JP3184878B2 - 血小板の粘着を阻害するペプチド及び抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （説明） （関連出願） 本出願は、1987年７月８日に出願された出願番号第07
0,953号の部分継続出願である。

（技術分野） 本発明は、血小板関連GP II b−III aがフィブリノー
ゲンに結合する際の抗原決定基を形成するGP II b重鎖
（Ｈ鎖）（hGP II b）の一部の構造遺伝子をコードする
DNA配列を含むDNA及び組換えDNA分子に関するものであ
る。また、本発明は、hGP II bの潜在的決定基であるポ
リペプチドアナログ及びこのポリペプチドアナログと免
疫反応する抗体に関するものである。

（背景） 一般的に、細胞粘着（adhesion）は、細胞表面レセプ
ターによる特異的粘着タンパク質の認識と関係してい
る。本発明に特に興味のもたれる一群の細胞表面レセプ
ターは、インテグリン（integrin）である。

ハインズ（Hynes）（セル（Cell）、48、549−554（1
987））によれば、インテグリンは、細胞外マトリクス
糖タンパク質、補体及び他の細胞と相互作用を起こす機
能的及び構造的に関連した一群のレセプターである。イ
ンテグリンは、発生学的発生、止血、血栓症、傷害治
癒、免疫及び非免疫防御メカニズム、及び腫瘍遺伝子ト
ランスホーメーションを含む、多くの生理学的に重要な
プロセスにおける、細胞−マトリクス及び細胞−細胞粘
着に関与している。２つのヒトの遺伝病、グラスマン・
トロンバスセニア及び白血球粘着欠損症は、インテグリ
ン類のいくつかを冒している。

構造的に、インテグリンは、アルファ及びベータサブ
ユニットが非共有的に会合したヘテロ二量体的複合体で
ある。インテグリン類の中には、同様のベータサブユニ
ットが存在することによって、関連づけられるグループ
があり、また、各グループの中のメンバーは、独特のア
ルファサブユニットによって区別される。

例えば、アルファ及びベータサブユニットからなる非
共有性、Ca 依存ヘテロ二重体である。ジェニングス
（Jennings）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J.Biol.Chem.）257、10458−10466（198
2）。アルファ・サブユニット、GP II bは約120キロダ
ルトン（KDa）の相対分子量を有する重鎖（hGP II b）
及びジスルフィド結合でこれと結合している約20KDaの
軽鎖（lGP II b）からなる。ベータサブユニット、GP I
II aは約100KDaの一本鎖ポリペプチドである。フィリッ
プス（Phillips）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）252、2121−2126（1
977）。免疫学的に、GP II b−III aと関連する細胞表
面分子は、多くの細胞型で同定されてきている。チアガ
ラジャン（Thagarajan）等（ジャーナル・オブ・クリニ
カル・インベスチゲーション（J.Chem.Invest.）75、89
6−901（1985）、プロー（Plow）等、プロシーディング
・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sei.）USA、83、6002−6006（1986）
及びフィッツジエラルド（Fitzgerald）等、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）260、10893−10896（1985）参照。

GP II b−III aは、フィブリトゲン〔ベネット（Benn
ett）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sei.）US
A、80、2417−2421（1983）〕、フィブロネクチン〔ギ
ンスベルグ（Ginsberg）等、ジャーナル・オブ・クリニ
カル、インベスチゲーション（J.Chem.Invest.）71、61
9−624（1983）〕及びホン・イルブランド因子〔ルゲリ
（Ruggeri）等、プロシーディング・イン・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Se
i.）USA、79、6038−6041（1982）〕などのRGD含有タン
パク質との相互作用を通して血小板機能に寄与してお
り、従って、一般的血小板粘着タンパク質レセプターの
一成分である（ピテラ（Pytera）等、サイエンス（Scie
nce）231、1559−1562（1986）及びプロー（Plow）等、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol.Chem.）259、5388−5391（1984）。

最近、GP II b−III aは、同様のベータサブユニット
及びトリペプチドアミノ酸残基配列Arg−Cly−Asp（一
文字記号を用いるとRGD）を認識する機能的性質をも
つ、いくつかの粘着レセプターのうちの１つであるとい
う証拠が示された。ピテラ（Pytera）等、サイエンス
（Science）231、1559−1562（1986）及びルオスラティ
（Ruoslahti）等、セル（Cell）、44、517−518（198
6）。GP II b−III aに加えて、関連するレセプターの
グループには、オステオザルコーマから単離したヒドロ
ネクチンレセプター（VnR）及びフィブロネクチンレセ
プター（FnR）が含まれる（ピテラ（Pytera）等、セル
（Cell）、40、191−198（1985）、ピテラ（Pytera）
等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sei.）USA、82、
5766−5770（1985）及びサンチェス・マドリッド（Sanc
hes−Madrid）等、ジャーナル・オブ・サススペリメン
タル・メディシン（J.Exp.Med.）158、1785−1803（198
3））。

これらタンパク質の同様の機能的、構造的及び抗原的
性質は、GP II b−III a及びVnRが、“サイトアドヘシ
ン”という名前が提唱された粘着レセプターグループの
メンバーであることを示している。プロー（Plow）等、
プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sei.）USA、82、6002
−6006（1986）。サイトアドヘシングループでは、独特
のアルファサブユニットが共通もしくは非常に類似して
いるベータサブユニットと結合しており、機能的に区別
しうるレセプターとなる。ギンスバーグ（Ginsbsrg）
等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）262、5437−5440（1987）。

ヘテロ二量体粘着レセプターの少なくとも２つの他の
グループが同定されており、それらの場合、１つの共通
ベータサブユニットは、独特のアルファ・サブユニット
のいくつかと結合している。１つのグループは、白血球
で見られるもので、白血球粘着群と呼ばれ、LFA−１、M
ac−１、P150、95が含まれる。サンチェス・マドリッド
（Sanchez−Madrid）等、ジャーナル・オブ・エススペ
リメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）158、1785−180
3（1983）及びスプリンガー（Springer）等、（シバ・
ファウンド・シンポジウム（Ciba,Found,Symp.）118、1
02−126（1986）。その他のものはより広く分布してお
り、VLA族と呼ばれている（ヘムラー（Hemler）等、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bi
ol.Chem.）262、3300−3309（1987））。チキンのVLA族
のベータサブユニット〔ヘムラー（Hemler）等、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.C
hem.）262、3300−3309（1987）がクローン化され、配
列決定され、“インテグリン”と命名された（タムクン
（Tamkun）等、セル（Cell）、46、271−282（198
6）〕。チキン・インテグリンの配列はGP III aのもの
〔フィッツジエラルド（Fitzgerald）等、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）
262、3936−3939（1987）〕及び白血球粘着族のベータ
サブユニットのベータサブユニットのもの〔キシモト
（Kishimoto）等、セル（Cell）48、681−690（198
7）〕と同様である。さらに、いくつかのアルファサブ
ユニットの部分配列も類似性を示している。ギンスベー
グ（ginsberg）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（J.Biol.Chem.）262、5437−5440（198
7）；スズキ（Suzuki）等、プロシーディング・イン・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Nat
l.Acad.Sei.）USA、82、8614−8698（1986）及びシャロ
（Charo）等、プロシーディング・イン・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Se
i.）USA、83、8351−8356（1986）。

粘着レセプターとしてのそれらの機能に基本的なGP I
I b−III a又はその他のサイトアドヘシン上の部位は、
現在でも不明である。いくつかの観察は、GP II b−III
a上の機能的に重要な部位は、モノクローナル抗体PMI
−１で決定されるエピトープ付近にあることを示してい
る。この抗体は、GP II bの重鎖に結合し〔シャドル（S
hadle）等、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジ
ー（J.Cell.Biol.）99、2056−2060（1984）、いくつか
の独特な機能活性に関連するGP II bの領域を限定す
る。第１にPMI−１は、洗浄した血小板のコラーゲンへ
の粘着を阻害する。シャドル（Shadle）等、ジャーナル
・オブ・セルラー・バイオロジー（J.Cell.Biol.）99、
2056−2060（1984）。第２に、本領域の表面での配向
は、カルシウム又はマグネシウムのミルモル濃度（mM）
がPMI−１エピトープの発現を抑制することから、二価
カチオンにより制御される。ギンスバーグ（Ginsberg）
等、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスチゲーシ
ョン（J.Clin.Invest.）78、1103−1111（1986）。第３
に、この部位の構造の異常な二価カチオン制御は、機能
的にトロンバスセニック状態と関連している。ギンスバ
ーグ（Ginsberg）等、ジャーナル・オブ・クリニカル・
インベスチゲーション（J.Clin.Invest.）78、1103−11
11（1986）。第４に、100ミリモル濃度までのアデノシ
ンニリン酸（ADP）又はエピネフリン、ミリリットル当
り１ユニットのトロンビン、又は、ミリリットル当り50
マイクログラムのウシ皮膚コラーゲンによる血小板の刺
激は、実質的に、血小板に対するPMI−１抗体の結合
を、バックグランド以上に増加させることはなかった。

（本発明の概要） 現在、特異的にリガンドを結合した細胞表面レセプタ
ーは、リガンド誘導抗体結合部位（LIBS）の存在によ
り、非占有レセプターと区別できることが分っている。
すなわち、細胞表面レセプターが特異的にリガンドと結
合したとき、発現するが、非占有レセプター又は、非結
合領域リガンドのいずれかによっても発現されない一群
の抗原決定基が発見されている。

従って、ある態様において、本発明は、特異的に結合
した細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レセプタ
ー−リガンド複合体によって発現された、リガンド誘導
結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体を作る方法
を考案しており、この方法には、 （ａ） ホ乳類をこの複合体で免疫化すること； （ｂ） 免疫化したホ乳類から抗体産生細胞を取り出
し、この細胞のサスペンジョンを作ること； （ｃ） この細胞をトランスホーミング剤で処理して、
トランスホームした抗体産生細胞を生成すること； （ｄ） 非トランスホーメーション細胞は生存できない
組織培養培地で制限希釈することにより、ステップ
（ｃ）で処理した細胞をクローニングし、クローン化ト
ランスホーマントを作ること； （ｅ） レセプター−リガンド複合体と免疫反応する
が、いずれも非結合型の細胞表面レセプター又はリガン
ドとは免疫反応しない分泌抗体分子の存否について、該
クローン化トランスホーマントの組織培養培地の評価を
行うこと； （ｆ） 分泌抗体分子を生産するクローン化トランスホ
ーマントを選択し、組織培養培地中で生育させること；
及び （ｇ） 選択され、かつクローン化されたトランスホー
マントの培養培地から、分泌抗体分子を収穫すること、 が含まれる。

別の態様において、本発明は、特異的に結合した細胞
表面レセプター及びリガンドを含むレセプター−リガン
ド複合体によって発現される、リガンド誘導結合部位と
免疫反応するモノクローナル抗体を生成する方法を考案
しており、その方法には、 （ａ） マウスを該複合体で免疫化すること； （ｂ） 該マウスから脾臓を取り出し、この脾細胞のサ
スペンジョンを作ること； （ｃ） 融合プロモーターの存在下、この脾細胞とマウ
スのミエローマ細胞と融合し、抗体分泌ハイブリドーマ
を生成すること； （ｄ） 分離したウェル中、未融合ミエローマ細胞を生
育させない培地で希釈し、この融合細胞を培養するこ
と； （ｅ） レスプター−リガンド複合体と免疫反応する
が、非結合型の細胞表面レセプターもしくはリガンドと
は免疫反応しない、分泌抗体分子の存在について、ハイ
ブリドーマを含む各ウェル中の上清を評価すること； （ｆ） 抗体分子を分泌するハイブリドーマを選択し、
これをクローニングすること；及び （ｇ） 上記クローンの上清から、抗体分子を収穫する
ことが含まれる。

さらに、特異的に結合した表面レセプター及びリガン
ドを含む、レセプター−リガンド複合体により発現され
る、リガンド誘導結合部位と免疫反応するモノクローナ
ル抗体を生成する方法を考案しており、その方法には、 （ａ） マウスを該複合体で免疫化すること； （ｂ） 該マウスから脾臓を取り出し、この脾細胞のサ
スペンジョンを作ること； （ｃ） 融合プロモーターの存在下、この脾細胞とマウ
スのミエローマ細胞と融合し、抗体分布ハイブリドーマ
を生産すること； （ｄ） 分離したウェル中、未融合ミエローマ細胞は生
育できない培地で希釈し、この融合細胞を培養するこ
と； （ｅ） 細胞表面レセプター−リガンド複合体とは免疫
反応するが、非結合型の細胞表面レセプター又はリガン
ドと免疫反応しない分泌抗体分子の存在について、ハイ
ブリドーマを含む各ウェル中の上清を評価すること； （ｆ） この抗体分子を分泌するハイブリドーマを選択
し、クローニングすること； （ｇ） このクローンを、マウス腹腔内に移すこと、そ
して、 （ｈ） 望ましい抗体を含む、マウスの腹水又は血清を
収穫すること； が含まれる。

また、特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガ
ンドを含む、レセプター−リガンド複合体の存在を、イ
ンビボで検出する方法を考案しており、その方法には、 （ａ） 生理学的に許容される希釈剤及びレセプター−
リガンド複合体と免疫反応するが、非結合型の細胞表面
レセプター又はリガンドとは免疫反応しない、インビボ
の指示手段を結合した抗体分子を含む、効果量のモノク
ローナル抗体組成物を被検者に静脈注射する、 （ｂ） インビボで抗体分子がレセプター−リガンド複
合体と免疫反応し、免疫反応産物を形成するのに十分
な、予め決めた時間、その被投与者を維持する、 （ｃ） ステップ（ｂ）で形成して免疫反応産物の存在
及びそれによる被検者中の複合体の存在を検定する、 以上のステップが含まれている。

また、さらに、血液サンプル中の、特異的に結合した
細胞表面レセプター及びリガンドを含む、レセプター−
リガンド複合体の存在を検定する方法を考案しており、
その方法には （ａ） 血液サンプルを、該レセプター−リガンド複合
体とは免疫反応するが、いずれも非結合型の細胞表面レ
セプター又は、リガンドとは免疫反応しない抗体分子を
含むモノクローナル抗体組成物と混合することにより免
疫反応混合物を作る； （ｂ） 抗体分子が、サンプル中に存在するレセプター
−リガンド複合体と免疫反応し、かつ免疫反応産物を形
成するのに十分な時間、この混合物を維持する； （ｃ） ステップ（ｂ）で形成した免疫反応産物の存在
を検出し、かつそれによりサンプル中の複合体の存在を
検出する、 以上のステップが含まれる。

別の態様において、本発明は、GP II b−III a−リガ
ンド複合体を表現する血小板の存在について、血小板を
含む血液サンプルを検定する方法を考案しており、その
方法には、 （ａ） 血液サンプルを、ハイブリドーマPMI−１又はP
MI−２によって生産されたGP II b−III a抗体分子を含
む、効果量のモノクローナル抗体組成物と混合すること
により、免疫反応混合物を作る； （ｂ） 該抗体がサンプル中に存在するフィブリノーゲ
ン結合血小板と免疫反応し、免疫反応産物を生成するの
に十分な時間、この混合物を維持する； （ｃ） ステップ（ｂ）で生成した免疫反応産物の存在
を検出する、 以上のステップが含まれる。

また、インビボで血栓の存在を検定する、 （ａ） 生理学的に許容される希釈剤及びハイブリドー
マPMI−１又はPMI−２から生産される、インビボ指示手
段と結合した抗GP II b−III a抗体分子を含む、効果量
のモノクローナル抗体組成物を被検者に静脈注射する； （ｂ） 抗体分子がインビボでフィブリノーゲン結合血
小板と免疫反応し、かつ、免疫反応産物が生成されるの
に十分な、予め決められた時間、被投与者を維持する； （ｃ） ステップ（ｂ）で生成した免疫反応産物の存在
を検出する、 以上（ａ）〜（ｃ）のステップを含む方法が考案されて
いる。

