JP3072895B2 - 精製された霊長類ｃｔｌａ−８抗原および関連する試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、多くの器官および
いくつかの異なるタイプの細胞からなる脊椎動物の免疫
系の分野に関する。また、本発明は、特定のサイトカイ
ンによる、免疫系、造血細胞、ならびに他のタイプの細
胞に影響する変性状態についての治療の分野に関する。

【０００２】

【従来の技術】脊椎動物の免疫系は、多くの器官および
いくつかの異なるタイプの細胞からなる。２つの主要な
細胞のタイプは、骨髄様系統およびリンパ球様系統を包
含する。リンパ球様細胞系統には、Ｂ細胞（起源を、胎
児の肝臓または成人の骨髄での分化として特徴づけられ
る）およびＴ細胞（起源を、胸腺での分化として特徴づ
けられる）がある。例えば、Paul（編）（1993）Fundam
ental Immunology（第３版） Raven Press,New Yorkを
参照のこと。

【０００３】免疫応答または細胞分化の発達の多くの局
面で、サイトカインとして公知の可溶性タンパク質が、
細胞相互作用の調節において極めて重要な役割を行う。
これらのサイトカインは、明らかに、多くの方法で細胞
活性を仲介する。それらは多くの場合において、造血幹
細胞の増殖、成長、および免疫応答の原因である細胞系
統を構成する莫大な数の前駆細胞（progenitor）への分
化を調整することが明らかにされている。

【０００４】しかし、これらの成熟経路において、異な
る発達段階の細胞により発現される細胞分子は、まだ完
全には同定されていない。さらに、これらの細胞の種々
の生理学的状態、発達状態、または増殖状態を誘導、維
持、または調整するシグナル分子の作用の役割および機
構は、わずかしか理解されていない。明らかに、免疫
系、および種々のストレスに対するその応答は、医学
（例えば、炎症、感染疾患、ガン関連応答および治療、
アレルギー応答および移植拒絶反応）に関連した。Thor
nら、Harrison's Principles of Internal Medicine Mc
Graw/Hill,New Yorkを参照されたい。

【０００５】医科学は、大きな度合いで、環境要因への
不十分なまたは不適切な生理学的応答についての治療を
行うにおいて、免疫系の適切な動員または抑制に依存す
る。しかし、どのように免疫系が調節されまたは分化す
るのかについての理解の欠如は、生物学的攻撃（challe
nge）への正常な防御機構を有利に調整する能力を妨げ
てきた。従って、関連する細胞の発達または生理の異常
なまたは不適切な調節により特徴づけられる医学的状態
は、処理不能のままである。特定のサイトカインの発見
および特徴づけは、免疫系、造血細胞ならびに他のタイ
プの細胞に影響する広範囲の変性状態または他の状態に
ついての治療法の開発に貢献する。本発明はこれらおよ
び他の多くの問題のいくつかに対する解答を提供する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】霊長類由来のCTLA-8抗
原、これに関連する試薬であって精製タンパク質、特異
的抗体、およびこの抗体をコードする核酸を包含する試
薬、この試薬を使用する方法およびキットを提供するこ
とが、本発明の課題である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の１つの局面にお
いて、炎症性の媒介物の分泌を誘導し得る、配列番号８
のアミノ酸26〜156を含む霊長類CTLA-8タンパク質をコ
ードする核酸と少なくとも95％同一である核酸が提供さ
れる。

【０００８】本発明の別の局面において、炎症性の媒介
物の分泌を誘導し得る、配列番号８のアミノ酸26〜156
に少なくとも95％同一であるアミノ酸を有する、実質的
に純粋な霊長類CTLA-8タンパク質またはそのペプチドが
提供される。

【０００９】本発明のさらに別の局面において、炎症性
の媒介物の分泌を誘導し得る、配列番号８のアミノ酸配
列26〜156に少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を
有するCTLA-8タンパク質による異常な発現または異常な
シグナル伝達に関連する異常な生理状態または発生状態
の診断のための、上記のタンパク質に対するモノクロー
ナル抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する
組成物が提供される。

【００１０】本発明のなおさらに別の局面において、炎
症性の媒介物の分泌を誘導し得る、配列番号８のアミノ
酸配列26〜156に少なくとも95％同一であるアミノ酸配
列を有するCTLA-8タンパク質による異常な発現または異
常なシグナル伝達に関連する異常な生理状態または発生
状態の処置のための、上記のタンパク質に対するモノク
ローナル抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有
する組成物が提供される。

【００１１】本発明は、一部は、サイトカイン様タンパ
ク質をコードするcDNAクローンの発見に基づく。このタ
ンパク質はヒトCTLA-8と呼ばれている。本発明は、本発
明のタンパク質をコードする単離された遺伝子、コード
されたタンパク質の変種（variant）（例えば、天然配
列の変異（突然変異タンパク質）種変種（species vari
ant）および対立遺伝子変種）、融合タンパク質、化学
的模擬体（chemical mimetics）、抗体、および他の構
造的または機能的アナログを包含する。これら異なる核
酸またはタンパク質組成物の種々の使用もまた提供され
る。

【００１２】本発明は、霊長類CTLA-8タンパク質または
そのフラグメントをコードする核酸と少なくとも95％の
同一性を有する核酸を提供する。コード核酸は配列番号
３、５または７の配列を含み得る。

【００１３】本発明はまた、実質的に純粋な霊長類CTLA
-8タンパク質またはそのペプチドを提供する。このタン
パク質またはペプチドは、配列番号４、６または８の少
なくとも１つのポリペプチドセグメントを含有し得る
か；天然の霊長類CTLA-8タンパク質と異なる翻訳後改変
パターンを示し得るか；または炎症メディエーター（例
えば、IL-6、IL-8、および/またはPGE2）を分泌するよ
う細胞を誘導し得る。さらなる実施態様は、このような
タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアーを含有
する組成物である。

【００１４】本発明は、霊長類CTLA-8タンパク質または
そのペプチドに特異的に結合する抗体を包含する；この
抗体は、配列番号４、６、または８のタンパク質配列に
対して生じるか；この抗体はモノクローナル抗体である
か；この抗体は炎症メディエーター（例えば、IL-6、IL
-8、および/またはPGE2）のCTLA-8誘導分泌をブロック
するか；あるいはこの抗体は標識される。

【００１５】本発明はまた、霊長類CTLA-8タンパク質ま
たはペプチドをコードする核酸に少なくとも95％同一
な、実質的に純粋な核酸；実質的に純粋な霊長類CTLA-8
タンパク質またはフラグメント（例えば、ポジティブコ
ントロールとして）；または霊長類CTLA-8タンパク質に
特異的に結合する抗体またはレセプターを含むキットを
包含する。

【００１６】これらの試薬の有用性（availability）は
また、細胞の生理または発達を調整する方法であって、
この細胞をCTLA-8タンパク質のアゴニストまたはアンタ
ゴニストと接触させることを包含する方法を提供する。
調整方法は、哺乳類CTLA-8タンパク質に特異的に結合す
る抗体または実質的に純粋な哺乳類CTLA-8タンパク質と
細胞または組織とを接触させることにより、炎症メディ
エーター（例えば、IL-6、IL-8、および/またはPGE2）
のCTLA-8誘導分泌を調節することを包含する。

【００１７】

【発明の実施の形態】概論 本発明は、Ｔ細胞により発現される機能的に重要な分子
に特有の性質を示す種々の霊長類タンパク質をコードす
るDNA配列を提供する。このcDNA配列は、サイトカイ
ン、成長因子、およびガン遺伝子をコードするmRNAに特
有の種々の特徴を示す。本明細書に記載されるヒト遺伝
子は、予測される155アミノ酸タンパク質をコードする
オープンリーディングフレームを含む。このタンパク質
は、ウイルスゲノム、ヘルペスウイルスSaimiri ORF13
によりコードされる推定タンパク質に66.4％相同であ
る。

【００１８】これらのタンパク質はCTLA-8タンパク質と
呼ばれる。類似のCTLA-8タンパク質をコードするマウス
cDNAは、Rouvierら（1993）J.Immunol.150:5445-5456に
より記載された。天然タンパク質は、標的細胞において
生物学的または生理学的応答に至る種々の生理学的応答
を仲介し得るはずである。初期の研究は、このタンパク
質をコードするメッセージを造血細胞の種々の細胞株に
限局した。この抗原をコードする遺伝子は、ヒト染色体
2q31およびマウス染色体1Aにマッピングされた。以下の
記載は、例示的な目的のために、ヒトCTLA-8タンパク質
に関するが、他の霊長類からの関連する実施態様に同様
に適用し得る。

【００１９】核酸 配列番号５〜８は、ヒトCTLA-8タンパク質のヌクレオチ
ド配列およびアミノ酸配列ならびにそのフラグメントを
開示している。記載されたヌクレオチド配列および関連
する試薬は、霊長類CTLA-8タンパク質を発現するに、あ
るいは例えば、別の天然の供給源から相同な遺伝子を単
離するに有用なDNAクローンの構築に有用である。代表
的には、この配列は、ヒトから他の遺伝子（例えば、対
立遺伝子変種）を単離するのに有用であり、そして同様
な手順が他の種（例えば、他の霊長類）から遺伝子を単
離するために適用される。クロスハイブリダイゼーショ
ンは、他の霊長類種からの遺伝子の単離を可能にする。
多くの異なるアプローチが、他の供給源からの適切な核
酸クローンの単離を成功させるに利用可能である。

【００２０】精製タンパク質または規定されたペプチド
は、上記のように、標準的な方法により抗体を作成する
のに有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質
は、特定の結合組成物（例えば、モノクローナル抗体ま
たはポリクローナル抗体）を作成するために免疫系に提
示され得る。例えば、Coligan（1991）Current Protoco
ls in Immunology Wiley/Greene；およびHarlowおよびL
ane（1989）Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spr
ing Harbor Pressを参照のこと。

【００２１】例えば、特定の結合組成物は、CTLA-8タン
パク質を発現する霊長類細胞株から作製された発現ライ
ブラリーのスクリーニングのために使用され得る。スク
リーニングは、表面発現タンパク質の標準的な染色であ
り得るかまたはパンニングにより得る。細胞内発現のス
クリーニングはまた、種々の染色または免疫蛍光手順に
より行われ得る。結合組成物は、このタンパク質を発現
する細胞をアフィニティー精製または選別するために使
用され得る。

【００２２】本発明は、単離されたDNAまたはフラグメ
ントの、生物学的に活性な対応するCTLA-8タンパク質ま
たはポリペプチドをコードするための使用を意図してい
る。あるいは、完全には同一でない核酸は、CTLA-8をコ
ードする核酸にハイブリダイズするプローブとして使用
され得る。さらに、本発明は、生物学的に活性なタンパ
ク質またはポリペプチドをコードする単離されたDNAま
たは組換えDNA、および適切な条件下で本明細書中に記
載されるDNA配列とハイブリダイズし得る単離されたDNA
または組換えDNAをカバーする。この生物学的に活性な
タンパク質またはポリペプチドは、インタクトな抗原、
またはフラグメントであり得、そして配列番号６または
８に開示されるアミノ酸配列を有する。さらに、本発明
は、単離されたDNAまたは組換えDNA、またはそのフラグ
メントの使用を包含する。ここで、このDNAは、霊長類C
TLA-8タンパク質に相同なタンパク質をコードするか、
または適切な条件下で、霊長類CTLA-8タンパク質をコー
ドするcDNAをプローブとして用いて単離された。単離さ
れたDNAは、５'および３'側面にそれぞれ調節配列（例
えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナ
ルおよびその他）を有し得る。特に、ヒトCTLA-8遺伝子
は、ヘルペスウイルスSaimiriのオープンリーディング
フレームORF13によりコードされる推定のタンパク質
（配列番号４）に66.4％の顕著な同一性を有し、そして
マウスCTLA-8の対応部分（配列番号２）には約60％の同
一性を有する。

【００２３】「単離された」核酸は、本来（native）の
配列に自然に付随する他の成分（例えば、起源の種由来
のリボソーム、ポリメラーゼ、および側面に位置するゲ
ノム配列）から実質的に分離された核酸（例えば、RN
A、DNA、または混合ポリマー）である。この用語は、自
然に生じる環境から取り出された核酸配列を包含し、そ
して組換えまたはクローン化DNA単離体、および化学的
に合成されるアナログまたは異種系（heterologous sys
tem）により生物学的に合成されるアナログを包含す
る。実質的に純粋な分子は、単離された形態の分子を包
含する。あるいは、精製種は、組換え発現系由来の宿主
成分から分離され得る。このような核酸の相同性のサイ
ズは、代表的には大きなベクターより小さく、例えば、
数十kBより小さく、代表的には数kBより小さく、そして
好ましくは２〜６kBの範囲である。

【００２４】単離された核酸は、一般的には、分子の同
質な組成物であるが、しかしいくつかの実施態様におい
ては、少量の異成分を含む。この異成分は、代表的に
は、ポリマー末端部、または所望の生物学的な機能また
は活性に重要ではない部分に見出される。

【００２５】「組換え」核酸は、その生成方法またはそ
の構造のいずれかにより定義される。その生成方法につ
いては、例えば、あるプロセスにより作製された生成物
をいうが、そのプロセスは、組換え核酸技術（例えば、
ヌクレオチド配列におけるヒトの介入、代表的には選択
または生成を含む）の使用である。もしくは、組換え核
酸は、天然には互いに隣接していない２つのフラグメン
トの融合を含む配列を生成することにより作製される核
酸であり得るが、しかし天然の生成物（例えば、自然に
発生する変異体）を除外することを意味する。従って、
任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを使用して誘導
される配列を含む核酸のように、例えば、任意の非自然
発生ベクターでの細胞の形質転換により作製された生成
物が包含される。このようなことは、コドンを、同じア
ミノ酸または保存アミノ酸をコードする重複コドンで置
換するためにしばしば行われる一方、代表的には、配列
認識部位を導入または除去される。あるいは、所望の機
能の核酸セグメントを結合し、一般的に利用可能な天然
形態では見出されない、機能の所望の組み合わせを含む
単一の遺伝実体（entity）を作成することが行われる。
制限酵素認識部位は、しばしばこのような人工的な操作
の標的であるが、しかし他の部位特異的標的（例えば、
プロモーター、DNA複製部位、調節配列、制御配列）ま
たは他の有用な特徴が設計により取り込まれ得る。同様
の概念が、組換え（例えば、融合）ポリペプチドについ
て意図される。これらの抗原のフラグメントに類似する
ポリペプチドを、遺伝子コードの重複性によりコードす
る合成核酸、および種々の異なる霊長類種の変種に由来
する配列の融合体が、特に包含される。

【００２６】核酸については有意な「フラグメント」と
は、少なくとも約17ヌクレオチド、一般的には少なくと
も約20ヌクレオチド、さらに一般的には少なくとも約23
ヌクレオチド、通常少なくとも約26ヌクレオチド、さら
に通常は少なくとも約29ヌクレオチド、しばしば少なく
とも約32ヌクレオチド、さらにしばしば少なくとも約35
ヌクレオチド、代表的には少なくとも約38ヌクレオチ
ド、さらに代表的には少なくとも約41ヌクレオチド、通
例少なくとも約44ヌクレオチド、さらに通例少なくとも
約47ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約50ヌクレオ
チド、さらに好ましくは約53ヌクレオチド、そして特に
好ましい実施態様においては少なくとも約56またはそれ
以上のヌクレオチドの連続セグメントである。これらの
フラグメントは、遺伝子、好ましくはコード配列（例え
ば、mRNAの）内の実質的に任意の位置で始まり得るかま
たは終わり得る。

【００２７】CTLA-8タンパク質をコードするDNAは、関
連するかまたは相同なタンパク質をコードする遺伝子、
mRNA、およびcDNA種、ならびに異なる霊長類種由来の相
同なタンパク質をコードするDNAを同定するのに特に有
用である。種々の霊長類CTLA-8タンパク質は相同であ
り、本明細書中に包含される。しかし、この抗原とより
遠い進化の関係を有するタンパク質でさえ、これらが十
分に相同である場合には、これらの配列を用いて適切な
条件下で容易に単離され得る。

