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JP2818191B2 - 固相分析装置 - Google Patents

固相分析装置

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JP2818191B2
JP2818191B2 JP1076382A JP7638289A JP2818191B2 JP 2818191 B2 JP2818191 B2 JP 2818191B2 JP 1076382 A JP1076382 A JP 1076382A JP 7638289 A JP7638289 A JP 7638289A JP 2818191 B2 JP2818191 B2 JP 2818191B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般に、単一の反応領域上で手順コントロー
ル領域および分析対象物結合領域を用いることにより複
数個の読み取り可能な結果を示し得る分析装置に関す
る。さらに詳しくは、結合アッセイを行うのに有用な改
良された分析装置に関する。本発明は、血清、血漿、全
血、尿、脊髄液および羊水などの生物学的流体およびそ
の産物の酵素イムノアッセイを行うのに特に有利であ
る。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） 種々の分析手順および装置が、臨床的に重要かまたは
感心の持たれる物質の存在および／または濃度を決定す
るためのアッセイに広く用いられている。これらの物質
は、流体または他の物質中に存在するかもしれないもの
である。そのような臨床的に重要かまたは感心の持たれ
る物質は一般に「分析対象物」と呼ばれ、これにはたと
えば、抗体、抗原、および［リガンド」なる語で一般に
広く知られている広範囲の物質が含まれる。
特に人体の疾患または他の病的状態の診断および治療
に関しては、臨床的に重要なある種の分析対象物の生物
学的流体中の存在または量を時宜よく正確に決定するこ
とが、病理学的身体的異常を治療および管理したり、ま
たは妊娠などのような生理学的状態の早期かつ正確な決
定を行う健康介護専門家の能力に重大な影響を与え得
る。
人体の種々の異常および病的状態の診断に用いられる
ことがますます多くなっているアッセイ法の一つは結合
アッセイであり、とりわけ酵素イムノアッセイ（EIA）
として知られるタイプの結合アッセイである。EIA法
は、生物にとって病原性であるかまたは異物である物質
（すなわち抗原）の生物内での存在に応答して抗体が産
生されるという、高等生物における免疫系の機構を利用
したものである。特定の抗原に応答して１種または２種
以上の抗体が産生され、抗体はその特定の抗原と反応す
ることができ、かくして非常に特異的な反応機構が得ら
れる。この反応機構を特定の抗原を決定するためにイン
ビトロで有利に利用することができる。
従来のEIA手順には液体試薬を用いた一連の湿潤化学
工程が含まれ、その場合、アッセイ下の生物学的流体試
料中の分析対象物、たとえば尿、全血または血清試験試
料中の抗原または抗体が検出される。一つのタイプのEI
A手順においては、試料中の分析対象物は、試料中に導
入された対応する抗原または抗体試薬とまず結合する。
ついで他の抗原または抗体を導入する。しかしながら、
この第二の抗原または抗体は、認識されているか、酵素
が結合しているか、または発色源や染料のような別の適
当な指示試薬と反応して、またはその存在下で発色のよ
うな検出可能な応答を産生もしくは引き起こし得る他の
物質が結合している。
ついで、こうして得られた検出可能な応答は、最初の
試料中に存在していた抗原または抗体の存在または量の
指標または測定基準として、視覚によりまたは器械によ
り読み取りおよび解釈がなされ得る。
固相EIA手順は、一般にラジオイムノアッセイ（RIA）
や他の従来の湿潤化学法などのこれまで用いられてきた
液体試薬結合アッセイに比べて安全性、使用の容易さ、
特異性および感度において優れていることから、抗体お
よび抗原の両アッセイにおいて好ましいと思われる。さ
らに、分光光度計を用いるなどして器械により発色を読
み取ることができるということは、多くの固相EIA法の
特徴であり、その結果、一般に広く用いられることとな
った。
従って、従来の固相EIA「サンドイッチ」アッセイの
１つのタイプにおいては、抗体または抗原を含有してい
ると思われる試験試料をまず固体と接触させる。この固
体は、該抗原または該抗体と反応することのできるタン
パク質または他の物質を前以てコーティングした、実質
的に不活性なプラスチックまたはガラスビーズまたは他
の支持体物質であり、抗原または抗体は支持体表面上に
固定化されるかまたは化学的に結合することにより支持
体表面上に保持される。
ついで、通常、酵素を結合（化学的に結合）した第二
の抗原または抗体を加え、この第二の抗原または抗体は
支持体上の対応する抗体または抗原と結合する。１また
は２以上の洗浄工程により未結合物質を除いた後、つい
で指示物質、たとえば酵素の存在下で反応することので
きる発色源物質を加えると、酵素の存在に対する感受性
の故に検出可能な色応答を生じる。色応答の発色、その
強度などは、視覚によりまたは器械により決定すること
ができ、試料中に存在した抗原または抗体の量と相関さ
せることができる。
そのようなアッセイ法、免疫学的反応を行うために固
相ビーズや他のタイプの支持体を使用すること、および
そのようなアッセイに必要な変更についてはよく知られ
ているが、欠点がないわけではなかった。たとえば、ア
ッセイを行うためや用いた液体試薬を入れるために精巧
な装置が必要とされることは、とりわけ個々の試料を少
量で試験しようとするときに相当の労力と装置費用とが
かさむという結果をしばしば招いた。
さらに、そのようなアッセイの正確さおよび再現性
は、しばしば最適条件を下回るものであった。というの
は、ある特定のアッセイのために、従来通りコーティン
グした固体支持体およびそのアッセイに付随する他の装
置の製造を、そのアッセイに用いたすべての物質を前以
て決定しておいた感度および特異性の条件に合うように
特別に設計することはしばしば困難であるからである。
従って、EIA法に有利に用いることができ、多数の繁雑
な湿潤化学工程や複雑な器械を使用する必要もなく、上
記のような従来法に匹敵する急速で感度がよく再現性の
優れた結果を得ることができ、比較的操作が簡単で使用
が容易かつ比較的廉価な固相物質および分析装置を開発
する必要性が存在する。
（課題を解決するための手段） 本発明は、上記必要性に直接取り組むものであり、一
つの観点において、試験試料中の分析対象物の存在およ
