JP2955314B2 - Ｉｌ―２含有リポソーム免疫アジュバント - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は有効な免疫アジュバント及び／又は抗腫瘍量
のリンホカイン、例えばインターロイキン−２（IL−
２）を含有するリポソームに関する。

発明の背景 免疫原生物質の投与における免疫アジュバントの有用
性はずっと前から認められて来ており、抗原又は他の免
疫原生物質に加えた場合、抗原活性を高め、それにより
抗体刺激能力を大にする物質を発見するというかなりの
業績がなされた。今日まで、多くのこのようなアジュバ
ントは、例えば、ある特定の抗原を混合すると、そのあ
るものは混合物中の他のの活性を高めるという抗原のミ
ョウバン沈降物の使用、インフルエンザ抗体生成を特に
高めるリン酸カルシウムの使用、及びある抗原に反応す
る抗体を改良するようにみえるスフタィロコッカス毒素
の類似の使用が見出された。幾つかの他のアジュバント
物質、例えばタピオカ、カルシウム又はマグネシウム
塩、なども、ある特定抗原に加えた場合、抗原のみを投
与した場合に得られる以上に抗体力価を増加できると考
えられて来た。

免疫アジュバントは、生成される抗体の量を増加し、
注射に必要な抗原の分量、即ち注射の度数を減じる。ア
ルミニウムアジュバントは広く用いられ、ヒトに安全で
あると考えられているが、滅菌膿瘍及び持続性小節がそ
れらの使用の後に続きうる。完全フロイントアジュバン
ト、結核菌含有水中油型乳剤はアルミニウムアジュバン
トよりも有効である。しかしながら、ひどい肉芽腫形
成、アレルギー反応及び組織内の油保持を含む有害な副
作用がヒトへの使用を妨げる。

インターロイキン−２（IL−２）は、細胞性免疫反応
の増強での中心的役割を占める。ケイ、エイ．スミス，
サイエンス,240、1169（1988）参照。ワクチンアジュバ
ントとして用いた場合、 IL−２は、マラリアスポロゾイトに対する一般的非反
応性をなくし、単純ヘルペス及び狂犬病ウイルスに対す
る保護を促進する。例えばエム．エフ．グッド等、ジャ
ーナル・オブ・イムノロジイ.141、972（1988）、エ
イ．ワインバーグ等、ジャーナル・オブ・イムノロジ
イ.140、294（1988）、ジェイ．エッチ．ナンバーグ
等、ジャーナル・オブ・セル・バイオケム．サフル.12
8、12（1988）参照。IL−２はまた、活性化マクロファ
ージによる非特異性腫瘍障害、及びリンパ球内のリンホ
カイン活性化キラー（LAK）現象の誘発を促進する。例
えばエム．マルコヴスキィ等、158、1356（1988）：ジ
ェイ．ジェイ．ムール等、サイエンス、225、1487（198
4）、及びジェイ．エム．ザーリング等、ネイチャー、2
74、269（1978）参照。それは、非常に多くのネズミ腫
瘍モデルにおいて、単独で、又は養子移入細胞、即ちIL
−２で活性化された、リンホカイン活性化キラー（LA
K）活性を示す細胞との組合せで用いると、抗腫瘍活性
を示す。しかしながら、このリンホカインを単独で又は
組織培養培地中、IL−２で活性化された末梢血単核細胞
との組合せで用いた場合、ヒト癌免疫治療プロトコール
において成功が得られる。アール．アール．サラップ
等、キャンサー、イムノル・イムノセル 22、31（198
6）、エヌ．ベリンシュタイン等ジャーナル・オブ・イ
ムノロジイ.140、2839（1988）、エヌ．エイ．ローゼン
バーグ等、エヌ・エンクル、ジェイ・メド 313、1485
（1985）。同上、316、889（1987）、アン・オブ・スル
ク 208、121（1988）、アンナルス・オブ・インターナ
ル・メディシン108、853（1988）及びマール・アイ．フ
ィッシャー等、アンナルス・オブ・インターナル・メデ
ィシン108,518（1988）参照。IL−２及び／又はIL−２
で活性化した養子移入細胞を受けている患者の臨床応答
は、腎細胞癌に対しては約20％ないし30％の範囲、メラ
ノーマに対して10％ないし20％、そして結腸癌に対して
は15％又はそれ以下である。

重症全身性毒性は、ヒトに長期間投与されたIL−２の
高用量と関連して、又、IL−２との組合せでLAK活性を
有する養子移入細胞を用いるプロトコールと関連する。
副作用は、発熱、倦怠、肝臓及び腎機能障害、中枢神経
系逆効果、例えば昏蒙、失見当及び昏睡並びに生命脅迫
肺毛管露出症候群と関連する全身水腫を含む。エス．エ
イ．ローゼンバーグ、インポータント・アドヴァンス・
イン・オンコロジィー・ヴィ・ティー・デヴィタ等、編
集、ジェイ・ピー・リッピンコット．カンパニー．フィ
ラデルフィア．ペンシルヴァニア、217−257頁参照。さ
らに、イン・ビボでのIL−２半減期はわずか約４分ほど
に過ぎない。

同遺伝子型C57BL/6マウスにおけるジメチルヒドラジ
ンの皮下注射により誘発された、MC−38ネズミ結腸アデ
ノカルシノーマによって、結腸癌の肝臓移転に対する免
疫療法処置の治療効力が評価されて来た。このモデルに
おける有意な腫瘍減少は、IL−２及びシクロホスファミ
ドと組み合わせた、IL−２活性化腫瘍浸透リンパ球（TI
L）（生成癌に浸透するリンパ球のサブポピュレーショ
ン）により先に達成された。エス．エイ．ローゼンバー
ダ等、サイエンス、233、1318（1986）参照。しかしな
がらIL−２単独の高用量は、この腫瘍に関し有意な治療
効果を示さない。さらに、LAK細胞は、腫瘍減少に必要
とするTIL細胞の数と比べると、ずっと多数を必要とす
る。両タイプの細胞培養の拡大が困難であるので、効果
的な免疫療法に充分な数の細胞を得るため、始発培地中
の細胞を大量にするか、長時間の培養を要する。

リポソーム、一又はそれ以上の二層を有するリン脂質
小胞は、リンパ管吸収及びマクロファージ取込みによ
り、固定された（entrapped）薬物の吸収及び分配を十
分に修飾し、変化させる。この取込みは、主として肝臓
中で起こり、肺、骨髄及び脾臓を含むマクロファージに
富む他の組織で少し起こる。ケイ．ジェイ．フワング．
リポソームス・フロム・バイオフィジックス・ツー・テ
ラピューティクス．エム．ジェイ．オストロ編集、マー
セル・ディッカー，ニューヨーク（1987）109−156頁参
照。例えば抗真菌効力が増加し、アンホテリシンＢの全
身性毒素をリポソーム製剤で有意に減少することが報告
されている。ジー・ロペズーベレシュタイン、アン・イ
ンフ・メド 105、130（1980）参照。しかしながら、 サイトカイン及び他の生理活性化合物の局在及び活性
に関するリポソーム取込み及び分配（delivery）の効果
は全く予測できない。さらに、リポソーム安定性は、生
理活性化合物又はその担体とリン脂質小胞壁との相互作
用、活性成分の漏出、又は最終組成成分の低安定性によ
り逆に影響を及ぼしうる。ある場合は、マクロファージ
による内存化よりもむしろリポソームからのサイトカイ
ン漏出が生物的活性と関連しているという証拠がある。