【００２８】本発明はさらに、本明細書中に記載の単離
されたDNAに同一かまたは高度に相同なDNA配列を有す
る、組換えDNA分子およびフラグメントをカバーする。
特に、この配列はしばしば、転写、翻訳、およびDNA複
製を制御するDNAセグメントに作動可能に連結される。
あるいは、ゲノム配列（例えば、イントロンを含む）由
来の組換えクローンは、トランスジェニック研究（例え
ば、トランスジェニック細胞および微生物を包含する）
および遺伝子療法に有用である。例えば、 Roitt（編）
Encyclopedia of Immunology Academic Press、San Die
go、pp.1502-1504のGoodnow（1992）「Transgenic Anim
als」；Travis（1992）Science 256:1392-1394；Kuhn
ら.（1991）Science 254:707-710；Capecchi（1989）Sc
ience 244:1288；Robertson（1987）（編）Teratocarci
nomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approac
hIRL Press、Oxford；Rosenberg（1992）J.Clinical On
cology 10:180-199；およびCournoyerおよびCaskey（19
93）Ann.Rev.Immunol.11:297-329を参照されたい。

【００２９】相同な核酸配列は、比較した場合、顕著な
類似性または同一性を示す。核酸における相同性の基準
は、当該分野で一般に使用される、配列比較による相同
性の量（measure）であるかまたはハイブリダイゼーシ
ョン条件に基づくかのどちらかである。ハイブリダイゼ
ーション条件は以下にさらに詳細に記載される。

【００３０】核酸配列比較についての実質的な相同性
は、比較した場合に、セグメントまたはそれらの相補的
な鎖が、適切なヌクレオチド挿入または削除を伴って最
適に並べられる場合、少なくとも約70％のヌクレオチ
ド、一般には少なくとも約75％、普通少なくとも約79
％、しばしば少なくとも約83％、代表的には少なくとも
約87％、通常少なくとも約90％、好ましくは少なくとも
約92％、さらに好ましくは少なくとも約95〜約98％また
はそれ以上、そして特定の実施態様においては、約99％
またはそれ以上のヌクレオチドで同一であることを意味
する。あるいは、セグメントが、選択的なハイブリダイ
ゼーション条件下で、鎖またはその相補体（代表的に
は、配列番号３、５または７由来の配列を使用する）に
ハイブリダイズする場合、実質的な相同性が存在する。
代表的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なく
とも約14ヌクレオチドのストレッチ（stretch）におい
て少なくとも約55％、好ましくは少なくとも約65％、さ
らに好ましくは少なくとも約75％、そして最も好ましく
は少なくとも約90％の相同性が存在する場合に起こる。
Kanehisa（1984）Nuc.Acids Res.12:203-213を参照され
たい。相同性比較の長さは、記載されるように、より長
いストレッチについてであり得、そして特定の実施態様
においては、少なくとも約17ヌクレオチド、通常少なく
とも約20ヌクレオチド、さらに通常は少なくとも約24ヌ
クレオチド、代表的には少なくとも約28ヌクレオチド、
さらに代表的には少なくとも約40ヌクレオチド、好まし
くは少なくとも約50ヌクレオチド、そしてさらに好まし
くは少なくとも約75〜100またはそれ以上のヌクレオチ
ドのストレッチについてである。本発明は、長さ、同一
性量、およびフラグメントの終点のすべての組合わせを
提供する。上記参照のこと。

【００３１】ハイブリダイゼーションについての相同性
を言う場合、ストリンジェントな条件は、塩、温度、有
機溶媒、および他のパラメーター（代表的にはハイブリ
ダイゼーション反応において制御される）のストリンジ
ェントな組合わされた条件である。ストリンジェントな
温度条件は、通常約30℃を超過する、さらに通常は約37
℃を超過する、代表的には約45℃を超過する、さらに代
表的には約55℃を超過する、好ましくは約65℃を超過す
る、そしてさらに好ましくは約70℃を超過する温度を包
含する。ストリジェントな塩条件は、普通約1000mM未
満、通常約500mM未満、さらに通常約400mM未満、代表的
には約300mM未満、好ましくは約200mM未満、そしてさら
に好ましくは約150mM未満である。しかし、パラメータ
ーの組合わせは、どの一つのパラメーターの量よりもは
るかに重要である。例えば、WetmurおよびDavidson（19
68）J.Mol.Biol.31:349-370を参照のこと。

【００３２】他の霊長類種由来のCTLA-8タンパク質は、
近縁の種（closely related species）の種間ハイブリ
ダイゼーション（cross-species hybridization）によ
りクローニングおよび単離され得る。遠縁の種（distan
tly related species）間では、相同性は比較的低くあ
り得、従って比較的近縁の種のハイブリダイゼーション
が望ましい（advisable）。あるいは、より低い種特異
性を示す抗体調製物の調製が発現クローニングアプロー
チにおいて有用であり得る。

【００３３】精製霊長類CTLA-8タンパク質 マウスCTLA-8の予測されるタンパク質配列は配列番号２
に示される。相同な、ヘルペスウイルスの予測されるOR
F13タンパク質配列は配列番号４に示される。ヒトの対
応部分の予測される配列は配列番号８に示される。ペプ
チド配列は、ペプチドの調製物がこのようなセグメント
を認識する抗体を生成することを可能にする。

【００３４】本明細書において使用される場合、用語
「ヒトCTLA-8タンパク質」は、タンパク質について使用
される場合には、配列番号８に示されるアミノ酸配列を
有するタンパク質、またはこのようなタンパク質の有意
なフラグメント（例えば、配列番号６）を包含する。こ
れはまた、同様な生物学的機能を示すかまたはCTLA-8タ
ンパク質特異的結合成分と相互作用するヒト由来ポリペ
プチドをもいう。これらの結合成分（例えば、抗体）
は、代表的にはCTLA-8タンパク質と高い親和性、例え
ば、少なくとも約100nM、通常約30nMより良く、好まし
くは約10nMより良く、そしてさらに好ましくは約３nMよ
り良い親和性で結合する。相同なタンパク質は、ヒト以
外の哺乳類種（例えば、ラット、マウス、霊長類）、お
よびヘルペスウイルスゲノム（例えば、ORF13）で見出
される。非哺乳類種もまた、構造的または機能的に関連
する遺伝子およびタンパク質を有する。

【００３５】本明細書中で使用されるように用語「ポリ
ペプチド」は、有意なフラグメントまたはセグメントを
包含し、そして少なくとも約８アミノ酸、一般的には少
なくとも約10アミノ酸、さらに一般的には少なくとも約
12アミノ酸、しばしば少なくとも約14アミノ酸、さらに
しばしば少なくとも約16アミノ酸、代表的には少なくと
も約18アミノ酸、さらに代表的には少なくとも約20アミ
ノ酸、通常少なくとも約22アミノ酸、さらに通常は少な
くとも約24アミノ酸、好ましくは少なくとも約26アミノ
酸、さらに好ましくは少なくとも約28アミノ酸、そして
特に好ましい実施態様においては少なくとも約30または
それ以上のアミノ酸からなるアミノ酸残基のストレッチ
を包含する。

【００３６】用語「結合組成物」は、霊長類CTLA-8タン
パク質に特異的に（例えば、リガンド-レセプタータイ
プ様式、抗体-抗原相互作用で）結合する分子、あるい
は化合物、例えば、CTLA-8タンパク質と特異的に結合す
るタンパク質（例えば、天然の生理学的に関係する自然
のタンパク質-タンパク質相互作用（共有結合または非
共有結合のどちらか）で）をいう。この分子はポリマ
ー、または化学的試薬であり得る。CTLA-8タンパク質
が、リガンド-レセプター相互作用のリガンドまたはレ
セプターのどちらかであるかについての暗示は、その相
互作用が同様な特異性（例えば、特異的親和性）を示す
ということ以外には示されていない。機能的アナログ
は、構造的な改変を有するタンパク質であり得るか、ま
たは全く無関係な分子（例えば、適切な結合決定基と相
互作用する分子形状を有する）であり得る。タンパク質
はレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして
働き得る。例えば、Goodmanら（編）（1990）Goodman&G
ilman's：The Pharmacological Bases of Therapeutics
（第８版）、Pergamon Pressを参照のこと。

【００３７】ポリペプチドまたはフラグメントの溶解性
は、環境およびそのポリペプチドに依存する。温度、電
解質環境、ポリペプチドのサイズおよび分子特性、およ
び溶媒の性質を包含する多くのパラメーターがポリペプ
チドの溶解性に影響を与える。代表的には、ポリペプチ
ドが使用される温度は約４℃〜約65℃の範囲である。通
常、使用温度は約18℃より高く、そしてさらに通常は約
22℃より高い。診断目的については、温度は、通常、室
温付近またはそれより暖かいが、アッセイにおける成分
の変性温度より低い。治療目的については、通常、体温
（代表的にはヒトについては約37℃）であるが、特定の
状況下では、温度はインサイチュウまたはインビトロで
上昇または低下させ得る。

【００３８】電解質は、通常、インサイチュウでの生理
学的条件にほぼ等しいが、有利な場合には、より高いか
またはより低いイオン強度に改変され得る。実際のイオ
ンは、例えば、生理学的または分析について使用される
標準緩衝液に適応するように改変され得る。

【００３９】ポリペプチドのサイズおよび構造は、一般
的には、実質的に安定な状態にあるべきであり、そして
通常は、変性状態にあるべきではない。このポリペプチ
ドは、４次構造で他のポリペプチドと会合し得、例え
ば、溶解性を与えるか、または天然の脂質二重層相互作
用に近い方法で、脂質または界面活性剤と会合し得る。

【００４０】溶媒は通常、生物学的活性の保存のために
使用されるタイプの生物学的に適合する緩衝液であり、
そして通常、生理学的溶媒に近い。通常、溶媒は中性の
pH、代表的には約５と10の間、好ましくは約7.5のpHを
有する。いくつかの場合、代表的にはマイルドな非変性
界面活性剤（例えば、CHSまたはCHAPS）か、または抗原
の構造的または生理学的特性の顕著な崩壊を避ける十分
に低い濃度で、界面活性剤が添加される。

【００４１】溶解性は、Svedberg単位で測定される沈降
により反映される。Svedberg単位は、特定の条件下での
分子の沈降速度の尺度である。沈降速度の測定は、古典
的には分析用超遠心機において行われたが、現在は、代
表的には標準超遠心機において行われる。Freifelder
（1982）Physical Biochemistry（第２版）、W.H.Freem
an；およびCantorおよびSchimmel（1980）Biophysical
Chemistry、１〜３部、W.H.Freeman&Co.、San Francisc
oを参照のこと。粗測定（crude determination）とし
て、推定の可溶性ポリペプチドを含有するサンプルを、
標準フルサイズ超遠心機において、約50Ｋrpmで約10分
間回転させる。そして可溶性分子は上清に留まる。可溶
性粒子またはポリペプチドは、代表的には約30Ｓより小
さく、さらに代表的には約15Ｓより小さく、通常約10Ｓ
より小さく、さらに通常は約６Ｓより小さく、そして特
定の実施態様においては、好ましくは約４Ｓより小さ
く、さらに好ましくは約３Ｓより小さい。

【００４２】霊長類CTLA-8タンパク質の作製；模擬体 霊長類CTLA-8タンパク質またはそのフラグメントをコー
ドするDNAは、化学的合成、cDNAライブラリーのスクリ
ーニング、または広範囲の細胞株または組織サンプルか
ら調製されたゲノムライブラリーのスクリーニングによ
り得られ得る。

【００４３】このDNAは、次に例えばポリクローナルま
たはモノクローナル抗体を作成するために使用され得る
完全長のタンパク質またはフラグメントの合成のため
に；結合研究のために；改変分子の構築および発現のた
めに；および構造/機能研究のために広範囲の宿主細胞
で発現され得る。それぞれの抗原またはそのフラグメン
トは、適切な発現ベクターで形質転換またはトランスフ
ェクトされた宿主細胞で発現され得る。これらの分子
は、組換え宿主由来のタンパク質または細胞夾雑物以外
のタンパク質または細胞夾雑物を含まないように実質的
に精製され得る。それゆえ、これらの分子は、薬学的に
受容可能なキャリアーおよび/または希釈剤と組み合わ
せた場合、薬学的組成物において特に有用である。抗原
またはその部分は、他のタンパク質との融合物として発
現され得る。

【００４４】発現ベクターは、代表的には、所望の抗原
遺伝子またはそのフラグメントを含有する自己複製DNA
またはRNA構築物であり、通常、適切な宿主細胞におい
て認識される適切な遺伝子制御要素に作動可能に連結さ
れている。これら制御要素は、適切な宿主内で発現を達
成し得る。発現を達成するに必要な特定のタイプの制御
要素は、使用される最終の宿主細胞に依存する。一般的
に、遺伝子制御要素は、原核生物プロモーター系または
真核生物プロモーター発現制御系を包含し得、代表的に
は、転写プロモーター、転写の開始を制御する任意のオ
ペレーター、mRNA発現のレベルを上昇させる転写エンハ
ンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、
および転写および翻訳を終了させる配列を包含する。発
現ベクターはまた、通常、宿主細胞とは独立してベクタ
ーが複製するのを可能にする複製起点を含有する。ま
た、ベクターコピー数を増幅させる方法もまた公知であ
り、Kaufmanら、（1985）Molec.and Cell.Biol. 5:1750
-1759を参照されたい。

【００４５】本発明のベクターは、霊長類CTLA-8タンパ
ク質をコードするDNAまたはそのフラグメント（代表的
には、生物学的に活性なポリペプチドをコードする）を
含有する。このDNAは、ウイルスプロモーターの制御下
にあり得、そして選択マーカーをコードし得る。本発明
はさらに、原核生物宿主または真核生物宿主においてCT
LA-8タンパク質をコードする真核生物cDNAを発現し得
る、このような発現ベクターの使用を意図する。ここ
で、このベクターは宿主に適合し、そして抗原をコード
する真核生物cDNAがこのベクターに挿入され、このベク
ターを含有する宿主の成長が、目的のcDNAを発現する。
通常、発現ベクターは、それらの宿主細胞での安定な複
製のために、または細胞あたりの所望の遺伝子のコピー
総数を大きく増加させる増幅のために設計される。発現
ベクターが宿主細胞中で複製することを要求すること
は、必ずしも必要ではない。例えば、宿主細胞により認
識される複製起点を含有しないベクターを使用して、種
々の宿主で抗原またはそのフラグメントの一過性の発現
を達成させることは可能である。組換えによる、CTLA-8
タンパク質遺伝子またはそのフラグメントの宿主DNAへ
の組み込みを引き起こすベクターを使用すること、また
は内因性遺伝子の発現を制御するプロモーターを組み込
むこともまた、可能である。

【００４６】本明細書で使用されるように、ベクター
は、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み
込み可能DNAフラグメント、およびDNAフラグメントの宿
主ゲノムへの組み込みを可能にする他のビヒクル（vehi
cle）を包含する。発現ベクターは、作動可能に連結さ
れた遺伝子の発現を達成する遺伝子制御要素を含有する
特殊化されたベクターである。プラスミドは、最も一般
的に使用される形態のベクターであるが、同等の機能を
果たす他の形態のベクター、および当該分野で公知の、
または公知になりつつあるすべての他の形態のベクター
が本明細書中での使用に適切である。例えば、Pouwels
ら、（1985および補遺）Cloning Vectors:ALaboratory
Manual、Elsevier、N.Y.、およびRodriquezら、（198
8）（編）Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vec
tors and Their Uses、Buttersworth、Boston、MAを参
照のこと。

【００４７】形質転換された細胞は、CTLA-8遺伝子を含
有するベクター（代表的には、組換えDNA技術を使用し
て作製された）で形質転換またはトランスフェクトされ
た細胞、好ましくは哺乳類の細胞を包含する。形質転換
された宿主細胞は通常、抗原またはそのフラグメントを
発現するが、そのDNAのクローニング、増幅、および操
作の目的のためには、タンパク質を発現する必要はな
い。本発明はさらに、形質転換された細胞を栄養培地で
培養すること、従ってタンパク質を培養物中に畜積させ
ることを意図している。このタンパク質は培養物中また
は培養培地のいずれかから回収され得る。

