JP3246918B2

JP3246918B2 - 感染症の治療のためのＩＬ―１２およびＩＦＮαの使用

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Publication number: JP3246918B2
Application number: JP54048197A
Authority: JP
Inventors: アルバー，ゴットフリート; カー，ジャクリーン・アン; マットネル，フランク・アルベルト; ミュルクィーン，マイケル・ジョン; パルマー，カスリン; ロジャーソン，ジェーン・アンドレ・ルイーズ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1996-05-13
Filing date: 1997-05-07
Publication date: 2002-01-15
Anticipated expiration: 2017-05-07
Also published as: EP0907373B1; PT907373E; EP0907373A1; WO1997042969A1; CA2253490A1; DE69729796D1; CN1218410A; DE69729796T2; ATE270556T1; AR007051A1; CN1178694C; CA2253490C; US5928636A; GB9609932D0; TR199802329T2; JP2000504029A; ES2224246T3; BR9709238A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、インターロイキン−12（IL−12）およびイ
ンターフェロン−α（IFNα）の組み合わせを使用し
た、感染症の予防および治療の分野に関する。この組み
合わせは、慢性感染症、例えばウイルス感染症、細胞内
細菌感染症および寄生虫感染症の予防および治療に特に
有用である。

感染症は成人の主要な病因および死因である（Marglo
is（1993）J.Infect.Dis.168,9−14）。例えば、ウイル
スにより引き起こされた肝疾患は、肝硬変および原発性
肝臓癌の誘導と関連しており、これらに関連した死亡の
件数は年間150万件である。現在の推計では、世界中で
３億人以上の人々がＢ型肝炎感染の慢性キャリアであ
り、毎年５千万以上の症例が新たに発生していると見積
もられている（Finter et al（1991）Drugs42,749−76
5）。頻度は高くないが、慢性Ｃ型肝炎感染も、その後
の肝硬変および肝細胞癌の発症に関与しており（３）、
西洋の国々における肝疾患の主要な原因となっている
（Scrip2170（1996）p.20）。したがって、これらのウ
イルス感染症は、大きな需要のある医療分野である。

これらの感染症の持続は、Ｔ細胞の寛容が誘導される
こと、およびウイルスを除去できないことに関連してい
る（Reis ＆ Rouse（1993）Immunol.Today14,333−33
5）。Ｉ型インターフェロン、特にIFNαによる現行の治
療は、ウイルス除去を促進させることに成功している。
ウイルス除去は、血清からのウイルスRNAの消失、およ
び患者のセロコンバージョンにより測定される。しか
し、持続的な効果は通常一部の患者にしか見られず、Ｂ
型肝炎患者で長期的な反応を示すのは25〜30％である
（Finter et al.前記文献）。Ｃ型肝炎患者による反応
性は様々であり、それは感染しているウイルスの遺伝子
型により異なるのかもしれない（Clarysse et al.（199
5）Netherlands J.Med.47,265−271）。インフルエンザ
様症状、疲労、体重減少、血小板数減少などのＩ型IFN
治療の副作用が、臨床において通常使用される最大用量
を制限しており、比較的低い反応率が観察される原因と
なっている。したがって、Ｉ型IFNの作用を補足する治
療は、反応率を増大させ、慢性肝炎ウイルス感染のため
の免疫療法の臨床上の有益性を改善する可能性を有して
いる。

インターロイキン12（IL−12）は、以前はナチュラル
・キラー細胞刺激因子（Kobayashi et al.（1989）J.Ex
p.Med.170,827−845）および細胞障害性リンパ球成熟因
子（Stern et al.（1990）Proc,Natl.Acad.Sci.USA87,6
808−6812）と呼ばれていたものであり、いくつかのマ
ウス腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍活性および抗転移
活性を有している（Brunda et al.（1993）J.Exp.Med.1
78,1223−1230;Nastala et al.（1994）J.Immunol.153,
1697−1706）。IL−12が抗腫瘍効果を発揮するメカニズ
ムは完全には理解されていないが、IL−12はインビトロ
でナチュラル・キラー細胞およびＴ細胞に対して様々な
生物学的効果を誘導することが示されている（Manetti
et al.（1994）J.Exp.Med.179,1273−1283;Wu et al.
（1993）J.Immunol.151,1938−1949;Tripp et al.（199
3）Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,3725−3729;Seder et a
l.（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,10188−10192;Bl
oom et al.（1994）J.Immunol.152,4242−4254;Cesano
et al.（1993）J.Immunol.151,2943−2957;Chan et al.
（1992）J.Immunol.148,92−98）。IL−12による細胞障
害性Ｔリンパ球の活性化は、その抗腫瘍活性に重要であ
ると考えられている（Brunda et al.（1993）J.Exp.Me
d.178,1223−1230）。IL−12の抗腫瘍効果は、いずれも
Ｔ細胞を欠損している。重症複合免疫不全マウス（SCI
D）およびヌードマウスにおいて、そしてCD8⁺を枯渇し
た気分正常マウスにおいて、部分的に維持されている
（Brunda et al.（1993）J.Exp.Med.178,1223−1230;O'
Toole et al.（1993）J.Immunol.150,294A）。これらの
結果は、IL−12がインビボでマウスの腫瘍に対して強力
な抗腫瘍効果および抗転移効果を有していることを示し
ており、皮下腫瘍に対する抗腫瘍効果の媒介にCD8⁺T細
胞が重要な役割を果たしていることも示している。

