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JP3162091B2 - ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体 - Google Patents

ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体

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JP3162091B2
JP3162091B2 JP03323691A JP3323691A JP3162091B2 JP 3162091 B2 JP3162091 B2 JP 3162091B2 JP 03323691 A JP03323691 A JP 03323691A JP 3323691 A JP3323691 A JP 3323691A JP 3162091 B2 JP3162091 B2 JP 3162091B2
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JP
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dna
subunit
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nitrile hydratase
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秀明 山田
真 西山
透 長沢
末治 堀之内
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はロドコッカス ロドクロ
ウス(Rhodo- coccus rhodochrous) Ｊ−１株に由来し、
ニトリル類を対応するアミド類に変換する能力を有する
ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子ＤＮＡ、このＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ
及び該組換え体ＤＮＡにより形質転換された形質転換体
に関する。
【０００２】
【従来の技術】ニトリル類を水和して相当するアミド類
を生成させる酵素はニトリラ−ゼまたはニトリルヒドラ
タ−ゼとして知られており、該酵素を産生する微生物と
して、例えばバチルス属、バクテリジュ−ム属、マイク
ロコカス属及びブレビバクテリウム属（特公昭62-21519
号公報参照）、コリネバクテリウム属及びノカルジア属
（特公昭56-17918号公報参照）、シュ−ドモナス属（特
公昭59-37951号公報参照）及びロドコッカス属、アルス
ロバクタ−属及びミクロバクテリウム属（特開昭61-192
193 号公報参照）、及びロドコッカス。ロドクロウス
（特開平2-470 号公報参照）等の微生物を挙げることが
できる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】遺伝子組換えの方法で
クロ−ン化されたニトリルヒドラタ−ゼ遺伝子によるニ
トリル類の水和では、菌体内に同遺伝子を多コピ−存在
させることができるため、微生物の触媒能力を従来の方
法に比して飛躍的に増大させることが期待できる。
【０００４】この遺伝子組換え方法に関し、ロドコッカ
スsp. N-774株（微工研条寄第1936号）に由来し、ニト
リル類を対応するアミド類に変換する能力、すなわちニ
トリルヒドラタ−ゼ活性を有するポリペプチドをコ−ド
する遺伝子ＤＮＡに係る発明が先に本発明者の一人らに
よって提案されている（特願昭63-202779号) 。本発明
は、さらに芳香族ニトリル類の水和に対しても極めて高
いニトリルヒドラタ−ゼ活性を有するロドコッカス ロ
ドクロウス Ｊ−１株前記特開平2-470 号公報記載から
ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを取り出し、これをベクターに組み込んで
組換え体ＤＮＡとし、さらに微生物に形質転換し形質転
換体を得て、本発明を完成するに至った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、 １. 配列番号１のサブユニットα(H)及び配列番号２の
サブユニットβ(H)のアミノ酸配列を有しニトリルヒド
ラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
ＤＮＡ(H)、 ２. 配列番号３のサブユニットα(L)及び配列番号４の
サブユニットβ(L)のアミノ酸配列を有しニトリルヒド
ラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
ＤＮＡ(L)、 ３．サブユニットα(H)及びサブユニットβ(H)が配列番
号５及び配列番号６のＤＮＡ配列を有するものである上
記１記載の遺伝子ＤＮＡ(H)、 ４. サブユニットα(L)及びサブユニットβ(L)が配列番
号７及び配列番号８のＤＮＡ配列を有する上記２記載の
遺伝子ＤＮＡ(L)、 ５. 上記１〜４記載のＨ遺伝子ＤＮＡ又はＬ遺伝子ＤＮ
Ａをベクターに組み込んだ組換え体ＤＮＡ、 ６. 上記５記載の組換え体ＤＮＡで形質転換された形質
転換体、 ７．上記６記載の形質転換体を培地に培養し、培養物か
らニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とするニ
トリルヒドラターゼの製造法、 ８．上記６記載の形質転換体を培地に培養し、得られる
ニトリルヒドラターゼの作用によりニトリル類を対応す
るアミド類に転換するアミド類の製造法、 ９．上記６記載の形質転換体を培養し、得られる形質転
換体の培養液、分離菌体、菌体処理物又はこれらの固定
化物をニトリル類に作用させ対応するアミド類を製造す
ることを特徴とするアミド類の製造法、に関する。
【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明
は、下記(1) 〜(8) の工程により実施されるものであ
る。 (1) ニトリルヒドラタ−ゼの抽出精製とアミノ酸配列
の部分的決定： 培養集菌したロドコッカス ロドクロウスＪ−１(微工
研条寄第1478号)株からその中に含有される２種類のニ
トリルヒドラタ−ゼ（Ｈ酵素とＬ酵素と呼称する。）を
抽出精製し、それぞれの酵素をさらに高速液体クロマト
グラフィーを用いて各２つのサブユニット（α、β）に
分離する。そして、これらのサブユニットのＮ末端のア
ミノ酸配列の一部を決定する。各アミノ酸配列は配列番
号９〜12に示す通りである。 (2) ニトリルヒドラタ−ゼのＤＮＡプロ−ブの作製： 本発明においては、前記特願昭63-202779号明細書記載の
ロドコッカス sp. N-774株のニトリルヒドラタ−ゼのβ
サブユニットのアミノ酸配列が上記各βサブユニットと
高い相同性を示したことより、同明細書記載の形質転換
体JM105/pYUK121(微工研条寄第1937号）を用いて、ＤＮ
Ａプローブの作製を行った。すなわち、培養集菌したpY
UK121 を含有する形質転換体からpYUK121 を抽出し、そ
の中に含まれるロドコッカス sp.N-774 株由来のニトリ
ルヒドラタ−ゼ遺伝子 (配列番号13) を含むＤＮＡ断片
を制限酵素SphI及びSalIで切断後抽出精製し、これを放
射性同位元素でラベルし、プロ−ブを作製する。 (3) ニトリルヒドラターゼ染色体ＤＮＡを含むＤＮＡ
断片の調製： ロドコッカス ロドクロウス J-1株から染色体ＤＮＡを
分離し、これを制限酵素で切断後、サザンハイブリダイ
ゼーション法〔Southern, E.M., J. Mol. Biol.98, 50
3(1975) 、以下同様〕により目的遺伝子を含有するＤＮ
Ａ断片を上記(2)のプロ−ブを用いて検出する。
【０００７】この工程で、プローブとハイブリダイズす
る鎖長の異なる２種類のＤＮＡ断片が選別される。 (4) 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入： 工程(3) で調製した染色体ＤＮＡ断片をそれぞれベクタ
ーに挿入し、組換え体ＤＮＡのライブラリーを作製す
る。 (5) 形質転換体の作製及び組換え体ＤＮＡの選別： 工程(4) で調製した組換え体ＤＮＡライブラリ−による
形質転換体を作製し、その中から工程(2) で作製したプ
ローブを用いてコロニーハイブリダイゼイション法〔R.
