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JP2635216B2 - プロテインキナーゼｃのオリゴヌクレオチド調節 - Google Patents

プロテインキナーゼｃのオリゴヌクレオチド調節

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JP2635216B2
JP2635216B2 JP5516616A JP51661693A JP2635216B2 JP 2635216 B2 JP2635216 B2 JP 2635216B2 JP 5516616 A JP5516616 A JP 5516616A JP 51661693 A JP51661693 A JP 51661693A JP 2635216 B2 JP2635216 B2 JP 2635216B2
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Description

【発明の詳細な説明】
技術分野 本発明はプロテインキナーゼＣの発現調節に応答する
疾病状態のための治療、診断および研究用試薬に関す
る。特に、本発明はプロテインキナーゼＣに関連する核
酸と特異的にハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドに関する。これらのオリゴヌクレオチドが
プロテインキナーゼＣの発現を調節することが観察され
た。軽減および治療効果が得られた。 背景技術 タンパク質のリン酸化は細胞内への細胞外信号の導入
において中心的な役割を果たしている。そのようなリン
酸化を引き起こすキナーゼと称される酵素は成長因子、
ホルモンおよび細胞の代謝、増殖および分化に関与する
その他の因子の作用標的である。主たる信号導入経路の
一つに酵素プロテインキナーゼＣ（PKC）が含まれてお
り、細胞増殖および分化に重大な影響を与えることが知
られている。PKCは、信号導入において放出される代謝
産物であるジアシルグリセロール（DAG）により活性化
される。 ホルボールエステルと称される一群の発癌促進剤が細
胞にそれらの多面的の効果を示す場合において、PKCが
主たる、および多分唯一の細胞性レセプターであること
が発見されたことからPKCに関しての興味がかき立てら
れた。Gescher et al.,Anti−Cancer Drug Design 198
9,4,93−105。腫瘍生成が可能なホルボールがPKCの活性
化においてDAGの効果を模倣しうることは、これらの発
癌促進剤がPKCを通して作用し、この酵素の活性化が少
なくとも部分的には腫瘍発生の原因になることを示唆し
ている。Parker et al.,Science 1986,233,853−866。 実験的証拠は、PKCが結腸癌の増殖制御において一つ
の役割を果たしていることを示してる。腸管中の特定の
細菌が脂質のDAGに変換し、PKCを活性化し細胞の増殖を
変化させていると信じられている。このことは高い食物
脂肪と結腸癌の間の相関を説明するものであろう。Wein
stein,Cancer Res.（Suppl.） 1991,51,5080s−5085
s。また、結腸直腸癌の患者の結腸粘膜中のPKCの大部分
は、癌を持たない患者のものと比較すると活性化された
状態にあることが示されている。Sakanoue et al.,Int.
J.Cancer 1991,48,803−806。 高進された腫瘍発生はまたヌードマウス内に接種され
た培養細胞中のPKCの過剰発現とも相関している。PKCの
突然変異形は高進された転移能を持つ非常に悪性の腫瘍
細胞を誘導する。スフィンゴシンおよび関連するPKC活
性の阻害剤はインビボにおいて腫瘍細胞増殖および放射
線誘発形質転換を阻害することが示されている。Endo e
t al.,Cancer.Research 1991,51,1613−1618;Borek et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci 1991,88,1953−1957。多く
の実験的にまたは臨床的に有用な抗癌剤はPKCに対して
調節効果を示す。従って、PKCの阻害剤は癌の予防また
は治療剤として重要であろう。PKCは通常の抗癌剤のよ
り合理的な設計のためのもっともらしい標的であると示
唆されてきた。Gescher,A.およびDale,I.L.,Anti−Canc
er Drug Design 1989,4,93−105。 また、実験はPKCが乾癬および皮膚癌のような過増殖
性皮膚疾患の病理生理学において重要な役割を果たして
いることを示している。乾癬は炎症、表皮の過増殖およ
び細胞分化の減少により特徴付けられる。種々の研究は
これらの症状の発現においてのPKCの役割を示唆してい
る。培養ケラチン細胞におけるPKC刺激が過増殖を起こ
すことを示すことができる。炎症はホルボールエステル
により誘発でき、PKCにより制御される。DAGは皮膚病性
疾患にPKCが含まれていることに関係しており、乾癬性
病変に多く生成される。 PKCの阻害剤はインビトロにおいて抗増殖性および抗
炎症性効果の両方を有することが示されている。シクロ
スポリンＡおよびアントラリンのような抗乾癬薬はPKC
を阻害することが示されている。PKCの阻害は乾癬の処
置に対する治療法として示唆されてきた。Hagemann,L.
およびG.Mahrle,Pharmacology of the Skin,H.Mukhtar
編、CRC Press,Boca Raton,FL,1992,p,357−368。 PKCは単一の酵素ではなく一群の酵素である。現在の
ところ、少なくとも７つのPKCのイソ型（イソ酵素）が
同定されている：イソ型α、β、およびγは均質に精製
されており、イソ型δ、ε、ζ、およびηは分子クロー
ニングにより同定されている。これらのイソ酵素は組織
および器官分布の異なったパターンを有し（総説として
Nishizuka,Nature 1988,334,661−665を参照された
い）、異なった生理学的機能を果たしているのであろ
う。例えば、PKC−γは中枢神経系でのみ発現されるら
しい。PKC−αおよび−βはほとんどの組織で発現され
るが、異なった細胞型においては異なった発現のパター
ンを有する。例えば、PKC−αおよびPKC−βの両方とも
ヒト表皮に発現され、それから精製されている。PKC−
αは主として表皮の基底層のケラチン細胞中に検出され
たが、PKC−βは主として表皮の中間層およびランゲル
ハンス細胞中に観察される。PKC−ηは主に皮膚および
肺で観察されており、これらの組織での発現のレベルは
脳におけるレベルよりも高い。ことことは、脳に最も豊
富に発現される傾向があるPKC群の他の構成要素とは対
照的である。Osada et al.,J.Biol.Chem. 1990,265,22
434−22440。ここに掲げたPKCイソ酵素は本発明による
標的化に好適であるが、PKCの他のイソ酵素もまた本発
明に包含される。 現在のところ、異なったPKCイソ酵素はそれらが発現
される器官または組織に依存して種々の疾患過程に関与
すると信じられている。例えば、乾癬病変においてはPK
C−αおよびPKC−β間の比が変化しており、正常皮膚と
比較してPKC−βが優先して失われている（Hagemann,L.
