JP3077609B2 - マイクロチップ電気泳動方法及び装置 - Google Patents
マイクロチップ電気泳動方法及び装置Info
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
- G01N27/44791—Microapparatus
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
- G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
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- Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、極微量のタンパク
質や核酸などを高速、かつ高分解能に分析する方法とそ
の装置に関し、更に詳しくは、一対の透明板状部材の少
なくとも一方の板状部材の表面に液が流れる溝が形成さ
れ、他方の板状部材にはその溝に対応する位置に貫通穴
が設けられ、これら板状部材がその溝を内側にして貼り
合わされてその溝により分離流路を形成してなるマイク
ロチップを用い、分離流路に泳動液を満たし、その一端
側に試料を注入し、分離流路の両端間に泳動電圧を印加
して試料を分離流路で電気泳動させるマイクロチップ電
気泳動方法とその装置に関するものである。
質や核酸などを高速、かつ高分解能に分析する方法とそ
の装置に関し、更に詳しくは、一対の透明板状部材の少
なくとも一方の板状部材の表面に液が流れる溝が形成さ
れ、他方の板状部材にはその溝に対応する位置に貫通穴
が設けられ、これら板状部材がその溝を内側にして貼り
合わされてその溝により分離流路を形成してなるマイク
ロチップを用い、分離流路に泳動液を満たし、その一端
側に試料を注入し、分離流路の両端間に泳動電圧を印加
して試料を分離流路で電気泳動させるマイクロチップ電
気泳動方法とその装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】極微量のタンパク質や核酸などを分析す
る場合には、従来から電気泳動装置が用いられており、
その代表的なものとしてキャピラリ電気泳動装置があ
る。キャピラリ電気泳動装置は、内径が１００μｍ以下
のガラスキャピラリー内に泳動バッファを充填し、一端
側に試料を導入した後、両端間に高電圧を印加して分析
対象物をキャピラリー内で展開させるものである。キャ
ピラリー内は容積に対して表面積が大きい、すなわち冷
却効率が高いことから、高電圧の印加が可能となり、Ｄ
ＮＡなどの極微量試料を高速、かつ高分解能にて分析す
ることができる。
る場合には、従来から電気泳動装置が用いられており、
その代表的なものとしてキャピラリ電気泳動装置があ
る。キャピラリ電気泳動装置は、内径が１００μｍ以下
のガラスキャピラリー内に泳動バッファを充填し、一端
側に試料を導入した後、両端間に高電圧を印加して分析
対象物をキャピラリー内で展開させるものである。キャ
ピラリー内は容積に対して表面積が大きい、すなわち冷
却効率が高いことから、高電圧の印加が可能となり、Ｄ
ＮＡなどの極微量試料を高速、かつ高分解能にて分析す
ることができる。
【０００３】キャピラリーはその外形が数１０μｍ〜１
００μｍ程度と細く破損しやすいため、ユーザーが行な
うべきキャピラリー交換時の取扱いが容易でない問題を
有する。そのため、D. J. Harrison et al./ Anal. Chi
m. Acta 283 (1993) 361-366に示されているように、２
枚の基板を接合して形成されたキャピラリー電気泳動チ
ップ（マイクロチップという）が提案されている。その
マイクロチップの例を図１に示す。一対の透明基板（ガ
ラス板）５１，５２からなり、一方の基板５２の表面に
互いに交差する泳動用キャピラリー溝５４，５５を形成
し、他方の基板５１にはその溝５４，５５の端に対応す
る位置にリザーバ５３を貫通穴として設けたものであ
る。
００μｍ程度と細く破損しやすいため、ユーザーが行な
うべきキャピラリー交換時の取扱いが容易でない問題を
有する。そのため、D. J. Harrison et al./ Anal. Chi
m. Acta 283 (1993) 361-366に示されているように、２
枚の基板を接合して形成されたキャピラリー電気泳動チ
ップ（マイクロチップという）が提案されている。その
マイクロチップの例を図１に示す。一対の透明基板（ガ
ラス板）５１，５２からなり、一方の基板５２の表面に
互いに交差する泳動用キャピラリー溝５４，５５を形成
し、他方の基板５１にはその溝５４，５５の端に対応す
る位置にリザーバ５３を貫通穴として設けたものであ
る。
【０００４】このマイクロチップを使用するときは、両
基板５１，５２を（Ｃ）に示すように重ね、いずれかの
リザーバ５３から泳動液を溝５４，５５中に注入する。
その後、短い方の溝５４の一方の端のリザーバ５３に試
料を注入しその溝５４の両端のリザーバ５３，５３間に
電極を差し込んで所定時間だけ高電圧を印加する。これ
により、試料は溝５４中に分散される。次に、長い方の
溝５５の両端のリザーバ５３，５３に電極を差し込み、
泳動電圧を印加する。これにより、両溝５４，５５の交
差部分５６に存在する試料が溝５５内を電気泳動する。
溝５５の適当な位置に紫外可視分光光度計、蛍光光度
計、電気化学検出器等の検出器を配置しておくことによ
り、分離成分の検出を行なう。
基板５１，５２を（Ｃ）に示すように重ね、いずれかの
リザーバ５３から泳動液を溝５４，５５中に注入する。
その後、短い方の溝５４の一方の端のリザーバ５３に試
料を注入しその溝５４の両端のリザーバ５３，５３間に
電極を差し込んで所定時間だけ高電圧を印加する。これ
により、試料は溝５４中に分散される。次に、長い方の
溝５５の両端のリザーバ５３，５３に電極を差し込み、
泳動電圧を印加する。これにより、両溝５４，５５の交
差部分５６に存在する試料が溝５５内を電気泳動する。
溝５５の適当な位置に紫外可視分光光度計、蛍光光度
計、電気化学検出器等の検出器を配置しておくことによ
り、分離成分の検出を行なう。
【０００５】従来のマイクロチップ電気泳動装置で検出
部に光学的検出器を採用したものは、検出手段としてレ
ーザ蛍光検出が行なわれており、紫外可視領域での吸収
による検出を行なっているものはない。紫外可視吸収検
出を適応しようとすれば、汎用のキャピラリー電気泳動
