JP2708590B2 - 生物学的に活性な分子が固定化された酵素膜，ｅｌｉｓａ膜，センサ膜 - Google Patents
生物学的に活性な分子が固定化された酵素膜，ｅｌｉｓａ膜，センサ膜Info
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- G—PHYSICS
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的に活性な分子が固定化された酵素
膜、ELISA膜、センサ膜に関し、更に詳しくは担体とし
て、平坦な、彎曲した、円筒状の、又は胞状の表面に沿
って伸び、かつ１ないし50nmの格子定数を有する結晶格
子に沿って配列された蛋白質分子から構成された少なく
とも１層から成る膜を使用することによって、生物学的
に活性な分子が上記蛋白質に由来する膜上の官能基と直
接共有結合することで固定化された酵素膜、ELISA膜、
センサ膜において、得られた膜は、固定化された分子の
均一な分布及び固定化された分子の官能基の一定の方向
性を有することを特徴とする、上記固定化膜に関する。
この場合、固定化として沈積を行うこともできる。
膜、ELISA膜、センサ膜に関し、更に詳しくは担体とし
て、平坦な、彎曲した、円筒状の、又は胞状の表面に沿
って伸び、かつ１ないし50nmの格子定数を有する結晶格
子に沿って配列された蛋白質分子から構成された少なく
とも１層から成る膜を使用することによって、生物学的
に活性な分子が上記蛋白質に由来する膜上の官能基と直
接共有結合することで固定化された酵素膜、ELISA膜、
センサ膜において、得られた膜は、固定化された分子の
均一な分布及び固定化された分子の官能基の一定の方向
性を有することを特徴とする、上記固定化膜に関する。
この場合、固定化として沈積を行うこともできる。
これまで種々の巨大分子を固定化するたに種々の化学
構造（アガロース、改質されたポリアクリルアミド等）
のスポンジ状構造のポリマー（ゲル）が使用されてい
る。このゲル体中の異なった分子量を有する重合物鎖の
偶然的配列に基づいて、存在する各官能基は一定のポジ
ションも特定の配向も有しない。ゲル母材の表面及びそ
の内部にるおける各官能基の分布は従って「偶然的」で
ある。これらの官能基が巨大分子の固定化のために活性
化されるときは、異分子の配列も「偶然的」分布で起
る。
構造（アガロース、改質されたポリアクリルアミド等）
のスポンジ状構造のポリマー（ゲル）が使用されてい
る。このゲル体中の異なった分子量を有する重合物鎖の
偶然的配列に基づいて、存在する各官能基は一定のポジ
ションも特定の配向も有しない。ゲル母材の表面及びそ
の内部にるおける各官能基の分布は従って「偶然的」で
ある。これらの官能基が巨大分子の固定化のために活性
化されるときは、異分子の配列も「偶然的」分布で起
る。
いわゆる試験紙技術（例えば血糖値又は尿糖値の検出
のためのグルコース試験棒等）のためには種々の酵素を
溶解された形で定品質紙に吸収させて乾燥させる。上述
したゲルの場合と同様にこの場合にも各種異分子はその
紙の比較的粗大な繊維母材中に統計的分布状態で存在す
る。もう一つの欠点はそれら酵素が共有結合で結合して
おらず、従って水性環境内で実験する場合に酵素の損失
を来すことがあることである。これによってその被分析
物を定量できる可能性はもはや保証されない。
のためのグルコース試験棒等）のためには種々の酵素を
溶解された形で定品質紙に吸収させて乾燥させる。上述
したゲルの場合と同様にこの場合にも各種異分子はその
紙の比較的粗大な繊維母材中に統計的分布状態で存在す
る。もう一つの欠点はそれら酵素が共有結合で結合して
おらず、従って水性環境内で実験する場合に酵素の損失
を来すことがあることである。これによってその被分析
物を定量できる可能性はもはや保証されない。
一方において種々の異分子の共有結合的な結合を確実
にするとともに、他方において薄い担体膜を持たせるた
めに、血清アルブミン又はコラーゲンからなる種々の蛋
白質膜が作り出されている。グルタルアルデヒドを導入
することによってその蛋白質膜を架橋化することがで
き、そして同時に各種異分子を共有結合的に結合させる
ことができるようになった。しかしながらこのような方
法によっても各種異分子を単分子層として特定のポジシ
ョン及び特定の配向において担体膜の上に共有結合的に
結合させることは未だ達成されていなかった。
にするとともに、他方において薄い担体膜を持たせるた
めに、血清アルブミン又はコラーゲンからなる種々の蛋
白質膜が作り出されている。グルタルアルデヒドを導入
することによってその蛋白質膜を架橋化することがで
き、そして同時に各種異分子を共有結合的に結合させる
ことができるようになった。しかしながらこのような方
法によっても各種異分子を単分子層として特定のポジシ
ョン及び特定の配向において担体膜の上に共有結合的に
結合させることは未だ達成されていなかった。
本発明によれば、平坦な、弯曲した、円筒状の、又は
胞状の表面に沿って伸びて、蛋白質を含む同一分子の少
なくとも１層よりなる膜を有する構造体が担体として用
いられるが、その際それら分子が１ないし50nmの格子定
数の結晶格子の形で配列されているものである。これに
よって、自由表面をその結合されるべき分子ができるだ
け密に占めるような態様でその固定された各分子が常
に、基質と結合するそれら表面の上に空間的に一定の配
置において配列されていると言うことが達成される。そ
れら蛋白質の各反応性官能基は従ってそのポリペプチド
鎖の中で厳密に定められたポジションを取るばかりでな
く、その蛋白質分子の折り畳みによってその結晶格子の
中で厳密に確定された位置及び配向をも有する。このこ
とはまたその膜の上に場合によりなお存在する炭水化物
部分及びそのヒドロキシル基についても当てはまる。
胞状の表面に沿って伸びて、蛋白質を含む同一分子の少
なくとも１層よりなる膜を有する構造体が担体として用
いられるが、その際それら分子が１ないし50nmの格子定
数の結晶格子の形で配列されているものである。これに
よって、自由表面をその結合されるべき分子ができるだ
け密に占めるような態様でその固定された各分子が常
に、基質と結合するそれら表面の上に空間的に一定の配
置において配列されていると言うことが達成される。そ
れら蛋白質の各反応性官能基は従ってそのポリペプチド
鎖の中で厳密に定められたポジションを取るばかりでな
く、その蛋白質分子の折り畳みによってその結晶格子の
中で厳密に確定された位置及び配向をも有する。このこ
とはまたその膜の上に場合によりなお存在する炭水化物
部分及びそのヒドロキシル基についても当てはまる。
有利には0.5ないし40nmの直径の空孔を有する膜を用
いることができる。それら空孔の存在によって、基質の
処理はまた、これがこの膜を貫通してゆっくりと通り抜
け、その際次にこの通過の間又は表面に沿って移動する
間にその膜の上に固定化された各分子による所望の反応
が行なわれるようにも達成することができる。更にそれ
とともに、それら空孔によってその処理されるべき基質
が膜の両側に到達し、次いで反応することができるの
で、この膜はそれら分子又は物質によって覆われていて
もよいと言うことも達成される。
いることができる。それら空孔の存在によって、基質の
処理はまた、これがこの膜を貫通してゆっくりと通り抜
