JP3157622B2 - フルクトシルアミンデグリカーゼ、その製造法及び該酵素を用いたアマドリ化合物の定量方法 - Google Patents
フルクトシルアミンデグリカーゼ、その製造法及び該酵素を用いたアマドリ化合物の定量方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規酵素フルクトシル
アミンデグリカーゼとその製造法及び該酵素を使用する
試料中のアマドリ化合物の定量方法に関する。
アミンデグリカーゼとその製造法及び該酵素を使用する
試料中のアマドリ化合物の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】本発明
でいうアマドリ化合物とは、還元糖であるアルドースと
アミノ基をもった化合物とが非酵素的に反応し、アマド
リ転移を経て形成される化合物をいう。例えば、醤油，
味噌等の、糖とアミノ酸，タンパク質を多量に含んだ物
質では、発酵時間，保存時間等に応じてアミノ酸は糖化
されてアマドリ化合物として生産され、食品の褐変や香
気成分の変化に重要な役割を示すことが知られている。
生体中においてもグルコースとアミノ基が結合したアマ
ドリ化合物であるフルクトシルアミン化合物が生成され
ており、例えば血液中のヘモグロビンがグルコース糖化
されたフルクトシルアミン化合物はグリコヘモグロビ
ン、また血清中に存在するアルブミンがグルコースと反
応して生成したフルクトシルアミン化合物はフルクトサ
ミンと呼ばれ、それぞれ臨床的に糖尿病の平均的な血糖
値を示す指標として生理的意義が指示され、糖尿病診断
のために盛んに測定されている。
でいうアマドリ化合物とは、還元糖であるアルドースと
アミノ基をもった化合物とが非酵素的に反応し、アマド
リ転移を経て形成される化合物をいう。例えば、醤油，
味噌等の、糖とアミノ酸，タンパク質を多量に含んだ物
質では、発酵時間，保存時間等に応じてアミノ酸は糖化
されてアマドリ化合物として生産され、食品の褐変や香
気成分の変化に重要な役割を示すことが知られている。
生体中においてもグルコースとアミノ基が結合したアマ
ドリ化合物であるフルクトシルアミン化合物が生成され
ており、例えば血液中のヘモグロビンがグルコース糖化
されたフルクトシルアミン化合物はグリコヘモグロビ
ン、また血清中に存在するアルブミンがグルコースと反
応して生成したフルクトシルアミン化合物はフルクトサ
ミンと呼ばれ、それぞれ臨床的に糖尿病の平均的な血糖
値を示す指標として生理的意義が指示され、糖尿病診断
のために盛んに測定されている。
【０００３】グリコヘモグロビンについては高速液体ク
ロマトグラフィーを利用した測定方法（Chromatogr.Sc
i.,第10巻, 659(1979))があるが、操作能率や精度の点
で問題があり、また高価な機器を必要とするなどの欠点
が多い。また、フルクトサミン測定方法として近年広く
用いられているフルクトシルアミン化合物がアルカリ性
条件下において示す還元性を利用して色素発色により測
定する方法(Clin. Chem.Acta., 第127 巻, 87(1983))
があるが、その反応の特異性に問題があり、また色素が
測定中にセルを汚染するといった問題もある。そのた
め、新しい測定方法が求められている。
ロマトグラフィーを利用した測定方法（Chromatogr.Sc
i.,第10巻, 659(1979))があるが、操作能率や精度の点
で問題があり、また高価な機器を必要とするなどの欠点
が多い。また、フルクトサミン測定方法として近年広く
用いられているフルクトシルアミン化合物がアルカリ性
条件下において示す還元性を利用して色素発色により測
定する方法(Clin. Chem.Acta., 第127 巻, 87(1983))
があるが、その反応の特異性に問題があり、また色素が
測定中にセルを汚染するといった問題もある。そのた
め、新しい測定方法が求められている。
【０００４】従来のアマドリ化合物分解酵素としては、
コリネバクテリウム属に属する微生物が生産するフルク
トシルアミノ酸オキシターゼ（特開昭６１−２６８１７
８），アスペルギルス属に属する微生物が生産するフル
クトシルアミンオキシターゼ（特開平３−１５５７８
０）、さらにはペニシリウム属に属する微生物が生産す
るフルクトシルアミノ酸分解酵素（特開平４−４８７
４）等が知られている。しかし、食品や生体中のフルク
トシルアミン化合物を定量するためには、アミノ酸のα
位のアミノ基と反応して生成するアマドリ化合物に対し
てのみならず、特にε位のアミノ基と反応し生成するア
マドリ化合物に対して極めて良く作用する酵素が重要で
ある。しかるに、既知の酵素では反応性が弱く、微量の
アマドリ化合物を定量することは困難であった。
コリネバクテリウム属に属する微生物が生産するフルク
トシルアミノ酸オキシターゼ（特開昭６１−２６８１７
８），アスペルギルス属に属する微生物が生産するフル
クトシルアミンオキシターゼ（特開平３−１５５７８
０）、さらにはペニシリウム属に属する微生物が生産す
るフルクトシルアミノ酸分解酵素（特開平４−４８７
４）等が知られている。しかし、食品や生体中のフルク
トシルアミン化合物を定量するためには、アミノ酸のα
位のアミノ基と反応して生成するアマドリ化合物に対し
てのみならず、特にε位のアミノ基と反応し生成するア
マドリ化合物に対して極めて良く作用する酵素が重要で
ある。しかるに、既知の酵素では反応性が弱く、微量の
アマドリ化合物を定量することは困難であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらア
マドリ化合物を酵素を用いて定量する方法を開発すべ
く、鋭意検討してきた。本発明者等は、広く自然界微生
物中に、アマドリ化合物を分解する活性のある酵素を検
索した結果、カンジダ属に属する微生物中にアミノ酸の
α位のみならず、特にε位のアミノ基と反応し生成した
アマドリ化合物に対しても極めて良く作用する酵素を生
産する菌株があることを見出し、この知見に基づいて本
発明を完成させた。以下に本発明を具体的に説明する。
マドリ化合物を酵素を用いて定量する方法を開発すべ
く、鋭意検討してきた。本発明者等は、広く自然界微生
物中に、アマドリ化合物を分解する活性のある酵素を検
索した結果、カンジダ属に属する微生物中にアミノ酸の
α位のみならず、特にε位のアミノ基と反応し生成した
アマドリ化合物に対しても極めて良く作用する酵素を生
産する菌株があることを見出し、この知見に基づいて本
発明を完成させた。以下に本発明を具体的に説明する。
【０００６】本発明は、第１に下記の理化学的性質を有
するフルクトシルアミンデグリカーゼに関する。 （ａ）作用及び基質特異性 本酵素は、アマドリ化合物に作用し、特にそのε−アミ
ノ酸誘導体に良好に作用して該化合物を酸化し、α−ケ
トアルデヒド，アミン誘導体及び過酸化水素を生成する
反応を触媒する。 （ｂ）至適ｐＨ及びｐＨ安定性 本酵素は、ジフルクトシルリジン(di-Fructosyl-lysin
e) を基質とした場合にｐＨ5.０〜8.０において安定で
あり、また至適ｐＨは、7.０〜8.０（燐酸緩衝液）であ
る。 （ｃ）反応温度の範囲 反応温度は、１５〜４５℃の範囲である。 （ｄ）熱安定性 本酵素は、４０℃、１０分間の加熱処理に対して安定で
ある。また、５０℃で１０分間加熱処理した場合、８０
％以上が失活する。 （ｅ）分子量 トーヨーパール ＨＷ−５５Ｆカラムを用いたゲル濾過
法で測定した分子量は約４３０００である。
するフルクトシルアミンデグリカーゼに関する。 （ａ）作用及び基質特異性 本酵素は、アマドリ化合物に作用し、特にそのε−アミ
ノ酸誘導体に良好に作用して該化合物を酸化し、α−ケ
トアルデヒド，アミン誘導体及び過酸化水素を生成する
反応を触媒する。 （ｂ）至適ｐＨ及びｐＨ安定性 本酵素は、ジフルクトシルリジン(di-Fructosyl-lysin
e) を基質とした場合にｐＨ5.０〜8.０において安定で
あり、また至適ｐＨは、7.０〜8.０（燐酸緩衝液）であ
る。 （ｃ）反応温度の範囲 反応温度は、１５〜４５℃の範囲である。 （ｄ）熱安定性 本酵素は、４０℃、１０分間の加熱処理に対して安定で
ある。また、５０℃で１０分間加熱処理した場合、８０
％以上が失活する。 （ｅ）分子量 トーヨーパール ＨＷ−５５Ｆカラムを用いたゲル濾過
法で測定した分子量は約４３０００である。
【０００７】第２は、カンジダ属に属し請求項１記載の
フルクトシルアミンデグリカーゼ生産能を有する微生物
を培地に培養し、培養物より該フルクトシルアミンデグ
リカーゼを採取することを特徴とするフルクトシルアミ
ンデグリカーゼの製造法に関する。
フルクトシルアミンデグリカーゼ生産能を有する微生物
を培地に培養し、培養物より該フルクトシルアミンデグ
リカーゼを採取することを特徴とするフルクトシルアミ
ンデグリカーゼの製造法に関する。
【０００８】さらに、本発明は第３に、アマドリ化合物
を含有する試料に前記のフルクトシルアミンデグリカー
ゼを作用させ、酸化反応に伴い生成する過酸化水素量、
もしくは消費される酸素量を測定し、該測定値からアマ
ドリ化合物量を求めることを特徴とするアマドリ化合物
の定量法に関する。
を含有する試料に前記のフルクトシルアミンデグリカー
ゼを作用させ、酸化反応に伴い生成する過酸化水素量、
もしくは消費される酸素量を測定し、該測定値からアマ
ドリ化合物量を求めることを特徴とするアマドリ化合物
の定量法に関する。
【０００９】本発明のフルクトシルアミンデグリカーゼ
の理化学的性質は下記の通りである。 （１）力価の測定方法 本酵素作用によって生成する過酸化水素水を発色定量す
る方法 方法１ 0.３ｍＭ ４−アミノアンチピリン及び0.５ｍＭ ＴＯ
ＯＳ、2.０単位／ｍｌのパーオキシダーゼを含有する0.
