JP2993964B2 - 植物において活性であるフォスフィノトリシン耐性遺伝子及びその使用 - Google Patents
植物において活性であるフォスフィノトリシン耐性遺伝子及びその使用Info
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- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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Description
【発明の詳細な説明】 公開前のドイツ国特許出願（P 36 28 747.4）（「主
出願」）は、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス
（Streptomyces viridochromogenes）DSM40736（一般寄
託株）又はDSM4112（ブダペスト条約に基づく寄託株）
の全DNAから得られるフォスフィノトリシン（PCT）耐性
遺伝子、すなわち、フォスフィノトリシル−アラニル−
アラニン（PTT）耐性による選択、BamH Iによる切断、
4.0kbの大きさのフラグメントのクローニング及びPTT耐
性による選択を経て得られる遺伝子、を提示している。
さらに、該特許出願は、該PCT耐性遺伝子を細菌におけ
るPTT耐性マーカー及び植物細胞におけるPTC耐性マーカ
ーとしてPTC耐性植物の生産に利用することも提示して
いる。耐性遺伝子が位置している4kb大の該BamH Iフラ
グメントは、制限酵素地図（該特許出願第１図）によっ
て詳細に定義されている。耐性遺伝子コード領域の位置
は、この4kbフラグメントの部分領域をクローニングす
ることによって、より正確に決定された。その結果、耐
性遺伝子は1.6kbの大きさのSst II−Sst Iフラグメント
（主出願第１図の0.55から2.15の位置）に位置している
ことが明らかになった。また、Bgl IIによる消化によっ
て得られる0.8kb大のフラグメントは、プラスミドに導
入してストレプトミセス・リビダンス（S.lividans）を
形質転換させた際のPTT耐性に関与する。この耐性は、P
TCのＮ−アセチル化に依存している。すなわち、耐性遺
伝子は、アセチルトランスフェラーゼをコードしてい
る。
出願」）は、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス
（Streptomyces viridochromogenes）DSM40736（一般寄
託株）又はDSM4112（ブダペスト条約に基づく寄託株）
の全DNAから得られるフォスフィノトリシン（PCT）耐性
遺伝子、すなわち、フォスフィノトリシル−アラニル−
アラニン（PTT）耐性による選択、BamH Iによる切断、
4.0kbの大きさのフラグメントのクローニング及びPTT耐
性による選択を経て得られる遺伝子、を提示している。
さらに、該特許出願は、該PCT耐性遺伝子を細菌におけ
るPTT耐性マーカー及び植物細胞におけるPTC耐性マーカ
ーとしてPTC耐性植物の生産に利用することも提示して
いる。耐性遺伝子が位置している4kb大の該BamH Iフラ
グメントは、制限酵素地図（該特許出願第１図）によっ
て詳細に定義されている。耐性遺伝子コード領域の位置
は、この4kbフラグメントの部分領域をクローニングす
ることによって、より正確に決定された。その結果、耐
性遺伝子は1.6kbの大きさのSst II−Sst Iフラグメント
（主出願第１図の0.55から2.15の位置）に位置している
ことが明らかになった。また、Bgl IIによる消化によっ
て得られる0.8kb大のフラグメントは、プラスミドに導
入してストレプトミセス・リビダンス（S.lividans）を
形質転換させた際のPTT耐性に関与する。この耐性は、P
TCのＮ−アセチル化に依存している。すなわち、耐性遺
伝子は、アセチルトランスフェラーゼをコードしてい
る。
上記の0.8kb大フラグメントのDNA塩基配列は、ドイツ
国特許追加出願P 36 42 829.9に再現されている。このD
NA配列から、遺伝子配列の開始コードン及び転写解読枠
（オープン・リーディング・フレイム）を決定すること
が可能である。最後部のヌクレオチドは、終止コードン
のTGA部分である。
国特許追加出願P 36 42 829.9に再現されている。このD
NA配列から、遺伝子配列の開始コードン及び転写解読枠
（オープン・リーディング・フレイム）を決定すること
が可能である。最後部のヌクレオチドは、終止コードン
のTGA部分である。
ストレプトミセス菌類由来の遺伝子は、Ｇ＋Ｃ比が非
常に高い。すなわち、アデニン（Ａ）＋チミン（Ｔ）：
グアニン（Ｇ）＋シトシン（Ｃ）は、約30:70である。
植物遺伝子のGC比はこれよりはるかに低く、約50％であ
る。このため、本発明は、そのさらなる発展として、耐
性遺伝子のDNA塩基配列を新規（de novo）合成によって
最適化して、植物のRNAポリメラーゼIIによって利用で
きる好ましいコードンにしたものである。
常に高い。すなわち、アデニン（Ａ）＋チミン（Ｔ）：
グアニン（Ｇ）＋シトシン（Ｃ）は、約30:70である。
植物遺伝子のGC比はこれよりはるかに低く、約50％であ
る。このため、本発明は、そのさらなる発展として、耐
性遺伝子のDNA塩基配列を新規（de novo）合成によって
最適化して、植物のRNAポリメラーゼIIによって利用で
きる好ましいコードンにしたものである。
本発明は、ドイツ国特許出願P 36 28 747.4及びその
追加出願P 36 42 829.9に提示された耐性遺伝子の修
飾、すなわち植物において有用なコードンへの改変に関
する。対応アミノ酸配列は、添付図面に示す通りであ
る。本発明のより具体的な態様は、特許請求の範囲に定
義され、また、以下に説明する通りである。
追加出願P 36 42 829.9に提示された耐性遺伝子の修
飾、すなわち植物において有用なコードンへの改変に関
する。対応アミノ酸配列は、添付図面に示す通りであ
る。本発明のより具体的な態様は、特許請求の範囲に定
義され、また、以下に説明する通りである。
知られているように、遺伝暗号は縮重する。すなわ
