JP3036844B2

JP3036844B2 - Ｃ反応性タンパク断片の部分修飾及び逆転置テトラペプチド類似体

Info

Publication number: JP3036844B2
Application number: JP05517942A
Authority: JP
Inventors: ヴェルディーニ，アントニオ・シルヴィーオ; ピノリ，マッシーモ; カペレッティ，シルヴァーナ; ガゼーロ，ラウラ; レオーニ，フラビオ
Original assignee: イタルファルマコ・ソシエタ・ペル・アチオニ
Priority date: 1992-04-16
Filing date: 1993-04-02
Publication date: 2000-04-24
Anticipated expiration: 2015-04-24
Also published as: EP0636140B1; AU667096B2; NO943903D0; EP0636140A1; ZA932614B; JPH07505640A; NO943903L; US5521159A; CN1078476A; ITMI920939A1; US5578575A; NZ251697A; DE69313842T2; IT1254883B; AU3951493A; FI944224A; TW242145B; CN1039124C; ES2109487T3; ATE157987T1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、Ｃ反応性タンパク（以降、CRPとする）断
片の逆転置（retro−inverted）テトラペプチド類似体
に関する。

CRPは、その血中濃度が一般的には非常に低いが、炎
症過程の後には2,000倍にも上昇するタンパク質である
［J.J.Morley及びI.Kushner,Am.N.Y.Acad.Sci.,389,406
−418（1989）］。F.A.Robey等によるJ.Biol.Chem.,26
2,No.15,7053−7057（1987）は、３種類のCRPテトラペ
プチド配列が、タフトシンのそれと非常に類似している
ことを開示している。化学的に合成されたテトラペプチ
ドは、質的、量的にもタフトシンと同様の方法で、食作
用を有する白血球を刺激し、超酸化物（スーパーオキシ
ド）を産生し、単核細胞によるインターロイキン１の産
生を誘導することが示されている。これら３種のCRPテ
トラペプチドは、タフトシンと同様に、in vivoにおい
てプロテアーゼにより速やかに代謝されて、親ペプチド
の生物学的活性を競合的に阻害するペプチド代謝物を産
生するはずである。現在では驚くべきことに、該CRPテ
トラペプチド断片の、部分修飾され、Ｎ末端が逆転置さ
れた類似体が、タフトシンで既に認められているような
免疫調整活性を維持しながらも、酵素による分解に対し
てかなりの安定性を示すばかりでなく（EP−Ａ−0 253
190を参照）、特に、敗血症性ショックの治療において
特異的に、その構造及び使用量に応じて異なる生物学的
効果を呈しうることが認められた。従って、本発明は、
一般式（Ｉ）：［式中、Ｒは水素原子又はスレオニンの側鎖；R₁はアル
ギニン、ロイシン又はグルタミンの側鎖；及びR₂は水素
原子又は代謝により脱離されるアシル基；但し、R₁がア
ルギニンの側鎖である場合、Ｒはスレオニンの側鎖では
ない］で示される逆転置テトラペプチド及びそのジアステレオ
異性体、ならびに薬理学的に許容される塩、エステル及
びアミドに関する。

特に、本発明は、逆転置テトラペプチドであるgGly−
（R,S）mLys−Pro−Arg、gThr−（R,S）mLys−Pro−Le
u、gThr−（R,S）mLys−Pro−Gln［式中、接頭辞ｇ及び
ｍは、アミノ酸がそれぞれgem−ジアミン及びマロニル
残基であることを意味する］、及びそれらのジアステレ
オ異性体に関する。

本発明の逆転置テトラペプチドは、当業界の技術者
が、逆転置させるアミノ酸の種類に応じて選択すること
ができる公知の方法により合成される。

例えば、gem−ジアミン残基が1,1−ジアミノメタン基
（gGly）である場合、逆転置テトラペプチドは、まず、
N,O−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（TSMA
c）、トリメチルシリルクロリド（TMS−C1）又はトリメ
チルシリルシアニド（TMSCN）などのシラン化剤の存在
下で、メルドラムの酸誘導体、ｃ−mLys（Ｚ）（つま
り、５−［４−ベンジルオキシカルボニル］−2,2−ジ
メチル−1,3−ジオキサン−4,6−ジオン）を、Ｈ−Gly
−NH₂と反応させることによって調製してもよい（M.J.
O.Anteunis ＆ Chr.Becu,Bull.Soc.Chim.Belg.,96119−
139,1986）。このようにして得られたプソイドペプチ
ド、OH−（R,S）mLys（Ｚ）−Gly−NH₂（Ｚはベンジル
オキシカルボニル）のマロニル残基上の第２の基を、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（DCC）及び１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール（HOBT）の存在下でｔ−ブチル
プロリネートと縮合させて、プソイドトリペプチド
［（R,S）mLys（Ｚ）−Gly−NH₂］−Pro−Ｈが得られ
る。そのプロリンのカルボキシル基は、DCC及びＮ−ヒ
ドロキシサクシンイミド（HOSu）により活性化させ、保
護基を有していないアルギニンと反応させて［Gottlie
b,P.et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,419,12（1983）］、逆
転置テトラペプチド［（R,S）mLys（Ｚ）−Gly−NH₂］
−Pro−Arg−OHが得られる。次いでその精製を、RP−DC
置換クロマトグラフィによって行い、この方法によっ
て、所望であれば、ジアステレオ異性体の分離を行うこ
とも可能である。精製物は、残存する保護基を除去する
ために、パラジウムの存在下でHCOOHにより接触水素添
加し、次いでグリシンカルボキサミドをgGlyのＮ末端残
基に変換するために、［I,I−ビス（トリフルオロアセ
トキシ）−ヨード］ベンゼン（TIB）により処理する。
イオン交換クロマトグラフィによる最終的精製により、
最終生成物を酢酸塩として得ることができる。