０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）0.４ｍｌに１ｍＭ ジフ
ルクトシルリジン（0.０５Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ7.０に溶
解）0.１ｍｌを加え、３７℃にて温度平衡にする。これ
に、適当な活性を保有する酵素液0.０６ｍｌを加え、分
光光度計（日立製作所製Ｕ−２０００）により、その吸
光値変化を測定した。予め過酸化水素の標準溶液を用い
て作成した吸光値変化と過酸化水素の量との関係を示す
検量線から、生成した過酸化水素量を求めた。また、３
７℃、１分間当たり１マイクロモルの過酸化水素を生成
する酵素量を１活性単位とした。
の理化学的性質は下記の通りである。 （１）力価の測定方法 本酵素作用によって生成する過酸化水素水を発色定量す
る方法 方法１ 0.３ｍＭ ４−アミノアンチピリン及び0.５ｍＭ ＴＯ
ＯＳ、2.０単位／ｍｌのパーオキシダーゼを含有する0.
０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）0.４ｍｌに１ｍＭ ジフ
ルクトシルリジン（0.０５Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ7.０に溶
解）0.１ｍｌを加え、３７℃にて温度平衡にする。これ
に、適当な活性を保有する酵素液0.０６ｍｌを加え、分
光光度計（日立製作所製Ｕ−２０００）により、その吸
光値変化を測定した。予め過酸化水素の標準溶液を用い
て作成した吸光値変化と過酸化水素の量との関係を示す
検量線から、生成した過酸化水素量を求めた。また、３
７℃、１分間当たり１マイクロモルの過酸化水素を生成
する酵素量を１活性単位とした。
【００１０】方法２ １ｍＭ ジフルクトシルリジン（0.０５Ｍ燐酸緩衝液ｐ
Ｈ7.０に溶解）0.２ｍｌを３７℃にて温度平衡にする。
これに、適当な活性を保有する酵素液0.１２ｍｌを加
え、３７℃にて適当な時間反応させ１００℃湯浴中で反
応を停止させる。これに0.３ｍＭ ４−アミノアンチピ
リン及び0.５ｍＭ ＴＯＯＳ、2.０単位／ｍｌのパーオ
キシダーゼを含有する0.０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）
0.８ｍｌを加え、分光光度計（日立製作所製Ｕ−２００
０）により、その吸光値変化を測定した。標準液を用い
て作成した該吸光値変化と過酸化水素の量との関係を示
す検量線から、生成した過酸化水素量を求めた。また、
３７℃、１分間当たり１マイクロモルの過酸化水素を生
成する酵素量を１活性単位とした。
Ｈ7.０に溶解）0.２ｍｌを３７℃にて温度平衡にする。
これに、適当な活性を保有する酵素液0.１２ｍｌを加
え、３７℃にて適当な時間反応させ１００℃湯浴中で反
応を停止させる。これに0.３ｍＭ ４−アミノアンチピ
リン及び0.５ｍＭ ＴＯＯＳ、2.０単位／ｍｌのパーオ
キシダーゼを含有する0.０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）
0.８ｍｌを加え、分光光度計（日立製作所製Ｕ−２００
０）により、その吸光値変化を測定した。標準液を用い
て作成した該吸光値変化と過酸化水素の量との関係を示
す検量線から、生成した過酸化水素量を求めた。また、
３７℃、１分間当たり１マイクロモルの過酸化水素を生
成する酵素量を１活性単位とした。
【００１１】（２）作用および基質特異性 本酵素は、α−アミノ酸，β−アミノ酸，ε−アミノ
酸，Ｄ−アミノ酸及びアミンのアマドリ化合物を分解
し、グルコソン，過酸化水素水及び対応するアミノ酸や
アミンを生成する反応を触媒する。本酵素の主なアマド
リ化合物への基質特異性は第１表に示した通りである。
本酵素はα−アミノ酸のアマドリ化合物を分解するだけ
でなく、アミノ酸のα位以外のアミノ基にフルクトース
の結合したアマドリ化合物（例えば、ジ−Ｄ−フルクト
シルリジン，ε−Ｄ−フルクトシル−Ｌ−リジン）に対
しても良好に作用する。
酸，Ｄ−アミノ酸及びアミンのアマドリ化合物を分解
し、グルコソン，過酸化水素水及び対応するアミノ酸や
アミンを生成する反応を触媒する。本酵素の主なアマド
リ化合物への基質特異性は第１表に示した通りである。
本酵素はα−アミノ酸のアマドリ化合物を分解するだけ
でなく、アミノ酸のα位以外のアミノ基にフルクトース
の結合したアマドリ化合物（例えば、ジ−Ｄ−フルクト
シルリジン，ε−Ｄ−フルクトシル−Ｌ−リジン）に対
しても良好に作用する。
【００１２】従来知られているフルクトシルアミン化合
物分解酵素であるコリネバクテリウム属に属する微生物
が生産するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開昭
６１−２６８１７８）は、ε位のアマドリ化合物には作
用しない。また、アスペルギルス属に属する微生物が生
産するフルクトシルアミンオキシダーゼ（特開平３−１
５５７８０）は、ε位のアマドリ化合物に作用すると明
細書に記載されているが、α位のＤ−フルクトシルグリ
シンに比べ、その活性は低い。同様に、ペニシリウム属
に属する微生物が生産するフルクトシルアミノ酸分解酵
素（特開平４−４８７４）も本願発明の酵素に比較して
著しく活性が低い。
物分解酵素であるコリネバクテリウム属に属する微生物
が生産するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開昭
６１−２６８１７８）は、ε位のアマドリ化合物には作
用しない。また、アスペルギルス属に属する微生物が生
産するフルクトシルアミンオキシダーゼ（特開平３−１
５５７８０）は、ε位のアマドリ化合物に作用すると明
細書に記載されているが、α位のＤ−フルクトシルグリ
シンに比べ、その活性は低い。同様に、ペニシリウム属
に属する微生物が生産するフルクトシルアミノ酸分解酵
素（特開平４−４８７４）も本願発明の酵素に比較して
著しく活性が低い。
【００１３】しかるに、本願発明の酵素はアミノ酸のα
位以外のアミノ基にフルクトースの結合したアマドリ化
合物（例えば、ジ−Ｄ−フルクトシルリジン，ε−Ｄ−
フルクトシル−Ｌ−リジシン）に対しても良好に作用す
るという特性を有している。なお、測定に用いた基質濃
度は２ｍＭである（但し、ジ−Ｄ−フルクトシルリジン
のみは１ｍＭである。）。
位以外のアミノ基にフルクトースの結合したアマドリ化
合物（例えば、ジ−Ｄ−フルクトシルリジン，ε−Ｄ−
フルクトシル−Ｌ−リジシン）に対しても良好に作用す
るという特性を有している。なお、測定に用いた基質濃
度は２ｍＭである（但し、ジ−Ｄ−フルクトシルリジン
のみは１ｍＭである。）。
【００１４】
【表１】
【００１５】表中の数値はそれぞれＤ−フルクトシルグ
リシンに対する活性を１００とした場合の比である。
リシンに対する活性を１００とした場合の比である。
【００１６】（３）至適ｐＨ 本酵素（0.２単位）を各緩衝液中にて３７℃で４分間反
応させ、生成した過酸化水素を比色定量し、その活性を
調べた。その結果、本酵素の至適ｐＨはジフルクトシル
リジンを基質とした場合、図１に示すように、ｐＨ7.０
〜8.０である。なお、使用した緩衝液は下記の通りであ
り、ｐＨ7.０における活性を１００％として示した。 〇−〇 0.１Ｍ クエン酸緩衝液 ＋−＋ 0.１Ｍ 燐酸緩衝液 △−△ 0.１Ｍ トリス塩酸緩衝液
応させ、生成した過酸化水素を比色定量し、その活性を
調べた。その結果、本酵素の至適ｐＨはジフルクトシル
リジンを基質とした場合、図１に示すように、ｐＨ7.０
〜8.０である。なお、使用した緩衝液は下記の通りであ
り、ｐＨ7.０における活性を１００％として示した。 〇−〇 0.１Ｍ クエン酸緩衝液 ＋−＋ 0.１Ｍ 燐酸緩衝液 △−△ 0.１Ｍ トリス塩酸緩衝液
【００１７】（４）ｐＨ安定性 本酵素（0.２単位）を含有する各緩衝液を３７℃で１０
分間加熱処理したのち３７℃で反応させ、吸光値変化よ
り活性を調べた。その結果は図２に示した通りである。
なお、使用した緩衝液は下記の通りであり、ｐＨ7.０処
理における活性を１００％として示した。 〇−〇 0.１Ｍ クエン酸緩衝液 ＋−＋ 0.１Ｍ 燐酸緩衝液 △−△ 0.１Ｍ トリス塩酸緩衝液