ち、単一のトリプレットでコードされるアミノ酸は２種
類しかなく、残りの18のアミノ酸はそれぞれ２ないし６
種類のトリプレットのいずれかによってコードされてい
る。したがって、理論的には、遺伝子合成に際しては、
多様のコードンの組合せが選択され得る。上記した、全
DNA配列中の各ヌクレオチドの構成比が影響することか
ら、この比を、塩基配列の最適条件を決める基準のひと
つに用いた。
ち、単一のトリプレットでコードされるアミノ酸は２種
類しかなく、残りの18のアミノ酸はそれぞれ２ないし６
種類のトリプレットのいずれかによってコードされてい
る。したがって、理論的には、遺伝子合成に際しては、
多様のコードンの組合せが選択され得る。上記した、全
DNA配列中の各ヌクレオチドの構成比が影響することか
ら、この比を、塩基配列の最適条件を決める基準のひと
つに用いた。
次のような修飾を、このように配列させた遺伝子に対
して行った。
して行った。
（１）ストレプトミセス菌類由来の遺伝子の開始コード
ンGTG（追加出願塩基配列図中258−260）を植物RNAポリ
メラーゼIIによって用いられる開始コードンATGで置き
換えた。
ンGTG（追加出願塩基配列図中258−260）を植物RNAポリ
メラーゼIIによって用いられる開始コードンATGで置き
換えた。
（２）遺伝子内部において、ストレプトミセス由来の遺
伝子コードンを植物遺伝子のコードンとして適するよう
に改変した（G/C比の改変）。
伝子コードンを植物遺伝子のコードンとして適するよう
に改変した（G/C比の改変）。
（３）翻訳プロセスを終結させるための終止コードンTG
Aを配列末端に位置させた。
Aを配列末端に位置させた。
（４）遺伝子配列の先端及び末端部は、制限酵素部位の
突出末端として、遺伝子を伸長したり、該遺伝子配列を
植物調節配列の間に連結（ライゲーション）したりでき
るようにした。
突出末端として、遺伝子を伸長したり、該遺伝子配列を
植物調節配列の間に連結（ライゲーション）したりでき
るようにした。
（５）パリンドローム（回文対構造）配列は最小限に減
らした。
らした。
本発明に係るDNA配列Ｉ（対応アミノ酸配列を併記）
を添付図面第１図に示す。
を添付図面第１図に示す。
遺伝子内部において、３種類の制限酵素に対するそれ
ぞれ単一の切断部位（Xba I:塩基番号152、BamH I:同31
2、Xma I:同436）が存在するので、pUC18やpUC19等よく
研究されたクローニングベクターに組み込みが可能な部
分配列のサブクローニングが可能である。さらに、他の
多くの制限酵素に対するそれぞれ単一の切断部位を有す
る塩基配列を遺伝子内に組み込んだ。これによって、一
方では、アセチルトランスフェラーゼの部分配列へのア
クセスが提供され、他方では、必要な修飾が可能にな
る。制限酵素名及び切断部位を次表に示す。
ぞれ単一の切断部位（Xba I:塩基番号152、BamH I:同31
2、Xma I:同436）が存在するので、pUC18やpUC19等よく
研究されたクローニングベクターに組み込みが可能な部
分配列のサブクローニングが可能である。さらに、他の
多くの制限酵素に対するそれぞれ単一の切断部位を有す
る塩基配列を遺伝子内に組み込んだ。これによって、一
方では、アセチルトランスフェラーゼの部分配列へのア
クセスが提供され、他方では、必要な修飾が可能にな
る。制限酵素名及び切断部位を次表に示す。
制限酵素名 切断部位前の塩基番号 （コード鎖） BspM II 11 Sac II 64 EcoR V 74 Hpa I 80 Aat II 99 BstX I 139 Apa I 232 Sca I 272 Avr II 308 Afl II 336 Stu I 385 BssH II 449 Fok I 487 Bgl I 536 Bgl II 550 化学合成及び酵素的連結（ライゲーション）反応によ
る部分配列の構築は、既知の方法（欧州特許出願0,133,
282、0,136,472、0,155,590、0,161,504、0,163,249、
0,171,024、0,173,149又は0,177,827号明細書）によっ
て行う。制限酵素による分析、DNAフラグメントの連結
及び大腸菌（E.coli）におけるプラスミドの形質転換等
の詳細は、Maniatisによる成書に記載されている（Mole
cular Cloning、Maniatisら:Cold Spring Harbor、198
2）。
る部分配列の構築は、既知の方法（欧州特許出願0,133,
282、0,136,472、0,155,590、0,161,504、0,163,249、
0,171,024、0,173,149又は0,177,827号明細書）によっ
て行う。制限酵素による分析、DNAフラグメントの連結
及び大腸菌（E.coli）におけるプラスミドの形質転換等
の詳細は、Maniatisによる成書に記載されている（Mole
cular Cloning、Maniatisら:Cold Spring Harbor、198
2）。
このようにして、クローニングされた遺伝子配列は、
植物に導入されて植物の調節遺伝子シグナルの支配下に
おかれ、発現が誘導される。欧州特許出願0,122,791号
明細書に既知の方法が解説されている。このようにし
て、PTC耐性を示す（形質転換細胞を選択する性質を有
する）植物細胞、植物体又は植物体部分及び種子が得ら
れる。
植物に導入されて植物の調節遺伝子シグナルの支配下に
おかれ、発現が誘導される。欧州特許出願0,122,791号
明細書に既知の方法が解説されている。このようにし
て、PTC耐性を示す（形質転換細胞を選択する性質を有
する）植物細胞、植物体又は植物体部分及び種子が得ら
れる。
本発明の実施態様のいくつかは、次の諸例によって詳
細に説明された通りである。特に記載がない限り、パー
セント表示は重量パーセントである。
細に説明された通りである。特に記載がない限り、パー
セント表示は重量パーセントである。
例 下記の諸例においては、次の培地を用いた。
ａ）細菌用： YT培地 :0.5％酵母エキス、0.8％バクトトリプト
ン、0.5％食塩 LB培地 :0.5％酵母エキス、１％バクトトリプト
ン、１％食塩 固形培地：上記それぞれの培地に1.5％の寒天を添加 ｂ）植物用： Ｍ＋Ｓ培地:Murashige及びSkoog: Physiologica Plantarum 15（1962）473
