JP2733138B2

JP2733138B2 - 抗ｈｃｖ抗体の免疫アッセイに使用するｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗原の組合せ

Info

Publication number: JP2733138B2
Application number: JP3507636A
Authority: JP
Inventors: ヒュートン，マイケル; チュー，チウーリン; クオ，ジョージ
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1990-04-04
Filing date: 1991-03-29
Publication date: 1998-03-30
Anticipated expiration: 2013-03-30
Also published as: EP0450931B1; DE69131488T2; NO923839D0; BR9106309A; MY107499A; GB2257784A; FI924349A; LT3808B; AU7651091A; RO109916B1; RU2130969C1; HU9203146D0; ES2088465T3; LV10344B; DK0450931T3; EP0450931A1; GB9220480D0; NO923839L; EP0693687B2; JPH05508219A

Description

【発明の詳細な説明】説明技術分野本発明は、HCV（以前は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスと
呼ばれていた）の免疫アッセイの分野に関する。特に、
本発明は、抗HCV抗体の広範囲な免疫アッセイを可能に
するHCV抗原の組成物に関する。

背景以前、非Ａ非Ｂ型肝炎（NANBH）として知られていた
疾病は、伝染性の疾患あるいは疾患群であり、ウイルス
が誘発すると考えられていた。そしてウイルスに関連す
る他の形態の肝臓疾患とは区別し得ると見なされてい
た。これらの他の形態の疾患には、公知の肝炎ウイル
ス、すなわち、Ａ型肝炎ウイルス（HAV）、Ｂ型肝炎ウ
イルス（HBV）および△肝炎ウイルス（HDV）、およびサ
イトメガロウイルス（CMV）またはエプスタイン−バー
ウイルス（EBV）によって引き起こされる肝炎が包含さ
れる。NANBHは、輸血した個体において初めて同定され
た。ヒトからチンパンジーへの伝染およびチンパンジー
間における一連の継代は、NANBHが、１種または複数種
の伝染性感染因子によるという証拠を与えた。疫学的証
拠によると、NA NBHには次の３つの型が存在し得ること
が示唆される：つまり、飲料水媒介の流行型；血液また
は非経口伝染型；および散発（集団取得（community ac
quired））型の３つの型である。しかし、最近まで、NA
NBHに関与する伝染性因子は同定されておらず、NANBHの
臨床診断および同定は、主に他のウイルスマーカーを排
除することによって行われてきた。推定されるNANBH抗
原および抗体を検出するために使用される方法として
は、寒天ゲル拡散法、対向免疫電気泳動法、免疫蛍光顕
微鏡法、免疫電子顕微鏡法、放射免疫アッセイ、および
酵素結合免疫吸着検定法がある。しかし、これらのアッ
セイのいずれも、NANBHの診断テストとして用いるため
に、十分に感度が高く、特異的であり、かつ再現性があ
るとは証明されていない。

1987年に、Chiron Corporation（本出願の所有者）の
科学者たちは、血液媒介のNANBHに明らかに関係してい
る核酸を初めて同定した。EPO公開No.318,216号、Hough
tonら、Science 244:359（1989）を参照のこと。これら
の文献には、新規なウイルスクラスである、Ｃ型肝炎ウ
イルス（HCV）からの単離物のクローニングが記載され
ている。これらの文献に記載のプロトタイプ単離物は、
「HCV1」と名付けられた。HCVは、RNAゲノムを有するフ
ラビ様ウイルスである。

本願に参考のために援用した、米国特許出願第456,63
7号（Houghtonら）は、HCV cDNAを発現することによる
様々な組換えHCVポリペプチドの調製、およびこれらの
ポリペプチドをHCV患者由来の血清との免疫反応性につ
いて、スクリーニングすることについて記載している。
このような限定されたスクリーニングにより、テストし
たポリペプチドのうち、特に５−１−１、C100、C33c、
CA279aおよびCA290aとして同定された５つのポリペプチ
ドの免疫原性が高いことが示された。これらの５つのポ
リペプチドのうち、５−１−１は、推定されるNS4ドメ
インに存在し、C100は、推定されるNS3およびNS4ドメイ
ンに広がっており、C33cは、推定されるNS3ドメインに
存在し、CA279aおよびCA290aは、推定されるＣドメイン
に存在する。さらに、このスクリーニングにより、テス
トしたシングルポリペプチドのいずれも、すべての血清
の免疫学的に反応性があるわけではないことが示され
た。従って、HCV陽性個体由来のすべてのまたはより多
くの試料と反応する、改良されたテストが望まれる。

発明の開示出願人は、HCV抗原の血清学的研究をさらに行い、今
日までに同定されているシングルHCVポリペプチドは、
いずれもすべての血清に対して免疫学的に反応性をもつ
わけではないことを確認した。HCVを有する個体からの
すべての血清に対して普遍的に反応するシングルポリペ
プチドがないのは、特に、HCVエピトープにおける株間
の多様性、個体間での体液応答における多様性、および
／または疾病状態の血清学上の多様性に起因する。

これらのさらなる研究により、いずれのシングルHCV
ポリペプチドよりもより効果的な、HCV抗体の検出を提
供するHCV抗原の組合せの同定が可能になった。

従って、本発明の１つの局面は、HCV抗原の組合せで
あって、（ａ）Ｃドメインからの第1HCV抗原、および（ｂ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの
別のHCV抗原、（ｉ）NS3ドメインからのHCV抗原、（ii）NS4ドメインからのHCV抗原、（iii）ＳドメインからのHCV抗原、および（iv）NS5ドメインからのHCV抗原を含む、HCV抗原の組合せ。

１つの実施態様では、HCV抗原の組合せは、複数の抗
原を含む融合タンパク質の形態である。他の実施態様で
は、抗原の組合せは、共通の固体マトリックスに結合し
た複数の個体抗原の形態である。さらに他の実施態様で
は、抗原の組合せは、個体抗原の混合物の形態である。

本発明の他の局面は、HCVに対する抗体を含むと思わ
れる哺乳類体成分中に、該抗体を検出する方法である。
この方法では、抗原抗体反応を起こさせる条件下で、該
哺乳類体成分を上記のHCV抗原の組合せに接触させる工
程；および該抗体および該抗原の免疫複合体の存在を検
出する工程とを包含する。

