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JP3118015B2 - バイオセンサーおよびそれを用いた分離定量方法 - Google Patents

バイオセンサーおよびそれを用いた分離定量方法

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Publication number
JP3118015B2
JP3118015B2 JP03113030A JP11303091A JP3118015B2 JP 3118015 B2 JP3118015 B2 JP 3118015B2 JP 03113030 A JP03113030 A JP 03113030A JP 11303091 A JP11303091 A JP 11303091A JP 3118015 B2 JP3118015 B2 JP 3118015B2
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JP
Japan
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substance
active substance
sample
physiologically active
electrode
Prior art date
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JP03113030A
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晴三 上野山
久 奥田
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Arkray Inc
Original Assignee
Arkray Inc
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Publication date
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Priority to DE69223848T priority patent/DE69223848T2/de
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Priority to US08/138,263 priority patent/US5382346A/en
Priority to US08/321,604 priority patent/US5496453A/en
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode

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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、バイオセンサーおよび
それを用いた分離定量方法に関し、更に詳しくは液体試
料中の特定物質と酵素等の生理活性物質とを反応させ、
反応に関与する物質を電気化学的に検出するバイオセン
サーおよび物質の分離定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】電気化学的検出手段によるバイオセンサ
ーを使用して血液等の液体生体試料を測定する際、試料
中に共存するアスコルビン酸、尿酸等の還元性物質が電
気化学的あるいは化学的に与える妨害作用が常に問題と
なっている。特許および文献上見られる、妨害作用除去
あるいは回避策は極めて多数である。それらを分類する
と、以下の通りである: (１)妨害除去膜法(たとえば、米国特許第３,９７９,２
７４号、同第４,２４０,８８９号、特開昭５７−２１１
５４２号公報、特開昭５８−５６４３号公報など) (２)電極酸化法(たとえば、米国特許第４,４３１,５０
７号、特開昭５７−１１８１５２号公報、特開昭５７−
２１１０５４号公報、特開昭５８−５６４２号公報、特
開昭５８−８５１４８号公報、特開昭５８−８５１４９
号公報、特開昭５８−１４６８４７号公報、ジ・イレブ
ンス・ケミカル・センサー・シンポジウム(Ｔhe １１th
Ｃhemical Ｓensor Ｓymposium),大川ら、２４．「フロ
ー型電気化学バイオセンサシステムに対する電気活性妨
害物質の電気化学的オンライン除去」など) (３)複数作用電極法(たとえば、米国特許第３,５３９,
４５５号、特開昭５８−１４６８４７号公報、特開平１
−２５３６４８号公報、ミヤハラら、センサー・アンド
・アクチュエーターズ(Ｓensorand Ａctuators),第７巻
１頁(１９８５)など) (４)妨害物質酸化酵素添加法(特公昭５８−１７４２７
号) (５)ダブル・ポテンシャル・ステップ法(たとえば、日
