JP2783568B2 - 望ましくない交差反応を排除するためにオリゴヌクレオチドを使用するポリヌクレオチドの検定法 - Google Patents
望ましくない交差反応を排除するためにオリゴヌクレオチドを使用するポリヌクレオチドの検定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、所望のヌクレオチド配列（標的ヌクレオチ
ド配列）の検定法であって、該配列が、この配列の検定
を妨害して偽の定性または定量結果を導き得るその他の
ヌクレオチド配列（非−標的ヌクレオチド配列）と共に
存在している可能性のあるものである該所望のヌクレオ
チド配列の検定法に関するものである。
ド配列）の検定法であって、該配列が、この配列の検定
を妨害して偽の定性または定量結果を導き得るその他の
ヌクレオチド配列（非−標的ヌクレオチド配列）と共に
存在している可能性のあるものである該所望のヌクレオ
チド配列の検定法に関するものである。
関連技術 ポリヌクレオチド中の独特な、または偽発現されるヌ
クレオチド配列は、ヌクレオチド重合体プローブとハイ
ブリダイゼーションさせることによって検出することが
できると長らく考えられてきた。この技法によって、細
菌、ウイルスなどの感染性微生物、鎌状赤血球貧血など
の遺伝子疾患、各種の癌の早期検出が可能になった。検
出したいと望むヌクレオチド配列（標的ヌクレオチド配
列）と相補（通常は正確に相補）するヌクレオチド配列
を有するプローブ（「標的プローブ」と称する）を選択
する。標的ポリヌクレオチドとプローブとのハイブリダ
イゼーションを行った後、通常、形成された標的プロー
ブ／ポリヌクレオチドハイブリッドを、ハイブリダイズ
していないプローブから分離する。次いで、２つの分離
した媒質のいずれかのプローブ量を試験し、初めに存在
した標的量の定性または定量測定値を得る。
クレオチド配列は、ヌクレオチド重合体プローブとハイ
ブリダイゼーションさせることによって検出することが
できると長らく考えられてきた。この技法によって、細
菌、ウイルスなどの感染性微生物、鎌状赤血球貧血など
の遺伝子疾患、各種の癌の早期検出が可能になった。検
出したいと望むヌクレオチド配列（標的ヌクレオチド配
列）と相補（通常は正確に相補）するヌクレオチド配列
を有するプローブ（「標的プローブ」と称する）を選択
する。標的ポリヌクレオチドとプローブとのハイブリダ
イゼーションを行った後、通常、形成された標的プロー
ブ／ポリヌクレオチドハイブリッドを、ハイブリダイズ
していないプローブから分離する。次いで、２つの分離
した媒質のいずれかのプローブ量を試験し、初めに存在
した標的量の定性または定量測定値を得る。
しかしながら、多数の検定には、標的配列のヌクレオ
チド配列に非常に類似しているヌクレオチド配列（例え
ば１〜５個のヌクレオチドのみが異なる）を有する１ま
たはそれ以上の非標的ポリヌクレオチドが存在し得る。
この様な場合、非標的ヌクレオチドは、少なくとも幾つ
かの標的プローブとハイブリダイズし、誤った定性また
は定量結果を生じることによって検定を妨害し得る。こ
の問題は、プローブ配列が、各々の種が標的ヌクレオチ
ド配列またはそれに非常に類似している（例えば１ヌク
レオチドのみが異なっている）ヌクレオチド配列を含有
している特定の属内の種々の微生物種を検定し得るよう
に選択される場合、特に問題となる。
チド配列に非常に類似しているヌクレオチド配列（例え
ば１〜５個のヌクレオチドのみが異なる）を有する１ま
たはそれ以上の非標的ポリヌクレオチドが存在し得る。
この様な場合、非標的ヌクレオチドは、少なくとも幾つ
かの標的プローブとハイブリダイズし、誤った定性また
は定量結果を生じることによって検定を妨害し得る。こ
の問題は、プローブ配列が、各々の種が標的ヌクレオチ
ド配列またはそれに非常に類似している（例えば１ヌク
レオチドのみが異なっている）ヌクレオチド配列を含有
している特定の属内の種々の微生物種を検定し得るよう
に選択される場合、特に問題となる。
上記のタイプの妨害に対する解決策は、例えばワレー
ス等（Wallace et al.）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
0,278−282（1983）によって提案され、その提案の中で
はストリンジェンシーを正確にコントロールすることに
よって１個のヌクレオチドの相違を検出する。ワレース
等は、わずか19ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドプ
ローブおよび正確にコントロールしているストリンジェ
ンシーを使用し、１点の突然変異だけが異なっている、
ニトロセルロースに結合している鎌状赤血球貧血に関連
するヘモグロビンDNAと正常なDNAを区別することができ
た。この方法は、存在し得る非標的ポリヌクレオチドの
類似ヌクレオチド配列より標的ヌクレオチド配列のヌク
レオチド配列により相補的なヌクレオチド配列を有する
標的プローブが意図的に選択されるので、標的プローブ
／標的ポリヌクレオチドハイブリッドは標的プローブ／
非標的ポリヌクレオチドハイブリッドより高い融解温度
を有するという事実を利用している。これらのタイプの
検定では、ニトロセルロースに結合しているポリヌクレ
オチドとポリヌクレオチドプローブを、理想的にはプロ
ーブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドとプローブ／
非標的ポリヌクレオチドのそれぞれの融解温度の間にあ
る制御された温度でハイブリダイズさせる。しかしなが
ら、上の融解温度は約２−３℃異なるだけかもしれな
い。
ス等（Wallace et al.）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
0,278−282（1983）によって提案され、その提案の中で
はストリンジェンシーを正確にコントロールすることに
よって１個のヌクレオチドの相違を検出する。ワレース
等は、わずか19ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドプ
ローブおよび正確にコントロールしているストリンジェ
ンシーを使用し、１点の突然変異だけが異なっている、
ニトロセルロースに結合している鎌状赤血球貧血に関連
するヘモグロビンDNAと正常なDNAを区別することができ
た。この方法は、存在し得る非標的ポリヌクレオチドの
類似ヌクレオチド配列より標的ヌクレオチド配列のヌク
レオチド配列により相補的なヌクレオチド配列を有する
標的プローブが意図的に選択されるので、標的プローブ
／標的ポリヌクレオチドハイブリッドは標的プローブ／
非標的ポリヌクレオチドハイブリッドより高い融解温度
を有するという事実を利用している。これらのタイプの
検定では、ニトロセルロースに結合しているポリヌクレ
オチドとポリヌクレオチドプローブを、理想的にはプロ
ーブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドとプローブ／
非標的ポリヌクレオチドのそれぞれの融解温度の間にあ
る制御された温度でハイブリダイズさせる。しかしなが
ら、上の融解温度は約２−３℃異なるだけかもしれな
い。
従って、上の方法についての大きな問題は、この方法
には温度のストリンジェントなコントロールが必要であ
り、更に通常、非標的ポリヌクレオチドからの多量の妨