【００４８】本発明の目的のためには、DNA配列は、そ
れらが互いに機能的に関連する場合、作動可能に連結さ
れる。例えば、プレ配列（presequence）または分泌リ
ーダーのDNAは、それがプレタンパク質として発現され
るか、またはポリペプチドを細胞膜に指向させることま
たはポリペプチドの分泌に関与する場合には、そのペプ
チドに作動可能に連結される。プロモーターは、それが
ポリペプチドの転写を制御する場合、コード配列に作動
可能に連結される；リボソーム結合部位は、それが翻訳
を可能にするように置かれる場合、コード配列に作動可
能に連結される。通常、作動可能に連結されるとは、隣
接し、そしてリーディングフレーム内にあることを意味
する。しかし、リプレッサー遺伝子のような特定の遺伝
子要素は、隣接して連結しないが、それでもやはりオペ
レーター配列（これは、次には発現を制御する）に結合
する。

【００４９】適切な宿主細胞は、原核生物、下等真核生
物、および高等真核生物を含む。原核生物は、グラム陰
性およびグラム陽性微生物の両方（例えば、E.coliおよ
びB.subtilis）を包含する。下等原核生物は酵母（例え
ば、S.cerevisiaeおよびPichia）、およびDictyosteliu
m属の種を包含する。高等真核生物は、非哺乳類起源
（例えば、昆虫細胞、および鳥類）および哺乳類起源
（例えば、ヒト、霊長類、および齧歯類）の両方の動物
細胞由来の確立された組織培養細胞株を包含する。

【００５０】原核生物宿主-ベクター系は、多くの異な
る種のための広範で多様なベクターを包含する。本明細
書で使用されるように、E.coliおよびそのベクターが一
般的に使用され、他の原核生物で使用される同等なベク
ターを含む。DNAを増幅するのための代表的なベクター
は、pBR322または多くのその誘導体である。CTLA-8タン
パク質またはそのフラグメントを発現するために使用さ
れ得るベクターは、lacプロモーター（pUCシリーズ）；
trpプロモーター（pBR322-trp）；Ippプロモーター（pI
Nシリーズ）；lambda-pPまたはpRプロモーター（pOT
S）；またはptac（pDR540）のようなハイブリッドプロ
モーターを含有するようなベクターを包含するが、これ
らに限定されない。 RodriguezおよびDenhardt（編）Ve
ctors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Th
eir Uses、Buttersworth、Boston、第10章、205〜236頁
のBrosiusら（1988）「Lambda-、trp-、lac-、およびIp
p-由来プロモーターを用いる発現ベクター」を参照のこ
と。

【００５１】下等真核生物（例えば、酵母およびDictyo
stelium）は、CTLA-8タンパク質をコードするベクター
で形質転換され得る。本発明の目的のために、最も一般
的な下等真核生物宿主は、パン酵母、Saccharomyces ce
revisiaeである。他の多くの株および種もまた利用可能
であるが、これが一般的に下等真核生物を代表して使用
される。酵母ベクターは、代表的には複製起点（組み込
みタイプでない場合）、選択遺伝子、プロモーター、所
望のタンパク質またはそのフラグメントをコードするDN
A、および翻訳終了、ポリアデニル化、および転写終了
の配列からなる。酵母に適切な発現ベクターは、3-ホス
ホグリセリン酸キナーゼおよび他の種々の解糖酵素遺伝
子プロモーターのような構成プロモーター、またはアル
コールデヒドロゲナーゼ２プロモーターまたはメタロチ
オネイン（metallothionine）プロモーターのような誘
導可能プロモーターを包含する。適切なベクターは以下
のタイプの誘導体を包含する：自己複製低コピー数（例
えば、YRp-シリーズ）、自己複製高コピー数（例えば、
YEp-シリーズ）、組み込みタイプ（例えば、YIp-シリー
ズ）、またはミニクロモソーム（例えば、YCp-シリー
ズ）。

【００５２】高等真核生物の組織培養細胞は、機能的に
活性なCTLA-8タンパク質の発現に好ましい宿主細胞であ
る。原則として、無脊椎動物起源または脊椎動物起源に
かかわらず多くの高等真核生物の組織培養細胞株が使用
可能（workable）である（例えば、昆虫バキュロウイル
ス発現系）。しかし、翻訳と同時および翻訳後の両方の
プロセシングという点においては哺乳類細胞が好まし
い。このような細胞の形質転換またはトランスフェクシ
ョンおよび増殖（propagation）は慣例手順（routine p
rocedure）になっている。有用な細胞株の例は、HeLa細
胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株、ベイ
ビーラット腎臓（BRK）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞
株、およびサル（COS）細胞株を包含する。このような
細胞株のための発現ベクターは、通常、複製起点、プロ
モーター、翻訳開始部位、RNAスプライシング部位（ゲ
ノムDNAが使用される場合）、ポリアデニル化部位、お
よび転写終了部位を含有する。これらのベクターはま
た、通常、選択遺伝子または増幅遺伝子を含有する。適
切な発現ベクターは、例えばアデノウイルス、SV40、パ
ルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガ
ロウイルスのような供給源由来のプロモーターを有する
プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得
る。適切な発現ベクターの代表的な例は、pCDNA1；pCD
（Okayamaら、（1985）Mol.Cell Biol. 5:1136-1142参
照）；pMC1neo Poly-A（Thomasら、（1987）Cell 51:50
3-512参照）；およびpAC373またはpAC 610のようなバキ
ュロウイルスベクター（O'Reillyら、（1992）Baculovi
rus Expression Vectors:A LaboratoryManual Freeman
and Co.、CRC Press、Boca Raton、Fla参照）を包含す
る。

【００５３】特定のまたは規定されたグリコシル化パタ
ーンを提供するシステムにおいて霊長類CTLA-8タンパク
質ポリペプチドを発現することがしばしば望ましい。こ
の場合、通常のパターンはこの発現系により自然に提供
される。しかし、このパターンは、ポリペプチド（例え
ば、グリコシル化されていない形態）を、異種の発現系
に導入された適切なグリコシル化タンパク質（glycosyl
ating protein）に曝露することにより改変可能であ
る。例えば、CTLA-8タンパク質遺伝子は、哺乳類または
他のグリコシル化酵素をコードする１つまたはそれ以上
の遺伝子で同時に形質転換され得る。このアプローチを
用いて、特定の哺乳類グリコシル化パターンは、原核生
物細胞または他の細胞において達成可能であるか、また
は近づけられる。

【００５４】霊長類CTLA-8タンパク質、またはそのフラ
グメントは、細胞膜にホスファチジルイノシトール（P
I）結合するように操作し得るが、ホスファチジルイノ
シトール切断酵素（例えば、ホスファチジルイノシトー
ルホスホリパーゼＣ）を用いる処理により膜から除去さ
れ得る。これは抗原を生物学的に活性な形態で放出し、
そしてタンパク質化学の標準的な手順による精製を可能
にする。例えば、Low（1989）Biochim.Biophys.Acta 98
8:427-454；Tseら、（1985）Science 230:1003-1008；
およびBrunnerら、（1991）J.Cell Biol.114:1275-1283
を参照のこと。

【００５５】CTLA-8タンパク質が特徴づけられたため、
そのフラグメントまたは誘導体はペプチド合成のための
従来のプロセスにより調製され得る。これらは、Stewar
tおよびYoung（1984）Solid Phase Peptide Synthesi
s、Pierce Chemical Co.、Rockford、IL；Bodanszkyお
よびBodanszky（1984）The Practice of Peptide Synth
esis、Springer-Verlag、New York；およびBodanszky
（1984）The Principles of Peptide Synthesis、Sprin
ger-Verlag、New Yorkに記載されるようなプロセスを包
含する。例えば、アジドプロセス、酸塩化物プロセス、
酸無水物プロセス、混合無水物プロセス、活性エステル
プロセス（例えば、p-ニトロフェニルエステル、N-ヒド
ロキシスクシンイミドエステル、またはシアノメチルエ
ステル）、カルボジイミダゾールプロセス、酸化剤還元
剤（oxidative-reductive）プロセス、またはジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（DCCD）/添加剤プロセスが使
用され得る。固相または液相合成は両方とも上記のプロ
セスに適用可能である。

【００５６】霊長類CTLA-8タンパク質、フラグメント、
または誘導体は、一般的に、アミノ酸を１つずつ次々と
末端アミノ酸に縮合する工程を包含するいわゆる段階的
プロセス、あるいは末端アミノ酸にペプチドフラグメン
トを結合させることのどちらかによるペプチド合成にお
いて代表的に使用されるような上記のプロセスに従って
適切に調製される。結合反応で用いられないアミノ基
は、代表的には不適切な位置での結合を防ぐために保護
される。

【００５７】固相合成を採用する場合、Ｃ末端アミノ酸
は、そのカルボキシル基により不溶性のキャリアーまた
は支持体に結合される。不溶性キャリアーは、それが反
応性カルボキシル基との結合能力を有する限り、特に限
定されない。このような不溶性キャリアーの例は、ハロ
メチル樹脂（例えば、クロロメチル樹脂またはブロモメ
チル樹脂）、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、
tert-アルキルオキシカルボニルヒドラジド化樹脂など
を包含する。

【００５８】アミノ基保護アミノ酸は、その活性化カル
ボキシル基と予め形成されたペプチドまたは鎖の反応性
アミノ基との縮合により次々と結合され、１段階ずつペ
プチドを合成する。完全な配列を合成した後、ペプチド
は不溶性キャリアーから分離され、ペプチドを生成す
る。この固相アプローチは、Merrifieldら、（1963）J.
Am.Chem.Soc. 85:2149-2156により一般的に記載されて
いる。

【００５９】調製されたタンパク質およびそのフラグメ
ントは、ペプチド分離、例えば抽出、沈殿、電気泳動お
よび種々の形態のクロマトグラフィーなどにより反応混
合液から単離および精製され得る。本発明の霊長類CTLA
-8タンパク質は、その所望の使用に依存して純度を変化
させて得ることができる。精製は、本明細書中で開示さ
れるタンパク質精製技術の使用、または本明細書中に記
載される抗体の免疫吸着アフィニティークロマトグラフ
ィー（immunoabsorbant affinity chromatography）に
おける使用により達成され得る。この免疫吸着アフィニ
ティークロマトグラフィーは、まず抗体を固体支持体に
結合させ、次いで結合した抗体を、適切な供給源細胞の
可溶化溶解物、タンパク質を発現する他の細胞の溶解
物、またはDNA技術の結果CTLA-8タンパク質を産生する
細胞の溶解物または上清と接触させることにより行われ
る（下記参照）。

【００６０】Ｖ. 物理的変種 本発明はまた、CTLA-8タンパク質のアミノ酸配列と実質
的なアミノ酸配列相同性を有するタンパク質またはペプ
チドを包含する。変種は、種変種または対立遺伝子変種
を包含する。

【００６１】アミノ酸配列相同性、または配列同一性
は、残基適合を最適化する（必要ならば、必要なギャッ
プを導入することにより）ことにより測定される。これ
は、保存的置換を適合と考える場合、変化する。保存的
置換は、代表的には、以下の群内での置換を包含する：
グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシ
ン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グ
ルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；
およびフェニルアラニン、チロシン。相同なアミノ酸配
列は、代表的には各個のタンパク質配列における天然の
対立遺伝子変種（variation）および種間変種を包含す
ると意図される。代表的な相同タンパク質またはペプチ
ドは、霊長類CTLA-8タンパク質のアミノ酸配列と、50〜
100％の相同性（ギャップが導入され得る場合）から80
〜100％の相同性（保存的置換が含まれる場合）を有す
る。同一性量は少なくとも約60％、一般的に少なくとも
約65％、しばしば少なくとも約70％、代表的には少なく
とも約75％、通常少なくとも約80％、さらに通常は少な
くとも約84％、好ましくは少なくとも約87％、そしてさ
らに好ましくは少なくとも約90％、そして特に好ましい
実施態様では少なくとも約95％またはそれ以上である。
また、Needlehamら（1970）J.Mol.Biol. 48:443-453；S
ankoffら（1983）Time Warps,String Edits,and Macrom
olecules:The Theory and Practice of Sequence Compa
rison Addison-Wesley、Reading、MAの第１章；およびI
ntelliGenetics、Mountain View、CA；およびウィスコ
ンシン大学Genetics Computer Group、Madison、WIのソ
フトウェアパッケージを参照のこと。フラグメントは、
記載される配列内で提供されるように、長さ、同一性
量、および末端のすべての組み合わせを包含する。

【００６２】CTLA-8タンパク質をコードする単離された
DNAは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレ
オチド挿入、およびヌクレオチドストレッチの倒置（in
version）により容易に改変され得る。これらの改変
は、これらの抗原、それらの誘導体、または類似の生理
学的活性、免疫原性活性、または抗原性活性を有するタ
ンパク質をコードする新規のDNA配列を生じる。これら
の改変された配列は変異体抗原を生成するため、または
発現を増強するために用いられ得る。増強された発現
は、遺伝子増幅、増加した転写、増加した翻訳、および
他の機構を包含し得る。このような変異体CTLA-8タンパ
ク質誘導体は、それぞれのタンパク質またはそのフラグ
メントの予め決定された変異、または部位特異的変異を
包含する。「変異体CTLA-8タンパク質」は、そうでなけ
れば上記のヒトCTLA-8タンパク質の相同性の定義に該当
するが、欠失、置換、または挿入のいずれによるかにか
かわらず、自然に見出されるCTLA-8タンパク質のアミノ
酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
包含する。特に、「部位特異的変異体霊長類CTLA-8タン
パク質」は、一般的に配列番号４、６、または８の配列
を有するタンパク質と顕著な相同性を有し、そしてこれ
らの配列と種々の生物学的な活性（例えば、抗原性また
は免疫原性活性）を共有するタンパク質を包含し、そし
て好ましい実施態様においては、開示された配列のほと
んどを含む。同様の概念が、異なるCTLA-8タンパク質、
特に種々の霊長類（例えば、サルおよびギボン（gibbo
n））に見出されるCTLA-8タンパク質に適用される。上
記のように、記載は、一般的には、すべてのCTLA-8タン
パク質を包含することを意味し、詳細に論じられるヒト
実施態様に限定されないことが強調される。

【００６３】部位特異的変異部位を予め決定するが、変
異体は部位特異的である必要はない。CTLA-8タンパク質
変異誘発は、アミノ酸挿入または欠失を作成することに
より導かれ得る。置換、欠失、挿入または任意の組み合
わせが生成されて、最終構築物に到達し得る。挿入は、
アミノ末端またはカルボキシ末端融合を包含する。ラン
ダム変異誘発が標的コドンで導かれ得、次いで発現され
た変異体は所望の活性についてスクリーニングされ得
る。公知の配列を有するDNA中の予め決定された部位に
置換変異を作成する方法は、当該分野において周知であ
り、例えば、M13プライマー変異誘発またはポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）技術による。また、Sambrookら（198
9）およびAusubelら（1987および補遺）を参照のこと。

【００６４】DNAにおける変異は、正常にはコード配列
をリーディングフレームの外に置くべきでなく、好まし
くは、ハイブリダイズして、ループまたはヘアピンのよ
うなmRNA２次構造を生成し得る相補的領域を作成しな
い。

【００６５】本発明はまた、組換えタンパク質、例え
ば、これらのタンパク質由来のセグメントを使用する異
種融合タンパク質を提供する。異種融合タンパク質は、
自然には同じ方法で正常に融合されないタンパク質また
はセグメントの融合物である。従って、CTLA-8ポリペプ
チドと免疫グロブリンとの融合生成物は、典型的なペプ
チド結合で融合された配列（代表的には単一の翻訳生成
物として作製される）を有し、それぞれの供給源ペプチ
ド由来の特性を示す連続タンパク質分子である。同様の
概念が異種核酸配列に適用される。