本発明の他の局面は、HCVに対する抗体を含むと思わ
れる哺乳類体成分中に、該抗体を検出する別の方法であ
る。この方法では、抗原抗体反応を起こさせる条件下
で、該哺乳類体成分を、以下を含むHCV抗原のパネルに
同時または連続して接触させる工程；（ａ）Ｃドメインからの第1HCV抗原、および（ｂ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの
別のHCV抗原、（ｉ）NS3ドメインからのHCV抗原、（ii）NS4ドメインからのHCV抗原、（iii）ＳドメインからのHCV抗原、および（iv）NS5ドメインからのHCV抗原、そして、該抗体および該抗原の免疫複合体の存在を検
出する工程とを包含する方法。

本発明の他の局面は、HCVに対する抗体を含むと思わ
れる哺乳類体成分中に、該抗体を検出するアッセイを実
施するためのキットである。このキットは、パッケージ
された状態で、（ａ）前記HCV抗原の組合せ、（ｂ）標準コントロール試薬、および（ｃ）該アッセイを実施するための説明書、を組合せて含む。

図面の簡単な説明図面において、図１は、HCVポリタンパク質のcDNAセンスおよびアン
チセンス鎖のヌクレオチド配列、およびセンス鎖によっ
てコードされるアミノ酸配列である。

図２は、HCVポリペプチドの推定されるドメインを示
す、図１のアミノ酸配列の概略図である。

発明を実施するための形態定義「HCV抗原」は、HCVの単離体に見いだされるエピトー
プを決定する、少なくとも５個のアミノ酸、より普通に
は、少なくとも８個から10個のアミノ酸のポリペプチド
を指す。好ましくは、エピトープは、HCVに特有であ
る。抗原が、英数字コードで示されるときには、エピト
ープは、英数字によって特定されるHCVドメインからの
ものである。

HCV抗原を特徴づけるのに使用される「合成の」は、H
CV抗原が、天然源からの単離されるか、または化学合成
または組換え合成のような人工によるものであることを
示す。

「ドメイン」は、図２に示すHCVポリタンパク質のセ
グメントを指し、これらは、通常、HCVの推定される構
造および非構造タンパク質に対応する。ドメインの記号
は、一般に、フラピウイルスタンパク質を名付けるのに
使用される従来の方法に従う。図２に示すドメインの位
置は、およそのものである。記号「NS」は、「非構造」
ドメインを指し、「Ｓ」は、エンベロープドメインを指
し、「Ｃ」は、ヌクレオカプシドまたはコアドメインを
指す。

「融合ポリペプチド」は、一種または複数種のHCV抗
原が、アミノ酸の１本の連続する鎖の一部となっている
ポリペプチドを指し、天然には存在しないものである。
HCV抗原は、ペプチド結合によって互いに直接結合され
得るかまたは、介在アミノ酸配列によって分離され得
る。融合ポリペプチドはまた、HCV以外のアミノ酸配列
を含み得る。

「共通固体マトリックス」は、個々のHCV抗原、また
はHCV抗原を含む融合ポリペプチドが、共有結合または
疎水性吸着のような非共有結合手段によって結合してい
る固体を指す。

「哺乳類体成分」は、通常、個体によって生産される
抗体を含む、哺乳類個体（例えば、ヒト）の流体または
組織を指す。このような成分は、当該技術分野において
公知であり、限定されないが、血液、血漿、血清、脊椎
液、リンパ液、呼吸器の分泌物、腸管または尿生性殖器
管、涙、唾液、乳汁、白血球細胞、および骨髄腫を含
む。

「免疫学的に反応性をもつ」は、問題の抗原が、HCV
に感染した個体由来の血清の重要な部分に通常存在する
抗HCV抗体と、特異的に反応し得ることを意味する。

「免疫複合体」は、抗体が、抗原上のエピトープと結
合するときに形成される組合せまたは集合体を指す。

HCV抗原の組合せ図２は、HCVポリタンパク質の推定ドメインを示す。
組合せに用いられる抗原が由来するドメインは、Ｃ、Ｓ
（またはＥ）、NS3、NS4およびNS5である。Ｃドメイン
は、HCVのヌクレオカプシドタンパク質を決定すると考
えられる。Ｃドメインは、図１のポリタンパク質のＮ末
端から、アミノ酸120位付近まで伸長している。Ｓドメ
インは、ビリオンエンベロープタンパク質、おそらくは
マトリックス（Ｍ）タンパク質を決定すると考えられ、
図１のアミノ酸120位付近から、アミノ酸400位まで伸長
している考えられる。NS3ドメインは、アミノ酸1050位
付近から、アミノ酸1640位まで伸長し、ウイルスプロテ
アーゼを構成すると考えられる。NS4ドメインは、NS3の
末端から、アミノ酸2000位付近まで伸長している。NS4
タンパク質の機能は、現時点では不明である。最後に、
NS5ドメインは、アミノ酸2000位付近から、ポリタンパ
ク質の末端まで伸長し、ウイルスポリメラーゼに対応す
ると考えられる。

図１に示す配列は、HCV1単離体の配列である。血液を
媒介としたHCVのその他の株の配列は、特に、エンベロ
ープ（Ｓ）およびヌクレオカプシド（Ｃ）ドメインにお
いて、図１の配列と異なり得ることが予想される。この
ように異なる配列を有するHCV抗原の使用は、本発明の
範囲内にあるものとする。但し、その改変は、HCVに感
染したヒト由来の血清に対する抗原の免疫学的反応性を
著しく退化させるものではない。

一般に、HCV抗原は、ドメイン全体または切形のドメ
インを含み、ドメインフラグメントの抗原性は、当業者
により容易にスクリーニングされる。組合せに用いられ
る個体HCV抗原は、好ましくは固定されたドメインの免
疫優勢部分（すなわち、ポリペプチドの免疫学的反応性
に主に関与する部分）を含み得る。Ｃドメインの場合、
Ｃドメイン抗原は、このドメインの全配列の大半を含む
のが好ましい。C22と名付けられた抗原（以下の実施例
４を参照）は、特に好ましい。Ｓドメイン抗原は、好ま
しくは、ドメインのＮ末端の、疎水性サブドメインを含
む。この疎水性サブドメインは、図１のアミノ酸199位
付近からアミノ酸328位まで伸びている。S2と名付けら
れたHCV抗原（以下の実施例３を参照）は、特に好まし
い。この疎水性サブドメインの下流側の配列は、必要に
応じて、Ｓドメイン抗原に含まれ得る。

