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JP2996995B2 - 茎頂による植物の形質転換方法 - Google Patents

茎頂による植物の形質転換方法

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Publication number
JP2996995B2
JP2996995B2 JP1506572A JP50657289A JP2996995B2 JP 2996995 B2 JP2996995 B2 JP 2996995B2 JP 1506572 A JP1506572 A JP 1506572A JP 50657289 A JP50657289 A JP 50657289A JP 2996995 B2 JP2996995 B2 JP 2996995B2
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ザ テキサス エイ アンド エム ユニヴァーシティ システム
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

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Description

【発明の詳細な説明】 これは1988年６月１日に出願された特許出願第201,56
8号の一部継続出願である。
本発明は、高水準の迅速な再生及び低リスクの組織培
養誘導遺伝的変異でもって植物を形質転換する方法に関
する。詳細には、その方法は形質転換のため及び植物の
再生に於けるその後の使用のための標的組織として幼植
物組織から分離された茎頂または無傷の植物のえき芽を
使用する。
農業上重要な作物に関して植物細胞培養系からの日常
的な反覆可能な再生を欠くことは、植物への遺伝子工学
技術の適用の際の重大な障害である。更に、ラーキン
（Larkin）及びスコウクロフト（Scowcroft）著、Theo
r.Appl.Genet.60巻、197頁（1981年）に報告されている
ように、植物が試験管内で不定に再生される場合には、
ソマクローナル（Somaclonal）変異の可能性がある。ソ
マクローナル変異体がA.ツメファシエンス（tumefacien
s）媒介遺伝子伝達に続いて生じ得る。ソマクローナル
変異は、カルス中間体から誘導される植物中に観察され
る遺伝的変異性である。形質転換された植物のもとの遺
伝的完全性を維持することが必須である場合には、この
現象は望ましくない。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacter
ium tumefaciens）は、遺伝子伝達のための共存培養形
中の葉盤、表皮果皮またはその他の外植に関して好まし
いベクターであった。A.ツメファシェンス媒介遺伝子伝
達は、培養中のソラナセアス（Solanaceas）科の操作の
容易なこと及びこの科に対するアグロバクテリウム種の
感染力のためにこの科の構成員を用いて展開されてい
た。多くのその他の双子葉種がアグロバクテリウムに適
した宿主であると知られているが、少数のこれらの種の
みからの植物が主として再生系の欠如のためにうまく形
質転換されていた。
ホルシュ（Horsh）らによる葉盤形質転換系の開発（A
nn.Rev.Plant.Physiol.38巻、467頁（1987年）を参照の
こと）が、外来遺伝子物質の殆どの慣例の伝達を可能に
したが、限られた数の植物種への伝達のみを可能にし
た。このモデル系は葉外植物質から再生するのに比較的
容易であるソラナセアエ科の構成員：ペチュニア、タバ
コ及びトマトを使用して実証された。葉盤技術はプロト
プラスト形質転換系に固有の多くの問題、特に必要とさ
れる延長された培養期間及びプロトプラスト植物の制限
された再生を解決した。
しかしながら、葉盤系は極めて制限される。最も重大