【００６６】さらに、新たな構築物が、他のタンパク質
由来の同様な機能的ドメインを組み合わせることから作
製され得る。例えば、抗原結合セグメントまたは他のセ
グメントは、異なる新たな融合ポリペプチドまたはフラ
グメントの間で「交換」され得る。例えば、Cunningham
ら（1989）Science 243:1330-1336；およびO'Dowdら（1
988）J.Biol.Chem. 263:15985-15992を参照のこと。従
って、特異性の新たな組合わせを示す新たなキメラポリ
ペプチドは、生物学的に関連するドメインと他の機能的
ドメインとの機能的結合から生じる。

【００６７】BeaucageおよびCarruthers（1981）Tetra.
Letts.22:1859-1862により記載されるホスホルアミダイ
ト（phosphoramidite）法は、適切な合成DNAフラグメン
トを生成する。相補鎖を合成し、そして適切な条件下で
鎖を一緒にアニーリングするか、または適切なプライマ
ー配列と伴にDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を付加す
るか（例えばPCR技術）のいずれかにより、二本鎖フラ
グメントがしばしば得られる。

【００６８】機能的変種 CTLA-8タンパク質に対する生理学的応答のブロックは、
天然の結合パートナーに対する抗原の結合阻害（例え
ば、競合的阻害による）から生じ得る。従って、本発明
のインビトロアッセイは、単離タンパク質、組換え膜関
連CTLA-8タンパク質を発現する細胞由来の膜、結合セグ
メントを含有する可溶性フラグメント、または固相基質
に接着するフラグメントをしばしば使用する。これらの
アッセイはまた、結合セグメントの変異および改変、ま
たはタンパク質の変異および改変（例えば、アナログ）
のいずれかの効果の診断的測定を可能にする。

【００６９】本発明はまた、競合的薬物スクリーニング
アッセイの使用を意図し、例えばここで、抗原に対する
中和化抗体または結合パートナーのフラグメントが、タ
ンパク質の結合に関して試験化合物と競合する。この方
法では、抗体は、このタンパク質の１つ以上の抗原性結
合部位を共有する任意のポリペプチドの存在を検出する
ために使用され、そしてまた、タンパク質上の結合部位
（そうでなければ結合パートナーと相互作用し得る）を
占有するために使用され得る。

【００７０】さらに、CTLA-8タンパク質に対する中和化
抗体、および高親和性レセプター結合部位を含む抗原の
可溶性フラグメントは、組織（例えば、異常な生理機能
を経験する組織）において抗原機能を阻害するために使
用され得る。

【００７１】霊長類CTLA-8抗原の「誘導体」は、アミノ酸
配列変異体、グリコシル化変種、および他の化学的部分
との共有結合体または凝集結合体を含む。共有結合誘導
体は、当該分野で周知の方法によって、CTLA-8アミノ酸
側鎖またはＮ末端またはＣ末端において見出される基に
官能性を結合することにより調製され得る。これらの誘
導体は、カルボキシル末端のまたはカルボキシル側鎖含
有残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシル基
含有残基のO-アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸
またはアミノ基含有残基（例えば、リジンまたはアルギ
ニン）のＮ-アシル誘導体を含むが、これらに限定され
ない。アシル基は、C3〜C18直鎖（normal）アルキルを
含み、それゆえアルカノイルアロイル種を形成するアル
キル部分を有する基から選択される。免疫原性部分がハ
プテンである場合、キャリアタンパク質への共有結合性
接着は重要であり得る。

【００７２】特に、例えば合成およびプロセシングの
間、またはさらなるプロセシング工程での、ポリペプチ
ドのグリコシル化パターンを改変することによってなさ
れるグリコシル化変更が含まれる。このことを達成する
ために特に好ましい手段は、このようなプロセシングを
通常に提供する細胞以来のグリコシル化酵素（例えば、
哺乳動物グリコシル化酵素）にポリペプチドを暴露する
ことによる。脱グリコシル化酵素もまた意図される。リ
ン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホ
セリン、またはホスホスレオニン）を含む、他の小さな
改変を有する同一の一次アミノ酸配列の変形体（versio
n）もまた意図される。

【００７３】誘導体の主要なグループは、CTLA-8タンパ
ク質またはそのフラグメントと他のタンパク質またはポ
リペプチドとの共有結合体である。Ｎ末端またはＣ末端
融合体などの組換え培養物において、または反応性側鎖
（side group）を介してタンパク質を架橋することにお
ける有用性について当該分野で公知である薬剤の使用に
よって、これらの誘導体は合成され得る。架橋剤によ
る、好ましい抗原誘導化部位（derivatization site）
は、遊離アミノ基、炭化水素部分、およびシステイン残
基である。

【００７４】霊長類CTLA-8タンパク質と他の同種または
異種タンパク質との間の融合ポリペプチドもまた提供さ
れる。同種ポリペプチドは、異なる表面マーカー間での
融合体であり得、例えば、レセプター結合特異性を示す
ハイブリッドタンパク質を生じる。同様に、誘導体タン
パク質の特性または活性の組み合わせを示す異種融合体
も構築される。代表的な例は、レポーターポリペプチド
（例えば、ルシフェラーゼ）と抗原のセグメントまたは
ドメイン（例えば、レセプター結合セグメント）との融
合体であり、融合された抗原の存在または位置は容易に
決定され得る。例えば、Dullら、米国特許第4,859,609
号を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーは、細菌の
βガラクトシダーゼ、trpE、プロテインＡ、βラクタマ
ーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、お
よび酵母α接合因子を含む。例えば、Godowskiら、（19
88） Science 241:812-816を参照のこと。

【００７５】ホスホルアミダイト法は、Beaucageおよび
Carruthers（1981） Tetra.Letts.22:1859-1862により
記載され、適切な合成DNAフラグメントを生成する。相
補鎖を合成し、そして適切な条件下でその鎖を一緒にア
ニーリングすることによるか、または適切なプライマー
配列と伴にDNAポリメラーゼを使用して相補鎖を付加す
ることによるかのどちらかで、二本鎖フラグメントはし
ばしば得られる。

【００７６】このようなポリペプチドはまた、リン酸
化、スルホン化、ビオチン化、または他の部分、特にリ
ン酸基に類似する分子形状を有する部分の付加または除
去により化学的に改変されたアミノ酸残基を有し得る。
いくつかの実施態様において、改変体は有用な標識試薬
であるか、または精製標的（例えば、親和性リガンド）
として作用する。

【００７７】融合タンパク質は、代表的には、組換え核
酸法、または合成ポリペプチド法のいずれかにより作製
される。核酸操作および発現の技術は、一般には、例え
ば、Sambrookら（1989） Molecular Cloning: A Labora
tory Manual （第２版）, 1-3巻,Cold Spring Harbor L
aboratoryに記載される。ポリペプチド合成の技術は、
例えば、Merrifield（1963） J.Amer.Chem.Soc. 85:214
9-2156;Merrifield （1986） Science 232:341-347;お
よびAthertonら（1989） Solid Phase PeptideSynthesi
s:A Practical Approach, IRL Press, Oxfordに記載さ
れる。

【００７８】本発明はまた、アミノ酸配列またはグリコ
シル化の変種（variation）以外のCTLA-8タンパク質の
誘導体の使用を意図する。このような誘導体は、化学部
分との共有結合または凝集結合を含み得る。これらの誘
導体は、一般的に、以下の３つのクラスに分類される：
（1）塩、（2）側鎖または末端残基共有結合改変体、お
よび（3）例えば、細胞膜との吸着複合体。このような
共有結合誘導体または凝集誘導体は免疫原、イムノアッ
セイにおける試薬として、または、例えば抗原または他
の結合タンパク質のアフィニティー精製のための精製方
法の試薬として有用である。例えば、抗CTLA-8タンパク
質抗体、またはそのレセプター、あるいは他の結合パー
トナーのアッセイまたは精製において使用するために、
霊長類CTLA-8抗原は、当該分野で周知の方法によって、
臭化シアン活性化Sepharoseなどの固体支持体に共有結
合させることにより固定化され得、またはグルタルアル
デヒド架橋によりまたはよらずにポリオレフィン表面上
へ吸着され得る。霊長類CTLA-8抗原はまた、診断アッセ
イに使用するために検出可能な基、例えば、クロラミン
Ｔ手順により放射性ヨウ素化するか、希土類キレートと
共有結合するか、または他の蛍光部分と結合した基で標
識され得る。CTLA-8タンパク質の精製は、固定化された
抗体または結合パートナーにより達成され得る。

【００７９】本発明の可溶化CTLA-8抗原またはフラグメ
ントは、このタンパク質またはそのフラグメントに特異
的な抗血清または抗体の生成のために免疫原として使用
され得る。精製された抗原は、このタンパク質を含む種
々の形態の不純な調製物での免疫化により調製されたモ
ノクローナル抗体または結合フラグメントをスクリーニ
ングするために使用され得る。特に、用語「抗体」はま
た、天然抗体の抗原結合フラグメントを包含する。抗原
を含むタンパク質または細胞フラグメントの上昇したレ
ベルの存在（これらの両方が、異常なまたは特定の生理
学的状態または疾患状態の診断であり得る）に応答して
産生される任意の抗体を検出するために試薬として、精
製されたCTLA-8タンパク質はまた使用され得る。さら
に、直ぐ下に記載されるように、抗原フラグメントはま
た、本発明の抗体を生成するために免疫原として働き得
る。例えば、本発明は、配列番号３、５または７に示さ
れるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配
列、またはこれらを含むタンパク質のフラグメントに対
して生じる抗体を意図する。特に、本発明は、脂質二重
層の外側に位置すると予測される特定のフラグメントに
結合親和性を有するかまたはこのフラグメントに対して
生じる抗体を意図する。

【００８０】本発明は、別の近親種の変種の単離を意図
する。サザンブロット分析により、類似の遺伝実体（en
tity）が他の哺乳動物（例えば、ラットおよびマウス）
に存在することが確立された。CTLA-8タンパク質は、種
変種（例えば、テナガザル（hybolates）、ゴリラ、オ
ナガザル（cercopothecidae））において広範囲に存在
する様である。

【００８１】本発明はまた、構造、発現、および機能に
おける相違性と類似性との両方を示す関連する抗原のグ
ループを単離する手段を提供する。この抗原の多くの生
理学的効果の解明は、異なる種変種の単離および特徴付
けによって、大きく加速される。特に本発明は、異なる
霊長類種において別の相同な遺伝実体を同定するために
有用なプローブを提供する。

【００８２】単離された遺伝子は、対応するCTLA-8タン
パク質の発現を欠く細胞（例えば、対応する抗原を欠き
そしてネガティブバックグランド活性を示す種タイプま
たは細胞のいずれか）の形質転換を可能にする。形質転
換遺伝子の発現は、規定されたまたは単一の種変種を用
いて、抗原性的に純粋な細胞株の単離を可能にする。こ
のアプローチは、CTLA-8タンパク質の生理学的効果のよ
り感受性の高い検出および区別を可能にする。亜細胞性
フラグメント（例えば、細胞質または膜フラグメント）
は、単離および使用され得る。

【００８３】タンパク質によって提供される種々の生理
学的機能または分化機能をもたらす重要な構造要素の詳
細な分析は、特に関連クラスのメンバーを比較すること
において、最新の分子生物学の標準的な技術を使用すれ
ば可能である。例えば、Cunninghamら（1989） Science
243:1339-1336に記載のホモローグスキャニング変異誘
発技術（homolog-scanning mutagenesis technique）；
およびO'Dowdら（1988） J.Biol.Chem. 263:15985-1599
2において使用されるアプローチ；およびLechleiterら
（1990） EMBOJ. 9:4381-4390を参照のこと。

【００８４】特に、どのような構造的特徴が、結合パー
トナーの親和性および特異性の両方ならびにシグナル変
換において重要であるかを決定するために、種変種の間
で機能ドメインまたはセグメントを置換し得る。多数の
異なる変種が、結合パートナーの異なる種変種との相互
作用の組み合わされた特性を示す分子についてスクリー
ニングするために使用される。

【００８５】抗原内在化は特定の情況下で生じ得、そし
て細胞内成分と相互作用に関連するタンパク質の「細胞
外」セグメントとの間の相互作用が生じ得る。CTLA-8タ
ンパク質と他の細胞内成分との相互作用の特定のセグメ
ントは、変異誘発または直接的な生化学的手段（例え
ば、架橋方法または親和性方法）によって同定され得
る。結晶構造学的方法または他の物理学的方法による構
造解析もまた適用可能である。生物学的機能の機構のさ
らなる研究は、親和性方法または遺伝学的手段（例え
ば、変異体の相補性分析）により単離可能であり得る結
合成分の研究を包含する。

【００８６】CTLA-8タンパク質の発現および制御のさら
なる研究が遂行される。抗原に結合する制御要素は、分
化発生発現パターン、組織特異的発現パターン、または
他の発現パターンを示し得る。上流遺伝子領域または下
流遺伝子領域（例えば、制御要素）も重要である。

【００８７】抗原の構造的研究は、新しい変種、特に結
合パートナー上でアゴニスト特性またはアンタゴニスト
特性を示すアナログの設計図を導く。これは、所望の範
囲の活性を示す変種を単離するために、以前に記載され
たスクリーニング法と組み合わせ得る。

【００８８】他の細胞タイプにおける発現は、しばし
ば、特定の抗原においてグリコシル化の相違を生じる。
様々な種変種は、アミノ酸配列以外の構造的相違に基づ
いて異なる機能を示し得る。特異な改変が特異な機能の
原因であり得、そしてこの効果の解明は、現在可能であ
る。

【００８９】従って、本発明は、抗原-結合パートナー
相互作用に関連する重要な試薬を提供する。前記の記載
は、ヒトCTLA-8タンパク質に主に焦点を当ててきたが、
本発明が他の抗原（例えば、サルおよび他の霊長種変種
または対立遺伝子変種、ならびにそれらの変種）を包含
することが、当業者らに即座に認識される。

【００９０】抗体 抗体は、天然に生じる形態および組換え形態の両方の種
々のCTLA-8タンパク質（種変種または対立遺伝子変種を
含む）およびそのフラグメントに対して生じ得る。さら
に、抗体は、活性形態または不活性形態のいずれかのCT
LA-8タンパク質に対して生じ得る。抗-イディオタイプ
抗体もまた意図される。

【００９１】抗原の予め決定されたフラグメントに対す
る抗体（結合フラグメントおよび一本鎖変形体（versio
n）を含む）は、このフラグメントと免疫原性タンパク
質との結合体で動物を免役することによって生じ得る。
モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から
調製される。これらの抗体は、正常CTLA-8タンパク質ま
たは欠損CTLA-8タンパク質への結合についてスクリーニ
ングされ得るか、またはアゴニスト活性またはアンタゴ
ニスト活性（例えば、結合パートナーにより仲介され
る）についてスクリーニングされ得る。これらのモノク
ローナル抗体は、通常、少なくとも約1mM、より通常に
は少なくとも約300μM、代表的には少なくとも約10μ
M、より代表的には少なくとも約30μM、好ましくは少な
くとも約10μM、そしてより好ましくは少なくとも約3μ
Mまたはより良好なK_Dで結合する。

【００９２】本発明の抗体（抗原結合フラグメントを含
む）は、十分な診断価値または治療価値を有し得る。こ
れらは、結合パートナーに結合しそして抗原結合を阻害
するかまたは抗原が生物学的応答を誘導する能力を阻害
する強力なアンタゴニストであり得る。それらはまた、
非中和化抗体として有用であり得、そしてトキシンまた
は放射性核種と結合され得るので、抗体が抗原に結合す
る場合、例えば細胞表面上に抗原を発現する細胞は殺さ
れる。さらに、これらの抗体は、薬物または他の治療剤
に、直接的にまたはリンカーよって間接的に結合され
得、そして薬物を目標に向けること（drug targeting）
を達成し得る。

