JP3018261B2 - 共役酵素反応によるｌ−ホスフィノトリシンの製造方法 - Google Patents
共役酵素反応によるｌ−ホスフィノトリシンの製造方法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は二つの酵素反応の共役に
よる４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキ
ソ酪酸（ＨＭＰＢ）からのＬ−２−アミノ−４−（ヒド
ロキシメチルホスフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリ
シン）の合成に関する。
よる４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキ
ソ酪酸（ＨＭＰＢ）からのＬ−２−アミノ−４−（ヒド
ロキシメチルホスフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリ
シン）の合成に関する。
【０００２】
【従来の技術】共役酵素合成によるホスフィノトリシン
製造は既にＥＰ ２４９ １８８に開示されている。これ
にはアミノ供与体であるアスパルテートおよび、グルタ
メート／オキザルアセテート・トランスアミナーゼ（Ｇ
ＯＴ）の存在下にα−ケトグルタレートをグルタメート
に転化することが記載されている。この転化反応は、こ
の第一反応において形成されたアミノ供与体であるグル
タメートの存在下に４−（ヒドロキシメチルホスフィニ
ル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ）をＬ−ホスフィノト
リシンに転化するもう一つのトランスアミナーゼ反応と
共役されている。
製造は既にＥＰ ２４９ １８８に開示されている。これ
にはアミノ供与体であるアスパルテートおよび、グルタ
メート／オキザルアセテート・トランスアミナーゼ（Ｇ
ＯＴ）の存在下にα−ケトグルタレートをグルタメート
に転化することが記載されている。この転化反応は、こ
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タメートの存在下に４−（ヒドロキシメチルホスフィニ
ル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ）をＬ−ホスフィノト
リシンに転化するもう一つのトランスアミナーゼ反応と
共役されている。
【０００３】さて、共役酵素反応における基質転化を完
全なものとするには、個々の酵素反応の平衡定数が相互
に異なっていることが重要である。しかしながら、アミ
ノ基転移反応の平衡定数は約１.０であるため、一般に
目的物は５０％収率でしか得られない（米国特許第4,82
6,766号参照）。
全なものとするには、個々の酵素反応の平衡定数が相互
に異なっていることが重要である。しかしながら、アミ
ノ基転移反応の平衡定数は約１.０であるため、一般に
目的物は５０％収率でしか得られない（米国特許第4,82
6,766号参照）。
【０００４】平衡系から反応生成物を除去するかまたは
過剰の出発物質を用いることにより、酵素反応の平衡を
生成物側にずらすことは可能である。
過剰の出発物質を用いることにより、酵素反応の平衡を
生成物側にずらすことは可能である。
【０００５】一般に、Ｌ−ホスフィノトリシン合成のた
めの前記アミノ基転移反応には過剰のアミノ供与体であ
るグルタメートが用いられる〔A. Schulz et al. (199
0) Appl. Environ. Micobiol. 56, 1〜6, No. 1〕。し
かしながら、これには、非タンパク原性アミノ酸である
Ｌ−ホスフィノトリシンの天然アミノ酸例えばグルタメ
ートからの分離が、例えばイオン交換クロマトグラフィ
ーを二回連続行うなど相当な苦労の結果はじめて可能と
なるという欠点がある〔A.Schulz et al. (1990) Appl.
Environ. Micobiol. 56, 1〜6, No. 1〕。
めの前記アミノ基転移反応には過剰のアミノ供与体であ
るグルタメートが用いられる〔A. Schulz et al. (199
0) Appl. Environ. Micobiol. 56, 1〜6, No. 1〕。し
かしながら、これには、非タンパク原性アミノ酸である
Ｌ−ホスフィノトリシンの天然アミノ酸例えばグルタメ
ートからの分離が、例えばイオン交換クロマトグラフィ
ーを二回連続行うなど相当な苦労の結果はじめて可能と
なるという欠点がある〔A.Schulz et al. (1990) Appl.
Environ. Micobiol. 56, 1〜6, No. 1〕。
【０００６】ホスフィノトリシン特異的トランスアミナ
ーゼおよびＧＯＴの関与する共役法のもう一つの可能性
は、そのホスフィノトリシントランスアミナーゼにより
消費されるグルタメートを再循環させることにより反応
をＧＯＴによってホスフィノトリシン合成の方向に動か
すことである。これはＧＯＴ反応生成物であるオキザル
アセテートが二価金属イオンの存在下においてピルベー
トに自然に脱カルボキシされ、従って反応平衡系から除
かれるためである。しかしながら、これまでに報告され
ているすべてのＧＯＴはグルタメートの存在下において
ピルベートをアミノ基転移してアラニンにする副次的活
性を有しているため、ＮＨ4 +が反応系から連続的に除か
れてしまい、また等モル量のＨＭＰＢとアミノ供与体
（グルタメートおよび／またはアスパルテート）を用い
たのではＬ−ホスフィノトリシン生成反応は完全なとこ
ろまで進行しない。加えて、生成Ｌ−ホスフィノトリシ
ンはアラニンによって汚染されている。
ーゼおよびＧＯＴの関与する共役法のもう一つの可能性
は、そのホスフィノトリシントランスアミナーゼにより
消費されるグルタメートを再循環させることにより反応
をＧＯＴによってホスフィノトリシン合成の方向に動か
すことである。これはＧＯＴ反応生成物であるオキザル
アセテートが二価金属イオンの存在下においてピルベー
トに自然に脱カルボキシされ、従って反応平衡系から除
かれるためである。しかしながら、これまでに報告され
ているすべてのＧＯＴはグルタメートの存在下において
ピルベートをアミノ基転移してアラニンにする副次的活