インターフェロン（IFN）は、抗ウイルス活性、抗増
殖活性および免疫調節活性を有する天然のタンパク質で
ある。４つの異なるクラスのインターフェロンがヒトに
存在することが知られている（Pestka et al.（1987）A
nn.Rev.Biochem.56,727−777およびEmanuel ＆ Pestka
（1993）J.Biol.Chem.268,12565−12569）。IFNαファ
ミリーは、刺激された末梢血白血球（Pestka et al.上
記引用;Havell et al.（1975）Proc.Natl.Acad.Sci.USA
72,2185−2187;Cavalieri et al.（1977）Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA74,3287−3291）ならびにリンパ芽球細胞系
および骨髄芽球細胞系（Familletti et al.（1981）Ant
imicrob.Agents.Chemother.20,5−９）により産正され
る、IFNの主要なクラスである。IFNαの抗ウイルス効果
は、ウイルス自体に対する直接的な影響によるのではな
く、標的細胞に対する活性がウイルス感染に対する防御
という効果をもつことにより達成される。インターフェ
ロンは、例えば、マクロファージおよびNK細胞を活性化
し、細胞膜の免疫学的に重要な様々な成分の発現を強化
するため、癌腫瘍に対して効果を示し、生体の免疫系に
影響を与えることができるのかもしれない。インターフ
ェロンcDNAの調製、および特に大腸菌における直接発現
の詳細は、多くの文献の主題となっている。したがっ
て、例えば、組換えインターフェロンの調製は、例え
ば、Nature295（1982）,503−508、Nature284（1980）,
316−320、Nature290（1981）,20−26、Nucleic Acids
Res.8（1980）,4057−4074、ならびに欧州特許第32134
号、第43980号および第211148号明細書に開示されてい
る。

IFNαは、ウイルス感染症、例えばＢ型肝炎ウイルス
およびＣ型肝炎ウイルス（HBV、HCV）両方の感染症の治
療に有効であることが証明されているが、相当数の患者
がこのサイトカインに反応しない。Th1成熟ならびにCTL
活性およびNK活性の増強を促進するIL−12の能力は、ウ
イルス感染症のマウスモデルにおける疾患防御能にとっ
て重要である可能性が高い（Orange et al.（1994）J.I
mmunol.152,1253−1264）。

本発明は、IFNαと組み合わせてIL−12を使用した、
感染症の予防および治療の分野に関する。驚くべきこと
に、最適以下の用量（sub−optimal doses）のIL−12お
よびIFNαは、感染症、特にウイルス感染症および寄生
虫感染症および細胞内細菌感染症に対するインビトロお
よびインビボの効果的な防御を促進する。

本発明により、IL−12およびIFNαの組み合わせが薬
学的に許容される担体と共に提供される。これは、感染
症、好ましくは慢性感染症、より好ましくはヘルペス
（HSV）、HIV、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎などのウイルス感染
症、結核、サルモネラ症、リステリア症などの細胞内細
菌感染症、およびマラリア、リーシュマニア症、住血吸
虫症などの寄生虫感染症の治療および予防に有効であ
る。これらの組成物は、IL−12とIFNαの相乗作用を特
徴とする。それらは、非経口を含む様々な経路により容
易に投与することができ、安全で、かつ感染症を治療ま
たは予防するために十分な用量で投与できる。上記の薬
学的組成物は、感染症の治療に有用な付加的な化合物を
含んでいてもよい。本発明は、上記の感染症の治療およ
び予防のための薬剤の製造のための、上記化合物の使用
も提供する。

図面の簡単な説明図1:マウスＴヘルパーリンパ球の成熟Th1細胞またはT
h2細胞へのインビトロ分化。CD4＋Ｔリンパ球をマウス
脾臓から精製した。細胞を固定化抗CD3抗体で活性化し
た。IL−12、IL−４および／またはIFNαと共に５日間
インキュベートした後、ELISAによりIFNγおよびIL−10
に関して上清を分析した。

図2:IL−12および／またはIFNαで分化したヘルパー
Ｔリンパ球によるIFNγ産生。精製したCD4＋脾細胞を抗
CD3で活性化した。IL−12および／またはIFNαを含む培
地で５日間細胞をインキュベートした。

図3:IL−12および／またはIFNαで分化したヘルパー
Ｔリンパ球によるIL−10産生。精製したCD4⁺脾細胞を抗
CD3で活性化した。IL−12および／またはIFNαを含む培
地で５日間細胞をインキュベートした。IL−10をELISA
で決定した。