およびG.Mahrle.pharmacology ofthe Skin,H.Mukhtar
編、CRC Press,Boca Raton,FL,1992,p.357−368）。 多数の化合物がPKC阻害剤として同定されているが
（総説としてHidakaおよびHagiwara,Trends in pharm.S
ci. 1987,8,162−164を参照されたい）、特異的にPKC
を阻害するものは見いだされていない。１−（５−イソ
キノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（Ｈ−
７）のようなキノリン スルホンアミド誘導体はマイク
ロモル濃度でPKCを阻害するが、それらのPKCおよびcAMP
−依存性およびcGMP−依存性プロテインキナーゼに対し
て類似の酵素阻害動力学を示している。ストレプトマイ
セス（Stretomyces）種のアルカロイド生成物であるス
タウロスポリンおよびその類似体は現在同定されている
内で最も強力なPKCのインビトロ阻害剤である。しかし
ながらそれらは異なったプロテインキナーゼ間では限ら
れた選択性しか示さない.Geschcr,Anti−Cancer Drug D
esign 1989,4,93−105。すなわち、PKCを特異的に阻害
するものは見いだされていない。また、研究用の道具と
しておよび特定のイソ酵素に伴われるであろう疾患の処
置のために、特異的なPKCイソ酵素の阻害も求められて
いる。 発明の目的 本発明の主たる目的は、プロテインキナーゼＣに付随
する新生物性、過増殖性、炎症性およびその他の疾患状
態の治療法を提供することである。 本発明の別の目的は、プロテインキナーゼＣの特定の
イソ酵素に付随する疾患のための選択的治療法を提供す
ることである。 本発明のさらなる目的は、プロテインキナーゼＣの発
現を調節しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供
することである。 本発明の別の目的は、プロテインキナーゼＣの特定の
イソ酵素の発現を選択的に調節しうるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを提供することである。 さらに別の目的は、プロテインキナーゼＣに伴う疾患
の診断手段を提供することである。 本発明のさらなる目的は、プロテインキナーゼＣの特
定のイソ酵素に伴う疾患の異なった診断手段を提供する
ことである。 本発明のさらに別の目的は、プロテインキナーゼＣの
発現の影響およびそれらに伴う疾患の研究のための研究
道具を提供することである。 本発明のさらなる目的は、プロテインキナーゼＣの特
定のイソ酵素の発現の影響およびそれらに伴う疾患の研
究のための研究道具を提供することである。 本発明のこれらおよびその他の目的は本明細書の記載
から明らかになるであろう。 図の簡単な説明 図１（ａ）および（ｂ）はPKC−αとハイブリダイズ
可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドのPKC発現に対
する効果をグラフで表したものである。オリゴヌクレオ
チドはPKC標的領域により配置される（５′から
３′）。 図２は対照（オリゴヌクレオチド無し）に対するパー
セントとして表現されたPKC−αタンパク質合成の用量
依存性アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を示してい
る線グラフである。▼＝ISIS 3520;■＝ISIS 3522;▲
＝ISIS 3527;▽＝ISIS 4985。 図３はISIS 4649（ISIS 3522の２′−Ｏ−メチル
体、両方ともホスホロチオエート）によるPKC−αタン
パク質合成の用量依存性阻害を示している線グラフであ
る。▼＝ISIS 4632;●＝ISIS 4636;■＝ISIS 4649;
▲＝ISIS 4648。 図４はアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のPKC
−α mRNA転写体のレベルの減少を示している棒グラフ
である。斜線を付けた棒は8.5kb転写体を表し、白抜き
の棒は4.0kb転写体を表している。 図５はA549細胞増殖のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド阻害を示している線グラフである。■＝4559;◆＝498
5;●＝3521;▲＝3527。 図６は同じ配列を有する完全−デオキシ ホスホロチ
オエート オリゴヌクレオチドと比較した８−デオキシ
ギャップを有する２′−Ｏ−メチル ホスホロチオエー
ト オリゴヌクレオチドによるPKC−α mRNAレベルの
阻害を示している一連の線グラフである。 図6Aは配列ID番号:2についてのデータを示している
（5357はギャップを有するオリゴヌクレオチドであり、
3521は完全デオキシ体である）。図6Bは配列ID番号:3に
ついてのデータを示している（5352はギャップを有する
オリゴヌクレオチドであり、3522は完全デオキシ体であ
る）。図6Cは配列ID番号:5についてのデータを示してい
る（5240はギャップを有するオリゴヌクレオチドであ
り、3527は完全デオキシ体である）。 図７はデオキシギャップ長（２′−Ｏ−メチルオリゴ
ヌクレオチドにおける）と配列ID番号:2、配列ID番号:3
および配列ID番号:5を有するアンチセンス オリゴヌク
レオチドによるPKC−α mRNAレベルの減少との関係を
示している線グラフである。 発明の要約 本発明に従うと、PKCをコードする遺伝子に由来するD
NAまたはRNAと特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌ
クレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドはそのよ
うな特異的ハイブリダイゼーションを有効にするのに十
分な同一性および数のヌクレオチド単位を含んでいる。
この相関関係は普通、“アンチセンス”と称されてい
る。一つの好適な実施態様においては、オリゴヌクレオ
チドは遺伝子の翻訳開始コドン（好適には配列CATを含
んでいる）と特異的にハイブリダイズ可能である。別の
好適な実施態様においては、オリゴヌクレオチドは遺伝
子の５′−非翻訳または３′−非翻訳領域と特異的にハ
イブリダイズ可能である。さらに別の好適な実施態様に
おいては、特定のPKCイソ酵素またはPKCイソ酵素の特定
の組をコードするDNAまたはmRNAと特異的にハイブリダ