【００９３】本発明の抗体はまた、診断での適用に有用
であり得る。捕獲または非中和化抗体として、これらの
抗体は、パートナーによる結合を阻害することなく抗原
に結合する能力についてスクリーニングされ得る。中和
化抗体としてこれらの抗体は、競合結合アッセイにおい
て有用であり得る。本発明の抗体は、CTLA-8タンパク質
またはその結合パートナーを検出または定量することに
おいてもまた有用である。例えば、Chan（編）（1987）
Immunoassay:A Practical Guide Academic Press,Orla
ndo,Fla；Ngo（編）（1988） Nonisotopic Immunoassay
Plenum Press,NY;およびPriceおよびNewman（編）（19
91） Principles and Practice of Immunoassay Stockt
onPress,NYを参照のこと。

【００９４】抗原フラグメントは、免疫原として使用さ
れるための融合ぺプチドまたは共有結合ポリペプチドの
ように、他の物質、特にポリペプチドに結合され得る。
抗原およびそのフラグメントは、キーホールカサガイ
（keyhole limpet）のヘモシアニン、ウシ血清アルブミ
ン、テタヌストキソイドなどの様々な免疫原に融合され
るかまたは共有結合され得る。ポリクローナル抗血清の
調製方法の記載については、Microbiology,Hoeber Medi
cal Division,Harper and Row,1969；Landsteiner（196
2） Specificity of Serological Reactions,Dover Pub
lications,New York、およびWilliamsら（1967） Metho
ds in Immunology and Immunochemistry,Vol.1,Academi
c Press,New York,を参照のこと。代表的な方法は、抗
原での動物の過免疫化を含む。次いで、免疫化を繰り返
した後間もなく、動物の血液は回収され、そしてγグロ
ブリンが単離される。

【００９５】いくつかの例において、マウス、げっ歯
類、霊長類、ヒトなどの種々の哺乳動物宿主由来のモノ
クローナル抗体を調製することが望ましい。このような
モノクロール抗体を調製する技術の記載は、例えば、St
itesら（編）、Basic and Clinical Immunology第４
版、Lange Medical Publications,Los Altos,CA,および
そこで引用される参考文献；HarlowおよびLane（1988）
Antibodies:A LaboratoryManual,CSH Press；Goding（1
986） Monoclonal Antibodies:Principles and Practic
e（第２版）Academic Press,New York；および特にKohl
erおよびMilstein（1975） Nature 256:495-497（モノ
クローナル抗体を生成する方法の１つを記載）に見い出
され得る。簡単に要約すると、この方法は、免疫原を動
物に注射することを包含する。次いで、動物は屠殺さ
れ、そして細胞が脾臓から取り出される。次いで細胞は
ミエローマ細胞と融合される。結果として、インビトロ
で再生可能なハイブリッド細胞すなわち「ハイブリドー
マ」を得る。次いで、ハイブリドーマの集団は、個々の
クローンを単離するためにスクリーニングされる。各々
のクローンは、免疫原に対する単一の抗体種を分泌す
る。この方法では、得られる個々の抗体種は、免疫原性
物質上に認識される特異的部位に対して生成される、免
疫動物由来で不死化およびクローン化された単一のＢ細
胞の産生物である。

【００９６】他の適切な技術は、リンパ球を抗原性ポリ
ペプチドに対してインビトロで曝露すること、あるいは
ファージまたは類似ベクターにおける抗体ライブラリー
の選択を包含する。Huseら（1989）「λファージにおけ
る免疫グロブリンレパートリーの大きな組み合わせライ
ブラリーの作成（Genenration of a Large Combinatori
al Library of the Immunoglobulin Repertoire in Pha
ge Lambda）」Science246:1275-1281；およびWardら（19
89） Nature 341:544-546を参照のこと。本発明のポリ
ペプチドおよび抗体は、改変を有してまたは有さないで
使用され得、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む。しば
しば、ポリペプチドおよび抗体は、共有結合的かまたは
非共有結合的のいずれかで、検出可能なシグナルを提供
する物質と結合することにより標識される。非常に様々
な標識および結合技術が公知であり、科学文献および特
許文献の両方において広く報告されている。適切な標識
は、放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビ
ター、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などを含む。
このような標識の使用を教示する特許は、米国特許第3,
817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,3
45号；第4,277,437号；第4,275,149号；および第4,366,
241号を含む。また、組換え免疫グロブリンが生成され
得る（Cabilly、米国特許第4,816,567号を参照のこ
と）。

【００９７】本発明の抗体はまた、タンパク質を単離す
ることにおけるアフィニティークロマトグラフィーのた
めに使用され得る。抗体が固体支持体（例えば、アガロ
ース、Sephadexなどの粒子）に結合するカラムが調製さ
れる。細胞溶解物がカラムを通過した後、カラムを洗浄
し、続いてマイルドな変成剤の濃度を増加させながら流
すことによって、精製されたCTLA-8タンパク質が遊離さ
れる。

【００９８】抗体はまた、発現ライブラリーを特定の発
現産物についてスクリーニングするために使用され得
る。通常、このような手順において使用される抗体は、
抗体の結合によって抗原の存在を容易に検出することを
可能にする部分で標識される。

【００９９】各CTLA-8タンパク質に対して生じる抗体
は、また、抗イディオタイプ抗体を生じるために有用で
ある。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する種々
の免疫学的状態を検出または診断することにおいて有用
である。

【０１００】使用 本発明は、本明細書の別の場所（例えば、生理学的異常
または発生異常の一般的な記載において、または下記の
診断のためのキットの記載において）に記載されるよう
な診断適用での使用を見い出す試薬を提供する。

【０１０１】本発明はまた、重要な治療価値を持つ試薬
を提供する。CTLA-8タンパク質（天然に生じるCTLA-8タ
ンパク質、または組換えCTLA-8タンパク質）、そのフラ
グメント、およびそれらに対する抗体、さらにCTLA-8タ
ンパク質に対して結合親和性を有すると同定される化合
物は、異常な増殖（例えば、ガン状態）、または変性
（degenerative）状態を含む異常な生理状態または発生
状態に関連する状態の処置において有用であるべきであ
る。異常な増殖、再生、変性およびアトロピーは、本明
細書が提供する組成物を使用する適切な治療処置によっ
て調整され得る。例えば、CTLA-8抗原による異常な発現
または異常なシグナル伝達に関連する疾患または異常
は、そのタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト
の有望な標的であるべきである。

【０１０２】他の異常な発生状態は、ノザンブロット分
析によってCTLA-8抗原mRNAを有することが示された細胞
タイプで知られている。Berkow編 The Merck Manual of
Diagnosis and Therapy, Merck & Co.,Rahway,N.J.；
およびThornらHarrison's Principles of Internal Med
icine,McGraw-Hill,N.Y.を参照のこと。これらの問題
は、本明細書で提供される組成物を使用する予防または
処置の対象となり得る。

【０１０３】CTLA-8に結合する組換え抗体は、精製され
得、次いで患者に投与され得る。これらの試薬は、治療
的使用のために別の活性な成分または不活性な成分、例
えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物
（例えば、免疫原性アジュバント）ならびに生理学的に
無毒な安定剤および防腐剤中で組み合され得る。これら
の組合わせは、滅菌濾過され得、そして凍結乾燥により
投薬形態にして投薬バイアル中に入れるか、または安定
化された水性調製物として保管され得る。本発明はま
た、抗体またはその結合フラグメント（補体が結合して
いない形態を含む）の使用を意図する。

【０１０４】CTLA-8を用いて、CTLA-8抗原に結合親和性
を有する結合パートナーまたは化合物のスクリーニング
が実施され得、関連する成分の単離を包含する。次い
で、化合物が内因性生物学的活性を有し、そしてそれゆ
えに抗原の活性をブロックするアゴニストまたはアンタ
ゴニストであるかどうかを決定するために、連続した生
物学的アッセイが利用され得る。本発明はさらに、アン
タゴニストとしてのCTLA-8タンパク質に対する抗体の治
療的使用を意図する。このアプローチは、他のCTLA-8タ
ンパク質種変異体にも特に有用であるべきである。

【０１０５】効果的な治療に必要な試薬の量は、多くの
異なる要素（投与手段、標的部位、患者の生理学的状
態、および他の投与される薬剤（medicant）を含む）に
依存している。従って、処置投薬量は、安全性および効
果を最適にするために滴定されるべきである。代表的
に、インビトロで使用される投薬量は、これらの試薬の
インサイチュ投与に有用な量の有用な指標を提供し得
る。特定の異常の処置に効果的な用量の動物試験は、ヒ
ト投薬量のさらに予測的指示を提供し得る。種々の考察
が例えば、Gilmanら編（1990） Goodman and Gilman's:
The PharmacologicalBases of Therapeutics、第８
版、Pergamon Press；およびRemington's Pharmaceutic
al Sciences、第17版（1990）、Mack Publishing Co.,E
aston,Pennに記載されている。投与の方法（例えば、経
口投与、静脈内投与、腹腔内投与、または筋肉内投与、
経皮的拡散など）は、それらの中でまたは下記に論じら
れる。Langer（1990） Science 249:1527-1533もまた参
照のこと。薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理食
塩水、緩衝液、および例えば、Merck Index,Merck & C
o.,Rahway,NewJerseyに記載される他の化合物を含む。
投薬量の範囲は、適切なキャリアを伴って、通常１mMよ
り低い濃度、代表的には約10μMより低い濃度、通常約1
00nMより低く、好ましくは約10pM（ピコモル）より低
く、最も好ましくは約1fM（フェントモル）より低い濃
度の用量であると通常予想される。徐放性処方物（slow
release formulation）、または徐放装置は、しばしば
連続投与に利用される。

【０１０６】CTLA-8タンパク質、そのフラグメント、お
よびそれに対する抗体またはそのフラグメント、アンタ
ゴニストおよびアゴニストは、処置する宿主に直接投与
され得るか、または化合物の大きさに依存して、それら
の投与の前にオボアルブミンまたはウシ血清アルブミン
などのキャリアタンパク質と結合させることが望まし
い。治療処方物は、任意の従来の投与処方物で投与され
得る。活性成分が単独で投与されることも可能である
が、薬学的処方物として存在することが好ましい。代表
的に処方物は、上記のように、少なくとも１つの活性成
分を、１つ以上の受容可能なそれらのキャリアと共に含
有する。各キャリアは、他の成分と適合性がある点、お
よび患者に対して傷害性でない点で、薬学的にも生理学
的にも受容可能であるべきである。処方物は、経口投
与、直腸投与、鼻腔内投与、または非経口投与（皮下投
与、筋肉内投与、静脈内投与および皮内投与を含む）に
適切なキャリアを含む。処方物は、都合の良いように単
位投薬形態であり得、そして薬学分野において周知の任
意の方法によって調製され得る。例えば、Gilmanら編
（1990）Goodman and Gilman's: The Pharmacological
Bases of Therapeutics,第８版,Pergamon Press,Parryt
own,NY；Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版
（1990）,Mack Publishing Co.,Easton,Penn.; Avisら
編（1993）Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral
Medications 第２版,Dekker,NY；Liebermanら編（199
0） Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets 第２版 De
kker,NY；およびLiebermanら編（1990） Pharmaceutica
l Dosage Forms: Disperse Systems Dekker,NYを参照の
こと。本発明の治療は、他の化学療法剤または化学予防
剤と組み合わせて、あるいは関連して用いられ得る。

【０１０７】本発明の天然に生じるCTLA-8タンパク質と
組換え形態のCTLA-8タンパク質の両方は、タンパク質に
対する結合活性について化合物をスクリーニングし得る
キットおよびアッセイ方法において特に有用である。近
年自動化アッセイのいくつかの方法が開発され、短期間
で何万もの化合物をスクリーニングすることが可能にな
った。例えば、Fodorら（1991） Science 251:767-773
（固体支持体上で合成された複数の特定のポリマーによ
って結合親和性を試験する方法を記載）を参照のこと。
適切なアッセイの開発は、本発明によって提供される大
量の精製された可溶性CTLA-8タンパク質の利用可能性に
よって非常に容易にされ得る。

【０１０８】本発明は、任意の種々の薬物スクリーニン
グ技術において、組換え抗原を使用することにより化合
物をスクリーニングするのに、特に有用である。特定の
リガントのスクリーニングにおいて組換えタンパク質を
使用する利点は：（a）特定の供給源に由来する改良さ
れた再生可能（renewable）な抗原の供給源；（b）アッ
セイにおいてより高いシグナル対ノイズの比を与える細
胞当たりの多数の潜在的抗原分子；および（c）種変異
体特異性（理論的に高い生物学的特異性および疾患特異
性を与える）を包含する。精製されたタンパク質は多様
なアッセイ、代表的には生物学的に関連する応答を評価
するインビトロアッセイにおいて試験され得る。例え
ば、Coligan Current Protocols in Immunology; Hood
ら、Immunology Benjamin/Cummings; Paul編 Fundament
al Immunology;およびMethods in Enzymology Academic
Pressを参照のこと。

【０１０９】薬物スクリーニングの１つの方法は、CTLA
-8抗原を発現する組換えDNA分子によって安定に形質転
換される真核または原核宿主細胞を利用する。他の機能
的に等価な抗原からの単離物において、抗原を発現する
細胞が単離され得る。このような細胞は、生存形態また
は固定化形態のいずれかで、標準的なタンパク質−タン
パク質結合アッセイに使用され得る。Parceら（1989）
Science 246:243-247；およびOwickiら（1990） Proc.N
at'l Acad. Sci. USA 87:4007-4011もまた参照のこと。
これらは細胞応答を検出する感度の高い方法を記載して
いる。競合アッセイは特に有用である。このアッセイで
は、細胞（CTLA-8タンパク質の供給源）を、標識結合パ
ートナー、リガンドに対する公知の結合親和性を有する
標識抗体（例えば、125I抗体）および結合組成物に対す
る結合親和性が測定される試験サンプルと接触させ、イ
ンキュベートする。次いで、結合した標識結合組成物ま
たは遊離の標識結合組成物を分離して、抗原結合の程度
を評価する。結合した試験化合物の量は、公知の供給源
に結合する標識レセプターの量に反比例する。非常に多
くの技術の任意の１つを用いて遊離抗原から結合抗原を
分離し、結合の程度を評価し得る。代表的には、この分
離工程はフィルターへの接着、続く洗浄、プラスチック
への接着、続く洗浄、または細胞膜の遠心分離などの手
順を包含し得る。生存細胞はまた、CTLA-8タンパク質媒
介機能（例えば、セカンドメッセンジャーレベル、すな
わちCa⁺⁺；細胞増殖；イノシトールリン酸プール変化な
ど）への薬物の効果をスクリーニングするためにもまた
使用され得る。いくつかの検出方法は、分離工程の排除
を可能にした（例えば、近接高感度検出システム（prox
imity sensitive detection system））。カルシウム感
受性色素は、蛍光計または蛍光細胞ソーティング装置で
Ca⁺⁺レベルを検出するのに有用である。

【０１１０】他の方法は、CTLA-8タンパク質の供給源と
して形質転換された真核宿主細胞または原核宿主細胞由
来の膜を利用する。これらの細胞は、膜関連CTLA-8タン
パク質（例えば、加工された膜結合形態）の発現を導く
DNAベクターによって、安定に形質転換される。本質的
に、膜はこの細胞から調製され、そして上記の競合アッ
セイのような任意のレセプター／リガンドタイプの結合
アッセイに使用される。

【０１１１】さらに別のアプローチは、形質転換された
真核宿主細胞または原核宿主細胞に由来する、可溶化さ
れた未精製CTLA-8タンパク質、または可溶化された精製
CTLA-8タンパク質を使用する。このことは、特異性の増
加という利点、自動化の可能性、および高い薬物試験の
処理量を有する「分子」結合アッセイを可能にする。

【０１１２】薬物スクリーニングの別の技術は、CTLA-8
に適切な結合親和性を有する化合物の高い処理量のスク
リーニングを提供する１つのアプローチを包含し、Geys
en、欧州特許出願第84/03564号、1984年９月13日公開に
詳細に記載されている。始めに多数の異なる小ペプチド
試験化合物を固体支持体（例えば、プラスチックピンま
たは他の適切な表面、Fodorら（1991）を参照のこと）
上で合成する。次いで、全てのピンを可溶化された未精
製CTLA-8タンパク質結合組成物、または可溶化された精
製CTLA-8タンパク質結合組成物と反応させ、洗浄する。
次の工程は、結合した結合組成物の検出を包含する。