図4:IL−12およびIFNαの共投与は、全身HSV感染を防
御する。方法に詳細に記載されているように、BALB/cマ
ウス（１群15匹）をIL−12、IFNαまたはこれら２つの
サイトカインの組み合わせで処理した後、HSV−２を感
染させた。感染後20日目まで毎日死亡率を確認し、感染
未処理対照動物と比較した。

図5:IL−12＋IFNαによるHSV感染防御に対するIFNγ
枯渇の効果。HSV−２感染の時点から−３、−１、０、
２および４日目に、抗インターフェロン−γ抗体（XMG
1.2、100μｇ、腹腔内注射）を投与した。実施例に詳細
に記載されているように、IL−12およびIFNαで動物を
処理した。

図6:HSV−２抗原で刺激された脾細胞培養物によるIFN
γ産生。UV不活化されたHSV−２で刺激された脾細胞培
養物の感染後10日目のIFNγ産生。

図7:IL−12およびIFNαの共投与は、全身mCMV感染を
防御する。方法に詳細に記載されているように、BALB/c
マウス（１群15匹）をIL−12、IFNαまたはこれら２つ
のサイトカインの組み合わせで処理した後、mCMVを感染
させた。感染後14日目まで毎日死亡率を確認した。

本発明は、感染症、特に慢性感染症の治療のための薬
剤の調製のための、IL−12およびIFNαの使用を提供す
る。これらの感染症は、ウイルス、細菌、寄生虫の侵
入、および他の微生物の侵入により引き起こされる。本
発明に係るIL−12およびIFNαの組み合わせの具体的な
用途は、ウイルス性疾患、好ましくは慢性ウイルス感染
症、例えば肝炎ウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染
症、パピローマウイルス感染症、またはヒト免疫不全ウ
イルス感染症の予防および治療のための薬剤の調製であ
る。本発明のもう一つの実施態様は、細菌感染症、好ま
しくは細胞内細菌感染症、例えば結核、サルモネラ症ま
たはリステリア症の予防および治療のための上記化合物
の使用を含む。本発明は、寄生虫感染の治療のための上
記化合物の使用にも関する。寄生虫感染症は、マラリ
ア、リーシュマニア症または住血吸虫症などの感染症を
含む。

さらに、本発明は、上記疾患の治療に有用な対応する
薬学的組成物にも関する。薬学的組成物は、IL−12、IF
Nαおよび薬学的に許容される担体を含むという特徴を
有する。これらの組成物は、感染症の予防および治療に
有用な一つまたは複数の付加的な化合物を含んでいても
よい。

本発明の結果は、最適以下の用量のIL−12およびIFN
αが相乗的に感染症を防御できること、およびこれが少
なくとも部分的にはIFNγにより媒介されることを示し
ている。驚くべきことに、インビトロ実験のデータは、
IL−12/IFNα処理済動物の脾細胞からのIFNγ産生が増
加することを示している。したがって、感染症に対する
Th1反応の増強が、IFNα/IL−12組み合わせ治療の有益
な効果の基礎となっている。

IFNαおよびIL−12の役割を分析するためのインビト
ロTh1/Th2分化系が確立されている。図１は、Ｔヘルパ
ーリンパ球の成熟Th1細胞またはTh2細胞へのインビトロ
分化の基本的な特徴を示している。図２に示された実験
は、Th1細胞活性の尺度としてのIFNγ誘導における、IF
Nαと最適以下の用量のIL−12との相乗効果を示してい
る。これは、IFNαによるIL−10産生（Th2リンホカイ
ン）の阻害に関連している（図３）。

これらのデータは、２型ヘルペス単純ウイルス（HSV
−２）およびマウス・サイトメガロウイルス（mCMV）を
用いたヘルペスウイルス感染モデルでさらに裏付けられ
ている。

HSV−２による全身感染腹腔内感染後、HSV−２は複数の部位、特に末梢神経
系および中枢神経系に分布する。その後CNS内で複製が
起こると、致命的な脳炎が生じる。IL−12およびIFNα
はいずれも、全身HSV−２感染の致死効果を用量依存的
に防御することが示されている。実施例２において、HS
Vにより誘導される死亡率が依然としてそれぞれ100％お
よび80％となるようなサイトカインの最適以下の用量と
して、マウス１匹当たりIL−12（皮下注射）50ngおよび
IFNα（腹腔内注射）20ngを用いた（図４）。これらの
準（sub）治療用量のIL−12およびIFNαを共に投与する
と、感染後20日目の生存率は極めて有意に改善され（ｐ
＜0.01）、死亡率が対照群の94％±４と比較して、22％
±９に減少した（表１）。UV不活化HSV−２により刺激
された脾細胞培養物からの得られた上清は、共治療を受
けた動物から採取された培養物中に、いずれかのサイト
カイン単独で単独治療を受けた動物から採取された培養
物中よりも多量のIFNγを示した（図６）。共治療で見
られた高度に増加した生存率は、予めIFNγ中和抗体XMG
1.2を用いて動物からIFNγを枯渇させることにより部分
的に減少しうる。IFNγを受けていない共治療と比較す
ると、生存率は30％減少した（ｐ＜0.06）（図５）。こ
れは、IFNγが共治療により得られる防御の一部分のみ
を担っていることを示している。