び量を決定するための結合アッセイを行う上で有用な装
置、および該装置を用いたアッセイを提供するものであ
る。他の観点において、本発明は改良された固相分析装
置、および該装置を用いた結合アッセイを提供するもの
であり、これらは従来の装置およびアッセイに比べて非
常に有利なものである。さらに別の観点において、本発
明は、固相分析装置に用いるための独特のオンボード
（on−board）手順コントロールを提供する。
すなわち、本発明は、結合アッセイにおいて流体試料
中の分析対象物の存在または量を決定するのに有用なク
ロマトグラフ試験装置であって、反応部位、流体試料を
接触させるための部位および毛管現象により流体試料を
反応部位に輸送するための手順を有する多孔質基準なら
びに結合を検出するための標識手順を含む装置におい
て、該反応部位に、試料中に分析対象物が存在すると否
とにかかわらず標識に結合できる結合試薬を固定化した
陽性コントロール領域、分析対象物への結合試薬を固定
化した分析対象物結合領域および陰性コントロール領域
を設け、その際、該陽性コントロール領域と該分析対象
物結合領域とは、標識の存在下において一緒になって、
試料中に分析対象物が存在する場合に陽性の結果を示す
第一の既存符号を形成するような形態にあり、該陽性コ
ントロールは、標識の存在下において単独で、試料中に
分析対象物が存在すると否とにかかわらず陰性の結果を
示す第二の既知符号を形成するような形態にある、こと
を特徴とする装置に関する。
本発明の改良装置はクロマトグラフ型試験装置であっ
て、結合アッセイを行うための反応部位を含む。従来よ
り公知のフロースルー（flow−through）型アッセイ装
置では、第一の試料接触表面および該第一の表面に向か
いあった第二の表面を有する。装置中での実質的に平面
な層の配置を、結合アッセイを行うのに装置を用いたと
きに第一の表面に接触する試料の少なくとも一部が実質
的に平面な層を通って第二の表面へ通過していくように
する。
本発明は、試験試料中の種々の分析対象物の未知の存
在または濃度を決定するための結合アッセイを行うのに
有利であるばかりでなく、固相アッセイ装置のためのオ
ンボードコントロールを提供する点でも有利である。以
下にさらに詳しく述べるように、本発明による好ましい
固相分析装置には、陰性の結果を示すための視覚化陽性
コントロール領域のようなアッセイコントロールが組み
込まれており、これにより視覚化アッセイシステムおけ
る試験結果の明白な解釈が可能となる。また、たとえ
ば、本発明を利用した好ましい手順コントロール装置に
は、本発明の物質を含んでいることができ、この物質は
繊維の多孔質マトリックス中に、分析下の試験試料中の
分析対象物に対して検出可能な応答を生成させることの
できる物質を有している。
本発明に従って、本発明の物質および装置を利用した
結合アッセイを行うための改良方法が提供される。その
ような好ましい方法の一つの態様においては、分析対象
物（たとえば抗原または抗体）を含有する試料を多孔質
物質からなる反応表面と接触させる。該多孔質物質は、
その上に反復固定化された固体粒子を含んでいてよい。
反応部位に接触させる方法は多数の手段のうちのいずれ
を用いても行うことができるが、クロマトグラフ流によ
って行うのが好ましい。
分析対象物は、多孔質物質内に保持された粒子上の試
薬に結合する。ついで、多孔質物質内に保持された試薬
により結合した分析対象物に結合することのできる第二
の「標識」試薬に反応表面を接触させる。別法として、
第二の試薬は非標識抗体であってもよく、その場合は、
ついで該抗体に向けられた標識物質または試薬を加える
（増幅または間接イムノアッセイ）。その後、未結合物
質をたとえば洗浄により除き、ついで装置を指示物質と
接触させる。指示物質は、第二の試薬の「標識」の存在
下で検出可能な応答を生じることができ、この応答によ
り試料中の分析対象物の存在および／または量が示され
る。
そのような検出可能な応答は視覚により、または器械
により読み取ることができ、また色応答であるのが有利
である。さらに、特にアッセイからそれぞれ陽性または
陰性の結果のみが必要であるかまたは所望されるときに
は、アッセイの結果を示すのに「＋」または「−」の符
号が視覚で見えるような形態にするのが最も望ましい。
また、検出可能な応答を視覚によりまたは器械により読
み取ることにより、定量的または半定量的な結果を得る
こともできる。
以下に本発明をさらに詳しく説明する。
本発明の読み取り可能な応答およびそれから得られる
装置は、多くのタイプの分析に適用可能であるが、イム
ノアッセイに用いるのが特に有利であり、既に記載した
ような生物学的流体の比色もしくは他のEIAを行うため
の従来の固相イムノアッセイ法を改良することができ
る。さらに、本発明による装置は、従来法のアッセイと
比較して比較的使用が容易であり、必要とされる工程手
順も少なく、複雑さの一層少ないアッセイ法である。
本発明の装置により提供されるさらに別の利点は、未
知の試料を試験するのに定量的、半定量的もしくは定性
的な結果が迅速に得られることである。本発明の物質お
よび装置はまた、たとえばアッセイの正確さおよび信頼
性を評価するためにコントロールとして有利に使用する
ように適合させることもできる。さらに、本発明の装置
は、その製造過程において比較的容易に製造が可能であ
る。そのような本発明の装置を利用したアッセイもま
た、種々のレベルの分析対象物に対して高い感度を示す
行ことがわかった。上記利点および他の利点は、以下に
詳細に記載された発明から明らかになるであろう。
本発明は、種々のタイプの結合アッセイに適用可能で
ある。抗原および抗体分析対象物のためのそのようなア
ッセイのタイプの幾つかの例について概略を以下に説明
するが、当業者には抗原または抗体以外の分析対象物を
含む他の多くのタイプのアッセイをも想起することがで
きるであろう。
（Ｉ）直接アッセイ AbはAb2と同じであっても同じでなくてもよく、種々
のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体からな
っている。
上記反応式を使用して本発明により決定可能な抗原分
析対象物の例としては、Strep−Ａ、β−hCGおよびＢ型
肝炎表面抗原（HBsAg）が挙げられるが、これらに限ら
れるものではない。
このアッセイは、標識が分析対象物に向けられていな
い一群のアッセイである。この態様においては、一般的
にはAbに対して、またはAb中に組み込まれた１または２
以上の官能基に対して抗Abが向けられてよい。
ある場合には、下記のように分析対象物を固相上に直
接捕捉するようにするのが望ましい。
このアッセイにおいては、試料と標識の両方が固相上