Bruce Wallace,et al., Nuc. Aci. Res.９, 879(1981)
、以下同様〕により目的の組換え体ＤＮＡを含む形質
転換体を選別する。更にサザンハイブリダイゼーション
により、目的組換え体ＤＮＡの再確認を行う。
【０００８】選別された目的のプラスミドを各々 pNHJ1
0H及び pNHJ20Lと称する。 (6) 組換え体ＤＮＡの精製と制限酵素地図の作成： 工程(5) で得られた pNHJ10H及び pNHJ20Lを精製した後
それを用いて制限酵素地図 (図１) を作成し、目的遺伝
子の含まれている箇所を決定する。 (7) 塩基配列の決定： 工程(5) で得られた pNHJ10H及び pNHJ20Lの親株由来の
染色体ＤＮＡ断片から不要部分を制限酵素を用いて除去
し、得られたＤＮＡ断片の全塩基配列 (配列番号14、1
5) を決定し、工程(1) で決定したアミノ酸配列から予
想される塩基配列を含むことを再確認する。 (8) 形質転換体を用いたニトリルヒドラターゼの生産と
ニトリル類のアミド類への変換： 工程(5) で作製した形質転換体を培養し、得られたニト
リルヒドラターゼ酵素を含む菌体をニトリル類を含む基
質溶液と混合し、アミド類を生成させる。
【０００９】なお、ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−
１株は微工研に微工研条寄第1478号(FERM BP-1478)とし
て、及び工程(5) で作製した pNHJ10Hを含有する形質転
換体TG1/pNHJ10H は微工研に微工研条寄第2777号(FERM
BP-2777)としてまた同じく工程(5) で作製したpNHJ20L
を含有する形質転換体TG1/pNHJ20L は微工研に微工研条
寄第2778号(FERM BP-2778)として寄託されている。
【００１０】また、上記工程で用いるベクターとしては
プラスミドベクター (例えば pAT153, pMP9, pHC624, p
KC７等) 、ファージベクター（例えばλgt11 (東洋紡績
社製), Charon ４A(Amersham社製)等)のいずれもが用い
られる。また、上記工程で用いられる制限酵素としては、S
phＩ、SalＩ、EcoRＩ、BamHＩ、SacＩ等であり、これらは
いずれも市販（宝酒造社製）されているものが用いられ
る。また、形質転換に用いる宿主生物としては E.coli
JM105株あるいは E.coliTG1 株が挙げられるが、特にこ
れらに限定されるものではなく、他の宿主生物を用いる
ことができる。
【００１１】形質転換体の培養に用いる培地は通常の培
地が用いられる。ニトリル類のアミドへの変換には、上
記形質転換体の培養により得られるニトリルヒドラター
ゼの他に形質転換体の培養液、分離菌体、菌体処理物、
粗酵素液が用いられる。また、本発明で対象とするニト
リルとしては、例えば、前記特開平2-470 号公報記載の
芳香環を形成する炭素数が４〜10の芳香族ニトリルおよ
び炭素数２〜６の脂肪族ニトリルであり、具体的には、
例えば4-、3-および2-シアノピリジン、ベンゾニトリ
ル、2,6-ジフルオロベンゾニトリル、2-チオフェンカル
ボニトリル、2-フロニトリル、シアノピラジン、アクリ
ロニトリル、メタクリロニトリル、クロトニトリル、ア
セトニトリルおよび3-ヒドロキシプロピオニトリルなど
を挙げることができる。
【００１２】以下、実施例により詳細に説明する。但
し、本発明はこれらの実施例により限定されるものでな
い。なお、実施例において下記の略語を用いた。 TE：Tris-HCl(10mM,pH7.8),EDTA(1mM,pH8.0) TNE:Tris-HCl(50mM,pH8.0),EDTA(1mM,pH8.0),NaCl(50m
M) STE:Tris-HCl(50mM,pH8.0),EDTA(5mM,pH8.0),Sucrose(3
5mM) 2xYT 培地: 1.6%トリプトン、1.0%酵母エキス,0.5%NaCl
【００１３】
【実施例】
(1) ニトリルヒドラタ−ゼの抽出精製とアミノ酸配列
の部分的決定： ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株を培地（酵母エ
キス３g/Ｌ、KH2PO4 0.5 g/ Ｌ、K2HPO40.5 g/Ｌ、MgSO4
・4H2O 0.5 g/Ｌ、CoCl2 0.01g/Ｌ、 クロトンアミド３g/
Ｌ、ｐＨ7.2)に28℃で80時間培養した後、集菌し、この
細胞（50g)を破砕し、硫安分画し、透析後遠心して上清
みをとり、DEAE・セルロファインクロマトグラフィー、
フェニル・セファロースクロマトグラフィー、セファデ
ックスG-150 クロマトグラフィー、オクチル・セファロ
ース・クロマトグラフィーにかけ、２種類の活性画分を
得て、これを透析して酵素液を得た。そして、この酵素
液をそれぞれ高速液体クロマトグラフィーで逆相カラム
(Senshu Pak VP-304-1251)〔（株）センシュウ科学製〕
を用いて二つのサブユニット (α, β) に分離した。こ
のサブユニットのＮ末端からのアミノ酸配列（α1 (H) ,
β1 (H) , α1 (L) , β 1 (L)) をアミノ酸シーケンサー〔ア
プライドバイオシステム社製 470A 〕を用いて決定し
た。
【００１４】このアミノ酸配列の結果は配列番号９〜12
に示す通りである。 (2) ニトリルヒドラタ−ゼのＤＮＡプロ−ブの作製： pYUK121 を含有するE.coli JM105株（微工研条寄第1937
号)を2xYT(50μg/mlアンピシリン含有）培地 100mlで30
℃で一夜 (12時間) 培養後、集菌し、TNEを加え再度集菌
し、STEを８ml、リゾチームを10mg加え、0℃で５分間反応
させ、0.25M EDTA４ml加えて、更に室温で10％ SDS 2m
l、５M NaCl 5mlを加え、０〜４℃で３時間放置した。
それを超遠心し、その上澄みに30％のPEG6000 を1/2 当
量加え、０〜４℃で一夜 (12時間) 放置し、再度遠心し
た後TNE に溶解して7.５mlとし、CsClを加えて遠心して
除蛋白後、臭化エチジウム溶液を３00〜５00mg／ml加え
シールチューブに移し、熱シールし超遠心した。そし
て、ペリスタポンプで cccＤＮＡを取り出し水飽和イソ
プロピルアルコールを等量以上加えて臭化エチジウムを
除き、TEで透析し、精製したプラスミドpYUK121 約３ml
を得た。
【００１５】このpYUK121 を制限酵素 SphＩと SalＩで
切断し、作製したロドコッカス sp.N-774 株由来のニト
リルヒドラタ−ゼ遺伝子を含む2.07kbのＤＮＡ断片を抽
出精製した。そして、このＤＮＡ断片を32Ｐで放射能ラ
ベルし、プロ−ブを作製した。なお、このプローブの塩
基配列は配列番号13に示す通りである。 (3) ニトリルヒドラターゼ染色体ＤＮＡを含むＤＮＡ
断片の調製： ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株を培地 (グルコ
ース10g/Ｌ、KH2PO4 0.5g/Ｌ、K2HPO4 0.5g/Ｌ、MgSO4・
7H2O 0.5g/Ｌ、酵母エキス１g/Ｌ、 ペプトン 7.5g/Ｌ、C
oCl2 0.01g/Ｌ、尿素7.5g/Ｌ、 グリシン１％又はアンピ
シリン 0.2μg/ml、水１Ｌ、 pＨ7.2) 100mlに植菌して
培養後、集菌し、TNEで洗浄後、TE10mlに懸濁し、0.25M
EDTA４ml、リゾチーム10〜20mg、アクロモプロテアー
ゼ10〜20mg及び10×SDS 10mlを加え、37℃で３時間放置
した。次にフェノールを15ml加え、室温で15分間放置
し、遠心し、その上層を採った。そして2.5M酢酸ナトリウ
ム溶液0.7ml、ジエチルエーテルを加え遠心し、その上層
を捨て、下層に２容量のエタノールを加え、棒でＤＮＡ
を巻き取った。これをTE：エタノール（容積比）の２：
８, １：９及び０：10の各溶液に５分間づつひたし、２
〜４mlのTE(37℃) に溶かし、37℃で RNase AとT1の混合
物を10μＬ加えた。次にフェノールを等量加え、遠心後
その上層を採り、エーテルを等量以上加え、また遠心し上
層を捨て、下層をクロロホルムを少量添加した２ＬのTE
で一晩透析した。更に２回目の透析を３〜４時間かけて
行い、粗染色体ＤＮＡ標品約４mlを得た。
【００１６】次に、粗染色体ＤＮＡ標品15μＬに制限酵
素SacＩ 2μＬ、該酵素用緩衝液(10倍濃度) ３μＬ及び
TE 10μＬを加え37℃で１時間反応させた後、アガロー
スゲル電気泳動(60V,3時間) に供した。そして工程(2)
で合成したＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイ
ゼ−ションを行った。その結果約 6.0Kbと 9.4Kbの位置
に上記プローブが強くハイブリダイズするＤＮＡ断片が
あることが見出された。
【００１７】そこで、粗染色体ＤＮＡ標品15μＬを前述
と同様の方法で制限酵素 SacＩで切断した後、アガロー
スゲル電気泳動を行い、 6.0Kbと 9.4KbのＤＮＡ断片を
含むゲルを切り出した。これを、それぞれ３倍容量の８
M NaClO4溶液を加えて可溶化した後、6mm 径のGF/C濾紙
(Whatman製)の上にＤＮＡを吸着させ、次いで６M NaCl
O4含有TE 100μＬを10回、更に95％エタノール 100μＬ
を10回滴下し、 ３分間風乾させた。そして、これを 0.5
mlエッペンドルフのチューブに移しTE 40μＬを添加し、
47 ℃, 30分間放置した後、遠心してその上澄み約40μ
Ｌを分取した。この溶液の中に目的のニトリルヒドラタ
ーゼ染色体ＤＮＡを含む 6.0KbＤＮＡ断片と 9.4KbＤＮ
Ａ断片がそれぞれ回収されたことになる。
【００１８】次の各工程の具体例は 6.0KbＤＮＡ断片の
例を述べるが、 9.4KbＤＮＡ断片の場合も同様である。 (4) 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入： プラスミド pUC19 10μＬに対し、制限酵素SacＩ２μ
Ｌ、該酵素用緩衝液（10倍濃度)3μＬ及びTE10μＬを加
え30℃で１時間反応させ、次に 0.25MEDTA２μＬを添加
して反応をとめ、更に１M Tris-HCl(pＨ９) を７μＬ、
BAP(細菌性アルカリホスファターゼ) ３μＬ加えて65℃
で１時間反応させた。これに TE を加えて全体を 100μ
Ｌとし、等量のフェノールで３回抽出し、これにエーテ
ルを等量加えて、下層を採り、これに3M酢酸ナトリウム溶
液10μＬとエタノール 250μＬを加え、−80℃で30分放
置後遠心し、乾燥してTEに溶解した。
【００１９】この様に SacＩで切断し、BAP 処理した p
UC19５μＬと工程(3) で回収した 6.0KbＤＮＡ断片溶液
40μＬを混合し、連結緩衝液６μＬ、6mg/ml ATP溶液６
μＬ及びＴ4-ＤＮＡリガーゼ３μＬとを加え、４℃で一
夜 (12時間) 反応させることによって目的遺伝子を含有