好ましいNS3ドメイン抗原は、C33cと名付けられた抗
原である。この抗原は、図１のアミノ酸1192位から1457
位を含む。好ましいNS4抗原は、図１のアミノ酸1569位
から1931位を含むC100である。好ましいNS5抗原は、図
１のアミノ酸2054位から2464位を含む。

HCV抗原は、HCVのアミノ酸配列全体を含むポリペプチ
ドの形態であり得るか、またはHCVに外因性の配列を含
み得る（すなわち、外因性配列を含む融合タンパク質の
形態であり得る）。組換えによって生産されたHCV抗原
の場合、SOD、α因子またはユビキチン等との融合タン
パク質として抗原を生産することにより（同一出願人に
よる米国特許第4,751,180号、第4,870,008号、および19
89年８月７日出願の米国特許出願第390,599号を参照の
こと。これらには、本願に参考のために援用する。これ
らには、SOD,α因子およびユビキチン融合タンパク質の
発現を記載している）、抗原の発現レベルが増加し、お
よび／または抗原の水溶解性が増加し得る。α因子とユ
ビキチンとの融合のような融合タンパク質は、発現宿主
によってプロセシングされ、異種配列が除去される。α
因子は、分泌システムであるが、ユビキチン融合物は細
胞質中に残存する。

さらに、抗原の組合せは、融合タンパク質として生産
され得る。例えば、C22およびC33cをコードするDNAの連
続フラグメントが、構築され得、発現ベクターにクロー
ニングされ、C22およびC33cの融合タンパク質を発現す
るのに使用され得る。同様に、C22およびC100;C22およ
びS2;C22およびNS5抗原;C22、C33cおよびS2;C22、C100
およびS2;C22、C33c、C100およびS2の融合タンパク質が
作成され得る。例示したドメインからの別のフラグメン
トも使用され得る。

HCV抗原の調製本発明のHCV抗原は、好ましくは、組換えまたは公知
の固相化学合成によって生産される。しかし、HCV抗原
は、抗原に対する抗体を用いるアフィニティークロマト
グラフィーを使用して、無関連なHCVまたはHCV粒子から
単離され得る。

組換え技術によって生産される場合には、抗原をコー
ドするDNAを構築し、このDNAを発現ベクターにクローニ
ングし、細菌、酵母、昆虫または哺乳類細胞のような宿
主細胞を形質転換し、このようなDNAを発現して抗原を
生産する、標準手法が用いられ得る。前記のように、発
現を向上させ、精製を容易にし、または溶解性を向上さ
せるためには、抗原を融合タンパク質として発現させる
ことが望ましい。代表的なHCV抗原を生産する特定の手
法例は、以下の実施例、および特許出願第456,637号に
おいて記載する。

免疫アッセイに使用する抗原の調製複数のHCV抗原は、２つまたはそれ以上の抗原を含む
融合タンパク質の形態にHCV抗原を生産するか、それら
を個々に共通の固体マトリックス上に固定化するか、ま
たは物理的にそれらを混合することにより、組合せられ
る。抗原の融合タンパク質はまた、固体マトリックスに
固定化（結合）され得る。タンパク質を固体マトリック
スに共有結合または非共有結合させる方法および手段
は、当該技術分野において公知である。固体表面の特性
は、アッセイフォーマットにより異なり得る。ミクロタ
イターウェルで実施されるアッセイでは、固体表面は、
ウェルまたはカップの壁であり得る。ビーズを用いるア
ッセイでは、固体表面は、ビーズの表面であり得る。デ
ィップスティック（dipstick）（すなわち、織物または
紙などの多孔性または繊維性物質からできた固体）を用
いるアッセイでは、表面は、ディップスティックを形成
する物質の表面であり得る。凝集アッセイでは、固体表
面は、ラテックスまたはゼラチン粒子の表面であり得
る。個々の抗原が、マトリックスに結合される場合に
は、それらは、表面上に均一に分布されるかまたは、結
合抗原のパターンが認められるように、帯のようなパタ
ーンで表面に分布され得る。

抗原の簡単な混合物では、任意の適切な溶剤または分
散培地における抗原が含まれる。

抗原の組合せを使用するアッセイフォーマット HCV抗原は、抗体を検出するための既知の抗原を用い
る、実質的にすべてのアッセイフォーマットにおいて使
用され得る。これらのアッセイのすべての共通の特性
は、抗原と、HCV抗体を含むと思われる体成分とを、成
分中に存在する任意のこのような抗体と抗原とが結合す
る条件下で、接触させることである。このような条件と
は、通常、過剰の抗原を用いた生理的温度、pHおよびイ
オン強度である。抗原と試料とをインキュベートさせ、
次に抗原を含む免疫複合体が検出される。

免疫アッセイの設計は、非常に多様であり、多くのフ
ォーマットが当該技術分野において公知である。プロト
コルは、例えば、固体支持体または免疫沈降を用い得
る。ほとんどのアッセイでは、標識された抗体またはポ
リペプチドを使用し、その標識は、例えば、酵素分子、
蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、または染料分子
であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅させるア
ッセイもまた知られている。その例としては、ビオチン
およびアビジンを用いるアッセイ、ならびにELISAアッ
セイのような、酵素で標識され媒介された免疫アッセイ
が挙げられる。

免疫アッセイは、限定されるわけではないが、異種ま
たは同種フォーマットであり、標準型または競合型であ
り得る。異種フォーマットの場合、通常、インキュベー
ション後、試料をポリペプチドから容易に分離するため
に、ポリペプチドは固体マトリックスまたは支持体に結
合される。使用され得る固体支持体の例としては、ニト
ロセルロース（例えば、膜またはミクロタイターウェル
の形態）、ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはミク
ロタイターウェルの形態）、ポリスチレンラテックス
（例えば、ビーズまたはミクロタイタープレートの形
態）、ポリフッ化ビニリデン（イムロン（Immulon^TM）
として知られる）、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビ
ーズ、およびプロテインＡビーズがある。例えば、Dyna
techイムロン^TM1もしくはイムロン^TM2ミクロタイタープ
レートまたは0.25インチのポリスチレンビーズ（精密標
準プラスチックボール（Precision Plastic Ball））
が、異種フォーマットに使用され得る。抗原性ポリペプ
チドを含む固体支持体は、通常、テスト試料から分離し
た後、結合抗体の検出前に洗浄される。標準および競合
フォーマットが当該技術分野において公知である。