イズ可能なオリゴヌクレオチドが提供される。そのよう
なオリゴヌクレオチドは薬学的に受容可能な担体中に都
合良くおよび望まれるように存在させることができる。 別の好適な実施態様に従うと、オリゴヌクレオチド
は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の連結基
の少なくとも一つがホスホロチオエート部分のような硫
黄含有種を含むように形成される。さらに別の好適な実
施態様においては、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチ
ドの少なくとも一つが糖の２′位で修飾されているよう
に形成される。そのような好適な修飾の例は、２′−Ｏ
−アルキルおよび２′−フルオロ修飾である。 本発明の別の態様は、細胞または組織中のPKCまたは
特定のPKCイソ酵素またはイソ酵素の組の発現を調節す
るための方法に関する。本発明の他の態様は、PKCをコ
ードするDNAまたはRNAの細胞または組織における検出
法、および特定のPKCイソ酵素をコードしているDNAまた
はRNAの細胞または組織における特異的検出法に関す
る。そのような方法は、前記DNAまたはRNAの作用を妨害
するためまたは検出するために、前記遺伝子を含んでい
ると疑われる細胞または組織を本発明に従ったオリゴヌ
クレオチドとを接触させることを含む。 本発明の別の態様は、PKCまたはそのイソ酵素の一つ
に伴う疾患を有すると疑われる動物の診断および治療法
に関する。そのような方法はPKCの発現を調節するた
め、PKCに伴う状況を処置するため、またはその診断を
達成するために、動物または動物からの細胞または組織
または体液と本発明に従ったオリゴヌクレオチドを接触
させることを含む。 発明の詳細な説明 アンチセンスオリゴヌクレオチドは多くのヒト疾患の
治療のための治療剤として非常に有望である。オリゴヌ
クレオチドはワトソン−クリック塩基対により定義され
ているごとく、DNA、pre−mRNAまたは成熟mRNAの相補的
配列と特異的に結合（ハイブリダイズ）して、DNAから
タンパク質への遺伝的情報の流れを妨害する。標的配列
に対して特異的にさせられたアンチセンスオリゴヌクレ
オチドの性質はまた、それらを非常に有用なものにして
いる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは単量体単位の
長い鎖であるため、それらは任意の標的RNA配列に対し
て容易に合成されるであろう。多数の最近の研究は、標
的タンパク質研究のための生化学的道具としてのアンチ
センスオリゴヌクレオチドの有用性を述べている。Roth
enberg et al.,J.Natl.Cancer Inst. 1989,81,1539−1
544;Zon.G.,Pharmaceutical Res. 1988,5,539−549。
オリゴヌクレオチド化学の最近の進歩、および細胞取り
込みが促進されたヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド
の合成により、現在では治療の新しい形としてのアンチ
センスオリゴヌクレオチドの使用を考えることが可能で
ある。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは従来の方法で直面
する問題点の理想的な解決法を提供する。それらは問題
とするイソ酵素またはイソ酵素の特定の組を選択的に阻
害するように、または、問題とするイソ酵素の群の全て
を阻害するように設計することができる。それうらはフ
リーラジカル捕捉のような非特異的機構では働かない。
特定の阻害剤の設計には酵素機構の完全な理解は必要と
されない。 プロテインキナーゼＣの活性または代謝を調節する現
在の薬は、それらの特異性の欠如による受容できない副
作用を有するか、またな酵素の阻害において限られた有
効性しか示さない。本発明は従来の研究者が直面した問
題を、酵素を直接的に阻害するのではなく酵素の産生を
調節することにより解決し、治療効果を達成する。本発
明において、オリゴヌクレオチドは直接mRNAまたは遺伝
子に結合し、最終的に遺伝子から産生されるPKCタンパ
ク質の量を調節する。 本発明の文脈において、術語“オリゴヌクレオチド”
とは天然に存在する塩基および天然のホスホジエステル
結合により連結されたペントフラノシル基から形成され
たポリヌクレオドを意味している。この術語は実際上、
天然に存在するサブユニットまたそれらの密接な類似体
から形成された天然に存在する化学種または合成種を意
味している。術語“オリゴヌクレオチド”はまた、天然
に存在するオリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天
然に存在しない部分を有するものを意味してもよい。従
って、オリゴヌクレオチドは修飾された糖部分または糖
間結合を有していてもよい。これらの例としては、ホス
ホロチオエートおよびこの分野で知られているホスホロ
ジチオエートのようなその他の硫黄含有種が挙げられ
る。いくつかの好適な実施態様において、オリゴヌクレ
オチドの少なくとも１つのオスホジエステル結合は、活
性が調節されるべきRNAまたはDNAが位置している細胞の
領域内に浸透する組成物の能力を促進する構造により置
換されている。そのような置換はホスホロチオエート結
合、メチルホスホネート結合、短鎖アルキルまたはシク
ロハルキル構造、またはヘテロ原子置換短鎖アルキル構
造を含むものが好適である。最も好適なものは、CH2−N
H−Ｏ−CH2、CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ−CH2、CH2−Ｏ−Ｎ
（CH3）−CH2、CH2−Ｎ（CH3）−Ｎ（CH3）−CH2、およ
びＯ−Ｎ（CH3）−CH2−CH2バックボーン（ここでホス
ホジエステルは０−Ｐ−Ｏ−CH2である）構造である。
モルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチ
ドもまた好適である。Summerton,J.E.およびWeller,D.
D.、米国特許出願第5,034,506号。タンパク質−拡散（P
NA）バックボーンのような別の実施態様においては、オ
リゴヌクレオチドのホスホジエステルバッグボーンはポ
リアミドバックボーンに置き換えられていてもよく、塩
基がポリアミドバックボーンのアザ窒素原子に直接また
は間接的に結合されている。P.E.Nielsen,M.Egholm,M.