の抗原に対して向けられる。結合した標識の量は、試料
中の抗体の量を反映する。
第１図および第２図には、参考までに従来のフロース
ルー型の分析装置10を示してある（アボット・ラボラト
リーズ、ノースシカゴ、イリノイからTESTPACKの登録商
標の下に市販されている）。装置10には、実質的に平面
的な、一般に円形のディスク形態の反応マトリックス12
が含まれている。マトリックス12の装置10内での配置
は、装置10を試料中の分析対象物の存在または量を決定
するためのアッセイを行うのに使用したときに、結合ア
ッセイに必要な種々の化学反応や変化が該マトリックス
12内で起こるようなものにする。マトリックス12は、試
料含有表面（反応部位）12a、およびそれと反対側に表
面12bを有している。マトリックス12の好ましい組成に
ついては、下記に述べる参考例においてさらに詳しく記
載する。
装置10にはさらにキャリア14が含まれ、この中にマト
リックス12が配置される。キャリア14は、プラスチッ
ク、金属または他の剛体もしくは半剛体物質などの適当
な物質からなっていてよい。キャリア14のために特に好
ましい物質は、「ABS」として商業的に知られるプラス
チックであり、モンサント社（サントルイス、ミズー
リ）から入手可能である。図に示した好ましい態様にお
いて、キャリア14はマトリックス12を完全に包含し、支
持体およびホルダーとして働く。この機能を果たすため
に、キャリア14はマトリックス12を堅固に支持し保持す
るための一般に円形のフランジ16を有している。
第１図および第3a図に最もよく示されているように、
アッセイを行うのに使用する流体試料および試薬を入れ
るための流体室17が、フランジ16の外壁面16aにより形
成される側壁およびマトリックス12の試料含有表面（反
応部位）12aにより形成される底壁面によって装置10中
に区画されている。
装置10はさらに、図に示すようにアッセイ装置を使用
する間に流体を吸収するための吸収手段20をキャリア14
中に含んでいる。吸収手段20は１または２以上の層物質
からなっていてよく、図に示すように、使用するときに
はバリヤ物質18と、または反応マトリックス12と物理的
に接触している。この特に有利な特徴により、アッセイ
手順中に過剰の流体が反応マトリックス12から通過した
後に必要になるように、装置10を用いたアッセイを行う
間に過剰の流体を容易に吸収させることが可能になる。
吸収手段20は実質的にいかなる水分もしくは流体保持物
質であってもよく、たとえばジェームズ・リバー（Jame
s River）から入手でき「105ポイント」または「50ポイ
ント」と呼ばれるものであってよく、これらの１層また
は２層以上の組合わせであるのが特に好ましい。
装置10の他の態様においては、固相分析装置中の流体
流を制限するためにバリヤ手段を使用する。この態様が
特に有利であるのは、透過性の反応表面もしくはマトリ
ックスまたはフィルター層、および用いた流体を吸収す
るための吸収層を有し、反応表面から吸収手段もしくは
層への流体流を可能にしながら吸収層から反応マトリッ
クスへの流体の逆流を防ぐようにしている固相分析装置
に用いる場合である。
第１図に示すように、バリヤ手段は、マトリックス12
の下部およびキャリア14の内部に広がるバリヤ物質18か
らなる。バリヤ手段18はマトリックス12の表面12bと接
触しており、装置を使用したときに流体がマトリックス
12を通って表面12bへまたは表面12bを通ってバリヤ物質
18中へ流れていくのを、表面12bと再接触することから
制限するように働く。
このバリヤ物質18を流体制限層として用いるのは、マ
トリックス12中の「バックグラウンド」妨害を防ぎもし
くは取り除くために最も好ましいものではあるが、この
特徴はマトリックス12の基本的な機能または概念からい
って本質的なものではなく、所望なら通常は装置から省
くことのできることを認識する必要がある。省いた場合
でも装置はアッセイにおいて一般に充分な性能を有する
であろうが、感度は悪くなる（検出可能な応答が減少す
る）かもしれない。
バリヤ物質18は、流体または水の流れを制限し実質的
に「一方通行」にすることのできる適当な物質であれば
いかなるものからなっていてもよい。この目的のために
特に適している物質の例としては、エチル・ビスキーン
（Ethyl Visqeen Corp.,）（バトンルージュ、ルイジア
ナ）から「Ｘ−6057」（1.0mil）および「Ｘ−6108」
（1.25mil）の名称の下に製造・販売されているポリエ
チレン織布、および米国特許第3,929,135号および同第
4,342,314号各明細書に記載されているポリエチレン織
布が挙げられる。
下記に述べるように、装置10は発色のような試験試料
中の分析対象物を示すことのできる視覚的に読み取り可
能な応答を生じることができることに加えて、たとえば
アッセイを行ったときにマトリックス12内に起こる化学
的および生物学的反応および変化の結果としてマトリッ
クス12により生成される視覚光の反射率、蛍光の強度な
どに対応して、検出可能な応答を器械により決定するこ
とができることも認識されなければならない。
従って、装置10からの検出可能な応答は、たとえば従
来の分光光度計により測定することができる。たとえば
特定のアッセイを行っているときに反応または変化によ
りマトリックス12中に生成した検出可能な応答が、発色
によるものであり、発色の増加が分析を行っている試験
試料中の特定の分析対象物の増加レベルを示すようなも
のである場合は、マトリックス12から分光光度計に反射
された光の減少レベルが試料中の分析対象物の増加レベ
ルに対応する。
こうして得られた結果の解釈は、当業者にはよく知ら
れた方法により行うことができ、たとえば主として通常
のエレクトロニクスを用いて分光光度計の検出器により
生成したアナログ信号をデジタル情報に変換することに
より行うことができる。そのようなエレクトロニクスは
また当業者にはよく知られており、そのようなデジタル
情報からヒトが読み取り可能な信号を生成することがで
き、これは試験試料中の分析対象物の存在および／また
は量に対応もしくは相関する。
第１図、第２図および第５図をさらに詳しく参照する
と、装置10にはさらにフィルター手段22が含まれ、これ
は反応マトリックス12の反応部位または表面12aの上方
に配置されている。フィルター手段22は保持リング22a
によってキャリア14中に圧着されており、ハンドル部分
22cの付いた取り外し可能な部分22bを有しているのが好
ましい。
フィルター手段22はさらに、たとえば周囲がプラスチ
ックのガラスもしくはセルロースフィルター膜のような
適当な多孔質繊維性物質22dを含んでおり、特に好まし