HSV−２による帯状疱疹状感染： IL−12およびIFNαの共投与は、より重篤な帯状疱疹
状HSV−２感染のモデルにおいて生存率を増大させた。
皮膚表面へのHSV−２の接種は、感覚ニューロンの感
染、感覚ガングリアへの逆行性のウイルスの軸索輸送、
およびこの部位における複製をもたらす。その後、感染
ガングリアからの軸索が分布する皮膚部位にウイルスが
出現し、特徴的な帯状疱疹巣が形成される。動物は進行
性のCNSの感染も示し、致命的な脳炎を発症する。この
感染の生存率は、IL−12およびIFNαの共治療を用いる
と（表２）、未処理ウイルス感染マウス、または単独治
療のみで処理されたマウスと比較して40％、有意に増加
した（＜0.01）。共治療は帯状疱疹巣の進展の重症度も
減少させたが、この効果にはばらつきが大きかった（３
回の実験のうち２回で有意に減少）。

mCMVによる全身感染マウスCMV感染は、体中の多数の組織に病理学的変化
を引き起こすが、ウイルス複製の主要な部位は、唾液腺
の腺房細胞である。死亡は、臓器組織傷害およびそれに
関連した免疫性の病理学的効果により起こると考えられ
ている。この致命的なmCMV感染において、組み合わせ投
与されたIL−12およびIFNαは、単独治療のみで処理さ
れた群よりも大きな生存率を与えた。−２日目および−
１日目に、マウス１匹当たり５〜50ngのIL−12のみを腹
腔内投与すると、致命的なmCMV感染は100％防御された
が、感染後に投与した場合には疾患の病理学は変化しな
かった。最適以下の用量のIL−12療法をもたらすため、
IL−12治療の時点に対して、感染の時点を２、４または
６日遅らせた。治療用に投与されたIFNαは、mCMVによ
り引き起こされる死亡を20〜30％防御したが、明白な用
量関連効果はなかった。予備実験で、マウス１匹当たり
400ngのIFNα（腹腔内注射）が最適以下の用量であるこ
とが示された。この用量のIFNαをIL−12治療と共投与
すると、ウイルス感染または単独治療のみを受けた対照
よりも生存率は増強された（表３）。これらの結果は、
同一のIL−12療法で処理された動物から、⁵¹Cr放出アッ
セイにおいて脾細胞を用いて測定されたNK活性を反映し
ている。NK活性は、IL−12処理の２日後に最大となり、
その後経時的に減少した（データは示していない）。こ
れは、NK活性が、このモデルで見られたIL−12により媒
介される生存率において役割を果たしていることを示し
ている。

要約すると、結果は、最適以下の用量のIL−12および
IFNαは共同で、感染症の効果的な防御をインビトロお
よびインビボで促進した。共治療を受けた脾細胞は、イ
ンビトロ刺激後、高レベルのIFNγを産生したため、実
験は、増強された生存率がTh1誘導の増加と関連してい
るかもしれないことを示している。

IFNγの中心的な役割は、細胞内細菌（リステリア・
モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes））の防
御でも示された。感染前の抗IFNγ処理は、感受性を増
大させ、組換えIFNγは抵抗生を増大させた。IFNγの主
要な機能の一つは、細胞障害活性、例えば活性酸素中間
体の産生のためのマクロファージの活性化である。さら
に、いくつかの発見から、感染宿主による細胞内寄生虫
（L.メジャー（L.major））の除去に、IFNγが重要であ
ることが証明されている。マウス・マクロファージによ
る寄生虫の破壊は、これらの細胞による一酸化窒素の産
生がIFNγにより誘導された結果であることが示されて
いる。

特に、IL−12およびIFNαの組み合わせは、実験的ヘ
ルペスウイルス感染モデルで示されたように、ウイルス
性疾患の管理において単独治療よりも明白で新規な利点
を提供する。

組み合わせ療法は、個別に投与した場合にはわずかに
しか有効でない用量レベルで、この療法を用いなければ
致命的となるウイルス（ここではHSV−２）の全身感染
を顕著に防御した。組み合わせ療法は、致命的なHSV−
２帯状疱疹状感染に関連する死亡率も減少させ、重要な
こととして、この感染モデルの傷害の重症度を減少させ
ることが示された。この後者の観察から、組み合わせ療
法は、ウイルス性疾患の臨床的な症状を制限するのに有
効であることが示唆される。IL−12およびIFNαの組み
合わせは、この療法を用いなければ致命的となるmCMV感
染の生存率も顕著に改善した。以前に、同じ治療を個別
に用いた場合には、mCMV感染に影響を与えることはでき
なかった。