それゆえ、増強された効力と減少した毒性の免疫アジ
ュバント及びIL−２のバイオ活性とバイオ有用性の改良
が、その毒性を緩和する一方、より必要である。さら
に、癌の免疫療法用の養子細胞の改良変更、及び使用と
関連する減少した毒性が共にずっと必要である。加え
て、サイトカイン、例えばIL−２の薬物分配における改
良が、実用的な外部患者処置規制を開発するために必要
である。

発明の概説 本発明は、有効な免疫アジュバント及び／又は抗腫瘍
量のインターロイキン−２（IL−２）を含むリポソーム
を提供する。本発明は、又、リポソーム取込みによりイ
ンターロイキン−２の免疫アジュバント及び／又は抗腫
瘍効力を増強し、それにより有効なワクチンアジュバン
ト又は抗腫瘍剤を生成する方法を提供する。例えばIL−
２の、リポソームへの取込みにより、インビボでフリー
のIL−２が示す（約４分）以上延長されたIL−２半減期
（68分）を示し、ネズミ肺転移モデルでの増強された抗
腫瘍効力を示す組成物となる。IL−２リポソームの有意
の免疫アジュバント性質は、又、フリーの又はアラム吸
着の破傷風トキソイドをモデル抗原として用いることを
試みた。これらの研究は、IL−２の有用性及び他のサイ
トカインの、抗腫瘍剤としての、及び免疫学的組成物、
例えばワクチンにおける免疫アジュバントとしての可能
性を示す。

従って、有効アジュバント量の本発明のサイトカイン
−リポソーム及び免疫学的に有効量のワクチン抗原を含
むワクチンも、又、本発明の範囲内にある。本明細書で
IL−２に関して用いられる用語「有効免疫アジュバント
量」とは、製薬単位量の本発明のIL−２リポソームが製
薬単位量のワクチン抗原及び最終ワクチンを生成するた
め生理的に許容しうる液体担体と組合せた場合、用いた
IL−２によって有意のアジュバント効果を示すことを意
味する。即ち、本発明の与えられたリポソーム中のIL−
２の取込みレベルは、最終液体ワクチン処方が許容量の
液体担体中直ちに注射できるほど充分に高いものであ
る。所望により、他のアジュバント、例えば以下に開示
するものも、抗原及びIL−２リポソームとを組合せでき
る。

本発明は、又、養子移入細胞と有効抗腫瘍量のインビ
ボIL−２を含むリポソームとの組合せを用いる腹膜及び
／又は肝臓に限られた種々の癌の有効な処置を提供す
る。これらの養子移入細胞は、既に、リンパ球表面受容
体、例えばモノクローナル抗体抗−CD3、プラスIL−２
（抗−CD3＋IL−２）インビボに対する抗体により刺激
された。これらのインビボ培地でのＴ細胞は、非特異的
［例えばリンホカイン活性化キラー（LAK）］現象によ
り抗癌活性を発達させ、そこでは細胞は非MHC限定方法
で溶解する。エイ．シイー．オコア等、キャンサー・リ
サーチ、49、963（1989）参照。

Ｔ細胞増殖はモノクローナル抗CD3抗体及びIL−２の
存在で非常に増加するもので、腫瘍に対する増強免疫特
異性は、腫瘍浸透リンパ球又は抗CD3＋IL−２刺激培養
の出発物質としての腫瘍関連抗原による予備免疫後得ら
れる細胞を用いることにより得ることができる。それ
は、又、最近、ガンマデルタ型の特異的Ｔ細胞受容体を
伴うCD3 CD4 CD8 Ｔ細胞が主組織適用性複合体（MH
C）制限を必要とせずに特異的抗原認識用の能力を有す
ることを示した。イー．エム．ジャニス等、サイエン
ス、244、713（1989）参照。これらの細胞は、又、抗CD
3＋IL−２の存在で速やかに拡大する。

上で述べたように、IL−２とリポソームの取込みは、
養子移入免疫細胞と共に又はそれなくして、ネズミ肺転
移に対する抗腫瘍剤としてのIL−２の有効性を増加す
る。他のネズミモデル系では、MC−38結腸アデノカルシ
ノーマ、養子移入抗CD3＋IL−２刺激細胞及びIL−２リ
ポソームの組合せが、肝臓転移に対する有意の抗腫瘍効
果を有することを証明した。一方、養子移入抗CD3＋IL
−２刺激細胞を用い又は用いることなくフリーのIL−２
を同一のIL−２用量及び予定で用いて置き換えたとき、
何らの有意な治療恩恵も見られなかった。

従って、上述の抗腫瘍処置は、１）有効量の本発明の
サイトカインリポソーム及び２）有効抗腫瘍量の養子移
入CD3＋IL−２刺激細菌を含む。本明細書でIL−２に関
して用いられる用語「有効抗腫瘍量」は、固定したIL−
２による腫瘍における有意な減少を示す本発明のIL−２
リポソーム処方の製薬上の単位用量を意味する。又、
「有効量の養子移入細胞及びIL−２リポソーム］は、製
薬上の単位用量のIL−２リポソームとの組合せで、混合
治療による腫瘍における有意な減少を示す細胞の数を意
味する。一般に、ヒトの処置での好ましい数の細胞は、
約１×10⁸ないし１×10¹¹細胞の範囲である。ヒト患者
の処置用のIL−２の最大使用量は、１日当りm²体表面当
り約３×10⁶単位である。しかしながら、治療用量が直
接腫瘍源に投与される場合は、投与されるIL−２の量
は、１日当りm²体表面当り１×10⁶−10×10⁶単位の範囲
内である。

本発明の与えられたリポソームにおけるIL−２の取込
みレベルは、処方が、インビボで許容量の液体担体で直
ちに注射しうるに充分なほど高い。注入経路は全身性、
即ち、静脈内又は皮下、或は腫瘍に関連する局所であり
うる。局所注射は、例えば腫瘍への直接、リンパ管内
に、腫瘍を含む体腔に、或いは腫瘍の動脈床又は血液供
給への注射を含む。例えば肝腫瘍のヒトには、投与は静
脈内又は腹腔内注射で、或いはカテーテルで肝静脈に直
接にしうる。

図面の要約 第１図は、破傷風トキソイド（TT）との組合せで用い
たときのIL−２リポソームのアジュバント効果を描くグ
ラフである。

第２図（パネルＡ−Ｄ）は、フリーIL−2,IL−２リポ
ソーム（IL−２リポ）、及びハンクス均衡塩類溶液（HB
SS）との組合せで、TTを用いて得られる抗破傷風抗体力
価を描くグラフである。