特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを
含む血液中のレセプター−リガンド複合体の存在を検定
する、キット型の診断システムも考案されており、その
システムには、 （ａ） 少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量
の、該レセプター−リガンド複合体と免疫反応するが、
非結合形の細胞表面レセプターもしくはリガンドとは免
疫反応しない抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物
を含有するパッケージ、 が含まれている。

特異的に結合した細胞表面レセプター及びリガンドを
含む細胞レセプター−リガンド複合体の存在を、インビ
ボで検出するための、キット型の診断システムが考案さ
れており、そのシステムには、 （ａ） 少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量
の、該レセプター−リガンド複合体とは免疫反応する
が、非結合型と細胞表面レセプターもしくはリガンドと
は免疫反応しない、インビボ指示手段と結合した抗体を
含むモノクローナル抗体組成物を含むパッケージ、 が含まれている。

GP II b−III a−リガンド複合体を発現する血小板の
存在について、血液サンプルを検定するための、キット
型の診断システムが考案されており、そのシステムに
は、 （ａ） 少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量
の、ハイブリドーマPMI−１又はPMI−２から生産された
抗GP II b−III aの抗体分子を含むパッケージ、 が含まれている。

インビボで血栓の存在を検定するための、キット型の
診断システムも考案されており、それには、 （ａ） 少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量
の、ハイブリドーマPMI−１又はPMI−２から生産され
る、インビボの指示手段と結合した、抗GP II b−III a
抗体分子を含むパッケージが含まれている。

さらに、現在、血小板GP II b−III a−リガンド複合
体は、ハイブリドーマPMI−１及びPMI−２によって生産
される抗体分子によって認識される、２個の潜在的抗原
決定基型LIBSを発現することが分っている。さらに、モ
ノクローナル抗体PMI−１により認識される潜在的決定
基を真似ることができるポリペプチドがインビボで、潜
在的決定基を形成しているGP II bタンパク質の一部を
コードするDNA配列から誘導されている。

従って、本発明は、第１図に示される、残基約50番か
ら約140番のアミノ酸残基配列を有するGP II bタンパク
質の一部をコードする構造遺伝子を定義している配列を
含むせいぜい約12000個のヌクレオチド塩基対を含むDNA
断片を考案している。

別の内容においては、第１図における残基約50番から
約145番までの、アミノ酸残基配列を有する、GP II bタ
ンパク質の一部をコードする構造遺伝子を定義している
DNA断片と機能的に結合したベクターを含む組換えDNA分
子も考案している。

さらに、せいぜい約50アミノ酸残基を含み、かつ、式 で表わされるアミノ酸残基配列を含む、hGP II b潜在的
決定基ポリペプチドアナログも考案している。

また、ファブリノーゲン結合血小板と免疫反応する抗
体分子を生産する、PMI−１及びPMI−２と命名されたハ
イブリドーマも考案している。

ファブリノーゲン結合血小板と免疫反応する、ハイブ
リドーマPMI−１により生産される抗体分子を含む、モ
ノクローナル抗体組成物を考案している。

（図式の簡単な説明） 第１図は、GP II bの前駆体タンパク質の一部をコー
ドするcDNAのヌクレオチド配列及び相当するアミン酸残
基配列を示しており、そこでのヌクレオチド配列は、塩
基１番から1104番まで連続して表わされている様に、一
文字ヌクレオチド塩基コードを用いて左から右に、５′
末端から３′末端の方向で示されている。アミノ酸残基
配列は、アミノ末端の残基１番（Ｒ）から、カルボキシ
末端の残基227番（Ｓ）まで連続して示されているよう
に、一文字アミノ酸残基コードを用い、左から右へ、ア
ミノ末端からカルボキシ末端の方向で表わされている。

読み枠は、ヌクレオチド配列の下の誘導されるアミノ
酸配列の位置で示されており、各アミノ酸残基を示す一
文字は対応するコドンの第１塩基の下に位置している。

p129−145と命名されるポリペプチド及びp114−156と
命名されるポリペプチドに対応するアミノ酸残基配列
の、GP II b前駆体タンパク質中の位置は、各々、大小
のボックスで示した。p19−34及びp53−65と命名された
ポリペプチドの位置は各々、二重又は一本の下線で示さ
れている。GP II bの軽鎖に対し、提唱されているアミ
ノ末端のアミノ酸残基配列は、点線で示し、矢印は、GP
II bの重鎖及び軽鎖を作る潜在的切断部位を示してい
る。

第２図は、血小板に結合する抗体PMI−１に関するポ
リペプチドp129−145の影響を示すグラフである。血小
板に、5mM濃度となるようEDTAを混ぜ、hGP II b上のPMI
−１エピトープを十分に露出させる。その後、この血小
板を０〜100マイクロモル濃度（μＭ）の範囲の種々の
濃度のポリペプチドp129−149及び¹²⁵Iラベル化PMI−１
抗体と、例９で説明するように混合した。血小板に結合
した¹²⁵Iラベル化PMI−１の割合を、検定物に加えたポ
リペプチド濃度に対してプロットした。

第３図は、例10で説明されるように測定された刺激を
受けたファブリノーゲン結合血小板上のPMI−１エピト
ープの露出を示したものである。

（１）刺激なし、（２）５μＭ ADPによる刺激又は
（３）50μＭエペネフリンによる刺激、条件下、ファブ
リノーゲン結合血小板と免疫反応する¹²⁵Iラベル化PMI
−１量を測定し、5mM EDTA存在下、非刺激血小板と免
疫学的に結合する¹²⁵I−PMI−１量に対する割合として
発現した。

第４図は、例11で説明されるような、血小板凝集に関
する、ポリペプチドp129−145及びp144−156の影響を示
したレコーダの写しである。時間（分）に対する透過率
をリニアー・プロットで示してあり、100パーセント透
過は最高の血小板凝集を示している。パネルＡは、タイ
ロード（Tyrode's）バッファ中の富血小板血漿（PRP）
のコントロール溶液（破線）及びさらに、1mMポリペプ
チドp129−145を含むPRP（実線）の透過率を描いてあ
る。パネルＢは、コントロール溶液（破線）及びさらに
1mMポリペプチドp144−156を含むPRP（実線）の透過率
を描いてある。

第５図は、血小板GP II b−III aによる、２個の別々
のリガンド誘導結合部位の発現を示すグラフである。各
LIBSは、アミノ酸残基配列RGDSを有するポリペプチド型
のリガンドとの特異的結合による誘導により、GP II b
−III aリガンド（GP II b−ポリペプチド）複合体を形
成する。種々のポリペプチド濃度によるLIBS発現率は例
13Aで説明されているように測定した。

（発明の詳細な説明） A.定義 アミノ酸：ここで同定されているアミノ酸残基は、天
然のＬ型のものである。標準的ポリペプチド命名法に従
がい（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）243、3557−59（1969）、アミノ酸
残基の略号は、下記の対応表に示した。

対 応 表 記 号 アミノ酸 一文字 三文字 Ｙ Tyr チロシン Ｇ Gly グリシン Ｆ Phe フェニルアラニン Ｍ Met メチオニン Ａ Ala アラニン Ｓ Ser セリン Ｉ Ile イソロイシン Ｌ Leu ロイシン Ｔ Thr スレオニン Ｖ Val バリン Ｐ Pro プロリン Ｋ Lys リジン Ｈ His ヒスチジン Ｑ Gln グルタミン Ｅ Glu グルタミン酸 Ｗ Trp トリプトファン Ｒ Arg アルギニン Ｄ Asp アスパラギン酸 Ｎ Asn アスパラギン Ｃ Cys システィン ここでは、全てのアミノ酸残基配列が左から右にアミ
ノ末端からカルボキシ末端の、伝統的に用いられている
方向の式で表わされていることに注意しなければならな
い。さらに、アミノ酸残基配列の始めと終りのダッシュ
は、ポリペプチド鎖中の１つ以上で全部で約50残基まで
の配列につながる結合を示していることにも注意しなけ
ればならない。

ポリペプチド及びペプチド；ポリペプチド及びペプチ
ドはここでは同等に用いられている語で、隣り合うα−
アミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結合により互
いに連結しているせいぜい約50個の連続するアミノ酸残
基を示している。

タンパク質；ここで用いられているタンパク質という
語は、ポリペプチドのように互いに連結している連続し
た50個以上のアミノ酸残基を示している。

ヌクレオシド及びヌクレオチド；糖部分（ペントー
ス）、リン酸、及び窒素ヘテロ環塩基からなる、DNA及
びRNAの単量体ユニット。この塩基は、グリコシド炭素
（ペントースの１′炭素）を介して糖部分に結合してお
り、この塩基と糖との組合せてヌクレオシドという。こ
のヌクレオシドが、そのペントースの３′位又は５′位
に結合したリン酸基を含むとき、これをヌクレオチドと
呼ぶ。

塩基対（bp）；二本鎖DNA分子中のアデニン（Ａ）と
チミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）
の水素結合の組合せ。

レセプター；ここで用いているレセプター及びレセプ
タータンパク質とは他の分子に特異的に結合する生物学
的に活性なタンパク質性分子を示している。

リガンド及び同種リガンド；リガンドとは、特別なレ
セプタータンパク質と特異的相互作用によって結合する
構造部分を含む分子を意味する。

リガンド誘導結合部位（LIBS）;LIBSとは、細胞表面
レセプター−リガンド複合体によっては発現されるが、
非占有レセプター又は未結合リガンドによっては発現さ
れないネオ抗原決定基のことである。LIBSは、“構造
的”なものと“配列的”なものがある。LIBSは、リガン
ド結合により誘導されるレセプターの特異的修正の結
果、すなわち“潜在的抗原決定基”であり、またこれ
は、レセプター−リガンド接触部位でのレセプターとリ
ガンドアミノ酸残基の組合せによって形成される。

潜在的抗原決定基；同種（特異的）リガンドとの結合
により、レセプタータンパク質の構造又は膜表面配位方
向の変化によって生じたネオ抗原決定基を意味する。こ
こで述べているレセプタータンパク質は、通常、このレ
セプターが特異的にリガンドと結合しないかぎり、潜在
的抗原決定基を発現しない。

B.DNA断片 生物において、タンパク質又はポリプペチドのアミノ
酸残基配列は直接、このタンパク質をコードする構造遺
伝子のデオキシリボ核酸（DNA）と遺伝子コードを介し
て直接対応している。従って、構造遺伝子は、それがコ
ードするアミト酸残基配列、すなわちタンパク質又はポ
リペプチドで定義することができる。

遺伝子コードでよく知られており重要な性質は、その
縮退である。すなわち、タンパク質を作る全んどのアミ
ノ酸について、１つ以上のコードヌクレオチドトリプレ
ット（コドン）が、１つのアミノ酸残基をコード、もし
くは指定している。それゆえ、特別のアミノ酸残基配列
を、多種のヌクレオチド配列がコードしうる。このよう
なヌクレオチド配列は、全ての生物において、同じアミ
ノ酸残基配列の生産を起こすことから、機能的には等価
と考えることができる。場合によっては、プリン又はピ
リミジンのメチル化体も、ヌクレオチド配列中に組込ま
れていることもある。しかし、これらメチル化は、コー
ド関係になんら影響を与えることはない。

本発明のDNA断片には、GP II b関連アミノ酸残基配
列、すなわちGP III b関連タンパク質を含むタンパク質
をコードする構造遺伝子が含まれる。GP II b関連アミ
ノ酸残基配列は、第１図の約50番から約227番で示され
る、アミノ酸残基配列の１部と相同的、好ましくは同一
の、少なくとも約10残基の配列である。

本発明のDNA断片には、第１図の残基約50番から約145
番で示されるアミノ酸残基配列をコードするDNA配列が
含まれる。別の態様においては、第１図の残基約50番か
ら約227番で示されているアミノ酸残基配列をコードす
るDNA配列を含むDNA断片を考案している。また、第１図
の残基約146番から約227番で示されているアミノ酸残基
配列をコードするDNA配列を含むDNA断片も考案してい
る。本発明のDNA断片は、第１図の残基約１番から約227
番で示されるアミノ酸残基配列をコードしていることが
望ましい。DNA配列は、上述のアミノ酸残基配列中のア
ミノ酸残基をコードするコドンが連続して存在する、す
なわちDNA配列がイントロンを含まないことが望まし
い。

基本的に第１図の塩基約148番から約435番で示される
ヌクレオチド配列からなるDNA断片も、本発明の１態様
を構成している。基本的に、第１図の塩基約148番から
約435番で示されるヌクレオチド配列からなるDNA断片
は、本発明の別の態様を構成している。基本的に本発明
のDNA断片が第１図の塩基約１番から約1104番で示され
るヌクレオチド配列からなることが好ましい。

GP II b関連アミノ酸残基配列をコードする本発明のD
NA断片は、化学的技術、例えばマチュウシ（Matteucc
i）等（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイアティ（J.Am.Chem.Soc.）103、3185（1981））の
ホスホトリエステル法によって容易に合成することがで
きる。もちろん、コード配列を化学的に合成することに
よって、天然のアミノ酸残基配列をコードするものを適
当な塩基に置換することによって、望ましい修正を容易
に行うことができる。しかし、第１図に示したものと全
く相同的な配列を含むDNA分子であることが望ましい。

さらに、基本的に、GP II b関連タンパク質をコード
する構造遺伝子からなるDNA断片は、これらの遺伝子を
含む組換えDNA分子から得ることができる。例えば、プ
ラスミド型組換えDNA分子HEL−41は、第１図に示したDN
A配列を含み、従って、第１図の残基１番から227番で示
されるアミノ酸残基をコードしている。HEL−41でトラ
ンスホームした大腸菌（E.coli）培養物を、ブダペスト
条約要請事項に従がい、1987年７月７日、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（20852、M
D州、ロックビル、パークローン・ドライブ、12301）に
登録し、受理番号67456号を割当てられた。

GP II b関連アミノ酸残基配列をコードするDNA配列を
含むDNA断片を、従来法に従がい、上記登録のプラスミ
ド由来の適当な制限断片を機能的に結合（ライゲーショ
ン）することにより作ることができる。

典型的に、このようにして作った本発明のDNA分子
は、粘着末端、すなわち、この分子の二本鎖部分を越え
て伸びる“突出した”一本鎖部分を有している。本発明
のDNA分子上の粘着末端が存在することは好ましいこと
である。

また、上記DNA断片と等価なリボ核酸（RNA）も本発明
で考案されている。

C.組換えDNA分子 本発明の組換えDNA分子は、本発明のDNA断片にベクタ
ーを機能的に結合することにより作ることができる。

ここで用いられるように、“ベクター”という語句
は、細胞中で自己増殖可能なDNA分子を意味し、別のDNA
断片を機能的に結合することにより、その付随する断片
の複製をもたらすことができるものである。GP II b関
連アミノ酸残基配列を有するタンパク質をコードする遺
伝子の発現を司るベクターを、ここでは“発現ベクタ
ー”と呼ぶ。従って、組換えDNA分子（rDNA）は、天然
では、通常一緒に発見されることはない、少なくとも２
つのヌクレオチド配列を含むハイブリットDNA分子であ
る。

本発明のDNA断片が機能的に結合するベクターの選択
は、この分野でよく知られているように、望ましい機能
的性質、例えばタンパク質の発現及びトランスホームさ
れる宿主細胞に直接依存し、これらは、組換えDNA分子
を構築する分野において本質的な制限となっている。し
かし、本発明で考案されているベクターは、機能的に結
合されたDNA断片中に含まれるGP II b関連アミノ酸残基
配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の少なくと
も複製、そして好ましくは発現も司ることができる。