実施例において、予防のために、即ち、マウスがウイ
ルス抗原に曝露される前にIL−12を投与した。したがっ
て、組み合わせ療法の劇的な効果に対するIL−12の寄与
は、非特異的なメカニズム、特にIFNγの誘導により行
われる可能性が高いと考えられる。データは、共治療に
より得られる防御の実質的な部分が、IFNγの誘導によ
ることを示している。インビボで見られる生存率に対す
るIL−12/IFNαの組み合わせの相乗効果は、インビトロ
の脾細胞によるIFNγ産生の抗原特異的な誘導と関連し
ているかもしれない。

IL−12およびIFNαはいずれも、宿主免疫反応に影響
を与える天然の分子であり、いずれのサイトカインもウ
イルス性疾患の管理において可能性を有している。明ら
かになっている限り、IL−12およびIFNαの作用の様式
は極めて異なっているが、最近の証拠によりIFNαがIL
−12の発現レベルを変化させる経路が存在することが示
されている。いずれかのサイトカイン（または両方）の
誘導の結果として、継続的なウイルス感染に対抗するた
めの免疫学的な環境が提供される。

IL−12は、免疫状態に影響を与えることにより、抗ウ
イルス効果を発揮する。特に、IL−12は、IFNγの誘
導、ウイルス感染細胞のNK細胞による溶解の増強、およ
びTh1型反応の誘導をもたらす。Th1フェノタイプの細胞
反応の進展の結果として、ウイルス感染細胞に対するCD
8⁺T細胞の細胞障害性が増強され、免疫グロブリン・ク
ラスがIgG2aにスイッチし、IgE合成が阻害される。この
ように、IL−12は、効果的なウイルス除去のための環境
を最適化する。

IL−12とは対照的に、IFNαは、主に免疫調節を介し
て作用するのではなく、感染細胞における一般的な抗ウ
イルス状態を誘導すると考えられている（Gresser et a
l.（1976）J.Exp.Med.144,1316−1323）。抗ウイルス状
態には、ウイルス複製周期のある範囲の段階を標的とす
る細胞メカニズムの誘導が含まれる。IFNαは、細胞核
におけるインターフェロン刺激反応因子（Interferon S
timulated Response Elements/ISRE）を活性化し、多数
のタンパク質の産生を引き起こす。これらには、特異的
抗ウイルス機能を有するMxタンパク質（Weitz et al.
（1986）,J.Int.Res.9,679−689）、二本鎖RNAにより活
性化され、真核細胞開始因子２をリン酸化し、次に翻
訳、そしてその結果としてウイルスの組み立てを阻害す
るプロテインキナーゼ（Hovanessian（1989）J.Interfe
ron Res.9,641−647）、および新たに形成されたウイル
ス成分の分解に関与している2',5−オリゴアデニル酸合
成酵素（Pestka et al.上記引用）が含まれる。

IFNα治療をIL−12と組み合わせることは、二重の意
味で患者にとって有益である。第一に、免疫応答を促す
IL−12の中心的な役割は、感染性抗原に対する寛容を破
壊することができる。そして、第二に、細胞障害性Ｔ細
胞反応に対するIL−12の効果は、この反応が感染原の完
全な除去を促進するのに充分なものとなるよう補助する
と考えられる。感染症の管理のためのこのサイトカイン
組み合わせ法は、大きな需要のある医療分野に強い影響
を与える可能性がある。

要約すると、結果は、最適以下の用量のIL−12および
IFNαが共同して、感染症に対するインビトロおよびイ
ンビボの効果的な防御を促進したことを示している。共
治療を受けた脾細胞は、インビトロ刺激の後、高レベル
のIFNγを産生したため、実験は、生存率の増強がTh1誘
導の増加と関連しているかもしれないことを示してい
る。

インターロイキン−12は、当分野で既知の方法、例え
ば欧州特許出願第433827号、国際特許出願WO9005147お
よびWO9205256、Kobayashi et al.,J.Exp.Med.170,827
−845（1989）、ならびにStern et al.（1990）Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA87,6808−6812に記載の方法により調製
できる。インターロイキン−12は、通常の化学合成、組
み換え法により作製することもできるし、天然起源から
精製することもできる。

任意の天然物質（例えば、白血球、繊維芽細胞、リン
パ球）またはそれに由来する物質（例えば、細胞系）か
ら由来するもの、または組み換えDNA技術により調製さ
れたものが、本発明のIFNαに含まれる。IFNαのクロー
ニングおよび、特に大腸菌におけるその直接発現の詳細
は、多くの文献の主題となっている。組換えIFNの調製
は、例えば、Gray et al.（1982）Nature295,503−50
8、Goeddel et al.（1980）Nature284,316−320、（198
1）Nature290,20−26、および欧州特許第174143号に開
示されている。IFNαには、IFNα I、IFNα２など多く
の型が存在する。そしてさらにそれらのサブタイプに
は、これらに限定されないが、IFNα2A、IFNα2B、、IF
Nα2CおよびIFNα II（IFNα_IIまたはω−IFNとも表記
される）が含まれる。