H.Berg,O.Buchardt,Science 1991,254,1497。別の好適
な実施態様に従うと、ホスホジエステル結合は同時に実
質的に非イオン生および非キラルである他の構造また
は、キラルおよび対掌体に特異的である構造に置換され
ている。当業者は本発明の実施に死するための別の結合
を選択することが可能であろう。 オリゴヌクレオチドは少なくと一つの修飾塩基形を含
む化学種を含んでいてもよい。すなわち、天然に見いだ
されるもの以外のプリンおよびピリミジンを用いてもよ
い。同様に、発明の本質的教義から離れない限りはヌク
レオチドサブユニットのペントフラノシル部分上の修飾
もまた有効である。そのような修飾の例は２′−Ｏ−ア
ルキル−および２′−ハロゲン−置換ヌクレオチドであ
る。本発明において有用である糖部分の２′位における
修飾のいくつかの特定の例は、OH、SH、SCH3、Ｆ、OC
H3、OCN、Ｏ（CH2）nNH2、またはＯ（CH2）nCH3（式
中、ｎは１から約10である）または類似の性質を有する
その他の置換基である。シクロブチルまたは他の炭素環
式のような糖模倣体もまたペントフラノシル基の代わり
に使用してもよい。二つまたはそれ以上の化学的に異な
る領域を有するキメラオリゴヌクレオチドもまた本発明
では有用である。そのようなキメラオリゴヌクレオチド
の特定の例は、一つまたはそれ以上のデオキシヌクレオ
チドの“デオキシギャップ”を除いて２′位が修飾され
ているものである。“デオキシギャップ”は分子の中心
にあってもよいし、また、両末端にまたはその近傍に位
置されていてもよい。異なったバックボーン化学の領域
を有するオリゴヌクレオチドもまたキメラオリゴヌクレ
オチドの例である。 そのようなオリゴヌクレオチドは天然のオリゴヌクレ
オチド（または、天然のラインに沿って合成されたオリ
ゴヌクレオチド）と機能的に交換可能であるが、天然の
構造とは一つまたはそれ以上の相違を有するものとして
記述するのが最適であろう。全てのそのようなオリゴヌ
クレオチドは、PKC RNAとハイブリダイズするのに有効
に機能する限りは本発明に包含される。本発明に従った
オリゴヌクレオチドは、好適には約５から約50ヌクレオ
チド単位を含む。約８から30のヌクレオチド単位を含む
ようなオリゴヌクレオチドがより好適であり、約12から
25のヌクレオチド単位を有するものがさらにより好適で
ある。ヌクレオチド単位とはホスホジエステルまたはそ
の他の結合を介して隣接するヌクレオチド単位に適切に
結合されている塩基−糖の組み合わせであることが理解
されよう。 本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固
相合成のよく知られた技術により都合よくかつルーチン
的に作製されるであろう。そのような合成のための装置
はApplied Biosystemsを含むいくつかの販売元から市販
されている。そのような合成のために他の手段を用いて
もよい；オリゴヌクレオチドの実際の合成は機能的に仕
事を処理する人の能力次第である。ホスホロチオエート
およびその他のアルキル化誘導体のような他のオリゴヌ
クレオチドを合成するために類似の技術を使用すること
もよく知られている。 本発明に従うと、メッセンジャーRNAには３文字遺伝
コードを用いてタンパク質をコードしている情報のみな
らず、５′−非翻訳領域、３′−非翻訳領域、５′キャ
ップ領域およびイントロン／エクソン結合リボヌクレオ
チドとして知られている領域を形成する付随するリボヌ
クレオチドも含まれていることが当業者には理解されよ
う。従って、情報部分のリボヌクレオチド並びにこれら
の付随するリボヌクレオチドの全体または一部を標的と
するオリゴヌクレオチドが本発明に従って形成される。
好適な実施態様において、オリゴヌクレオチドは転写開
始部位、翻訳開始部位、５′キャップ領域、イントロン
／エクソン結合部、コード配列または５′−または３′
−非翻訳領域中の配列と特異的にハイブリダイズ可能で
ある。 本発明のオリゴヌクレオチドはPKC遺伝子に由来する
メッセンジャーRNAにハイブリダイズ可能なように設計
されている。そのようなハイブリダイゼーションが達成
された場合、メッセンジャーRNAの正常な役割を妨害
し、細胞におけるその機能の調節を起こす。妨害される
べきメッセンジャーRNAの機能には、DNAからのRNAの転
写、タンワク質翻訳部位へのRNAのトランスロケーショ
ン、RNAからタンパク質への実際の翻訳、一つまたはそ
れ以上のmRNA種を得るためのRNAのスプライシング、お
よび多分RNAに携わっているであろう独立した触媒活性
のような全ての生体機能が含まれる。RNA機能へのその
ような妨害の全体の効果はPKC遺伝子発現の調節であ
る。 本発明のオリゴヌクレオチドは診断薬、治療薬、予防
薬および研究要試薬およびキットとして使用することが
できる。本発明のオリゴヌクレオチドはPKC遺伝子およ
びそのmRNAにハイブリダイズするため、この事実を利用
してサンドイッチおよびその他のアッセイを容易に組み
立てることができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオ
チドはPKC mRNAの特定のイソ酵素にハイブリダイズす
るため、特定のPKCイソ酵素に対する細胞および組織の
スクリーニングのためのアッセイが工夫できる。そのよ
うなアッセイは種々のPKC形に伴う疾患の診断に利用す
ることができる。PKC遺伝子に対するオリゴヌクレオチ
ドのハイブリダイゼーションを検出する手段の準備はル
ーチン的に達成される。そのような準備には酵素のコン
ジュゲート、放射性標識または別の適した検出系などが
含まれる。PKCの存在および不在を検出するためのキッ
トもまた製造されるであろう。 治療または予防処置のために、オリゴヌクレオチドが
本発明に従って投与される。オリゴヌクレオチドは医薬
組成物中に処方され、それにはオリゴヌクレオチドに加
えて担体、粘稠化剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、表面活
性化剤などが含まれているであろう。医薬組成物は、オ
リゴヌクレオチドに加えて一つまたはそれ以上の抗菌
薬、抗炎症薬、麻酔薬などのような活性成分を含んでい
てもよい。 医薬組成物は局所または全身の処置が望まれている
か、および処置されるべき領域に依存して多くの方法で
投与されるであろう。投与は局所的に（点眼、膣内、直
腸内、鼻孔内を含む）、経口で、吸入により、または非
経口で（例えば、静脈内点滴または皮下、腹腔内または
筋肉内注射）実施されるであろう。 局所投与のための処方には軟膏、ローション剤、クリ
ーム剤、ゲル剤、滴雑、座剤、スプレー剤、水剤および
散剤が含まれるであろう。通常の医薬担体、水性、粉末
または油性基剤、粘稠化剤などが必要かまた望ましいで
あろう。被覆されたコンドームもまた有用であろう。 経口投与のための処方には散剤、顆粒剤、水または非
水性媒質中の懸濁化剤または液剤、カプセル剤、サッシ
ェ剤、または錠剤が含まれる。粘稠化剤、芳香剤、希釈
剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が含まれであろ
う。 非経口投与のための処方には緩衝液、希釈剤よおびそ
の他の適切な添加剤を含む無菌水溶液が含まれる。 投与量は処置されるべき状態の重度および応答性に依
存するが、治療に有効になるかまたは疾患状態の軽減が
達成されるまで数日から数カ月の処置過程で、通常一日
当たり一回またはそれ以上の投与量であろう。当業者は
容易に最適の投与量、投与法および反復率を決定するこ
とができる。 以下の実施例は本発明の例示であり、それらに制限す
ることを意図したものではない。 実施例１ オリゴヌクレオチド合成 非修飾DNAオリゴヌクレオチドはヨウ素により酸化す
る標準ホスホロアミダイト化学を使用する自動DNAシン
セサイザー（Applied Biosystems モデル380B）にて合
成された。β−シアノエチルジイソプロピル−ホスホロ
アミダイトはApplied Biosystems（Foster City,CA）か
ら購入した。ホスホロチオエート オリゴヌクレオチド
に対しては、ホスファイト結合の段階的チオ化のために
標準酸化ボトルを3H−1,2−ベンゾジチオール−３−オ
ン 1,1−ジオキシドの0.2Mアセトニトリル溶液に置き
換えた。チオ化サイクル待ち時間は68秒に増加し、続い