害物が混入される（即ち、比較的大量のプローブが非標
的ポリヌクレオチドとハイブリダイズされる）か、また
は標的プローブと標的ポリヌクレオチドのナイブリダイ
ゼーションの程度が低くなり、その結果、誤った定性結
果を導き得るということである。更に、よい定量結果を
得るためには、標準曲線を確立するための検定および未
知試料の検定の両者におけるハイブリダイゼーションの
間、ほぼ同一の温度が維持されなければならないので、
更に高度な温度制御が必要である。
には温度のストリンジェントなコントロールが必要であ
り、更に通常、非標的ポリヌクレオチドからの多量の妨
害物が混入される（即ち、比較的大量のプローブが非標
的ポリヌクレオチドとハイブリダイズされる）か、また
は標的プローブと標的ポリヌクレオチドのナイブリダイ
ゼーションの程度が低くなり、その結果、誤った定性結
果を導き得るということである。更に、よい定量結果を
得るためには、標準曲線を確立するための検定および未
知試料の検定の両者におけるハイブリダイゼーションの
間、ほぼ同一の温度が維持されなければならないので、
更に高度な温度制御が必要である。
定義 本発明の開示および特許請求の範囲で使用される時、
以下の用語は次の様に定義される： ヌクレオチド：リン酸基、５炭糖および窒素含有塩基か
らなる核酸のサブユニット。RNAでは５炭糖はリボース
である。DNAでは２デオキシリボースである。
以下の用語は次の様に定義される： ヌクレオチド：リン酸基、５炭糖および窒素含有塩基か
らなる核酸のサブユニット。RNAでは５炭糖はリボース
である。DNAでは２デオキシリボースである。
ヌクレオチド重合体：ホスホジエステル結合で結合して
いるヌクレオチド鎖またはその類似体。
いるヌクレオチド鎖またはその類似体。
オリゴヌクレオチド：通常約10〜約100ヌクレオチドで
あるが、200またはそれ以上のヌクレオチド長さである
こともあるヌクレオチド重合体。これらは通常、ヌクレ
オチドモノマーから合成されるかまたは酵素的手段によ
って得られる。
あるが、200またはそれ以上のヌクレオチド長さである
こともあるヌクレオチド重合体。これらは通常、ヌクレ
オチドモノマーから合成されるかまたは酵素的手段によ
って得られる。
ポイヌクレオチド：通常約100ヌクレオチド長さ以上の
ヌクレオチド重合体。
ヌクレオチド重合体。
標的ヌクレオチド配列：検定しようとするヌクレオチド
配列。これは、非常に類似したヌクレオチド配列群（例
えば１つの属内の種々の微生物の様に１ヌクレオチドだ
けが異なっている）を包含し得る。
配列。これは、非常に類似したヌクレオチド配列群（例
えば１つの属内の種々の微生物の様に１ヌクレオチドだ
けが異なっている）を包含し得る。
非標的ヌクレオチド配列：標的ヌクレオチド配列と高度
にホモロジーな配列なので、選択されたプローブを使用
する標的ヌクレオチド配列の検定を妨害し得る１または
それ以上のヌクレオチド配列。通常、しかしながら必然
的ではないが、標的および非標的ヌクレオチド配列は別
個のヌクレオチド重合体である。非標的プローブは、非
標的配列の１部分のみに相補的であり、非標的配列およ
び隣接するヌクレオチドの両者の部分とオーバーラップ
し得る。非標的プローブの必要なことは、標的プローブ
との交差反応を防ぐに十分なだけ非標的配列とハイブリ
ダイズすることである。
にホモロジーな配列なので、選択されたプローブを使用
する標的ヌクレオチド配列の検定を妨害し得る１または
それ以上のヌクレオチド配列。通常、しかしながら必然
的ではないが、標的および非標的ヌクレオチド配列は別
個のヌクレオチド重合体である。非標的プローブは、非
標的配列の１部分のみに相補的であり、非標的配列およ
び隣接するヌクレオチドの両者の部分とオーバーラップ
し得る。非標的プローブの必要なことは、標的プローブ
との交差反応を防ぐに十分なだけ非標的配列とハイブリ
ダイズすることである。
ヌクレオチド重合体プローブ：標的または非標的ヌクレ
オチド重合体と優先的にハイブリダイズするように選択
された、それ自身ヌクレオチド重合体であるプローブ
（通常オリゴヌクレオチドであるが、必然的ではな
い）。
オチド重合体と優先的にハイブリダイズするように選択
された、それ自身ヌクレオチド重合体であるプローブ
（通常オリゴヌクレオチドであるが、必然的ではな
い）。
融解温度：ヌクレオチド重合体ハイブリッドについて、
そのハイブリッドの1/2が変性する温度。
そのハイブリッドの1/2が変性する温度。
発明の要点 本発明は、１またはそれ以上の非標的ヌクレオチド配
列からの妨害を低減し得るように選択されたプローブ
（“標的プローブ”）を使用する、標的ヌクレオチド配
列の検定方法を提供するものである。この方法は、標的
プローブとハイブリダイズし得る非標的配列の量を低減
するために、存在し得る非標的配列の少なくとも１部分
とハイブリダイズし得る１またはそれ以上のその他のプ
ローブ（“非標的プローブ”）を与えることによって行
なわれる。
列からの妨害を低減し得るように選択されたプローブ
（“標的プローブ”）を使用する、標的ヌクレオチド配
列の検定方法を提供するものである。この方法は、標的
プローブとハイブリダイズし得る非標的配列の量を低減
するために、存在し得る非標的配列の少なくとも１部分
とハイブリダイズし得る１またはそれ以上のその他のプ
ローブ（“非標的プローブ”）を与えることによって行
なわれる。
好ましくは、本発明は、非標的ポリヌクレオチド配列
をも含有していることがある標的ポリヌクレオチド配列
を検出するための検定方法、およびこの様な検定を行な
うのに有用なキットを提供するものである。ハイブリダ
イズ条件下で、培地を標的および非標的ヌクレオチド重
合体プローブそれぞれと接触させる。これによって標的
プローブは、存在する標的（即ち、存在し得る標的）と
ハイブリダイズすることができる。しかしながら、標的
および非標的重合体は非常に類似しているので、プロー
ブは偶然、存在している非標的ポリヌクレオチド配列と
もハイブリダイズし得る。非標的プローブは、非標的プ
ローブが存在しない時に起こり得る標的プローブ／非標
的のハイブリダイゼーションの程度を低減するが、標的
プローブ／標的のハイブリダイゼーションを不当に低減
しない（即ち、実用の場で検定を行ない得ないようにす
る程度まで低減しない）ことを目的とし、この様なハイ
ブリダイズ条件下、存在している非標的ポリヌクレオチ
ド配列とハイブリダイズするように選ばれる。
をも含有していることがある標的ポリヌクレオチド配列
を検出するための検定方法、およびこの様な検定を行な
うのに有用なキットを提供するものである。ハイブリダ
イズ条件下で、培地を標的および非標的ヌクレオチド重
合体プローブそれぞれと接触させる。これによって標的
プローブは、存在する標的（即ち、存在し得る標的）と
ハイブリダイズすることができる。しかしながら、標的
および非標的重合体は非常に類似しているので、プロー
ブは偶然、存在している非標的ポリヌクレオチド配列と
もハイブリダイズし得る。非標的プローブは、非標的プ
ローブが存在しない時に起こり得る標的プローブ／非標
的のハイブリダイゼーションの程度を低減するが、標的
プローブ／標的のハイブリダイゼーションを不当に低減
しない（即ち、実用の場で検定を行ない得ないようにす
る程度まで低減しない）ことを目的とし、この様なハイ
ブリダイズ条件下、存在している非標的ポリヌクレオチ