同種フォーマットでは、テスト試料は、溶液中で、抗
原の組合せとインキュベートされる。例えば、このフォ
ーマットは、形成される任意の抗原抗体複合体を沈降さ
せ得る条件下であり得る。これらのアッセイには、標準
および競合アッセイの両方が当該技術分野において公知
である。

標準フォーマットでは、抗体抗原複合体を形成するHC
V抗体の量は、直接モニターされる。このモニターは、
抗HCV抗体上のエピトープを認識する標識された抗異種
（例えば、抗ヒト）抗体が、複合体の形成によって結合
するか否かを決定することによって成し遂げられ得る。
競合フォーマットでは、試料中のHCV抗体の量は、複合
体内における既知の量の標識された抗体（または他の競
合リガンド）の結合に対する競合効力をモニターするこ
とによって推定される。

抗HCV抗体を含む形成された複合体（または、競合ア
ッセイの場合には、競合抗体の量）は、フォーマットに
従って、任意の多数の公知の技術によって検出される。
例えば、複合体中の標識されていないHCV抗体は、標識
（例えば、酵素標識）と複合した抗異種Igの結合体を用
いて検出され得る。免疫沈降または凝集アッセイフォー
マットでは、HCV抗原と抗体との反応により、溶液また
は懸濁液から沈降し、沈降物の可視層または膜を形成す
るネットワークが形成される。テスト試料中に、抗HCV
抗体が存在しない場合には、可視沈降物は形成されな
い。

HCV抗原は、通常、これらの免疫アッセイにおいて使
用されるようにキットの形態にパッケージされる。キッ
トは、通常、別々の容器に、抗原の組合せ（固体マトリ
ックスにすでに結合しているか、または抗原をマトリッ
クスに結合させる試薬と共に、それぞれ別々に存在して
いる）コントロール抗体調製物（陽性および／または陰
性）、アッセイフォーマットが同一のものを要求する際
の標識された抗体、および標識がシグナルを直接生成し
ないならば、シグナル発生試薬（例えば、酵素基質）を
含む。アッセイを実施するための指導書（例えば、書
面、テープ、VCR、CD−ROM等）は、通常、キットに含ま
れる。

以下の実施例は、本発明を例示することを目的として
おり、本発明を決して限定するものではない。

実施例1:HCV抗原C33cの合成 HCV抗原C33cはNS3ドメイン由来の配列を含有する。特
に図１のアミノ酸1192位から1457位を含有する。この抗
原はヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）との
融合タンパク質としてバクテリア内で以下のように生産
された。ベクターpSODcf1（Steinerら（1986）、J.Viro
l.58:9）は、EcoR IおよびBamH Iで完全消化され、得ら
れたEcoR I、BamH I断片は、以下のリンカーに連結され
て、pcf1EFが形成された。

アミノ酸1192から1457をコードし、EcoR I末端を有す
るcDNAクローンがpcf1ERに挿入され、pcf1EF/C33cが形
成される。この発現構築物をD1210 E.coli細胞に形質転
換した。

この形質転換細胞を用いて、Ｎ末端にSODを有し、Ｃ
末端C33c HCV抗原をインフレームで有する融合タンパク
質を発現させる。発現は、15mlの形質転換細胞の一晩培
養物をアンピシリン（100μg/ml）含有する1500mlのル
リアブイヨンに接種することにより行われる。細胞をO.
D.O.3になるまで増殖させ、IPTGを最終濃度2mMになるよ
うに添加して、細胞の濃度がO.D.1に達するまで増殖を
続行した。その時点で3,000×ｇで４℃にて20分間遠心
分離機にかけて採取した。パックした細胞は−80℃で数
カ月保存可能である。

SOD−C33cのポリペプチドを精製するために、ポリペ
プチドが発現される細菌細胞を浸透圧衝撃および機械的
破砕に供し、SOD−C33cを含む不溶性画分を単離して、N
aClアルカリ溶液で分画抽出にかけ、そして抽出物中の
融合ポリペプチドをＳ−セファロースおよびＱ−セファ
ロースのカラムでクロマトグラフィーにより精製した。

浸透圧衝撃および機械的破砕により得た粗抽出物を以
下の手順により調製した。１グラムのパックした細胞を
0.02M Tris HCl、pH7.5、10mM EDTA、20％のスクロース
を含有する10mlの溶液中に懸濁して、氷上で10分間イン
キュベートした。次に細胞を4,000×ｇで15分間４℃に
て遠心分離機にかけてペレット状にした。上清を除去
後、細胞ペレットを10mlの緩衝液Al（0.01M Tris HCl、
pH7.5、1mM EDTA、14mMβメルカプトエタノール［BM
E］）に再懸濁して、氷上で10分間インキューベートし
た。細胞を再び4,000×ｇで15分間４℃でペレット状に
した。透明な上清（ペリプラズム画分Ｉ）を除去後、細
胞ペレットを緩衝液A1に再懸濁して、氷上で10分間イン
キュベートして、再び4,000×ｇで15分間４℃で遠心分
離機にかけた。透明の上清（ペリプラズム画分II）を除
去後、細胞ペレットを5mlの緩衝液A2（0.02M Tris HC
l、pH7.5、14mM BME、1mM EDTA、1mM PMSF）に再懸濁し
た。細胞を破砕させるため、懸濁液（5ml）および7.5ml
のダイノミル型の無鉛酸洗浄ガラスビーズ（直径0.10−
0.15mm）（Glen−Mills（株）から入手）をファルコン
チューブに入れて、２分間最高速度でボルテックスにか
け、続いて少なくとも２分間氷上で冷した。ボルテック
ス−冷却工程をさらに４回繰り返した。ボルテックス
後、スラリーを低い吸引力でガラス漏斗を用いて濾過し
た。ガラスビーズを２回、緩衝液A2で洗浄し、そして濾
液と洗浄液を混ぜ合わせた。