分間加熱処理したのち３７℃で反応させ、吸光値変化よ
り活性を調べた。その結果は図２に示した通りである。
なお、使用した緩衝液は下記の通りであり、ｐＨ7.０処
理における活性を１００％として示した。 〇−〇 0.１Ｍ クエン酸緩衝液 ＋−＋ 0.１Ｍ 燐酸緩衝液 △−△ 0.１Ｍ トリス塩酸緩衝液
【００１８】（５）反応温度の範囲 ジフルクトシルリジンを基質とした場合、本酵素（0.３
単位）により１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ6.０）中で、各
温度において４分間反応させ、生成した過酸化水素水を
比色定量した。その結果は、図３に示した通りであり、
本酵素の反応適温は１５〜４５℃である。なお、４０℃
における活性を１００％として示した。
単位）により１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ6.０）中で、各
温度において４分間反応させ、生成した過酸化水素水を
比色定量した。その結果は、図３に示した通りであり、
本酵素の反応適温は１５〜４５℃である。なお、４０℃
における活性を１００％として示した。
【００１９】（６）熱安定性 本酵素（0.２単位）を含有する酵素液0.２ｍｌ（１０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ6.０）を各温度において１０分間放
置した。その後、この酵素液0.０６ｍｌを用いて３７℃
にて反応させ、吸光値変化より活性を調べた。ジフルク
トシルリジンを基質とした場合の結果は、図４に示す通
りであり、本酵素は４０℃以下では安定であるが、５０
℃で８０％以上が活性を失う。なお、図中には４℃処理
における活性を１００％として示した。
Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ6.０）を各温度において１０分間放
置した。その後、この酵素液0.０６ｍｌを用いて３７℃
にて反応させ、吸光値変化より活性を調べた。ジフルク
トシルリジンを基質とした場合の結果は、図４に示す通
りであり、本酵素は４０℃以下では安定であるが、５０
℃で８０％以上が活性を失う。なお、図中には４℃処理
における活性を１００％として示した。
【００２０】（７）阻害剤の影響 本酵素0.２単位を含有する酵素液0.２ｍｌ（１０ｍＭ燐
酸緩衝液、ｐＨ6.０）に阻害剤を混合し、３７℃におい
て４分間反応させ、生成した過酸化水素水を比色定量し
た。２ｍＭの阻害剤が本酵素に及ぼす影響は次の通りで
ある。本酵素はＣｕ2+，Ｎｉ2+，Ｚｎ2+，Ｃｏ2+により
強く阻害され、Ｍｇ2+には阻害されなかった。また、ｐ
−クロルメルクリ安息香酸（ＰＣＭＢ）には強く阻害さ
れ、ＮａＮ3 には阻害されなかった。
酸緩衝液、ｐＨ6.０）に阻害剤を混合し、３７℃におい
て４分間反応させ、生成した過酸化水素水を比色定量し
た。２ｍＭの阻害剤が本酵素に及ぼす影響は次の通りで
ある。本酵素はＣｕ2+，Ｎｉ2+，Ｚｎ2+，Ｃｏ2+により
強く阻害され、Ｍｇ2+には阻害されなかった。また、ｐ
−クロルメルクリ安息香酸（ＰＣＭＢ）には強く阻害さ
れ、ＮａＮ3 には阻害されなかった。
【００２１】（８）精製方法 本酵素は後記する精製方法により精製することができ
る。
る。
【００２２】（９）分子量 本酵素の分子量は、トーヨーパール ＨＷ−５５Ｆを用
いたゲル濾過法により測定した結果、約４３０００であ
った。なお、測定に用いた緩衝液は0.１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ6.０）である。
いたゲル濾過法により測定した結果、約４３０００であ
った。なお、測定に用いた緩衝液は0.１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ6.０）である。
【００２３】（１０）等電点 ディスク等電点電気泳動法により測定した結果、本酵素
の等電点はｐＩ＝4.８であった。
の等電点はｐＩ＝4.８であった。
【００２４】（１１）酵素純度の検定 電気泳動用グラジエントゲル（ＰＡＧ４／１５、第一化
学薬品株式会社製）を用いて３０ｍＡ／ゲルで２時間泳
動を行い、酵素タンパク質をクマシーブリリアントブル
ーＧ−２５０で染色した。その結果、単一なバンドを確
認した。
学薬品株式会社製）を用いて３０ｍＡ／ゲルで２時間泳
動を行い、酵素タンパク質をクマシーブリリアントブル
ーＧ−２５０で染色した。その結果、単一なバンドを確
認した。
【００２５】本酵素は、前記のように、その作用及び基
質特異性において従来未知の新規な酵素である。なお、
本酵素は上記のような作用及び基質特異性を有している
ので、フラクトシルアミンデグリカーゼと命名した。
質特異性において従来未知の新規な酵素である。なお、
本酵素は上記のような作用及び基質特異性を有している
ので、フラクトシルアミンデグリカーゼと命名した。
【００２６】次に、本発明によるフルクトシルアミンデ
グリカーゼの製造方法について説明する。本発明におい
て用いる微生物はフルクトシルアミンデグリカーゼ生産
能を有する微生物であればいずれでも良いが、具体例と
してカンジダ・ギアモンディ(Candida guilliermondii)
7087が挙げられる。また、本菌の自然もしくは人工的な
変異処理により得られる菌株も、上記能力を有する限り
本発明に用いることができる。
グリカーゼの製造方法について説明する。本発明におい
て用いる微生物はフルクトシルアミンデグリカーゼ生産
能を有する微生物であればいずれでも良いが、具体例と
してカンジダ・ギアモンディ(Candida guilliermondii)
7087が挙げられる。また、本菌の自然もしくは人工的な
変異処理により得られる菌株も、上記能力を有する限り
本発明に用いることができる。
【００２７】本菌株は、本発明者らが三重県山中のクヌ
ギの樹液より分離した菌株であり、その菌学的性質は下
記の通りである。 （１）ＭＹ培地（２５℃生育） 生育は普通で４日間プレート培養した結果、乳白色、平
滑で粘ちょう感のある全縁がやや波状の、凸状のコロニ
ーが得られた。 （２）細胞の形態は、伸長形、円筒形、ソーセージ形で
あり、多極出芽で増殖し、小さな楕円形細胞が混在して
いた。 （３）オイル状の沈査しやすい膜を形成した。 （４）グルコースよりガスを生成した。 （５）硝酸塩の資化性は認められなかった。 （６）アピＣオクサノグラム（アスカ純薬株式会社製）
により炭水化物資化性を調べた。その結果を第２表に示
す
ギの樹液より分離した菌株であり、その菌学的性質は下
記の通りである。 （１）ＭＹ培地（２５℃生育） 生育は普通で４日間プレート培養した結果、乳白色、平
滑で粘ちょう感のある全縁がやや波状の、凸状のコロニ
ーが得られた。 （２）細胞の形態は、伸長形、円筒形、ソーセージ形で
あり、多極出芽で増殖し、小さな楕円形細胞が混在して
いた。 （３）オイル状の沈査しやすい膜を形成した。 （４）グルコースよりガスを生成した。 （５）硝酸塩の資化性は認められなかった。 （６）アピＣオクサノグラム（アスカ純薬株式会社製）
により炭水化物資化性を調べた。その結果を第２表に示
す
【００２８】また、上記の菌学的性質を"The Yeast, A
Taxonomic"(M.J.W.Kreger-van Rij(ed) 、Elsevier Sci
ence Publishers B.V.-Amsterdam(1984)) を参考にして
検討した結果、カンジダ・ギアモンディ(Candida guill
iermondii)と同定し、本菌をカンジダ・ギアモンディ70
87株と命名した。
Taxonomic"(M.J.W.Kreger-van Rij(ed) 、Elsevier Sci
ence Publishers B.V.-Amsterdam(1984)) を参考にして
検討した結果、カンジダ・ギアモンディ(Candida guill
iermondii)と同定し、本菌をカンジダ・ギアモンディ70
87株と命名した。
【００２９】なお、本菌は工業技術院微生物工業技術研
究所にＦＥＲＭ ＢＰ−３８７８として寄託されてい
る。
究所にＦＥＲＭ ＢＰ−３８７８として寄託されてい
る。