ド配列とハイブリダイズするように選ばれる。
本発明は、いずれの標準的ハイブリダイゼーション法
についても使用することができる。この方法は通常、ハ
イブリダイズされていな標的プローブの量を過度に検出
せずに、標的プローブ／標的ハイブリッドを検出できる
ような方法で、表面上または溶液中での標的プローブ／
標的ハイブリッドの形成を利用する。これは通常、以下
の方法を使用して行なうことができる： 1.固形支持体の表面で標的プローブ／標的ハイブリッド
を形成させ、次いでハイブリダイズしていない標的プロ
ーブから該ハイブリッドを分離する。
についても使用することができる。この方法は通常、ハ
イブリダイズされていな標的プローブの量を過度に検出
せずに、標的プローブ／標的ハイブリッドを検出できる
ような方法で、表面上または溶液中での標的プローブ／
標的ハイブリッドの形成を利用する。これは通常、以下
の方法を使用して行なうことができる： 1.固形支持体の表面で標的プローブ／標的ハイブリッド
を形成させ、次いでハイブリダイズしていない標的プロ
ーブから該ハイブリッドを分離する。
2.溶液中で標的プローブ／標的ハイブリッドを形成さ
せ、次いで該ハイブリッドと該ハイブリダイズしていな
い標的プローブを分離する。
せ、次いで該ハイブリッドと該ハイブリダイズしていな
い標的プローブを分離する。
これらの方法を使用して存在する標的ヌクレオチド配
列の量を定量的または定性的に調べるためには、ハイブ
リダイズしているかまたはハイブリダイズしていない標
的プローブの量を求め、形成したハイブリッドの量に関
連づけることができる。通常、標的プローブが、先にハ
イブリダイズされた標識（ラベル）プローブと置換する
場合以外、ハイブリダイズされた形態中の標的プローブ
の量が求められる（例えばClin.Chem.32,1696−1701（1
986）参照）。
列の量を定量的または定性的に調べるためには、ハイブ
リダイズしているかまたはハイブリダイズしていない標
的プローブの量を求め、形成したハイブリッドの量に関
連づけることができる。通常、標的プローブが、先にハ
イブリダイズされた標識（ラベル）プローブと置換する
場合以外、ハイブリダイズされた形態中の標的プローブ
の量が求められる（例えばClin.Chem.32,1696−1701（1
986）参照）。
しかしながら、この方法は、分離工程を必要とするハ
イブリダイゼーション法に限定されない。例えば、改善
されたホモジニアスな検定法が利用できるようになった
時、ここに記載のこの発明方法はホモジニアスな検定形
態においても有用となるであろう。
イブリダイゼーション法に限定されない。例えば、改善
されたホモジニアスな検定法が利用できるようになった
時、ここに記載のこの発明方法はホモジニアスな検定形
態においても有用となるであろう。
本発明は、幾つかの形態で使用することができる。ハ
イブリダイゼーション検定のある時点で、非標的プロー
ブは、標的配列と有意にハイブリダイズすることなく、
非標的配列とハイブリダイズし得ることが必要である。
この様な、非標的配列の“キャッピング（おおい）”
は、標的プローブと標的配列のハイブリダイゼーション
の前、間、または後に起こり得る。好ましい態様は、標
的プローブと標的配列のハイブリダイゼーションの間に
該“キャッピング”を使用することである。本発明のこ
の用途は、幾つかの形態で行なうことができる。これら
には、 1.等温 一定温度でハイブリダイゼーションを行なう 2.徐々に冷却 通常、標的プローブ／標的ヌクレオチド
配列ハイブリッドの融解温度（Tm）を包含する低下して
いく温度範囲に渡ってハイブリダイゼーションを行なう がある。
イブリダイゼーション検定のある時点で、非標的プロー
ブは、標的配列と有意にハイブリダイズすることなく、
非標的配列とハイブリダイズし得ることが必要である。
この様な、非標的配列の“キャッピング（おおい）”
は、標的プローブと標的配列のハイブリダイゼーション
の前、間、または後に起こり得る。好ましい態様は、標
的プローブと標的配列のハイブリダイゼーションの間に
該“キャッピング”を使用することである。本発明のこ
の用途は、幾つかの形態で行なうことができる。これら
には、 1.等温 一定温度でハイブリダイゼーションを行なう 2.徐々に冷却 通常、標的プローブ／標的ヌクレオチド
配列ハイブリッドの融解温度（Tm）を包含する低下して
いく温度範囲に渡ってハイブリダイゼーションを行なう がある。
別法として、標的プローブを加える前に非標的配列を
キャッピングするために、標的プローブにより前に非標
的プローブを加えてもよい。高温および／または高スト
リンジェンシーな条件下で標的プローブ／標的配列ハイ
ブリダイゼーションを行ない、次いで、標的プローブ／
非標的配列のハイブリダイゼーションを防ぐために、温
度および／またはストリンジェンシーが低下した時に非
標的プローブを加えるのも好適である。
キャッピングするために、標的プローブにより前に非標
的プローブを加えてもよい。高温および／または高スト
リンジェンシーな条件下で標的プローブ／標的配列ハイ
ブリダイゼーションを行ない、次いで、標的プローブ／
非標的配列のハイブリダイゼーションを防ぐために、温
度および／またはストリンジェンシーが低下した時に非
標的プローブを加えるのも好適である。
非標的プローブ／非標的配列ハイブリッドの融解温度
が標的プローブ／非標的配列ハイブリッドの融解温度よ
り高くなるようにプローブを選択するのが好ましい。ハ
イブリダイゼーション条件は、少なくともプローブと、
存在している標的配列を変性させるために培地をまず加
熱し（好ましくは存在する全てのヌクレオチド重合体を
変性させる温度まで）、次いで標的プローブが標的配列
とハイブリダイズし得るような（好ましくは全てのハイ
ブリダイゼーションが終了する）温度まで培地を徐々に
冷却することによって設定されるのが好ましい。
が標的プローブ／非標的配列ハイブリッドの融解温度よ
り高くなるようにプローブを選択するのが好ましい。ハ
イブリダイゼーション条件は、少なくともプローブと、
存在している標的配列を変性させるために培地をまず加
熱し（好ましくは存在する全てのヌクレオチド重合体を
変性させる温度まで）、次いで標的プローブが標的配列
とハイブリダイズし得るような（好ましくは全てのハイ
ブリダイゼーションが終了する）温度まで培地を徐々に
冷却することによって設定されるのが好ましい。
冷却させる間に非標的プローブと非標的配列がハイブ
リダイズし、標的プローブが非標的配列と交差反応する
温度に到達した時の交差反応を防ぐことができる。本発
明の１つの態様では、液体媒質が吸収される固相支持体
が存在しない場合、液体媒質中に存在する全てのポリヌ
クレオチドについて、前記の方法によるハイブリダイズ
条件が設定される。この様な固相には、ニトロセルロー
スの様な固形支持体が包含される。
リダイズし、標的プローブが非標的配列と交差反応する
温度に到達した時の交差反応を防ぐことができる。本発
明の１つの態様では、液体媒質が吸収される固相支持体
が存在しない場合、液体媒質中に存在する全てのポリヌ
クレオチドについて、前記の方法によるハイブリダイズ
条件が設定される。この様な固相には、ニトロセルロー
スの様な固形支持体が包含される。
本発明のその他の態様では、標的プローブを、これら
を容易に検出するのに役立つ１またはそれ以上の原子ま
たは分子で標識する。この様な標識は、放射標識、酵
