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JP2609580B2 - Novel mutant strain and method for producing soy sauce using the same - Google Patents

Novel mutant strain and method for producing soy sauce using the same

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Publication number
JP2609580B2
JP2609580B2 JP1296257A JP29625789A JP2609580B2 JP 2609580 B2 JP2609580 B2 JP 2609580B2 JP 1296257 A JP1296257 A JP 1296257A JP 29625789 A JP29625789 A JP 29625789A JP 2609580 B2 JP2609580 B2 JP 2609580B2
Authority
JP
Japan
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soy sauce
saccharomyces
yeast
strain
mutant strain
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
JP1296257A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPH03160985A (en
Inventor
光達 青木
金治 内田
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Kikkoman Corp
Original Assignee
Kikkoman Corp
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Publication date
Application filed by Kikkoman Corp filed Critical Kikkoman Corp
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  • Soy Sauces And Products Related Thereto (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は醤油中の重要な香気成分の1種である2−フ
ェニルエタノールを高生成する新規変異株及びこれを用
いる香気の優れた醤油の製造法に関する。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to a novel mutant strain that highly produces 2-phenylethanol, one of important flavor components in soy sauce, and a soy sauce having an excellent aroma using the same. Related to manufacturing method.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

酵母によりエタノールと共に生成される高級アルコー
ルとそのエステルは、醤油中の重要な香気成分の一つで
ある。それら高級アルコールの中で、中心的役割をはた
すものの一つにバラ様の香気を有する2−フェニルエタ
ノールがある。これら高級アルコールは、酵母の発酵過
程で生成するが、その生成については、清酒酵母、ビー
ル酵母等について検討され、2−フェニルエタノールに
ついても、アミノ酸の一つであるフェニルアラニンより
生成するエールリッヒ(Ehrlich)経路とグルコースに
よりフェニルアラニンを生合成する経路の途中の中間体
より生成する生合成経路が知られている。
Higher alcohols and their esters produced together with ethanol by yeast are one of the important flavor components in soy sauce. Among these higher alcohols, 2-phenylethanol having a rose-like aroma is one of the ones that play a central role. These higher alcohols are produced during the fermentation process of yeast, and their production has been studied for sake yeast, brewer's yeast, and the like. For 2-phenylethanol, Ehrlich produced from phenylalanine, one of the amino acids, is also used. A biosynthetic pathway which is produced from an intermediate in the pathway and a pathway in which phenylalanine is biosynthesized by glucose is known.

このグルコースより2−フェニルエタノールを生合成
する経路に関し、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、
焼酎酵母などのサッカロミセス・セレビシエ(Saccharo
myces cerevisiae)では、該生合成経路の制御(生合成
の抑制の原因)として、デオキシ−D−アラビノ−D−
ヘプチュロソネート ホスフェート生合成酵素(deoxy
−D−arabino−D−heptulosonate phosphate synthas
e)活性のフェニルアラニンとチロシンによるフィード
バック阻害、コリスメート ミュターゼ(chorismate m
utase)活性のチロシンによる同阻害、プレフェネート
デハイドラダーゼ(prephenate dehydratase)活性の
フェニルアラニンによる同阻害、さらにはプレフェネー
ト デハイドロゲナーゼ(prephenate dehydrogenase)
活性のチロシンによる同阻害が知られている(Lingens,
F. et al., Eur. J. Biochem., 1, 363(1967))。
Regarding the pathway for biosynthesizing 2-phenylethanol from glucose, sake yeast, beer yeast, wine yeast,
Saccharomyces cerevisiae such as shochu yeast
myces cerevisiae), the regulation of the biosynthetic pathway (the cause of the suppression of biosynthesis) includes deoxy-D-arabino-D-
Heptulosonate phosphate biosynthetic enzyme (deoxy
-D-arabino-D-heptulosonate phosphate synthas
e) Feedback inhibition of activity by phenylalanine and tyrosine, chorismate mutease
utase) activity inhibition by tyrosine, prephenate dehydratase activity inhibition by phenylalanine, and prephenate dehydrogenase
This activity is known to be inhibited by tyrosine (Lingens,
F. et al., Eur. J. Biochem., 1, 363 (1967)).

