JP3131215B2 - 新規インスリン誘導体 - Google Patents
新規インスリン誘導体Info
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- JP3131215B2 JP3131215B2 JP02297376A JP29737690A JP3131215B2 JP 3131215 B2 JP3131215 B2 JP 3131215B2 JP 02297376 A JP02297376 A JP 02297376A JP 29737690 A JP29737690 A JP 29737690A JP 3131215 B2 JP3131215 B2 JP 3131215B2
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- arg
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/62—Insulins
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
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Description
【発明の詳細な説明】 知られているように糖尿病（disease diabetes melli
tus）の治療には相当量のインスリンおよびインスリン
誘導体が必要であり、またそれらの一部は大規模に生産
されている。様々な作用プロフィールをもった相当数の
既存のインスリン製剤および修飾物が存在するにも拘ら
ず、個体相互間のおよび個体自体内の変動を伴う生物間
の相違の故に、さらにその他の性質および作用特徴を有
する別のインスリン生成物が依然として必要とされてい
る。
tus）の治療には相当量のインスリンおよびインスリン
誘導体が必要であり、またそれらの一部は大規模に生産
されている。様々な作用プロフィールをもった相当数の
既存のインスリン製剤および修飾物が存在するにも拘ら
ず、個体相互間のおよび個体自体内の変動を伴う生物間
の相違の故に、さらにその他の性質および作用特徴を有
する別のインスリン生成物が依然として必要とされてい
る。
持効性作用を有するインスリン誘導体は、例えばEP−
B 132,769号およびEP−B 132,770号明細書に記載されて
いる。これらは次の式I: （ここで式中、 R1はＨまたはＨ−Pheを表わし、 R30は中性で、遺伝子的にコード化可能なＬ−アミノ
酸の基であり、そして R31は塩基性であって50個までの炭素原子を有し、そ
の合成には０〜３個のα−アミノ酸が関与し、そして任
意の末端カルボキシル官能が遊離状態で、エステル官能
として、アミド官能として、ラクトンとして存在する
か、またはCH2OHに還元されていてもよい、生理学的に
許容し得る有機基を表わす） で示される、インスリンＢ鎖のB31位が特に基本的に修
飾された誘導体である。
B 132,769号およびEP−B 132,770号明細書に記載されて
いる。これらは次の式I: （ここで式中、 R1はＨまたはＨ−Pheを表わし、 R30は中性で、遺伝子的にコード化可能なＬ−アミノ
酸の基であり、そして R31は塩基性であって50個までの炭素原子を有し、そ
の合成には０〜３個のα−アミノ酸が関与し、そして任
意の末端カルボキシル官能が遊離状態で、エステル官能
として、アミド官能として、ラクトンとして存在する
か、またはCH2OHに還元されていてもよい、生理学的に
許容し得る有機基を表わす） で示される、インスリンＢ鎖のB31位が特に基本的に修
飾された誘導体である。
これらインスリン誘導体の特徴は5.8〜8.5の等電点
（等電フォーカシングにより測定）である。該等電点
（これは未修飾天然インスリンまたはプロインスリン等
電点（pH＝5.4）と比較すると中性域にシフトしてい
る）は、塩基性修飾の結果分子表面に局在する付加的な
陽性荷電による。これによって塩基性修飾を伴うこれら
インスリン誘導体は、例えば中性域では通常溶解状態に
ある天然インスリンまたはプロインスリンよりも、生理
学的に重要な中性域における溶解性が低下する。
（等電フォーカシングにより測定）である。該等電点
（これは未修飾天然インスリンまたはプロインスリン等
電点（pH＝5.4）と比較すると中性域にシフトしてい
る）は、塩基性修飾の結果分子表面に局在する付加的な
陽性荷電による。これによって塩基性修飾を伴うこれら
インスリン誘導体は、例えば中性域では通常溶解状態に
ある天然インスリンまたはプロインスリンよりも、生理
学的に重要な中性域における溶解性が低下する。
式Ｉで示される塩基性修飾を伴うインスリン誘導体の
持効性またはデポー作用は、等電点における難溶性に由
来している。前記二つの刊行物によれば、誘導体に応じ
てトリプシンまたはトリプシン様および／またはカルボ
キシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチターゼＢ様
および／またはエステラーゼ活性により生じる付加的塩
基性基の除去によって、生理学的条件下におけるインス
トリン誘導体の再溶解が達成されるはずである。各場合
に除去される基は純生理学的代謝物であるか、または易
代謝性の生理学的に許容し得る物質である。
持効性またはデポー作用は、等電点における難溶性に由
来している。前記二つの刊行物によれば、誘導体に応じ
てトリプシンまたはトリプシン様および／またはカルボ
キシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチターゼＢ様
および／またはエステラーゼ活性により生じる付加的塩
基性基の除去によって、生理学的条件下におけるインス
トリン誘導体の再溶解が達成されるはずである。各場合
