JP2886249B2 - ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびα―アミラーゼ活性測定方法 - Google Patents
ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびα―アミラーゼ活性測定方法Info
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- JP2886249B2 JP2886249B2 JP2064620A JP6462090A JP2886249B2 JP 2886249 B2 JP2886249 B2 JP 2886249B2 JP 2064620 A JP2064620 A JP 2064620A JP 6462090 A JP6462090 A JP 6462090A JP 2886249 B2 JP2886249 B2 JP 2886249B2
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- C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、良好な保存安定性を有するα−アミラーゼ
活性測定用基質として用いることができる新規なガラク
トシル−マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびそれ
を用いたα−アミラーゼ活性測定方法に関する。
活性測定用基質として用いることができる新規なガラク
トシル−マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびそれ
を用いたα−アミラーゼ活性測定方法に関する。
ヒトの体液、例ば唾液、膵液、血液、尿等に含まれる
α−アミラーゼの活性を測定することは、臨床診断上極
めて重要である。例ば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎の際に
は、血液や尿中のα−アミラーゼ活性が著るしく上昇す
ることが知られており、α−アミラーゼ活性が臨床診断
上の重要な指標となっている。
α−アミラーゼの活性を測定することは、臨床診断上極
めて重要である。例ば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎の際に
は、血液や尿中のα−アミラーゼ活性が著るしく上昇す
ることが知られており、α−アミラーゼ活性が臨床診断
上の重要な指標となっている。
α−アミラーゼ活性測定の方法としては、各種の方法
が知られているが、近年では構造の明確なマルトオリゴ
糖またはマルトオリゴ糖誘導体を基質として用いる方法
が主流になりつつある。
が知られているが、近年では構造の明確なマルトオリゴ
糖またはマルトオリゴ糖誘導体を基質として用いる方法
が主流になりつつある。
この方法では、マルトオリゴ糖またはマルトオリゴ糖
誘導体を基質として用い、α−アミラーゼの共役酵素で
あるα−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダ
ーゼの存在下に、α−アミラーゼを含有する検体を反応
させ、生成するグルコースまたはオリゴ糖等の還元末端
から遊離するアグリコン（例えばｐ−ニトロフェノール
等）の吸収スペクトルを測定することによって、α−ア
ミラーゼ活性を測定する。
誘導体を基質として用い、α−アミラーゼの共役酵素で
あるα−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダ
ーゼの存在下に、α−アミラーゼを含有する検体を反応
させ、生成するグルコースまたはオリゴ糖等の還元末端
から遊離するアグリコン（例えばｐ−ニトロフェノール
等）の吸収スペクトルを測定することによって、α−ア
ミラーゼ活性を測定する。
しかしながら、α−グルコシダーゼ等の共役酵素は、
α−アミラーゼの反応に関係なく、少しずつ基質を分解
するという欠点を有している。したがって、このような
共役酵素法は、測定液が不安定でブランク値が上昇する
ため、調製した測定液の保存が困難であった。この共役
酵素法の欠点を解決するため、マルトオリゴ糖またはマ
ルトオリゴ糖の非還元末端のグルコースを修飾し、共役
酵素の作用受けないようにした基質を用いることが試み
られている。
α−アミラーゼの反応に関係なく、少しずつ基質を分解
するという欠点を有している。したがって、このような
共役酵素法は、測定液が不安定でブランク値が上昇する
ため、調製した測定液の保存が困難であった。この共役
酵素法の欠点を解決するため、マルトオリゴ糖またはマ
ルトオリゴ糖の非還元末端のグルコースを修飾し、共役
酵素の作用受けないようにした基質を用いることが試み
られている。