性を有しているため、ＮＨ4 +が反応系から連続的に除か
れてしまい、また等モル量のＨＭＰＢとアミノ供与体
（グルタメートおよび／またはアスパルテート）を用い
たのではＬ−ホスフィノトリシン生成反応は完全なとこ
ろまで進行しない。加えて、生成Ｌ−ホスフィノトリシ
ンはアラニンによって汚染されている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】今般、ＧＯＴ活性を有す
るトランスアミナーゼおよびＬ−ホスフィノトリシント
ランスアミナーゼ活性を有するトランスアミナーゼを用
いた共役酵素反応においてアミノ供与体であるグルタメ
ートを触媒量で用いそしてアミノ供与体であるアスパル
テートがＨＭＰＢに対して略等モル量で用いると、実質
的に定量的収率で、そしてまた天然アミノ酸によって実
質的に全く汚染されることなくホスフィノトリシンが生
成することを見出した。
るトランスアミナーゼおよびＬ−ホスフィノトリシント
ランスアミナーゼ活性を有するトランスアミナーゼを用
いた共役酵素反応においてアミノ供与体であるグルタメ
ートを触媒量で用いそしてアミノ供与体であるアスパル
テートがＨＭＰＢに対して略等モル量で用いると、実質
的に定量的収率で、そしてまた天然アミノ酸によって実
質的に全く汚染されることなくホスフィノトリシンが生
成することを見出した。
【０００８】従って本発明は式（Ｉ）
【化３】 で示されるＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホ
スフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリシン）を式（I
I）
スフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリシン）を式（I
I）
【化４】 で示される４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２
−オキソ酪酸(ＨＭＰＢ)から以下の反応工程、すなわち ａ） 適当なトランスアミナーゼ１の存在下にアスパル
テートとα−ケトグルタレートを反応させてオキザルア
セテートおよびグルタメートを生成させる、および ｂ） 適当なトランスアミナーゼ２の存在下にグルタメ
ートと式（II）のＨＭＰＢを反応させてα−ケトグルタ
メートおよびＬ−ホスフィノトリシンを生成させる工程
より成る共役酵素反応により製造する方法であって、ア
スパルテート対ＨＭＰＢモル比を０.５〜１.５対１、好
ましくは０.８〜１.２対１、特に等モル比とし、またグ
ルタメートまたはα−ケトグルタレートを触媒量で添加
することを特徴とする前記方法に関する。
−オキソ酪酸(ＨＭＰＢ)から以下の反応工程、すなわち ａ） 適当なトランスアミナーゼ１の存在下にアスパル
テートとα−ケトグルタレートを反応させてオキザルア
セテートおよびグルタメートを生成させる、および ｂ） 適当なトランスアミナーゼ２の存在下にグルタメ
ートと式（II）のＨＭＰＢを反応させてα−ケトグルタ
メートおよびＬ−ホスフィノトリシンを生成させる工程
より成る共役酵素反応により製造する方法であって、ア
スパルテート対ＨＭＰＢモル比を０.５〜１.５対１、好
ましくは０.８〜１.２対１、特に等モル比とし、またグ
ルタメートまたはα−ケトグルタレートを触媒量で添加
することを特徴とする前記方法に関する。
【０００９】グルタメート、アスパルテートおよびα−
ケトグルタレートまたはそれらの相当する酸は購入可能
な物質である。ＨＭＰＢはＥＰ ３０４２４に記載され
ている如くに製造することができる。
ケトグルタレートまたはそれらの相当する酸は購入可能
な物質である。ＨＭＰＢはＥＰ ３０４２４に記載され
ている如くに製造することができる。
【００１０】トランスアミナーゼ１はトランスアミナー
ゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのアスパルテー
トの存在下にα−ケトグルタレートからグルタメートに
アミノ基転移できるいずれかの酵素（いわゆるＧＯＴ活
性酵素）である。ピルベートからアラニンにアミノ基転
移できず、またそれ故に共役反応の目的生成物であるＬ
−ホスフィノトリシンを他の天然アミノ酸で汚染するこ
とのないＧＯＴ（グルタメート／オキザルアセテートト
ランスアミナーゼ）を用いるのが好ましい。ピルベート
は例えばアスパルテートのアミノ基転移反応生成物であ
るオキザルアセテートの脱カルボキシ化によって製造さ
れる。
ゼ活性を有しそしてアミノ供与体としてのアスパルテー
トの存在下にα−ケトグルタレートからグルタメートに
アミノ基転移できるいずれかの酵素（いわゆるＧＯＴ活
性酵素）である。ピルベートからアラニンにアミノ基転
移できず、またそれ故に共役反応の目的生成物であるＬ
−ホスフィノトリシンを他の天然アミノ酸で汚染するこ
とのないＧＯＴ（グルタメート／オキザルアセテートト
ランスアミナーゼ）を用いるのが好ましい。ピルベート
は例えばアスパルテートのアミノ基転移反応生成物であ
るオキザルアセテートの脱カルボキシ化によって製造さ
れる。
【００１１】特に、大腸菌（Escherichia coli (E.col
i)）またはバチルス属細菌からのＧＯＴ活性を有し、ま
たピルベート特異的活性を持たないトランスアミナーゼ
を用いるのが好ましい。
i)）またはバチルス属細菌からのＧＯＴ活性を有し、ま
たピルベート特異的活性を持たないトランスアミナーゼ
を用いるのが好ましい。
【００１２】トランスアミナーゼ２はトランスアミナー
ゼ活性を有し、またアミノ供与体としてのグルタメート
の存在下にＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンにアミ
ノ基転移することができるいずれかの酵素である。この
タイプの酵素はＥＰ ２４９ １８８に示されている。ト
ランスアミナーゼ１と同様、ピルベートからアラニンに
アミノ基転移できないトランスアミナーゼをトランスア
ミナーゼ２として用いるのが好ましい。
ゼ活性を有し、またアミノ供与体としてのグルタメート
の存在下にＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンにアミ
ノ基転移することができるいずれかの酵素である。この
タイプの酵素はＥＰ ２４９ １８８に示されている。ト
ランスアミナーゼ１と同様、ピルベートからアラニンに
アミノ基転移できないトランスアミナーゼをトランスア
ミナーゼ２として用いるのが好ましい。
【００１３】特に、大腸菌からのＬ−ホスフィノトリシ
ン特異的トランスアミナーゼはピルベート特異的活性を
有さず、従って好ましいものとして用いることができ
る。大腸菌からのＬ−ホスフィノトリシン特異的トラン
スアミナーゼは例えばA. Schulz (1990）の方法によっ
て濃縮することができる。
ン特異的トランスアミナーゼはピルベート特異的活性を
有さず、従って好ましいものとして用いることができ
る。大腸菌からのＬ−ホスフィノトリシン特異的トラン
スアミナーゼは例えばA. Schulz (1990）の方法によっ
て濃縮することができる。
【００１４】原則として、特定のトランスアミナーゼ活
性を有する全細胞、細胞抽出物、部分的精製細胞抽出物
または精製酵素をアミノ基転移反応に用いることもでき
る。しかしながら、副次的反応、特にピルベートからア
ラニンへのアミノ基転移反応、がもはや生じなくなるま
で精製された酵素を用いるのが有利である。
性を有する全細胞、細胞抽出物、部分的精製細胞抽出物
または精製酵素をアミノ基転移反応に用いることもでき
る。しかしながら、副次的反応、特にピルベートからア
ラニンへのアミノ基転移反応、がもはや生じなくなるま
で精製された酵素を用いるのが有利である。
【００１５】少くとも一つの、特に両方の、酵素を固定
された形で用いるのが特に有利である。トランスアミナ
ーゼ固定のための一つの可能な方法は例えばA. Schulz
et al. (1990）に記載されている。
された形で用いるのが特に有利である。トランスアミナ
ーゼ固定のための一つの可能な方法は例えばA. Schulz
et al. (1990）に記載されている。
【００１６】アミノ基転移反応は一般に、バイオコンパ
チブル（biocompatible）緩衝液、すなわちpHを６.５〜
１０、好ましくは７.５〜９.０、特に７.５〜８.５の範
囲に維持しかつ個々の成分とは反応しない緩衝液、中で
行われる。ホスフェートまたはｔｒｉｓ緩衝液、特にｔ
ｒｉｓ緩衝液を選択するのが好ましい。アスパルテート
対ＨＭＰＢモル比は０.５〜１.５対１、好ましくは０.
８〜１.２対１、特に等モル比である。グルタメートま
たはα−ケトグルタレートは触媒量で反応混合物に添加
される。ＨＭＰＢ対グルタメートまたはα−ケトグルタ
レートは一般に０.０１〜１対１、好ましくは０.０１〜
０.２対１、特に０.０５〜０.２対１である。反応混合
物は一般に少量の補助因子（cofactor）であるピリドキ
サールホスフェートをも例えば１〜５００μｍ、好まし
くは５〜１００μｍの濃度で含有する。反応温度は一般
に約２０〜７０℃、好ましくは３０〜４０℃である。
チブル（biocompatible）緩衝液、すなわちpHを６.５〜
１０、好ましくは７.５〜９.０、特に７.５〜８.５の範
囲に維持しかつ個々の成分とは反応しない緩衝液、中で
行われる。ホスフェートまたはｔｒｉｓ緩衝液、特にｔ
ｒｉｓ緩衝液を選択するのが好ましい。アスパルテート
対ＨＭＰＢモル比は０.５〜１.５対１、好ましくは０.
８〜１.２対１、特に等モル比である。グルタメートま
たはα−ケトグルタレートは触媒量で反応混合物に添加
される。ＨＭＰＢ対グルタメートまたはα−ケトグルタ
レートは一般に０.０１〜１対１、好ましくは０.０１〜
０.２対１、特に０.０５〜０.２対１である。反応混合
物は一般に少量の補助因子（cofactor）であるピリドキ
サールホスフェートをも例えば１〜５００μｍ、好まし
くは５〜１００μｍの濃度で含有する。反応温度は一般
に約２０〜７０℃、好ましくは３０〜４０℃である。
【００１７】Ｌ−ホスフィノトリシン収率を高めるため
に、グルタメート／オキザルアセテートトランスアミナ
ーゼ反応で生成したオキザルアセテートを多価金属イオ
ンの存在下に脱カルボキシル化するのが好ましい（英国
特許出願第２ １６１ １５９号）。適当な多価金属イオ
ンの例は前記英国特許出願に列挙されたすべての金属イ
オン、好ましくは、Ａｌ3+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｆｅ2+ま
たはＦｅ3+である。この好ましい態様において、付加的
なピルベート特異的活性を有するトランスアミナーゼま
たはトランスアミナーゼ画分を全く用いないのがさらに
有利である。前述の反応条件下にオキザルアセテートの
脱カルボキシル化反応を行うことによってＬ−ホスフィ
ノトリシンの収率が増大したことは全く予想外であっ
た。何故ならば英国特許出願第２ １６１ １５９号によ
れば最高の生成物収率は反応系においてアスパルテート
を唯一のアミノ供与体として用いた場合に認められたに
過ぎなかったからである。
に、グルタメート／オキザルアセテートトランスアミナ
ーゼ反応で生成したオキザルアセテートを多価金属イオ
ンの存在下に脱カルボキシル化するのが好ましい（英国
特許出願第２ １６１ １５９号）。適当な多価金属イオ
ンの例は前記英国特許出願に列挙されたすべての金属イ
オン、好ましくは、Ａｌ3+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｆｅ2+ま
たはＦｅ3+である。この好ましい態様において、付加的
なピルベート特異的活性を有するトランスアミナーゼま
たはトランスアミナーゼ画分を全く用いないのがさらに
有利である。前述の反応条件下にオキザルアセテートの
脱カルボキシル化反応を行うことによってＬ−ホスフィ
ノトリシンの収率が増大したことは全く予想外であっ
た。何故ならば英国特許出願第２ １６１ １５９号によ
れば最高の生成物収率は反応系においてアスパルテート
を唯一のアミノ供与体として用いた場合に認められたに
過ぎなかったからである。
【００１８】アミノ供与体であるアスパルテートとグル
タメートが実質的に完全に消費されると、実質的に天然
アミノ酸不含の生成物Ｌ−ホスフィノトリシンが得ら
れ、またそれの形成されたα−ケト酸、α−ケトグルタ
レートおよびオキザルアセテートまたはピルベートから
の分離は一段階で可能である。α−ケトグルタレートま