に除去される基は純生理学的代謝物であるか、または易
代謝性の生理学的に許容し得る物質である。
インスリンを塩基性修飾した結果としての前述のデポ
ー原理は、その後、更に、主としてＡおよびＢ鎖内を塩
基性修飾した他のインスリン誘導体（例えばEP−A 0,19
4,864およびEP−A 0,254,516参照）の製造および相当す
る市販により利用されている。
ー原理は、その後、更に、主としてＡおよびＢ鎖内を塩
基性修飾した他のインスリン誘導体（例えばEP−A 0,19
4,864およびEP−A 0,254,516参照）の製造および相当す
る市販により利用されている。
A1位を超えたＡ鎖延長部に塩基性修飾を有するいくつ
かの塩基性修飾されたインスリン誘導体と知られている
（P.Rsen et al.,Biochem.J.（1980），186,945〜952
参照）。修飾成分として塩基性アミノ酸を有するかかる
インスリン誘導体として、前記文献には特定的に、 Lys−Arg−GlyA1−ウシインスリン、 Arg−GlyA1−ウシインスリン、 Arg−Arg−GlyA1−ウシインスリンおよび Arg−Arg−Arg−GlyA1−ウシインスリン が記載されている。これらのインスリン誘導体は未修飾
インスリンに比べかなり減少された生物活性を有するも
のとされている（特に前記文献記事中の第947頁の第１
表参照）。該化合物のデポー作用の可能性については前
記参考文献中に全く記述されていない。
かの塩基性修飾されたインスリン誘導体と知られている
（P.Rsen et al.,Biochem.J.（1980），186,945〜952
参照）。修飾成分として塩基性アミノ酸を有するかかる
インスリン誘導体として、前記文献には特定的に、 Lys−Arg−GlyA1−ウシインスリン、 Arg−GlyA1−ウシインスリン、 Arg−Arg−GlyA1−ウシインスリンおよび Arg−Arg−Arg−GlyA1−ウシインスリン が記載されている。これらのインスリン誘導体は未修飾
インスリンに比べかなり減少された生物活性を有するも
のとされている（特に前記文献記事中の第947頁の第１
表参照）。該化合物のデポー作用の可能性については前
記参考文献中に全く記述されていない。
デポー作用を有する特に有利な、塩基性修飾されたイ
ンスリン誘導体は、ドイツ特許出願P3844211.6号明細書
に記載の塩基性修飾されたインスリン誘導体である。そ
れらはAO位に塩基性アミノ酸アルギニンが存在する次の
式IIで示されるインスリン誘導体である： （ここで式中、 ａ） R30＋R31＝OHまたは ｂ） R30＝中性の、遺伝子的にコード化可能な、Ｌ−
アミノ酸の基、および R31＝OHまたは塩基性であって50個までの炭素原子を
有し、その合成に０〜３個のα−アミノ酸が関与しそし
て任意の末端カルボキシル官能が遊離状態で、エステル
官能として、アミド官能として、ラクトンとして存在す
るかまたはCH2OHに還元され得る、生理学的に許容し得
る有機基。
ンスリン誘導体は、ドイツ特許出願P3844211.6号明細書
に記載の塩基性修飾されたインスリン誘導体である。そ
れらはAO位に塩基性アミノ酸アルギニンが存在する次の
式IIで示されるインスリン誘導体である： （ここで式中、 ａ） R30＋R31＝OHまたは ｂ） R30＝中性の、遺伝子的にコード化可能な、Ｌ−
アミノ酸の基、および R31＝OHまたは塩基性であって50個までの炭素原子を
有し、その合成に０〜３個のα−アミノ酸が関与しそし
て任意の末端カルボキシル官能が遊離状態で、エステル
官能として、アミド官能として、ラクトンとして存在す
るかまたはCH2OHに還元され得る、生理学的に許容し得
る有機基。
ただし、同時にR30＝Ala、R31＝OHであってＡ−およ
びＢ−鎖がウシインスリンの配列である場合〔すなわ
ち、AO−Arg−ウシインスリン〕を除く）。
びＢ−鎖がウシインスリンの配列である場合〔すなわ
ち、AO−Arg−ウシインスリン〕を除く）。
これらのインスリン誘導体の生理学的に許容し得る塩
（例えばアルカリ金属またはアンモニウム塩）もその遊
離インスリン誘導体と同等である。
（例えばアルカリ金属またはアンモニウム塩）もその遊
離インスリン誘導体と同等である。
これらのインスリン誘導体は、AO位が塩基性修飾され
る結果（前記の塩基性修飾を有するインスリン誘導体と
同様）持効性作用プロフィール、および（前記の塩基性
修飾を有するインスリン誘導体と比較した場合）体内許
容性に関し、際立った長所を有している。すなわち、そ
れらの生物活性は天然インスリンのそれに対応する。
る結果（前記の塩基性修飾を有するインスリン誘導体と
同様）持効性作用プロフィール、および（前記の塩基性
修飾を有するインスリン誘導体と比較した場合）体内許
容性に関し、際立った長所を有している。すなわち、そ
れらの生物活性は天然インスリンのそれに対応する。
さらにこれらのインスリン誘導体を発展させる試みに
おいて、今や本発明によるこの目的はAO−Arg位を超え
たＡ鎖延長によって達成されることが見出された。
おいて、今や本発明によるこの目的はAO−Arg位を超え
たＡ鎖延長によって達成されることが見出された。
すなわち、本発明は次の式III （ここで式中、 ａ） R30＋R31＝OHまたは ｂ） R30＝中性の、遺伝子的にコード化可能なＬ−ア
ミノ酸の基および R31＝OHまたは その合成には０〜３個のα−アミノ酸が関与しそして
任意の末端カルボキシル官能が遊離形態で、エステル官
能として、アミド官能として、ラクトンとして存在する
かまたはCH2OHに還元されていてもよい、50個までの炭
素原子を有する塩基性の生理学的に許容し得る有機基、
および ｃ） RA-1＝遺伝子的にコード化可能なＬ−アミノ酸の
基または50個までの炭素原子を有する生理学的に許容し
得る有機基、 ただし、同時にR30＝Ala、R31＝OH、RA-1＝Lysまたは
