JP2776480B2 - 組み換え型ヒトリンホトキシン - Google Patents
組み換え型ヒトリンホトキシンInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規生理活性ポリペ
プチドの遺伝情報を有するポリデオキシリボ核酸（以下
ＤＮＡと略す）に関する。本発明は又、該ＤＮＡを含む
複製可能な組み換えＤＮＡ及び該複製可能な組換ＤＮＡ
で形質転換された大腸菌、枯草菌又は酵母に関する。該
ＤＮＡが有する遺伝情報を発現して得られる新規生理活
性ポリペプチド及びその製造方法に関しても参考のため
に説明する。本明細書においてアミノ酸およびペプチド
は IUPAC-IUB生化学命名委員会(CBN)で採用された略記
法により表示され、例えば下記の略号が使用される。な
お、アミノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ体を示すものとする。 Ｇｌｎ：グルタミン残基 Ａｓｐ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ：プロリン残基 Ｔｙｒ：チロシン残基 Ｖａｌ：バリン残基 Ｌｙｓ：リジン残基 Ｇｌｕ：グルタミン酸残基 Ａｌａ：アラニン残基 Ａｓｎ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ：ロイシン残基 Ｐｈｅ：フエニルアラニン残基 Ｇｌｙ：グリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 Ｓｅｒ：セリン残基 Ｔｈｒ：スレオニン残基 Ｉｌｅ：イソロイシン残基 Ｔｒｐ：トリプトフアン残基 Ａｒｇ：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 又、本明細書中においてＤＮＡのポリマー又はオリゴマ
ーは下記の如き略号の配列により表記する。 Ａ：２’−デオキシアデニル酸残基 Ｃ：２’−デオキシシチジル酸残基 Ｇ：２’−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特にことわらない限り、配列の左から右への方向は５’
から３’への方向を示すものとする。 【０００２】 【従来の技術】リンホトキシン（以下ＬＴと略す）はリ
ンパ球由来の抗腫瘍活性を有する蛋白で、マクロフアー
ジ由来の癌壊死因子（以下ＴＮＦと略す）と共にその臨
床応用に期待が寄せられている。これらのＬＴやＴＮＦ
はそれぞれリンパ球やマクロフアージにエンドトキシン
やホルボールエステルを添加し活性化することにより得
られていたが、近年遺伝子操作技術の進歩に伴いその構
造が明らかになり、これらの蛋白をコードする遺伝子を
用いることにより微生物又は細胞培養で該蛋白を製造す
ることが可能となった。Ｇrayら〔ネイチャー(Nature),
312巻(1984年)721頁〕及びPennicaら〔ネイチャー(Natu
re),312巻(1984年)724頁〕はそれぞれこの遺伝子操作技
術を駆使してそのクローニングに成功した。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】一方これらの技術の進
歩に伴い、形質転換体よりの該蛋白の抽出が大きな問題
となっている。上記のＬＴに関してもその抗腫瘍性を損
うことなく菌体より効率良く該ＬＴを抽出する方法につ
いて満足すべき結果を得ていないのが現状である。すな
わち形質転換体内に産生されたＬＴを抽出するためには
菌体の破砕が必要であるが、この際蛋白変性剤として７
Ｍグアニジン塩酸塩や８Ｍ尿素もしくは２％ドデシル硫
酸ナトリウム（SDS)を用いるとＬＴの活性に重大な影響
を与え非可逆的な失活をもたらす。そのため緩和な菌体
破砕条件としてリゾチーム分解と超音波処理が考えられ
るが、この条件では回収率が低い。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる技
術的背景のもとに遺伝子操作技術を用いて、抗腫瘍活性
の高い蛋白を好収率で抽出することを目的として種々の
ＬＴ遺伝子を構築し、該組み換えＤＮＡを含有する形質
転換体で遺伝情報を発現させ産生されたＬＴの細胞毒性
を測定した結果、Ｎ末端にＰｒｏもしくはＰｈｅを有
し、かつ１０から２１個のＮ末端アミノ酸、ペプチドを
欠損するＬＴムテインが１７１個の全アミノ酸配列を有
するＬＴよりも生物活性を損わない緩和な条件で好収率
で抽出、精製されるという新知見を得、これに基づいて
更に研究した結果、本発明を完成したものである。すな
わち、本発明は次の如きアミノ酸配列を有する蛋白質を
コードする塩基配列を含むポリデオキシリボ核酸を包含
する。 H-(Met)n-R1-R2-Ala-His-Ser-Thr-Leu-Lys-Pro-Ala- Ala-His-Leu-Ile-Gly-Asp-Pro-Ser-Lys- Gln-Asn-Ser-Leu-Leu-Trp-Arg-Ala-Asn- Thr-Asp-Arg-Ala-Phe-Leu-Gln-Asp-Gly- Phe-Ser-Leu-Ser-Asn-Asn-Ser-Leu-Leu- Val-Pro-Thr-Ser-Gly-Ile-Tyr-Phe-Val- Tyr-Ser-Gln-Val-Val-Phe-Ser-Gly-Lys- Ala-Tyr-Ser-Pro-Lys-Ala-Thr-Ser-Ser- Pro-Leu-Tyr-Leu-Ala-His-Glu-Val-Gln- Leu-Phe-Ser-Ser-Gln-Tyr-Pro-Phe-His- Val-Pro-Leu-Leu-Ser-Ser-Gln-Lys-Met- Val-Tyr-Pro-Gly-Leu-Gln-Glu-Pro-Trp- Leu-His-Ser-Met-Tyr-His-Gly-Ala-Ala- Phe-Gln-Leu-Thr-Gln-Gly-Asp-Gln-Leu- Ser-Thr-His-Thr-Asp-Gly-Ile-Pro-His- Leu-Val-Leu-Ser-Pro-Ser-Thr-Val-Phe- Phe-Gly-Ala-Phe-Ala-Leu-OH ???、R1はＰｒｏ又はＰｈｅ、Ｒ2はAla-Gln-Thr-Ala-Arg
-Gln-His-Pro-Lys-Met-His-Leu のＣ末端から数えて１
個または２個以上のアミノ酸を示し、ｎは０又は１を示
す。〕本発明は形質転換された微生物中で上記のアミノ
酸配列を含むポリペプチドを発現しうる複製可能な組み
換えＤＮＡに係る。このような組み換えＤＮＡとして
は、例えば pＴＢ622、pＴＢ697、pＴＢ848および pＴ
Ｂ849などが挙げられる。更に本発明は上記ＬＴのアミ
ノ酸配列を示すポリペプチドを発現しうる複製可能な組
み換えＤＮＡで形質転換された微生物に係り、このよう
な微生物は、大腸菌、枯草菌、酵母である。更に本発明
では、Ｎ末端欠損ＬＴ遺伝子をコードする遺伝子を、微
生物中で発現させることからなるＬＴの製造方法につい
ても参考のため説明する。詳しくは、複製可能な組み換
えＤＮＡで形質転換された微生物を増殖させ、該ペプチ
ドを効率良く回収することからなる該ポリペプチドの製
造方法について説明する。 【０００５】本発明のＮ末端欠損ＬＴをコードするＤＮ
Ａは、例えば下記の方法により調製できる。 １． 12−O−テトラデカノイルホルボール− 13−アセ
テート（ＴＰＡ）およびコンカナバリンＡ（ＣonＡ）で
ＬＴ合成を誘導させたヒト末梢リンパ球より公知の方法
でｍ−ＲＮＡを採取することができ、さらにそれから約
５×105個のcＤＮＡライブラリーを作製することができ
る。 ２． ＬＴの部分ペプチド鎖をコードする通常10-merか
ら50-merのオリゴヌクレオチドを合成しプローブとして
使用し、ＬＴ cＤＮＡのスクリーニングを実施する。例
えばＣ末端側18-mer（ＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴ
ＡＣＴ)の合成ヌクレオチドを使用した時、約50個のク
ローンを得ることができる。 ３． 得られたＬＴ cＤＮＡクローンからプラスミドを
単離し塩基配列を決定する。既報のＬＴのアミノ酸配列
をコードするプラスミドを選択し、これを適当な制限酵
素で切断し、適宜発現ベクターに導入して、そのＤＮＡ
を含む組み換えＤＮＡを作製することができる。 ４． ３．で調製されたベクターを使用して各種宿主、
例えば大腸菌を形質転換し、ＬＴをコードするＤＮＡを
保持する菌株を得ることができる。 ５． ４．で形質転換体を培養しプラスミドを単離した
のち、以下のようにしてＮ末端欠損ＬＴをコードするＤ
ＮＡを調製できる。 ヒトＬＴ遺伝子の場合には、Ｎ末端側より20−21番
目のメチオニン−ヒスチジンをコードする領域に制限酵
素ＮsiＩ認識部位が存在する。そこでＬＴ遺伝子を Ｎs
iＩ で切断することにより、Ｎ末端欠損ＬＴをコードす
るＤＮＡ断片を得ることができる。この断片に 【０００６】 【化１】 【０００７】の配列を含む適当なアダプターを結合させ
ることによりＬＴ（20−171)をコードするＤＮＡを作製
し、適当なベクターに挿入する。 ＮsiＩ切断後のＮ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡ
断片に化学合成したＤＮＡを結合させる。その際、ＬＴ
のＮ末端10番目のアラニンから20番目のメチオニンまで
のペプチド鎖をコードするＤＮＡか、あるいは該ペプチ
ド鎖内の一部のアミノ酸またはペプチドを欠損もしくは
他のものに置換したペプチドをコードするＤＮＡを使用
することができ、読み枠を正しく保つように合成すれば
よい。 同様にヒトＬＴ遺伝子の場合、Ｎ末端側より９−10
番目のセリン−アラニンをコードする領域に制限酵素Ｐ
vuII認識部位が存在する。そこでＬＴ遺伝子をＰvuIIで
切断し、Ｎ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡ断片を得る
ことができる。この断片に 【０００８】 【化２】 【０００９】の配列を含む適当なアダプターを結合させ
ることによりＬＴ（10−171)をコードするＤＮＡを作製
し、適当なベクターに挿入する。 ＰvuII切断後のＮ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡ
断片をさらにエキソヌクレアーゼ、例えばヌクレアーゼ
ＢＡＬ31で１−10個のアミノ酸をコードする領域を除去
し、その中で遺伝子の読み枠が正しく保たれているもの
を選び出すことによりＬＴ（ｘ−171)，ｘ=10〜20をコ
ードするＤＮＡを調製することができる。 また特定部位指向性変異（site-directed mutagene
sis)〔Smith,M.and Gillam,S,「ジェネティック エンジ
ニアリング(Genetic Engineering)」,３,１(1981)〕の
手法を応用することもできる。すなわちＰvuII切断後の
Ｎ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡ断片をベクターＭ13
に挿入し、これを大腸菌ＪＭ103(Pharmacia P-L Bioche
micals)に感染させる。成育後、ブロス中に放出された
Ｍ13ファージをポリエチレングリコールで沈殿させ、つ
いでフェノール処理によってＭ13ファージ１本鎖ＤＮＡ
を得ることができる。次にＬＴのＮ末端側10番目のアラ
ニンから20番目のメチオニンまでのペプチド鎖内の一部
のアミノ酸またはペプチドを欠損もしくは他のものに置
換したペプチドをコードするＤＮＡを化学合成によって
作製しプライマーとして使用できる。このプライマーと
先に調製したＭ13ファージＤＮＡとを混合し、ＤＮＡポ
リメラーゼＩラージ・フラグメントの作用によって２本
鎖にしたのち、Ｔ4ＤＮＡリガーゼの作用によって環状
化することができる。この環状ＤＮＡを大腸菌ＪＭ103
に導入し、放出されてくるＭ13ファージＤＮＡをフィル
ターに転移させたのち、32Ｐで標識した該合成プライマ
ーを用いてプラーク・ハイブリダイゼイション〔Maniat
is,T.ら「モレキュラー クローニング, ア ラボラトリ
ィー・マニュアル(Molecular Cloning,A Laboratory Man
nual)」,Cold Spring Harbor Laboratory,P.312(198
2)〕を行う。強いシグナルが検出されたファージからＤ
ＮＡを調製し、適当な制限酵素で切り出し、このＤＮＡ
断片をプラスミドに組み込むことにより修飾されたＮ末
端欠損ＬＴをコードするＤＮＡが得られる。ヒトＬＴ遺
伝子の全体または一部を含むプラスミドＤＮＡ、コスミ
ドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどを特定部位指向性変異の
ための鋳型ＤＮＡとして用いることができる。Ｍ13ファ
ージやφX174ファージは、１本鎖ＤＮＡが容易に調製で
きるので、鋳型ＤＮＡとしてより望ましい。例えばＭ13
ファージやφX174ファージにヒトＬＴ遺伝子の全体また
は一部が組み込まれたものを使用する時は、ブロス中に
存在するファージ粒子をポリエチレングリコールで沈殿
させ、フェノール処理で除蛋白を行い、ついでエタノー
ル沈殿を行いファージ粒子内にあった１本鎖ＤＮＡを得
ることができる。また鋳型ＤＮＡとしてヒトＬＴ遺伝子
の全体または一部が組み込まれた２本鎖のプラスミドＤ
ＮＡやコスミドＤＮＡを用いる時は、２本鎖ＤＮＡを 1
00℃で１分から10分、望ましくは３分から５分熱処理し
た後、氷水で急冷し１本鎖ＤＮＡに変性させて使用する
ことができる。特定部位指向性変異のためのプライマー
は、変換しようとするＤＮＡ配列を持ち、鋳型ＤＮＡと
ハイブリダイズしてＤＮＡ合成時のプライマーとして機
能しうるものであれば、どのようなＤＮＡ配列のもので
もよい。またプライマーの作製は、どのような方法でも
よいが、化学合成で適当な配列の１本鎖ＤＮＡを作るこ
とが望ましい。このようなプライマーと先に調製した１
本鎖ＤＮＡとを混合し、ＤＮＡポリメラーゼＩラージ・
フラグメントの作用によって２本鎖ＤＮＡに修復した
後、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼの作用によって環状化すること
ができる。この環状ＤＮＡを大腸菌に導入した後、ラジ
オアイソトープで標識したプライマーをプローブに用い
て、プラーク・ハイブリダイゼイション〔Maniatis,T.