第３図はIL−２リポソームを用い又は用いることな
く、破傷風トキソイド（TT）及び、アラム吸着TTで得ら
れる抗破傷風IgG抗体力価を描くグラフである。

発明の詳細な説明 IL−２ インターロイキン−２（IL−２）は、商業上入手しう
るＴ細胞増殖因子（ヒトインターロイキン−２、組換え
体、T3267）でシグマ・ケミカル・カンパニー（セント
・ルイス・ミズリィ）からの培養されたラット脾細胞
（T0892）に由来する。組換え体IL−２は又、ゲンザイ
ム（ボストン、マサチューセッツ）又はアールアントデ
ィシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ）から得られう
る。当分野で入手可能な他のリンホカインも本発明に用
いることができると確信する。これらは、IL−４、IL−
６、アルファインターフエロン、及びガンマーインター
フエロンを含む。これらのインホカインは単独でも、順
次に、又は組合せて、例えばリポソームにおける混合固
定（Co−entropment）（例えば、IL−２及びIL−６）で
用いることができる。

リポソーム 適当な条件下で、リン脂質分散は、水の存在で自然に
閉鎖膜系に再生できることが知られている。電子顕微鏡
は、これらの構造が、多数の濃縮二層（bilayer）のリ
ン脂質分子から造られ、リポソームと呼ばれることを明
らかにする。リポソームの膜モデル系としての有用性
は、乾燥リン脂質が限られた配列の分子再配列を受けて
いるので、親水性頭群の面の間の親水性溶質の非制限的
侵入の機会があるという事実から生じている。同様に、
親水性溶質の隔壁が、親油性二層内に起こる。結果は、
溶質とリン脂質の間の相互作用の型による、サイトカイ
ン又は他の生理活性化合物の量を変えることを含むこと
ができる送り出し配送系である。

多くの方法がリポソームの製造に提案されて来た。こ
れらの方法のほとんどは、粉末形であるか乾燥フィルム
のいずれかでありうる、脂質の水性水和の形を含む。最
も広く用いられる技術の一つは、フィルム法として知ら
れている。簡単にいうと、有機溶剤を伴う溶液中の所望
の組成物の脂質を丸底フラスコの壁上に、薄いフィルム
の形に乾燥させる。生理活性化合物は、この状態でフィ
ルムに含むことができる。乾燥フィルムは、適当な水性
相を加え、ゆるやかにフラスコを振蘯することにより水
和する。親水性生理活性化合物により、水性溶液は水和
に用いられる。この手順により形成されるリポソーム
は、一般に多数の濃縮二層を有し、多重ベシクル（MLV
s）と呼ばれる。

リポソームは、生理学的に活性な物質を細胞に導入す
るための潜在性薬物分配系として評価されて来た。ポズ
ナンスキー及びジュリアノ、ファルマコル Col.Rev 3
6、277−336（1984）、ビー、イー、ライマン等、エッ
セイズ・イン・バイオケミストリィ16、49（1980）参
照。

幾つかの経路の投与、例えば静脈内、皮下、腹腔内及
び経口伝達がリポソームの投与に用いられて来たグレゴ
リアディス及びアリソン編集、リポソームス・イン・バ
イオケミカル・システムズ、ジョーン・ウィリィ・アン
ド・ソンズ、ニュー・ヨーク（1980）153−178頁参照。
リポソーム送り出しの重量な進展は、生理活性成分のフ
リー型と比べて組織分布及び結合性質を変化し、それに
より治療係数を高め毒性を低下させる。例えば、腎毒性
の低下は、アンフォテリシンＢ又はサイクロスポリンＡ
を含むリポソームの使用と関連した。ジー・ロープズー
ベレーシュタイン、アン・インド・メド 105、130（19
85）及びシー等、トランスフランテイション・プロシー
ディングス、XVII巻、1397−1400（1985）参照。又、心
臓毒性及び腎毒性の減少は、フリー型の薬物に比べて、
それぞれドキソルビシン及びシスプラチン含有リポソー
ムと関連する。ラーマン等、キャンサー・リサーチ、4
2、1817（1982）及びフォースン等、キャンサー・リサ
ーチ、43、546（1983）参照。

生理活性剤の送り出しに用いられるリポソームは、典
型的には直径250Åから数マイクロメーターにわたるけ
れども、約250Åないし1300Åの範囲の小単層ベシクル
（SUVs）は、その大きさの故に、薬物担体として特に望
ましい。SUVsは、静脈内に与えると、骨髄への分配を増
大し、又、循環系での長命増加するように思える。より
小さいベシクルも又、リンパ節に皮下注射で薬物を与え
るとより効果的であると報告されている。

しかしながら、SUVsを含むリポソームは、長期間の蓄
臓及び哺乳動物系への注入でしばしば不安定である。物
理的安定性に欠ける理由は、よくわかっていない。しか
しながら、哺乳動物系での安定性に関しては、リン脂質
がインビボで見られる酵素、例えばホスホリラーゼA₂、
レシチン−コレステロール、アシルトランスフェラーゼ
（LCAT）などの基質であることが知られている。

最近、1987年２月24日出願の米国特許出願第17,369号
において、ダブリュー・ジェイ・バウマンは、リポソー
ム膜のホスホリパーゼA₂−型切断を阻害する方法を記載
した。この発明の一態様において、１−パルミトイル−
２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスホ−コリン
（POPC）と約20〜30モル％１−パルミトイル−sn−グリ
セロ−３−ホスホコリン（lysoPC）の混合物を含む膜を
有する小単層ベシクル（SUV）リポソームのホスホリラ
ーゼA₂（PLA₂）加水分解が完全に阻害された。

歴史的に、リポソームは分散体として研究されて来、
わずかに最近になって、投与時に再び分散できるよう粉
末形に連結乾燥した。ゴードン等、トラッグ・Dev.Ind.
Parm.8,465（1982）、クロメリン等、ファルム・レス、
１、159（1984）及びエヴァンズ等、米国特許第4,311,7
12号及び第4,370,349号参照。リポソームの凍結乾燥の
系統的最適化が種々の二糖類および凍結保護物質の存在
下、マーカーとしてカルボキシフルオレッセンを用いて
行なわれた。フランセン等、Int.J.Parm 33、27（198
6）参照。リポソームの不安定性は長期間の保存に大き
く関係するので、すぐに再分散可能な乾燥粉末形でリポ
ソームを提供することが大いに望ましい。一方、凍結乾
燥は、乾燥粉末リポソーム及び薬物混合物を造るのに適
用されて来、研究者は、再構成に関する薬物漏出の問題
を報告した。ある場合には、リポソームはショ糖及びト
レハローズを用いて安定化され、凍結乾燥の間、リポソ
ーム膜の結合性を保った。ストラウス及びハウザー・プ
ロシーディングス・ナショナル・アカデミィ・オブ・サ
イエンス、ユーエスーエイ、83、2422（1986、４月）；
及びストラウス等、バイオキム・バイオフィス・アク
タ、858、169（1986）参照。