いのはライダル（Lydall）からの「Lydair TM Grade25
4」およびファットマン（Whatman）からの「GF/F」また
は「GF/D」を単独で用いたものかまたはそれらを組合わ
せて用いたものである。
装置10をアッセイを行うのに使用したときには、フィ
ルター手段22は種々の機能を果たすことができる。行っ
たアッセイの種類や試験試料の性質に応じて、試料を保
持したり試料または試薬が反応マトリックス12へ通過す
るのを遅くしたりするための貯蔵器として、試薬（たと
えば凍結乾燥試薬）を保持してアッセイに使用するため
の運搬手段として、および試料中の外来性微細物質を除
いたりもしくは血漿部分は通過させながら全血から血球
を分離・保持したりするための「プレフィルター」とし
ての機能を果たす。
さらに、第５図に示すように、フィルター手段22が少
なくとも部分的に装置10から取り外し可能な場合は、フ
ィルター手段22内に保持された物質を除くため、反応マ
トリックス12を試薬の添加にさらすため、または反応マ
トリックス12から検出可能な応答を読み取るため、所望
により装置10を用いたアッセイを行っている間にフィル
ター手段22の取り外し可能な部分22bの取り外しをアッ
セイ工程中に行うことができる。この場合、フィルター
手段22の膜部分は取り外し可能な部分22bの絶対に必要
な部分である。
本発明に従えば、本発明の分析装置および方法に有用
な物質には、多孔質の繊維状マトリックスが含まれる。
ここで「多孔質」とは、その中を流体が流れることがで
き容易に通過することができるような物質からマトリッ
クスができていることを意味する。本発明の物質におい
て多孔質の性質は、ガラス、セルロース、プラスチック
ナイロンまたは他の当業者によく知られた繊維状物質を
単に選択することによって得ることができる。
たとえば使用するのに特に好ましい物質は「ファット
マンGF/D」ガラス繊維濾紙であり、これは名目上の厚さ
が0.032インチである。そのような物質の厚さは重要な
ものではなく、主としてアッセイする試料（および分析
対象物）の性質、たとえば流動性や分析対象物の充分な
結合を可能にするために充分長い時間にわたって充分量
の試料を物質内に保持しておく必要性などに基づいた、
ありきたりの選択の問題であるだろう。
さらに繊維状物質は、平均直径が約0.1〜約10ミクロ
ンまたはそれ以上、最も好ましくは約0.1〜約５ミクロ
ンで該繊維状物質上に保持・固定化された実質的に球形
の多数の固体粒子を有しているのが好ましい。「保持・
固定化された」とは、粒子が一旦繊維状物質上に置かれ
たら繊維状物質内のどこかの位置（すなわち、他の繊
維）へ実質的に移動することができないか、または破壊
しない限り繊維状物質から完全に取り去るができないこ
とを意味する。粒子がそのように保持・固定化される機
構はわかっていないが、繊維と粒子との間、および／ま
たは粒子相互間の物理的な表面引力によるものであるか
もしれない。
粒子の選択は、「微細粒子」として一般に知られてい
る微細物質のいかなる適当なタイプからも当業者により
行うことができる。そのような粒子は、一般に、たとえ
ばポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリプロピ
レン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ
アクリロニトリル、ポリカーボネートまたは同様の物質
からできている。本発明に使用するのにいかなるタイプ
の微細粒子を選択したとしても、重要なことは、粒子を
つくっている物質が、試験試料中の分析対象物（たとえ
ば抗体または抗原、またはこれらの組合わせ）と反応す
ることのできる物質を粒子表面上に保持することができ
るか、またはそれ自身が粒子表面上に分析対象物を保持
することができることである。
さらに粒子の大きさも重要ではなく、粒子の平均直径
が実質的に前記範囲にある限り（粒子の平均直径は繊維
状マトリックスの平均孔径よりも小さいのが好ましい
が）、上記性質を有するいかなるタイプの粒子も使用に
適している。
本発明により提供される物質および分析装置は、他の
よく知られた広範囲にわたるアッセイ法および手順に有
利に用いることができ、本明細書中に詳細に記載した特
別のイムノアッセイ法に適用が限られるものではないこ
とを認識する必要がある。従って、本明細書の物質およ
び装置は、いわゆる「競合」結合アッセイや同様の結合
アッセイ手順に用いることができ、さらにグルコースや
尿酸などの分析対象物のための典型的な酵素アッセイの
ような他のアッセイにおいても用いることができる。こ
れらのアッセイはイムノアッセイではないが、アッセイ
に用いる試薬の少なくとも１種を本発明の装置の物質ま
たは反応マトリックス内の粒子上に最初に保持すること
によって有利に行うことができる。本発明が種々のタイ
プのアッセイ手順に広範囲かつ有利に適用可能なこと、
従って本明細書中に特別詳細に記載したアッセイおよび
手順に決して限定されるものではないことは、当業者に
は容易に理解できるであろう。
しかしながら、本発明の原理によって得られる物質お
よび分析装置は、酵素イムノアッセイ、とりわけいわゆ
る「サンドイッチ」および間接酵素イムノアッセイに特
に有利に用いることができる。本発明の物質および装置
を用いたそのようなアッセイは、比較的精巧で時間がか
かり高価な器具および物質を必要とする従来の典型的な
「ビーズ」または他のアッセイよりも実質的に簡単なや
り方で行うことができる。そのようなアッセイはまた、
驚くほど感度が高いこともわかった。
本発明の物質および装置を用いた現在のところ好まし
い「サンドイッチ」イムノアッセイ手順の例を一般的に
述べると以下のようになる。
（工程ａ） 抗体または抗原を物質内の粒子上に保持させて上記の
ごとき反応マトリックスを生成させる。
（工程ｂ） 決定しようとする抗原または抗体を含有する試験試料
をマトリックスに加える。
（工程ｃ） 工程ｂの抗原または抗体に酵素結合抗体または抗原を
加える。
（工程ｄ） 洗浄して未結合物質を除く。
（工程ｅ） 指示試薬を加える。指示試薬は、工程ｃの結合体の酵
素部分の存在下で検出可能な色または他の応答を反応マ
トリックス中に生成する。
本発明の装置を用いてそのような「サンドイッチ」ア
ッセイ手順をいかに有利に行い得るかについての一層詳
細な議論については、以下の実施例において述べる。
本発明に従えば、分析装置の多孔質物質または反応マ
トリックス上の反応表面または部位に検出可能な応答が
生じる。この応答は、分析下の試料中の分析対象物の存
在および／または量を示すことができるものである。そ
のような検出可能な応答は、本発明の好ましい態様にお
いては、すでに記載したような一連のアッセイ工程に続