粗抽出物の不溶性画分を20,000×ｇで15分間４℃で遠
心分離機にかけて回収し、10mlの緩衝液A2で２回洗浄
し、5mlのMILLI−Ｑ水に再懸濁した。

最終濃度が各々20mMになるようにNaOH（2M）およびNa
Cl（2M）を懸濁液に添加し、混合物を１分間ボルテック
スにかけ、20,000×ｇで20分間４℃で遠心分離機にか
け、そして上清を維持することにより、SOD−C33c含有
画分を、不溶性物質から単離した。

Ｓ−セファロースでSOD−C33cを精製するために、上
清画分を最終濃度が6M尿素、0.05M Tris HCl、pH7.5、1
4mM BME、1mM EDTAになるように調整した。この画分
を、緩衝液Ｂ（0.05M Tris HCl、pH7.5、14mM BME、1mM
EDTA）で平衡化したＳ−セファロース速流動（1.5×10
cm）のカラムにかけた。カラムにかけた後、カラムをカ
ラムの２倍容の緩衝液Ｂで洗浄した。通過および洗浄画
分を回収した。アプライおよび洗浄の流速は1m 1/分で
あり、回収された画分は1mlであった。SOD−C33c含有画
分を同定するため、画分の部分標本をSDSを含有する10
％のポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析して、
クーマシープルーで染色した。画分をさらにSODに対す
る抗体を用いてウェスタン法によっても分析した。SOD
−C33c含有画分をプールした。

SOD−C33cを緩衝液Ｂで平衡化したＱ−セファロース
カラム（1.5cm×5cm）でさらに精製した。Ｓ−セファロ
ース上でのクロマトグラフィーから得たSOD−C33cを含
有するプールされた画分を、カラムにかけた。カラムを
緩衝液Ｂで洗浄して、60mlの緩衝液Ｂ中のNaCl 0.0から
0.4Mのグラジエントで溶出させた。アプライ、洗浄、お
よび溶出の流速は1ml/分であり、回収された画分は1ml
であった。Ｑ−セファロースカラムからの全画分をＳ−
セファロースカラムの時と同様に分析した。カラムから
溶出されたSOD−C33cのピークは約0.2M NaClの時点であ
った。

Ｑ−セファロースカラムから得たSOD−C33cは、ポリ
アクリルアミドSDSゲルおよびヒトSODに対するモノクロ
ーナル抗体を用いたイムノブロットでの分析によると、
約90％以上の純度であった。

実施例2:HCV抗原C100の合成 HCV抗原C100は、NS3ドメインおよびNS4ドメイン由来
の配列を含有する。より詳しくは、図１のアミノ酸1569
位から1931位までを含有する。この抗原は酵母で生産さ
れた。上述のアミノ酸をコードしEcoR I末端を有する12
70bpのcDNA断片が調製された。

この断片が直接S.cerevisiae ADH2/GAPプロモーター
に融合されている酵母発現ベクターの構築は、PCR法を
用いたC100配列の増幅、次いで増幅された配列をクロー
ニングベクターに連結することを含むプロトコールによ
ってなされる。クローニングの後、C100配列を取り出し
て、ADH2/GAPプロモータを含有する配列と共に、酵母ベ
クターの大きな断片に連結させて、酵母発現ベクターを
得る。

C100のPCR増幅は、鋳型として、Sal Iの消化により直
鎖状にされたベクターpS3−56_C100m,を用いて行われ
た。pBR322の誘導体であるpS3−56は、ヒトスーパーオ
キシドジスムターゼ遺伝子の上流にADH2/GAPDHハイブリ
ッド酵母プロモーター、および下流にアルファ因子転写
ターミネーターからなる発現カセットを含有する。

増幅に用いられるオリゴヌクレオチドのプライマーは
発現ベクターへのクローニングを促進し、翻訳終止コド
ンを導入するように設計された。特に、新規な５′−Hi
nd IIIおよび３′−Sal I部位がPCRオリゴヌクレオチド
で作成された。Sal I部位を含有するオリゴヌクレオチ
ドはまた二重終止コドン、TAAおよびTGAをコードする。
Hind III部位を含有するオリゴヌクレオチドはまたAUG
コドンの上流のすぐ近くにあるpgap63由来の非翻訳リー
ダ配列を含有する。pEco63GAPDH遺伝子はHolland ＆ Ho
lland（1980）およびKniskernら（1986）に記載されて
いる。C100mの直接発現に用いられたPCRプライマー配列
は、以下の通りである。

およびプライマーおよび鋳型を利用したPCRによる増幅はCet
us−Perkin−Elmer PCRキットを用いたものであり、製
造元の指示に従って行った。PCR条件は、１分間94℃、
２分間37℃、３分間72℃で29サイクルであり、最終イン
キュベーションは72℃で10分間であった。DNAは４℃か
ら−20℃で一晩保存され得る。

増幅後、PCRの産物をHind IIIおよびSal Iで消化し
た。1.1kbの主産物をゲル上で電気泳動により精製し
て、そして溶出された精製産物をpBR322のSal I−Hand
IIIの大きな断片に連結させた。正確な組換え物を単離
するために、コンピテントHB101細胞を組換えベクター
で形質転換させ、クローニング後、所望の組換え物を、
クローンから取り出したHind III−Sal I断片の予想さ
れるサイズを基に同定した。正確なサイズのHind III−
Sal I断片を含有するクローンの１つをpBR322/C100^-dと
命名した。このクローンが増幅したC100を含有すること
をHind III−Sal I断片の直接配列分析によって確認し
た。

C100を含有する発現ベクターは、pBR322/C100^-d由来
のHind III−Sal I断片をpBS24.1の13.1kb BamH I−Sal
I断片およびADH2/GAPプロモーターを含有する1369bm B
amH I−Hind III断片を連結することにより構築された
（後者の断片は欧州特許第164,556号に記載されてい
る）。pBS24.1ベクターは、同一出願人による1989年７
月19日出願のU.S.S.N.382,805に主に記載されている。A
DH2/GAPプロモーター断片は、ベクターpPGAP/AG/Hind I
IIをHind IIIおよびBamH Iで消化して、次に1369bpの断
片をゲル上で精製することにより得られた。

コンピテントHB101細胞を組換えベクターで形質転換
して、正確な組換え物を、クローン化されたベクターの
BamH IおよびSal I消化により生じる2464bp断片および1
3.1kb断片の生成により同定した。クローン化された正
確な組換えベクターの１つをpC100^-d＃３と命名した。

