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JP3154720B2 - 誘導性発現ベクター - Google Patents

誘導性発現ベクター

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JP3154720B2
JP3154720B2 JP51010190A JP51010190A JP3154720B2 JP 3154720 B2 JP3154720 B2 JP 3154720B2 JP 51010190 A JP51010190 A JP 51010190A JP 51010190 A JP51010190 A JP 51010190A JP 3154720 B2 JP3154720 B2 JP 3154720B2
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gene
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vector
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ナガラジヤン，バサンサ
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イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
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Publication date
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はB.ズブチリス及び他のグラム陽性菌に有用な
調節可能で複製可能な発現及び分泌ベクターに関する。
バチルス・ズブチリスにおける異種タンパク質生産用
のいくつかの発現及び分泌ベクターが報告されている。
これらはα−アミラーゼ［Palvaら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA79:5582−5586（1972）;Plavaら、Gene、22:229−
235（1983）、及びGB2091268B］及びプロテアーゼ遺伝
子のベクター［Vasanthaら、J.Bacteriol.,165:837−84
2（1986）;Honjoら、J.Biotech.4:63−71（1986）、及
びNagarajanら、米国特許4801537］を包含する。これら
のベクターの利点はこれらの発現が調節されておらず、
異種遺伝子が始終生産されることである。B.ズブチリス
からのレバンスクラーゼ（levansucrase）遺伝子（sac
B［Bsu］）の基地となるB.ズブチリス分泌ベクターもGa
nesan及びHoch編、Bacillus:Molecular Genetics and B
ictechnology Applications（Academic Press、1986）
中479−493でJoyetらによつて報告された。Edelmanら、
FEMS Micaobiology Letters52:117−120（1988）は複製
可能なかかるベクターを開示している。しかしながら、
多重コピー（multicopy）プラスミドベクター上のレバ
ンスクラーゼ遺伝子はB.ズブチリス細菌の染色体sac B
［Bsu］遺伝子に相同であり、従つて、広範囲に亘る組
換えが起こり、プラスミドが不安定になる可能性があ
る。従つて、安定で調節可能な発現ベクターのために
は、異種遺伝子をこれらの不利益を克服することができ
るB.ズブチリス及び他のグラム陽性菌中にクローン化す
る必要がある。
バチルス・ズブチリスレバンスクラーゼ発現系は調節
可能な発現系をデザインする土台としていくつかの利点
を有している。該発現系は安価でタンパク質産物から容
易に精製され、スクロースによつて調節可能である。し
かしながら、レバンスクラーゼ発現系の遺伝子光学に関
する主たる障害はその複雑さである。レバンスクラーゼ
レギユロンには少なくとも２つの他の遺伝子、sac S及
びsac U（これらは該遺伝子の発現の制御に関与する）
がある。（Microbiology,American Society of Microbi
logy）［1976］中のlepesantら、Debarbouillら、FEMS
Microbiol.Lett.41、137−140（1987））。その構造遺
伝子は、よく分つていない方法であつて、恐らく、転写
開始配列と翻訳開始配列の間の、遺伝子の調節領域での
特定構造の形成に関与する方法で転写的に調節される。
これらの構造はスクロースの存在下でのsac S及びsac U
遺伝子の生産物の間の非常に精密でデリケートな相互作
用によつて不安定になり、かくして抗転写終始及び読み
過しを起こして構造遺伝子内に入る（Shimotsuら、J.Ba
cteriol.163−380−388［1976））。このようにレバン
スクラーゼ発現系を遺伝子的に工作する試みはいずれも
この複雑なレギユロンとの適合性を考慮する必要性によ
つて複雑化される。
sac B［Bsu］のスクロース調節の機構はShimotsuら、
既出によつて研究された。プロモーターと翻訳開始部位
の間の調節領域のDNA配列は逆方向反復よりなつてい
た。従つてそのRNA構造は長いステムと短いループ構造
を形成する可能性を有している。Shimotsuらはまたもは
やスクロースによつて調節されない（レバンスクラーゼ
がスクロースと無関係に発現される）、２つのB.ズブチ
リス変異株のDNA配列を決定した。２つの場合における
変異は調節領域における１個の塩基変化であることが見
い出された（図４参照）。このようにレバンスクラーゼ
の調節がB.ズブチリス中のこの調節領域の特定のDNA配
列によつて非常に厳重に制御されているというしるしが
あつた。
バチルスの少なくとも１つの他のスピーシーズ、例え
ばバチルス・アミロリクエフアシエンス（B.amylolique
faciens）がレバンスクラーゼを生産することも知られ
ていた（Mantsala,P.及びM.Puntab.FEMS Microbiol.Let
t.13、395−399［1982］）。しかしながら、それがB.ア
ミロリクエフアシエンス中で調節されるのかどうか、ま
たはもしそうだとしても、B.アミロリクエフアシエンス
遺伝子の発現要素がB.ズブチリスのスクロースレギユロ
ンの他の遺伝子と適合し得るのかどうかは知られていな
かつた。
発明の概要 かくして、１つの面において、本発明はグラム陽性宿
主微生物、好ましくはB.ズブチリス中の外来タンパク質
またはポリペプチドを発現するのに有用な調節可能な複
製可能なベクターであつて;B.アミロリクエフアシエン
スのレバンスクラーゼ遺伝子からの発現要素（expressi
on elements）（プロモーター及び調節配列）（プロモ
