JP2801564B2 - ポリヌクレオチド合成用ホスホルアミダイト - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】ハイブリドＤＮＡ技術が出現
しかつ広範な種類の天然生産物、例えばポリペプチド、
および核酸の両者を単離し、精製し、そして検定する可
能性が急激に増加し、アミノ酸および核酸のオリゴマー
を製造する迅速かつ効率よい方法の必要性が増加してい
る。核酸では、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）、アダプタ
ー、合成遺伝子および合成制御配列、ならびにプロー
ブ、プライマーなどとして使用するため配列を合成する
ことが必要とされる。これらの配列はクローニングでき
るので、初期の用途においてほんの少量の物質のみを必
要とするが、誤まりを含む配列は望ましくない産生物ま
たは結果を生ずる構造を形成しうるので、このような配
列を実質的に含有しないことが非常に重要である。 【０００２】ポリ（アミノ酸）またはポリペプチドにつ
いて、天然ポリペプチドをその生理学的性質の研究のた
めに、ポリペプチドの断片および天然の産生物の製造の
ために、合成できることに実質的に関心がもたれてお
り、ここでこのような断片はその生理学的性質について
研究することができ、問題の決定因子の部位に対して特
異的な抗体の産生のためのハプテン、薬物アゴニスト又
は拮抗物質等として使用できる。ヌクレオチド、アミノ
酸または他の天然モノマーのオリゴマーを製造するため
の多くの手順が開発された。これらの手順は多くの場
合、選択的に切離し可能な結合により第１モノマーを固
体の支持体へ取付けることに頼る。次いで各モノマー単
位を順次に付加（ａｄｄ）し、各付加はある数の化学反
応を含む。 【０００３】オリゴマーの合成の間各段階において、あ
る数の鎖が伸長されないというある程度の可能性が存在
する。したがって、オリゴメリゼーションの間、多数の
誤まりが導入されることがあり、ここで単一または複数
のモノマーが省略された配列が生成する。配列が完結し
かつ支持体が分離されたとき、所望の配列はそれに密接
に類似する配列で汚染されるであろう。次いでこれらの
誤まりは種々の態様で現われ、その態様はポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドのいずれが生産されているかに
よって異なる。ポリヌクレオチドでは、配列が種々の構
成でクローニングされかつ使用されるとき、誤まりが導
入されることがありこの場合選択されるクローンが誤ま
った配列を含む。造成物を配列する場合に前もってオリ
ゴマーを精製しないと、誤まりが保持されて望ましくな
い生成物、最適でない性能などに導く。ポリペプチドで
は、誤まった配列は意図する配列とは異なる生理学的活
性、注目の配列以外の配列に結合する抗体の形成を導く
ことがあり、そして変化する結合の応答の結果、誤まり
の結果を与える可能性がある。 【０００４】したがって、誤まった生成物または観察に
導くであろう、所望の配列に近似する配列の汚染が実質
的に存在しないことを保証する配列を調製できることの
重要性が増加してきた。製造の間失敗した（ｆａｉｌｕ
ｒｅ）配列を除去することによって、材料を損失しうる
引き続く精製、例えば、電気泳動を実施する必要性を排
除することができる。クローニングまたは研究用ポリペ
プチドを用いる初期の段階において非常に少量の合成さ
れる材料を取り扱うとき、材料の損失は重大な問題とな
ることがある。 【０００５】 【従来の技術】マチウシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）および
カルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、ジャーナル・オブ
・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．）（１９８１）１０３：３１８５−３
１９１は、オリゴヌクレオチドの製造におけるホスホル
クロリダイトの使用を記載している。ビーウケイジ（Ｂ
ｅａｕｃａｇｅ）およびカルーサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅ
ｒｓ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａ．Ｌｅ
ｔｔ．）（１９８１）２２：１８５９−１８６２および
米国特許第４，４１５，７３２号は、オリゴヌクレオチ
ドの製造におけるホスホルアミダイドの使用を記載して
いる。スミス（Ｓｍｉｔｈ）、ＡＢＬ（１９８３年１２
月）１５−２４は、自動化された固相オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの合成を記載している。また、その中に
引用されている参考文献を参照のこと。また、ワーナー
（Ｗａｒｎｅｒ）ら、ＤＮＡ（１９８４）３：４０１−
４１１参照その開示を引用によってここに加える。 【０００６】アデノシンのアミジン保護は、マクブライ
ド（ＭｃＢｒｉｄｅ）およびカルーサーズ（Ｃａｒｕｔ
ｈｅｒｓ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａ．
Ｌｅｔｔ．）（１９８３）２４：２４５およびフレーラ
ー（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ）およびマッテウシ（Ｍａｔｔｅ
ｕｃｃｉ）、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）（１９８３）１１：８０３
１に記載されている。他のブロッキング（ｂｌｏｃｋｉ
ｎｇ）基は後述する。 【０００７】 【発明の要約】ポリヌクレオチド（本明細書において、
単に「ポリマー」又は「オリゴマー」と言う場合があ
る）の製造を包含する新規な方法および組成物が提供さ
れ、ここで個々のヌクレオチド（本明細書において「モ
ノマー」という場合がある）は前もって決定した群の構
成員であり、そして順次に付加されて個々の構成員の前
もって決定した配列を形成する。成長する鎖が不溶性支
持体に結合している間に、オリゴメリゼーションが起こ
る。各段階の後に、失敗の配列（ｆａｉｌｕｒｅｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ）をキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）し、そ
して配列が完結するまで次のモノマーを付加（ａｄｄ）
する。 【０００８】個々のモノマー上の保護基、末端ブロッキ
ング基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）、キャッピン
グ基、および支持体への結合は選択可能な切離しを可能
とするように選択される。ブロッキング基は末端ブロッ
キングを欠く配列の酵素的分解を妨害しないように選択
されるか、あるいはキャッピングの除去時に選択的に除
去することができる。完結のとき、キャッピング基を除
去し、酵素的分解を妨害するブロッキング基を除去し、
そして末端ブロッキング基を欠く不完全配列を酵素的に
分解する。不完全配列の酵素的分解前に、オリゴマーは
支持体上に保持するかあるいは除去することができる。
次いで、誤まり（ｅｒｒｏｒ）を有する配列を実質的に
含まない完成された正しい配列を単離する。 【０００９】 【特定の実施態様の説明】本発明は、共通の官能基を有
するが側鎖が異なるモノマーのオリゴメリゼーションに
関する。モノマーは縮合型オリゴメリゼーションを行
い、ここで鎖は支持体へ結合している間伸長される。オ
リゴメリゼーションはモノマーを段階的に付加して少な
くとも約１０の構成員、通常少なくとも１２の構成員の
所望の配列を生成することを含み、そして構成員の数は
１００以上であることができる。種々の官能基が種々の
機能のために用いられ、それらは選択的に除去すること
ができる。官能基は側鎖の保護基、末端ブロッキング
基、キャッピング基および、オリゴマーを支持体へ結合
させて維持するための結合基を包含する。これらの官能
基はオリゴマーの製造の間および／または配列の完結後
に選択的に除去または切離されることができ、同時にオ
リゴメリゼーションの間および必要に応じて不完全配列
の酵素的分解の間に配列を支持体へ結合させて保持する
ように、これらの官能性は選択される。 【００１０】さらに、誤まりまたは不完全配列のエキソ
ヒドラーゼ分解を妨害しないか、あるいは酵素的加水分
解前に選択的除去することができる保護基を用いる。誤
まりまたは不完全の配列の分解の前または後の支持体か
らの完成された配列の切離しが実施され、そして支持体
からの分離および不完全配列の分解後、配列の調製に関
連する物質を実質的に含まない完成された配列を次いで
単離することができる。 【００１１】本発明の方法は、誤まりを含有するかある
いは不完全な配列を選択的に除去する。エキソヒドロラ
ーゼはブロッキングされない不完全配列を加水分解する
ことができるが、エキソヒドロラーゼの完全配列への作
用を阻止する末端ブロッキング官能基を用いることによ
って、上の選択的除去が達成される。この方法は、ま
た、順次的付加（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ａｄｄｉｔｉ
ｏｎ）において次の段階を行っておらず、かつキャッピ
ング前に、反応性の遊離末端官能基を保持する配列を停
止するキャッピング官能基の使用を必要とする。こうし
て、失敗の配列は失敗の時に停止、そして連続しない。 【００１２】ブロッキング基および結合基の選択的使用
を可能とする縮合オリゴメリゼーションを用いる本発明
は、多くの場合、核酸、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮ
Ａ、およびポリ（アミノ酸）に関するが、同一の手段を
多糖類、炭水化物およびアミノ単糖類の調製に有効であ
ろう。各ポリマーまたはオリゴマーは個々の縮合モノマ
ーの間の結合のために同一の官能基を用い、核酸のため
にはホスフェートエステルを用い、アミノ酸のためには
ペプチドまたはアミド結合を用い、糖類についてはヘミ
アセタールまたはヘミケタールのエーテル結合を用い
る。次の式は本発明において使用するモノマーの一般化
された表示である： 【００１３】 【化１】 式中、Ｍはオリゴマーの結合の形成に関与せずかつまた
ブロッキングまたは保護に関与しない分子の部分のすべ
てを含む、分子の中央の残基であり、例えば、グリシン
の場合において、それはメチレンであり、アデノシンの
場合において、それはリンに結合した基およびホスフェ
ートエステル結合の形成に関与するブロックされたオキ
シ基を除外した分子のすべてを含み、αはオリゴマーの
末端官能基と反応するために活性化可能な形態または活
性な形態の官能基であり、 【００１４】βはブロックされていないときαと反応す
る末端官能基であり、γはβのブロッキング基であり、
δは保護を必要とする官能基、通常アミノ、ヒドロキシ
またはメルカプトであり、そして存在することあるいは
存在しないことができ、εは保護であり、μはαのブロ
ッキング基であり、そしてａは保護しなくてはならない
官能基の数であり、一般に０〜２、より通常０〜１であ
る。化合物がプリンであるとき、本発明において用いる
プリンヌクレオチドは多くの場合次式を有する： 【００１５】 【化２】 式中、Ｍ¹ は、それぞれ、グアニンおよびアデニンにつ
いては２または６位置に環の外のアミノ基をもつアデニ
ンまたはグアニンの残基であり、ＺはＯ−ブロッキング
基であり、Ｂ¹ またはＧ¹ の一方は水素であり、そして
他方は保護基であることができ、あるいは２つは窒素に
二重結合した保護基を形成することができ、Ｗは１対の
電子または酸素であり、Ｙが二置換アミノ基であるとき
１対の電子であり、そしてＹがオキシであるとき、酸素