を参照されたい。
ン、0.5％食塩 LB培地 :0.5％酵母エキス、１％バクトトリプト
ン、１％食塩 固形培地：上記それぞれの培地に1.5％の寒天を添加 ｂ）植物用： Ｍ＋Ｓ培地:Murashige及びSkoog: Physiologica Plantarum 15（1962）473
を参照されたい。
2MS培地:2％シュークロースを含むＭ＋Ｓ培地 MSC10培地:2％シュークロース、500mg/lセフォタクシ
ム、0.1mg/lナフチル酢酸（NAA）、1mg/lベンジルアミ
ノプリン（BAP）、100mg/lカナマイシンを含むＭ＋Ｓ培
地 MSC15培地:2％シュークロース、500mg/lセフォタキシ
ム、100mg/lカナマイシンを含むＳ＋Ｍ培地 例１ 一本鎖オリゴヌクレオチドの化学合成 ４個の部分フラグメントＩ−IVの一つであるフラグメ
ントIIの合成は、末端オリゴヌクレオチドII c（DNA配
列Ｉのコード鎖中のヌクレオチド番号219−312）から開
始した。固相合成のために、オリゴヌクレオシド（この
場合はヌクレオチド番号312のグアノシン）の３′末端
をその３′水酸基を介して支持体に共有結合させる。こ
のとき、支持体は、長鎖アミノアルキル基を官能基とし
て有するCPG（調整孔ガラス）を用いる。その他に関し
ては、合成は、前出の欧州特許出願に記載の既知の方法
に準じて行った。
ム、0.1mg/lナフチル酢酸（NAA）、1mg/lベンジルアミ
ノプリン（BAP）、100mg/lカナマイシンを含むＭ＋Ｓ培
地 MSC15培地:2％シュークロース、500mg/lセフォタキシ
ム、100mg/lカナマイシンを含むＳ＋Ｍ培地 例１ 一本鎖オリゴヌクレオチドの化学合成 ４個の部分フラグメントＩ−IVの一つであるフラグメ
ントIIの合成は、末端オリゴヌクレオチドII c（DNA配
列Ｉのコード鎖中のヌクレオチド番号219−312）から開
始した。固相合成のために、オリゴヌクレオシド（この
場合はヌクレオチド番号312のグアノシン）の３′末端
をその３′水酸基を介して支持体に共有結合させる。こ
のとき、支持体は、長鎖アミノアルキル基を官能基とし
て有するCPG（調整孔ガラス）を用いる。その他に関し
ては、合成は、前出の欧州特許出願に記載の既知の方法
に準じて行った。
合成の設計は、DNA配列II（添付図面第２図）に示し
た通りである。これは、他の点においてはDNA配列Ｉ
（第１図）に対応している。
た通りである。これは、他の点においてはDNA配列Ｉ
（第１図）に対応している。
例２ 一本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的結合による遺
伝子フラグメントIIの形成 オリゴヌクレオチドの５′末端を燐酸化するために、
オリゴヌクレオチドII b及びII cの各1nmolを、それぞ
れ5nmolのアデノシン三燐酸及び４ユニットのT4ポリヌ
クレオチドキナーゼと20μｌの緩衝液（50mMトリス−塩
酸（pH7.6）、10mM塩化マグネシウム及び10mMジチオス
レイトール（DTT）を含む）中で37℃で30分間反応させ
た。その後、95℃で５分間加熱して酵素を失活させた。
DNAフラグメントIIで「突出」配列を形成するオリゴヌ
クレオチドII a及びII dは燐酸化しない。これによっ
て、次の連結プロセス中においてDNAフラグメントIIに
相当するよりも大きいサブフラグメントの形成が妨げら
れる。
伝子フラグメントIIの形成 オリゴヌクレオチドの５′末端を燐酸化するために、
オリゴヌクレオチドII b及びII cの各1nmolを、それぞ
れ5nmolのアデノシン三燐酸及び４ユニットのT4ポリヌ
クレオチドキナーゼと20μｌの緩衝液（50mMトリス−塩
酸（pH7.6）、10mM塩化マグネシウム及び10mMジチオス
レイトール（DTT）を含む）中で37℃で30分間反応させ
た。その後、95℃で５分間加熱して酵素を失活させた。
DNAフラグメントIIで「突出」配列を形成するオリゴヌ
クレオチドII a及びII dは燐酸化しない。これによっ
て、次の連結プロセス中においてDNAフラグメントIIに
相当するよりも大きいサブフラグメントの形成が妨げら
れる。
オリゴヌクレオチドII（ａ−ｄ）を次のようにして連
結して、サブフラグメントIIを構成する。まず、オリゴ
ヌクレオチドII a及びII d、５′末端を燐酸化したオリ
ゴヌクレオチドII b及びII cの各1nmolを一緒に45μｌ
の緩衝液（50mMトリス−塩酸（pH7.6）、20mM塩化マグ
ネシウム、25mM塩化カリウム及び10mM DTTを含む）に溶
解する。DNAフラグメントIIに対応するオリゴヌクレオ
チドをアニーリングさせるため、オリゴヌクレオチド溶
液を95℃で２分間加熱の後、緩やかに（２−３時間かけ
て）20℃まで冷却する。次いで、酵素的結合を行うため
に、２μｌの0.1M DTT、８μｌの2.5mMアデノシン三燐
酸（pH7）及び５μｌのT4DNAリガーゼ（2000ユニット）
を加え、この混合溶液を22℃で16時間反応させる。
結して、サブフラグメントIIを構成する。まず、オリゴ
ヌクレオチドII a及びII d、５′末端を燐酸化したオリ
ゴヌクレオチドII b及びII cの各1nmolを一緒に45μｌ
の緩衝液（50mMトリス−塩酸（pH7.6）、20mM塩化マグ
ネシウム、25mM塩化カリウム及び10mM DTTを含む）に溶
解する。DNAフラグメントIIに対応するオリゴヌクレオ
チドをアニーリングさせるため、オリゴヌクレオチド溶
液を95℃で２分間加熱の後、緩やかに（２−３時間かけ
て）20℃まで冷却する。次いで、酵素的結合を行うため
に、２μｌの0.1M DTT、８μｌの2.5mMアデノシン三燐
酸（pH7）及び５μｌのT4DNAリガーゼ（2000ユニット）
を加え、この混合溶液を22℃で16時間反応させる。
遺伝子フラグメントIIを、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（アクリルアミド濃度10％、尿素無添加、ゲルサ
イズ20×40cm、厚さ1mm）によって精製する。用いるマ
ーカー物質は、Hinf Iで切断したφX174DNA（BRL社製）