別の例としては、スレオニンがgem−ジアミン残基で
ある例が挙げられる。逆転置テトラペプチドの合成は、
Ｚ−Pro−OH及びＨ−Ｙ−OtBuの縮合（ここでＹは、式
Ｉの定義における記載に従って、所望であれば適宜保護
されていてもよいアミノ酸Leu又はGlnを表わす）と、続
いて接触水素添加によるベンジルオキシカルボニル基の
除去とによって得られる、Ｃ末端ジペプチドから始ま
る。このようなジペプチドは、例えばイタリア国特許出
願明細書第21349 A/90号に記載されたように調製された
Ｎ末端逆転置ジペプチドと反応させる。

適当なカルボキシ活性化剤の存在下で、予めシラン化
されたＨ−Thr（tBu）−OHをMNP−COOHによりアシル化
することによって得られたMNP−Thr（tBu）−OHを、ビ
フェニルフォスフォラジド（DPPA）で処理することによ
って対応するアジドが得られ、これを加熱することによ
ってイソシアネートが得られる。これを、触媒量のアミ
ン、好ましくはトリエチルアミンもしくはジイソプロピ
ルアミン等の３級アミンの存在下で、チオフェノールで
処理することによって、フェニルチオカルボニル誘導
体、MNP−gThr（tBu）−PTCが得られる。その後、例え
ば希釈水酸化ナトリウムで処理することによってアミン
残基から保護基を除去して、MNP−gThr（tBu）−Ｈを得
る。後者の物質とｃ−mLys（Boc）との縮合により、Ｎ
−末端プソイドジペプチド、MNP−gThr（tBu）−（R,
S）mLys（Boc）を得、次にこれをDCC/HOBTの存在下でＨ
−Pro−Ｙ−OtBu（ここでＹは上記で定義したとおりで
ある）と縮合させて、保護基を有する式Ｉの逆転置テト
ラペプチド（ここでＲは１−ヒドロキシエチルである）
を得る。酸で処理することにより、gem−ジアミン残基
の保護基以外のすべての保護基が除去される。RP−DCに
よる精製と同時に、所望であれば２種類のジアステレオ
異性体を分離することが可能である。MNP基は、例えば
スポンジ状パラジウムにギ酸アンモニウムを用いること
によって、接触水素添加により除去してもよい。逆転置
テトラペプチドは、適当なクロマトグラフ法による最終
精製に供せられる。

特許請求されているクラスを代表しているいくつかの
逆転置テトラペプチドの調製例をここに述べるが、これ
は如何なる方法においても本発明を制限することを意図
するものではない。

保護された断片及び逆転置テトラペプチドのアミノ酸
誘導体のHPLCによる分析は、以下の実験条件で行う：カラム：リクロソルブ（Lichrosorb）RP−18; 流速:1.5ml/分；検出器：メルク（Merck）Ｌ−4200 UV−VIS（230又は25
4nm）；溶離剤A:水90％、MeCN 10％、トリフルオロ酢酸（TFA）
0.1％；溶離剤B:MeCN、TFA 0.1％；溶離剤C:水、TFA 0.1％；グラジエント：（Ｉ）:A中０〜40％のＢ（20′）、Ａ中
80％までのＢ（10′）、（II）:A中37〜80％のＢ（20′）、（III）:C中０〜50％のＡ（20′）、100％までのＡ
（３′）、Ａ中4040％までのＢ（20′）、（IV）:C中10〜40％のＡ（８′）、100％までのＡ
（２′）、Ａ中40％までのＢ（20′）。

イオン交換精製においては、226nmのフィルターを有
するLKB UVICORD S II検出器、ファルマシア記録計（Ph
armacia recorder）（チャートスピード＝0.1cm/分）及
びファルマシアFRAC200フラクションコレクター（Pharm
acia FRAC 200 fraction collector）を装備したファル
マシアFPLCシステム（FPLC System of Pharmacia）を採
用する。

各種逆転置ペプチドのアミノ酸及びNH₃組成及び比率
（gem−ジアミノ残基の特異的データとして）を、110℃
で22時間の6MHClによる加水分解後に、ベックマンシス
テムゴールド自動アミノ酸分析器（Beckman SYSTEM GOL
D automatic aminoacid analyzer）により測定する。

化合物の名称の後ろの括弧内の英数字コードは内部の
同定コードである。

実施例１Ｈ−gGly−（R,S）mLys−Pro−Arg−OH・2AcOH（ITF 11
27）Ａ）Ｈ−Gly−NH₂・HCl（3.32g、30mmol）をTHF200mlに
懸濁した懸濁液に、TMSAc（19.6ml、80mmol）及びTMS−
C1（2.54ml、20mmol）を連続して加えた。30分後、ｃ−
mLys（Ｚ）（6.98g、20mmol）を加え、反応混合物を室
温で更に３時間撹拌した。溶媒を真空中で蒸発させ、0.
1N HClでpHを３に調整しながら、残渣を水（200ml）に
取った。室温で１時間撹拌した後、生成した固体をろ過
し、水洗し、熱エタノールに溶解した。冷却後得られた
固体をろ過し、エチルエーテルで洗浄し、乾燥した。3.
8gの（R,S）mLys（Ｚ）−Gly−NH₂が得られた（収率:51
％）。