てキャッピング工程を実施した。 オリゴヌクレオチドは制御細孔ガラスカラム（Applie
d Biosystems）から切断し、55℃で18時間濃水酸化アン
モニウム中で脱保護した後、2.5容量のエタノールを加
えた0.5M NaClから二回沈澱させることにより精製し
た。分析ゲル電気泳動は20％アクリルアミド、8M尿素、
45mMトリス−ホウ酸緩衝液、pH7.0で実施した。 実施例２ 細胞培養およびホルボールエステルおよびPK
C−αを標的とするオリゴヌクレオチドによる処理 PKCタンパク質半減期は6.7時間から24時間まで変動す
ることが報告されている。Young et al.Biochem.J. 19
87,244,775−779;Ballester et al.J.Biol.Chem. 198
5,260,15194−15199。これらの長い半減期のため長いイ
ンキュベーション時間が必要とされ、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドをスクリーニングする場合、PKC−αの
定常状態を阻害することは実際的ではない。それ故、PK
Cの細胞内レベルを可逆的に低くするホルボールエステ
ルの能力が利用されてきた。細胞をホルボールエステル
で処理すると最初にキナーゼ活性の活性化、続いてPKC
のダウンレギュレーションが起こる。PKC−αについて
は、このダウンレギュレーションはキナーゼの合成速度
は明らかに変化せずにタンパク質分解の速度が増加した
直接の結果であることが示されている。 ヒト肺癌腫（A549）細胞において、Krug et al.J.Bio
l.Chem. 1987,262,11852−11856の方法の変法を用いた
ホルボールエステル 12,13−ジブチレート（PDBu）の
処理は、膣細にPKC−α mRNAレベルに影響を与えずにP
KC−αの細胞レベルを低下させ、この効果は可逆的であ
ることが最初に決定された。PKC−αを標的とするオリ
ゴヌクレオチドの能力をスクリーニングするアッセイの
基本は、最初にPDBuて長期間処理することによりPKC−
αタンパク質レベルを低下させ、細胞をよく洗浄するこ
とによりPDBuを除去し（これにより細胞の新規のPKC−
αタンパク質の合成を可能にする）、新PKC−αタンパ
ク質の再合成を阻害するためオリゴヌクレオチドと細胞
をインキュベートすることである。 A549細胞（American Type Culture Collection,Bethe
sda MDから入手した）を、６−ウェルプレート（Falcon
Labware,Lincoln Park,NJ）上、1gグルコース／リット
ルおよび10％ウシ胎児血清（FCS,Irvine Scientific,Sa
nta Ana,CA）を含むダルベッコ改良イーグル培地（DM
E）中でコンフルエントになるまで増殖させた。 細胞を500nMのPBDu（Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO）
で12−16時間（終夜）処理した。次に、細胞をDME中37
℃にて３回洗浄し、20μｌのDOTMA（Lipofectin試薬,BR
L,Bethesda,MD）を含む1mlのDMAを加えた。ホスホロチ
オエート オリゴヌクレオチドを１μＭの濃度まで添加
し、細胞を37℃でさらに４時間インキュベートした。 細胞を0.1mg/ml BSAを含む3mlのDMEで１回洗浄し、
0.1mg/mlBSAを含む2mlのDMEをさらに加えた。ホスホロ
チオエート オリゴヌクレオチド（１μＭ）を加えて細
胞を37℃で24時間インキュベートした。 細胞をリン酸緩衝化塩溶液（PBS）中で３回洗浄し、
細胞タンパク質を120μｌの試料緩衝液（60mM トリス
pH6.8,2％SDS,10％グリセロール,10mMジチオスレイト
ール）中に抽出して５分間煮沸した。PKC−αタンパク
質の細胞内レベルはイムノブロッティングにより決定し
た。 本アッセイで試験されたオリゴヌクレオチドは表１に
示されている。配列データはFinkernzeller et al.,Nuc
l.Acids Res. 1990,18,2183により発表されたcDNA配列
からのものである；オリゴヌクレオチドの下に与れられ
ている配列番号はcDNA上ひ配列されるべき第一の残基
（ATG開始コドンの上流の28番目の残基）に対して相対
的なものである。 実施例３ PKC発現のイムノブロットアッセイ 細胞抽出物を10％SDS−PAGEミニゲル上で電気泳動し
た。分離したタンパク質を電気泳動的移動によりImmobi
lon−Ｐ膜（（MIllipore,Bedford MA）に移し、膜を５
％脱脂ミルクを含むTBS（トリス−HCl pH7.4,150mM N
aCl）中、60分間ブロックした。次に、0.2％脱脂ミルク
を含むTBSで0.2μg/mlに希釈したPKC−αに対するモノ
クローナル抗体（UBI,Lake Placid NY）と膜を４℃で16
時間インキュベートした。続いて0.2％脱脂ミルクを加
えたTBS中で３回洗浄した。次に膜を125I−標準ヤギ抗
マウス二次抗体（ICN Radiochemicals,Irvine,CA）と１
時間インキュベートした。次に膜を0.2％脱脂ミルクを
加えたTBS中でよく洗浄した。バンドを可視化したホス
ファーイメージャー（Molcular Dynamics,Summyvale,C
A）を使用して定量した。PKC−αは80kDの分子量を有す
る単一バンドとして現れる。 各々のオリゴヌクレオチドは３回試験され（３重
に）、実験の結果はオリゴヌクレオチドで処理されてい
ない細胞と比較して、存在するタンパク質のパーセント
に対して標準化されている（図１）。５つの最も有効な
オリゴヌクレオチドは、AUG開始コドンおよびそれから
わずかに上流および下流の領域を標的をしている（オリ
ゴ１、３、17、７、６）。次に最も有効なオリゴヌクレ
オチドはRNAの３′非翻訳領域を標的としている（オリ
ゴ２、５、14）。 実施例４ PKCの他のイソ酵素 ヒトPKC−αのアンチセンス標的化のために最も有効
な配列は、翻訳開始コドン周辺および３′非翻訳領域で
あることが観察された。これらの配列はまたPKCの他の
イソ酵素に行かうオリゴヌクレオチドについても有用な
標的であろうと信じられる。配列データが入手可能であ
るヒトPKCの他のイソ酵素はPKC−β（タイプＩおよびI
I）、PKC−γ（部分配列）およびPKC−ηである。PKCの
有効な阻害剤であろうアンチセンスオリゴヌクレオチド
が以下に同定されているい。これらのオリゴヌクレオチ
ドは実施例１のごとく合成し、入手可能な適当な抗体を
用いて実施例２および３のごとくスクリーニングするこ
とができる。または、TPA−応答性エンハンサーまたは
適当なプロモーターの影響下、所望のPKCのイソ酵素と
ルシフェラーゼを一時的に同時発現するレポーター遺伝
子アッセイ系を確立することができる。次に、常法を用
いてルシフェラーゼ活性を測定することによりPKC発現
をアッセイする。すなわち、Greenberg,M.E.,Current P
rotocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,R.Brent,
R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidmanおよび
K.Strahl編,John Wiley and Sons,NY（1987）により記
載されているごとく、界面活性剤トリトンＸ−100によ
る溶解により細胞からルシフェラーゼを抽出する。Dyna
tech ML1000発光計を用いて、625μＭまでのルシフェリ
ン（Sigma）添加によるピーク発光の測定を行う。 PKC−β、タイプＩおよびII 配列データはKubo et al.,FEBS Lett. 1987,223,138
−142、からのものである；配列はcDNAで配列決定され
た最初の５′塩基から番号付けられている。PKC−βタ
イブＩおよびIIは単一の遺伝子生成物の異なったmRNAス
プライシングの結果である。このため同一のアミノ末端
を有するタンパク質が生じている（mRNAの５′末端）；
しかしながら、カルボキシ末端に配列の相違が存在する
（mRNAの３′末端）。下記のオリゴヌクレオチド（翻訳
開始コドンを標的とする）はPKC−βタイプＩおよびII
両方の発現を調節することが期待される： 下記のアンチセンスオリゴヌクレオチドはPKC−βタ