又はHae IIIで切断したpBR322である。
気泳動（アクリルアミド濃度10％、尿素無添加、ゲルサ
イズ20×40cm、厚さ1mm）によって精製する。用いるマ
ーカー物質は、Hinf Iで切断したφX174DNA（BRL社製）
又はHae IIIで切断したpBR322である。
遺伝子フラグメントＩ、III及びIVを同様の方法にて
調製するが、連結ステップが不要であるので、「突出」
配列はアニーリングの前に５′燐酸に転換する。
調製するが、連結ステップが不要であるので、「突出」
配列はアニーリングの前に５′燐酸に転換する。
例３ 遺伝子フラグメントＩ、II、III及びIVを含むハ
イブリッドプラスミドの調製 ａ）pUC18への遺伝子フラグメントＩの組み込み 市販のプラスミドpUC18を、制限酵素Sal I及びXba I
を製造者の指示通りに用いて、既知の方法で開環する。
制限酵素反応混合液を１％アガロースゲル電気泳動にか
けて既知の方法で分画し、フラグメントをエチジウムブ
ロマイドで染色して可視化する。プラスミドバンド（約
2.6kb）をアガロースゲルから切り出して、そのアガロ
ースからDNAを電気溶出させる。
イブリッドプラスミドの調製 ａ）pUC18への遺伝子フラグメントＩの組み込み 市販のプラスミドpUC18を、制限酵素Sal I及びXba I
を製造者の指示通りに用いて、既知の方法で開環する。
制限酵素反応混合液を１％アガロースゲル電気泳動にか
けて既知の方法で分画し、フラグメントをエチジウムブ
ロマイドで染色して可視化する。プラスミドバンド（約
2.6kb）をアガロースゲルから切り出して、そのアガロ
ースからDNAを電気溶出させる。
最後に、Xba I及びSal Iで開環した１μｇのプラスミ
ドと10ngのDNAフラグメントＩとを16℃で一晩反応させ
て連結する。
ドと10ngのDNAフラグメントＩとを16℃で一晩反応させ
て連結する。
ｂ）pUC18への遺伝子フラグメントIIの組み込み ａ）と同様の方法にて、Xba I及びBamH Iを用いて開
環したpUC18と遺伝子フラグメントIIとを連結する。そ
の際、フラグメントIIは、例２で述べたように突出末端
を予め燐酸化しておく。
環したpUC18と遺伝子フラグメントIIとを連結する。そ
の際、フラグメントIIは、例２で述べたように突出末端
を予め燐酸化しておく。
ｃ）pUC18への遺伝子フラグメントIIIの組み込み ａ）と同様の方法にて、pUC18をBamH I及びXma IIIを
用いて開環して、遺伝子フラグメントIIIと連結する。
用いて開環して、遺伝子フラグメントIIIと連結する。
ｄ）pUC18への遺伝子フラグメントIVの組み込み ａ）と同様の方法にて、pUC18をXma III及びSal Iを
用いて開環して、遺伝子フラグメントIVと連結する。
用いて開環して、遺伝子フラグメントIVと連結する。
例４ 完全遺伝子の構築及びpUCプラスミドにおけるク
ローニング ａ）形質転換及び遺伝子フラグメントＩ−IVの複製 このようにして得たハイブリッドプラスミドを用いて
大腸菌を形質転換した。このために、大腸菌K12株を70m
Mの塩化カルシウム溶液で処理してコンピテント（DNAを
導入できる状態）にし、ハイブリッドプラスミドの懸濁
液（70mMカルシウムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.5））を加える。常法に従って、プラスミドの示す抗
生物質耐性又は感受性を利用して形質転換体を選択し、
ハイブリッドベクターを複製する。細胞を死滅させた
後、ハイブリッドプラスミドを分離し、最初に用いたも
のと同じ制限酵素で開環し、遺伝子フラグメントＩ、I
I、III及びIVをゲル電気泳動にて分離する。
ローニング ａ）形質転換及び遺伝子フラグメントＩ−IVの複製 このようにして得たハイブリッドプラスミドを用いて
大腸菌を形質転換した。このために、大腸菌K12株を70m
Mの塩化カルシウム溶液で処理してコンピテント（DNAを
導入できる状態）にし、ハイブリッドプラスミドの懸濁
液（70mMカルシウムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.5））を加える。常法に従って、プラスミドの示す抗
生物質耐性又は感受性を利用して形質転換体を選択し、
ハイブリッドベクターを複製する。細胞を死滅させた
後、ハイブリッドプラスミドを分離し、最初に用いたも
のと同じ制限酵素で開環し、遺伝子フラグメントＩ、I
I、III及びIVをゲル電気泳動にて分離する。
ｂ）遺伝子フラグメントＩ、II、III及びIVの連結によ
る全遺伝子の構築 複製によって得られたサブフラグメントＩとIIとを次
のようにして連結する。
る全遺伝子の構築 複製によって得られたサブフラグメントＩとIIとを次
のようにして連結する。
分離したフラグメントＩ及びIIの各100ngを10μｌの
緩衝液（50mMトリス−塩酸（pH7.6）、20mM塩化マグネ
シウム及び10mM DTTを含む）に溶解し、この溶液を57℃
で５分間加熱処理する。溶液を室温にまで戻した後、１
μｌの10mMアデノシン三燐酸（pH7）及び１μｌのT4リ
ガーゼ（400ユニット）を加え、室温で16時間反応させ
る。制限酵素Sal I及びBamH Iを用いて切断後、所望の3
12塩基対フラグメント（ヌクレオチド番号１−312、Sal
I−BamH Iフラグメント）を８％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にて分離精製する。ゲル電気泳動に用いるマ
ーカー物質は、制限酵素Hae IIIにて切断したφX174RFD
NA（BRL社製）である。
緩衝液（50mMトリス−塩酸（pH7.6）、20mM塩化マグネ
シウム及び10mM DTTを含む）に溶解し、この溶液を57℃
で５分間加熱処理する。溶液を室温にまで戻した後、１
μｌの10mMアデノシン三燐酸（pH7）及び１μｌのT4リ
ガーゼ（400ユニット）を加え、室温で16時間反応させ
る。制限酵素Sal I及びBamH Iを用いて切断後、所望の3
12塩基対フラグメント（ヌクレオチド番号１−312、Sal
I−BamH Iフラグメント）を８％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にて分離精製する。ゲル電気泳動に用いるマ