HPLC［グラジエント（Ｉ）（254nm）］:r.t.13.5分；純
度98％；融点:161℃（分解）。¹ H−NMRにより、生成物の構造が確認された。

Ｂ）Ａ）で得られた生成物（3.65g、10mmol）をDMF（15
ml）に溶解した溶液に、氷浴で冷却しながら、HOBT（1.
43g、10.5mmol）及びDCC（1.96g、9.5mmol）を連続して
加えた。30分撹拌した後、混合物をろ過し、HCl・Ｈ−P
ro−OtBu（2.49g、12mmol）及びTEA（1.67ml、12mmol）
のDMF（10ml）溶液にろ液を加えた。混合物を３時間撹
拌した後、溶媒を真空中で蒸発させ、残渣を酢酸エチル
（50ml）に取り、有機相を、２％重硫酸カリウム及び５
％炭酸水素ナトリウムにより洗浄し、水で中和し、次い
で硫酸ナトリウムにより無水化した。得られた軽油状物
質4.2g（収率:82％）をDMC及びTFAの混合物（容積比で
1:1、16ml）に溶解し、１時間撹拌した。溶媒を真空中
で蒸発させ、残渣を酢酸エチル及びエチルエーテルと共
に粉砕し、3.6gの［（R.S）mLys（Ｚ）−Gly−NH₂］−P
ro−OHを白色固体として得た（収率:79％）。

HPLC［グラジエント（Ｉ）（254nm）］:r.t.14.6及び1
5.7分（２種類のジアステレオ異性体）；純度97％。¹ H−NMRにより、生成物の構造が確認された。

Ｃ）Ｂ）で得られた生成物（3.36g、7.5mmol）のTHF（5
0ml）溶液に、HOSu（0.95g、8.25mmol）を加え、−10℃
に冷却後にDCC（1.54g、7.5mmol）を加えた。室温で４
時間撹拌後、反応混合物をろ過し、Ｈ−Arg−OH（1.74
g、10mmol）及びKCl（0.74g、10mmol）を含むDMF/水
（（容積比で7:3、125ml）溶液にろ液を加えた。反応混
合物を室温で90分間撹拌し続け、次いで溶媒を真空中で
蒸発させ、残渣をエチルエーテルで数回洗浄し、乾燥し
た。得られた固体をTFA水溶液（容積比で0.16、30ml）
に溶解し、３回に分けてRP−DCにより精製した。各精製
において、TFAを含む水（容積比で0.1％）により予め平
衡化したダイナマックス300ÅC₁₈（Dynamax 300Å
C₁₈）カラム（21.4×300mm）に、溶液10mlを流速2.7ml/
分で充填した。充填の終了時にカラムを、2.7ml/分の流
速のままで、50mMベンジルジメチルヘキサデシルアンモ
ニウムクロリド（BDHA−Cl）のTFA含有水溶液（容積比
で0.1％）で溶離した。約１時間の溶離後、2.7mlずつの
フラクションを集めた。これらのフラクションを、HPLC
［グラジエント（Ｉ）］により分析して、不純物を含有
するフラクションを除去しながら、他のフラクション
は、それぞれ化合物［mLys（Ｚ）−Gly−NH₂］−Pro−A
rg−OHのアイソマーＡ、２種類のアイソマーの混合物、
及びアイソマーＢを含有する３群として採取した。３回
のクロマトグラフィの後に、３群のフラクションを凍結
乾燥して、アイソマーＡを1.9g、アイソマーの混合物を
0.45g、アイソマーＢを1.8g得た（合計収率:89％）。

HPLC［グラジエント（Ｉ）（220nm）］:r.t.13.6分（ア
イソマーＡ）、純度:96％;r.t.14.7分（アイソマー
Ｂ）；純度93％＋４％のアイソマーＡ。

FAB−MS: m/z＝619 amu[M+H]⁺;m/z＝485 amu[M-Z+H]⁺
（２種類のアイソマーについて同一のスペクトル）。

Ｄ）新しいスポンジ状パラジウム（約0.1g）を、Ｃ）で
得られたアイソマー混合物（0.31g、0.5mmol）のギ酸溶
液（85％、5ml）に加え、混合物を室温で90分間緩やか
に撹拌した。触媒をろ去した後、溶媒を真空中で蒸発さ
せ、残渣を水に取り、凍結乾燥した。得られた固形分
を、DMF/水の混合物（容積比で3:1、5ml）に溶解し、TI
B（0.43g、1mmol）を加えた。反応混合物を、遮光しな
がら室温で16時間撹拌した。溶媒を真空中で蒸発させ、
残渣を水に溶解し、エチルエーテルで洗浄し、凍結乾燥
した。得られた固形分をpH6で水に溶解し、CM−52カル
ボキシメチルセルロースを充填してpH6の15mM酢酸アン
モニウム溶液で予め平衡化したカラム（６×200mm）に
充填した（流速＝1ml/分）。充填後、カラムを、pHを６
に維持しながら、６時間以内で0.15mMから150mMへ酢酸
アンモニウム濃度を変化させる直線状グラジエントによ
り、流速1ml分で溶離した。3mlのフラクションを集め、
HPLC［グラジエント（III）］による解析を行った。標
記の生成物（ITF 1127）を含有するフラクションを集
め、数回凍結乾燥を行った。得られた固形分を無水エタ
ノールに溶解し、エチルエーテルを加えることによって
沈殿生成物0.085gを得た（収率:30％）。

HPLC:［グラジエント（III）］:r.t.8.8分（アイソマー
Ａ）及び10.2分（アイソマーＢ）；純度99％。

FAB−MS: m/z＝457 amu[M+H]⁺ 同様の操作により、0.425gのアイソマーＡ（ITF1357）
を得た（収率:30％）。¹ H−NMR（200MHz;DMSO）ｔ（1H;NHG）8.25;d（1H;NH−Ｒ）7.20;m（1H;CαＰ）
4.30;m（4H;αG;αR;δ_AP）3.93÷3.64;m（3H;δ_BP；δ
Ｋ）3.61÷3.37;t（2H;δＲ）3.04;t（2H;εＫ）2.74;m
（6H;βP;γP;βＫ）2.09÷1.79;s（6H CH₃COOH）1.75;
m（8H;δK;γK;βR;γＲ）1.70÷1.18. アイソマーＡに関する操作により、アイソマーＢ（IT
F1358）として0.45gの生成物（収率:32％）、及び0.1g
の混合物（ITF 1127）を得た。

