JP3007037B2 - ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ蛋白由来の人工抗原及びその人工抗原によって誘発された抗体 - Google Patents
ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ蛋白由来の人工抗原及びその人工抗原によって誘発された抗体Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、消化器病変の一因
になると言われているヘリコバクター・ピロリ感染症に
対するワクチンや診断薬等として利用可能なヘリコバク
ター・ピロリ菌ウレアーゼ蛋白由来の人工抗原、及び、
ヘリコバクター・ピロリ感染症に対する治療薬や診断薬
等として利用可能な抗ヘリコバクター・ピロリ菌ウレア
ーゼ抗体に関するものである。
になると言われているヘリコバクター・ピロリ感染症に
対するワクチンや診断薬等として利用可能なヘリコバク
ター・ピロリ菌ウレアーゼ蛋白由来の人工抗原、及び、
ヘリコバクター・ピロリ感染症に対する治療薬や診断薬
等として利用可能な抗ヘリコバクター・ピロリ菌ウレア
ーゼ抗体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】１９８３年にワレン（Warren）とマーシ
ャル（Marshall）らが胃粘膜からヘリコバクター・ピロ
リ菌（Helicobacter pylori 、以下「ＨＰ」という）を
分離・培養して以来、胃・十二指腸潰瘍や胃癌等の消化
器病変に対するＨＰの関与が注目されるようになり、現
在、多数の研究者によって研究が進められている。現在
のところ、ＨＰの感染が消化器病変の一因になるとの認
識が定着しつつあるが、感染から病状発現に至るまでの
病態については解明されていない部分が多い。最近よう
やくＨＰ感染のマウスモデルが開発された（サイエンス
（Science ）、第２６７巻１７号第１６６５〜１６５８
頁（１９９５））のを契機として、今後、病態の解明が
進展するものと予想される。
ャル（Marshall）らが胃粘膜からヘリコバクター・ピロ
リ菌（Helicobacter pylori 、以下「ＨＰ」という）を
分離・培養して以来、胃・十二指腸潰瘍や胃癌等の消化
器病変に対するＨＰの関与が注目されるようになり、現
在、多数の研究者によって研究が進められている。現在
のところ、ＨＰの感染が消化器病変の一因になるとの認
識が定着しつつあるが、感染から病状発現に至るまでの
病態については解明されていない部分が多い。最近よう
やくＨＰ感染のマウスモデルが開発された（サイエンス
（Science ）、第２６７巻１７号第１６６５〜１６５８
頁（１９９５））のを契機として、今後、病態の解明が
進展するものと予想される。
【０００３】ＨＰによる消化器病変は、いわばＨＰ感染
症としてとらえ得ることから、その病態解明と並行し
て、ワクチンや抗体等を利用した免疫学的治療法の研究
も進められている。特に、ＨＰ菌体成分の一つであるＨ
Ｐウレアーゼが、ＨＰの増殖及びＨＰによる消化器粘膜
の障害の両面にとって不可欠な酵素であると考えられる
ことから、ＨＰウレアーゼ又はそのサブユニット（短鎖
のＡサブユニットと長鎖のＢサブユニットとがある）を
免疫原として用いた研究がなされている。
症としてとらえ得ることから、その病態解明と並行し
て、ワクチンや抗体等を利用した免疫学的治療法の研究
も進められている。特に、ＨＰ菌体成分の一つであるＨ
Ｐウレアーゼが、ＨＰの増殖及びＨＰによる消化器粘膜
の障害の両面にとって不可欠な酵素であると考えられる
ことから、ＨＰウレアーゼ又はそのサブユニット（短鎖
のＡサブユニットと長鎖のＢサブユニットとがある）を
免疫原として用いた研究がなされている。
【０００４】ガストロエンテロロジー（Gastroenterolo
gy）、第１０７巻第１００２〜１０１１頁（１９９４）
には、マウスにＨＰウレアーゼ、Ａサブユニット又はＢ
サブユニットを経口投与して免疫した後にＨＰに近縁の
ヘリコバクター・フェリス（Helicobacter felis）を接
種したところ、ＨＰウレアーゼ又はＢサブユニットによ
る経口免疫群には感染防御効果が認められたが、Ａサブ
ユニット群には効果が認められなかった旨が報告されて
いる。
gy）、第１０７巻第１００２〜１０１１頁（１９９４）
には、マウスにＨＰウレアーゼ、Ａサブユニット又はＢ
サブユニットを経口投与して免疫した後にＨＰに近縁の
ヘリコバクター・フェリス（Helicobacter felis）を接
種したところ、ＨＰウレアーゼ又はＢサブユニットによ
る経口免疫群には感染防御効果が認められたが、Ａサブ
ユニット群には効果が認められなかった旨が報告されて
いる。
【０００５】インフェクション・アンド・イミュニティ
（Infection and immunity）、第６０巻１１号第４８２
６〜４８３１頁（１９９２）には、長鎖サブユニット
（Ｂサブユニット）又は短鎖サブユニット（Ａサブユニ
ット）のいずれかを認識する合計１０種のモノクロナー
ル抗ＨＰウレアーゼ抗体のうち、長鎖を認識するＬ２抗
体と短鎖を認識するＳ２抗体に強いウレアーゼ活性阻害
作用を認めた旨と、上記のＬ２抗体によって認識される
抗原決定基はヘリコバクター種に共通の構造であると推
測される旨が報告されている。また、この文献には、ポ
リクロナール抗ＨＰウレアーゼ抗体中に、抗ＨＰウレア
ーゼ抗体によるＨＰウレアーゼ阻害作用を無効化する抗
体が含まれていた旨も報告されている。
（Infection and immunity）、第６０巻１１号第４８２
６〜４８３１頁（１９９２）には、長鎖サブユニット
（Ｂサブユニット）又は短鎖サブユニット（Ａサブユニ
ット）のいずれかを認識する合計１０種のモノクロナー
ル抗ＨＰウレアーゼ抗体のうち、長鎖を認識するＬ２抗
体と短鎖を認識するＳ２抗体に強いウレアーゼ活性阻害
作用を認めた旨と、上記のＬ２抗体によって認識される
抗原決定基はヘリコバクター種に共通の構造であると推
測される旨が報告されている。また、この文献には、ポ
リクロナール抗ＨＰウレアーゼ抗体中に、抗ＨＰウレア
ーゼ抗体によるＨＰウレアーゼ阻害作用を無効化する抗
体が含まれていた旨も報告されている。
【０００６】また、日本消化器病学会雑誌第９１巻１２
号第２２０２〜２２１３頁（１９９４）には、胃・十二
指腸病変患者の血清中にＨＰウレアーゼとは強く反応す
るが他のウレアーゼとの交差反応性を示さない、特異的
な抗ＨＰＩｇＧ抗体が存在しており、この抗体は、Ｂ鎖
（Ｂサブユニット）を認識していたことが報告されてい
る。
号第２２０２〜２２１３頁（１９９４）には、胃・十二
指腸病変患者の血清中にＨＰウレアーゼとは強く反応す
るが他のウレアーゼとの交差反応性を示さない、特異的
な抗ＨＰＩｇＧ抗体が存在しており、この抗体は、Ｂ鎖
（Ｂサブユニット）を認識していたことが報告されてい
る。
【０００７】これらの研究報告は、ＨＰ感染に対する免
疫原として、ＨＰウレアーゼ、そのＢサブユニット、又
はこれらのタンパク質中に存在する抗原決定基を利用で
きる可能性を示唆している。
疫原として、ＨＰウレアーゼ、そのＢサブユニット、又
はこれらのタンパク質中に存在する抗原決定基を利用で
きる可能性を示唆している。
【０００８】しかしながら、消化器粘膜への障害作用を
有するＨＰウレアーゼそのものをワクチンとして利用す
るのは危険である。また、たとえ障害作用のないＢサブ
ユニットを用いたとしても、ＨＰウレアーゼと同様に分
子量の大きい蛋白質であることから、特定の抗原決定基
のみを免疫することができない。したがって、高力価の
抗体を産生することが困難だという問題があり、しかも
上述のように、ＨＰウレアーゼ阻害作用を無効化する抗
体が同時に産生されてしまう恐れもある。
有するＨＰウレアーゼそのものをワクチンとして利用す
るのは危険である。また、たとえ障害作用のないＢサブ
ユニットを用いたとしても、ＨＰウレアーゼと同様に分
子量の大きい蛋白質であることから、特定の抗原決定基
のみを免疫することができない。したがって、高力価の
抗体を産生することが困難だという問題があり、しかも
上述のように、ＨＰウレアーゼ阻害作用を無効化する抗
体が同時に産生されてしまう恐れもある。
【０００９】そして、以上のような問題があるにもかか
わらず、ＨＰウレアーゼ中の抗原決定基の構造について
は全く研究がなされていないのが現状である。
わらず、ＨＰウレアーゼ中の抗原決定基の構造について
は全く研究がなされていないのが現状である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＨＰ
ウレアーゼの活性を強力に且つ特異的に阻害する抗体を
産生し得る抗原決定基のみを有し、ＨＰ感染に対するワ
クチンや診断薬等として有用な人工抗原、及び該人工抗
原によって誘導され、ＨＰ感染に対する治療薬や診断薬
等として有用な抗ＨＰウレアーゼ抗体を提供することに
ある。
ウレアーゼの活性を強力に且つ特異的に阻害する抗体を
産生し得る抗原決定基のみを有し、ＨＰ感染に対するワ
クチンや診断薬等として有用な人工抗原、及び該人工抗
原によって誘導され、ＨＰ感染に対する治療薬や診断薬
等として有用な抗ＨＰウレアーゼ抗体を提供することに
ある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ＨＰウレア
ーゼの抗原決定基について研究を進める過程で、ＨＰウ
レアーゼのＡサブユニット及びＢサブユニットが有する
アミノ酸配列の断片（フラグメント）に相当する多数の
ペプチドを合成し、各ペプチド断片の免疫原性を詳細に
検討した。その結果、Ｂサブユニット中のあるアミノ酸
配列（ＵＢ−３３）が極めて特異的な免疫原性を有して
いることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて
完成されたものである。
ーゼの抗原決定基について研究を進める過程で、ＨＰウ
レアーゼのＡサブユニット及びＢサブユニットが有する
アミノ酸配列の断片（フラグメント）に相当する多数の
ペプチドを合成し、各ペプチド断片の免疫原性を詳細に
検討した。その結果、Ｂサブユニット中のあるアミノ酸
配列（ＵＢ−３３）が極めて特異的な免疫原性を有して
いることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて
完成されたものである。
【００１２】すなわち本発明は、下記一般式（１） Cys-His-His-Leu-Asp-Lys-Ser-Ile-Lys-Glu-Asp-Val-Gln-Phe-Ala-Asp-Ser-Arg- Ile …（１） ［式中、Cys はシステイン、His はヒスチジン、Leu は
ロイシン、Asp はアスパラギン酸、Lys はリジン、Ser
はセリン、Ile はイソロイシン、Glu はグルタミン酸、
Val はバリン、Gln はグルタミン、Phe はフェニルアラ
ニン、Ala はアラニン、Arg はアルギニンをそれぞれ表
す。］のアミノ酸配列で表されるペプチド、又は、当該
ペプチドのフラグメント及び当該ペプチドの欠失、付加
又は置換によって得られる修飾体及び当該ペプチドの塩
及び当該ペプチドのエステルの中から選ばれ且つ当該ペ
プチドと同等の免疫学的特異性を有し且つ下記一般式
（４） Ser-Ile-Lys-Glu-Asp-Val-Gln-Phe …（４） ［式中の各略号は、一般式（１）と同じ］のアミノ酸配
列で表される最小抗原決定基を有する変異体からなるこ
とを特徴とする、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ
人工抗原を提供するものである。ここで、「一般式
（１）のアミノ酸配列で表されるペプチドと同等の免疫
学的特異性を有する」、或いは、「一般式（４）のアミ
ノ酸配列で表されるペプチドと同等の免疫学的特異性を
有する」とは、ある抗原に対して一般式（１）又は
（４）のアミノ酸配列で表されるペプチドから誘導され
る抗体が交差反応性を有し、且つ、当該抗原が一般式
（１）又は（４）のアミノ酸配列で表されるペプチドと
交差反応性を有する抗体だけを誘導することを言う。
ロイシン、Asp はアスパラギン酸、Lys はリジン、Ser
はセリン、Ile はイソロイシン、Glu はグルタミン酸、
Val はバリン、Gln はグルタミン、Phe はフェニルアラ
ニン、Ala はアラニン、Arg はアルギニンをそれぞれ表
す。］のアミノ酸配列で表されるペプチド、又は、当該
ペプチドのフラグメント及び当該ペプチドの欠失、付加
又は置換によって得られる修飾体及び当該ペプチドの塩
及び当該ペプチドのエステルの中から選ばれ且つ当該ペ
プチドと同等の免疫学的特異性を有し且つ下記一般式
（４） Ser-Ile-Lys-Glu-Asp-Val-Gln-Phe …（４） ［式中の各略号は、一般式（１）と同じ］のアミノ酸配
列で表される最小抗原決定基を有する変異体からなるこ
とを特徴とする、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ
人工抗原を提供するものである。ここで、「一般式
（１）のアミノ酸配列で表されるペプチドと同等の免疫
学的特異性を有する」、或いは、「一般式（４）のアミ
ノ酸配列で表されるペプチドと同等の免疫学的特異性を
有する」とは、ある抗原に対して一般式（１）又は
（４）のアミノ酸配列で表されるペプチドから誘導され
る抗体が交差反応性を有し、且つ、当該抗原が一般式
（１）又は（４）のアミノ酸配列で表されるペプチドと
交差反応性を有する抗体だけを誘導することを言う。
【００１３】また本発明は、上記一般式（１）のアミノ
酸配列で表されるペプチド、又は、当該ペプチドと同等
の免疫学的特異性を有する上記変異体からなる人工抗原
を免疫原とすることによって誘導される抗ＨＰウレアー
ゼ抗体（ただし、Ｌ２抗体を除く）をも提供する。
酸配列で表されるペプチド、又は、当該ペプチドと同等
の免疫学的特異性を有する上記変異体からなる人工抗原
を免疫原とすることによって誘導される抗ＨＰウレアー
ゼ抗体（ただし、Ｌ２抗体を除く）をも提供する。
【００１４】本発明の人工抗原及び抗ＨＰウレアーゼ抗
体は、以下のような種々の優れた性質を有している。 （１）本発明の人工抗原によって誘導される抗ＨＰウレ
アーゼ抗体は、ＨＰウレアーゼの活性を強力に阻害する
だけでなく、ジャックビーン（Jack Bean ）などの他種
ウレアーゼに対しては交差反応性を示さないので、特異
性も高い。
体は、以下のような種々の優れた性質を有している。 （１）本発明の人工抗原によって誘導される抗ＨＰウレ
アーゼ抗体は、ＨＰウレアーゼの活性を強力に阻害する
だけでなく、ジャックビーン（Jack Bean ）などの他種
ウレアーゼに対しては交差反応性を示さないので、特異
性も高い。
【００１５】（２）本発明の人工抗原は不要な抗原決定
基を含んでいないので、不要な抗体や抗ＨＰウレアーゼ
抗体によるウレアーゼ活性阻害作用を中和してしまう有
害な抗体を誘導しない。
基を含んでいないので、不要な抗体や抗ＨＰウレアーゼ
抗体によるウレアーゼ活性阻害作用を中和してしまう有
害な抗体を誘導しない。
【００１６】（３）特に一般式（１）の構造を有する場
合には、ペプチドのＮ末端はシステインであり、免疫原
性を高めるためのキャリア蛋白や診断薬として用いる際
のラベル蛋白を容易に結合させることができる。
合には、ペプチドのＮ末端はシステインであり、免疫原
性を高めるためのキャリア蛋白や診断薬として用いる際
のラベル蛋白を容易に結合させることができる。
【００１７】（４）本発明の人工抗原は、ヘリコバクタ
ー種に共通の抗原決定基であると考えられ、この人工抗
原によって誘導される本発明の抗体は、変異株ＨＰ（バ
リアント）のウレアーゼに対しても有効であると考えら
れる。
ー種に共通の抗原決定基であると考えられ、この人工抗
原によって誘導される本発明の抗体は、変異株ＨＰ（バ
リアント）のウレアーゼに対しても有効であると考えら
れる。
【００１８】従って、本発明の人工抗原及び抗体は、高
力価で特異性が高いワクチン又は治療薬として、或いは
ＨＰ感染に対する有効な抗体産生が体内で行われている
か否かを判定するための診断薬等として、極めて有用で
ある。治療的応用の観点からみた場合、ＨＰウレアーゼ
はＨＰの増殖及びＨＰによる消化器粘膜障害の両面にと
って不可欠な酵素であると考えられることから、本発明
の人工抗原又は抗体によってＨＰウレアーゼ活性を強力
に抑制すれば、ＨＰ増殖の阻止という根本的治療と消化
器粘膜障害の緩和という対症的治療を同時に行うことが
でき、非常に効果的である。
力価で特異性が高いワクチン又は治療薬として、或いは
ＨＰ感染に対する有効な抗体産生が体内で行われている
か否かを判定するための診断薬等として、極めて有用で
ある。治療的応用の観点からみた場合、ＨＰウレアーゼ
はＨＰの増殖及びＨＰによる消化器粘膜障害の両面にと
って不可欠な酵素であると考えられることから、本発明
の人工抗原又は抗体によってＨＰウレアーゼ活性を強力
に抑制すれば、ＨＰ増殖の阻止という根本的治療と消化
器粘膜障害の緩和という対症的治療を同時に行うことが
でき、非常に効果的である。
【００１９】本発明においては、さらに、下記一般式
（４） Ser-Ile-Lys-Glu-Asp-Val-Gln-Phe …（４） ［式中、Ser はセリン、Ile はイソロイシン、Lys はリ
ジン、Glu はグルタミン酸、Asp はアスパラギン酸、Va
l はバリン、Gln はグルタミン、Phe はフェニルアラニ
ンをそれぞれ表す。］のアミノ酸配列で表されるペプチ
ド、又は、当該ペプチドの付加によって得られる修飾体
及び当該ペプチドの酸及び当該ペプチドのエステルの中
から選ばれ且つ当該ペプチドと同等の免疫学的特異性を
有し且つ上記一般式（４）のアミノ酸配列で表される最
小抗原決定基を有する変異体からなることを特徴とす
る、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ人工抗原を提
供する。
（４） Ser-Ile-Lys-Glu-Asp-Val-Gln-Phe …（４） ［式中、Ser はセリン、Ile はイソロイシン、Lys はリ
ジン、Glu はグルタミン酸、Asp はアスパラギン酸、Va
l はバリン、Gln はグルタミン、Phe はフェニルアラニ
ンをそれぞれ表す。］のアミノ酸配列で表されるペプチ
ド、又は、当該ペプチドの付加によって得られる修飾体
及び当該ペプチドの酸及び当該ペプチドのエステルの中
から選ばれ且つ当該ペプチドと同等の免疫学的特異性を
有し且つ上記一般式（４）のアミノ酸配列で表される最
小抗原決定基を有する変異体からなることを特徴とす
る、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ人工抗原を提
供する。
【００２０】また同時に、上記一般式（４）のアミノ酸
配列で表されるペプチド、又は、当該ペプチドと同等の
免疫学的特異性を有する上記変異体からなる人工抗原を
免疫原とすることによって誘導される抗ＨＰウレアーゼ
抗体（ただし、Ｌ２抗体を除く）をも提供する。
配列で表されるペプチド、又は、当該ペプチドと同等の
免疫学的特異性を有する上記変異体からなる人工抗原を
免疫原とすることによって誘導される抗ＨＰウレアーゼ
抗体（ただし、Ｌ２抗体を除く）をも提供する。
【００２１】上記の一般式（４）で表されるアミノ酸配
列は、一般式（１）のアミノ酸配列中に含まれる最小抗
原決定基であり、一般式（１）で表されるペプチドの極