け、その際次にこの通過の間又は表面に沿って移動する
間にその膜の上に固定化された各分子による所望の反応
が行なわれるようにも達成することができる。更にそれ
とともに、それら空孔によってその処理されるべき基質
が膜の両側に到達し、次いで反応することができるの
で、この膜はそれら分子又は物質によって覆われていて
もよいと言うことも達成される。
この膜の表面特性の変化のためにこの膜の上に蛋白質
分子及び／又はペプチド分子を固定化することができ
る。これによって中でも表面の増大が達成され、それに
よって更に別な種々の分子の固定化のために追加的な空
間が作り出され、これはその蛋白質分子及び／又はペプ
チド分子の上記の特定的配列に基いて同様に厳密に定義
される空間構造を有する。更に、それによって、その表
面が親水性か疎水性かになることも達成できる。表面特
性をこのように変えることによって中でもそれらの膜が
僅かな非特異的吸着しか示さないと言うことも達成され
る。また、同様な諸性質を膜の上に糖蛋白質分子及び／
又はグリコペプチド分子を固定化することによっても得
ることができる。同様にまた、膜の上に多糖類及び／又
はオリゴ糖類及び／又は糖類を固定することもでき、そ
の際これら全ての分子は後での使用目的に従って採用す
ることができる。
分子及び／又はペプチド分子を固定化することができ
る。これによって中でも表面の増大が達成され、それに
よって更に別な種々の分子の固定化のために追加的な空
間が作り出され、これはその蛋白質分子及び／又はペプ
チド分子の上記の特定的配列に基いて同様に厳密に定義
される空間構造を有する。更に、それによって、その表
面が親水性か疎水性かになることも達成できる。表面特
性をこのように変えることによって中でもそれらの膜が
僅かな非特異的吸着しか示さないと言うことも達成され
る。また、同様な諸性質を膜の上に糖蛋白質分子及び／
又はグリコペプチド分子を固定化することによっても得
ることができる。同様にまた、膜の上に多糖類及び／又
はオリゴ糖類及び／又は糖類を固定することもでき、そ
の際これら全ての分子は後での使用目的に従って採用す
ることができる。
しかしながらこのような特性を得るためにリピド分子
を固定化させることも可能であり、その際これらの分子
は追加的に、例えばラングミュア・プロジェット膜のよ
うな単分子リピド層を載せるためにも使用することがで
き、或はまた他の種々のポリマー層、中でも種々の疎水
性膜の担体として使用することも可能である。若干の特
別な目的のためにはまた、その膜の上に上述の各作用を
同様に発揮させることのできるリボ多糖を固定化させる
ことも可能である。
を固定化させることも可能であり、その際これらの分子
は追加的に、例えばラングミュア・プロジェット膜のよ
うな単分子リピド層を載せるためにも使用することがで
き、或はまた他の種々のポリマー層、中でも種々の疎水
性膜の担体として使用することも可能である。若干の特
別な目的のためにはまた、その膜の上に上述の各作用を
同様に発揮させることのできるリボ多糖を固定化させる
ことも可能である。
諸酵素反応を使用するためにはその膜の上に酵素及び
／又は補酵素を固定化させることができる。本発明に従
う膜をバイオテクノロジーの諸目的に使用すべきときは
その膜の上に抗原、抗体、レクチン、ビオチン、アビジ
ン、プロテインＡ及びハプテンを含む群の内の一つの物
質を固定化させることができる。特定の目的について、
中でも遺伝子工学におけるハイブリッド化試験用及びゾ
ンデ分子として適している種々の核酸類も固定化させる
ことができる。
／又は補酵素を固定化させることができる。本発明に従
う膜をバイオテクノロジーの諸目的に使用すべきときは
その膜の上に抗原、抗体、レクチン、ビオチン、アビジ
ン、プロテインＡ及びハプテンを含む群の内の一つの物
質を固定化させることができる。特定の目的について、
中でも遺伝子工学におけるハイブリッド化試験用及びゾ
ンデ分子として適している種々の核酸類も固定化させる
ことができる。
この膜の上の種々の染料、中でも蛍光染料を固定化し
た場合には本発明に従う膜は例えば指示薬膜又は特に光
電子工業的評価（光学センサ）に適した膜として使用す
ることも可能である。この場合にそのような評価のため
にはそれぞれの膜が異なった染料を有してそれにより同
時に異なった反応を検出できるような１群の膜を使用す
ることも可能である。
た場合には本発明に従う膜は例えば指示薬膜又は特に光
電子工業的評価（光学センサ）に適した膜として使用す
ることも可能である。この場合にそのような評価のため
にはそれぞれの膜が異なった染料を有してそれにより同
時に異なった反応を検出できるような１群の膜を使用す
ることも可能である。
この膜の上に金、白金、炭素又はポリビニルピロリド
ンを固定化、又は沈積させることができる。これによっ
てそれらの膜を種々のセンサ、中でも例えば生物学的電
界効果トランジスタ又は化学的電界効果トランジスタと
して利用する可能性が与えられ、と言うのはその作り出
された構造体がイオン選択性があって、従っていわゆる
イオン選択的電界効果トランジスタ（ISFET）として使
用できるからである。構造体や物理的諸特性の制御のた
めや膜の上での合金の形成のために種々の物質の混合物
や多数の物質の個別の層を沈積させることも可能であ
る。媒質からの制御された電子転移又はイオンの取り出
しを達成するためにその膜の上にフエロセン又はNAHD2
を固定化させることも可能である。酵素的に規制される
種々の過程において用いた各酵素の回収を容易にするた
めに種々の酵素及び／又は補酵素を固定化して有してい
るような膜を酵素膜として使用することができる。この
場合に、基質はこの酵素膜と接触させるか、又はこの膜
が胞状の形のものであるときはそれらの胞状体を基質中
に濁懸させ、それによって次に反応終了の後で基質を膜
と分離し、又はその胞状体を例えば濾過によって分離す
ることができる。
ンを固定化、又は沈積させることができる。これによっ
てそれらの膜を種々のセンサ、中でも例えば生物学的電
界効果トランジスタ又は化学的電界効果トランジスタと
して利用する可能性が与えられ、と言うのはその作り出
された構造体がイオン選択性があって、従っていわゆる
イオン選択的電界効果トランジスタ（ISFET）として使
用できるからである。構造体や物理的諸特性の制御のた
めや膜の上での合金の形成のために種々の物質の混合物
や多数の物質の個別の層を沈積させることも可能であ
る。媒質からの制御された電子転移又はイオンの取り出
しを達成するためにその膜の上にフエロセン又はNAHD2
を固定化させることも可能である。酵素的に規制される
種々の過程において用いた各酵素の回収を容易にするた
めに種々の酵素及び／又は補酵素を固定化して有してい
るような膜を酵素膜として使用することができる。この
場合に、基質はこの酵素膜と接触させるか、又はこの膜
が胞状の形のものであるときはそれらの胞状体を基質中
に濁懸させ、それによって次に反応終了の後で基質を膜
と分離し、又はその胞状体を例えば濾過によって分離す
ることができる。
特に好ましい態様において、抗原、抗体、レクチン、
ビオチン、アビジン、プロテインＡ又はハプテンを固定
化して有している膜がELISA−膜として使用できる。種
々の診断的反応を行なうために診断薬として種々の酵素
類又は補酵素類、抗原類、抗体類、ビオチン、アビジ