好ましい態様において、本発明で考案されたベクター
は、原核性レプリコン、すなわち、バクテリア宿主細胞
のような原核性宿主細胞において、染色体外で組換えDN
A分子を自己複製及び維持を司ることができる能力を有
するDNA配列を含んでいる。このようなレプリコンは当
分野ではよく知られているものである。さらに、原核性
レプリコンを含む、これらの態様は、それでトランスホ
ームしたバクテリア宿主に薬剤耐性を付与する遺伝子も
含んでいる。典型的なバクテリアの薬剤耐性遺伝子は、
アンピシリン又はテトラサイクリン耐性を付与するもの
である。

原核性レプリコンを含む、これらベクターは、大腸菌
のようなバクテリア宿主細胞をトランスホームすること
で、GP II b関連アミノ酸残基配列をコードする遺伝子
の発現（転写及び翻訳）を司る原核性プロモーターも含
む。プロモーターとは、RNAポリメラーゼの結合及び転
写を可能とするDNA配列によって形成される発現コント
ロール要素である。バクテリア宿主に適合するプロモー
ター配列は一般的に、本発明のDNA断片の挿入のため
の、簡便な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供
されている。このようなベクタープラスミドの典型例に
は、バイオ・ラド・ラボラトリー（CA州、リッチモン
ド）から市販されているpUC8、pUC9、pBR322及びpBR32
9、及びファルマシア（NJ州、ピスカタウェイ）から市
販されているpPL及びpKK223がある。

真核性細胞好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベ
クターは、本発明の組換えDNA分子を生成するのに用い
ることができる。真核性細胞発現ベクターは、当分野で
よく知られており、また、いくつかの販売元から市販さ
れている。典型的に、このようなベクターは、望ましい
DNA断片の挿入するために便利な制限部位を含むものが
提供されている。このようなベクターの典型例には、pS
VL及びpKSV−10（ファルマシア）、pBPV−1/pML2d（イ
ンターナショナルバイオテクノロジーズ）及びpTDT1（A
TCC、＃31255）がある。

好ましい態様において、本発明の組換えDNA分子を構
築するのに使用される真核細胞発現ベクターは、真核細
胞中で効果的な選択マーカー、好ましくは、薬剤耐性選
択マーカーを含んでいる。好ましい薬剤耐性マーカーは
発現によりネオマイシン耐性となる遺伝子、すなわち、
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）遺伝子
である。サウザーン（Southern）等、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネティクス
（J,Mol.Appl.Genet.）１、327−341（1982）。

本発明のrDNAを生成するのにレトロウィルス発現ベク
ターを用いることも考案している。ここで用いているよ
うに“レトロウィルス発現ベクター”という語句は、レ
トロウィルス・ゲノムのロング・ターミナル・リピート
（LTR）由来のプロモーター配列を含むDNA分子を意味す
る。

好ましい態様における、典型的な発現ベクターは、好
ましくは、真核細胞中で複雑不能なレトロウィルス発現
ベクターである。レトロウィルスベクターの構築を使用
例がソージ（Sorge）等（モレキュラー・アンド・セル
ラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）４、1730−37
（1984）によって報告されている。

相補的粘着末端を介して、ベクターにDNAを機能的に
結合する多くの方法が開発されてきている。例えば、相
補的ホモポリマー鎖を、挿入するDNA断片及びベクターD
NAに付加することができる。それから、この相補的ホモ
ポリマー末端間の水素結合により、このベクター及びDN
A断片を結合し組換えDNA分子を生成する。

１つ以上の制限部位を含む合成リンカーは、DNA断片
とベクターを結合する別法を提供する。先に説明したよ
うに、エンドヌクレアーゼによる制限消化により生じた
DNA断片を３′−５′エクソヌクレアーゼ活性により、
突出する３′一本鎖末端を除去し、また重合活性によ
り、窪んだ３′末端を充填する酵素である、バクテリオ
ファージT4DNAポリメラーゼ又は、大腸菌DNAポリメラー
ゼＩで処理する。それゆえ、これら活性の組合せは、平
滑末端DNA断片を生ずる。それから、この平滑末端断片
をバクテリオファージT4DNAリガーゼ等の平滑末端DNA分
子のライゲーションを触媒しうる酵素の存在下、大過剰
のリンカー分子とインキュベーションする。このように
してできた反応産物は、その末端に重合リンカー配列を
もつDNA断片である。これらDNA断片を適当な制限酵素で
切断し、このDNA断片の末端に適合する末端を生ずる酵
素で切断した発現ベクターにライゲーションする。

多くの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカ
ーは、CN州、ニュヘブンのインターナショナル・バイオ
テクノロジーズ社を含む多くの業者から市販されてい
る。

本発明は、上述の組換えDNA分子と等価なRNAも考案し
ている。

D.トランスホームした細胞及び培養 また、本発明は、本発明の組換えDNA分子でトランス
ホームした宿主にも関連している。宿主細胞は原核性の
ことも、真核性のこともある。バクテリア細胞が原核性
宿主細胞であることが好ましく、また典型的には、MD
州、ベセスダ、ベセスダ州−４、ラボラトリース社から
市販されている大腸菌DH5株のような大腸菌株である。
好ましい真核性宿主細胞には、イースト及び好ましく
は、マウス、ラット、サル又はヒトの繊維芽細胞系列由
来のもの等の脊椎動物などホ乳類細胞が含まれる。好ま
しい真核性宿主細胞には、CCL61のようなATCCから入手
できるチャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞及びC
RL1658のようなATCCから入手できるNIHスイスマウス胎
児細胞NIH/3T3が含まれる。

好ましいトランスホーム化細胞系列とは、組換えDNA
分子HEL−41を含む大腸菌であり、その培養物は、1987
年７月７日、MD州、ロックビル、アメリカン・ティシュ
・カルチャー・コレクション（ATCC）に登録され、受理
番号67456が割当てられた。

本発明の組換えDNA分子による、適当な宿主細胞のト
ランスホーメーションは、典型的には、使用するベクタ
ーのタイプに依存する、従来法によって行なわれる。原
核性宿主細胞のトランスホーメーションに関しては、例
えば、コーエン（Cohen）等、プロシーディング・イン
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.N
atl.Acad.Sci.）USA、69、2110（1972）、及びマニアチ
ス（Maniatis）等、モレキュラー・クローニング、ラボ
ラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー、コールドスプリングハーバー、NY州、（198
2）参照。rDNAを含むレトロウィルスベクターによる脊
椎動物細胞のトランスホーメーションに関しては、例え
ば、ソージ（Sorge）等、モレキュラー−アンド・セル
ラーバイオロジー（Mol.Cell.Biol.）４、1730−37（19
84）；グラハム（Graham）等、ビロロジー（Virol.）5
2、456（1973）及びウィグラー（Wigler）等、プロシー
ディングス・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、76、1373−76
（1979）参照。

うまくトランスホームした細胞、すなわち、本発明の
組換えDNA分子を含む細胞は、従来法により同定するこ
とができる。例えば、本発明のrDNAの導入により生じた
細胞をクローン化し、モノクローナルコロニーを作るこ
とができる。これらのコロニー由来の細胞を収穫し、溶
解してから、そのDNA含有物について、サウザーン（Sou
thern）（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（J.Mol.Biol.）98、503（1975））及びベレント
（Berent）等（バイオテクノロジー（Biotech）、３、2
08（1985））によって報告されているような方法を用
い、rDNAの有無を試験した。

rDNAの存在の直接的検定に加えて、rDNAがGP II b関
連タンパク質を発現できる場合、トランスホーメーショ
ンは、従来の免疫学的方法で確めることができる。例え
ば、発現ベクターでうまくトランスホームした細胞は、
GP II b抗原性を示すタンパク質を生産する。トランス
ホームされた細胞サンプルを収穫し、本発明のハイブリ
ドーマによって生産されるような、抗原に特異的な抗体
を用いて、GP II関連タンパク質を検定した。

このように、トランスホームした宿主細胞自身に加
え、本発明は、栄養培地中の、これら細胞培養物、好ま
しくはモノクローナルな（クローン的に均一な）培養
物、又は、モノクローナルな培養物由来の培養物も考案
している。またこの培養物は、GP II b抗原性を示して
いることが好ましい。

トランスホームした宿主細胞を培養するために有用な
栄養培地は当分野でよく知られているものであり、いく
つかの販売業者から市販されている。宿主細胞がホ乳類
細胞である態様の場合、“無血清”培地を用いることが
好ましい。

E.GP II b関連タンパク質の生産方法 本発明のもう１つの特徴に、GP II b抗原性を示すタ
ンパク質の生産方法がある。GP II b抗原性を示すタン
パク質は、天然のGP II bで誘導される抗体と免疫反応
するタンパク質である。GP II b抗原性を示すタンパク
質は、抗原として、及び抗体を生じさせるものとして有
用であり、それらの各々は、本発明の診断システム及び
診断方法に用いることができる。

本方法には、GP II b関連アミノ酸残基配列をコード
する遺伝子を遺伝子を発現できる本発明の組換えDNA分
子でトランスホームした、宿主細胞、好ましくはヒトの
細胞を含有する栄養培地を含む培養の開始を伴う。この
培養を、そのトランスホームした細胞がGP II b関連ア
ミノ酸残基配列を含むタンパク質を発現するのに十分時
間維持する。その後発現したタンパク質を培養物から回
収する。

培養物から発現したタンパク質を回収する方法は、当
分野ではよく知られているものであり、従来の生化学的
技術を用いた培養物のタンパク質含有成分の分画が含ま
れる。例えば、タンパク質を分画するのによく知られて
いる、ゲルロ過、ゲルクロマトグラフィー、限外ロ過、
電気泳動法、イオン交換、アフィニティークロマトグラ
フィー等の方法が培養物中に存在する発現タンパク質を
単離するのに用いることができる。さらに、免疫親和
性、免疫吸着等の免疫学的方法も従来の方法を用いて行
なわれる。

せいぜい約50個のアミノ酸残基までの、以後特別に列
挙する配列に付加する、本発明のポリペプチド中に存在
するアミノ酸は、以後議論されているようなポリペプチ
ドの基本的かつ新規な特性に実質的に影響を与えない残
基である。このような付加残基は、通常、列挙したポリ
ペプチドの一端又は両端に付加しており、列挙したポリ
ペプチド配列の反復及び部分的反復も含むことがある。

F.ポリペプチド 本発明のポリペプチドは、せいぜい約50個、より通常
には約35個以下、そして、好ましくは、約25個以下のア
ミノ酸残基配を含み、少なくとも、約10個の残基を含
む。さらに、本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸残
基配列及び新しい機能性を特徴としている。

1. hGP II b潜在的決定基ポリペプチドアナログ 広く言うと、本発明の１態様は、RDG結合細胞粘着タ
ンパク質のアルファサブユニットの重鎖により発現され
る潜在的抗原決定基を真似るアミノ酸残基配列を含むポ
リペプチドを考案している。潜在的決定基ポリペプチド
アナログのアミノ酸残基配列は、サイトアドヘシンのア
ルファサブユニットの重鎖の約15個のカルボキシ末端ア
ミノ酸残基の配列に対応している。

好ましいサイトアドヘシンのアルファサブユニット重
鎖潜在的決定基ポリペプチドアナログは、hGP II bがフ
ィブリノーゲンと結合した時に形成される、hGP II b潜
在的決定基に似ている。好ましい態様において、hGP II
b潜在的決定基ポリペプチドアナログは、第１図のアミ
ノ酸残基137〜145番を表わす、次のアミノ酸残基配列、 を少なくともも含んでいる。

さらに、hGP II b潜在的決定基ポリペプチドアナログ
は、少なくとも、第１図のアミノ酸残基配列129〜145番
を表わしている、次のアミノ酸残基配列、 を含むことが好ましい。

hGP II b潜在的決定基アナログには、第１表に示され
るアミノ酸残基配列を含むことが望ましい。

a.各ポリペプチドの名称は、第１図において、含有され
るアミノ酸残基配列を表わしている。

第１表に示したポリペプチドは、さらに、hGP II bが
GP II b〜III a/フィブリノーゲン複合体として存在す
るとき、以下に延べるように、PMI−１抗体分子とhGP I
I bとの結合を中和する（競合的に阻害する）能力によ
り特徴づけられた。

ここで用いる後“複合体”は、抗体−抗原又はレセプ
ター−リガンド反応のような特異的結合反応産物を意味
する。代表的複合体には、免疫反応産物、GP II b−III
a−フィブリノーゲン結合反応産物及びサイトアドヘシ
ン−リガンド結合反応産物がある。

好ましい態様において、hGP II b潜在的決定基アナロ
グは、さらに、フィブリノーゲン結合血小板の凝集を競
合的に阻害する能力によって特徴づけられる。フィブリ
ノーゲン結合血小板凝集を阻害しうる代表的hGP II b潜
在的決定基アナログは、ポリペプチドp129−145があ
る。

本発明のhGP II b潜在的決定基ポリペプチドアナログ
は、フィブリノーゲン結合血小板凝集を競合的に阻害
し、そして、または、以下に延べるように、hGP II bが
GP II b−III a/フィブリノーゲン複合体として存在す
る時、PMI−１抗体分子のhGP II bへの結合を競合的に
阻害する限り、hGP II bのアミノ酸残基配列と同一であ
る必要はないことが理解されなければならない。それゆ
え、hGP II b潜在的決定基ポリペプチドアナログは、保
存的であれ、非保存的であれ、挿入、欠失及び置換のよ
うな種種の変化を受けることが可能で、そのような変化
はその使用に際し、ある利点を提供することもある。

保存的置換とは、１つのアミノ酸が別の、生物学的に
同様な残基に置き換るものである。保存的置換の代表例
には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン
などの疎水性残基の間の置換又は、アルギニンとリジ
ン、グルタミン酸とアスパラギン酸、グルタミンとアス
パラギンなどの極性残基の間の置換などが含まれる。
“保存的置換”という語句もそのようなポリペプチドが
必要とされる結合活性を示すなら、未置換の元のアミノ
酸の代りに置換したアミノ酸を使用することも含まれ
る。

本発明のポリペプチドが、１つ以上の保存的又は非保
存的置換が起っているため、hGP II bの配列と同一では
ない配列を有しているとき、本発明のポリペプチドが簡
便にラベル又は固体マトリクス又は抗原性キャリヤーに
固定できるように、“リンカー”を提供する目的でその
末端に付加的残基が付加される場合を除いて、通常多く
とも約20％、より普通には、多くて10％のアミノ酸残基
が置換される。本発明のポリペプチドに使用できるラベ
ル、固体マトリクス及びキャリヤーは以下に説明する。

通常、アミノ酸残基リンカーは、少なくとも１残基
で、40残基以上のこともあるが、普通には１個乃至10個
の残基からなる。リンカーに用いる典型的アミノ酸残基
は、チロシン、システィン、リジン、グルタミン酸及び
アスパラギン酸などである。さらに、本発明のポリペプ
チド配列は、例えばアセチル化などの末端ＮH_２アシル
化又は例えばアンモニア、メチルアミンその他の、チオ
クリコール酸アミデーション、末端カルボキシアミデー
ションによる修飾を受けることによる天然の配列と異な
るものであることもありうる。