く発色反応であってよいし、または分析技術の分野でよ
く知られ同様の目的に使用される何個の応答であっても
よい。
たとえば、当業者にはよく知られているように適当な
試薬をアッセイに使用することを条件として、生成する
応答は蛍光の１種であってよい。応答はまた、化学発
光、または、視覚によりまたは種々の知られた計器を用
いた器具により検出可能な種々の放射性エネルギー応答
（たとえば放射線放射）のいずれであってもよい。従っ
て、本発明の物質および装置の使用に際して多くの異な
るタイプの検出可能な応答が可能で望ましく、本発明が
これらによって限定されるものでないことが特に認識さ
れなければならない。
固相分析装置上には「オンボード手順」コントロール
領域が設置され、陽性コントロール（試験試料中に分析
対象物が存在してもしなくても有効なアッセイ結果を示
すことのできる検出可能な応答を生じるであろう）、陰
性コントロール（アッセイ結果が無効である場合にのみ
検出可能な応答変化を生じるであろう）、および単一の
分析装置反応部位中の試料分析対象物にそれぞれ対応す
る検出可能な応答を同時に表示する。
本発明に用いる典型的な装置は、すでに記載した１ま
たは２以上の層、クロマトグラフアッセイ装置のための
試験ストリップ（たとえば紙）または薄層クロマトグラ
フアッセイ装置のための試験ストリップ（たとえばニト
ロセルロース）（この場合、単一のストリップの別々の
ゾーン中に１種またはすべての試薬が含まれる）、また
はそれと連結した他の多孔質物質を有する。
同容量の試験試料およびアッセイ試薬を手順コントロ
ール領域および試験領域に同時に接触させて置くことに
より、技術の分野で一般に行なわれているような別のコ
ントロール試験の必要がなくなる。試料および試薬を反
応部位に適用する方法は、用いた特定の装置に適したい
かなる方法であってもよい。たとえばクロマトグラフア
ッセイ装置または試験ストリップとしての本発明の装置
において、試料および試薬をストリップに加えて手順コ
トロール領域および試験領域を含む反応部位へまた反応
部位を通って流れるようにすることができる。用いた特
定の装置のいかんにかかわらず、手順コントロール（陰
性コントロールおよび陽性コントロール）領域および分
析対象物結合領域を含む反応部位に試薬および試料を同
時に適用して接触させる。
本発明の手順コントロールおよび読み取り可能な結果
が、多数のまたは非常に多数の反応結果を同時に表示す
ることのできる反応部位を有するいかなる分析装置にも
同様に用いることができることは、当業者には明らかで
あろう。そのような他のタイプの反応表面としては、た
とえばコーティングまたは非コーティング繊維マトリッ
クス、フィルター、紙または膜、比較的平面的な固体表
面などが挙げられる。
つぎに第6A〜6C図および第7A〜7C図を参照しながら説
明すると、分析装置11の反応表面またはマトリックス12
上の反応部位にオンボード陰性コントロール領域30およ
び陽性コントロール領域32が設置されているのが好まし
い。装置11はクロマトグラフストリップである。陰性お
よび陽性コントロール領域は、定量的に機能して陰性ア
ッセイおよび陽性アッセイ標準コントロールとして機能
するか、または定性的に機能してアッセイを行うときに
使用した手順および試薬の有効性を示す手順コントロー
ルとして機能する。
本明細書に使用した「コントロール」なる語には、定
量的および定性的な態様の両方が含まれる。陰性コント
ロール領域30を形成するには、本明細書に記載したよう
な結合アッセイに際して装置11を普通に使用する間に、
該領域30が酵素標識または他の符号応答物質を保持する
物質を含まないようにすればよい。
陽性コントロール32を形成するには、試験試料中の分
析対象物の存在または不存在にかかわらず、酵素標識ま
たは他の符号応答物質に結合することのできる物質を該
領域32内に含ませればよい。すでに記載した特に好まし
い反応マトリックスに関連して用いるものとして、陽性
コントロール領域32を形成するには、該領域32内の微細
粒子を分析対象物、または結合アッセイを行う間に該領
域32内に酵素標識と結合または保持することのできる他
の物質をコーティングすればよい。
さらにマトリックス12上には１または２以上の分析対
象物結合領域34が設けられ、結合アッセイを行う間に試
験試料から分析対象物を該領域34上に結合または保持さ
せる。分幾積対象物結合領域34は、マトリックス12の該
領域34内の微細粒子を抗原または抗体のような分析対象
物と結合することのできる物質でコーティングすること
により、本明細書に記載した特に好ましい反応マトリッ
クス物質中に形成することができる。
陽性コントロール領域32および分析対象物結合領域34
は、結合アッセイを行うときに装置11の使用が容易にな
るようないかなる形態で設置されていてもよい。しかし
ながら、現在のところ陽性コントロール領域および分析
対象物結合領域は、相互作用的な形態にあるように設置
するのが好ましく、その際、試験結果が陽性であるとき
には陽性コントロール領域は分析対象物結合領域と相互
作用することにより使用者に意味の知られた表象符号を
生成し、試験結果が陰性であるときには陽性コントロー
ル領域は単独で機能することにより第一の表象符号とは
異なるが使用者に知られた意味の第二の表象符号を生成
する。
相互作用的な陽性コントロール領域および分析対象物
結合領域は、特に好ましい実施態様である第6A〜6C図に
最もよく示されている。図に示すように、陽性コントロ
ール領域32は方形棒すなわち「−」符号の形状で形成さ
れており、一方、分析対象物結合領域34は陽性コントロ
ール領域32の両反対側に陽性コントロール領域32に対し
直角方向に位置して方形棒の形状で形成されている。従
って、第6A〜6C図の装置を使用する場合には、装置11正
しく使って得られた陽性試験結果からは、第3C図および
第6C図に示すように陽性コントロール領域32および分析
対象物結合領域34の両方において「＋」符号の形状で検
出可能な応答が得られ、「＋」すなわち陽性の試験結果
を使用者に表示する。
これに対して装置11を正しく使って得られた陰性試験
の結果からは、第6B図に示すように陽性コントロール領
域32のみにおいて「−」符号の形状で検出可能な応答が
得られ、「−」すなわち陰性の試験結果を使用者に表示
する。結合アッセイが適切に行なわれなかったり用いた
試薬がアッセイ中に適切に働かなかったときには、第6A
図に示すように陽性コントロール領域32および分析対象
物結合領域34のいずれからも検出可能な応答が得られ
ず、試験の結果は無効であることを示す。さらに、非特
異的結合やアッセイ中に洗浄工程を適切に行わなかった
ことなどによって陰性コントロール領域30中に検出可能