ーター配列はRNAポリメラーゼの結合を制御し、調節配
列は転写がスクロースが存在するときのみ起こるように
することにより転写を調節する）、及び該発現要素に機
能し得るように結合した、タンパク質またはポリペプチ
ドをコード化した配列を有するベクターを提供する。好
ましい面はグラム陽性微生物、好ましくはB.ズブチリス
において外来タンパク質またはポリペプチドを発現する
のに有用な調節可能な複製可能な発現ベクターであつ
て;B.アミロリクエフアシエンスのレバンスクラーゼ遺
伝子からの発現要素、例えばB.アミロリクエフアシエン
スからの、シグナルペプチドをコード化したDNA配列で
あつて調節配列の下流に位置したDNA配列、及び該シグ
ナル配列に隣接し、その下流に位置した制限エンドヌク
レアーゼ切断部位を有する発現ベクターである。この制
限エンドヌクレアーゼ切断部位は外来タンパク質または
ポリペプチドをコード化した異種DNA配列がシグナル配
列に隣接してそれとの適当な読取り枠において位置する
ことを常用技術によつて容易に可能にする。本発明の好
ましいベクターで形質転換したグラム陽性菌、好ましく
はバチルス、好ましくはB.ズブチリスは目的とするタン
パク質またはポリペプチドを生産し、分泌することがで
きる。
別の好ましい面の本発明はB.アミロリクエフアシエン
スからのレバンスクラーゼ遺伝子（sac B［Bam P］）か
らのDNA断片であつて、多重コピープラスミド上に維持
できる安定で調節可能なベクターの構築を可能にするDN
A断片を提供する。B.ズブチリス中に形質転換すると
き、多重コピープラスミド上のベクターはスクロースに
よつて調節可能である。（sac B［Bam P］）遺伝子は
（sac B［Bsu］）遺伝子と相同性を有しているとしても
その相同性は（sac B［Bam P］）が染色体sac B［Bsu］
位置と再結合するには十分でない。かくして、本発明の
ベクターは種々の異種ポリペプチドを、菌体内または菌
体外に、安定で調節された仕方で生産するのに用いるこ
とができる。
本発明のさらに別の面によると、グラム陽性菌中の異
種ポリペプチドを調節可能に発現する方法であつて；酵
素レバンスクラーゼをコード化したB.アミロリクエフア
シエンス遺伝子から発現要素を有するDNA断片を単離
し、該DNA断片を修飾して適切に配置された制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位を含有せしめ、該断片を、グラム
陽性菌、特にB.ズブチリス中で存在でき、かつ複製でき
るプラスミドに加え、それによつて、ベクターであつ
て、それで形質転換したグラム陽性菌が、スクロースの
存在下に、タンパク質であつてその遺伝情報がベクター
中の該断片に機能し得るように結合したタンパク質を菌
体内に生産するか及び／または培地中に分泌するように
するベクターを生産することを特徴とする方法が提供さ
れる。
本発明の別の面によると、本発明のベクターを、該ベ
クターの調節要素と適合性がある調節要素を有さない宿
主微生物中に形質転換することによつて、構成的（cons
titutive）で、調節されないやり方で異種ポリペプチド
を発現する方法が提供される。
図面の簡単な説明 本発明の他の種々の目的、特徴及び付随の利点は添付
の図面と共に考えるときより良い理解を伴つて十分に知
覚されるであろう。
図１（上）:pBE301のプラスミド地図。
はsac B［Bam P］を示し、 はB.アミロリクエフアシエンスDNAを示し、 はBlue ScriptベクターDNAを示し、はpBR322の複数開
始点を示す。
図１（下）:B.アミロリクエフアシエンスDNAの制限地
図。文字は以下の如く制限酵素認識部位を示す:E＝EcoR
I、R V＝EcoR V、Ｂ＝BamH I、Ｐ＝Pst1、Ｓ＝SAll、
Ｘ＝Xbal1、Ｍ＝Sma1、Ｈ＝Hind III、Ｋ＝Kpn。
図2:単離されたsac B［Bam P］断片を配列決定するた
めの制限地図及び配列決定計画。矢印はいくつかのクロ
ーンの各々で生じた配列を示す。
図3a、3a′、3a、″：全部で、単離されたsac B［Bam
P］断片のヌクレオチド配列。コドン−29は翻訳の開始
部位である。＋１は成熟レバンスクラーゼのＮ末端アミ
ノ酸を示す。下線部分は推定調節配列を示す。
図3b:sac B［Bam P］配列の図示的表示。
図4:図３の708−733のsac B［Bsu］、sac B［Bam
P］、sac R 36［Bsu］DNA配列及びB.ズブチリスDNA配列
305−370（Steinmetzら、後出（infra））の提案された
調節領域の配列及び構造をWisconsinデータベース中のF
oldプログラムを用いて分析し、比較した。
図5:sac B［Bam P］シヤトルベクターpBE501の構築。
はpBR322オリ（ori）を示し、▲はpC194オリを示し、
△はflオリを示す。
図6:pBE311の構築。pBE504はpBE501から部位特異的突
然変異誘発によつて構築した。pBE311はpBE504から構築
した。pBE501及び504のシグナルペプチドコード化配列
を示す。pBE501のシグナルペプチドコード化領域のDNA
配列は独立に決定したが、pBE301のそれと同じであつ
た。
図7:pBE312の構築。
定義 本明細書で用いた定義を以下に示す。
sac B［Bam P］:B.アミロリクエフアシエンスからの
レバンスクラーゼ遺伝子。
sac B［Bsu］:B.ズブチリスからのレバンスクラーゼ
遺伝子。
発現要素（expression element）：プロモーター及び
調節ヌクレオチド配列。
調節配列：翻訳開始部位の上流の配列であつて、短い
距離離れた、ステム及びループ構造を形成し得る逆方向
反復配列よりなる配列。
プロモーター配列：翻訳開始部位の上流のヌクレオチ
ド塩基の配列であつて、RNAポリメラーゼの結合する部
位である配列。
シグナルペプチド：分泌されたタンパク質に先行する
アミノ末端ポリペプチドであつて、切断された成熟タン
パク質には存在せず、該タンパク質を菌体膜の方向に向
かわせ、それを通つて移動させる機能を有する該ポリペ
プチド。
成熟タンパク質：最終タンパク質産物（すなわち、シ
グナルペプチドを有さない）。
上流の配列：発現とは逆の方向に向かう配列 下流の配列：発現の方向に向かう配列 スクロース：該ベクターに含まれる調節配列を活性化
する、スクロース、チオスクロース、関連二糖類及び炭
水化物、及びそれらの類縁体を包含する。
異種DNA配列：本発明のベクターを含有する細菌以外
のいずれかの微生物（organism）からのDNA配列。
外来タンパク質：本発明のベクターを含有する細菌に
よつては正常には生産されないタンパク質。
組換え：例えばプラスミド上に位置したDNA配列が例
えば染色体上に位置した相同配列と交換されるプロセ
ス。
cm:クロラムフエニコール kana:カナマイシン フアゲミド（Phagemids）:M13複数開始点を有するプ
ラスミド。
「タンパク質」と「ポリペプチド」は交換可能に用い
る。