ワクチン抗原 本発明は、広範囲のワクチン及び抗原組成物への取込
み用の、人及び動物に用いるための、高力価の寛容性の
よいアジュバントを提供する。抗原自体は、バクテリ
ア、寄生虫、ウイルス又はケッチャに由来する精製又は
部分的に精製した抗原、或いは腫瘍抗原の形でありう
る。或いは抗原はアレルゲン、例えば花粉、ほこり、ふ
け、又はそれらの抽出物でありうる。又は抗原は毒物又
は毒性昆虫又はは虫類動物に由来する毒液の形でありう
る。抗原は、又、多糖又は固相合成により又は組換えDN
Aの技術により得られる合成ポリペプチドでありうる。
どの場合でも、抗原は、有効なアジュバントと共に又は
それなくして適当なホストに導入した場合、抗体及び／
又は特異抗原に対する細胞免疫応答の生成を刺激するこ
とにより活性免疫を誘導するか、或いは、アレルゲンの
場合、特異アレルゲンによるアレルギーの症状を軽減す
ることを助ける形になる。抗原は、単独で又は、組合せ
て使用できる。特に重要な抗原は、バクテリア、例えば
エッチ・ヘルツシス、レプトスピラ・ポメラ及びイクテ
ロヘモルハシア、エス・テホサ、エス・パラチヒＡ及び
Ｂ、シー・ジフテリア、シー・テタニ、シー・ボツリナ
ム、シー・ペルフリンケンス、シー・フェセリ、及び他
のガス壌疸バクテリア、ビー・アンスラシス、ピー・ペ
スティス、ピー・ムルトシダ、ヴィー・コレラ、ミコバ
クテリアなどに由来し、ウィルス、例えばポリオウィル
ス（多重型）、アデノウィルス（多重型）、パラインフ
ルエンザウィルス（多重型）、麻疹、ムンプス RSウィ
ルス、インフルエンザ（多重型）、運送熱（SF4）、Ｂ
型肝炎、レトロウィルス、例えばHIV及びHTLVI、西部及
び東部ウマ脳脊髄炎ウィルス、ニホンＢ、脳脊髄炎、ロ
シア春夏脳脊髄炎、ブタコレラウィルス、口蹄病、鶏
痘、ニューカツスル病ウィルス、狂犬病、ネコ及びイヌ
のジステンパーなどに由来し、リケッチャ、例えば発疹
チフス及び発疹熱又は他の多くの斑点熱群から由来し、
種々のクモ及び蛇毒液或いは全ての既知のアレルケン、
例えばサワギク、家のほこり、花粉抽出物、草の花粉な
どに由来する。加えて、重要な抗原は、石灰病（Lyme d
isease）、マラリア（プラスモジウム・ファルシパルム
及びプラスモジウム・ヴィヴマックス）、シストミアシ
ス、レシュメリアシス、システィセアコシス（サナダム
シ類）及びヒラメ類と関連した寄生虫などに由来し、さ
らに肺癌、結腸癌メラノーマ及び神経芽腫に由来する腫
瘍抗原に由来する。

ワクチン製剤 本発明のIL−２リポソームは、商業的に入手可能な処
方を補足するアジュバントとして用いることができる
し、又は、それらを、有効量、製薬上許容しうる非毒性
担体、例えば、液体担体、例えば無菌の生理食塩水中
で、有効量の抗原製剤と組合せることによりワクチンに
製剤化できる。ワクチンの送達は、筋肉、腹腔、皮下又
は皮内注射により、滴下又は鼻腔内エロゾールで、或い
はこれらのモードを組合せて、一度に、或いは多くの単
位使用量で行ないうる。

ワクチンの与えられた単位用量に含まれる、ワクチン
抗原及び／又はIL−２リポソームの絶対量は、広く変え
ることができ、例えば、年齢、体重、ワクチン投与が考
慮される患者の生理的条件などの因子による。かかる因
子は、臨床医又は動物モデルを用いている獣医、又は、
この分野でよく知られている他の試験系によって直ちに
決定できる。

刺激される細胞 リンパ球は、IL−２及び抗原の存在下、リンパ球表面
受容体に培着しうる。リンパ球表面受容体に対するある
モノクローナル抗体、例えばＴ−リンパ球のCD3コンプ
レックスを結合するモノクローナル抗体は、分裂可能性
を有する。さらに、CD3T−細胞受容体コンプレックスの
信号送付は、インターロイキン−２依存経路を通るＴ細
胞増殖となる。エス・シー・ミューアー著、プロシデイ
ンクス：ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス，
ユーエスエイ、81、1509（1984）参照。この情報は、IL
−２の存在下、細胞表面受容体に対する抗体で刺激した
リンパ球の組合せを用いるリンホカイン活性化キラー活
性による、末梢血モノクローナル細胞又は脾細胞の迅速
拡大培養を行なうのに用いられた。例えば抗CD3モノク
ローナル抗体及びIL−２エクスビボは、組織培養媒体中
で、細胞の大量増殖を誘導する。エイ・シー・オチオア
著、ジャーナル・オブ・イムノロジィ、138、2728（198
7）、ピー・エム・マンダーソン著、シャンサー・イム
ノル・アンド・イムノセル、27、82（1988）、エイ・シ
ー・オチオア著、キャンサー・リサーチ、49、963（198
9）及びピー・エム・アンダーソン著、ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー、142、142、1383（1989）参照。

抗CD3＋IL−２の組合せで活性化した培地は、一般
に、IL−２のみで刺激した培地より約10ないし100倍速
く拡大する。さらに、MCA106肉腫を用いる肺転移モデル
で、インビボで、抗腫瘍活性を示す。しかしながら、こ
れらの抗CD3＋IL−２活性化細胞を、MC−38肝臓転移を
有するマウスに養子移入し、且つ、その動物を細胞移入
後、１日に１回フリーIL−２で処置したが、何らの有意
な治療結果も見られなかった。驚くべきことに、IL−２
リポソームの存在下、リンパ球表面受容体プラスIL−２
に対する抗体で、予め刺激した養子移入細胞は、肝臓転
移の高い有意の減少を示した。

本発明を、以下の詳細な実施例によりさらに詳しく記
載する。

実施例1. ジミストイルホスファチジルダリセロールとの組合せ
によるジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC/DMP
G）を含むIL−２−含有リポソームの製造。3.6×10⁶単
位/mg蛋白の特異活性を有する組換えIL−２をシータス
・コーポレーション、エメリィヴィル、カリホルニアか
ら得た。水性IL−２（1mgIL−2/mlH₂O、300mg脂質当り1
mlIL−２溶液）を、137Cs源からの15,000ラドガンマで
予め刺激した脂質粉末に加えた。使用した脂質は、ジミ
リストイルホスファチジルシリコン（DMPC）及びジミリ
ストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）が3:7の
割合のものであった。これら安定な合成リン脂質は、ア
ヴァンチ、バーミンガム、アラバマより入手し、−20℃
でデシケーターで保存した。

水和により形成した多重ベシクル（MLVs）として、脂
質／水性IL−２混合物を、渦き装置を用いて１分間十分
に混合した。デタージェント透析を、塩化ナトリウム、
脂質とIL−２の50:1比を用いて行なった。次いでデター
ジェントを、リポソマール（商標）装置（ディアノルム
・ゲラーテ、ミュンヘン、西独）中、リン酸緩衝食塩水
で36時間透析した。この手段はオウ・ズンビュール著に
よりバイオケム・バイオフィル・アクタ、640、252（19
81）に記載されており、本記載を引用して明細書記載の
一部とする。IL−２含有、水和MLVsの凍結／溶解は、ド
ライアイス／プロパノール及び37℃水浴中、５分サイク
ルで３回行なった。