な制限は、少数の植物種を葉組織から再生し得ることで
ある。幾つかの培養ペチュニア品種に関してさえも、葉
盤からの再生が困難である。葉盤系の別の制限は、不定
茎分裂組織が表皮の葉組織及び皮下の葉組織から分化す
ることである。葉盤法の派生法が、体細胞胚形成の誘導
と組合せた幼植物組織の使用、並びにカルスの使用、そ
の後の茎誘導を含むように開発された。しかしながら、
これらの場合の夫々に於いて、胚並びに茎分裂組織は不
定に発達する必要があるので、ソマクローナル変異の可
能性がある。
植物形質転換の別の系がトリン（Trinn）らにより開
発された（5 Biotechnology、1081頁（1987年）を参照
のこと）。この系はタバコ表皮果皮系の使用及びアグロ
バクテリウムによる共存培養を伴なう。この系の利点
は、８週間で花及び種子の直接生産であった。再度、こ
の系の重大な関心は、作物種へのこの技術の制限された
適用及びソマクローナル変異の可能性である。何となれ
ば、植物が不定の器官形成により生じるからである。
本発明は、遺伝子伝達を受ける組織として茎頂組織を
使用することにより、前記の技術により呈された障害に
取り組むものである。このような組織の使用は、形質転
換される植物の特異的なクローン特性及び遺伝子特性を
永続化するとともに、植物の早い繁殖を可能にする。茎
先端培養及びえき芽増殖を含む、茎分裂組織が本発明の
実施に好ましい。茎頂は植物形質転換に最も好ましい外
植である。何となれば、殆どの草本双子葉植物及び単子
葉植物がこの外植源を用いて無傷植物に生殖し得るから
である。また、茎培養物が根づき植物（rooted plant
s）に直接かつ迅速に発育する。茎頂の他に、えき芽の
如きその他の非不定組織が本発明の実施に使用し得る。
本発明の方法を茎頂（shoot apices）に適用するに際
して、選択された植物から切除された茎頂が適当な培地
中で培養される。茎頂が切除され、または数日間培養さ
れた後、茎頂はアグロバクテリウム・ツメファシエンス
の如き好適なベクターに曝露される。その後、接種茎頂
が数日以上にわたっても培養される。培養後、茎頂は非
形質転換植物組織から形質転換植物組織を分化するため
の選択培地に移される。その後、形質転換組織が選択さ
れ発根培地中で再培養される。その後、根づき植物は通
常の条件下で成長させることができる。
この方法は形質転換植物の早い再生を可能にする。例
えば、ペチュニアを用いた実験は６週間以内に成果を生
じた。上記の方法により生産された植物は自殖され、得
られた種子が無菌発芽した。生産されさ幼植物の90％が
新しい挿入遺伝子をもつことが判明し、これは新しい遺
伝情報の有性伝達を実証した。
アグロバクテリウム属からの細菌が本発明の実施に好
ましいが、植物中で遺伝子形質転換し得るその他のベク
ターが使用でき、その他の細菌、ブラスミド、ウイル
ス、及びDNAフラグメントを含む。
第１図は、５時間にわたるGUS活性の経過を示す形質
転換植物の螢光光度法GUS分析の結果を示す。生産され
たメチルウンベリフェロンの量がコントロン（kontro
n）分光螢光計で定量化された。これは本発明の方法を
用いるペチュニアの成功した形質転換を示す。
以下の説明及び実施例は、本発明を実施するのに最善
であると知られた方法を詳しく説明する。この方法の変
化は標的植物種及び標的植物に伝達すべき形質に応じて
異なる培地または異なるベクターを含み得ることが認め
られる。以下の実施例に於いて、ペチュニア、大豆、ム
ラサキウマゴヤシ、ヒマワリ、綿、小麦及びトウモロコ
シを標的植物として選んだが、以下に説明される方法
は、有意な実験をしないで、また本発明の精神及び範囲
から逸脱しないで、茎頂またはえき茎から再生し得るそ
の他の植物に適用し得る。
以下の実施例は本発明の性質を単に説明する。この方
法は、茎頂から再生でき且つアグロバクテリウムにより
形質転換し得るあらゆる双子葉植物に使用し得ることが
当業者に明らかである。また、その方法は、本発明の範