【００３０】
【表２】
【００３１】＋＋＋：資化性あり −：資化性なし
【００３２】本発明の酵素を生産するために使用する培
地としては、炭素源，窒素源，無機物，その他の栄養素
を適当に含有しており、上記微生物を培養して目的とす
る酵素を生産し得るものであれば、合成培地，天然培地
のいずれであってもよい。炭素源としては、例えばグル
コース，フルクトース，ショ糖等の糖類の他、これらを
含む天然物を用いることができる。窒素源としては無機
アンモニア塩の他、ペプトン，カゼイン消化物，酵母エ
キス等の窒素性有機物を使用することができる。また、
無機物としては、マグネシウム，ナトリウム，カリウ
ム，マンガン，鉄等の塩類が使用できる。
地としては、炭素源，窒素源，無機物，その他の栄養素
を適当に含有しており、上記微生物を培養して目的とす
る酵素を生産し得るものであれば、合成培地，天然培地
のいずれであってもよい。炭素源としては、例えばグル
コース，フルクトース，ショ糖等の糖類の他、これらを
含む天然物を用いることができる。窒素源としては無機
アンモニア塩の他、ペプトン，カゼイン消化物，酵母エ
キス等の窒素性有機物を使用することができる。また、
無機物としては、マグネシウム，ナトリウム，カリウ
ム，マンガン，鉄等の塩類が使用できる。
【００３３】本発明の酵素、フルクトシルアミンデグリ
カーゼを効率よく生産するためには、フルクトシルアミ
ノ酸を培地に添加して培養する方法が好ましい。例えば
フルクトシルリジン１％，燐酸２カリウム0.１％，硫酸
マグネシウム0.０５％，塩化カリウム0.０５％，硫酸鉄
（II）0.００１％，グルコース1.０％，イーストエキス
0.０５％を含有した培地（ｐＨ6.８）が好適な培地とし
て挙げられる。
カーゼを効率よく生産するためには、フルクトシルアミ
ノ酸を培地に添加して培養する方法が好ましい。例えば
フルクトシルリジン１％，燐酸２カリウム0.１％，硫酸
マグネシウム0.０５％，塩化カリウム0.０５％，硫酸鉄
（II）0.００１％，グルコース1.０％，イーストエキス
0.０５％を含有した培地（ｐＨ6.８）が好適な培地とし
て挙げられる。
【００３４】培養温度は通常２５〜３５℃の範囲が適当
であり、好ましくは３０℃付近である。培養時のｐＨは
4.０〜7.０が適当であるが、ｐＨ5.０付近が望ましい。
また、培養時間は目的とする酵素が十分に生産されるま
でであり、通常は１２〜３６時間が適当である。培養方
法としては、振盪培養または深部攪拌培養が望ましい。
であり、好ましくは３０℃付近である。培養時のｐＨは
4.０〜7.０が適当であるが、ｐＨ5.０付近が望ましい。
また、培養時間は目的とする酵素が十分に生産されるま
でであり、通常は１２〜３６時間が適当である。培養方
法としては、振盪培養または深部攪拌培養が望ましい。
【００３５】次に、精製方法について述べると、本酵素
は通常菌体内に存在するので、培養物から菌体を集め、
適当量の緩衝液に懸濁し菌体を破砕し、酵素を可溶化す
ることにより酵素含有液を得ることができる。このよう
にして得られた酵素含有液から核酸，細胞壁等の夾雑物
を取り除いてフルクトシルアミンデグリカーゼを得るこ
とができる。
は通常菌体内に存在するので、培養物から菌体を集め、
適当量の緩衝液に懸濁し菌体を破砕し、酵素を可溶化す
ることにより酵素含有液を得ることができる。このよう
にして得られた酵素含有液から核酸，細胞壁等の夾雑物
を取り除いてフルクトシルアミンデグリカーゼを得るこ
とができる。
【００３６】さらに、常法の酵素精製法を適用して本酵
素を単離、精製することが可能である。例えば（１）硫
安分画、（２）ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグ
ラフィー、（３）フェニルセルロースカラムクロマトグ
ラフィー、（４）ヒドロキシアパタイトカラムクロマト
グラフィー、（５）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー
等の方法を単独で、または適宜組合わせたり、その他の
方法を必要に応じて組合わせ用いることにより、本酵素
の精製品を得ることができる。
素を単離、精製することが可能である。例えば（１）硫
安分画、（２）ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグ
ラフィー、（３）フェニルセルロースカラムクロマトグ
ラフィー、（４）ヒドロキシアパタイトカラムクロマト
グラフィー、（５）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー
等の方法を単独で、または適宜組合わせたり、その他の
方法を必要に応じて組合わせ用いることにより、本酵素
の精製品を得ることができる。
【００３７】本酵素の精製法の具体例は次の通りであ
る。培養物中から集めた菌体を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有
する５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）に懸濁し、フレン
チプレス（アメリカン インストウルメント カンパニ
ー製）による菌体破砕処理（１５００ｐｓｉ）を行う。
これを遠心分離して上清を集め、この上清液に硫酸アン
モニウムを加え７０％飽和濃度とし硫安分画を行い、遠
心分離して沈澱部分を集める。この沈澱部分を少量の１
ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.
０）に懸濁し、同緩衝液にて一夜透析をする。予め１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.
０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインカラムにか
け酵素を吸着させる。１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０
ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）で洗浄した後、０→0.１Ｍ
塩化カリウム濃度勾配による溶出を行い活性部分を集め
る。得られた酵素液に硫酸アンモニウムを加え1.２Ｍに
調整し、予め1.２Ｍ硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）で平衡化
させたフェニル−セルロース−カラムにかけ酵素を吸着
させる。同緩衝液にて洗浄した後、1.２→0.５Ｍ硫酸ア
ンモニウム濃度勾配による溶出を行い活性部分を集め
る。次に、得られた酵素液を１ｍＭ ＥＤＴＡを含有す
る１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ6.０）により一夜透析を行
う。この酵素液を同緩衝液で予め平衡化したヒドロキシ
アパタイトカラムにかけ、酵素を吸着させる。同緩衝液
で洗浄した後、１０→２００ｍＭ同緩衝液濃度勾配によ
り 溶出を行い活性部分を集める。活性部分を濃縮後、
予め0.１Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ6.０）で平衡化したトーヨーパール ＨＷ−５
５Ｆカラムによりゲル濾過を行い、目的とする精製酵素
を得ることができる。
る。培養物中から集めた菌体を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有
する５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）に懸濁し、フレン
チプレス（アメリカン インストウルメント カンパニ
ー製）による菌体破砕処理（１５００ｐｓｉ）を行う。
これを遠心分離して上清を集め、この上清液に硫酸アン
モニウムを加え７０％飽和濃度とし硫安分画を行い、遠
心分離して沈澱部分を集める。この沈澱部分を少量の１
ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.
０）に懸濁し、同緩衝液にて一夜透析をする。予め１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.