であり、Ｙはオキシまたは二置換アミノ基であり、ここ
で置換基は反応過程を妨害しない有機基であり、そして
二置換アミノ基はホスフェートエステルの形成のための
離脱基（ｌｅａｖｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）としてはたら
き、 【００１６】オキシは通常はアンモニウム塩であり、便
利には３〜１２個の炭素原子のトリアルキルアンモニウ
ム塩であり、Ｙが二置換アミノ基であるとき、それは式
−ＮＴ¹ Ｔ² をもち、式中Ｔ¹ およびＴ² は同一である
か異なり、そして有機であり、Ｄは選択的除去可能な有
機基であり、そしてＥは水素または保護基である。ヌク
レオチドがピリミジンであるとき、ピリミジンは次式を
有するであろう： 【００１７】 【化３】 式中、記号のすべては前に定義した通りであるが、ただ
しＭ² はシトシンまたはチミンの残基であり、Ｍ² がシ
トシン残基であるとき、ｂは１であり、Ｍ² がチミン残
基であるとき、ｂは０であり、Ｂ² は水素であり、そし
てＧ² は保護基、通常アシルである。 【００１８】Ｄのために用いる基は脂肪族基、とくに飽
和脂肪族基；β−ヘテロ置換脂肪族基（ここで、β−置
換基はβ−排除において、離脱基またはプロトン活性化
基として、容易に関与することができる電子吸引基であ
る）；α−置換メチレン（ここでα−置換基は広く変化
することができ、そして誘導作用または共鳴作用を介し
てメチレン上に陰性電荷を支持する）；アリール；およ
びアラルキルであろう。リンの官能性の性質に依存し
て、１つの基を他の基の代わりに選択することができ
る。こうして、ホスホルクロリダイト、ホスホルアミダ
イド、ホスフェート、チオホスフェート、ホスファイト
などを用いるかどうかに依存して、特定のホスホロエス
テル基が好ましいであろう。 【００１９】ホスホルクロリダイトおよびホスホルアミ
ダイトについて、アルキルおよびβ−置換ジメチレンが
好ましく、一方ホスフェートおよびホスフィンについ
て、アリールおよびアラルキルの官能性が好ましいであ
ろう。 【００２０】多くの場合、Ｄは次式により示すことがで
きる： Ｑ（ＣＨ₂ ）_c −Ｃ¹ （Ｊ₂ ）− 式中、１は第１炭素原子であり、Ｊは同一であるかある
いは異なり、Ｈまたは１〜３個、通常１〜２個の炭素原
子のアルキル基、好ましくはメチルであり、ｃは０また
は１であり、通常、Ｑが炭素原子を介して結合している
とき、０または１であり、そしてＱが異種原子を介して
結合しているとき１であり、 【００２１】ＱはＨ、１〜９個の炭素原子のアルキル、
ニトラト、メチルスルホニル、シアノ、フェニル、ベン
ジル、フェニル−、ベンジル−、置換フェニル−、置換
ベンジルチオまたは−スルホキシ（ここでアリール置換
基の数は０〜２であり、そしてシアノ、ハロ、ニトロな
ど、トリハロメチル、とくにフルオロおよびクロロによ
り例示される）、β−ナフチル、９−フルオレニル、２
−アントラキノリルなどあることができ、あるいはＤは
フェニルまたは置換フェニルであることができ、ここで
置換基は上に示したものと同一であることができ、さら
にフェニルへ直接にあるいは酸素または炭素を介して結
合したトリチルを含むことができる。 【００２２】Ｄとして使用に報告されている特定の基
は、次の通りである：アルキル ビーウケイジ（Ｂｅａ
ｕｃａｇｅ）およびカルスサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ．）（１９８１）２２：１８５９；ＮＣ
ＣＨ₂ Ｃ（Ｍｅ）_0-2 （Ｈ_2-0 ）− コスター（Ｋｏｓ
ｔｅｒ）、ニュクレイック・アシズリサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）（１９８４）１２：４
５３９；マルッグ（Ｍａｒｕｇｇ）ら、Ｒｅｃ．ｔｒａ
ｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙ−Ｂａｙｓ（１９８４）１０３：
９７−８；バン・ブーム（ＶａｎＢｏｏｍ）ら、ニュー
クレイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．）（１９８４）１２：８６３９； 【００２３】ｐ−Ｏ₂ ＮＯＣＨ₂ ＣＨ₂ − シュワルツ
（Ｓｃｈｗａｒｚ）およびプフレイデレル（Ｐｆｌｅｉ
ｄｅｒｅｒ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）（１９８４）２５：５５１
３；ＭｅＳＯ₂ ＣＨ₂ ＣＨ₂ − クラエセン（Ｃｌａｅ
ｓｅｎ）ら、ｉｂｉｄ（１９８４）２５：１３０７；
（ハロ）₃ ＣＣ（Ｍｅ）_0-2 （Ｈ）_0-2 − タカク（Ｔ
ａｋａｋｎ）ら、ケミストリー・レターズ（Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）１９８４：１２６７；レト
シンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら、テトラヘドロン
（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）（１９８４）４０：１３
７； 【００２４】Ｏ（ＣＨ₂ ）_0-1 Ｓ（Ｏ）_0-2 （ＣＨ₂ ）
₂ バルゴビン（Ｂａｌｇｏｂｉｎ）ら、テトラヘドロ
ン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）
（１９８１）２２：１９１５；アガルワル（Ａｇａｒｗ
ａｌ）ら、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイアティ
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）（１９７６）９８：
１０６５；フェルダー（Ｆｅｌｄｅｒ）ら、テトラヘド
ロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．）（１９８４）２５：３９６７； 【００２５】（Ｘ）_0-2 ＯＣＨ₂ −，２−ナフチル−Ｃ
Ｈ₂ −９−フルオレニル−ＣＨ₂ −アンスラキノニル
カルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）ら、核酸の研究（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）Ｓｙｍ．Ｓｅ
ｒ．（１９８０）７：２１５；クリストドンロン（Ｃｈ
ｒｉｓｔｏｄｏｎｌｏｎ）およびリーズ（Ｒｅｅｓ
ｅ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ．）（１９８３）２４：１９５１；クウ
ィアトコウスキー（Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ）ら、アス
トラクツ、コンフェレンス・オン・シンセチック・オリ
ゴヌクレオチド・イン・モレキュラー・バイオロジー
（Ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｃｏｎｆ．ｏｎ Ｓｙｎ．Ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ウップサラ（Ｕｐｐｓａｌ）、
スウェーデン・コンフェレンス（Ｓｗｅｄｅｎ Ｃｏｎ
ｆ．）１６−２０（１９８２）＃６４；バルゴビン（Ｂ
ａｌｇｏｂｉｎ）、ｉｂｉｄ； 【００２６】（Ｘ）ＯＣＨ₂ ＣＨ₂ − ウルマン（Ｕｈ
ｌｍａｎｎ）ら、テトラヘドロン・レターズ（１９８
０）２１：１１８１；シュルツ（Ｓｃｈｕｌｚ）および
プフレイデレル（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ）、ｉｂｉｄ
（１９８３）２４：３５８２；ベイテ（Ｂｅｉｔｅ）お
よびプフレイデレル（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ）、ｉｂｉ
ｄ（１９８４）２５：１９７５；ＭｅＣＯＣＨ（Ｍｅ）
− バミレズ（Ｂａｍｉｒｅｚ）ら、テトラヘドロン
（１９８３）３９：２１５７；Ｏ₃ ＣＯ（Ｃｌ）− バ
ッセウル（Ｖａｓｓｅｕｒ）ら、テトラヘドロン・レタ
ーズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）（１９８
３）２４：２５７３。 【００２７】Ｘは水素あるいは中性または極性の電子供
与性または電子吸引性の、一般に１〜１０個、通常１〜
６個、一般に０〜７個の炭素原子の非妨害性の安定な置
換基であることができ、そして脂肪族、脂環族、芳香族
または複素環族の基、一般に脂肪族性飽和のハロ炭化水
素、例えば、トリフルオロメチル、ハロ、チオエーテ
ル、オキシエーテル、エステル、アミド、ニトロ、シア
ノ、スルホン、アミノ、アゾなどであることができる。
種々のＸ^x （ここでｘは数である）の各々について、そ
れらはＸの定義の範囲内に入るが、当業者はこの発明の
開示に照して適当な基を選択することができるであろ
う。ある場合において、好ましいＸは示されるか、ある
いはＸ^x は再定義することができる。 【００２８】Ｄとして用いる基は、末端ブロッキング基
を除去しないかあるいは、適当ならば、オリゴマーを支
持体から切り離す試薬、例えば、フェニル−メルカプチ
ドまたは置換フェニル−メルカプチドおよびｔｅｒｔ−
アミン、アンモニア、アルドキシド、モノアミンまたは
ポリアミンを包含する有機アミン溶媒により除去できる
であろう。Ｚのために用いる基は、アラルキル基、とく
に置換および非置換のピクシルまたはトリアリールメチ
ルであり、ここでアリールはフェニル、ナフチル、フラ
ニル、ビフェニルなどであることができ、そして置換基
は０〜３、通常０〜２であり、そしてＸの定義の範囲内
に入るであろう。 【００２９】Ｚとして用いる基は保護基およびキャッピ
ング基の除去に用いられる試薬に対して安定であり、主
として塩基に対して安定であり、そして酸に対して感受
性である。こうして、ベンジル、とくにα−置換された
もの、例えば、トリチル基は末端ブロッキング基として
使用される。ある場合において、オリゴマーの合成の完
結後、Ｚを異なる基で置換することが望ましいであろ
う。ブロッキング基（とくにトリチル基を用いる場合）
および不完全オリゴマーを分解するために用いる酵素の
性質に依存して、加水分解条件は有意な比率でＺ基を除
去することがある。これらの条件下では、完全オリゴマ
ーもまた分解してオリゴマーの収率を実質的に減少させ
るであろう。 【００３０】エキソヌクレアーゼによる完全オリゴマー
の分解を避けるために、Ｚ基はエキソヌクレオリティッ
ク（ｅｘｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）条件の条件下で安定
である異なるブロッキング基で置換することができる。
このような基はキャッピング基の除去の間保持されるこ
と、エキソヌクレオリティック条件の間保持されるこ
と、およびそれ自体であるいは支持体からの切離と関連
して、オリゴマーを分解せずに除去されうることによっ
て特徴づけられるであろう。 【００３１】ブロッキング基を除去しかつ別の基で置換
するかわりに、代わりのブロッキング基、例えば、カル
ボン酸エステル、ホスフェートなどに依存して、究極の
ヌクレオチドは代わりの保護基を存在させて調製するこ
とができる。こうして、置換ブロッキング基を含有する
ヌクレオチドを予備調製することにより、これらを最後
の工程において付加することができ、ここで手動手順ま
たは自動化手順は異なるヌクレオチドの使用を可能とす
る。 【００３２】多くの場合、Ｚの代わりに使用する基は安
定なエステルを与えるアシル基であろう。アシル基は有
機または無機であることができ、例えば、カルボキシ
ル、ホスホリル、ピロホスホリルなどある。とくに興味
あるものは、アルカン酸、とくにアリール置換アルカン
酸であり、ここでこの酸は少なくとも４個の炭素原子で