リンカーを介してキャリヤーに結合し、当分野でキャ
リヤー−ハプテン結合体として知られているものを形成
する場合、本発明のhGP II b潜在的決定基ポリペプチド
アナログは、hGP II bが血小板会合GP II b−III a/フ
ィブリノーゲン複合体として存在するとき、hGP II bと
免疫反応する抗体を誘導することができる。免疫学的交
叉反応性に関する確立された原則からみて、本発明は、
ポリペプチドp129−149の抗原的関連変異体を考案して
いる。“抗原的関連変異体”とは、ポリペプチドp129−
145の少なくとも６個のアミノ酸残基配列部分を含み、
かつ、hGP II bが、血小板会合GP II b−III a/フィブ
リノーゲン複合体として存在するとき、p129−145及びh
GP II bと免疫反応する抗体分子を誘導することができ
るポリペプチドのことである。

2. 1GP II bポリペプチド 別の態様において、本発明は、第１図のアミノ酸残基
144〜156番で示される次のアミノ酸残基配列 を少なくとも含んでいる1GP II bポリペプチドを考案し
ている。

さらに、1GP II bポリペプチドには、1GP II bとは免
疫反応するがhGP II bとは免疫反応しない抗体分子を誘
導することができる特徴を有する。p144−156と命名さ
れる、好ましい1GP II bポリペプチドは、次の式 で表わされるアミノ酸残基配列を有している。

本発明のhGP II b及び1GP II bポリペプチドの両方と
も当分野でよく知られている技術で合成することができ
る。使用できる技術の秀れた概要が、J,M.スチワード
（Steward）及びJ.D.ヤング（“固相ペプチド合成”、
W.H.フリーマン社、サンフランシスコ、1969）及びJ.メ
イエンホーファー（Meien−hofer）（“ホルモンタンパ
ク質及びペプチド”、２巻、46頁、アカデミックプレス
版（ニューヨーク）、1983年）によって固相法につい
て、及びE.シュローダー（Schroder）及びK.クブケ（Ku
bke）（“ペプチド"1巻、アカデミックプレス版（ニュ
ーヨーク）、1965年）によって、古典的溶液合成につい
て、まとめられている。

G.接種物 別の態様において、本発明のポリペプチドもしくは、
その抗原的関連変異体を、薬学的に許容しうる水性希釈
組成物中で用いて、その効果的投与したとき、hGP II b
と免疫反応する抗体を誘導できる接種物を作った。

種々の文法型の“接種物”という語は、GP II bの重
鎖又は軽鎖に対する抗体の調製に用いられる活性成分と
して、本発明のポリペプチドを含む組成物を示して用い
ている。

ポリペプチドを抗体の誘導に用いる時、このポリペプ
チドは単独、又は結合体として、キャリヤーに結合し
て、又は、ポリペプチドポリマーとして使用されること
を理解すべきであるが、発現の簡便性のため、本発明の
種々の態様においては、集約的に“ポリペプチド”又
は、その種々の文法型のものを、その意味で用いてい
る。

約35残基以下のアミノ酸を含むポリペプチドは、すで
に延べてきたように、抗体の産生を誘導する目的には、
キャリヤーに結合したペプチドを使用することが好まし
い。

すでに延べてきたように、１個以上の付加的アミノ酸
残基をポリペプチドのアミノ及びカルボキシ末端に付加
して、そのポリペプチドのキャリヤーへの結合を助ける
ことができる。ポリペプチドのアミノ及びカルボキシ末
端へ付加したシスティン残基は、ジスルフィド結合を介
した結合体を作る上で特に有用なものであることが分っ
ている。しかし、結合体を作るための、当分野でよく知
られている他の方法も、使用することができる。代表的
付加結合操作には、グルタルアルデヒドのようなジアル
デヒド、ミカエル付加の使用（クリプスタイン（Klipst
ein）等、ジャーナル・オブ・インフェクシャスデシー
ズ（J.Infect.Dis.）147、318−326（1983）もしくは、
水溶性カルボジイミドを使用して、キャリヤーへのアミ
ド結合を生成するような、カルボジイミド技術の使用が
含まれる。タンパク質結合体もしくは、活性化官能基を
介しての結合のレヴューについては、オーラメアス（Au
rameas）等のスカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー（Scand.J.Immunol.）８、補１、７、７〜23
（1978）を参照せよ。

有用なキャリヤーは当分野ではよく知られており、一
般にタンパク質それ自体である。これらキャリヤーの代
表例には、キーホールリンペット・ヘモシアニン（KL
H）、エデスチン、チログロブリン、ウシ血清アルブミ
ン（BSA）もしくは、ヒト血清アルブミン（HSA）などの
アルブミン、ヒツジ赤血球（SRBC）のような赤血球、テ
タナス、トキソイド、コレラトキソイド及びポリ（Ｄ−
リジン:D−グルタミン酸）などのポリアミン酸などがあ
る。

キャリヤーの選択は、その接種物の最終的使用により
依存し、本発明に特に関係しない事項に基づいている。
例えば接種を受ける動物において、不都合な反応が起こ
らないキャリヤーを選択すべきである。

本接種物には、典型的には、キャリヤーに結合した結
合体として、効果的な免疫原的量の、本発明のポリペプ
チドが含まれている。他の事項の中で、単位投与当りの
ポリペプチドもしくはタンパク質の効果量は、接種を受
ける動物種、その動物の体重及び選択された接種管理に
依存し、このことは、当分野でよく知られていることで
ある。典型的に、接種物は、接種当り約10マイクログラ
ムから約500ミリグラムのポリペプチド又はタンパク質
濃度、好ましくは、投与当り、約50マイクログラムから
約50ミリグラムのポリペプチドもしくは、タンパク質を
含んでいる。

本発明の接種物に使われる限り、“単位投与”という
語句は、動物への単一投与に適した物理的に分離した単
位を意味し、各単位は必要とする希釈剤、すなわち、キ
ャリヤーもしくは、ビヒクルと合せて、望ましい免疫原
的効果を産むと計算された、予め決められた量の活性物
質を含んでいる。本発明の接種物の新しい単位投与に対
する明細は、（ａ）活性物質の特性及び遂行される特別
の免疫学的効果、及び（ｂ）動物において、免疫学的に
使用するための、このような活性物質の調合技術に本質
的な制限、によって記述され、直接これらに依存してお
り、それらは、ここに詳述されていると同時に本発明の
特徴となっている。

典型的に、接種物は、水、食塩水、又は、リン酸緩衝
液のような生理学的に許容される希釈剤又はビヒクル中
にポリペプチド結合体を分散して、水性組成物を作るこ
とにより、乾燥した固体ポリペプチド結合体から調製さ
れる。このような希釈剤は、当分野でよく知られている
ものであり、例えば、レミントン（Remington）の薬
学、第16編、マック・パブリッシング社、イーストン、
PA州（1980）、1465−1467頁で議論されている。

また、接種物は、希釈剤の一部として、アジュバント
も含むことがある。完全フロイント・アジュバント（CF
A）、不完全フロイント・アジュバンド（IFA）及びミョ
ウバンのようなアジュバントは、当分野でよく知られた
物質であり、いくつかの販売業者より、市販されてい
る。

H.抗体及び抗体組成物 1. 抗体組成物 ここで用いられている、種々の文法型の“抗体”とい
う語は、イムノグロブリン分子及び免疫学的に活性なイ
ムノグロブリン分子の一部、すなわち、抗体結合部位も
しくは、パラトープを含む分子を意味している。代表的
抗体分子には、本来のイムノグラブリン分子、実質的
な、本来のイムノグロブリン分子及び当分野でFab、Fa
b′、Ｆ（ab′）_２及びＦ（Ｖ）として知られている領
域を含む、パラトープを含む、イムノグロブリン分子の
一部が含まれる。

“抗体結合部位”とは、特異的に抗原と結合する（免
疫反応する）重鎖及び軽鎖の可変及び超可変領域を含む
抗体分子の構造領域のことである。種々の文法型の“免
疫反応”という語は、抗原決定基含有分子及び全抗体分
子もしくはその一部のような抗体結合部位を含む分子の
間の結合を意味する。

“抗原決定基”とは、抗体結合部位によって、免疫学
的に結合をうける抗原の実質的構造領域を意味する。ま
た、この語句は、“エピトープ”と互換的に使用され
る。

本発明の抗体組成物は、ａ）hGP II b又は1GP II b及
びｂ）本発明の少なくとも１つの特別なポリペプチドと
免疫反応する抗体分子を含むことを特徴とする。好まし
い態様において、本発明の抗体組成物は、GP II bと免
疫反応することができる１種以上のパラトープを含んで
いる。

例えば、血小板会合GP II b−III a/フィブリノーゲ
ン複合体及びhGP II b潜在的決定基ポリペプチドアナロ
グと免疫反応するが、そのアミノ酸残基配列を第２表に
示した。ポリペプチドp53−64と、実質的に免疫反応を
起こさない抗体分子を含む本発明の抗体組成物は、フィ
ブリノーゲン結合血小板と、フィブリノーゲンと結合し
ていない血小板とを区別することができる。したがっ
て、好ましい抗体組成物は、ａ）それが血小板会合GP I
I b−III a/フィブリノーゲン複合体として存在すると
きの、hGP II b、及びｂ）ポリペプチドp129−145、と
免疫反応し、かつ、実質的に、ポリペプチドp53−64と
の免疫反応を起こさない抗体分子を含むものである。

典型的に本発明の抗体組成物は、本発明の接種物でホ
乳動物を免疫化し、それにより、そのホ乳動物中に、適
当なポリペプチド免疫特異性を有する抗体分子を誘導す
ることにより生産される。それから、この抗体分子を、
そのホ乳動物から回収し、例えば、免疫親和性クロマト
グラフィーなどの従来法により、望ましい程度の単離を
行う。このようにして生成した抗体組成物は、そのま
ま、本発明の診断法及び診断システムに用いて、身体中
のフィブリノーゲン結合血小板の検出に使用される。

2. モノクローナル抗体組成物 本発明は、抗LIBSモノクローナル抗体組成物も考案し
ている。種々の文法型の“モノクローナル抗体組成物”
という語句は、ある抗体と免疫反応することができる唯
一種の抗体結合部位を含む抗体分子の集合体を意味す
る。したがって典型的に、モノクローナル抗体組成物
は、それが免疫反応する抗原に対する単一の結合親和性
を示す。それゆえ、モノクローナル抗体組成物は、異な
る抗原に対して、各々が免疫特異性を有する、多種の抗
体結合部位をもつ、単一の抗体分子、例えば、二特異的
モノクローナル抗体が含まれている。

典型的に、モノクローナル抗体組成物は、ほんの一種
の抗体分子を分泌．（生産）するハイブリドーマと呼ば
れる単一細胞のクローンから生産される抗体を含む。こ
のハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞及びミエローマ
もしくは、自己生存細胞系列の融合によって生成する。
このような抗体は、最初に、コラー（Kohler）及びミル
スタイン（Milstein）により報告されており（ネイチャ
ー（Nature）、256、495−497（1975））、その報告を
参考としてここに組込んである。

１つの態様において、本発明のモノクローナル抗体組
成物は、細胞表面レセプター−リガンド複合体により発
現されるLIBS、好ましくは、その複合体中のレセプター
の潜在的抗原決定基と免疫反応する抗体分子を含むこと
を特徴とする。

別の態様において、モノクローナル抗体組成物は、hG
P II b及びhGP II b潜在的決定基ポリペプチドアナロ
グ、好ましくはp129−145と免疫反応する抗体分子を含
む。これら組成物中に含まれる抗体分子は、GP II b機
能部位もしくはその付近のhGP II bと免疫反応するが、
血小板会合GP II b−III aによるフィブリノーゲンの結
合を阻害せず、また、それがフィブリノーゲンと結合し
たときは、血小板会合GP II b−III aと免疫学的に反応
することができる。このタイプの好ましいモノクローナ
ル抗体組成物には、ハイブリドーマPMI−１（ATCC HB 9
476）によって生産することができる抗体分子、すなわ
ちPMI−１抗体分子が含まれる。

3. モノクローナル抗体組成物の産生方法 本発明は、（ａ）細胞表面レセプター−リガンド複合
体により発現されるリガンド誘導結合部位（LIBS）と免
疫反応し、かつ、（ｂ）そのレセプター−リガンド複合
体の非占有レセプターもしくは、非結合リガンドとは免
疫反応しない、モノクローナル抗体の生成法を考案して
いる。この方法には、 （ａ） 動物の、細胞表面−レセプター複合体もしくは
hGP II b潜在的決定基ポリペプチドアナログによる免疫
化。これは、典型的に、免疫学的受容ホ乳動物に免疫原
の免疫学的効果量、すなわち、免疫応答を起こすのに十
分な量投与することにより行なわれる。このホ乳動物
は、ウサギ、ラット又はマウス等のげっ歯動物であるこ
とが望ましい。これからこのホ乳動物を、レセプター−
リガンド複合体と免疫反応する抗体分子を分泌する細胞
を作るのに十分な時間、維持する。

（ｂ） 免疫化したホ乳動物から取り出した抗体産生細
胞のサスペンジョンを調製する。これは典型的には、そ
のホ乳動物の脾臓を取り出し、ついで個々の脾細胞を機
械的に分離し、生理的に許容される媒体に分散するとい
う、当分野でよく知られている方法によって行なわれ
る。

（ｃ） サスペンジョン化した抗体産生細胞を、トラン
スホームした（“生存化”）細胞系列を作ることができ
るトランスホーム剤で処理する。トランスホーム剤及び
生存化細胞系列を作るための、その使用は、当分野では
よく知られていることであり、それには、エプスタイン
・バーウイルス（EBV）、シミアンウイルス40（SV4
0）、ポリオマウイルス等のDNAウイルス類、モロニー・
ムライン・リューケミア・ウイルス（MoMuLV）、ラウス
・ザルコーマウイルス等のRNAウイルス類、P3X63−Ag8,
653、Sp2/0−Ag14等のミエローマ細胞類等が含まれる。

好ましい態様において、トランスホーム剤による処理
は、適当な融合促進剤の使用による、適当な細胞系列由
来のマウスミエローマ細胞を、サスペンジョン化脾細胞
と融合することにより、ハイブリドーマを生成する。ミ
エローマ細胞当り約５個の脾細胞を用いることが好まし
い。総容積当り、約10⁸個の脾細胞を使用する。

使用する細胞系列は、いわゆる“薬剤耐性”であるこ
とが望ましく、その結果、未融合のミエローマ細胞は、
選択培地中で生存できず、一方、ハイブリットは生存で
きることになる。最も一般的なものには、８−アザグア
ニン耐性細胞系列があり、これは、酵素の、ヒポキサン
チン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ
を欠失しており、そのため、HAT（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン及びチミジン）培地で生育することができ
ない。また、一般的に、使用するミエローマ細胞系列
は、分泌型を使用したとしても、それ自身、なんら抗体
を産生しないという点で、いわゆる“非分泌”型である
ことが望ましい。しかし、ある場合には、分泌型ミエロ
ーマ系列であることが好ましい。好ましい融合促進剤は
約1000から約4000の平均分子量をもつポリエチレングリ
コール（PEG1000として市販されている）である一方、
この分野で知られている、その他の融合促進剤も使用す
ることができる。

（ｄ） その後、トランスホームした細胞を、好ましく
はモノクローナルにクローン化する。このクローニング
は、非トランスホーム細胞は生育できない組織培養培地
で行うことが望ましい。このトランスホーム細胞がハイ
ブリドーマの場合は、一般的にこのことは、分離容器
中、未融合脾細胞、未融合ミエローマ細胞及び融合細胞
（ハイブリドーマ）を、未融合ミエローマ細胞が生存で
きない選択培地中に希釈し、ついで未融合細胞が死滅す
るのに十分な時間（約１週間）、培養することによって
行なわれる。この希釈は、制限因子の１つであり、希釈
体積は、各分離容器中にある個数の細胞（例えば１〜４
個）が分離されるように統計的に計算する（分離容器と
は例えばマイクロプレートの各ウェルである）。この培
地は、薬剤耐性（例えば、８−アザグアニン耐性）未融
合ミエローマ細胞系列を生育させないものである。