C100を発現させるために、Saccharomyces cerevisiae
株AB133（MATa leu2 ura3−53 prb 1−1122 pep4−3 pr
cl−407［cir−０］）のコンピテント細胞を発現ベクタ
ーpC100^-d＃３で形質転換した。形質転換された細胞をU
RA−ソルビトールに置いて、個々の形質転換細胞をLeu^-
プレート上にひろげた。

個々のクローンを２％のグルコースを用いたLeu^-、ur
a^-培地で30℃にて24〜36時間培養した。２％グルコース
を含有する１リットルの酵母エキストラクトペプトン培
地（YEP）に10mlの一晩培養物を接種して、そして得ら
れた培養物を400rpmの撹拌速度、１分間に１リットルの
培地に付き１リットルの空気の通気率（すなわち1vvm）
で30℃にて48時間増殖させた。培地のpHは制御しなかっ
た。培養物をNew Brunswick Science社製のBioFlo II発
酵槽で増殖させた。発酵に続いて、細胞を単離させて、
C100の発現について分析した。

形質転換された細胞により発現したC100ポリペプチド
の分析を、Leu^-プレートから得た単−酵母コロニーから
調製した細胞溶解物および粗抽出物で行った。細胞溶解
物および粗抽出物をSDSポリアクリアミドゲル電気泳
動、およびウェスタンブロットにより分析した。ウェス
タンブロットは、酵母で発現したSOD−C100ポリペプチ
ドに対するウサギのポリクローナル抗体でプローブして
行った。C100ポリペプチドの予想サイズは364個のアミ
ノ酸であった。ゲル分析の結果、発現したポリペプチド
は39.9kのMW_rを有していた。

両方の分析法は、ともに発現されたC100ポリペプチド
が全細胞溶解物中に存在するが、粗抽出物には存在しな
いことを示した。これらの結果は、発現されたC100ポリ
ペプチドが不溶性であることを示唆している。

実施例3:HCV抗原S2の発現 HCV抗原S2は、Ｓドメインの疎水性Ｎ末端からの配列
を含有し、図１のアミノ酸199位から328位を含む。

S2ポリペプチドをコードする発現ベクターの構築およ
びそれを酵母で発現させるためのプロトコールは、実施
例２で記載のC100ポリペプチドの発現に用いたものと類
似していた。

PCR反応のための鋳型は、Hind IIIでの消化により直
線化されたベクターpBR322/Pil4aであった。Pil4aはア
ミノ酸199から328をコードするcDNAクローンである。

S2をコードする配列のPCRによる増幅のためのプライ
マーとして用いられるオリゴヌクレオチドは以下の通り
である。

S2配列の５′領域においては：および S2配列の３′領域においては：５′領域のプライマーによってHind III部位およびAT
G開始コドンが増幅生産物に導入される。３′領域のプ
ライマーにより、翻訳終止コドンおよびSal I部位が増
幅生産物に導入される。

PCR条件は、１分間94℃、２分間37℃、３分間72℃で2
9サイクルであり、最終インキュベーションは72℃で10
分間であった。

PCR反応の主な生産物はゲル精製された413bpの断片で
あった。精製断片を、Hind IIIおよびSal I断片で消化
したpBR322から得た大きな断片に連結させて、プラスミ
ドpBR322/S2dを作成した。

413bpのHind III−Sal I S2断片と、ADH2/GAPプロモ
ータを含有する1.36kbのBamH I−Hind III断片、および
酵母ベクターpBS24.1のBamH I−Sal Iの大きな断片との
連結により、クローン化された組換えベクターが作成さ
れた。正しい組換えベクターはBamH IおよびSal Iで消
化した後の1.77kbの断片の存在により同定された。増幅
配列から構築され、ADH2/GAPプロモーターに直接融合さ
れたS2をコードする配列を含有する発現ベクターは、pS
2d＃９と命名された。

実施例4:HCV C抗原の合成 HCV抗原C22は、Ｃドメインに由来し、図１のアミノ酸
１−122を含有する。

Ｃポリペプチドをコードする発現ベクターの構築、お
よび酵母中でそれを発現させるためのプロトコールは、
上述のC100ポリペプチドの発現に用いられたものと下記
の点を除いて同様であった。

PCR反応のための鋳型は、Hind IIIで直鎖状にされたP
BR322/Ag30aであった。Ag30は、アミノ酸１−122をコー
ドするcDNAクローンである。Ｃをコードする配列をPCR
によって増幅させるためのプライマーとして用いられる
オリゴヌクレオチドは以下の通りである。

Ｃ配列の５′領域においては：およびＣ配列の３′領域においては：５′領域のプライマーによってHind III部位が増幅生
産物に導入され、３′領域のプライマーによって、翻訳
終止コドンおよびSal I部位が導入される。PCR条件は、
１分間94℃、２分間37℃、３分間72℃で29サイクルであ
り、最終インキュベーションは72℃で10分間であった。

PCR増幅による生産物は381bpのポリヌクレオチドであ
る。この断片をpBR322の大きなSal I−Hind III断片に
連結させてプラスミドpBR322/C2を作成した。

pBR322/C2から取り出した381bpのHind III−Sal I C
コード断片と、ADH2/GAPプロモータを含有する1.36kbの
BamH I−Hind III断片、および酵母ベクターpBS24.1のB
amH I−Sal Iの大きな断片との連結により、クローン化
された組換えベクターが作成された。正しい組換えベク
ターは、BamH IおよびSal Iで消化した後の1.74kbの断
片の存在により同定された。この増幅配列から構築さ
れ、直接ADH2/GAPプロモーターに融合されたＣをコード
する配列を含有する発現ベクターは、pC22と命名され
た。

形質転換された細胞により発現されたＣポリペプチド
の分析を、Leu^-プレートから得た単−酵母コロニーから
調製した全細胞溶解物および粗抽出物により行った。細
胞溶解物および粗抽出物をSDSポリアクリアミドゲル電
気泳動により分析した。Ｃポリペプチドは122個のアミ
ノ酸を有すると予想され、ゲル分析の結果、発現したポ
リペプチドは約13.6kdのMW_rを有している。

実施例5:NS5ポリペプチドの合成このポリペプチドは、NS5ドメインのＮ末端からの配
列を含有し、詳しくは図１のアミノ酸2054位から2464位
を含む。NS5ポリペプチドをコードする発現ベクターの
構築、およびその発現のためのプロトコールは、C33cの
発現に用いたものと類似していた（実施例１参照）。