そしてこれに関連し、清酒酵母や焼酎酵母のサッカロ
ミセス・セレビシエを親株とし、該親株より2倍以上あ
るいは10倍以上の2−フェニルエタノールを生成するフ
ルオロフェニルアラニン耐性変異株を得たことが報告さ
れている(平成元年度日本醗酵工学会大会講演要旨集、
第50頁及び52頁、平成元年9月10日発行)。
In this regard, it has been reported that Saccharomyces cerevisiae, a sake yeast or shochu yeast, was used as a parent strain, and a fluorophenylalanine-resistant mutant strain that produced 2-phenylethanol at least twice or at least 10 times that of the parent strain was obtained. (Heisei 1989 Annual Meeting of the Japanese Fermentation Engineering Congress,
(Pages 50 and 52, issued September 10, 1989).

しかし、チゴサッカロミセス属酵母ではそのようなこ
とは知られていない。
However, such a thing is not known about yeast of the genus S. saccharomyces.

〔発明が解決しようとする課題〕[Problems to be solved by the invention]

本発明者は、醤油香気成分のなお一層豊富な生成を目
指し、グルコースより生合成される2−フェニルエタノ
ールを高生成するチゴサッカロミセス(Zygosacchromyc
es)属に属する酵母変異株の検索を行なった。即ち、本
発明の目的は、チゴサッカロミセス属酵母において、2
−フェニルエタノールを高生成する変異株を得ること及
びこの変異酵母を用いて香気のすぐれた醤油を製造する
ことにある。
The present inventor aimed at producing even more abundant soy sauce flavor components, and produced Zygosacchromyc (Zygosacchromyc) which highly produces 2-phenylethanol biosynthesized from glucose.
es) A yeast mutant belonging to the genus was searched. That is, an object of the present invention is to provide a yeast belonging to the genus Tigosaccharomyces
-To obtain a mutant strain that produces high phenylethanol and to produce a soy sauce with excellent aroma using the mutant yeast.

〔課題を解決するための手段〕[Means for solving the problem]

本発明者等は、種々のチゴサッカロミセス属に属する
酵母を対象として、これに種々の変異処理を施すことに
より、グルコースより2−フェニルエタノールを生合成
する経路におけるプレフェネート デハイドロゲナーゼ
を除く前記律速酵素が阻害を受けることなく、2−フェ
ニルエタノールを多量に生成する能力を有する変異株を
検索した結果、親株であるチゴサッカロミセス・ルキシ
ー(Zygosaccharomyces rouxii)ATCC 13356を変異処理
することにより目的とする2−フェニルエタノールを高
生成するチゴサッカロミセス属に属する新規変異株を得
ることに成功し、本発明を完成した。
The present inventors have performed various mutation treatments on yeast belonging to the genus S. saccharomyces, thereby performing the above-described rate-limiting except for prephenate dehydrogenase in the pathway for biosynthesizing 2-phenylethanol from glucose. As a result of searching for a mutant having the ability to produce a large amount of 2-phenylethanol without inhibition of the enzyme, the target strain was obtained by mutating the parent strain Zygosaccharomyces rouxii ATCC 13356. -The inventors succeeded in obtaining a novel mutant belonging to the genus Tigosaccharomyces which produces phenylethanol at a high level, and completed the present invention.

即ち、本発明は、チゴサッカロミセス・ルキシー属に
属し、フルオロフェニルアラン耐性を有する新規変異株
であり、また本発明は、該新規変異株を醤油製造におけ
る発酵熟成工程中に用いることを特徴とする醤油の製造
法である。
That is, the present invention is a novel mutant belonging to the genus T. saccharomyces luxii and having resistance to fluorophenylalan, and the present invention is characterized in that the novel mutant is used during a fermentation ripening step in soy sauce production. This is a method for producing soy sauce.

以下、本発明について詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

先ず、本発明の親株として使用する菌株としては、例
えば、チゴサッカロミセス・ルキシー ATCC13356などが
挙げられる。そして該親株に通常の変異処理を行なって
本発明における新規変異株チゴサッカロミセスFPA−1
を得ることができる。
First, as a strain used as a parent strain of the present invention, for example, S. saccharomyces luxii ATCC13356 and the like can be mentioned. Then, the parent strain is subjected to ordinary mutation treatment to obtain a novel mutant strain of the present invention, Tigosaccharomyces FPA-1.
Can be obtained.

次に、上記チゴサッカロミセスFPA−1の菌学的性質
を示す。
Next, the bacteriological properties of the above-mentioned C. saccharomyces FPA-1 will be described.

(a)各培地における生育状態 YM寒天培地でクリーム色コロニーを形成し、栄養細
胞は主径3〜7μの球形ないし卵形で出芽により増殖す
る。YM液体培地では薄膜を形成しない。
(A) Growth state in each medium A cream-colored colony is formed on the YM agar medium, and the vegetative cells proliferate by budding in a spherical or oval shape having a main diameter of 3 to 7 μm. YM liquid medium does not form a thin film.