ン、レクチン、プロテインＡ、ハプテン、種々の核酸類
又はフエロセン又はHAHD2の固定化された膜を使用する
ことができる。中でも酵素類の場合には生物発光反応が
興味あるものであり、と言うのはそれによって種々の反
応の光学的評価が可能になるからである。酵素類並びに
補酵素類、抗原類、抗体類、ビオチン、アビジン、レク
チン類、プロテインＡ、ハプテン類、核酸類、フエロセ
ン又はNAHD2の固定化されている膜は、存在する各種成
分に対して種々の物質を試験するために直接使用できる
ようなセンサ膜として用いることも可能である。幾つか
の特定の形態の信号取り出し、中でもレドックス系のた
めの信号取り出しのためにはその膜の上に固定化された
各物質とその膜とに例えば金属又は導電性合成樹脂のよ
うな導電性層を設けることができる。このような導電性
層はスパッタリングによって特に簡単に形成することが
できる。最後に、合成樹脂層はまたプラズマ重合によっ
て形成することも可能である。
ビオチン、アビジン、プロテインＡ又はハプテンを固定
化して有している膜がELISA−膜として使用できる。種
々の診断的反応を行なうために診断薬として種々の酵素
類又は補酵素類、抗原類、抗体類、ビオチン、アビジ
ン、レクチン、プロテインＡ、ハプテン、種々の核酸類
又はフエロセン又はHAHD2の固定化された膜を使用する
ことができる。中でも酵素類の場合には生物発光反応が
興味あるものであり、と言うのはそれによって種々の反
応の光学的評価が可能になるからである。酵素類並びに
補酵素類、抗原類、抗体類、ビオチン、アビジン、レク
チン類、プロテインＡ、ハプテン類、核酸類、フエロセ
ン又はNAHD2の固定化されている膜は、存在する各種成
分に対して種々の物質を試験するために直接使用できる
ようなセンサ膜として用いることも可能である。幾つか
の特定の形態の信号取り出し、中でもレドックス系のた
めの信号取り出しのためにはその膜の上に固定化された
各物質とその膜とに例えば金属又は導電性合成樹脂のよ
うな導電性層を設けることができる。このような導電性
層はスパッタリングによって特に簡単に形成することが
できる。最後に、合成樹脂層はまたプラズマ重合によっ
て形成することも可能である。
特に薬理作用物質の場合にはその沈積され、又は固定
化された物質を制御して放出させるためにこれら物質を
膜の中に包み込んでしまうことができる。
化された物質を制御して放出させるためにこれら物質を
膜の中に包み込んでしまうことができる。
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。
例１ 結晶化した蛋白質膜（Ｓ層）の上へのポリ−Ｌ−リジン
の固定化 クロストリジウム・テルモヒドロスルフリクムＬ−11
1−69の結晶性蛋白質膜よりなる胞状構造体を安定化す
るためにグルタルアルデヒドで架橋化させる。このため
にそれら胞状構造体の湿潤ペレット（20000gにおいて遠
心分離して得られる）の0.5gをpH7.2の0.1Mカコジル酸
ナトリウム緩衝液50ml中に懸濁させ、そして0.5mlのグ
ルタルアルデヒド（50％）の添加の後に20℃において20
分間保持する。エタノールアミンの添加によって反応を
停止させた後にこの懸濁液を2000gにおいて遠心分離
し、蒸留水で３回洗浄し、そして改めてペレット化す
る。カルボキシル基を化学的に活性化するためにこの得
られたペレットの0.2gを8mlの蒸留水中に懸濁させ、こ
れに60mgの１−エチル−3,3′−ジメチル（アミノプロ
ピル）カルボジイミド（以下EDCと略記する）を添加
し、この懸濁液のpH値を0.1N NaOH又は0.1N HClの添加
によって4.63に調節し、そしてこのpH値を80分間継続す
る反応の間中一定に維持する。20000gにおいて遠心分離
した後にそのペレットを氷冷した蒸留水で洗浄し、そし
てあらためて20000gにおいて遠心分離した後でポリ−Ｌ
−リジンの溶液（分子量30000、蒸留水1ml当り2mg）の
中に懸濁させる。20℃において４時間保った後に共有結
合的に結合していないリジンを除去するために蒸留水
で、次いで0.1Mの燐酸カリウム緩衝液（PH＝7.0）で洗
浄する。
の固定化 クロストリジウム・テルモヒドロスルフリクムＬ−11
1−69の結晶性蛋白質膜よりなる胞状構造体を安定化す
るためにグルタルアルデヒドで架橋化させる。このため
にそれら胞状構造体の湿潤ペレット（20000gにおいて遠
心分離して得られる）の0.5gをpH7.2の0.1Mカコジル酸
ナトリウム緩衝液50ml中に懸濁させ、そして0.5mlのグ
ルタルアルデヒド（50％）の添加の後に20℃において20
分間保持する。エタノールアミンの添加によって反応を
停止させた後にこの懸濁液を2000gにおいて遠心分離
し、蒸留水で３回洗浄し、そして改めてペレット化す
る。カルボキシル基を化学的に活性化するためにこの得
られたペレットの0.2gを8mlの蒸留水中に懸濁させ、こ
れに60mgの１−エチル−3,3′−ジメチル（アミノプロ
ピル）カルボジイミド（以下EDCと略記する）を添加
し、この懸濁液のpH値を0.1N NaOH又は0.1N HClの添加
によって4.63に調節し、そしてこのpH値を80分間継続す
る反応の間中一定に維持する。20000gにおいて遠心分離
した後にそのペレットを氷冷した蒸留水で洗浄し、そし
てあらためて20000gにおいて遠心分離した後でポリ−Ｌ
−リジンの溶液（分子量30000、蒸留水1ml当り2mg）の
中に懸濁させる。20℃において４時間保った後に共有結
合的に結合していないリジンを除去するために蒸留水
で、次いで0.1Mの燐酸カリウム緩衝液（PH＝7.0）で洗
浄する。
ポリ−Ｌ−リジンの固定によってそのポリマー中に存
在するリジン基の遊離アミノ基に基づきその胞状構造体
（蛋白質断片）の表面特性を強制的に変化させ、そして
正の総合荷電を形成させることができる。加えて、それ
ら存在するアミノ基は他の種々の異分子を固定化するた
めに活性化させることができる。
在するリジン基の遊離アミノ基に基づきその胞状構造体
（蛋白質断片）の表面特性を強制的に変化させ、そして
正の総合荷電を形成させることができる。加えて、それ
ら存在するアミノ基は他の種々の異分子を固定化するた
めに活性化させることができる。
例２ ホスファチジルエタノールアミンの固定 種々の胞状構造体を上記のように、化学的安定化のた
めにグルタルアルデヒドで架橋化し、そしてその結晶性
母材の上に存在するカルボキシル基をEDCで活性化す
る。80分間の活性化時間の後にこの懸濁液を20000gにお
いて遠心分離し、そしてペレットを４℃の温度において
ジオキサンで洗浄して改めて沈降させる。次にこのペレ
ットをフォスファチジルエタノールアミン（以下PEと略
記する）の溶液（3mg/mlジオキサン）の中に溶解して20
℃において20時間保持する。共有結合によって結合しな
かったPEを除去するためにその胞状構造体を遠心分離し
た後、ジオキサンで５回、そして次いでクロロホルム／
メタノール（50/60）で洗浄する。PEの遊離アミノ基と
Ｓ層の蛋白質とカルボキシル基との反応によってPEはそ
の親水性部分が膜表面に向けられる態様でその結晶性母
材を結合し、一方疎水性の残りの部分は外側へ曝された
ままに留まると言うことがもたらされる。そのように形
成された疎水性の表面は界面活性剤（例えばアラキン酸