な応答が生じたときも、試験結果が無効であることを示
している。
第6A〜6C図に示す態様は、試験結果の陽性（＋）また
は陰性（−）の性質に関して、またアッセイの有効性に
関して明確な符号形態で使用者に直ちに情報を提供する
ことができるという点で現在のところ特に好ましい態様
である。
手順コントロール領域および分析対象物結合領域はま
た、所望により他の形態で設置されてもよい。第7A〜7C
図に示した別の態様においては、図に示すように陽性コ
ントロール領域32および分析対象物結合領域34は点の形
状で形成される。従って、陽性の試験結果は、第7C図に
示すように２個の点状の検出可能な応答領域の存在によ
って、陰性の試験結果は、第7B図に示すように陽性コン
トロール領域32のみにおける検出可能な応答の存在によ
って、試験結果が無効であることは、第7A図に示すよう
に検出可能な応答の欠如によって、それぞれ示される。
陰性コントロール領域30、陽性コントロール領域32およ
び分析対象物結合領域34についての他の等価な形態、た
とえば他の符号や数字なども当業者には容易に想起され
るであろう。
つぎに実施例により本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれに限られるものではない。以下の実施
例は、本発明の物質およびそれを利用した装置の好まし
い製造および使用方法並びにそれらを用いたアッセイ手
順を記載するものである。製造した分析装置は、実質的
に第１図および第２図を参照して記載、表示した装置の
全体の形状および外観を有しており、以下の手順で調製
しアッセイに利用した。なお、特に断らない限り％はす
べて重量％で表した。
参考例１（抗体コーティング微細粒子の調製） カルボキシレート修飾微細粒子［固形分2.5％；平均
直径0.45ミクロン；ポリサイエンス・アンド・セラジェ
ン（Polyscience and Seragen）より市販］（100μ）
を、スルホン酸メチルエチル（MES）バッファー（1.0m
l、5mM、pH4.75）および抗体溶液（β−hCG）（75μ
、2mg/ml）に加えた。この溶液を撹拌し、ついで１−
エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミドHCl（EDAC）（100ml、水10ml当たり2mg）を加え
た。溶液を２〜８℃で一夜撹拌し、ついで微細粒子を遠
心分離により単離し、0.1％「ツイーン−20」溶液で２
回洗浄し、リン酸バッファー食塩水「PBS」（0.01M KH2
PO4;0.15M NaCl;pH7.2）中に再懸濁して0.125％溶液を
得た。PBS中に再懸濁した後、次の工程に引き続き用い
るために微細粒子を２〜８℃で貯蔵した。
参考例２（固相反応マトリックスの調製） 上記参考例１で得た抗体コーティング微細粒子（50μ
）をファットマンGF/Dガラスフィルターの中央に滴下
し、ついでブタ血清（100μ）を加え、フィルターお
よび微細粒子を加湿室中、室温にて30分インキュベート
した。この時間の後、微細粒子をすでに含んでいるフィ
ルターをPBSバッファー（300μ）中で３回洗浄した。
ついでフィルターを以下のイムノアッセイの参考例で使
用するときまで加湿室中で貯蔵した。走査電子顕微鏡で
観察したところ、微細粒子はフィルター物質のガラス繊
維上に不可逆的に捕捉されもしくは凝集されていること
が観察された。
抗体（または抗原）の微細粒子への付着は、上記参考
例に記載した方法に加えて、吸着や種々の化学活性化剤
の使用などの種々の方法により行うことができることも
認識されなければならない。また、微細粒子の繊維マト
リックスへの添加はたとえば動物血清を加えた後に行う
こともできること、およびそのような血清を使用するこ
とはさして重要なことではないことも認識されなければ
ならない。従って、微細粒子をマトリックスに加える順
序、およびマトリックスに組み込む前に処理するか後に
処理するかは重要ではない。さらに、本参考例で得に記
載したガラスフィルターマトリックス物質の代わりにポ
リスチレンコーティングガラスのようなコーティング繊
維状物質をも用いることができ、それによっても利点が
得られることも認識されるであろう。
参考例３（イムノアッセイプロトコール（β−hCGの決
定）） 上記の抗体コーティング微細粒子含有ガラス繊維物質
を実質的に円形の「ディスク」にカッティングし、この
ディスク（反応マトリックスを形成）をアッセイで使用
した溶液から過剰の流体を吸収するために吸取紙物質と
接触させて置いた。その後、ヒト尿の試験試料（５滴、
約280μ）（β−hCGレベルが０、50および100mIU/ml
のものを含む。下記第１表参照）を、各マトリックスの
上部に位置するプレフィルター中を通して各マトリック
スに加えた。
ついで抗体−酵素結合体（３滴、下記第１表参照）を
プレフィルターを通して各マトリックスに加え、各マト
リックスを室温で約20分間インキュベートした。ついで
プレフィルターを取り除き、界面活性剤洗浄溶液（1.0m
l）を各マトリックスに加えて過剰の抗体−酵素結合体
を除いた。ついで発色源指示薬（１滴、下記第１表参
照）を各マトリックスに加え、２分後に発色について各
マトリックスを視覚により調べた。β−hCGを含有する
試験試料について発色が観察され、発色と相関関係を有
する光の吸光度は、通常の分光光度計を用いて器械によ
り決定した。結果を第１表に示す。
上記抗体−酵素結合体の調製は、一般に下記文献に従
って行った。すなわち、HRPOについてはナカネ（Nakan
e,P.K.）およびカワオイ（Kawaoi,A.）のThe Journal o
f Histochemistry and Cytochemistry、22（12）1084〜
1091（1984）、アルカリホスファターゼについてはグル
タルジアルデヒド法にわずかに変更を加えたもの［ベー
リンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim GmbH）よ
り入手可］により調製した。
12人の妊娠していない女性および６人の妊娠の確認さ
れた女性からの尿試料を用い、上記HRPO−抗体酵素結合
体および実質的に上記に記載した手順を用いて試験し
た。妊娠していない女性から採取した12個の試料から
は、目に見える色が反応マトリックス中に生成されなか
った。すなわち、すべての吸光度は0.050（この閾値以
下では色を視覚化することは容易にできない）未満であ
った。６人の妊娠した女性から採取したすべての試料か
らは、試験により目に見える色を生じた。
参考例４（β−hCG手順コントロールの調製） β−hCGに対する抗体を表面に有する微細粒子（上記
のもの、固形分0.125％）（1.0ml）をβ−hCG溶液（14.