ら「モレキュラー クローニング, ア ラボラトリィー・
マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Mannua
l)」, Cold Spring Harbor Laboratory,P.312(1982)〕
や、コロニー・ハイブリダイゼイション〔同 P.326〕を
行い、目的とする変異体を選び出すことができる。この
ようにして得られたプラークやコロニーからファージＤ
ＮＡやプラスミドＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを用いてＮ
末端欠損ＬＴ遺伝子を調製することができる。 【００１０】このようにして得られるＮ末端欠損ＬＴを
コードするＤＮＡを各種宿主（例、大腸菌，枯草菌，酵
母）で機能するプロモーター領域の３′末端に挿入する
ことにより、Ｎ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡを発現
させうる組み換えＤＮＡを構築することができる。プロ
モーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼが結合することに
よってmＲＮＡ合成を開始させるのに必要な部位を含む
領域であれば、いかなるものであってもよい。たとえば
大腸菌を宿主として用いる場合、Ｎ末端欠損ＬＴをコー
ドするＤＮＡを大腸菌で機能しうるプロモーター領域の
３′末端に挿入すれば、Ｎ末端欠損ＬＴをコードするＤ
ＮＡを発現しうる組み換えＤＮＡが構築できる。またこ
のように大腸菌を宿主とする場合のベクターとしてpＢ
Ｒ322,pＢＲ325，ptrp781，pＵＣ８，pＵＣ９，pＪＢ８
などが用いられ、これにＮ末端欠損ＬＴをコードするＤ
ＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼの作用により挿入する。この
反応液を用いて、大腸菌(例、Ｃ600株，MM294株，ＤＨ
１株，Ｗ3110株，ＲＲ１株，ＰＲ13株など）を公知の方
法〔Cohen,S.N.ら,「プロシージング オブ ナショナル
アカデミー オブサイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A）」 69,2110(1972)〕もしくはそれに準ずる方法によ
って形質転換する。使用するプロモーターは、trpプロ
モーター(trp-p)に限定する必要はなく、たとえばrecA
プロモーター〔特開昭59−65099号〕,lacプロモーター,
λＰLプロモーターなどを使用してもよい。上記のよう
にして得られたＮ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡを含
む新規な組み換えプラスミドＤＮＡを保持する形質転換
体は、たとえばアンピシリン耐性、テトラサイクリン耐
性あるいはこれら両薬剤耐性を表現形として選ぶことが
できる。上記の形質転換体をそれ自体公知の培地で培養
する。培地としては、例えばＬブロス，ペナセイ(Penas
say) ブロスおよびグルコース,カザミノ酸を含むＭ−９
培地〔 Miller,J.,「エクスペリメンツ イン モレキュ
ラー ジェネティクス(Experiments in Molecular Genet
ics)」,431-433(Cold Spring Harbor Laboratory,New Y
ork,1972)〕が挙げられる。ここに、必要によりプロモ
ーターを効率よく働かせるために、たとえば3β-インド
リルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。該
形質転換体の培養は通常 15〜43℃,好ましくは28〜40℃
で２〜24時間，好ましくは４〜16時間行い、必要により
通気や攪拌を加えることもできる。 宿主として、たとえ
ば枯草菌または酵母を使用する場合においては枯草菌ま
たは酵母で機能し得るプロモーター領域の３’末端にＮ
末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡを挿入し、自体公知の
方法により、該組み換えＤＮＡで宿主を形質転換させ、
形質転換体を培養することにより、Ｎ末端欠損ＬＴを製
造することができる。この場合ベクターとして、すでに
多くのものが知られており、該遺伝子の発現に利用でき
るものであれば、いかなるものであってもよい。具体的
には酵母の場合には、ｐＰＨＯ１７，ｐＧＬＤ906，ｐ
ＧＬＤ906−１やｐｃＤＸ〔Okayama,H.,& Berg,P.,「モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Ce
ll.Biol.)」３，280（1983)〕および ｐＫＳＶ−10（フ
ァルマシア社製）などが挙げられ、枯草菌の場合には、
ｐＵＢ110，ｐＴＢ５，ｐＣ195などが挙げられる。プロ
モーターとしては、酵母について例えば、ＰＨ０５，Ｇ
ＬＤ，ＰＧＫ，ＡＤＨ，ＰＨＯ８１プロモーターなど
が、枯草菌について例えばＳＰ０１，ＳＰ０２，ｐｅｎ
Ｐなどが挙げられる。上記の宿主のなかでも、大腸菌が
より好ましい。 培養後、公知の方法で菌体を集め、大
腸菌の形質転換体の場合には菌体を適当な緩衝液、例え
ばトリス−塩酸緩衝液（pＨ7.5)に懸濁し、超音波処
理、リゾチームおよび／または凍結融解によって菌体を
破壊したのち、遠心分離によりＮ末端欠損ＬＴを含む上
澄液を得る方法などが適宜用い得る。好ましくは、菌体
を集めて緩衝液に懸濁しリゾチームを加えて０〜10℃で
10分〜３時間インキュベートし、０〜10℃で30秒〜５分
間超音波処理後、遠心分離して上澄を得る方法が用いら
れる。抽出液からのＮ末端欠損ＬＴの分離、精製はたと
えばゲルろ過、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、超遠
心、ヒトＬＴ抗体を用いるアフィニティクロマトグラフ
ィーにより行うことができる。以上により、本発明者が
Ｎ末端欠損ＬＴの遺伝子を取得し、この遺伝子を用いる
Ｎ末端欠損ＬＴの製造方法が示されたが、本発明は以上
に限定されるものではない。本発明において各アミノ酸
に対応するコドン(遺伝暗号)の使用頻度が異なる等の理
由により、アミノ酸配列を変えることなく塩基配列の一
部又は全部を有機化学的に合成された人工のＤＮＡに置
き換えることも可能である。本発明の生理活性ポリペプ
チドは正常細胞にはその細胞毒性を発揮せず、腫瘍細胞
や形質転換細胞を選択的に殺傷するので制癌剤としてそ
の有用性が期待される。又該ペプチドは既報の171個の
アミノ酸配列を有するLT(1-171)と同等の生物活性を有
し、しかも遺伝子操作技術を駆使して産生され菌体内に
貯溜した該蛋白は、前記LT(1-171)の数10倍以上の好収
率で回収されうる。 【００１１】 【実施例】以下に参考例・実施例により本発明を具体的
に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するもので
ないことはいうまでもない。本発明の実施にあたり組み
換えＤＮＡの作製、組み換え体の微生物への導入は特に
断わらない限り下記の実験書に従って実施した。 (1)T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook,「モレキュ
ラー クローニング(Molecular Clo ning)」, Cold S
pring Harbor Laboratory刊(米国) (2)高木康敬 編著、「遺伝子操作実験法」、講談社刊 参考例 1. Ｌ929細胞障害活性評価 ＬＴの細胞毒性能はL929細胞を用いて〔ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー(J.Immunol.), 126巻(1981年)235頁〕
あるいは〔ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ
(J.Immunol. Methods), 70巻(1984年)257頁〕の方法に
準じて測定した。即ち、96穴の組織培養用マイクロプレ
ート(フローラボラトリー社)を用いて10％のウシ胎児血
清(FCS)を含むRPMI 1640培地で2倍階段希釈した試料50
μlにマイトマイシンＣ 4μg/mlを含む上記培地に懸濁
した4×105個/mlの濃度のＬ929細胞50μlを添加し5％炭
酸ガス中37℃,48時間培養した。培養終了後ジメチルチ
アゾイル・ジフェニルテトラゾリウム臭酸塩 (MTT)を用
いて生細胞を染色し10％SDS-0.01N HClで溶解後590nmに
おける吸光度をタイターテック・マルチスキャン(フロー
ラボラトリー社)で測定した。得られた吸光度は生細胞
数に比例する。Ｌ929細胞の50％を殺すために必要な生
物活性量を1ユニット/mlと定義し試料の生物活性をユニ
ット/mlで表した。 参考例 2. 天然の（Natural）ＬＴの採取 Hinumaら〔Microbiol, Immunol, 28巻 (1984年) 935
頁〕の方法に従い、ＴＰＡとConAとで活性化した正常ヒ
ト末梢リンパ球を、10％Ｆetal Calf Serum (FCS)含有R
PMI 1640培地中37℃,５％ CO2で2〜3日間培養し、その
培養上清からＬＴ含有液を得た。 参考例 ３．形質転換用大腸菌株の作製 大腸菌ＤＨ１株のコロニーをＳＯＢ培地〔実験書(1)69
頁〕を用いて550nmの吸光度が0.5になるまで培養した。
該培養30mlを集め、12mlの0.1Ｍ RbCl-10mＭ CaCl2-50m
M MnCl2-15％グリセロールを含む0.2Ｍ酢酸緩衝液(pH5.
8)に懸濁し5分間氷冷後遠心し、次いで10mＭ RbCl-75m
Ｍ CaCl2-15％グリセロールを含む10mＭ MOPS緩衝液(p
Ｈ6.5 )に再懸濁した。15分間氷冷後ドライアイス-エタ
ノールで急冷凍結後−70℃で保存した。 参考例 ４.形質転換用大腸菌株の作製 ＤＨ１，Ｃ600，ＭＭ294 の各種大腸菌株のコロニーをS
OB培地10mlを用いて550nm の吸光度が0.3になるまで培
養した。氷冷後遠心分離し得られた菌体を5mlの10mM Na
Clで洗浄した。菌体を5mlの50mM CaCl2に再懸濁し氷冷
下15分間放置した。遠心分離後、0.5mlの50mM CaCl2に
懸濁し直ちに使用した。 参考例 ５．形質転換用酵母菌株の作製 Beggs,J.D.らの方法に従った、すなわち、Saccharomyce
s cerevisiae ＡＨ22Ｒ~のコロニーをＹＰＤＡ培地（10
ｇ/l酵母エキス, 20ｇ/lポリペプトン, 10ｇ/lグルコー
スおよび0.4ｇ/lアデニンを含有）を用いて一晩静置培
養した。該培養４ｍlを集め、菌体を４ｍlの0.1Ｍ sodi
um citrate（ｐＨ5.8)−0.01Ｍ ＥＤＴＡ−1.2Ｍ sorbi
tolで洗浄した後、４ｍlの１mg／ｍl Zymolyase 100Ｔ
（生化学工業)−1.1Ｍ sodium citrate（ｐＨ5.8)−0.0
1Ｍ ＥＤＴＡ−1.2Ｍ sorbitolに懸濁し、30℃にて２時
間反応させ細胞壁を溶解させた。次いで菌体を 10ｍＭ
ＣａＣl2−1.2Ｍ sorbitolで２回洗浄した後、同溶液0.