IL−２の抱括固定は、リポソームペレットと1000gを1
0分間遠心分離したIL−2MLV製剤の上澄の蛍光アミン蛋
白アッセーにより測定し、ゲル濾過クロマトグラフィー
により大量のリポソーム（0.2−４ミクロン径）からフ
リー薬物（MW15,000）を分離して確認した。

デタージェント透析技術により単層ベシクルは42％IL
−２を固定することが判った。しかしながらIL−２含有
MLVsの凍結／溶解により、IL−２バイオアッセー及び蛍
光アミン蛋白アッセーのいずれも70％−80％IL−２蛋白
固定であることが測定された。脂質組成物がジミリスト
イルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファ
チジルコリンのみである場合、少なくとも95％固定、例
えば95％−98％が得られた（実施例２参照）。IL−２バ
イオアッセー及び蛍光蛋白アッセーについては、それぞ
れ、エス・ギリス著、ジャーナル・オブ・イムノロジィ
ー、120、2027（1978）及びピー・エム・アンダーソン
著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ィ、254、6924（1979）参照。この両者を引用して明細
書記載の一部とする。

これらの結果は、凍結／溶融手順が、多重ベシクル
中、利用できる水性スペースが５倍ないし10倍増加する
という報告と一致する。リポソームIL−２製剤は４℃で
保存すると少なくとも３ケ月安定であった。125mMショ
糖又はトレハロースの存在下に製造すると、希釈IL−２
リポソーム製剤は、溶解したときベシクル含量のロスな
く凍結できる。IL−２リポソームは、水和及び凍結／溶
解技術により30分で造ることができ、４℃で保存する。

リポソームは、その後、ハンクス平衡塩溶液（HBSS、
シグマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、ミズ
ウリィ）又は0.9％水性NaClで希釈しうる。例えば、1mg
バイアルの水性IL−２をリポソーム中に造り、次いで3.
6mlに希釈すると［IL−２＝１×10⁶シータス単位/m
l］、この用量は、インビボ研究用に注射器で容易に投
与できる。

実施例２ ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）を含むIL
−２含有リポソームの合成 脂質と蛋白の濃度、凍結／溶解及び脂質におけるIL−
２の取込みに関する浴音波処理の効果を、フリーのドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）（実施例１で用いたシータ
スIL−２と非類似）であるIL−２の供給を利用して評価
した。この組換えIL−２は、ホフマン−ラロッシュ（ナ
ットレイ、ニュージャージィ）から提供され、1.5×10⁷
単位/mgの特異的活性を有した。研究は、IL−２含有ヒ
ト血清アルブミン（HSA）キャリヤー（25mg/1×10⁶μIL
−２）及びキャリヤーフリーIL−２の両方について行な
った。ハンクス平衡塩溶液（HBSS）中のIL−２の水性溶
液を、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC,ア
ヴァンティ・ホーラー・リピッズ、ペルハン、アラバ
マ、300mg脂質/mlのIL−２）とを渦ミキサーを用いて１
分間混合し、30分間浴音波処理し、ドライアイス／エタ
ノール浴（５分）で凍結し、37℃水浴（５分）で溶解し
た。DMPCを予め137Cs源からの15,000ラドガンマ放射で
刺激した。凍結／溶解／音波処理の３循環後、リポソー
ムフラクション中のパーセントIL−２を、CTLL−20バイ
オアッセー及びリポソームペレットと10分間1000gで遠
心分離した製剤の上澄の蛍光アミン蛋白アッセーにより
測定した。用いたアッセーは、既に実施例１に記載し
た。エス・ギリス著、ジャーナル・オブ・イムノロジ
ィ、上記、ピー・エム・アンダーソン著、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリィ、上記、参照。HS
Aキャリヤー蛋白により、脂質対蛋白比は2:1で、脂質対
IL−２比は50mgDMPC/ml中750:1であった。300mgDMPC/ml
中、脂質対蛋白比は12:1で、脂質対IL−２比は4500:1で
あった。

結果は以下の表２に要約され、これらの実験でリポソ
ームが脂質ヘジクル中高濃度のIL−２を保証する方法に
より造られたことを示す。

実施例３ リポソームにおけるIL−２のバイオ有用性 MLV、実施例１の凍結／溶解リポソームにおけるIL−
２のバイオ有用性は、IL−２依存CTLL−２細胞系のDNA
への3H−チミジン取込みにより測定されるIL−２バイオ
アッセーにおけるフリーリンホカインと少なくとも同様
に良好であった。C57BL/6マウスでの皮下IL−２の半減
期は、フリー薬物に関しての４分と比べて68分であっ
た。250,000単位のIL−２リポソームの単一皮下（SC）
注射後72時間で、IL−２はマウス血清で検出可能であっ
た。一方、薬物フリーは注射後24時間で検出できなかっ
た。

実施例４ リポソーム中のIL−２の抗腫瘍活性 IL−２リポソームのMCA106肉腫肺転移に対する抗腫瘍
活性を、C57BL/6マウス中腹腔内（ip）経路を用いて評
価したところ、何の治療効果も見られなかった。しかし
ながら、皮下腫瘍へのIL−２リポソームの局所注射によ
り治療が達せられた。従って、肺転移に対するフリー又
はリポソーム処方として与えられた局所［肺内／肺部内
（itx）］IL−２の有効性が評価された。

８ないし10のC57BL/6マウス群を、ユニバーシティ・
オブ・ミネソタ・リサーチ・アミマル・リソーシィズ・
ガイドラインに従って、任意に、即ち拘束することな
く、収容し、餌を与えた。肺転移は、0.4ccハンクス平
衡塩溶液（HBSS）中、５×10⁵MCA106肉腫細胞の尻尾静
脈への注射により誘導した。腫瘍接種後５、６及び７日
目に、マウスはエーテル麻酔と以下のルートによるIL−
２の治療注射を受けた。皮下（SC）、噴霧、静脈内（i
v）、腹腔内（ip）又は肺内／肺部内（itx）。実験Ａ
で、マウス５、６及び７日目に、１日１回、50,000単位
フリーIL−２をSC又はitxルートで、又は50,000単位リ
ポソームのIL−２をSC、iv又はitxルートで与えた。肺
転移の数は、14日目にCO₂ガス室内で犠牲にし、墨汁を
気管に注入し、フェケーツ溶液（300cc70％エタノー
ル、30ccホルムアルデヒド、15cc水酢酸）中に集めた肺
を保存することにより、数えた。実験例Ｂ及びＣでは、
マウスは、５、６及び７日目に１日１回100,000単位を
以下のいずれかにより受けた。ip又はitxルートによる
フリーIL−２、噴霧によるフリーIL−２、又はitxルー
トによるリポソームIL−２、これらのマウスを生存によ
り評価した。結果は以下の表３に示す。