等）の単一層を積層させるのに役立ち、この層は次いで
それ自身の疎水性部分を結合させ、一方その親水性部分
は外側へ曝される。次にアラキン酸の単一膜をその上に
更に積層することが可能であり、その際今度はそれらの
分子はその親水性側が結合する。このような原理に従っ
て結晶状に配列された胞状構造体の表面上に界面活性性
剤分子の多数の単一層を積層することができる。
めにグルタルアルデヒドで架橋化し、そしてその結晶性
母材の上に存在するカルボキシル基をEDCで活性化す
る。80分間の活性化時間の後にこの懸濁液を20000gにお
いて遠心分離し、そしてペレットを４℃の温度において
ジオキサンで洗浄して改めて沈降させる。次にこのペレ
ットをフォスファチジルエタノールアミン（以下PEと略
記する）の溶液（3mg/mlジオキサン）の中に溶解して20
℃において20時間保持する。共有結合によって結合しな
かったPEを除去するためにその胞状構造体を遠心分離し
た後、ジオキサンで５回、そして次いでクロロホルム／
メタノール（50/60）で洗浄する。PEの遊離アミノ基と
Ｓ層の蛋白質とカルボキシル基との反応によってPEはそ
の親水性部分が膜表面に向けられる態様でその結晶性母
材を結合し、一方疎水性の残りの部分は外側へ曝された
ままに留まると言うことがもたらされる。そのように形
成された疎水性の表面は界面活性剤（例えばアラキン酸
等）の単一層を積層させるのに役立ち、この層は次いで
それ自身の疎水性部分を結合させ、一方その親水性部分
は外側へ曝される。次にアラキン酸の単一膜をその上に
更に積層することが可能であり、その際今度はそれらの
分子はその親水性側が結合する。このような原理に従っ
て結晶状に配列された胞状構造体の表面上に界面活性性
剤分子の多数の単一層を積層することができる。
例３ 種々の結晶性胞状構造体の上へのグルコースオキシダー
ゼの固定化 グルコースオキシダーゼを固定化するために種々の胞
状構造体を前述のようにグルタルアルデヒドで架橋化
し、そして次にその結晶格子中に存在するカルボキシル
基をEDCで活性化する。氷水で洗浄し、あらためて20000
gにおいて遠心分離した後にその胞状構造体の活性化さ
れたペレットをグルコースオキシダゼーの溶液（3mg/ml
蒸留水）の中に懸濁させて20℃において６時間反応させ
る。次にこの懸濁液を遠心分離し、そして例１に記述し
たと同様に共有結合により結合していない物質を除去す
るために洗浄する。この方法を用いて1mgのＳ層蛋白質
当り1mgのグルコースオキシダーゼを結合させることが
可能である。このことはｓ層のサブユニット当り１個の
グルコースオキシダーゼ分子を固定できることを意味
し、これは結晶性母材の上に異分子の最密充填に相当す
る。固定化されたグルコースオキシダーゼはその生の酵
素に比して50％の活性を示す。
ゼの固定化 グルコースオキシダーゼを固定化するために種々の胞
状構造体を前述のようにグルタルアルデヒドで架橋化
し、そして次にその結晶格子中に存在するカルボキシル
基をEDCで活性化する。氷水で洗浄し、あらためて20000
gにおいて遠心分離した後にその胞状構造体の活性化さ
れたペレットをグルコースオキシダゼーの溶液（3mg/ml
蒸留水）の中に懸濁させて20℃において６時間反応させ
る。次にこの懸濁液を遠心分離し、そして例１に記述し
たと同様に共有結合により結合していない物質を除去す
るために洗浄する。この方法を用いて1mgのＳ層蛋白質
当り1mgのグルコースオキシダーゼを結合させることが
可能である。このことはｓ層のサブユニット当り１個の
グルコースオキシダーゼ分子を固定できることを意味
し、これは結晶性母材の上に異分子の最密充填に相当す
る。固定化されたグルコースオキシダーゼはその生の酵
素に比して50％の活性を示す。
例４ 結晶性Ｓ層の金属層による沈着被覆 結晶の配列された膜（Ｓ層）を蒸留水の中に懸濁さ
せ、そして10mlの限外濾過セルの中で２バールの圧力の
もとに微孔質担体（孔直径0.1μｍのNuclepore社のポリ
カーボネートからなるマイコロ濾過膜）の上に沈積させ
る。次に個々の膜断片をグルタルアルデヒドにより（pH
7.0の0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中0.5％）架橋化
させる。20分間の反応時間の後で蒸留水で洗浄すること
により過剰の反応剤を除去し、その沈積した蛋白質断片
を有するマイクロ濾過膜を限外濾過セルから取り出して
空気乾燥する。次にこの構造体をスパッタコーター装置
（Polaron Instruments社）の中に置いて５×10-2Torr
の真空度まで減圧する。次に2000ボルトの電圧をかけて
約20mAの電流でその結晶性膜断片の表面上に金をスパッ
タリング被覆し、それによって約40nmの厚さの連続した
金属層が形成される。スパッタコーター装置から取り出
した後にその構造体をクロロホルムの満たされているビ
ーカーの中に注意深く移してこれをそのポリカーボネー
ト／担体膜がその液体と直接接触するように置き、それ
によって存在するポリマーを溶解させる。このようにし
するとその液体方面に極めて薄い構造体が残留し、これ
は上記の金層とその下に存在するＳ層断片とからなる。
次にこの構造体は注意深く持ちあげて任意の表面の上に
載せることができる。結晶状に配列された膜断片の上へ
の金のスパッタリング被覆によって金属と担体との間の
直接の接触を達成することが可能である。
せ、そして10mlの限外濾過セルの中で２バールの圧力の
もとに微孔質担体（孔直径0.1μｍのNuclepore社のポリ
カーボネートからなるマイコロ濾過膜）の上に沈積させ
る。次に個々の膜断片をグルタルアルデヒドにより（pH
7.0の0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中0.5％）架橋化
させる。20分間の反応時間の後で蒸留水で洗浄すること
により過剰の反応剤を除去し、その沈積した蛋白質断片
を有するマイクロ濾過膜を限外濾過セルから取り出して
空気乾燥する。次にこの構造体をスパッタコーター装置
（Polaron Instruments社）の中に置いて５×10-2Torr
の真空度まで減圧する。次に2000ボルトの電圧をかけて
約20mAの電流でその結晶性膜断片の表面上に金をスパッ
タリング被覆し、それによって約40nmの厚さの連続した
金属層が形成される。スパッタコーター装置から取り出
した後にその構造体をクロロホルムの満たされているビ
ーカーの中に注意深く移してこれをそのポリカーボネー
ト／担体膜がその液体と直接接触するように置き、それ
によって存在するポリマーを溶解させる。このようにし
するとその液体方面に極めて薄い構造体が残留し、これ
は上記の金層とその下に存在するＳ層断片とからなる。
次にこの構造体は注意深く持ちあげて任意の表面の上に
載せることができる。結晶状に配列された膜断片の上へ
の金のスパッタリング被覆によって金属と担体との間の
直接の接触を達成することが可能である。
例５ 結晶状に配列された構造体の上への蛍光染料の固定化 蛋白質サブユニットよりなる胞状構造体をpH感受性染
料である蛍光染料７−ヒドロキシ−クマリン−３−カル
ボン酸（HCCと略記する）を共有結合的に結合させるた
めに用いる。この染料50mgを蒸留水中に溶解し、pHを0.