装置と同様に、入射光を流路と垂直に入射させ、出射光
をフォトセルなどの検出手段を用いてその検出部のある
特定位置を通過する目的成分を検出することにより、分
離を確認する。
部に光学的検出器を採用したものは、検出手段としてレ
ーザ蛍光検出が行なわれており、紫外可視領域での吸収
による検出を行なっているものはない。紫外可視吸収検
出を適応しようとすれば、汎用のキャピラリー電気泳動
装置と同様に、入射光を流路と垂直に入射させ、出射光
をフォトセルなどの検出手段を用いてその検出部のある
特定位置を通過する目的成分を検出することにより、分
離を確認する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】マイクロチップ電気泳
動の場合、特に光をチップの表面に対する垂直方向から
入射させた場合、光路長は１０μｍ程度しか得られず、
汎用キャピラリー電気泳動と比べてもその１／５程度に
しかならない。また汎用キャピラリー電気泳動にしても
光路長は５０μｍ程度と短かく、高分解能でありなが
ら、その感度の低さが大きな欠点となっている。光路長
を長くする目的でバブルセルなどに見られるようにセル
部分の流路を膨らませることも考えられるが、それでも
なお、十分な光路長を実現するのは難しい。そこで、本
発明はマイクロチップ電気泳動で検出感度を高めること
を目的とするものである。
動の場合、特に光をチップの表面に対する垂直方向から
入射させた場合、光路長は１０μｍ程度しか得られず、
汎用キャピラリー電気泳動と比べてもその１／５程度に
しかならない。また汎用キャピラリー電気泳動にしても
光路長は５０μｍ程度と短かく、高分解能でありなが
ら、その感度の低さが大きな欠点となっている。光路長
を長くする目的でバブルセルなどに見られるようにセル
部分の流路を膨らませることも考えられるが、それでも
なお、十分な光路長を実現するのは難しい。そこで、本
発明はマイクロチップ電気泳動で検出感度を高めること
を目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明のマイクロチップ
電気泳動方法は、試料中の目的成分が分離を完了した段
階で泳動電圧の印加を停止し、分離流路で目的成分が分
離している所定の範囲にわたって光を照射し、その範囲
全体にわたって試料による吸収又は発光を繰り返して測
定し、その測定値を分離流路の各位置ごとに積算するよ
うにした。
電気泳動方法は、試料中の目的成分が分離を完了した段
階で泳動電圧の印加を停止し、分離流路で目的成分が分
離している所定の範囲にわたって光を照射し、その範囲
全体にわたって試料による吸収又は発光を繰り返して測
定し、その測定値を分離流路の各位置ごとに積算するよ
うにした。
【０００８】本発明のマイクロチップ電気泳動装置は、
一対の透明板状部材を備え、少なくとも一方の板状部材
の表面に液が流れる溝が形成され、他方の板状部材には
その溝に対応する位置に貫通穴が設けられ、これら板状
部材が前記溝を内側にして貼り合わされてその溝により
分離流路を形成してなるマイクロチップと、分離流路の
両端間に泳動電圧を印加する泳動電源装置と、分離流路
の所定の範囲にわたって光を照射する照射手段と、分離
流路内で分離された目的成分による前記光の吸収または
発光を検出するための、分離流路にそって配列された複
数個の受光素子を有する光検出手段と、光検出手段によ
る測定を繰り返して行ない、その測定信号を受光素子ご
とに積算した後にデータ処理を行なうデータ処理・制御
部とを備えている。
一対の透明板状部材を備え、少なくとも一方の板状部材
の表面に液が流れる溝が形成され、他方の板状部材には
その溝に対応する位置に貫通穴が設けられ、これら板状
部材が前記溝を内側にして貼り合わされてその溝により
分離流路を形成してなるマイクロチップと、分離流路の
両端間に泳動電圧を印加する泳動電源装置と、分離流路
の所定の範囲にわたって光を照射する照射手段と、分離
流路内で分離された目的成分による前記光の吸収または
発光を検出するための、分離流路にそって配列された複
数個の受光素子を有する光検出手段と、光検出手段によ
る測定を繰り返して行ない、その測定信号を受光素子ご
とに積算した後にデータ処理を行なうデータ処理・制御
部とを備えている。
【０００９】データ処理・制御部は、試料の拡散係数及
びピークの劣化度をパラメータとして含んで分離流路で
の光照射による測定の繰返し回数を計算する計算式を備
えており、前記パラメータが入力されることにより測定
の繰返し回数を自動的に計算し、繰返し測定を制御する
ものであることが好ましい。
びピークの劣化度をパラメータとして含んで分離流路で
の光照射による測定の繰返し回数を計算する計算式を備
えており、前記パラメータが入力されることにより測定
の繰返し回数を自動的に計算し、繰返し測定を制御する
ものであることが好ましい。
【００１０】目的成分の分離が完了した後、分離流路に
かけられていた泳動電圧を取り除くと、分離された成分
には液体クロマトグラフィーのような慣性力は働かず、
自然拡散するだけで流路内に留まる。その状態で流路全
体に当てられた光による吸収または蛍光を光検出装置で
繰返し測定する。光検出装置の一つ一つの受光素子の位
置が流路の位置と対応しているので、流路各位置の光強
度を測定し、それを繰返し積算していく。測定中、流路
内の成分は自然拡散していくが、例えば後述のように、
ピークの形状が理論段数に換算して９０％程度劣化する
までに約２.５秒間があり、その間に３００回の積算を
行なうとすれば、Ｓ／Ｎ比は約１７.３倍となる。
かけられていた泳動電圧を取り除くと、分離された成分
には液体クロマトグラフィーのような慣性力は働かず、
自然拡散するだけで流路内に留まる。その状態で流路全
体に当てられた光による吸収または蛍光を光検出装置で
繰返し測定する。光検出装置の一つ一つの受光素子の位
置が流路の位置と対応しているので、流路各位置の光強
度を測定し、それを繰返し積算していく。測定中、流路
内の成分は自然拡散していくが、例えば後述のように、
ピークの形状が理論段数に換算して９０％程度劣化する
までに約２.５秒間があり、その間に３００回の積算を
行なうとすれば、Ｓ／Ｎ比は約１７.３倍となる。
【００１１】
【実施例】装置の一実施例を図２に示す。マイクロチッ
プ５は図１に示されたものである。その分離流路５５の
一定範囲を光照射するために、分離流路５５に沿って線
状に延びた光源１からの光がシリンドリカルレンズ２で
平行光にされてバンドパスフィルター３に入射し、バン