【０１１３】合理的な薬物設計はまた、CTLA-8タンパク
質および他のエフェクターまたはアナログの分子形状の
構造研究に基づき得る。エフェクターは、抗原の結合に
応じて他の機能を仲介する他のタンパク質、または抗原
と正常に相互作用する他のタンパク質であり得る。特定
の他のタンパク質と相互作用する部位を決定する１つの
手段は、物理的な構造決定（例えば、Ｘ線結晶学、また
は２次元NMR技術）である。これらは、分子接触領域を
形成するアミノ酸残基に関する指標を提供する。タンパ
ク質の構造決定の詳細な説明については、例えば、Blun
dellおよびJohnson （1976） Protein Crystallograph
y, Academic Press, New Yorkを参照のこと。

【０１１４】精製CTLA-8タンパク質は、前述の薬物スク
リーニング技術において使用するために、直接プレート
上にコートされ得る。しかし、これらのリガンドに対す
る非中和化抗体は、捕獲抗体として固相上でそれぞれの
リガンドを固定化するために使用され得る。

【０１１５】キット 本発明はまた、結合組成物の存在を検出する種々の診断
キットおよび方法における、CTLA-8タンパク質、そのフ
ラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用
を意図する。代表的に、キットは規定のCTLA-8ペプチド
または遺伝子セグメント、またはあるものか別のものか
（例えば、抗原フラグメントまたは抗体）を認識する試
薬のいずれかを有する区画を有する。例えば、Chen編
（1987） Immunoassay: A Practical Guide,Academic P
ress,Orlando,FL；PriceおよびNewman編（1991）、Prin
ciples and Practice of Immunoassay,Stockton Press,
NewYork；およびNgo編（1988） Nonisotopic Immunoass
ay,Plenum Press,NY.を参照のこと。

【０１１６】試験化合物のCTLA-8タンパク質に対する結
合親和性を測定するためのキットは、代表的に以下を含
む：試験化合物；標識化合物（例えば、抗原に対する公
知の結合親和性を有する抗体）；CTLA-8タンパク質の供
給源（天然に生じるか、または組換えで生じる）；およ
び、抗原を固定化する固相のように遊離標識化合物から
結合標識化合物を分離する手段。一旦、化合物がスクリ
ーニングされると、抗原に対して適切な結合親和性を有
する化合物は、当該分野において周知のように適切な生
物学的アッセイにおいて評価され、それらが天然の抗原
に類似する生物学的活性を表すかどうかを決定し得る。
組換えCTLA-8タンパク質ポリペプチドの有用性はまた、
そのようなアッセイを較正するための十分に規定された
標準を提供する。

【０１１７】例えば、サンプル中のCTLA-8タンパク質の
濃度を測定するための好ましいキットは、代表的に、標
識化合物（例えば、抗原に公知の結合親和性を有する抗
体）、抗原供給源（天然に生じるか、または組換えで生
じる）および遊離標識化合物から結合標識化合物を分離
する手段（例えば、CTLA-8タンパク質を固定化する固
相）を含む。試薬を含む区画、および説明書が、通常提
供され得る。

【０１１８】サンプル中のCTLA-8タンパク質の濃度を測
定する１つの方法は、代表的に以下の工程を包含する：
（1）膜結合CTLA-8タンパク質供給源からなるサンプル
から膜を調製する工程；（2）膜を洗浄し、そしてそれ
らを緩衝液中に懸濁する工程；（3）適切な界面活性剤
が添加された培養培地中で膜をインキュベートすること
により抗原を可溶化する工程；（4）可溶化抗原の界面
活性剤濃度を調製する工程；（5）前記希釈物を放射性
標識抗体と接触、およびインキュベートして複合体を形
成する工程；（6）ポリエチレンイミン処理したフィル
ターを通して濾過することなどにより複合体を回収する
工程；および（7）回収した複合体の放射活性を測定す
る工程。

【０１１９】CTLA-8タンパク質またはフラグメントに特
異的な抗体（抗原結合フラグメントを含む）は、増加し
たレベルのCTLA-8タンパク質および／またはそのフラグ
メントの存在を検出する診断適用において有用である。
このような診断アッセイは、溶解物、生存細胞、固定化
細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液を使用し得、さらに
血清中のタンパク質などに関連する抗原の検出を包含し
得る。診断アッセイは、同種（遊離試薬とタンパク質−
タンパク質複合体との間の分離工程を有さない）または
異種（分離工程を有する）であり得る。ラジオイムノア
ッセイ（RIA）、酵素免疫吸着測定法（ELISA）、酵素免
疫測定法（EIA）、酵素増加（enzyme-multiplied）イム
ノアッセイ技法（EMIT）、基質標識蛍光イムノアッセイ
（SLFIA）などの種々の市販のアッセイが存在する。例
えば、CTLA-8タンパク質またはその特定のフラグメント
に対する抗体を認識し標識されている２次抗体を使用す
ることにより、非標識抗体を利用し得る。同様のアッセ
イがまた、広範囲に亘って文献に論じられている。例え
ば、HarlowおよびLane（1988） Antibodies: A Laborat
ory Manual,CSHを参照のこと。

【０１２０】抗イディオタイプ抗体は、CTLA-8タンパク
質に対する抗体の存在を診断するための同様の使用を有
し得、それ自体種々の異常な状態の診断であり得る。例
えば、CTLA-8タンパク質の過剰生成は、種々の免疫学的
反応の生成となり得る。それは特に、ガンまたは異常な
分化のような増殖細胞状態において、異常な生理学的状
態の診断となり得る。

【０１２１】しばしば、診断アッセイのための試薬がキ
ット中に供給され、アッセイの感度を最適化する。本発
明のためには、アッセイの性質に依存して、プロトコ
ル、および標識、標識抗体または非標識抗体のいずれ
か、または標識CTLA-8タンパク質が提供される。これは
通常、他の付加物（例えば、緩衝液、安定剤、酵素の基
質などのシグナル生成に必要な物質）などとの組み合わ
せである。好ましくは、キットは、正しい利用のための
説明書および使用後の内容物のディスポーザーをも包含
する。代表的には、キットはそれぞれの有用な試薬につ
いての区画を有する。望ましくは、試薬は凍結乾燥粉末
として提供される。この試薬は水性媒介物中で再構成さ
れ、アッセイを行うために適切な濃度の試薬を提供し得
る。

【０１２２】薬物スクリーニングおよび診断アッセイの
任意の前記構成要素が改変せずに使用され得るか、また
は種々の方法で改変され得る。例えば標識化は、共有結
合的にまたは非共有結合的に部分を結合することに達成
され得、直接的または非直接的に検出可能なシグナルを
提供する。任意のこれらのアッセイにおいて、抗原、試
験化合物、CTLA-8タンパク質、またはそれらに対する抗
体が、直接的または間接的のいずれかで標識され得る。
直接標識の可能性は、標識群を含む：¹²⁵Iのような放射
標識、パーオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ
のような酵素（米国特許第3,645,090号）、および蛍光
強度、波長シフト、または蛍光偏光における変化をモニ
ターし得る蛍光標識（米国特許第3,940,475号）。間接
標識の可能性は１つのビオチンを標識した後、上記の標
識群の１つにカップリングさせたアビジンに結合させる
ことを包含する。

【０１２３】また、遊離抗原から結合抗原を分離する
か、あるいは遊離試験化合物から結合化合物を分離す
る、非常に多くの方法がある。CTLA-8タンパク質は種々
のマトリックス上で固定化され得、次いで洗浄される。
適切なマトリックスは、ELISAプレート、フィルター、
およびビーズのようなプラスチックを含む。CTLA-8タン
パク質をマトリックスに固定化する方法は、プラスチッ
クへの直接接着、捕獲抗体の使用、化学的カップリン
グ、およびビオチン-アビジンを含むが、これらに限定
されない。このアプローチの最終工程は、任意のいくつ
かの方法（例えば、ポリエチレングリコールのような有
機溶媒、または硫酸アンモニウムのような塩の利用を含
む）によるタンパク質−タンパク質複合体の沈澱を包含
する。他の適切な分離技術は、Rattleら（1984） Clin.
Chem. 30:1457-1461に記載される蛍光抗体磁化粒子法、
および米国特許第4,659,678に記載されるような二重抗
体磁化粒子分離を含むが、これらに限定されない。

【０１２４】種々の標識にタンパク質またはそれらのフ
ラグメントを結合する方法は、広範囲にわたって文献中
に報告されており、本明細書中での詳細な考察は必要と
しない。多くの技術が、ペプチド結合を形成するために
カルボジイミドまたは活性エステルのいずれかの使用を
介して活性化されたカルボキル基の使用、結合のために
クロロアセチルなどの活性化ハロゲンまたはマレイミド
などの活性化オレフィンとメルカプト基を反応させるこ
とによるチオエーテルの形成などを包含する。融合タン
パク質もまた、これらの適用における使用が見出され
る。

【０１２５】本発明の別の診断的局面は、CTLA-8タンパ
ク質の配列から得られるオリゴヌクレオチド配列または
ポリヌクレオチド配列の使用を包含する。これらの配列
は異常な状態（例えば、ガンまたは発生の問題）を有す
る疑いのある患者由来のサンプルにおける抗原メッセー
ジのレベルを検出するためのプローブとして使用され得
る。RNAヌクレオチド配列およびDNAヌクレオチド配列の
両方の調製、配列の標識、および配列の好ましいサイズ
は、文献中で十分に記載され、そして考察されてきた。
標準的には、オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも
約14ヌクレオチドを有し、通常少なくとも約18ヌクレオ
チドを有し、そしてポリヌクレオチドプローブは数キロ
ベースまでであり得る。種々の標識が利用され得、最も
一般的には放射性核種、特に³²Pである。しかし、ポリ
ヌクレオチド中に導入するためにビオチン修飾したヌク
レオチドを用いるような他の技術もまた利用され得る。
次いでビオチンはアビジンまたは抗体に対する結合部位
として作用し、放射性核種、蛍光剤、酵素などのような
幅広い種々の標識で標識され得る。あるいは、特定の二
本鎖（DNA二本鎖、RNA二本鎖、DNA-RNAハイブリッド二
本鎖、またはDNA-タンパク質二本鎖を含む）を認識し得
る抗体が利用され得る。続いて抗体もまた標識され得、
そして二本鎖が表面に結合する場合にアッセイが行わ
れ、その結果、表面上で二本鎖が形成される際に、二本
鎖に結合している抗体の存在が検出され得る。新規なア
ンチセンスRNAに対するプローブの使用は、核酸ハイブ
リダイゼーション、プラススクリーニングおよびマイナ
ススクリーニング、組換えプロービング、ハイブリッド
解離翻訳（HRT）、およびハイブリッド阻害翻訳（HAR
T）のような任意の従来の技術で行われ得る。ポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）のような増幅技術もまた含まれ
る。

【０１２６】他のマーカーの定性的存在または定量的存
在を試験する診断キットもまた、意図される。診断また
は予防は、マーカーとして利用される多数の表示（示
度）の組合わせに依存する。従って、キットはマーカー
の組み合わせを試験し得る。例えば、Vialletら（198
9） Progress in Growth Factor Res. 1:89-97を参照の
こと。

【０１２７】本発明の大まかな範囲は以下の実施例を参
考にして最も良く理解されるが、本発明を特定の実施態
様に限定することを意図しない。

【０１２８】

【実施例】Ｉ．一般的方法 いくつかの標準的な方法は、例えば、Maniatisら（198
2）Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spri
ng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press；Sa
mbrookら（1989）Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual,（第二版]）１〜３巻,CSH Press,NY；Ausubelら、B
iology,Greene Publishing Associates,Brooklyn,NY；
またはAusubelら（1987および増刊）Current Protocols
in Molecular Biology,Greene/Wiley,New York；Innis
ら編（1990） PCR Protocols:A Guide to Methods and
Applications Academic Press,N.Yに記載され、または
述べられている。タンパク質の精製方法は、硫酸アンモ
ニウム沈澱、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠
心分離、結晶化などの方法を包含する。例えば、Ausube
lら（1987および定期増刊）；Deutscher（1990）Method
s in Enzymologyの「Guide to Protein Purification」1
82巻、およびこのシリーズの他の巻；および、例えば、
Pharmacia Piscataway,N.J.またはBio-Rad,Richmond,CA
のタンパク質精製製品の使用に関する製造業者の使用説
明書を参照のこと。組換え技術との組合わせにより適切
なセグメント（例えば、FLAG配列またはプロテアーゼに
よって除去可能な配列を介して融合され得る等価物）へ
の融合が可能になる。例えば、Hochuli（1989）Chemisc
he Industrie 12:69-70;Setlow編のGenetic Engineerin
g,Principle and Methods 12:87-98 Plenum Press,N.Y.
中のHochuli （1990）「Purification of Recombinant
Proteins with Metal Chelate Absorbent」；およびCro
weら（1992） OIAexpress:The High Level Expression
& Protein Purification System QUIAGEN,Inc.,Chatswo
rth,CAに記載されている。

【０１２９】FACS解析は、Melamedら（1990）Flow Cyto
metry and Sorting Wiley-Liss,Inc.,New York,NY;Shap
iro（1988） Practical Flow Cytometry Liss,New Yor
k,NY；およびRobinsonら（1993） Handbook of Flow Cy
tometry Methods Wiley-Liss,New York,NYに記載されて
いる。

【０１３０】CTLA-8メッセージの供給源 適切なプローブを用いて、高いレベルのメッセージ発現
に関して種々の細胞株をスクリーニングした。適切な細
胞株をCTLA-8メッセージの発現レベルに基づいて選択し
た。出願人らは活性化された細胞傷害性のＴ細胞に対す
るサブトラクティブハイブリダイゼーション方法を使用
した。

【０１３１】CTLA-8をコードするクローンの単離 標準的なPCR技術を使用して、ゲノムライブラリーまた
はcDNAライブラリーから、あるいはmRNAから、CTLA-8遺
伝子配列を増幅する。提供された配列から適切なプライ
マーを選択し、そして完全長のクローンを単離する。完
全長のクローン、またはその適切なフラグメントは、ハ
イブリダイゼーションプローブとして使用され得、例え
ば、ストリンジェントなまたはストリンジェンシーの低
いハイブリダイゼーションの条件を使用して、他の相同
遺伝子をスクリーニングする。

【０１３２】別の方法において、オリゴヌクレオチドを
用いてライブラリーをスクリーニングし得る。ポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）技術と組合わせて、適切な方向の
合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、
ライブラリーから正確なクローンを選択する。

【０１３３】II．ヒトCTLA-8の単離 ヒトゲノムライブラリーをClontech（カタログHL1006
d）から入手し、そして453塩基対のマウスCTLA-8の完全
コード配列からなるcDNAプローブでスクリーニングし
た。配列番号１を参照のこと。多くの独立したλクロー
ンがmCTLA-8プローブと強くハイブリダイズすることが
見出された。１つのクローンは、約2000塩基対のハイブ
リダイズしているXbaIフラグメントを含んだ。これはヒ
トゲノムDNAサザンブロットで同様のプローブを使用し
て以前に検出されたフラグメントと一致する。この2000
塩基対フラグメントをBluescript（Stratagene）にサブ
クローン化しそして配列決定した。これにより配列番号
１のマウスCTLA-8に83.8％相同な、240塩基対領域（配
列番号５を参照のこと）が明らかになった。この領域の
翻訳で、マウスCTLA-8推定タンパク質のカルボキシル末
端の79アミノ酸に70.8％相同なアミノ酸配列が生じた。
コード領域の最後の21ヌクレオチドと一致するプライマ
ーで作製されたcDNAのライブラリーをスクリーニングす
るためにエキソンをプローブとして使用した。ヒトCTLA
-8の完全なコード領域を含む３つの独立したcDNAクロー
ンを得た。468塩基対オープンリーディングフレーム
は、理論的分子量17,100ダルトンの155アミノ酸ポリペ
プチドをコードする。配列番号７〜８を参照のこと。こ
のヒトCTLA-8はウイルスのORF-13に66.4％相同であり、
そしてマウスCTLA-8コードタンパク質に58.3％相同であ
る。さらに、６つのシステインが３つの遺伝子の間で保
存されており、および予測されるグリコシル化部位なら
びにリン酸化部位も保存される。