1ｍlの同溶液に懸濁し直ちに使用した。 【００１２】実施例１． ヒトリンパ球由来mＲＮＡを用いたcＤＮＡライブラリー
の作製 ヒト末梢血より調製したリンパ球をＴＰＡ(15ng/ml)と
ＣonA(40μg/ml)とを含むＲＰＭＩ 1640培地(10％FCSを
含む )中、37℃で培養し、ＬＴを誘導させた。24時間
後、この誘導した1×1010個のヒトリンパ球を５Ｍグラ
ニジンチオシアネート、５％メルカプトエタノール、50
mM Tris・HClpH 7.6, 10mM ＥＤＴＡ溶液中でテフロンホ
モゲナイザーによって破壊変性した後Ｎ-ラウロイリル
ザルコシン酸ナトリウムを4％になるように加え、均質
化した混合物を5.7Ｍ塩化セシウム溶液（5.7Ｍ塩化セシ
ウム、0.1Ｍ ＥＤＴＡ)6ml上に重層し、ベックマン Ｓ
Ｗ28のローターを用いて15℃で24,000rpm 48時間遠心処
理を行い、ＲＮＡ沈殿を得た。このＲＮＡ沈殿を0.25％
Ｎ-ラウロイルザルコシン酸ナトリウム溶液にとかした
後、エタノールで沈殿させ、10mgのＲＮＡを得た。この
ＲＮＡを高塩溶液(0.5M NaCl, 10mM Tris・HCl pH 7.6,
1mM EDTA,0.3％ SDS)中でオリゴ(dT)セルロースカラム
に吸着させ、ポリ(Ａ)を含む mＲＮＡを低塩溶液（10mM
Tris-HCl・pH 7.6,1mM EDTA0.3％ SDS )で溶出させる
ことにより、ポリ(Ａ)を含むmＲＮＡ 300μgを分取し
た。この mＲＮＡをさらにエタノールで沈殿させ、0.2m
lの溶液（10mM Tris・HClpH 7.6, 2mM EDTA,0.3％ SDS
)に溶かし、65℃で２分間処理して10−35％ショ糖密度
勾配遠心処理（ベックマンＳＷ28のローターを用いて20
℃,25,000rpmで21時間遠心分離）することにより分画し
た。この各分画につき RNAの一部づつを、アフリカツメ
ガエルの卵母細胞に注入し、合成される蛋白質中のＬＴ
活性を測定し、沈降定数16Ｓ近辺に相当する分画にＬＴ
の活性を検出した。この分画のＬＴ mＲＮＡは約25μg
であった。このポリ(Ａ)ＲＮＡを鋳型として cＤＮＡラ
イブラリーを OkayamaとBerg の方法〔モレキュラー ア
ンド セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.),２巻(19
82年）161頁；同誌,３巻(1983年)280頁〕に従って pcＤ
Ｖ１ベクター、pＬ１リンカーを用いて作製した。環状
化した cＤＮＡを含むベクタープラスミドは大腸菌ＤＨ
１に感染させ、５μgのポリ(Ａ）ＲＮＡより出発して約
５×105個のクローンよりなる大腸菌ＤＨ１を宿主とし
た cＤＮＡライブラリーを得ることができた。 【００１３】実施例２． ヒトＬＴcＤＮＡを含むプラスミドの単離とその塩基配
列の決定 上記大腸菌ＤＨ１を用いたヒト cＤＮＡライブラリーを
ニトロセルロースフィルター（ミリポア社、HATFフィル
ター ）上に約３×１０4クローン／フィルターとなるよ
うに１０枚まき、このフィルターをマスターフィルター
としている各２枚ずつを１組としたレプリカフィルター
計２０枚を作製した。このレプリカフィルター上の大腸
菌を 0.5N ＮaＯＨ溶液でとかし露出変性したプラスミ
ドＤＮＡをフィルター上に乾燥固定した〔Grunstein,M,
＆ Hogness,D,S.,「プロシージング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス」(Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA),72巻(1975年)3961頁〕。一方、既に報告されて
いるＬＴ遺伝子の塩基配列〔 Gray,ら,「ネイチャー(Na
ture)」,312巻(1984年)721頁〕の一部（アミノ酸NO.162
−167に対応する遺伝子部分)に相当するオリゴヌクレオ
チド 【００１４】 【化３】 【００１５】を合成してヒトＬＴcＤＮＡのスクリーニ
ングプローブとした。これらオリゴヌクレオチドプロー
ブの５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ，〔γ−
32Ｐ〕ＡＴＰを用いて32Ｐで標識した。標識したプロー
ブをＤＮＡを固定したレプリカフィルターに別々に会合
させた。会合反応は１０μＣｉの標識プローブを含む５
×ＳＳＣ（0.15M NaCl，0.015MSodium citrate),５×De
nhardt's,0.1％ＳＤＳ，100μg／ml変性サケ精子ＤＮＡ
溶液１０ml中で４０℃１６時間行い、反応後、フィルタ
ーを６×ＳＳＣ，０．1％ＳＤＳ溶液で室温で３０分ず
つ３回、さらに４３℃で６０分ずつ２回洗浄した。〔実
験書（１）309頁〕。洗浄したフィルターよりラジオオ
ートグラムをとり、プローブに対して反応する菌株を１
組２枚のレプリカフィルターのラジオオートグラムを重
ね合わせることにより探した。この方法により約３×1
０5coloniesより、プローブに対して反応する50株の
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１株を得た。これらの菌株よりプラ
スミドＤＮＡをアルカリ法〔Birnboim,H.C. & Doly,J.,
「ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Re
s.),11巻(1979年)1513頁〕によって抽出精製した。ＤＮ
Ａを制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造製）で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動で分画した後、ＤＮＡ断片をアガロー
スゲル中よりニトロセルロースフィルター(エス アンド
エス社，ＢＡ８５）上に移した〔サザンブロッティン
グ法、実験書（１）382頁〕。このフィルターを前記の
オリゴヌクレオチドプローブと会合させると、プラスミ
ドＤＮＡ断片はプローブと反応した。そこで、これらの
うち最大のＢamＨＩＤＮＡ断片（ cＤＮＡ部分）を生じ
たプラスミドを有する１株 Ｅ．coli Ｋ１２ ＤＨ１／p
ＴＢ618 を選び出した。このプラスミドＤＮＡの cＤＮ
Ａ部分の塩基配列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止
法〔 J.Messingら，「ヌクレイック アシッズ リサーチ
(Nucleic Acids Res.),９巻（1981年) 309頁〕によって
決定した。その結果、プラスミドｐＴＢ618 に含まれる
ＬＴ遺伝子は完全ではなく３′末端側非翻訳部分より上
流側Ｎo.18のアミノ酸であるＰroのコドンＣＣＣの第３
番目のＣまでを含むことが判明した。 【００１６】実施例３． ヒトＬＴ(21-171)発現ベクターpＴＢ622の構築 上記で作製したプラスミドpＴＢ618を制限酵素ＮsiＩ
(宝酒造製)とＢａｍＨＩで切断し、ＬＴ遺伝子を含む
１.1キロ塩基対（以下、Ｋbp と略す）のＤＮＡ断片を
分離した。このＤＮＡに Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ
Ｌ社製）を反応させ、末端を平滑化させた後、フレーム
が合うように、１６-merのＡＴＧつきＥcoＲＩリンカー
（ＡＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＴ）をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼによって結合させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを65℃
10分間の熱処理によって失活させたのちさらに制限酵素
ＥcoＲＩで切断し、アガロース電気泳動でリンカーの結
合したＬＴ遺伝子を含む0.6Ｋbp のＤＮＡ断片を分離し
た。一方、Ｋurokawa, T．ら.,「ヌクレイック アシッ
ズリサーチ(Nucl.Acids Res)」11巻(1983年)3077頁に記
載のプラスミドptrp781を制限酵素EcoRIで切断し、5'末
端のリン酸をアルカリ性ホスファターゼ処理によって除
去した。このDNAと、ATGつきＥcoＲＩリンカーの結合し
た、0.6Ｋbp のＬＴＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを作用させて、トリプトファンプロモーターの
下流にＬＴ遺伝子の挿入された、大腸菌のヒトＬＴ発現
ベクターpＴＢ622を構築した(図１)。 【００１７】実施例４．ヒトＬＴ（1-171）発現ベクタ
ーpＴＢ694の構築 工程１(pＴＢ693プラスミドＤＮＡの調製) 図２に示すように、２μgのプラスミドpＴＢ618を0.6ユ
ニットのBal Ｉ(宝酒造製)を用いて37℃で６時間分解し
た。一方ＣＡＧＡＴＣＴＧの８- merで示されるＢgl II
リンカー２μgを0.5mM ＡＴＰと 2.5ユニットのＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼとでリン酸化後、そのリン酸化
リンカー0.2μgを1.6μgの上記Bal I消化pＴＢ618に添
加し35ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ存在下で14℃、
一夜反応した。65℃で５分間不活化後 30ユニットＢgl
IIを用いてトリミングし、1.2 ％のアガロースゲル電気
泳動に供した。4.3Ｋbp に相当する主バンドを切り取
り、トリス・塩酸緩衝液で抽出後 RDPミニカラム(バイオ
ラッド社)で精製した。上記直鎖状ＤＮＡ100ngに10ユニ
ットのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加しpＴＢ693プラスミド
含有ＤＮＡを得、次いで常法に従い大腸菌ＤＨ１株へ形
質転換した。詳しくは、参考例３で作製、−70℃で凍結
保存した形質転換用ＤＨ１菌体を氷冷下除々に融解し、
その懸濁液 100μlにpＴＢ693 含有ＤＮＡ 30ngを添加
した。氷冷下30分間反応後、42℃で90秒間ヒートシヨッ
クを与え、１−２分間氷冷した。0.2mlの20mMグルコー
スを含むＳＯＢ培地を添加し37℃で１時間培養後、該懸
濁液を 35μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレー
ト上にまき37℃で一夜培養した。その結果プラスミドp
ＴＢ693からアンピシリン耐性形質転換のコロニーを得
ることができた。プラスミドpＴＢ693を含有する上記大
腸菌ＤＨ１株を、35μg/ml のアンピシリンを含むＬＢ
培地〔実験書(1)68頁〕250ml中で培養後、実験書(1)88
頁の方法に従ってプラスミドを単離し約300μgのpＴＢ6
93が得られた。 工程２（ヒトＬＴ−cＤＮＡの作成) pＴＢ693プラスミド50μgを100ユニットのＮsiＩと120
ユニットのＢgl II（宝酒造製）とで37℃、１時間分解
し、２％アガロースゲル電気泳動に供した。ＬＴ−cＤ
ＮＡを含むＮsiＩ−Ｂgl II断片に相当する0.56Ｋbpの
バンドを切り取り、工程１で述べたRDPミニカラムを用
いて精製した。一方、ＬＴのＮ末端ペプチド（１−20)
をコードする下記の６本のオリゴヌクレオチド鎖をAppl
ied Biosystems社（米国）の Model 380A-DMA synthesi
zer で化学合成し〔「テトラヘドロン レターズ( Tetra
hedron Lett.)」,21巻（ 1980年）3243頁〕、それら各
１μg の混合物にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ12.5ユ
ニットと１mM ＡＴＰとを加えて37℃、１時間でリン酸
化した。 【００１８】 【化４】 【００１９】70℃、５分間不活化後さらに350ユニット
のＴ4ＤＮＡリガーゼで14℃、一夜反応させ、次いで65
℃で５分間不活化後反応終了液（約3.5μgのＤＮＡを含
む）にＥcoＲＩ(宝酒造製)45ユニット及びＮsiＩ35ユニ
ットを添加し37℃で２時間分解し、10％のポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供した。 約70bp に相当するバ
ンドを切り取り、ＲＤＰミニカラムで精製した。上記約
70bp のＥcoＲＩ−ＮsiＩ断片 30ng に0.56ＫbpのＮsi
Ｉ−Ｂgl II断片110ngを添加し35ユニットのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ存在下で14℃、２時間反応させた。反応終了液
に６ユニットの Ｂgl IIと９ユニットの ＥcoＲＩとで