薬学的組成物にとって適当な「IL−12」および「IFN
α」という用語には、精製タンパク質および／または組
換えタンパク質のポリペプチドに類似したポリペプチ
ド、例えば、逆位、欠失、挿入および修飾（例えば、IF
Nαおよび／またはIL−12のPEG化型）を含む分子も含ま
れる。これらの修飾は、天然に得られたものであっても
よいし、人工的に作出したものであってもよい。また、
上記の分子から得ることができる任意のIL−12またはIF
Nαのハイブリッド分子またはコンセンサス分子も含ま
れる。

本発明の組み合わせ治療を実施するためには、IL−12
をIFNαと関連して患者に投与する。即ち、IFNαは、患
者がIL−12を受容する時期と同じ時期または異なる時期
に投与される。

本発明に係るIL−12およびIFNαの薬学的に許容され
る製剤は、当業者に既知の製剤法を用いて作製されう
る。これらの製剤は、標準的な経路により投与されう
る。一般的には、非経口投与（例えば、静脈内、皮下ま
たは筋肉内）されるが、局所経路、経皮経路、口腔内経
路、または直腸経路も考えられる。さらに、製剤を、IL
−12および／またはIFNαを徐放することができる生分
解性ポリマーに取り込ませ、そのポリマーを薬物を輸送
したい部位近傍に埋め込むこともできる。生分解性ポリ
マーおよびその使用は、例えば、Brem et al.（1991）
J.Neurosurg.74,441−446に詳細に記載されている。IL
−12およびIFNαの用量は、治療を受ける状態、特定の
化合物、ヒトまたは動物の体重および状態などのその他
の臨床的な要因、ならびにIL−12の投与経路により異な
る。本発明は、ヒトおよび動物両方に使用できることを
理解されたい。ヒトへの非経口投与には、週に１から３
回、体重1kg当たり約1000ngから10ng、好ましくは1kg当
たり約300ngから30ngという用量のIL−12が、一般的に
充分である。IFNαについては、週に１から３回、体重1
kg当たり約50μｇから0.1μｇ、好ましくは約15μｇか
ら１μｇという用量が、一般的に充分である。しかし、
その必要が示された場合には、上記の上限および下限を
越えてもよいことが理解できよう。

製剤には、非経口投与（皮下、筋肉内、静脈内、経
皮、気管内および硬膜外など）に適したものが含まれ
る。製剤は、便利に、単位用量の形態で存在することが
でき、通常の薬学的手法により調製されうる。そのよう
な手法には、IL−12および／またはIFNαと薬学的な担
体または賦形剤とを混和する工程が含まれる。一般的
に、製剤は、IL−12およびIFNαを液状担体と均一に、
完全に混和することにより調製される。非経口投与に適
した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を目的
とする受容者の血液と等張にするための溶質、懸濁化剤
および濃化剤などの水性および非水性の無菌懸濁液を含
んでいてもよい、水性または非水性の無菌注射用液剤が
含まれる。製剤は、単位用量容器または複数用量容器、
例えば、アンプルおよびバイアルに収納することがで
き、また、無菌の液状担体、例えば注射用水を使用直前
に添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵することもで
きる。

好ましい単位用量製剤は、上記のような１日の用量も
しくは単位、１日量以下の用量、またはそれらを適当に
分割した量の投与成分を含むものである。

錠剤、被包錠、糖衣錠または硬ゼラチン・カプセル剤
の調製には、本発明の化合物を薬学的に不活性な、無機
または有機の賦形剤と混合できる。錠剤、糖衣錠または
硬ゼラチン・カプセル剤に適した賦形剤の例としては、
ラクトース、トウモロコシ・デンプンまたはそれらの誘
導体、タルクもしくはステアリン酸またはそれらの塩が
挙げられる。

軟ゼラチン・カプセル剤で用いるのに適した賦形剤に
は、例えば、植物油、ロウ、脂質、半固体または液体の
ポリオールなどが含まれる。液剤およびシロップ剤の調
製に使用できる賦形剤には、例えば、水、ポリオール、
ショ糖、転化糖およびグルコースが含まれる。注射用液
剤に使用できる賦形剤には、例えば、水、アルコール、
ポリオール、グリセリン、および植物油が含まれる。座
剤、および局所適用または経皮適用に使用できる賦形剤
には、例えば天然油または硬化油、ロウ、脂質、および
半固体または液体のポリオールが含まれる。薬学的組成
物には、保存剤、液化剤、安定化剤、湿潤化剤、乳化
剤、甘味剤、着色剤、芳香剤、浸透圧を変化させるため
の塩、緩衝剤、コーティング剤、または抗酸化剤が含ま
れていてもよい。また、その他の治療に有用な薬剤を含
んでいてもよい。