する 6.0KbＤＮＡ断片を pUC19に挿入した組換え体プラ
スミド約60μＬを作製してＤＮＡライブラリーとした。 (5) 形質転換体の作製及び組換え体ＤＮＡの選別： E.coli TG1株(Amersham社製)を2xYT培地10mlに37℃で植
菌して12時間培養後、それを新規な2xYT培地に１％植菌
し、37℃で 2時間培養した。そして遠心集菌後、冷 50m
M CaCl2 溶液を５ml加え、０℃で40分放置後、再度遠心
して、冷 50mM CaCl2 溶液0.25ml及び工程(4) で調製し
た組換え体プラスミドを含有する溶液60μＬを加え、０
℃で40分放置後、42℃で２分間ヒートショックを与え０
℃で５分放置して、2xYT培地10mlを加え、37℃で90分間
振とう培養した後、遠心集菌した。これに2xYT培地 1ml
添加し菌体を充分懸濁させた後、その懸濁液を10μＬず
つアンピシリン50μg/ml含有2xYT培地寒天２プレートに
分注し、37℃で培養した。そして、プレート上に生育し
た形質転換体コロニーをコロニーハイブリダイゼーショ
ン法にてニトリルヒドラターゼ遺伝子を持つ形質転換体
を選抜した。すなわちプレート中に培養した形質転換体
をニトロセルロースフィルター上に移し、菌体を溶かし
てＤＮＡを固定した後、これを工程(2) 作製のプローブ
で処理し、オートラジオグラフ法で目的の組換え体ＤＮ
Ａを含むコロニーを選択した。更に、この選択したコロ
ニーから組換え体プラスミドを抽出し、サザンハイブリ
ダイゼーションによって上述のプローブとハイブリダイ
ズさせ、選抜したコロニーが目的遺伝子を含む形質転換
体であることを再確認した。 (6) 組換え体プラスミドの精製と制限酵素地図の作
成： 工程(5) で選択した形質転換体を2xYT (50μg/mlアンピ
シリン含有) 培地 100mlに植菌し、37℃で一夜 (12時
間) 培養後、集菌し、TNE を加え再度集菌し、STEを８m
l、リゾチームを10mg加え、0℃で５分間反応させ、0.25
M EDTA４ml加えて、更に室温で10％ SDS 2ml、５M NaCl
5mlを加え、０〜４℃で３時間放置した。それを超遠心
し、その上澄みに30％のPEG6000 を1/2 当量加え、０〜
４℃で一夜(12時間) 放置し、再度遠心した後TNE に溶
解して7.５mlとし、CsClを加えて遠心して除蛋白後、臭
化エチジウム溶液を 300〜500mg/ml加えシールチューブ
に移し、熱シールし超遠心した。そして、ペリスタポン
プで cccＤＮＡを取り出し水飽和イソプロピルアルコー
ルを等量以上加えて臭化エチジウムを除き、TEで透析
し、精製した組換え体プラスミド約３mlを得た。これを
pNHJ10Hと命名した。なお、9.4kb ＤＮＡ断片の場合は
pNHJ20L)と命名した。
【００２０】この組換え体プラスミドを、制限酵素 Eco
RＩ、BamHＩ、PstＩ、SacＩ及び SalＩ等を用いて切断
し、図１に示される制限酵素地図を作製した。 (7) 塩基配列の決定： pNHJ10H の親株由来のＤＮＡ断片のどの部分に目的遺伝
子が位置しているかを工程(6) で作成した制限酵素地図
とサザンハイブリダイゼーションによって決め、不要部
分を制限酵素 PstＩと SalＩ（pNHJ20L の場合は EcoR
ＩとSacＩ）にて切り縮め、6.0Kb の鎖長を1.97Kb（pNH
J20L の場合は9.4Kb を1.73Kb）とした。そしてこの得
られたＤＮＡ断片の全塩基配列をＭ13ファージベクター
を用いたサンガー法 Sanger, F.Science 214, 1205-121
0 (1981) により決定した。その結果、この親株由来の
ＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号14(pNHJ20Lの場合は配
列番号15）に示す通りであった。
【００２１】なお、この塩基配列から予想されるアミノ
酸配列は、工程(1)で決定したアミノ酸配列と完全に一
致することが確認され、このＤＮＡ断片にα，βサブユ
ニット遺伝子の両方が存在することが明らかとなった。 (8) 形質転換体を用いたニトリルヒドラターゼ生産とニ
トリル類のアミド類への変換： TG1/pNHJ10H およびTG1/pNHJ20L 株をそれぞれ2xYT (50
μg/mlアンピシリン含有）培地10mlに接種し30℃で一夜
(12時間) 培養し、この培養物を2xYT(50 μg/mlアンピ
シリン、0.1g/l CoCl2・6H2O含有）培地10mlに１％宛接
種し、30℃で４時間培養し、これに終濃度が１mMとなる
ようにIPTGを添加し、更に30℃で10時間培養した。集菌
後、この菌体を0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.5)５mlに懸濁
し、５分間超音波処理により菌体を破砕後、遠心分離
（12,000G 30分）した。得られた上清液、50mMリン酸カ
ルシウム緩衝液(pH7.5) および６mMベンゾニトリルを含
有する混合液（12ml）を20℃、30分反応後、0.2ml 1MHC
l を添加して反応を止めた。なお、対照試験として、上
記形質転換体に代えて、E.coli TG1株のみを用いて同様
に行った。反応終了後、反応液中の生成ベンズアミドを
高速液体クロマトグラフィーを用いて検出した。その結
果、宿主E.coli TG1株ではベンズアミドが検出できなか
ったが、形質転換体TG1/pNHJ10H およびTG1/pNHJ20L 株
では、それぞれ、1.75×10-3および6.99×10-3 units/m
g の酵素活性が認められた。
【００２２】ここで、unitはベンゾニトリルからベンズ
アミドを１Ｍモル／分の速度で生成させる酵素活性とし
て定義される。
【００２３】
【発明の効果】本発明により、ロドコッカス ロドクロ
ウス Ｊ−１株の持つサブユニットα及びサブユニット
βのアミノ酸配列を有し、ニトリルヒトラターゼ活性を
有する２種類のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が
明らかにされた。そして、このＤＮＡを含むプラスミド
で形質転換された形質転換体が作出された。以上によ
り、このニトリルヒトラターゼ遺伝子を菌体内に多コピ
ー存在させ、菌体内酵素量を従来に比して飛躍的に増大
させることができる。
【００２４】
【配列表】
(1) 配列番号：１ (i) 配列の長さ：203 (ii) 配列の型：アミノ酸 (iii) トポロジー：直鎖状 (iv) 配列の種類：ペプタイド (v) 起源 (a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vi) 配列の特徴
(a) 他の情報：α(H) −サブユニット (vii) 配列： 5 10 15 MetSerGluHisValAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr 20 25 30 LysAlaIleGluThrLeuLeuTyrGluArgGlyLeuIleThrPro 35 40 45 AlaAlaValAspArgValValSerTyrTyrGluAsnGluIleGly 50 55 60 ProMetGlyGlyAlaLysValValAlaLysSerTrpValAspPro 65 70 75 GluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAlaThrAlaAlaMetAla 80 85 90 SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGlnIleSerAlaVal 95 100 105 PheAsnAspSerGlnThrHisHisValValValCysThrLeuCys 110 115 120 SerCysTyrProTrpProValLeuGlyLeuProProAlaTrpTyr 125 130 135 LysSerMetGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGly 140 145 150 ValLeuLysArgAspPheGlyPheAspIleProAspGluValGlu 155 160 165 ValArgValTrpAspSerSerSerGluIleArgTyrIleValIle 170 175 180 ProGluArgProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeu 185 190 195 ThrLysLeuValSerArgAspSerMetIleGlyValSerAsnAla 200 LeuThrProGlnGluValIleVal
【００２５】 (2) 配列番号：２ (i) 配列の長さ：229 (ii) 配列の型：アミノ酸 (iii) トポロジー：直鎖状 (iv) 配列の種類：ペプタイド (v) 起源 (a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vi) 配列の特徴 (a) 他の情報：β(H) −サブユニット (vii) 配列： 5 10 15 MetAspGlyIleHisAspThrGlyGlyMetThrGlyTyrGlyPro 20 25 30 ValProTyrGlnLysAspGluProPhePheHisTyrGluTrpGlu 35 40 45 GlyArgThrLeuSerIleLeuThrTrpMetHisLeuLysGlyIle 50 55 60 SerTrpTrpAspLysSerArgPhePheArgGluSerMetGlyAsn 65 70 75 GluAsnTyrValAsnGluIleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp 80 85 90 LeuSerAlaAlaGluArgIleLeuValAlaAspLysIleIleThr 95 100 105 GluGluGluArgLysHisArgValGlnGluIleLeuGluGlyArg 110 115 120 TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGlnIle 125 130 135 GluLysAlaIleGluArgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeu 140 145 150 ProGlyAlaGluProSerPheSerLeuGlyAspLysIleLysVal 155 160 165 LysSerMetAsnProLeuGlyHisThrArgCysProLysTyrVal 170 175 180 ArgAsnLysIleGlyGluIleValAlaTyrHisGlyCysGlnIle 185 190 195 TyrProGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgPro 200 205 210 LeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnGluLeuTrpGlyAspAsp 215 220 225 GlyAsnGlyLysAspValValCysValAspLeuTrpGluProTyr LeuIleSerAla