ドパスフィルター３を透過して所定の波長にされた光が
シリンドリカルレンズ４によりマイクロチップ５の分離
流路に集光されて入射する。マイクロチップ５の反対側
には分離流路を透過した光を集光するためにシリンドリ
カルレンズ６が設けられ、シリンドリカルレンズ６で集
光された光が光検出器のフォトセルアレイ７に入射して
検出される。シリンドリカルレンズ２，４，６、バンド
パスフィルター３及びフォトセルアレイ７は分離流路よ
りは短かいが、分離流路とほぼ同じ長さを有している。
フォトセルアレイ７は、検出素子として分離流路の長さ
方向の一直線上に配列された、例えば５１２個のフォト
ダイオードを備えている。
プ５は図１に示されたものである。その分離流路５５の
一定範囲を光照射するために、分離流路５５に沿って線
状に延びた光源１からの光がシリンドリカルレンズ２で
平行光にされてバンドパスフィルター３に入射し、バン
ドパスフィルター３を透過して所定の波長にされた光が
シリンドリカルレンズ４によりマイクロチップ５の分離
流路に集光されて入射する。マイクロチップ５の反対側
には分離流路を透過した光を集光するためにシリンドリ
カルレンズ６が設けられ、シリンドリカルレンズ６で集
光された光が光検出器のフォトセルアレイ７に入射して
検出される。シリンドリカルレンズ２，４，６、バンド
パスフィルター３及びフォトセルアレイ７は分離流路よ
りは短かいが、分離流路とほぼ同じ長さを有している。
フォトセルアレイ７は、検出素子として分離流路の長さ
方向の一直線上に配列された、例えば５１２個のフォト
ダイオードを備えている。
【００１２】フォトセルアレイ７は図３のような回路構
成を有している。そのフォトセルアレイ７は、一直線上
で互い違いに並べられた奇数フォトダイオード１１と偶
数フォトダイオード１２を有しており、両フォトダイオ
ード１１，１２をあわせれば５１２個となる。さらに、
測定に用いられるフォトダイオード１１，１２と同一特
性を持つダミーフォトダイオード１３が５１２個設けら
れている。各フォトダイオード１１，１２，１３には、
ＭＯＳ−ＦＥＴからなるスイッチング素子１４が接続さ
れている。各スイッチング素子１４には奇数シフトレジ
スタ１５又は偶数シフトレジスタ１６が接続されてお
り、シフトレジスタ１５，１６からの信号によって各ス
イッチング素子１４のオン、オフの切換えが行なわれる
ようになっている。
成を有している。そのフォトセルアレイ７は、一直線上
で互い違いに並べられた奇数フォトダイオード１１と偶
数フォトダイオード１２を有しており、両フォトダイオ
ード１１，１２をあわせれば５１２個となる。さらに、
測定に用いられるフォトダイオード１１，１２と同一特
性を持つダミーフォトダイオード１３が５１２個設けら
れている。各フォトダイオード１１，１２，１３には、
ＭＯＳ−ＦＥＴからなるスイッチング素子１４が接続さ
れている。各スイッチング素子１４には奇数シフトレジ
スタ１５又は偶数シフトレジスタ１６が接続されてお
り、シフトレジスタ１５，１６からの信号によって各ス
イッチング素子１４のオン、オフの切換えが行なわれる
ようになっている。
【００１３】１７は奇数シフトレジスタ１５の動作信号
入力端子、１８は偶数シフトレジスタ１５の動作信号入
力端子、１９は奇数側リセット信号入力端子、２０は偶
数側リセット信号入力端子、２１は奇数フォトダイオー
ド１１からの出力用の出力端子、２２は偶数フォトダイ
オード１２からの出力用の出力端子、２３及び２４はダ
ミーフォトダイオードからの出力用の出力端子、Ｃはコ
ンデンサーである。
入力端子、１８は偶数シフトレジスタ１５の動作信号入
力端子、１９は奇数側リセット信号入力端子、２０は偶
数側リセット信号入力端子、２１は奇数フォトダイオー
ド１１からの出力用の出力端子、２２は偶数フォトダイ
オード１２からの出力用の出力端子、２３及び２４はダ
ミーフォトダイオードからの出力用の出力端子、Ｃはコ
ンデンサーである。
【００１４】さらに、この電気泳動装置は図４に示す制
御部４０を備えており、その制御部４０によってこの電
気泳動装置が制御される。制御部４０はＣＰＵ、ＲＡ
Ｍ、ＲＯＭなどを含むマイクロコンピュータから構成さ
れている。制御部４０にはフォトセルアレイ７の入力端
子１７〜２０が接続されている。フォトセルアレイ７の
出力端子２１〜２４は、アンプ４１及びＡ／Ｄ変換器４
２を介して制御部４０に接続されている。制御部４０に
はさらに操作者が指令を入力するためのキーや表示を行
なうためのＣＲＴを備えた操作盤４３と、測定結果をチ
ャート化するためのＸＹプリンター４４と、電源３４と
が接続されている。
御部４０を備えており、その制御部４０によってこの電
気泳動装置が制御される。制御部４０はＣＰＵ、ＲＡ
Ｍ、ＲＯＭなどを含むマイクロコンピュータから構成さ
れている。制御部４０にはフォトセルアレイ７の入力端
子１７〜２０が接続されている。フォトセルアレイ７の
出力端子２１〜２４は、アンプ４１及びＡ／Ｄ変換器４
２を介して制御部４０に接続されている。制御部４０に
はさらに操作者が指令を入力するためのキーや表示を行
なうためのＣＲＴを備えた操作盤４３と、測定結果をチ
ャート化するためのＸＹプリンター４４と、電源３４と
が接続されている。
【００１５】この実施例で、光源１からの光は、シリン
ドリカルレンズ２により平行光となり、バンドパスフィ
ルタ３を通って特定波長のみの光となり、シリンドリカ
ルレンズ４によってマイクロチップ５上の分離流路へ集
光される。分離流路を通過した光はシリンドリカルレン
ズ６により再び平行光になり、フォトセルアレイ７へ照
射される。
ドリカルレンズ２により平行光となり、バンドパスフィ
ルタ３を通って特定波長のみの光となり、シリンドリカ
ルレンズ４によってマイクロチップ５上の分離流路へ集
光される。分離流路を通過した光はシリンドリカルレン
ズ６により再び平行光になり、フォトセルアレイ７へ照
射される。
【００１６】この実施例の動作を図５に示す制御フロー
チャートにしたがって説明する。プログラムがスタート
すると、電源３４をオフ状態としたり、プリンタ４４を
初期位置にセットしたりするなどの初期設定が行なわれ
る（ステップＳ１）。操作盤４３を介してサンプル注入
時間や電圧、泳動電圧などの分離パラメータの設定が操
作者により行なわれる（ステップＳ２）。泳動終了時間
（＝積算開始時間）や積算時間などの測定パラメータの
設定が操作者により行なわれる（ステップＳ３）。そし
て、プログラムはスタート指令を待つ（ステップＳ
４）。