素、化学発光標識、比色分析用標識、または蛍光標識を
包含するがこれらに限定されない。更に、既述した様
に、標的プローブの存在の試験段階は、ヌクレオチド重
合体とハイブリダイズした標的プローブを、ハイブリダ
イズしていない標的プローブから分離（および好ましく
は単離）する段階を含むのが好ましい。この様な分離
（または単離）は、コーン（Kohne,D.E.）およびブリッ
テン（Britten,R.J.）の“核酸の研究”、Vol.2,P.500
−12（1971）に記載された様な方法を使用し、ヒドロキ
シアパタイトの様な固形支持体上にポリヌクレオチドハ
イブリッドを選択的に吸収させることによって行ない得
る。しかしながら、標的ヌクレオチド配列が、標的プロ
ーブより実質上長いポリヌクレオチド上にある場合（こ
れはポリヌクレオチドが臨床的試料を起源とする場合、
通常の状況である）、より長い標的配列およびハイブリ
ダイズした標的プローブを、イオン性親和力によって多
価陽イオン粒子に選択的に固定化することによって分離
するのが好ましい。
を容易に検出するのに役立つ１またはそれ以上の原子ま
たは分子で標識する。この様な標識は、放射標識、酵
素、化学発光標識、比色分析用標識、または蛍光標識を
包含するがこれらに限定されない。更に、既述した様
に、標的プローブの存在の試験段階は、ヌクレオチド重
合体とハイブリダイズした標的プローブを、ハイブリダ
イズしていない標的プローブから分離（および好ましく
は単離）する段階を含むのが好ましい。この様な分離
（または単離）は、コーン（Kohne,D.E.）およびブリッ
テン（Britten,R.J.）の“核酸の研究”、Vol.2,P.500
−12（1971）に記載された様な方法を使用し、ヒドロキ
シアパタイトの様な固形支持体上にポリヌクレオチドハ
イブリッドを選択的に吸収させることによって行ない得
る。しかしながら、標的ヌクレオチド配列が、標的プロ
ーブより実質上長いポリヌクレオチド上にある場合（こ
れはポリヌクレオチドが臨床的試料を起源とする場合、
通常の状況である）、より長い標的配列およびハイブリ
ダイズした標的プローブを、イオン性親和力によって多
価陽イオン粒子に選択的に固定化することによって分離
するのが好ましい。
図面 第１図および第２図を参照して、本発明の態様を記載
する。
する。
第１図は、以下に記載の実験で形成したハイブリッド
の熱安定性を示すグラフである。
の熱安定性を示すグラフである。
第２図は、生じ得る種々のハイブリッドについてのTm
の関係を示す図式である。
の関係を示す図式である。
発明の態様についての詳細な既述 実施例Ｉ 本発明を説明するために、４種類の合成オリゴデオキ
シヌクレオチド、即ち“プローブ”、“標的”、“ミス
プローブ”および“ミス標的”を調製した。プローブ
は、“標的”に対する正確な相補体である35塩基配列で
ある。ミス標的は、２個の置換を有する標的配列（ミス
マッチ）である:12位はＴと置換したＡを有し、24位は
Ｇと置換したＣを有する。ミスプローブは、ミス標的の
正確な相補体である。２個の置換は、プローブの末端か
ら1/3の距離に位置する。プリンおよびピリミジンの含
有量は、Ｇ＋Ｃの含有量と同様に、全ての配列間で一定
である。アプライド・バイオシステム社（Applied Bios
ystems,Inc.）のモデル308A DNAシンセサイザーを使用
してプローブを合成し、通常の方法（テトラヘドロン
（Tetrahedron），39 3−22（1983））で精製した。
シヌクレオチド、即ち“プローブ”、“標的”、“ミス
プローブ”および“ミス標的”を調製した。プローブ
は、“標的”に対する正確な相補体である35塩基配列で
ある。ミス標的は、２個の置換を有する標的配列（ミス
マッチ）である:12位はＴと置換したＡを有し、24位は
Ｇと置換したＣを有する。ミスプローブは、ミス標的の
正確な相補体である。２個の置換は、プローブの末端か
ら1/3の距離に位置する。プリンおよびピリミジンの含
有量は、Ｇ＋Ｃの含有量と同様に、全ての配列間で一定
である。アプライド・バイオシステム社（Applied Bios
ystems,Inc.）のモデル308A DNAシンセサイザーを使用
してプローブを合成し、通常の方法（テトラヘドロン
（Tetrahedron），39 3−22（1983））で精製した。
上のオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りであ
る： 以下の実験では、プローブおよびミスプローブはヌク
レオチド重合体プローブとして作用し、標的およびミス
標的はそれぞれ、標的または非標的ヌクレオチド重合体
のいずれかとして作用する（それぞれの全配列は標的ま
たは非標的ヌクレオチド配列のいずれかである）。
る： 以下の実験では、プローブおよびミスプローブはヌク
レオチド重合体プローブとして作用し、標的およびミス
標的はそれぞれ、標的または非標的ヌクレオチド重合体
のいずれかとして作用する（それぞれの全配列は標的ま
たは非標的ヌクレオチド配列のいずれかである）。
最初に各プローブと各標的重合体の熱安定性を調べ
た。プローブおよびミスプローブを、T4キナーゼ32Pお
よびガンマアデノシントリホスフェート（ATP）でキナ
ーゼ末端標識し、次いで、それぞれを、0.48Mリン酸バ
ッファー、pH6.8、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）中、50℃にて、標的およびミス標的の両者と別個に
ハイブリダイズさせた（合計４種類の別個のハイブリダ
イゼーション）。次ぎに、溶液の１部（10μ）を0.1M
リン酸バッファー、pH6.8および0.1％SDSからなる“反
応バッファー"3ml中で希釈し、第１図に示した種々の温
度で５分間加熱した。コーンの方法（前掲）を使用し、
0.08Mリン酸バッファー、pH6.8、0.02％SDS中、45℃で
ヒドロキシアパタイトに結合させることによって、ハイ
ブリダイズしたプローブの百分率を求めた。結果を、残
留している１本鎖ヌクレオチドの百分率として第１図に
プロットする。２分の１のプローブがハイブリダイズし
ており２分の１のプローブが１本鎖である温度は融解温
度（Tm）として知られており、熱安定性の基準として使
用される。各プローブの正確な相補体（標的重合体）が
非標的重合体で置換された（即ち各プローブの相補体を
２塩基のみが異なったヌクレオチド重合体で置換した）
時、Tmが６−７℃低下する。
た。プローブおよびミスプローブを、T4キナーゼ32Pお
よびガンマアデノシントリホスフェート（ATP）でキナ
ーゼ末端標識し、次いで、それぞれを、0.48Mリン酸バ
ッファー、pH6.8、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）中、50℃にて、標的およびミス標的の両者と別個に
ハイブリダイズさせた（合計４種類の別個のハイブリダ
イゼーション）。次ぎに、溶液の１部（10μ）を0.1M
リン酸バッファー、pH6.8および0.1％SDSからなる“反
応バッファー"3ml中で希釈し、第１図に示した種々の温
度で５分間加熱した。コーンの方法（前掲）を使用し、
0.08Mリン酸バッファー、pH6.8、0.02％SDS中、45℃で
ヒドロキシアパタイトに結合させることによって、ハイ
ブリダイズしたプローブの百分率を求めた。結果を、残
留している１本鎖ヌクレオチドの百分率として第１図に