37℃、１時間分解トリミングし 0.63ＫbpのヒトＬＴ
（１−171)の全アミノ酸配列をコードする cＤＮＡを作
製することができた。 工程３（pＴＢ692プラスミドＤＮＡの調製） ２μgのプラスミドptrp781を32ユニットのＰstＩ（宝酒
造製）で37℃、１時間分解した。反応終了後、ＴＮＥ緩
衝液〔 実験書（１）448頁〕と最終濃度 0.2％のＳＤＳ
を添加してフェノール−クロロホルムで抽出、精製し
た。上記ＰstＩ消化 ptrp781 1μgに0.1mMＸＴＰと４ユ
ニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼとを加え、37℃、５分
間反応後、ＴＮＥ緩衝液およびＳＤＳを添加しフェノー
ル−クロロホルムで抽出、精製した。次に工程１に記載
のリン酸化Ｂgl IIリンカー0.2μgと35ユニットのＴ４
ＤＮＡリガーゼとを上記の ptrp781 ＤＮＡ 0.8μgに加
え14℃で一夜反応した。65℃で５分間不活化後、30ユニ
ットの Ｂgl IIでトリミングしフェノール−クロロホル
ムで抽出し、さらにセファロース４Ｂカラムで精製し
た。その後、10ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し
pＴＢ692含有ＤＮＡを得、次いで工程１記載の常法に従
い大腸菌ＤＨ１株へ形質転換した。但し35μg/mlのアン
ピシリンの代りに10μg/mlのテトラサイクリンを含むＬ
Ｂ寒天プレートを使用し、テトラサイクリン耐性形質転
換菌のコロニーが得られた。該コロニーを10μg／mlの
テトラサイクリンを含むＬＢ培地で培養し、工程１の方
法に従いpＴＢ692プラスミドが得られた。 工程４（pＴＢ694プラスミドＤＮＡの調製） 工程３記載 pＴＢ692プラスミドＤＮＡ10μgにＥcoＲＩ
54ユニットおよびＢglII30ユニットを加え５℃で一夜反
応後、１％アガロースゲル電気泳動で精製し3.3Ｋbpの
ＤＮＡバンドを切り出した。この3.3ＫbpのＤＮＡ36ng
に工程２記載の0.63ＫbpのＤＮＡ 15ngを加え10ユニッ
トＴ４ＤＮＡリガーゼでpＴＢ694含有ＤＮＡを得、工程
３記載の方法に従いテトラサイクリン耐性の形質転換体
を作製し、ヒトＬＴ（１−171）発現用プラスミドpＴＢ
694を得ることができた。 【００２０】実施例５．ヒトＬＴ（11−171）発現ベク
ターpＴＢ697の構築 図３に示すように、10μgのプラスミドpＴＢ694に30ユ
ニットのＰvuII（宝酒造製)を加えて37℃で２時間反応
後、フェノール−クロロホルムで抽出・精製した。一
方、ＧＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣの14-merで示される
ＥcoＲＩリンカー２μgを 0.5mM ＡＴＰと2.5 ユニット
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとでリン酸化後、その
0.5μgを上記のＰvuII消化 pＴＢ694２μgに添加し35ユ
ニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ存在下で14℃一夜反応し
た。65℃で５分間不活化後、45ユニットＥcoＲＩを加え
てトリミングし、0.8 ％のアガロースゲル電気泳動に供
した。3.9Ｋbp に相当する主バンドを切り取り、実施例
４工程１に述べたように RDPミニカラムを用いて精製
し、その直鎖状ＤＮＡ100 ngに10ユニットのＴ４ＤＮＡ
リガーゼを添加しpＴＢ697プラスミド含有ＤＮＡを得、
次いで実施例４工程３記載の常法に従い大腸菌ＤＨ１株
へ形質転換し、その形質転換体からpＴＢ697プラスミド
を得ることができた。 【００２１】実施例６．ヒトＬＴ（21−171）発現ベク
ターpＴＢ848の構築（図４） 実施例４で作製したプラスミドpＴＢ694を制限酵素Ｎｓ
ｉＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを反応させ末端
を平滑化後、フレームが合うように16-merのＡＴＧつき
ＥcoＲＩリンカー（ＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣ
Ｃ）をＴ４ＤＮＡリガーゼによって結合させた。Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを熱処理により失活させたのち、さらに２
種の制限酵素 ＥcoＲＩとＢgl IIとで切断し、アガロー
ス電気泳動で0.56 kbpのＤＮＡ断片を分離した。一方、
同じプラスミドpＴＢ 694を ＥcoＲＩとＢgl IIとで切
断し、次いで上記の 0.56 kbpのＤＮＡ断片を添加し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用させて、トリプトファンプロ
モーターの下流にＬＴ遺伝子の挿入された、大腸菌のヒ
トＬＴ発現ベクターpＴＢ848を構築した（図４）。 実施例７．ヒトＬＴ（21−171）酵母菌発現ベクターpＴ
Ｂ849の構築（図５） プラスミドpＴＢ 694を制限酵素ＮｓｉＩとＢgl IIとで
切断し、ＬＴ遺伝子を含む 0.56Ｋbp ＤＮＡ断片を分離
した。このＤＮＡにＴ４ＤＮＡポリメラーゼを反応さ
せ、末端を平滑化後フレームが合うように20-merの合成
オリゴマー 【００２２】 【化５】 【００２３】をＴ４ＤＮＡリガーゼによって結合させ
た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを熱処理により失活化後、制限
酵素ＸｈｏＩで切断しアガロース電気泳動でＸｈｏＩリ
ンカーの結合したＬＴ遺伝子を含む 0.6ＫbpのＤＮＡ断
片を分離した。一方、〔Itoh,Y.ら,「バイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーショ
ン(Biochem. Bio phys. Res.Comm．)」，138, 268（198
6)〕 に記載のプラスミドｐＧＬＤ906−1を制限酵素Ｘ
ｈｏＩで切断し、このＤＮＡと上記の 0.6ＫbpのＤＮＡ
断片とを混合しＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて、ＧＬ
Ｄプロモーターの下流にヒトＬＴ遺伝子を有する酵母菌
発現用ベクター ｐＴＢ849を構築した(図５)。 【００２４】実施例８．細胞毒性能の評価 １．大腸菌株におけるヒトＬＴの発現 実施例３，４，５および６で作製したプラスミド pＴＢ
622，694，697および848を用いて参考例４記載の大腸菌
ＤＨ１およびＣ 600株を形質転換させた。得られた形質
転換体をＭ９−ＣＡ培地〔実験書(１）69頁〕４ml中37
℃、４時間培養し、インドールアクリル酸25μg／ml添
加し、さらに４時間培養を継続した。集菌後、0.01％リ
ゾチームおよび10％庶糖を含むトリス・塩酸緩衝液（p
Ｈ7.5)0.3mlに懸濁し５℃で１時間反応後氷冷下45秒間
超音波処理した。pＴＢ622,694および 697のＤＨ１形質
転換体の比較を表１に示した。表２にはpＴＢ622および
694のＣ600形質転換体の各種コロニーの比較を示した。
pＴＢ622／Ｃ600−11形質転換体が最大の生物活性を示
した。表３には pＴＢ694および848のＤＨ１形質転換体
の比較を示した。 【００２５】 【表１】 【００２６】 【表２】 【００２７】 【表３】 【００２８】２．酵母菌株におけるヒトＬＴの発現 実施例７で作製したプラスミドpＴＢ849を用いて参考例
５.記載の酵母菌株ＡＨ22Ｒ-を形質転換させた。得られ
た形質転換体を８％庶糖を含む改変 Burkholder 最少培
地〔Toh-E,A.ら「J.Bacteriol.」,113,727（1973)〕 ５
ｍl中 30℃で数日間培養し、適宜25％アンモニア水でｐ
Ｈを６−７に調整した。培養終了後、遠心分離操作によ
り培養上清と菌体はさらに Zymolyaseで溶解後、遠心分
離し菌体抽出液を採取した。培養上清および菌体抽出液
のＬ929 細胞障害活性を測定したところ表４の結果を得
た。 【００２９】 【表４】 【００３０】実施例９．ヒトＬＴの精製 実施例３に記載された方法で調製したプラスミドpＴＢ6
22を用いて参考例４記載の形質転換用大腸菌株ＤＨ１、
Ｃ600 およびＭＭ294をトランスフォームし発現量の大
きいコロニーを選択した。結果は表５に示す通りであっ
た。 【００３１】 【表５】 【００３２】最大の生物活性を示したＣ600−３をＭ９
−ＣＡ培地1.5l中37℃で培養し、約４時間後インドール
アクリル酸25μg／mlを添加し、さらに37℃で４時間培
養した。遠心分離操作で菌体採取後、該菌体を0.03％リ
ゾチーム処理および４回の繰り返し超音波処理で破砕
し、ヒトＬＴを含む菌体抽出液(Ａ)を得た。この溶液の
比活性は 1.1 ×105U／mgであった。次いで該抽出液を
５mＭリン酸緩衝液（pＨ8.0)で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ファロースＣＬ−６Ｂ(ファルマシア社)のカラムに添加
し、同緩衝液で洗浄後0.1ＭＮaＣlを含む同緩衝液で溶
出し比活性7.8×105U／mgの粗精製液（Ｂ）を得た。上
記粗精製液（Ｂ）を塩酸を用いてpＨ 6.0に調整後、0.1
Ｍ ＮaＣl含有５mＭリン酸緩衝液（pＨ6.0）で平衡化し
たブルーセファロースＣＬ-６Ｂカラムに添加し十分洗
浄後、0.5Ｍ ＮaＣlを含む５mＭリン酸緩衝液（pＨ8.0)
で溶出した。同溶出液（Ｃ）の比活性は 7.4 ×106U／m
gであった。さらに溶出液（Ｃ）を５mＭリン酸緩衝液
（pＨ7.3）で平衡化したセファクリルＳ−200 のカラム
でゲルろ過し、比活性 1.6 ×107U／mg の精製液(Ｄ）
を得た。その結果を表６に示した。 【００３３】 【表６】 【００３４】実施例１０．抗ヒトＬＴ抗体 実施例９に記載した方法で精製されたヒトＬＴ100μg／
0.8ml生理食塩水に等量のフロイント・コンプリート・
アジュバンドを添加し十分乳濁後、マウス Balb／c
（♀，n＝4；25μg／0.4ml／マウス)に腹腔内投与し、
３週間隔で追加免疫を実施した。３回免疫後、マウス眼
窩静脈叢より採血し抗ヒトＬＴ含有血清を得た。実施例
９記載の精製ヒトＬＴを固相抗原として用いる酵素イム
ノアッセイにおけるマウス血清の抗体価を図６に示し
た。 次に該抗血清のヒトＬＴに対する中和抗体価を測
定した。詳しくは２倍階段希釈したマウス血清に等量の
ヒトＬＴ抗原液（２ユニット）を添加し37℃で１時間反
応後、Ｌ929 細胞を添加して参考例１記載の通常の細胞
毒性能試験を実施した。ヒトＬＴ抗原液として参考例２
記載の活性化リンパ球培養上清および実施例９記載の菌
体抽出液（Ａ）を使用した。結果は図７に示した通りで
あった。ヒトＬＴに対する中和抗体の産生が４種の抗血
清で確認された。本明細書に記載のＣ600株，プラスミ
ド pＴＢ622またはpＴＢ 697を保持するＣ600株（Ｅ．c
oli Ｃ600／pＴＢ 622，Ｅ．coli Ｃ600／pＴＢ697），
プラスミド pＴＢ618，pＴＢ848，およびptrp781を保持
するＤＨ１株（Ｅ．coli ＤＨ１／pＴＢ 618，Ｅ．coli
ＤＨ１／pＴＢ848，Ｅ．coli ＤＨ１／ptrp 781)プラス
ミド pＴＢ849を保持するＡＨ22Ｒ-株（S.cerevisiae
ＡＨ22Ｒ-／pＴＢ849）の寄託機関の受託番号は表７に
示すとおりである。 【００３５】 【表７】
プチドの遺伝情報を有するポリデオキシリボ核酸（以下
ＤＮＡと略す）に関する。本発明は又、該ＤＮＡを含む
複製可能な組み換えＤＮＡ及び該複製可能な組換ＤＮＡ
で形質転換された大腸菌、枯草菌又は酵母に関する。該
ＤＮＡが有する遺伝情報を発現して得られる新規生理活
性ポリペプチド及びその製造方法に関しても参考のため
に説明する。本明細書においてアミノ酸およびペプチド
は IUPAC-IUB生化学命名委員会(CBN)で採用された略記
法により表示され、例えば下記の略号が使用される。な
お、アミノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ体を示すものとする。 Ｇｌｎ：グルタミン残基 Ａｓｐ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ：プロリン残基 Ｔｙｒ：チロシン残基 Ｖａｌ：バリン残基 Ｌｙｓ：リジン残基 Ｇｌｕ：グルタミン酸残基 Ａｌａ：アラニン残基 Ａｓｎ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ：ロイシン残基 Ｐｈｅ：フエニルアラニン残基 Ｇｌｙ：グリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 Ｓｅｒ：セリン残基 Ｔｈｒ：スレオニン残基 Ｉｌｅ：イソロイシン残基 Ｔｒｐ：トリプトフアン残基 Ａｒｇ：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 又、本明細書中においてＤＮＡのポリマー又はオリゴマ