チャートにしたがって説明する。プログラムがスタート
すると、電源３４をオフ状態としたり、プリンタ４４を
初期位置にセットしたりするなどの初期設定が行なわれ
る（ステップＳ１）。操作盤４３を介してサンプル注入
時間や電圧、泳動電圧などの分離パラメータの設定が操
作者により行なわれる（ステップＳ２）。泳動終了時間
（＝積算開始時間）や積算時間などの測定パラメータの
設定が操作者により行なわれる（ステップＳ３）。そし
て、プログラムはスタート指令を待つ（ステップＳ
４）。
【００１７】操作者は通常のマイクロチップ電気泳動と
同じように試料の注入を行ない、操作盤４３のスタート
ボタンを押す。これによりプログラムに従って試料の電
気泳動分離が開始され、設定されたパラメータに基づい
てマイクロチップ５の分離流路の両端間に泳動電圧が印
加される（ステップＳ４，Ｓ５）。これにより、試料は
分離流路内を移動しつつ分離されていく。
同じように試料の注入を行ない、操作盤４３のスタート
ボタンを押す。これによりプログラムに従って試料の電
気泳動分離が開始され、設定されたパラメータに基づい
てマイクロチップ５の分離流路の両端間に泳動電圧が印
加される（ステップＳ４，Ｓ５）。これにより、試料は
分離流路内を移動しつつ分離されていく。
【００１８】設定された泳動時間が終了すると（ステッ
プＳ６）、目的成分が分離流路内で分離された状態とな
る。そのとき、図６（Ａ）に示すように、目的成分ａ，
ｂ，ｃ，ｄの分離が行なわれているとする。キャピラリ
ー電気泳動（このマイクロチップ電気泳動も同じ）の特
徴として、電気泳動用にかけられていた高電圧を除く
と、キャピラリー中の成分は慣性力の影響もなく、その
場に留まる。したがって、成分ａ，ｂ，ｃ，ｄは自然拡
散を行なうだけである。ステップＳ３での設定に従って
測定を開始する（ステップＳ７）。このとき、フォトセ
ルアレイ７のフォトダイオード１つ１つが流路の各位置
に対応している。フォトセルアレイ７は、一例として、
５１２個のフォトダイオードが２５μｍピッチで並んで
おり、１２.８ｍｍの長さである。したがって、分離流
路の１２.８ｍｍの長さの範囲の光吸収像が２５μｍの
分解能で得られる。例えば、図６（Ａ）のような分離の
様子が、図６（Ｂ）に見られるような紫外吸収像として
得られる。
プＳ６）、目的成分が分離流路内で分離された状態とな
る。そのとき、図６（Ａ）に示すように、目的成分ａ，
ｂ，ｃ，ｄの分離が行なわれているとする。キャピラリ
ー電気泳動（このマイクロチップ電気泳動も同じ）の特
徴として、電気泳動用にかけられていた高電圧を除く
と、キャピラリー中の成分は慣性力の影響もなく、その
場に留まる。したがって、成分ａ，ｂ，ｃ，ｄは自然拡
散を行なうだけである。ステップＳ３での設定に従って
測定を開始する（ステップＳ７）。このとき、フォトセ
ルアレイ７のフォトダイオード１つ１つが流路の各位置
に対応している。フォトセルアレイ７は、一例として、
５１２個のフォトダイオードが２５μｍピッチで並んで
おり、１２.８ｍｍの長さである。したがって、分離流
路の１２.８ｍｍの長さの範囲の光吸収像が２５μｍの
分解能で得られる。例えば、図６（Ａ）のような分離の
様子が、図６（Ｂ）に見られるような紫外吸収像として
得られる。
【００１９】制御部４０によりフォトセルアレイ７のス
キャン（走査）が繰り返し行なわれ、積算されていくこ
とにより、図６（Ｂ）のＳ／Ｎ比はどんどん大きくなっ
ていく。（ステップＳ７，Ｓ８，Ｓ９）。積算が終了す
ると、測定結果がプリンターに出力され（ステップＳ１
０）、電源ランプがオフにされてプログラムが終了する
（ステップＳ１１，Ｓ１２）。
キャン（走査）が繰り返し行なわれ、積算されていくこ
とにより、図６（Ｂ）のＳ／Ｎ比はどんどん大きくなっ
ていく。（ステップＳ７，Ｓ８，Ｓ９）。積算が終了す
ると、測定結果がプリンターに出力され（ステップＳ１
０）、電源ランプがオフにされてプログラムが終了する
（ステップＳ１１，Ｓ１２）。
【００２０】繰返し測定を行なう時間は、理論段数Ｎの
劣化度を１つの目安として決定することができる。電気
泳動を止めたときの理論段数Ｎは自然拡散により劣化し
ていくが、例えば１０％の劣化で留めるならば、後述す
るように２.５秒間の繰返し時間があり、１スキャンを
８ミリ秒とすると約３００回のスキャンを行なうことが
でき、Ｓ／Ｎ比は約１７.３倍となる。また、さらなる
高速スキャン又は拡散係数の小さい成分を分析するとき
はＳ／Ｎ比はさらによくなる。
劣化度を１つの目安として決定することができる。電気
泳動を止めたときの理論段数Ｎは自然拡散により劣化し
ていくが、例えば１０％の劣化で留めるならば、後述す
るように２.５秒間の繰返し時間があり、１スキャンを
８ミリ秒とすると約３００回のスキャンを行なうことが
でき、Ｓ／Ｎ比は約１７.３倍となる。また、さらなる
高速スキャン又は拡散係数の小さい成分を分析するとき
はＳ／Ｎ比はさらによくなる。
【００２１】図６（Ｃ）は通常のキャピラリー電気泳動
で、特定の検出部の位置を通過した目的成分を検出して
得られたエレクトロフェログラムを示したものである。
本発明の図５（Ｂ）のものと比べて、Ｓ／Ｎ比が小さ
く、測定時間は長く、また泳動速度の遅い成分のピーク
幅が広くなっている。
で、特定の検出部の位置を通過した目的成分を検出して
得られたエレクトロフェログラムを示したものである。
本発明の図５（Ｂ）のものと比べて、Ｓ／Ｎ比が小さ
く、測定時間は長く、また泳動速度の遅い成分のピーク
幅が広くなっている。
【００２２】ここで、泳動電圧の印加を止めた後、繰返
し測定が可能な回数について説明する。一般に、理論段
数Ｎはキャピラリー長Ｌ、ピークの標準偏差σにより Ｎ＝（Ｌ／σ）2 （１） と表わされる。いま、仮りに、Ｌ＝２ｃｍ、Ｎ＝１００
００とすると、 σ2＝４／１００００ ＝１／２５００ である。泳動電圧の印加停止からｔ’秒後の理論段数
Ｎ’は、次のように示すことができる。 Ｎ'＝Ｌ2／(σ2＋σ'2） （２） σ'は泳動電圧の印加停止からｔ’秒後のピークの標準
偏差である。溶媒中の溶質の自然拡散は、拡散係数を
Ｄ、時間をｔとして、 σ2＝２Ｄｔ （３） と表わされるので、 Ｎ'＝Ｌ2／(σ2＋２Ｄｔ'） （４） となる。よって、理論段数がＮ’に劣化するまでの時
間、すなわち、理論段数がＮ’に劣化するまでに繰返し
測定が可能な時間ｔ'は、 ｔ'＝（Ｌ2／Ｎ'−σ2)／２Ｄ （５） となる。繰返し測定が可能な時間ｔ'が求まれば、フォ
トセルアレイのスキャン１回に要する時間はわかってい