【００２６】 (3) 配列番号：３ (i) 配列の長さ：207 (ii) 配列の型：アミノ酸 (iii) トポロジー：直鎖状 (iv) 配列の種類：ペプタイド (v) 起源 (a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vi) 配列の特徴 (a) 他の情報：α(L) −サブユニット (vii) 配列： 5 10 15 MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsn 20 25 30 GluGluIleAlaAlaArgValLysAlaMetGluAlaIleLeuVal 35 40 45 AspLysGlyLeuIleSerThrAspAlaIleAspHisMetSerSer 50 55 60 ValTyrGluAsnGluValGlyProGlnLeuGlyAlaLysIleVal 65 70 75 AlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThr 80 85 90 AspAlaThrSerAlaCysArgGluMetGlyValGlyGlyMetGln 95 100 105 GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn 110 115 120 MetValValCysThrLeuCysSerCysTyrProTrpProValLeu 125 130 135 GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg 140 145 150 AlaValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyTyrThr 155 160 165 ProAspProAspValGluIleArgIleTrpAspSerSerAlaGlu 170 175 180 LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn 185 190 195 PheThrGluGluGlnLeuAlaAspLeuValThrArgAspSerLeu 200 205 IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAla
【００２７】 (4) 配列番号：４ (i) 配列の長さ：226 (ii) 配列の型：アミノ酸 (iii) トポロジー：直鎖状 (iv) 配列の種類：ペプタイド (v) 起源 (a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vi) 配列の特徴 (a) 他の情報：β(L) −サブユニット (vii) 配列： 5 10 15 MetAspGlyIleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyLeuGlyPro 20 25 30 IleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu 35 40 45 ArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaGlyAla 50 55 60 PheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnIleProPro 65 70 75 HisAspTyrLeuThrSerGlnTyrTyrGluHisTrpMetHisAla 80 85 90 MetIleHisHisGlyIleGluAlaGlyIlePheAspSerAspGlu 95 100 105 LeuAspArgArgThrGlnTyrTyrMetAspHisProAspAspThr 110 115 120 ThrProThrArgGlnAspProGlnLeuValGluThrIleSerGln 125 130 135 LeuIleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu 140 145 150 AlaAlaPheAlaValGlyAspLysValIleValArgSerAspAla 155 160 165 SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg 170 175 180 ValGlyGluValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAsp 185 190 195 ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr 200 205 210 ValArgPheSerAlaThrGluLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro 215 220 225 AsnValValAsnHisIleAspValPheGluProTyrLeuLeuPro Ala
【００２８】 (5) 配列番号：５ (i) 配列の長さ：609 (ii) 配列の型：核酸 (iii) 鎖の数：一本鎖 (iv) トポロジー：直鎖状 (v) 配列の種類： GenomicＤＮＡ (iv) 起源 (a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vii) 配列の特徴 (a) 他の情報：α(H) −サブユニット (viii)配列： 15 30 45 GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC 60 75 90 AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC 105 120 135 GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGC 150 165 180 CCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT 195 210 225 GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG 240 255 270 TCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC 285 300 315 TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT 330 345 360 TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC 375 390 405 AAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA 420 435 450 GTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG 465 480 495 GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC 510 525 540 CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG 555 570 585 ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG 600 CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTA
【００２９】 (6) 配列番号：６ (i) 配列の長さ：687 (ii) 配列の型：核酸 (iii) 鎖の数：一本鎖 (iv) トポロジー：直鎖状 (v) 配列の種類： GenomicＤＮＡ (vi) 起源
(a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vii) 配列の特徴 (a) 他の情報：β(H) −サブユニット (viii)配列： 15 30 45 ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCG 60 75 90 GTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG 105 120 135 GGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATA 150 165 180 TCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAAC 195 210 225 GAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG 240 255 270 CTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACC 285 300 315 GAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGAGATCCTTGAGGGTCGG 330 345 360 TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATC 375 390 405 GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT 420 435 450 CCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG 465 480 495 AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG 510 525 540 CGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC 555 570 585 TATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG 600 615 630 CTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC 645 660 675 GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTAC CTGATCTCTGCG