あり、そして約１２個以下、通常約１０個以下の炭素原
子をもち、通常８〜１２個の炭素原子をもつアリール、
通常フェニル置換アルカン酸である。種々の異種原子、
例えば、酸素（オキシ）、ハロゲン、窒素、例えば、シ
アノなどが存在することができる。大部分について、カ
ルボン酸エステルは塩基安定性であるが、とくに約５０
℃以下、さらにとくに約３５℃以下の温度において、お
よび約２より大きく、とくに約４より大きいpHにおいて
適度な酸に対して安定である。 【００３３】ある場合において、所望の保護を与える特
殊な試薬を用いることができる。例えば、Ｏ−ジブロモ
メチルベンゾエートを用いてエステルを形成し、次いで
これを後述するように特定の試薬で切離すことができ
る。次の表は、ある数の使用できる基およびブロッキン
グ剤として使用する基およびこれらの基を除去する条件
および試薬を記載する参考文献を示す。 【００３４】 【表１】【００３５】 【表２】【００３６】 【表３】【００３７】ベンゾエート基は酵素α−キモトリプシン
で容易に除去することができる。ホスフェートはアルカ
リ性ホスファターゼで除去できる。使用できる他の酵素
は、カルボキシペタチダーゼＡ、ロイシンアミノペプチ
ダーゼ、酸性ホスファターゼ、ピロホスファターゼなど
を包含する。あるいは、酵素の加水分解を用いる代わり
に、カルボキシレートエステル基は水酸化アンモニウ
ム、水酸化ナトリウム、モルホリンなどで除去すること
ができる。 【００３８】とくに興味あるものは、ヌクレオシドのヒ
ドロキシル、例えば、完成した配列の末端５′−ヒドロ
キシルをホスホリル化するために使用できる特定のホス
ホリル化剤である。新規なＯ，Ｏ′−ジ（シアノエチ
ル）ホスホルアミダイドの使用は本発明においてとくに
有利であり、ここで窒素は置換されている（１〜２個の
基）かあるいは置換されていないことができ、とくに二
置換されており、さらにとくに、ジアルキル置換されて
おり、アルキル基は１〜６個、通常２〜４個、とくに３
個の炭素原子をもち、例えば、イソプロピルである。
（下の−ＮＴ¹ Ｔ²の説明を参照。） 【００３９】この試薬は、酸化可能なホスファイトエス
テルを与える置換ブロッキング基（Ｚ^s ）、およびモノ
マーとして使用するヌクレオシジルホスホルアミダイド
と同じ方法で除去されるＯ−置換基として使用できる。
主題の試薬はオリゴマーの末端ヒドロキシルの容易な官
能化を可能とし、完成された鎖の保護を提供し、そして
自動化された核酸の配列の合成に容易に適合する。Ｙに
用いる基はオリゴメリゼーションに使用するリン誘導体
の性質に依存する。ホスホルアミダイドを用いるとき、
Ｙは式−ＮＴ¹ Ｔ² を有し、式中Ｔ¹ およびＴ² は同一
であるかあるいは異なることができ、そして炭化水素で
あることができ、あるいは０〜５個、通常０〜４個の異
種原子、主としてオキシとして酸素原子、チオとしてイ
オウ、またはアミノ、とくにｔｅｒｔ−アミノ、ＮＯ₂
またはシアノとして窒素を有することができる。２つの
Ｔは一緒になって合計１〜３、通常１〜２のヘテロ環構
成員および１〜３の環を有するモノ−またはポリ複素環
式環を形成することができる。 【００４０】通常、２つのＴは合計２〜２０、より通常
２〜１６個の炭素原子を有し、ここでＴは脂肪族（脂環
族を含む）、とくに飽和脂肪族の１価の基、あるいは、
一緒になったとき、２価の基であることができ、置換ま
たは非置換の複素環式環を形成する。アミンは、広範な
種類の飽和第二アミン、例えば、ジメチルアミン、ジエ
チルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、
メチルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチル
シクロプロピルアミン、エチルシクロヘキシルアミン、
メチルベンジルアミン、メチルシクロヘキシルメチルア
ミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルホリン、チオ
モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、２，６−ジメチ
ルピペリジン、ピペラジンおよび同様に飽和された単環
式窒素複素環族を包含する（米国特許第４，４１５，７
３２号）。−ＮＴ¹ Ｔ² として使用するために報告され
ている特定の基は、次の通りである： 【００４１】 【表４】 【００４２】基の例は、次の通りである：Ｎ−ピロリジ
ノ、Ｎ−ピペリジノ、１−メチル−Ｎ−ピペラジノ、Ｎ
−ヘキサヒドロアジピノ、Ｎ−オクタヒドロアゾニノ、
Ｎ−アザシクロトリデカノ、Ｎ−３−アザビシクロ
（３．２．２）ノナノ、チオモルホリノ、Ｎ，Ｎ−ジエ
チルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジイソ
プロピルアミノ、ピペリジノ、２，２，６，６−テトラ
メチル−Ｎ−ピペリジノ。 【００４３】Ｙは、また、ハロ、例えば、クロロである
ことができ〔レトシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）およ
びルンスフォード（Ｌｕｎｓｆｏｒｄ）、ジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）（１９７６）９８：３６５
５；マテウシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびカルサーズ
（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、ｓｕｐｒａ〕あるいはアンモ
ニウムオキシ塩、とくに３〜１２個の炭素原子のトリア
ルキルアンモニウムであることができる。ＲＮＡまたは
混合ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴマーを調製するとき、とくに
トリエステル法を用いる場合、Ｅとして使用する基は次
の通りである： 【００４４】 【表５】【００４５】使用できる他の基は、三置換シリル、例え
ば、３〜１２個の炭素原子のトリアルキルシリル、２−
テトラヒドロフラニル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリ
ル、あるいは塩基性条件および縮合条件に対して安定な
他の保護基を包含する。環外（ｅｘｃｙｃｌｉｃ）アミ
ン保護基は、縮合条件に対して安定でありかつ、末端ブ
ロッキング基を除去しないであるいは、適当ならば、支
持体への結合基を切離さないで、配列の完結時に除去さ
れうるようにあるいは、誤まりの配列の分解を妨害しな
いように選択されるであろう。ＢおよびＧは同一である
かあるいは異なることができ、そして一緒になって２価
の基を形成できる。 【００４６】Ｂが水素であるとき、Ｇは通常２〜１６
個、通常２〜１４個の炭素原子および０〜６個（オキソ
酸素を除外する）、通常０〜４個のカルコゲン（酸素お
よびイオウ）または窒素である異種原子のアシルであり
（ここで窒素は通常水素以外に結合している）そして脂
肪族、脂環族、芳香族、複素環族、またはそれらの組み
合わせであることができ、そして置換または非置換であ
ることができ、通常脂肪族不飽和を含まず、ここで置換
基は１〜６個の炭素原子のアルキルまたはアルコキシ、
ハロ、ニトロ、フェニル、２〜６個の炭素原子のジアル
キルアミノ、オキソなどを包含し、そしてギ酸および炭
酸の誘導体を包含する。 【００４７】多くの場合、ＢがＨであるとき、Ｇは次式
をもつであろう： （Ｘ² ）_c −Δ−ＣＯ 式中、Δは１〜１０個、通常１〜６個の炭素原子の、通
常飽和された脂肪族または脂環族の基、またはアリール
基（カルコゲンまたは窒素である異種原子の１〜２個を
有する複素環族を包含し、そして環は５〜６の環構成
員、１〜２の環および５〜１２個の炭素原子を有す
る）、またはアラルキル基（ここでアリールは上に定義
した通りであり、そしてアルキルは１〜３個の炭素原子
をもつ）であり、ｃはΔが脂肪族であるとき０であり、
そしてΔがアリールまたはアラルキルであるとき０〜
３、通常０〜２であり、 【００４８】Ｘ² は１〜６個、通常１〜４個の炭素原子
のアルキルまたはアルコキシ、ハロ、とくにクロロ、フ
ェニル、ニトロ、シアノなどある。ＢおよびＧが一緒に
なって２価の基を形成するとき、２価の基は３〜１２個
の炭素原子およびジオイルのオキソ原子以外の０〜４個
の異種原子のアルキリデンまたはジオイルであり、そし
て脂肪族、脂環族、芳香族または複素環族、あるいはそ
れらの組み合わせてあることができ、アルキリデンはイ
ミンまたはアミジンを形成し、ジオイルは環式イミドを
形成し、ここでアルキリデンは通常１〜３個の炭素原子
のアルキリデンであり、二置換アミノ、とくに２〜１０
個の炭素原子のジアルキルアミノ基でα−置換されてお
り、一方ジオイルは４〜１２個の炭素原子をもつであろ
う。 【００４９】ＢおよびＧとして使用するために報告され
た特定の基は、次の通りである： 【表６】【００５０】 【表７】【００５１】上の成分の中にはある種の好ましい基が存
在する。末端ブロッキング基について、トリアリールメ
チル基、とくにジメトキシトリチルは合成の間のモノマ
ーのために好ましい。環外アミノ保護基について、アル
キリデン、とくにジブチルアミノメチレンは好ましい。
次に重要な官能性はオリゴマーの支持体への結合であ
る。この結合はオリゴメリゼーションの種々の段階、キ
ャッピング基および保護基、および通常ブロッキング基
の除去、および、適当ならば、誤まりの配列の加水分解
的分解の間に安定であるべきである。完成されたオリゴ
マーを解放するための官能性を包含する結合単位の選択
は、支持体、ブロッキング基およびリンの基のモノマー
および性質、キャッピング基およびオリゴメリゼーショ
ンのために用いる試薬により影響を受けるであろう。 【００５２】広範な種類の支持体を用いることができ、
それらの例は次の通りである：シリカ、ポラシル（Ｐｏ
ｒａｓｉｌ）Ｃ、ポリスチレン、調節された孔のガラス
（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（Ｃ
ＰＧ）、ケイ藻土、ポリ（ジメチルアクリルアミド）、
ポリ（アクリルモルホリド）、ポリ（テトラフルオロエ
チレン）上にグラフトしたポリスチレン、セルロース、
セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０、フラ
クトシル（Ｆｒａｃｔｏｓｉｌ）５００など。 【００５３】興味ある参考文献は、次の通りである：マ
テウシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびカルーサーズ（Ｃ
ａｒｕｔｈｅｒｓ）、ｓｕｐｒａ：チオウ（Ｃｈｏｗ）
ら、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）（１９８１）９：２８０７；
フェルダー（Ｆｅｌｄｅｒ）ら、テトラヘドロン・レタ
ーズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）（１９８
４）２５：３９６７；ゴー（Ｇｏｕｇｈ）ら、ｉｂｉｄ
（１９８１）２２：４１７７；ガイト（Ｇａｉｔ）ら、
ニュークレイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．）（１９８２）１０：６２４３；
ベラガジェ（Ｂｅｌａｇｊｅ）およびブラッシ（Ｂｒｕ
ｓｈ）、前記（１９８２）１０：６２９５；ガイト（Ｇ
ａｉｔ）およびシェパード（Ｓｈｅｐｐａｒｄ）、前掲
（１９７７）４：４３９１；ミヨシ（Ｍｉｙｏｓｈｉ）
およびイタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）、テトラヘドロン・
レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）（１
９７８）３８：３６３５； 【００５４】ポタポフ（Ｐｏｔａｐｏｖ）ら、ヌクレイ