０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインカラムにか
け酵素を吸着させる。１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０
ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）で洗浄した後、０→0.１Ｍ
塩化カリウム濃度勾配による溶出を行い活性部分を集め
る。得られた酵素液に硫酸アンモニウムを加え1.２Ｍに
調整し、予め1.２Ｍ硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）で平衡化
させたフェニル−セルロース−カラムにかけ酵素を吸着
させる。同緩衝液にて洗浄した後、1.２→0.５Ｍ硫酸ア
ンモニウム濃度勾配による溶出を行い活性部分を集め
る。次に、得られた酵素液を１ｍＭ ＥＤＴＡを含有す
る１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ6.０）により一夜透析を行
う。この酵素液を同緩衝液で予め平衡化したヒドロキシ
アパタイトカラムにかけ、酵素を吸着させる。同緩衝液
で洗浄した後、１０→２００ｍＭ同緩衝液濃度勾配によ
り 溶出を行い活性部分を集める。活性部分を濃縮後、
予め0.１Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ6.０）で平衡化したトーヨーパール ＨＷ−５
５Ｆカラムによりゲル濾過を行い、目的とする精製酵素
を得ることができる。
【００３８】次に、本発明によるアマドリ化合物の定量
方法について説明する。本発明の定量方法は、次式に示
すように、フラクトシルアミン化合物を酵素により分解
することによるものである。
方法について説明する。本発明の定量方法は、次式に示
すように、フラクトシルアミン化合物を酵素により分解
することによるものである。
【００３９】
【数１】
【００４０】上式において、Ｒ1 はタンパク質，ペプチ
ド鎖，アミノ酸またはアミン残基を示し、Ｒ2 はアルド
ース残基を示す。
ド鎖，アミノ酸またはアミン残基を示し、Ｒ2 はアルド
ース残基を示す。
【００４１】本発明の定量方法は、上記のようなフラク
トシルアミン化合物含有する液であれば如何なるもので
も適用することができる。例えば、醤油等の高濃度のア
ミノ酸，糖を含有する食品中のフラクトシルアミン化合
物の濃度を定量することができる。生体中のフルクトサ
ミンのような糖化タンパク質についても被検体を適当な
処理によりフラクトシルアミノ酸を遊離させることによ
り測定可能である。
トシルアミン化合物含有する液であれば如何なるもので
も適用することができる。例えば、醤油等の高濃度のア
ミノ酸，糖を含有する食品中のフラクトシルアミン化合
物の濃度を定量することができる。生体中のフルクトサ
ミンのような糖化タンパク質についても被検体を適当な
処理によりフラクトシルアミノ酸を遊離させることによ
り測定可能である。
【００４２】本発明の定量方法に使用する酵素は、菌体
を破壊して該酵素を可溶化した粗酵素から各段階の精製
酵素までフラクトシルアミン化合物を分解する活性を有
するものであればよい。
を破壊して該酵素を可溶化した粗酵素から各段階の精製
酵素までフラクトシルアミン化合物を分解する活性を有
するものであればよい。
【００４３】本酵素を被検体に作用させる場合、ｐＨ6.
０〜9.０、４０℃以下、好ましくはｐＨ6.５〜8.０、温
度３０〜４０℃で通常５分程度反応させる。この場合に
用いる緩衝液としては、本酵素を阻害しないあらゆる緩
衝液が使用可能であり、例えば酢酸−酢酸ナトリウム緩
衝液，クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液，燐酸カリ
ウム緩衝液，トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。
０〜9.０、４０℃以下、好ましくはｐＨ6.５〜8.０、温
度３０〜４０℃で通常５分程度反応させる。この場合に
用いる緩衝液としては、本酵素を阻害しないあらゆる緩
衝液が使用可能であり、例えば酢酸−酢酸ナトリウム緩
衝液，クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液，燐酸カリ
ウム緩衝液，トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。
【００４４】本発明においては、下記のいずれかの方法
にりアマドリ化合物を定量することが可能である。 （１）酵素反応により生成する過酸化水素を測定する方
法 本酵素の反応により生成する過酸化水素を常法の比色定
量方法，過酸化水素電極法等を用いて測定することによ
り過酸化水素濃度を定量する。次いで、予め用意した過
酸化水素量とアマドリ化合物との標準曲線によりアマド
リ化合物を定量する。なお、発色法によりアマドリ化合
物を定量する場合、前記した「力価の測定方法」に記載
した測定方法が一例として挙げられる。生体中のタンパ
ク質の糖化量を測定する場合は、予めプロテアーゼによ
り糖結合部位であるアミノ酸残基を遊離させた後に本酵
素を作用させ、同様にして測定することができる。
にりアマドリ化合物を定量することが可能である。 （１）酵素反応により生成する過酸化水素を測定する方
法 本酵素の反応により生成する過酸化水素を常法の比色定
量方法，過酸化水素電極法等を用いて測定することによ
り過酸化水素濃度を定量する。次いで、予め用意した過
酸化水素量とアマドリ化合物との標準曲線によりアマド
リ化合物を定量する。なお、発色法によりアマドリ化合
物を定量する場合、前記した「力価の測定方法」に記載
した測定方法が一例として挙げられる。生体中のタンパ
ク質の糖化量を測定する場合は、予めプロテアーゼによ
り糖結合部位であるアミノ酸残基を遊離させた後に本酵
素を作用させ、同様にして測定することができる。
【００４５】（２）酸素消費に基づく定量方法 本酵素の反応により消費される酸素量を測定し、予め用
意した酸素消費量とアマドリ化合物との標準曲線により
アマドリ化合物を定量する。なお、酸素量の測定はワー
ルブルグ検圧法，酸素電極法等の常法により測定でき
る。
意した酸素消費量とアマドリ化合物との標準曲線により
アマドリ化合物を定量する。なお、酸素量の測定はワー
ルブルグ検圧法，酸素電極法等の常法により測定でき
る。
【００４６】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ カンジダ・ギアモンディ(Candida guilliermondii)7087
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８７８）株をジフルクトシルリジ
ン１％，燐酸２カリウム0.１％，硫酸マグネシウム0.０
５％，塩化カリウム0.０５％，硫酸鉄（II）0.００１
％，グルコース1.０％およびイーストエキス0.０５％を
含有する培地（ｐＨ6.８）１００ｍｌを入れた坂口フラ
スコ（５００ｍｌ容量）に植菌し、３０℃で２４時間振
盪培養を行った。
る。 実施例１ カンジダ・ギアモンディ(Candida guilliermondii)7087
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８７８）株をジフルクトシルリジ
ン１％，燐酸２カリウム0.１％，硫酸マグネシウム0.０
５％，塩化カリウム0.０５％，硫酸鉄（II）0.００１
％，グルコース1.０％およびイーストエキス0.０５％を
含有する培地（ｐＨ6.８）１００ｍｌを入れた坂口フラ
スコ（５００ｍｌ容量）に植菌し、３０℃で２４時間振
盪培養を行った。
【００４７】次に、この種培養物を５リットルのジャー
ファーメンター中の上記組成と同一の培地３リットルに
植え、通気量2.５リットル／分、攪拌速度４００r.p.m
で温度を３０℃、ｐＨを5.０に制御し、２４時間深部攪
拌培養を実施した。培養終了後、培養液を６０００r.p.
m 、４℃にて１０分間遠心分離して集菌した。得られた
培養菌体を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ7.０）に懸濁し、フレンチプレス（アメリカ
ン インストウルメント カンパニー製）による菌体破
砕処理（１５００ｐｓｉ）を行った。破砕液を１２００
０r.p.m 、４℃にて１０分間遠心分離して上清部分を集
め、２８０ｍｌの上清液を得た。この上清液に硫酸アン
モニウムを加え７０％飽和濃度とし、４℃にて２時間放
置した後、１２０００r.p.m 、４℃にて１０分間遠心分
離して沈澱部分を集めた。
ファーメンター中の上記組成と同一の培地３リットルに
植え、通気量2.５リットル／分、攪拌速度４００r.p.m
で温度を３０℃、ｐＨを5.０に制御し、２４時間深部攪
拌培養を実施した。培養終了後、培養液を６０００r.p.