るので、スキャン回数が求まる。理論段数がある程度ま
で低下するまでの時間を実際に求めると表１のようにな
る。
し測定が可能な回数について説明する。一般に、理論段
数Ｎはキャピラリー長Ｌ、ピークの標準偏差σにより Ｎ＝（Ｌ／σ）2 （１） と表わされる。いま、仮りに、Ｌ＝２ｃｍ、Ｎ＝１００
００とすると、 σ2＝４／１００００ ＝１／２５００ である。泳動電圧の印加停止からｔ’秒後の理論段数
Ｎ’は、次のように示すことができる。 Ｎ'＝Ｌ2／(σ2＋σ'2） （２） σ'は泳動電圧の印加停止からｔ’秒後のピークの標準
偏差である。溶媒中の溶質の自然拡散は、拡散係数を
Ｄ、時間をｔとして、 σ2＝２Ｄｔ （３） と表わされるので、 Ｎ'＝Ｌ2／(σ2＋２Ｄｔ'） （４） となる。よって、理論段数がＮ’に劣化するまでの時
間、すなわち、理論段数がＮ’に劣化するまでに繰返し
測定が可能な時間ｔ'は、 ｔ'＝（Ｌ2／Ｎ'−σ2)／２Ｄ （５） となる。繰返し測定が可能な時間ｔ'が求まれば、フォ
トセルアレイのスキャン１回に要する時間はわかってい
るので、スキャン回数が求まる。理論段数がある程度ま
で低下するまでの時間を実際に求めると表１のようにな
る。
【００２３】
【表１】
【００２４】キャピラリー電気泳動において泳動途中に
泳動電圧を取り除くと、溶媒中の溶質は自然拡散以外の
移動を起こさないことが知られている。印加電圧を取り
去った状態で分離流路に平行に紫外吸収測定をスキャン
した場合、スキャン回数に応じてＳ／Ｎ比の向上が期待
できる。フォトセルアレイ７としてフォトダイオードア
レイＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（高速液体クロマトグラフ用
フォトダイオードアレイ検出器で、株式会社島津製作所
の製品）の場合、スキャンに要する時間は８ミリ秒であ
る。紫外吸収を有する溶質は分子量が１００以上のもの
がほとんどであり、そのような溶質は少なくとも２.５
秒間は理論段数Ｎが９０％以下には劣化しない。２.５
秒間に３００回のスキャンを行なったとして、３００回
のスキャンによる測定を積算したときのノイズｎ'は、
１回のスキャンによる測定のノイズｎに対し、 ｎ'＝ｎ／(３００)1/2 ≒ｎ／１７.３ となる。よって、約１７.３倍のＳ／Ｎ比の向上が期待
できる。
泳動電圧を取り除くと、溶媒中の溶質は自然拡散以外の
移動を起こさないことが知られている。印加電圧を取り
去った状態で分離流路に平行に紫外吸収測定をスキャン
した場合、スキャン回数に応じてＳ／Ｎ比の向上が期待
できる。フォトセルアレイ７としてフォトダイオードア
レイＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（高速液体クロマトグラフ用
フォトダイオードアレイ検出器で、株式会社島津製作所
の製品）の場合、スキャンに要する時間は８ミリ秒であ
る。紫外吸収を有する溶質は分子量が１００以上のもの
がほとんどであり、そのような溶質は少なくとも２.５
秒間は理論段数Ｎが９０％以下には劣化しない。２.５
秒間に３００回のスキャンを行なったとして、３００回
のスキャンによる測定を積算したときのノイズｎ'は、
１回のスキャンによる測定のノイズｎに対し、 ｎ'＝ｎ／(３００)1/2 ≒ｎ／１７.３ となる。よって、約１７.３倍のＳ／Ｎ比の向上が期待
できる。
【００２５】（５）式で、パラメータに数値を代入して
繰返し可能時間を求めるとスキャン回数を決定すること
ができる。しかし、この計算は煩雑であり、測定前に操
作者が手計算にて行なうには多くの時間を要し、また計
算間違いによる誤った操作を導きかねない。そこで、好
ましい例として、（５）式をコンピュータである制御部
４０に記憶させておき、この計算を制御部４０に必要な
パラメータを入力するだけで自動的に行なうようにす
る。このときの動作を図７の制御フローチャートにした
がつて説明する。
繰返し可能時間を求めるとスキャン回数を決定すること
ができる。しかし、この計算は煩雑であり、測定前に操
作者が手計算にて行なうには多くの時間を要し、また計
算間違いによる誤った操作を導きかねない。そこで、好
ましい例として、（５）式をコンピュータである制御部
４０に記憶させておき、この計算を制御部４０に必要な
パラメータを入力するだけで自動的に行なうようにす
る。このときの動作を図７の制御フローチャートにした
がつて説明する。
【００２６】プログラムがスタートすると、電源３４を
オフ状態としたり、プリンタ４４を初期位置にセットし
たりするなどの初期設定が行なわれる（ステップＳ
１）。操作盤４３を介してサンプル注入時間や電圧、泳
動電圧などの分離パラメータの設定が操作者により行な
われる（ステップＳ２）。次に、スキャン回数を決定す
るためのパラメータ、すなわち拡散係数Ｄ、キャピラリ
ー長Ｌ、繰返し測定を行なうことによる待ち時間のため
に起こる理論段数の許容劣化度（Ｎ'に対応する）の入
力が操作者により行なわれる（ステップＳ３）。そし
て、プログラムはスタート指令を待つ（ステップＳ
４）。
オフ状態としたり、プリンタ４４を初期位置にセットし
たりするなどの初期設定が行なわれる（ステップＳ
１）。操作盤４３を介してサンプル注入時間や電圧、泳
動電圧などの分離パラメータの設定が操作者により行な
われる（ステップＳ２）。次に、スキャン回数を決定す
るためのパラメータ、すなわち拡散係数Ｄ、キャピラリ
ー長Ｌ、繰返し測定を行なうことによる待ち時間のため
に起こる理論段数の許容劣化度（Ｎ'に対応する）の入
力が操作者により行なわれる（ステップＳ３）。そし
て、プログラムはスタート指令を待つ（ステップＳ
４）。
【００２７】操作者は通常のマイクロチップ電気泳動と
同じように試料の注入を行ない、操作盤４３のスタート
ボタンを押す。これによりプログラムに従って試料の電
気泳動分離が開始され、設定されたパラメータに基づい
てマイクロチップ５の分離流路の両端間に泳動電圧が印
加される（ステップＳ４，Ｓ５）。これにより、試料は
分離流路内を移動しつつ分離されていく。設定された泳
動時間が終了すると（ステップＳ６）、目的成分が分離
流路内で分離された状態となる。フォトセルアレイ７で
の測定では、まず１回目のスキャンが行なわれた後（ス
テップＳ７）、その測定結果に基づいてサンプルピーク
の標準偏差σが求められ、（５）式からスキャン回数が
計算される（ステップＳ８）。そして、その計算された
スキャン回数だけフォトセルアレイ７のスキャンが繰り