非還元末端のグルコース残基を置換基によってブロッ
クすることにより、α−グルコシダーゼ等の共役酵素の
作用を受けない安定な基質となり、このような基質を用
いると、ブランク値の上昇が殆ど見られない安定なα−
アミラーゼ活性測定試液を調製することができる。
クすることにより、α−グルコシダーゼ等の共役酵素の
作用を受けない安定な基質となり、このような基質を用
いると、ブランク値の上昇が殆ど見られない安定なα−
アミラーゼ活性測定試液を調製することができる。
例えば、非還元末端のグルコースをカルボキシメチル
基あるいはアミノピリジル基で修飾したマルトオリゴ糖
を基質として用いる方法が知られている（特開昭59−31
699、同59−51800および同61−83195）。しかし、これ
らの基質の調製法は、極めて複雑な工程を必要とする。
例えばデキストリンやアミロースを構成するグルコース
を部分的に化学修飾した後、液化型アミラーゼとグルコ
アミラーゼを作用させて非還元末端のグルコースが修飾
されたマルトオリゴ糖の混合物を得、この混合物をカラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、非還元末端が修飾
された所望の重合度のマルトオリゴ糖誘導体を得る。さ
らに、このようにして得られた非還元末端が修飾された
マルトオリゴ糖誘導体とｐ−ニトロフェニルグルコシド
等にサイクロデキストリングルカノランスフェラーゼを
作用させ、次いでカラムクロマトグラフィーを行い、非
還元末端が修飾され、還元末端に発色団が結合した目的
とする重合度のマルトオリゴ糖誘導体を分取する。この
ため、非還元末端を修飾したマルトオリゴ糖誘導体の収
率が低く実用的でなかった。
基あるいはアミノピリジル基で修飾したマルトオリゴ糖
を基質として用いる方法が知られている（特開昭59−31
699、同59−51800および同61−83195）。しかし、これ
らの基質の調製法は、極めて複雑な工程を必要とする。
例えばデキストリンやアミロースを構成するグルコース
を部分的に化学修飾した後、液化型アミラーゼとグルコ
アミラーゼを作用させて非還元末端のグルコースが修飾
されたマルトオリゴ糖の混合物を得、この混合物をカラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、非還元末端が修飾
された所望の重合度のマルトオリゴ糖誘導体を得る。さ
らに、このようにして得られた非還元末端が修飾された
マルトオリゴ糖誘導体とｐ−ニトロフェニルグルコシド
等にサイクロデキストリングルカノランスフェラーゼを
作用させ、次いでカラムクロマトグラフィーを行い、非
還元末端が修飾され、還元末端に発色団が結合した目的
とする重合度のマルトオリゴ糖誘導体を分取する。この
ため、非還元末端を修飾したマルトオリゴ糖誘導体の収
率が低く実用的でなかった。
また、発色団の結合したマルトオリゴ糖誘導体の非還
元末端のグルコースを化学修飾する方法が知られている
（特開昭60−54395、同60−87297、同60−237998、同61
−63299、同63−301892、特開平１−157996）。これら
はマルトオリゴ糖誘導体の非還元末端のグルコースに、
例えばベンジリデン基、エチリデン基、イソプロピリデ
ン基、ハロゲン、アルキル基、フェニル基、ベンジル
基、ケトブチリデン基等の置換基を導入した基質を用い
るものである。しかし、これらの非還元末端を特異的に
修飾する化学的合成法は、例えばアセチル化、脱アセチ
ル化等の工程が必要となる等、工程が複雑で収率が低い
という欠点があった。
元末端のグルコースを化学修飾する方法が知られている
（特開昭60−54395、同60−87297、同60−237998、同61
−63299、同63−301892、特開平１−157996）。これら
はマルトオリゴ糖誘導体の非還元末端のグルコースに、
例えばベンジリデン基、エチリデン基、イソプロピリデ
ン基、ハロゲン、アルキル基、フェニル基、ベンジル
基、ケトブチリデン基等の置換基を導入した基質を用い
るものである。しかし、これらの非還元末端を特異的に
修飾する化学的合成法は、例えばアセチル化、脱アセチ
ル化等の工程が必要となる等、工程が複雑で収率が低い
という欠点があった。
このように非還元末端が修飾されたマルトオリゴ糖誘
導体を調製することは容易ではなく、このためこれらの
基質を用いたα−アミラーゼ活性の測定法を実用化する
ことも容易ではなかった。
導体を調製することは容易ではなく、このためこれらの
基質を用いたα−アミラーゼ活性の測定法を実用化する
ことも容易ではなかった。
〔発明が解決しようとする課題〕 そこで本発明の目的は、共役酵素を用いるα−アミラ
ーゼ測定法に基質として用いた場合に、共役酵素によっ
て分解されることがなく、かつ製造が容易な新規なマル
トオリゴ糖誘導体を提供することにある。