m 、４℃にて１０分間遠心分離して集菌した。得られた
培養菌体を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ7.０）に懸濁し、フレンチプレス（アメリカ
ン インストウルメント カンパニー製）による菌体破
砕処理（１５００ｐｓｉ）を行った。破砕液を１２００
０r.p.m 、４℃にて１０分間遠心分離して上清部分を集
め、２８０ｍｌの上清液を得た。この上清液に硫酸アン
モニウムを加え７０％飽和濃度とし、４℃にて２時間放
置した後、１２０００r.p.m 、４℃にて１０分間遠心分
離して沈澱部分を集めた。
【００４８】この沈澱部分を少量の１ｍＭ ＥＤＴＡを
含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）に懸濁し、同
緩衝液にて一夜透析をした。この酵素液を同緩衝液で予
め平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインカラム（直径５
ｃｍ×１０ｃｍ）にかけ、酵素を吸着させた。しかるの
ち、０→0.１Ｍ塩化カリウム濃度勾配による溶出を行
い、活性部分を集めた。次に、この酵素液に硫酸アンモ
ニウムを加え1.２Ｍに調整し、予め1.２Ｍ硫酸アンモニ
ウムと１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ7.０）で平衡化させたフェニル−セファロースカ
ラム（直径５ｃｍ×５ｃｍ）にかけ、酵素を吸着させ
た。さらに、1.２→0.５Ｍ硫酸アンモニウム濃度勾配に
よる溶出を行い、活性部分を集めた。次に、この酵素液
を１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ6.０）により一夜透析を行った。この酵素液を同緩衝
液で予め平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（直径
５ｃｍ×５ｃｍ）にかけ、酵素を吸着させた。１０→２
００ｍＭ同緩衝液濃度勾配により溶出を行い、活性部分
を集めた。
含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）に懸濁し、同
緩衝液にて一夜透析をした。この酵素液を同緩衝液で予
め平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインカラム（直径５
ｃｍ×１０ｃｍ）にかけ、酵素を吸着させた。しかるの
ち、０→0.１Ｍ塩化カリウム濃度勾配による溶出を行
い、活性部分を集めた。次に、この酵素液に硫酸アンモ
ニウムを加え1.２Ｍに調整し、予め1.２Ｍ硫酸アンモニ
ウムと１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ7.０）で平衡化させたフェニル−セファロースカ
ラム（直径５ｃｍ×５ｃｍ）にかけ、酵素を吸着させ
た。さらに、1.２→0.５Ｍ硫酸アンモニウム濃度勾配に
よる溶出を行い、活性部分を集めた。次に、この酵素液
を１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ6.０）により一夜透析を行った。この酵素液を同緩衝
液で予め平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（直径
５ｃｍ×５ｃｍ）にかけ、酵素を吸着させた。１０→２
００ｍＭ同緩衝液濃度勾配により溶出を行い、活性部分
を集めた。
【００４９】このようにして得た活性部分をアミコン社
製限外濾過膜装置（分画膜１００００）にて濃縮した
後、予め0.１Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ6.０）で平衡化したトヨパール ＨＷ−５
５Ｆカラム（直径２ｃｍ×７０ｃｍ）にかけ、ゲル濾過
を行った。この活性部分を集めた結果、５0.４単位の酵
素液が得られた。収率は１2.２％であった。
製限外濾過膜装置（分画膜１００００）にて濃縮した
後、予め0.１Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ6.０）で平衡化したトヨパール ＨＷ−５
５Ｆカラム（直径２ｃｍ×７０ｃｍ）にかけ、ゲル濾過
を行った。この活性部分を集めた結果、５0.４単位の酵
素液が得られた。収率は１2.２％であった。
【００５０】実施例２ グルコース１５％，リジン５％を含む水溶液（ｐＨ6.
８）２０ｍｌを１２１℃で１５分間加圧処理し、燐酸２
カリウム0.１２５％，硫酸マグネシウム0.０６３％，塩
化カリウム0.０６３％，硫酸鉄（II)0. ００１３％，イ
ーストエキス0.０６３％を含有する培地（ｐＨ6.８）８
０ｍｌを入れた坂口フラスコ（５００ｍｌ容量）に加
え、カンジダ・ギアモンディ(Candida guilliermondii)
7087（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８７８）株を植菌し、３０℃
で２４時間振盪培養を行った。
８）２０ｍｌを１２１℃で１５分間加圧処理し、燐酸２
カリウム0.１２５％，硫酸マグネシウム0.０６３％，塩
化カリウム0.０６３％，硫酸鉄（II)0. ００１３％，イ
ーストエキス0.０６３％を含有する培地（ｐＨ6.８）８
０ｍｌを入れた坂口フラスコ（５００ｍｌ容量）に加
え、カンジダ・ギアモンディ(Candida guilliermondii)
7087（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８７８）株を植菌し、３０℃
で２４時間振盪培養を行った。
【００５１】次に、この種培養物を５リットルのジャー
ファーメンター中の上記組成と同一の培地３リットルに
植え、通気量2.５リットル／分、攪拌速度４００r.p.m
で温度を３０℃、ｐＨを5.０に制御し、２４時間深部攪
拌培養を実施した。培養終了後、培養液を６０００r.p.
m 、４℃にて１０分間遠心分離して集菌した。得られた
培養菌体を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ6.０）に懸濁し、ダイノミル（シンマル エ
ンタープライズ製）による菌体破砕処理（コンテナ容量
0.６リットル、ビーズ直径0.２５〜0.５ｍｍ、流速１０
リットル／時間）を行った。破砕液を１２０００r.p.m
、４℃にて１０分間遠心分離して上清部分を集め、１
４００ｍｌの上清液を得た。この上清液に硫酸アンモニ
ウムを加え３０％飽和濃度とし、４℃にて２時間放置し
た後、１２０００r.p.m 、４℃にて１０分間遠心分離し
て上清部分を集めた。
ファーメンター中の上記組成と同一の培地３リットルに
植え、通気量2.５リットル／分、攪拌速度４００r.p.m
で温度を３０℃、ｐＨを5.０に制御し、２４時間深部攪
拌培養を実施した。培養終了後、培養液を６０００r.p.
m 、４℃にて１０分間遠心分離して集菌した。得られた
培養菌体を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ6.０）に懸濁し、ダイノミル（シンマル エ
ンタープライズ製）による菌体破砕処理（コンテナ容量
0.６リットル、ビーズ直径0.２５〜0.５ｍｍ、流速１０
リットル／時間）を行った。破砕液を１２０００r.p.m
、４℃にて１０分間遠心分離して上清部分を集め、１
４００ｍｌの上清液を得た。この上清液に硫酸アンモニ
ウムを加え３０％飽和濃度とし、４℃にて２時間放置し
た後、１２０００r.p.m 、４℃にて１０分間遠心分離し
て上清部分を集めた。
【００５２】この上清部分に硫酸アンモニウムを加えて
７０％飽和濃度としたのち、４℃にて２時間放置した
後、上記と同一条件で遠心分離して沈殿部分を得た。こ
の沈殿部分を少量の１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ6.０）に懸濁し、同緩衝液にて一夜
透析をした。この酵素液を同緩衝液で予め平衡化したＤ
ＥＡＥ−セルロファインカラム（直径５ｃｍ×１０ｃ
ｍ）にかけ、夾雑タンパク質を吸着させ、活性画分を含
む非吸着部分を集めた。
７０％飽和濃度としたのち、４℃にて２時間放置した
後、上記と同一条件で遠心分離して沈殿部分を得た。こ
の沈殿部分を少量の１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ6.０）に懸濁し、同緩衝液にて一夜
透析をした。この酵素液を同緩衝液で予め平衡化したＤ
ＥＡＥ−セルロファインカラム（直径５ｃｍ×１０ｃ
ｍ）にかけ、夾雑タンパク質を吸着させ、活性画分を含
む非吸着部分を集めた。
【００５３】次に、この酵素液を１ｍＭ ＥＤＴＡを含
有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ6.０）で予め平衡化し
たヒドロキシアパタイトカラム（直径５ｃｍ×５ｃｍ）
にかけ、酵素を吸着させた。１０→２００ｍＭ同緩衝液
濃度勾配により溶出を行い、活性部分を集めた。
有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ6.０）で予め平衡化し
たヒドロキシアパタイトカラム（直径５ｃｍ×５ｃｍ）
にかけ、酵素を吸着させた。１０→２００ｍＭ同緩衝液
濃度勾配により溶出を行い、活性部分を集めた。
【００５４】このようにして得た活性部分をアミコン社
製限外濾過膜装置（分画膜１００００）にて濃縮した
後、予め0.１Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ6.０）で平衡化したトーヨーパール ＨＷ
−５５Ｆカラム（直径２ｃｍ×７０ｃｍ）にかけ、ゲル
濾過を行った。この活性部分を集めた結果、１５３単位
の酵素液が得られた。収率は２7.６％であった。
製限外濾過膜装置（分画膜１００００）にて濃縮した
後、予め0.１Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ6.０）で平衡化したトーヨーパール ＨＷ
−５５Ｆカラム（直径２ｃｍ×７０ｃｍ）にかけ、ゲル
濾過を行った。この活性部分を集めた結果、１５３単位
の酵素液が得られた。収率は２7.６％であった。
【００５５】実施例３ 0.０２５〜1.０ｍＭ ジフルクトシルリジン（５０ｍＭ
燐酸緩衝液、ｐＨ7.０に溶解したもの）0.１ｍｌに0.３
ｍＭ ４−アミノアンチピリン及び0.５ｍＭＴＯＯＳ，
2.０単位／ｍｌのパーオキシダーゼを含有する0.０５Ｍ
燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）0.４ｍｌを加え、３７℃にて温
度平衡にした。
燐酸緩衝液、ｐＨ7.０に溶解したもの）0.１ｍｌに0.３
ｍＭ ４−アミノアンチピリン及び0.５ｍＭＴＯＯＳ，
2.０単位／ｍｌのパーオキシダーゼを含有する0.０５Ｍ
燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）0.４ｍｌを加え、３７℃にて温
度平衡にした。
【００５６】次いで、このものに0.２単位／ｍｌの活性
を保有する本酵素液0.０６ｍｌを加え、分光光度計（日