HPLC:［グラジエント（III）］:10.2分；純度96％＋ア
イソマーＡ。

FAB−MS: m/z＝457 amu［Ｍ＋Ｈ］¹ H−NMR（200MHz;DMSO）ｔ（1H;NGH）8.30;d（0.4H;NHR）7.57;d（0.6H;NHR7.4
7;m（1H,CαＰ）4.43;m（3H;αG;αＲ）3.97÷3.82;m
（4H;δP;δＫ）3.63÷3.33;m（2H;δＲ）3.06;m（2H;
εＫ）2.72;s（6H CH₃COO^-）1.76;m（14H;β，γP;β，
γ，δK;β，γＲ）1.21÷1.15. 実施例２Ｈ−gThy−（R,S）mLys−Pro−Leu−OHAcOH（ITF 119
2）Ａ）ビス（トリクロロメチル）カーボネート（3.71g、1
2.5mmole）のメチレンクロリド（125ml）溶液に、メチ
レンクロリド（80ml）中の１−メチルイミダゾール（5.
96ml、75mmole）を０℃で加えた。５分後、メチレンク
ロリド（80ml）に溶解したMNP−OH（5.63g、25mmole）
を加え、更に５分後、TMSCN（11.3ml、90mmole）により
予めシラン化したＨ−Thr（tBu）−OH（5.26g、30mmol
e）を加え、更にメチレンクロリド200mlを加えた。10分
後、反応混合物を、pH3.5に酸性化した水性緩衝液で洗
浄し、無水化し、蒸発乾固させた。残渣を５％炭酸ナト
リウム（300ml）に取り、メチレンクロリドで洗浄し
た。水相に更に酢酸エチル200mlを加え、pHを5.7に調節
した。有機相を分離・無水化し、溶媒を蒸発させ、MNP
−Thr（tBu）−OHを油として得た（6.5g、収率:68
％）。

HPLC［グラジエント（Ｉ）（254nm）］:r.t.25.1分；純
度:88％。

Ｂ）Ａ）で得られた化合物（5.2g、13.6mmole）の無水
トルエン（50ml）溶液に、DPPA（3.22ml、14.9mmole）
及びTEA（2.09ml、14.9mmole）を０℃で加えた。４時間
後、反応混合物を、いずれも予め０℃に冷却しておいた
炭酸水素ナトリウムの飽和溶液で３回及び塩化ナトリウ
ム飽和溶液で洗浄し、次いで無水化した。アジドを含む
本溶液を80℃まで加熱し、その温度で40分間保持した。
生成するイソシアネートにチオフェノール（1.39ml、1
3.6mmole）及び触媒量のTEA（191μｌ、1.36mmole）を
室温で添加した。一夜の後、混合物を酢酸エチル及び水
で処理し、有機相を、２％重硫酸カリウム、５％炭酸水
素ナトリウムで洗浄し、水で中和し、次いで硫酸ナトリ
ウムで無水化し、蒸発乾固して、得られた油を石油エー
テルと共に粉砕した。4.7gのMNP−gThr（tBu）−PCTが
得られた（収率:71.2％）。

HPLC［グラジエント（II）（254nm）］:r.t.14.9分；純
度:95％。

Ｃ）０℃に保持した水酸化ナトリウム（1M、26ml）及び
水（877ml）の混合物に、Ｂ）で得られた化合物（4.7
g、9.6mmole）のTHF（64ml）溶液を徐々に加えた。添加
終了５分後に、反応混合物をHCl（1M、26ml）で中和し
た。THFを蒸発させ、クロロホルム（80ml）を加え、こ
の２相性混合物のpHを、1M水酸化ナトリウムで9.0に調
節した。有機相を分離し、水相をクロロホルムで３回、
毎回pHを9.0に調節しながら処理し、有機相を集め、蒸
発乾固させた。残渣をエチルエーテルで再懸濁させて水
（50ml）を加え、混合物を、1M HClでpH3.5になるよう
に一定のpHとなるまで滴定した。水相を分離し、処理を
２回繰り返した。水相を集め、凍結乾燥して、2.8gのMN
P−gThr（tBu）−Ｈ・HClを得た（収率:85％）。

HPLC［グラジエント（Ｉ）（254nm）］:r.t.16.43分；
純度:99.9％。

Ｄ）Ｃ）で得られた化合物（2.6g、6.6mmole）及びｃ−
mLys（Boc）（2.4g、8mmole）のTHF（120ml）溶液に、T
MSAc（4.6ml、20mmole）を徐々に加えた。20時間後、反
応混合物を蒸発させ、残渣を水に取り、酢酸エチルの存
在下で1M HClによりpHを3.5に調節した。水相を酢酸エ
チルで３回抽出し、集めた有機相を無水化し、容積を減
らし、ジイソプロピルエーテルを加えて、3.4gのMNP−g
Thr（tBu）−（R,S）mLys（Boc）−OHを得た（収率:85
％）。

HPLC［グラジエント（II）（230nm）］:r.t.9.9分及び1
0.2分（２種類のジアステレオ異性体）；純度93％。

Ｅ）Ｚ−Pro−OH（2.4g、10mmole）及びＨ−Leu−OtBu
・HCl（2.7g、12mmole）のメチレンクロリド（50ml）溶
液に、TEA（3ml、22mmole）を加え、続いてBOP（4.4g、
10mmole）及びHOBT（1.35g、10mmoleを加えた。５時間
後、反応混合物を塩化ナトリウム飽和溶液で１回処理
し、ついで蒸発乾固させた。残渣を酢酸エチル及び水に
分け、有機相を２％重硫酸カリウム、５％炭酸水素ナト
リウムで洗浄し、水で中和し、硫酸ナトリウムで無水化
し、次いで乾燥し、残渣をジイソプロピルエーテルに溶
解して、石油エーテルの添加により、3.8gのＺ−Pro−L
eu−OtBuを得た（収率:92.7％）。