本化学会第５８回春季年会、４ＩＧ０６、松浦ら「微小
カーボンファイバー電極による過酸化水素の測定」）
【０００３】しかし、これら従来技術はそれぞれ以下の
ような欠点を有する。 （１)妨害除去膜法 電気化学的検出手段である電極を選択透過性の膜で被覆
し、測定対象物質は透過させ、妨害作用を有する共存物
質は阻止しようとする方法である。酸素分子、過酸化水
素のような極低分子を電気化学反応物質とする場合には
この方法を使えるが、フェリシアン化カリ、フェロセン
等のメディエータ(電荷仲介媒体)の場合は、妨害作用を
有する共存物質とメディエータとの分子サイズ上の区別
は不可能となりこの方法は使用できない。また、この方
法は、妨害除去膜の外部(試料液中)で起り得る共存物質
と電気化学反応物質との酸化還元反応に対する対策とは
ならない。さらに、膜による感度および応答性の劣化が
あり、それが膜厚により左右されるため、センサーの個
体差が拡大される。
【０００４】(２)電極酸化法 この方法では、目的物質を測定するための電極系(測定
電極系)の他に、試料中に共存する妨害物質を陽極酸化
するための電極系(電解電極系)を使用する。試料が供給
されると、妨害物質が酵素反応系や測定電極系に達する
前に、それを電解電極系により陽極酸化する方法であ
る。
【０００５】この方法では測定電極系の他に電解電極系
が本質的に必要であり、それらおよび酵素等生理活性物
質の反応系を空間的に分離するため、構造が複雑とな
る。妨害物質電解効率を向上させるには、電解電極系の
表面積を大きくする、試料液を強制的に攪拌する、流動
させるなど種々の工夫がなされているが、いずれもセン
サー構造を複雑に大きく、応答性を低下させてしまう。
ことに使い捨て使用を目的としたセンサーへの応用が困
難となる。
【０００６】また、妨害物質電解効率の向上と測定時間
の短縮・応答性の向上とは背反する要求である。両者を
満足するための極めて薄い一体化多孔質電極系が提案さ
れているが、構造的に弱く、不安定であるので、構造的
強化が必要であり、単純で安価なセンサーの実現は困難
である。
【０００７】測定系全系を含めると、測定電極系の他
に、電解電極系を有するので、電気回路や測定用ソフト
ウエアも複雑で高価となることは避けられない。
【０００８】(３)複数作用電極法 この方法では、測定電極系の他に、試料中に共存する妨
害物質を測定するための電極系(妨害物質測定系)を使用
する。試料が供給されると、測定電極系は目的物質と妨
害物質の両者を測定し、妨害物質測定系は妨害物質のみ
を測定する。両測定値の差をとることにより目的物質の
濃度を測定する方法である。
【０００９】この方法では、測定電極系の他に妨害物質
測定系が本質的に必要である。測定電極系で生成された
反応生成物が妨害物質測定系へ影響を及ぼす危険性があ
り、充分な空間的分離が必要である。従って、それだけ
センサーのサイズが大きく、複雑化する。また、電極系
が２系統以上あるので、電流増幅用電気回路も２系統以
上必要となる。
【００１０】さらに、目的物質測定系および妨害物質測
定系の妨害物質に対する測定感度を釣り合わせる必要が
あるが、実際問題として、これが非常に困難である。く
り返し使用のセンサーでは両電極の妨害物質の測定感度
を校正する方法も考えられるが、一回使い捨てセンサー
では不可能である。
【００１１】(４)妨害物質酸化酵素添加法 妨害物質が電極反応あるいは測定対象物質との酸化還元
反応を行う前に、アスコルビン酸、尿酸等の妨害物質を
各々の酸化酵素により酸化しておく方法である。この方
法では妨害物質を除去するために特異性の高い酵素を使
用するため、複数の妨害物質が存在する場合にはそれぞ
れに対応した複数の酵素を共存させる必要があり、バイ
オセンサーのコストアップになる。また、妨害物質の前
酸化が必要条件であり、妨害物質酸化生成物が目的物質
の測定を妨害しない工夫も必要となるので構造的に複雑
になるのは避けられない。さらに、妨害物質は酸化によ
り、測定にはかかってこないように「除去」されてしま
う。これは測定すれば有効な情報を捨てることになる。
【００１２】(５)ダブル・ポテンシャル・ステップ法 測定電極の測定対象物質に対する自然電位(Ｅ02とする)
と、共存する妨害物質の自然電位(Ｅ01とする)が異なる
場合(Ｅ01＜Ｅ02とする)、Ｅ01＜Ｅ1＜Ｅ02を満足する
電位Ｅ1で妨害物質濃度を測定し、Ｅ02＜Ｅ2を満足する
電位Ｅ2で測定対象物質および妨害物質の両者の和を測
定し、その差を求めて、目的物質の濃度を測定する方法
である。
【００１３】この方法はその原理から、測定対象物質に
対する自然電位(Ｅ02)と妨害物質の自然電位(Ｅ01)が十
分離れていなければ、分離測定することが不可能とな
る。測定対象物質が過酸化水素の場合、この関係は保た
れることが多いが、電極材質やその表面状態によって
は、Ｅ01とＥ02は接近することや、逆転することも観察
されている。
【００１４】バイオセンサーの安定化や直線領域の拡大