ArgでありそしてＡ鎖およびＢ鎖がウシインスリンの配
列である場合を除く）で示される新規インスリン誘導体
およびその生理学的に許容し得る塩に関する。
ミノ酸の基および R31＝OHまたは その合成には０〜３個のα−アミノ酸が関与しそして
任意の末端カルボキシル官能が遊離形態で、エステル官
能として、アミド官能として、ラクトンとして存在する
かまたはCH2OHに還元されていてもよい、50個までの炭
素原子を有する塩基性の生理学的に許容し得る有機基、
および ｃ） RA-1＝遺伝子的にコード化可能なＬ−アミノ酸の
基または50個までの炭素原子を有する生理学的に許容し
得る有機基、 ただし、同時にR30＝Ala、R31＝OH、RA-1＝Lysまたは
ArgでありそしてＡ鎖およびＢ鎖がウシインスリンの配
列である場合を除く）で示される新規インスリン誘導体
およびその生理学的に許容し得る塩に関する。
ａ） R30＋R31＝OHである式IIIの化合物は対応するR
A-1−AO−Arg−Des−B30インスリンである。これらの化
合物は特に好ましい。
A-1−AO−Arg−Des−B30インスリンである。これらの化
合物は特に好ましい。
ｂ） あるいはまた、式IIIにおいてR30は中性の、遺伝
子的にコード化可能なＬ−アミノ酸の基でありそしてR
31はOHであるかまたは塩基性であって50個までの炭素原
子を有する相当する生理学的に許容し得る有機基である
こともできる。これらの化合物は対応するRA-1−AO−Ar
gインスリン誘導体である。
子的にコード化可能なＬ−アミノ酸の基でありそしてR
31はOHであるかまたは塩基性であって50個までの炭素原
子を有する相当する生理学的に許容し得る有機基である
こともできる。これらの化合物は対応するRA-1−AO−Ar
gインスリン誘導体である。
R30およびR31は前記のより早い特許出願による化合物
についての式IIの場合と同じ意味を有する。
についての式IIの場合と同じ意味を有する。
中性の、遺伝子的にコード化可能なＬ−アミノ酸（R
30について）は、Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Il
e、Asn、Gln、Cys、Met、Try、PheおよびProであり、そ
してAla、ThrおよびSerが好ましく、特にThrが好まし
い。
30について）は、Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Il
e、Asn、Gln、Cys、Met、Try、PheおよびProであり、そ
してAla、ThrおよびSerが好ましく、特にThrが好まし
い。
R31＝OHである場合には、対応するインスリンとは
（Ａ−１）およびAO位が修飾されている点のみ異なるイ
ンスリン誘導体が生成する。
（Ａ−１）およびAO位が修飾されている点のみ異なるイ
ンスリン誘導体が生成する。
R31が塩基性であって、50個までの炭素原子を有する
相当する生理学的に許容し得る有機基である場合には、
同様に、導入部に記載の刊行物EP−Ｂ−132,769号およ
びEP−Ｂ−132,770号による塩基性修飾を有するインス
リン誘導体とは（Ａ−１）およびAO位が修飾されている
点のみが異なるインスリン誘導体が生成する。
相当する生理学的に許容し得る有機基である場合には、
同様に、導入部に記載の刊行物EP−Ｂ−132,769号およ
びEP−Ｂ−132,770号による塩基性修飾を有するインス
リン誘導体とは（Ａ−１）およびAO位が修飾されている
点のみが異なるインスリン誘導体が生成する。
R31の合成においてα−アミノ酸が全く関与しない場
合、このラジカルに適した塩基性基の例は次のとおりで
ある：アミノ−（C2〜C6）−アルコキシ、（C1〜C4）−
アルキルアミノ−（C2〜C6）−アルコキシ、ジ−（C1〜
C4）−アルキルアミノ−（C2〜C6）−アルコキシ、トリ
−（C1〜C4）−アンモニオ−（C2〜C6）−アルコキシ、
アミノ−（C2〜C6）−アルキルアミノ、〔（C1〜C4）−
アルキルアミノ〕−（C2〜C6）−アルキルアミノ、ジ−
（C1〜C4）−アルキルアミノ−（C2〜C6）−アルキルア
ミノまたは〔トリ−（C1〜C4）−アルキルアミノ〕−
（C2〜C6）−アルキルアミノ、特に、−Ｏ−〔CH2〕ｐ
−NR2、−Ｏ−〔CH2〕ｐ−Ｎ R3、−NH−〔CH2〕ｐ−N
R2または−NH−〔CH2〕ｐ−Ｎ R3〔式中、ｐ＝２〜６
であり、そしてＲは同一であるかまたは異なり、そして
水素または（C1〜C4）アルキルを表わす〕。
合、このラジカルに適した塩基性基の例は次のとおりで
ある：アミノ−（C2〜C6）−アルコキシ、（C1〜C4）−
アルキルアミノ−（C2〜C6）−アルコキシ、ジ−（C1〜
C4）−アルキルアミノ−（C2〜C6）−アルコキシ、トリ
−（C1〜C4）−アンモニオ−（C2〜C6）−アルコキシ、
アミノ−（C2〜C6）−アルキルアミノ、〔（C1〜C4）−
アルキルアミノ〕−（C2〜C6）−アルキルアミノ、ジ−
（C1〜C4）−アルキルアミノ−（C2〜C6）−アルキルア
ミノまたは〔トリ−（C1〜C4）−アルキルアミノ〕−
（C2〜C6）−アルキルアミノ、特に、−Ｏ−〔CH2〕ｐ
−NR2、−Ｏ−〔CH2〕ｐ−Ｎ R3、−NH−〔CH2〕ｐ−N
R2または−NH−〔CH2〕ｐ−Ｎ R3〔式中、ｐ＝２〜６
であり、そしてＲは同一であるかまたは異なり、そして
水素または（C1〜C4）アルキルを表わす〕。
３個までのα−アミノ酸がR31の合成に関与する場
合、これらは主として中性または塩基性の天然Ｌ−アミ
ノ酸および／またはこれらに相当するＤ−アミノ酸であ
る。中性の天然アミノ酸は、特に、Gly、Ala、Ser、Th
r、Var、Leu、Ile、Asn、Gln、Cys、Met、Tyr、Phe、Pr