細菌培養菌の増殖及び維持については当業者に周知の
標準的な微生物学的方法を用いることができる。遺伝子
工学の適当な方法はManiatisら、Molecular Cloning:A
Laboratory Manual（Cold Spring Harbor、ニユーヨー
ク:Cold Spring Harbor Laboratory、1982）、及び市販
の遺伝子工学キツトに添付の指示書に記載されている。
本発明を行うのに必要な細胞培養菌及びプラスミドは市
販されており、以下の記述においてそれらの起源に沿つ
て同定する。
誘導化合物、例えばスクロース及びその類縁体の適当
量は当業者によつてルーチンに決定し得る。
本発明のベクターに適した宿主細菌は一般にグラム陽
性であり、特にバチルス属に属する細菌である。かかる
適当な宿主細菌の非制限的例としてB.ブレビス（brevi
s）、B.リケニホルミス（lichenformis）、及びストレ
プトマイセス属のスピーシーズが挙げられる。さらに、
調節要素が本発明のベクターの調節要素と適合性がない
ような、例えばE.コリ等の非グラム陽性スピーシーズを
含む他の細菌も、例えば一時的にさらなるクローニング
のためにまたはポリペプチドの発現の調節を望まない場
合に適当な宿主となり得る。かかる他の細菌中では、発
現の調節はベクターをバチルス等のグラム陽性菌中に形
質転換する場合ほど機能し得ない。さらに、本発明のベ
クターは該ベクター上に保持された（carried on）ポリ
ペプチドを天然に生産する宿主細菌中に形質転換するこ
とができる。好ましくは、該宿主細菌壁は該ポリペプチ
ドをコード化した染色体遺伝子を除去されているか、該
ベクターと染色体遺伝子の間で組換えが起こらないよう
に、すなわち該ベクターが安定であるように変異処理さ
れている。
本発明において好ましい安定なベクターは、例えば、
宿主微生物中に多重、例えば10以上のコピーで形質転換
した場合に10世代後にそれらのコピーの半分以上を、特
に組換えの結果として、失わないベクターとして定義で
きる。本発明のベクターを、一般に、先行技術における
同様のベクターと対比して、染色体DNAとの間のかなり
の（significant）組換えまたは組込みなしに、多重コ
ピープラスミドとして複製できることは本発明の驚くべ
き一面である。しかしながら、本発明のベクターを本発
明の発現系が染色体に組み込まれる細菌に用いることも
可能である。
適当なベクターは一般に該ベクターが形質転換する微
生物と適合性があるベクターである。かくして、例え
ば、それらは適合性ある調節配列及び複製開始点を有
し、好ましくは多重コピー性であり、また選択し得るマ
ーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性をコード化した遺伝
子を有する。これらはフアージ、プラスミド、コスミド
及び染色体組込みベクターを包含し得る。さらに、本発
明の発現ベクターは該発現要素及び異種遺伝子配列を常
用技術によつて宿主の染色体に組み込むために用いるこ
とができる（Saundereら、J.Bacteriol.157、718−726
［1984］］。何らの制限を意図することなく、発現要素
及び他の関連配列を有する断片を受け取るのに適したプ
ラスミドの例としてATCC39294、37278、37277、37105、
37280及び37108のププラスミドが挙げられる。本発明の
プラスミドで形質転換した場合、グラム陽性菌、特にB.
ズブチリスはスクロースが存在するときのみレバンスク
ラーゼを生産する。かくして、例えば、本発明のベクタ
ーは自律的プラスミドとして、エシエリキア・コリ及び
B.ズブチリスの両方で存在でき、異種タンパク質の発現
はB.ズブチリス中でのスクロースの存在または不存在に
よつて調節される。ベクターは外来タンパク質及びポリ
ペプチドをコード化したDNA配列の容易な挿入のための
唯一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を持つよう工作
することができる。外来タンパク質をコード化した配列
を適切に配置した、かつシグナルペプチドをコード化し
た適切なDNA配列を有するベクターで形質転換したB.ズ
ブチリスはスクロースの存在下で培地中に該外来タンパ
ク質を分泌する。適当に挿入した制限エンドヌクレアー
ゼ部位は該ベクターの残りに対し、好ましくは、唯１つ
である部位であり、かつコード化されたタンパク質また
は調節またはシグナルペプチド配列の機能に悪影響を与
えないアミノ酸配列をコード化した部位である。さら
に、制限部位は他の制限部位を公知の技術（Maniatis、
既出）を用いて他のリンカー配列の使用によつて作出す
る（create）のに用いることができる平滑末端部位であ
ることができる。
適当なシグナルペプチドは発現要素と同じまたは異な
る遺伝子に由来することができ、異種ポリペプチドコー
ド化配列と同じまたは異なる遺伝子に由来することがで
き、または宿主及び排せつされるポリペプチドにもつと
も適するように、既知技術によつて、修飾するか合成配
列仕立することができる。例えば分泌を達成する困難さ
は、既知の手法によつて、いくぶん疎水性のアミノ酸を
配列のコアまたは端を有するシグナルペプチドを代わり
に用いるか、シグナルペプチドをより長くまたはより短
くするか、または荷電残基を加えるか取り除くことによ
つて処理できる。好ましいシグナルペプチドは既知の技
術（Smithら、Gene70、351−361［1988］）を用いて単
離でき、また例えばB.アミロリクエフアシエンスのアミ
ラーゼ、アルカリプロテアーゼまたは中性プロテアーゼ
から導かれる。
適当なポリペプチドは宿主微生物と適合性があるポリ
ペプチドである。それらは、例えば、ウイルス、細菌、
真菌、植物、昆虫または哺乳類をはじめとする背椎動物
起源のポリペプチドである。それらは、例えば、構造タ
ンパク質、酵素またはペプチドである。非制限的例示と
して小麦α−アミラーゼ、HIVプロテアーゼ、エラスチ
ン及び免疫グロブリンが挙げられる。
周知のごとく、本発明の方法によつて生産されるポリ
ペプチドはその配列が由来する微生物によつて生産され
るポリペプチドと同じでもよいし、本来のタンパク質よ
り１以上のアミノ酸はど長いか短くてもよいし、または
別様に変えられていてもよい。このことは、例えば、発
現要素またはシグナルペプチドコード配列とポリペプチ
ドコード化配列の間に結合を置くことであるか、または
ポリペプチドを他の目的のために修飾することである。
このような修飾を行う方法は常用されている（例えば、
Maniatisら、既出及びSmith,M.,Ann.Rev.Genet.19、423
−462［1985］）。例えば、本発明の実施例４で構築さ
れた分泌ベクターはレバンスクラーゼのＮ末端をコード
化したDNA配列中に外来の制限部位をコード化した６塩
基の挿入物をクローン化することによつて作製した。得
られたレバンスクラーゼはこの挿入物によつてコード化
された、レバンスクラーゼの活性に影響を与えない２つ