めて有用なフラグメントである。従って、この最小抗原
決定基を内包しているペプチドは、一般式（１）のアミ
ノ酸配列を有するペプチドと同等又はそれ以上に優れた
抗原として利用できる。
列は、一般式（１）のアミノ酸配列中に含まれる最小抗
原決定基であり、一般式（１）で表されるペプチドの極
めて有用なフラグメントである。従って、この最小抗原
決定基を内包しているペプチドは、一般式（１）のアミ
ノ酸配列を有するペプチドと同等又はそれ以上に優れた
抗原として利用できる。
【００２２】なお、本発明において「機能的に均等な変
異体」とは、アミノ酸残基の欠失、付加、置換又は誘導
化によって得られる修飾体であって、免疫学的又は生物
学的に同様の作用を発現するものを言う。例えば、一般
式（１）又は（４）で表されるアミノ酸配列の一部が欠
失又は置換された合成ペプチドや、そのアミノ酸配列の
Ｎ末端又はＣ末端に数個のペプチド残基が付加された合
成ペプチド、そのアミノ酸配列の一部に相当するフラグ
メント、さらには塩やエステル等の誘導体は、本発明の
目的に反しない限り、一般式（１）又は（４）で表され
るアミノ酸配列を有するペプチドと機能的に均等な変異
体に該当する。
異体」とは、アミノ酸残基の欠失、付加、置換又は誘導
化によって得られる修飾体であって、免疫学的又は生物
学的に同様の作用を発現するものを言う。例えば、一般
式（１）又は（４）で表されるアミノ酸配列の一部が欠
失又は置換された合成ペプチドや、そのアミノ酸配列の
Ｎ末端又はＣ末端に数個のペプチド残基が付加された合
成ペプチド、そのアミノ酸配列の一部に相当するフラグ
メント、さらには塩やエステル等の誘導体は、本発明の
目的に反しない限り、一般式（１）又は（４）で表され
るアミノ酸配列を有するペプチドと機能的に均等な変異
体に該当する。
【００２３】
【実施例】以下において、実験例を通じて本発明をさら
に詳しく説明する。実験例１（抗原決定基の特定） 本発明の人工抗原は、ＨＰウレアーゼのＢサブユニット
に含まれる抗原決定基である。本発明者は、この抗原決
定基を特定するために、先ず、ＨＰウレアーゼのＡサブ
ユニットとＢサブユニット中の部分的なアミノ酸配列に
相当する多数のポリペプチドを合成し、各ペプチド断片
とＨＰウレアーゼ活性中和能を有する既知の抗ＨＰウレ
アーゼ抗体との反応性について検討した。さらに、かか
る反応性試験において特異的な反応性を示したペプチド
断片の免疫原性を調べた。
に詳しく説明する。実験例１（抗原決定基の特定） 本発明の人工抗原は、ＨＰウレアーゼのＢサブユニット
に含まれる抗原決定基である。本発明者は、この抗原決
定基を特定するために、先ず、ＨＰウレアーゼのＡサブ
ユニットとＢサブユニット中の部分的なアミノ酸配列に
相当する多数のポリペプチドを合成し、各ペプチド断片
とＨＰウレアーゼ活性中和能を有する既知の抗ＨＰウレ
アーゼ抗体との反応性について検討した。さらに、かか
る反応性試験において特異的な反応性を示したペプチド
断片の免疫原性を調べた。
【００２４】１−（１）：ペプチド断片の調製 抗原決定基の候補として、２３種のＡサブユニットに由
来するペプチド断片及び５６種のＢサブユニットに由来
するペプチド断片を合成した。
来するペプチド断片及び５６種のＢサブユニットに由来
するペプチド断片を合成した。
【００２５】ＨＰウレアーゼは、下記の一般式（２）で
表される短鎖のＡサブユニットと下記の一般式（３）で
表される長鎖のＢサブユニットから構成されている。 ［ウレアーゼＡサブユニット・シークエンス］ ＭＫＬＴＰ ＫＥＬＤＫ ＬＭＬＨＹ ＡＧＥＬＡ ＫＫＲＫＥ ＫＧＩＫＬ ＮＹＶＥＡ ＶＡＬＩＳ ＡＨＩＭＥ ＥＡＲＡＧ ＫＫＴＡＡ ＥＬＭＱＥ ＧＲＴＬＬ ＫＰＤＤＶ ＭＤＧＶＡ ＳＭＩＨＥ ＶＧＩＥＡ ＭＦＰＤＧ ＴＫＬＶＴ ＶＨＴＰＩ ＥＡＮＧＫ ＬＶＰＧＥ ＬＦＬＫＮ ＥＤＩＴＩ ＮＥＧＫＫ ＡＶＳＶＫ ＶＫＮＶＧ ＤＲＰＶＱ ＩＧＳＨＦ ＨＦＦＥＶ ＮＲＣＬＤ ＦＤＲＥＫ ＴＦＧＫＲ ＬＤＩＡＳ ＧＴＡＶＲ ＦＥＰＧＥ ＥＫＳＶＥ ＬＩＤＩＧ ＧＮＲＲＩ ＦＧＦＮＡ ＬＶＤＲＱ ＡＤＮＥＳ ＫＫＩＡＬ ＨＲＡＫＥ ＲＧＦＨＧ ＡＫＳＤＤ ＮＹＶＫＴ ＩＫＥ …（２） ［式中、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラ
ギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇ
はグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋは
リジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラ
ギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
ン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
リプトファン、Ｙはチロシンをそれぞれ表す。］ ［ウレアーゼＢサブユニット・シークエンス］ ＭＫＫＩＳ ＲＫＥＹＶ ＳＭＹＧＰ ＴＴＧＤＫ ＶＲＬＧＤ ＴＤＬＩＡ ＥＶＥＨＤ ＹＴＩＹＧ ＥＥＬＫＦ ＧＧＧＫＴ ＬＲＥＧＭ ＳＱＳＮＮ ＰＳＫＥＥ ＬＤＬＩＩ ＴＮＡＬＩ ＶＤＹＴＧ ＩＹＫＡＤ ＩＧＩＫＤ ＧＫＩＡＧ ＩＧＫＧＧ ＮＫＤＭＱ ＤＧＶＫＮ ＮＬＳＶＧ ＰＡＴＥＡ ＬＡＧＥＧ ＬＩＶＴＡ ＧＧＩＤＴ ＨＩＨＦＩ ＳＰＱＱＩ ＰＴＡＦＡ ＳＧＶＴＴ ＭＩＧＧＧ ＴＧＰＡＤ ＧＴＮＡＴ ＴＩＴＰＧ ＲＲＮＬＫ ＷＭＬＲＡ ＡＥＥＹＳ ＭＮＬＧＦ ＬＡＫＧＮ ＡＳＮＤＡ ＳＬＡＤＱ ＩＥＡＧＡ ＩＧＦＫＩ ＨＥＤＷＧ ＴＴＰＳＡ ＩＮＨＡＬ ＤＶＡＤＫ ＹＤＶＱＶ ＡＩＨＴＤ ＴＬＮＥＡ ＧＣＶＥＤ ＴＭＡＡＩ ＡＧＲＴＭ ＨＴＦＨＴ ＥＧＡＧＧ ＧＨＡＰＤ ＩＩＫＶＡ ＧＥＨＮＩ ＬＰＡＳＴ ＮＰＴＩＰ ＦＴＶＮＴ ＥＡＥＨＭ ＤＭＬＭＶ ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩＲ ＰＱＴＩＡ ＡＥＤＴＬ ＨＤＭＧＩ ＦＳＩＴＳ ＳＤＳＱＡ ＭＧＲＶＧ ＥＶＩＴＲ ＴＷＱＴＡ ＤＫＮＫＫ ＥＦＧＲＬ ＫＥＥＫＧ ＤＮＤＮＦ ＲＩＫＲＹ ＬＳＫＹＴ ＩＮＰＡＩ ＡＨＧＩＳ ＥＹＶＧＳ ＶＥＶＧＫ ＶＡＤＬＶ ＬＷＳＰＡ ＦＦＧＶＫ ＰＮＭＩＩ ＫＧＧＦＩ ＡＬＳＱＭ ＧＤＡＮＡ ＳＩＰＴＰ ＱＰＶＹＹ ＲＥＭＦＡ ＨＨＧＫＡ ＫＹＤＡＮ ＩＴＦＶＳ ＱＡＡＹＤ ＫＧＩＫＥ ＥＬＧＬＥ ＲＱＶＬＰ ＶＫＮＣＲ ＮＩＴＫＫ ＤＭＱＦＮ ＤＴＴＡＨ ＩＥＶＮＰ ＥＴＹＨＶ ＦＶＤＧＫ ＥＶＴＳＫ ＰＡＮＫＶ ＳＬＡＱＬ ＦＳＩＦ …（３） ［式中の記号は上記と同じ。］ Ａサブユニット由来のペプチド断片は、下記のＵＡ−１
〜ＵＡ−２３の２３種であった。これらは原則として２
０個のアミノ酸からなり、ＡサブユニットのＮ末端から
アミノ酸を１０個ずつずらして切り出した配列を有する
ように合成した。従って、隣合うペプチド断片のアミノ
酸配列は、アミノ酸が１０個ずつ重複している。
表される短鎖のＡサブユニットと下記の一般式（３）で
表される長鎖のＢサブユニットから構成されている。 ［ウレアーゼＡサブユニット・シークエンス］ ＭＫＬＴＰ ＫＥＬＤＫ ＬＭＬＨＹ ＡＧＥＬＡ ＫＫＲＫＥ ＫＧＩＫＬ ＮＹＶＥＡ ＶＡＬＩＳ ＡＨＩＭＥ ＥＡＲＡＧ ＫＫＴＡＡ ＥＬＭＱＥ ＧＲＴＬＬ ＫＰＤＤＶ ＭＤＧＶＡ ＳＭＩＨＥ ＶＧＩＥＡ ＭＦＰＤＧ ＴＫＬＶＴ ＶＨＴＰＩ ＥＡＮＧＫ ＬＶＰＧＥ ＬＦＬＫＮ ＥＤＩＴＩ ＮＥＧＫＫ ＡＶＳＶＫ ＶＫＮＶＧ ＤＲＰＶＱ ＩＧＳＨＦ ＨＦＦＥＶ ＮＲＣＬＤ ＦＤＲＥＫ ＴＦＧＫＲ ＬＤＩＡＳ ＧＴＡＶＲ ＦＥＰＧＥ ＥＫＳＶＥ ＬＩＤＩＧ ＧＮＲＲＩ ＦＧＦＮＡ ＬＶＤＲＱ ＡＤＮＥＳ ＫＫＩＡＬ ＨＲＡＫＥ ＲＧＦＨＧ ＡＫＳＤＤ ＮＹＶＫＴ ＩＫＥ …（２） ［式中、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラ
ギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇ
はグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋは
リジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラ
ギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
ン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
リプトファン、Ｙはチロシンをそれぞれ表す。］ ［ウレアーゼＢサブユニット・シークエンス］ ＭＫＫＩＳ ＲＫＥＹＶ ＳＭＹＧＰ ＴＴＧＤＫ ＶＲＬＧＤ ＴＤＬＩＡ ＥＶＥＨＤ ＹＴＩＹＧ ＥＥＬＫＦ ＧＧＧＫＴ ＬＲＥＧＭ ＳＱＳＮＮ ＰＳＫＥＥ ＬＤＬＩＩ ＴＮＡＬＩ ＶＤＹＴＧ ＩＹＫＡＤ ＩＧＩＫＤ ＧＫＩＡＧ ＩＧＫＧＧ ＮＫＤＭＱ ＤＧＶＫＮ ＮＬＳＶＧ ＰＡＴＥＡ ＬＡＧＥＧ ＬＩＶＴＡ ＧＧＩＤＴ ＨＩＨＦＩ ＳＰＱＱＩ ＰＴＡＦＡ ＳＧＶＴＴ ＭＩＧＧＧ ＴＧＰＡＤ ＧＴＮＡＴ ＴＩＴＰＧ ＲＲＮＬＫ ＷＭＬＲＡ ＡＥＥＹＳ ＭＮＬＧＦ ＬＡＫＧＮ ＡＳＮＤＡ ＳＬＡＤＱ ＩＥＡＧＡ ＩＧＦＫＩ ＨＥＤＷＧ ＴＴＰＳＡ ＩＮＨＡＬ ＤＶＡＤＫ ＹＤＶＱＶ ＡＩＨＴＤ ＴＬＮＥＡ ＧＣＶＥＤ ＴＭＡＡＩ ＡＧＲＴＭ ＨＴＦＨＴ ＥＧＡＧＧ ＧＨＡＰＤ ＩＩＫＶＡ ＧＥＨＮＩ ＬＰＡＳＴ ＮＰＴＩＰ ＦＴＶＮＴ ＥＡＥＨＭ ＤＭＬＭＶ ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩＲ ＰＱＴＩＡ ＡＥＤＴＬ ＨＤＭＧＩ ＦＳＩＴＳ ＳＤＳＱＡ ＭＧＲＶＧ ＥＶＩＴＲ ＴＷＱＴＡ ＤＫＮＫＫ ＥＦＧＲＬ ＫＥＥＫＧ ＤＮＤＮＦ ＲＩＫＲＹ ＬＳＫＹＴ ＩＮＰＡＩ ＡＨＧＩＳ ＥＹＶＧＳ ＶＥＶＧＫ ＶＡＤＬＶ ＬＷＳＰＡ ＦＦＧＶＫ ＰＮＭＩＩ ＫＧＧＦＩ ＡＬＳＱＭ ＧＤＡＮＡ ＳＩＰＴＰ ＱＰＶＹＹ ＲＥＭＦＡ ＨＨＧＫＡ ＫＹＤＡＮ ＩＴＦＶＳ ＱＡＡＹＤ ＫＧＩＫＥ ＥＬＧＬＥ ＲＱＶＬＰ ＶＫＮＣＲ ＮＩＴＫＫ ＤＭＱＦＮ ＤＴＴＡＨ ＩＥＶＮＰ ＥＴＹＨＶ ＦＶＤＧＫ ＥＶＴＳＫ ＰＡＮＫＶ ＳＬＡＱＬ ＦＳＩＦ …（３） ［式中の記号は上記と同じ。］ Ａサブユニット由来のペプチド断片は、下記のＵＡ−１