返し行なわれ、積算されていく（ステップＳ９）。積算
が終了すると、測定結果がプリンターに出力され（ステ
ップＳ１０）、電源ランプがオフにされてプログラムが
終了する（ステップＳ１１，Ｓ１２）。
同じように試料の注入を行ない、操作盤４３のスタート
ボタンを押す。これによりプログラムに従って試料の電
気泳動分離が開始され、設定されたパラメータに基づい
てマイクロチップ５の分離流路の両端間に泳動電圧が印
加される（ステップＳ４，Ｓ５）。これにより、試料は
分離流路内を移動しつつ分離されていく。設定された泳
動時間が終了すると（ステップＳ６）、目的成分が分離
流路内で分離された状態となる。フォトセルアレイ７で
の測定では、まず１回目のスキャンが行なわれた後（ス
テップＳ７）、その測定結果に基づいてサンプルピーク
の標準偏差σが求められ、（５）式からスキャン回数が
計算される（ステップＳ８）。そして、その計算された
スキャン回数だけフォトセルアレイ７のスキャンが繰り
返し行なわれ、積算されていく（ステップＳ９）。積算
が終了すると、測定結果がプリンターに出力され（ステ
ップＳ１０）、電源ランプがオフにされてプログラムが
終了する（ステップＳ１１，Ｓ１２）。
【００２８】（５）式は、（１）式の関係から、 ｔ'＝Ｌ2（１／Ｎ'−１／Ｎ)／２Ｄ （５ａ） と変形することができる。ステップＳ８でのスキャン回
数の計算では、１回目のスキャンの測定結果に基づいて
サンプルピークの理論段数Ｎを求めてスキャン回数を計
算するようにしてもよい。
数の計算では、１回目のスキャンの測定結果に基づいて
サンプルピークの理論段数Ｎを求めてスキャン回数を計
算するようにしてもよい。
【００２９】１回目の測定による理論段数Ｎの大小によ
り理論段数許容劣化度を予め決めおき、分離流路の長さ
Ｌが決まっているとすれば、測定者が入力するパラメー
タは拡散係数Ｄだけとなる。さらには、測定対象試料と
溶媒が決定していれば拡散係数Ｄも決まるので、測定者
がパラメータを入力しなくてもはスキャン回数を自動的
に計算することができる。他の実施例として、測定部の
光照射手段と光検出手段がマイクロチップの分離流路に
沿って移動可能に支持したり、又は光照射手段と光検出
手段に対してマイクロチップが移動可能に支持すること
により、測定のスキャンを繰り返すことができる。例え
ば、ＤＮＡなどの巨大分子を泳動させた場合や、バッフ
ァ液としてゲル状のものを用いた場合には、サンプルの
拡散（自然拡散）はほとんど起こらないと考えることが
できるので、高速スキャンでなくても積算することがで
きる。
り理論段数許容劣化度を予め決めおき、分離流路の長さ
Ｌが決まっているとすれば、測定者が入力するパラメー
タは拡散係数Ｄだけとなる。さらには、測定対象試料と
溶媒が決定していれば拡散係数Ｄも決まるので、測定者
がパラメータを入力しなくてもはスキャン回数を自動的
に計算することができる。他の実施例として、測定部の
光照射手段と光検出手段がマイクロチップの分離流路に
沿って移動可能に支持したり、又は光照射手段と光検出
手段に対してマイクロチップが移動可能に支持すること
により、測定のスキャンを繰り返すことができる。例え
ば、ＤＮＡなどの巨大分子を泳動させた場合や、バッフ
ァ液としてゲル状のものを用いた場合には、サンプルの
拡散（自然拡散）はほとんど起こらないと考えることが
できるので、高速スキャンでなくても積算することがで
きる。
【００３０】
【発明の効果】従来のように分離流路の一部に検出器を
備えてその位置を通過する目的成分を検出する方法であ
れば、分離を完了して最後の目的成分がその位置を通過
するまで分析終了とならなかったが、本発明では最後の
目的成分が分離を完了した時点で測定を実行でき、測定
時間が短縮される。測定を繰り返し、測定値を積算する
ことによってＳ／Ｎ比を向上させることができ、検出感
度が向上する。従来の検出方法であれば、泳動速度の遅
い成分ほどエレクトロフェログラムのピーク幅が広くな
るが、本発明ではどの目的成分でも泳動時間が同じであ
るため、ピーク幅の揃った美しいエレクトロフェログラ
ムを得ることができる。また、繰返し測定を行なう回数
を自動的に計算させるようにすることにより、煩雑な計
算を測定者が手計算にて行なう必要がなくなり、計算間
違いによる誤った操作もなくなる。
備えてその位置を通過する目的成分を検出する方法であ
れば、分離を完了して最後の目的成分がその位置を通過
するまで分析終了とならなかったが、本発明では最後の
目的成分が分離を完了した時点で測定を実行でき、測定
時間が短縮される。測定を繰り返し、測定値を積算する
ことによってＳ／Ｎ比を向上させることができ、検出感
度が向上する。従来の検出方法であれば、泳動速度の遅
い成分ほどエレクトロフェログラムのピーク幅が広くな
るが、本発明ではどの目的成分でも泳動時間が同じであ
るため、ピーク幅の揃った美しいエレクトロフェログラ
ムを得ることができる。また、繰返し測定を行なう回数
を自動的に計算させるようにすることにより、煩雑な計
算を測定者が手計算にて行なう必要がなくなり、計算間
違いによる誤った操作もなくなる。
【図１】マイクロチップを示す図であり、（Ａ）と
（Ｂ）はマイクロチップを構成する透明板状部材を示す
平面図、（Ｃ）はマイクロチップの正面図である。
（Ｂ）はマイクロチップを構成する透明板状部材を示す
平面図、（Ｃ）はマイクロチップの正面図である。
【図２】一実施例を示す概略斜視図である。
【図３】同実施例におけるフォトセルアレイを示す回路
図である。
図である。
【図４】同実施例における制御系を示すブロック図であ
る。
る。
【図５】一実施例の動作を示すフローチャート図であ
る。
る。
【図６】一実施例と従来例の動作を示す図であり、
（Ａ）は実施例で分離を停止した状態を示す概略平面
図、（Ｂ）は実施例のクロマトグラムを示す波形図、
（Ｃ）は従来例のエレクトロフェログラムを示す波形図
である。
（Ａ）は実施例で分離を停止した状態を示す概略平面
図、（Ｂ）は実施例のクロマトグラムを示す波形図、
（Ｃ）は従来例のエレクトロフェログラムを示す波形図
である。
【図７】他の実施例の動作を示すフローチャート図であ
る。
る。
１ 光源 ５ マイクロチップ ７ フォトセルアレイ ５１，５２ 透明基板 ５３ リザーバ ５４，５５ 泳動用キャピラリー溝