囲及び精神から逸脱しないで単子葉植物種を形質転換す
るように変更し得る。
カナマイシン抵抗性を用いる選択が好ましいが、G41
8、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはチオラムフ
ェニカル（chioramphenical）の如きその他の抗生物質
またはグリフォセート（glyphosate）の如き除草剤に対
する抵抗性を暗号化する遺伝子配列の挿入並びに当業者
に知られているその他の選択遺伝子が使用し得る。更
に、茎種の充分な感染を促進するための或種の添加剤が
使用されてもよい。これらはアセトシリンゴン並びにオ
クタピン、ノパリン及びロイシノピンの如き或種のオピ
ンを含むが、これらに限定されない。
実施例１ 外植源の発芽 市販のペチュニア品種“ローズ・フラッシュ（Rose F
lash）”、即ちシングル・グランジフロラ（Single Gra
ndiflora）とディープ・ローズのF1雑種の種子をザ・ボ
ール・シード・カンパニィ（the Ball Seed Co.、ウエ
スト シカゴ、イリノイ州）から入手した。トゥイーン
（Tween）20の如き湿潤剤または皿洗浄用洗剤を添加し
た20％（v/v）の市販漂白剤中で種子を30分間表面滅菌
した。その後、種子を無菌水で５回すすいだ。滅菌した
種子を、その後、30％の蔗糖（w/v）を含むムラシゲ（M
urashige）とスクーグ（Skoog）の塩で無菌発芽させ
た。ムラシゲとスクーグの塩は、以下のようにして調製
した。下記の塩の原液を調製した（成分の数値は原液１
当りのｇ数を示す）。
（１） 硝酸塩：硝酸アンモニウム（NH4NO3）、165;硝
酸カリウム（KNO3）、190; （２） 硫酸塩：硫酸マグネシウム（MgSO4 7H2O）、3
7;硫酸マンガン（MnSO4H2O）、1.690;硫酸亜鉛（ZnSO4
7H2O）、0.860;硫酸第二銅（CuSO4 5H2O）、0.0025; （３） ハロゲン化物：塩化カルシウム（CaCl2 2H
2O）、44;ヨウ化カリウム（KI）、0.083;塩化コバルト
（CoCl2 6H2O）、0.0025; （４） PO4、BO3、MoO4:リン酸カリウム（KH2PO4）、1
7;ホウ酸（H3BO3）、0.620;モリブデン酸ナトリウム（N
a2MoO4 2H2O）、0.025; （５） Na2FeEDTA:硫酸第一鉄（FeSO4 7H2O）、2.784;
エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩（Na2EDT
A）、3.724 上記の原液の夫々10mlを調製培地１に添加した。
茎頂の切除及び接種 発芽の１週間後に、茎頂を上記の操作により発芽した
植物から切除した。茎頂は大きさ0.3×0.6mmであり、頂
端半球体（apicaldome）と二枚の始原葉からなってい
た。その後、切除した茎頂を下記の添加成分を含む上記
のムラシゲとスクーグの塩で培養した。0.1mg/のN6−
ベンジルアデニン、30,000mg/の蔗糖及び2,000mg/
のKCバイオロジカル（Biological、カンサスシティ、ミ
ズーリイ州）から得られたゲル−ライト（Gel−rit
e）。細菌を保存培養液中で培養した場合には寒天を培
地溶液に添加し、懸濁培養液または液体培養液に関して
は、寒天を省いた。その後、培地溶液を25分間高圧加熱
滅菌し冷却した。その後、塩溶液及び培地溶液を合わ
せ、カナマイシン50mgを培地に添加した。A.ツメファシ
エンスLBA4404（pRGUS2）を培地3mlで２日間増殖させ
た。その後、培地及び培養A.ツメファシエンスを使用し
て上記の方法で茎頂を接種した。
形質転換茎頂の選択及びクローニング 接種及び培養に続いて、茎頂を0.1mg/のN6−ベンジ
ルアデニン、30,000mg/の蔗糖及び2,000mg/のゲル
−ライトを含む上記のムラシゲとスクーグの塩を含む新
鮮な培地に移し更に２日培養した。その後、上記のムラ