ーカー物質は、制限酵素Hae IIIにて切断したφX174RFD
NA（BRL社製）である。
遺伝子フラグメントIIIとIVとを同様の方法にて連結
し、精製をして246塩基対のフラグメント（ヌクレオチ
ド番号313−558、BamH I−Sal Iフラグメント）を得
る。ゲル電気泳動に用いるマーカーは、制限酵素Msp I
で切断したpBR322である。
し、精製をして246塩基対のフラグメント（ヌクレオチ
ド番号313−558、BamH I−Sal Iフラグメント）を得
る。ゲル電気泳動に用いるマーカーは、制限酵素Msp I
で切断したpBR322である。
全遺伝子（DNA配列Ｉ）を構築するために、15ngの312
塩基対フラグメント及び12ngの246塩基対フラグメント
を、前記のようにして１μｇの市販のプラスミドpUC18
と連結させる。その際、pUC18は、制限酵素Sal Iにて予
め開環し、末端を酵素的に脱燐酸しておく。例4a）と同
様の方法にて形質転換及び複製を行った後、DNA配列Ｉ
に相当する558塩基対フラグメントを有する目的のクロ
ーンをSal I消化によって確認する。
塩基対フラグメント及び12ngの246塩基対フラグメント
を、前記のようにして１μｇの市販のプラスミドpUC18
と連結させる。その際、pUC18は、制限酵素Sal Iにて予
め開環し、末端を酵素的に脱燐酸しておく。例4a）と同
様の方法にて形質転換及び複製を行った後、DNA配列Ｉ
に相当する558塩基対フラグメントを有する目的のクロ
ーンをSal I消化によって確認する。
例５ ハイブリッドプラスミドの形質転換 コンピテントにした大腸菌をDNA配列Ｉを含むハイブ
リッドプラスミド0.1−１μｇにて形質転換し、アンピ
シリンを含む寒天平板に塗布する。このようにして、プ
ラスミドに正しく組み込まれた塩基配列を有するクロー
ンを、迅速DNA分析法（Maniatis:前出）を用いて確認す
ることができる。
リッドプラスミド0.1−１μｇにて形質転換し、アンピ
シリンを含む寒天平板に塗布する。このようにして、プ
ラスミドに正しく組み込まれた塩基配列を有するクロー
ンを、迅速DNA分析法（Maniatis:前出）を用いて確認す
ることができる。
例６ 合成遺伝子と、植物において認識される調節シグ
ナルとの融合 末端にSal I切断部位を設けておいた最適条件にした
耐性遺伝子とプラスミドpDH51（Pietrzakら:Nucleic Ac
ids Res.14（1986）5857）のポリリンカー配列とを、Sa
l I切断部位で連結した。このプラスミドは、植物の転
写機構によって認識される、カリフラワーモザイクウイ
ルス由来の35S転写のプロモーター及びターミネーター
を含んでいる。この連結によって、耐性遺伝子を、35S
転写のプロモーターの下流であってターミネーターの上
流である位置に挿入した。この遺伝子の正確な位置を制
限酵素分析によって確認した。
ナルとの融合 末端にSal I切断部位を設けておいた最適条件にした
耐性遺伝子とプラスミドpDH51（Pietrzakら:Nucleic Ac
ids Res.14（1986）5857）のポリリンカー配列とを、Sa
l I切断部位で連結した。このプラスミドは、植物の転
写機構によって認識される、カリフラワーモザイクウイ
ルス由来の35S転写のプロモーター及びターミネーター
を含んでいる。この連結によって、耐性遺伝子を、35S
転写のプロモーターの下流であってターミネーターの上
流である位置に挿入した。この遺伝子の正確な位置を制
限酵素分析によって確認した。
同様の方法にて、ソラナム・ツベロサム（Solanum tu
berosum）からのST−LS1遺伝子のプロモーター（Eckes
ら:Mol.Gen.Genet.205（1986）14）を、最適条件にした
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の植物における発現
に用いた。
berosum）からのST−LS1遺伝子のプロモーター（Eckes
ら:Mol.Gen.Genet.205（1986）14）を、最適条件にした
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の植物における発現
に用いた。
例７ 調節配列を含む耐性遺伝子のアグロバクテリウム
・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）へ
の挿入 ａ）同時取り込み法 プロモーター、最適条件にした耐性遺伝子及びターミ
ネーターを含む全転写ユニット（例６）を制限酵素EcoR
Iで切断し、中間大腸菌ベクターpMPK110（Peter Ecke
s:博士論文、Univ.Cologne（1985）、p91以降参照）のE
coR I切断部位に連結した。この中間ベクターは、耐性
遺伝子をその調節配列とともにアグロバクテリウム・ツ
メファシエンスのTi（ティー・アイ）プラスミドに移動
させるのに必要であった。この、いわゆる接合は、Van
Hauteらの記載している方法にて行った（EMBO J.2（198
3）411）。これによって、遺伝子を、pMPK110ベクター
及びTiプラスミドpGV3850kanR（Jonesら:EMBO J.4（198
5）2411）に存在する標準ベクターpBR322の塩基配列を
介しての相同組換えによって、調節シグナルとともにTi
プラスミドに組み込んだ。
・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）へ
の挿入 ａ）同時取り込み法 プロモーター、最適条件にした耐性遺伝子及びターミ
ネーターを含む全転写ユニット（例６）を制限酵素EcoR
Iで切断し、中間大腸菌ベクターpMPK110（Peter Ecke
s:博士論文、Univ.Cologne（1985）、p91以降参照）のE
coR I切断部位に連結した。この中間ベクターは、耐性
遺伝子をその調節配列とともにアグロバクテリウム・ツ
メファシエンスのTi（ティー・アイ）プラスミドに移動
させるのに必要であった。この、いわゆる接合は、Van
Hauteらの記載している方法にて行った（EMBO J.2（198
3）411）。これによって、遺伝子を、pMPK110ベクター