ック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）（１９７９）６：２０４１；シュイザー
（Ｓｃｈｗｙｚｅｒ）ら、ヘルベチカ・ヒミカ・アクタ
（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）（１９８４）５７：
１３１６；チョレット（Ｃｈｏｌｌｅｔ）ら、前掲（１
９８４）６７：１３５６；イトー（Ｉｔｏ）ら、ヌクレ
イック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．）（１９８２）１０：１７５５；エフィモ
フ（Ｅｆｉｍｏｖ）ら、前掲（１９８３）１１：８３６
９；クレア（Ｃｒｅａ）およびホーン（Ｈｏｒｎ）、前
掲（１９８０）８：２３３１；ホーン（Ｈｏｒｎ）ら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍ．Ｓｅ
ｒ．（１９８０）７：２２５；トラゲイン（Ｔｒａｇｌ
ｉｎ）ら、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）（１９８３）２４：１６９１；
コスター（Ｋｏｓｔｅｒ）ら、テトラヘドロン（Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ）（１９８４）４０：１０３； 【００５５】ゴー（Ｇｏｕｇｈ）ら、テトラヘドロン・
レターズ（１９８３）２４：５３２１；コスター（Ｋｏ
ｓｔｅｒ）ら、前掲（１９７２）１６：１５２７；コス
ター（Ｋｏｓｔｅｒ）およびヘインス（Ｈｅｙｎｓ）、
前掲（１９７２）１６：１５３１；デンベク（Ｄｅｍｂ
ｅｋ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・
ソサイアティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）（１９
８１）１０３：７０６；カルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ）ら、ゼネティック・エンジニアリング：プリンシプ
ルス・アンド・メソズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ）、セトロウ（Ｓｅｔｌｏｗ）およびホレンダー
（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ）編、Ｖｏｌ．４，１９８２，
１−１２ページ、プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐ
ｒｅｓｓ）ニューヨーク。 【００５６】支持体の性質に依存して、異なる官能基が
アンカー（ａｎｃｌｒｏｒ）としてはたらくであろう。
ケイ素含有支持体、例えば、シリカおよびガラスについ
て、置換アルキルおよびアリールシリル化合物を用いて
シロキサンまたはシロキシイミンの結合を形成する。有
機ポリマーでは、エーテル、エステル、アミド、サルフ
ァイド、スルホン、ホスフェートを使用できる。アリー
ル基、例えば、ポリスチレンについて、ハロメチル化を
官能化に使用することができ、ここでハロ基を次いでオ
キシ、チオ（これは酸化してスルホンにすることができ
る）、アミノ、ホスホ（ホスフィン、ホスファイトまた
はホスフェートとして）、シリルなどで置換することが
できる。 【００５７】ケイ藻土、例えば、多孔質ケイ藻土では、
ケイ藻土をポリアクリル酸誘導体により活性化し、そし
て活性化された官能性をアミノ基と反応させてアミン結
合を形成できる。多糖類を無機エステル、例えば、ホス
フェートで官能化することができ、ここで他の酸素は鎖
を結合するはたらきをする。ポリアクリル酸誘導体で
は、カルボキシルおよび側鎖の官能性、例えば、Ｎ−ヒ
ドロキシエチルアクリルアミドは普通の方法で使用して
結合基を接合することができる。結合の基および鎖は、
第１ヌクレオチドを結合する長さ、官能性および方法に
関して広く変化するであろう。鎖を延長するため、官能
性はシリル基、エーテル基、アミノ基、アミド官能性な
どを含むことができ、ここで試薬、例えば、ジアミンお
よび二塩基酸、アミノ酸、単糖、シランなどを用いる。
文献に報告されてきているある数の支持体および結合基
を、下表に示す。 【００５８】 【表８】【００５９】 【表９】【００６０】ポリヌクレオチドを製造する種々の技術が
文献に記載されている。例えば、ホスホルアミダイドの
その場の製造、ベアウケイジ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）、テ
トラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔ．）（１９８４）２５：３７５；ホスフェートト
リエステルの紙のディスク法、フランク（Ｆｒａｎｋ）
ら、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（１９８３）１
１：４３６５およびメイセス（Ｍａｔｈｅｓ）ら、ＥＭ
ＢＯ（１９８４）８００；ホスフェートトリエステル−
１−ヒドロキシベントリアゾール法、ファン・デル・マ
レル（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａｒｅｌ）ら、ヌクレイック
・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．）（１９８２）７：２３３７；前掲（１９８４）
１２：８６３９；ホスフェートトリエステル−アリール
スルホニルテトラゾール結合法、スタウンスキ（Ｓｔａ
ｗｉｎｓｋｉ）ら、前掲（１９７７）５：３５３；ポス
フェートトリエステルバリウム塩法、 【００６１】ゴー（Ｇｏｕｇｈ）ら、前掲（１９７９）
７：１９５５；ホスフェートトリエステル濾過法、チャ
ウトフリ（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ）ら、テトラヘドロン・
レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）（１
９８４）２５：４０３７；逆ホスフィチル化、ジャラマ
ン（Ｊａｙａｒａｍａｎ）およびマククラウハーティ
（ＭｃＣｌａｕｇｈｅｒｔｙ）、バイオテクニークス
（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９８４，９４；逆
方向ホスフェートトリエステル（５′−３′）法、ベラ
ガジェ（Ｂｅｌａｇａｊｅ）およびブラチ（Ｂｒｕｓ
ｈ）、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）（１９８２）１０：６２９
５；ホスホルアミダイド法、ベアウケイジ（Ｂｅａｕｃ
ａｇｅ）およびカルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、テ
トラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔ．）（１９８１）２２：１８５９；ホスホクロリ
ダイト法、マテウシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびカル
サーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、 【００６２】ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル
・ソサイアティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）（１
９８１）１０３：３１８５；ホスファイト“シリンジ”
法、タナカ（Ｔａｎａｋａ）およびレトシンガー（Ｌｅ
ｔｓｉｎｇｅｒ）、ヌクレイック・アシズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）（１９８
２）１０：３２４９；メチルホスロジテトラゾリド（Ｍ
ＰＤＴ）−ホスファイト法、カオ（Ｃａｏ）ら、テトラ
ヘドロン・レターズ（１９８３）２４：１０１９；シア
ノエチルホスホルアミダイド、シンハ（Ｓｉｎｈａ）
ら、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）（１９８４）１２：４５３
９；およびニトロフェネチルホスホルアミダイド、ベイ
ツェル（Ｂｅｉｔｚｅｒ）およびプフレィデレル（Ｐｆ
ｌｅｉｄｅｒｅｒ）、テトラヘドロン・レターズ（１９
８４）２５：１９７５。 【００６３】残りの試薬はキャッピング剤であり、これ
は遊離ヒドロキシル基を有する失敗の配列をキャッピン
グするはたらきをする。大部分について、キャッピング
基は、カルボン酸アシル基であり、とくに２〜８個、通
常２〜６個の炭素原子および０〜２個のヘテロ置換基を
有するアシル基であり、ヘテロ置換基は酸素、イオウお
よび窒素、とくにオキシまたはオキソとして酸素、チオ
エーテルまたはスルホンとしてイオウ、およびアミノ窒
素として窒素を含み、それに共有結合した水素原子を含
有しない。 【００６４】キャッピング基の例は、アセチル、レブリ
ニル、アリールチオウタニル、とくにフェニル、および
ジメトキシトリアゾリルホスフィンである。キャッピン
グ試薬およびその使用法は、前に引用した参考文献、マ
テウシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびカルサーズ（Ｃａ
ｒｕｔｈｅｒｓ）、およびチョウ（Ｃｈｏｗ）ら、なら
びにアガルワル（Ａｇａｒｗａｌ）およびコラナ（Ｋｈ
ｏｒａｎａ）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカ
ルソサイアティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉ．）
（１９７２）９４：３５７８に記載されており、これら
の参考文献を引用によってここに加える。 【００６５】種々の組み合わせが好ましいであろう。例
えば、３′−５′方向の核酸の調製において、好ましい
末端ブロッキング基は通常トリチル基であり、ここでア
リール基ならびに置換基を変更することができ、ジメト
キシトリチルは好ましい。環外アミン保護基として、好
ましい基はメチレン基、とくにジアルキルアミノメチレ
ン、アルカノイル、とくに分枝鎖状アルカノイル、およ
びアロイル、とくにベンゾイルおよび置換ベンゾイルで
ある。結合官能基として、カルボン酸エステル、グリコ
ール、およびトリチルエーテルが使用されるであろう。
キャッピング官能基として、カルボン酸のキャッピング
基、とくにアセチルおよびレブリニルはとくに興味があ
る。保護官能基、ブロッキング官能基、キャッピング官
能基および結合官能基の種々の組み合わせを、関連する
官能基を除去または切離すための種々の試薬と組み合わ
せて使用できる。次の組み合わせは例示である。 【００６６】 【表１０】【００６７】 【表１１】 上に示したように、環外アミノ基のための保護基の除去
のため、水性アンモニアおよびヒドラジンを用いること
ができ、これらはキャッピング基を除去するはたらきを
する。 【００６８】酵素的加水分解妨害保護官能基あるいは所
望の生成物上の末端５′または３′部分を除外したすべ
てのブロッキング基を除去した後、先端を切った失敗配
列（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆａｉｌｕｒｅ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｓ）の酵素的加水分解を実施する。加水分解のた
めの酵素は、速度、５′−３′または３′−５′の加水
分解（合成の方向に依存する）、末端ブロッキング基に
よる阻止、エンドヌクレアーゼ活性の欠除および配列ま
たは二次構造依存性の欠除に基づいて選択されるであろ