シゲとスクーグの塩;0.1mg/のN6−ベンジルアデニ
ン、30,000mg/の蔗糖、2,000mg/のゲル−ライト、2
00mg/のカナマイシン及び500mg/のカルベニシリン
（これはシグマ（Sigma）社（セントルイス、ミズーリ
ィ州）から入手した）を含む培地で継代培養した。
培養３週間後に、全ての外植が生長した。未形質転換
組織は200mg/のカナマイシン培地の存在下で漂白を示
した。形質転換茎は漂白された葉の下部で緑色の領域と
して現われた。その後、漂白された茎を除去し、緑色の
組織を100mg/のカナマイシンを含む培地で再度培養し
た。単一の緑色の茎が１週間後に外植から発育し、これ
をムラシゲとスクーグの塩、３％の蔗糖、100mg/のカ
ナマイシン及び500mg/のカルベニシリンを含む発根培
地に移した。全ての外植が根生産を示した。
その後、根づき植物を、以下のようにしてGUSの存在
に関して測定した。植物組織約50mgをエッペンドルフ
（Eppendolf）管中で200μ中50mMのNaPO4、pH7.0、10
mMのEDTA、0.1％のトリトン（Triton）Ｘ−100、（シグ
マケミカル社）、0.1％のサルコシル）、（シグマケミ
カル社）、10mMのβ・メルカプトエタノールと乳棒で均
一にした。そのエキス100μを、同緩衝液に溶解され
た2mMの４−メチルウンベリフェリルグルクロニド100μ
に添加した。その反応を37℃で５時間保温し0.2MのNa
2CO3lmlで停止した。メチルウンベリフェロンの生産を
コントロン分光螢光計で１時時間隔で定量化した。測定
の結果が第１図に見られる。
実施例２−茎頂培養系と葉盤培養系の比較 葉盤培養法と本発明の茎頂法との比較を行なった。
ペチュニア雑種C.V“ローズ・フラッシュ”からの113
個の茎頂をA.ツメファシエンスと共存培養し上記の選択
培地で培養した。緑色の下部を有する茎を分離し（表１
を参照のこと）、100mg/のカナマイシンを含む培地に
１週間移し、続いて上記の発根培地に移した。
また、葉盤をペチュニア雑種CV“ローズ・フラッシ
ュ”から採取し、ホルシュらにより記載された操作（Sc
ience227巻、1229頁（1985年）を参照のこと）に従って
形質転換した。選択培地は1.0mg/のN6−ベンジルアデ
ニン、0.1ナフタレン酢酸、100mg/、200mg/または3
00mg/のカナマイシン及び500mg/のカルベニシリン
を含むMS培地を含んでいた。表１は得られた結果を示
す。
葉盤外植からのカルス生産は100mg/及び300mg/の
カナマイシンでは高く（46％及び100％）、茎頂外植か
らのカルス生産は非常に制限されていた（３％）。カナ
マイシンで培養された茎頂外植からの茎生産は、葉盤の
茎生産（46％）と較べて低かった（６％）。しかしなが
ら、茎頂外植から形成された茎は葉盤外植を用いて形成
された茎（15％）よりも多く形質転換することができた
（71％）。
このデータからわかるように、二つの技術の重要な差
異は茎頂からの植物の殆ど全体の再生である。同様の結
果を、側芽外植を用いて得ることができる。
キメラ植物が茎頂外植法を用いて生産されたか否かに
ついて調べるために、上記の型のGUS分析をGUS陽性植物
の種々の領域からの葉、花弁、子房、及び胚珠組織に関
して行なった。測定した全ての組織はGUS遺伝子形質発
現を示した。
実施例３−移入の安定性 植物形質転換に於いて重要なことは、生殖系中の形質
の安定な移入及び子孫中の形質発現である。これが起こ
る場合、一次形質転換体のキメラの性質の問題はそれ程
重要ではない。
形質が実施例２の次の世代にうまく入れられたか否か
を調べるために、GUS陽性植物の花を自殖した。４種の
異なるGUS陽性植物の20の花からの307個の種子を上記の
ように発芽させ、幼植物をGUS活性に関して測定した。
表２に示されるように、幼植物の約90％がGUS陽性であ
った。
表３を参照して、一つの植物の子孫中のGUS遺伝子に