HPLC［グラジエント（Ｉ）（230nm）］:r.t.28.6分；純
度100％。

Ｆ）Ｅ）で得られたジペプチド（1.5g、3.5mmole）をメ
タノール（70ml）に溶解し、窒素下で本溶液にPd/C触媒
（100mg）を加え、次いで非常に緩徐にトリエチルシラ
ン（2.9ml、18mmole）を加えた。３時間後、反応混合物
をろ過し、溶媒を蒸発させ、1gのＨ−Pro−Leu−OtBuを
得た（収率:100％）。

HPLC［グラジエント（Ｉ）（230nm）］r.t.15.9分；純
度93％。

Ｇ）Ｄ）で得られたプソイドジペプチド（1.1g、1.9mmo
le）のメチレンクロリド（15ml）溶液に、DMF（200ml）
に溶解したHOBT（320mg、2.3mmole）を加えた。温度を
０℃にし、DCCI（392mg、1.9mmole）を加えた。15分
後、混合物を、Ｅ）で得られたＣ末端ジペプチド（540m
g、1.9mmole）を含むフラスコ中でろ過し、一夜反応さ
せた。溶媒を蒸発させた後、残渣を酢酸エチル及び水に
分け、有機相を２％重硫酸カリウム、５％炭酸水素ナト
リウムで洗浄し、水で中和し、次いで硫酸ナトリウムで
無水化した。残渣をジイソプロピルエーテルと共に粉砕
することによって、乾燥した有機相から、12.3gのMNP−
gThr（tBu）−（R,S）mLys（Boc）−Pro−Leu−OtBを得
た（収率:77％）。

HPLC:65％のＢ（230及び254nm）と同様:r.t.8.2分及び
8.6分；純度:100％。

Ｈ）Ｇ）で得られた化合物の一部（1.4g、1.3mmole）
を、氷浴中、濃HCl（5ml）で８分間処理した。反応混合
物を蒸発乾固させ、次いで水に取り、凍結乾燥した。91
0mgの粗生成物を得、これを。ディスプレーサーとして
臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム（90％水、
10％アセトニトリル、及び0.1％TFA中に溶解した50mMの
BDDA−Br）を用い、流速2.7ml/分で、ダイナマックスカ
ラム（Dynamax column）（300Å C18、12μｍ、21×250
mm）によるRP−DCにより精製した。このようにして、MN
P−gThr−mLys−Pro−Leu−OHの３分画、つまり320mgの
アイソマーA,320mgのアイソマーＢ、及び160mgのジアス
テレオ異性体混合物を回収した。

HPLC［グラジエント（Ｉ）（230nm）］r.t.16.1分及び1
8分；純度99.9％。

Ｉ）Ｈ）で得られたアイソマーＡ（315mg、0.4mmole）
をメタノール（15ml）に溶解し、ギ酸で活性化されたス
ポンジ状Pd及びギ酸アンモニウム（120ml）のギ酸（5m
l）溶液を加えた。２時間後、触媒をろ去し、溶媒を蒸
発させた後、残渣を水に取った。水相をエチルエーテル
で洗浄し、凍結乾燥して、200mgの粗生成物を得、これ
を、pH6.0の0.015M酢酸アンモニウム（Ａ）及びpH6.0の
0.3M酢酸アンモニウム（Ｂ）を溶離液として、Ａ中Ｂを
０〜25％に変化させる直線状グラジエント（30′）によ
り、Ｓ−セファロースファストフロー（Ｓ−Sepharose
Fast Flow）のファルマシア（Pharmacia）XK16カラム
（16×200mm）によるイオン交換により精製し、次いで
流速3ml/分で40分間同様に精製した。２分ごとに採取し
たフラクションをHPLCにより分析し、標記の生成物を含
有するフラクションを凍結乾燥した。

HPLC［グラジエント（III）（230nm）］r.t.12.8分；純
度97％。

アミノ酸組成:Pro（１）1.0;Leu（１）1.0;NH₃（２）1.
9;ペプチド含有率:77μmole（40mg;収率:20％）。¹ H−NMR（200MHz;¹H−DMSO;30℃）（アイソマーＡ−ITF
1432）:d（1H;NH−_gT）7.79;d（1H;NH−Ｌ）6.93;m（2
H;Cα−P,Cα−_gT）4.31÷4.21;q（1H;Cα−Ｌ）3.84;m
（1H;Cδ−Ｐ）3.74;m（3H;Cδ²P;Cβ−_gT;Cα−mK）3.
63÷3.37;m（2H;Cε−mK）2.75;m（4H;Cβ,Cγ−Ｐ）2.
19÷1.74;m（9H;Cβ,Cγ,Cδ−mK;Cβ,Cγ−Ｌ）1.73÷
1.13;d（3H;Cγ−_gT）1.06;d（3H;Cδ¹L）0.88;d（3H;C
δ²L）0.87。

アイソマーについて行ったのと同様の操作を行い、ア
イソマーＢ（ITF 1443）を得た。¹ H−NMR（200MHz;¹H−DMSO;30℃）ｄ（0.9H;N^AH-_gT）8.13;d（0.1H;N^BH-_gT）8.03;d（0.1
H;N^BH-L）7.45;d（0.9H;N^AH-L）7.36;m（2H;Cα−P,Cα
−_gT4.37÷4.24;m（1H;Cα−Ｌ）3.86;m（3H;Cδ−P;C
β−_gT）3.56÷3.38;m（1H;Cα−mK）3.16;m（2H;Cε−
mK）2.76;m（13H;Cβ,Cγ−P;Cβ,Cγ,Cδ−mK;Cβ,Cγ
−Ｌ）2.23÷1.15;d（3H;Cγ−_gT）1.03;d（6H;Cδ−
Ｌ）0.88。