ーゼ測定法に基質として用いた場合に、共役酵素によっ
て分解されることがなく、かつ製造が容易な新規なマル
トオリゴ糖誘導体を提供することにある。
さらに本発明の目的は、上記新規なマルトオリゴ糖誘
導体の製造法及びこの誘導体を用いたα−アミラーゼ活
性測定法を提供することにある。
導体の製造法及びこの誘導体を用いたα−アミラーゼ活
性測定法を提供することにある。
本発明の新規マルトオリゴ糖誘導体は、 一般式（１） （式中、X1及びX2の少なくとも一方はガラクトシル基で
あり、他方は水素原子であり、Ｒは水素原子または置換
あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の整数
を示す。）で示されるガラクトシル−マルトオリゴ糖誘
導体である。
あり、他方は水素原子であり、Ｒは水素原子または置換
あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の整数
を示す。）で示されるガラクトシル−マルトオリゴ糖誘
導体である。
以下本発明について詳説する。
一般式（１）中、X1及びX2は、いずれか一方がガラク
トシル基であるか、あるいは両方ともがガラクトシル基
である。X1及びX2の一方のみがガラクトシル基である場
合、他方は水素原子である。又、Ｒで示される置換フェ
ニル基は、α−アミラーゼの共役酵素であるグルコアミ
ラーゼ、α−グルコシダーゼまたはβ−グルコシダーゼ
によって色素を遊離するものであればいずれでもよい。
例えば４−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル基、2,4−ジクロロフェニル基等を挙げること
ができる。これらの配糖体のアグリコン部の結合様式は
α体、β体いずれでも良い。
トシル基であるか、あるいは両方ともがガラクトシル基
である。X1及びX2の一方のみがガラクトシル基である場
合、他方は水素原子である。又、Ｒで示される置換フェ
ニル基は、α−アミラーゼの共役酵素であるグルコアミ
ラーゼ、α−グルコシダーゼまたはβ−グルコシダーゼ
によって色素を遊離するものであればいずれでもよい。
例えば４−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル基、2,4−ジクロロフェニル基等を挙げること
ができる。これらの配糖体のアグリコン部の結合様式は
α体、β体いずれでも良い。
一般式（１）中のｎは２〜５のいずれの整数でもよ
い。ただし、基質として使用する場合の水解様子を考慮
すると、ｎは３又は５であることが特に好ましい。
い。ただし、基質として使用する場合の水解様子を考慮
すると、ｎは３又は５であることが特に好ましい。
上記の本発明の新規なマルトオリゴ糖は、酵素の転移
反応を利用した新規な方法により得られる。この方法は
ガラクトシル残基をもつ糖をドナーとし、マルトオリゴ
糖誘導体をアクセプターとする糖転移反応をα−または
β−ガラクトシダーゼを用いて行うことにより、目的と
する新規マルトオリゴ糖誘導体を合成するものである。
反応を利用した新規な方法により得られる。この方法は
ガラクトシル残基をもつ糖をドナーとし、マルトオリゴ
糖誘導体をアクセプターとする糖転移反応をα−または
β−ガラクトシダーゼを用いて行うことにより、目的と
する新規マルトオリゴ糖誘導体を合成するものである。
以下この方法について説明する。
「ガラクトシル残基を持つ糖」は以下の一般式（３）
で表わされる。
で表わされる。
（式中、X3はグルコース残基、シュークロース残基また
はガラクトースの重合体を示す） 「ガラクトシル残基をもつ糖」としては、例えばラク
トース、メリビオース、ラフィノース、スタキオース、
ガラクタン等を挙げることができる。好ましくは二糖で
あるラクトース、メリビオース等を挙げることができ、
特に工業的生産を考慮した場合、安価で入手可能なラク
トースが適当である。
はガラクトースの重合体を示す） 「ガラクトシル残基をもつ糖」としては、例えばラク
トース、メリビオース、ラフィノース、スタキオース、
ガラクタン等を挙げることができる。好ましくは二糖で
あるラクトース、メリビオース等を挙げることができ、
特に工業的生産を考慮した場合、安価で入手可能なラク
トースが適当である。
アクセプターとして用いられるマルトオリゴ糖誘導体
は、以下の一般式（２）で表わされる。
は、以下の一般式（２）で表わされる。
（式中のＲ及びｎは一般式（１）のそれと同義である） 式（２）で示される化合物の具体例としては、マルト
オリゴ糖（Ｒ＝Ｈ）として、マルトテトラオース、マル
トペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオ
ース等を例示できる。
オリゴ糖（Ｒ＝Ｈ）として、マルトテトラオース、マル
トペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオ
ース等を例示できる。
Ｒがフェニル基であるものとして、フェニル−α−マ
ルトシド、フェニル−α−トリオシド、フェニル−α−
テトラオシド、フェニル−α−ペンタオシド、フェニル
−α−ヘキサオシド、フェニル−α−ヘプタオシドを例
示できる。Ｒが置換フェニル基であるものとして、ｐ−
ニトロフェニル−α−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル
−α−トリオシド、ｐ−ニトロフェニル−α−ペンタオ
シド、ｐ−ニトロフェニル−α−ヘキサオシド、ｐ−ニ
トロフェニル−α−ヘプタオシドを例示できる。
ルトシド、フェニル−α−トリオシド、フェニル−α−
テトラオシド、フェニル−α−ペンタオシド、フェニル
−α−ヘキサオシド、フェニル−α−ヘプタオシドを例
示できる。Ｒが置換フェニル基であるものとして、ｐ−
ニトロフェニル−α−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル
−α−トリオシド、ｐ−ニトロフェニル−α−ペンタオ
シド、ｐ−ニトロフェニル−α−ヘキサオシド、ｐ−ニ
トロフェニル−α−ヘプタオシドを例示できる。
本発明において使用されるα−またはβ−ガラクトシ
ダーゼはガラクトシドを加水分解してガラクトースを遊
離する酵素として知られている。本発明ではドナーとし
てラクトース等のβ−ガラクトシドを用いる場合はβ−
ガラクトシダーゼを、ドナーとしてメリビオースまたラ
フィノース等のα−ガラクトシドを用いる場合はα−ガ
ラクトシダーゼを使用する。本発明では、いずれの起源
のβ−ガラクトシダーゼを用いてもよいが、具体的には
Biolacta（大和化成（株））、Lactase F “アマノ”
（天野製薬（株））、Lactase Y−A0（（株）ヤクル
ト）、Lactase P（ケイ・アイ化成（株））等を用いる
ことができる。また、α−ガラクトシダーゼも、いずれ
の起源のものを用いてもよい。具体的にはモルチェレラ
ビナセア（Mortierella vinaces）またはアブシディ
ア レフレキア（Absidia reflexa）起源α−ガラクト
シダーゼ（北海道糖業（株））、グリーンコーヒー豆
（Green Coffee Beans）由来α−ガラクトシダーゼ（Si
gma（株））等を用いることができる。
ダーゼはガラクトシドを加水分解してガラクトースを遊
離する酵素として知られている。本発明ではドナーとし
てラクトース等のβ−ガラクトシドを用いる場合はβ−
ガラクトシダーゼを、ドナーとしてメリビオースまたラ
フィノース等のα−ガラクトシドを用いる場合はα−ガ
ラクトシダーゼを使用する。本発明では、いずれの起源
のβ−ガラクトシダーゼを用いてもよいが、具体的には
Biolacta（大和化成（株））、Lactase F “アマノ”
（天野製薬（株））、Lactase Y−A0（（株）ヤクル
ト）、Lactase P（ケイ・アイ化成（株））等を用いる
ことができる。また、α−ガラクトシダーゼも、いずれ
の起源のものを用いてもよい。具体的にはモルチェレラ
ビナセア（Mortierella vinaces）またはアブシディ
ア レフレキア（Absidia reflexa）起源α−ガラクト
シダーゼ（北海道糖業（株））、グリーンコーヒー豆
（Green Coffee Beans）由来α−ガラクトシダーゼ（Si
gma（株））等を用いることができる。
本発明の酵素を用いた糖転移反応は、好ましくは溶媒
中で行う。溶媒としては水及び親水性有機溶媒との混合
溶媒を例示できる。特に、水と親水性有機溶媒との混合
溶媒中で反応を行うことにより、目的物質の収率を高め
ることができるので好ましい。親水有機溶媒としては特
に限定はなく、水親和性の有機溶媒であれば良い。親水
有機溶媒の例としては、ジメチルスルホキサイド、ジメ
チルホルムアミド、ｎ−プロパノール、イソプロパノー
ル、アセトン、メタノール、エタノール、エチレングリ
コール、プロピレングリコール等が挙げられる。これら
の溶媒は単独で使用しても良く、また２種以上を混合し
て使用しても良い。
中で行う。溶媒としては水及び親水性有機溶媒との混合
溶媒を例示できる。特に、水と親水性有機溶媒との混合
溶媒中で反応を行うことにより、目的物質の収率を高め
ることができるので好ましい。親水有機溶媒としては特
に限定はなく、水親和性の有機溶媒であれば良い。親水
有機溶媒の例としては、ジメチルスルホキサイド、ジメ
チルホルムアミド、ｎ−プロパノール、イソプロパノー
ル、アセトン、メタノール、エタノール、エチレングリ
コール、プロピレングリコール等が挙げられる。これら
の溶媒は単独で使用しても良く、また２種以上を混合し
て使用しても良い。
水との混合溶媒における親水性有機溶媒の含有率は、