1N HCl又は0.1N NaOHに添加によって4.75に調節し、そ
して次に20mgのEDCを加える。HCCのカルボキシル基を80
分間の反応時間の間に活性化させた後にこの混合物を胞
状構造体の湿潤ペレット（20000gでの遠心分離によって
得られた）の0.5gと混合し、そしてこの懸濁液を20℃に
おいて２時間反応させる。この時間の間にHCCのEDC−活
性化されたカルボキシル基はＳ層の蛋白質の遊離のアミ
ノ基と反応することができ、そして染料は共有結合的に
その結晶性母材の上に結合される。過剰の反応剤を除去
するためにこの懸濁液を予めうるかしておいた透析チュ
ーブの中に移して４℃の温度において48時間にわたり蒸
留水に対して透析する。HCC又はEDCのような低分子量化
合物はこの透析の間に除去される。この懸濁液を次に遠
心分離し、蒸留水及び1 N NaClで非特異的に吸着した物
質を除去するために洗浄する。それら胞状構造体の上に
固定化された蛍光染料は対応的媒質中のpH値変化に対し
て、その発出する蛍光の波長の変化によって反応する。
料である蛍光染料７−ヒドロキシ−クマリン−３−カル
ボン酸（HCCと略記する）を共有結合的に結合させるた
めに用いる。この染料50mgを蒸留水中に溶解し、pHを0.
1N HCl又は0.1N NaOHに添加によって4.75に調節し、そ
して次に20mgのEDCを加える。HCCのカルボキシル基を80
分間の反応時間の間に活性化させた後にこの混合物を胞
状構造体の湿潤ペレット（20000gでの遠心分離によって
得られた）の0.5gと混合し、そしてこの懸濁液を20℃に
おいて２時間反応させる。この時間の間にHCCのEDC−活
性化されたカルボキシル基はＳ層の蛋白質の遊離のアミ
ノ基と反応することができ、そして染料は共有結合的に
その結晶性母材の上に結合される。過剰の反応剤を除去
するためにこの懸濁液を予めうるかしておいた透析チュ
ーブの中に移して４℃の温度において48時間にわたり蒸
留水に対して透析する。HCC又はEDCのような低分子量化
合物はこの透析の間に除去される。この懸濁液を次に遠
心分離し、蒸留水及び1 N NaClで非特異的に吸着した物
質を除去するために洗浄する。それら胞状構造体の上に
固定化された蛍光染料は対応的媒質中のpH値変化に対し
て、その発出する蛍光の波長の変化によって反応する。
例６ 結晶性蛋白質断片上へのグルコースオキシダーゼの固定
及び金属層による被覆 微孔質担体（Pall社のナイロンよりなる、空孔直径0.
1mのマイクロ濾過膜）の上に沈着させた結晶状配列の蛋
白質断片の上へのグルコースオキシダーゼの固定化を行
なう。マイクロ濾過膜を直径25mmの限外濾過セルの中に
置き、そして蛋白質断片を含んでいる懸濁液3mlをその
膜の表面上にピペット滴下する。その多孔質担体膜の上
に２バールの圧力をかけて蛋白質断片を沈着させた後に
その存在する蛋白質をグルタルアルデヒドの添加（pH7.
2の0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中0.5％）によって
共有結合的に架橋化させる。この膜を蒸留水で洗浄した
後にこれを限外濾過セルから取り出して10mlの蒸留水が
含まれているビーカーの中に入れる。カルボキシル基を
活性化するために50mgのEDCを加えた後にそのpH値を次
の80分間の間4.65の値に一定に保つ。それら膜を氷水中
に浸漬することによって過剰の反応剤を除去することが
できる。この膜を次にその蛋白質断片の沈着した側が上
側を向くように限外濾過セルの中に入れる。次いで2ml
のグルコースオキシダーゼ溶液（2mg/ml）を加え、そし
て酵素を共有結合的に結合させるために20℃において２
時間保持する。共有結合的に結合しなかった酵素は蒸留
水及び緩衝液（前述と同じ）によって洗浄することによ
り除去することができる。限外濾過セルから膜を取り出
したあとでこれを空気乾燥させ、スパッタコーター装置
（Polaron Instruments社）の中に置き、そして５×10
-2Torrの圧力において20mAの電流で２分間白金をスパッ
タリング被覆する。30nmの厚さを有する金属層は結晶性
マトリックスの上に最密充填的に結合されている上記酵
素と直接接触している。これにより、この酵素の上でそ
の酵素反応の間に生じた電子を直接白金層によって取り
出すことが可能である。
及び金属層による被覆 微孔質担体（Pall社のナイロンよりなる、空孔直径0.
1mのマイクロ濾過膜）の上に沈着させた結晶状配列の蛋
白質断片の上へのグルコースオキシダーゼの固定化を行
なう。マイクロ濾過膜を直径25mmの限外濾過セルの中に
置き、そして蛋白質断片を含んでいる懸濁液3mlをその
膜の表面上にピペット滴下する。その多孔質担体膜の上
に２バールの圧力をかけて蛋白質断片を沈着させた後に
その存在する蛋白質をグルタルアルデヒドの添加（pH7.
2の0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中0.5％）によって
共有結合的に架橋化させる。この膜を蒸留水で洗浄した
後にこれを限外濾過セルから取り出して10mlの蒸留水が
含まれているビーカーの中に入れる。カルボキシル基を
活性化するために50mgのEDCを加えた後にそのpH値を次
の80分間の間4.65の値に一定に保つ。それら膜を氷水中
に浸漬することによって過剰の反応剤を除去することが
できる。この膜を次にその蛋白質断片の沈着した側が上
側を向くように限外濾過セルの中に入れる。次いで2ml
のグルコースオキシダーゼ溶液（2mg/ml）を加え、そし
て酵素を共有結合的に結合させるために20℃において２
時間保持する。共有結合的に結合しなかった酵素は蒸留
水及び緩衝液（前述と同じ）によって洗浄することによ
り除去することができる。限外濾過セルから膜を取り出
したあとでこれを空気乾燥させ、スパッタコーター装置
（Polaron Instruments社）の中に置き、そして５×10
-2Torrの圧力において20mAの電流で２分間白金をスパッ
タリング被覆する。30nmの厚さを有する金属層は結晶性
マトリックスの上に最密充填的に結合されている上記酵
素と直接接触している。これにより、この酵素の上でそ
の酵素反応の間に生じた電子を直接白金層によって取り
出すことが可能である。
例７ 抗体を用いての診断用膜の製造 出発物質としての微孔質担体の上に結合されている蛋
白質断片を用いる。これら蛋白質断片の表面上に存在す
るカルボキシル基をEDCにより活性化する（その実施方
法は前記の各例参照）。次にこの活性化された膜を直径
25mmの限外濾過セルの中に入れ、そしてその膜の表面上
に2mlの抗体溶液（0.4mg/ml、ウィルス蛋白質に対して
作られた抗体Ａ）をピペットで載せて20℃において４時
間保持する。抗体溶液を傾瀉除去した後にその膜を限外
濾過セルから取り出してpH7.2の0.2M燐酸カリウム緩衝
液で洗浄する。抗体分子はその固定化の間に結晶性母材
の表面に単分子層の形で最密充填状に結合された。従っ