実施例３Ｈ−gThr−（R,S）mLys−Pro−Gln−OH・AcOH（ITF119
3）Ａ）Ｚ−Gln−OH（5.6g、20mmole）を氷酢酸（60ml）に
溶解し、Trt−OH（Trtはトリチル）（10.4g,40mmol
e）、Ac₂O（3.77ml、40mmole）及び硫酸を加えた。反応
混合物を50℃に加熱し、この温度に90分間保持し、次い
で室温に冷却し、水で処理した。得られた沈殿物をろ過
し、水に懸濁し、酢酸エチルで３回抽出した。有機相を
集め、無水化した後、濃縮及びｎ−ヘキサンの添加によ
り、8.12gのＺ−Gln（Trt）−OH沈殿物を得た（収率:77
％）。

HPLC［グラジエント（II）（230nm）］r.t.11.3分；純
度100％。

Ｂ）Ａ）で得られた生成物（4g、7.6mmole）のメチレン
クロリド（50ml）溶液に、ボロントリフルオロエーテラ
ート（153μｌ）及びｔ−ブチル−2,2,2−トリクロロア
セトイミデート（TBTA;4.2g、15.3mmole）を加えた。10
分後、反応混合物を、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液で
１回、更に水で洗浄し、次いで無水化して、蒸発乾固さ
せた。得られた残渣をメタノール（60ml）に溶解し、水
の添加により、3.5gのＺ−Gln（Trt）−OtBuの沈殿物を
得た（収率:81％）。

HPLC［グラジエント（II）（230nm）］r.t.17.7分；純
度100％。

Ｃ）Ｂ）で得られた化合物（2.5g、4.3mmole）をメタノ
ール200mlに溶解した溶液を窒素で飽和し、ギ酸で活性
化されたスポンジ状Pd、及びギ酸アンモニウム溶液（5m
l中200mg）を添加した。３時間後、触媒をろ去し、メタ
ノール溶液を蒸発乾固させた。残渣を酢酸エチルに取
り、５％炭酸水素ナトリウムで１回洗浄し、次いで水で
中和した。有機溶液を無水化し、少量に濃縮し、次いで
０℃に冷却し、酢酸エチル中１等量のHClで処理した（4
M、1.08ml）。次いで石油エーテルを添加することによ
って、2gのHCl・Gln（Trt）−OtBuの沈殿物を得た（収
率:100％）。

HPLC［グラジエント（II）（230nm）］:r.t.7.4分；純
度:100％。

Ｄ）Ｚ−Pro−OH（1.15g、4.6mmole）をメチレンクロリ
ド（15ml）に溶解し、DMF（250μｌ）に溶解したHOBT
（0.7g、5.5mmole）を加えた。氷浴中で本溶液にDCCI
（0.95g、4.6mmole）を加えた。15分後、反応混合物
を、Ｃ）で得られた化合物（2g、4.1mmole）を含むフラ
スコ中でろ過し、TEA（587μｌ、4.1mmole）で中和し
た。18時間後、溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチル及び
水に分け、有機相を２％重硫酸カリウム、５％炭酸水素
ナトリウムで洗浄し、水で中和し、次いで硫酸ナトリウ
ムにより無水化した。少量に濃縮した有機溶液から、ｎ
−ヘキサンの添加により2.6gのＺ−Pro−Gln（Trt）−O
tBuを得た（収率:93％）。

HPLC［グラジエント（II）（230nm）］:r.t.16.8分；純
度100％。

Ｅ）Ｄ）で得られた保護基を有するジペプチド（2.4g、
3.5mmole）を、Ｃ）におけるのと同様に、スポンジ状Pd
及びギ酸によりメタノール100ml中で水素添加した。触
媒をろ去し、メタノールを蒸発させた後、残渣を酢酸エ
チルに取り、５％炭酸水素ナトリウムで１回洗浄し、無
水化した。濃縮した有機相を、０℃で酢酸エチル中HCl
で処理し（4M、875μｌ）、石油エーテルを添加するこ
とによって2gのHCl・Ｈ−Pro−Gln（Trt）−OtBuを得た
（収率:100％）。

HPLC［グラジエント（II）（230nm）］:r.t.7.8分；純
度100％。

Ｆ）実施例２、Ｄ）で得られたプソイドジペプチド（1.
38g、2.26mmole）のメチレンクロリド（15ml）溶液に、
200μｌのDMFに溶解したHOBT（382mg、2.82mmole）を加
えた。温度を０℃にし、DCCI（466mg、2.26mmole）を添
加した。15分後、混合物を直接、Ｅ）で得られたジペプ
チド（1.31g、2.26mmole）を含むフラスコ中でろ過し、
TEA（318μｌ、2.26mmole）で中和し、一夜反応させ
た。溶媒を蒸発させた後、残渣を酢酸エチル及び水に分
け、有機相を２％重硫酸カリウム、５％炭酸水素ナトリ
ウムで洗浄し、水で中和し、次いで硫酸ナトリウムによ
り無水化した。有機相を蒸発乾固させ、次いで酢酸エチ
ル/n−ヘキサン（容積比1:1、15ml）に取り、ｎ−ヘキ
サンの添加により2.3gのMPN−gThr（tBu）−（R,S）mLy
s（Boc）−Pro−Gln（Trt）−OtBuを得た（収率:92
％）。

HPLC［グラジエント（II）（230nm）］:r.t.21.5分及び
22.0分（２種類のジアステレオ異性体）純度:92.5％。

Ｇ）Ｆ）で得られた逆転置テトラペプチド（2.13g、1.8
7mmole）を、室温でメチレンクロリド/TFA（容積比1:
1、40ml）に溶解した。90分後、溶媒を蒸発させ、エチ
ルエーテルの添加により粗沈殿物を得た。このようにし
て1.416gのMPN−gThr−（R,S）mLys−Pro−Gln−OHを得
た（収率:95％）。