（ｅ） クローン化トランスホーマントの組織培養培地
について、よく知られている免疫学的技術を用い、分泌
された抗LIBS抗体分子の存在を評価する。

（ｆ） ステップ（ｅ）で１度望ましいトランスホーマ
ントが同定されれば、それを選択し、適当な時間、適当
な組織培養培地で生育させ、ついでその培養上清から、
望ましい抗体を回収する。適当な培地及び適当な培養時
間は、既知であるか、もしくは、容易に測定できる。

より高濃度の準精製モノクローナル抗体を生産するた
め、この望ましいハイブリドーマを、マウス、好ましく
は、同種もしくは、準同種のマウスに注射する。このハ
イブリドーマは、適当なインキュベーション時間の後、
抗体産生腫瘍を生成し、これは、この宿主マウスの血液
及び腹腔分泌物内に高い濃度の目的抗体を生ずる（約５
−20mg/ml）。

これら組成物の調製に適する培地は当分野でよく知ら
れ、かつ、市販されており、また、これには、合成培養
培地、近交系マウス及びそれに類するものが含まれてい
る。代表的合成培地は、4.5g/のグルコース、20mmグ
ルタミン及び20％ウシ胎児血清を補った、ダルベユ最小
基礎培地である。代表的な近交系マウス株はBalb/cであ
る。

上記の方法で調製したモノクローナル抗体組成物は、
例えば、LIBS含有免疫反応産物の生成が望まれるよう
な、診断及び治療に用いることができる。代表的反応産
物には、GP II bもしくは、GP III aの含有免疫反応産
物が含まれる。

1.ハイブリドーマ及びその調製法 本発明のハイブリドーマは、抗LIBSモノクローナル抗
体組成物を生産する能力を有することを特徴とするもの
である。

本発明の好ましいハイブリドーマは、細胞表面レセプ
ター潜在的抗原決定基と免疫反応する抗体分子を生産す
ることを特徴とする。

望ましい免疫特異性、すなわち、特定のタンパク質、
特定のタンパク質上の同定可能なエピトープ、そして、
または、ポリペプチド上の同定可能なエピトープと、免
疫反応する能力を有する抗体分子を生産（分泌）するハ
イブリドーマの調製方法は、当分野ではよく知られてい
るものである。参考のためここに組入れられているナイ
マン（Niman）等（プロシーディングス・イン・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro.Natl.Acad.
Sci.）（ISA、80、4949−4953、（1983））及びガルフ
レ（Galfre）等（メソッズ・イン・エンザイモロジー
（Meth.Enzymol.）73、３−46（1981））の報告にある
ハイブリドーマ技術は特に利用される。

ハイブリドーマ培養物PMI−１は、ブタペスト協定要
請物に基づき、1987年７月７日、アメリカ、20852、MD
州、ロックビル、アメリカン・タイプ、ティシュ・コレ
クション（ATCC）に登録され、受理番号HB9476が割当て
られた。同様に、ハイブリドーマ培養物PMI−２は1987
年、12月22日ATCCに登録され、受理番号HB9615を割当て
られた。

J.治療法及び治療組成物 本発明のhGP II b潜在的決定基ポリペプチドアナログ
は、インビボにおけるフィブリノーゲン結合血小板の凝
集を緩和するのに用いることができる。

例えば、hGP II b潜在的決定基ポリペプチドアナログ
は、効果的量を被検者に投与したとき、フィブリノーゲ
ン結合血小板の凝集を競合的に阻害しうる、医療的に許
容しうる組成物で用いることができる。この阻害は、血
栓生成を減速させると考えられている。従って、インビ
ボでの、hGP II b潜在的決定基ポリペプチドアナログの
投与は、凝血及びある炎症応答のような血小板凝集によ
り開始される生理学応答を緩和するのに用いることがで
きる。

他の態様において、フィブリノーゲン結合血小板の凝
集は、基本的に、hGP II b潜在的決定基ポリペプチドア
ナログ、好ましくはp129−145と免疫反応する抗体分子
を含む医療的に許容しうる組成物を効果量、静脈投与す
ることにより阻害しうる。この抗体分子は、モノクロー
ナル抗体組成物として存在することが好ましく、また、
ハイブリドーマPMI−１で生産されるものがより好まし
い。

投与するポリペプチドもしくは抗体分子含有組成物
は、溶液もしくはサスペンジョンとしてであるが、ポリ
ペプチドは、錠剤、丸薬、カプセル放射維持製剤又は粉
末の形でも投与される。どの場合にも、典型的な組成物
は約0.1μＭから約1.0Mの活性成分、好ましくは、約1.0
μＭから約10ミリモル濃度（mM）の活性成分を含む。

活性成分として、ポリペプチド又は、抗体分子を含む
治療組成物の調製は、当分野でよく理解されている。典
型的に、これらの組成物は、溶液又はサスペンジョンの
ような接種物として調製されるが、接種前の液体である
溶液もしくはサスペンジョンに適した固体も調製される
こともある。また、この調製物はエマルジョン化するこ
ともある。しばしば、この活性治療成分は、医療的に許
容され、かつ、この活性成分と適合することが知られて
いる賦形剤と混合される。例えば、適当な賦形剤には、
水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール
等及びそれらの組合せたものがある。さらに、もし、望
ましいときは、この組成物は、活性成分の効果を上げる
ための、湿潤剤又はエマルジョン化剤、pH緩衝剤のよう
な少量の補助物質を含むこともある。

ポリペプチドもしくは抗体分子組成物は、中和した医
療許容塩としての医療組成物に整えられることもある。
医療的に許容される塩には、例えば塩酸、リン酸のよう
な無機酸、もしくは、酢酸、酒石酸、マンデル酸のよう
な有機酸で作られる酸付加塩（ポリペプチド又は抗体分
子の遊離アミノ基で形成される）が含まれる。また遊離
カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウ
ム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは鉄の
水酸化物のような無機塩基及びイソプロピルアミン、ト
リエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチ
ジン、プロカイン等の有機塩基から誘導されることもあ
る。

このポリペプチド又は抗体含有医療組成物は、例え
ば、単位投与量の静脈注射などの従来法で投与される。
本発明の医療組成物に対して用いられる“単位投与量”
という語句は、ヒトへの単一投与に適する物理的に分離
した単位を意味し、各単位は、必要とされる希釈剤すな
わちキャリヤー又はビヒクルと合せて、望ましい医療効
果を産むよう計算され、予め決められた量の活性物質を
含んでいる。

この組成物は、投与物の形状に適した方法で、かつ、
医療的に効果的量が投与される。投与量は、治療される
被検者、活性成分を利用する被検者の容量、及び望まし
いレセプター−リガンド結合の阻害度に依存する。投与
するのに必要な活性成分の正確な量は医者の判断に依存
し、かつ、各個人に特異的なものである。しかし、適当
な投与範囲は、１日、１人当り活性成分１から数ミリグ
ラムのオーダーである。第１次及び第２次投与の適正な
処方も、様々であるが、典型的には、第１次投与につい
でひきつづく注射又は他の投与法で、１時間以上の間隔
で反復投与する。別に、血液中の医療的に効果的濃度を
維持するのに十分な継続的な静脈への注入も考案されて
いる。hGP II b潜在的決定基ポリペプチドに関する、医
療的に効果的な血液濃度は、約0.1mMから約10mMの範囲
であり、約1.0mMが好ましい。本発明の抗体の医療的に
効果的な血液濃度は約0.1μＭから約10μＭの範囲であ
り、1.0μＭが好ましい。

K.診断システム 本発明のキット型の診断システムには、分包された試
薬として、少なくとも１回の検定に十分な量の、本発明
の発現タンパク質、ポリペプチド、抗体組成物もしくは
モノクローナル抗体組成物が含まれている。この分包試
薬の使用説明書も含まれているのが普通である。

典型的には、“使用説明書”には、その試薬濃度もし
くは、混合する試薬及びサンプルの相対的量、試薬／サ
ンプル混合物の維持時間、温度、バッファ条件などの、
少なくとも１回の検定法のパラメータを記述した明確な
表現物が含まれる。

１つの態様において、血液又は血漿のような、血小板
含有血液サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板を検
定するための診断システムには、hGP II b潜在的決定基
ポリペプチドアナログ、好ましくはp129−145と免疫反
応する分子を含むパッケージが含まれている。さらに、
この抗体分子は、hGP II bと免疫反応するハイブリドー
マPMI−１から生産されるものであることがより好まし
い。またこの抗体分子は、モノクローナル抗体組成物と
して存在することが好ましい。さらに、この抗体分子が
放射性核種ラベルに結合する、好ましくは、¹²⁵Iラベル
化PMI−１抗体を含むキットであることがより望まし
い。

別の態様における、本発明の診断システムは、インビ
ボで血栓の存在を検定するのに有用である。このシステ
ムには、hGP II b潜在的決定基ポリペプチドアナログ、
好ましくはp129−145と免疫反応する抗体分子を含むパ
ッケージが含まれる。この抗体分子は、基本的にhGP II
bと免疫反応するPMI−１抗体分子を含むモノクローナ
ル抗体組成物として存在することがより好ましい。この
抗体分子は、インビボ指示手段と結合させておく。

このように、好ましい態様において、本発明の診断シ
ステムには、さらに、本発明の抗体分子又はポリペプチ
ドを含む複合体の生成を知らせることができるラベルも
しくは指示手段が含まれている。

ここで用いられているように、種々の文法型の、“ラ
ベル”及び“指示手段”という語句は、複合体の存在を
示す検出可能なシグナルの生成に直接もしくは間接的に
関係する単一原子及び分子を意味している。“インビ
ボ”ラベルもしくは指示手段は、被検者身体中で有効に
働くもので、それには、¹¹¹In、⁹⁹Tc、⁶⁷Ga、¹⁸⁶Re及び
¹³²Iが含まれる。どのラベルもしくは指示手段も、本発
明の抗体もしくはモノクローナル抗体組成物の一部であ
る、発現タンパク質、ポリペプチドもしくは抗体分子と
結合するか、又はそれらに組込まれることもあるし、も
しくは、別々に使用されることもあり、またそれらの原
子又は分子は、単独で用いられることもあるし、別の試
薬と組合せで使用されることもある。このようなラベル
は、臨床診断化学の分野ではよく知られているものであ
り、そして、これらが、ここで述べられている新しいタ
ンパク質を用いた方法そして、またはシステムで使用さ
れる場合に限り、本発明の一部を構成している。

ラベルの結合、すなわち、ポリペプチド及びタンパク
質のラベル化は、当分野でよく知られているものであ
る。例えば、ハイブリドーマによって生産される抗体分
子は、培養培地中の成分として提供されるラジオアイソ
トープ含有アミノ酸の代謝的取込みによりラベル化する
ことができる。例えばガルフレ（Galfre）等、メソッズ
・イン・エンザイモロジー（Meth,Enzymol）、73、３−
46（1981）参照。活性化官能基を介するタンパク質結合
技術が特に利用される。例えば、オーラメアス（Aurame
as）等、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（Scand.J,Immunol.）８、補７、７−23（197
8）、ロットウェル（Rodwell）等、バイオテクノロジー
（Biotech）、３、889−894（1984）及び米国特許第4,4
93,795号参照。

また、この診断システムには、好ましくは分包状態で
特異的結合剤を含むことができる。“特異的結合剤”
は、本発明の試薬を選択的に結合できるが、本発明のタ
ンパク質発現物質、ポリペプチドもしくは抗体分子それ
自体ではない分子である。代表的な特異的結合剤には、
抗体分子、補体タンパク質もしくはその断片、プロテイ
ンＡ及びそれに類するものがある。この特異的結合剤は
本発明の抗体分子もしくはポリペプチドが複合体の一部
として存在するとき、これを結合することができること
が好ましい。

好ましい態様においては、この特異的結合剤はラベル
化されている。しかし、この診断システムがラベル化さ
れていない特異的結合剤を含んでいる場合、典型的にこ
の結合剤は、増巾手段又は増巾試薬として用いられてい
る。これらの態様において、ラベル化特異的結合剤は、
その増巾手段が試薬含有複合体に結合しているとき、そ
の増巾手段と特異的に結合しうる。

本発明の診断キットは、血清、血漿又は尿のような体
液サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板の存在もし
くはその量を検出するのに、“イライザ法”様式で用い
ることができる。“イライザ法”とは、固相に結合した
抗体又は抗原及び酵素−抗原もしくは酵素−抗体結合体
を用いて、サンプル中に存在する抗原もしくは抗体の量
を検出及び定量する酵素結合免疫吸着検定法のことであ
る。イライザ法の説明は、参考として、組込まれてい
る、1982年、CA州、ロスアラモスのレンジメディカル出
版社から出版されている、D.P.サイツ（Sites）等の、
“基礎及び臨床免疫学”の第４編、第22章及び米国特許
第3,654,090号、第3,850,752号及び第4,016,043号に報
告されている。

このように、好ましい態様において、本発明の発現タ
ンパク質、ポリペプチド又は抗体分子は、固体マトリク
スに固定され、本診断システム中、分包されている固体
サポートとなっている。

この試薬は、当分野ではよく知られているその他の固
定様式が使われることもあるが、水性媒体中から吸着に
より、固体マトリクスに固定化されるのが一般的であ
る。

当分野において、有用な固体マトリクスはよく知られ
ている。このような物質には、ファルマシア、フィイン
ケミカルス（NJ.ピスカタウェイ）からSEPHADEXの商標
で市販されている架橋デキストラン、アガロース;IL
州、北シカゴのアボット・ラボラトリーズ社から市販さ
れている約１ミクロンから約５ミリメートル径のポリス
チレンビーズ、シート、小片又はヘラ状の、ポリ塩化ビ
ニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロ
セルロースもしくはナイロンベースの織物、もしくは、
ポリスチレン又はポリ塩化ビニルから出来ているチュー
ブ、プレートもしくは、マイクロプレートのウェルが含
まれる。

ここで延べられている診断システムの試薬、ラベル化
特異的結合剤もしくは増巾剤は、液体分散物のような溶
解もしくは、例えば凍結乾燥形のような実質的に乾燥し
た粉末として提供される。指示手段が酵素の場合、その
酵素基質もこのシステムの分包の形で提供される。先に
述べたマイクロプレートのような固体サポート及び１種
以上のバッファ類も本診断検定システムにおける分包要
素として含まれている。

この診断システムに関してここで議論されているパッ
ケージは、通常、診断システムで使用されているもので
ある。このようなパッケージには、ガラス製及びプラス
チック製（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン／及
びポリカーボネート）のボトル、バイアル、プラスチッ
ク及びプラスチックホイルでラミネートした包装等が含
まれている。

L.検定法 本発明は、本発明の抗体もしくは抗体分子組成物中に
含まれる抗体、発現タンパク質もしくはポリペプチドを
含む複合体を生成することにより、GP II b及び特に血
栓もしくは、フィブリノーゲン結合血小板中に見られる
ようなフィブリノーゲン結合GP II bを含む複合体を検
出する方法を考案している。当業者は、これら複合体を
形成するのに利用することができる、よく知られた臨床
的診断化学操作が多く存在することをよく理解できよ
う。従って代表的検定法をここに示すが、これにより本
発明が制限されることはない。