〜ＵＡ−２３の２３種であった。これらは原則として２
０個のアミノ酸からなり、ＡサブユニットのＮ末端から
アミノ酸を１０個ずつずらして切り出した配列を有する
ように合成した。従って、隣合うペプチド断片のアミノ
酸配列は、アミノ酸が１０個ずつ重複している。
【００２６】 ＵＡ−１：ＭＫＬＴＰ ＫＥＬＤＫ ＬＭＬＨＹ ＡＧＥＬＡ ＵＡ−２：ＬＭＬＨＹ ＡＧＥＬＡ ＫＫＲＫＥ ＫＧＩＫＬ ＵＡ−３：ＫＫＲＫＥ ＫＧＩＫＬ ＮＹＶＥＡ ＶＡＬＩＳ ＵＡ−４：ＮＹＶＥＡ ＶＡＬＩＳ ＡＨＩＭＥ ＥＡＲＡＧ ＵＡ−５：ＡＨＩＭＥ ＥＡＲＡＧ ＫＫＴＡＡ ＥＬＭＱＥ ＵＡ−６：ＫＫＴＡＡ ＥＬＭＱＥ ＧＲＴＬＬ ＫＰＤＤＶ ＵＡ−７：ＧＲＴＬＬ ＫＰＤＤＶ ＭＤＧＶＡ ＳＭＩＨＥ ＵＡ−８：ＭＤＧＶＡ ＳＭＩＨＥ ＶＧＩＥＡ ＭＦＰＤＧ ＵＡ−９：ＶＧＩＥＡ ＭＦＰＤＧ ＴＫＬＶＴ ＶＨＴＰＩ ＵＡ−１０：ＴＫＬＶＴ ＶＨＴＰＩ ＥＡＮＧＫ ＬＶＰＧＥ ＵＡ−１１：ＥＡＮＧＫ ＬＶＰＧＥ ＬＦＬＫＮ ＥＤＩＴＩ ＵＡ−１２：ＬＦＬＫＮ ＥＤＩＴＩ ＮＥＧＫＫ ＡＶＳＶＫ ＵＡ−１３：ＮＥＧＫＫ ＡＶＳＶＫ ＶＫＮＶＧ ＤＲＰＶＱ ＵＡ−１４：ＶＫＮＶＧ ＤＲＰＶＱ ＩＧＳＨＦ ＨＦＦＥＶ ＵＡ−１５：ＩＧＳＨＦ ＨＦＦＥＶ ＶＲＣＬＤ ＦＤＲＥＫ ＵＡ−１６：ＮＲＣＬＤ ＦＤＲＥＫ ＴＦＧＫＲ ＬＤＩＡＳ ＵＡ−１７：ＴＦＧＫＲ ＬＤＩＡＳ ＧＴＡＶＲ ＦＥＰＧＥ ＵＡ−１８：ＧＴＡＶＲ ＦＥＰＧＥ ＥＫＳＶＥ ＬＩＤＩＧ ＵＡ−１９：ＥＫＳＶＥ ＬＩＤＩＧ ＧＮＲＲＩ ＦＧＦＮＡ ＵＡ−２０：ＧＮＲＲＩ ＦＧＦＮＡ ＬＶＤＲＱ ＡＤＮＥＳ ＵＡ−２１：ＬＶＤＲＱ ＡＤＮＥＳ ＫＫＩＡＬ ＨＲＡＫＥ ＵＡ−２２：ＫＫＩＡＬ ＨＲＡＫＥ ＲＧＦＨＧ ＡＫＳＤＤ ＵＡ−２３：ＲＧＦＨＧ ＡＫＳＤＤ ＮＹＶＫＴ ＩＫＥ 一方、Ｂサブユニット由来のペプチド断片は、下記のＵ
Ｂ−１〜ＵＢ５６の５６種であった。これらは原則とし
て１９個のアミノ酸からなり、ＢサブユニットのＮ末端
からアミノ酸を１０個ずつずらして切り出した配列を有
するように合成した。従って、隣合うペプチド断片のア
ミノ酸配列は、アミノ酸が９個ずつ重複している。
Ｂ−１〜ＵＢ５６の５６種であった。これらは原則とし
て１９個のアミノ酸からなり、ＢサブユニットのＮ末端
からアミノ酸を１０個ずつずらして切り出した配列を有
するように合成した。従って、隣合うペプチド断片のア
ミノ酸配列は、アミノ酸が９個ずつ重複している。
【００２７】 ＵＢ−１：ＭＫＫＩＳ ＲＫＥＹＶ ＳＭＹＧＰ ＴＴＧ ＵＢ−２：ＳＭＹＧＰ ＴＴＧＤＫ ＶＲＬＧＤ ＴＤＬＩ ＵＢ−３：ＶＲＬＧＤ ＴＤＬＩＡ ＥＶＥＨＤ ＹＴＩＹ ＵＢ−４：ＥＶＥＨＤ ＹＴＩＹＧ ＥＥＬＫＦ ＧＧＧＫ ＵＢ−５：ＥＥＬＫＦ ＧＧＧＫＴ ＬＲＥＧＭ ＳＱ ＵＢ−６：ＬＲＥＧＭ ＳＱＳＮＮ ＰＳＫＥＥ ＬＤＬＩ ＵＢ−７：ＰＳＫＥＥ ＬＤＬＩＩ ＴＮＡＬＩ ＶＤＹＴ ＵＢ−８：ＴＮＡＬＩ ＶＤＹＴＧ ＩＹＫＡＤ ＩＧＩＫ ＵＢ−９：ＩＹＫＡＤ ＩＧＩＫＤ ＧＫＩＡＧ ＩＧＫＧ ＵＢ−１０：ＧＫＩＡＧ ＩＧＫＧＧ ＮＫＤＭＱ ＤＧＶＫ ＵＢ−１１：ＧＮＫＤＭ ＱＤＧＶＫ ＮＮＬＳＶ ＧＰＡＴ ＵＢ−１２：ＮＬＳＶＧ ＰＡＴＥＡ ＬＡＧＥＧ ＬＩＶＴ ＵＢ−１３：ＬＡＧＥＧ ＬＩＶＴＡ ＧＧＩＤＴ ＨＩＨＦ ＵＢ−１４：ＧＧＩＤＴ ＨＩＨＦＩ ＳＰＱＱＩ ＰＴＡＦ ＵＢ−１５：ＳＰＱＱＩ ＰＴＡＦＡ ＳＧＶＴＴ ＭＩＧＧ ＵＢ−１６：ＳＧＶＴＴ ＭＩＧＧＧ ＴＧＰＡＤ ＧＴＮＡ ＵＢ−１７：ＴＧＰＡＤ ＧＴＮＡＴ ＴＩＴＰＧ ＲＲＮＬ ＵＢ−１８：ＴＩＴＰＧ ＲＲＮＬＫ ＷＭＬＲＡ ＡＥＥＹ ＵＢ−１９：ＷＭＬＲＡ ＡＥＥＹＳ ＭＮＬＧＦ ＬＡＫＧ ＵＢ−２０：ＳＭＮＬＧ ＦＬＡＫＧ ＮＡＳＮＤ ＡＳＬＡ ＵＢ−２１：ＡＳＮＤＡ ＳＬＡＤＱ ＩＥＡＧＡ ＩＧＦＫ ＵＢ−２２：ＥＡＧＡＩ ＧＦＫＩＨ ＥＤＷＧＴ ＴＰＳＡ ＵＢ−２３：ＩＨＥＤＷ ＧＴＴＰＳ ＡＩＮＨＡ ＬＤＶＡ ＵＢ−２４：ＩＮＨＡＬ ＤＶＡＤＫ ＹＤＶＱＶ ＡＩＨＴ ＵＢ−２５：ＫＹＤＶＱ ＶＡＩＨＴ ＤＴＬＮＥ ＡＧＣＶ ＵＢ−２６：ＴＬＮＥＡ ＧＣＶＥＤ ＴＭＡＡＩ ＡＧＲＴ ＵＢ−２７：ＴＭＡＡＩ ＡＧＲＴＭ ＨＴＦＨＴ ＥＧＡＧ ＵＢ−２８：ＨＴＦＨＴ ＥＧＡＧＧ ＧＨＡＰＤ ＩＩＫＶ ＵＢ−２９：ＧＧＨＡＰ ＤＩＩＫＶ ＡＧＥＨＮ ＩＬＰＡ ＵＢ−３０：ＡＧＥＨＮ ＩＬＰＡＳ ＴＮＰＴＩ ＰＦＴＶ ＵＢ−３１：ＴＮＰＴＩ ＰＦＴＶＮ ＴＥＡＥＨ ＭＤＭＬ ＵＢ−３２：ＥＡＥＨＭ ＤＭＬＭＶ ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫ ＵＢ−３３：ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩ ＵＢ−３４：ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩＲ ＰＱＴＩＡ ＡＥＤＴ ＵＢ−３５：ＰＱＴＩＡ ＡＥＤＴＬ ＨＤＭＧＩ ＦＳＩＴ ＵＢ−３６：ＨＤＭＧＩ ＦＳＩＴＳ ＳＤＳＱＡ ＭＧＲＶ ＵＢ−３７：ＳＤＳＱＡ ＭＧＲＶＧ ＥＶＩＴＲ ＴＷＱＴ ＵＢ−３８：ＥＶＩＴＲ ＴＷＱＴＡ ＤＫＮＫＫ ＥＦＧＲ ＵＢ−３９：ＡＤＫＮＫ ＫＥＦＧＲ ＬＫＥＥＫ ＧＤＮＤ ＵＢ−４０：ＫＥＥＫＧ ＤＮＤＮＦ ＲＩＫＲＹ ＬＳＫＹ ＵＢ−４１：ＲＩＫＲＹ ＬＳＫＹＴ ＩＮＰＡＩ ＡＨＧＩ ＵＢ−４２：ＩＮＰＡＩ ＡＨＧＩＳ ＥＹＶＧＳ ＶＥＶＧ ＵＢ−４３：ＳＥＹＶＧ ＳＶＥＶＧ ＫＶＡＤＬ ＶＬＷＳ ＵＢ−４４：ＶＡＤＬＶ ＬＷＳＰＡ ＦＦＧＶＫ ＰＮＭＩ ＵＢ−４５：ＡＦＦＧＶ ＫＰＮＭＩ ＩＫＧＧＦ ＩＡＬＳ ＵＢ−４６：ＫＧＧＦＩ ＡＬＳＱＭ ＧＤＡＮＡ ＳＩＰＴ ＵＢ−４７：ＧＤＡＮＡ ＳＩＰＴＰ ＱＰＶＹＹ ＲＥＭＦ ＵＢ−４８：ＱＰＶＹＹ ＲＥＭＦＡ ＨＨＧＫＡ ＫＹＤＡ ＵＢ−４９：ＨＨＧＫＡ ＫＹＤＡＮ ＩＴＦＶＳ ＱＡＡＹ ＵＢ−５０：ＩＴＦＶＳ ＱＡＡＹＤ ＫＧＩＫＥ ＥＬＧＬ ＵＢ−５１：ＫＧＩＫＥ ＥＬＧＬＥ ＲＱＶＬＰ ＶＫＮＣ ＵＢ−５２：ＲＱＶＬＰ ＶＫＮＣＲ ＮＩＴＫＫ ＤＭＱＦ ＵＢ−５３：ＲＮＩＴＫ ＫＤＭＱＦ ＮＤＴＴＡ ＨＩＥＶ ＵＢ−５４：ＤＴＴＡＨ ＩＥＶＮＰ ＥＴＹＨＶ ＦＶＤＧ ＵＢ−５５：ＥＴＹＨＶ ＦＶＤＧＫ ＥＶＴＳＫ ＰＡＮＫ ＵＢ−５６：ＥＶＴＳＫ ＰＡＮＫＶ ＳＬＡＱＬ ＦＳＩＦ サンプルであるペプチド断片は、一般的なｔ−ＢＯＣ法
（t-Boc chemistry ）に従い、合成装置としてモデル４
３０マルチプル ペプチド シンセサイザー（アプライ
ド バイオシステムズ社製、米国）を使用して合成し
た。ＨＦ（フッ化水素酸）液で樹脂から切り離した合成
ペプチドは、０．１重量％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）
の水溶液とＴＦＡのアセトニトリル溶液の濃度勾配を利
用したＣ１８カラムによる逆相ＨＰＬＣによって純度と
濃度を測定した。そして、さらに９％のギ酸を用いたバ
イオゲルＰ４カラム（バイオラッド社製、米国）によっ
て純化を行い、必要に応じて逆相ＨＰＬＣで純度と濃度
を測定したものを実験に使用した。
（t-Boc chemistry ）に従い、合成装置としてモデル４
３０マルチプル ペプチド シンセサイザー（アプライ
ド バイオシステムズ社製、米国）を使用して合成し
た。ＨＦ（フッ化水素酸）液で樹脂から切り離した合成
ペプチドは、０．１重量％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）
の水溶液とＴＦＡのアセトニトリル溶液の濃度勾配を利
用したＣ１８カラムによる逆相ＨＰＬＣによって純度と
濃度を測定した。そして、さらに９％のギ酸を用いたバ
イオゲルＰ４カラム（バイオラッド社製、米国）によっ
て純化を行い、必要に応じて逆相ＨＰＬＣで純度と濃度
を測定したものを実験に使用した。
【００２８】１−（２）：ペプチド断片と抗ＨＰウレア
ーゼ抗体との反応性テスト 抗ＨＰウレアーゼ抗体としては、ＨＰウレアーゼ活性に
対して強い中和能を有するＬ２抗体と、中和能を有しな
いＳ５抗体とを用いた。これらの抗体は、ＢＡＬＢ／ｃ
マウスの腹腔内に精製ＨＰウレアーゼ蛋白とフロイント
完全アジュバント（Freund´s complete ajuvant ）と
の混合物を投与して免疫し、その後、２週間目と４週間
目に同様の免疫原で追加免疫した後に採取した免疫脾臓
細胞に、ポリエチレングリコール法によってミエローマ
細胞を融合させて作成したハイブリドーマが産生するモ
ノクロナール抗体であり、Ｓ５抗体はＡサブユニット
を、またＬ２抗体はＢサブユニットを認識することが確
認されている（インフェクション・アンド・イミュニテ
ィ、第６０巻１１号第４８２６〜４８３１頁（１９９
２）中の第４８２７頁左欄第４３行〜右欄第３行）。
ーゼ抗体との反応性テスト 抗ＨＰウレアーゼ抗体としては、ＨＰウレアーゼ活性に
対して強い中和能を有するＬ２抗体と、中和能を有しな