関して計算されたChi二乗値は、単一染色体に関する挿
入を示す一遺伝子雑種の3:1分離パターンを示した。植
物のうちの３種に関するChi二乗値は、二つの独立の染
色体に関するコピーの挿入を示す重複優性二遺伝子雑種
分離の15:1分離パターンを示した。
実施例４ 更に２種のペチュニア栽培品種、即ちT.ゲラッツ（Ge
rats）からのV23xR51及び“ホワイト・フラッシュ（Whi
te Flasah"（F1雑種：グランジフロラ（Grandiflora）
×ピュア・ホワイト・ボール・シード（Pure White Bal
l Seed）、カンパニィ、シカゴ、イリノイ州）を、上記
の茎頂法を用いて形質転換した。表４に示されるよう
に、これらの株の形質転換は表１に見られた結果と同様
の結果を得た。これは、その操作が同様の成功でもって
その他の植物品種に使用し得ることを示す。
形質転換ペチュニア雑種株V23XR51を自殖させ、種子
を集め培養した。表５に示されるように、子孫の70％〜
90％がGUS活性を示し、遺伝子が次の世代にうまく伝達
されたことを示した。
このデータは、実施例３に示されたデータと対になっ
て、本発明の方法の重要な特徴の一つ、即ち将来の世代
による新しい形質の遺伝を可能にする標的植物の発芽細
胞並びに体細胞の形質転換を強調する。ほかの人により
使用された技術は不ねん植物を生産し、発芽細胞を形質
転換するのに失敗し、または発芽細胞の形質転換が非常
に低い比率で起こり、所定の形質を発現する少数の子孫
を生じる。
形質転換“V23xR51"植物の子孫中のGUS遺伝子の形質
発現に関するChi二乗値は、単一染色体に関する挿入を
示す一遺伝子雑種の3:1分離を示した。その他の植物に
関するChi二乗値は、二つの独立の染色体に関するGUS遺
伝子のコピーの挿入を示す重複優性二遺伝子雑種分離の
15:1分離パターンを示した。
データは、df＝１でもって、95％の信頼限界で計算し
た。
実施例５ また、茎頂による形質転換を綿、特にゴシピウム・ヒ
ルスタム（Gossypium hirsutum）、var.コーカー（Coke
r）312、タムコット（Tamcot）CAB−CS.及びゴシピウム
・バルバデンス（Gossypium barbadense）、var.ピマ
（Pima）５−６とともに使用した。使用した工程は、以
下の変化でもって上記と同様であった。
種子を蒸留水で10分間すすぐことにより種子を消毒
し、ついで１滴のトウイーン20を含む20％の市販漂白液
で15分間浸軟した。その後、種子を無菌水で３回すすい
だ。
消毒後、種子を、カラザの端部（chalazal end）を下
にして滅菌ペトリプレートに移した。５つの種子を夫々
のプレートの上に置いた。プレートはMSハロゲン化物を
含む溶液を含んでおり、0.8％の寒天で固化した。プレ
ートを暗所で30℃でシールしないで４日間保温した。そ
の後、プレートを、分離前の１日につき16時間の昼間の
養生にかけた。
茎頂を発育の同様の段階で植物から切除することを確
実にするために、幼植物の最も均一な集団を使用した。
遅い発芽性の幼植物または汚染幼植物を廃棄した。
茎頂を、解剖顕微鏡の助けにより、５日たった幼植物
から分離した。或る場合には、プラスチックシリンジケ
ーシングに取り付けた滅菌皮下ニードル（22ゲージ及び
27ゲージ）を使用して解剖を行なった。
茎頂は、まずその基部で二つの子葉のうちの一つを除
去することにより切除した。その後、茎領域を幼植物か
ら除去した。その後、茎領域の基部をトリミングして茎
頂分裂組織の基部表面を露出した。
また、この技術の改良法を使用して茎頂分裂組織の側
面及び基部表面を露出する最大の葉及び下層の組織を除
去した。
３〜４日たった幼植物から分離した茎頂は分裂組織の
半球体及び二枚の始原葉からなっていた。幼植物がより
多くの日数（５〜７日）を経ている場合、茎頂はしばし
ば２枚より多い葉始原体を含んでいた。
その後、分離した茎頂を、ホルモンを含まない基本MS
培地（後記される）で16時間の光周期で28〜30℃で培養