溶媒の種類等によっても異なるが約10〜70％好ましくは
20〜60％が適当である。
溶媒の種類等によっても異なるが約10〜70％好ましくは
20〜60％が適当である。
本発明の糖転移反応において、ガラクトシル残基を持
つ糖の基質濃度は10〜40％、マルトオリゴ糖誘導体
（２）の基質濃度は10〜40％とすることが適当である。
反応時間は５〜40時間程度、反応温度は20〜60℃の範囲
で行うことが適当である。反応終了後、pH調整または加
熱により酵素反応を停止し、例えばカラムクロマトグラ
フィーにより分画を行い、本発明のマルトオリゴ糖誘導
体（１）を得ることができる。カラムクロマトグラフィ
ーには例えば、トヨパール（Toyopearl）HW−40Sゲルを
充填したカラムに25％メタノールを移動相として用いる
方法やODSカラムに10％メタノールを移動相として用い
る方法を挙げることができる。また、分画の際に未反応
のアクセプターであるマルトオリゴ糖またマルトオリゴ
糖誘導体画分を回収し、くり返し再使用することにより
収率を著じるしく高めることができる。
つ糖の基質濃度は10〜40％、マルトオリゴ糖誘導体
（２）の基質濃度は10〜40％とすることが適当である。
反応時間は５〜40時間程度、反応温度は20〜60℃の範囲
で行うことが適当である。反応終了後、pH調整または加
熱により酵素反応を停止し、例えばカラムクロマトグラ
フィーにより分画を行い、本発明のマルトオリゴ糖誘導
体（１）を得ることができる。カラムクロマトグラフィ
ーには例えば、トヨパール（Toyopearl）HW−40Sゲルを
充填したカラムに25％メタノールを移動相として用いる
方法やODSカラムに10％メタノールを移動相として用い
る方法を挙げることができる。また、分画の際に未反応
のアクセプターであるマルトオリゴ糖またマルトオリゴ
糖誘導体画分を回収し、くり返し再使用することにより
収率を著じるしく高めることができる。
このようにして得られる本発明のマルトオリゴ誘導体
（１）は、α−アミラーゼ活性測定用基質として使用す
ることができる。測定検体としては、α−アミラーゼを
含有するものであればよく、例えばヒトの血液、血清、
尿、唾液等が挙げられる。また共役酵素としては、グル
コアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダー
ゼを一種または必要に応じて二種以上組み合わせて使用
する。これらの共役酵素の起源は、微生物、植物等いず
れのものも使用することができる。本発明のα−アミラ
ーゼ活性の測定条件は、従来より使用されているマルト
オリゴ糖誘導体を基質とする条件をそのまま採用するこ
とができる。例えば基質の濃度は約0.1〜10mMの範囲と
することが好ましく、反応温度は約25〜40℃とすること
が好ましい。反応時間は測定の目的により自由に選定で
きるが、通常約３〜30分間とする。至適pHは約６〜８で
あり、各種緩衝剤を使用してpHを維持することが好まし
い。
（１）は、α−アミラーゼ活性測定用基質として使用す
ることができる。測定検体としては、α−アミラーゼを
含有するものであればよく、例えばヒトの血液、血清、
尿、唾液等が挙げられる。また共役酵素としては、グル
コアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダー
ゼを一種または必要に応じて二種以上組み合わせて使用
する。これらの共役酵素の起源は、微生物、植物等いず
れのものも使用することができる。本発明のα−アミラ
ーゼ活性の測定条件は、従来より使用されているマルト
オリゴ糖誘導体を基質とする条件をそのまま採用するこ
とができる。例えば基質の濃度は約0.1〜10mMの範囲と
することが好ましく、反応温度は約25〜40℃とすること
が好ましい。反応時間は測定の目的により自由に選定で
きるが、通常約３〜30分間とする。至適pHは約６〜８で
あり、各種緩衝剤を使用してpHを維持することが好まし
い。
以下実施例により本発明をさらに説明する。
実施例１ ラクトース209.5mg（122.4mM）とｐ−ニトロフェニル
−α−マルトペンタオシド（pNP−α−G5）290.5mg（6
1.2mM）を20％（v/v）ジメチルスルホキサイドを含む20
mMリン酸緩衝液（pH7.0）1mlに溶解し、これにβ−ガラ
クトシダーゼ（商品名:BIOLACTA,大和化成（株））を1m
g添加し、40℃で静置して反応を行ったところ、18時間
に基質であるpNP−α−G5の16％をｐ−ニトロフェニル
−α−ガラクトシル−マルトペンタオシド（pNP−α−G
5（Gal）１）に変換することができた。反応終了後、ト
ヨパール（Toyopearl）HW−40Sゲルを充填したカラム
（φ2.2×95cm）を用い、移動相:25％メタノール、流
速:0.8ml/min.、室温という条件で分画し、目的とする