の付加的アミノ酸、アスパラギン酸及びイソロイシンを
含有する。
本発明において、「機能し得るように結合した」（op
erably linked）は異種ポリペプチドの合成、発現及び
／または分泌がレバンスクラーゼ発現要素によつて調節
されることを意味する。かくして異種遺伝子の融合は転
写または翻訳の遺伝子融合であることができる。
本発明において、「実質上相同の」（substantially
homologous）は発現要素が第一のバチルス・スピーシー
ズに由来するか、それが発現要素自体と等価に機能する
ように修飾されるか、または等価に機能する合成的に作
り出した配列であることができることを意味する。
本発明において、「単離された」は発現要素がその天
然に存在する環境から分離されたことを意味する。
sac B［Bam P］遺伝子を有する断片を単離するDNA源
は、例えばバチルス・アミロリクエフアシエンスであり
得る。これらの細菌はアメリカンタイプカルシヤーコル
クシヨン、12301パークローンドライブ、ロツクヴイ
レ、MD 20852から得られる。かかる培養菌の非制限的一
例はATCC 23844である。B.アミロリクエフアシエンスは
細菌学者に周知の方法によつて増殖させることができ
る。ライブラリーをつくるクローニングに適した、例え
ばB.アミロリクエフアシエンスからの細菌DNAは常法に
より、例えば以下に記述するようにして得ることができ
る。常用の手段、例えばλ−ZAP DNA、Gigaパツクグラ
ス（pack plus）（Stratagene,11099 North Torrey Pin
es Road,La Jolla、CA92037）等の市販のキツト用の製
造者の指示書を入手してこれに従うという手段もかかる
ライブラリーを生産するのに用いることができる。
レバンスクラーゼ遺伝子を含有するDNAのクローンを
選び取るために、13以上の（more than 13）塩基よりな
るオリゴヌクレオチドプローブであつて、その塩基配列
がB.ズブチリス中のレバンスクラーゼをコード化した塩
基配列［Steinmetzら、Mol.Gen.Geet 200:220−228［19
85］）またはB.アミロリクエフアシエンス中のレバンス
クラーゼ化塩基配列（図３参照）から選抜されるオリゴ
ヌクレオチドプローブを作ることができる。かかるプロ
ーブは標準的方法によつて合成するか、商業的に購入す
ることができる。用い得るプローブの例として以下の配
列を有するプローブが挙げられる： 単離された断片がEcoR I制限エンドヌクレアーゼ部位
で始まる５′末端から３′の方向に少なくとも893のヌ
クレオチド対を含有することが重要である。その理由は
そこに含まれるヌクレオチドが発現要素及びレバンスク
ラーゼ遺伝子のシグナルペプチドのための配列を構成す
るからである。
目的とする配列を得るためには、発現要素のみなら
ず、シグナルペプチドをコード化した配列、成熟レバン
スクラーゼ遺伝子及びひよつとしてクローニングベクタ
ーからの２〜３塩基対も含有するより大きな断片を単離
するのがよい。これはライブラリーからの特定のプロー
ブ及び標準的微生物学的選択方法によつて同定し、単離
したフアージクローンを、製造者の指示に従つてBlue S
criptプラスミドベクター（Stratagene、既出）に変換
することによつて行うことができる。目的とする発現要
素及びシグナルペプチド及び成熟レバンスクラーゼをコ
ード化した配列を含有するDNA断片はBlue Scriptプラス
ミドから、それをEcoR V及びXba Iで消化し、少なくと
も2350のヌクレオチド対を含有する断片を単離し、回収
することによつて単離することができる。得られる断片
はグラム陽性菌中で多重コピープラスミドとして存在す
ることができるベクター中に挿入することができ、本発
明の１つの面を表す。
本発明の１つの好ましい態様は2350塩基対の断片を、
その最初の893の塩基対の３′末端（すなわち、29塩基
対のシグナル配列の３′末端）で成熟レバンスクラーゼ
の開始コドンの近くに１以上の制限エンドヌクレアーゼ
切断部位を挿入することによつて、さらに修飾すること
によつて構築したベクターである。かかる制限エンドヌ
クレアーゼ部位の１つはEcoR Vのそれである。それは市
販の突然変異誘発キツト、例えばBioRan、1414 Harbour
Way South、リツチモンド、CA 94894からのMuta−遺伝
子フアゲミド（phagemid）インビトロ突然変異誘発キツ
トに付帯の指示に従つて部位特異的突然変異誘発によつ
て挿入できる（Smith［1985］、既出）。挿入された制
限エンドヌクレアーゼ切断部位（site or sites）は興
味ある外来タンパク質をコード化した遺伝情報を挿入
し、該遺伝情報の発現を先行する発現要素の制御下に置
く便利な方法を提供する。ついで、バチルス・スピーシ
ーズ、好ましくはB.アミロリクエフアシエンスからの発
現、調節及びシグナル配列を有する修飾断片をグラム陽
性菌中で多重コピープラスミドとして存在できるプラス
ミドベクター中に挿入することによつて好ましい型のベ
クターを作る。本発明のベクター（すなわち、シグナル
配列及び適当な読取り枠でそれに結合したポリペプチド
コード化DNA配列のすぐ下流に制限エンドヌクレアーゼ
切断部位を含むように修飾した、好ましくは2350塩基対
の断片）で形質転換したグラム陽性菌、特にB.ズブチリ
スは挿入された制限エンドヌクレアーゼ部位（site or
sites）によつて修飾された断片に機能し得るように（o
perably）結合した遺伝配列（genetic sequence）によ
つてコード化されたいずれのタンパク質をも、スクロー
スの存在下に、そのときだけに、生産し、培地中に分泌
する。
B.アミロリクエフアシエンスライブラリーからのsac
B［Bam P］遺伝子を含有する適当なクローンを選抜する
常用の技術、例えば予想されたB.アミロリクエフアシエ
ンスの既知のB.ズブチリスレバンスクラーゼ遺伝子の配
列との相同性に基いて合成プローブを作つて該クローン
を選抜する技術を用いることができるが、２つのスピー
シーズからの遺伝子の間には、宿主菌体の染色体遺伝子
と本発明によつて工作され、多重コピープラスミド上に
コード化された異種遺伝子との間に好ましくない（dele
terious）組換えが起こるのを防ぐ異質性（heterogenei
ty）が依然として十分にある。かくして本発明のベクタ
ーの使用によりプラスミドの不安定性がさけられる。
本開示に含まれる情報によると、バチルス・スピーシ
ーズを通して実質上相同である、レバンスクラーゼ遺伝
子及びその発現要素の領域に対応する１セツトのプロー
ブ、例えば２−４個のプローブをデザインできる。遺伝
子工学の標準的技術を用いて、いずれかのバチルス・ス
ピーシーズから構築したライブラリーをルーチンにスク
リーニングして本発明の遺伝子に相同な目的とする遺伝
子、または同様に相同な、他の発現要素及びシグナルペ
プチドDNA配列をルーチンに見つけ出すことができる。