した。50μE/m2秒でグローラックス（Gro−Lux、商標）
の光及び白色螢光の継続を使用して光を与えた。茎頂を
新鮮な培地で再培養した。
その培地は、下記の添加物とともに、ムラシゲとスク
ーグにより記載されたMS基本塩配合（ムラシゲとスクー
グの著作文献、1962年を参照のこと）を含んでいた。蔗
糖、15,000mg/；チアミン6.4mg/;TC寒天、8,000mg/
。使用の前に、培地を通常の高圧加熱滅菌法により滅
菌し、滅菌ペトリプレート中に計量分配した。
茎頂を、切除の２日以内に、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンスで接種した。接種は、その細菌を培養プ
レートからかき取り、このプラークを皮下ニードルまた
はトウース・ピック（tooth−pick）を用いて茎頂の切
断表面に適用することにより行なった。
茎頂をA.ツメファシエンスの一種もしくは二種の株で
接種した。第一の株は上記の株LBA4404“GUS2"である。
第二の株は、GUS2の場合と同様のTiプラスミドを含む株
EHA1である。このプラスミドは、テキサスA ＆ M大学の
T.マックナイト（Mcknight）博士によりEHAI株に挿入さ
れ、“GUS3"と命名された。株EHA1はA.ツメファシエン
スの宿主範囲を増大する高毒性の部位を含むと考えられ
る。
A.ツメファシエンス株EHA1の使用に加えて、下記の添
加剤を使用して、好結果の感染を促進した。アセトシリ
ンゴン、10〜30μM;及びノパリン、10〜100μＭ（ベル
サンビ（Veluthambi）らにより提出された）。
A.ツメファシエンスと２日間接触した後、外植を500m
g/のカルベネシリンを含む培地に１週間移した。その
後、外植を7.5mg/のカナマイシン及び500mg/のカル
ベネシリンを含む培地に更に１週間移した。最後に、外
植を500mg/のカルベネシリンを含む培地に１週間移し
た。
茎が４枚以上の葉を含んでいた場合、茎基部を滅菌ル
ートン（rootone）中に浸漬し、３インチ（7.6cm）のク
レーポット中の滅菌バーミキュライトに移し、カバーを
かけた。
外植及び小植物を上記のGUS遺伝子に関して測定し、G
US陽性であることがわかった。
実施例６ ヒマワリ、ヘレアンサス・アヌス（Heleanthus annu
s）、var.トリウムフ（Triumph）560。種子を発芽さ
せ、茎を分離し、下記の変更でもって綿に関して記載さ
れた操作を使用してA.ツメファシエンスEHAI、アセトシ
リンゴン及びノパリン（１）と共に培養した。種子を、
茎分離の前に、２〜３日間培養した。綿に関して記載さ
れた基本培地に1mg/のIAA（インドール酢酸）を補充
した。
４つのヒマワリ植物は、開花し種子を生産した。これ
らの種子を発芽させ、子孫幼植物の多くはGUS陽性であ
った。
実施例６ 大豆、グリシン・マックス（Glycine max）、var.ダ
ウリング・アンド・ブラッグ（Dowling ＆ Bragg）。滅
菌した種子を１日間で発芽させ、ついで幼芽を切除し、
上記のように培養した。また、水を１週間吸収させた種
子から茎頂を得た。
使用した培地は、茎培養に使用した培地に茎頂の成長
を促進するための0.1mg/のカイネチンを補充し1.0mg/
のカイネチンを添加して不定茎生産を促進した以外
は、綿に関して使用した培地と同じであった。
A.ツメファシエンスEHAI、ノパリン及びアセトシリン
ゴンとの共存培養は、上記の綿の場合と同じであった。
アグロバクテリウムとの共存培養の２日後に、外植を
25mg/または50mg/のカナマイシン及び500mg/のカ
ルベニシリンを含む培地に１週間移した。その後、外植
を500mg/のカルベニシリンを含むホルモン不含の培地
に移した。
カルベニシリンを含む培地で成長させた外植の多く
に、自然発根が観察された。根を示さない外植を滅菌ル
ートン中に浸漬した。その後、３インチ（7.6cm）中の