たはグルタメートは過剰にではなく極く少量で添加され
たに過ぎず、また同様に、アスパルテートは過剰にでは
なく好ましくはＨＭＰＢに対して等モルで添加されたに
もかかわらず、ＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンへ
の実質的に完全な転化が認められた。このことは全く予
測し得なかったことである。
タメートが実質的に完全に消費されると、実質的に天然
アミノ酸不含の生成物Ｌ−ホスフィノトリシンが得ら
れ、またそれの形成されたα−ケト酸、α−ケトグルタ
レートおよびオキザルアセテートまたはピルベートから
の分離は一段階で可能である。α−ケトグルタレートま
たはグルタメートは過剰にではなく極く少量で添加され
たに過ぎず、また同様に、アスパルテートは過剰にでは
なく好ましくはＨＭＰＢに対して等モルで添加されたに
もかかわらず、ＨＭＰＢからＬ−ホスフィノトリシンへ
の実質的に完全な転化が認められた。このことは全く予
測し得なかったことである。
【００１９】Ｌ−ホスフィノトリシンは既知の方法、例
えばメチルイソブチルケトン抽出により、または例えば
Amberlite IR 120 を用いた陽イオン交換クロマトグラ
フィーにより簡易に精製することができる。
えばメチルイソブチルケトン抽出により、または例えば
Amberlite IR 120 を用いた陽イオン交換クロマトグラ
フィーにより簡易に精製することができる。
【００２０】得られるＬ−ホスフィノトリシンは一般に
農業において除草剤として用いられる。以下の実施例は
本発明をさらに詳述するものであるが、本発明を限定す
るものでは全くない。
農業において除草剤として用いられる。以下の実施例は
本発明をさらに詳述するものであるが、本発明を限定す
るものでは全くない。
【００２１】
【実施例】実施例１ 大腸菌Ｋ−１２による生物学的転換によるＬ−ホスフィ
ノトリシン合成 大腸菌Ｋ−１２をＬＢ培地（１０ｇ／リットル トリプ
トン、５ｇ／リットル酵母エキス、１０ｇ／リットル
ＮａＣｌ）中、３７°で１５時間培養した。５０００ｇ
で１０分間遠心分離することにより菌体を集め、ホスフ
ェート緩衝液（１０mM燐酸ナトリウム、pH＝７.０、１
０mM ＮａＣｌ）で２回洗浄し、次いで以下の溶液に１
００mg／ml濃度となるように再懸濁した。
ノトリシン合成 大腸菌Ｋ−１２をＬＢ培地（１０ｇ／リットル トリプ
トン、５ｇ／リットル酵母エキス、１０ｇ／リットル
ＮａＣｌ）中、３７°で１５時間培養した。５０００ｇ
で１０分間遠心分離することにより菌体を集め、ホスフ
ェート緩衝液（１０mM燐酸ナトリウム、pH＝７.０、１
０mM ＮａＣｌ）で２回洗浄し、次いで以下の溶液に１
００mg／ml濃度となるように再懸濁した。
【００２２】溶液１： ＨＭＰＢ：グルタミン酸：アスパラギン酸＝１：１：１ １００mM ＨＭＰＢ １００mMグルタミン酸 １００mMアスパラギン酸 ５０mM ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、pH＝８.０
【００２３】溶液２： ＨＭＰＢ：グルタミン酸＝１：４ １００mM ＨＭＰＢ ４００mMグルタミン酸 ５０mM ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、pH＝８.０
【００２４】菌体懸濁液を反応混合物と共に３７℃でイ
ンキュベートした。反応混合物中のＬ−ホスフィノトリ
シン含量を合成過程の様々な時点でアミノ酸分析機を用
いて測定した。表１は反応過程におけるＬ−ホスフィノ
トリシンへの転化率（％）を両方の生物学的転換混合物
について示したものである。（溶液２の場合）Ｌ−ＰＰ
Ｔ収率は４倍過剰のアミノ供与体グルタミン酸を用いて
も８５％を超えなかったのに、（溶液１の場合）アミノ
供与体グルタミン酸およびアスパラギン酸の等モル使用
によりほぼ１００％の転化率を達成できた。
ンキュベートした。反応混合物中のＬ−ホスフィノトリ
シン含量を合成過程の様々な時点でアミノ酸分析機を用
いて測定した。表１は反応過程におけるＬ−ホスフィノ
トリシンへの転化率（％）を両方の生物学的転換混合物
について示したものである。（溶液２の場合）Ｌ−ＰＰ
Ｔ収率は４倍過剰のアミノ供与体グルタミン酸を用いて
も８５％を超えなかったのに、（溶液１の場合）アミノ
供与体グルタミン酸およびアスパラギン酸の等モル使用
によりほぼ１００％の転化率を達成できた。
【００２５】
【表１】
【００２６】実施例２ ブタからのグルタメート／オキザルアセテートトランス
アミナーゼの精製
アミナーゼの精製
【００２７】実施例３ 大腸菌からの精製Ｌ−ホスフィノトリシン特異的トラン
スアミナーゼおよびブタからのＧＯＴを様々なグルタミ
ン酸濃度で用いたＬ−ホスフィノトリシン合成 大腸菌Ｋ−１２からのＬ−ホスフィノトリシン特異的ト
ランスアミナーゼ（ＰＳＴ）（ＥＰ−Ａ ０ ３３４ ６
８３参照）およびブタ心臓からのＧＯＴ（実施例２参
照）をホスフェート緩衝液（２０mM燐酸ナトリウム、pH
＝７.０、０.１mMピリドキサールホスフェート、１mM
２−ケトグルタレート、５mM β−メルカプトエタノー
ル）に１mg／ml濃度となるよう溶解した。次に各場合に
ついて、それら二酵素の１単位（＝ＰＳＴの場合は１μ
mol Ｌ−ホスフィノトリシン／分、およびＧＯＴの場合
は１μmolグルタメート／分）の活性に相当する容量を
混合しそして以下の反応溶液と共に３７℃で１時間イン
キュベートした。
スアミナーゼおよびブタからのＧＯＴを様々なグルタミ
ン酸濃度で用いたＬ−ホスフィノトリシン合成 大腸菌Ｋ−１２からのＬ−ホスフィノトリシン特異的ト
ランスアミナーゼ（ＰＳＴ）（ＥＰ−Ａ ０ ３３４ ６
８３参照）およびブタ心臓からのＧＯＴ（実施例２参
照）をホスフェート緩衝液（２０mM燐酸ナトリウム、pH
＝７.０、０.１mMピリドキサールホスフェート、１mM
２−ケトグルタレート、５mM β−メルカプトエタノー
ル）に１mg／ml濃度となるよう溶解した。次に各場合に
ついて、それら二酵素の１単位（＝ＰＳＴの場合は１μ
mol Ｌ−ホスフィノトリシン／分、およびＧＯＴの場合
は１μmolグルタメート／分）の活性に相当する容量を
混合しそして以下の反応溶液と共に３７℃で１時間イン
キュベートした。