バレイショ抽出液寒天培地で偽菌糸は形成しない。 No pseudohyphae are formed on the potato extract agar medium.

(b)子嚢胞子の形成 一般酵母用胞子形成培地では子嚢を形成し難いが、0.
9%食塩を含むYM培地で接合子型子嚢を形成する。
(B) Formation of ascospores It is difficult to form ascospores in a spore-forming medium for general yeast,
Form oocysts in YM medium containing 9% saline.

(c)射出胞子の形成 YM寒天平面培養で射出胞子を形成せず。(C) Formation of ejected spores No ejected spores were formed on YM agar plate culture.

(d)各生理的性質 15〜37℃でよく生育し、最適温度は30℃、pH3〜7
でよく生育し、最適pHは5である。
(D) Each physiological property Grows well at 15-37 ° C, optimal temperature is 30 ° C, pH 3-7
And has an optimum pH of 5.

硝酸塩の同性化・・・・なし。 Nitrate homogenization: None.

塩化ナトリウム耐性・・・・18%(W/W)以上の塩
化ナトリウム存在下でよく生育する。
Sodium chloride resistant ... Grows well in the presence of 18% (W / W) or more sodium chloride.

ビタミン要求性・・・・ビオチン、パントテン酸。 Vitamin requirement: biotin, pantothenic acid.

(e)同化性、発酵性の有無 同化性 発酵性 D−アラビノース − − D−キシロース − − D−グルコース + + D−ガラクトース + − 同化性 発酵性 麦芽糖 − − ショ糖 + + 乳糖 − − ラフィノース − − α−メチル−D−グルコシド − − アルブチン − − コハク酸塩 − − メリビオース − − セロビオース − − トレハロース − − エタノール − − D−マンニット + + (f)2−フェニルエタノール生成量 親株チゴサッカロミセス・ルキシーATCC13356と本発
明における変異株チゴサッカロミセスFPA−1を対比
し、以下の試験を行なった。
(E) Assimilation, fermentability presence or absence assimilation fermentability D-arabinose--D-xylose--D-glucose ++ D-galactose +-assimilation fermentable maltose--sucrose + + lactose--raffinose- -Α-methyl-D-glucoside--arbutin--succinate--melibiose--cellobiose--trehalose--ethanol--D-mannitol + + (f) 2-phenylethanol production amount Parent strain Tigosaccharomyces luxii ATCC13356 was compared with the mutant strain S. saccharomyces FPA-1 of the present invention, and the following tests were performed.

チゴサッカロミセス・ルキシーATCC13356とチゴサッ
カロミセスFPA−1の両株を、おのおの下記組成の合成
培養培地で30℃、5日間前培養した。
Both strains of S. saccharomyces luxii ATCC13356 and S. saccharomyces FPA-1 were precultured in a synthetic culture medium having the following composition at 30 ° C. for 5 days.

(合成培養培地) ディフコ・イースト・ナイトロジェン・ベース(アミノ
酸及び硫酸アンモニウムを含まない)0.2%(W/V)、硫
酸アンモニウム20mM、グルコース5%(W/V)、食塩5
%(W/V)、pH5.2 次いで、これを上記組成の合成培養培地で、30℃、7
日間静置培養した。その結果、培養培地中の2−フェニ
ルエタノール生成量は、親株であるチゴサッカロミセス
・ルキシーATCC13356が4ppmであるのに対し、変異株チ
ゴサッカロミセスFPA−1は150ppmであった。
(Synthetic culture medium) Difco yeast nitrogen base (excluding amino acids and ammonium sulfate) 0.2% (W / V), ammonium sulfate 20 mM, glucose 5% (W / V), salt 5
% (W / V), pH 5.2 Then, this was mixed with a synthetic culture medium having the above composition at 30 ° C., 7
The culture was allowed to stand for a day. As a result, the amount of 2-phenylethanol produced in the culture medium was 4 ppm for the parent strain, S. saccharomyces luxii ATCC13356, and 150 ppm for the mutant S. saccharomyces FPA-1.