滅菌バーミキュライトに無菌移植し、カバーをかけた。
かなりの数の根は、培地中で成長させた場合、GUS陽
性であることがわかった。土壌への移植に耐えた幼植物
の全てがGUS陽性であった。
実施例７ ムラサキウマゴヤシ、メジカゴ・サチバ（Medicago s
ativa）var.サザン・スペシャル（Southern Specia
l）。種子を発芽させ、綿に関して記載したように茎を
分離した。組織をA.ツメファシエンスEHAI、アセトシリ
ンゴン及びノパリンと共存培養した。
幾つかのGUS陽性組織を試験管内で生産し、10本の植
物をポット中に定着させた。これらのうちの少なくとも
４本がGUSに対して陽性であった。
実施例８ トウモロコシ（品種、フンクス（Funks）６〜90）及
び小麦（品種チャイニーズ・スプリング（chinese spri
ng））を蒸留水で10分間すすぎ、１滴のトウイーン20を
含む20％の市販漂白液中に15分間浸軟し、滅菌水中で３
回すすいだ。消毒した種子をMSハロゲン化物及び硫酸塩
を含む培地に移し、0.8％の寒天で固化させた。種子の
胚領域を寒天と接着させて置いた。未シールのプレート
を暗所で30℃で１日間保温した。
茎頂を解剖顕微鏡の助けにより分離した。葉及び下層
の組織を切除して茎頂分裂組織の側面及び基部表面を露
出させた。
分離した茎頂を、ホルモンを含まない基本MS培地で培
養した。組織を新鮮な培地で１週間再培養した。培地
は、MS基本塩配合物（ムラシゲとスクーグ、1962年を参
照のこと）及び下記の成分（mg/）を含んでいた。蔗
糖15,000;チアミン0.4;TC寒天、8,000。培地を通常の条
件下で高圧加熱滅菌することにより滅菌し、滅菌プラス
チックペトリ皿に計量分配した。培養物を、グロ−ラッ
クス光及び白色螢光の組合せを50μE/m2秒で使用して28
〜30℃で16時間保った。
茎頂外植を分離の日または分離の１日後及び２日後に
接種した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス、即
ちトム・マックナイト博士から提供された“GUS3"構成
物を含む株EHA1を使用した。この株は、この株により感
染（及び形質転換）される種の範囲を増大し得る高活性
の毒性領域を含むと推測される（トム・マックナイト、
親展の手紙）。適当な成育培地及び抗生物質を含む２〜
３日前に接種した集密プレートからアグロバクテリアを
かき取った。茎頂の切断表面に滅菌皮下ニードルまたは
滅菌トウースピックでアグロバクテリウムを接種した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスの高毒性“GU
S3"株の使用に加えて、ノパリン及びアセトシリンゴン
を接種工程の前にアグロバクテリウムと混合して毒性を
高めて、好結果の感染と関連するその他の応答を誘発し
た。
アグロバクテリウムとの接触の２日後に、外植を500m
g/のカルベニシリンを含む培地に１週間移し、ついで
7.5mg/のカナマイシン及び500mg/のカルベニシリン
を含む培地に１週間移し、最後に500mg/のカルベニシ
リンを含む新しい培地に１週間間隔で移した。
発育しているトウモロコシ及び小麦の茎は２週間また
は３週間後に自然に発根した。
ウリアン（Ulian）らの文献（1988年）に記載された
ように、トウモロコシ及びその他の単子葉植物はGUS基
質を開裂し弱い陽性反応を生じる酵素を明らかに含む。
それ故、単子葉植物に於けるこの弱にGUS陽性応答は好
結果の形質転換を示さない。トウモロコシ組織及び小麦
組織の幾つかで観察されたような強いGUS陽性応答が好
結果の形質転換を示し得る。
DNAをロジャース（Rogers）及びベンディッチ（Bendi
ch）（1985年、Plant Molec.Biol.5巻、69〜76頁）に従
って抽出し、製造業者の指示に従ってHind III（ボーリ
ンガー・マンハイム・インコーポレーション（Boehring