【００２８】すべての反応混合物は １００ｍＭ ＨＭＰＢ １００mMアスパラギン酸 ５０mM ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、pH／８.０ および付加的にグルタミン酸を以下の濃度で含有した。 実験１：１００mM 実験２：５０mM 実験３：２０mM 実験４：１０mM 実験５：５mM 実験６：−
【００２９】反応時間後の各種混合物中のＬ−ホスフィ
ノトリシン含有量をアミノ酸分析機（Biotronic LC 500
1）で測定した。それより転化率（％）として算出され
たＬ−ホスフィノトリシン合成速度を表２にまとめる。
これらの実験は、グルタミン酸濃度をＨＭＰＢまたはア
スパルテート使用濃度の０.２倍まで低下させることが
できしかもＬ−ホスフィノトリシン合成速度に対する悪
影響は無視できることを示している。
ノトリシン含有量をアミノ酸分析機（Biotronic LC 500
1）で測定した。それより転化率（％）として算出され
たＬ−ホスフィノトリシン合成速度を表２にまとめる。
これらの実験は、グルタミン酸濃度をＨＭＰＢまたはア
スパルテート使用濃度の０.２倍まで低下させることが
できしかもＬ−ホスフィノトリシン合成速度に対する悪
影響は無視できることを示している。
【００３０】
【表２】
【００３１】実施例４ 精製ＰＳＴ（大腸菌）およびＧＯＴ（ブタ）を各種酵素
比で用いたＬ−ホスフィノトリシン合成 それら二つの精製トランスアミナーゼを実施例３に記載
の如く、１００mM ＨＭＰＢ、２０mMグルタミン酸、１
００mMアスパラギン酸および５０mM ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ、pH＝８.０、より成る反応溶液と共に３７℃でイン
キュベートした。それら二酵素の様々な活性比をこのた
めに用いた： １． ＰＳＴ １単位／ＧＯＴ １０単位 ２． ＰＳＴ １単位／ＧＯＴ １単位 ３． ＰＳＴ １単位／ＧＯＴ ０単位
比で用いたＬ−ホスフィノトリシン合成 それら二つの精製トランスアミナーゼを実施例３に記載
の如く、１００mM ＨＭＰＢ、２０mMグルタミン酸、１
００mMアスパラギン酸および５０mM ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ、pH＝８.０、より成る反応溶液と共に３７℃でイン
キュベートした。それら二酵素の様々な活性比をこのた
めに用いた： １． ＰＳＴ １単位／ＧＯＴ １０単位 ２． ＰＳＴ １単位／ＧＯＴ １単位 ３． ＰＳＴ １単位／ＧＯＴ ０単位
【００３２】合成反応過程の様々な時点で検体をアミノ
酸分析機で測定しながら混合物中のＬ−ホスフィノトリ
シン含量を測定した。それより算出されたＬ−ホスフィ
ノトリシン合成を表３に示す。酵素比ＰＳＴ：ＧＯＴ＝
１：１（混合物２）の場合に最高転化率が得られた。Ｇ
ＯＴを添加しない場合（混合物３）に達成し得る最大Ｐ
ＰＴ転化率はわずか約２０％に過ぎなかったが、これ
は、この場合、Ｌ−ホスフィノトリシン合成にグルタミ
ン酸しか用い得ず、アスパラギン酸は使用できないから
である。
酸分析機で測定しながら混合物中のＬ−ホスフィノトリ
シン含量を測定した。それより算出されたＬ−ホスフィ
ノトリシン合成を表３に示す。酵素比ＰＳＴ：ＧＯＴ＝
１：１（混合物２）の場合に最高転化率が得られた。Ｇ
ＯＴを添加しない場合（混合物３）に達成し得る最大Ｐ
ＰＴ転化率はわずか約２０％に過ぎなかったが、これ
は、この場合、Ｌ−ホスフィノトリシン合成にグルタミ
ン酸しか用い得ず、アスパラギン酸は使用できないから
である。
【００３３】
【表３】
【００３４】実施例５ Ｌ−ホスフィノトリシン合成に対する塩化マンガンの効
果 精製トランスアミナーゼを実施例３に記載の如く１：１
比（各１単位）で混合し、そして１mM ＭｎＣｌ2の存在
下と、あるいはＭｎＣｌ2を用いずに、反応溶液（１０
０mM ＨＭＰＢ、２０mMグルタミン酸、１００mMアスパ
ラギン酸、５０mM ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、pH＝８.０）と共
に３７℃でインキュベートした。Ｌ−ホスフィノトリシ
ン合成の進行を実施例４に記載の如く測定し、それを表
４にまとめる。塩化マンガンの添加により反応速度を顕
著に増大させることができた。２４時間の反応時間後の
Ｌ−ホスフィノトリシン転化率は塩化マンガンを用いな
い比較混合物よりも約１０％高かった。
果 精製トランスアミナーゼを実施例３に記載の如く１：１
比（各１単位）で混合し、そして１mM ＭｎＣｌ2の存在
下と、あるいはＭｎＣｌ2を用いずに、反応溶液（１０
０mM ＨＭＰＢ、２０mMグルタミン酸、１００mMアスパ
ラギン酸、５０mM ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、pH＝８.０）と共
に３７℃でインキュベートした。Ｌ−ホスフィノトリシ
ン合成の進行を実施例４に記載の如く測定し、それを表
４にまとめる。塩化マンガンの添加により反応速度を顕
著に増大させることができた。２４時間の反応時間後の
Ｌ−ホスフィノトリシン転化率は塩化マンガンを用いな
い比較混合物よりも約１０％高かった。
【００３５】
【表４】
【００３６】実施例６ シリカゲルへの“ＰＳＴ”トランスアミナーゼの固定 ５０mlの活性化シリカゲル（文献、すなわちK. Mosbac
h, Methods in Enzymology, Vol. XLIV; Academic Pres
s, New York, 1976, 139および140ページに記載の如く
シラン化およびグルタールアルデヒド活性化したもの）
を５０mlのＰＳＴ溶液（大腸菌からの精製ＰＳＴ、０.
２５Ｍ燐酸カリウム緩衝液（pH８）中のタンパク質１０
mg／ml溶液）に添加し、そしてゆるやかに撹拌しながら
３時間反応させる。次にまだ湿っている触媒を濾去しそ
して１００mlの０.２５Ｍホスフェート緩衝液（pH８）
で洗浄した。このようにして調製された生物学的触媒
（biocatalyst）は後述の反応に用いることができる。
h, Methods in Enzymology, Vol. XLIV; Academic Pres