oおよびHypである。塩基性の天然アミノ酸は、特に、Ar
g、Lys、Hyl、Orn、CitおよびHisである。中性のα−ア
ミノ酸のみが関与する場合、（R31を塩基性とするため
には）それらの末端カルボキシル官能は遊離であっては
ならない。この場合にはそのカルボキシル官能はむしろ
塩基性基でエステル化またはアミド化されていなければ
ならず、またこの場合の適切な塩基性基は、例えば、α
−アミノ酸がR31の合成に全く関与しない場合について
既述した塩基性基である。もちろん、これらの塩基性エ
ステルまたはアミド基は塩基性α−アミノ酸のカルボキ
シル官能をブロックすることもできる。中性のエステル
またはアミド基、例えば（C1〜C6）−アルコキシ、（C3
〜C6）−シクロアルコキシ、NH2、（C1〜C6）−アルキ
ルアミノまたはジ−（C1〜C6）−アルキルアミノなど
も、ブロッキングが所望される場合、塩基性α−アミノ
酸がカルボキシル官能のブロッキングに適切であり得
る。
合、これらは主として中性または塩基性の天然Ｌ−アミ
ノ酸および／またはこれらに相当するＤ−アミノ酸であ
る。中性の天然アミノ酸は、特に、Gly、Ala、Ser、Th
r、Var、Leu、Ile、Asn、Gln、Cys、Met、Tyr、Phe、Pr
oおよびHypである。塩基性の天然アミノ酸は、特に、Ar
g、Lys、Hyl、Orn、CitおよびHisである。中性のα−ア
ミノ酸のみが関与する場合、（R31を塩基性とするため
には）それらの末端カルボキシル官能は遊離であっては
ならない。この場合にはそのカルボキシル官能はむしろ
塩基性基でエステル化またはアミド化されていなければ
ならず、またこの場合の適切な塩基性基は、例えば、α
−アミノ酸がR31の合成に全く関与しない場合について
既述した塩基性基である。もちろん、これらの塩基性エ
ステルまたはアミド基は塩基性α−アミノ酸のカルボキ
シル官能をブロックすることもできる。中性のエステル
またはアミド基、例えば（C1〜C6）−アルコキシ、（C3
〜C6）−シクロアルコキシ、NH2、（C1〜C6）−アルキ
ルアミノまたはジ−（C1〜C6）−アルキルアミノなど
も、ブロッキングが所望される場合、塩基性α−アミノ
酸がカルボキシル官能のブロッキングに適切であり得
る。
もちろん、末端カルボキシル官能は末端アミノ酸がヒ
ドロキシアミノ酸である場合にのみラクトン形態であり
得る。
ドロキシアミノ酸である場合にのみラクトン形態であり
得る。
末端カルボキシル官能をCH2OHに還元することも更に
可能である。
可能である。
RA-1は（20個の）遺伝子的にコード化可能なアミノ酸
のいずれかの基であることができる。それらの遺伝子的
にコード化可能なアミノ酸はGly、Ala、Ser、Thr、Va
l、Leu、Ile、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Arg、Ly
s、His、Try、Phe、Proである。
のいずれかの基であることができる。それらの遺伝子的
にコード化可能なアミノ酸はGly、Ala、Ser、Thr、Va
l、Leu、Ile、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Arg、Ly
s、His、Try、Phe、Proである。
さらに、RA-1は50個までの炭素原子を有する生理学的
に許容し得る有機基であることも可能である。このよう
な基としては例えば直鎖状または分枝鎖状のアルキル基
であるか、あるいはさらに場合によっては例えばヒドロ
キシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシル、カルボア
ルコキシおよび／またはカルボキサミド基によって置換
されていてもよいアリールまたはアラルキル基である。
に許容し得る有機基であることも可能である。このよう
な基としては例えば直鎖状または分枝鎖状のアルキル基
であるか、あるいはさらに場合によっては例えばヒドロ
キシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシル、カルボア
ルコキシおよび／またはカルボキサミド基によって置換
されていてもよいアリールまたはアラルキル基である。
好ましくは、RA-1はAla、Thr、Ser、LysまたはArgで
あり、特にThrが好ましい。
あり、特にThrが好ましい。
式IIIの好ましいインスリン誘導体は式中、 ａ） R30＋R31＝OHまたは ｂ） R30＝Ala、ThrまたはSer、特にThrのラジカルお
よび R31＝OHおよび ｃ） RA-1＝Thr であるインスリン誘導体である。
よび R31＝OHおよび ｃ） RA-1＝Thr であるインスリン誘導体である。
これらのインスリン誘導体は（Ａ−１）Thr−（AO）A
rg−Des（B30）インスリンおよび（Ａ−１）Thr−（A
O）Argインスリンである。
rg−Des（B30）インスリンおよび（Ａ−１）Thr−（A
O）Argインスリンである。
ここでのA1−A21およびB1〜B29配列がヒト、ブタまた
はウサギインスリンの（同一）配列であるかまたはウシ
インスリンの（この点では僅かに異なる）配列である場
合、これらは（Ａ−１）Thr−（AO）Arg−Des（B30）ヒ
ト、ブタ、ウサギまたはウシインスリンおよび（Ａ−
１）Thr−（AO）Argヒトインスリン〔（B30）Thrを伴
う〕（Ａ−１）Thr−（AO）Argブタインスリン〔（B3
0）Alaを伴う〕、（Ａ−１）Thr−（AO）Argウサギイン
スリン〔（B30）Serを伴う〕および（Ａ−１）Thr−（A
O）Argウシインスリン〔（B30）Alaを伴う〕である。
はウサギインスリンの（同一）配列であるかまたはウシ
インスリンの（この点では僅かに異なる）配列である場
合、これらは（Ａ−１）Thr−（AO）Arg−Des（B30）ヒ