区分を分取し、凍結乾燥品として粉末40mgを得た。これ
はガラクトシル残基がpNP−α−G5の非還元末端のグル
コシル残基にβ−1,4結合したものとβ−1,6結合したも
のとの混合物（生成比はβ−1,4:β−1,6＝約4:1）であ
った。さらにODSカラム（YMC−pack AQ−323）を用い、
移動相:10％メタノール、流速:3.8ml/min.、室温という
条件で、この混合物を分画したところpNP−α−G5の非
還元末端のグルコシル残基にβ−1,4結合したものを凍
結乾燥品として25mgを得ることができた。構造確認のた
め13C核磁気共鳴スペクトルの測定を行い、非還元末端
のグルコシル残基にガラクトシル基の結合していること
を確認した。この測定結果を第１図に示す。
−α−マルトペンタオシド（pNP−α−G5）290.5mg（6
1.2mM）を20％（v/v）ジメチルスルホキサイドを含む20
mMリン酸緩衝液（pH7.0）1mlに溶解し、これにβ−ガラ
クトシダーゼ（商品名:BIOLACTA,大和化成（株））を1m
g添加し、40℃で静置して反応を行ったところ、18時間
に基質であるpNP−α−G5の16％をｐ−ニトロフェニル
−α−ガラクトシル−マルトペンタオシド（pNP−α−G
5（Gal）１）に変換することができた。反応終了後、ト
ヨパール（Toyopearl）HW−40Sゲルを充填したカラム
（φ2.2×95cm）を用い、移動相:25％メタノール、流
速:0.8ml/min.、室温という条件で分画し、目的とする
区分を分取し、凍結乾燥品として粉末40mgを得た。これ
はガラクトシル残基がpNP−α−G5の非還元末端のグル
コシル残基にβ−1,4結合したものとβ−1,6結合したも
のとの混合物（生成比はβ−1,4:β−1,6＝約4:1）であ
った。さらにODSカラム（YMC−pack AQ−323）を用い、
移動相:10％メタノール、流速:3.8ml/min.、室温という
条件で、この混合物を分画したところpNP−α−G5の非
還元末端のグルコシル残基にβ−1,4結合したものを凍
結乾燥品として25mgを得ることができた。構造確認のた
め13C核磁気共鳴スペクトルの測定を行い、非還元末端
のグルコシル残基にガラクトシル基の結合していること
を確認した。この測定結果を第１図に示す。
実施例２ 試薬ブランク値の経時変化を調べるため、0.04M CaCl
を含有する0.1M 3,3−ジメチルグルタリックアシッド−
5M NaOH緩衝液（pH6.8）1.0mlに、酵母由来のα−グル
コシダーゼ100U/mlと基質5mgを加え、30℃に保持し、経
時的に405nmの吸光度を測定した。なお、基質としては
実施例１で得られた本発明のpNP−α−G5（Gal）１と比
較のためにpNP−α−G5を用いた。この結果を第１表に
示した。
を含有する0.1M 3,3−ジメチルグルタリックアシッド−
5M NaOH緩衝液（pH6.8）1.0mlに、酵母由来のα−グル
コシダーゼ100U/mlと基質5mgを加え、30℃に保持し、経
時的に405nmの吸光度を測定した。なお、基質としては
実施例１で得られた本発明のpNP−α−G5（Gal）１と比
較のためにpNP−α−G5を用いた。この結果を第１表に
示した。
実施例３ α−アミラーゼによる吸光度変化を調べるため、10mM
NaClを含有する50mMリン緩衝液（pH7.0）1mlに基質5mg
と酵素由来のα−グルコシダーゼ40U/mlと、これにブタ
膵臓のα−アミラーゼを加え37℃で20分間、経時的に40
5nmの吸光度を測定した。なお、基質としては実施例１
で得られた本発明のpNP−α−G5（Gal）１とpNP−α−G
5を用いた。また、ブタ膵臓のα−アミラーゼは1U/ml、
2U/ml、3U/ml、4U/mlの各濃度になるように添加した。
この結果を第２図に示した。この図からα−アミラーゼ
活性とは吸光度との間には明かな相関関係が認められ
た。また、pNP−α−G5（Gal）１とpNP−α−G5の吸光
度変化には大差がないことも確認された。
NaClを含有する50mMリン緩衝液（pH7.0）1mlに基質5mg
と酵素由来のα−グルコシダーゼ40U/mlと、これにブタ
膵臓のα−アミラーゼを加え37℃で20分間、経時的に40
5nmの吸光度を測定した。なお、基質としては実施例１
で得られた本発明のpNP−α−G5（Gal）１とpNP−α−G
5を用いた。また、ブタ膵臓のα−アミラーゼは1U/ml、
2U/ml、3U/ml、4U/mlの各濃度になるように添加した。
この結果を第２図に示した。この図からα−アミラーゼ
活性とは吸光度との間には明かな相関関係が認められ
た。また、pNP−α−G5（Gal）１とpNP−α−G5の吸光
度変化には大差がないことも確認された。
本発明のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体を基質