0μ、1.0mg/ml）と反応させた。この溶液を室温で３
時間撹拌し、ついで必要なときまで２〜８℃で貯蔵し
た。粒子をさらに洗浄する必要はなかった。
表面にβ−hCGが結合した上記手順コントロール微細
粒子（50ml）を種々の濃度に希釈し、抗体コーティング
微細粒子を加えた場合（上記）と同様にして上記ガラス
繊維フィルター物質に加えた。ついでHRPO−抗体酵素結
合体（２滴、約100μ）を加え、５分間インキュベー
トし、活面活性剤洗浄溶液（1.0ml）で洗浄し、ついでT
MB溶液（１滴、約50μ）を添加して発色させることに
より、各希釈液の活性を調べた。ついで通常の分光光度
計を用いて各コントロールの吸光度を測定した。結果を
第３表に示す。
1:32希釈における手順コントロールの吸光度が、100m
IU/mlβ−hCG標準の吸光度にほぼ等しいことがわかっ
た。
参考例５（細菌学的試験−異種細菌） 上記アッセイ装置を用い、Strep A抗原のアッセイ、
および下記第４表に示した種々の微生物の抗原について
のアッセイを行った。アッセイのプロトコールは概略次
のようであった。
（１）前以て調製した細菌スワブ試料（よく知られた方
法により調製）を溶液中に入れ、装置の反応マトリック
ス上のフィルター部分へピペットにて加えた。フィルタ
ー中に試料を通した。
（２）抗体−酵素結合体（２滴、約100μ）を加え、
フィルター中に通した。
（３）ついでフィルターを取り除き、マトリックスをPB
Sバッファー（10〜12滴、約500μ）で洗浄した。
（４）TMB（１滴、約50μ）を加え、室温で約２分間
インキュベートした後にマトリックス中の発色を読み取
った。
ついで下記第４表に示す微生物抗原を含有する試料に
ついて上記のようにしてアッセイを行った結果として、
通常の反射率装置を用いマトリックスから反射された65
0nm光の吸光度を測定した。結果を第４表に示す。
参考例６（固相評価；本発明による種々の反応マトリッ
クス物質の使用） 0mIU/mlおよび250mIU/mlの濃度のβ−hCGを含有する
尿試料について、種々の繊維マトリックス物質中に組み
込んだ微細粒子を用い参考例３に記載したと同様の手順
によりアッセイを行った。下記第５表に示した物質は異
なる孔径および流速のものであった。ファットマンGF/D
物質はまた、粒子を加える前に前処理した。HRPO結合体
を用いた。各アッセイにおいてアッセイの成功を示す発
色が視覚により観察され、吸光度の読み取りは650nmに
て行った。結果を第５表に示す。
上記データは、物質および反応マトリックスに種々の
繊維性未処理物質を用いることができることを示してい
る。そうした未処理物質は、所望により物質の性質（た
とえば流速）を幾分変えるために、タンパク質またはポ
リスチレン（親水性または疎水性）で前処理した後に用
いることができる。
参考例７（粒径の影響） サイズが0.19から約3.0ミクロン（平均直径）の範囲
の粒子を、マトリックス物質（ファットマンGF/D）の試
料に加えた。試料当たりの抗体の量を約3.0μｇに保持
し、アルカリホスファターゼ結合体を用い上記のように
して０および250mIU/mlの濃度のβ−hCGを含有する尿試
料についてアッセイを行った。吸光度の読み取りを650n
mにて行った。結果を第６表に示す。
上記の結果は、直径が0.19から約3.0ミクロンの範囲
のサイズの粒子が特に有効であり、従って好ましいこと
を示している。しかし、約0.1〜約５ミクロンの範囲の
粒子が使用するのに適している。ファットマンGF/Dフィ
ルター物質の孔径は約2.7ミクロンであるので、上記デ
ータはこの繊維性マトリックス物質の平均孔径よりもか
なり大きいかまたは小さい粒子も使用することができる
ことを示している。
参考例８（β−hCGの迅速アッセイ） 第１図および第２図に示したような分析装置を用い、
迅速さという点で利点を有し手順においても簡単なアッ
セイをβ−hCGについて行った。アッセイのプロトコー
ルは以下のようであった。
移入ピペットを用い、点滴用器から患者の尿試料（５
滴）を装置の反応マトリックスの上部にあるフィルター
の中央へ加えた。試料をマトリックス中に吸い込ませた
（約10秒間）。ついで抗体−酵素結合体（アルカリホス
ファターゼ）（３滴）を加え、反応マトリックスを室温
にて60秒インキュベートした。
ついでフィルターを取り除いて捨て、ツイーンおよび
トリトンバッファー溶液を加えたクエン酸/NaCl洗浄溶
液（約1ml）を加え、マトリックス中を流れさせた。
ついで発色源の酵素基質（ブロモ−クロロインドール
リン酸ニトロブルーテトラゾリウム（３滴）を加え、ま
る２分間マトリックス中で発色させた。その後、さらに
洗浄溶液（1.0ml）を加え、結果を視覚により読み取っ
た。視覚的に検出可能な陽性の符号（＋）の出現によ
り、試料がβ−hCGを上昇したレベル（約50mIU/mlより
も大きい）で含有していることが示された。同様に上記
手順を用いるがそのような上昇したレベルのβ−hCGを
含有しない試料を用いて行ったアッセイからは、マトリ
ックス中に陰性の符号（−）が生成した。
実質的に上記と同様のプロトコールに従って行っても
陽性（＋）符号も陰性（−）符号もともに出現しない試
験は、試薬の添加が不適当であるかまたは試薬が劣化し
ていることを示していた。
以下に本発明による分析装置の調製の一般的な例示を
挙げる。本発明の装置は、固相対する試料の非特異的な
反応性（干渉）を決定するための手順コントロール領域
をも含んでいる。
本発明の物質を利用した反応マトリックスは実質的に
上記方法によって調製することができ、粒子は全体の形
状が実質的に「十字」形のパターンで物質中に組み込ま
れる。「十字」の垂直軸は表面に分析体対象物結合物質
を有する粒子で形成することができ、一方、「十字」の
水平軸は酵素標識を結合することのできる物質（すなわ
ち、標識に「結合」することができるかまたは付着する
ことのできる抗体）で形成することができる。