s, New York, 1976, 139および140ページに記載の如く
シラン化およびグルタールアルデヒド活性化したもの）
を５０mlのＰＳＴ溶液（大腸菌からの精製ＰＳＴ、０.
２５Ｍ燐酸カリウム緩衝液（pH８）中のタンパク質１０
mg／ml溶液）に添加し、そしてゆるやかに撹拌しながら
３時間反応させる。次にまだ湿っている触媒を濾去しそ
して１００mlの０.２５Ｍホスフェート緩衝液（pH８）
で洗浄した。このようにして調製された生物学的触媒
（biocatalyst）は後述の反応に用いることができる。
【００３７】実施例７ シリカゲルへの“ＧＯＴ”トランスアミナーゼの固定 １０mlのＧＯＴ溶液（ブタからの精製ＧＯＴ、タンパク
質８.４mg／溶液１０ml）を実施例６に記載の如き１０m
lのシリカゲルに固定する。この生物学的触媒はこの形
で共役アミノ基転移反応に用いることができる。
質８.４mg／溶液１０ml）を実施例６に記載の如き１０m
lのシリカゲルに固定する。この生物学的触媒はこの形
で共役アミノ基転移反応に用いることができる。
【００３８】実施例８ 固定化ＰＳＴおよび固定化ＧＯＴを用いた共役アミノ基
転移反応 １８０mg（１mmol）のＨＭＰＢ、１３３mg（１mmol）の
Ｌ−アスパラギン酸、２９.４mg（０.２mmol）のＬ−グ
ルタミン酸、１０mgのピリドキサールホスフェートおよ
び０.６ｇのＴＲＩＳを蒸留水で５ｇの溶液としそしてp
H８に調整する。これに０.５mlの固定化ＰＳＴ（実施例
６）および０.５mlの固定化ＧＯＴ（実施例７）を添加
し、そして注意深く撹拌しながら２６℃、pH８で４８時
間反応させる。反応混合物のアミノ酸含量をＨＰＬＣ
（アミノ酸分析機）により調べる。
転移反応 １８０mg（１mmol）のＨＭＰＢ、１３３mg（１mmol）の
Ｌ−アスパラギン酸、２９.４mg（０.２mmol）のＬ−グ
ルタミン酸、１０mgのピリドキサールホスフェートおよ
び０.６ｇのＴＲＩＳを蒸留水で５ｇの溶液としそしてp
H８に調整する。これに０.５mlの固定化ＰＳＴ（実施例
６）および０.５mlの固定化ＧＯＴ（実施例７）を添加
し、そして注意深く撹拌しながら２６℃、pH８で４８時
間反応させる。反応混合物のアミノ酸含量をＨＰＬＣ
（アミノ酸分析機）により調べる。
【００３９】 収量（ＨＰＬＣ）：０.１２２ｇのＬ−ＰＰＴ（ＨＭＰＢに対し６８％） ０.０１２ｇのＬ−アスパラギン酸 ０.０２８ｇのＬ−グルタミン酸 ０.０２５ｇのＬ−アラニン
【００４０】実施例９ 固定化ＰＳＴおよび固定化ＧＯＴを用いた共役アミノ基
転移反応 １ｇ（５.６mmol）のＨＭＰＢ、７１５mg（５.６mmol）
のＬ−アスパラギン酸、１６３mg（１.１mmol）のＬ−
グルタミン酸および１０mgのピリドキサールホスフェー
トを蒸留水で２０ｇの溶液としそしてＫＨＣＯ3でpH８
に調整する。１mlの固定化ＰＳＴ（実施例６）および１
mlのＧＯＴ（実施例７）を添加後、ゆるやかに撹拌しな
がら３６℃で７２時間反応させる。生成物溶液のアミノ
酸含量をＨＰＬＣ（ＡＡＡ）により調べる。
転移反応 １ｇ（５.６mmol）のＨＭＰＢ、７１５mg（５.６mmol）
のＬ−アスパラギン酸、１６３mg（１.１mmol）のＬ−
グルタミン酸および１０mgのピリドキサールホスフェー
トを蒸留水で２０ｇの溶液としそしてＫＨＣＯ3でpH８
に調整する。１mlの固定化ＰＳＴ（実施例６）および１
mlのＧＯＴ（実施例７）を添加後、ゆるやかに撹拌しな
がら３６℃で７２時間反応させる。生成物溶液のアミノ
酸含量をＨＰＬＣ（ＡＡＡ）により調べる。
【００４１】 収量（ＨＰＬＣ）：０.５８ｇのＬ−ＰＰＴ（ＨＭＰＢに対し５８％） ０.３０ｇのＬ−アスパラギン酸 ０.１６ｇのＬ−グルタミン酸 ０.０２ｇのＬ−アラニン
【００４２】実施例１０ 固定化ＰＳＴおよび遊離ＧＯＴを用いた共役アミノ基転
移反応 １８０mg（１mmol）のＨＭＰＢ、１４７mg（１mmol）の
Ｌ−グルタミン酸、１３３mg（１mmol）のＬ−アスパラ
ギン酸、１０mgのピリドキサールホスフェートおよび
０.７ｇのＴＲＩＳを蒸留水で５０ｇの溶液（pH８）と
し、そして実施例６からの溶液からの０.５mlの固定化
ＰＳＴおよび実施例７で調製されたＧＯＴ溶液からの４
２μｌの遊離ＧＯＴを添加する。注意深く撹拌しながら
３６℃で反応を行う。４８時間後の溶液中のアミノ酸含
量をＨＰＬＣ（ＡＡＡ）により調べる。
移反応 １８０mg（１mmol）のＨＭＰＢ、１４７mg（１mmol）の
Ｌ−グルタミン酸、１３３mg（１mmol）のＬ−アスパラ
ギン酸、１０mgのピリドキサールホスフェートおよび
０.７ｇのＴＲＩＳを蒸留水で５０ｇの溶液（pH８）と
し、そして実施例６からの溶液からの０.５mlの固定化
ＰＳＴおよび実施例７で調製されたＧＯＴ溶液からの４
２μｌの遊離ＧＯＴを添加する。注意深く撹拌しながら
３６℃で反応を行う。４８時間後の溶液中のアミノ酸含
量をＨＰＬＣ（ＡＡＡ）により調べる。
【００４３】 収量（ＨＰＬＣ）：０.１４５ｇのＬ−ＰＰＴ（ＨＭＰＢに対し８０％） ０.０２４ｇのＬ−アスパラギン酸 ０.１４７ｇのＬ−グルタミン酸 ０.００３ｇのＬ−アラニン
【００４４】実施例１１ 固定化ＰＳＴおよび固定化ＧＯＴを用いた共役アミノ基
転移反応 実施例１０と同様にして反応を行う。遊離ＧＯＴに代え
て０.５mlの固定化ＧＯＴ（実施例６）を用いる。生成
物溶液中のアミノ酸組成は実施例１０のそれに相当す
る。
転移反応 実施例１０と同様にして反応を行う。遊離ＧＯＴに代え
て０.５mlの固定化ＧＯＴ（実施例６）を用いる。生成
物溶液中のアミノ酸組成は実施例１０のそれに相当す
る。
【００４５】Ｌ−ＰＰＴ含量は薄層クロマトグラフィー
により測定した。それは約８０％である。
により測定した。それは約８０％である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アルノ・シユルツ ドイツ連邦共和国デー−6239エプシユタ イン／タウヌス．インデンアムトマンス ヴイーゼン５ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 1/00 - 41/00 C07F 9/30 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 で示されるＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホ
スフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリシン）を式（I
I） 【化２】 で示される４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２
−オキソ酪酸(ＨＭＰＢ)から以下の反応工程、すなわち ａ） 適当なトランスアミナーゼ１の存在下にアスパル
テートとα−ケトグルタレートを反応させてオキザルア
セテートおよびグルタメートを生成させる、および ｂ） 適当なトランスアミナーゼ２の存在下にグルタメ
ートと式（II）のＨＭＰＢを反応させてα−ケトグルタ
メートおよびＬ−ホスフィノトリシンを生成させる工程
より成る共役酵素反応により製造する方法であって、ア
スパルテート対ＨＭＰＢモル比を０.５〜１.５対１、好
ましくは０.８〜１.２対１、特に等モル比とし、またグ
ルタメートまたはα−ケトグルタレートを触媒量で添加
することを特徴とする製造方法。 - 【請求項２】 グルタメートまたはα−ケトグルタレー
トをＨＭＰＢに対し０.０１〜１対１、好ましくは０.０
１〜０.２対１、特に０.０５〜０.２対１のモル比で添
加する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 トランスアミナーゼ１がグルタメート／
オキザルアセテートトランスアミナーゼ活性（ＧＯＴ活
性）を有する請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 ＧＯＴがブタ、大腸菌またはバチルス、
好ましくは大腸菌またはバチルスを起源とする請求項３
記載の方法。 - 【請求項５】 トランスアミナーゼ２がＬ−ホスフィノ
トリシントランスアミナーゼ活性を有する請求項１また
は２記載の方法。 - 【請求項６】 Ｌ−ホスフィノトリシン特異的トランス
アミナーゼが大腸菌を起源とする請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 オキザルアセテートが多価陽イオン、好
ましくはＡｌ3+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｚｎ2+、Ｆｅ2+また
はＦｅ3+の存在下にピルベートに脱カルボキシル化され
る請求項１〜６の少くとも一に記載の方法。 - 【請求項８】 トランスアミナーゼ１およびトランスア
ミナーゼ２がピルベートをアラニンに転化しない請求項
７記載の方法。 - 【請求項９】 少くとも一方のトランスアミナーゼが固
定化された形で存在する請求項１〜８の少くとも一に記
載の方法。 - 【請求項１０】 固定化されたトランスアミナーゼがカ
ラム反応装置に存在する請求項９記載の方法。
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|---|---|---|---|
| DE4030578A DE4030578A1 (de) | 1990-09-27 | 1990-09-27 | Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin durch eine gekoppelte enzymatische reaktion |
| DE40305783 | 1990-09-27 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04248987A JPH04248987A (ja) | 1992-09-04 |
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|---|---|---|---|
| JP3247204A Expired - Fee Related JP3018261B2 (ja) | 1990-09-27 | 1991-09-26 | 共役酵素反応によるｌ−ホスフィノトリシンの製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6335186B1 (ja) |
| EP (1) | EP0477902B1 (ja) |
| JP (1) | JP3018261B2 (ja) |
| KR (1) | KR100190203B1 (ja) |
| DE (2) | DE4030578A1 (ja) |
| DK (1) | DK0477902T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5335413B2 (ja) * | 2006-03-02 | 2013-11-06 | Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 | アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子およびｌ−ホスフィノスリシンの製造方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06245780A (ja) * | 1993-02-25 | 1994-09-06 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Ｌ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸の製造法 |
| WO2000023609A1 (en) * | 1998-10-19 | 2000-04-27 | Nsc Technologies Llc | Transaminase biotransformation process employing glutamic acid |
| DE19919848A1 (de) * | 1999-04-30 | 2000-11-02 | Aventis Cropscience Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Phosphinothricin durch enzymatische Transaminierung mit Aspartat |