発現系のソース（source）として用いられる他の可能性
があるバチルス・スピーシーズとして、B.パミリス（pu
milis）、B.ブレビス（brevis）、B.リケニホルミス（l
icheniformis）及びB.ステアロサーモフイラス（stearo
thermophilus）が挙げられる。さらに、バチルスにおけ
る遺伝子の高度保存領域を決定することによつて、関連
した属のレバンスクラーゼ遺伝子を見つけ出すプローブ
をルーチンにデザインできる。
かくして、本発明のベクター及び方法を用いて、今
や、本発明の安定なベクターで広範囲の細菌宿主を、異
種ポリペプチドをそこで発現させるため、形質転換する
ことができることがわかる。さらに、宿主スピーシーズ
がベクター上の発現要素の調節要素と適合し得る調節要
素を含有している場合には、かかる発現を調節すること
が可能である。さらに、当業者に公知の技術を用いて、
本発明のベクターの調節された発現に必要とされ得る調
節要素を、これらの調節要素を欠くスピーシーズ中に、
付加的に共形質転換する（co−transform）ことが可能
である。その結果、望まれる場合には、本発明のベクタ
ーをこれらの調節要素を正常には含まないスピーシーズ
中に調節された仕方で発現することができる。かくして
本発明の好ましい面は異種ポリペプチドをバチルス株中
に、調節された仕方で、菌体内にもしくは培養培地中に
分泌して生産するための、ベクター、細菌株及び方法を
提供する。本発明の別の好ましい面は異種ポリペプチド
を非バチルス、好ましくは、しかし必須ではなく、グラ
ム陽成菌中に、調節されない仕方で、菌体中にもしくは
培養培地に分泌して生産するための、ベクター、細菌株
及び方法を提供することである。
さらなる骨折りなしに、当業者は上記説明を用いて、
本発明をその最高程度まで利用することができると思わ
れる。従つて、以下の好ましい具体的態様は端に例示的
なものとして本開示の残りについて制限的でなく解され
るべきである。
上記において及び以下の実施例において、すべての温
度はセ氏で補正されないものとして示され、他に指示が
なければ、すべての部及びパーセンテージは重量によ
る。
本明細書で引用したすべての出願、特許及び刊行物の
本文をここに参考に加入する。
実施例 B.アミロリクエフアシエンスDNAの単離方法 B.アミロリクエフアシエンス（25ml）をPenassay培地
（Difco、デトロイト、ミシガン）中で５時間増殖させ
る。細菌を遠心分離によつて回収し、50mMトリス−50mM
EDTA緩衝液（pH8.0）5mlに再懸濁する。リソチームを
最終濃度800μg/mlになるように加え、得られる混合物
を37℃で15分インキユベートする。ドデシル硫酸ナトリ
ウム及びプロテイナーゼＫ（それぞれ最終濃度0.5％及
び50μg/ml）を加え、得られる混合物を５分間インキユ
ベートする。ついで試料を等量のトリス緩衝液（100m
M、pH8.0）飽和フエノールと混合する。フエノールの除
去後、水層を等量のクローンホルム：イソアミルアルコ
ール（24:1）で２回抽出する。得られる水層を除去し、
NaClを最終濃度0.4Mになるように加える。２倍容量のエ
タノールを穏やかに加え、DNAをパスツール（Pasteur）
ピペツトで渦に巻いて界面から取り出した。単離したDN
Aを70％エタノール溶液ですすぎ、真空乾燥した。単離
したDNAを10mMトリス−1mM EDTA中で可溶化し、その濃
度を当業者に周知の方法を用いて決定した。
実施例１ sac B［Bam P］遺伝子の単離 レバンスクラーゼ（lvs）をコード化した、B.アミロ
リクエフアシエンスsac B［Bam P］遺伝子を、適切な配
列を含有するクローンを同定する手段としてオリゴヌク
レオチドプローブを用いて、B.アミロリクエフアシエン
スのλZAPライブラリーから単離した。B.アミロリクエ
フアシエンスλライブラリーは市販のEcoR I消化λZAP
DNA及びGigaパツクプラス（pack plus）（Stratagene、
1109 North Torrey Pines Road,LaJolla,CA92037）を用
い製造者の指示に従つて構築した。
Ａ オリゴヌクレオチドプローブの合成 各々30塩基の２つのオリゴヌクレオチドプローブであ
つて、それらの配列がB.ズブチリス（sac B［Bsu］）遺
伝子（Steinmetzら、既出）についての報告されたヌク
レオチド配列に基づいている該プローブを合成した。各
オリゴヌクレオチドプローブの配列を以下に示す。
各プローブの試料１μ（400ng）を、標準的プロト
コル（protocol）（Maniatisら、既出、122頁）に記載
されたようにして、32PλATPで５′末端標識した。該２
つのプローブ（52142−2NP及び52142−3NP）の等量をプ
ールし、（pooled）、さらなる使用のため混合した。
Ｂ 宿主菌体の感染及びB.アミロリクエフアシエンスラ
イブラリーのスクリーニング 用いた方法は本質的にManiatisら、同上に記述された
のと同じであつた。E.コリ株BB4を宿主菌体として用
い、B.アミロリクエフアシエンスλZAPフアージプラー
ク／プレート５μで感染させた。感染菌体を、8NZYM
平板（plates）上で、NZYMトツプアガー3.0mlを用いる
ポアプレート法（pour plate method）によつて1000−1
500の濃度に平板培養した。平板を37℃で一夜インキユ
ベートした。得られたプラークからのDNAをニトロセル
ロースフイルターに移した。ついでフイルターをB.アミ
ロリクエフアシエンスsac B［Bam P］遺伝子の存在につ
いて上述の放射標識オリゴヌクレオチドプローブ（5214
2−NP及び52142−3NP）を用いてスクリーニングした。
全部で11200のプラークをスクリーニングした。
標識したオリゴヌクレオチドプローブ（52142−2NP及
び52142−NP）（60ng）を６×SSC/0.5％SDS緩衝液中ニ
トロセルロースフイルターに37℃で16時間ハイブリツド
した。ニトロセルロースフイルターを６×SSC/0.1％SDS
緩衝液で洗浄した。最初の洗浄（wash）は室温で２回目
は37℃で行つた。引き続いてのフイルターのオートラジ
オグラフはプローブとハイブリツドした５つのクローン
を明らかにした。しかしながら、高いバツクグラウンド
活性があつたので、フイルターを37℃で再洗浄した。得
られたフイルターのオートラジオグラフをプローブにハ
イブリツドしたDNAを含有する可能性のある２つのクロ
ーン（2A及び2cと名づけた）があることを示した。
Ｃ sac B［Bam P］断片を含有するフアージプラークの
単離及び精製 プローブとハイブリツドしたプラークを単離し、そこ
にあるフアージをManiatisら、既出によつて精製した。
感染及びスクリーニング操作を繰り返した（二次スクリ
ーン）。二次スクリーンではフアージクローン2A及び2C
からのプラークのそれぞれ約20％及び80％がプローブと