実施例6:HCVに対する抗体のラジオイムノアッセイ（RI
A） HCV（非Ａ、非Ｂ）を有すると臨床的に診断された個
体の血清中、および供給血液から採取した血清中のHCV
に対する抗体を検出する実施例１から５のHCV抗原の能
力を、RIAフォーマットで試験した。

RIAは、SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY
（W.H.Freeman ＆ Co.）,pp.373−391に記載のTsuおよ
びHerzenberg（1980）の手順に基づき行った。一般に
は、マイクロタイタープレート（Immulon 2,Removawell
strips）を精製したHCV抗原で被覆した。被覆したプレ
ートを血清試料または適切な対照と共にインキュベート
した。インキュベーションの間、抗体は、もし存在する
なら、固相抗原に免疫学的に結合する。結合しなかった
物質を除去して、マイクロタイタープレートを洗浄後、
ヒト抗体−NANBV抗原の複合体は、¹²⁵I標識ヒツジ抗ヒ
ト免疫グロブリンと共にインキュベートすることにより
検出される。結合していない標識抗体を吸引により除去
して、プレートを洗浄する。個々のウェルの放射活性を
測定する。結合ヒト抗HCV抗体の量はウェルの放射活性
に比例する。

詳細には、0.125M Naホウ酸緩衝液、pH8.3、0.075M N
aCl（BBS）中に0.1から0.5μｇのHCV抗原を含有する100
μｌの部分標本を、マイクロタイタープレート（Dynate
ch Immulon 2 Removawell Strips）の各ウェルに添加し
た。プレートを４℃にて一晩湿気のあるチャンバーでイ
ンキュベートした。その後、抗原液を除去し、ウェルを
0.02％のTriton X−100（BBST）を含有するBBSで３回洗
浄した。非特異的結合を阻害するため、BBS中の5mg/ml
のBSA溶液を100μｌ添加し、続いて室温で１時間インキ
ュベートして、このインキュベーションの後BSA溶液を
除去することにより、ウェルをウシ血清アルブミン（BS
A）で被覆した。10mg/mlのBSAを含有する0.01Mリン酸ナ
トリウム緩衝液、pH7.2、0.15M NaCl（PBS）で1:100に
希釈した血清試料を100μｌ添加し、そして血清含有ウ
ェルを37℃で１時間インキュベートすることにより、被
覆されたウェル中の抗原を血清と反応させた。インキュ
ベーション後、血清試料を吸引により除去して、ウェル
をBBSTで５回洗浄した。抗原に結合した抗体を¹²⁵I標識
Ｆ′（ab）_２ヒンジ抗ヒトIgGを被覆ウェルに結合する
ことにより定量した。100μｌの標識プローブの部分標
本（比放射能５−20μCi/μｇ）を各ウェルに添加し、
プレートを１時間37℃でインキュベートし、次いで過剰
のプローブを吸引により除去して、BBSTで５回洗浄し
た。各ウェルに結合した放射活性をガンマ放射線を検出
するカウンターにより測定した。

下記の表１は、HCVを有すると診断された個体から採
取した血清の試験結果を示すものである。

これらの結果によると、すべての血清と反応する単一
抗原はない。C22およびC33cが最も反応性が高く、S2
は、他の抗原とは反応しない、いくつかの推定急性HCV
ケース由来のいくつかの血清と反応する。これらの結果
に基づくと最も大きい検出の範囲を示す２つの抗原の組
み合わせはC22およびC33cである。急性感染を最大に検
出したいなら、S2を組み合わせに含めるとよい。

表２は供給血液の試験結果を示す。

供給血液による結果は一般に感染した個体の血清によ
る結果を確認したものとなっている。

実施例7:HCV抗原の組み合わせを用いたHCV抗体のELISA
測定 C22およびC33c抗原の組み合わせで被覆したプレート
を以下のように調製した。被覆緩衝液（50mMのホウ酸ナ
トリウム、pH9.0）、21ml/プレート、BSA（25μg/m
l）、C22およびC33c（各2.50μg/ml）含有溶液をRemove
awell Immulon Iプレート（Dynatech社）に添加する直
前に調製する。５分間混合した後、0.2ml/ウェルの溶液
をプレートに添加して、被覆し、37℃で２時間インキュ
ベートして、その後溶液を吸引により除去する。ウェル
を１回400μｌの洗浄緩衝液（100mMリン酸ナトリウム、
pH7.4、140mM塩化ナトリウム、0.1％（M/V）カゼイン、
１％（W/V）Trinton x−100、0.01％（W/V）チメロサー
ル）で洗浄する。洗浄溶液を除去後、200μl/ウェルのP
ostcoat溶液（10mMリン酸ナトリウム、pH7.2、150mM塩
化ナトリウム、0.1％（w/v）カゼイン、３％のスクロー
スおよび2mMのフェニルメチルスルフォニルフルオライ
ド（PMSF））を添加して、蒸発を防ぐためプレートを緩
く被覆して、室温に30分間放置した。次にウェルを吸引
して溶液を除去して、たなを加熱することなく一晩凍結
乾燥させる。調製したプレートは乾燥剤（3g Sorb−it
packs）と共にアルミニウムの袋に密閉して２〜８℃で
保存され得る。

ELISA測定を行うために、20μｌの血清試料または対
照試料を、200μｌの試料希釈液（100mMリン酸ナトリウ
ム、pH7.4、500mM塩化ナトリウム、1mM EDTA、0.1％（W
/V）カゼイン、0.01％（W/V）チメロサール、１％（W/
V）トリトンＸ−100、100μg/ml酵母抽出物）を含むウ
ェルに添加する。プレートを密閉して37℃で２時間イン
キュベートし、次に溶液を吸引により除去して、ウェル
を３回400μｌの洗浄緩衝液（0.05％ Tween 20を含有す
るリン酸緩衝溶液（PBS））で洗浄する。洗浄したウェ
ルを、Ortho（結合）希釈液（10mMリン酸ナトリウム、p
H7.2、150mM塩化ナトリウム、50％（V/V）ウシ胎児血
清、１％（V/V）熱処理したウマ血清、1mM K₃Fe（CN）
_６、0.05％（W/V）Tween 20、0.02％（W/V）チメロサー
ル）に含まれた、200μｌのマウス抗ヒトIgG−ホースラ
ディッシュペルオキシダーゼ（HRP）結合物で処理す
る。処理は１時間37℃で行い、溶液は吸引により除去し
て、ウェルを３回400mlの洗浄緩衝液で洗浄して、この
緩衝液もまた吸引により除去する。結合した酵素結合物
を測定するために、200μｌの基質溶液（5mlの現像液当
り10mgのＯ−フェニレンジアミンジヒドロ塩化物）を添
加する。現像液はリン酸でpH5.1に調整した50mMのクエ
ン酸ナトリウム、および0.6μl/mlの30％ H₂O₂を含有す
る。基質溶液を含有するプレートを暗所で30分間室温で
インキュベートする。反応を50μl/mlの4N硫酸を添加し
て中止し、0Dを測定する。