う。３′−５′合成のルートについて次の酵素を使用で
きる：脾ホスホジエステラーゼ〔ベルナルディ（Ｂｅｒ
ｎａｒｄｉ）およびベルナルディ（Ｂｅｒｎａｒｄ
ｉ）、１９７１、ザ・エンチム（Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ
ｓ）、Ｐ．Ｄ．ボイアー（Ｂｏｙｅｒ）編、第３版、
Ｖ．４，２７１ページ、アカデミック・プレス、ニュー
ヨーク〕、バシルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞外エキソヌクレアーゼ〔ケル
（Ｋｅｒｒ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）（１９６
７）２４２：２７００、 【００６９】カナモレ（Ｋａｎａｍｏｒｅ）ら、バイオ
ヒミカ・エト・バイフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、（１９７４）３３
５：１７３；カナモレ（Ｋａｎａｍｏｒｅ）ら、バイオ
ヒミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、（１９７４）３３
５：１５５〕、サケ・テステス（Ｓａｌｍｏｎ ｔｅｓ
ｔｅｓ）エキソヌクレアーゼ〔メノン（Ｍｅｎｏｎ）お
よびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、バイオケミストリー（Ｂｉ
ｃｈｅｍ．）９：１５８４〕、およびラクトバシルス・
アミドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉ
ｄｏｐｈｉｌｕｓ）ホスホジエステラーゼ〔ファイアー
ズ（Ｆｉｒｅｓ）およびコラナ（Ｋｈｏｒａｎａ）、ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー、（１９８３）２
３８：２７９８〕。 【００７０】５′−３′合成ルートのために、次の酵素
を使用できる：スネイク・ベノム（Ｓｎａｋｅ ｖｅｎ
ｏｍ）ホスホジエステラーゼ〔ラスコウスキー（Ｌａｗ
ｋｏｗｓｈｉ）、１９７１、ザ・エンチムス（Ｔｈｅ
Ｅｎｚｙｍｅｓ）、Ｐ．Ｄ．ボイアー（Ｂｏｙｅｒ）
編、第３版、Ｖ．４，３１３ページ、アカデミック・プ
レス、ニューヨーク〕、マウスの腎のホスホジエステラ
ーゼ〔ラゼル（Ｒａｚｚｅｌｌ）、Ｗ．Ｅ．、ジャーナ
ル・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．）（１９６１）２３６：３０３１〕、ニンジン
のエキソヌクレアーゼ〔ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）ら、
バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、
（１９６７）６：３６８９；ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）
ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、（１９７０）９：９２１〕およびアベナ・リーク
（ａｖｅｎａ ｌｅａｋ）ホスホジエステラーゼ〔ウド
バルディ（Ｕｄｖａｒｄｙ）、バイオヒミカ・エト・バ
イオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ．）（１９７０）２０６：３９２〕。検定
のために適当な条件は、引用した参考文献に記載されて
いる。 【００７１】核酸と多くの類似性を共有するポリペプチ
ドを本発明において使用することもできる。ポリペプチ
ドについて、末端ブロッキング基は通常α−アミノ基に
結合した基であるが、合成は末端基としてカルボキシル
を用いて逆方向であることもできる。保護基は側鎖のア
ミノ、ヒドロキシル、メルカプトおよびカルボキシ基に
結合した基であり、これらの基はリジン、アルギニン、
ヒスチジン、チロシン、セリン、スレオニン、システイ
ン、アスパラギン酸およびグルタミン酸中に存在する。
さらに、種々の樹脂を用い、ここで完成された鎖は樹脂
から切離さなくてはならず、そして付加が起こらなかっ
た鎖をキャッピングすることが望ましく、これは核酸の
鎖の場合とまったく同じである。多くの場合、鎖がＣ−
Ｎ方向またはＮ−Ｃ方向のいずれに構成されるか、すな
わち、鎖上の末端官能基がカルボキシであるかアミノで
あるかに依存して、鎖の構成に用いるアミノ酸は次の式
の１つを有するであろう。 【００７２】 【化４】 式中、ＪおよびＪ¹ はＤ−またはＬ−アミノ酸のいずれ
かのアミノ酸の残部であり、そして２０の天然アミノ酸
または天然以外のアミノ酸、例えば、ホモセリン、ノル
ロイシン、サルコシンなどのノルマル側鎖のいずれかを
含み、 【００７３】ＫおよびＫ¹ は官能基保護基であり、官能
基がアミノ（これはアミノがアミノ基、グアニジンまた
はイミダゾールであるかどうかによりさらに区別されう
る）、ヒドロキシ、メルカプトまたはカルボキシのいず
れであるか依存して、それらの性質が異なり；アミノに
ついて、保護基は４〜１２個の炭素原子のα，β−不飽
和ケトン、２〜１２個、通常４〜１０個の炭素原子のオ
キシカルボニル（とくに脂肪族、芳香族およびアラルキ
ルは酸不安定性である）、β−ジケトン、アリールスル
フェニル、アリールスルホニル、アラルキル、ニトロ、
およびポリニトロフェニルを包含することができ、ヒド
ロキシについて、７〜１２個の炭素原子のアラルキルお
よびアリールオキシカルボニル（両者は置換および非置
換である）を包含することができ、メルカプトについ
て、１〜１０個の炭素原子のアルキルおよびアラルキル
（これはジサルファイドを形成するイオウ、例えば、メ
チルジチオを形成するメチルチオを含有できる）を包含
することができ、 【００７４】カルボキシについて、７〜１２個の炭素原
子のアラルキル（置換および非置換）または２〜７個の
炭素原子のアルキルを包含することができ、末端ブロッ
キングＱについて、アミノ末端基について、２〜１２個
の炭素原子、通常５〜１０個の炭素原子のオキシカルボ
ニル（これらは脂肪族、脂環族、芳香族、またはそれら
の組み合わせである）；ジアシル（これは５〜６の環構
成員の環式イミドを形成できる）；アラルキル、とくに
トリチル（置換および非置換）、および２〜４個の炭素
原子のポリフルオロカルボン酸、とくにパーフルオロを
包含することができ、Ｑ¹ は水素であろうが、ここで末
端基はカルボキシであり、 【００７５】末端基がアミノであるとき、Ｕはヒドロキ
シまたは水性媒質中でアミノ酸へのアミド結合を形成で
きるエステル基であることができ、そしてＮ−オキシス
クシンイミド、ｏ−ニトロフェニル、ペンタクロロフェ
ニル、４−オキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸、ま
たは、とくにカルボン酸誘導体との、混合無水物のよう
な基を包含するであろう、Ｕ¹ は、末端基としてはたら
き、１〜１０個の炭素原子のアルキルまたはアラルキル
であることができる。窒素上の残りの原子価は、他の方
法で置換されていない場合、水素であろう。 【００７６】種々のブロッキング基および保護基につい
て一般化された参考文献は、次のものである：バラニー
（Ｂａｒａｎｙ）およびメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ）、ペプチドズ：アナリシス・シスセシス・バ
イオロジー（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．２、ス
ペシャルメソズ（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、
〔グロス（Ｇｒｏｓｓ）およびメイエンホファー（Ｍｅ
ｉｅｎｈｏｆｅｒ）編〕、１９７９。文献に記載されて
いる保護基の例示的列挙は、次の通りである。 【００７７】 【表１２】【００７８】 【表１３】【００７９】 【表１４】【００８０】 【表１５】【００８１】特定のブロッキング基および保護基に加え
て、支持体への結合および支持体の性質に関連する官能
基がまた存在する。広範な種類の支持体がポリペプチド
合成に関連して使用されてきている。支持体は架橋した
ポリスチレン、セルロース、ポリビニルアルコール、ガ
ラス、ポリエチレンイミンなどのような種々の物質を包
含する。このような支持体を用いるとき、広範な種類の
結合がこの支持体へ最初のアミノ酸を結合するために使
用されてきている。結合は、ポリペプチド末端がアミノ
またはカルボキルであるかに依存して、エステル、アミ
ドおよび置換アミンを包含する。文献に記載される支持
体および結合官能基の例は、次の通りである： 【００８２】 【表１６】【００８３】 【表１７】【００８４】 【表１８】【００８５】 【表１９】【００８６】キャッピング基として、アミンのための側
鎖の保護基として用いたのと同一の形であるが、末端ブ
ロッキング基と異なる基を使用できる。この方法におい
て、キャッピング基および側鎖の保護基は誤まりの配列
の酵素的分解の前に同時に除去することができる。アミ
ノ末端のためのキャッピング基の例は、トリチル、ポリ
フルオロアシル、フルオロメトキシカルボニル、ジチア
スクシニノイル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニルおよ
び２，４−ジニトロフェニルである。オリゴマーのポリ
ペプチドが完成したとき、保護基、キャッピング基およ
びブロッキング基とともに含まれる種々の官能基を切離
し、基を除去し、次いで支持体から切離す。次の表は、
官能基および試薬の種々の組み合わせを例示する。 【００８７】 【表２０】 【００８８】 【表２１】 【００８９】実施例１において上に示したように、ポリ
ペプチドの調製において、保護基およびキャッピング基
としてチオ分解性基を用いることにより、末端アミノ酸
が付加されたとき、保護基およびキャッピング基はカル
ボニル末端ブロッキング基の存在下に優先的に除去する
ことができる。塩基性条件下でのチオフェノールのよう
な条件を用いると、α−アミノ末端ブロッキングを保持
している間、保護基およびキャッピング基を除去でき
る。 【００９０】次いで、誤まりの配列をアミノペプチダー
ゼ、例えば、アミノペプチダーゼＭを用いて分解できる
〔ロイアー（Ｒｏｙｅｒ）およびアンドリュー（Ａｎｄ
ｒｅｗ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．）（１９７３）２４
８：１８０７−１８１２〕。分解後、末端保護基および
支持体への結合は、特定の基に依存して、同時にあるい
は順次に切離すことができる。例えば、オキソ−カルボ
ニルおよびβ−排除を可能とする基、例えば、スルホニ
ルエチルを用いると、アミノ酸の鎖は同時に支持体から
解放しかつ脱ブロッキングすることができるであろう。 【００９１】カルボキシル基が末端であるとき、末端ブ
ロッキング基は第三アルキルまたはアラルキル基を含む
ことができ、これらの基は酸不安定性であるが、塩基不
安定性側鎖保護基、例えば、ポリフルオロアセチルまた
はチオ分解性側鎖保護基（上を参照）を用いることがで
きる。次いで、誤まりの配列をカルボキシペプチダーゼ
Ａ，ＢまたはＣあるいはそれらの組み合わせで分解する
ことができる。配列の例は、次の通りである。光不安定
性であるｏ−ニトロベンジル結合官能基に対して第１ア
ミノ酸を用いて、エステルを形成する。末端ブロッキン
グ基はｔｅｒｔ−ブトキシオキシカルボニル（ｔＢＯ
Ｃ）であることができるであろう。チオ分解性側鎖保護
基、例えば、Ｓ−アルキルメルカプト、ジチアスクシノ
イル、ジニトロフェニル、フェナシルなどを用いる。こ
うして、側鎖保護基は除去できるが、末端ブロッキング
基は保持される。 【００９２】カルボキシが末端基であるとき、異なる試
薬をブロッキング基、保護基およびキャッピング基とし