| TWI728974B (zh) | 2015-05-11 | 2021-06-01 | 德商拜耳作物科學股份有限公司 | 包含ｌ-固殺草及茚嗪氟草胺之殺草劑組合 |
| US9834802B2 (en) | 2016-03-02 | 2017-12-05 | Agrimetis, Llc | Methods for making L-glufosinate |
| CN107119084B (zh) * | 2017-03-23 | 2019-12-17 | 浙江大学 | 一种利用转氨酶和乙烯合成酶生产l-草铵膦的方法 |
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| AU2021210110A1 (en) | 2020-01-23 | 2022-08-11 | Basf Se | PPO formulations containing ether sulfates |
| BR112022014855A2 (pt) | 2020-01-31 | 2022-09-20 | Basf Se | Combinação de herbicidas, composição, métodos de produção de combinações herbicidas, de tratamento ou proteção de plantas produtoras em fileiras e de tratamento ou proteção de plantas especializadas e uso da combinação de herbicidas |
| WO2021151745A1 (en) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Basf Se | Herbicide combinations comprising glufosinate and oxadiazon |
| BR112022014950A2 (pt) | 2020-01-31 | 2022-09-20 | Basf Se | Combinação de herbicidas, composição, métodos de produção de combinações de herbicidas, de controle do crescimento vegetal indesejado e de tratamento ou proteção de plantas e uso da combinação de herbicidas |
| WO2021151753A1 (en) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Basf Se | Herbicide combinations comprising glufosinate and selected ppo inhibitors |
| WO2021151735A1 (en) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Basf Se | Herbicide combinations comprising glufosinate and carfentrazone-ethyl |
| BR112022014831A2 (pt) | 2020-01-31 | 2022-09-27 | Basf Se | Combinação de herbicidas, composição, métodos para produzir uma combinação de herbicidas, para controlar o crescimento de plantas indesejadas e para tratar ou proteger culturas e uso de uma combinação de herbicidas |
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| BR112022014955A2 (pt) | 2020-01-31 | 2022-09-20 | Basf Se | Combinação herbicida, composição, métodos para produzir uma combinação herbicida, para controlar o crescimento indesejado das plantas e/ou controlar plantas nocivas, para tratar ou proteger culturas em linha e para tratar ou proteger culturas especiais e uso de combinação herbicida |
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| AU599985B2 (en) * | 1986-06-09 | 1990-08-02 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | New process for the production of L-2-amino-4- (hydroxymethyl-phosphinyl)-butyric acid |
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1995
- 1995-03-22 US US08/408,178 patent/US6335186B1/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5335413B2 (ja) * | 2006-03-02 | 2013-11-06 | Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 | アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子およびｌ−ホスフィノスリシンの製造方法 |
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