HPLC［グラジエント（Ｉ）（230nm）］:r.t.12.4分；純
度91.5％。

アミノ酸組成:Pro（１）1.0;Gly（１）1.0;NH₃（３）2.
9;ペプチド含有率:92.7％。保護された逆転置テトラペ
プチドを、ディスプレーサーとしてBDDA−Br（水中50m
M、0.1％TFA）を用いたダイナマックス（Dynamax）（30
0Å C18、12μｍ、21.4×300mm）カラムによるRP−DCに
より流速2.7ml/分で精製した。このようにして1.04gの
生成物を回収した（収率:81％）。

HPLC［グラジエント（Ｉ）（230nm）］:r.t.12.4分；純
度100％。Ａ中０〜20％のグラジエント（20分）:r.t.1
7.5分及び17.8分（２種類のジアステレオ異性体）；純
度:100％。

Ｈ）Ｇ）で得られた保護基を有する逆転置テトラペプチ
ド（875mg、1.1mmole）をギ酸アンモニウム水溶液（0.2
5M、pH3.0）15mlに溶解し、ギ酸アンモニウム（0.5M、p
H3.0）により活性化されたスポンジ状Pdに添加し、60℃
で15分間反応させた。HPLCにより出発化合物の消失が認
められるまで、反応温度を70℃に引き上げてこの処理を
４回繰り返した。触媒をろ去し、水相をエチルエーテル
で洗浄し、凍結乾燥した。粗生成物を、pH6.0の0.015M
酢酸アンモニウム（Ａ）及びpH6.0の0.3M酢酸アンモニ
ウム（Ｂ）を溶離液として、Ｂを０〜100％へと変化さ
せる直線状グラジエントにより、CM−セファデックス
（CM−Sephadex）Ｃ−25のファルマシア（Pharmacia）X
K26カラム（26×300mm）によるイオン交換により精製し
た（360分、流速4ml/分）。3.7mlのフラクションを集
め、標記の生成物を含むことが認められたフラクション
を凍結乾燥した。

HPLC［グラジエント（IV）（230nm）］:r.t.6.5分及び
7.7分（1:1の比率の２種類のジアステレオ異性体）；純
度:99％。

アミノ酸組成:Pro（１）1.0;Gln（１）1.0;NH₃（３）2.
9;ペプチド含有率:966μmole（515mg）；収率88％。¹H
−NMR（200MHz;DMSO）ｄ（0.5H;NHT）8.26;d（0.5H;NHT）7.99;d（0.5H;NHQ）
7.49;s（1H;N Q）7.31;d（0.5H;NαＱ）7.04;s（1H;Nα
Ｑ）6.67;m（1H;CαＴ）4.31;m（1H;CαＰ）4.22;m（2
H;CαQ;CδＰ）3.83÷3.70;m（3H;CβT;CαK;Cδ′Ｐ）
3.64÷3.34;m（2H;CεＫ）2.74;m（8H;CβP;CβK;Cβ e
CγＱ）2.17÷1.66;s（6H CH₃COOH）1.85;m（6H;CγP;C
γe CδＫ）1.64÷1.12;t（3H;CγＴ）1.04。

本発明の代表的な化合物に関し、その生物学的活性の
試験を行った。

マウス脾細胞によるin vitroにおけるIFN−γ産生の刺
激 BALB/Cマウスの脾臓より脾細胞を採取し、単細胞懸濁
液とした。このようにして得られた脾細胞を、ウシ胎児
血清（FCS）（HyClone,ST,Utah,USA）を５％含むRPMI 1
640培地（Flow Lab.,Hertz,UK）に最終濃度が10⁷細胞/m
lとなるように再懸濁し、96ウェルのプレート中で、表
示した濃度の試験化合物の存在下で37℃で24時間インキ
ュベートした。インキュベーション終了時に上清を採取
し、22μｍのフィルターでろ過し、ELISAの市販キット
（Genzyme,Boston,MA,USA）により試験を行うまで−80
℃で凍結保存した。

結果を表１に示す。

U/ml及び対照（非処理細胞）に関する刺激指標（IS）
として得られた結果は、本発明の化合物が、マウスの脾
細胞によるIFN−γの産生を投与量に依存して刺激する
能力を有することを示した。特に実施例１の化合物は、
本クラス中最も強力な化合物であることが示された。本
化合物は実際、既に1.0μg/mlの用量で問題のサイトカ
インを倍増させた。

マウス腹腔内マクロファージによるIL−１産生の刺激加水分解デンプン（BDH Chemicals,Poole,Dorset,U
K）溶液をBALB/Cマウスの腹腔に接種し、３日後に屠殺
することによって、マウス腹腔マクロファージを得た。
FCSを10％含むRPMI 1640溶液で腹腔内を洗浄することに
よって腹腔細胞を集め、96ウェルのプレート中、同溶液
中10⁶細胞/mlの濃度に再懸濁した。本願化合物の存在
下、37℃で96時間、インキュベーションを行った。処理
の終了時に上清を集め、適当なELISA市販キット（Genzy
me,Boston,MA,USA）によるサイトカインの測定に上清を
用いた。

結果を、表２に示す。

U/ml及び対照に関するISとして得られた結果は、被験
化合物が顕著な刺激効果を示すことを明らかにしてい
る。特に実施例３の化合物は、用いたいずれの用量にお
いてもIL−１の産生を約10倍増加させた（9.3＜IS＜10.
7）。

マウス腹腔細胞による酸化窒素の刺激前記試験に記載したのと同様に腹腔細胞を得、本願化
合物及び30μg/mlの濃度のリポ多糖の存在下で、37℃で
96時間インキュベートした。処理終了時に上清を集め、
酸化窒素含有量を、Palmer R.M.J.らによりNature,327,
524,1987に記載されている化学発光試験により測定し
た。

