉｒｌｉｎｃｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１
９８９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５５（９）２１３０−２１３７。 ４．Ｃｈａｓｓｙ，Ｂ．Ｍ．ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｆｌｉｃ
ｋｉｎｇｅｒ，（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｌｅｔｔ．，（４４）１７３−１７７。 ５．ｄｅ Ｖｏｓ，Ｗ．Ｎ．，（１９８７ ＦＥＲＭ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，４６，２８１−２９
５。 ６．Ｋｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ａｐｐ
ｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４８，７
２６−７３１。 ７．Ｓｉｍｏｎ Ｄ，ａｎｄ Ａ．Ｃｈｏｐｉｎ，（１
９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７０（４）５５９−５６
６。 ８．Ｅｆｔｈｙｍｉｏｕ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（１９６
２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１１０，２５８−２
６７。 ９．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｄ．ａｎｄ Ｌ．Ｌ．Ｍｃｋａ
ｙ，（１９８３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，４６，５４９−５５２。 １０．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９８
２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。 １１．ＬｅＢｌａｎｃ Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｌ．Ｎ．Ｌｅ
ｅ，（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５７
４４５−４５３。 １２．Ｃｈａｎｇ Ｓ．ａｎｄ Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ，
（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．，１６８，
１１１−１１５。 １３．Ｙａｍａｎｅ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８
４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６，１８４９−１８５８。 １４．安藤忠彦、坂口健二編、（１９８７）微生物学基
礎講座８、遺伝子工学第６章枯草菌、ｐｐ．１６８−２
１５。
【００４６】
【発明の効果】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂ
ｒｕｅｃｋｉｉ亜種において自律複製可能なプラスミド
の存在は今まで知られておらず、本発明者らが初めて見
い出したものである。また、本発明プラスミドをレプリ
コンとして用いることによりＬｂ．ｌａｃｔｉｓの形質
転換が初めて可能となった。それ故、本発明プラスミド
に種々の遺伝子を組み込んで、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種に導入し、有用な形
質、例えば高い乳糖資化能や改善された乳蛋白質分解活
性等を有する改良種を創製することが期待される。また
本発明によればシャトルベクターでもある広宿主域プラ
スミドも提供することができるので、更に有効性が高ま
る。
ｒｕｅｃｋｉｉ亜種において自律複製可能なプラスミド
の存在は今まで知られておらず、本発明者らが初めて見
い出したものである。また、本発明プラスミドをレプリ
コンとして用いることによりＬｂ．ｌａｃｔｉｓの形質
転換が初めて可能となった。それ故、本発明プラスミド
に種々の遺伝子を組み込んで、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種に導入し、有用な形
質、例えば高い乳糖資化能や改善された乳蛋白質分解活
性等を有する改良種を創製することが期待される。また
本発明によればシャトルベクターでもある広宿主域プラ
スミドも提供することができるので、更に有効性が高ま
る。
【００４７】また、本発明プラスミドはヨーグルト中に
存在するＬｂ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの一株から分離さ
れたものであるから、歴史的に安全性が確かめられてい
るものであって、しかもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種のみならず、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ属やＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属などの食品工業等に
おいて重要な菌種をも形質転換させる能力を有している
ことから、種々の食品製造のほか、酵素や各種生理活性
物質製造用等の微生物の育種にも利用することが期待さ
れる。
存在するＬｂ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの一株から分離さ
れたものであるから、歴史的に安全性が確かめられてい
るものであって、しかもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種のみならず、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ属やＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属などの食品工業等に