以下の実施例は本発明の詳細を例示するためのもので
あり、決して本発明を制限するものではない。

実施例実施例1:Th1細胞のインビトロ成熟 Th1細胞のインビトロ成熟に関する実験を、以下のよ
うにして行った。

ａ）マウス脾細胞：８〜10週齢の雌C57BL7/6マウスから得られた脾臓を用
いて、ハンクス（Hank's）培地＋１％FCSで、脾細胞の
単一細胞懸濁液を調製した。標準的な方法に従い（Camb
ier et al.（1987）Scand.J.Immunol.27,59）、ゲイス
（Geys）溶液で赤血球を除去し、パーコール（Percol
l）勾配遠心分離により細胞を予備活性化した。

ｂ）CD4⁺精製： 1ml当たり10⁷個の脾臓細胞をハンクス培地中でインキ
ュベートし、10μg/mlのmAb抗6IA/IE（クローンM5/11
4、Bhattacharya et al.（1981）J.Immunol.127,2488）
および10μg/mlのmAB抗CD8（クローン53−6.7、Ledbett
er et al.（1979）Immunnol.Rev.47,63）を添加した。
氷上で30分間インキュベートし、洗浄（３回）した後、
細胞を５×10⁶細胞/mlで再懸濁させた。100μｌのマグ
ネティック・ダイナ・ビーズ（Magnetic Dyna Beads）
（ヒツジ抗ラット）を添加し、４℃で30分間攪拌した
後、磁石で標的細胞（ビーズに結合）を取り出した。CD
4⁺細胞の純度は90％を超えていた。これらの細胞を完全
IMDMに10⁶細胞/mlで再懸濁させた。

ｃ）CD4⁺細胞の活性化： 48ウェル細胞培養プレートを、５μg/mlのmAb抗CD3
（クローン2C11、Leo et al.,（1987）PNAS84,1374）で
コーティングした。プレートを洗浄（３回）し、１ウェ
ル当たり500μｌの精製CD4⁺細胞懸濁液およびサイトカ
イン（IL−12、IL−４、IFN⁺ ₊A/D、非感作IFN⁺ ₊）およ
びそれらの組み合わせを添加した。37℃、7.5％CO₂で５
日間インキュベートした後、市販のリンホカイン特異的
ELISAを用いてIFNγおよびIL−10について細胞培養液を
分析した。

実施例2:ウイルス感染ａ）マウス：ハーラン・オラック（Harlan−Olac）から供給された
特定病原体を含まない雌BALB/cマウスを６から８週齢で
使用した。

ｂ）ウイルスストック： HSV−２（333株）WTおよびmCMVスミス（Smith）株（A
TCC No.VR−194）を、２％FCSを含むDMEM培養培地（Gib
co No.22320−022）を用いて、それぞれベロ（Vero）細
胞（ATCC No.CCL−81）および3T3L1細胞（ECACC No.860
52701）の細胞培養単層中で培養した。完全な細胞障害
効果が観察された時点で、攪拌によりフラスコからコン
フルエンシー状態の細胞単層を取り除いた。その後、凍
結−解凍および超音波処理を行いウイルスを放出させ、
3000rpmで15分間遠心分離することにより清澄化した。
細胞単層に対する標準的なプラークアッセイによりウイ
ルス力価を決定した。細胞培養物から得られたmCMVのス
トックは、この時点ではマウスにおいて非侵襲性である
ため、マウスに継代接種することにより侵襲性のストッ
クを調製した。簡単に述べると、弱毒化ストックをマウ
スに腹腔内注射し、感染後10日目に唾液腺を取り出し
た。次に、プールされた組織をホモジナイズし、ウイル
スを放出させ、1400rpmで10分間遠心分離することによ
り清澄化した。次に、感染性ウイルスを含む上清を再び
マウスに継代接種し、インビボで100％の死亡率を示す
ウイルスストックを得た。

ｃ）マウスのHSV−２感染：全身感染に関しては、10⁴〜10⁵pfu/100μｌを単回腹
腔内注射することにより動物を感染させた。感染後（p.
i.）20日目まで毎日動物の死亡率をモニターした。帯状
疱疹状感染に関しては、25Gニードルで左側腹を乱刺
し、10⁶pfuウイルスを含む10μｌの小滴を適用して動物
を感染させた。感染後14日目まで毎日、動物の帯状疱疹
巣進展および死亡率をモニターした。

ｄ）マウスのmCMV感染：致死感染のための全ての実験において、唾液腺に由来
するウイルス調製物５×10³pfuを腹腔内投与することに
よりマウスを感染させた。感染後15日目まで毎日、動物
の感染の徴候および死亡率をモニターした。