従って、これらの反応マトリックスをたとえばβ−hC
Gのアッセイに用いる場合には、検出可能なレベルの分
析対象物が試料中に存在しないときは、マトリックスの
「手順コントロール領域」のみが検出可能な応答を生成
するであろう。すなわち、「十字」の水平軸（「−」符
号）が発色または他の応答を生成して陰性の結果を示す
であろう。しかしながら、検出可能なレベルの分析対象
物が試料中に存在するときは、分析対象物は標識ととも
に水平および垂直の両軸中の粒子に結合して両軸におい
て検出可能な応答（「＋」符号）を生成するであろう。
別法として、応答が生成されるマトリックスの領域は
「点」、円形、数字などの形態であってもよい。従っ
て、微細粒子は上記のように所望により種々のパターン
でマトリックスの物質中にスプレーするかまたは分配し
組み込むことができる。上記コントロールは本発明の現
在のところ好ましいマトリックス物質と関連するものと
して実施例に記載したが、オンボードコントロールは上
記のように他の固相分析装置と関連して同様に用いても
よい。
そのような手順コントロールを本発明の物質および装
置並びに他のタイプのマトリックス物質を用いた固相ア
ッセイ装置に用いることによる利点としては、（ａ）コ
ントロールにより各アッセイにおいて物質の確認手段が
得られること、（ｂ）特に「プラス」（「＋」）および
「マイナス」（「−」）のような特別のパターンを用い
たときには、コントロールにより各アッセイにおいて結
果の比較解釈が可能となること、および（ｃ）各アッセ
イ装置にコントロールを組み込むことにより、アッセイ
の都合のよい確認手段が得られ、使用者がアッセイ結果
について一層確信を持てるようになることが挙げられ
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、従来の分析装置の部分断面図の側面図、 第２図は、第１図の装置の平面図、 第3A図、第3B図および第3C図は、第１図の装置の特に好
ましい態様の平面図、 第4A図、第4B図および第4C図は、第１図の装置の他の態
様を示す平面図、 第５図は、第１図の装置において装置の本体からプレフ
ィルターを取り外したところの見取り図、 第6A図、第6B図および第6C図は、本発明のクロマトグラ
フ装置の特に好ましい態様を示す平面図、 第7A図、第7B図および第7C図は、本発明のクロマトグラ
フ装置の他の態様を示す平面図である。 （図面の主要符号の説明） 11……本発明の装置 12……反応マトリックス 30……陰性コントロール領域 32……陽性コントロール領域 34……分析対象物結合領域
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン・エム・クレメンズ アメリカ合衆国イリノイ 60031、ガー ニィ、キャリッジ・ドライブ 4989番 (56)参考文献 特開 昭62−228167（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/543

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】結合アッセイにおいて流体試料中の分析対
    象物の存在または量を決定するのに有用なクロマトグラ
    フ試験装置であって、反応部位、流体試料を接触させる
    ための部位および毛管現象により流体試料を反応部位に
    輸送するための手段を有する多孔質基材ならびに結果を
    検出するための標識手段を含む装置において、該反応部
    位に、試料中に分析対象物が存在すると否とにかかわら
    ず標識に結合できる結合試薬を固定化した陽性コントロ
    ール領域、分析対象物への結合試薬を固定化した分析対
    象物結合領域および陰性コントロール領域を設け、その
    際、該陽性コントロール領域と該分析対象物結合領域と
    は、標識の存在下において一緒になって、試料中に分析
    対象物が存在する場合に陽性の結果を示す第一の既知符
    号を形成するような形態にあり、該陽性コントロール
    は、標識の存在下において単独で、試料中に分析対象物
    が存在すると否とにかかわらず陰性の結果を示す第二の
    既知符号を形成するような形態にある、ことを特徴とす
    る装置。
  2. 【請求項２】試験が不適当に行なわれたときには該第一
    の符号も該第二の符号も形成されない請求項（１）記載
    の装置。
  3. 【請求項３】陽性コントロール領域が方形棒状の形態で
    あり、該第二の符号としてマイナスの符号を形成して陰
    性の結果を示す請求項（１）記載の装置。
  4. 【請求項４】分析対象物結合領域が２個の同一直線上に
    並んだ半棒状の形態であり、該２個の半棒は該陽性コン
    トロール棒の両側に位置し該陽性コントロール棒に対し
    て実質的に直行する位置にある請求項（３）記載の装
    置。
  5. 【請求項５】該２個の同一直線上に並んだ半棒が該陽性
    コントロール棒の中央付近を横切り、第一の符号として
    プラスの符号を形成して陽性の結果を示す請求項（４）
    記載の装置。
  6. 【請求項６】標識が、抗分析対象物抗体と検出可能な残
    基との結合体からなる請求項（１）記載の装置。
  7. 【請求項７】標識に対する固定化結合試薬が固定化抗体
    −分析対象物複合体からなり、その際、分析対象物は該
    結合体の結合する少なくとも１個の抗原決定基を有する
    ものである請求項（６）記載の装置。
  8. 【請求項８】装置中を輸送された試料流体が、陽性コン
    トロール領域、陰性コントロール領域および分析対象物
    結合領域に実質的に同時に結合する請求項（１）記載の
    装置。
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