【００３０】 (7) 配列番号：７ (i) 配列の長さ：621 (ii) 配列の型：核酸 (iii) 鎖の数：一本鎖 (iv) トポロジー：直鎖状 (v) 配列の種類： GenomicＤＮＡ (vi) 起源
(a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vii) 配列の特徴 (a) 他の情報：α(L) −サブユニット (viii)配列： 15 30 45 ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC 60 75 90 GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC 105 120 135 GACAAGGGCCTGATCTCCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCG 150 165 180 GTCTACGAGAACGAGGTCGGTCCTCAACTCGGCGCCAAGATCGTC 195 210 225 GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACC 240 255 270 GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAG 285 300 315 GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC 330 345 360 ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC 375 390 405 GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC 420 435 450 GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC 465 480 495 CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAA 510 525 540 CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC 555 570 585 TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC 600 615 ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCC
【００３１】 (8) 配列番号：８ (i) 配列の長さ：678 (ii) 配列の型：核酸 (iii) 鎖の数：一本鎖 (iv) トポロジー：直鎖状 (v) 配列の種類： GenomicＤＮＡ (vi) 起源
(a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vii) 配列の特徴 (a) 他の情報：β(L) −サブユニット (viii)配列： 15 30 45 ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG 60 75 90 ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG 105 120 135 CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG 150 165 180 TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG 195 210 225 CACGACTACCTGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCG 240 255 270 ATGATCCACCACGGCATCGAGGCGGGCATCTTCGATTCCGACGAA 285 300 315 CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG 330 345 360 ACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAA 375 390 405 CTGATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG 420 435 450 GCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAGTCATCGTGCGGTCGGACGCC 465 480 495 TCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCGGTCGT 510 525 540 GTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC 555 570 585 ACCAACGCACTCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAACACCTGTACACC 600 615 630 GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACCTGCCGCCCCG 645 660 675 AACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGCTACCG GCC
【００３２】 (9) 配列番号：９ (i) 配列の長さ：26 (ii) 配列の型：アミノ酸 (iii) トポロジー：直鎖状 (iv) 配列の種類：ペプタイド (v) 起源 (a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vi) 配列の特徴 (a) 他の情報：α(H) −サブユニット：α1 (H) (vii) 配列： 5 10 15 Ser-Glu-His-Val-Asn-Lys-Tyr-Thr-Glu-Tyr-Glu-Ala-Arg-Thr-Lys 20 25 Ala-Ile-Glu-Thr-Leu-Leu-Tyr-Glu-Arg-Gly-Leu
【００３３】 (10) 配列番号：10 (i) 配列の長さ：28 (ii) 配列の型：アミノ酸 (iii) トポロジー：直鎖状 (iv) 配列の種類：ペプタイド (v) 起源
(a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vi) 配列の特徴 (a) 他の情報：β(H) −サブユニット：β1 (H) (vii) 配列： 5 10 15 Met-Asp-Gly-Ile-His-Asp-Thr-Gly-Gly-Met-Thr-Gly-Tyr-Gly-Pro 20 25 Val-Pro-Tyr-Gln-Lys-Asp-Glu-Pro-Phe-Phe-His-Tyr-Glu
【００３４】 (11) 配列番号：11 (i) 配列の長さ：15 (ii) 配列の型：アミノ酸 (iii) トポロジー：直鎖状 (iv) 配列の種類：ペプタイド (v) 起源
(a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vi) 配列の特徴 (a) 他の情報：α(L) −サブユニット：α1 (L) (vii) 配列： 5 10 15 Thr-Ala-His-Asn-Pro-Val-Gln-Gly-Thr-Leu-Pro-Arg-?-Asn-Glu
【００３５】 (12) 配列番号：12 (i) 配列の長さ：19 (ii) 配列の型：アミノ酸 (iii) トポロジー：直鎖状 (iv) 配列の種類：ペプタイド (v) 起源
(a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vi) 配列の特徴 (a) 他の情報：β(L) −サブユニット：β1 (L) (vii) 配列： 5 10 15 Met-Asp-Gly-Ile-His-Asp-Leu-Gly-Gly-Arg-Ala-?-Leu-?-Pro Ile-Lys-Pro-Glu
【００３６】 (13) 配列番号：13 (i) 配列の長さ：2070 (ii) 配列の型：核酸 (iii) 鎖の数：一本鎖 (iv) トポロジー：直鎖状 (v) 配列の種類： GenomicＤＮＡ (vi) 起源 (a) 生物名：ロドコッカス sp (b) 株名：N-774 (FERM BP-1936) (vii) 配列の特徴 No.675〜1295：サブユニットα No.1225 〜1960：サブユニットβ (viii)配列： SphI . . . . GCATGCTTTCCACATCTGGAACGTGATCGCCACGGACGGTGGTG .50 . . . CCTACCAGATGTTGGACGGCAACGGATACGGCATGAACGCCGAAG . .100 . . . GTTTGTACGATCCGGAACTGATGGCACACTTTGCTTCTCGACGCA . .150 . . TTCAGCACGCCGACGCTCTGTCCGAAACCGTCAAACTGGTGGCCC . . .200 . . TGACCGGCCACCACGGCATCACCACCCTCGGCGGCGCGAGCTACG . . .250 . GCAAAGCCCGGAACCTCGTACCGCTTGCCCGCGCCGCCTACGACA . . . .300 . CTGCCTTGAGACAATTCGACGTCCTGGTGATGCCAACGCTGCCCT . . . .350 ACGTCGCATCCGAATTGCCGGCGAAGGACGTAGATCGTGCAACCT . . . . .400 TCATCACCAAGGCTCTCGGGATGATCGCCAACACGGCACCATTCG . . . . ACGTGACCGGACATCCGTCCCTGTCCGTTCCGGCCGGCCTGGTGA .450 . . . . ACGGGGTTCCGGTCGGAATGATGATCACCGGCAGACACTTCGACG .500 . . HindIII ATGCGACAGTCCTTCGTGTCGGACGCGCATTCGAAAAGCTTCGCG . .550 . . . GCCGGTTTCCGACGCCGGCCGAACGCGCCTCCAACTCTGCACCAC . .600 . . AACTCAGCCCCGCCTAGTCCTGACGCACTGTCAGACAACAAATTC . . .650 . . CACCGATTCACACATGATCAGCCCACATAAGAAAAGGTGAACCAG . . .700 . ATGTCAGTAACGATCGACCACACAACGGAGAACGCCGCACCGGCC MetSerValThrIleAspHisThrThrGluAsnAlaAlaProAla . Subunitα . .750 . CAGGCGGCGGTCTCCGACCGGGCGTGGGCACTGTTCCGCGCACTC GlnAlaAlaValSerAspArgAlaTrpAlaLeuPheArgAlaLeu . KpnＩ . .800 GACGGTAAGGGATTGGTACCCGACGGTTACGTCGAGGGATGGAAG AspGlyLysGlyLeuValProAspGlyTyrValGluGlyTrpLys . . . .850 AAGACCTCCGAGGAGGACTTCAGTCCAAGGCGCGGAGCGGAATTG LysThrSerGluGluAspPheSerProArgArgGlyAlaGluLeu . . . PvuII GTAGCGCGCGCATGGACCGACCCCGAGTTCCGGCAGCTGCTTCTC ValAlaArgAlaTrpThrAspProGluPheArgGlnLeuLeuLeu .900 KpnＩ . . . ACCGACGGTACCGCCGCAGTTGCCCAGTACGGATACCTGGGCCCC ThrAspGlyThrAlaAlaValAlaGlnTyrGlyTyrLeuGlyPro .950 . . . CAGGCGGCCTACATCGTGGCAGTCGAAGACACCCCGACACTCAAG GlnAlaAlaTyrIleValAlaValGluAspThrProThrLeuLys . .1000 . . . AACGTGATCGTGTGCTCGCTGTGTTCATGCACCGCGTGGCCCATC AsnValIleValCysSerLeuCysSerCysThrAlaTrpProIle . .1050 . . CTCGGTCTGCCACCCACCTGGTACAAGAGCTTCGAATACCGTGCG LeuGlyLeuProProThrTrpTyrLysSerPheGluTyrArgAla . . .1100 . . CGCGTGGTCCGCGAACCACGGAAGGTTCTCTCCGAGATGGGAACC ArgValValArgGluProArgLysValLeuSerGluMetGlyThr . . .1150 . GAGATCGCGTCGGACATCGAGATTCGCGTCTACGACACCACCGCC GluIleAlaSerAspIleGluIleArgValTyrAspThrThrAla . . . .1200 . GAAACTCGCTACATGGTCCTCCCGCAGCGTCCCGCCGGCACCGAA GluThrArgTyrMetValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGlu . . PstＩ . .1250 GGCTGGAGCCAGGAACAACTGCAGGAAATCGTCACCAAGGACTGC GlyTrpSerGlnGluGlnLeuGlnGluIleValThrLysAspCys . . . . .1300 CTGATCGGGGTTGCAATCCCGCAGGTTCCCACCGTCTGATCACCC LeuIleGlyValAlaIleProGlnValProThrValTRM . . . . CGACAAGAAGGAAGCACACC-ATGGATGGAGTACACGATCTTGCC MetAspGlyValHisAspLeuAla Subunitβ .1350 . . . . GGAGTACAAGGCTTCGGCAAAGTCCCGCATACCGTCAACGCCGAC GlyValGlnGlyPheGlyLysValProHisThrValAsnAlaAsp .1400 . . . ATCGGCCCCACCTTTCACGCCGAATGGGAACACCTGCCCTACAGC IleGlyProThrPheHisAlaGluTrpGluHisLeuProTyrSer . .1450 . . SalＩ CTGATGTTCGCCGGTGTCGCCGAACTCGGGGCCTTCAGCGTCGAC LeuMetPheAlaGlyValAlaGluLeuGlyAlaPheSerValAsp . .1500 . . GAAGTGCGATACGTCGTCGAGCGGATGGAGCCGGGCCACTACATG GluValArgTyrValValGluArgMetGluProGlyHisTyrMet . . .1550 . . ATGACCCCGTACTACGAGAGGTACGTCATCGGTGTCGCGACATTG MetThrProTyrTyrGluArgTyrValIleGlyValAlaThrLeu . . .1600 . ATGGTCGAAAAGGGAATCCTGACGCAGGACGAACTCGAAAGCCTT MetValGluLysGlyIleLeuThrGlnAspGluLeuGluSerLeu . . . .1650 . GCGGGGGGACCGTTCCCACTGTCACGGCCCAGCGAATCCGAAGGG AlaGlyGlyProPheProLeuSerArgProSerGluSerGluGly . . . .1700 CGGCCGGCACCCGTCGAGACGACCACCTTCGAAGTCGGGCAGCGA ArgProAlaProValGluThrThrThrPheGluValGlyGlnArg . . . . .1750 GTACGCGTACGCGACGAGTACGTTCCGGGGCATATTCGAATGCCT ValArgValArgAspGluTyrValProGlyHisIleArgMetPro . . . . GCATACTGCCGTGGACGAGTGGGAACCATCTCTCATCGAACTACC AlaTyrCysArgGlyArgValGlyThrIleSerHisArgThrThr .1800 . . . . GAGAAGTGGCCGTTTCCCGACGCAATCGGCCACGGGCGCAACGAC GluLysTrpProPheProAspAlaIleGlyHisGlyArgAsnAsp .1850 . . . GCCGGCGAAGAACCGACGTACCACGTGAAGTTCGCCGCCGAGGAA AlaGlyGluGluProThrTyrHisValLysPheAlaAlaGluGlu . .1900 . . SalＩ TTGTTCGGTAGCGACACCGACGGTGGAAGCGTCGTTGTCGACCTC LeuPheGlySerAspThrAspGlyGlySerValValValAspLeu . .1950 . . TTCGAGGGTTACCTCGAGCCTGCGGCCTGATCTTCCAGCATTCCA PheGluGlyTyrLeuGluProAlaAlaTRM . . .2000 . . GGCGGCGGTCACGCGATCACAGCGGTTCGTGCGACCGCCGCCTGA . . .2050 . TCACCACGATTCACTCATTCGGAAGGACACTGGAAATCATGGTCG SalＩ
【００３７】 (14) 配列番号：14 (i) 配列の長さ：1970 (ii) 配列の型：核酸 (iii) 鎖の数：一本鎖 (iv) トポロジー：直鎖状 (v) 配列の種類： GenomicＤＮＡ (vi) 起源 (a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM BP-1478) (vii) 配列の特徴 No.408〜1094：サブユニットβ(H) No.1111 〜1719：サブユニットα(H) (viii)配列： 10 20 30 40 50 60CT GCAGCTCGAACATCGAAGGGTGCGAGCCGAGAGATCGGAGACGCAGACACCCGGAGGG 70 80 90 100 110 120 AACTTAGCCTCCCGGACCGATGCGTGTCCTGGCAACGCCTCAAAATTCAGTGCAAGCGAT 130 140 150 160 170 180 TCAATCTTGTTACTTCCAGAACCGAATCACGTCCCCGTAGTGTGCGGGGAGAGCGCCCGA 190 200 210 220 230 240 ACGCAGGGATGGTATCCATGCGCCCCTTCTCTTTTCGAACGAGAACCGGCCGGTACAGCC 250 260 270 280 290 300 GACCCGGAGACACTGTGACGCCGTTCAACGATTGTTGTGCTGTGAAGGATTCACCCAAGC 310 320 330 340 350 360 CAACTGATATCGCCATTCCGTTGCCGGAACATTTGACACCTTCTCCCTACGAGTAGAAGC 370 380 390 400 410 420 CAGCTGGACCCCTCTTTGAGCCCAGCTCCGATGAAAGGAATGAGGAAATGGATGGTATCC MetAspGlyIleH Subunit β(H) 430 440 450 460 470 480 ACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCGGTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCT isAspThrGlyGlyMetThrGlyTyrGlyProValProTyrGlnLysAspGluProPheP 490 500 510 520 530 540 TCCACTACGAGTGGGAGGGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCA heHisTyrGluTrpGluGlyArgThrLeuSerIleLeuThrTrpMetHisLeuLysGlyI 550 560 570 580 590 600 TATCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAACGAAAACTACGTCA leSerTrpTrpAspLysSerArgPhePheArgGluSerMetGlyAsnGluAsnTyrValA 610 620 630 640 650 660 ACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGGCTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCG snGluIleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrpLeuSerAlaAlaGluArgIleLeuValA 670 680 690 700 710 720 CCGACAAGATCATCACCGAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGAGATCCTTGAGGGTC laAspLysIleIleThrGluGluGluArgLysHisArgValGlnGluIleLeuGluGlyA 730 740 750 760 770 780 GGTACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATCGAGAAGGCGATCG rgTyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGlnIleGluLysAlaIleG 790 800 810 820 830 840 AACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTTCCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCG luArgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeuProGlyAlaGluProSerPheSerLeuG 850 860 870 880 890 900 GTGACAAGATCAAAGTGAAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATG lyAspLysIleLysValLysSerMetAsnProLeuGlyHisThrArgCysProLysTyrV 910 920 930 940 950 960 TGCGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATCTATCCCGAGAGCA alArgAsnLysIleGlyGluIleValAlaTyrHisGlyCysGlnIleTyrProGluSerS 970 980 990 1000 1010 1020 GCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCGCTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGG erSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgProLeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnG 1030 1040 1050 1060 1070 1080 AACTGTGGGGCGACGACGGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGT luLeuTrpGlyAspAspGlyAsnGlyLysAspValValCysValAspLeuTrpGluProT 1090 1100 1110 1120 1130 1140 ACCTGATCTCTGCGTGAAAGGAATACGATAGTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAG yrLeuIleSerAla MetSerGluHisValAsnLysTyrThrGlu Subunit α(H) 1150 1160 1170 1180 1190 1200 TACGAGGCACGTACCAAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC TyrGluAlaArgThrLysAlaIleGluThrLeuLeuTyrGluArgGlyLeuIleThrPro 1210 1220 11230 1240 1250 1260 GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGCCCGATGGGCGGTGCC AlaAlaValAspArgValValSerTyrTyrGluAsnGluIleGlyProMetGlyGlyAla 1270 1280 1290 1300 1310 1320 AAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCTGAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCG LysValValAlaLysSerTrpValAspProGluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAla 1330 1340 1350 1360 1370 1380 ACGGCCGCGATGGCGTCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC ThrAlaAlaMetAlaSerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGlnIleSerAlaVal 1390 1400 1410 1420 1430 1440 TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGTTCGTGCTATCCGTGG PheAsnAspSerGlnThrHisHisValValValCysThrLeuCysSerCysTyrProTrp 1450 1460 1470 1480 1490 1500 CCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTACAAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTA ProValLeuGlyLeuProProAlaTrpTyrLysSerMetGluTyrArgSerArgValVal 1510 1520 1530 1540 1550 1560 GCGGACCCTCGTGGAGTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG AlaAspProArgGlyValLeuLysArgAspPheGlyPheAspIleProAspGluValGlu 1570 1580 1590 1600 1610 1620 GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATCCCGGAACGGCCGGCC ValArgValTrpAspSerSerSerGluIleArgTyrIleValIleProGluArgProAla 1630 1640 1650 1660 1670 1680 GGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTGACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATC GlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeuThrLysLeuValSerArgAspSerMetIle 1690 1700 1710 1720 1730 1740 GGTGTCAGTAATGCGCTCACACCGCAGGAAGTGATCGTATGAGTGAAGACACACTCACTG GlyValSerAsnAlaLeuThrProGlnGluValIleVal 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ATCGGCTCCCGGCGACTGGGACCGCCGCACCGCCCCGCGACAATGGCGAGCTTGTATTCA 1810 1820 1830 1840 1850 1860 CCGAGCCTTGGGAAGCAACGGCATTCGGGGTCGCCATCGCGCTTTCGGATCAGAAGTCGT 1870 1880 1890 1900 1910 1920 ACGAATGGGAGTTCTTCCGACAGCGTCTCATTCACTCCATCGCTGAGGCCAACGGTTGCG 1930 1940 1950 1960 1970 AGGCATACTACGAGAGCTGGACAAAGGCGCTCGAGGCCAGCGTGGTCGAC
【００３８】 (15) 配列番号：15 (i) 配列の長さ：1731 (ii) 配列の型：核酸 (iii) 鎖の数：一本鎖 (iv) トポロジー：直鎖状 (v) 配列の種類： GenomicＤＮＡ (vi) 起源 (a) 生物名：ロドコッカス・ロドクロウス (b) 株名：J-1 (FERM・BP) (vii) 配列の特徴 No.171〜848 ：サブユニットβ(L) No.915〜1535：サブユニットα(L) (viii)配列： 10 20 30 40 50 60 GAGCTCCCTGGAGCCACTCGCGCCGACGCATCCACGCTCGGACAGCCCACGGTGCGGATC 70 80 90 100 110 120 ACCCCTGTTCGTCGGTAACAGAACAGTAACATGTCATCAGGTCATGACGTGTTGACGCAT 130 140 150 160 170 180 TAGACGAGGGCACATAGGGTTGGTGACTCACGGCACAAGGAGAGCATTTCATGGATGGAA MetAspGlyI Subunit β(L) 190 200 210 220 230 240 TCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCGATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTG leHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyLeuGlyProIleLysProGluSerAspGluProV 250 260 270 280 290 300 TTTTCCATTCCGATTGGGAGCGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCG alPheHisSerAspTrpGluArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaG 310 320 330 340 350 360 GCGCGTTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCGCACGACTACC lyAlaPheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnIleProProHisAspTyrL 370 380 390 400 410 420 TGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCGATGATCCACCACGGCATCGAGGCGG euThrSerGlnTyrTyrGluHisTrpMetHisAlaMetIleHisHisGlyIleGluAlaG 430 440 450 460 470 480 GCATCTTCGATTCCGACGAACTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACG lyIlePheAspSerAspGluLeuAspArgArgThrGlnTyrTyrMetAspHisProAspA 490 500 510 520 530 540 ACACGACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAACTGATCACCC spThrThrProThrArgGlnAspProGlnLeuValGluThrIleSerGlnLeuIleThrH 550 560 570 580 590 600 ACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAGGCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAG isGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGluAlaAlaPheAlaValGlyAspLysV 610 620 630 640 650 660 TCATCGTGCGGTCGGACGCCTCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCG alIleValArgSerAspAlaSerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgG 670 680 690 700 710 720 GTCGTGTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGACACCAACGCAC lyArgValGlyGluValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAspThrAsnAlaL 730 740 750 760 770 780 TCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAACACCTGTACACCGTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGT euGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThrValArgPheSerAlaThrGluLeuT 790 800 810 820 830 840 GGGGTGAACCTGCCGCCCCGAACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGC rpGlyGluProAlaAlaProAsnValValAsnHisIleAspValPheGluProTyrLeuL 850 860 870 880 890 900 TACCGGCCTGACCAGGTCATCCGGTCCACCCAGCGAGACGTCCCTTCACCACAGACAGAA euProAla 910 920 930 940 950 960 ACGAGCCCACCCCGATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAACG MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsnG Subunit α(L) 970 980 990 1000 1010 1020 AGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTCGACAAGGGCCTGATCT luGluIleAlaAlaArgValLysAlaMetGluAlaIleLeuValAspLysGlyLeuIleS 1030 1040 1050 1060 1070 1080 CCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCGGTCTACGAGAACGAGGTCGGTCCTCAACTCG erThrAspAlaIleAspHisMetSerSerValTyrGluAsnGluValGlyProGlnLeuG 1090 1100 1110 1120 1130 1140 GCGCCAAGATCGTCGCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACCG lyAlaLysIleValAlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThrA 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAGGGCGAAGAAATGGTCG spAlaThrSerAlaCysArgGluMetGlyValGlyGlyMetGlnGlyGluGluMetValV 1210 1220 1230 1240 1250 1260 TGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAACATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATC alLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsnMetValValCysThrLeuCysSerCysTyrP 1270 1280 1290 1300 1310 1320 CGTGGCCGGTTCTCGGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGCG roTrpProValLeuGlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArgA 1330 1340 1350 1360 1370 1380 CTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACCCCCGACCCTGACGTCG laValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyTyrThrProAspProAspValG 1390 1400 1410 1420 1430 1440 AGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAACTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAG luIleArgIleTrpAspSerSerAlaGluLeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProA 1450 1460 1470 1480 1490 1500 CCGGCACCGAGAACTTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTCA laGlyThrGluAsnPheThrGluGluGlnLeuAlaAspLeuValThrArgAspSerLeuI 1510 1520 1530 1540 1550 1560 TCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCCTGACATGCCCCGACTCAACGAACAA leGlyValSerValProThrThrProSerLysAla 1570 1580 1590 1600 1610 1620 CCCCACCCGGGTCTCGAAGCCAACCTCGGCGACCTGGTACAGAATCTGCCGTTCAACGAA 1630 1640 1650 1660 1670 1680 CGAATCCCCCGCCGCTCCGGCGAGGTCGCCTTCGATCAGGCCTGGGAGATCCGCGCCTTC 1690 1700 1710 1720 1730 AGCATTGCCACCGCATTGCATGGCCAGGGCCGATTCGAATGGGACGAATTC
【図面の簡単な説明】
【図１】組換え体プラスミドpNHJ10H 及び pNHJ20Lの制
限酵素地図。
フロントページの続き (72)発明者 山田 秀明 京都府京都市左京区松ヶ崎木ノ本町19番 地の１ (72)発明者 西山 真 東京都新宿区西落合二丁目16番11号 (72)発明者 長沢 透 京都府京都市左京区高野東開町１−７ (72)発明者 堀之内 末治 千葉県千葉市弥生町１−170 (56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，181 （３），ｐｐ．563−570（1989) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，155（２）ｐｐ. 1008−1016（1988)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１のサブユニットα(H)及び配
    列番号２のサブユニットβ(H)のアミノ酸配列を有しニ
    トリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコード
    する遺伝子ＤＮＡ(H)。
  2. 【請求項２】 配列番号３のサブユニットα(L)及び配
    列番号４のサブユニットβ(L)のアミノ酸配列を有しニ
    トリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコード
    する遺伝子ＤＮＡ(L)。
  3. 【請求項３】 サブユニットα(H)及びサブユニットβ
    (H)が配列番号５及び配列番号６のＤＮＡ配列を有する
    ものである請求項１記載の遺伝子ＤＮＡ(H)。
  4. 【請求項４】 サブユニットα(L)及びサブユニットβ
    (L)が配列番号７及び配列番号８のＤＮＡ配列を有する
    請求項２記載の遺伝子ＤＮＡ(L)。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４記載のＨ遺伝子ＤＮＡ又は
    Ｌ遺伝子ＤＮＡをベクターに組み込んだ組換え体ＤＮ
    Ａ。
  6. 【請求項６】 請求項５記載の組換え体ＤＮＡで形質転
    換された形質転換体。
  7. 【請求項７】 請求項６記載の形質転換体を倍地に培養
    し、培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを
    特徴とするニトリルヒドラターゼの製造法。
  8. 【請求項８】 請求項６記載の形質転換体を培地に培養
    し、得られるニトリルヒドラターゼの作用によりニトリ
    ル類を対応するアミド類に転換するアミド類の製造法。
  9. 【請求項９】 請求項６記載の形質転換体を培養し、得
    られる形質転換体の培養液、分離菌体、菌体処理物又は
    これらの固定化物をニトリル類に作用させ対応するアミ
    ド類を製造することを特徴とするアミド類の製造法。
JP03323691A 1990-02-28 1991-02-27 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体 Expired - Lifetime JP3162091B2 (ja)

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