として用いるとα−アミラーゼの測定時に、上述のよう
に共役酵素であるα−グルコシダーゼによるブランク値
の上昇を押えることができ、しかも従来の測定試薬と同
様の方法で測定が可能である。また、基質溶解液とα−
グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ等の共役酵素溶解液
との一液化が可能となるなどα−アミラーゼの活性測定
法においてきわめて有用である。
として用いるとα−アミラーゼの測定時に、上述のよう
に共役酵素であるα−グルコシダーゼによるブランク値
の上昇を押えることができ、しかも従来の測定試薬と同
様の方法で測定が可能である。また、基質溶解液とα−
グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ等の共役酵素溶解液
との一液化が可能となるなどα−アミラーゼの活性測定
法においてきわめて有用である。
さらに、本発明のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導
体の製造方法は、特に安価に入手可能なラクトースを用
いることができ、比較的簡単な酵素的合成法であり、収
率も良いことから有効な工業的生産方法となり得る。ま
た本発明のα−アミラーゼ測定法は、従来のこの種の測
定法と同様、ヒト体液のα−アミラーゼの活性測定に広
く使用することができる。
体の製造方法は、特に安価に入手可能なラクトースを用
いることができ、比較的簡単な酵素的合成法であり、収
率も良いことから有効な工業的生産方法となり得る。ま
た本発明のα−アミラーゼ測定法は、従来のこの種の測
定法と同様、ヒト体液のα−アミラーゼの活性測定に広
く使用することができる。
第１図は、本発明で得られたpNP−α−G5（Gal）１の13
C核磁気共鳴スペクトルを示す。第２図は、pNP−α−G5
（Gal）１およびpNP−α−G5を用いた試薬のα−アミラ
ーゼによる吸光度変化を示す。
C核磁気共鳴スペクトルを示す。第２図は、pNP−α−G5
（Gal）１およびpNP−α−G5を用いた試薬のα−アミラ
ーゼによる吸光度変化を示す。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07H 3/06 C07H 15/203 C12P 19/18 C12Q 1/40 C08B 37/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】下記一般式（１）で表わされるガラクトシ
ル−マルトオリゴ糖誘導体。 （式中、X1及びX2の少なくとも一方はガラクトシル基で
あり、他方は水素原子であり、Ｒは水素原子または置換
あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の整数
を示す。） - 【請求項２】ガラクトシル残基をもつ糖と、一般式
（２） （式中、Ｒは水素原子または置換あるいは無置換のフェ
ニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す）で示されるマ
ルトオリゴ糖誘導体とにα−ガラクトシダーゼ又はβ−
ガラクトシダーゼを作用させることを特徴とする請求項
１記載のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造
法。 - 【請求項３】α−ガラクトシダーゼ又はβ−ガラクトシ
ダーゼを水又は親水性有機溶媒と水との混合溶媒中で作
用させる請求項２記載の製造法。 - 【請求項４】グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼお
よびβ−グルコシダーゼのうち少なくとも１種の存在下
に、マルトオリゴ糖誘導体をα−アミラーゼを含有する
検体と反応させ、生成するグルコースまたはオリゴ糖の
還元末端から遊離するアグリコンの吸収スペクトルを測
定するα−アミラーゼ活性測定法において、上記マルト
オリゴ糖誘導体として請求項１記載のガラクトシル−マ
ルトオリゴ糖誘導体を用いることを特徴とするα−アミ
ラーゼ活性測定法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2064620A JP2886249B2 (ja) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびα―アミラーゼ活性測定方法 |