ト、ブタ、ウサギまたはウシインスリンおよび（Ａ−
１）Thr−（AO）Argヒトインスリン〔（B30）Thrを伴
う〕（Ａ−１）Thr−（AO）Argブタインスリン〔（B3
0）Alaを伴う〕、（Ａ−１）Thr−（AO）Argウサギイン
スリン〔（B30）Serを伴う〕および（Ａ−１）Thr−（A
O）Argウシインスリン〔（B30）Alaを伴う〕である。
特に好ましい式IIIのインスリン誘導体は式中、 ａ） R30＋R31＝OHおよび ｂ） RA-1＝Thr である該誘導体すなわち、（Ａ−１）Thr−（AO）Arg−
Des（B30）インスリン、特に（Ａ−１）Thr−（AO）Arg
−Des（B30）ヒトインスリンである。
Des（B30）インスリン、特に（Ａ−１）Thr−（AO）Arg
−Des（B30）ヒトインスリンである。
式IIIのＡ鎖およびB1〜B29鎖は基本的にあらゆる可能
なインスリンの配列であってよい。しかしながら、それ
らは、好ましくは、ヒト、ブタ、ウサギまたはウシイン
スリンの配列、特にヒトインスリンの配列（これはブタ
およびウサギインスリンのA1〜A21およびB1〜B29配列に
一致する）である。
なインスリンの配列であってよい。しかしながら、それ
らは、好ましくは、ヒト、ブタ、ウサギまたはウシイン
スリンの配列、特にヒトインスリンの配列（これはブタ
およびウサギインスリンのA1〜A21およびB1〜B29配列に
一致する）である。
式IIIのインスリン誘導体の等電点は5.5〜9.0である
（等電フォーカシングにより測定）。
（等電フォーカシングにより測定）。
式IIIのインスリン誘導体の製造は下記の手法で実施
され得る。
され得る。
ａ） 次の式IV 〔ここで式中、 AS＝遺伝子的にコード化可能なアミノ酸、 ｘ、ｚ＝互いに独立して０または１〜50の整数（ただ
しｘが０でない場合はｚも０ではない）、 Ｒ＝50個までの炭素原子を有する有機基、好ましくは
遺伝子的にコード化可能なアミノ酸の基または２個以上
の同一または相異なる遺伝子的にコード化可能なアミノ
酸から生成されるペプチド基、 Ｙ＝LysまたはArg、 そしてＡおよびＢ（１〜29）鎖は好ましくはヒト、ブ
タ、ウサギまたはウシインスリンの、特にヒト、ブタま
たはウサギインスリンの配列を有する〕で示されるイン
スリン誘導体をリジルエンドペプチターゼと接触させ、
リジル基のＣ−末端の結合を開裂させ、そしてＹ＝Lys
である場合にはR30＋R31＝OHおよびRA-1＝遺伝子的にコ
ード化可能なアミノ酸である式IIIの化合物を得るか、
またはＹ＝Argである場合にはトリプシンまたはトリプ
シン様エンドペプチターゼをさらに加えてプレ−アミノ
酸配列Ｒ−ArgをＢ鎖から開裂させそして同様にR30＋R
31＝OHおよびRA-1＝遺伝子的にコード化可能なアミノ酸
である式IIIの化合物を得るかまたは ｂ） 次の式Ｖ （式中、R30およびR31は式IIIの場合と同じ意味を有す
る）で示される場合により保護されたインスリン生成物
を（AO）アルギニンのＮ−末端においてそれ自体知られ
た方法で場合により保護されたおよび／または活性化さ
れた遺伝子的にコード化可能なＬ−アミノ酸、または50
個までの炭素原子を有する生理学的に許容し得る有機基
の供与体好ましくは場合により置換されたアルキル、ア
リールまたはアルカリール基と反応させ、次に存在する
保護基を知られた方法で除去する ことより成る手法によって実施され得る。
しｘが０でない場合はｚも０ではない）、 Ｒ＝50個までの炭素原子を有する有機基、好ましくは
遺伝子的にコード化可能なアミノ酸の基または２個以上
の同一または相異なる遺伝子的にコード化可能なアミノ
酸から生成されるペプチド基、 Ｙ＝LysまたはArg、 そしてＡおよびＢ（１〜29）鎖は好ましくはヒト、ブ
タ、ウサギまたはウシインスリンの、特にヒト、ブタま
たはウサギインスリンの配列を有する〕で示されるイン
スリン誘導体をリジルエンドペプチターゼと接触させ、
リジル基のＣ−末端の結合を開裂させ、そしてＹ＝Lys
である場合にはR30＋R31＝OHおよびRA-1＝遺伝子的にコ
ード化可能なアミノ酸である式IIIの化合物を得るか、
またはＹ＝Argである場合にはトリプシンまたはトリプ
シン様エンドペプチターゼをさらに加えてプレ−アミノ
酸配列Ｒ−ArgをＢ鎖から開裂させそして同様にR30＋R
31＝OHおよびRA-1＝遺伝子的にコード化可能なアミノ酸
である式IIIの化合物を得るかまたは ｂ） 次の式Ｖ （式中、R30およびR31は式IIIの場合と同じ意味を有す
る）で示される場合により保護されたインスリン生成物
を（AO）アルギニンのＮ−末端においてそれ自体知られ
た方法で場合により保護されたおよび／または活性化さ
れた遺伝子的にコード化可能なＬ−アミノ酸、または50
個までの炭素原子を有する生理学的に許容し得る有機基
の供与体好ましくは場合により置換されたアルキル、ア
リールまたはアルカリール基と反応させ、次に存在する
保護基を知られた方法で除去する ことより成る手法によって実施され得る。
変法ａ）の出発物質、すなわち式IVのインスリン前駆
体は、好ましくは例えば既述した各ドイツ特許出願P 38
21159.9号（1988年６月23日付出願）、P 3837273.8号
（1988年11月３日付出願）およびP 3844211.6号（1988
年11月29日付出願）に記載の遺伝子工学的手法によって
得られる。
体は、好ましくは例えば既述した各ドイツ特許出願P 38
21159.9号（1988年６月23日付出願）、P 3837273.8号
（1988年11月３日付出願）およびP 3844211.6号（1988
年11月29日付出願）に記載の遺伝子工学的手法によって
得られる。
式IVのインスリン前駆体においてＹ＝Lysの場合、リ
ジルエンドペプチターゼによる酵素開裂が直接的に進行