て使用できる。例えば、アミノ基を支持体へ酸および塩
基安定性の結合により固定し、この結合は水素化分解、
例えば、スルフェニル、または光分解切離しにより切離
すことができる。末端ブロッキング基は酸不安定性ｔｅ
ｒｔ−アルキル基であることができ、この基は二塩化メ
チレン中でトリフルオロ酢酸で除去することができる。
あるいは、ｔＢＯＣヒドラジニルを末端ブロッキング基
として使用することができ、この基は４ＮのＨＣｌ／ジ
オキサンのような試薬で除去できる。側鎖の保護基は塩
基不安定性基、例えば、フルオレニルメチルオキシカル
ボニル（Ｆｍｏｃ）およびチオ分解性基（上を参照）で
あり、一方キャッピング基は低級アルキル、例えば、メ
チルである。誤まりの配列を分解した後、末端ブロッキ
ング基を除去し、完成したポリペプチドを支持体から切
り離し、単離し、そして必要に応じて精製する。 【００９３】通常不必要であるが、存在しうる他の物質
を除去するために、さらに精製に行うとき、種々の技
術、例えば、透析、ゲル透過クロマトグラフィー、ＨＰ
ＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、親和クロマトグラフィーなどを用
いることができる。使用する支持体は、種々の配列の調
製に手動法または自動化法のいずれを用いるかに依存し
て変化するであろう。一般に、自動化手順について、粒
子サイズは約５０〜３００ミクロン、より通常約１００
〜２００ミクロンであり、これに対して手動合成を用い
るとき粒子の大きさは前記範囲の下であり、一般に約１
００〜１５０ミクロンであることができる。 【００９４】ポリヌクレオチドの合成を例示するため
に、次の例を提供する。便利には、支持体への結合基の
カルボン酸を適当なカーボジイミドまたは活性化カルボ
ニル、例えば、カルボニルジイミダゾールで活性化し、
カルボン酸無水物または混合無水物との反応によりある
いは他の慣用の技術により、第１ヌクレオシドへのエス
テル結合を形成できる。 【００９５】いったん支持体へ接合したヌクレオシジル
エステルが調製されると、それをポリヌクレオチド鎖の
伸長の開始に使用することができる。一連の段階の各々
はヌクレオチドの付加を含む各配列について反復される
ので、第１工程は支持体へ結合した末端ヌクレオチドか
らのブロッキング基の除去であろう。すでに示したよう
に、多くの場合、ブロッキング基はトリチル基であろ
う。便利には、この基は不活性有機媒質、例えば、ジク
ロロメタン中で、ルイス酸、金属ハロゲン化物、例え
ば、臭化亜鉛、またはプロトン酸、とくに強いカルボン
酸（ｐＫａ＜４）例えばジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸
などにより除去される。ルイス酸の濃度は一般に約０．
１〜１．０モルである。反応時間は一般に約１〜５分で
あり、そしてこの時間は反応を完結させ、同時に副反応
を最小とするように選択される。この工程はホスホルア
ミダイドまたはホスフェートを含むいずれの手順に対し
ても共通である。 【００９６】次いで粒子を適当な不活性溶媒または溶媒
混合物あるいは溶媒の系列、とくに有機極性溶媒で洗浄
し、最後に不活性無水極性溶媒、例えば、アセトニトリ
ル、ジクロロメタンなどで洗浄して湿気が確実に存在し
ないようにする。適当ならば、これらの工程は不活性の
無水の環境、例えば、アルゴン、水素、ヘリウム、窒素
などの存在下に実施する。通常、各段階における最後の
洗浄は次の工程の溶媒系を用いる。 【００９７】よく洗浄して微量の酸を除去した後、接合
粒子（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は
次のヌクレオチドを付加できる状態にある。使用する特
定のリン酸誘導体に依存して、プロトコール（ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ）はここで変化するであろう。ホスホルアミ
ダイドを使用するとき、ホスホルアミダイドは活性化
剤、例えば、テトラゾールと組み合わせて添加される。
この反応の条件は不活性無水極性溶媒、例えば、アセト
ニトリルを短時間に使用することであり、一般に５分以
内、通常約１〜３分は十分である。トリエステルのルー
トにおいて、ホスフェートのトリアルキルアンモニウム
塩の添加は活性化剤、例えば、メシチレンスルホニル−
３−ニトロ−１，２，３−トリアゾールまたは塩化スル
ホニルおよびＮ−メチルイミダゾール、すなわち、活性
化アリールスルホン酸化合物の存在下に実施する。 【００９８】リン化合物と縮合の後、不活性無水極性有
機溶媒、例えば、アセトニトリルを用いる完全な洗浄を
実施する。ホスホルアミダイドでは、次の段階を変化さ
せることができ、キャッピングは酸化と交互するであろ
う。すなわち、ホスファイトは酸化してホスフェートに
しなくてはならない。キャッピングのため、アミノ保護
基とともにアミン保護基を効率よく除去できるカルボン
酸誘導体を使用する。好ましいカルボン酸は脂肪族カル
ボン酸であり、とくにヒドラジンと反応して、通常５〜
６環構成員の、環式化合物の形成を可能とする間隔を置
いて位置するカルボニル基を有することができる、２〜
８個、通常２〜５個の炭素原子のオキソ−置換脂肪族カ
ルボン酸である。とくに興味あるものは酢酸またはレブ
リン酸であり、これらは便利には無水物で用い、エステ
ルの形成に使用できる。 【００９９】キャッピング反応は、４〜６個の炭素原子
の極性エーテル、例えば、テトラヒドロフラン中の約５
〜２０容量％、通常約１０容量％のジアルキル化ピリジ
ンの溶液中に、約０．１〜１モル、通常０．４〜０．６
モルの濃度で複素環式芳香族アミンまたはアミンの化合
物、とくにジアルキルアミノピリジン、さらにとくに４
−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含有する塩基
性溶液を最初に添加することによって実施する。上のア
ミン溶液の添加後、脂肪族カルボン酸無水物を極性エー
テル溶媒中の約１〜３モル、好ましくは２モルの濃度で
加える。こうして、複素環式芳香族塩基は、カルボン酸
誘導体との反応のためヒドロキシル基を活性化してエス
テルを生成し、失敗配列をキャッピングする。 【０１００】酸化のため、酸化は便利には温和な酸化
剤、例えば、塩基性溶液中のヨウ素を少量の、例えば各
々約５〜１５容量％のジアルキルピリジン、例えば、
２，６−ルチジン、および水を含有する極性脂肪族エー
テル中で約０．１〜０．４モル、好ましくは約０．２モ
ルの濃度で用いて普通に実施される。あるいは、有機ヒ
ドロパーオキシド、例えば、ｔ−ブチルヒドロパーオキ
シドまたはベンジルパーオキシドを用いることができ
る。キャッピング工程と酸化工程との間に、洗浄を実施
し、これには次の工程の溶媒系を使用する。水を酸化工
程において使用し、そして無水系はキャッピングのため
に好ましいので、この系列においては、キャッピングは
通常最初に実施されるであろう。トリエステル系列のた
めには、酸化は不必要であり、それゆえキャッピングは
縮合後直ちに実施する。 【０１０１】好ましくは不活性の無水有機溶媒、例え
ば、アセトニトリルおよびジクロロメタンである逐次的
溶媒を用いて、よく洗浄した後、この手順は反復するこ
とができる。ポリヌクレオチド鎖がいったんその所望長
さに伸長されると、保護基の除去、失敗配列の分解およ
び所望配列の単離をここで開始できる。次の工程はアル
キルまたは置換アルキルである酸素上の置換基の除去の
ために普通に実施される。通常、チオフェノキシドを三
置換アミンの存在下に用いる。便利には、不活性エーテ
ル性有機溶媒、例えば、ジオキサンを使用する。時間は
この系の性質に依存して広く変化するであろう。この時
間は約５分程度に短かく、そして約１時間程度に長くあ
ることができる。便利には、溶媒、メルカプチドおよび
アミンの比は容量で２：１：１の比である。脂肪族ホス
フエートエステル基の除去に引き続いて、極性有機ヒド
ロキシル化合物、とくにアルコール、例えば、メタノー
ルを用いる洗浄を実施する。酸素上の置換基がクロロフ
ェニルであるとき、オキシメート、典型的には２−ピリ
ジニルアルドキシメート、および１，１，３，３−テト
ラメチルグアニジンの無水塩基性溶液を普通の条件下に
用いることができる。 【０１０２】次の工程において、キャッピング基、例え
ば、ルブリン酸、およびアミノ保護基を同時に除去す
る。この試薬は高度に塩基性の有機溶媒中のヒドラジン
であり、この溶媒は少量の有機アンモニウム塩、例え
ば、２〜４個の炭素原子の脂肪族カルボン酸、例えば、
酢酸と、溶媒としても作用する複素環式アミンとの塩を
含有する。溶媒は複素環式芳香族塩基、例えば、ピリジ
ンまたは５〜８個の炭素原子の置換ピリジンであり、こ
こでカルボン酸の量は一般に約１０〜３０容量％、好ま
しくは約１５〜２５容量％であろう。ヒドラジンは、水
和物として、一般に約０．２〜１モル、好ましくは約
０．５モルであろう。反応時間は少なくとも１時間、よ
り通常少なくとも６時間であり、そして約４８時間以
下、好ましくは約２４時間以下であり、温度はほぼ周囲
温度ないし５０℃である。この反応に引き続いて、極性
有機溶媒、とくにメタノールによる洗浄を実施し、次い
で乾燥する。乾燥の方法は臨界的ではなく、便利には、
室温における高い真空で十分であろう。 【０１０３】この時点において、失敗した配列は遊離の
ヒドロキシル基を有するであろうが、成功した配列はト
リチルブロッキング基で終るであろう。トリチル基を異
なる基で置換すべきとき、トリチル基は温和な酸を下に
記載するようにして用いて除去することができる。通
常、脱トリチルおよび再ブロッキングはキャッピング基
および保護基の除去前に実施される。こうして、ヌクレ
オチド保護官能基は存在してそれらの部位における反応
を阻止するであろう。次いで、末端ヒドロキシルをアシ
ル無水物、例えば、安息香酸無水物を第三アミン、例え
ば、テトラヒドロフラン中のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピ
リジン（ＤＭＡＰ）および２，６−ルチジンの組み合わ
せ、と一緒に用いて再ブロッキングすることができ、こ
こで２，６−ルチジンは約１：１０（ｖ／ｖ）であり、
無水物は約０．２〜２モルであり、そしてＤＭＡＰは約
３〜１０％（ｗ／ｖ）である。時間は通常周囲条件にお
いて約５〜３０分で変化するであろう。 【０１０４】失敗した配列をここで酵素的分解、とくに
ホスホジエステラーゼを使用して分解する。用いる媒質
は酵素の活性を最適化し、通常緩衝化水性媒質を用い
る。酵素は緩衝化媒質、１：１水：ポリオール、とくに
グリセロール中に加えることができる。この反応は約４
０℃を越えず、一般に約２５℃〜４０℃、好ましくは約
３５℃〜４０℃の高温において実施することができ、通
常約１時間より長くかつ約２４時間以下の範囲の時間を
通常必要とする。反応の完結時に、媒質を冷却すること
ができ、次いで支持体をpH約６〜７、好ましくは約６．
４〜６．５の水性緩衝化媒質で洗浄する。緩衝剤の濃度
は一般に約０．０５〜０．２モルである。 【０１０５】ポリヌクレオチドの配列は、前に除去され
ていない場合、ここで支持体から除去し、そして末端ヒ
ドロキシル基を脱ブロッキングすることができる。支持
体からの除去は反応性アミン、例えば、アンモニア、と
くに濃水性水酸化アンモニウムを用いて容易に達成され
る。除去を脱ブロッキングの前に実施するとき、除去は
保護基の除去と関連させて、よりきびしい除去の条件を
用いて実施して保護基を同時に除去することができる。
この反応は周囲温度で比較的急速に進行し、通常約０．
５〜６時間、好ましくは約１〜３時間実施する。反応の
完結時に、粒子ポリヌクレオチド配列から、便利には遠
心、および引き続くヌクレオチド配列の単離により、便
利には溶媒の蒸発により、除去される。 【０１０６】先端が切られた失敗の断片の酵素的加水分
解を５′−保護ターゲット断片の存在下に実施できる別