ｅ）IL−12およびIFNαの投与： PBS＋１％w/v BSAに含まれる50ngの組換えマウスIL−
12（特異的活性2.1×10⁸U/mg、Hoffmann−La Roche,Nut
ley,NJ）を、体重1kg当たり5mlの容量で、１日１回、腹
腔内注射または皮下注射（s.c.）のいずれかにより投与
した。治療用投与は、感染の６時間後に開始し、その後
４日間毎日行った。予防用治療では、感染の結果に記載
されている時点で、１日２回注射した。感染の２時間
前、それから感染の４、24、48、および72時間後に、PB
S＋１％w/v BSAに含まれる組換えヒトIFNα−A/D（特異
的活性５×10⁷U/mg、Hoffmann−La Roche,Nutley,NJ）
を、体重1kg当たり5mlの容量で、腹腔内注射により投与
した。用量は、１日当たり20mgと400mgの間の範囲であ
った。

ｆ）インビボIFNγ枯渇：ラット抗マウスIFNγ抗体、XMG1.2（Pestka et al.
（1987）、上記引用）。注射用無菌水に含まれるこのIF
Nγ中和抗体を、体重1kg当たり5ml、腹腔内投与した。
インビボでIFNγ枯渇させるため、感染の３日前および
１日前、感染後０日目、２日目、および５日目に、マウ
ス１匹当たり100μｇのIFNγ抗体を合計５回それぞれの
マウスに投与した。この療法により、インビボでIL−12
処理に応答して産生される血清IFNγのレベルが、約95
％減少した。

ｇ）インビトロIFNγ産生：感染後７から10日目に、各群から脾臓の単一細胞懸濁
液を得た後、10³pfuのUV不活化HSV−２の存在下で、完
全PRMI1640（Gibco Cat.No.52400−033）中で、37℃、
５％CO₂で48時間培養した。その後、上清を取り出し、
市販のキット（Amersham Cat No.RPN2717）を用いてELI
SAでIFNγレベルをアッセイするまで、−80℃で凍結し
た。

フロントページの続き (72)発明者カー，ジャクリーン・アンイギリス国、ハートフォードシャーエスジー12 ０イーピー、ウェア、チャーチフィールド４ (72)発明者マットネル，フランク・アルベルトイタリア国、イ―20122 マイランド、ヴィア・デッラ・コメンダ、31 (72)発明者ミュルクィーン，マイケル・ジョンイギリス国、エセックスエスエス４１アールジェー、ロッチフォード、ミドルミード 25、フラット２ (72)発明者パルマー，カスリンスイス国、ツェーハー―4142 ミュンヘンシュタイン、ドルケンシュトラーセ 34 (72)発明者ロジャーソン，ジェーン・アンドレ・ルイーズイギリス国、ハートフォードシャーエーエル４９エルゼット、セント・アールバンズ、チョークデル・フィールズ 29 (56)参考文献ＬａｃｈｇａｒＡ．ｅｔａｌ．, “Ｉｎｖｏｌｖｍｅｎｔｏｆａｌｐｈａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｉｎＨＩＶ−１ｉｎｄｕｃｅｄｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＡｐｏｔｅｎｔｉａｌｔａｒｇｅｔｆｏｒＡＩＤＳｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ”，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，1994，Ｖｏｌ．48，Ｎｏ．２，ｐ．73−77 ＯｒａｎｇｅＪ．Ｓ．ｅｔａｌ．，“ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＩＬ− 12 ｏｎｔｈｅＲｅｓｐｏｎｓｅａｎｄＳｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｏＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＶｉｒａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，1994，ｖｏｌ．152，ｎｏ．３, ｐ．1253−1264 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/21 A61K 38/20 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】感染症の治療および予防のための薬剤の製
造のための、インターロイキン−12（IL−12）およびイ
ンターフェロン−アルファ（IFNα）の組み合わせの使
用。
【請求項２】感染症が慢性感染症である。請求項１記載
の使用。
【請求項３】感染症が慢性ウイルス感染症である、請求
項２記載の使用。
【請求項４】感染症が肝炎、乳頭腫、ヒト免疫不全また
はヘルペスウイルス感染症である、請求項３記載の使
用。
【請求項５】感染症が細菌感染症である、請求項１また
は２に記載の使用。
【請求項６】感染症が結核、サルモネラ症またはリステ
リア症である、請求項５記載の使用。
【請求項７】感染症が寄生虫感染症である、請求項１ま
たは２に記載の使用。
【請求項８】感染症がマラリア、リーシュマニア症また
は住血吸虫症である、請求項７記載の使用。
【請求項９】請求項１〜８のいずれか一項記載の疾患の
治療のための、インターロイキン12およびインターフェ
ロン−αを含む組成物。
【請求項１０】請求項１〜８のいずれか一項記載の疾患
の治療のための、一つまたは複数の付加的な化合物と組
み合わされたインターロイキン−12およびインターフェ
ロン−αを含む組成物。
【請求項１１】インターロイキン−12、インターフェロ
ン−αおよび薬学的に許容される担体を含む、感染症の
予防および治療のための薬学的組成物。
【請求項１２】感染症の治療に有用な一つまたは複数の
付加的な化合物を含む、請求項11記載の薬学的組成物。