ーは下記の如き略号の配列により表記する。 Ａ：２’−デオキシアデニル酸残基 Ｃ：２’−デオキシシチジル酸残基 Ｇ：２’−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特にことわらない限り、配列の左から右への方向は５’
から３’への方向を示すものとする。 【０００２】 【従来の技術】リンホトキシン（以下ＬＴと略す）はリ
ンパ球由来の抗腫瘍活性を有する蛋白で、マクロフアー
ジ由来の癌壊死因子（以下ＴＮＦと略す）と共にその臨
床応用に期待が寄せられている。これらのＬＴやＴＮＦ
はそれぞれリンパ球やマクロフアージにエンドトキシン
やホルボールエステルを添加し活性化することにより得
られていたが、近年遺伝子操作技術の進歩に伴いその構
造が明らかになり、これらの蛋白をコードする遺伝子を
用いることにより微生物又は細胞培養で該蛋白を製造す
ることが可能となった。Ｇrayら〔ネイチャー(Nature),
312巻(1984年)721頁〕及びPennicaら〔ネイチャー(Natu
re),312巻(1984年)724頁〕はそれぞれこの遺伝子操作技
術を駆使してそのクローニングに成功した。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】一方これらの技術の進
歩に伴い、形質転換体よりの該蛋白の抽出が大きな問題
となっている。上記のＬＴに関してもその抗腫瘍性を損
うことなく菌体より効率良く該ＬＴを抽出する方法につ
いて満足すべき結果を得ていないのが現状である。すな
わち形質転換体内に産生されたＬＴを抽出するためには
菌体の破砕が必要であるが、この際蛋白変性剤として７
Ｍグアニジン塩酸塩や８Ｍ尿素もしくは２％ドデシル硫
酸ナトリウム（SDS)を用いるとＬＴの活性に重大な影響
を与え非可逆的な失活をもたらす。そのため緩和な菌体
破砕条件としてリゾチーム分解と超音波処理が考えられ
るが、この条件では回収率が低い。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる技
術的背景のもとに遺伝子操作技術を用いて、抗腫瘍活性
の高い蛋白を好収率で抽出することを目的として種々の
ＬＴ遺伝子を構築し、該組み換えＤＮＡを含有する形質
転換体で遺伝情報を発現させ産生されたＬＴの細胞毒性
を測定した結果、Ｎ末端にＰｒｏもしくはＰｈｅを有
し、かつ１０から２１個のＮ末端アミノ酸、ペプチドを
欠損するＬＴムテインが１７１個の全アミノ酸配列を有
するＬＴよりも生物活性を損わない緩和な条件で好収率
で抽出、精製されるという新知見を得、これに基づいて
更に研究した結果、本発明を完成したものである。すな
わち、本発明は次の如きアミノ酸配列を有する蛋白質を
コードする塩基配列を含むポリデオキシリボ核酸を包含
する。 H-(Met)n-R1-R2-Ala-His-Ser-Thr-Leu-Lys-Pro-Ala- Ala-His-Leu-Ile-Gly-Asp-Pro-Ser-Lys- Gln-Asn-Ser-Leu-Leu-Trp-Arg-Ala-Asn- Thr-Asp-Arg-Ala-Phe-Leu-Gln-Asp-Gly- Phe-Ser-Leu-Ser-Asn-Asn-Ser-Leu-Leu- Val-Pro-Thr-Ser-Gly-Ile-Tyr-Phe-Val- Tyr-Ser-Gln-Val-Val-Phe-Ser-Gly-Lys- Ala-Tyr-Ser-Pro-Lys-Ala-Thr-Ser-Ser- Pro-Leu-Tyr-Leu-Ala-His-Glu-Val-Gln- Leu-Phe-Ser-Ser-Gln-Tyr-Pro-Phe-His- Val-Pro-Leu-Leu-Ser-Ser-Gln-Lys-Met- Val-Tyr-Pro-Gly-Leu-Gln-Glu-Pro-Trp- Leu-His-Ser-Met-Tyr-His-Gly-Ala-Ala- Phe-Gln-Leu-Thr-Gln-Gly-Asp-Gln-Leu- Ser-Thr-His-Thr-Asp-Gly-Ile-Pro-His- Leu-Val-Leu-Ser-Pro-Ser-Thr-Val-Phe- Phe-Gly-Ala-Phe-Ala-Leu-OH ???、R1はＰｒｏ又はＰｈｅ、Ｒ2はAla-Gln-Thr-Ala-Arg
-Gln-His-Pro-Lys-Met-His-Leu のＣ末端から数えて１
個または２個以上のアミノ酸を示し、ｎは０又は１を示
す。〕本発明は形質転換された微生物中で上記のアミノ
酸配列を含むポリペプチドを発現しうる複製可能な組み
換えＤＮＡに係る。このような組み換えＤＮＡとして
は、例えば pＴＢ622、pＴＢ697、pＴＢ848および pＴ
Ｂ849などが挙げられる。更に本発明は上記ＬＴのアミ
ノ酸配列を示すポリペプチドを発現しうる複製可能な組
み換えＤＮＡで形質転換された微生物に係り、このよう
な微生物は、大腸菌、枯草菌、酵母である。更に本発明
では、Ｎ末端欠損ＬＴ遺伝子をコードする遺伝子を、微
生物中で発現させることからなるＬＴの製造方法につい
ても参考のため説明する。詳しくは、複製可能な組み換
えＤＮＡで形質転換された微生物を増殖させ、該ペプチ
ドを効率良く回収することからなる該ポリペプチドの製
造方法について説明する。 【０００５】本発明のＮ末端欠損ＬＴをコードするＤＮ
Ａは、例えば下記の方法により調製できる。 １． 12−O−テトラデカノイルホルボール− 13−アセ
テート（ＴＰＡ）およびコンカナバリンＡ（ＣonＡ）で
ＬＴ合成を誘導させたヒト末梢リンパ球より公知の方法
でｍ−ＲＮＡを採取することができ、さらにそれから約
５×105個のcＤＮＡライブラリーを作製することができ
る。 ２． ＬＴの部分ペプチド鎖をコードする通常10-merか
ら50-merのオリゴヌクレオチドを合成しプローブとして
使用し、ＬＴ cＤＮＡのスクリーニングを実施する。例
えばＣ末端側18-mer（ＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴ
ＡＣＴ)の合成ヌクレオチドを使用した時、約50個のク
ローンを得ることができる。 ３． 得られたＬＴ cＤＮＡクローンからプラスミドを
単離し塩基配列を決定する。既報のＬＴのアミノ酸配列
をコードするプラスミドを選択し、これを適当な制限酵
素で切断し、適宜発現ベクターに導入して、そのＤＮＡ
を含む組み換えＤＮＡを作製することができる。 ４． ３．で調製されたベクターを使用して各種宿主、
例えば大腸菌を形質転換し、ＬＴをコードするＤＮＡを
保持する菌株を得ることができる。 ５． ４．で形質転換体を培養しプラスミドを単離した
のち、以下のようにしてＮ末端欠損ＬＴをコードするＤ
ＮＡを調製できる。 ヒトＬＴ遺伝子の場合には、Ｎ末端側より20−21番
目のメチオニン−ヒスチジンをコードする領域に制限酵
素ＮsiＩ認識部位が存在する。そこでＬＴ遺伝子を Ｎs
iＩ で切断することにより、Ｎ末端欠損ＬＴをコードす
るＤＮＡ断片を得ることができる。この断片に 【０００６】 【化１】 【０００７】の配列を含む適当なアダプターを結合させ
ることによりＬＴ（20−171)をコードするＤＮＡを作製
し、適当なベクターに挿入する。 ＮsiＩ切断後のＮ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡ
断片に化学合成したＤＮＡを結合させる。その際、ＬＴ
のＮ末端10番目のアラニンから20番目のメチオニンまで
のペプチド鎖をコードするＤＮＡか、あるいは該ペプチ
ド鎖内の一部のアミノ酸またはペプチドを欠損もしくは
他のものに置換したペプチドをコードするＤＮＡを使用
することができ、読み枠を正しく保つように合成すれば
よい。 同様にヒトＬＴ遺伝子の場合、Ｎ末端側より９−10
番目のセリン−アラニンをコードする領域に制限酵素Ｐ
vuII認識部位が存在する。そこでＬＴ遺伝子をＰvuIIで
切断し、Ｎ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡ断片を得る
ことができる。この断片に 【０００８】 【化２】 【０００９】の配列を含む適当なアダプターを結合させ
ることによりＬＴ（10−171)をコードするＤＮＡを作製
し、適当なベクターに挿入する。 ＰvuII切断後のＮ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡ
断片をさらにエキソヌクレアーゼ、例えばヌクレアーゼ
ＢＡＬ31で１−10個のアミノ酸をコードする領域を除去
し、その中で遺伝子の読み枠が正しく保たれているもの
を選び出すことによりＬＴ（ｘ−171)，ｘ=10〜20をコ
ードするＤＮＡを調製することができる。 また特定部位指向性変異（site-directed mutagene
sis)〔Smith,M.and Gillam,S,「ジェネティック エンジ
ニアリング(Genetic Engineering)」,３,１(1981)〕の
手法を応用することもできる。すなわちＰvuII切断後の
Ｎ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡ断片をベクターＭ13
に挿入し、これを大腸菌ＪＭ103(Pharmacia P-L Bioche
micals)に感染させる。成育後、ブロス中に放出された
Ｍ13ファージをポリエチレングリコールで沈殿させ、つ
いでフェノール処理によってＭ13ファージ１本鎖ＤＮＡ
を得ることができる。次にＬＴのＮ末端側10番目のアラ
ニンから20番目のメチオニンまでのペプチド鎖内の一部
のアミノ酸またはペプチドを欠損もしくは他のものに置
換したペプチドをコードするＤＮＡを化学合成によって
作製しプライマーとして使用できる。このプライマーと
先に調製したＭ13ファージＤＮＡとを混合し、ＤＮＡポ
リメラーゼＩラージ・フラグメントの作用によって２本
鎖にしたのち、Ｔ4ＤＮＡリガーゼの作用によって環状
化することができる。この環状ＤＮＡを大腸菌ＪＭ103
に導入し、放出されてくるＭ13ファージＤＮＡをフィル
ターに転移させたのち、32Ｐで標識した該合成プライマ
ーを用いてプラーク・ハイブリダイゼイション〔Maniat
is,T.ら「モレキュラー クローニング, ア ラボラトリ
ィー・マニュアル(Molecular Cloning,A Laboratory Man
nual)」,Cold Spring Harbor Laboratory,P.312(198
2)〕を行う。強いシグナルが検出されたファージからＤ
ＮＡを調製し、適当な制限酵素で切り出し、このＤＮＡ
断片をプラスミドに組み込むことにより修飾されたＮ末
端欠損ＬＴをコードするＤＮＡが得られる。ヒトＬＴ遺
伝子の全体または一部を含むプラスミドＤＮＡ、コスミ
ドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどを特定部位指向性変異の
ための鋳型ＤＮＡとして用いることができる。Ｍ13ファ
ージやφX174ファージは、１本鎖ＤＮＡが容易に調製で
きるので、鋳型ＤＮＡとしてより望ましい。例えばＭ13
ファージやφX174ファージにヒトＬＴ遺伝子の全体また
は一部が組み込まれたものを使用する時は、ブロス中に
存在するファージ粒子をポリエチレングリコールで沈殿
させ、フェノール処理で除蛋白を行い、ついでエタノー
ル沈殿を行いファージ粒子内にあった１本鎖ＤＮＡを得
ることができる。また鋳型ＤＮＡとしてヒトＬＴ遺伝子
の全体または一部が組み込まれた２本鎖のプラスミドＤ
ＮＡやコスミドＤＮＡを用いる時は、２本鎖ＤＮＡを 1
00℃で１分から10分、望ましくは３分から５分熱処理し
た後、氷水で急冷し１本鎖ＤＮＡに変性させて使用する
ことができる。特定部位指向性変異のためのプライマー
は、変換しようとするＤＮＡ配列を持ち、鋳型ＤＮＡと
ハイブリダイズしてＤＮＡ合成時のプライマーとして機
能しうるものであれば、どのようなＤＮＡ配列のもので
もよい。またプライマーの作製は、どのような方法でも
よいが、化学合成で適当な配列の１本鎖ＤＮＡを作るこ
とが望ましい。このようなプライマーと先に調製した１
本鎖ＤＮＡとを混合し、ＤＮＡポリメラーゼＩラージ・
フラグメントの作用によって２本鎖ＤＮＡに修復した
後、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼの作用によって環状化すること
ができる。この環状ＤＮＡを大腸菌に導入した後、ラジ
オアイソトープで標識したプライマーをプローブに用い
て、プラーク・ハイブリダイゼイション〔Maniatis,T.