の手段は、失敗の断片およびターゲット断片を支持体か
ら酵素の添加前に除去することである。これは支持体か
らのＤＮＡの除去の前に５′−保護基が安定であること
を必要とする。水酸化アンモニウム感受性の結合では、
５′−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、ト
リチル、ホスホリル、ピロホスホリルおよび他の基を使
用できる。別の結合は他の５′−保護基の使用を可能と
するであろう。 【０１０７】酵素的分解は、酵素を溶液中で使用し、次
いで活性を除去する（例えば、フェノール抽出）か、あ
るいは固体に支持された酵素〔例えば、脾ホスホジエス
テラーゼ；セリゲット（Ｓｅｌｉｇｅｔ）ら、バイオテ
クノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ）、ｖｏｌ．ＸＸII、ジョン・ウイリー・アン
ド・サンズ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ
ｓ）、１９８０〕を用いて実施できる。 【０１０８】末端トリチルヒドロキシルブロッキング基
の除去は慣用法により、便利には酸性媒体好ましくは水
中の約７５％〜８５％の酢酸の中にポリヌクレオチド配
列をまず懸濁することによって達成することができる。
反応が起こるために十分な時間を経過させた後、一般に
約２時間以内の後、ＤＮＡ，ＲＮＡまたはそれらの組み
合わせを少量の沈殿剤、例えば、エタノールまたはエー
テルの添加に沈殿させることができる。次いでポリヌク
レオチドは、便利には遠心および引き続く少量の塩基、
例えば、濃水酸化アンモニウムの添加による少なくとも
部分的中和により単離し、そして混合物を蒸発乾固する
ことができる。 【０１０９】アロイル末端ブロッキング基の除去のた
め、濃水性水酸化アンモニウムを４０℃〜７０℃の高温
において２〜６時間実施することができる。得られる配
列はプローブとして使用することができ、ＤＮＡポリメ
ラーゼとともに使用して二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを形成す
ることができ、あるいは複数の断片を重なりを可能とす
る部分的相補性をもたせて使用して、複数の断片から大
きく伸長した配列を生成することができる。断片をアニ
ーリングして、複数のニックを有する二本鎖を形成し、
そして結合する。 【０１１０】二本鎖配列を得る場合、配列を種々の方法
で操作することができる。配列はベクターまたはウイル
スの中に直接挿入することができ、あるいはアダプター
（ａｄａｐｔｏｒ）、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）などの
付加により修飾することができ、ここで得られるｄｓＤ
ＮＡはベクターの中に挿入してクローニングし、引き続
いて制限マッピング（ｍａｐｐｉｎｇ）または配列決定
して所望配列の存在を確保することができ、あるいは適
当ならば、発現させることができる。ポリヌクレオチド
の調製は図面に示すような装置を用いて自動化すること
ができる。脱ブロッキングおよび精製のための自動化装
置１０を構成し、この装置は温度が制御された反応塔１
２および共通のヘリウム源１４を有する。種々の弁がＮ
Ｃ（常態で閉じている）、ＮＯ（常態で開いている）お
よびＣ（共通の弁または口）として示されている。 【０１１１】反応塔１２は両端が多孔質バリヤーで囲ま
れている。バリヤー中の孔は十分に微細であって分散し
た固相支持体を反応器内に保持するが、実質的な差圧を
用いないで混合を可能とする。パッキング１６は密に詰
められている。反応塔１２は試薬マニホールド１８から
単離弁２０よりおよびヘリウムマニホールドから単離弁
２２により分離されている。弁２０および２２の各々
は、それぞれ、廃物ライン２４および２６に接続されて
いる。廃物弁２８は、また、三方、２位置の自動弁であ
り、そして試薬マニホールドに接続された共通の常態で
開いた口を有する。 【０１１２】試薬マニホールド１８はある数の試薬およ
び洗浄溶液の供給容器を接続する：３０Ａ、アセトニト
リル−洗浄；３０Ｂ、水；３０Ｃ、水酸化アンモニウ
ム；３０Ｄ、水；３０Ｅ、８０％の酢酸；３０Ｆ、緩衝
剤；３０Ｇ、ホスホジエステル塩基；３０Ｈ、メタノー
ル；および３０Ｋ、チオフェノール−トリエチルアミン
−ジオキサン。試薬／洗浄溶液の対の各々は単一の入口
点で試薬マニホールド１８に接続されている。弁の対を
直列に接続することが好ましい。洗浄溶液または希釈溶
液を試薬溶液と結合させ、こうしてそれらを混合しそし
て反応器へ移送することができる。ポリヌクレオチドを
調製する種々の方法の前の説明および米国特許第４，４
８３，９６４号中の詳細な説明、ならびに実験の部分に
記載する手順に基づいて、種々の弁を操作して脱ブロッ
キングおよび精製を実施する方法は明らかとなるであろ
う。 【０１１３】実 験 実施例１ −ホルムアミジン置換グアニジンの調製 反応フラスコに６．７ｇのデオキシグアノシンを導入
し、これをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）とともに共
蒸発させる。このデオキシグアノシンに、８．７５mlの
ジ−Ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタール〔メー
ルウエイン（Ｍｅｅｒｗｅｉｎ）ら、リービグス・アン
ナーレン・デル・ヘミー（ＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎ．）
（１９６１）６４１：１に記載されるようにして調製〕
および２００mlのＤＭＦを加える。ヌクレオシドは急速
に溶解するが、３時間以内に完全には溶解しない。 【０１１４】透明な黄色がかった溶液を蒸発させると油
が得られ、これをジクロロメタン／水性重炭酸ナトリウ
ム中に分配し、有機層を蒸発により乾燥し、次いで１０
０mlのジクロロメタン中に溶解し、次いで９００mlの石
油エーテルで沈殿させる。上澄み液をデカンテーション
し、沈殿をジクロロメタン中に再溶解し、そしてジクロ
ロメタンを蒸発させると、１２ｇが得られ、これをピリ
ジンと共蒸発させる。次いでこの混合物に２００mlのピ
リジンおよび８．５ｇのジメトキシトリチルクロライド
を加え、そして反応を室温において１８時間進行させ
る。 【０１１５】この反応混合物に１０mlのメタノールを加
え、揮発性物質をジクロロメタンと水性重炭酸ナトリウ
ムとの間に分配させ、蒸発により乾燥し、次いでトルエ
ン中で共蒸発させる。得られる発泡体にジクロロメタン
を加えて生成物を溶解し、そしてこの生成物をシリカで
精製する。ジトリチル化生成物を１％のメタノールおよ
びジクロロメタンで溶離し、一方所望生成物は２％〜３
％のメタノール溶離で得られる。生成物を含有する分画
を合わせ、蒸発により濃縮し、そして９０mlのジクロロ
メタン中に溶解し、次いで石油エーテル（９００ml）で
沈殿させ、そして単離すると、７．９ｇの所望生成物が
得られる。 【０１１６】実施例２−ホルムアミジン置換アデノシン
の調製 フレーラー（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ）およびマテウシ（Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉ）、ヌクレイック・アシズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）（１９８
３）１１：８０３１−８０３６に記載されているように
して調製する。実施例３ −レブリン酸キャッピング剤の調製 ジエチルエーテル（３２５ml）中のレブリン酸（１００
ミリモル）および５０ミリモルのジシクロヘキシルカー
ボジイミドを６０時間攪拌した。濾過後、溶媒を蒸留に
より除去すると、１２ｇの黄色がかった油が得られる。
この油を５０mlの無水テトラヒドロフラン中に溶解し
て、最終濃度１モルのレブリン酸無水物を得た。 【０１１７】実施例４−ホルムアミダイドの調製 トリチルブロックドヌクレオシド（環外アミンはジブチ
ルアミノホルムアジニル官能性またはベンゾイル官能性
により保護されている）を注意して乾燥し、そして次の
ようにして反応させた。１５ミリモルのヌクレオシドに
２１mlのジイソプロピルエチルアミジンおよび３０mlの
クロロホルムを加え、そしてこの混合物を窒素の雰囲気
のもとに攪拌する。次いで上の混合物に、Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルアミノメトキシホスホロクロリダイト（４．
３ml）を約１分かけてゆっくり加える。この添加を反復
し、そして攪拌を２０分間続ける。 【０１１８】次いでこの混合物に２４０mlの酢酸エチル
を加え、この混合物を分液漏斗に移し、窒素でフラッシ
ュし、そして２５０mlの脱気した飽和水性ＮａＣｌ溶液
を加える。両方の相を激しく振とうしながら混合し、相
を分離させ、水相を除去し、そして抽出を３回反復す
る。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで蒸発乾固
する。この残留物に、５０mlのトルエンを加え、蒸発を
反復する。この残留物を５０mlのトルエン中に溶解し、
そしてこの溶液を６００mlのヘキサンに−７０℃におい
て攪拌しながら窒素のもとに滴々加える。ホスホルアミ
ダイドは沈殿し、これを濾過し、そして使用するまでデ
シケーター中に真空下に維持する。 【０１１９】実施例５−固体の支持体の調製 ９５％のエタノール（２５０ml）中に懸濁させた調節さ
れた孔のガラス（ＣＰＧ）（２５ｇ，５００Åの孔）
〔エレクトロヌクレオニクス（ＥｌｅｃｔｒｏＮｕｃｌ
ｅｏｎｉｃｓ）、米国マサチュセッツ州〕を、３−アミ
ノプロピルトリメトキシシラン（７．５ml）で４８時間
処理した。濾過および洗浄後、ＣＰＧを１２０℃で２時
間硬化させてＣＰＧ−ＰｒＮＨ₂ を得た。１０ｇのこの
物質を、コハク酸無水物（３．７ｇ）および４−（Ｎ，
Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（０．５ｇ）を添加して
含有するＴＨＦ中に懸濁させた。 【０１２０】４８時間反応を停止し、この時ＣＰＧはア
ミノ官能について陽性の試験（エタノール中のニンヒン
ドリン）をもはや与えなかった。末端カルボキシル基の
活性化を、ＤＭＦ中のカルボニルジイミダゾール（４
ｇ）で１８時間真空中で実施した。ＣＰＧを濾過し、ヘ
キサンジアミン（４ｇ）を含有するＤＭＦ中に直ちに懸
濁させた。４８時間後、ＣＰＧを濾過し、メタノール、
ジクロロメタン、エーテルでよく洗浄し、次いで６０℃
で１８時間乾燥した。 【０１２１】実施例６−固体支持ＤＮＡ合成。 固体支持オリゴヌクレオチドの脱保護および酵素的精製 チョウ（Ｃｈｏｗ）ら、ヌクレイック・アシズ・リサー
チ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）（１９８
１）９：２８０７−２８１１の手順に従い、脱保護した
デオキシヌクレオシド３′−Ｏ−コハク酸誘導体を官能
化アミノ末端−ＣＰＧに結合させることによって、ヌク
レオシドを支持体へ接合させた。 【０１２２】次はポリヌクレオチドの調製に用いたサイ
クルであり、ここでＣＰＧと第１ヌクレオチドとの間の
結合基は次の式を有する： ＣＰＧ₅₀₀ −（ＣＨ₂)₃ ＮＨＣＯ（ＣＨ₂)₂ ＣＯＮＨ
（ＣＨ₂)₆ ＮＨＣＯ（ＣＨ₂)₂ ＣＯ−３′−Ｏ− 第１ヌクレオシドは５′−ジメトキシトリメチルでブロ
ッキングされたチミジンであった。モノマーの単位はヌ
クレオシジル置換Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−メチル
ホスホルアミダイドであった。アデノシンおよびグアノ
シンはＮ，Ｎ−ジブチルアミノメチレンでブロッキング
された環外窒素を有して、環外アミン窒素をもつアミジ
ンを形成し、一方シトシンはベンゾイルでブロッキング