イプＩの３′非翻訳領域のみを標的とする： 下記のアンチセンスオリゴヌクレオチドはPKC−βタ
イプIIの３′非翻訳領域のみを標的とする： PKC−γ： 配列データはCoussens et al.,Science 1986,233,85
9−866からのものである；配列はcDNA中で配列決定され
た最初の５′塩基から番号付けられている。完全な配列
は入手不可能であった：オープンリーディングフレーム
の３′最末端および３′非翻訳領域が欠如している。そ
の結果、これらの領域は現在のところアンチセンス標的
としては入手不可能である。 PKC−η： PKC−ηのための配列データはBacherおよびその協同
研究者［Bacher et al.,Mol.Cell.Biol. 1991,11,126
−133］からなるものである。彼らはそのイソ酵素をPKC
−Ｌと名付けている；しかしながら、その配列はマウス
PKC−ηのものとほとんど同一であり、一貫性を保つた
めここでは後者の命名法が用いられた。配列はcDNA中で
配列決定された最初の５′塩基から番号付けられてい
る。 実施例５ PKCのオリゴヌクレオチド阻害の用量依存性 PKC−αに対して活性である図１の４つのオリゴヌク
レオチドをさらに検討した。実施例３に記載したイムノ
ブロッティングアッセイを用いたISIS 3520（配列ID番
号:1）、3521（配列ID番号:2）、3522（配列ID番号:3）
および3527（配列ID番号:5）の用量応答研究により、全
てのものがPKC−αタンパク質発現に対して用量応答性
活性を有することが示された。ISIS 3521、3522および
3527は100−200nMのIC50値を有しており、すべてが500n
Mで最高にPKC発現を阻害した。ことことは図２に示され
ている。ISIS 3527と同一の塩基組成を有するスクラン
ブル対照体であるISIS 4985（配列ID番号:52）は影響
を示さなかった。 実施例６ ２′−Ｏ−メチル ホスホロチオエート オ
リゴヌクレオチドの合成 ２′−Ｏ−メチル ホスホロチオエート オリゴヌク
レオチドは、２′−Ｏ−メチル β−シアノエチルジイ
ソプロピルホスホロアミダイト（Chemgenes,Needham M
A）およびテトラゾールおよび塩基のパルス添加後の待
ち工程を360秒に延長した非修飾オリゴヌクレオチドの
標準サイクルを用いて合成された。合成の出発に使用さ
れた３′−塩基は２′−デオキシリボヌクレオチドであ
った。 実施例７ PKC−αタンパク質合成に対するISISの２′
−Ｏ−メチル体の影響 ホスホロチオエート オリゴヌクレオチド ISIS 35
22（配列ID番号:3）と同一の配列を有し、均等に２′−
Ｏ−メチル修飾されたホスホロチオエート オリゴヌク
レオチド（ISIS 4649）はPKCタンパク質合成を阻害で
き（実施例３に記載したイムノブロッチングにより示さ
れた）、300nM未満のIC50を示した。このことは図３に
示されている。 実施例８ PKC−α mRNA発現に対するオリゴヌクレオ
チドの影響 PKC−α mRNAレベルに対するオリゴヌクレオチドの
影響を決定するため、A549細胞をカチオン性リポソーム
存在下、示された濃度のオリゴヌクレオチドで４時間処
理した。全細胞RNAは4Mグアニジニウム イソチオシア
ネート中の溶解、続いての塩化セシウム濃度勾配により
細胞から単離された。全RNA（15−30μｇ）を1.1％ホル
ムアルデヒドを含む1.2％アガロースゲル上で分離し、
ナイロン膜に移した。次にこの膜をATCC（Bethesda,M
D）から得られたウシPKC−α cDNAとハイブリダイズさ
せた。cDNAは、市販品として入手可能なキット（Promeg
a）を用いて、使用説明書に従うランダムプライマー標
識により、［α−32P］dCFTPで32P放射性標識した。フ
ィルターをQuikhyb溶液（Stratagene,San Diego,CA）中
で68℃で60分間ハイブリダイズさせた。次に室温で低ス
トリンジェンシー（2x SSC/0.1％ SDS）洗浄を２回行
い、60℃で高ストリンジェンシー（0.1x SSC/0.1 SD
S）洗浄を２回行った。ハブリダイズしたバンドを可視
化し、ホスファーイメージャーを用いて定量した。次に
ブロットを煮沸して放射活性を除き、32P−標識グリセ
ロール−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ（G3PD
H）プローブ（Cloutech）をプローブとして、等量のRNA
がのせられたことを確認した。 PKC−α−特異的cDNAプローブを使用するA549細胞か
らの全RNAのノーザン分析は、約8.5kbおよび4.0kbの大
きさの二つの主なハイブリダイズ転写体を明らかにし
た。典型的には、これらは2:1の比で大きい方の転写体
が優勢に発現される。A549細胞をDOTMA存在下、500nMの
アンチセンスオリゴヌクレオチドで４時間処理し、続い
てさらに20時間インキュベートすると、両方の転写体の
レベルが減少した。このことは図４に示されている。最
大の減少はオリゴヌクレオチドISIS 3521（配列ID番
号:2）および3527（配列ID番号:5）で観察された（両方
とも３′−非翻訳配列に特異的にハイブリダイズ可能で
ある）。これらのPKC−α mRNA減少量は90−95％であ
った。ISIS 3522（配列ID番号:3）（翻訳開始コドンを
標的にしている）はPKC−α mRNAレベルを80％減少さ
せ、ISIS 3520（配列ID番号:1）はPKC−α mRNAを40
％減少させた。全てのオリゴヌクレオチドはPKC mRNA
減少に対し約200nMのIC50値を有していた。スクランプ
ル対照対はこの濃度では何の影響も示さなかった。 PKC mRNAレベルの減少におけるアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの反応速度論は、試験された４つのオリゴ
ヌクレオチドについて類似していた。オリゴヌクレオチ
ドを添加して４時間以内に60−70％の最大PKC RNA減少
が起こり、最大減少はオリゴヌクレオチド添加後12−24
時間で起こった。 実施例９ アンチセンスオリゴヌクレオチドによるPKC
−αの特異的阻害 A549細胞は通常PKC−αに加えてPKC−δ、PKC−εお
よびPKC−ζを発現することが示されている。PKC−αイ
ソ酵素を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに
よるこれらの細胞中におけるPKC−αの阻害の特異性
が、ISIS 3521（配列ID番号:2）、ISIS 3522（配列ID
番号:3）またはそれらのスクランブル対照体であるオリ
ゴヌクレオチドISIS 4559（配列ID番号:53）および460
8（配列ID番号:54）処理後のイムノブロッティングによ
り示された。A549細胞はオリゴヌクレオチド（400nMか
または300nM）およびDOTMAで４時間処理し、洗浄後48時
間回復させた。次に細胞をオリゴヌクレオチド（250n
M）およびDOTMAで再び処理し、洗浄し、さらに20時間回
復させた。細胞抽出物を電気泳動し、膜に移して実施例
３のごとくブロックした。続いて膜を0.5％脱脂ミルク
を含むTBSで希釈した下記の抗体の何れかで一夜処理し
た：抗−PKC−α、−β、または−γモノクローナル抗
体（Upstate Biochemicals,Inc.）、１μg/ml;抗−PKC
−δまたは−ζポリクローナル抗体（Gibco BRL）、1:2
000希釈：抗−PKC−ε〔Huwiler et al.,Biochem.J. 1
991,279,441−445〕、1:4000希釈；または抗−PKC−
η、1:4000希釈。抗体インキュベーション後、0.1％脱
脂ミルクを含むTBSで３回洗浄し、次に膜を５μCiの125
I−ヤギ 抗−ウサギまたは抗−マウス抗体（ICN Radio
chemicals,Irvine CA）とともに１時間インキュベート
した。膜をよく洗浄し、標識タンパク質を可視化しホス
ファーイメージャーとMolecular Dynamics,CA）を使用
して定量した。 オリゴヌクレオチド処理後に発現されたPKCイソ酵素
の分析により、PKC−δ、−εおよび−ζのレベルはア
ンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのスクランブル
対照体両方の処理によっても変化しなかったことが明ら
かにされた。アンチセンスオリゴヌクレオチドはPKC−
α発現を70−80％減少させたが、一方、スクランブル対
照体は影響を与えなかった。 実施例10 A549細胞増殖に対するオリゴヌクレオチドの
影響 A549細胞をウェル当たり4000細胞の濃度で６−ウェル
プレートに加えた。24時間後、細胞をDMEMで３回洗浄
し、20μg/mlのDOTMA存在下、オリゴヌクレオチドを必
要とされた濃度まで加え４時間インキュベートした。次
に細胞を５％FCSを加えたDMEMで一度洗浄した後、５％F
CSを加えたDMEM中でさらに72時間増殖させた。この時点
で細胞をPBSで２度洗浄し、トリプシンでウェルから除
いて血球計数器で計数した。 ISIS 3521および3527によA549細胞増殖の阻害は250
−500nMの一回のオリゴヌクレオチド投与後に観察され
た。この結果は図５に示されている。 実施例11 キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによ
るPKC−αの阻害 ２′−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド中に４から８の
デオキシヌクレオチドの“デオキシギャップ”を有する
キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、実施
例８に記載したごとくPKC−α mRNAレベル減少能力に
ついて試験した。キメラオリゴヌクレオチドはISIS 35
21（配列ID番号:2）、ISIS 3522（配列ID番号:3）およ
びISIS 3527（配列ID番号:5）の配列と同一の配列であ
る。キメラオリゴヌクレオチドは表７に示されている： ８−デオキシギャップを有するオリゴヌクレオチドは
PKC−α mRNAレベルを少なくとも85％低下させること
ができた。同じ配列のギャップを有しないオリゴヌクレ
オチドと比較した８−デオキシギャップのオリゴヌクレ
オチドの活性が図6A、6Bおよび6Cに示されている。６−
デオキシギャップオリゴヌクレオチドの内の二つ（ISIS
5361、配列ID番号:2およびISIS 5350、配列ID番号:
3）はPKC−α mRNAを50％以上低下させることができ、
４−デオキシギャップオリゴヌクレオチドの一つ（ISIS
3522、配列ID番号:3）はPKC−α mRNAを約85％阻害
することができた。配列ID番号:2、配列ID番号:3および
配列ID番号:5を有するオリゴ類について、活性とデオキ
シギャップ長の関係が図７に示されている。 実施例12 ヌードマウスにおけるヒト腫瘍細胞のオリゴ
ヌクレオチド処置 ヒト肺癌腫A549細胞を採取し、5x106の細胞をヌード
マウスの後脚内側へ皮下で注射した。約一か月後に触診
できる腫瘍が現れた。アンチセンスオリゴヌクレオチド
ISIS 3521および3527を二つの投与量、１および10mg/k
g体重で、２日おきに６週間マウスに腹腔内投与した。
マウスの腫瘍成長をモニターし、６週間後に腫瘍を切り
出してPKC−αの発現をノーザンブロットおよびイムノ
ブロットにより決定した。
【配列表】
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Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】PKC遺伝子由来の選択されたDNAまたはRNA
    と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドで
    あって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番
    号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号
    ８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号1
    2、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号1
    6、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号2
    0、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号2
    4、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号2
    8、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号3
    2、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号3
    6、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号4
    0、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号4
    4、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号4
    8、配列番号49、配列番号50および配列番号51からなる
    群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌク
    レオチド。
  2. 【請求項２】前記DNAまたはRNAが、PKC−α、PKC−β、
    PKC−γ、PKC−ηの１つまたはそれ以上をコードする、
    請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】PKCの発現を調節する方法であって、前記
    遺伝子を含む組織または細胞を、PKC遺伝子由来の選択
    されたDNAまたはRNAと特異的にハイブリダイズしうるオ
    リゴヌクレオチドと接触させることを含み、ここで前記
    オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列
    番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番
    号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号
    11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号1
    5、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号1
    9、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号2
    3、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号2
    7、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号3
    1、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号3
    5、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号3
    9、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号4
    3、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号4
    7、配列番号48、配列番号49、配列番号50および配列番
    号51からなる群より選択されるヌクレオチド配列からな
    ることを特徴とする方法。
  4. 【請求項４】前記オリゴヌクレオチドが配列番号１、配
    列番号２、配列番号３または配列番号５からなる、請求
    項３記載の方法。
  5. 【請求項５】細胞または組織においてPKCをコードするD
    NAまたはRNAの存在を検出する方法であって、 細胞または組織を、前記DNAまたはRNAと特異的にハイブ