【０１３４】ヒトCTLA-8アミノ酸配列の分析により、シ
グナルペプチドに類似する、アミノ末端の７位から約25
位の19残基の疎水性ストレッチが明らかになった。ヒト
CTLA-8はサイトカインに類似した分子量の分泌タンパク
質であるようである。

【０１３５】III. CTLA-8タンパク質の生化学的特徴付
け ２つの型のヒトCTLA-8が異種細胞において発現された；
天然型、およびカルボキシル末端でFLAGぺプチドを示す
組換え型である。例えば、Croweら（1992） OIAexpres
s: The High Level Expression and Protein Purificat
ion System QUIGEN,Inc.Chatsworth,CA;およびHoppら
（1988） Bio/Technology 6:1204-1210を参照のこと。
これらの２つの型のヒトCTLA-8タンパク質を、発現ベク
ターpME18SまたはpEE12中に導入し、次いでエレクトロ
ポレーションによりCOS-7細胞またはNSO細胞にそれぞれ
トランスフェクトした。次いでエレクトポレートした細
胞を10％ウシ胎児血清を補充したRPMI培地で48時間培養
した。次いで細胞性タンパク質を標識するために細胞を
³⁵S-Metおよび³⁵S-Cysとインキュベートした。SDS-PAGE
における還元条件下でのタンパク質の比較は、ヒトCTLA
-8でトランスフェクトされた細胞が15,000ダルトンのポ
リペプチドを分泌することを示した。非還元SDS-PAGEに
より、28,000ダルトンおよび33,000ダルトン付近の２つ
の特異的なバンドが明らかになった。

【０１３６】トランスフェクトされたCOS-7細胞およびN
SO細胞と同様に、活性化CD4+Ｔ細胞によって生成される
ヒトCTLA-8の天然形態もまた、２量体として分泌される
かどうかを決定するために、末梢血単核細胞（PBMC）を
Ficoll勾配で500mlのヒト血液から精製した。Ｂ細胞、C
D8+T細胞、単球、およびNK細胞を、抗CD19、抗CD８、抗
CD14、および25μgのNKH1モノクローナル抗体（Coulte
r,Hialeah,FL）を含む100μlの腹水液（ascitic flui
d）を使用して枯渇させた。４℃で30分間インキュベー
ションした後、PBMCを10％ウシ胎児血清（FCS）を含有
するRPMIで２回洗浄した。マウスIgGに対するヤギ抗体
でコートしたパラマグネティックビーズ（Dynabeads M4
50,Dynal,Oslo,Norway）を、枯渇させるために最終濃度
が５ビーズ/細胞になるように添加した。次いで、所望
でない細胞をマグネットに３回通して除去した。残存す
る細胞は純度87％のCD4+細胞であり、これを10％FCS、1
0ng/ml PMA（Sigma,St.Louis,MO）および500ng/mlのイ
オノマイシン（Sigma,St.Louis,MO）を含有するDMEMF12
（Gibco,Gaithersburg,MD）で10⁷細胞/mlとなるように
希釈した。５％CO₂中、37℃で４時間インキュベートし
た後、培地を１％透析FCS、10ng/ml PMAおよび500ng/ml
イオノマイシンを補充したメチオニンおよびシステイン
非含有のDMEM（ICN Biomedicals,Costa Mesa,CA）に変
え、そして５％CO₂中、37℃で１時間インキュベートし
た。100μCi/mlの³⁵S-メチオニンおよび³⁵S-システイン
（Amersham）を添加し、そして代謝標識を５％CO₂中、3
7℃で18時間行った。上清を抗IFN-g Mab B27および0.5m
lのプロテイン-Gセファロース（Sigma St.Louis,MO）で
予め清澄化（preclear）した後、上清をヒトCTLA-8に対
するモノクローナル抗体を使用して免疫沈降した。免疫
沈降したタンパク質をSDS-PAGEで分析した。CD4+Ｔ細胞
およびトランスフェクトされたNSO細胞は、ヒトCTLA-8
二量体に一致する28,000ダルトンおよび33,000ダルトン
の２つのバンドを明らかにする。従って、トランスフェ
クトされたNSO細胞に由来するヒトCTLA-8、および活性
化されたＴ細胞から単離されたCTLA-8は同じ生物学的特
徴を示す。

【０１３７】IV．ヒトCTLA-8の大規模生成 生物学的アッセイのために、１％のNutridoma HU（Boer
inger Mannheim,Mannheim,Germany）を補充したRPMI培
地中で増殖したトランスフェクトCOS-7細胞により、ヒ
トCTLA-8およびヒトCTLA-8-FLAGを大量に生成し、次い
で精製した。

【０１３８】天然ヒトCTLA-8またはヒトCTLA-8-FLAGを
大量に生成するために、Celltech（Slough,Berkshire,U
K；国際特許出願第WO86/05807号、同第WO87/04462号、
同第WO89/01036号、およびWO89/10404号）によって開発
された方法論に従って、NSO細胞の安定な形質転換体を
調製した。CTLA-8およびCTLA-8-FLAGの両方をpEE12にサ
ブクローン化し、次いでエレクトロポレーションにより
NSO細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトNSO
細胞を、Celltechのプロトコルに記載されたように10％
ウシ胎児血清を補充したグルタミン非含有選択DMEMに播
種した。最も良く産生している株由来の上清をヒトCTLA
-8およびヒトCTLA-8-FLAGの生物学的アッセイおよび精
製に使用した。

【０１３９】ヒトCTLA-8タンパク質の精製 代表的に、ヒトCTLA-8またはヒトCTLA-8-FLAGを含む１
リットルの上清を、Chelating Sepharose Fast Flowマ
トリックス（Pharmacia,Upsalla,Sweden）に合体させた
Zn⁺⁺イオンの60mlカラムに通した。10倍容量の結合緩衝
液（His-Bind Bufferキット,Novagen,Madison,WI）で洗
浄した後、金属イオンによって保持されたタンパク質を
20〜100mM イミダゾールの勾配で溶出した。溶出画分中
のヒトCTLA-8-FLAG含有量を、抗FLAGモノクローナル抗
体 M2（Eastman Kodak,New Haven,CT）を使用してドッ
トブロットにより測定し、一方ヒトCTLA-8含有量は非還
元SDS-PAGEの銀染色により評価した。次いでCTLA-8を含
む画分をプールし、PBSに対して透析し、そして生物学
的アッセイまたはDEAEカラムでの陰イオン交換HPLCによ
るさらなる精製のいずれかに使用した。

【０１４０】CTLA-8に特異的な抗体の調製 近親交配のBalb/cマウスを、０日目にFreundの完全アジ
ュバント中で、そして15日目および22日目にFreundの不
完全アジュバント中で、乳状化した１mlの精製ヒトCTLA
-8-FLAGを用いて腹腔内に免疫した。マウスを0.5mlの精
製hCTLA-8でブーストし、静脈内投与した。

【０１４１】非分泌ミエローマ細胞株SP2/0-Ag8および
融合剤としてポリエチレングリコール1000（Sigma,St.L
ouis,MO）を使用して、ハイブリドーマを作製した。ハ
イブリドーマ細胞を96ウェルのFalcon組織培養プレート
（Becton Dickinson,NJ）中に入れ、そして80μg/mlゲ
ンタマイシン、２mMグルタミン、10％ウマ血清（Gibco,
Gaithersburg,MD）、１％ADCM（CRTS,Lyon,France）、1
0^-5Mアザセリン（Sigma,St.Louis,MO）および５×10^-5M
ヒポキサンチンを補充したDMEM F12（Gibco,Gaithersbu
rg,MD）を与えた。アセトンで固定したヒトCTLA-8トラ
ンスフェクトCOS-7細胞を使用する免疫細胞化学（IC
C）、およびコーティング抗原としてCOS-7細胞上清から
精製されるヒトCTLA-8-FLAGを使用するELISAによって、
ヒトCTLA-8に対する抗体産生についてハイブリドーマ上
清をスクリーニングした。陽性細胞クローンのアリコー
トを６日間拡大して凍結保存し、ならびにプリスタン
（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン、Sigma,St.Lou
is,MO）処理Balb/cマウス（15日前にプリスタンの腹腔
内注射を受けた）由来の腹水中で増殖させた。１mlのPB
S中の約10⁵のハイブリドーマ細胞を腹腔内に与え、そし
て10日後に、腹水を各マウスから回収した。

【０１４２】腹水を遠心分離した後、抗体画分を硫酸ア
ンモニウム沈澱、および20mM TrispH8.0で平衡化したZe
phyr-Dシリシウム（silicium）カラム（IBF Sepracor）
での陰イオン交換クロマトグラフィーによって単離し
た。タンパク質をNaCl勾配（0M〜1M NaClの範囲）で溶
出した。２mlの画分を回収し、抗CTLA-8抗体の存在をEL
ISAによって試験した。特異的な抗CTLA-8活性を含む画
分をプールし、透析し、そして凍結した。精製モノクロ
ーナル抗体のアリコートをペルオキシダーゼ標識した。

【０１４３】ヒトCTLA-8の定量化 CTLA-8に特異的な抗体の中のAb25およびペルオキシダー
ゼ標識したAb16を選択し、サンドイッチアッセイを使用
してヒトCTLA-8のレベルを定量した。精製Ab25をコーテ
ィング緩衝液（炭酸緩衝液,pH9.6。15mM Na₂CO₃、35mM
NaHCO₃）中で２μg/mlに希釈した。この希釈溶液で96ウ
エルELISAプレート（Immunoplate Maxisorp F96 certif
ied,NUNC,Denmark）を、室温で一晩コートした。次いで
このプレートをリン酸緩衝化生理食塩水および0.05％Tw
een 20（Technicon Diagnositics,USA）からなる洗浄緩
衝液で１回手で洗浄した。TBS-B-T緩衝液[20mM Tris,15
0mM NaCl,１％ BSA（Sigma,St.Louis,MO）,および0.05
％ Tween20]で希釈した110μlの精製ヒトCTLA-8を各ウ
ェルに添加した。37℃で３時間インキュベートした後、
プレートを１回洗浄した。TBS-B-T緩衝液で５μg/mlま
で希釈した100μlのペルオキシダーゼ標識Ab16を各ウェ
ルに加え、そして２時間37℃でインキュベートした。次
いでウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。クエン酸/リ
ン酸緩衝液中で１mg/mlに希釈した100μlのペルオキシ
ダーゼ基質、すなわち2.2'アジノ-ビス（3-エチルベン
ゾズチアゾン-6-スルホン酸）（ABTS）を各ウェルに添
加し、そして比色反応を405nmで読んだ。検出された最
も低いヒトCTLA-8の濃度は0.015ng/mlであった。

【０１４４】Ｖ．CTLA-8ホモログの単離 結合組成物をCTLA-8タンパク質を発現する細胞株から作
製された発現ライブラリーのスクリーニングに使用す
る。標準的な染色技術を使用して、細胞内または表面で
発現される抗原を検出または分類するか、あるいは表面
発現形質転換細胞をパニングによってスクリーニングす
る。細胞内発現のスクリーニングを、種々の染色手順ま
たは免疫蛍光手順により実施する。McMahanら（1991）E
MBO J. 10:2821-2832もまた参照のこと。

【０１４５】例えば、０日目に、2-チャンバーのペルマ
ノックス（permanox）スライドを、チャンバー当り１ml
のPBS中の10ng/mlフィブロネクチンで、30分間室温でプ
レコートする。PBSで一回リンスする。次いで、１チャ
ンバー当り1.5mlの増殖培地中、２〜３×10⁵のCOS細胞
をプレートする。37℃で一晩インキュベートする。

【０１４６】１日目に、各サンプル用に66mg/ml DEAEデ
キストラン、66mMクロロキン、および無血清DME中の４m
g DNAの溶液0.5mlを調製する。各セットについて、ポジ
ティブコントロール（例えば、１倍希釈および1/200倍
希釈のhuIL-10-FLAG cDNA）、およびネガティブモック
（mock）を調製する。無血清DMEで細胞をリンスする。D
NA溶液を添加し、37℃で５時間インキュベートする。培
地を取り除き、そしてDME中の10％ DMSO、0.5mlを2.5分
間添加する。DMEを取り除き、そして１回DMEで洗浄す
る。1.5mlの増殖培地を添加し、一晩インキュベートす
る。

【０１４７】２日目に、培地を交換する。３日目または
４日目に、細胞を固定し、そして染色する。ハンクス緩
衝化生理食塩水溶液（HBSS）で２回細胞を洗浄し、４％
のパラホルムアルデヒド（PFA）／グルコース中で５分
間固定する。HBSSで３回洗浄する。全ての液体を除去し
た後にスライドを-80℃で保存し得る。各チャンバーに
ついて、0.5mlのインキュベーションを以下のように実
施する。32ml/mlの１MNaN₃を有するHBSS/サポニン（0.1
％）を20分間に亘って添加する。次いで、細胞をHBSS/
サポニンで１回洗浄する。可溶性抗体を細胞に添加し、
そして30分間インキュベートする。HBSS/サポニンで細
胞を２回洗浄する。二次抗体（例えば、Vector抗マウス
抗体）を1/200希釈で添加し、そして30分間インキュベ
ートする。ELISA溶液（例えば、Vector EliteABC西洋ワ
サビペルオキシダーゼ溶液）を調製し、30分間プレイン
キュベートする。例えば、2.5ml HBSS/サポニン当り１
滴の溶液Ａ（アビジン）および１滴の溶液Ｂ（ビオチ
ン）を使用する。HBSS/サポニンで細胞を２回洗浄す
る。ABC HRP溶液を添加し、そして30分間インキュベー
トする。細胞をHBSSで２回洗浄し、二回目の洗浄は２分
間行い、それにより細胞を閉じる。次いで、Vectorジア
ミノ安息香酸を（DAB）５分〜10分間添加する。5mlのガ
ラス蒸留水（glassdistilled water）につき、２滴の緩
衝液および４滴のDAB、および２滴のH₂O₂を使用する。
注意深くチャンバーを取り出し、そしてスライドを水中
でリンスする。数分間空気乾燥して、ついで１滴のCrys
tal Mountを添加し、カバーガラスをかける。85〜90℃
で５分間ベークする。

【０１４８】あるいは、結合組成物を用いて抗原を発現
する細胞をアフィニティー精製、または分類する。例え
ば、Sambrookら、またはAusubelらを参照のこと。

【０１４９】同様の方法を、種変種または対立遺伝子変
種を単離するために適用し得る。種変異体は、プローブ
として、１つの種由来の完全長の単離物またはフラグメ
ントを基にして、種間ハイブリダイゼーション技術を使
用して単離される。

【０１５０】ヒトCTLA-8の生物学的活性 滑膜切除をうけた慢性関節リュウマチ患者から滑膜細胞
（synoviocyte）を単離した。Dechanetら（1993） J.Im
munol. 151:4908-4917に記載される手順に従って、一次
細胞株を樹立した。滑膜細胞を３〜８継代目で、96ウェ
ル平底プレートに10⁴細胞／ウェルで播種した。CTLA-8
をウエルに添加し、そして48時間インキュベートした。
次いで上清を回収し、そして即座に試験するかまたは凍
結した。すべてのサンプルをELISAによって三重に試験
した。IL-6、IL-8およびGM-CSFのためのELISAキットはM
edgenix（Fleurus,Belgium）から得た。MIP-1aおよびTG
FbのためのELISAキットは、R&D Systems（Minneapolis,
MN）から得た。プロスタグランジンE2（PGE2）レベルを
RIAキット（New England Nuclear,Boston,MA）によって
測定した。

【０１５１】COS-7トランスフェクト細胞またはNSOトラ
ンスフェクト細胞のいずれかによって産生され、精製さ
れた天然のヒトCTLA-8およびCTLA-8-FLAGは、異なる患
者のリュウマチ様滑膜細胞からIL-6の分泌を顕著に誘導
した。同様に、NSO細胞由来の精製した天然のヒトCTLA-
8は、リュウマチ様滑膜細胞からのIL-8およびPGE2の分
泌を刺激した。