立製作所製、Ｕ−２０００）により５５５ｎｍにおける
２分間の吸光度変化を２０秒毎に測定し、１分間当たり
の吸光度変化を求めた。その結果、ジフルクトシルリジ
ンの濃度と吸光度との間に図５のような比例関係を認
め、このことからアマドリ化合物の定量が可能であるこ
とが確認された。
を保有する本酵素液0.０６ｍｌを加え、分光光度計（日
立製作所製、Ｕ−２０００）により５５５ｎｍにおける
２分間の吸光度変化を２０秒毎に測定し、１分間当たり
の吸光度変化を求めた。その結果、ジフルクトシルリジ
ンの濃度と吸光度との間に図５のような比例関係を認
め、このことからアマドリ化合物の定量が可能であるこ
とが確認された。
【００５７】実施例４ 以下の方法により血清中タンパク質の糖化量を測定し
た。 （１）血清タンパク質の分解 前処理試薬 プロナーゼ（和光純薬社製）１0,０００ｕを１０ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）１Ｌに溶解し反応液（１）とし
た。
た。 （１）血清タンパク質の分解 前処理試薬 プロナーゼ（和光純薬社製）１0,０００ｕを１０ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ7.０）１Ｌに溶解し反応液（１）とし
た。
【００５８】（２）発色測定試薬 0.３ｍＭ ４−アミノアンチピリン（和光純薬社製）、
0.３ｍＭ ＴＯＯＳ（ドータイト社製），２ｕ／ｍｌパ
ーオキシダーゼ（片山化学社製）を５０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ7.０）に溶解した溶液に、最終１ｕ／ｍｌになる
ように本フルクトシルアミンデグリカーゼを添加し、反
応液（２）とした。
0.３ｍＭ ＴＯＯＳ（ドータイト社製），２ｕ／ｍｌパ
ーオキシダーゼ（片山化学社製）を５０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ7.０）に溶解した溶液に、最終１ｕ／ｍｌになる
ように本フルクトシルアミンデグリカーゼを添加し、反
応液（２）とした。
【００５９】（３）測定方法 １０μｌのヒト血清試料に反応液（１）を２００μｌ添
加し攪拌後、３７℃で５分間保温した。引き続いて反応
液（２）を２００μｌ添加し攪拌後、３７℃で保温しな
がら１分後および５分後の５４５ｎｍにおける吸光度を
分光光度計（日立製作所製、Ｕ−２０００型）で測定
し、その吸光度変化を各検体の測定値とした。上記の方
法により、糖尿病患者から健常者まで１００件のヒト血
清検体を測定した。なお、これらの血清試料は予めフラ
クトサミン法（フラクトサミン測定キット「ＮＥＷ グ
リカ・ピー」：中外製薬社製）により糖化量を測定し
た。
加し攪拌後、３７℃で５分間保温した。引き続いて反応
液（２）を２００μｌ添加し攪拌後、３７℃で保温しな
がら１分後および５分後の５４５ｎｍにおける吸光度を
分光光度計（日立製作所製、Ｕ−２０００型）で測定
し、その吸光度変化を各検体の測定値とした。上記の方
法により、糖尿病患者から健常者まで１００件のヒト血
清検体を測定した。なお、これらの血清試料は予めフラ
クトサミン法（フラクトサミン測定キット「ＮＥＷ グ
リカ・ピー」：中外製薬社製）により糖化量を測定し
た。
【００６０】図６に結果を示したが、本発明の酵素を使
用した酵素測定法は、化学的測定法（フラクトサミン
法）と高い相関性があることが示された。このように、
プロテアーゼにより適当なタンパク質分解処理を施すこ
とによって生体中のタンパク質の糖化量を測定できるこ
とが確認された。
用した酵素測定法は、化学的測定法（フラクトサミン
法）と高い相関性があることが示された。このように、
プロテアーゼにより適当なタンパク質分解処理を施すこ
とによって生体中のタンパク質の糖化量を測定できるこ
とが確認された。
【００６１】
【発明の効果】本発明により、特にε位のアミノ基に糖
が結合しているアマドリ化合物への反応性が高い特性を
有する新規酵素とその製造法およびアマドリ化合物の定
量方法が提供され、従来酵素法では困難であったアマド
リ化合物量の測定を容易に行うことができるようになっ
た。
が結合しているアマドリ化合物への反応性が高い特性を
有する新規酵素とその製造法およびアマドリ化合物の定
量方法が提供され、従来酵素法では困難であったアマド
リ化合物量の測定を容易に行うことができるようになっ
た。
【００６２】特に生体中で重要な糖尿病の指標物質であ
る糖化タンパク質を測定する場合、フラクトサミンの測
定において本酵素法は、従来の化学的方法では避けられ
なかった生体試料中に混入する干渉物質の影響を受けに
くく、より正確に測定することができ、さらに測定機器
を汚染することもない。また、グリコヘモグロビンの測
定においては、従来法に比べ操作が簡便で手間がかから
ず、短時間で測定することができるという特色を有して
いる。
る糖化タンパク質を測定する場合、フラクトサミンの測
定において本酵素法は、従来の化学的方法では避けられ
なかった生体試料中に混入する干渉物質の影響を受けに
くく、より正確に測定することができ、さらに測定機器
を汚染することもない。また、グリコヘモグロビンの測
定においては、従来法に比べ操作が簡便で手間がかから
ず、短時間で測定することができるという特色を有して
いる。
【図１】 本発明の酵素のｐＨと相対活性の関係から至
適ｐＨを示すグラフ。
適ｐＨを示すグラフ。
【図２】 本発明の酵素のｐＨと相対活性の関係からｐ
Ｈ安定性を示すグラフ。
Ｈ安定性を示すグラフ。
【図３】 本発明の酵素の温度と相対活性の関係から作
用温度を示すグラフ。
用温度を示すグラフ。
【図４】 本発明の酵素の温度と相対活性の関係から温
度安定性を示すグラフ。
度安定性を示すグラフ。
【図５】 本発明の酵素の濃度と吸光度の関係を示すグ
ラフ。
ラフ。
【図６】 本発明による測定結果と化学的測定法による
測定結果の相関を示すグラフ。
測定結果の相関を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−280297（ＪＰ，Ａ) Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, Ｖｏｌ．53［１］（1989）ｐ．103−110 Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, Ｖｏｌ．55［２］（1991）ｐ．333−338 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/06 C12Q 1/26 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するフルクトシ
ルアミンデグリカーゼ。 （ａ）作用及び基質特異性 本酵素は、アマドリ化合物に作用し、特にそのε−アミ
ノ酸誘導体に良好に作用して該化合物を酸化し、α−ケ
トアルデヒド，アミン誘導体及び過酸化水素を生成する
反応を触媒する。 （ｂ）至適ｐＨ及びｐＨ安定性 本酵素は、ジフルクトシルリジン(di-Fructosyl-lysin
e) を基質とした場合にｐＨ5.０〜8.０において安定で
あり、また至適ｐＨは、7.０〜8.０（燐酸緩衝液）であ
る。 （ｃ）反応温度の範囲 反応温度は、１５〜４５℃の範囲である。 （ｄ）熱安定性 本酵素は、４０℃、１０分間の加熱処理に対して安定で
ある。また、５０℃で１０分間加熱処理した場合、８０
％以上が失活する。 （ｅ）分子量 トーヨーパール ＨＷ−５５Ｆカラムを用いたゲル濾過
法で測定した分子量は約４３０００である。 - 【請求項２】 カンジダ属に属し請求項１記載のフルク
トシルアミンデグリカーゼ生産能を有する微生物を培地
に培養し、培養物より該フルクトシルアミンデグリカー
ゼを採取することを特徴とするフルクトシルアミンデグ
リカーゼの製造法。 - 【請求項３】 カンジダ属に属し請求項１記載のフルク
トシルアミンデグリカーゼ生産能を有する微生物がカン
ジダ・ギアモンディ(Candida guilliermondii)である請
求項２記載の製造法。 - 【請求項４】 アマドリ化合物を含有する試料に請求項
１記載のフルクトシルアミンデグリカーゼを作用させ、
酸化反応に伴い生成する過酸化水素量、もしくは消費さ
れる酸素量を測定し、該測定値からアマドリ化合物量を
求めることを特徴とするアマドリ化合物の定量方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27929292A JP3157622B2 (ja) | 1992-06-05 | 1992-09-25 | フルクトシルアミンデグリカーゼ、その製造法及び該酵素を用いたアマドリ化合物の定量方法 |
| US08/066,499 US5387109A (en) | 1992-06-05 | 1993-05-24 | Fructosylamine deglycase and a method of producing it |
| EP19930108649 EP0576838A3 (en) | 1992-06-05 | 1993-05-28 | Fructosylamine deglycase, method of producing it, and method of quantitative determination of amadori compounds using the enzyme |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16993892 | 1992-06-05 | ||
| JP4-169938 | 1992-06-05 | ||
| JP27929292A JP3157622B2 (ja) | 1992-06-05 | 1992-09-25 | フルクトシルアミンデグリカーゼ、その製造法及び該酵素を用いたアマドリ化合物の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646846A JPH0646846A (ja) | 1994-02-22 |
| JP3157622B2 true JP3157622B2 (ja) | 2001-04-16 |
Family
ID=26493119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27929292A Expired - Lifetime JP3157622B2 (ja) | 1992-06-05 | 1992-09-25 | フルクトシルアミンデグリカーゼ、その製造法及び該酵素を用いたアマドリ化合物の定量方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5387109A (ja) |
| EP (1) | EP0576838A3 (ja) |
| JP (1) | JP3157622B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0678576B1 (en) * | 1994-03-03 | 2001-01-03 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same |