して式III（式中R30＋R31＝OHおよびRA-1＝遺伝子的に
コード化可能なアミノ酸）を有する対応するDes−B30目
的生成物が得られる。Ｙ＝Argである場合には基Ｒ−Ｙ
はリジルエンドペプチダーゼによる開裂では依然として
Ｂ鎖のＮ−末端に保持される（それはリジルエンドペプ
チターゼがLysのカルボキシル側のペプチド鎖のみを開
裂することによる）。次にこの基は好ましくはさらに、
基質／酵素の割合を約（100〜100,000）:1特に好ましく
は約（1000〜10,000）:1にしてトリプシンを用いること
により除去される。Ｙ＝Lysである出発物質の場合と同
一の目的生成物が生成する。別法としてこれらの酵素開
裂はそれ自体知られた方法でかつ好ましくは室温におい
て実施される。
ジルエンドペプチターゼによる酵素開裂が直接的に進行
して式III（式中R30＋R31＝OHおよびRA-1＝遺伝子的に
コード化可能なアミノ酸）を有する対応するDes−B30目
的生成物が得られる。Ｙ＝Argである場合には基Ｒ−Ｙ
はリジルエンドペプチダーゼによる開裂では依然として
Ｂ鎖のＮ−末端に保持される（それはリジルエンドペプ
チターゼがLysのカルボキシル側のペプチド鎖のみを開
裂することによる）。次にこの基は好ましくはさらに、
基質／酵素の割合を約（100〜100,000）:1特に好ましく
は約（1000〜10,000）:1にしてトリプシンを用いること
により除去される。Ｙ＝Lysである出発物質の場合と同
一の目的生成物が生成する。別法としてこれらの酵素開
裂はそれ自体知られた方法でかつ好ましくは室温におい
て実施される。
変法ｂ）の出発物質、すなわち式Ｖのインスリン生成
物は前述のドイツ特許出願P 3844211.6号に記載のAO−A
rgインスリン誘導体である。それらはさらに変法ｂ）で
使用するにはアミノおよび／またはカルボキシル基に対
してペプチド化学で慣用の保護基を備えることができ、
その場合には勿論、AOアルギニンのＮ−末端は未保護の
ままでなければならない（それは基RA-1のカップリング
がそこで行われなければならないからである）。次に場
合により適当に保護された式Ｖのインスリン生成物を、
同様に場合により保護されたおよび／または活性化され
た遺伝子的にコード化可能なアミノ酸と、または50個ま
での炭素原子を有する生理学的に許容し得る有機基の供
与体、好ましくは場合により置換された50個までの炭素
原子を有するアルキル、アリールまたはアラルキル基
（例えばアルキルハライド、アリールハライドまたはア
ラルキルハライド）と、このタイプの反応に慣用の手法
で反応させる。アルキル、アリールおよびアラルキル基
に対して適当ないくつかの置換基は基RA-1の説明で前述
した基である。
物は前述のドイツ特許出願P 3844211.6号に記載のAO−A
rgインスリン誘導体である。それらはさらに変法ｂ）で
使用するにはアミノおよび／またはカルボキシル基に対
してペプチド化学で慣用の保護基を備えることができ、
その場合には勿論、AOアルギニンのＮ−末端は未保護の
ままでなければならない（それは基RA-1のカップリング
がそこで行われなければならないからである）。次に場
合により適当に保護された式Ｖのインスリン生成物を、
同様に場合により保護されたおよび／または活性化され
た遺伝子的にコード化可能なアミノ酸と、または50個ま
での炭素原子を有する生理学的に許容し得る有機基の供
与体、好ましくは場合により置換された50個までの炭素
原子を有するアルキル、アリールまたはアラルキル基
（例えばアルキルハライド、アリールハライドまたはア
ラルキルハライド）と、このタイプの反応に慣用の手法
で反応させる。アルキル、アリールおよびアラルキル基
に対して適当ないくつかの置換基は基RA-1の説明で前述
した基である。
次に存在し得る保護基はそれ自体知られた方法で再び
除去される。
除去される。
変法ａ）によれば式IIIにおいてR30＋R31＝OH（Des−
B30インスリン誘導体）およびRA-1＝遺伝子的にコード
化可能なアミノ酸であるインスリン誘導体のみを得るこ
とができるけれども、式IIIにおいてR30およびR31が式I
II b）に対する説明で記載された基、およびまたRA-1が
50個までの炭素原子を有する生理学的に許容し得る有機
基を有するインスリン誘導体の製造もまた変法ｂ）によ
り可能である。
B30インスリン誘導体）およびRA-1＝遺伝子的にコード
化可能なアミノ酸であるインスリン誘導体のみを得るこ
とができるけれども、式IIIにおいてR30およびR31が式I
II b）に対する説明で記載された基、およびまたRA-1が
50個までの炭素原子を有する生理学的に許容し得る有機
基を有するインスリン誘導体の製造もまた変法ｂ）によ
り可能である。
式IIIのインスリン誘導体はin vivoで十分に活性であ
り、このことは前述のP.Rsen et alによる参考文献に
関して極めて驚くべきことである。それらは前述の特許
出願P 3844211.6号に記載のAO−Argインスリン誘導体と
非常によく類似した作用を有する。従って、それらはそ
の生理学的に許容し得る塩（例えばNa塩またはNH4塩）
と同様に、主として糖尿病治療用製剤のための活性化合
物として使用される。
り、このことは前述のP.Rsen et alによる参考文献に
関して極めて驚くべきことである。それらは前述の特許
出願P 3844211.6号に記載のAO−Argインスリン誘導体と
非常によく類似した作用を有する。従って、それらはそ
の生理学的に許容し得る塩（例えばNa塩またはNH4塩）
と同様に、主として糖尿病治療用製剤のための活性化合
物として使用される。
従って、本発明の少なくとも１種の式IIIのインスリ
ンおよび／または少なくとも１種のその生理学的に許容
し得る塩を、溶解された、無定形のおよび／または結晶