てこの抗体を沈着させた膜はウィルス蛋白質の検出に用
いることができる。そのためにはこの膜をウィルスの含
まれた液体と接触させて20℃において２時間保持する。
次に過剰の抗原を除去するためにpH7.2の0.2M燐酸カリ
ウム緩衝液及び蒸留水で洗浄する。次いでその結合して
いるウィルス蛋白質の量を定量的に評価するためにその
膜をビオチニル化した抗体Ａの含まれているもう一つの
溶液（0.1N重炭酸ナトリウム1ml当り0.1mg）の中に入
れ、そして30分間保持する。そのようにすればビオチニ
ル化した抗体はウィルス蛋白質のなお遊離しているハプ
テンと結合する。膜をその抗体溶液から取り出した後で
このものをpH8.0の0.1M燐酸塩緩衝液で20分間再び洗浄
する。次に定量的評価のためにパーオキシダーゼ／アビ
ジン接合物を用いる。アビジンは特異的なビオチンと結
合し、また従ってそれぞれのビオチニル化した抗体に結
合する。10分間の反応時間の後に膜を取り出してこれを
再び隣接塩緩衝液で20分間洗浄し、そして最後に染料ｏ
−ジアニシジンの1mgを含む0.01％濃度の過酸化水素溶
液1mlでその膜の上に滴加する。10分間の後に反応を5N
HClの添加によって停止させ、そして生じた染料を400nm
の波長において測定することにより定量する。対応的に
作った検量線の上でその結合したウィルス蛋白質の量を
求めることができる。
白質断片を用いる。これら蛋白質断片の表面上に存在す
るカルボキシル基をEDCにより活性化する（その実施方
法は前記の各例参照）。次にこの活性化された膜を直径
25mmの限外濾過セルの中に入れ、そしてその膜の表面上
に2mlの抗体溶液（0.4mg/ml、ウィルス蛋白質に対して
作られた抗体Ａ）をピペットで載せて20℃において４時
間保持する。抗体溶液を傾瀉除去した後にその膜を限外
濾過セルから取り出してpH7.2の0.2M燐酸カリウム緩衝
液で洗浄する。抗体分子はその固定化の間に結晶性母材
の表面に単分子層の形で最密充填状に結合された。従っ
てこの抗体を沈着させた膜はウィルス蛋白質の検出に用
いることができる。そのためにはこの膜をウィルスの含
まれた液体と接触させて20℃において２時間保持する。
次に過剰の抗原を除去するためにpH7.2の0.2M燐酸カリ
ウム緩衝液及び蒸留水で洗浄する。次いでその結合して
いるウィルス蛋白質の量を定量的に評価するためにその
膜をビオチニル化した抗体Ａの含まれているもう一つの
溶液（0.1N重炭酸ナトリウム1ml当り0.1mg）の中に入
れ、そして30分間保持する。そのようにすればビオチニ
ル化した抗体はウィルス蛋白質のなお遊離しているハプ
テンと結合する。膜をその抗体溶液から取り出した後で
このものをpH8.0の0.1M燐酸塩緩衝液で20分間再び洗浄
する。次に定量的評価のためにパーオキシダーゼ／アビ
ジン接合物を用いる。アビジンは特異的なビオチンと結
合し、また従ってそれぞれのビオチニル化した抗体に結
合する。10分間の反応時間の後に膜を取り出してこれを
再び隣接塩緩衝液で20分間洗浄し、そして最後に染料ｏ
−ジアニシジンの1mgを含む0.01％濃度の過酸化水素溶
液1mlでその膜の上に滴加する。10分間の後に反応を5N
HClの添加によって停止させ、そして生じた染料を400nm
の波長において測定することにより定量する。対応的に
作った検量線の上でその結合したウィルス蛋白質の量を
求めることができる。
結晶状に配列された蛋白質断片は、抗体Ａが或る一定
表面の上に最密充填状に結合することができ、それによ
って検査すべき蛋白質についての検出限界が対応的に低
いと言う利点をもたらす。
表面の上に最密充填状に結合することができ、それによ
って検査すべき蛋白質についての検出限界が対応的に低
いと言う利点をもたらす。
例８ 胞状構造体の上へのビオチニル化した蛋白質の固定化 蛋白質結晶よりなる胞状構造体を上述した方法に従っ
て化学的にグルタルアルデヒドにより架橋化させ、そし
てその表面に存在するカルボキシル基をEDCにより活性
化させる。EDCで活性化された湿潤したペレット0.1gを
ビオチニル化したオボアルブミンの溶液（蒸留水1ml当
り1mg）の2mlと混合し、そして20℃において２時間保
つ。次に20000gにおいて遠心分離し、そしてペレットを
pH7.0の燐酸カリウム緩衝液で５回洗浄する。結晶性母
材の蛋白質サブユニット当り２分子のビオチニル化オボ
アルブミンを結合することができ、これもまた結晶性母
材の上の異分子の細密充填に相当する。次にその固定化
されたビオチニル化オボアルブミンはアビジン−パーオ
キシダーゼ接合物の添加により、そして次にその発現し
た染料のパーオキシダーゼ活性による測定によって検出
することができる。このためにはビオチニル化オボアル
ブミンがその上に固定されている胞状構造体よりなる湿
潤ペレット50mgをpH8.5の0.1M重炭酸ナトリウム1ml中に
懸濁させ、そしてこれに200μの0.2％濃度のアビジン
−パーオキシダーゼ接合物を加える。20℃に20分間保持
した後に遠心分離し、そのペレットを0.2Mの燐酸カリウ
ム緩衝液（pH7.0）で５回洗浄し、そしてこのペレット
（胞状構造体と、ビオチニル化オボアルブミンと、及び
それに結合しているアジビン−パーオキシダーゼ接合物
とからなる）の20mgの1mgのｏ−ジアニシジンの含まれ
ている0.01％濃度の過酸化水素の溶液200μと混合す
る。発現した染料を上述と同様に定量する。
て化学的にグルタルアルデヒドにより架橋化させ、そし
てその表面に存在するカルボキシル基をEDCにより活性
化させる。EDCで活性化された湿潤したペレット0.1gを
ビオチニル化したオボアルブミンの溶液（蒸留水1ml当
り1mg）の2mlと混合し、そして20℃において２時間保
つ。次に20000gにおいて遠心分離し、そしてペレットを
pH7.0の燐酸カリウム緩衝液で５回洗浄する。結晶性母
材の蛋白質サブユニット当り２分子のビオチニル化オボ
アルブミンを結合することができ、これもまた結晶性母
材の上の異分子の細密充填に相当する。次にその固定化
されたビオチニル化オボアルブミンはアビジン−パーオ
キシダーゼ接合物の添加により、そして次にその発現し
た染料のパーオキシダーゼ活性による測定によって検出
することができる。このためにはビオチニル化オボアル
ブミンがその上に固定されている胞状構造体よりなる湿
潤ペレット50mgをpH8.5の0.1M重炭酸ナトリウム1ml中に
懸濁させ、そしてこれに200μの0.2％濃度のアビジン
−パーオキシダーゼ接合物を加える。20℃に20分間保持
した後に遠心分離し、そのペレットを0.2Mの燐酸カリウ
ム緩衝液（pH7.0）で５回洗浄し、そしてこのペレット
（胞状構造体と、ビオチニル化オボアルブミンと、及び
それに結合しているアジビン−パーオキシダーゼ接合物
とからなる）の20mgの1mgのｏ−ジアニシジンの含まれ
ている0.01％濃度の過酸化水素の溶液200μと混合す
る。発現した染料を上述と同様に定量する。
例９ エライサ（ELISA＝enzyme−linked immunosorbent assa