1. 血栓の検出 被検者中の血栓の存在を検出する方法が考案されてい
る。インビボ指示手段を結合した、抗hGP II b抗体分子
を含む、本発明の、効果的量の抗体組成物もしくは、モ
ノクローナル抗体組成物を被検者に静脈投与する。好ま
しい態様において、ラベル化抗体分子は、hGP II b及び
ポリペプチドp125−145とは免疫反応するが、p53−64と
は免疫反応しないもので、ハイブリドーマPMI−１によ
って生産されるものであればより好ましい。

その後、この被検者を、ラベル化抗体が血栓の一部と
して存在するhGP II bと反応し、複合体を生成するのに
十分な予め決めた時間、及び好ましくは、非結合抗体分
子の実質的量が身体から一掃されるのに必要な付加的時
間維持する。さらにこの被検者を、生成したラベル化複
合体の存在、及び好ましくその位置について検定する。

2. 身体サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板の検
出 好ましくは血液や血液の血小板含有画分のような体液
サンプルなどの、血小板含有身体サンプル中のフィブリ
ノーゲン結合血小板の存在及び好ましくはその量を検出
するために、競合的、非競合的にかかわらず、種々の不
均一及び均一検定プロトコールが使用できる。例えば、
ヘパリン保存（非凝血化）血液サンプル及び¹²⁵Iラベル
化PMI−１抗体分子を混合する。このようにして生成し
た免疫反応混合物を、生物検定条件下、フィブリノーゲ
ン結合血小板がラベル化抗体と免疫反応し、ラベル化免
疫反応産物を生成するのに十分な時間維持する。それか
ら、このラベル化免疫反応産物を典型的には、サンプル
中に存在する全ての血小板がペレット化するのに十分な
遠心により、未反応ラベル化抗体から分離する。その
後、この生成したラベル化免疫反応産物の量を検定す
る。

生物学的検定条件とは、本発明の抗体分子及びポリペ
プチド分子及び検定しようとするフィブリノーゲン結合
血小板の生物学的活性を維持する条件である。これらの
条件には、約４℃から約45℃の範囲で、好ましくは約37
℃の温度、約５から約９の範囲で、好ましくは約７のpH
値、及び蒸留水から、約１モル濃度塩化ナトリウムまで
の範囲で、好ましくはおよそ生理的食塩水のイオン強度
が含まれる。このような条件を至適化する方法は、当分
野ではよく知られている。

例 次に示す例は、本発明を説明するものでその制限を意
図したものではない。

1. GP II b−III aの単離 A.血小板の単離 最終濃度、ミリリットル当り0.06ユニットのヒルビン
（MO州、セントルイス、シグマケミカル社）を含むACD5
ml（0.065Mクエン酸、0.085Mクエン酸ナトリウム、２％
デキストロース）にヒトの血液６ミリリットル（ml）を
採取し、これを120×ｇで15分間遠心する。富血小板血
漿（PRP）と命名した、この上清を回収し、単離してか
ら、さらに、1200×ｇで15分間遠心して、単離血小板の
ペレットを作った。

B.血小板からのGP II b−III aの単離 例1Aにおけるように調製した血小板ペレットを5mlのT
BS（0.15M NaCl、0.2Mトリス pH7.4、５×10^-4M CaC
l₂、10^-5Mロイペプチン）に懸濁し、モデルＭ−375ソン
ケーターを用い、最高強度で10分間、氷上で超音波処理
した（NY州、プレインビュー、ヒート−システムス・ウ
ルトラソニックス）。この超音波処理したサスペンジョ
ンを、ドライアイス−メタノールアイスバスを用いて２
度凍結融解を行ない、ついでマイナス20℃で保存した。
この凍結融解したペレット超音波処理物を5mlのスクロ
ース溶液（TBS中40％v/v）上に重層し、ついで、SW41遠
心ローター（CA州、フラートン、ベックマン・インスツ
ラメンツ）を用いて、４℃、毎分38000回転で１時間遠
心すると、ミルク色の下層が生ずる。その後、このミル
ク色の下層を回収し、SW50.1遠心ローター（ベックマ
ン）を用い、４℃で１時間、43,000RPMで遠心した。生
成したペレットを典型的には１〜2ml TBSに懸濁して、
血小板メンブレン溶液を作り、そのタンパク質濃度を典
型的には、バイオ−ラドタンパク質検定キット（CA州、
リッチモンド、バイオ−ラド）を、業者の説明に従って
用いて、10−25mg/mlの範囲での測定を行った。

再度、この血小板メンブレン溶液を、SW50.1遠心ロー
ター用いて、上述のように遠心し、ついで生成したペレ
ットを、2mlの抽出バッファ（0.03Mトリス、pH7.4、１
×10^-5Mロイペプチン、200mM ｎ−オクチル−ベータ−
Ｄ−グルコピラノシド;CA州、ラジョラ、カルバイオケ
ム−ベーリング）に懸濁した。このようにして作った血
小板メンブレン抽出物を渦巻撹拌により完全に混合し、
そして室温に30分間、維持した。その後、この抽出物を
SW50.1遠心ローターを用いて、４℃、45000rpmで１時間
遠心し、そして、このようにして生成した血小板メンブ
レン抽出物上清を回収した。

この回収した上清を、１リットルのカラムバッファ
（0.03Mトリス、pH7.4、0.1mM CaCl₂、0.1％ｎ−オクチ
ル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド）で平衡化した、LK
Bウルトロゲル、アクタ34ゲル濾過カラム（３×97cm、M
D州、ゲイサーズバーグ、LKBインスツルメント社）にか
け、このカラム溶出物から5mlづつのフラクションを採
取した。各フラクションの280ナノメーターの光学密度
を測定し、いくつかのピーク付近のフラクションを合せ
て、各ピークのプールを作った。各プール由来のサンプ
ルを、還元バッファ及びレムリ（Laemmli）（ネイチャ
ー（Nature）（ロンドン）、227、680−685（1970））
によって報告された操作、及び14.4キロダルトン（KD
a）から92.5KDaのサイズ範囲の低分子量タンパク質標準
物質（CA、リッチモンド、バイオ−ラド）を用いて、６
％ポリアクリルアミド・スラブゲルによる電気泳動で分
析した。

GP II b及びGP III aに相当する分子量、すなわち、
各々120KDa及び100KDaの主要な２種のタンパク質を含む
プールが回収された。このように調製した、単離GP II
b−III a調製物のタンパク質濃度は、典型的に、バイオ
−ラドタンパク質検定キットを用いて、0.3から0.8mg/m
lの範囲であると測定された。

2.ポリクローナル抗GP II b−III a抗血清の調製 例１で説明したように調製した、安全フロイント・ア
ジュバント及び単離したGP II b−III aタンパク質100
マイクログラム（μｇ）を含む組成物による免疫化によ
り、ウサギ抗GP II b−III a抗体を調製した。GP II b
−III aの二次免疫注射を三週間の間、一週間スケジュ
ールに従がい、不完全フロイントアジュバントを用い、
いくつかのイントラダーマル部位に投与し（典型的には
４部位に100μｇを分配する）、ついでさらに三ケ月
間、二週間スケジュールに従って投与した。

3. cDNAライブラリー構築、抗体スクリーニング及びcD
NAの同定 全細胞性RNAを、グアニジニウム・イソチオシアネー
ト／塩化セシウム法を用い、HEL細胞から調製した。ポ
リ（A⁺）RNAを２サイクルのオリゴ（dT）セルロース・
クロマトグラフィーにより、全RNAフラクションから精
製した。二本鎖cDNAは、標準操作に従い、AMV逆転写酵
素（FL州、セント・ピータースバーグ、ライクサイエン
ス社）及びランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用
いて、10μｇのHELポリ（A⁺）RNAから合成した。サイズ
選択したcDNAを、ファージgt11のEcoR I部位にライゲー
ションし、ストラタジーン・クローニングシステムズ社
から市販されているギガパック・パッキング抽出物を用
い、その業者のプロトコールに従ってそのファージ中に
包み込んでから、大腸菌Y1088にプレーティングし、増
巾した。大腸菌Y1090へのファージのプレーティング、
融合タンパク質合成の誘導、ニトロセルロースフィルタ
ーへの転移及び、例２で調製したウサギのポリクローナ
ルGP II b−III a抗血清による、そのフィルターのスク
リーニングは、イムノパーオキシダーゼに基づくベクタ
スタインABC法（CA州、バーリンガム、ベクターラボラ
トリーズ社）を業者の説明書に従って用いた、ヤング
（Young）等（プロシーディング・イン・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA、80、1194−1198（1983））によって報告され
たように行った。陽性の組換えクローンをプラーク精製
し、増巾してから、プレート溶解物として採取した。

ウサギのポリクローナルGP II b−III aの抗血清によ
る、200,000個の組換え体の最初のスクリーニングで６
個の免疫反応クローンが同定された。陽性クローンのベ
ーターガラクトシダーゼ−cDNA融合タンパク質と、モノ
クローナル抗体PMI−１との免疫反応性を試験するた
め、ファージ溶原体を、ヤング（Young）等（サンエン
ス（Science）、222、778−782（1983））の報告に従い
大腸菌Y1089株で使った。IPTG誘導培養物由来の溶解物
を、還元性ゲルサンプルバッファ中に、そのバクテリア
細胞ペレットを懸濁することにより調製し、その後、こ
のサンプルを、６％SDS−ポリアクリルアミドゲルで泳
動してから、トービン（Towbin）等（プロシーディング
・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、26、4350−4354（197
9））により報告されているように、ニトロセルロース
フィルターに転移し、ついでベカスタインABC法を用
い、PMI−１で採った。

1.1キロベース（kb）の挿入物を含む、これらのクロ
ーンの１つ、HEL41は、GP II bエピトープを有するもの
と一致する特徴を有する140KDaのバクテリア融合タンパ
ク質の合成を行うことが分った。これらの特徴には、
（１）HEL41クローンによりコードされる融合タンパク
質との、ポリクローナル抗GP II b−III aの抗体組成物
の阻害可能な反応性は、単離したGP II a−III aによる
予備吸着により阻害されること、（２）血小板溶解物及
び精製GP II b−III aのイムノブロットにおいて、融合
タンパク質に関しアフィニティー精製した抗体とのGP I
I bとの特異的反応、及び（３）表面ラベル化血小板由
来のGP II b−III aの、アフィニティー精製抗血清によ
る免疫沈殿化が含まれる。アフィニティー精製抗体は、
ウェスタンブロッティングによるビトロネクチンレセプ
ター（VnR）のアルファサブユニットとの反応を起こす
ことができず、また関連する内皮細胞サイトアドヘシン
を免疫沈殿化することができない。さらに、HEL41によ
りコードされる融合タンパク質は、モノクローナル抗体
PMI−１との免疫反応性を有し、このことは、このクロ
ーンがGP II b上にあるエピトーマをコードしている証
拠を提供している。

4. DNAの配列決定及び配列解析 HEL41由来の組換えファージDNAを液体培養技術により
精製し、EcoR Iで消化してからM13mp18にサブクローン
化した。各鎖のDNA配列は、ビギン（Biggin）等（プロ
シーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、80、3963−39
65（1983））により報告されているような、³⁵S−dATP
及びバッファ勾配ゲルを用い、サンガー（Sanger）等
（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、74、54
63−5467（1977））のダイデオキシ・チェーン・ターミ
ネーション法により決定した。cDNA配列は、ストラウス
（Stranss）等（アナリティカル・バイオケミストリー
（Anal.Biochem.）、154、353−360（1986））により報
告されている特異的プライマー依存DNA配列決定法を用
いて伸長した。オリゴヌクレオチド20マーシーケンシン
グプライマーは、アプライド・バイオシステムズ、モデ
ル380A DNAシンセサイザーを用いて合成した。不明瞭
さを除くため両鎖とも配列決定を行った。

クローンHEL41のヌクレオチド配列を第１図に示した
が、それは、次のような特性を有している。挿入物は、
部位682番から始まるTAG終止コドンとそれに続く420塩
基の３′非翻訳配列を伴う、681塩基の読み取り枠から
なる。このクローンの５′末端の初めの120ヌクレオチ
ドは、コンセンサスAlu反復配列の特徴を有しており、
このことは、このクローンが不完全なプロセッシングを
受けたmRNAに由来することを示している。

クローンHEL41のcDNA配列は、227個のアミノ酸の読み
取り枠をコードしている（第１図）。シャロ（Charo）
等（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、83、
8351−8356（1976））により報告されているように、GP
II bの軽鎖の配列決定されたＮ末端配列は、このクロ
ーン内のアミノ酸残基157番から171番として同定され
る。このコンセンサスAlu反復配列が読み枠どおりに翻
訳されると、これは、HEL41にコードされている最初の4
0個のアミノ酸に対応することを示している。

マトリクス分析（ジョージ（George）等、PIRレポー
ト＃REL−0286、ナショナル・バイオメディカル・リサ
ーチ・ファンデーション（1986））によるGP II b及びV
nRアルファサブユニットの誘導されたアミノ酸配の比較
（スズキ（Suzuki）等、プロシーディング・イン・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.）USA、83、8614−8618（1986））は、保存的置
換を可能とする類似性を有する２つの領域を検出した。
およそ50個のアミノ酸残基にわたる１つの領域は、重鎖
のカルボキシ末端付近に位置する。約15残基の第２の領
域は、軽鎖のアミノ末端付近に位置し、両タンパク質の
重鎖及び軽鎖間のジスルフィド結合の形成に関係するシ
スティン残基を含んでいる。突然変異データマトリクス
を用いたリレート・プログラムによる、GP II b及びVnR
アルファサブユニットの配列間の関係の統計的意義の評
価は、２つの配列に存在する、この類似性の度合を偶然
に見つける確率の低さを示している（Ｐ＜0.0001）。GP
II b及びFnRアルファサブユニットの配列間の関係を分
析すると（アーグレイブス（Argraves）等、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）261、12922−12924（1986））、この２つの配列中
に存在する類似性の度合を偶然に見つける確率が同様に
低いことが示された（Ｐ＜0.0005）。

コンピュータ調査では、GP II bのこの領域とNBRFタ
ンパク質データーベースに存在する他の配列間にその他
の明白な類似性は明らかにされなかった。さらに、神経
細胞粘着分子、Ｎ−CAMの、報告されている部分配列と
の直接の比較で有意な一致は検出されなかった。

5. ポリペプチド合成 ヌクレオチド配列から誘導されたアミノ酸残基に基づ
いて、ここで使用されている種々のGP II b領域に対応
するポリペプチドを、ハーゲンメイヤー（Hagenmaier）
等（ポプセイラーズ・Z.フィジオロジカル・ケミストリ
ー（Hoppe−Seyler's Z.Phisiol.CHem.）353、1973（19
82））の対称無水物法を用い、アプライド・バイオシス
テムズ社モデル430ペプチドシンセタイザーで化学合成
した。

合成したポリペプチドのアミノ酸残基配列及び第１図
に示したGP II bの誘導されたアミノ酸残基配列内のそ
れらの位置を第２表にリストした。

6. モノクローナル抗体組成物の調製 単離したイムノグロブリンIgG（IgG）を含むモノクロ
ーナル抗体組成物を、典型的にファルマシア社（NJ.ピ
スカタウェイ）から市販されており、業者の説明書に従
って用いられるプロティンＡ−セファロースを用いて、
マウスのハイブリドーマ細胞系列PMI−１（ATCC番号HB9
476）を含むマウスの腹水から単離した。単離したIgGの
タンパク質濃度を、バイオラドのプロティンアセッセイ
・キットを業者の説明書に従って使用することにより測
定した。