及びTiプラスミドpGV3850kanR（Jonesら:EMBO J.4（198
5）2411）に存在する標準ベクターpBR322の塩基配列を
介しての相同組換えによって、調節シグナルとともにTi
プラスミドに組み込んだ。
この目的のため、大腸菌DH1（pMPK110誘導体の宿主
株）及びGJ23（Van Hauteら:Nucleic Acids Res.14（19
86）5857）の新鮮培養液各50μｌを、乾燥させたYT−寒
天平板上で混合し、37℃で１時間培養した。得られた細
菌を3mlの10mM硫酸マグネシウムに再懸濁させて、抗生
物質を含む寒天平板（スペクチノマイシン50μg/ml:pMP
K110を選択、テトラサイクリン10μg/ml:R64drd11を選
択、カナマイシン50μg/ml:pGJ28を選択）に塗布する。
選択寒天平板で増殖する細菌は３種類のプラスミドを有
するものであって、アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスと接合させるためにYT液体培地中で37℃で増殖させ
た。アグロバクテリアをLB培地中で28℃で培養した。細
菌懸濁液各50μｌを乾燥させたYT−寒天平板上で混合
し、28℃で12−16時間培養した。得られた細菌を3mlの1
0mM硫酸マグネシウムに再懸濁させて、抗生物質を含む
寒天平板（エリスロマイシン0.05g/l、クロラムフェニ
コール0.025g/l:アグロバクテリウム菌株選択、ストレ
プトマイシン0.03g/l及びスペクチノマイシン0.1g/l:pM
PK110のTiプラスミドへの組入の選択）に塗布した。相
同接合によって細菌TiプラスミドにpMPK110を組み込ん
だアグロバクテリアのみが、これらの選択平板培地で増
殖できる。
株）及びGJ23（Van Hauteら:Nucleic Acids Res.14（19
86）5857）の新鮮培養液各50μｌを、乾燥させたYT−寒
天平板上で混合し、37℃で１時間培養した。得られた細
菌を3mlの10mM硫酸マグネシウムに再懸濁させて、抗生
物質を含む寒天平板（スペクチノマイシン50μg/ml:pMP
K110を選択、テトラサイクリン10μg/ml:R64drd11を選
択、カナマイシン50μg/ml:pGJ28を選択）に塗布する。
選択寒天平板で増殖する細菌は３種類のプラスミドを有
するものであって、アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスと接合させるためにYT液体培地中で37℃で増殖させ
た。アグロバクテリアをLB培地中で28℃で培養した。細
菌懸濁液各50μｌを乾燥させたYT−寒天平板上で混合
し、28℃で12−16時間培養した。得られた細菌を3mlの1
0mM硫酸マグネシウムに再懸濁させて、抗生物質を含む
寒天平板（エリスロマイシン0.05g/l、クロラムフェニ
コール0.025g/l:アグロバクテリウム菌株選択、ストレ
プトマイシン0.03g/l及びスペクチノマイシン0.1g/l:pM
PK110のTiプラスミドへの組入の選択）に塗布した。相
同接合によって細菌TiプラスミドにpMPK110を組み込ん
だアグロバクテリアのみが、これらの選択平板培地で増
殖できる。
ここにおいて、植物において活性であり、最初から存
在していた抗生物質カナマイシンに対する耐性遺伝子の
他に、PTC耐性遺伝子がTiプラスミドpGV3850kanR上に組
み込まれた。これらのアグロバクテリウムのクローンを
形質転換に用いる前に、所望の組み込みが行われたかど
うかをサザーンブロット法で確認した。
在していた抗生物質カナマイシンに対する耐性遺伝子の
他に、PTC耐性遺伝子がTiプラスミドpGV3850kanR上に組
み込まれた。これらのアグロバクテリウムのクローンを
形質転換に用いる前に、所望の組み込みが行われたかど
うかをサザーンブロット法で確認した。
ｂ）バイナリーベクター法 Konczら（Mol.Gen.Genet.204（1986）383）の記載し
ているバイナリーベクターシステムを用いた。Konczら
の記載しているベクターpPCV701（PNAS 84（1987）13
1）を次のように改変した。とくにTR1及びTR2プロモー
ターを含むフラグメントをベクターから取り除くため
に、制限酵素BamH I及びHind IIIを用いた。得られたプ
ラスミドを再び環状にした。このベクターのEcoR I切断
部位に、ベクターpDH51からのフラグメントを挿入し
た。このpDH51ベクターは、約800塩基対の長さで、カリ
フラワーモザイクウイルス由来の35S転写のプロモータ
ー及びターミネーターを含んでいる（Pietrzakら:Nucle
ic Acids Res.14（1986）5858）。得られたプラスミドp
PCV801は、35Sプロモーターとターミネーターとの間に
唯１個のSal I切断部位を有する。最適条件にしたPTC耐
性遺伝子をこの切断部位に挿入した。ここにおいて、遺
伝子の発現は35S転写調節配列の制御下に置かれた。
ているバイナリーベクターシステムを用いた。Konczら
の記載しているベクターpPCV701（PNAS 84（1987）13
1）を次のように改変した。とくにTR1及びTR2プロモー
ターを含むフラグメントをベクターから取り除くため
に、制限酵素BamH I及びHind IIIを用いた。得られたプ
ラスミドを再び環状にした。このベクターのEcoR I切断
部位に、ベクターpDH51からのフラグメントを挿入し
た。このpDH51ベクターは、約800塩基対の長さで、カリ
フラワーモザイクウイルス由来の35S転写のプロモータ
ー及びターミネーターを含んでいる（Pietrzakら:Nucle
ic Acids Res.14（1986）5858）。得られたプラスミドp
PCV801は、35Sプロモーターとターミネーターとの間に
唯１個のSal I切断部位を有する。最適条件にしたPTC耐
性遺伝子をこの切断部位に挿入した。ここにおいて、遺
伝子の発現は35S転写調節配列の制御下に置かれた。
このプラスミド（pPCV801Ac）で大腸菌SM10（Simon
ら:Bio/Technology 1（1983）784）を形質転換させた。
プラスミドpPCV801Acをアグロバクテリウム・ツメファ