y）でＰ−膜（蛋白質膜）限外濾過膜としてＰ−膜断片
の利用 バシルス ステアロサーモフイルス（Bacillus stear
othermophilus）PV72からのＰ−膜限外濾過膜を記載し
た様に製造する。直径5mmの膜に穴をあけ、装置中に入
れる。この装置でＰ−膜断片から成る活性濾過層のみが
さらされる。次いでマトリックスの結晶性構造を伴う十
分に限定された位置でｐ−膜サブユニット上に存在する
遊離カルボキシル基をカルボジイミドで活性化する。こ
のために、１−エチル−3P3′（ジメチルアミノ）プロ
ピルカルボジイミド（EDC）60mgを蒸留水3ml中に溶解
し、溶液をＰ−膜断片の表面に移送する。80分後、限外
濾過膜を数回蒸留水で洗滌する。次いで蒸留水mlにつき
2mgのヒト血清アルブミン（HSA）を含有する溶液3mlを
装置に移し、膜を少なくとも３時間HSA−溶液と共に温
置する。膜は0.2M K−リン酸塩緩衝液（pH7）で少なく
とも30分間洗滌し、ゆるく吸着したHSA−分子を除去す
る。定量測定によってHSA72μｇをＰ−膜蛋白質100μｇ
につき結合することが認められる。この蛋白質はまさに
Ｐ−膜断片の表面上でHSA分子の単層の形成に相当す
る。50mM K−リン酸塩緩衝液（pH7）mlにつきIgG 50μ
ｇを含有する抗−HSA IgG（ウサギから）1mlを２時間20
℃でIgG溶液と共に温度する。再び0.2Mリン酸塩緩衝液
で膜表面を少なくとも30分間洗滌して、非特異的に吸着
したIgGを除く。ヤギ中で育てられた、パーオキシダー
ゼ標識された非−ウサギIgGを、膜表面と接触させる。
この目的のために、50mM K−リン酸塩緩衝液mlにつき接
合体20μｇを含有する溶液1mlを膜表面上に広げ、30分
間温置する。リン酸塩緩衝液でくり返し洗滌して過剰の
接合体を除去後、0.01％H2O2 1mlを０−ジアニジン6mg
を含有する膜表面に移す。３分後、反応を32％HC150μ
ｌの添加によって中止し、生じる色の吸収をELISA−フ
ォトメーターで400nmで測定する。得られた値は1.320の
範囲内にあり、これは通常のELISA−プレートを用いた
よりも高い。
y）でＰ−膜（蛋白質膜）限外濾過膜としてＰ−膜断片
の利用 バシルス ステアロサーモフイルス（Bacillus stear
othermophilus）PV72からのＰ−膜限外濾過膜を記載し
た様に製造する。直径5mmの膜に穴をあけ、装置中に入
れる。この装置でＰ−膜断片から成る活性濾過層のみが
さらされる。次いでマトリックスの結晶性構造を伴う十
分に限定された位置でｐ−膜サブユニット上に存在する
遊離カルボキシル基をカルボジイミドで活性化する。こ
のために、１−エチル−3P3′（ジメチルアミノ）プロ
ピルカルボジイミド（EDC）60mgを蒸留水3ml中に溶解
し、溶液をＰ−膜断片の表面に移送する。80分後、限外
濾過膜を数回蒸留水で洗滌する。次いで蒸留水mlにつき
2mgのヒト血清アルブミン（HSA）を含有する溶液3mlを
装置に移し、膜を少なくとも３時間HSA−溶液と共に温
置する。膜は0.2M K−リン酸塩緩衝液（pH7）で少なく
とも30分間洗滌し、ゆるく吸着したHSA−分子を除去す
る。定量測定によってHSA72μｇをＰ−膜蛋白質100μｇ
につき結合することが認められる。この蛋白質はまさに
Ｐ−膜断片の表面上でHSA分子の単層の形成に相当す
る。50mM K−リン酸塩緩衝液（pH7）mlにつきIgG 50μ
ｇを含有する抗−HSA IgG（ウサギから）1mlを２時間20
℃でIgG溶液と共に温度する。再び0.2Mリン酸塩緩衝液
で膜表面を少なくとも30分間洗滌して、非特異的に吸着
したIgGを除く。ヤギ中で育てられた、パーオキシダー
ゼ標識された非−ウサギIgGを、膜表面と接触させる。
この目的のために、50mM K−リン酸塩緩衝液mlにつき接
合体20μｇを含有する溶液1mlを膜表面上に広げ、30分
間温置する。リン酸塩緩衝液でくり返し洗滌して過剰の
接合体を除去後、0.01％H2O2 1mlを０−ジアニジン6mg
を含有する膜表面に移す。３分後、反応を32％HC150μ
ｌの添加によって中止し、生じる色の吸収をELISA−フ
ォトメーターで400nmで測定する。得られた値は1.320の
範囲内にあり、これは通常のELISA−プレートを用いた
よりも高い。
例10 Ｐ−膜断片をセンサ膜として使用 バシルススファエリクス（Bacillus sphaericus）CCM
2120からのＰ−膜を記載した様に製造する。懸濁液の
蛋白質含有量を決め、懸濁液を1mg/mlの蛋白質含有量に
希釈する。この懸濁液100μｌを、CaCl2溶液50ml（蒸留
水中で10mM）と混合する。この懸濁液20mlをＰ−膜限外
濾過膜の製造に使用する。このために直径62nmのマイク
ロ濾過膜（ヌクレポール（nuclepore、）細孔サイズ100
nm）を、限外濾過セル中に入れる。膜上に懸濁液20mlを
移した後、２バールの圧力をかけ、それによってＰ−膜
断片を平滑なヌクレポール膜の表面上に沈着させる。圧
力を除いた後、グルタルアルデヒド溶液10ml（0.1Mカコ
ジル酸ナトリウム緩衝液pH7中で５％）を、限外濾過セ
ル中に移す。２バールの圧力をかけて、グルタルアルデ
ヒド溶液を、マイクロ濾過膜上に沈着されたＰ−膜断片
に強制的に通し、隣接のＰ−膜断片の架橋を生じる。20
分後、過剰のグルタルアルデヒド溶液を除き、Ｐ−膜断
片から成る限外濾過膜を、広範囲で蒸留水で洗滌する。
次いでＰ−膜限外濾過膜をアルコールオキシダーゼの固
定に使用し、金属沈着を次に行う。Ｐ−膜断片上での遊
離カルボキシル基の活性化のために、EDC 60mgを蒸留水
中に溶解する。EDC−溶液を限外濾過セル中に入れる。8
0分後、EDC−溶液を捨て、膜表面を氷冷された蒸留水で
速やかに洗滌し、アルコールオキシダーゼ溶液5ml（2mg
/ml蒸留水）で４時間、20℃で温置する。次いで酵素溶
液を捨て、Ｐ−膜限外濾過膜を限外濾過セルから除き、
0.2M Kリン酸塩緩衝液pH7.2で少なくとも３時間洗滌す
る。次いで酵素−負荷された膜を減圧エキジシケーター
中で乾燥し、スプッタコーター装置（ポラロン インス
トルメント）中に置き、5000Paに排気する。電流20mAで
電圧2000Vを適用して、金をＰ−膜断片上の酵素単層の
表面上に沈着する。60秒後、厚さ10nmの密閉された金層
が得られる。酵素膜をフローインジエクシュン分析シス
テル（FIA）中に入れる。蒸留水100mlにつきエタノール
１〜10mgを含有する溶液を、装置によって酵素膜にポン
プ送入する。エタノールはマイクロ濾過膜を通過する及
びＰ−膜断片の細孔を通過するのに十分小さく、最後に
固定されたアルコールオキシダーゼ分子に到達する。エ
タールの酸化の間遊離されるエレクトロンは金層の直ち
に移行し、FIAのエレクトロンと密接に接触する。直線
性は蒸留水mlにつきエタノール１μｇ〜８μｇの間にあ
ることが分る。５μｇの場合、観察される電流は12mAで
ある。
2120からのＰ−膜を記載した様に製造する。懸濁液の
蛋白質含有量を決め、懸濁液を1mg/mlの蛋白質含有量に