| US07/941,302 US5378831A (en) | 1990-03-14 | 1992-09-04 | Galactosyl maltooligosaccharide derivatives |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2064620A JP2886249B2 (ja) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびα―アミラーゼ活性測定方法 |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP2886249B2 true JP2886249B2 (ja) | 1999-04-26 |
Family
ID=26405707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2064620A Expired - Fee Related JP2886249B2 (ja) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびα―アミラーゼ活性測定方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2886249B2 (ja) |
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| JP3124435B2 (ja) * | 1993-10-20 | 2001-01-15 | キッコーマン株式会社 | α‐アミラーゼアイソザイム活性の分別定量法 |
| JPH0770165A (ja) * | 1993-06-28 | 1995-03-14 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 非還元性オリゴ糖とその製造方法並びに用途 |
| JPH11299498A (ja) | 1998-02-19 | 1999-11-02 | Toyobo Co Ltd | アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬 |
| JP3087891B2 (ja) | 1998-03-31 | 2000-09-11 | 東洋紡績株式会社 | 電解質測定用試薬組成物 |
| US6387646B1 (en) | 1998-12-11 | 2002-05-14 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Reagent compositions for measuring electrolyte |
| DE19954233A1 (de) * | 1999-11-11 | 2001-05-31 | Nutricia Nv | Diabetikernahrung |
| WO2018167259A1 (en) * | 2017-03-16 | 2018-09-20 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Production of glycoconjugates and multivalent carbohydrate structures and uses thereof |
Family Cites Families (3)
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|---|---|---|---|---|
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| DE3323245A1 (de) * | 1983-06-28 | 1985-01-10 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren und reagenz zur bestimmung von (alpha)-amylase |
| US4963479A (en) * | 1986-10-07 | 1990-10-16 | Hoechst Celanese Corporation | Reagent system for an alpha-amylase assay containing aromatic substituted glycoside |
-
1990
- 1990-03-14 JP JP2064620A patent/JP2886249B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-09-04 US US07/941,302 patent/US5378831A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03264596A (ja) | 1991-11-25 |
| US5378831A (en) | 1995-01-03 |
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