表３に集約されたデータにより示されるようにitxル
ートは、ip,sc又はivルートよりも有意に良好であっ
た。肺転移についての局所ルート処置の有効性を示す幾
つかの実験を実施し、表４にまとめた。肺転移は、８−
10のC57BL/6マウスのグループに、0.4ccハンクス平衡塩
溶液（HBSS）中、５×10⁵MCA106肉腫細胞の尻尾静脈注
射により誘導した。腫瘍接種後５、６及び７日目に、マ
ウスはエーテル麻酔し、フリー又はリポソームのIL−２
処方を用い、局所itxルートによりIL−２の治療注射を
した。

表４中に報告した５つの各実験で、itxルートにより
与えられたIL−２リポソームは、ネズミ肺転移モデルで
のフリーリンホカインに比べて、生存を延長し、及び／
又は肺転移を減少させた。

表５に要約されるデータにより示されるように、養子
移入抗CD3＋IL−２刺激細胞をitxルートで投与した場
合、IL−２リポソームを用いると肺転移の数がさらに大
きく減少しているのが見られる。養子細胞は、抗CD3モ
ノクローナル抗体及びIL−２と共にインビボで８日間刺
激し培養したネズミ脾細胞であった。C57BL/6マウスの
群は腫瘍接種後５、６及び７日目に、フリー又はリポソ
ーム処方として10,000単位、局所肺部内（itx）に処置
した。６日目に、20,000,000細胞をIL−２処方とitx投
与した。

実験を繰り返し、結果を生存に関して評価した。マウ
スのグループを、３×10⁴単位itx IL−２により、フリ
ー又はリポソーム処方のいずれかで、養子移入細胞と共
に又はなしで、上に記載したと同じ日程で処置した。結
果は表６に報告する。

最後に、実験を、IL−２の用量応答を決定するために
行なった。10のC57BL/6腫瘍を持つマウスのグループ
を、１日１回、５日連続して、IL−２の種々の用量で、
itxフリーIL−２又はitxリポソームIL−２処方を用い
て、ivMCA−106肉腫腫瘍接種後４−８日に処置した。結
果は表７に報告する。これらの結果は、用量応答効果と
10,000単位、25,000単位及び50,000単位をitxで５日連
続の用量で、フリーIL−２に比べ、IL−２の優れている
ことを示す。

局所肺内（itx）IL−２リポソームがフリーIL−２よ
りすぐれているのは、より長期のIL−２半減期、マクロ
ファージによるIL−２の有効なプロセシング、又はリン
パ管取込み及びリンホカインの、LAK減少又は免疫応答
を仲介した細胞のいずれかに関係する免疫細胞へのリン
ホカインの表現によると信じられる。

上記ネズミの研究において、撹乱したコート又は低下
した活性レベルにより決定されるように、リポソーム含
有IL−２の比差itx又はip用量レジメで、毒性の徴候は
全く見られなかった。日差肺内IL−２リポソームによる
イヌの研究でも、前足骨肉腫のリセッション後の60kgア
イルランドウルフハウンド及びグレートデンを、胸膜の
スペースにカテーテルチップで皮下の穴を通して、週当
り３〜５の連続日間、１日当り10×10⁶単位IL−２リポ
ソームで処置した場合、許容しうる毒性しか認められな
かった。１℃の温度上昇が、IL−２リポソームの各投与
後約３時間後に観察された。これらのイヌは、呼吸速度
又は体重増では有意な上昇を示さず、又、彼らの食欲及
活性レベルは全く影響しないように見えた。

実施例５ IL−２リポソームのアジュバント効果 A.マウスの免疫 IL−２リポソームはマクロファージにより容易に取込
まれることが知られていること、又、IL−２がマクロフ
ァージに加えて、Ｔ及びＢリンパ球に作用することか
ら、ワクチンアジュバントとして機能する実施例１［表
１（３）］のDMPC/DMPG IL−２リポソームの能力を評価
した。破傷風トキソイドをこれらの研究のためのモデル
抗原として選んだ。C57BL/6マウスに、アジュバントな
し（ハンクス平衡塩溶液、HBSS）、33,000単位フリーIL
−２、又は33,000単位IL−２リポソームと混合した0.2m
l破傷風トキソイド（0.8Lf単位、コンノート・ラボ、
（スウィフトウォーター，ペンシルヴェニア）をsc注射
した。同一処方の0.1mlの半用量ブースター免疫を28日
目にsc投与した。抗体力価を、系列希釈及びオウ・オウ
・ストラヴィトスキー、ジャーナル・オブ・イムノロジ
ィ、72.360（1954）の方法［この開示を引用して明細書
記載の一部とする］による検出の受身血球凝集法を用い
て14、28、42及び56日に評価した。

第１図に示すように、フリー及びリポソームIL−２は
共に破傷風トキソイド単独よりも高い抗体力価を促進
し、即ち正にアジュバントであった。IL−２リポソーム
処方のみが、受身血球凝集により測定されるように抗体
力価を高持続上昇に関連した。

次に、マウスを上記したようにして、アジュバントな
し（HBSS）、フリーIL−２又はIL−２リポソームで免疫
し、特異的抗破傷風抗体力価をエリサアッセーを用いて
測定した。エリサを実施するため、水性炭酸緩衝液（Na
HCO₃,Na₂CO:pH9.6）中、0.6μg/100mlのポリ−ｄ−リジ
ン（シグマ・ケミカル・カンパニー）の溶液を96−ウェ
ルアッセープレートのウェルに加え、２時間37℃でイン
キュベートした。ウェルを５回ダルベッコリン酸緩衝食
塩水（DPBS,GIBCO、グランドアイランド、ニューヨー
ク）で洗浄し、乾燥した。DPBS（100μ／ウェル）中
0.5％に希釈した50％水性グルタルアルデヒドの溶液を3
0分間37℃でインキュベートし、ウェルを５回DPBSで洗
浄した。DPBS（pH9.6）中破傷風トキソイド（TT）の1:4
希釈液を、22.5mlのTT保存溶液（コンノート・ラボ）を
67.5mlの緩衝液で希釈することにより調製した。希釈TT
をウェル（100μ／ウェル）に加えて２時間37℃で、
及び18時間４℃でインキュベートした。ウェルを５回DP
BSで洗浄した。水素化ホウ素ナトリウム、0.19g/100ml
炭酸緩衝液の溶液をウェル（150μ／ウェル）に加え
５分間25℃でインキュベートした。ウェルを５回DPBSで
洗浄した。

陽性又は陰性対照マウス又はウサギからの、或は試験
される動物からの血清をNFDM/DPBS（3g脱脂乾燥牛乳/10
0mlリン酸緩衝食塩水プラス５μの0.1％チメルゾール
溶液/NFDM/DPBS溶液のml）中に希釈し、100μの希釈
血清を各ウェルに加えた。インキュベーション時間は１
時間37℃（IgG）及び２時間37℃（IgM）であった。血清
試料をウェルから取り、次いで10回DPBSで洗った。

抗IgM（マウス又はウサギIgMに対する西洋ワサビペル
オキシダーゼ標識ヒツジIgG）を1:250にNFDM/DPBSに希
釈した。抗IgG（ウサギIgGに対する西洋ワサビペルオキ
シダーゼ標識ヒツジIgG又はマウスIgGに対する西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ標識ヒツジIgG）をNFDM/DPBS（抗ウ
サギIgG）中1:4000に、又は抗マウスIgGに対し1:500に
希釈した。これらの二次抗体とのインキュベーションを
１時間37℃で実施した。次いでウェルを10回DPBSで洗浄
した。