希釈する。この懸濁液100μｌを、CaCl2溶液50ml（蒸留
水中で10mM）と混合する。この懸濁液20mlをＰ−膜限外
濾過膜の製造に使用する。このために直径62nmのマイク
ロ濾過膜（ヌクレポール（nuclepore、）細孔サイズ100
nm）を、限外濾過セル中に入れる。膜上に懸濁液20mlを
移した後、２バールの圧力をかけ、それによってＰ−膜
断片を平滑なヌクレポール膜の表面上に沈着させる。圧
力を除いた後、グルタルアルデヒド溶液10ml（0.1Mカコ
ジル酸ナトリウム緩衝液pH7中で５％）を、限外濾過セ
ル中に移す。２バールの圧力をかけて、グルタルアルデ
ヒド溶液を、マイクロ濾過膜上に沈着されたＰ−膜断片
に強制的に通し、隣接のＰ−膜断片の架橋を生じる。20
分後、過剰のグルタルアルデヒド溶液を除き、Ｐ−膜断
片から成る限外濾過膜を、広範囲で蒸留水で洗滌する。
次いでＰ−膜限外濾過膜をアルコールオキシダーゼの固
定に使用し、金属沈着を次に行う。Ｐ−膜断片上での遊
離カルボキシル基の活性化のために、EDC 60mgを蒸留水
中に溶解する。EDC−溶液を限外濾過セル中に入れる。8
0分後、EDC−溶液を捨て、膜表面を氷冷された蒸留水で
速やかに洗滌し、アルコールオキシダーゼ溶液5ml（2mg
/ml蒸留水）で４時間、20℃で温置する。次いで酵素溶
液を捨て、Ｐ−膜限外濾過膜を限外濾過セルから除き、
0.2M Kリン酸塩緩衝液pH7.2で少なくとも３時間洗滌す
る。次いで酵素−負荷された膜を減圧エキジシケーター
中で乾燥し、スプッタコーター装置（ポラロン インス
トルメント）中に置き、5000Paに排気する。電流20mAで
電圧2000Vを適用して、金をＰ−膜断片上の酵素単層の
表面上に沈着する。60秒後、厚さ10nmの密閉された金層
が得られる。酵素膜をフローインジエクシュン分析シス
テル（FIA）中に入れる。蒸留水100mlにつきエタノール
１〜10mgを含有する溶液を、装置によって酵素膜にポン
プ送入する。エタノールはマイクロ濾過膜を通過する及
びＰ−膜断片の細孔を通過するのに十分小さく、最後に
固定されたアルコールオキシダーゼ分子に到達する。エ
タールの酸化の間遊離されるエレクトロンは金層の直ち
に移行し、FIAのエレクトロンと密接に接触する。直線
性は蒸留水mlにつきエタノール１μｇ〜８μｇの間にあ
ることが分る。５μｇの場合、観察される電流は12mAで
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スライトル・ウーウェ・ベー オーストリア国、アー‐1170 ウイー ン、パルハメルプラッツ、10 (72)発明者 サラ・マルギット オーストリア国、アー‐1200 ウイー ン、フォルガルテンストラーセ、90／２ ／24 (56)参考文献 特開 昭62−501199（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−501619（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−124868（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−148015（ＪＰ，Ａ)
Claims (21)
- 【請求項１】担体として、平坦な、彎曲した、円筒状
の、又は胞状の表面に沿って伸び、かつ１ないし50nmの
格子定数を有する結晶格子に沿って配列された蛋白質分
子から構成された少なくとも１層から成る膜を使用する
ことによって、生物学的に活性な分子が上記蛋白質に由
来する膜上の官能基と直接共有結合することで固定化さ
れた酵素膜、ELISA膜、センサ膜において、得られた膜
は、固定化された分子の均一な分布及び固定化された分
子の官能基の一定の方向性を有することを特徴とする、
上記固定化膜。 - 【請求項２】固定化として、沈積を行う、請求の範囲１
記載の固定化膜。 - 【請求項３】膜が直径0.5ないし40nmの空孔を有する、
請求の範囲１又は２記載の固定化膜。 - 【請求項４】膜の上に蛋白質分子及び／又はペプチド分
子が固定化されている、請求の範囲１ないし３のいずれ
かに記載の固定化膜。 - 【請求項５】膜の上に糖蛋白質分子及び／又はグリコペ
プチド分子が固定化されている、請求項１又は２記載の
固定化膜。 - 【請求項６】膜の上に多糖及び／又はオリゴ糖及び／又
は糖が固定化されている、請求の範囲１ないし３のいず
れかに記載の固定化膜。 - 【請求項７】膜の上にリピド分子が固定化されている、
請求の範囲１ないし３のいずれかに記載の固定化膜。 - 【請求項８】膜の上にリポ多糖が固定化されている、請
求の範囲１ないし３のいずれかに記載の固定化膜。 - 【請求項９】膜の上に酵素及び／又は補酵素が固定化さ
れている、請求の範囲１ないし３のいずれかに記載の固
定化膜。 - 【請求項１０】膜の上に抗原、抗体、レクチン、ビオチ
ン、アビジン、プロテインＡ及びハプテンを含む群の物
質が固定化されている、請求の範囲１ないし３のいずれ
かに記載の固定化膜。 - 【請求項１１】膜の上に核酸類が固定化されている、請
求の範囲１ないし３のいずれかに記載の固定化膜。 - 【請求項１２】膜の上に染料、特に蛍光染料、又は染料
混合物が固定化されている、請求の範囲１ないし３のい
ずれかに記載の固定化膜。 - 【請求項１３】膜の上に、金、白金、炭素又はポリビニ
ルピロリドンが固定化される、請求の範囲１ないし３の
いずれかに記載の固定化膜。 - 【請求項１４】それら各物質の混合物又は多数の物質の
個別の層が固定化されている、請求の範囲13記載の固定
化膜。 - 【請求項１５】膜の上にフエロセン又はNAHD2が固定化
されている、請求の範囲１ないし３のいずれかに記載の
固定化膜。 - 【請求項１６】膜上に酵素及び／又は補酵素が固定化さ
れている、請求の範囲１ないし３のいずれかに記載の方
法によって酵素膜。 - 【請求項１７】膜上に抗原類、抗体類、レクチン類、ビ
オチン、アビジン、プロテインＡ又はハプテン類が固定
化されている、請求の範囲１ないし３のいずれかに記載
のELISA膜。 - 【請求項１８】膜上に酵素類又は補酵素類、抗原類、抗
体類、ビオチン、アビジン、レクチン類、プロテイン
Ａ、ハプテン類、核酸類、フエロセン又はNAHD2が固定
化されている膜を有する、請求の範囲１ないし３のいず
れかに記載の診断剤。 - 【請求項１９】膜上に酵素類又は補酵素類、抗原類、抗
体類、ビオチン、アビジン、レクチン類、プロテイン
Ａ、セプテン類、核酸類、フエロセン又はNAHD2が固定
化されている、請求の範囲１ないし３のいずれかに記載
のセンサ膜。 - 【請求項２０】膜の上に固定されている物質と膜とが例
えば金属又は導電性合成樹脂等の導電性層を備えてい
る、請求の範囲19記載のセンサ膜。 - 【請求項２１】導電性層がスパッタリングによって被覆
されている、請求項13,14又は19記載の固定化膜。
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