バイブリツドした。これらの二次スクリーンから陽性プ
ラークを選抜し、フアージを生産し、ついでさらにスク
リーニングした。三次スクリーンからのオートラジオグ
ラフはすべてのプラークがオリゴヌクレオチドプローブ
にハイブリツドすることを示した。クローン2A及び2B共
スクリーニングした。
Ｄ λDNAの単離及びフアゲミド（Blue Script）の切除 推定上のsac B［Bam P］遺伝子配列を有するλZAPフ
アージクローン2A及び2Cを製造者（Stratagene）の指示
に従つてBlue Scriptプラスミドベクターに変換した。
得られたλZAP 2Aクローン及びλZAP 2Cクローンからの
Blue ScriptpプラスミドをそれぞれpBE300及びpBE301と
命名した。
Ｅ クローン化したB.アミロリクエフアシエンスDNA断
片の性格づけ Stratagenの指示に従つてpBE300及びpBE301から別々
にプラスミドDNAを単離した。各プラスミドからのDNA
（５μ）を総容量20μ中のEcoR Iで消化した。得ら
れた制限断片を、Maniatisら、既出、64頁に記録された
ように、0.8％ゲルを用いるポリアクリルアミドゲル電
気泳動（PAGE）によつて分析した。pBE300のEcoR I消化
物は3.0及び1.5kbサイズの断片に相当する２つのバンド
を生じ、他方pBE301のEcoR I消化物は、pBE300の場合と
同様、3.0及び1.5kbサイズのDNA断片、及びさらに0.6kb
の断片に相当するバンドを生じた。放射標識したオリゴ
ヌクレオチドプローブ（52142−2NP及び52142−3NP）を
Maniatisら、既出に記載されたサザンバイブリダイゼー
シヨン法に従つて該断片にハイブリツドさせた。プロー
ブは1.5kb断片とのみバイブリツドした。このことはそ
れがsac B［Bam P］遺伝子を含有することを示唆する。
制限マツピング（mapping）は0.6kb断片が1.5kb断片に
対し５′に配向している（was oriented 5′to the 1.5
kb fragmen）ことを実証した。3.0kb断片はBlue Script
ベクター（2.9kb）の大きさに相当する。pBE301の詳細
な制限地図を図１に示す。
両EcoR I断片の配列決定計画の概要を図２に示す。種
々の制限断片をフアージベクターM13mp18及びM13mp19
（Pharmacia,Inc.,800Centennial Avenue,Piscataway,N
J08854から購入）中にクローン化した。DNA配列をUnite
d States Biochemical Corp.,P.O.Box22400、クリーブ
ランド、オハイオから購入したSequenaseTM配列決定用
キツトを用いて得た。２つの鎖（strands）のいくつか
の重なるクローンを配列決定した。そのデータは0.6kb
及び1.5kb断片がそれぞれ長さ801bp及び1549bpであるこ
とを明らかにした。かくして、連続した（contiguous）
2350塩基のヌクレオチド配列が生成した（generated）
（図3a参照）。配列の分析は472のアミノ酸をコード化
した大きな読取り枠を示した。成熟タンパク質に先行す
る−31及び−29に２つの可能な開始コドンがあつた。し
かしながら、コドン−29のみがバチルスリボソーム結合
部位［Mchaughlinら、J.Biol.Chem.256:11283−11291
（1981）］によつて先行された。このように、レバンス
クラーゼについてのシグナルペプチドは恐らく長さ29の
アミノ酸であり、成熟タンパク質は443個のアミノ酸を
含む。コード領域から上流に向うDNA配列の分析はB.ズ
ブチリスRNAポリメラーゼ（Sig A）［Losickら、Ann.Re
v.Gen.20:625−669（1986）］の主形態によつて認識さ
れると考えられるプロモーター配列に似たDNA配列によ
つて先行された調節配列（bp706−bp764）を明らかにす
る。コード領域の末端はρ−独立転写ターミネーター
（rho−independent transcriptional terminator）に
似た逆方向反復を有する。この分析の図示的表示を図3b
に示す。
sac B［Bam P］及びsac B［Bsu］のヌクレオチド配列
をWisconsinデータベースGapプログラムを用いて比較し
た。82.6％の相同性が観察された。成熟タンパク質の推
定アミノ酸配列は90％の相同性を示す。
sac B［Bam P］の推定調節領域におけるステム及びル
ープ構造の自由エネルギーB.ズブチリスsac B遺伝子及
び２つの構成的調節変異体についてのShimotsuら（既
出）のデータと、調節と自由エネルギーの間に何らかの
相関々係が見い出されるかどうかを見るため、比較した
（自由エネルギーが高いほど、調節がよくなる）。自由
エネルギー計算はsac B［Bam P］がB.ズブチリス中でス
クロースによつて調節されると予見できるかどうかを明
らかにしなかつた。
実施例２ B.ズブチリス中でのB.アミロリクエフアシエンスレバン
スクラーゼの調節可能な発現 pBE301からのsac B［Bam P］のEcoR V−Xba I断片を
図５の概略に従つてプラスミドpBE20中にクローン化し
て新規ベクターpBE501を得た。pBE20はF1開始点を含有
するE.コリーB.ズブチリスシヤトルベクターである。pB
E20はE.コリについての複製開始点、1Fオリ及び抗生物
質耐性マーカーampRを含有するpTZ18R（フアーマシア）
のHind III消化物と、B.ズブチリス中の多重コピープラ
スミドであつてB.ズブチリス中での選抜のためのクロラ
ムフエニコール耐性マーカーを含有するスタフイロコツ
メス・アウレウス（aureus）プラスミドである、pC194
（Bacillus Stock Center、オハイオ州立大学、Collumb
us、OH43210）のHind III消化物とを連結することによ
つて構築した。pBE501もE.コリーB.ズブチリスキヤトル
ベクターであり、pBE501及びpBE20でB.ズブチリス株BE1
010を形質転換した。各プラスミドで形質転換した細菌
の培養物についてレバンスクラーゼレベルを測定した。
各形質転換培養菌を50μMnCl2含有Penassay培地中、
２％スクロースの存在及び不存在下で８時間増殖させ
た。菌体を上清から分離し、プロテアーゼ阻害剤（フエ
ニルメチルスルホニルフルオライド）を加えた（1mM最
終濃度）。酢酸の添加によつて上清のpHを4.2に調節
し、ついで等量のエタノールを加え、十分に混合した。
４℃で一夜インキユベート後、沈殿タンパク質を39000x
gで30分の遠心分離によつて回収した。タンパク質を50m
Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）中で可溶化した。スク
ロースから放出されるグルコースの量を測定することに
よつてレバンスクラーゼ活性を求めた。酵素は１％スク