いＳ５抗体とを用いた。これらの抗体は、ＢＡＬＢ／ｃ
マウスの腹腔内に精製ＨＰウレアーゼ蛋白とフロイント
完全アジュバント（Freund´s complete ajuvant ）と
の混合物を投与して免疫し、その後、２週間目と４週間
目に同様の免疫原で追加免疫した後に採取した免疫脾臓
細胞に、ポリエチレングリコール法によってミエローマ
細胞を融合させて作成したハイブリドーマが産生するモ
ノクロナール抗体であり、Ｓ５抗体はＡサブユニット
を、またＬ２抗体はＢサブユニットを認識することが確
認されている（インフェクション・アンド・イミュニテ
ィ、第６０巻１１号第４８２６〜４８３１頁（１９９
２）中の第４８２７頁左欄第４３行〜右欄第３行）。
【００２９】ペプチドと抗体との反応性はＥＬＩＳＡ法
によって評価した。ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で調整した
各ペプチド断片を９６穴ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート
（Immulon 2 ; Dynatech 社製、米国）に各５０μｌず
つ撒き、４℃でオーバーナイト又は３７℃で６０分間イ
ンキュベートしてコーティングした後、ＰＢＳで３回洗
浄した。各ウェルに４倍希釈ブロックエース液（大日本
製薬社製）２００μｌを加え、４℃でオーバーナイトに
渡ってブロッキングを実施した後、０．０５重量％Ｔｗ
ｅｅｎ ２０を加えた１０倍希釈ブロックエース液で３
回洗浄した。そして、１０倍希釈ブロックエース液で１
００〜３００倍に希釈した抗ＨＰウレアーゼ抗体を加
え、３７℃で６０分間インキュベーションを行った後、
洗浄液で３回洗浄し、二次抗体としてアルカリフォスフ
ァターゼの結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（CAPPEL社製，米
国）を５００倍希釈したものを加え、さらに３７℃で６
０分間インキュベーションを行った。洗浄液で４回洗浄
した後、発色剤（carbonatebuffer ５ｍｌに１０-1ｍ
ｏｌ／ｌ濃度ＭｇＣｌ2 ５０μｌを加えたものに溶解
したphosphatase substrate （Sigma Chemical company
社製，米国））を５０μｌ加え、発色したところで、マ
イクロプレートリーダーを用い４０５ｎｍにおける吸光
度を測定した。
によって評価した。ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で調整した
各ペプチド断片を９６穴ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート
（Immulon 2 ; Dynatech 社製、米国）に各５０μｌず
つ撒き、４℃でオーバーナイト又は３７℃で６０分間イ
ンキュベートしてコーティングした後、ＰＢＳで３回洗
浄した。各ウェルに４倍希釈ブロックエース液（大日本
製薬社製）２００μｌを加え、４℃でオーバーナイトに
渡ってブロッキングを実施した後、０．０５重量％Ｔｗ
ｅｅｎ ２０を加えた１０倍希釈ブロックエース液で３
回洗浄した。そして、１０倍希釈ブロックエース液で１
００〜３００倍に希釈した抗ＨＰウレアーゼ抗体を加
え、３７℃で６０分間インキュベーションを行った後、
洗浄液で３回洗浄し、二次抗体としてアルカリフォスフ
ァターゼの結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（CAPPEL社製，米
国）を５００倍希釈したものを加え、さらに３７℃で６
０分間インキュベーションを行った。洗浄液で４回洗浄
した後、発色剤（carbonatebuffer ５ｍｌに１０-1ｍ
ｏｌ／ｌ濃度ＭｇＣｌ2 ５０μｌを加えたものに溶解
したphosphatase substrate （Sigma Chemical company
社製，米国））を５０μｌ加え、発色したところで、マ
イクロプレートリーダーを用い４０５ｎｍにおける吸光
度を測定した。
【００３０】Ｂサブユニット由来ペプチド断片の反応性
（吸光度）を第１表と図１に示す。ＵＢ−１〜ＵＢ−５
６のうち、一般式（１）で表されるアミノ酸配列を有す
るＵＢ−３３（分子量：２２２３．８）のみがＬ２抗体
と特異的に反応し、その反応性はＨＰウレアーゼそのも
の（ポジティブコントロール）とほぼ同じ強度であっ
た。
（吸光度）を第１表と図１に示す。ＵＢ−１〜ＵＢ−５
６のうち、一般式（１）で表されるアミノ酸配列を有す
るＵＢ−３３（分子量：２２２３．８）のみがＬ２抗体
と特異的に反応し、その反応性はＨＰウレアーゼそのも
の（ポジティブコントロール）とほぼ同じ強度であっ
た。
【００３１】
【表１】 表中の記号 Positive：ペプチド断片に代えてＨＰウレアーゼを添加
したもの Negative：ペプチド断片を添加しないもの Back：二次抗体のみを添加したコントロール １−（３）：免疫原性テスト 上記の反応性テストにおいてＵＢ−３３が特異的な反応
性を示したので、このペプチドの免疫賦活性（免疫原
性）を検討した。
したもの Negative：ペプチド断片を添加しないもの Back：二次抗体のみを添加したコントロール １−（３）：免疫原性テスト 上記の反応性テストにおいてＵＢ−３３が特異的な反応
性を示したので、このペプチドの免疫賦活性（免疫原
性）を検討した。
【００３２】上記と同様に合成し精製したＵＢ−３３の
免疫原性を高める目的で、マレイミド法によって、キャ
リア蛋白としてのＫＬＨ（Keyhole lympet hemocianin
e：カラス貝のヘモシアニン）をＵＢ−３３のＮ末端に
あるシステイン（Ｃ）に結合させた。このＵＢ−３３−
ＫＬＨ １ｍｇを１ｍｌのＰＢＳに溶解し、得られた溶
液１ｍｌと等量のフロイント完全アジュバント（ＣＦ
Ａ）とを混合したものをウサギの皮下及び腹腔内に総計
１ｍｌ接種し、さらに接種後１６日目に同様の抗原で追
加免疫を実施した。接種直前（ネガティブコントロー
ル）、接種後１０日目、１６日目（追加免疫直前）、追
加免疫から１週後、２週後、３週後に採血し、ＵＢ−３
３に対する血清の抗体価をＥＬＩＳＡ法によって経時的
に測定した。ＥＬＩＳＡ法は、上記実験例１−（２）の
反応性テストの場合と同様に操作した。
免疫原性を高める目的で、マレイミド法によって、キャ
リア蛋白としてのＫＬＨ（Keyhole lympet hemocianin
e：カラス貝のヘモシアニン）をＵＢ−３３のＮ末端に
あるシステイン（Ｃ）に結合させた。このＵＢ−３３−
ＫＬＨ １ｍｇを１ｍｌのＰＢＳに溶解し、得られた溶
液１ｍｌと等量のフロイント完全アジュバント（ＣＦ
Ａ）とを混合したものをウサギの皮下及び腹腔内に総計
１ｍｌ接種し、さらに接種後１６日目に同様の抗原で追
加免疫を実施した。接種直前（ネガティブコントロー
ル）、接種後１０日目、１６日目（追加免疫直前）、追
加免疫から１週後、２週後、３週後に採血し、ＵＢ−３
３に対する血清の抗体価をＥＬＩＳＡ法によって経時的
に測定した。ＥＬＩＳＡ法は、上記実験例１−（２）の
反応性テストの場合と同様に操作した。
【００３３】ＥＬＩＳＡ法の結果を第２表に示す。ＵＢ
−３３で免疫したウサギの血清は、３頭とも、免疫開始
から７日後にはすでにＵＢ−３３に対する高い抗体価を
認め、その後も抗体価が上昇した。
−３３で免疫したウサギの血清は、３頭とも、免疫開始
から７日後にはすでにＵＢ−３３に対する高い抗体価を
認め、その後も抗体価が上昇した。
【００３４】
【表２】 さらに、免疫期間終了時（追加免疫から３週後）の血清
を採取し、ＨＰウレアーゼ活性に対する中和能を調べ
た。
を採取し、ＨＰウレアーゼ活性に対する中和能を調べ
た。
【００３５】ウレアーゼ活性に対する中和能の測定は、
尿素ブイヨン法の変法にて実施した。すなわち、９６穴
ＥＬＩＳＡ用プレートに、あらかじめ所定量のＨＰウレ
アーゼ２５μｌとＩｇＧ蛋白に換算して０〜２５μｇの
血清２５μｌを加え、４℃でオーバーナイトのインキュ
ベーションを行った後、尿素培地（３％尿素水溶液、
０．０２５Ｍリン酸緩衝液に０．０２％のフェノールレ
ッドを加えｐＨ６．０に調節した培地；栄研化学社製、
日本）１００μｌを添加し、５９５ｎｍにおける吸光度
をマイクロプレートリーダー（モデル３５５０；Bio-Ra
d 社製）によって測定した。
尿素ブイヨン法の変法にて実施した。すなわち、９６穴
ＥＬＩＳＡ用プレートに、あらかじめ所定量のＨＰウレ
アーゼ２５μｌとＩｇＧ蛋白に換算して０〜２５μｇの
血清２５μｌを加え、４℃でオーバーナイトのインキュ
ベーションを行った後、尿素培地（３％尿素水溶液、
０．０２５Ｍリン酸緩衝液に０．０２％のフェノールレ
ッドを加えｐＨ６．０に調節した培地；栄研化学社製、
日本）１００μｌを添加し、５９５ｎｍにおける吸光度
をマイクロプレートリーダー（モデル３５５０；Bio-Ra
d 社製）によって測定した。
【００３６】図２に示すように、ＵＢ−３３免疫群の血
清はＨＰウレアーゼ活性を強力に阻害し、血清添加量の
増加に伴って阻害率が上昇した。以上の実験によれば、
ＵＢ−３３は抗ＨＰウレアーゼ抗体の特異的な認識部位
であると共に強力な免疫原性を有しており、しかもＵＢ
−３３で免疫することによって強力なＨＰウレアーゼ活
性中和能を有する抗体が産生されることから、ＵＢ−３
３は反応原性並びに免疫原性を有する優れた抗原決定基
であり、ＨＰウレアーゼに対する強力な中和抗体の誘発
部位であることが判明した。
清はＨＰウレアーゼ活性を強力に阻害し、血清添加量の
増加に伴って阻害率が上昇した。以上の実験によれば、
ＵＢ−３３は抗ＨＰウレアーゼ抗体の特異的な認識部位
であると共に強力な免疫原性を有しており、しかもＵＢ
−３３で免疫することによって強力なＨＰウレアーゼ活
性中和能を有する抗体が産生されることから、ＵＢ−３