(g)プレフェネート デヒドロゲナーゼ活性 親株チゴサッカロミセス・ルキシーATCC13356と本発
明における変異株チゴサッカロミセスFPA−1とを比較
すると、チゴサッカロミセスFPA−1より得られたプレ
フェネート デヒドロゲナーゼの菌体総蛋白質量当りの
活性は、親株のチゴサッカロミセス・ルキシーATCC1335
6のそれを100%とした場合、2%以下に減少し、親株と
は大きく異なっている。
(G) Prephenate dehydrogenase activity Comparing the parent strain S. saccharomyces luxii ATCC13356 with the mutant strain S. saccharomyces FPA-1 in the present invention, the activity of the prephenate dehydrogenase obtained from S. saccharomyces FPA-1 per total cell mass of the bacterial cell is: Parent strain S. saccharomyces luxii ATCC1335
Assuming that of 6 is 100%, it is reduced to 2% or less, which is significantly different from the parent strain.

即ち、変異株チゴサッカロミセスFPA−1では上記の
ごとくプレフェネート デヒドロゲナーゼ活性が著しく
低下してチロシンの生合成が減少し、そしてグルコース
より2−フェニルエタノールを生合成する経路上の酵素
のチロシンによるフィードバック阻害が軽減され、その
結果として2−フェニルエタノールが著量生成されるの
である。
That is, in the mutant strain T. saccharomyces FPA-1, as described above, the activity of prephenate dehydrogenase is significantly reduced to decrease the biosynthesis of tyrosine, and the feedback inhibition by tyrosine of the enzyme on the pathway of biosynthesizing 2-phenylethanol from glucose is suppressed. Is reduced, resulting in significant production of 2-phenylethanol.

以上のチゴサッカロミセスFPA−1における(a)〜
(e)の菌学的性質は、クレガー編(N.J.W.Kreger−va
n Rij)の「ザ イースト」(The Yeasts,A toxonomic
study」 Elsevir Science Pub.)第3版により、いずれ
もチゴサッカロミセス・ルキシーに属する菌株の有する
ものと同一である。
(A)-in the above-mentioned T. saccharomyces FPA-1
The mycological properties of (e) are described in Kreger (NJWKreger-va
n Rij 「The Yeasts, A toxonomic
study ”Elsevir Science Pub.) According to the third edition, all are the same as those belonging to the strain belonging to T. saccharomyces luxii.

そしてこの親株チゴサッカロミセス・ルキシーATCC13
356と変異株チゴサッカロミセスFPA−1の両菌株間の違
いは、上記(f)及び(g)の他に、後者の変異株が、
前者の親株と異なって、フルオロフェニルアラニンを50
μg/ml含む培地で生育できるフルオロフェニルアラニン
耐性菌であることである。
And this parent strain Chigosaccharomyces luxii ATCC13
The difference between both strains of 356 and the mutant strain S. saccharomyces FPA-1 is that, in addition to (f) and (g) above,
Unlike the former parent strain, 50
It is a fluorophenylalanine-resistant bacterium that can grow on a medium containing μg / ml.

これらのことより、該菌株チゴサッカロミセスFPA−
1は新株菌であると同定した。
From these facts, the strain S. saccharomyces FPA-
1 was identified as a new strain.

なお、このチゴサッカロミセスFPA−1は、工業技術
院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第11115号(FER
M P−11115)として寄託されている。
In addition, this Strawberry saccharomyces FPA-1 was supplied to the Institute of Microbial Industry and Technology by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
MP-11115).

上記変異処理としては、如何なる方法でもよい。例え
ば化学的方法としてN−メチル−N′−ニトロ−N−ニ
トロソグアニジン(以下、MNNGと略称する)、エチルメ
タンスルホネート、メチルメタンスルホネート、4−ニ
トロソキノン、亜硝酸、ブロモウラシル等の変異誘発剤
を用いるか、物理的方法として紫外線照射、X線照射、
放射線照射処理などを行なう。
Any method may be used for the mutation treatment. For example, as a chemical method, a mutagenic agent such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (hereinafter abbreviated as MNNG), ethyl methanesulfonate, methyl methanesulfonate, 4-nitrosoquinone, nitrite, bromouracil, etc. Is used, or physical methods such as ultraviolet irradiation, X-ray irradiation,
A radiation irradiation treatment or the like is performed.