ロースを含有する50mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）
中でこれを37℃で30分インキユベートすることによつて
アツセイした。70℃での加熱によつて酵素を不活性化
し、グルコース量をシグマからのGlucose TrinderTMキ
ツト（sigma Chemicals,P.O.ボツクス14508、セントル
イス、MO63178、Cat.No315−100）を用いて測定した。
活性は培養物1mlあたり37℃で１時間に放出されたグル
コースの量として表す。１単位は培養上清1mlあたり１
時間に放出された１μｇのグルコースに相当する。
表１に示すごとく、菌株をスクロースの存在下に増殖
させた場合にのみレバンスクラーゼ活性が検出された。
pBE20で形質転換した細菌の培養物中に観察された活性
はB.ズブチリス中に正常に存在するsac B［Bsu］の発現
による。
（染色体sac B［Bsu］に突然変異を有するB.ズブチリス
株I 5194もpBE20及びpBE501で形質転換した。レバンス
クラーゼ活性はスクロースの存在下でのみ及びpBE501で
形質転換した細菌の培養物においてのみ検出された。） 実施例３ B.アミロリクエフアシエンスのレバンスクラーゼ遺伝子
のクローン化された発現要素の調節可能な機能性の実証 Williamsら、J.Bacteriol.146:1162−1165（1981）
（Bacillus Stocs Center）によつて記載された、プロ
モーターを欠くcat86遺伝子（クロラムフエニコール耐
性）を含有するプロモータークローニング用ベクターpP
L703をsac B［Bam P］プロモーター／調節領域のスクロ
ースで誘導される性質をさらに評価するために用いた。
pBE301の0.8kb EcoR I断片をpPL703のEcoR I部位でクロ
ーン化してpBE305を得た。B.ズブチリスBR151をpBE305
で形質転換し、トリプトース血液寒天ベース平板（tryp
tose blood agar base plates）［TBABアガー（Difco、
デトロイト、ミシガン）＋Kan（20μg/ml）］上で培養
した（plated）。コロニーを選び取り（picked）、TBAB
＋cm（10μg/ml）を含有する寒天平板、及びTBAT＋２％
スクロース＋cm（10μg/ml）を含有する寒天平板に乗せ
た（patched）、クロラムフエニコール耐性はスクロー
スを含有する平板についてのみ観察された。pPL703のみ
で形質転換したB.ズブチリスはスクロースの存在にかか
わらず検出し得るCAT活性を有さなかつた。このよう
に、sac B［Bam P］プロモーターは多重コピープラスミ
ド上でスクロースによつて調節し、B.ズブチリスにおけ
る菌体内タンパク質発現に用いることができる。
実施例４ 制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有する調節可能sac
B［Bam P］ベース分泌ベクターの構築 B.ズブチリス内の分泌ベクターは以下の発現要素を提
供しなければならない：転写及び翻訳開始部位及びシグ
ナルペプチドコード領域。異種遺伝子融合物（fusion）
を容易に構築するため、図６に示すごとく、sac B［Bam
P］中にシグナルペプチドコード領域の３′末端から２
コドン下流にEcoR V部位を作出した。Muta遺伝子フアゲ
ミドインビトロ突然変異誘発キツト（BioRad,1414 Harb
our Way South、リツチモンド、（A94804）を用いて部
位特異的突然変異を誘発した。pBE504（pBE504は、シグ
ナルペプチド中に２つのさらなるサイレント突然変異を
有することを除き、pBE501と同様である）から一本鎖鋳
型を作り、オリゴヌクレオチド（CTTCGCGAAAGAAGATATCA
ATAACCAAAAAGC）を用いて６塩基挿入物によるEcoR V部
位を作出した。EcoR V部位の存在は制限消化によつて決
定し、後でDNA配列決定によつて確認した。得られたプ
ラスミドをpBE311（図６参照）と名づけた。B.ズブチリ
ス株BE10101をpBE311で形質転換し、培養上清中のレバ
ンスクラーゼ活性を測定した。その結果、６つの塩基の
挿入によつてコード化された２つのアミノ酸（アスパラ
ギン酸及びイソロイシン）の導入が酵素活性に影響を与
えなかつたことが明らかとなつた。
実施例５ 外来遺伝子産物の調節可能な分泌 その生産物がこの遺伝子の本発明の好ましいベクター
への挿入によつて調節可能に生産できる異種遺伝子の例
はブドウ球菌タンパク質の（spa）についての例であつ
た。spa遺伝子はフアーマシア、800Cenennial Avenue,P
iscataway,NJ 088854から購入したプラスミドpRIT5から
得た。pRT15からのspa遺伝子はpBE311のEcoR V部位に融
合できる便利な制限部位を含有していない。sac B［Bam
P］に融合したときプロテインＡが分泌されるかどうか
は演繹的に（a priori）知られていなかつた。しかしな
がら、B.アミロリクエフアシエンスアルカリプロテアー
ゼシグナルペプチドがプロテインＡを変位させる（tran
slocate）ことができることは実証されていた（Vasanth
a,N.及びThompson,L.D.,J.Bacteriol.165、837−842［1
986］）。pBE20をベースにしたベクターであるpBE26は
B.アミロリクエフアシエンスからのアルカリプロテアー
ゼ遺伝子（apr）（Vasantha、同）及びアルカリプロテ
アーゼシグナルペプチドコード領域から２コドン下流の
唯一のEcoR V部位を含有する。pBE26をEcoR V及びPstで
消化し、予めBcl1で消化したpRIT5に連結した。５′突
出部（overhang）をうめてEcoR Vと適合し得る平滑末端
とした。得られたプラスミドをPst Iで切断した。正し
いプラスミドをpBE35と名づけたが、このものはBal1部
位及びEcoR V部位を失つていた。Bal1−EcoR V接合部
（junction）に部位特異的突然変異誘発によつてEcoR V
部位を再作出した。得られたプラスミドをpBE45と名づ
けた。かくしてpBE45は成熟プロテインＡ配列中のBcl1
部位が部位特異的突然変異誘発によつてEcoR V部位に変
換されたapr−spa融合物（fusion）を含有する。pBE45
及びpBE311をKpn−EcoR Vで消化し、連結した。正しい
制限パターンを有するプラスミドを選抜し、pBE312（図
７参照）と名づけた。融合接合部を通つての（across）
DNA配列は正しいsac B［Bam P］−spa配列が得られてい
たことを示した。
B.ズブチリス株BE1010（△arpE、△npr、trpC2、metB
10、lys3）の培養菌をpBE312またはpBE20で別々に形質
転換し、ニトロセルロース及び酢酸セルロースフイルタ
ー（filters）で覆つたTBAB＋２％スクロース＋cm（５