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平８−233778（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−327593（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−269315（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−304338（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−210960（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−25759（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/447 ＥＣＬＡ
Claims (3)
- 【請求項１】 一対の透明板状部材を備え、少なくとも
一方の板状部材の表面に液が流れる溝が形成され、他方
の板状部材にはその溝に対応する位置に貫通穴が設けら
れ、これら板状部材が前記溝を内側にして貼り合わされ
てその溝により分離流路を形成してなるマイクロチップ
を用い、分離流路に泳動液を満たし、その一端側に試料
を注入し、分離流路の両端間に泳動電圧を印加して試料
を分離流路で電気泳動させる方法において、 試料中の目的成分が分離を完了した段階で泳動電圧の印
加を停止し、 分離流路で目的成分が分離している所定の範囲にわたっ
て光を照射し、その範囲全体にわたって試料による吸収
又は発光を繰り返して測定し、その測定値を分離流路の
各位置ごとに積算することを特徴とするマイクロチップ
電気泳動方法。 - 【請求項２】 一対の透明板状部材を備え、少なくとも
一方の板状部材の表面に液が流れる溝が形成され、他方
の板状部材にはその溝に対応する位置に貫通穴が設けら
れ、これら板状部材が前記溝を内側にして貼り合わされ
てその溝により分離流路を形成してなるマイクロチップ
と、 分離流路の両端間に泳動電圧を印加する泳動電源装置
と、 分離流路の所定の範囲にわたって光を照射する照射手段
と、 分離流路内で分離された目的成分による前記光の吸収ま
たは発光を検出するための、分離流路にそって配列され
た複数個の受光素子を有する光検出手段と、 前記光検出手段による測定を繰り返して行ない、その測
定信号を受光素子ごとに積算した後にデータ処理を行な
うデータ処理・制御部と、を備えたことを特徴とするマ
イクロチップ電気泳動装置。 - 【請求項３】 データ処理・制御部は、試料の拡散係数
及びピークの劣化度をパラメータとして含んで分離流路
での光照射による測定の繰返し回数を計算する計算式を
備えており、前記パラメータが入力されることにより測
定の繰返し回数を自動的に計算し、繰返し測定を制御す
るものである請求項２に記載のマイクロチップ電気泳動
装置。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08307055A JP3077609B2 (ja) | 1996-10-31 | 1996-10-31 | マイクロチップ電気泳動方法及び装置 |
| DE69735745T DE69735745T2 (de) | 1996-10-31 | 1997-10-10 | Verfahren und Vorrichtung zur Elektrophorese auf einem Mikrochip |
| EP97117616A EP0840113B1 (en) | 1996-10-31 | 1997-10-10 | Microchip electrophoretic method and apparatus |
| US08/949,433 US6042708A (en) | 1996-10-31 | 1997-10-14 | Microchip electrophoretic method and apparatus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08307055A JP3077609B2 (ja) | 1996-10-31 | 1996-10-31 | マイクロチップ電気泳動方法及び装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10132783A JPH10132783A (ja) | 1998-05-22 |
| JP3077609B2 true JP3077609B2 (ja) | 2000-08-14 |
Family
ID=17964513
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08307055A Expired - Fee Related JP3077609B2 (ja) | 1996-10-31 | 1996-10-31 | マイクロチップ電気泳動方法及び装置 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6042708A (ja) |
| EP (1) | EP0840113B1 (ja) |
| JP (1) | JP3077609B2 (ja) |
| DE (1) | DE69735745T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6224830B1 (en) | 1998-01-30 | 2001-05-01 | The Governors Of The University Of Alberta | Absorbance cell for microfluid devices |
| WO2000014527A1 (fr) * | 1998-09-02 | 2000-03-16 | Sankyo Company, Limited | Systeme d'electrophorese |
| CA2379125C (en) | 1999-07-02 | 2009-04-07 | Clondiag Chip Technologies Gmbh | Microchip matrix device for duplicating and characterizing nucleic acids |
| JP2001033427A (ja) * | 1999-07-16 | 2001-02-09 | Hitachi Software Eng Co Ltd | 電気泳動方法及び電気泳動装置 |
| JP2001242138A (ja) * | 2000-02-29 | 2001-09-07 | Hitachi Chem Co Ltd | マイクロチップ電気泳動装置 |