【０１５２】抗CTLA-8モノクローナル抗体がヒトCTLA-8
の生物学的活性をブロックする能力についてそれらを試
験した。滑膜細胞へ添加する前に、１ng/mlのヒトCTLA-
8を１μg/mlの抗CTLA-8モノクローナル抗体とインキュ
ベートした。大部分のモノクローナル抗体が、滑膜細胞
からのIL-6の分泌を部分的にまたは全体的にブロックし
得た。同様に、ヒトCTLA-8で誘導されるIL-8およびPGE2
の分泌もまた、抗CTLA-8モノクローナル抗体によって阻
害された。これらのことを考慮すると、これらの結果
は、CTLA-8が、繊維芽細胞の炎症性の媒介物（例えば、
IL-6、IL-8、またはPGE2）の分泌を誘導するプロ炎症性
（proinflammatory）サイトカインとして作用すること
を示した。

【０１５３】以下に示す配列表において、配列番号１
は、マウスCTLA-8cDNAの核酸配列である。配列番号２
は、マウスCTLA-8ぺプチドアミノ酸配列である。配列番
号３は、ヘルペスウイルスORF13核酸配列である。配列
番号４は、ヘルペスウイルスORF13の予想されるアミノ
酸配列である。配列番号５は、ヒトCTLA-8エキソンcDNA
の核酸配列である。配列番号６は、ヒトCTLA-8エキソン
の予測されるアミノ酸配列である。配列番号７は、ヒト
CTLA-8完全長cDNA配列である。配列番号８は、Ｎ末端シ
グナル配列を含むヒトCTLA-8の予測されるアミノ酸配列
である。配列番号９は、予測される成熟した生物学的に
活性なアミノ酸配列である。

【０１５４】本明細書中で引用したすべての参考文献
は、個々の刊行物または特許出願のそれぞれが、特別に
および個別に本明細書中で援用されていることが示され
るのと同じ範囲まで、本明細書中に参考として援用され
る。

【０１５５】本発明の多くの改変および変形は、当業者
に明白なように、本発明の意図および範囲から逸脱する
ことなく行われ得る。本明細書中で記載した特定の実施
態様は実施例という方法によってのみ提供され、そして
本発明は、請求項が権利を与えられるに等しい全ての範
囲に加え、添付の請求項の用語によってのみ限定される
ものである。

【０１５６】

【発明の効果】本発明によって、重要な治療価値を持つ
試薬が提供される。CTLA-8タンパク質（天然に生じるCT
LA-8タンパク質、または組換えCTLA-8タンパク質）、そ
のフラグメント、およびそれらに対する抗体、さらにCT
LA-8タンパク質に対して結合親和性を有すると同定され
る化合物は、異常な増殖（例えば、ガン状態）、または
変性（degenerative）状態を含む異常な生理状態または
発生状態に関連する状態の処置において有用である。

【０１５７】

【配列表】

配列番号１： 配列の長さ：1080塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴： （A）特徴を表す記号：CDS （B）存在位置：12..464 配列 GAATTCCATC C ATG TGC CTG ATG CTG TTG CTG CTA CTG AAC CTG GAG GCT 50 Met Cys Leu Met Leu Leu Leu Leu Leu Asn Leu Glu Ala 1 5 10 ACA GTG AAG GCA GCG GTA CTC ATC CCT CAA AGT TCA GTG TGT CCA AAC 98 Thr Val Lys Ala Ala Val Leu Ile Pro Gln Ser Ser Val Cys Pro Asn 15 20 25 GCC GAG GCC AAT AAC TTT CTC CAG AAC GTG AAG GTC AAC CTG AAA GTC 146 Ala Glu Ala Asn Asn Phe Leu Gln Asn Val Lys Val Asn Leu Lys Val 30 35 40 45 ATC AAC TCC CTT AGC TCA AAA GCG AGC TCC AGA AGG CCC TCA GAC TAC 194 Ile Asn Ser Leu Ser Ser Lys Ala Ser Ser Arg Arg Pro Ser Asp Tyr 50 55 60 CTC AAC CGT TCC ACT TCA CCC TGG ACT CTG AGC CGC AAT GAG GAC CCT 242 Leu Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu Ser Arg Asn Glu Asp Pro 65 70 75 GAT AGA TAT CCT TCT GTG ATC TGG GAG GCA CAG TGC CGC CAC CAG CGC 290 Asp Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Gln Cys Arg His Gln Arg 80 85 90 TGT GTC AAC GCT GAG GGG AAG TTG GAC CAC CAC ATG AAT TCT GTT CTC 338 Cys Val Asn Ala Glu Gly Lys Leu Asp His His Met Asn Ser Val Leu 95 100 105 ATC CAG CAA GAG ATC CTG GTC CTG AAG AGG GAG CCT GAG AAG TGC CCC 386 Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Lys Arg Glu Pro Glu Lys Cys Pro 110 115 120 125 TTC ACT TTC CGG GTG GAG AAG ATG CTG GTG GGC GTG GGC TGC ACC TGC 434 Phe Thr Phe Arg Val Glu Lys Met Leu Val Gly Val Gly Cys Thr Cys 130 135 140 GTT TCC TCT ATT GTC CGC CAT GCG TCC TAAACAGAGA CCTGAGGCTA 481 Val Ser Ser Ile Val Arg His Ala Ser 145 150 GCCCCTAAGA AACCCCTGCG TTTCTCTGCA AACTTCCTTG TCTTTTTAAA 531 ACAGTTCACA GTTGAATCTC AGCAAGTGAT ATGGATTTAA AGGCGGGGTT 581 AGAATTGTCT GCCTTCCACC CTGAAAAGAA GGCGCAGAGG GGATATAAAT 631 TGCTTCTTGT TTTTCTGTGG GCTTTAAATT ATTTATGTAT TTACTCTATC 681 CCGAGATAAC TTTGAGGCAT AAGTTATTTT AATGAATTAT CTACATTATT 731 ATTATGTTTC TTAATGCAGA AGACAAAATT CAAGACTAAG AAATTTTATT 781 ATTTAAAAGG TAAAACCTAT ATTTATATGA GCTATTTATG GGTCTATTTA 831 TTTTTCTTCA GTGCTAAGAT CATGATTATC AGATCTACCT AAGGAAGTCC 881 TAAATAATAT TAAATATTAA TTGAAATTTC AGTTTTACTA TTTGCTTATT 931 TAAGGTTCCC TCCTCTGAAT GGTGTGAAAT CAAACCTCGT TTTATGTTTT 981 TAAATTATTG AGGCTTCGAA AAATTGGGCA ATTTAGCTTC CTACTGTGTG 1031 TTTAAAAACC TTGTAACAAT ATCACTATAA TAAATTTTTG GAAGAAAAT 1081 配列番号２； 配列の長さ：150アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Cys Leu Met Leu Leu Leu Leu Leu Asn Leu Glu Ala Thy Val Lys 1 5 10 15 Ala Ala Val Leu Ile Pro Gln Ser Ser Val Cys Pro Asn Ala Glu Ala 20 25 30 Asn Asn Phe Leu Gln Asn Val Lys Val Asn Leu Lys Val Ile Asn Ser 35 40 45 Leu Ser Ser Lys Ala Ser Ser Arg Arg Pro Ser Asp Tyr Leu Asn Arg 50 55 60 Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu Ser Arg Asn Glu Asp Pro Asp Arg Tyr 65 70 75 80 Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Gln Cys Arg His Gln Arg Cys Val Asn 85 90 95 Ala Glu Gly Lys Leu Asp His His Met Asn Ser Val Leu Ile Gln Gln 100 105 110 Glu Ile Leu Val Leu Lys Arg Glu Pro Glu Lys Cys Pro Phe Thr Phe 115 120 125 Arg Val Glu Lys Met Leu Val Gly Val Gly Cys Thr Cys Val Ser Ser 130 135 140 Ile Val Arg His Ala Ser 145 150 配列番号３： 配列の長さ：456塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴： （A）特徴を表す記号：CDS （B）存在位置：1..453 配列 ATG ACA TTT AGA ATG ACT TCA CTT GTG TTA CTT CTG CTG CTG AGC ATA 48 Met Thr Phe Arg Met Thr Ser Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile 1 5 10 15 GAT TGT ATA GTA AAG TCA GAA ATA ACA AGC GCA CAA ACC CCA AGA TGC 96 Asp Cys Ile Val Lys Ser Glu Ile Thr Ser Ala Gln Thr Pro Arg Cys 20 25 30 TTA GCT GCT AAC AAT AGC TTT CCA CGG TCT GTG ATG GTT ACT TTG AGC 144 Leu Ala Ala Asn Asn Ser Phe Pro Arg Ser Val Met Val Thr Leu Ser 35 40 45 ATC CGT AAC TGG AAT ACT AGT TCT AAA AGG GCT TCA GAC TAC TAC AAT 192 Ile Arg Asn Trp Asn Thr Ser Ser Lys Arg Ala Ser Asp Tyr Tyr Asn 50 55 60 AGA TCT ACG TCT CCT TGG ACT CTC CAT CGC AAT GAA GAT CAA GAT AGA 240 Arg Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu His Arg Asn Glu Asp Gln Asp Arg 65 70 75 80 TAT CCC TCT GTG ATT TGG GAA GCA AAG TGT CGC TAC TTA GGA TGT GTT 288 Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg Tyr Leu Gly Cys Val 85 90 95 AAT GCT GAT GGG AAT GTA GAC TAC CAC ATG AAC TCA GTC CCT ATC CAA 336 Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln 100 105 110 CAA GAG ATT CTA GTG GTG CGC AAA GGG CAT CAA CCC TGC CCT AAT TCA 384 Gln Glu Ile Leu Val Val Arg Lys Gly His Gln Pro Cys Pro Asn Ser 115 120 125 TTT AGG CTA GAG AAG ATG CTA GTG ACT GTA GGC TGC ACA TGC GTT ACT 432 Phe Arg Leu Glu Lys Met Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr 130 135 140 CCC ATT GTT CAC AAT GTA GAC TAA 456 Pro Ile Val His Asn Val Asp 145 150 配列番号４： 配列の長さ：151アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Thr Phe Arg Met Thr Ser Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile 1 5 10 15 Asp Cys Ile Val Lys Ser Glu Ile Thr Ser Ala Gln Thr Pro Arg Cys 20 25 30 Leu Ala Ala Asn Asn Ser Phe Pro Arg Ser Val Met Val Thr Leu Ser 35 40 45 Ile Arg Asn Trp Asn Thr Ser Ser Lys Arg Ala Ser Asp Tyr Tyr Asn 50 55 60 Arg Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu His Arg Asn Glu Asp Gln Asp Arg 65 70 75 80 Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg Tyr Leu Gly Cys Val 85 90 95 Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln 100 105 110 Gln Glu Ile Leu Val Val Arg Lys Gly His Gln Pro Cys Pro Asn Ser 115 120 125 Phe Arg Leu Glu Lys Met Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr 130 135 140 Pro Ile Val His Asn Val Asp 145 150 配列番号５： 配列の長さ：240塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列の特徴： （A）特徴を表す記号：CDS （B）存在位置：1..240 配列 AGC CGC AAT GAG GAC CCT GAG AGA TAT CCC TCT GTG ATC TGG GAG GCA 48 Ser Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala 1 5 10 15 AAG TGC CGC CAC TTG GGC TGC ATC AAC GCT GAT GGG AAC GTG GAC TAC 96 Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr 20 25 30 CAC ATG AAC TCT GTC CCC ATC CAG CAA GAG ATC CTG GTC CTG CGC AGG 144 His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg 35 40 45 GAG CCT CCA CAC TGC CCC AAC TCC TTC CGG CTG GAG AAG ATA CTG GTG 192 Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val 50 55 60 TCC GTG GGC TGC ACC TGT GTC ACC CCG ATT GTC CAC CAT GTG GCC TA 240 Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 65 70 75 80 配列番号６： 配列の長さ：79アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ser Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Sel Val Ile Trp Glu Ala 1 5 10 15 Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr 20 25 30 His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg 35 40 45 Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val 50 55 60 Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 65 70 75 配列番号７： 配列の長さ：510塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴： （A）特徴を表す記号：CDS （B）存在位置：43..507 配列 GGCACAAACT CATCCATCCC CAGTTGATTG GAAGAAACAA CG ATG ACT CCT GGG 54 Met Thr Pro Gly 1 AAG ACC TCA TTG GTG TCA CTG CTA CTG CTG CTG AGC CTG GAG GCC ATA 102 Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Glu Ala Ile 5 10 15 20 GTG AAG GCA GGA ATC ACA ATC CCA CGA AAT CCA GGA TGC CCA AAT TCT 150 Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser 25 30 35 GAG GAC AAG AAC TTC CCC CGG ACT GTG ATG GTC AAC CTG AAC ATC CAT 198 Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His 40 45 50 AAC CGG AAT ACC AAT ACC AAT CCC AAA AGG TCC TCA GAT TAC TAC AAC 246 Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn 55 60 65 CGA TCC ACC TCA CCT TGG AAT CTC CAC CGC AAT GAG GAC CCT GAG AGA 294 Arg Ser Thr Ser Plo Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg 70 75 80 TAT CCC TCT GTG ATC TGG GAG GCA AAG TGC CGC CAC TTG GGC TGC ATC 342 Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile 85 90 95 100 AAC GCT GAT GGG AAC GTG GAC TAC CAC ATG AAC TCT GTC CCC ATC CAG 390 Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln 105 110 115 CAA GAG ATC CTG GTC CTG CGC AGG GAG CCT CCA CAC TGC CCC AAC TCC 438 Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser 120 125 130 TTC CGG CTG GAG AAG ATA CTG GTG TCC GTG GGC TGC ACC TGT GTC ACC 486 Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr 135 140 145 CCG ATT GTC CAC CAT GTG GCC TAA 510 Pro Ile Val His His Val Ala 150 155 配列番号８： 配列の長さ：155アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly 20 25 30 Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 35 40 45 Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 50 55 60 Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 65 70 75 80 Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 85 90 95 Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser 100 105 110 Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 115 120 125 Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile/Lys Leu Val Ser Val Gly Cys 130 135 140 Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val/Leu Ala 145 150 155 配列番号９： 配列の長さ：132アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile/Lys Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile 115 120 125 Val His His Val/Leu Ala 130

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 596129215 2000 Ｇａｌｌｏｐｉｎｇ Ｈｉｌｌ Ｒｏａｄ， Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ 07033−0530, Ｕ．Ｓ．Ａ (72)発明者 ピエール ゴルスタン フランス国 マルセイユ エフ−13009, シュマン ジョゼフ エキエール， 34， ヴィラ 41 (72)発明者 エリック ルヴィエ フランス国 マルセイユ エフ−13009, トラヴェルス ドゥ ラ グフォン ヌ， 109， ヴァルマント ミシュレ ベー４ (72)発明者 フランソワ フォシエ フランス国 クラポンヌ エフ−69290, レジダンス ドゥ ラ ヴォワ−ロメ ンヌ， 51 (72)発明者 セルジュ ジー．ウー． ルベック フランス国 シャゼ−ダゼルク エフ− 69380， リュ モリス−ラヴェル，11 (72)発明者 オディール ジョス フランス国 フランシュヴィル エフ− 69340， シュマン ドゥ カルザン （番地なし) (72)発明者 ジャック バンシュロ フランス国 エキュイ エフ−69130, アベニュ ポール−サンティ，25 (56)参考文献 特表 平９−501572（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．66, （1992），ｐ．5047−5058 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．150, （1993），ｐ．5445−5456 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A61K 31/00 - 51/12 C07K 14/00 - 16/46 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号８のアミノ酸２６〜１５６を含
   む霊長類ＣＴＬＡ−８タンパク質のフラグメントをコー
   ドする核酸と少なくとも９５％同一である核酸であっ
   て、ここで、該フラグメントは、ＩＬ−６の分泌を誘導
   し得、ここで、該核酸が配列番号８のアミノ酸２６〜１
   ５６を含む霊長類ＣＴＬＡ−８タンパク質をコードする
   核酸と少なくとも９５％同一である核酸は除く、核酸。