¹²⁵Iラベル化抗体を含むPMI−１モノクローナル抗体
組成物を調製するため、１ミリリットル当り１ミリグラ
ムの上記単離PMI−1IgGを含む、350マイクロリットル
（μ）のPBS（0.15M NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム、
pH7.09）を、40マイクログラム（μｇ）のクロラミン−
Ｊ及び１ミリキューリー（ｍ Ci）の無キャリヤーNa
¹²⁵I（IL州、アーリントン・ハイツ・アマーシャム）と
混合した。この混合物を約20℃に５分間維持し、その
後、20μの2mg/mlメタ重亜硫酸ナトリウム溶液及び20
μのヨウ化カリウム溶液と混合する。それから、１％
のBSAを含むPBS800μを混合し、さらに最終濃度10mM
となるように、ジイソプロピルフルオロホスフェートを
混合する。この混合物を22℃で60分維持してから、PBS
に対して透析する。生成した¹²⁵Iラベル化PMI−１の比
活性はμｇ当り約4.5マイクロキューリーであった。

上述の単離IgG由来のFab断片を含む組成物は、パパイ
ンによる、37℃、６時間の消化（パパインに対するIgG
の重量比、1:200）する、メージ（Mage）等の方法に従
って調製した（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Me
thods in Enzymology）70、142−150（1980）。未消化
のIgG及びFc断片を、プロティンＡ−セファロースによ
るクロマトグラフィーで除去した。こうしてできたFab
断片含有組成物は使用準備ができており、もしくは、必
要なときは、上述のモノクローナル抗体組成物で報告し
た操作と同様に、¹²⁵Iラベルした。

PMI＝１と異なる免疫特異性を有する、本発明のモノ
クローナル抗体も、PMI−１と同様に調製される。たと
えば、このような組成物は、マウスのハイブリドーマ細
胞系列PMI−２を用いて調製した（ATCC番号HB9615）。

7. イライザ検定法（ELISA） A.ポリペプチドイライザ法 PMI−１及びTabモノクローナル抗体組成物中に含まれ
る抗体分子を、ポリペプチドp129−145及びp144−156と
免疫反応する能力について調べた。（Tabは、コントロ
ールとして用いた無関連モノクローナル抗体である。）
20μＭのポリペプチドを含む50マイクロリットル（μ
）コーティング溶液（0.1M NaHCO₃、pH8.5、0.1％NaN
₃）を、平底96穴マイクロプレート（イムロン２、VA
州、チャンティリー、ダイナテク・ラボラトリーズ社）
のウェルに入れた。その後、このプレートを37℃に60分
間維持し、ポリペプチドをウェルの壁上に吸着させる。
振って、このコーティング溶液を除き、このウェルを、
洗浄バッファ（0.01Mトリス、pH7.4、0.05％トウィーン
20、0.15M NaCl、200mg/mlメルチオレート）で２度すす
ぎ、さらに各ウェル（固体サポート）に50μのブロッ
キングバッファ（コーティング溶液中の５％ウシ血清ア
ルブミン溶液）を加えて、過剰のタンパク質部位をブロ
ックした。

このウェルを約37℃に60分間維持してから、このブロ
ッキング溶液を除去した。各ウェルに、（ａ）例８で調
製し、かつ希釈バッファ（5mM EDTA及び1mg/ml BSAを
含む洗浄バッファ）で200倍に希釈した、ウサギ抗ポリ
ペプチド抗体、（ｂ）例６で報告したように調製した、
1.5ナノモル濃度（nM）のPMI−１モノクローナル抗体Ig
G、もしくは希釈バッファで320,000倍に希釈した、TAB
ハイブリドーマ腹水（TX州、サンアントニオ、テキサス
大学、R.マクエバー博士より提供された）を含む溶液50
μを加えた。このようにしてできた固／液相免疫反応
混合物を60分間、室温に維持して、固相結合ポリペプチ
ド及び添加された抗体との第１の固相結合免疫反応産物
を形成させた。それから、この固液相を分離し、このウ
ェルを洗浄バッファで２度すすいでから、過剰の液体を
振って除去した。

希釈バッファで2000倍に希釈した、ホースラディッシ
ュパーオキシダーゼラベル化ヤギ抗マウスIgG（CA州、
バーリンガム、タゴ社）、もしくは、希釈バッファで20
00倍に希釈したヤギ抗ウサギIgG（CA州、リッチモン
ド、バイオ・ラド・ラボラトリーズ社）を含む溶液50μ
を各ウェルに添加し、第２の固／液相免疫反応混合物
（ラベル化免疫反応混合物）を形成させた。このウェル
を50分間、室温に維持して、ラベル化抗体及び第１の免
疫反応産物の固相結合抗体間の第２免疫反応産物を形成
させた後、洗浄バッファで２度すすいで、固相結合ラベ
ル含有免疫反応産物を単離した。それから、過剰の液体
をウェルから除去した。

CPバッファ（水１リットル当り、0.1Mクエン酸243ml
及び0.2Mリン酸二ナトリウム250ml）中、0.4mg/ml o−
フェニレンジアミン及び0.012％（v/v）過酸化水素を含
む発色基質溶液50μを各ウェルに加え、発色反応混合
物を作る。この発色反応混合物を、約20℃に10分間維持
した後、2N H₂SO₄ 50μを各ウェルに添加して、この
発色反応を停止してから、この溶液の490ナノメーター
（nm）の吸光度を、モデル310イライザ・プレート・リ
ーダー（VT州、ウィノスキー、バイオテク・インスツル
メント社）を用いて測定した。

第３表に示した、本研究の結果は、モノクローナル抗
体PMI−１が、ポリペプチドp129−145と免疫反応する
が、ポリペプチドp144−156とは免疫反応しないことを
示している。以下に議論しているように、PMI−１は、G
P II b−III aがフィブリノーゲンと結合したとき、hGP
II bにより形成されている（上に露出している）潜在
的決定基と免疫反応するため、本研究の結果は、p129−
145がhGP II b潜在的決定基を真似る能力を有している
ことを示している。

２ 三回の測定から得られた平均光学密度の値±標準偏
差 B.競合イライザ法 ポリペプチド及び単離GP II b−III aについて、PMI
−１及びTabモノクローナル抗体組成物中に含まれる抗
体分子との免疫反応に対し、固相GP II b−III aと抗原
として競合する能力を調べた。

競合イライザ法は、１）ポリペプチドの代りに、例１
で報告したように単離したGP II b−III aをコーティン
グ溶液中20μg/mlで用いてマイクロプレートのウェルを
コートすること、及び２）抗体を添加し、免疫反応混合
物を作る直前にウェルにGP II b−III aもしくはポリペ
プチドを各々、0.73μＭもしくは25μＭ濃度でウェルに
添加すること、以外は、例7Aで述べたように行った。

第４表で示した、本研究の結果は、p129−145及びGP
II b−III aが競合的に、固相GP II b−III aに対するP
MI−１抗体分子の免疫学的結合を阻害する一方、p144−
156は阻害しないことを示している。加えて、ポリペプ
チドは、GP II b−III aと免疫反応するTab抗体分子の
能力に有意な影響を示さなかった。これらの結果は、ポ
リペプチドp129−145がP129−145アミノ酸残基配列を含
むhGP II b領域の二次構造及び抗原決定基を真似る能力
を有することを示している。

1. 三回の測定から得られた平均光学密度値±標準偏
差。

8.抗ペプチド抗血清の調製 抗ペプチド抗血清は、例５で調製したペプチドでウサ
ギを免疫化することにより作った。グルタルアルデヒド
を用いた、抗原キャリヤーとしてチログロブリン（MO
州、セントルイス、シグマケミカル社、ウシＩ型）への
ペプチドの結合を、参考として、ここに組込んだJ.G.ド
クレー（Dockray）の報告（制御ペプチド（Regulatory
Peptides）、１、169−186（1980））に従って行った。
その後、一次免疫に、400μｇのチログロブリン結合ペ
プチドを用いたこと以外は、例２で述べたように免疫化
を行った。

9. ポリペプチドによる、血小板会合GP II bへの抗体
結合の阻害 A.血小板の調製 例1Aで示したように調製した単離血小板を、1mg/mlの
BSA及び1mg/mlデキストロースを含む無カルシウムタイ
ローズバッファ（0.13M NaCl、0.0026M KCl、0.002M Mg
Cl₂−6H₂O、5mMヘペス、0.012M NaHCO₃、pH7.2）2mlに
懸濁した。この血小板サスペンジョンを、同様のタイロ
ーズバッファで平衡化したセファロースCL2Bカラム（NJ
州、ピスカタウェイ、ファルマシア社、40ml全吸着床容
積）にかけた。血小板を、最終容積約４〜5mlの、CL2B
カラムの空隙容量から回収し、洗浄血小板及びこの洗浄
血小板サスペンジョンと命名し、コールター社モデルII
カウンター（FL州、ハイアリーフ、コールターエレクト
ロニクス社）で計数した。全血小板調製操作は、プラス
チック容器中及び室温で行った。

B.血小板競合検定法 例9Aで述べた、タイローズバッファ中に調製した洗浄
血小板（２×10⁸/ml）を、最終濃度5mMとなるようなテ
トラエチレン四酢酸（EDTA）と混合し、30分間37℃に維
持して、PMI−１結合エピトープに露した。その後、こ
の血小板を第２図に示した濃度のポリペプチドと混合
し、さらに、例６で調製した。¹²⁵Iラベル化PMI−１と
混合させて、生成した免疫反応混合物中、１μＭのラベ
ル化抗体を作る。この混合物を22℃に30分間維持し、免
疫反応産物を形成させる。その後、¹²⁵Iラベル化PMI−1
/血小板免疫反応産物は、その維持した全混合物を、ベ
ックマン・マイクロフュージＢ（CA州、フラートン、ベ
ックマン・インスツルメント社）中、0.3mlの20％スク
ロース中での遠心により未結合の¹²⁵I−PMI−１から単
離され、血小板ペレットとした。血小板ペレットに会合
した放射活性¹²⁵I−PMI−１の量を、シンチレーション
スペクトロメトリーにより測定した。

第２図に示した、本研究の結果は、ポリペプチドp129
−145が、二価カチオンの非存在下、血小板メンブレン
会合GP II bへの、抗体分子結合を競合的に阻害しうる
ことを示している。また、第２図は、抗体分子濃度が１
μＭのとき、50％阻害が、1.6μＭのポリペプチド濃度
で起こることから、p129−145/PMI−１相互作用のおよ
そのKd値が1.2μＭであることを示している。

10. フィブリノーゲン結合血小板による、hGP II b潜
在的決定基の発現 例1aで示したように、富血小板血漿（PRP）を調製
し、３つの部分標本に分けた。１つの部分標本におい
て、血小板を最終濃度50μＭとなるようアデノシン二リ
ン酸は添加することにより刺激して、官能性GP II b−I
II a（フィブリノーゲンレセプター）を発現させ、ADP
刺激血小板を生成した。第２の部分標本において、最終
濃度50μＭのエピネフリンの添加によりGP II a−III a
の発現の刺激を行った。両方の場合、刺激を受けた血小
板上に発現したGP II b−III aフィブリノーゲンレセプ
ターは、血漿中に存在するフィブリノーゲンと結合し、
フィブリノーゲン結合血小板となる。ネガティブコント
ロールとして、PRPの第３の部分標本は刺激せず、非刺
激血小板とした。

通常の技術で、例６で述べた、¹²⁵Iラベル化抗体から
調製した、¹²⁵Iラベル化PMI−1 Fab断片を、最終濃度0.
8μＭとなるように各PRP部分標本に添加した。このよう
にして生成した免疫反応混合物を30分間37℃に維持し、
ラベル化した免疫反応産物、すなわち、フィブリノーゲ
ン結合血小板/¹²⁵I/PMI−１複合体を形成させた。それ
から、ラベル含有免疫反応産物を、例9Bで述べたような
スクロースクッションを介した血小板の遠心により、未
結合¹²⁵I−PMI−１から分離した。

第３図は、本研究の結果を示しており、PMI−１抗体
分子が、刺激化フィブリノーゲン結合血小板とは免疫反
応するが、実質的に、非刺激化血小板とは免疫反応しな
いことを示している。非刺激化PRP部分標本中“結合”
していると見なされる¹²⁵I−PMI−１は、非特異的結合
（“スティッキング”）、そして、または、天然のバッ
クグランドレベルの刺激化フィブリノーゲン結合血小板
もしくは、取扱いの結果として結合及び刺激化された血
小板の存在によるものであると考えられている。それゆ
え、これらの結果は、GP II b−III aサイトアトヘシン
による、フィブリノーゲン、arg−gly−asp（RGD）アミ
ノ酸残基配列含有リガンドの結合は、その他の潜在的抗
原決定基を発現させることを示している。このように、
PMI−１抗体分子及び同様の免疫特異性を有する抗体分
子は、血液サンプル中の刺激化フィブリノーゲン結合血
小板の存在及びその量の検定に使用することができる。

11. ポリペプチドによる血小板凝集の阻害 例1Aで述べたように調製した富血小板血漿（PRP）200
μを、BSA及びテキストロース（各々1mg/ml）を含む
タイローズバッファ190μ及び第４表で示した種々の
量のポリペプチドp129−45もしくはP144−156と混合し
た。それから10μのADP（タイローズバッファ中80μ
Ｍ）を添加して、血小板凝集を刺激した。この混合物を
37℃に維持しながら、デュアルサンプルアグリゲーショ
ンメーター（CO州、モリソン、シエンコ社、モデルDP−
247E）を用い、この混合物の透過率の時間変化をモニタ
ーした。

アグリゲーションメータは、200μのPRP及び200μ
のタイローズバッファを含む溶液を用い、コントロー
ルアグリゲーションに対しては５％、及びポリペプチド
存在下のアグリゲーションに対しては10％に透過率のベ
ースラインをセットすることにより補正した。100％透
過率の上限は、100ml PRP及び300μのタイローズバ
ッファの混合物を用いて一律に設定した。

12. 抗ペプチド抗血清を用いたGP II b軽鎖の免疫反応 例1Aで述べたように調製した約１兆個の血小板を1ml
の冷PBS（すなわち４℃）懸濁し、ついで、200μｇのラ
クトパーオキシダーゼ（シグマ社）及び2m Ciの無キャ
リヤーNa ¹²⁵I（16m Ci/μｇ、IL州、アーリントンハイ
ツ、アマーシャム）と混合し血小板ラベル化サスペンジ
ョンを調製した。それから、５分間隔で２回、0.06％ス
トック溶液から５μのパーオキサイドをこのサスペン
ジョンに添加し、４℃に維持して、ラベル化反応を開始
させた。その後、200μｇのチロシンを加えて、この反
応を停止させ、1200xg、15分の遠心を５回繰り返して洗
浄し、さらに冷PBSに懸濁して、ラベル化血小板サスペ
ンジョンを調製した。５番目の遠心ステップの後、この
ラベル化血小板を、40mlの溶解バッファ（0.5％トライ
トンＸ−100（v/V）、10mM EDTA、10μg/mlベンスアミ
ジン及び100ユニット/mlのトラシロール；全てシグマ社
製）に懸濁することにより、ラベル化血小板溶解物を調
製した。

1mlのラベル化血小板溶解物を15μの加熱失活化正
常ウサギ血清（NRS）と混合し、22℃に30分間維持し、
さらに、免疫反応バッファ（IPB:0.02Mトリス塩酸、pH
7.4、0.156M NaCl、0.01M EDTA、10mMベンズアミジン
−塩酸、10μg/mlソイビーン・トリプシン・インヒビタ
ー、0.2mMフェニルメチルスルホニル・フルオライド、
１％（v/V）トライトンＸ−100、0.05％〔v/V〕トウィ
ーン20、0.02％〔w/V〕NaN₃、５ユニット/mlトラシロー
ル；全てシグマ製）中に調製した、10％（v/V）ハイソ
ービル（CA州、ラジョラ、ベーリング、ダィアグ／ステ
ィクス社）溶液100μを添加し、ベックマン、マイク
ロフュージＢ中で１分間遠心し、ついで生成した上清を
単離して、透明な溶解物を調製した。このNRSの添加、
維持、パンソービンの添加及び遠心の透明化操作を２度
繰り返してから、再び、NRS及び維持ステップを省い
た、パンソービンを用いる同様の操作を行ない、三回透
明化溶解物を調製した。