の形、好ましくは無定形のおよび／または結晶の形で含
む製剤にも関する。
ンおよび／または少なくとも１種のその生理学的に許容
し得る塩を、溶解された、無定形のおよび／または結晶
の形、好ましくは無定形のおよび／または結晶の形で含
む製剤にも関する。
この製剤の好ましい式IIIのインスリン誘導体は （Ａ−１）Thr−AO−Argヒトインスリン、 （Ａ−１）Thr−AO−Argブタインスリン、 （Ａ−１）Thr−AO−Argウサギインスリン、 （Ａ−１）Thr−AO−Argウシインスリンおよび （Ａ−１）Thr−AO−Arg−Des−B30ヒトインスリン 好ましくは（Ａ−１）Thr−AO−Arg−Des−B30ヒトイ
ンスリン、 およびそれらの生理学的に許容され得る塩である。
ンスリン、 およびそれらの生理学的に許容され得る塩である。
この製剤は好ましくは、 適当な張度調節剤、 適当な保存剤および所望により適当な緩衝剤、 および所望により、ある亜鉛イオン濃度または他のデ
ポー主剤（principle）例えば硫酸プロタミン、 をもちろんすべての滅菌水性溶液または懸濁液中に含有
する約3.0〜9.0、好ましくは約5.0〜8.5のpHを有する注
射用溶液または懸濁液である。活性化合物以外の製剤成
分全体が製剤の賦形剤を形成する。
ポー主剤（principle）例えば硫酸プロタミン、 をもちろんすべての滅菌水性溶液または懸濁液中に含有
する約3.0〜9.0、好ましくは約5.0〜8.5のpHを有する注
射用溶液または懸濁液である。活性化合物以外の製剤成
分全体が製剤の賦形剤を形成する。
適当な張度調節剤の例はグリセロール、グルコース、
マンニトール、NaCl、カルシウムまたはマグネシウム化
合物、例えばCaCl2、MgCl2などである。
マンニトール、NaCl、カルシウムまたはマグネシウム化
合物、例えばCaCl2、MgCl2などである。
適当な保存剤の例はフェノール、ｍ−クレゾール、ベ
ンジルアルコールおよび／またはｐ−ヒドロキシ安息香
酸エステルである。
ンジルアルコールおよび／またはｐ−ヒドロキシ安息香
酸エステルである。
特に約5.0〜8.5にpHを調節するのに用いることができ
る緩衝物質の例は、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム、燐酸ナトリウムなどである。その他、pH調節に適し
ているのは生理学的に許容し得る希酸（典型的にはHC
l）またはアルカリ（典型的にはNaOH）である。
る緩衝物質の例は、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム、燐酸ナトリウムなどである。その他、pH調節に適し
ているのは生理学的に許容し得る希酸（典型的にはHC
l）またはアルカリ（典型的にはNaOH）である。
製剤が亜鉛を含有する場合、約１μｇ〜2mg、特に約
５μｇ〜200μｇの亜鉛（1mlあたり）という含有量が好
ましい。
５μｇ〜200μｇの亜鉛（1mlあたり）という含有量が好
ましい。
本発明の製剤の作用プロフィールを変えるために他の
修飾された（EP−B 132,769号、EP−B 132,770号および
ドイツ特許出願P 3844211.6号参照）および／または未
修飾のインスリン、好ましくはウシ、ブタ、ウサギまた
はヒトインスリン、特にヒトインスリンを混合すること
も可能である。
修飾された（EP−B 132,769号、EP−B 132,770号および
ドイツ特許出願P 3844211.6号参照）および／または未
修飾のインスリン、好ましくはウシ、ブタ、ウサギまた
はヒトインスリン、特にヒトインスリンを混合すること
も可能である。
活性化合物の好ましい濃度は、約１〜15,000、好まし
くは約５〜1000、特に好ましくは約40〜400国際単位/ml
に相当する濃度である。
くは約５〜1000、特に好ましくは約40〜400国際単位/ml
に相当する濃度である。
製剤は、少なくとも１種の式IIIのインスリン誘導体
および／または少なくとも１種のその生理学的に許容し
得る塩を、所望により他の修飾されたおよび／または未
修飾のインスリンまたはそれらの誘導体と共に、生理学
的に許容し得る賦形剤を用いて、所望により適当な添加
剤および助剤と共に、適当な剤形に変えることにより製
造される。
および／または少なくとも１種のその生理学的に許容し
得る塩を、所望により他の修飾されたおよび／または未
修飾のインスリンまたはそれらの誘導体と共に、生理学
的に許容し得る賦形剤を用いて、所望により適当な添加
剤および助剤と共に、適当な剤形に変えることにより製
造される。
本発明を以下の実施例により詳細に説明する。
変法ａ）による（Ａ−１）Thr−（AO）Arg−Des−B30ヒ
トインスリンの製造 ドイツ特許出願P 3821159.9号による方法で製造され
た次の式 を有する組換えタンパク質、すなわちAS＝Thr、ｘ、ｚ
＝０、Ｙ＝ArgおよびＲ＝Ｈ−Ile−Glu−Gly−である式
Ｖの化合物200mgを20mMホスフェートバッファー（pH8.
4）50ml中に溶解しついで20℃で30分間リジルエンドペ
プチダーゼ100mcgで消化した。次にトリプシン100mcgを
用いてペプチド配列Ile−Glu−Gly−Argを除去した。室
温での２時間の反応時間経過後に、バッチの反応をトリ
フルオロ酢酸の添加により停止し、反応生成物を0.1％
トリフルオロ酢酸／アセトニトリル系中の逆相上で精製
した。次の式 を有する（Ａ−１）Thr−（AO）Arg−（B30）Des−Thr
ヒトインスリンの51mgが得られた。
トインスリンの製造 ドイツ特許出願P 3821159.9号による方法で製造され
た次の式 を有する組換えタンパク質、すなわちAS＝Thr、ｘ、ｚ
＝０、Ｙ＝ArgおよびＲ＝Ｈ−Ile−Glu−Gly−である式
Ｖの化合物200mgを20mMホスフェートバッファー（pH8.