| US5712138A (en) | 1994-10-05 | 1998-01-27 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase |
| EP0737744B1 (en) * | 1995-04-11 | 2005-11-30 | ARKRAY, Inc | Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same |
| AU694039B2 (en) * | 1995-05-05 | 1998-07-09 | Genzyme Limited | Determination of glycated proteins |
| WO1997013872A1 (fr) * | 1995-10-12 | 1997-04-17 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Procede pour doser les composes d'amadori |
| US5639672A (en) * | 1995-10-16 | 1997-06-17 | Lxn Corporation | Electrochemical determination of fructosamine |
| DE69629489T2 (de) * | 1995-11-30 | 2004-07-22 | Kyoto Daichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosylaminosäuren oxidase, verfahren zu ihrer herstellung und zum testen von amadori-verbindungen unter zuhilfenahme des enzyms |
| WO1997021818A1 (fr) * | 1995-12-14 | 1997-06-19 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Nouvelle oxydase d'acide amine fructosyle provenant d'un champignon du genre penicillium |
| WO1998048043A1 (fr) * | 1997-04-24 | 1998-10-29 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Procede de dosage enzymatique d'une proteine de saccharification |
| JP3987900B2 (ja) * | 1997-11-26 | 2007-10-10 | アークレイ株式会社 | 糖化タンパク質の測定方法 |
| CN1324234A (zh) * | 1998-09-25 | 2001-11-28 | 格利科克斯有限公司 | 果糖胺氧化酶,拮抗剂和抑制剂 |
| EP1115842A4 (en) * | 1998-09-25 | 2002-08-21 | Glycox Corp Ltd | DETERMINATION OF FRUCTOSAMINE OXIDASE: METHODS AND SUBSTANCES |
| USRE46130E1 (en) * | 2000-07-14 | 2016-08-30 | Arkray, Inc. | Method of selectively determining glycated hemoglobin |
| EP2248909B1 (en) | 2001-01-31 | 2016-09-28 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Compositions for assaying glycoprotein |
| WO2003077901A1 (en) * | 2002-03-08 | 2003-09-25 | Protemix Corporation Limited | Preventing and/or treating cardiovascular disease and/or associated heart failure |
| CA3011023A1 (en) | 2002-08-20 | 2004-03-04 | Philera New Zealand Limited | Composition comprising triethylenetramine salts for treating tissue damage |
| WO2004038033A1 (ja) | 2002-10-23 | 2004-05-06 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | 脱フルクトシル化方法 |
| EP2096173B1 (en) * | 2003-05-21 | 2019-01-30 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method of measuring glycolated hemoglobin A1C, enzyme to be used therefor and process for producing the same |
| AU2004298393A1 (en) * | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Protemix Corporation Limited | Copper antagonist compounds |
| CA3050047A1 (en) | 2004-07-19 | 2006-03-16 | Philera New Zealand Limited | Synthesis of triethylenetetramines |
| US7314982B2 (en) * | 2005-02-25 | 2008-01-01 | Stine Seed Farm, Inc. | Soybean cultivar 4817034 |
| JP5204483B2 (ja) | 2005-07-19 | 2013-06-05 | キッコーマン株式会社 | 糖化蛋白質の測定方法および測定キット |
| JP2008125368A (ja) | 2006-11-16 | 2008-06-05 | Amano Enzyme Inc | 新規なジペプチド分解酵素及びその製造方法並びにジペプチド分解酵素を用いる糖化蛋白質等の測定方法及びそれに用いる試薬組成物 |
| WO2010113217A1 (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-07 | 富士通フロンテック株式会社 | 文字認識装置及び文字認識方法 |
| CN114158267A (zh) | 2019-07-01 | 2022-03-08 | 旭化成制药株式会社 | 包含使亚铁氰化物的氧化还原电位增大的蛋白酶的稳定剂的糖化蛋白质测定试剂、糖化蛋白质的测定方法、糖化蛋白质测定试剂的保存方法以及糖化蛋白质测定试剂的稳定化方法 |
| CN113564195B (zh) * | 2021-07-30 | 2024-04-30 | 武汉百氨汇基生物技术有限公司 | 一种果糖胺脱糖酶毕赤酵母表达载体、基因工程菌及构建方法和蛋白表达方法 |
| WO2023004770A1 (zh) * | 2021-07-30 | 2023-02-02 | 武汉百氨汇基生物技术有限公司 | 一种果糖胺脱糖酶毕赤酵母表达载体、基因工程菌及构建方法和蛋白表达方法 |
| CN113584007B (zh) * | 2021-07-30 | 2024-08-23 | 武汉百氨汇基生物技术有限公司 | 果糖胺脱糖酶载体、表达果糖胺脱糖酶的转基因细胞系和基因工程菌及果糖胺脱糖酶的应用 |
| US20230348882A1 (en) * | 2021-07-30 | 2023-11-02 | Wuhan Bai'anhuiji Biotechnology Co., Ltd | Fructosamine Deglycase Vector, Transgenic Cell Line and Genetic Engineering Bacteria Expressing Fructosamine Deglycase, and Use of Fructosamine Deglycase |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0665300B2 (ja) * | 1985-05-22 | 1994-08-24 | 財団法人野田産業科学研究所 | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ |
| JPS61280297A (ja) * | 1985-06-04 | 1986-12-10 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | アマドリ化合物の定量法及びその定量用試薬 |
| JP2601356B2 (ja) * | 1989-11-14 | 1997-04-16 | 財団法人野田産業科学研究所 | フルクトシルアミン・オキシダーゼ、その製造法、該酵素を用いたアマドリ化合物の定量法及びその試薬 |
| JPH044874A (ja) * | 1990-04-20 | 1992-01-09 | Nakano Vinegar Co Ltd | フラクトシルアミノ酸分解酵素、その製造法及びその利用 |
-
1992
- 1992-09-25 JP JP27929292A patent/JP3157622B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-05-24 US US08/066,499 patent/US5387109A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-28 EP EP19930108649 patent/EP0576838A3/en not_active Ceased
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５３［１］（１９８９）ｐ．１０３−１１０ |
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５５［２］（１９９１）ｐ．３３３−３３８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0576838A3 (en) | 1994-07-06 |
| EP0576838A2 (en) | 1994-01-05 |
| US5387109A (en) | 1995-02-07 |
| JPH0646846A (ja) | 1994-02-22 |
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