| JP2001314187A (ja) * | 2000-03-02 | 2001-11-13 | Hitachi Chem Co Ltd | ベロ毒素遺伝子の検出方法 |
| US7033475B2 (en) * | 2000-10-25 | 2006-04-25 | Shimadzu Corporation | Electrophoretic apparatus |
| US6942773B1 (en) * | 2001-01-26 | 2005-09-13 | The Regents Of The University Of California | Particle sizer and DNA sequencer |
| US20040202575A1 (en) * | 2003-04-09 | 2004-10-14 | Allington Robert W. | Signal to noise ratio in chromatography |
| DE10318219A1 (de) * | 2003-04-22 | 2004-11-11 | Febit Ag | Handhabungs- und Schutzgehäuse für einen Biochip, insbesondere für einen mikrofluidischen Reaktionsträger |
| US20080258086A1 (en) * | 2004-09-03 | 2008-10-23 | Alan Mathewson | Optical Detector |
| JP5075150B2 (ja) * | 2009-03-17 | 2012-11-14 | 富士フイルム株式会社 | 検出方法および検出システム |
| JP6308607B2 (ja) * | 2012-11-02 | 2018-04-11 | ファインバイオメディカル有限会社 | カテーテルシミュレータ、光弾性効果観察装置、薄板状モデル及び保持具。 |
| CN114354729B (zh) * | 2022-03-18 | 2022-06-21 | 南昌大学 | 毛细管电泳检测装置 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE68911856T2 (de) * | 1988-10-19 | 1994-06-01 | Res Ass Petroleum Alternat Dev | Verfahren zur Hydrogenierung von Schwerölen. |
| US5395502A (en) * | 1988-11-14 | 1995-03-07 | Anthony R. Torres | Apparatus for performing and universally detecting capillary isoelectric focusing without mobilization using concentration gradient imaging systems |
| JPH07503068A (ja) * | 1992-01-13 | 1995-03-30 | トーレス アントニー アール． | 密度グラジエント造画システムを使用した非移動式の毛管等電フォーカス処理を実施して普遍的に検出する方法及び装置 |
| US5784154A (en) * | 1992-01-13 | 1998-07-21 | Anthony R. Torres | Electrophoresis separation in a capillary passage |
| SE500702C2 (sv) * | 1992-04-07 | 1994-08-15 | Staffan Birnbaum | Sätt och anordning för optisk analys av prov separerade i tunna kapillärer |
| EP0687358B1 (en) * | 1993-03-05 | 1997-05-07 | PAWLISZYN, Janusz B. | Method and device for isoelectric focusing without carrier ampholytes |
| DE69409626T2 (de) * | 1994-01-28 | 1998-11-05 | Hewlett Packard Gmbh | Kapillar aus Kunststoff für Kapillarelektroforese und Verfahren zu dessen Herstellung |
| AU2275097A (en) * | 1996-02-20 | 1997-09-02 | Waters Investments Limited | Capillary chromatography detector apparatus |
-
1996
- 1996-10-31 JP JP08307055A patent/JP3077609B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-10-10 DE DE69735745T patent/DE69735745T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-10 EP EP97117616A patent/EP0840113B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-14 US US08/949,433 patent/US6042708A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0840113A3 (en) | 1999-08-18 |
| EP0840113B1 (en) | 2006-04-26 |
| JPH10132783A (ja) | 1998-05-22 |
| DE69735745T2 (de) | 2007-04-12 |
| US6042708A (en) | 2000-03-28 |
| EP0840113A2 (en) | 1998-05-06 |
| DE69735745D1 (de) | 2006-06-01 |
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