その後、この三回透明化溶解物を、250μのIPB、例
８で調製した抗ポリペプチド抗血清４μ、例２で調製
した抗GP II b−III aもしくはNRS、及び最終濃度１％
となるようなウシ血清アルブミンと混合した。この混合
物を、４℃に12〜18時間維持してから、１％パンソービ
ン100μと混合し、その後、22℃に１時間維持した。
その後、この混合物をマイクロフュージＢで１分間遠心
してから、生成したぺレットを単離した。この単離ペレ
ットをIPBで２回、0.5M LiClで１回、再びIPBで１回洗
浄した。この洗浄操作には、指示したバッファ約1mlへ
の懸濁、マイクロフューじＢでの１分間の遠心及び生成
したペレットの単離が含まれる。

ついでこの洗浄ペレットを溶解して、レムリ（Laemml
i）により報告されているように、サンプルバッファ約1
00ml中、３分間100℃に加熱することにより、存在する
免疫複合体を脱離させる。例えば、レムリ（Laemml
i）、U.K.ネイチャー（Nature）（ロンドン）、227、68
0−685（1970）参照。その後、溶解免疫複合体をマイク
ロフュージＢで１分間遠心してから、免疫沈殿化タンパ
ク質を含む上清を、５％２−メルカプトエタノールを含
むレムリ（Laemmli）バッファーを用い、15％ポリアク
リルアミドスラブゲルでの電気泳動で分析した。さら
に、このゲルを乾燥し、そこに含まれているタンパク質
をコダックＸ−オマット（Omat）ARフィルム（NY州、ロ
チェスター・イーストマン・コダック社）への放射線露
光により可視化した。この可視化タンパク質の分子量
を、12,300及び97,400ダルトンの範囲の分子量をもつ、
¹⁴Cラベル化タンパク質標準物質に相対的な電気泳動移
動度に基づいて見積った（標準物質;MA州、ボストン、
ニューイングランドニュークリアー製）。

この方法で分析したラベル化溶解物は、約20KDaの分
子量をもつ、ゲル上に可視化されたタンパク質を生じ、
このタンパク質は、ポリクローナル抗GP II b−III a抗
血清もしくはNRSを用いたときは実質的には検出されな
い、抗ポリペプチドp144−156抗血清使用時のGP II b軽
鎖タンパク質（1GP II b）に対応している。それゆえ、
抗ポリペプチドp144−156抗血清及び同免疫特異性を有
する抗体組成物は、1GP II bを検出するのに用いること
ができる。

13. リガンド結合による、GP II b−III a潜在的抗原
決定基の発現 A.混合による、潜在的抗原決定基を発現する血小板への
抗体結合の検定法 使用するタイローズバッファを始めに、キレックス10
0（200−400メッシュ、ナトリウム型、CA州、リッチモ
ンド、バイオラド・ラボラトリーズ社）との混合し、タ
イローズバッファ中に存在する二価カチオンを錯体を作
るよう維持し、ついでバッファから、錯体を作った二価
カチオンを濾過して除去する処理を行うこと以外、例9A
で述べた方法により、洗浄血小板を、ml当り１×10⁸個
の濃度となるように調製した。

上記の洗浄化血小板含有調製溶液を部分標本に分けた
後、各部分標本中の血小板を、最終濃度５μＭとなるよ
うにADPを添加することにより刺激してADP刺激化血小板
を調製した。また、刺激を行なわないものも用意した。

まず、例６で述べたように調製した、¹²⁵Iラベル化全
抗体分子もしくは、¹²⁵Iラベル化Fab断片を含むモノク
ローナル抗体組成物を種々のポリペプチド及び二価カチ
オンもしくはEDTAと混合した。さらに、この¹²⁵Iラベル
化抗体／ポリペプチド混合物を、刺激化もしくは非刺激
血小板部分標本と、結果として、抗体もしくはFab断片
濃度が約0.8μＭとなるように混合した。それから、こ
の免疫反応混合物を30分間37℃に維持し、潜在的抗原決
定基を発現させ、かつ、¹²⁵Iラベル化免疫反応産物、す
なわち、リガンド結合血小板/¹²⁵I−抗体もしくは¹²⁵I
−Fab断片複合体を形成させた。さらに、ラベル含有免
疫反応産物は、例9Bで報告されているように、スクロー
スクッションを介しての部分標本の遠心により、未結合
¹²⁵Iラベル化抗体又はFab断片から分離した。

第５表は、モノクローナル抗体PMI−１を用いた、リ
ガンド存在下の、血小板へのラベル化抗体の結合を検定
した結果を示す。

1. 結合したPMI−１量の増加は、リガンド存在下での
結合量から、リガンドは含まないが2mM CaCl₂及び1mM M
gCl₂存在下での結合量を引いた値として観測される増加
を、血小板当りに結合したPMI−１分子数±標準偏差と
して表現されている。非刺激又は刺激化血小板に対す
る、二価カチオン存在かつリガンド非存在下での結合量
は、各々、PMI−１ IgGに対し、6769±84又は6643±15
7分子／血小板であり、また、PMI−１ Fabに対し、各
々、3917±212又は3785±150分子／血小板であった。

2. 使用するリガンドは例５で述べたように調製した。
指示されたポリペプチドの１つであり、例13Aで述べた
免疫反応混合物中の最終濃度が1mMとなるよう添加する
か、又は、アミノ酸配列HHLGGAKQAGDVを有し、残基399
−410番のフィブリノーゲンガンマ鎖由来のものであ
る。コントロールポリペプチドＨ−12で、これも1mM添
加される。コントロールとしてのリガンドポリペプチド
の非存在下では、4.5mM EDTAが添加された。EDTAを含
まない全ての場合に、2mM CaCl₂及び1mM MgCl₂が含まれ
る。

3. 測定せず。

第６表は、ハイブリドーマPMI−２より生産される全
モノクローナル抗体又はFab断片（すなわち、PMI−２モ
ノクローナル抗体）を含むモノクローナル抗体組成物を
用いた、リガンド存在下での、抗体の血小板への結合の
実験結果を示している。

1. PMI−２ IgGの結合量は例13Aで示したように測定
し、指示して条件下、血小板当り結合したPMI−２分子
数として表現されている。

2. 使用したリガンドは、例５で述べたように調製し
た、指示されるポリペプチドの１つであり、最終濃度0.
5mMとなるよう添加するか、もしくは、これも、0.5mMと
なるよう添加される。残基部位400から411番のフィブリ
ノーゲンガンマ鎖の配列に相当する配列を有するポリペ
プチド、もしくは、最終濃度15μＭで使用する、マーグ
エリー（Marguerie）等（ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、254、5357−5
363（1979））により報告されているように単離フィブ
リノーゲン・タンパク質（Fg）である。またコントロー
ルとして、リガンドの添加がないものも行った。

3. 添加二価カチオンとは、1mM CaCl₂か、又は5mM ED
TAの二通りの条件を意味する。

第５表及び第６表に示した結果は、フィブリノーゲン
（Fg）4g由来ペプチド、400−411及RGD含有ペプチドがG
P II b−III aを結合し、かつ、通常、抗原決定基が抑
制される条件下、すなわち、CaCl₂の生理学的濃度存在
下、PMI−１又はPMI−２により認識される潜在的抗原決
定基を露出させる能力を示している。

また、この結果は、PMI−２により認識される潜在的
抗原決定基はが刺激化血小板とのリガンド結合で誘導さ
れるが、非刺激化血小板では誘導されないことを示して
いる。一方、PMI−１により認識される潜在的抗原決定
基は、刺激化、もしくは非刺激化血小板の両方との、ポ
リペプチドリガンドの結合により誘導される。

さらに、この結果は、GP II b−III aに対するこのリ
ガンドの構造特異性も示している。逆配列ペプチド、SD
GRは、PMI−２認識抗原決定基を誘導せず、また、通常
見うけられるアスパラギン酸残基（Ｄ）の代りに、グル
タミン酸（Ｅ）を用いる保存的置換は、潜在的抗原決定
基誘導リガンドとして、かなり効果の小さいペプチドを
生ずる。

このポリペプチドリガンド、RGDS濃度を、上記の抗体
の血小板結合検定法で変化させた時、刺激化又は、非刺
激化血小板上の潜在的抗原決定基のリガンド誘導に対す
る投与−応答曲線が得られた。潜在的抗原決定基を検出
するためにPMI−１又はPMI−２を用いた、投与−応答曲
線の結果をLIBS誘導率として表現した、第５図に示す。
ポリペプチド存在下結果したIgG量は、完全なリガンド
誘導結合部位（LIBS）の誘導の際の、IgGの最高結合量
の割合として表現されており、そこでは、4.5mM EDTA存
在下及びペプチド非存在下での血小板当りのIgG分子量
として測定したIgG結合は、100％誘導として考え、ま
た、2mM CaCl₂及び1mM MgCl₂存在下、かつ、ペプチド非
存在下でのIgG結合は、０％誘導と考えた。

第５図に示した結果は、ポリペプチドリガンドが同じ
ハーフマキシマムリガンド濃度約2mMで２つの異なる潜
在的抗原決定基を誘導することを示している。さらに、
この結果は、PMI−２により認識される決定基は、刺激
化血小板では誘導されるが、非刺激血小板では誘導され
ないが、一方、PMI−１により認識される潜在的抗原決
定基は、RGDSを用いたとき、刺激化血小板及び非刺激血
小板の両方で誘導されることを示している。

PMI−１及びPMI−２モノクローナル抗体の両方が抗LI
BSモノクローナル抗体である一方、これら２つの抗体の
特異性は区別可能なものであることに注意すべきであ
る。従ってリガンドによるレセプターの占有は１つ以上
のLIBSを誘導しうる。結果として、本発明の方法は、細
胞表面レセプターリガンド複合体と免疫反応する１種以
上のモノクローナル抗体を生産するのに使用することが
できる。

B.潜在的抗原決定基を発現する可溶性精製GP II b−III
aへの抗体結合の検定 潜在的抗原決定基の発現を誘導する、種々のポリペプ
チドの能力を、可溶性の単離GP II b−III aを用いて研
究した。

最後に、次に示すこと以外は、例7Bで述べた様に、競
合イライザ法を行った。マイクロプレートは、ml当り10
μｇ濃度の、例１で述べた様に単離したGP II b−III a
を含むコート溶液を用いてコーティングした。ブロッキ
ング後、全ての使用される溶液は、その使用前、例13A
でタイローズバッファについて述べたように、キレック
ス100で処理した。（１）例５で述べたように調製した
1.5ナノモル濃度のPMI−１ IgG、又は、例7Aで述べ
た、Tabハイブリドーマ、（２）2mM CaCl₂、（３）例
１で述べたように単離し、PMI−１検定に対しては、40
μg/mlの濃度、また、Tab検定に対しては４μg/mlの濃
度となるように添加されるGP II b−III a及び（４）1m
Mのポリペプチドを含む免疫反応混合物を調製した。こ
の免疫反応混合物を16〜20時間、22℃に維持して、固相
結合GP II b−III a及び添加した抗体間の、第１の固相
結合免疫反応産物を形成させる。

上述の実験結果を以下の第７表に示した。

1. 発現率は、ポリペプチドリガンド結合により、誘導
されるGP II b−III a上に存在する潜在的決定基の尺度
となる。このデータは、5mM EDTAの存在下、GP II b−
III aを用いて得られた最高の決定基発現の割合として
表わされている。各条件下で行った測定数をカッコ中に
示し、また、その結果は、それらの測定値の平均値±標
準偏差で示した。

2. 添加したリガンドは、例５で述べたように合成し、
その配列は、一文字コードで示したポリペプチドであ
る。“コントロール”とは、ポリペプチドを添加しなか
ったことを意味する。

第７表に示した結果は、RGD含有ポリペプチドリガン
ドは本来の血小板を用いて観察されたのと同じような方
法で（例えば第６表参照）、GP II b−III aによる、潜
在的抗原決定基の発現を誘導することを示している。リ
ガンド誘導の発現の特異性は、逆配列（SDGR）又は、保
存的置換（GRGESP）を有するポリペプチドを用いること
により確証され、またさらに、Tabモノクローナル抗体
結合に関して有意なリガンドの影響が観察されなかった
ことにより確証された。これらの結果は、モノクローナ
ル抗体PMI−１により認識される潜在的抗原決定基のリ
ガンド誘導の発現は、GP II b−III aの本質的性質であ
りまた、GP II b−III aの血小板との会合に依存しない
ことを示している。例を要する特別な態様を含む、先に
示した明細は本発明を説明するためのもので、制限を意
図したものではない。本発明の精神及び範囲を逸脱する
ことなしに、多くの変化及び修正を行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ 15/09 ＺＮＡ 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＢ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ ９６１５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ ９４７６ (72)発明者 ギンズバーグ マーク エイチ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サン ディエゴ レノート プ レイス 2944 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（1987．Ｊ ｕｎ．）262（18）ｐｐ．8476−8482 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ（1983）80ｐｐ．6992−6995 Ｂｌｏｏｄ（1985）65（５）ｐｐ. 1112−1119 Ｊ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．（1984）99ｐ ｐ．2056−2060 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ. （1986）78ｐｐ．1103−111

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】刺激されたフィブリノーゲン結合血小板と
   免疫反応する抗体分子を生成することを特徴とするPMI
   −２（ATCC HB 9615）と命名されるハイブリドーマ。
2. 【請求項２】刺激された、フィブリノーゲン結合血小板
   と免疫反応する、ハイブリドーマPMI−２（ATCC HB 9
   615）により生成される抗体分子を含むことを特徴とす
   るモノクローナル抗体組成物。
3. 【請求項３】ａ）少なくとも１回の検定を行うのに十分
   な量の、ハイブリドーマPMI−２（ATCC HB 9615）に
   より生成された抗GP II b−III a抗体分子を含むパッケ
   ージ、 を含み、血液サンプル中のGP II b−III a−リガンド複
   合体を発現する血小板の存在を検定するための、診断キ
   ット。
4. 【請求項４】上記抗体分子が放射性核種でラベル化さ
   れ、かつモノクローナル抗体組成物として存在する、請
   求項３記載の診断キット。
5. 【請求項５】ａ）少なくとも１回の検定を行うのに十分
   な量の、ハイブリドーマPMI−２（ATCC HB 9615）に
   より生成された、インビボ指示手段と結合した抗GP II
   b−III a抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物を含
   むパッケージ、 を含む、インビボで血栓の存在を検定するための診断キ
   ット。
6. 【請求項６】血小板含有血液サンプルを、GP II b−III
   a−リガンド複合体を発現する血小板の存在について検
   定する方法であって、 ａ）ハイブリドーマPMI−２（ATCC HB 9615）により
   生成された抗GP II b−III a抗体分子を含む、効果量の
   モノクローナル抗体組成物を、血液サンプルと混合する
   ことにより、免疫反応混合物を作る、 ｂ）該抗体が、サンプル中に存在するフィブリノーゲン
   結合血小板と免疫反応し、かつ、免疫反応産物を生成す
   るのに十分な時間、この混合物を維持する、 ｃ）ステップｂ）で生成した免疫反応産物の存在を検定
   する、 以上のａ）〜ｃ）のステップを含むことを特徴とする方
   法。