シエンスに移入するために、各50μｌのSM10培養液及び
C58アグロバクテリウム培養液（GV3101、Van Larebeke
ら:Nature 252（1974）169）をヘルパープラスミドとし
てのTiプラスミドpMP90RK（Konczら:Mol.Gen.Genet.204
（1986）383）とともに、乾燥させたYT寒天平板上で混
合し、28℃で約16時間培養した。得られた細菌を3mlの1
mM硫酸マグネシウムに再懸濁させ、これを抗生物質寒天
平板（リファンピシン0.1g/l:GV3101を選択、カナマイ
シン0.025g/l:pMP90RKを選択、カルベニシリン0.1g/l:p
PCV801Acを選択）上に塗布した。両プラスミド（pMP90R
K及びpPCV801Ac）を含むアグロバクテリアのみがこの平
板上で増殖することができる。これらのアグロバクテリ
アを植物の形質転換に用いる前に、プラスミドpPCV801A
cが間違いなくアグロバクテリア内に存在しているかど
かを、サザーンブロット法によって確認した。
ら:Bio/Technology 1（1983）784）を形質転換させた。
プラスミドpPCV801Acをアグロバクテリウム・ツメファ
シエンスに移入するために、各50μｌのSM10培養液及び
C58アグロバクテリウム培養液（GV3101、Van Larebeke
ら:Nature 252（1974）169）をヘルパープラスミドとし
てのTiプラスミドpMP90RK（Konczら:Mol.Gen.Genet.204
（1986）383）とともに、乾燥させたYT寒天平板上で混
合し、28℃で約16時間培養した。得られた細菌を3mlの1
mM硫酸マグネシウムに再懸濁させ、これを抗生物質寒天
平板（リファンピシン0.1g/l:GV3101を選択、カナマイ
シン0.025g/l:pMP90RKを選択、カルベニシリン0.1g/l:p
PCV801Acを選択）上に塗布した。両プラスミド（pMP90R
K及びpPCV801Ac）を含むアグロバクテリアのみがこの平
板上で増殖することができる。これらのアグロバクテリ
アを植物の形質転換に用いる前に、プラスミドpPCV801A
cが間違いなくアグロバクテリア内に存在しているかど
かを、サザーンブロット法によって確認した。
例８ アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるニ
コチナ・タバカム（Nicotina tabacum）の形質転換 最適条件にした耐性遺伝子を、いわゆる、リーフディ
スク形質転換法によってタバコ植物に移入した。
コチナ・タバカム（Nicotina tabacum）の形質転換 最適条件にした耐性遺伝子を、いわゆる、リーフディ
スク形質転換法によってタバコ植物に移入した。
アグロバクテリアを適当な抗生物質を含むLB培地30ml
中で約28℃で継続振とうしながら培養した（約５日
間）。得られた細菌をクリスト遠心分離器による7000rp
mで10分間の遠心分離によって沈澱させ、20mlの10mM硫
酸マグネシウムで１回洗浄した。さらに遠心分離した
後、得られた細菌を20mlの10mM硫酸マグネシウムに懸濁
させてペトリ皿に移した。2MS培地で無菌培養したウィ
スコンシン38タバコ植物の葉をリーフディスク感染に用
いた。全ての無菌培養は、25−27℃で、16時間明培養/8
時間暗培養のサイクルで、明培養は白色光の下で行っ
た。
中で約28℃で継続振とうしながら培養した（約５日
間）。得られた細菌をクリスト遠心分離器による7000rp
mで10分間の遠心分離によって沈澱させ、20mlの10mM硫
酸マグネシウムで１回洗浄した。さらに遠心分離した
後、得られた細菌を20mlの10mM硫酸マグネシウムに懸濁
させてペトリ皿に移した。2MS培地で無菌培養したウィ
スコンシン38タバコ植物の葉をリーフディスク感染に用
いた。全ての無菌培養は、25−27℃で、16時間明培養/8
時間暗培養のサイクルで、明培養は白色光の下で行っ
た。
タバコ葉を切り取り、葉の表面をサンドペーパーにて
傷つけ、これを小片に切り刻んで細菌培養液に浸した。
次いで、葉小片をＭ＋Ｓ培地に移し、通常の培養条件で
２日間維持した。２日間の細菌感染の後、葉小片をＭ＋
Ｓ液体培地で洗浄し、MSC10寒天平板に移した。形質転
換した芽を、共に移入されたカナマイシン耐性をマーカ
ーとして選択した。３−６週間の後、最初の芽が肉眼で
見えるようになった。個々の芽を、さらにガラス容器中
でMSC15培地で培養した。数週間の後、切断をしておい
たいくつかの芽の切断部位から根が生じた。
傷つけ、これを小片に切り刻んで細菌培養液に浸した。
次いで、葉小片をＭ＋Ｓ培地に移し、通常の培養条件で
２日間維持した。２日間の細菌感染の後、葉小片をＭ＋
Ｓ液体培地で洗浄し、MSC10寒天平板に移した。形質転
換した芽を、共に移入されたカナマイシン耐性をマーカ
ーとして選択した。３−６週間の後、最初の芽が肉眼で
見えるようになった。個々の芽を、さらにガラス容器中
でMSC15培地で培養した。数週間の後、切断をしておい
たいくつかの芽の切断部位から根が生じた。
形質転換植物は、PTCを含む植物培地から直接に選択
することも可能であった。PTC耐性遺伝子の存在とその
発現を、形質転換植物のDNA分析（サザーンブロット
法）及びRNA分析（ノーザンブロット法）によって確認
した。
することも可能であった。PTC耐性遺伝子の存在とその
発現を、形質転換植物のDNA分析（サザーンブロット
法）及びRNA分析（ノーザンブロット法）によって確認
した。
例９ 形質転換植物のPTC耐性の証明 形質転換植物の耐性遺伝子の機能を調べるため、形質
転換植物及び非形質転換植物からの葉片を0.1mM L−PTC
を含むＭ＋Ｓ栄養培地に入れた。非転換植物からの葉片
は死滅したが、形質転換植物からの葉片は発芽した。形
質転換植物からの葉からは根が生じ、1mM L−PTCを含む
Ｍ＋Ｓ栄養培地上で容易に生長した。形質転換した植物
を無菌状態から土壌に移植し、そこで2kg/ha及び5kg/ha
のPTC噴霧を行った。非転換植物は、この除草剤処理で
は生存できなかったが、形質転換植物ではこの除草剤に
よる影響が認められなかった。噴霧処理した形質転換植
物の生長状態は、噴霧処理をしない対照植物にも劣らな
かった。