基質緩衝液（100μ／ウェル:11.5mlトリスクエン酸
緩衝液、0.0375mlのＯ−フェニレンジアミン2HCl、0.01
mlの30％H₂O₂、及び1mlH₂Oを組合せることにより調製）
をウェルに加えて、５分（ウサギIgG測定）、10分（ウ
サギIgM測定又はマウスIgG測定）又は30分（マウスIgM
測定）、37℃でインキュベートした。停止溶液（50μ
又は53ml 0.3MH₃PO₄プラス21ml 0.5MHClを水で500mlに
希釈）を各ウェルに加えて、基質（Ａ）を490mmフィル
ターを用いて測定した。

第２図パネルＡ−Ｄに要約されるデータは、IL−２リ
ポソーム処方が、最初の注射から各14、28、42及び56日
後に抗破傷風トキソイド抗体力価を高める能力に関し、
すぐれていることを示す。

B.ウサギの免疫 1.抗原吸着 Al（OH）_３としてのアラム（0.05wg）（アベロ・ラボ
ライリィズ、マドリド、スペイン）を1Lf単位を破傷風
トキソイド（保存溶液、8Lf単位/ml、コンノート・ラ
ボ）と混合した。吸着は30分間（25℃で10分ロッキング
し20分放置）実施した。

2.免疫プロトコール 免疫プロトコールは以下の表８に要約される。ウサギ
は、０日及び28日に0.74ml/ウサギの各４つの用量形をs
c注射した。

ウサギは、56及び70日に抗体応答のレベル及び持続性
をアッセーするために採血した。血清をNFDM/DPBSで1:8
0に希釈し、上に記載したエリサ手順によりアッセーし
た。アッセーの結果は、最初の注射後56日目及び70日目
のいずれも高い持続性の抗TT抗体力価を示し、第３図に
要約される。

実施例６ Ｂ型肝炎抗原との組合せでマウスに投与した場合のIL−
２リポソームのアジュバント有効性 Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）をメルク・インコーポレ
ーテッドから入手した、A/JマウスをIL−２リポソーム
（免疫当り50,000単位）と混合した0.1mcgHBsAgで、0.5
及び19日に免疫した。マウスは0.05ccを各後足肉趾に受
けた。ラジオイムノアッセー（アボット）により測定し
た抗体力価はIL−２リポソームを用いると有意に高い抗
体力価を示した。遅延型高血圧（DTH）により示される
ように、細胞免疫応答も、IL−２リポソームを使用した
場合、有意に高かった。HBsAgに対するDTHは、0.9％NaC
l中1mcgHBsAg（0.05cc＝容量）を右耳に、0.9％NaClの
みを左耳に注射することにより測定した。耳の厚さをミ
クロメーターを用いて注射の24時間後に測定した。結果
は以下の表９に要約され、Ｂ型肝炎抗原のみに比べＢ型
肝炎／リポソームIL−２ワクチン処方の接種による免疫
応答で有意の改善を示す。

実施例７ ヒト免疫不全ウイルス（HIV）抗原との組合せでマウス
に投与した場合のIL−２リポソームのアジュバント有効
性 ヒト免疫不全ウイルス（HIV）抗原をバイオデザイン
・インコーポレイテッド（ゲンバンクポート・メーン）
から精製ウイルス溶解物（1mg）として得た。ウイルス
溶解物は少量のgp41とコア蛋白を含むがgp120は検出で
きなかった。HIV抗原で免疫したバルブＣマウスにおい
て、液性及び細胞免疫応答へのIL−２リポソームの有意
なアジュバント効果を示した。10マウスのグループを、
HBSS又はIL−２リポソーム（免疫当り75,000単位）と混
合して0.1mcg、0.5mcg及び2.5mcgHIV抗原を、0.7及び21
日に皮内に（足趾）免疫した。各後足趾に、1.2mgペン
トバルビタールで麻酔後0.05cc注射した。33日目に、５
匹のマウスから血清を得、抗HIV力価をジェネティック
・システムズ・EIAキットを用いて測定した。HIV抗原に
対する免疫応答を、0.9％NaCl（0.05cc二容量）中、1mc
gHIV抗原で右耳を、0.9％NaClのみで左耳を注射して測
定した。耳の厚さはミクロメーターを用いて注射後24時
間目に測定した。結果は以下の表10および11に示され、
HIVワクチン処方中のIL−２リポソームの取込みで、液
性及び細胞免疫応答において有意な増加を示す。

実施例８ 杭CD3＋IL−２細胞の培養 ６−12週のC57BL/6マウスからの脾細胞を、無菌ガラ
スストッパーで脾臓をゆっくりとつぶし、5mMHEPES、2m
ML−グルタミン、５％ウシ胎児血清、ml当たり100単位
ペニシリン、ml当たり100ミリグラムのストレプトマイ
シン,10mM非必須アミノ酸,10mMピルビン酸ナトリウム
（ジブコ、グランド・アイランド、ニューヨーク）及び
25ミクロモル２−メルカプトエタノール（シグマ・ケミ
カル・カンパニー、セントルイス・ミズウリ）を含む、
RPM11640補足（シブコ、グランド・アイランド、ニュー
ヨーク）からなる組織培養培地の懸濁液より得た。脾臓
細胞懸濁液から得た巨大分子細胞をナイテックススクリ
ーンを通して濾過し、次いでフィコール−ハイパック
（ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージィ）
で遠心分離し、巨大分子調製物を得た。界面細胞を集め
て組織培養培地で２回洗浄し、次いで、145−2C11ネズ
ミ抗CD3抗体及びIL−２（ml当り300単位）を補助した組
織培養培地を入れたフラスコに移した。オウ、レオ著、
プロシーディングス、ナショナル・アカデミィ・オブ・
サイエンス・オブ・ユーエスエイ、84、1374（1987）参
照。最初の細胞の密度は、ml当り0.5×10⁶細胞であっ
た。これらを湿った５％CD₂雰囲気中37℃でインキュベ
ートした。細胞を5.7及び９日目に集め、投与した。即
ち、腹腔内ルートを用いて、各腫瘍を有するマウスに0.
2ccの容量で養子移入した。これらのマウスは予め0.5×
10⁶MC−38:結腸マデノカルシノーマ細胞を０日目に脾臓
内に注射し、3.5及び７日に養子関係細胞でipに処置し
た。あるマウスは、又、IL−２リポソームで１日１回
（10,000から50,000単位までの範囲の用量）で、３日か
ら７日にかけて、0.2ccipで処置した。腫瘍接種後11日
目に、マウスを黒汁で超腸間膜静脈注射し、肝臓移転を
直接数えることにより脾臓移転の存在を評価した。空の
リポソーム、細胞のみ、細胞プラスIL−２、又はIL−２
リポソームのみで処置した動物は、肝臓移転の数につい
て有意な減少を示さなかった。ただ、抗CD3＋IL−２細
胞及びIL−２リポソームの組合わせを用いた場合のみ、
肝臓移転に有意な減少が見られた。用量応答パターンが
治療のリポソーム及び細胞腕に存在した。即ち、移転の
すぐれた減少がIL−２リポソーム及び細胞の用量を増加
することで見られた。表12−14参照。