er Mannheim Inc.））を用いて制限し、電気泳動により
一夜で分離した。ゲルからナイロンフィルターへのDNA
の転移を、リード（Reed）及びマン（Mann）（1985年、
Nucleic Acid Res.13巻、7207〜7221頁）のアルカリ転
移改良法を用いてサザン（1975年、J.Molec.Biol、98
巻、503頁）に従って行なった。DNAを35Sプロモータ
ー、GUS配列及び前記のポリアデニル化暗号領域からな
る32P−ラベルしたGUSプローブにハイブリッドした。ト
ウモロコシ植物のサザン分析は、好結果の形質転換を確
かめた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ユリアン ユージニオ シー アメリカ合衆国 テキサス州 77840 カレッジ ステーション 1077 バール ストリート 301 (56)参考文献 特開 昭59−63187（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−138966（ＪＰ，Ａ) Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （ｓｕｐｐｌ．），86［４］（Ａｐｒ 1988），ｐ．108 Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，８（1987），ｐ．291− 298 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）切除した非双子葉植物の茎分裂組織を
    好適な成育培地中で培養すること、ここで該茎分裂組織
    は本質的に頂端半球体及び２枚以上の始原葉からなり；
    ついで ｂ）上記の茎分裂組織を形質転換し得る好適なベクター
    を上記の組織に接種することを含むことを特徴とする非
    双子葉植物組織の形質転換方法。
  2. 【請求項２】上記の組織が非双子葉植物から切除された
    茎頂である請求の範囲１項記載の方法。
  3. 【請求項３】上記の茎頂が上記の非双子葉植物から切除
    された頂端半球体及び２枚以上の始原葉を含む請求の範
    囲２項記載の方法。
  4. 【請求項４】上記の組織がえき芽である請求の範囲１項
    記載の方法。
  5. 【請求項５】上記のベクターがアグロバクテリウム・ツ
    メファシエンスである請求の範囲１項記載の方法。
  6. 【請求項６】上記のベクターが選択形質またはレポータ
    ー形質の遺伝暗号を含む請求の範囲１項記載の方法。
  7. 【請求項７】上記の選択形質が抗生物質抵抗性である請
    求の範囲６項記載の方法。
  8. 【請求項８】形質転換工程中にアセトシリンゴム及びオ
    ピンを添加する追加の工程を含む請求の範囲５項記載の
    方法。
  9. 【請求項９】オピンがノパリンである請求の範囲８項記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】ａ）形質転換植物組織を選択する工程；
    及び ｂ）形質転換植物組成を培養して根の成長を誘導する工
    程 を更に含む請求の範囲１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】ａ）好適な成育培地中で切除した非双子
    葉植物の茎頂組織を培養し； ｂ）上記の茎頂組織と、アセトシリンゴン、オピン、及
    びアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接触させ上
    記の組織を形質転換し； ｃ）形質転換植物組織を選択し；ついで ｄ）形質転換植物組織を培養して根の成長を誘導するこ
    とを含むことを特徴とする非双子葉植物組織の形質転換
    方法。
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