プロットする。２分の１のプローブがハイブリダイズし
ており２分の１のプローブが１本鎖である温度は融解温
度（Tm）として知られており、熱安定性の基準として使
用される。各プローブの正確な相補体（標的重合体）が
非標的重合体で置換された（即ち各プローブの相補体を
２塩基のみが異なったヌクレオチド重合体で置換した）
時、Tmが６−７℃低下する。
第２図は、起こり得る種々の反応および交差反応につ
いてのハイブリダイゼーションTmを示す。
いてのハイブリダイゼーションTmを示す。
第１図については、標的またはミス標的のいずれか一
方についての検定（検定が望まれる一方を“標的ヌクレ
オチド重合体”と呼び、他方を“非標的ヌクレオチド重
合体”と呼ぶ）において、両者が一緒に存在し得る場
合、同時に実質的な割合の標的プローブを非標的重合体
とハイブリダイズさせることなく、大部分の標的重合体
がその相補的なプローブ（“標的プローブ”）とハイブ
リダイズされる温度を選択するのは困難であろう。従っ
て、ごくわずかの標的ヌクレオチド重合体のみがハイブ
リダイズされる温度が選択されないと、非標識ヌクレオ
チド重合体は標的ヌクレオチド重合体の検定を妨害する
であろう。
方についての検定（検定が望まれる一方を“標的ヌクレ
オチド重合体”と呼び、他方を“非標的ヌクレオチド重
合体”と呼ぶ）において、両者が一緒に存在し得る場
合、同時に実質的な割合の標的プローブを非標的重合体
とハイブリダイズさせることなく、大部分の標的重合体
がその相補的なプローブ（“標的プローブ”）とハイブ
リダイズされる温度を選択するのは困難であろう。従っ
て、ごくわずかの標的ヌクレオチド重合体のみがハイブ
リダイズされる温度が選択されないと、非標識ヌクレオ
チド重合体は標的ヌクレオチド重合体の検定を妨害する
であろう。
本発明は、ハイブリダイゼーション中に標的プローブ
および非標的プローブの両者を存在させることによっ
て、非標識ヌクレオチド配列から生じ得る妨害を実質上
低減し、それによって、ストリンジェントな温度制御の
必要を排除することができる。
および非標的プローブの両者を存在させることによっ
て、非標識ヌクレオチド配列から生じ得る妨害を実質上
低減し、それによって、ストリンジェントな温度制御の
必要を排除することができる。
このことを説明するために、更に実験を行なった。プ
ローブとミスプローブを反応バッファー中、以下の第１
表に示されるモル比で混合した。水浴を使用し、反応を
70℃で５分間加熱し、次いで２時間で50℃まで徐々に冷
却した。次に、50℃で１時間インキュベートを続けた。
反応をまず加熱することによって、開始時に全ての配列
が１本鎖である（即ち“変性している”）ことを保証
し；最後に50℃の温度にすることによって全ての組合わ
せのプローブと標的配列のハイブリダイゼーションが生
じるのを可能にした。なぜならこの温度は全てのTm値よ
り十分低いからである。後述する様に、温度がそれぞれ
のTmを通って徐々に低下するので、徐々に冷却すること
は、誤った相補体より正確な相補体とのペアリングに有
利である。反応を、前記の様にしてヒドロキシアパタイ
トに結合させることによって検定した。
ローブとミスプローブを反応バッファー中、以下の第１
表に示されるモル比で混合した。水浴を使用し、反応を
70℃で５分間加熱し、次いで２時間で50℃まで徐々に冷
却した。次に、50℃で１時間インキュベートを続けた。
反応をまず加熱することによって、開始時に全ての配列
が１本鎖である（即ち“変性している”）ことを保証
し；最後に50℃の温度にすることによって全ての組合わ
せのプローブと標的配列のハイブリダイゼーションが生
じるのを可能にした。なぜならこの温度は全てのTm値よ
り十分低いからである。後述する様に、温度がそれぞれ
のTmを通って徐々に低下するので、徐々に冷却すること
は、誤った相補体より正確な相補体とのペアリングに有
利である。反応を、前記の様にしてヒドロキシアパタイ
トに結合させることによって検定した。
第１（Ａ）表の結果を得るために、標的プローブを標
識し、標的およびミス標的はそれぞれ標的および非標的
ヌクレオチド重合体とし、ミスプローブは標識しなかっ
た。第１（Ａ）表の結果は、（１）標的プローブと標的
重合体のハイブリダイゼーション（反応Ａ−Ｄ）は、４
倍過剰量までの非標的プローブの存在では不当に低減さ
れず；（２）同一条件下、おおよそ予想される様に（実
験的不確実さの限度内で）過剰量の非標識プローブは標
識プローブと競合し（反応Ｅ−Ｇ）；（３）標的プロー
ブは非標的と有意にハイブリダイズする（反応Ｈ）が、
このハイブリダイゼーションは、比較的少量の非標的プ
ローブ（標的プローブと1:1のモル比）が存在する時、
非常に効果的に排除され（反応Ｉ−Ｋ）；そして（４）
両プローブと両重合体を一緒に混合した場合、非標的プ
ローブは外見上、非標的プローブがが存在しない時に起
こり得る標的プローブ／非標的重合体のハイブリダイゼ
ーションの程度を低減するが標的プローブ／標的重合体
のハイブリダイゼーションにほとんど影響しない（そし
て確実にそれを不当に低減しない）様に、非標的重合体
とハイブリダイズする（反応Ｌ−Ｏ）。
識し、標的およびミス標的はそれぞれ標的および非標的
ヌクレオチド重合体とし、ミスプローブは標識しなかっ
た。第１（Ａ）表の結果は、（１）標的プローブと標的
重合体のハイブリダイゼーション（反応Ａ−Ｄ）は、４
倍過剰量までの非標的プローブの存在では不当に低減さ
れず；（２）同一条件下、おおよそ予想される様に（実
験的不確実さの限度内で）過剰量の非標識プローブは標
識プローブと競合し（反応Ｅ−Ｇ）；（３）標的プロー
ブは非標的と有意にハイブリダイズする（反応Ｈ）が、
このハイブリダイゼーションは、比較的少量の非標的プ
ローブ（標的プローブと1:1のモル比）が存在する時、
非常に効果的に排除され（反応Ｉ−Ｋ）；そして（４）
両プローブと両重合体を一緒に混合した場合、非標的プ
ローブは外見上、非標的プローブがが存在しない時に起
こり得る標的プローブ／非標的重合体のハイブリダイゼ
ーションの程度を低減するが標的プローブ／標的重合体
のハイブリダイゼーションにほとんど影響しない（そし
て確実にそれを不当に低減しない）様に、非標的重合体
とハイブリダイズする（反応Ｌ−Ｏ）。
第１（Ｂ）表は、標識プローブとしてミス標的プロー
ブを用い、非標識プローブとして標識プローブを用いて
行なわれた同じ実験の結果を示す。従って、ミス標的お
よび標的はそれぞれ、標的および非標的ヌクレオチド重
合体と見なすことができる。これらの結果はまた、上の
（１）−（４）の結論を支持する。具体的には、第1B表
中の反応ＡおよびＨは、２種類の標的重合体が１種類の
標識プローブによって識別され得なかった（82％:78％
のハイブリダイゼーション）という状況を表わす。標的
プローブ（ここでは、非標的“キャッピング”プローブ
として使用された）の存在が、むしろハイブリダイゼー
ションの程度に明らかな差を生じさせる。この場合、標
識ミスプローブとミス標的の所望のハイブリダイゼーシ
ョンは、標識ミスプローブと標的に対し、56％対０％で
あった（反応ＤおよびＫ）。
ブを用い、非標識プローブとして標識プローブを用いて
行なわれた同じ実験の結果を示す。従って、ミス標的お
よび標的はそれぞれ、標的および非標的ヌクレオチド重
合体と見なすことができる。これらの結果はまた、上の
（１）−（４）の結論を支持する。具体的には、第1B表