同様に、C22およびC33c:C22、C33c、およびS2の融合
タンパク質、並びにC22およびC100;C22およびS2;C22お
よびNS5抗原;C22、C33c、およびS2;並びにC22、C100、
およびS2の組み合わせを用いて、ELISAを行い得る。

上述の実施態様を改変して本発明を実行することは、
分子生物学、免疫学、および関連分野の当業者に公知で
あり、それらも本発明の請求項の範囲に包含される。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者クオ，ジョージアメリカ合衆国カリフォルニア 94112 サンフランシスコ，シックススアベニュー 1370 (56)参考文献特開平２−500880（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対する抗体を
含むと思われる哺乳類体成分において該抗体を検出する
ための、化学合成または組換え発現により生成されるHC
V抗原の組合せを含む物質の組成物であって、（ａ）HCVポリタンパク質のＣドメインからのエピトー
プを含む第1HCV抗原；および（ｂ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの
別のHCV抗原（第2HCV抗原）：（ｉ）HCVポリタンパク質のNS3ドメインからのエピトー
プを含むHCV抗原；（ii）HCVポリタンパク質のNS4ドメインからのエピトー
プを含むHCV抗原；（iii）HCVポリタンパク質のＳドメインからのエピトー
プを含むHCV抗原；および（iv）HCVポリタンパク質のNS5ドメインからのエピトー
プを含むHCV抗原、ただし、該組合せは、ペプチドp1
（アミノ酸１位〜75位）とc100、ペプチドp35（アミノ
酸35位〜75位）とc100、ペプチドp99（アミノ酸99位〜1
26位）とc100の組合せではない、を含む、組成物。
【請求項２】以下からなる群から選択される第3HCV抗
原：（ｉ）HCVポリタンパク質のNS3ドメイン由来のエピトー
プを含むHCV抗原；（ii）HCVポリタンパク質のNS4ドメインからのエピトー
プを含むHCV抗原；（iii）HCVポリタンパク質のＳドメインからのエピトー
プを含むHCV抗原；および（iv）HCVポリタンパク質のNS5ドメインからのエピトー
プを含むHCV抗原、をさらに含み、ここで、前記第2HCV
抗原と該第3HCV抗原とは、HCVポリタンパク質の異なる
ドメインからのエピトープを含む、請求項１に記載の組
成物。
【請求項３】前記第2HCV抗原が、HCVポリタンパク質のN
S3ドメインからのエピトープを有する、請求項１または
２に記載の組成物。
【請求項４】前記第2HCV抗原が、HCVポリタンパク質のN
S4ドメインからのエピトープを有する、請求項１または
２に記載の組成物。
【請求項５】前記第2HCV抗原が、HCVポリタンパク質の
Ｓドメインからのエピトープを有する、請求項１または
２に記載の組成物。
【請求項６】前記第2HCV抗原が、HCVポリタンパク質のN
S5ドメインからのエピトープを有する、請求項１または
２に記載の組成物。
【請求項７】前記組合せが、融合ポリペプチドの形態で
ある、請求項１、２、３、４、５、または６に記載の組
成物。
【請求項８】前記組合せが、前記第1HCV抗原および前記
第2HCV抗原のそれぞれが共通の固体マトリックスに結合
した形態である、請求項１、２、３、４、５、または６
に記載の組成物。
【請求項９】前記組合せが、前記第1HCV抗原と、前記第
2HCV抗原との混合物の形態である、請求項１、２、３、
４、５、または６に記載の組成物。
【請求項１０】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対する抗体
を含むと思われる哺乳類体成分において、該抗体を検出
する方法であって、抗原抗体反応を起こさせる条件下
で、該哺乳類体成分を請求項１〜９のいずれかに記載の
組成物に接触させる工程；および該抗体と該組成物中の
HCV抗原との免疫複合体の存在を検出する工程、を包含
する方法。
【請求項１１】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対する抗体
を含むと思われる哺乳類体成分において、該抗体を検出
する方法であって、抗原抗体反応を起こさせる条件下で、該哺乳類体成分
を、以下の（ａ）および（ｂ）を含む化学的合成または
組換え発現により生成されるHCV抗原のパネルに接触さ
せる工程：（ａ）HCVポリタンパク質のＣドメインからのエピトー
プを含む第1HCV抗原；および（ｂ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの
別のHCV抗原：（ｉ）HCVポリタンパク質のNS3ドメインからのエピトー
プを含むHCV抗原；（ii）HCVポリタンパク質のNS4ドメインからのエピトー
プを含むHCV抗原；（iii）HCVポリタンパク質のＳドメインからのエピトー
プを含むHCV抗原；および（iv）HCVポリタンパク質のNS5ドメインからのエピトー
プを含むHCV抗原、ただし、（ａ）および（ｂ）の組合
せは、ペプチドp1（アミノ酸１位〜75位）とc100、ペプ
チドp35（アミノ酸35位〜75位）とc100、ペプチドp99
（アミノ酸99位〜126位）とc100の組合せではない；な
らびに該抗体および該HCV抗原の免疫複合体の存在を検出する
工程、を包含する方法。
【請求項１２】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対する抗体
を含むと思われる哺乳類体成分において、該抗体を検出
するアッセイを実施するためのキットであって、パッケ
ージされた状態で、（ａ）請求項１〜９のいずれかに記載の組成物、（ｂ）標準コントロール試薬、および（ｃ）該アッセイを実施するための指導書、を組合せて含む、キット。