μg/ml）上で平板培養した。平板を一夜インキユベート
した。ついでニトロセルロースフイルターを取り外し
て、コロニーイムノアツセイ［saundersら、J.Bacterio
l.169:2917−2925（1987）］によつて処理した（proces
sed）。プロテインＡ陽性の表現型を有するコロニーは
スクロースを細菌培地中に存在させておいた場合にのみ
観察された。さらに、pBE312で形質転換したB.ズブチリ
スBE1010の培養菌をスクロースの存在下及び不存在下で
増殖させた。両者の菌体及び培養上清画分のプロテイン
Ａをイムノブロツテイングによつて分析した。プロテイ
ンＡはスクロースと共にインキユベートした培養物の培
養上清中に主として（＞95％）見い出され、菌体物質に
関して見い出されたのは少量（＜５％）にすぎなかつ
た。スクロースの不存在下でインキユベートした培養物
は発現ベクターのごくわずかな構成的読み過しによる、
非常に低いレベルのプロテインＡしか有さないことが判
明した。
上記実施例は本発明の一般的にまたは具体的に説明し
た反応体及び／または操作条件を上記実施例で用いたそ
れらと置き代えることによつても同様な成功下に繰り返
すことができる。
上記説明から理解できるように、本発明の主な態様は
次のとおりである。
1.宿主バチルス・ズブチリスを形質転換するのに適し
た、スクロースで調節可能な組換え発現ベクターであつ
て、 ａ） プロモーター配列、及びスクロースもしくはスク
ロース類縁体によつて調節可能な調節配列よりなる、ス
クロースで調節可能な発現要素であつて、該バチルス・
ズブチリス以外の微生物に由来する該発現要素、及び ｂ） 該発現要素に機能可能に結合し、そしてあるポリ
ペプチドをコードするDNA配列 を含有する該ベクター。
2.発現要素がレバンスクラーゼ遺伝子に由来する上記１
のベクター。
3.レバンスクラーゼ遺伝子がバチルス・アミロリクエフ
アシエンスに由来する上記２のベクター。
4.ポリペプチドがレバンスクラーゼである上記１のベク
ター。
5.レバンスクラーゼがバチルス・アミロリクエフアシエ
ンスからのものである上記４のベクター。
6.ポリペプチドが発現要素に対し異種である上記１のベ
クター。
7.スクロース類縁体がチオスクロースである上記１のベ
クター。
8.ベクターがプラスミドである上記１のベクター。
9.シグナルペプチドをコード化したDNA配列をさらに有
する上記１のベクター。
10.シグナルペプチドをコード化したDNAがレバンスクラ
ーゼ遺伝子に由来する上記９のベクター。
11.シグナルペプチドをコード化したDNAが発現要素に対
し異種の遺伝子に由来する上記９のベクター。
12.発現要素の下流に唯一の制限エンドヌクレアーゼ切
断部位をさらに含有する上記１のベクター。
13.シグナルペプチドをコード化したDNA配列の下流に、
機能し得るように該シグナルペプチドに結合した唯一の
制限エンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含有する上記
９のベクター。
14.上記１の、スクロースで調節し得る発現ベクターで
形質転換したバチルス・ズブチリス。
15.シグナルペプチドをコード化したDNAをさらに含有す
る上記14のバチルス・ズブチリス。
16.シグナルペプチドがレバンスクラーゼ遺伝子に由来
する上記15のバチルス・ズブチリス。
17.バチルス・ズブチリス中の異種遺伝子によつてコー
ド化されたポリペプチドを調節可能に生産する方法であ
つて、 ａ） 上記14の形質転換バチルス・ズブチリスを適当な
栄養培地中該異種遺伝子が発現される条件下に増殖さ
せ、ついで ｂ） 該ポリペプチドを単離する ことよりなる方法。
18.バチルス・ズブチリス中の異種遺伝子によつてコー
ド化されたポリペプチドを調節可能に生産する方法であ
つて、 ａ） 上記15の形質転換バチルス・ズブチリスを適当な
栄養培地中該異種遺伝子が発現される条件下に増殖さ
せ、ついで ｂ） 該ポリペプチドを単離する ことよりなる方法。
19.発現要素がレバンスクラーゼ遺伝子に由来し、発現
を可能にする条件が栄養培地におけるスクロースまたは
スクロース類縁体の存在である上記16の方法。
20.ポリペプチドがレバンスクラーゼである以上19の方
法。
21. ａ）ｉ）プロモーター配列、及び ii）スクロースまたはスクロース類縁体によつて調節可
能な調節配列 よりなるスクロースによつて調節可能な発現要素、及び ｂ） ポリペプチドをコード化したDNA配列であつて、
該発現要素が機能し得るように結合したDNA配列 よりなるDNA断片であつて、縮主バチルス・ズブチリス
中でスクロース調節下に発現可能であり、かつ該バチル
ス・ズブチリス以外の微生物に由来するDNA断片。
22.各々請求項１のベクターである、プラスミドpBE30
0、pBE301、pBE501、pBE305、pBE504、pBE311及びpBE31
2。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】宿主バチルス・ズブチリスを形質転換する
    のに適した、スクロースで調節可能な組換え発現ベクタ
    ーであって、 ａ） プロモーター配列、及びスクロースもしくはスク
    ロース類縁体によって調節可能な調節配列を含むスクロ
    ースで調節可能な発現要素、並びに ｂ） 該発現要素に機能可能に結合し、そしてポリペプ
    チドをコードするDNA配列 を含んでなり、かつ該発現要素がバチルス・アミロリク
    エフアシエンスのレバンスクラーゼ遺伝子に由来するも
    のであるベクター。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の、スクロースで調節し得
    る発現ベクターで形質転換したバチルス・ズブチリス。
  3. 【請求項３】バチルス・ズブチリス中に異種遺伝子によ
    ってコード化されたポリペプチドを調節可能に生産する
    方法であって、 ａ） 請求項２に記載の形質転換バチルス・ズブチリス
    を適当な栄養培地中で該異種遺伝子が発現される条件下
    に増殖させ、ついで ｂ） 該ポリペプチドを単離する ことを含んでなる方法。
  4. 【請求項４】ａ）ｉ） バチルス・スピーシーズに由来
    するプロモーター配列、及び ii） 下記配列： で示される推定調節配列 を含むスクロースによって調節可能な発現要素、並びに ｂ） 該発現要素に機能しうるように結合したポリペプ
    チドをコード化したDNA配列 を含んでなるDNA断片であって、該DNA断片が宿主バチル
    ス・ズブチリス中でスクロース調節下に発現可能である
    ものであり、そして該スクロースによって調節可能な発
    現要素がバチルス・アミロリクエフアシエンスのレバン
    スクラーゼ遺伝子に由来するものであるDNA断片。
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