転換植物及び非形質転換植物からの葉片を0.1mM L−PTC
を含むＭ＋Ｓ栄養培地に入れた。非転換植物からの葉片
は死滅したが、形質転換植物からの葉片は発芽した。形
質転換植物からの葉からは根が生じ、1mM L−PTCを含む
Ｍ＋Ｓ栄養培地上で容易に生長した。形質転換した植物
を無菌状態から土壌に移植し、そこで2kg/ha及び5kg/ha
のPTC噴霧を行った。非転換植物は、この除草剤処理で
は生存できなかったが、形質転換植物ではこの除草剤に
よる影響が認められなかった。噴霧処理した形質転換植
物の生長状態は、噴霧処理をしない対照植物にも劣らな
かった。
例10 形質転換したPTC耐性植物におけるPTCのアセチル
化を証明するアセチルトランスフェラーゼ分析 形質変換させたPCT耐性タバコ植物又は非転換タバコ
植物から採った葉組織約100mgを緩衝液（50mMトリス−
塩酸（pH7.5）、2mM EDTA、0.1mg/mlロイペプチン、0.3
mg/mlウシ血清アルブミン、0.3mg/ml DTT、0.15mg/mlフ
ェニールメチルスルフォニル・フルオライド（PMSF））
中で均質化した。
化を証明するアセチルトランスフェラーゼ分析 形質変換させたPCT耐性タバコ植物又は非転換タバコ
植物から採った葉組織約100mgを緩衝液（50mMトリス−
塩酸（pH7.5）、2mM EDTA、0.1mg/mlロイペプチン、0.3
mg/mlウシ血清アルブミン、0.3mg/ml DTT、0.15mg/mlフ
ェニールメチルスルフォニル・フルオライド（PMSF））
中で均質化した。
遠心分離の後、得られた上澄液の20μｌを１μｌの放
射線ラベルした10mM D,L−PTC及び１μｌの100mMアセチ
ル−CoAとともに37℃で20分間反応させた。その後、25
μｌの12％トリクロル酢酸を反応液に加え、遠心分離し
た。得られた上澄液の７μｌを薄層クロマトグラクィー
プレートに移し、ピリジン/n−ブタノール／酢酸／水の
混液（容量比で50:75:15:60）中で２回上昇展開を行っ
た。PTCとアセチルPTCとをこのようにして単離して、オ
ートラジオグラフィーで確認した。非形質変換植物にお
いてはPTCのアセチルPTCへの転化は見られなかったが、
形質変換させた耐性植物においてはこの転化が可能であ
った。
射線ラベルした10mM D,L−PTC及び１μｌの100mMアセチ
ル−CoAとともに37℃で20分間反応させた。その後、25
μｌの12％トリクロル酢酸を反応液に加え、遠心分離し
た。得られた上澄液の７μｌを薄層クロマトグラクィー
プレートに移し、ピリジン/n−ブタノール／酢酸／水の
混液（容量比で50:75:15:60）中で２回上昇展開を行っ
た。PTCとアセチルPTCとをこのようにして単離して、オ
ートラジオグラフィーで確認した。非形質変換植物にお
いてはPTCのアセチルPTCへの転化は見られなかったが、
形質変換させた耐性植物においてはこの転化が可能であ
った。
第１図は、本発明の遺伝子のDNA配列及びそれに対応す
るアミノ酸配列を示す、アミノ酸及びDNA配列Ｉ、の説
明図である。 第２図は、第１図の本発明の遺伝子のDNA配列及びそれ
に対応するアミノ酸配列を示し、かつ、該DNA配列の構
築の設計をサブフラグメント名を表示して説明する、ア
ミノ酸及びDNA配列II、の説明図である。
るアミノ酸配列を示す、アミノ酸及びDNA配列Ｉ、の説
明図である。 第２図は、第１図の本発明の遺伝子のDNA配列及びそれ
に対応するアミノ酸配列を示し、かつ、該DNA配列の構
築の設計をサブフラグメント名を表示して説明する、ア
ミノ酸及びDNA配列II、の説明図である。
フロントページの続き (72)発明者 ウォルフガング、ウォールレーベン ドイツ連邦共和国ビーレフェルト、メン ツェルシュトラーセ、１ (72)発明者 アルフレート、ピューラー ドイツ連邦共和国ビーレフェルト、ア ム、ワルトシュレースヒェン、２ (72)発明者 ペーター、エッケス ドイツ連邦共和国ケルクハイム（タウヌ ス）、アム、フラックスラント、18 (72)発明者 ギュンター、ドン ドイツ連邦共和国ホーフハイム、アム、 タウヌス、ザクセンリング、35 (72)発明者 オイゲン、ウールマン ドイツ連邦共和国グラースヒュッテン ／タウヌス、ツム、ターブリック、31 (72)発明者 フリードリッヒ、ハイン ドイツ連邦共和国ハッタースハイム、ア ム、マイン、エルレスリング、40 (72)発明者 フリードリッヒ、ウェンゲンマイヤー ドイツ連邦共和国ホーフハイム、アム、 タウヌス、アム、ザイエンバッハ、38 (56)参考文献 特表 平１−503434（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 5/00 A01H 1/00 A01H 5/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有するタンパク質を
コードする耐性遺伝子であって、下記のDNA塩基配列Ｉ
（ヌクレオチド番号９−554）を含み、そのＧ＋Ｃ含量
を低下させることによって植物中での使用に適するよう
にしてある、耐性遺伝子。 - 【請求項２】植物において活性である調節及び発現シグ
ナルと連結させた、下記のDNA塩基配列を有する遺伝
子。 - 【請求項３】請求項１に記載の耐性遺伝子を含むベクタ
ー。 - 【請求項４】請求項２に記載の遺伝子を含むベクター。
- 【請求項５】請求項３又は４に記載のベクターを含む宿
主細胞。 - 【請求項６】請求項１又は２に記載の遺伝子を含む双子
葉植物由来の植物細胞。 - 【請求項７】請求項１又は２に記載の遺伝子を含む双子
葉植物の植物体、植物体部分又は種子。 - 【請求項８】請求項１又は２に記載の遺伝子を双子葉植
物の細胞に導入して植物の調節遺伝子シグナルの制御下
におき、それを発現させることからなる、フォスフィノ
トリシン耐性の双子葉植物由来の植物細胞を産生させる
方法。 - 【請求項９】請求項１又は２に記載の遺伝子を双子葉植
物に導入して植物の調節遺伝子シグナルの制御下にお
き、それを発現させることからなる、フォスフィノトリ
シン耐性の双子葉植物の植物体、植物部分又は種子を産
生させる方法。
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