4）50ml中に溶解しついで20℃で30分間リジルエンドペ
プチダーゼ100mcgで消化した。次にトリプシン100mcgを
用いてペプチド配列Ile−Glu−Gly−Argを除去した。室
温での２時間の反応時間経過後に、バッチの反応をトリ
フルオロ酢酸の添加により停止し、反応生成物を0.1％
トリフルオロ酢酸／アセトニトリル系中の逆相上で精製
した。次の式 を有する（Ａ−１）Thr−（AO）Arg−（B30）Des−Thr
ヒトインスリンの51mgが得られた。
低血糖作用 無水（Ａ−１）Thr−（AO）Arg−（B30）Des−Thrヒ
トインスリン2.2mgを0.9％NaCl溶液1.5ml中に取り入れ
た。また生理学的塩水溶液1.5ml中に溶解したヒトイン
スリン2.2mgも比較および標準物質として使用した。平
均体重3.1kgを有する絶食させた雄ウサギ５匹に、生体
重1kg当たり試料溶液6.25μを各場合に静脈内投与し
た。同様にその他の動物５匹に1kg当たり標準液6.25μ
を静脈内投与した。種々の時間の経過後に、血液試料
を採取し、血中の糖濃度を調べた。誤差の限界内で、検
出された測定結果は下記のとおりであった。
トインスリン2.2mgを0.9％NaCl溶液1.5ml中に取り入れ
た。また生理学的塩水溶液1.5ml中に溶解したヒトイン
スリン2.2mgも比較および標準物質として使用した。平
均体重3.1kgを有する絶食させた雄ウサギ５匹に、生体
重1kg当たり試料溶液6.25μを各場合に静脈内投与し
た。同様にその他の動物５匹に1kg当たり標準液6.25μ
を静脈内投与した。種々の時間の経過後に、血液試料
を採取し、血中の糖濃度を調べた。誤差の限界内で、検
出された測定結果は下記のとおりであった。
上記数値から、新規インスリン誘導体の低血糖作用は
（未修飾の）ヒトインスリン該作用と同程度の大きさで
あることが分かる。
（未修飾の）ヒトインスリン該作用と同程度の大きさで
あることが分かる。
結晶懸濁液の皮下投与において、新規インスリン誘導
体は持効的に作用する。
体は持効的に作用する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リヒアルト・ビカー ドイツ連邦共和国デー‐6237 リーデル バハ．ブルネンシユトラーセ40 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/62 C12P 21/00 - 21/06 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】次の式III 【化１】 （ここで式中、 ａ） R30＋R31＝OHまたは ｂ） R30＝Ala、ThrもしくはSerの基、およびR31＝O
H、並びに ｃ） RA-1＝ThrまたはSerの基 で示されるインスリン誘導体およびその生理学的に許容
し得る塩。 - 【請求項２】式IIIにおいて、 ａ） R30＋R31＝OHまたは ｂ） R30＝Thrの基およびR31＝OH、並びに ｃ） RA-1＝Thr である請求項１記載のインスリン誘導体およびその生理
学的に許容し得る塩。 - 【請求項３】式IIIにおいて、 ａ） R30＋R30＝OHおよび ｃ） RA-1＝Thr である請求項１または２記載のインスリン誘導体および
その生理学的に許容し得る塩。 - 【請求項４】式IIIのＡ鎖およびＢ鎖（B1〜B29）がヒ
ト、ブタ、ウサギまたはウシインスリン、好ましくはヒ
ト、ブタまたはウサギインスリンの配列である請求項１
〜３のいずれかに記載のインスリン誘導体およびその生
理学的に許容し得る塩。 - 【請求項５】5.5〜9.0に等電点を有する請求項１〜４の
いずれかに記載のインスリン誘導体。 - 【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の少なくと
も１種の式IIIのインスリン誘導体および／または少な
くとも１種のその生理学的に許容し得る塩を、溶解され
る無定形および／または結晶形態で含有する糖尿病治療
用製剤。 - 【請求項７】式IIIに包含される以下のインスリン誘導
体 （Ａ−１）Thr−AO−Argヒトインスリン、 （Ａ−１）Thr−AO−Argブタインスリン、 （Ａ−１）Thr−AO−Argウサギインスリン、 （Ａ−１）Thr−AO−Argウシインスリンおよび （Ａ−１）Thr−AO−Arg−Des−B30ヒトインスリン、 好ましくは（Ａ−１）Thr−AO−Arg−Des−B30ヒトイン
スリン、およびそれらの生理学的に許容し得る塩のうち
の少なくとも１種を含有する請求項６記載の製剤。 - 【請求項８】3.0〜9.0のpHを有する注射用溶液または懸
濁液としての請求項６または７記載の製剤。 - 【請求項９】少なくとも１種の式IIIのインスリン誘導
体および／または少なくとも１種のその生理学的に許容
し得る塩を、所望によりその他の修飾されたおよび／ま
たは未修飾のインスリンまたはインスリン誘導体と共
に、生理学的に許容し得る賦形剤および所望により適当
な添加剤および／または助剤を用いて適当な製剤にする
ことより成る請求項６〜８のいずれかに記載の製剤の製
造方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE3936876A DE3936876A1 (de) | 1989-11-06 | 1989-11-06 | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| DE3936876.9 | 1989-11-06 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=6392948
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02297376A Expired - Lifetime JP3131215B2 (ja) | 1989-11-06 | 1990-11-05 | 新規インスリン誘導体 |
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| Country | Link |
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| EP (1) | EP0427162B1 (ja) |
| JP (1) | JP3131215B2 (ja) |
| KR (1) | KR910009930A (ja) |
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| AU (1) | AU6577290A (ja) |
| CA (1) | CA2029289A1 (ja) |
| DE (2) | DE3936876A1 (ja) |
| DK (1) | DK0427162T3 (ja) |
| ES (1) | ES2087879T3 (ja) |
| FI (1) | FI905439A7 (ja) |
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| HU (1) | HU205773B (ja) |
| IE (1) | IE903978A1 (ja) |
| IL (1) | IL96239A0 (ja) |
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| PT (1) | PT95788A (ja) |
| ZA (1) | ZA908842B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US6875589B1 (en) * | 1988-06-23 | 2005-04-05 | Hoechst Aktiengesellschaft | Mini-proinsulin, its preparation and use |
| TW224471B (ja) * | 1991-11-26 | 1994-06-01 | Lilly Co Eli | |
| JP3406244B2 (ja) | 1999-04-30 | 2003-05-12 | 伊藤ハム株式会社 | 新規な融合蛋白質からの組み換えインスリンの製造方法 |
| CA2468100A1 (en) * | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Eli Lilly And Company | Insulin molecule having protracted time action |
| WO2004096854A2 (en) * | 2003-04-29 | 2004-11-11 | Eli Lilly And Company | Insulin analogs having protracted time action |
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