された環外アミン窒素を有した。下表１は、ほぼ３μモ
ルのチミジンを有する支持体の７０mgを使用する、用い
たサイクルを示す。 【０１２３】 【表２２】 ^*ＤＭＴ−ｐ，ｐ′−ジメトキシトリフェニルメタン ＤＣＡ−シクロロ酢酸 ａｎｈ−無水／無水物 ＤＭＡＰ−４−ジメチレアミノピリジン ＴＨＦ−テトラヒドロフラン ルチジン−２，６−ジメチルピリジン ｖ／ｖ−容量／容量 【０１２４】１〜９のサイクルを１４回反復した。第１
４ヌクレオチドを付加後、試料を３つの部分に分割し、
そして３サイクルを、それぞれ、Ａ，ＣおよびＧを用い
て異なるように実施し、第１５ヌクレオチドおよび第１
６および第１７ヌクレオチドについて、チミジンであっ
た。試料を第１５ヌクレオシドの後に合成を続ける前に
採取し、ここでオリゴヌクレオチドはそれらの最後の残
基としてＤＭＴ−Ａ，ＤＭＴ−ＣおよびＤＭＴ−Ｇを有
する。これらを酵素分解のための対照として使用し、こ
こで最後のオリゴヌクレオチドでは、組成物を半分に分
割し、１つは完全に脱ブロッキングしかつ脱トリチル化
し、そして第２は脱ブロッキングするが、ＤＭＴ基を最
後のチミジン上に保持させた。双方の種を酵素反応に使
用した。 【０１２５】次の配列を調製した： ３′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴＴ Ｘ＝Ａ，ＣまたはＧ 断片を脱保護、酵素による消化および固体の支持体から
の除去は次のようにして実施した。支持体に２００μｌ
のジオキサン／チオフェノール／トリエチルアミン
（２：１：１）を加え、そして反応を室温で１時間実施
して、ホスフェートエステルのメチル基を完全に除去し
た。次いで支持体をメタノールでよく洗浄し、次いで２
００μｌのビリジン／酢酸（４：１ｖ／ｖ）中の０．５
モルのヒドラジン・Ｈ₂ Ｏを加え、そして反応を室温で
２４時間実施し、次いでメタノールで洗浄し、そして高
真中で乾燥した。この処理は環外アミノ保護基のすべ
て、ならびにルブリンキャッピング基を除去する。 【０１２６】５０μｌの０．１モルの酢酸ナトリウム、
pH６．４５の中に懸濁させた１〜２ngの上からの支持体
に、３６μｌのグリセロール／０．１モルのコハク酸ナ
トリウム（１：１ｖ／ｖ）、pH６．５中の３単位の脾ホ
スホジエステラーゼ〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｐ−０７７
０〕を加え、この混合物を３７℃に１８時間維持した。
この時、混合物を冷却し、そして支持体を０．１モルの
酢酸ナトリウム、pH６．４５（１００μｌ）でよく洗浄
した。この洗浄した支持体に２００μｌの濃水性水酸化
アンモニウムを加え、そしてこの混合物を室温で２時間
放置した。次いでこの混合物を遠心し、上澄み液を単離
し、そしてスピード−バク（Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ）内で
蒸発乾固させた。 【０１２７】乾燥した残留物を１００μｌの８０％の水
性酢酸中に再懸濁させ、そして反応を室温で１時間進行
させた。次いでＤＮＡを１mlのエーテルの添加により沈
殿させ、分散物を遠心し、そして残留物を単離した。１
滴の濃水性水酸化アンモニウムを沈殿物に加え、次いで
沈殿をスピード−バク内で蒸発乾固させた。容器（エッ
ペンドルフ管）を２５μｌの蒸留水で洗浄し、そして沈
殿を蒸発乾固した。生成物をゲル電気泳動により分析
し、ここで試料を９０％のホルムアミド／１％のフィコ
ール（Ｆｉｃｏｌｌ）／０．００５％ブロモフェノール
ブルー（１０μｌ／mg支持体）中で可溶化し、そして２
０％のアクリルアミドゲル上へ装入した。 【０１２８】ゲル電気泳動に基づき、ここで調製は本発
明に従い実施されており、鋭い帯がヘプタデカヌクレオ
チドについて観測され、ここでわずかに弱く観測可能な
中間の帯が存在し、一方酵素処理前にブロッキング基を
除去した調製物は低分子量の数本の帯の存在を示し、こ
れらは本発明に従って調製した生成物で得られた帯ほど
暗色ではなかった。脱保護および精製プロトコール（ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌ）についての別のプロトコールは、次の
通りである。 【０１２９】１．完成された合成物の脱トリチル化およ
びＣＨ₂ Ｃｌ₂ を用いる洗浄。 ２．２，６−ルチジン／ＴＨＦ（１：１０ｖ／ｖ）中に
おける６．５％のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ｗ
／ｖ）中の２モルの安息香酸無水物による１０分のベン
ジル化、引き続くＣＨ₃ ＣＮによる洗浄。 ３．チオフェノール−トリエチルアミン／ジオキサン
（１：１：２ｖ／ｖ）を用いる１時間のホスフェートの
脱メチル化、およびメタノールによる洗浄。 ４．ピリジン／氷酢酸（４：１ｖ／ｖ）中の０．５モル
のヒドラジン水和物による環外窒素および５′−Ｏキャ
ッピング基の脱保護、および引続くメタノールおよび
０．１モルのリン酸ナトリウム、pH６．０による洗浄。 【０１３０】５．０．１モルのリン酸ナトリウム、pH
６．０中の１単位（支持体１mgにつき）の脾ホスホジエ
ステラーゼによる１８時間の消化、引き続く０．１モル
のリン酸ナトリウム、pH６．０および水による洗浄。 ６．ＮＨ₄ ＯＨで２時間処理することによる支持体から
の断片の除去。 ７．上澄み液のガラスバイアル中への移しおよび６０℃
で４時間の脱ベンゾイル化のための密閉。 ８．スピード−バク内の乾燥および水中の再懸濁。 【０１３１】実施例７−ホスホリル化試薬の調製および
オリゴヌクレオチドの５′−ホスホリル化 試薬ビス（β−シアノエトキシ）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロ
ピルアミノホスフィンを次のようにして調製した。クロ
ロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキ
シホスフィン〔Ｎ．Ｄ．シンハ（Ｓｉｎｈａ）ら、ヌク
レイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）（１９８４）１２：４５３９；アメリカン・
バイオネチクス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃ
ｓ）、米国カリフォルニア州エメリービレから入手可
能〕をアルゴンのもとに、１０mlの塩化メチレン中の３
−ヒドロキシプロピオニトリル（４．６ミリモル）およ
びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；
４．９ミリモル）の攪拌した溶液に０℃において急速に
添加した。 【０１３２】この溶液を室温に加温し、酢酸エチル（５
０ml）で希釈し、そして８０％の飽和水性ＮａＣｌ（２
×２０ml）で洗浄した。有機相を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾
燥し、そして減圧濃縮した。この油を酢酸エチル中に溶
解し、次いで各々２００μモルの前記試薬を含有する１
５mlの隔膜密閉式バイアルにアリコートを入れた。溶媒
を排気により除去し、そして生成物を−２０℃でアルゴ
ンのもとに貯蔵した。この粗生成物はそれ以上精製せず
に使用した。乾燥した物質をアセトニトリル中のテトラ
ゾールで活性化し、そして固体に支持されたオリゴヌク
レオチドに結合した。引き続いて合成ＤＮＡを水性Ｉ₂
で標準条件下に酸化し、そして６０℃においてＮＨ₄ Ｏ
Ｈで脱保護した。この方法は定量的収率で５′−ホスホ
リル化ターゲット断片を与える。 【０１３３】実施例８−溶液中のオリゴヌクレオチドの
溶解酵素的精製 断片５′−ＴＡＴＣＡＡＴＴＣＣＡＡＴＡＡＡＣＴＴＴ
ＡＣＴＣＣＡＡＡＣＣ−３′および５′−ＡＡＧＧＡＴ
ＣＣＡＧＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＣ
ＣＡＴＧＧＡＡＡＣ−３′を、実施例６〔ワーナー（Ｗ
ａｒｎｅｒ）ら、ＤＮＡ３，４０１（１９８４）〕に記
載するようにしてＣＰＧ支持体上で合成した。次いで断
片を実施例７に記載するようにして５′−ホスホリル化
した。オリゴマーを室温においてＮＨ₄ ＯＨで支持体か
ら除去し、次いで６０℃で一夜脱保護した。溶液をスピ
ード−バク内で蒸発乾固した。 【０１３４】２mgの支持体から得られる粗生成物を２０
μｌのＨ₂ Ｏ中に懸濁させ、これに０．３単位の脾ホス
ホジエステターゼを含有する５０μｌのリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH７．０を加えた。かきまぜた後、溶液を３
７℃に１時間保持した。ポリアクリルアミドゲルによる
と、先端が切られた失敗配列（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆ
ａｉｌｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）は引き続いて分解
されたが、これに対してホスホリル化ターゲット断片は
加水分解から保護されたことが立証された。 【０１３５】本発明は、問題の配列に密接に類似する
が、１または２以上の単位の欠如において有意に異なる
配列を含まないかあるいは実質的に含まない生成物を提
供することにおいて、多くの利点を有する。本発明の変
法において、オリゴマーまたはポリマーが製造され、こ
こで個々のモノマーは単一のモノマーよりはむしろモノ
マーの群の構成員であり、そしてオリゴマーまたはポリ
マーはこれらのモノマーの特定の配列を有することを必
要とする。本発明によれば、オリゴマーの順次の形成の
間に特定のモノマーの付加の失敗から生ずる、誤まりの
配列である配列を含まないかあるいは実質的に含まない
オリゴマーまたはポリマーを製造できる。 【０１３６】本発明を用いることにより、所望の配列の
使用を妨害し、誤まった結果を与え、そして所望の配列
を使用するときの効率を減少させることのある密接に類
似する配列で汚染されずに、生成物は合成から純粋な形
態で得られ、そして直接使用することができる。さら
に、この方法はブロッキング基および保護基を広範な種
類の官能性を官能化するための現在存在する広範な技術
を使用し、前記ブロッキング基および保護基はこのよう
な官能性の順次および／または連続の除去を可能とする
と同時に、オリゴマーまたはポリマーを支持体に結合さ
せて維持する。 【０１３７】次いで誤まりの配列を酵素的加水分解によ
り破壊して、所望の配列のみを支持体に結合させて残す
ことができる。次いで残るブロッキング基を支持体から
の切離しに関連させて除去することができる。このよう
にして、誤まりの配列で汚染されていない、プローブと
して直接使用できるポリヌクレオチドを得ることがで
き、そしてポリペプチドの性質の評価、免疫原としての
その使用などを妨害しうる種々の他のアミノ酸配列を含
まないポリペプチドを得ることができる。

【図面の簡単な説明】 【図１】図１は、オリゴヌクレオチドを製造するこの発
明の方法において使用する装置の略図である。 【符号の説明】 １０…脱ブロッキングおよび精製のための自動化装置 １２…温度制御された反応塔 １４…ヘリウム原 １６…パッキング １８…試薬マニホールド ２０，２２…分離弁 ２４，２６…廃物ライン ２８…廃物弁 ３０Ａ，３０Ｂ，３０Ｃ，３０Ｄ，３０Ｅ，３０Ｆ，３
０Ｇ，３０Ｈおよび３０Ｋ…供給容器

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07F 9/24 C07H 19/06 C07H 19/16 C07K 1/06 C12N 15/09 ZNA ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．炭素原子数１〜６個のアルキル基０〜２個で窒素が
   置換されているＯ，Ｏ′−ジシアノエチルホスホルアミ
   ダイト。