おいて重要な菌種をも形質転換させる能力を有している
ことから、種々の食品製造のほか、酵素や各種生理活性
物質製造用等の微生物の育種にも利用することが期待さ
れる。
【図１】ｐＢＵＬ１の制限酵素地図である。各制限酵素
の認識部位をＢｇｌＩＩを基準として、ｋｂ単位で示し
た。ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ及び
ＳａｌＩ認識部位は存在しない。なおｐＢＵＬ１の構造
の中で配列番号１に示される塩基配列に該当する個所
（ＳｍａＩ断片のうち、３番目の大きさのもの）を太線
で示す。
の認識部位をＢｇｌＩＩを基準として、ｋｂ単位で示し
た。ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ及び
ＳａｌＩ認識部位は存在しない。なおｐＢＵＬ１の構造
の中で配列番号１に示される塩基配列に該当する個所
（ＳｍａＩ断片のうち、３番目の大きさのもの）を太線
で示す。
【図２】エリスロマイシン耐性カセットプラスミドｐ８
Ｅｍ１の構築手順を示したものである。図中ΔはｐＵＣ
１１８由来のマルチクローニングサイトを示す。
Ｅｍ１の構築手順を示したものである。図中ΔはｐＵＣ
１１８由来のマルチクローニングサイトを示す。
【図３】ｐＢＵＬ１誘導体である、ｐＸ３、ｐＸ４、ｐ
Ｓ３及びｐＳ４の制限酵素地図である（これらのプラス
ミドはいずれも環状であるが、ＢｇｌＩＩを基準として
直線状にして示した）。図中細線はｐＢＵＬ１の配列
を、太線はｐＡＭβ１由来のエリスロマイシン耐性遺伝
子を示す。
Ｓ３及びｐＳ４の制限酵素地図である（これらのプラス
ミドはいずれも環状であるが、ＢｇｌＩＩを基準として
直線状にして示した）。図中細線はｐＢＵＬ１の配列
を、太線はｐＡＭβ１由来のエリスロマイシン耐性遺伝
子を示す。
【図４】プラスミドｐＵ８ＳＴ８及びｐＵ８ＳＴ９の制
限酵素地図である。図中の点線矢印はＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｍ−１９２株のＬ−乳酸脱水素
酵素（ＳＴ−ＬＤＨ）遺伝子を示す。
限酵素地図である。図中の点線矢印はＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｍ−１９２株のＬ−乳酸脱水素
酵素（ＳＴ−ＬＤＨ）遺伝子を示す。
【図５】プラスミドｐＸＬ３８、ｐＸＬ３９、ｐＸＬ４
８及びｐＸＬ４９の制限酵素地図を表す（なおこれらは
いずれも環状であるが、ＢｇｌＩＩを基準として直線状
にして示した）。図中細線はｐＢＵＬ１の配列を、太線
はｐＡＭβ１由来のエリスロマイシン耐性遺伝子、点線
矢印はＳＴ−ＬＤＨ遺伝子を示す。
８及びｐＸＬ４９の制限酵素地図を表す（なおこれらは
いずれも環状であるが、ＢｇｌＩＩを基準として直線状
にして示した）。図中細線はｐＢＵＬ１の配列を、太線
はｐＡＭβ１由来のエリスロマイシン耐性遺伝子、点線
矢印はＳＴ−ＬＤＨ遺伝子を示す。
【図６】デリーション法によるｐＢＵＬ１の複製必須領
域（太線）の推定過程を示した図である。
域（太線）の推定過程を示した図である。
【図７】ｐＢＵＬ１の複製必須領域（太線）を含有する
ｐＸ３Δ１８Ｅプラスミドの制限酵素地図である。
ｐＸ３Δ１８Ｅプラスミドの制限酵素地図である。
【図８】ｐＸ３Δ１８Ｅプラスミドと大腸菌プラスミド
（ｐＢＲ３２２）との結合によるｐＢＲ３Δ１８Ｅ１プ
ラスミドの制限酵素地図である。
（ｐＢＲ３２２）との結合によるｐＢＲ３Δ１８Ｅ１プ
ラスミドの制限酵素地図である。
【図９】同じくｐＢＲ３Δ１８Ｅ２プラスミドの制限酵
素地図である。
素地図である。
【図１０】ｐＸ３Δ１８Ｅプラスミドと大腸菌プラスミ
ド（ｐＵＣ１１８）との結合によるｐ８Ｘ３Δ１８Ｅ１
プラスミドの制限酵素地図である。
ド（ｐＵＣ１１８）との結合によるｐ８Ｘ３Δ１８Ｅ１
プラスミドの制限酵素地図である。
【図１１】同じくｐ８Ｘ３Δ１８Ｅ２プラスミドの制限
酵素地図である。
酵素地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｒ 1:125） 1:225） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:225） Ｃ１２Ｒ 1:225） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/09 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】 下記の性質を有し、下図１に示す制限酵
素地図を有する環状二本鎖ＤＮＡプラスミドｐＢＵＬ
１。 （ａ）約８．０ｋｂの長さを持つ。 （ｂ）ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ及
びＳａｌＩ認識部位を有しない。 （ｃ）下図１に示すＳｃａＩ認識部位から時計回りに約
１．１ｋｂｐ離れ、ＮｄｅＩ認識部位から反時計回りに
約０．４５ｋｂｐ離れた部位とＥｃｏ４７ＩＩＩ認識部
位との間の約４ｋｂｐの領域に複製領域を含んでいる。 （ｄ）下図１の太線部分の１３４４ｂｐのＳｍａＩ断片
の塩基配列が配列番号１で表される。 （ｅ）ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピー
シーズ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉ
ｃｕｓ）Ｍ−８７８株由来である。 【図１】 - 【請求項２】 請求項１の環状二本鎖ＤＮＡプラスミド
ｐＢＵＬ１を含有し、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１１９７
８として寄託されているラクトバチルス・デルブリュッ
キー・サブスピーシーズ・ブルカリクス（Ｌａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓ
ｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）Ｍ−８７８株。 - 【請求項３】 請求項１の環状二本鎖ＤＮＡプラスミド
に選択マーカーが組み込まれてなる環状二本鎖ＤＮＡプ
ラスミド。 - 【請求項４】 選択マーカーがｐＡＭβ１由来のエリス
ロマイシン耐性遺伝子である請求項３の環状二本鎖ＤＮ
Ａプラスミド。 - 【請求項５】 請求項３又は請求項４の環状二本鎖ＤＮ
Ａプラスミドに外来遺伝子が組み込まれてなる環状二本
鎖ＤＮＡプラスミド。 - 【請求項６】 外来遺伝子がストレプトコッカス・サリ
バリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂ
ｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＬ−乳酸脱水
素酵素遺伝子である請求項３の環状二本鎖ＤＮＡプラス
ミド。 - 【請求項７】 請求項５〜請求項６のいずれか１項の環
状二本鎖ＤＮＡプラスミドを宿主微生物に導入してなる
形質転換微生物。 - 【請求項８】 形質転換微生物が、バチルス・ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトコ
ッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａ
ｃｔｉｓ）及び／又はラクトバチルス・デルブリュッキ
ー・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａ
ｃｔｉｓ）である請求項７の形質転換微生物。 - 【請求項９】 図１で示される環状二本鎖ＤＮＡプラス
ミドｐＢＵＬ１のＳｃａＩ認識部位から時計回りに約
１．１ｋｐ離れ、ＮｄｅＩ認識部位から反時計回りに約
０．４５ｋｂｐ離れた部位とＥｃｏ４７ＩＩＩ認識部位
との間（下図２（図７と同じ）の太線部分）の約４ｋｂ
ｐの領域（ここに複製領域を含む）およびｐＡＭβ１由
来のエリスロマイシン耐性遺伝子を含み、下図２に示す
制限酵素地図を有する環状二本鎖ＤＮＡプラスミドｐＸ
３Δ１８Ｅ。 【図２】 - 【請求項１０】 請求項９のプラスミドｐＸ３Δ１８Ｅ
と大腸菌由来のプラスミド断片とを結合してなるシャト
ルベクターとしても利用可能なプラスミド。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18392291A JP3294288B2 (ja) | 1991-02-22 | 1991-06-28 | 乳酸桿菌由来の新規なプラスミドｐＢＵＬ１ 及びその誘導体 |
| CA002079174A CA2079174A1 (en) | 1991-02-22 | 1992-02-24 | Plasmid pbul1 derived from a lactobacillus and the derivatives thereof |
| DE69207512T DE69207512T2 (de) | 1991-02-22 | 1992-02-24 | Aus lactobacillus gewonnenes plasmid und derivat davon |
| AU12058/92A AU654326B2 (en) | 1991-02-22 | 1992-02-24 | Novel plasmid pBUL1 derived from lactobacillus and derivative thereof |
| DK92905307.2T DK0529088T3 (da) | 1991-02-22 | 1992-02-24 | Hidtil ukendt plasmid pBUL1 afledt af en lactobacillus og derivater af dette |
| EP92905307A EP0529088B1 (en) | 1991-02-22 | 1992-02-24 | NOVEL PLASMID pBUL1 DERIVED FROM LACTOBACILLUS AND DERIVATIVE THEREOF |
| PCT/JP1992/000193 WO1992014825A1 (fr) | 1991-02-22 | 1992-02-24 | NOUVEAU PLASMIDE pBUL1 DERIVE DE LACTOBACILLUS ET DERIVE DE CE PRODUIT |
| US07/940,852 US5426047A (en) | 1991-02-22 | 1992-02-24 | Plasmid pBUL1 derived from a lactobacillus and derivatives thereof |
| US08/396,126 US5688683A (en) | 1991-02-22 | 1995-02-28 | Plasmid pBUL1 derived from a lactobacillus and derivatives thereof |
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| JP11267491 | 1991-02-22 | ||
| JP3-87338 | 1991-03-28 | ||
| JP8733891 | 1991-03-28 | ||
| JP18392291A JP3294288B2 (ja) | 1991-02-22 | 1991-06-28 | 乳酸桿菌由来の新規なプラスミドｐＢＵＬ１ 及びその誘導体 |
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|---|---|---|---|---|
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| JP3294288B2 (ja) * | 1991-02-22 | 2002-06-24 | 明治乳業株式会社 | 乳酸桿菌由来の新規なプラスミドｐＢＵＬ１ 及びその誘導体 |
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1992
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