を目的として、メディエータが使われることが多いが、
この場合は、測定対象物質も妨害物質もメディエータを
介して電極と電荷の受授を行なうので、Ｅ01＝Ｅ02とな
り、ダブル・ポテンシャル・ステップ法は使用できな
い。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、液体試料を
分離することなく、測定対象物質の信号を妨害物質の信
号から、簡単に安価に分離することのできるバイオセン
サーおよび分離定量方法を提供しようとするものであ
る。
【００１６】前述の通り従来法では、妨害除去膜法やダ
ブル・ポテンシャル・ステップ法はメディエータを使用
したバイオセンサー系では適用できない。また、妨害除
去膜法や電極酸化法は、測定感度や応答速度を犠牲にせ
ざるを得ない。さらに、電極酸化法や複数作用電極法
は、バイオセンサーの構造が複雑になり、従って電気回
路系や測定系も複雑・高価になる。本発明は、これらの
問題を解決しようとするものである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、上記課
題は、液体試料中の特定物質と生理活性物質またはそれ
に関与する物質(以下、まとめて「生理活性物質」とい
う。)とを反応させ、反応に関与する物質を電気化学的
に検出するバイオセンサーにおいて、生理活性物質およ
び要すればメディエータを電気化学的検出手段である電
極から離れた部位に配置し、要すれば配置された生理活
性物質またはメディエータを高分子物質層により被覆し
たバイオセンサー、および上記バイオセンサーに試料供
給後、供給された試料について少なくとも２回、すなわ
ち、生理活性物質に関与しないが試料中に共存する電気
化学的活性物質に関与する試料供給当初の電気化学信
号、並びに生理活性物質および試料中に共存する電気化
学的活性物質の両者に関与する試料供給後十分な時間経
過後の電気化学信号を取り込み、両信号を演算すること
により、生理活性物質と特異的に反応する物質、並びに
試料中に共存する電気化学的活性物質を分離定量するこ
とを特徴とする分離定量方法により解決される。
【００１８】本発明において生理活性物質には、次のよ
うなものが包含される: (１)酸化還元酵素の基質(たとえば、乳酸、ブドウ糖、
尿酸、ピルビン酸、コレステロールなど) (２)酸化還元酵素(たとえば、乳酸脱水素酵素、イソク
エン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、グルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素など) (３)基質または酵素の反応を利用して最終的に酸化還元
反応を行う物質(たとえば、トリグリセリド、リン脂
質、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＣＰＫなど) (４)抗原抗体反応を活用して測定する物質(たとえば、
各種免疫グロブリン、Ｔ3、Ｔ4などの各種ホルモン）
【００１９】本発明において、生理活性物質を「配置」
するとは、所定の箇所に生理活性物質を、試料中の特定
物質と反応可能な状態で存在させておくことを意味し、
メディエータを「配置」するとは、所定の箇所にメディエ
ータを、試料に溶解可能な状態で存在させておくことを
意味し、その状態は限定されない。たとえば、生理活性
物質を溶液の形で所定箇所に塗布し、乾燥して、生理活
性物質を乾燥残渣として配置することができる。あるい
は、適当な含浸用基材(たとえば、濾紙、布片など)に生
理活性物質の溶液を含浸させ、乾燥して作成した、生理
活性物質を含む基材を所定箇所に固定してもよい。ま
た、生理活性物質のあるものは、グルタルアルデヒドや
ジサクシニミジルスベレート等の架橋剤で固定してもよ
い、あるいは基材と生理活性物質間の吸着力を利用して
吸着させてもよい。
【００２０】メディエータを使用するバイオセンサーで
は、測定電極上には必要に応じてメディエータを配置
し、酵素等の生理活性物質は配置しない。親水性高分子
等をメディエータと混合し、配置してもよい。
【００２１】一方、酵素等の生理活性物質は少なくとも
メディエータと共に測定電極から十分離れた位置に配置
する。その位置は、試料供給後、測定電極上に配置され
たメディエータが溶解し、電極反応の結果、その信号が
取り込まれる極めて短時間(通例０〜数秒)の間に、試料
中の目的物質と酵素等生理活性物質との反応の結果生じ
たメディエータが測定電極へ拡散により到達しないよう
な位置関係にあればよい。
【００２２】メディエータを利用しない、過酸化水素電
極などを利用したバイオセンサーでは、測定電極上には
何ら配置しない。ただし、親水性高分子等は試料導入の
円滑化を図るため配置してもよい。一方、酵素等の生理
活性物質は測定電極から十分離れた位置に配置する。そ
の位置は試料供給後、試料中の妨害物質が直接的に電極
反応の結果、その信号が取り込まれる極めて短時間(通