中の反応ＡおよびＨは、２種類の標的重合体が１種類の
標識プローブによって識別され得なかった（82％:78％
のハイブリダイゼーション）という状況を表わす。標的
プローブ（ここでは、非標的“キャッピング”プローブ
として使用された）の存在が、むしろハイブリダイゼー
ションの程度に明らかな差を生じさせる。この場合、標
識ミスプローブとミス標的の所望のハイブリダイゼーシ
ョンは、標識ミスプローブと標的に対し、56％対０％で
あった（反応ＤおよびＫ）。
徐々に冷却する方法と等温法を比較するために、試験
を行なった。第２表に示される様に、70℃の予備加熱段
階の後、温度が50℃または55Cのインキュベーション温
度に直ちに低下された（反応溶液を含有しているチュー
ブをこれらのそれぞれの温度の水浴に入れることによっ
て）ということ以外、第１（Ａ）表における反応Ａ−Ｄ
とＨ−Ｋを繰り返した。次いで、インキュベーション温
度で２時間、インキュベーションを続け、前記の様にし
てヒドロキシアパタイト上で反応を検定した。結果を第
２表に示す。“キャッピング”ミス標的プロープの存在
下、直ちに冷却した時には、標的プローブ／標的重合体
ハイブリダイゼーションの量は幾分低下するが（反応Ａ
−Ｄ）、標的プローブ／ミス標的重合体のハイブリダイ
ゼーションの量は、幾分増大する（反応Ｈ−Ｋ）という
ことが第２表からわかる。従って、ハイブリダイゼーシ
ョンの確立の一部として徐々に冷却することは、本発明
の方法に有利であるらしい。
を行なった。第２表に示される様に、70℃の予備加熱段
階の後、温度が50℃または55Cのインキュベーション温
度に直ちに低下された（反応溶液を含有しているチュー
ブをこれらのそれぞれの温度の水浴に入れることによっ
て）ということ以外、第１（Ａ）表における反応Ａ−Ｄ
とＨ−Ｋを繰り返した。次いで、インキュベーション温
度で２時間、インキュベーションを続け、前記の様にし
てヒドロキシアパタイト上で反応を検定した。結果を第
２表に示す。“キャッピング”ミス標的プロープの存在
下、直ちに冷却した時には、標的プローブ／標的重合体
ハイブリダイゼーションの量は幾分低下するが（反応Ａ
−Ｄ）、標的プローブ／ミス標的重合体のハイブリダイ
ゼーションの量は、幾分増大する（反応Ｈ−Ｋ）という
ことが第２表からわかる。従って、ハイブリダイゼーシ
ョンの確立の一部として徐々に冷却することは、本発明
の方法に有利であるらしい。
標的プローブを使用する標的ヌクレオチド配列の検定
では、非標的ヌクレオチド重合体ハイブリッドとハイブ
リッドを形成する標的プローブ／非標的プローブのTmよ
り高いTmを有する、非標的ヌクレオチド重合体とハイブ
リッドを形成する非標的プローブを与えることによっ
て、非標的ヌクレオチド配列（通常、その他のヌクレオ
チド重合体上）からの妨害を低減することができるとい
うことが上で説明された。従って、与えられた標的ヌク
レオチド配列の検定において、非常に類似している非標
的ヌクレオチド配列から起こり得る妨害を低減すること
ができる。更に、上記からわかる様に、ハイブリダイズ
条件が、徐々に冷却することによって設定されるなら、
上記の有利な効果が更に高められる。
では、非標的ヌクレオチド重合体ハイブリッドとハイブ
リッドを形成する標的プローブ／非標的プローブのTmよ
り高いTmを有する、非標的ヌクレオチド重合体とハイブ
リッドを形成する非標的プローブを与えることによっ
て、非標的ヌクレオチド配列（通常、その他のヌクレオ
チド重合体上）からの妨害を低減することができるとい
うことが上で説明された。従って、与えられた標的ヌク
レオチド配列の検定において、非常に類似している非標
的ヌクレオチド配列から起こり得る妨害を低減すること
ができる。更に、上記からわかる様に、ハイブリダイズ
条件が、徐々に冷却することによって設定されるなら、
上記の有利な効果が更に高められる。
標的プローブに対する非標的プローブの割合は実質上
変えることができる。この割合は9:1以下であるのが好
ましく、とりわけ好ましい比は、4:1以下である。
変えることができる。この割合は9:1以下であるのが好
ましく、とりわけ好ましい比は、4:1以下である。
使用される非標的プローブの量は、広範囲に変えるこ
とができるが、なお上記の改善された結果を与える。し
かしながら、非標的プローブが、非標的配列の量にほぼ
等しいモル量で存在するのが好ましく、試料中に存在す
る非標的配列より過剰量のモル量であるのがとりわけ好
ましい。これは、試料中の標的および非標的RNA配列の
量より大きい量のプローブを使用することによって行な
うことができる。上の実験では、標的および非標的ヌク
レオチド配列は、標的および非標的ヌクレオチド重合体
の全長からなるが、これは必然的でなくてもよいという
ことは明らかであろう。事実、大部分の臨床的応用で
は、両配列は、実質上より長い標的および非標的ポリヌ
クレオチドの長さの一部分のみとなろう。以下の実施例
は、このような臨床上の検定を説明する。
とができるが、なお上記の改善された結果を与える。し
かしながら、非標的プローブが、非標的配列の量にほぼ
等しいモル量で存在するのが好ましく、試料中に存在す
る非標的配列より過剰量のモル量であるのがとりわけ好
ましい。これは、試料中の標的および非標的RNA配列の
量より大きい量のプローブを使用することによって行な
うことができる。上の実験では、標的および非標的ヌク
レオチド配列は、標的および非標的ヌクレオチド重合体
の全長からなるが、これは必然的でなくてもよいという
ことは明らかであろう。事実、大部分の臨床的応用で
は、両配列は、実質上より長い標的および非標的ポリヌ
クレオチドの長さの一部分のみとなろう。以下の実施例
は、このような臨床上の検定を説明する。
実施例II この場合、臨床上の検定の場合と同様に、合成標的プ
ローブおよび非標的プローブを細胞RNAにハイブリダイ
ズした。この系は、ネイセリア・ゴノロエア（Neisseri
a gonorrhoeae）（所望の標的としてのgon RNA）および
ネイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningit
idr）（望ましくない誤った標的としてのmen RNA）で構
成された。実施例Ｉと同様に誤った２個の塩基以外は両
方のRNAに相補的なプローブを合成した。プローブ配列
は、以下の通りであった： 実施例Ｉと同様にしてプローブを合成した。非常に近
縁の生物の配列整列を行ない、所望の生物に固有の領域
を選択することによってプローブ配列を得る。
ローブおよび非標的プローブを細胞RNAにハイブリダイ
ズした。この系は、ネイセリア・ゴノロエア（Neisseri
a gonorrhoeae）（所望の標的としてのgon RNA）および
ネイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningit
idr）（望ましくない誤った標的としてのmen RNA）で構
成された。実施例Ｉと同様に誤った２個の塩基以外は両
方のRNAに相補的なプローブを合成した。プローブ配列
は、以下の通りであった： 実施例Ｉと同様にしてプローブを合成した。非常に近
縁の生物の配列整列を行ない、所望の生物に固有の領域
を選択することによってプローブ配列を得る。
プローブと標的RNAの各組合わせのTm値を求めた:gon
プローブ＋gon RNA 59.2℃、gonプローブ＋men RNA 48.