ら「モレキュラー クローニング, ア ラボラトリィー・
マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Mannua
l)」, Cold Spring Harbor Laboratory,P.312(1982)〕
や、コロニー・ハイブリダイゼイション〔同 P.326〕を
行い、目的とする変異体を選び出すことができる。この
ようにして得られたプラークやコロニーからファージＤ
ＮＡやプラスミドＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを用いてＮ
末端欠損ＬＴ遺伝子を調製することができる。 【００１０】このようにして得られるＮ末端欠損ＬＴを
コードするＤＮＡを各種宿主（例、大腸菌，枯草菌，酵
母）で機能するプロモーター領域の３′末端に挿入する
ことにより、Ｎ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡを発現
させうる組み換えＤＮＡを構築することができる。プロ
モーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼが結合することに
よってmＲＮＡ合成を開始させるのに必要な部位を含む
領域であれば、いかなるものであってもよい。たとえば
大腸菌を宿主として用いる場合、Ｎ末端欠損ＬＴをコー
ドするＤＮＡを大腸菌で機能しうるプロモーター領域の
３′末端に挿入すれば、Ｎ末端欠損ＬＴをコードするＤ
ＮＡを発現しうる組み換えＤＮＡが構築できる。またこ
のように大腸菌を宿主とする場合のベクターとしてpＢ
Ｒ322,pＢＲ325，ptrp781，pＵＣ８，pＵＣ９，pＪＢ８
などが用いられ、これにＮ末端欠損ＬＴをコードするＤ
ＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼの作用により挿入する。この
反応液を用いて、大腸菌(例、Ｃ600株，MM294株，ＤＨ
１株，Ｗ3110株，ＲＲ１株，ＰＲ13株など）を公知の方
法〔Cohen,S.N.ら,「プロシージング オブ ナショナル
アカデミー オブサイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A）」 69,2110(1972)〕もしくはそれに準ずる方法によ
って形質転換する。使用するプロモーターは、trpプロ
モーター(trp-p)に限定する必要はなく、たとえばrecA
プロモーター〔特開昭59−65099号〕,lacプロモーター,
λＰLプロモーターなどを使用してもよい。上記のよう
にして得られたＮ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡを含
む新規な組み換えプラスミドＤＮＡを保持する形質転換
体は、たとえばアンピシリン耐性、テトラサイクリン耐
性あるいはこれら両薬剤耐性を表現形として選ぶことが
できる。上記の形質転換体をそれ自体公知の培地で培養
する。培地としては、例えばＬブロス，ペナセイ(Penas
say) ブロスおよびグルコース,カザミノ酸を含むＭ−９
培地〔 Miller,J.,「エクスペリメンツ イン モレキュ
ラー ジェネティクス(Experiments in Molecular Genet
ics)」,431-433(Cold Spring Harbor Laboratory,New Y
ork,1972)〕が挙げられる。ここに、必要によりプロモ
ーターを効率よく働かせるために、たとえば3β-インド
リルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。該
形質転換体の培養は通常 15〜43℃,好ましくは28〜40℃
で２〜24時間，好ましくは４〜16時間行い、必要により
通気や攪拌を加えることもできる。 宿主として、たとえ
ば枯草菌または酵母を使用する場合においては枯草菌ま
たは酵母で機能し得るプロモーター領域の３’末端にＮ
末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡを挿入し、自体公知の
方法により、該組み換えＤＮＡで宿主を形質転換させ、
形質転換体を培養することにより、Ｎ末端欠損ＬＴを製
造することができる。この場合ベクターとして、すでに
多くのものが知られており、該遺伝子の発現に利用でき
るものであれば、いかなるものであってもよい。具体的
には酵母の場合には、ｐＰＨＯ１７，ｐＧＬＤ906，ｐ
ＧＬＤ906−１やｐｃＤＸ〔Okayama,H.,& Berg,P.,「モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Ce
ll.Biol.)」３，280（1983)〕および ｐＫＳＶ−10（フ
ァルマシア社製）などが挙げられ、枯草菌の場合には、
ｐＵＢ110，ｐＴＢ５，ｐＣ195などが挙げられる。プロ
モーターとしては、酵母について例えば、ＰＨ０５，Ｇ
ＬＤ，ＰＧＫ，ＡＤＨ，ＰＨＯ８１プロモーターなど
が、枯草菌について例えばＳＰ０１，ＳＰ０２，ｐｅｎ
Ｐなどが挙げられる。上記の宿主のなかでも、大腸菌が
より好ましい。 培養後、公知の方法で菌体を集め、大
腸菌の形質転換体の場合には菌体を適当な緩衝液、例え
ばトリス−塩酸緩衝液（pＨ7.5)に懸濁し、超音波処
理、リゾチームおよび／または凍結融解によって菌体を
破壊したのち、遠心分離によりＮ末端欠損ＬＴを含む上
澄液を得る方法などが適宜用い得る。好ましくは、菌体
を集めて緩衝液に懸濁しリゾチームを加えて０〜10℃で
10分〜３時間インキュベートし、０〜10℃で30秒〜５分
間超音波処理後、遠心分離して上澄を得る方法が用いら
れる。抽出液からのＮ末端欠損ＬＴの分離、精製はたと
えばゲルろ過、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、超遠
心、ヒトＬＴ抗体を用いるアフィニティクロマトグラフ
ィーにより行うことができる。以上により、本発明者が
Ｎ末端欠損ＬＴの遺伝子を取得し、この遺伝子を用いる
Ｎ末端欠損ＬＴの製造方法が示されたが、本発明は以上
に限定されるものではない。本発明において各アミノ酸
に対応するコドン(遺伝暗号)の使用頻度が異なる等の理
由により、アミノ酸配列を変えることなく塩基配列の一
部又は全部を有機化学的に合成された人工のＤＮＡに置
き換えることも可能である。本発明の生理活性ポリペプ
チドは正常細胞にはその細胞毒性を発揮せず、腫瘍細胞
や形質転換細胞を選択的に殺傷するので制癌剤としてそ
の有用性が期待される。又該ペプチドは既報の171個の
アミノ酸配列を有するLT(1-171)と同等の生物活性を有
し、しかも遺伝子操作技術を駆使して産生され菌体内に
貯溜した該蛋白は、前記LT(1-171)の数10倍以上の好収
率で回収されうる。 【００１１】 【実施例】以下に参考例・実施例により本発明を具体的
に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するもので
ないことはいうまでもない。本発明の実施にあたり組み
換えＤＮＡの作製、組み換え体の微生物への導入は特に
断わらない限り下記の実験書に従って実施した。 (1)T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook,「モレキュ
ラー クローニング(Molecular Clo ning)」, Cold S
pring Harbor Laboratory刊(米国) (2)高木康敬 編著、「遺伝子操作実験法」、講談社刊 参考例 1. Ｌ929細胞障害活性評価 ＬＴの細胞毒性能はL929細胞を用いて〔ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー(J.Immunol.), 126巻(1981年)235頁〕
あるいは〔ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ
(J.Immunol. Methods), 70巻(1984年)257頁〕の方法に
準じて測定した。即ち、96穴の組織培養用マイクロプレ
ート(フローラボラトリー社)を用いて10％のウシ胎児血
清(FCS)を含むRPMI 1640培地で2倍階段希釈した試料50
μlにマイトマイシンＣ 4μg/mlを含む上記培地に懸濁
した4×105個/mlの濃度のＬ929細胞50μlを添加し5％炭
酸ガス中37℃,48時間培養した。培養終了後ジメチルチ
アゾイル・ジフェニルテトラゾリウム臭酸塩 (MTT)を用
いて生細胞を染色し10％SDS-0.01N HClで溶解後590nmに
おける吸光度をタイターテック・マルチスキャン(フロー
ラボラトリー社)で測定した。得られた吸光度は生細胞
数に比例する。Ｌ929細胞の50％を殺すために必要な生
物活性量を1ユニット/mlと定義し試料の生物活性をユニ
ット/mlで表した。 参考例 2. 天然の（Natural）ＬＴの採取 Hinumaら〔Microbiol, Immunol, 28巻 (1984年) 935
頁〕の方法に従い、ＴＰＡとConAとで活性化した正常ヒ
ト末梢リンパ球を、10％Ｆetal Calf Serum (FCS)含有R
PMI 1640培地中37℃,５％ CO2で2〜3日間培養し、その
培養上清からＬＴ含有液を得た。 参考例 ３．形質転換用大腸菌株の作製 大腸菌ＤＨ１株のコロニーをＳＯＢ培地〔実験書(1)69
頁〕を用いて550nmの吸光度が0.5になるまで培養した。
該培養30mlを集め、12mlの0.1Ｍ RbCl-10mＭ CaCl2-50m
M MnCl2-15％グリセロールを含む0.2Ｍ酢酸緩衝液(pH5.
8)に懸濁し5分間氷冷後遠心し、次いで10mＭ RbCl-75m
Ｍ CaCl2-15％グリセロールを含む10mＭ MOPS緩衝液(p
Ｈ6.5 )に再懸濁した。15分間氷冷後ドライアイス-エタ
ノールで急冷凍結後−70℃で保存した。 参考例 ４.形質転換用大腸菌株の作製 ＤＨ１，Ｃ600，ＭＭ294 の各種大腸菌株のコロニーをS
OB培地10mlを用いて550nm の吸光度が0.3になるまで培
養した。氷冷後遠心分離し得られた菌体を5mlの10mM Na
Clで洗浄した。菌体を5mlの50mM CaCl2に再懸濁し氷冷
下15分間放置した。遠心分離後、0.5mlの50mM CaCl2に
懸濁し直ちに使用した。 参考例 ５．形質転換用酵母菌株の作製 Beggs,J.D.らの方法に従った、すなわち、Saccharomyce
s cerevisiae ＡＨ22Ｒ~のコロニーをＹＰＤＡ培地（10
ｇ/l酵母エキス, 20ｇ/lポリペプトン, 10ｇ/lグルコー
スおよび0.4ｇ/lアデニンを含有）を用いて一晩静置培
養した。該培養４ｍlを集め、菌体を４ｍlの0.1Ｍ sodi
um citrate（ｐＨ5.8)−0.01Ｍ ＥＤＴＡ−1.2Ｍ sorbi
tolで洗浄した後、４ｍlの１mg／ｍl Zymolyase 100Ｔ
（生化学工業)−1.1Ｍ sodium citrate（ｐＨ5.8)−0.0
1Ｍ ＥＤＴＡ−1.2Ｍ sorbitolに懸濁し、30℃にて２時
間反応させ細胞壁を溶解させた。次いで菌体を 10ｍＭ
ＣａＣl2−1.2Ｍ sorbitolで２回洗浄した後、同溶液0.
1ｍlの同溶液に懸濁し直ちに使用した。 【００１２】実施例１． ヒトリンパ球由来mＲＮＡを用いたcＤＮＡライブラリー
の作製 ヒト末梢血より調製したリンパ球をＴＰＡ(15ng/ml)と
ＣonA(40μg/ml)とを含むＲＰＭＩ 1640培地(10％FCSを
含む )中、37℃で培養し、ＬＴを誘導させた。24時間
後、この誘導した1×1010個のヒトリンパ球を５Ｍグラ
ニジンチオシアネート、５％メルカプトエタノール、50
mM Tris・HClpH 7.6, 10mM ＥＤＴＡ溶液中でテフロンホ
モゲナイザーによって破壊変性した後Ｎ-ラウロイリル
ザルコシン酸ナトリウムを4％になるように加え、均質
化した混合物を5.7Ｍ塩化セシウム溶液（5.7Ｍ塩化セシ
ウム、0.1Ｍ ＥＤＴＡ)6ml上に重層し、ベックマン Ｓ
Ｗ28のローターを用いて15℃で24,000rpm 48時間遠心処
理を行い、ＲＮＡ沈殿を得た。このＲＮＡ沈殿を0.25％
Ｎ-ラウロイルザルコシン酸ナトリウム溶液にとかした
後、エタノールで沈殿させ、10mgのＲＮＡを得た。この
ＲＮＡを高塩溶液(0.5M NaCl, 10mM Tris・HCl pH 7.6,
1mM EDTA,0.3％ SDS)中でオリゴ(dT)セルロースカラム
に吸着させ、ポリ(Ａ)を含む mＲＮＡを低塩溶液（10mM
Tris-HCl・pH 7.6,1mM EDTA0.3％ SDS )で溶出させる
ことにより、ポリ(Ａ)を含むmＲＮＡ 300μgを分取し
た。この mＲＮＡをさらにエタノールで沈殿させ、0.2m
lの溶液（10mM Tris・HClpH 7.6, 2mM EDTA,0.3％ SDS
)に溶かし、65℃で２分間処理して10−35％ショ糖密度
勾配遠心処理（ベックマンＳＷ28のローターを用いて20
℃,25,000rpmで21時間遠心分離）することにより分画し
た。この各分画につき RNAの一部づつを、アフリカツメ
ガエルの卵母細胞に注入し、合成される蛋白質中のＬＴ
活性を測定し、沈降定数16Ｓ近辺に相当する分画にＬＴ
の活性を検出した。この分画のＬＴ mＲＮＡは約25μg
であった。このポリ(Ａ)ＲＮＡを鋳型として cＤＮＡラ
イブラリーを OkayamaとBerg の方法〔モレキュラー ア
ンド セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.),２巻(19
82年）161頁；同誌,３巻(1983年)280頁〕に従って pcＤ
Ｖ１ベクター、pＬ１リンカーを用いて作製した。環状
化した cＤＮＡを含むベクタープラスミドは大腸菌ＤＨ
１に感染させ、５μgのポリ(Ａ）ＲＮＡより出発して約
５×105個のクローンよりなる大腸菌ＤＨ１を宿主とし
た cＤＮＡライブラリーを得ることができた。 【００１３】実施例２． ヒトＬＴcＤＮＡを含むプラスミドの単離とその塩基配
列の決定 上記大腸菌ＤＨ１を用いたヒト cＤＮＡライブラリーを
ニトロセルロースフィルター（ミリポア社、HATFフィル
ター ）上に約３×１０4クローン／フィルターとなるよ
うに１０枚まき、このフィルターをマスターフィルター
としている各２枚ずつを１組としたレプリカフィルター
計２０枚を作製した。このレプリカフィルター上の大腸
菌を 0.5N ＮaＯＨ溶液でとかし露出変性したプラスミ
ドＤＮＡをフィルター上に乾燥固定した〔Grunstein,M,
＆ Hogness,D,S.,「プロシージング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス」(Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA),72巻(1975年)3961頁〕。一方、既に報告されて