例０〜数秒)の間に試料中の目的物質と酵素等生理活性
物質との反応の結果生じた過酸化水素等が測定電極へ拡
散により到達しないような位置関係にあればよい。
【００２３】さらに、測定電極と離れた部位の配置部か
ら拡散したメディエータ、過酸化水素などの測定電極へ
の到達時間を適度に調節(延長)するため、配置する酵素
層への親水性高分子添加量を増加することができる。あ
るいは、配置した酵素層を覆う形で、親水性高分子層を
形成することができる。
【００２４】本発明の分離定量方法では、バイオセンサ
ーに試料供給当初(通例数秒以内)に第１の電流測定を行
い、試料供給後十分な時間経過後(通例数１０秒以内)
に、第２の電流測定を行なう。第１の電流測定値は、酵
素等の生理活性物質と反応した目的物質からの生成物が
測定電極に到達する以前の値であり、これから試料中に
共存する妨害物質濃度が定量できる。第２の電流測定値
は、妨害物質および酵素等の生理活性物質と反応した目
的物質による生成物両者による値であり、これから、目
的物質および妨害物質の和の濃度が定量できる。従っ
て、第１の電流測定値から得られた妨害物質の濃度を第
２の電流測定値から得られた濃度値より差し引くことに
より目的物質の濃度を求めることができる。なお、第１
および第２の電流測定のタイミングは、各々妨害物質お
よび目的物質と妨害物質両者に起因する電流を正確に測
定できるタイミングであることが重要であり、上記通例
の時間に拘束されるものではない。
【００２５】実施例１ 作製した２電極式分離分析用バイオセンサーの模式断
面図を図１に示す。ポリエチレンテレフタレート(ＰＥ
Ｔ)製シート状基板１上に、シルク印刷により銀リード
線付カーボン電極２を形成した。その上に、被検液を収
容する空間３'を有するＰＥＴ製スペーサ３を両面接着
テープにより貼付した。さらにスペーサ３の電極２と反
対側にも両面接着テープにより蓋４を貼付した。被検液
を開口７より空間３'内へ導入することにより測定が行
なわれる。次の(Ａ)、(Ｂ)及び(Ｃ)の手順で配置した。
【００２６】(Ａ)電極２の一定面積を占めるカーボン電
極上５の位置に、３．３mＭのフェリシアン化カリ(３０
μl)を滴下し、乾燥することにより、電極上にフェリシ
アン化カリを固相として配置した。 (Ｂ)蓋４の内面上６の位置に、１６０mＭフェリシアン
化カリ及び４００Ｕ／ml乳酸酸化酵素を含むpＨ６．４
の０．１Ｍクエン酸緩衝液５μlを滴下し、乾燥するこ
とにより酵素およびフェリシアン化カリを固相として配
置した。 (Ｃ)電極２の５の位置に、３．３mＭフェリシアン化カ
リ(３０μl)を滴下し、乾燥することにより、電極上に
フェリシアン化カリを固相として配置し、さらに蓋４の
内面上６の位置に１６０mＭフェリシアン化カリ及び４
００Ｕ／ml乳酸酸化酵素を含むpＨ６．４の０．１Ｍク
エン酸緩衝液５μlを滴下し、乾燥することにより，酵
素およびフェリシアン化カリを固相として配置した。
【００２７】実施例２ 実施例１(Ａ)で作製したセンサーに、２mＭアスコル
ビン酸水溶液,１０μlを開口部７より導入すると同時
に、検知電極−対極間に一定電位＋２００mＶを印加
し、陽極酸化電流を測定した。結果を図２(線Ａ)に示
す。陽極電流は、電位＋２００mＶ印加で、０．５秒後
には最高値に達しており、アスコルビン酸によるフェリ
シアン化カリの還元反応は極めて速く、検出されること
がわかった。
【００２８】実施例３ 実施例１(Ｂ)で作製したセンサーを用いて、５mＭ乳
酸水溶液１０μlを被検試料として、実施例２と同様に
陽極電流の時間変化を測定した。結果を図２(線Ｂ)に示
す。陽極電流は、電位＋２００mＭ印加後も４秒間ほと
んど０μＡを示し、第１図６の位置で乳酸の酵素反応に
より生じたフェロシアン化カリの検出電極への到達は約
４秒遅延したことがわかった。
【００２９】実施例４ 実施例１(Ｃ)で作製したセンサーを用いて、乳酸濃度
０mg／dl、９．０mg／dl、18.0mg／dl、４５．０mg／dl
に対し、アスコルビン酸０mg／dl、１７．６mg／dl、３
５．２mg／dl(いずれも終濃度)を添加した水溶液を調製
し、その１０μlを開口部７より導入すると同時に、検
知電極−対極間に第一の印加電位＋２００mＶを４秒間
印加し、その間、陽極酸化電流を測定した。次に、被検
液導入から３０秒の酵素反応時間経過後、第二の印加電
位＋２００mＶを５秒間印加し、その間陽極酸化電流を
測定した。
【００３０】測定結果を図３〜５に示す。図３はアスコ
ルビン酸濃度０mg／dlにおける乳酸濃度０mg／dl、９．
０mg／dl、１８．０mg／dl、４５．０mg／dlの被検液を
測定した場合の時間経過に伴った陽極電極電流の変化で
ある。同様に図４はアスコルビン酸濃度１７．６mg／d
l、図５はアスコルビン酸濃度、３５．２mg／dlにおけ
る乳酸濃度０mg／dl、９．０mg／dl、１８．０mg／dl、
４５．０mg／dlの被検液を測定した場合の陽極電流の変
化を示す。
【００３１】図６は、図３〜５の測定開始より４秒後の