    リダイズしうるオリゴヌクレオチドと接触させ、ここで
    前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、
    配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配
    列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列
    番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番
    号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号
    19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号2
    3、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号2
    7、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号3
    1、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号3
    5、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号3
    9、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号4
    3、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号4
    7、配列番号48、配列番号49、配列番号50および配列番
    号51からなる群より選択されるヌクレオチド配列からな
    り、そして ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する ことを含む方法。
  6. 【請求項６】前記オリゴヌクレオチドが配列番号１、配
    列番号２、配列番号３または配列番号５からなる、請求
    項５記載の方法。
  7. 【請求項７】PKCに関連する疾病状態を処置する方法で
    あって、ヒトを除く動物を、有効量の、PKC遺伝子由来
    の選択されたDNAまたはRNANと特異的にハイブリダイズ
    しうるオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、こ
    こで前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号
    ２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号
    ６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号1
    0、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号1
    4、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号1
    8、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号2
    2、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号2
    6、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号3
    0、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号3
    4、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号3
    8、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号4
    2、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号4
    6、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50
    および配列番号51からなる群より選択されるヌクレオチ
    ド配列からなることを特徴とする方法。
  8. 【請求項８】前記オリゴヌクレオチドが配列番号１、配
    列番号２、配列番号３または配列番号５からなる、請求
    項７記載の方法。
  9. 【請求項９】PKCに関連する疾病状態を診断する方法で
    あって、 PKCに関連する疾病状態を有すると疑われる動物からの
    細胞または組織または体液を、PKC遺伝子由来の選択さ
    れたDNAまたはRNAと特異的にハイブリダイズしうるオリ
    ゴヌクレオチドと接触させ、ここで前記オリゴヌクレオ
    チドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番
    号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号
    ８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号1
    2、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号1
    6、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号2
    0、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号2
    4、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号2
    8、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号3
    2、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号3
    6、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号4
    0、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号4
    4、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号4
    8、配列番号49、配列番号50および配列番号51からなる
    群より選択されるヌクレオチド配列からなり、そして ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する、 ことを含む方法。
  10. 【請求項１０】前記オリゴヌクレオチドが配列番号１、
    配列番号２、配列番号３または配列番号５からなる請求
    項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】配列番号１からなるオリゴヌクレオチ
    ド。
  12. 【請求項１２】請求項11記載のオリゴヌクレオチドおよ
    び薬学的に受容可能な担体を含む、PKCの発現を調節す
    るための医薬組成物。
  13. 【請求項１３】配列番号２からなるオリゴヌクレオチ
    ド。
  14. 【請求項１４】請求項13記載のオリゴヌクレオチドおよ
    び薬学的に受容可能な担体を含む、PKCの発現を調節す
    るための医薬組成物。
  15. 【請求項１５】配列番号３からなるオリゴヌクレオチ
    ド。
  16. 【請求項１６】請求項15記載のオリゴヌクレオチドおよ
    び薬学的に受容可能な担体を含む、PKCの発現を調節す
    るための医薬組成物。
  17. 【請求項１７】配列番号５からなるオリゴヌクレオチ
    ド。
  18. 【請求項１８】請求項17記載のオリゴヌクレオチドおよ
    び薬学的に受容可能な担体を含む、PKCの発現を調節す
    るための医薬組成物。
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