３は反応原性並びに免疫原性を有する優れた抗原決定基
であり、ＨＰウレアーゼに対する強力な中和抗体の誘発
部位であることが判明した。
【００３７】実験例２（交差性−１） ＵＢ−３３によって誘導される抗ＵＢ−３３抗体が、他
種ウレアーゼに対して交差性を有するか否かについて検
討した。
種ウレアーゼに対して交差性を有するか否かについて検
討した。
【００３８】２−（１）：使用した抗体とウレアーゼ 抗ＵＢ−３３抗体としては、実験例１−（３）の免疫原
性テストにおいて免疫したウサギから得られたウサギ抗
ＵＢ−３３血清を用いた。ネガティブコントロールとし
ては、健常ウサギの血清を用い、ポジティブコントロー
ルとしては、ＨＰウレアーゼＢサブユニットを認識する
ことが知られているＬ２抗体とＨＰウレアーゼＡサブユ
ニットを認識することが知られているＳ２抗体を、１０
倍希釈ブロックエース液にて１００倍に希釈したものを
用いた。Ｌ２抗体とＳ２抗体は、実験例１−（２）の反
応性テストの場合と同様に、インフェクション・アンド
・イミュニティ、第６０巻１１号第４８２６〜４８３１
頁（１９９２）中の第４８２７頁左欄第４３行〜右欄第
３行に記載された方法で得られたモノクロナール抗体で
ある。
性テストにおいて免疫したウサギから得られたウサギ抗
ＵＢ−３３血清を用いた。ネガティブコントロールとし
ては、健常ウサギの血清を用い、ポジティブコントロー
ルとしては、ＨＰウレアーゼＢサブユニットを認識する
ことが知られているＬ２抗体とＨＰウレアーゼＡサブユ
ニットを認識することが知られているＳ２抗体を、１０
倍希釈ブロックエース液にて１００倍に希釈したものを
用いた。Ｌ２抗体とＳ２抗体は、実験例１−（２）の反
応性テストの場合と同様に、インフェクション・アンド
・イミュニティ、第６０巻１１号第４８２６〜４８３１
頁（１９９２）中の第４８２７頁左欄第４３行〜右欄第
３行に記載された方法で得られたモノクロナール抗体で
ある。
【００３９】サンプル抗体と反応させるウレアーゼとし
ては、ＨＰウレアーゼ、ナタ豆類であるジャックビーン
のウレアーゼ（Jack-bean urease, 和光純薬社製）及び
好熱性バチルス属のウレアーゼ（Thermophilic Bacillu
s sp. urease, 和光純薬社製）の３種を用いた。ＨＰウ
レアーゼとしては、実験例１（２）の反応性テストにお
いてポジティブコントロールとして使用したものと同じ
ものを用いた。また、ウレアーゼを添加しないバックグ
ランドも設定した。
ては、ＨＰウレアーゼ、ナタ豆類であるジャックビーン
のウレアーゼ（Jack-bean urease, 和光純薬社製）及び
好熱性バチルス属のウレアーゼ（Thermophilic Bacillu
s sp. urease, 和光純薬社製）の３種を用いた。ＨＰウ
レアーゼとしては、実験例１（２）の反応性テストにお
いてポジティブコントロールとして使用したものと同じ
ものを用いた。また、ウレアーゼを添加しないバックグ
ランドも設定した。
【００４０】２−（２）：交差反応性テスト 各種ウレアーゼに対する各サンプル抗体の反応性は、Ｅ
ＬＩＳＡ法によって検討した。ＥＬＩＳＡ法は、ペプチ
ド断片に代えてウレアーゼを撒き、抗ＨＰウレアーゼ抗
体に代えてウサギ血清を用いたことを除き、実験例１−
（２）の反応性テストにおける場合と同様に操作した。
ＬＩＳＡ法によって検討した。ＥＬＩＳＡ法は、ペプチ
ド断片に代えてウレアーゼを撒き、抗ＨＰウレアーゼ抗
体に代えてウサギ血清を用いたことを除き、実験例１−
（２）の反応性テストにおける場合と同様に操作した。
【００４１】ＥＬＩＳＡ法の結果を第３表に示す。ウサ
ギ抗ＵＢ−３３血清は、ＨＰウレアーゼと強く反応した
が、他種のウレアーゼとは極めて僅かしか反応せず、バ
ックグランドと比べても無視できる程度であった。すな
わちＵＢ−３３によって誘導された抗体は、他種のウレ
アーゼに対して交差性を示さなかった。
ギ抗ＵＢ−３３血清は、ＨＰウレアーゼと強く反応した
が、他種のウレアーゼとは極めて僅かしか反応せず、バ
ックグランドと比べても無視できる程度であった。すな
わちＵＢ−３３によって誘導された抗体は、他種のウレ
アーゼに対して交差性を示さなかった。
【００４２】
【表３】 実験例３（ＨＰウレアーゼ蛋白による免疫） ＨＰウレアーゼ蛋白によって免疫したマウスの血清を用
い、当該血清中に存在する抗体が認識するリニア・エピ
トープ（Linear epitope）を同定すると共に、当該血清
のウレアーゼ活性中和能を調査した。
い、当該血清中に存在する抗体が認識するリニア・エピ
トープ（Linear epitope）を同定すると共に、当該血清
のウレアーゼ活性中和能を調査した。
【００４３】３−（１）：ＨＰウレアーゼ蛋白によるマ
ウスの免疫 ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に、精製したＨＰウレアーゼ
蛋白とフロイント完全アジュバントとの混合物を投与し
て免疫し、その後、２週間目と４週間目に同様の免疫原
で追加免疫した。さらに２週間経過後にマウスの心臓か
ら採血し、免疫血清と免疫脾臓細胞を得た。
ウスの免疫 ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に、精製したＨＰウレアーゼ
蛋白とフロイント完全アジュバントとの混合物を投与し
て免疫し、その後、２週間目と４週間目に同様の免疫原
で追加免疫した。さらに２週間経過後にマウスの心臓か
ら採血し、免疫血清と免疫脾臓細胞を得た。
【００４４】３−（２）：マウス抗ＨＰウレアーゼ蛋白
血清が認識するリニア・エピトープの同定 実験例１−（２）の反応性テストで行ったＥＬＩＳＡ法
と同様に操作して、リニア・エピトープを同定した。す
なわち、エピトープ候補のペプチドとして上記のＵＡ−
１〜ＵＡ−２３及びＵＢ−１〜ＵＢ−５６のペプチドを
用い、これらのペプチドをＥＬＩＳＡ用マイクロプレー
トに撒き、実験例１−（２）の場合と同様に操作して、
マウス抗ＨＰウレアーゼ蛋白血清が認識する部位を検索
した。
血清が認識するリニア・エピトープの同定 実験例１−（２）の反応性テストで行ったＥＬＩＳＡ法
と同様に操作して、リニア・エピトープを同定した。す
なわち、エピトープ候補のペプチドとして上記のＵＡ−
１〜ＵＡ−２３及びＵＢ−１〜ＵＢ−５６のペプチドを
用い、これらのペプチドをＥＬＩＳＡ用マイクロプレー
トに撒き、実験例１−（２）の場合と同様に操作して、
マウス抗ＨＰウレアーゼ蛋白血清が認識する部位を検索
した。
【００４５】その結果、第４表及び図３に示すようにＡ
サブユニット内にはほとんどリニア・エピトープを見い
だせなかったが、第５表及び図４に示すようにＢサブユ
ニット内にはＵＢ−３３以外に、ＵＢ−２８〜ＵＢ−３
１に相当する部分にリニア・エピトープが認められた。
サブユニット内にはほとんどリニア・エピトープを見い
だせなかったが、第５表及び図４に示すようにＢサブユ
ニット内にはＵＢ−３３以外に、ＵＢ−２８〜ＵＢ−３
１に相当する部分にリニア・エピトープが認められた。
【００４６】
【表４】
【００４７】
【表５】 ３−（３）：マウス抗ＨＰウレアーゼ蛋白血清の中和活
性テスト 実験例１−（３）の中和活性テストの場合と同様に操作
して、マウス抗ＨＰウレアーゼ蛋白血清とＵＢ−３３を
認識するモノクロナール抗体（Ｌ２）のＨＰウレアーゼ
活性に対する中和能を調べた。この際に使用した血清又
はＬ２抗体の添加量は、ＩｇＧ蛋白に換算して０〜８μ
ｇであった。
性テスト 実験例１−（３）の中和活性テストの場合と同様に操作
して、マウス抗ＨＰウレアーゼ蛋白血清とＵＢ−３３を
認識するモノクロナール抗体（Ｌ２）のＨＰウレアーゼ
活性に対する中和能を調べた。この際に使用した血清又
はＬ２抗体の添加量は、ＩｇＧ蛋白に換算して０〜８μ
ｇであった。
【００４８】結果を図５に示す。抗ＨＰウレアーゼ・モ
ノクロナール抗体であるＬ２抗体は、実験例１−（３）
で評価した抗ＵＢ−３３抗体と同様に、用量依存的に強
い中和能を有していたが、マウス抗ＨＰウレアーゼ蛋白
血清は、ＨＰウレアーゼ活性をほとんど中和しなかっ
た。
ノクロナール抗体であるＬ２抗体は、実験例１−（３）
で評価した抗ＵＢ−３３抗体と同様に、用量依存的に強
い中和能を有していたが、マウス抗ＨＰウレアーゼ蛋白
血清は、ＨＰウレアーゼ活性をほとんど中和しなかっ
た。
【００４９】これらの結果から、マウスの全血清は、そ
れ単独ではＨＰウレアーゼを強力に中和するＵＢ−３３
に対する抗体を含有しているにもかかわらず、ＨＰウレ
アーゼ中和能をほとんど有していないことが判明した。
この事実は、ＵＢ−３３以外のエピトープに対する抗体
が、ＵＢ−３３に対する抗体の特異的な活性を抑制して
いる可能性を示唆している。
れ単独ではＨＰウレアーゼを強力に中和するＵＢ−３３
に対する抗体を含有しているにもかかわらず、ＨＰウレ
アーゼ中和能をほとんど有していないことが判明した。
この事実は、ＵＢ−３３以外のエピトープに対する抗体
が、ＵＢ−３３に対する抗体の特異的な活性を抑制して
いる可能性を示唆している。
【００５０】実験例４（交差性−２） 実験例３においてＵＢ−３３以外のリニア・エピトープ
がＢサブユニット中に存在することが判明したので、Ｕ
Ｂ−３３によって誘導される抗ＵＢ−３３抗体が、ＵＢ
−３３以外のリニア・エピトープを認識するか否かにつ
いて検討した。
がＢサブユニット中に存在することが判明したので、Ｕ
Ｂ−３３によって誘導される抗ＵＢ−３３抗体が、ＵＢ
−３３以外のリニア・エピトープを認識するか否かにつ
いて検討した。
【００５１】４−（１）：使用した抗体とペプチド断片 抗ＵＢ−３３抗体としては、実験例１−（３）の免疫原
性テストにおいて免疫したウサギから得られたウサギ抗
ＵＢ−３３血清を用いた。ネガティブコントロールとし