応答電流(陽極電流)値を縦軸に、アスコルビン酸濃度を
横軸にとったアスコルビン酸に対する検量線である。こ
の検量線は乳酸濃度の幅広い変化にもかかわらず一本の
直線で近似することができる。すなわちアスコルビン酸
は乳酸から分離定量できた。
【００３２】図７は、図３〜５の測定開始後より３５秒
後の応答電流(陽極電流)値を縦軸に、アスコルビン酸濃
度を横軸にとった乳酸に対する検量線である。この検量
線はアスコルビン酸の各濃度に対し、それに依存した応
答電流分だけ、縦軸正方向に移動した。これは、乳酸測
定に対してアスコルビン酸の正の妨害があることを示し
ている。図７の検量線を図６のアスコルビン酸の検量線
を使って補正した。すなわち、第１の電位印加時と第２
の電位印加時のアスコルビン酸に対する応答電流の感度
差を考慮し、図７のアスコルビン酸０mg／dlおよび３
５．２mg／dlに対する検量線が原点を通るよう図６のア
スコルビン酸の検量線を修正した後、その検量線(直線)
を使って図７のすべての測定点を補正した。結果を図８
に示す。この検量線はアスコルビン酸の幅広い変化にも
かかわらず一本の直線で近似することができた。すなわ
ち乳酸はアスコルビン酸から分離できた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の２電極式分離分析用バイオセンサー
の１例の模式断面図。
【図２】 実施例２および３において得られた陽極酸化
電流の測定値を示すグラフ。
【図３】 アスコルビン酸濃度０mg／mlにおける各種乳
酸濃度での陽極酸化電流の変化を示すグラフ。
【図４】 アスコルビン酸濃度１７．６mg／mlにおける
各種乳酸濃度での陽極酸化電流の変化を示すグラフ。
【図５】 アスコルビン酸濃度３５．２mg／mlにおける
各種乳酸濃度での陽極酸化電流の変化を示すグラフ。
【図６】 図３〜５の測定開始より４秒後の応答電流
(陽極電流)値を縦軸に、アスコルビン酸濃度を横軸にと
ったアスコルビン酸に対する検量線。
【図７】 図３〜５の測定開始後より３５秒後の応答電
流(陽極電流)値を縦軸に、アスコルビン酸濃度を横軸に
とった乳酸に対する検量線。
【図８】 図７の検量線を図６のアスコルビン酸の検量
線を使って補正した検量線。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/327 G01N 27/416

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 液体試料中の特定物質と生理活性物質ま
    たはそれに関与する物質とを反応させ、反応に関与する
    物質を電気化学的に検出するバイオセンサーにおいて、
    生理活性物質を含む物質は電気化学的検出手段である電
    極から離れた部位に配置されており、該液体試料は、該
    生理活性物質を含む物質と該電極とに実質的に同時に供
    給され、該生理活性物質に関与しないが試料中に共存す
    る電気化学的活性物質に関与する試料供給当初の電気化
    学信号、並びに該生理活性物質および試料中に共存する
    電気化学的活性物質の両者に関与する試料供給後十分な
    時間経過後の電気化学信号を取り込むことができること
    を特徴とするバイオセンサー。
  2. 【請求項２】 生理活性物質またはそれに関与する物質
    および少なくともメディエータを電気化学的検出手段で
    ある電極から離れた部位に配置した請求項１記載のバイ
    オセンサー。
  3. 【請求項３】 電極上にメディエータを配置した請求項
    ２記載のバイオセンサー。
  4. 【請求項４】 配置した生理活性物質またはそれに関与
    する物質、あるいは少なくともメディエータが共存配置
    された生理活性物質またはそれに関与する物質と液体試
    料が接する部位を高分子物質層で被覆した請求項１〜３
    のいずれかに記載のバイオセンサー。
  5. 【請求項５】 生理活性物質が酵素である請求項１〜４
    のいずれかに記載のバイオセンサー。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載のバイオ
    センサーに試料供給後、供給された試料について少なく
    とも２回、すなわち、生理活性物質に関与しないが試料
    中に共存する電気化学的活性物質に関与する試料供給当
    初の電気化学信号、並びに生理活性物質および試料中に
    共存する電気化学的活性物質の両者に関与する試料供給
    後十分な時間経過後の電気化学信号を取り込み、両信号
    を演算することにより、生理活性物質と特異的に反応す
    る物質、並びに試料中に共存する電気化学的活性物質を
    分離定量することを特徴とする分離定量方法。
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