いるＬＴ遺伝子の塩基配列〔 Gray,ら,「ネイチャー(Na
ture)」,312巻(1984年)721頁〕の一部（アミノ酸NO.162
−167に対応する遺伝子部分)に相当するオリゴヌクレオ
チド 【００１４】 【化３】 【００１５】を合成してヒトＬＴcＤＮＡのスクリーニ
ングプローブとした。これらオリゴヌクレオチドプロー
ブの５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ，〔γ−
32Ｐ〕ＡＴＰを用いて32Ｐで標識した。標識したプロー
ブをＤＮＡを固定したレプリカフィルターに別々に会合
させた。会合反応は１０μＣｉの標識プローブを含む５
×ＳＳＣ（0.15M NaCl，0.015MSodium citrate),５×De
nhardt's,0.1％ＳＤＳ，100μg／ml変性サケ精子ＤＮＡ
溶液１０ml中で４０℃１６時間行い、反応後、フィルタ
ーを６×ＳＳＣ，０．1％ＳＤＳ溶液で室温で３０分ず
つ３回、さらに４３℃で６０分ずつ２回洗浄した。〔実
験書（１）309頁〕。洗浄したフィルターよりラジオオ
ートグラムをとり、プローブに対して反応する菌株を１
組２枚のレプリカフィルターのラジオオートグラムを重
ね合わせることにより探した。この方法により約３×1
０5coloniesより、プローブに対して反応する50株の
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１株を得た。これらの菌株よりプラ
スミドＤＮＡをアルカリ法〔Birnboim,H.C. & Doly,J.,
「ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Re
s.),11巻(1979年)1513頁〕によって抽出精製した。ＤＮ
Ａを制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造製）で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動で分画した後、ＤＮＡ断片をアガロー
スゲル中よりニトロセルロースフィルター(エス アンド
エス社，ＢＡ８５）上に移した〔サザンブロッティン
グ法、実験書（１）382頁〕。このフィルターを前記の
オリゴヌクレオチドプローブと会合させると、プラスミ
ドＤＮＡ断片はプローブと反応した。そこで、これらの
うち最大のＢamＨＩＤＮＡ断片（ cＤＮＡ部分）を生じ
たプラスミドを有する１株 Ｅ．coli Ｋ１２ ＤＨ１／p
ＴＢ618 を選び出した。このプラスミドＤＮＡの cＤＮ
Ａ部分の塩基配列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止
法〔 J.Messingら，「ヌクレイック アシッズ リサーチ
(Nucleic Acids Res.),９巻（1981年) 309頁〕によって
決定した。その結果、プラスミドｐＴＢ618 に含まれる
ＬＴ遺伝子は完全ではなく３′末端側非翻訳部分より上
流側Ｎo.18のアミノ酸であるＰroのコドンＣＣＣの第３
番目のＣまでを含むことが判明した。 【００１６】実施例３． ヒトＬＴ(21-171)発現ベクターpＴＢ622の構築 上記で作製したプラスミドpＴＢ618を制限酵素ＮsiＩ
(宝酒造製)とＢａｍＨＩで切断し、ＬＴ遺伝子を含む
１.1キロ塩基対（以下、Ｋbp と略す）のＤＮＡ断片を
分離した。このＤＮＡに Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ
Ｌ社製）を反応させ、末端を平滑化させた後、フレーム
が合うように、１６-merのＡＴＧつきＥcoＲＩリンカー
（ＡＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＴ）をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼによって結合させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを65℃
10分間の熱処理によって失活させたのちさらに制限酵素
ＥcoＲＩで切断し、アガロース電気泳動でリンカーの結
合したＬＴ遺伝子を含む0.6Ｋbp のＤＮＡ断片を分離し
た。一方、Ｋurokawa, T．ら.,「ヌクレイック アシッ
ズリサーチ(Nucl.Acids Res)」11巻(1983年)3077頁に記
載のプラスミドptrp781を制限酵素EcoRIで切断し、5'末
端のリン酸をアルカリ性ホスファターゼ処理によって除
去した。このDNAと、ATGつきＥcoＲＩリンカーの結合し
た、0.6Ｋbp のＬＴＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを作用させて、トリプトファンプロモーターの
下流にＬＴ遺伝子の挿入された、大腸菌のヒトＬＴ発現
ベクターpＴＢ622を構築した(図１)。 【００１７】実施例４．ヒトＬＴ（1-171）発現ベクタ
ーpＴＢ694の構築 工程１(pＴＢ693プラスミドＤＮＡの調製) 図２に示すように、２μgのプラスミドpＴＢ618を0.6ユ
ニットのBal Ｉ(宝酒造製)を用いて37℃で６時間分解し
た。一方ＣＡＧＡＴＣＴＧの８- merで示されるＢgl II
リンカー２μgを0.5mM ＡＴＰと 2.5ユニットのＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼとでリン酸化後、そのリン酸化
リンカー0.2μgを1.6μgの上記Bal I消化pＴＢ618に添
加し35ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ存在下で14℃、
一夜反応した。65℃で５分間不活化後 30ユニットＢgl
IIを用いてトリミングし、1.2 ％のアガロースゲル電気
泳動に供した。4.3Ｋbp に相当する主バンドを切り取
り、トリス・塩酸緩衝液で抽出後 RDPミニカラム(バイオ
ラッド社)で精製した。上記直鎖状ＤＮＡ100ngに10ユニ
ットのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加しpＴＢ693プラスミド
含有ＤＮＡを得、次いで常法に従い大腸菌ＤＨ１株へ形
質転換した。詳しくは、参考例３で作製、−70℃で凍結
保存した形質転換用ＤＨ１菌体を氷冷下除々に融解し、
その懸濁液 100μlにpＴＢ693 含有ＤＮＡ 30ngを添加
した。氷冷下30分間反応後、42℃で90秒間ヒートシヨッ
クを与え、１−２分間氷冷した。0.2mlの20mMグルコー
スを含むＳＯＢ培地を添加し37℃で１時間培養後、該懸
濁液を 35μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレー
ト上にまき37℃で一夜培養した。その結果プラスミドp
ＴＢ693からアンピシリン耐性形質転換のコロニーを得
ることができた。プラスミドpＴＢ693を含有する上記大
腸菌ＤＨ１株を、35μg/ml のアンピシリンを含むＬＢ
培地〔実験書(1)68頁〕250ml中で培養後、実験書(1)88
頁の方法に従ってプラスミドを単離し約300μgのpＴＢ6
93が得られた。 工程２（ヒトＬＴ−cＤＮＡの作成) pＴＢ693プラスミド50μgを100ユニットのＮsiＩと120
ユニットのＢgl II（宝酒造製）とで37℃、１時間分解
し、２％アガロースゲル電気泳動に供した。ＬＴ−cＤ
ＮＡを含むＮsiＩ−Ｂgl II断片に相当する0.56Ｋbpの
バンドを切り取り、工程１で述べたRDPミニカラムを用
いて精製した。一方、ＬＴのＮ末端ペプチド（１−20)
をコードする下記の６本のオリゴヌクレオチド鎖をAppl
ied Biosystems社（米国）の Model 380A-DMA synthesi
zer で化学合成し〔「テトラヘドロン レターズ( Tetra
hedron Lett.)」,21巻（ 1980年）3243頁〕、それら各
１μg の混合物にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ12.5ユ
ニットと１mM ＡＴＰとを加えて37℃、１時間でリン酸
化した。 【００１８】 【化４】 【００１９】70℃、５分間不活化後さらに350ユニット
のＴ4ＤＮＡリガーゼで14℃、一夜反応させ、次いで65
℃で５分間不活化後反応終了液（約3.5μgのＤＮＡを含
む）にＥcoＲＩ(宝酒造製)45ユニット及びＮsiＩ35ユニ
ットを添加し37℃で２時間分解し、10％のポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供した。 約70bp に相当するバ
ンドを切り取り、ＲＤＰミニカラムで精製した。上記約
70bp のＥcoＲＩ−ＮsiＩ断片 30ng に0.56ＫbpのＮsi
Ｉ−Ｂgl II断片110ngを添加し35ユニットのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ存在下で14℃、２時間反応させた。反応終了液
に６ユニットの Ｂgl IIと９ユニットの ＥcoＲＩとで
37℃、１時間分解トリミングし 0.63ＫbpのヒトＬＴ
（１−171)の全アミノ酸配列をコードする cＤＮＡを作
製することができた。 工程３（pＴＢ692プラスミドＤＮＡの調製） ２μgのプラスミドptrp781を32ユニットのＰstＩ（宝酒
造製）で37℃、１時間分解した。反応終了後、ＴＮＥ緩
衝液〔 実験書（１）448頁〕と最終濃度 0.2％のＳＤＳ
を添加してフェノール−クロロホルムで抽出、精製し
た。上記ＰstＩ消化 ptrp781 1μgに0.1mMＸＴＰと４ユ
ニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼとを加え、37℃、５分
間反応後、ＴＮＥ緩衝液およびＳＤＳを添加しフェノー
ル−クロロホルムで抽出、精製した。次に工程１に記載
のリン酸化Ｂgl IIリンカー0.2μgと35ユニットのＴ４
ＤＮＡリガーゼとを上記の ptrp781 ＤＮＡ 0.8μgに加
え14℃で一夜反応した。65℃で５分間不活化後、30ユニ
ットの Ｂgl IIでトリミングしフェノール−クロロホル
ムで抽出し、さらにセファロース４Ｂカラムで精製し
た。その後、10ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し
pＴＢ692含有ＤＮＡを得、次いで工程１記載の常法に従
い大腸菌ＤＨ１株へ形質転換した。但し35μg/mlのアン
ピシリンの代りに10μg/mlのテトラサイクリンを含むＬ
Ｂ寒天プレートを使用し、テトラサイクリン耐性形質転
換菌のコロニーが得られた。該コロニーを10μg／mlの
テトラサイクリンを含むＬＢ培地で培養し、工程１の方
法に従いpＴＢ692プラスミドが得られた。 工程４（pＴＢ694プラスミドＤＮＡの調製） 工程３記載 pＴＢ692プラスミドＤＮＡ10μgにＥcoＲＩ
54ユニットおよびＢglII30ユニットを加え５℃で一夜反
応後、１％アガロースゲル電気泳動で精製し3.3Ｋbpの
ＤＮＡバンドを切り出した。この3.3ＫbpのＤＮＡ36ng
に工程２記載の0.63ＫbpのＤＮＡ 15ngを加え10ユニッ
トＴ４ＤＮＡリガーゼでpＴＢ694含有ＤＮＡを得、工程
３記載の方法に従いテトラサイクリン耐性の形質転換体
を作製し、ヒトＬＴ（１−171）発現用プラスミドpＴＢ
694を得ることができた。 【００２０】実施例５．ヒトＬＴ（11−171）発現ベク
ターpＴＢ697の構築 図３に示すように、10μgのプラスミドpＴＢ694に30ユ
ニットのＰvuII（宝酒造製)を加えて37℃で２時間反応
後、フェノール−クロロホルムで抽出・精製した。一
方、ＧＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣの14-merで示される
ＥcoＲＩリンカー２μgを 0.5mM ＡＴＰと2.5 ユニット
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとでリン酸化後、その
0.5μgを上記のＰvuII消化 pＴＢ694２μgに添加し35ユ
ニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ存在下で14℃一夜反応し
た。65℃で５分間不活化後、45ユニットＥcoＲＩを加え
てトリミングし、0.8 ％のアガロースゲル電気泳動に供
した。3.9Ｋbp に相当する主バンドを切り取り、実施例
４工程１に述べたように RDPミニカラムを用いて精製
し、その直鎖状ＤＮＡ100 ngに10ユニットのＴ４ＤＮＡ
リガーゼを添加しpＴＢ697プラスミド含有ＤＮＡを得、
次いで実施例４工程３記載の常法に従い大腸菌ＤＨ１株
へ形質転換し、その形質転換体からpＴＢ697プラスミド
を得ることができた。 【００２１】実施例６．ヒトＬＴ（21−171）発現ベク
ターpＴＢ848の構築（図４） 実施例４で作製したプラスミドpＴＢ694を制限酵素Ｎｓ
ｉＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを反応させ末端
を平滑化後、フレームが合うように16-merのＡＴＧつき
ＥcoＲＩリンカー（ＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣ
Ｃ）をＴ４ＤＮＡリガーゼによって結合させた。Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを熱処理により失活させたのち、さらに２
種の制限酵素 ＥcoＲＩとＢgl IIとで切断し、アガロー
ス電気泳動で0.56 kbpのＤＮＡ断片を分離した。一方、
同じプラスミドpＴＢ 694を ＥcoＲＩとＢgl IIとで切
断し、次いで上記の 0.56 kbpのＤＮＡ断片を添加し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用させて、トリプトファンプロ
モーターの下流にＬＴ遺伝子の挿入された、大腸菌のヒ
トＬＴ発現ベクターpＴＢ848を構築した（図４）。 実施例７．ヒトＬＴ（21−171）酵母菌発現ベクターpＴ
Ｂ849の構築（図５） プラスミドpＴＢ 694を制限酵素ＮｓｉＩとＢgl IIとで
切断し、ＬＴ遺伝子を含む 0.56Ｋbp ＤＮＡ断片を分離
した。このＤＮＡにＴ４ＤＮＡポリメラーゼを反応さ
せ、末端を平滑化後フレームが合うように20-merの合成
オリゴマー 【００２２】 【化５】 【００２３】をＴ４ＤＮＡリガーゼによって結合させ
た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを熱処理により失活化後、制限