2℃、men プローブ−men RNA 61.5℃、men プローブ＋g
on RNA55℃。上の最初の実施例の場合と同様に、正確に
合ったハイブリダイゼーションは、対応する誤ったハイ
ブリダイゼーションより約６−10゜高いTMを有した。
プローブ＋gon RNA 59.2℃、gonプローブ＋men RNA 48.
2℃、men プローブ−men RNA 61.5℃、men プローブ＋g
on RNA55℃。上の最初の実施例の場合と同様に、正確に
合ったハイブリダイゼーションは、対応する誤ったハイ
ブリダイゼーションより約６−10゜高いTMを有した。
第２表の55℃等温条件と同様で、更に55℃→40℃の冷
却段階が徐々に行なわれるハイブリダイゼーション検定
をおこなった。（この場合、0.48Mリン酸バッファー、p
H6.8、0.5％SDS中でハイブリダイゼーションを行ない、
0.12Mリン酸バッファー、pH6.8、0.02％SDS中、40℃で
ヒドロキシアパタイト分離を行なった。）全ての成分が
完全に変性するのを保証するために反応を70℃で５分間
加熱し、直ちに55℃に冷却し、15時間インキュベート
し、４時間かけて徐々に40℃に冷却し、さらに１時間、
40℃でインキュベートを続けた。これらのプローブはよ
り徐々にハイブリダイズすることがわかっているので、
最初の実施例より長く、より大過剰量のプローブを用い
てこれらの反応をインキュベートした。
却段階が徐々に行なわれるハイブリダイゼーション検定
をおこなった。（この場合、0.48Mリン酸バッファー、p
H6.8、0.5％SDS中でハイブリダイゼーションを行ない、
0.12Mリン酸バッファー、pH6.8、0.02％SDS中、40℃で
ヒドロキシアパタイト分離を行なった。）全ての成分が
完全に変性するのを保証するために反応を70℃で５分間
加熱し、直ちに55℃に冷却し、15時間インキュベート
し、４時間かけて徐々に40℃に冷却し、さらに１時間、
40℃でインキュベートを続けた。これらのプローブはよ
り徐々にハイブリダイズすることがわかっているので、
最初の実施例より長く、より大過剰量のプローブを用い
てこれらの反応をインキュベートした。
第３表の結果は、最初の実施例で見られたのと同様
の、非標的RNAに対する非標的プローブ（men）のキャッ
ピング効果を示す。標的RNAに対する標的プローブのハ
イブリダイゼーションは、２倍過剰量の非標的プローブ
の存在下ではあまり低減されなかった。非標的RNAに対
する標的プローブの望ましくない交差ハイブリダイゼー
ションは、少量はあったが、標的プローブに対して非標
的キャッピングプローブの1:1比で完全に排除された
（反応Ｊ）。
の、非標的RNAに対する非標的プローブ（men）のキャッ
ピング効果を示す。標的RNAに対する標的プローブのハ
イブリダイゼーションは、２倍過剰量の非標的プローブ
の存在下ではあまり低減されなかった。非標的RNAに対
する標的プローブの望ましくない交差ハイブリダイゼー
ションは、少量はあったが、標的プローブに対して非標
的キャッピングプローブの1:1比で完全に排除された
（反応Ｊ）。
実施例III キャッピングの有効性を調べるために、臨床上の検定
でよくあるように大過剰量のプローブおよび低濃度のRN
Aを使用し、更に実験を行なった。この実施例では、プ
ローブとRNAを記載の割合で混合し（0.48Mリン酸バッフ
ァー、pH6.8、0.5％SDS、1mM EDTA、1mM EGTA中）、70
℃で５分間加熱し、11/4時間かけて55℃に徐々に冷却
し、55℃で２時間インキュベートし、30分間で45℃に徐
々に冷却し、次いで45℃で30分間インキュベートした。
次に、上の様にして、ヒドロキシアパタイト上、ハイブ
リダイゼーション体を分離した。このインキュベーショ
ン法は、55℃の中間（ストリンジェントな）温度を越え
て徐々に冷却し、その温度でさらにインキュベートする
ので、正確なマッチハイブリダイゼーションを最大限に
識別することができる。
でよくあるように大過剰量のプローブおよび低濃度のRN
Aを使用し、更に実験を行なった。この実施例では、プ
ローブとRNAを記載の割合で混合し（0.48Mリン酸バッフ
ァー、pH6.8、0.5％SDS、1mM EDTA、1mM EGTA中）、70
℃で５分間加熱し、11/4時間かけて55℃に徐々に冷却
し、55℃で２時間インキュベートし、30分間で45℃に徐
々に冷却し、次いで45℃で30分間インキュベートした。
次に、上の様にして、ヒドロキシアパタイト上、ハイブ
リダイゼーション体を分離した。このインキュベーショ
ン法は、55℃の中間（ストリンジェントな）温度を越え
て徐々に冷却し、その温度でさらにインキュベートする
ので、正確なマッチハイブリダイゼーションを最大限に
識別することができる。
第４表に見られる様に、キャッピング（非標的）プロ
ーブはまた、標的プローブと非標的RNAの交差反応を完
全に排除したが、特異的ハイブリダイゼーション（標的
プローブ／標的RNA）を26％低下させただけであった。
ーブはまた、標的プローブと非標的RNAの交差反応を完
全に排除したが、特異的ハイブリダイゼーション（標的
プローブ／標的RNA）を26％低下させただけであった。
標的プローブは、当業者に既知の多数の標識によって
標識され得るということも、当然、前記から理解される
であろう。更に、類似した非標的ヌクレオチド配列が存
在し得ることがある培地中の標的ヌクレオチド配列の存
在の確認に使用するためのキットであって、標的および
非標的プローブを別個にまたは混合して含有しているキ
ットを組み立てることができる。
標識され得るということも、当然、前記から理解される
であろう。更に、類似した非標的ヌクレオチド配列が存
在し得ることがある培地中の標的ヌクレオチド配列の存
在の確認に使用するためのキットであって、標的および
非標的プローブを別個にまたは混合して含有しているキ
ットを組み立てることができる。
当業者には明らかな様に、上に記載の態様の種々の改
良法および変法が可能である。従って、本発明の範囲
は、上に詳細に記載された態様によって限定されるもの
ではない。
良法および変法が可能である。従って、本発明の範囲
は、上に詳細に記載された態様によって限定されるもの
ではない。
Claims (17)
- 【請求項１】試料中の標的ヌクレオチド配列の検定方法
であって、以下の工程を含んでなる方法： （ａ）標的プローブ／標的ヌクレオチド配列ハイブリッ
ドを形成させるための、ハイブリダイゼーション条件下
で該標的配列と特異的にハイブリダイズ可能なヌクレオ
チド配列を有する標識されている標的プローブを提供す
ること（該標的プローブの該ヌクレオチド配列は、該標