即ち、IL−２リポソームの包投固定は、有意の抗腫瘍
とアジュバント有効性を有する組成物となる。IL−２以
外の数多くの組換えサイトカインも入手可能であるか
ら、同様の方法を用いるリポソームが、癌及びワクチン
研究における免疫応答修飾剤の治療有効性を増加するの
に用いることが可能である。

本発明を種々の特異的及び好ましい態様並びに技術を
引用して記載した。しかしながら、多くの変更及び修飾
をなし得、本発明の精神及び範囲内にあることが理解さ
れるべきである。引例の関連部分を引用して明細書記載
の一部とする。

以下に、本発明の具体的な実施態様の例を列記する。

1.免疫原的有効量の非リポソーム的捕捉ワクチン抗原と
有効な免疫アジュバント量のリポソーム的捕捉インター
ロイキン−２（IL−２）を、医薬的に許容し得る液体担
体と共に含有することを特徴とする、ワクチン。

2.（ａ）免疫原的有効量の非リポソーム的捕捉ワクチン
抗原と（ｂ）有効な免疫アジュバント量のリポソーム的
捕捉インターロイキン−２（IL−２）を、（ｃ）医薬的
に許容し得る液体担体と共に含有し、リポソーム的捕捉
IL−２がリポソーム脂質、IL−２および蛋白質担体を含
み、蛋白質担体とリポソーム脂質の重量比が1:2〜1:12
であることを特徴とする、ワクチン。

3.IL−２の免疫アジュバント効果または抗新生（antine
oplastic）効果増強用医薬の調製のための、（ａ）リポ
ソーム的に捕捉されたインターロイキン−２（IL−２）
と（ｂ）医薬的に許容し得る液体担体の使用。

4.（ａ）有効量のリポソーム的捕捉インターロイキン−
２（IL−２）と（ｂ）有効量の活性化細胞を含有し、活
性化細胞はイン・ビトロでIL−２とリンパ球表面リセプ
ターに対する抗体により刺激されたものであることを特
徴とする、転移（metastases）処置用医薬。

5.ワクチン抗原がバクテリア、パラサイト、ウイルスま
たはリケッチャから誘導されるものである、上記１また
は２記載のワクチンもしくは上記３記載の免疫アジュバ
ント治療増強のための使用。

6.抗原がH.pertussis,Leptospira pomona,Leptospira i
cterohaemorr hagiae,S.typhosa,S.paratyphi A,S.para
typhi B,C.diphtheriae,C.tetani,C.botulinum,C.perfr
ingens,C.feseri,B.anthracis,P.pestis,P.multocida,
V.choleraeおよびmycobacteriaからなる群から選択され
たバクテリアより誘導されるものである、上記５記載の
ワクチン。

7.抗原がC.tetaniである上記６記載のワクチン。

8.poliovirus,adenovirus,parainfluenza virus,measle
s,mumps,respiratory syncytial virus,influenza,ship
ping fever virus（SF4）,hepatitis B,retroviruses,W
estern and Eastern equine encephalomyelitis,Japane
se B.encephalomyelitis,Russian Spring Summer encep
halomyelitis,hog cholera virus,hoof and mouth dise
ase,fowl pox,Newcastle disease virus,rabies,Feline
distemperおよびcanine distemperからなる群から選択
されたウイルスより誘導されるものである、上記５記載
のワクチン。

9.抗原がＢ型肝炎ウイルスである、上記８記載のワクチ
ン。

10.抗原がHIVレトロウイルスである、上記８記載のワク
チン。

11.Lyme disease,malaria,schistosomiasis,leshmenias
is,cysticercosisおよびfluke parasitesからなる群か
ら選択されたウイルスより誘導されるものである、上記
５記載のワクチン。

12.ワクチン抗原が腫瘍抗原である、上記１または２記
載のワクチンもしくは上記３記載の免疫アジュバント治
療増強のための使用。

13.腫瘍抗原が肺癌、腸癌、メラノーマおよび神経芽細
胞腫からなる群から選択された腫瘍より誘導されるもの
である、上記12記載のワクチン。

14.ワクチン抗原がアレルゲンである、上記１または２
記載のワクチンもしくは上記３記載の免疫アジュバント
治療増強のための使用。

15.ワクチン抗原が毒性昆虫または爬虫動物から誘導さ
れた毒または毒物の形にある、上記１または２記載のワ
クチンもしくは上記３記載の免疫アジュバント治療増強
のための使用。

16.リポソーム的捕捉IL−２がリポソーム脂質、IL−２
および蛋白質担体を含み、当該担体と当該リポソーム脂
質との重量比が1:2〜1:12である、上記１記載のワクチ
ン、上記３記載の使用または上記４記載の医薬。

17.医薬が肺転移を有する患者に対して胸腔内投与され
る、上記３記載のIL−２の抗新生効果増強のための使
用。

18.抗体がCD3コンプレックスに結合するモノクローナル
抗体である、上記４記載の医薬。

19.転移が肺または肝臓の転移である、上記４または18
記載の医薬。

フロントページの続き (72)発明者 オチョア、オーガスト・シー アメリカ合衆国55406 ミネソタ、ミネ アポリス、イースト・トゥエンティーセ カンド・ストリート 2529番 (72)発明者 ローフラー、シンシア アメリカ合衆国55125 ミネソタ、ウッ ドベリー、アムバーウッド・ドライブ 2299番 (56)参考文献 特開 昭60−243022（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−37729（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−130920（ＪＰ，Ａ) 欧州公開274219（ＥＰ，Ａ１) Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ａｇｅ ｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒｃ ｐｙ，Ｖｏｌ．27，（1985）ｐ．903− 907 Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓ ｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．507（1987) ｐ344−347 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 39/39 A61K 38/00 A61K 9/127 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】免疫原的有効量の非リポソーム的捕捉ワク
   チン抗原と、有効な免疫アジュバント量のリポソーム的
   捕捉インターロイキン−２（IL−２）を、医薬的に許容
   し得る液体担体と共に含有することを特徴とする、ワク
   チン。
2. 【請求項２】（ａ）免疫原的有効量の非リポソーム的捕
   捉ワクチン抗原と、（ｂ）有効な免疫アジュバント量の
   リポソーム的捕捉インターロイキン−２（IL−２）を、
   （ｃ）医薬的に許容し得る液体担体と共に含有し、上記
   リポソーム的補足IL−２がリポソーム脂質、IL−２およ
   び蛋白質担体を含み、蛋白質担体とリポソーム脂質の重
   量比が1:2〜1:12であることを特徴とする、ワクチン。
3. 【請求項３】（ａ）リポソーム的捕捉インターロイキン
   −２（IL−２）と（ｃ）医薬的に許容し得る液体担体と
   を含有することを特徴とする、非リポソーム的捕捉ワク
   チン抗原と共に使用されるべき免疫アジュバント効果増
   強剤。