酵素ＸｈｏＩで切断しアガロース電気泳動でＸｈｏＩリ
ンカーの結合したＬＴ遺伝子を含む 0.6ＫbpのＤＮＡ断
片を分離した。一方、〔Itoh,Y.ら,「バイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーショ
ン(Biochem. Bio phys. Res.Comm．)」，138, 268（198
6)〕 に記載のプラスミドｐＧＬＤ906−1を制限酵素Ｘ
ｈｏＩで切断し、このＤＮＡと上記の 0.6ＫbpのＤＮＡ
断片とを混合しＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて、ＧＬ
Ｄプロモーターの下流にヒトＬＴ遺伝子を有する酵母菌
発現用ベクター ｐＴＢ849を構築した(図５)。 【００２４】実施例８．細胞毒性能の評価 １．大腸菌株におけるヒトＬＴの発現 実施例３，４，５および６で作製したプラスミド pＴＢ
622，694，697および848を用いて参考例４記載の大腸菌
ＤＨ１およびＣ 600株を形質転換させた。得られた形質
転換体をＭ９−ＣＡ培地〔実験書(１）69頁〕４ml中37
℃、４時間培養し、インドールアクリル酸25μg／ml添
加し、さらに４時間培養を継続した。集菌後、0.01％リ
ゾチームおよび10％庶糖を含むトリス・塩酸緩衝液（p
Ｈ7.5)0.3mlに懸濁し５℃で１時間反応後氷冷下45秒間
超音波処理した。pＴＢ622,694および 697のＤＨ１形質
転換体の比較を表１に示した。表２にはpＴＢ622および
694のＣ600形質転換体の各種コロニーの比較を示した。
pＴＢ622／Ｃ600−11形質転換体が最大の生物活性を示
した。表３には pＴＢ694および848のＤＨ１形質転換体
の比較を示した。 【００２５】 【表１】 【００２６】 【表２】 【００２７】 【表３】 【００２８】２．酵母菌株におけるヒトＬＴの発現 実施例７で作製したプラスミドpＴＢ849を用いて参考例
５.記載の酵母菌株ＡＨ22Ｒ-を形質転換させた。得られ
た形質転換体を８％庶糖を含む改変 Burkholder 最少培
地〔Toh-E,A.ら「J.Bacteriol.」,113,727（1973)〕 ５
ｍl中 30℃で数日間培養し、適宜25％アンモニア水でｐ
Ｈを６−７に調整した。培養終了後、遠心分離操作によ
り培養上清と菌体はさらに Zymolyaseで溶解後、遠心分
離し菌体抽出液を採取した。培養上清および菌体抽出液
のＬ929 細胞障害活性を測定したところ表４の結果を得
た。 【００２９】 【表４】 【００３０】実施例９．ヒトＬＴの精製 実施例３に記載された方法で調製したプラスミドpＴＢ6
22を用いて参考例４記載の形質転換用大腸菌株ＤＨ１、
Ｃ600 およびＭＭ294をトランスフォームし発現量の大
きいコロニーを選択した。結果は表５に示す通りであっ
た。 【００３１】 【表５】 【００３２】最大の生物活性を示したＣ600−３をＭ９
−ＣＡ培地1.5l中37℃で培養し、約４時間後インドール
アクリル酸25μg／mlを添加し、さらに37℃で４時間培
養した。遠心分離操作で菌体採取後、該菌体を0.03％リ
ゾチーム処理および４回の繰り返し超音波処理で破砕
し、ヒトＬＴを含む菌体抽出液(Ａ)を得た。この溶液の
比活性は 1.1 ×105U／mgであった。次いで該抽出液を
５mＭリン酸緩衝液（pＨ8.0)で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ファロースＣＬ−６Ｂ(ファルマシア社)のカラムに添加
し、同緩衝液で洗浄後0.1ＭＮaＣlを含む同緩衝液で溶
出し比活性7.8×105U／mgの粗精製液（Ｂ）を得た。上
記粗精製液（Ｂ）を塩酸を用いてpＨ 6.0に調整後、0.1
Ｍ ＮaＣl含有５mＭリン酸緩衝液（pＨ6.0）で平衡化し
たブルーセファロースＣＬ-６Ｂカラムに添加し十分洗
浄後、0.5Ｍ ＮaＣlを含む５mＭリン酸緩衝液（pＨ8.0)
で溶出した。同溶出液（Ｃ）の比活性は 7.4 ×106U／m
gであった。さらに溶出液（Ｃ）を５mＭリン酸緩衝液
（pＨ7.3）で平衡化したセファクリルＳ−200 のカラム
でゲルろ過し、比活性 1.6 ×107U／mg の精製液(Ｄ）
を得た。その結果を表６に示した。 【００３３】 【表６】 【００３４】実施例１０．抗ヒトＬＴ抗体 実施例９に記載した方法で精製されたヒトＬＴ100μg／
0.8ml生理食塩水に等量のフロイント・コンプリート・
アジュバンドを添加し十分乳濁後、マウス Balb／c
（♀，n＝4；25μg／0.4ml／マウス)に腹腔内投与し、
３週間隔で追加免疫を実施した。３回免疫後、マウス眼
窩静脈叢より採血し抗ヒトＬＴ含有血清を得た。実施例
９記載の精製ヒトＬＴを固相抗原として用いる酵素イム
ノアッセイにおけるマウス血清の抗体価を図６に示し
た。 次に該抗血清のヒトＬＴに対する中和抗体価を測
定した。詳しくは２倍階段希釈したマウス血清に等量の
ヒトＬＴ抗原液（２ユニット）を添加し37℃で１時間反
応後、Ｌ929 細胞を添加して参考例１記載の通常の細胞
毒性能試験を実施した。ヒトＬＴ抗原液として参考例２
記載の活性化リンパ球培養上清および実施例９記載の菌
体抽出液（Ａ）を使用した。結果は図７に示した通りで
あった。ヒトＬＴに対する中和抗体の産生が４種の抗血
清で確認された。本明細書に記載のＣ600株，プラスミ
ド pＴＢ622またはpＴＢ 697を保持するＣ600株（Ｅ．c
oli Ｃ600／pＴＢ 622，Ｅ．coli Ｃ600／pＴＢ697），
プラスミド pＴＢ618，pＴＢ848，およびptrp781を保持
するＤＨ１株（Ｅ．coli ＤＨ１／pＴＢ 618，Ｅ．coli
ＤＨ１／pＴＢ848，Ｅ．coli ＤＨ１／ptrp 781)プラス
ミド pＴＢ849を保持するＡＨ22Ｒ-株（S.cerevisiae
ＡＨ22Ｒ-／pＴＢ849）の寄託機関の受託番号は表７に
示すとおりである。 【００３５】 【表７】
【図面の簡単な説明】
【図１】組み換えプラスミドpＴＢ622の組み立てを示す
模式図である。 【図２】組み換えプラスミドpＴＢ694の組み立てを示す
模式図である。 【図３】組み換えプラスミドpＴＢ697の組み立てを示す
模式図である。 【図４】組み換えプラスミドpＴＢ848の組み立てを示す
模式図である。 【図５】組み換えプラスミドpＴＢ849の組み立てを示す
模式図である。 【図６】抗ＬＴ血清のELISA 抗体価を測定した結果を示
すグラフである。 【図７】抗ＬＴ血清の中和抗体価を測定し、(Ａ)、(Ｂ)
はそれぞれ活性化リンパ球培養上清およびＬＴ発現大腸
菌体抽出液を抗原とした時の結果を示すグラフである。 【符号の説明】 ●，○，□，△ はＬＴ免疫マウス血清、■ は非免疫マ
ウス血清を表わす。 Ｂ ：Ｂａl Ｉ Ｂａ：Ｂａｍ ＨＩ Ｂｇ：Ｂｇl II Ｃ ：Ｃlａ Ｉ Ｅ ：Ｅｃｏ ＲＩ Ｈ ：Ｈｉｎｄ III Ｎ ：Ｎｓｉ Ｉ ＰもしくはＰｓ：Ｐｓｔ Ｉ Ｐｕ：Ｐｖｕ II Ｓ ：Ｓａl Ｉ Ｘ ：Ｘｈｏ Ｉ
模式図である。 【図２】組み換えプラスミドpＴＢ694の組み立てを示す
模式図である。 【図３】組み換えプラスミドpＴＢ697の組み立てを示す
模式図である。 【図４】組み換えプラスミドpＴＢ848の組み立てを示す
模式図である。 【図５】組み換えプラスミドpＴＢ849の組み立てを示す
模式図である。 【図６】抗ＬＴ血清のELISA 抗体価を測定した結果を示
すグラフである。 【図７】抗ＬＴ血清の中和抗体価を測定し、(Ａ)、(Ｂ)
はそれぞれ活性化リンパ球培養上清およびＬＴ発現大腸
菌体抽出液を抗原とした時の結果を示すグラフである。 【符号の説明】 ●，○，□，△ はＬＴ免疫マウス血清、■ は非免疫マ
ウス血清を表わす。 Ｂ ：Ｂａl Ｉ Ｂａ：Ｂａｍ ＨＩ Ｂｇ：Ｂｇl II Ｃ ：Ｃlａ Ｉ Ｅ ：Ｅｃｏ ＲＩ Ｈ ：Ｈｉｎｄ III Ｎ ：Ｎｓｉ Ｉ ＰもしくはＰｓ：Ｐｓｔ Ｉ Ｐｕ：Ｐｖｕ II Ｓ ：Ｓａl Ｉ Ｘ ：Ｘｈｏ Ｉ
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(56)参考文献 特開 昭61−56197（ＪＰ，Ａ)
特開 昭62−181298（ＪＰ，Ａ)
Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，100（３)
（1986）．Ｐ．727−733
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むこ
とを特徴とするポリデオキシリボ核酸。 H-(Met)n-R1-R2-Ala-His-Ser-Thr-Leu-Lys-Pro-Ala- Ala-His-Leu-Ile-Gly-Asp-Pro-Ser-Lys- Gln-Asn-Ser-Leu-Leu-Trp-Arg-Ala-Asn- Thr-Asp-Arg-Ala-Phe-Leu-Gln-Asp-Gly- Phe-Ser-Leu-Ser-Asn-Asn-Ser-Leu-Leu- Val-Pro-Thr-Ser-Gly-Ile-Tyr-Phe-Val- Tyr-Ser-Gln-Val-Val-Phe-Ser-Gly-Lys- Ala-Tyr-Ser-Pro-Lys-Ala-Thr-Ser-Ser- Pro-Leu-Tyr-Leu-Ala-His-Glu-Val-Gln- Leu-Phe-Ser-Ser-Gln-Tyr-Pro-Phe-His- Val-Pro-Leu-Leu-Ser-Ser-Gln-Lys-Met- Val-Tyr-Pro-Gly-Leu-Gln-Glu-Pro-Trp- Leu-His-Ser-Met-Tyr-His-Gly-Ala-Ala- Phe-Gln-Leu-Thr-Gln-Gly-Asp-Gln-Leu- Ser-Thr-His-Thr-Asp-Gly-Ile-Pro-His- Leu-Val-Leu-Ser-Pro-Ser-Thr-Val-Phe- Phe-Gly-Ala-Phe-Ala-Leu-OH 〔式中、Ｒ1はＰｒｏ又はＰｈｅ、Ｒ2はAla-Gln-Thr-Al
a-Arg-Gln-His-Pro-Lys-Met-His-Leu のＣ末端から数え
て１個または２個以上のアミノ酸を示し、ｎは０又は１
を示す。〕 ２．下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むこ
とを特徴とするポリデオキシリボ核酸および複製可能な
ベクターを含む複製可能な組み換えＤＮＡ。 H-(Met)n-R1-R2-Ala-His-Ser-Thr-Leu-Lys-Pro-Ala- Ala-His-Leu-Ile-Gly-Asp-Pro-Ser-Lys- Gln-Asn-Ser-Leu-Leu-Trp-Arg-Ala-Asn- Thr-Asp-Arg-Ala-Phe-Leu-Gln-Asp-Gly- Phe-Ser-Leu-Ser-Asn-Asn-Ser-Leu-Leu- Val-Pro-Thr-Ser-Gly-Ile-Tyr-Phe-Val- Tyr-Ser-Gln-Val-Val-Phe-Ser-Gly-Lys- Ala-Tyr-Ser-Pro-Lys-Ala-Thr-Ser-Ser- Pro-Leu-Tyr-Leu-Ala-His-Glu-Val-Gln- Leu-Phe-Ser-Ser-Gln-Tyr-Pro-Phe-His- Val-Pro-Leu-Leu-Ser-Ser-Gln-Lys-Met- Val-Tyr-Pro-Gly-Leu-Gln-Glu-Pro-Trp- Leu-His-Ser-Met-Tyr-His-Gly-Ala-Ala- Phe-Gln-Leu-Thr-Gln-Gly-Asp-Gln-Leu- Ser-Thr-His-Thr-Asp-Gly-Ile-Pro-His- Leu-Val-Leu-Ser-Pro-Ser-Thr-Val-Phe- Phe-Gly-Ala-Phe-Ala-Leu-OH 〔式中、Ｒ1はＰｒｏ又はＰｈｅ、Ｒ2はAla-Gln-Thr-Al
a-Arg-Gln-His-Pro-Lys-Met-His-Leu のＣ末端から数え
て１個または２個以上のアミノ酸を示し、ｎは０又は１
を示す。〕 ３．プラスミドｐＴＢ６２２、ｐＴＢ６９７、ｐＴＢ８
４８またはｐＴＢ８４９である請求項２記載の組み換え
ＤＮＡ。 ４．下記のアミノ酸配列 H-(Met)n-R1-R2-Ala-His-Ser-Thr-Leu-Lys-Pro-Ala- Ala-His-Leu-Ile-Gly-Asp-Pro-Ser-Lys- Gln-Asn-Ser-Leu-Leu-Trp-Arg-Ala-Asn- Thr-Asp-Arg-Ala-Phe-Leu-Gln-Asp-Gly- Phe-Ser-Leu-Ser-Asn-Asn-Ser-Leu-Leu- Val-Pro-Thr-Ser-Gly-Ile-Tyr-Phe-Val- Tyr-Ser-Gln-Val-Val-Phe-Ser-Gly-Lys- Ala-Tyr-Ser-Pro-Lys-Ala-Thr-Ser-Ser- Pro-Leu-Tyr-Leu-Ala-His-Glu-Val-Gln- Leu-Phe-Ser-Ser-Gln-Tyr-Pro-Phe-His- Val-Pro-Leu-Leu-Ser-Ser-Gln-Lys-Met- Val-Tyr-Pro-Gly-Leu-Gln-Glu-Pro-Trp- Leu-His-Ser-Met-Tyr-His-Gly-Ala-Ala- Phe-Gln-Leu-Thr-Gln-Gly-Asp-Gln-Leu- Ser-Thr-His-Thr-Asp-Gly-Ile-Pro-His- Leu-Val-Leu-Ser-Pro-Ser-Thr-Val-Phe- Phe-Gly-Ala-Phe-Ala-Leu-OH 〔式中、Ｒ1はＰｒｏ又はＰｈｅ、Ｒ2はAla-Gln-Thr-Al
a-Arg-Gln-His-Pro-Lys-Met-His-Leu のＣ末端から数え
て１個または２個以上のアミノ酸を示し、ｎは０又は１
を示す。〕をコードする塩基配列を含むことを特徴とす
るポリデオキシリボ核酸および複製可能なベクターを含
む複製可能な組み換えＤＮＡで形質転換された大腸菌、
枯草菌又は酵母。
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-
1996
- 1996-12-04 JP JP8323933A patent/JP2776480B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，１００（３）（１９８６）．Ｐ．７２７−７３３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09173085A (ja) | 1997-07-08 |
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