結果を表３に示す。

nmol/ml及び対照に関する刺激指標として得られた結
果は、本発明の化合物が、使用したいずれの用量におい
ても、酸化窒素の産生を刺激することを示している。特
に実施例２の化合物は、既に0.01μg/mlの濃度で刺激ピ
ークを示した（IS＝4.3）。

マウス腹腔マクロファージの殺リーシュマニア活性に対
する効果上述したように得た腹腔細胞を、96ウェルの平底プレ
ート（Nunc,Roskiled,DK）に10⁵/100μｌの濃度で蒔
き、37℃で24時間インキュベートした。処理終了時にウ
ェルに接着していない細胞を分離して捨て、接着してい
た細胞は、培地で３回洗浄し、本願化合物と共に24時間
インキュベートした。次いで細胞を、リーシュマニア・
メジャー（Leishmania major、Dr.Neal R.A.,London Sc
hool of Hygiene and Tropical Medicine,London,UKよ
り供与されたPVL49株）のプロマスディゴートと共に24
時間インキュベートして感染させた。感染処理終了時
に、各ウェルに0.01％ドデシル硫酸ナトリウムを含むRP
MI 1640溶液を100μｌずつ添加し、プレートを37℃で30
分間インキュベートした。FCSを30％含むシュナイダー
培地（Schneider Drosophila medium,Gibco Lab.,Grand
island,New Yorko,USA）を添加し、各ウェルに、１μC
iの³H−チミジンを添加し、37℃で72時間インキュベー
トした。腹腔細胞内に生存している寄生虫による放射活
性の取り込みは、感染の程度と相関しており、したがっ
て細胞の殺リーシュマニア活性と相関している。この取
り込みを、細胞採取器（cell−harvester）を用いて細
胞を採取し、液体シンチレーションβ−カウンターによ
り放射活性を測定することによって測定した。

結果を表４に示す。

得られた結果により、本発明の化合物は、感染程度を
低下させる能力があることが示された。特に実施例１の
化合物は、非常に強力であることが示され、事実、本化
合物は試験で用いた最少用量で既に70％以上もの感染の
低下をもたらした。

敗血症性ショックに対するin vivoでの保護効果の評価体重20〜25gのBALB/Cマウス（１群６匹）の腹腔に、5
0mg/kgのLPS（リポ多糖、Sigma）を接種した。対照以外
の群には、最終容量が0.5mlになるように生理食塩水に
溶解した本発明の化合物のいずれかを、LSP接種後０分
（つまりLPSと同時）又は30分後に、用量を増量しなが
ら接種した。マウスは８日間観察し、生存率を求めた。
実施例１の化合物は、6.2μg/マウス及び0.62μg/マウ
スの用量で約65％の生存率を示し、そのアイソマーＢに
よる生存率は、6.25μg/マウスの用量で約80％、62.5μ
g/マウスの用量で75％であった。

上述したことを考慮すると、本発明の化合物は、あら
ゆる病理学的及び非病理学的状況において、治療及び予
防の両方における免疫反応を増強又は回復させるのに有
用である。したがって、本発明の化合物の使用例として
は、細菌感染症、主に敗血症性ショックの場合、ウイル
ス感染症（ヘルペス）、寄生虫症、後天性免疫不全症候
群に起因する感染症、若年者及び老人における疾患の予
防、重度の火傷、透析、腫瘍及び移植などが挙げられ
る。更に、本発明の化合物は、ワクチンのアジュバント
として用いてもよい。

本発明の別の目的は、本発明化合物を含む医薬組成物
など、上記使用と関連したあらゆる産業的局面での新規
化合物の使用の他、免疫刺激剤としての新規化合物の使
用である。治療を目的とした用途としては、式Ｉの化合
物は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences
Handbook,Mack Pub.Co.,XVII Ed.,N.Y.,USAに記載され
ているように、医薬組成物に配合して好適に投与しても
よい。投与量は、治療すべき症例の種類及び重度、及び
患者の状態（体重、年齢、性別など）など幾つかの要素
次第であるのは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ピノリ，マッシーモイタリア国、20099 セスト・エッセ・ジオヴァンニ（ミラノ）、ヴィア・ジ・カルドゥッシ、125 (72)発明者カペレッティ，シルヴァーナイタリア国、20099 セスト・エッセ・ジオヴァンニ（ミラノ）、ヴィア・ジ・カルドゥッシ、125 (72)発明者ガゼーロ，ラウライタリア国、20099 セスト・エッセ・ジオヴァンニ（ミラノ）、ヴィア・ジ・カルドゥッシ、125 (72)発明者レオーニ，フラビオイタリア国、20099 セスト・エッセ・ジオヴァンニ（ミラノ）、ヴィア・ジ・カルドゥッシ、125 (56)参考文献特開平２−215797（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−23897（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 262（15），ｐ7053−7057（1987) Ｊ．Ｈｅｄ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．34 （12），ｐ3372−3379（1991) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 5/00 A61K 37/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（Ｉ）：［式中、Ｒは水素原子又はスレオニンの側鎖；R₁はアル
ギニン、ロイシン又はグルタミンの側鎖；及びR₂は水素
原子又は代謝により脱離されるアシル基；但し、R₁がア
ルギニンの側鎖である場合、Ｒはスレオニンの側鎖では
ない］で示される逆転置テトラペプチド、そのジアステレオ異
性体、又はそれらの薬理学的に許容される塩。
【請求項２】gGly−（R,S）mLys−Pro−Argであり、単
一のジアステレオ異性体である、請求項１記載のテトラ
ペプチド。
【請求項３】gThr−（R,S）mLys−Pro−Leuであり、単
一のジアステレオ異性体である、請求項１記載のテトラ
ペプチド。
【請求項４】gThr−（R,S）mLys−Pro−Glnであり、単
一のジアステレオ異性体である、請求項１記載のテトラ
ペプチド。
【請求項５】請求項１記載の逆転置テトラペプチドを含
有する、敗血症性ショックの予防及び治療剤。