ては、健常ウサギの血清を用いた。
性テストにおいて免疫したウサギから得られたウサギ抗
ＵＢ−３３血清を用いた。ネガティブコントロールとし
ては、健常ウサギの血清を用いた。
【００５２】サンプルと反応させたペプチド断片は、Ｕ
Ｂ−３１〜ＵＢ−３５の５つであった。なお、ペプチド
断片を添加しないバックグランドも設定した。 ４−（２）：交差反応性テスト ペプチド断片に対するウサギ抗ＵＢ−３３血清の反応性
は、ＥＬＩＳＡ法によって検討した。ＥＬＩＳＡ法は、
抗ＨＰウレアーゼ抗体に代えてウサギ血清を用いたこと
を除き、実験例１−（２）の反応性テストにおける場合
と同様に操作した。
Ｂ−３１〜ＵＢ−３５の５つであった。なお、ペプチド
断片を添加しないバックグランドも設定した。 ４−（２）：交差反応性テスト ペプチド断片に対するウサギ抗ＵＢ−３３血清の反応性
は、ＥＬＩＳＡ法によって検討した。ＥＬＩＳＡ法は、
抗ＨＰウレアーゼ抗体に代えてウサギ血清を用いたこと
を除き、実験例１−（２）の反応性テストにおける場合
と同様に操作した。
【００５３】ＥＬＩＳＡ法によって測定した４０５ｎｍ
での吸光度を第６表と図６に示す。ウサギ抗ＵＢ−３３
血清は、免疫原であるＵＢ−３３と強く反応したが、Ｕ
Ｂ−３３と重複性がある隣接のＵＢ−３２やＵＢ−３４
とは殆ど反応せず、また、Ｂサブユニット内の別のリニ
ア・エピトープであるＵＢ−３１とも全く反応しなかっ
た。すなわちＵＢ−３３によって誘導された抗体は、Ｂ
サブユニット内の他の部分に対して交差性を示さなかっ
た。
での吸光度を第６表と図６に示す。ウサギ抗ＵＢ−３３
血清は、免疫原であるＵＢ−３３と強く反応したが、Ｕ
Ｂ−３３と重複性がある隣接のＵＢ−３２やＵＢ−３４
とは殆ど反応せず、また、Ｂサブユニット内の別のリニ
ア・エピトープであるＵＢ−３１とも全く反応しなかっ
た。すなわちＵＢ−３３によって誘導された抗体は、Ｂ
サブユニット内の他の部分に対して交差性を示さなかっ
た。
【００５４】
【表６】 実験例５（最小抗原決定基の特定） ＵＢ−３３のアミノ酸配列の一部を構成するフラグメン
トを数種類合成し、各フラグメントと抗ＨＰウレアーゼ
抗体との反応性を調べ、最小抗原決定基（ミニマルサイ
ト）を特定した。
トを数種類合成し、各フラグメントと抗ＨＰウレアーゼ
抗体との反応性を調べ、最小抗原決定基（ミニマルサイ
ト）を特定した。
【００５５】５−（１）：フラグメントの調製 ミニマルサイトの候補として１８種類のフラグメント、
すなわち下記のＵＢ−３３（１０Ｒ）〜ＵＢ−３３（１
８Ｒ）及びＵＢ−３３（１０Ｌ）〜ＵＢ−３３（１８
Ｌ）を合成した。合成は、実験例１の場合と同様に、一
般的なｔ−ＢＯＣ法に従って行った。
すなわち下記のＵＢ−３３（１０Ｒ）〜ＵＢ−３３（１
８Ｒ）及びＵＢ−３３（１０Ｌ）〜ＵＢ−３３（１８
Ｌ）を合成した。合成は、実験例１の場合と同様に、一
般的なｔ−ＢＯＣ法に従って行った。
【００５６】 ＵＢ−３３ ：ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩ ＵＢ−３３（１０Ｒ）： Ｅ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩ ＵＢ−３３（１１Ｒ）： ＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩ ＵＢ−３３（１２Ｒ）： ＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩ ＵＢ−３３（１３Ｒ）： ＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩ ＵＢ−３３（１４Ｒ）： ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩ ＵＢ−３３（１５Ｒ）： Ｄ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩ ＵＢ−３３（１６Ｒ）： ＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩ ＵＢ−３３（１７Ｒ）： ＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩ ＵＢ−３３（１８Ｒ）： ＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲＩ ＵＢ−３３（１０Ｌ）：ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＵＢ−３３（１１Ｌ）：ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ Ｄ ＵＢ−３３（１２Ｌ）：ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶ ＵＢ−３３（１３Ｌ）：ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱ ＵＢ−３３（１４Ｌ）：ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦ ＵＢ−３３（１５Ｌ）：ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＵＢ−３３（１６Ｌ）：ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ Ｄ ＵＢ−３３（１７Ｌ）：ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳ ＵＢ−３３（１８Ｌ）：ＣＨＨＬＤ ＫＳＩＫＥ ＤＶＱＦＡ ＤＳＲ ５−（２）：フラグメントと抗ＨＰウレアーゼ抗体との
反応性テスト 実験例１−（２）の場合と同様に操作して、ＵＢ−３３
由来の各フラグメントとＬ２抗体との反応性をＥＬＩＳ
Ａ法によって評価した。テストは２回行った。なお、ポ
ジティブコントロールとしてＵＢ−３３及びＨＰウレア
ーゼを使用し、ネガティブコントロールとしてペプチド
を使用しない空試験を行った。また、ジャックビーンウ
レアーゼのアミノ酸配列中に存在するＵＢ−３３に相当
する部分のフラグメントについても反応性を評価した。
反応性テスト 実験例１−（２）の場合と同様に操作して、ＵＢ−３３
由来の各フラグメントとＬ２抗体との反応性をＥＬＩＳ
Ａ法によって評価した。テストは２回行った。なお、ポ
ジティブコントロールとしてＵＢ−３３及びＨＰウレア
ーゼを使用し、ネガティブコントロールとしてペプチド
を使用しない空試験を行った。また、ジャックビーンウ
レアーゼのアミノ酸配列中に存在するＵＢ−３３に相当
する部分のフラグメントについても反応性を評価した。
【００５７】各フラグメントの反応性（吸光度）を第７
表と図７に示す。図７は第７表中の平均値を視覚化した
ものである。ＵＢ−３３のＮ末端側から１つずつアミノ
酸残基を減らしていくと、Ｎ末端側から７個目のＳ（セ
リン）残基が無くなった時点で反応性が急激に弱くなっ
た。一方、ＵＢ−３３のＣ末端側から１つずつアミノ酸
残基を減らしていくと、Ｃ末端側から６個目のＦ（フェ
ニルアラニン）残基が無くなった時点で反応性が急激に
弱くなった。この結果から、ＵＢ−３３−Ｆ８、すなわ
ち一般式（４）で表されるアミノ酸配列を有するフラグ
メントが最小抗原決定基であると決定された。
表と図７に示す。図７は第７表中の平均値を視覚化した
ものである。ＵＢ−３３のＮ末端側から１つずつアミノ
酸残基を減らしていくと、Ｎ末端側から７個目のＳ（セ
リン）残基が無くなった時点で反応性が急激に弱くなっ
た。一方、ＵＢ−３３のＣ末端側から１つずつアミノ酸
残基を減らしていくと、Ｃ末端側から６個目のＦ（フェ
ニルアラニン）残基が無くなった時点で反応性が急激に
弱くなった。この結果から、ＵＢ−３３−Ｆ８、すなわ
ち一般式（４）で表されるアミノ酸配列を有するフラグ
メントが最小抗原決定基であると決定された。
【００５８】
【表７】
【００５９】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の人工抗原
は抗ＨＰウレアーゼ抗体の特異的な認識部位であり強い
免疫原性を有している。そして、この人工抗原で動物を
免疫することによって、ＨＰの増殖及び消化器病変誘発
の両面に不可欠なＨＰウレアーゼの活性を特異的に且つ
強力に阻害する抗ＨＰウレアーゼ抗体を効率よく産生さ
せることができる。しかも、この人工抗原で免疫すれ
ば、ＨＰウレアーゼ蛋白で免疫する場合と異なり、抗Ｈ
Ｐウレアーゼ抗体を不活化する抗体のような都合の悪い
抗体を副生させることがない。
は抗ＨＰウレアーゼ抗体の特異的な認識部位であり強い
免疫原性を有している。そして、この人工抗原で動物を
免疫することによって、ＨＰの増殖及び消化器病変誘発
の両面に不可欠なＨＰウレアーゼの活性を特異的に且つ
強力に阻害する抗ＨＰウレアーゼ抗体を効率よく産生さ
せることができる。しかも、この人工抗原で免疫すれ
ば、ＨＰウレアーゼ蛋白で免疫する場合と異なり、抗Ｈ
Ｐウレアーゼ抗体を不活化する抗体のような都合の悪い
抗体を副生させることがない。
【００６０】従って、本発明の人工抗原及び当該人工抗
原によって誘導される抗ＨＰウレアーゼ抗体は、優れた
ワクチン、抗体、或いは診断薬などとして好適に利用す
ることが可能である。
原によって誘導される抗ＨＰウレアーゼ抗体は、優れた
ワクチン、抗体、或いは診断薬などとして好適に利用す
ることが可能である。
【００６１】
配列番号：１ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylor
i ） 配列： Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp 1 5 10 15 Ser Arg Ile 配列番号：２ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylor
i ）
i ） 配列： Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp 1 5 10 15 Ser Arg Ile 配列番号：２ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylor
i ）
【図１】Ｌ２抗体に対するＨＰウレアーゼＢサブユニッ
ト由来ペプチド断片の反応性を評価した結果を示すグラ
フである。
ト由来ペプチド断片の反応性を評価した結果を示すグラ
フである。
【図２】ＨＰウレアーゼに対するウサギ抗ＵＢ−３３血
清の中和活性を評価した結果を示すグラフである。
清の中和活性を評価した結果を示すグラフである。
【図３】マウス抗ＨＰウレアーゼ蛋白血清が認識するＡ
サブユニット中リニアエピトープを検索した結果を示す
グラフである。
サブユニット中リニアエピトープを検索した結果を示す
グラフである。
【図４】マウス抗ＨＰウレアーゼ蛋白血清が認識するＢ
サブユニット中リニアエピトープを検索した結果を示す
グラフである。
サブユニット中リニアエピトープを検索した結果を示す
グラフである。
【図５】ＨＰウレアーゼに対するマウス抗ＨＰウレアー
ゼ蛋白血清の中和活性の評価結果を示すグラフである。
ゼ蛋白血清の中和活性の評価結果を示すグラフである。
【図６】ＵＢ−３３以外のＢサブユニット中リニアエピ
トープに対するウサギ抗ＵＢ−３３血清の交差反応性を
検索した結果を示すグラフである。
トープに対するウサギ抗ＵＢ−３３血清の交差反応性を
検索した結果を示すグラフである。
【図７】Ｌ２抗体に対するＵＢ−３３由来のフラグメン
トの反応性を評価した結果を示すグラフである。
トの反応性を評価した結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/08 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 7/08 ＺＮＡ 16/12 16/12 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ 33/573 33/573 Ａ // Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｋ 31/00 ６０１Ｃ 31/04 ６３１Ｃ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/195 A61K 39/00 C07K 7/08 C07K 16/12 G01N 33/569 G01N 33/573 A61K 31/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】 下記一般式（１） Cys-His-His-Leu-Asp-Lys-Ser-Ile-Lys-Glu-Asp-Val-Gln-Phe-Ala-Asp-Ser-Arg- Ile …（１） ［式中、Cys はシステイン、His はヒスチジン、Leu は
ロイシン、Asp はアスパラギン酸、Lys はリジン、Ser
はセリン、Ile はイソロイシン、Glu はグルタミン酸、
Val はバリン、Gln はグルタミン、Phe はフェニルアラ
ニン、Ala はアラニン、Arg はアルギニンをそれぞれ表
す。］のアミノ酸配列で表されるペプチド、又は、当該
ペプチドのフラグメント及び当該ペプチドの欠失、付加
又は置換によって得られる修飾体及び当該ペプチドの塩
及び当該ペプチドのエステルの中から選ばれ且つ当該ペ
プチドと同等の免疫学的特異性を有し且つ下記一般式
（４） Ser-Ile-Lys-Glu-Asp-Val-Gln-Phe …（４） ［式中の各略号は、一般式（１）と同じ］のアミノ酸配
列で表される最小抗原決定基を有する変異体 からなるこ
とを特徴とする、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ
人工抗原。 - 【請求項２】 下記一般式（１） Cys-His-His-Leu-Asp-Lys-Ser-Ile-Lys-Glu-Asp-Val-Gln-Phe-Ala-Asp-Ser-Arg- Ile …（１） ［式中、Cys はシステイン、His はヒスチジン、Leu は
ロイシン、Asp はアスパラギン酸、Lys はリジン、Ser
はセリン、Ile はイソロイシン、Glu はグルタミン酸、
Val はバリン、Gln はグルタミン、Phe はフェニルアラ
ニン、Ala はアラニン、Arg はアルギニンをそれぞれ表
す。］のアミノ酸配列で表されるペプチド、又は、当該
ペプチドのフラグメント及び当該ペプチドの欠失、付加
又は置換によって得られる修飾体及び当該ペプチドの塩
及び当該ペプチドのエステルの中から選ばれ且つ当該ペ
プチドと同等の免疫学的特異性を有し且つ下記一般式
（４） Ser-Ile-Lys-Glu-Asp-Val-Gln-Phe …（４） ［式中の各略号は、一般式（１）と同じ］ のアミノ酸配
列で表される最小抗原決定基を有する変異体 からなる人
工抗原を免疫原とすることによって誘導される抗ヘリコ
バクター・ピロリ菌ウレアーゼ抗体（ただし、Ｌ２抗体
を除く）。 - 【請求項３】 下記一般式（４） Ser-Ile-Lys-Glu-Asp-Val-Gln-Phe …（４） ［式中、Ser はセリン、Ile はイソロイシン、Lys はリ
ジン、Glu はグルタミン酸、Asp はアスパラギン酸、Va
l はバリン、Gln はグルタミン、Phe はフェニルアラニ
ンをそれぞれ表す。］のアミノ酸配列で表されるペプチ
ド、又は、当該ペプチドの付加によって得られる修飾体
及び当該ペプチドの酸及び当該ペプチドのエステルの中
から選ばれ且つ当該ペプチドと同等の免疫学的特異性を
有し且つ上記一般式（４）のアミノ酸配列で表される最
小抗原決定基を有する変異体からなることを特徴とす
る、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ人工抗原。 - 【請求項４】 下記一般式（４） Ser-Ile-Lys-Glu-Asp-Val-Gln-Phe …（４） ［式中、Ser はセリン、Ile はイソロイシン、Lys はリ
ジン、Glu はグルタミン酸、Asp はアスパラギン酸、Va
l はバリン、Gln はグルタミン、Phe はフェニルアラニ
ンをそれぞれ表す。］のアミノ酸配列で表されるペプチ
ド、又は、当該ペプチドの付加によって得られる修飾体
及び当該ペプチドの酸及び当該ペプチドのエステルの中
から選ばれ且つ当該ペプチドと同等の免疫学的特異性を
有し且つ上記一般式（４）のアミノ酸配列で表される最
小抗原決定基を有する変異体からなる人工抗原を免疫原
とすることによって誘導される抗ヘリコバクター・ピロ
リ菌ウレアーゼ抗体（ただし、Ｌ２抗体を除く）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8101601A JP3007037B2 (ja) | 1995-07-19 | 1996-04-23 | ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ蛋白由来の人工抗原及びその人工抗原によって誘発された抗体 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18258495 | 1995-07-19 | ||
| JP7-182584 | 1995-07-19 | ||
| JP8101601A JP3007037B2 (ja) | 1995-07-19 | 1996-04-23 | ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ蛋白由来の人工抗原及びその人工抗原によって誘発された抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0987297A JPH0987297A (ja) | 1997-03-31 |
| JP3007037B2 true JP3007037B2 (ja) | 2000-02-07 |
Family
ID=26442462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8101601A Expired - Lifetime JP3007037B2 (ja) | 1995-07-19 | 1996-04-23 | ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ蛋白由来の人工抗原及びその人工抗原によって誘発された抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3007037B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CA2351110A1 (en) * | 2000-07-17 | 2002-01-17 | Akzo Nobel N.V. | Helicobacter felis vaccine |
-
1996
- 1996-04-23 JP JP8101601A patent/JP3007037B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0987297A (ja) | 1997-03-31 |
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