的配列とは別の且つ異なる非標的ヌクレオチド配列と該
条件下で特異的にハイブリダイズして該標的プローブ／
標的ヌクレオチド配列ハイブリッドとは別の且つ異なる
標的プローブ／非標的ヌクレオチド配列ハイブリッドを
形成することも可能であり、該条件下では該標的プロー
ブ／標的ヌクレオチド配列ハイブリッドの融解温度は該
標的プローブ／非標的ヌクレオチド配列ハイブリッドの
融解温度よりも高い）； （ｂ）非標的プローブ／非標的ヌクレオチド配列ハイブ
リッドを形成させるための、該条件下で該非標的ヌクレ
オチド配列と特異的にハイブリダイズ可能な第二のヌク
レオチド配列を有する標識されていない非標的プローブ
を提供すること（該条件下では該非標的プローブ／非標
的ヌクレオチド配列ハイブリッドの融解温度は該標的プ
ローブ／非標的ヌクレオチド配列ハイブリッドの融解温
度よりも高い）； （ｃ）該条件下、固相支持体の全く存在しない液体培地
中で、該試料を該標的プローブ及び少なくとも１種の該
非標的プローブと接触させること；及び （ｄ）該試料と該標的プローブのハイブリダイゼーショ
ンについて検定すること。 - 【請求項２】非標的プローブ／非標的ヌクレオチド配列
ハイブリッドの方が標的プローブ／非標的ヌクレオチド
配列ハイブリッドよりも相補的ヌクレオチドの数が多い
ようにプローブを選択する請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】プローブが部分的な共通領域を有するオリ
ゴヌクレオチドである請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】プローブが１ないし３ヌクレオチドだけが
異なっているオリゴヌクレオチドである請求項１から３
までのいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】標識が放射標識、酵素、化学発光標識、比
色分析用標識、及び蛍光標識から選択される請求項１〜
４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】標識されていないプローブの標識されてい
るプローブに対するモル比が９対１を越えない請求項１
〜５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】非標的プローブの標的プローブに対するモ
ル比が９対１を越えない請求項１〜６のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項８】非標的プローブの標的プローブに対するモ
ル比が４対１を越えない請求項１〜７のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項９】始めに培地を加熱し、少なくともプローブ
及び存在しているあらゆる標的配列を変性させ、次いで
標的プローブが標的配列とハイブリダイズしうる温度ま
でこの培地の温度を外部の熱交換媒体によって徐々に低
下させることによりハイブリダイゼーション条件が設定
される請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】ハイブリダイゼーションがあらかじめ決
められた温度で起こる請求項１〜９のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項１１】標的ヌクレオチド配列がRNAである請求
項１〜10のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】標的ヌクレオチド配列がDNAである請求
項１〜10のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】検定工程が、始めにハイブリダイズして
いない標識プローブからハイブリッドを分離し、次いで
このハイブリッド中の標識の存在を確認することを含ん
でなる請求項５〜10のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】プローブがオリゴヌクレオチドであり、
標的および非標的ヌクレオチド配列がプローブより長い
ポリヌクレオチドであり、そして検定工程が以下の工程
を含んでなる請求項11〜13のいずれかに記載の方法： （ａ）長さが100ヌクレオチドより短いすべてのオリゴ
ヌクレオチドを有意に結合させることなく、ポリヌクレ
オチドおよびそのハイブリッドを非共有結合によって結
合させることができる適当なポリカチオン性固体支持体
に液体培地を接触させて、ポリヌクレオチドとハイブリ
ダイズした標的プローブをそのようにハイブリダイズし
ていない標的プローブから分離すること； （ｂ）該そのようにハイブリダイズしていない標的プロ
ーブを含む液体培地から固体支持体を分離すること；お
よび （ｃ）該固体支持体に結合している標識の存在を検出す
ること。 - 【請求項１５】非標的ヌクレオチド配列をも含有してい
る被験試料中の標的ヌクレオチド配列を検定するのに有
用なキットであって、以下のものを含んでなるキット： （ａ）標的プローブ／標的ヌクレオチド配列ハイブリッ
ドを形成させるための、ハイブリダイゼーションの条件
下で該標的配列と特異的にハイブリダイズ可能なヌクレ
オチド配列を有する標識されている標的プローブ（該標
的プローブの該ヌクレオチド配列はまた、該標的配列と
は別の且つ異なる非標的ヌクレオチド配列と該条件下で
特異的にハイブリダイズして標的プローブ／標的ヌクレ
オチド配列ハイブリッドとは別の且つ異なる標的プロー
ブ／非標的ヌクレオチド配列ハイブリッドを形成するこ
とが可能でもあって、該条件下では該標的プローブ／標
的ヌクレオチド配列ハイブリッドの融解温度は該標的プ
ローブ／非標的ヌクレオチド配列ハイブリッドの融解温
度よりも高い）；及び （ｂ）非標的プローブ／非標的ヌクレオチド配列ハイブ
リッドを形成させるための条件下で該非標的配列と特異
的にハイブリダイズ可能である第二のヌクレオチド配列
を有する標識されていない非標的プローブ（該条件下で
は該非標的プローブ／非標的ヌクレオチド配列ハイブリ
ッドの融解温度は該標的プローブ／非標的ヌクレオチド
配列ハイブリッドの融解温度よりも高い）。 - 【請求項１６】請求項１〜５のいずれかにおいて定義さ
れる標的及び非標的プローブを含む請求項15に記載のキ
ット。 - 【請求項１７】請求項１〜14のいずれかに記載の分析方
法を実施するための請求項15又は16に記載のキット。
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-
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