培地としては、酵母が利用し得る炭素源、窒素源、無
機塩類、その他酵母の生育に必要な成分を、適宜配合し
た合成培地、天然培地が用いられる。なお醤油の如く、
高塩濃度の諸味への添加を意図する場合には、該培地の
食塩濃度を6〜18%(W/V)程度に調整することが望ま
しい。そしてフルオロフェニルアラニン耐性を付与する
ために、上記酵母培養培地にp−フルオロフェニルアラ
ニン、o−フルオロフェニルアラニン又はm−フルオロ
フェニルアラニン、好ましくはp−フルオロフェニルア
ラニンを50μg/ml程度添加する。
As the medium, a synthetic medium or a natural medium appropriately containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other components necessary for the growth of yeast, which can be used by yeast, is used. In addition, like soy sauce,
When adding a high salt concentration to moromi, it is desirable to adjust the salt concentration of the medium to about 6 to 18% (W / V). Then, in order to impart fluorophenylalanine resistance, p-fluorophenylalanine, o-fluorophenylalanine or m-fluorophenylalanine, preferably p-fluorophenylalanine, is added to the yeast culture medium at about 50 μg / ml.

この酵母の培養は、振盪培養、通気培養、撹拌培養、
静置培養等の好気的、あるいは嫌気的培養方法のうち、
適宜な方法が採用される。培養温度は酵母菌体が生育し
得る範囲内で可能であるが通常25〜30℃であり、培養時
間は好気的培養の場合には10〜50時間、嫌気的培養の場
合には120〜170時間程度培養する。
This yeast culture is performed by shaking culture, aeration culture, stirring culture,
Among aerobic or anaerobic culture methods such as stationary culture,
An appropriate method is adopted. The culturing temperature is possible within a range in which yeast cells can grow, but is usually 25 to 30 ° C., and the culturing time is 10 to 50 hours for aerobic culturing, and 120 to 50 hours for anaerobic culturing. Incubate for about 170 hours.

このようにして固体培養の場合には生じたコロニーを
分離し、液体培養の場合には遠心分離、濾過等の通常の
操作方法に従い分離し、必要により洗浄して本変異株を
得る。
In the case of solid culture in this manner, the resulting colony is separated, and in the case of liquid culture, the colony is separated according to ordinary operation methods such as centrifugation and filtration, and washed as necessary to obtain the mutant strain.

このようにして得られた本変異株の培養は、通常の酵
母の培養法に従えばよい。
The thus obtained mutant strain may be cultured according to a usual yeast culture method.

次に本変異株を用いて醤油を製造する方法について述
べる。
Next, a method for producing soy sauce using this mutant strain will be described.

先ず、常法により、通常の蛋白質原料、炭水化物原料
などに、例えば蒸煮、膨化、炒熬などの原料処理を施し
たのち、種麹を接種して製麹し、醤油麹を得る。次い
で、常法により、該醤油麹を適宜の濃度の食塩水と共に
仕込み、これを発酵熟成させて熟成諸味を得る。そして
本発明においては、この仕込から熟成諸味を得る迄の発
酵熟成工程期間中の適当時期に、別に培養して得た本菌
株の菌体又はその培養液を添加し、以後は通常の諸味発
酵熟成管理を行なう。このときの本菌株の菌体又はその
培養液の添加時期、添加量などは特に制限されないが、
好ましくは通常仕込後1〜2か月、菌体量として約105
個/g程度である。
First, a conventional protein raw material, carbohydrate raw material, or the like is subjected to a raw material treatment such as steaming, puffing, and roasting, and then inoculated with a seed koji to produce a soy sauce koji. Next, the soy sauce koji is charged together with a salt solution having an appropriate concentration by a conventional method, and this is fermented and aged to obtain an aged moromi. Then, in the present invention, at an appropriate time during the fermentation and ripening process from the preparation to the aging moromi, the cells of the present strain obtained by separately culturing or a culture solution thereof are added, and thereafter, ordinary moromi fermentation is performed. Perform aging management. At this time, the time of addition of the bacterial cell of the present strain or its culture solution, the amount added is not particularly limited,
Preferably, usually about 1 to 2 months after preparation, about 10 5
Unit / g.

このようにして得た熟成諸味を、常法により圧搾し、
規格調整、火入などを行なって、香気の優れた火入醤油
が得られる。
The aged moromi thus obtained is squeezed by a conventional method,
By performing standard adjustment and burning, a burned soy sauce with excellent aroma can be obtained.

また、原料の酸あるいは酵素分解液を常法により固定
化した乳酸菌、酵母などと接触させて発酵熟成させ、香
味芳醇なる発酵液を得るに際し、通常の酵母菌株の一部
または全部に替えて、本変異株を使用することもでき
る。
Also, the acid or enzymatic decomposition solution of the raw material is immobilized by a conventional method, contacted with lactic acid bacteria, yeast and the like, and fermented and ripened to obtain a fermentation solution with a rich flavor, replacing some or all of the normal yeast strains, The present mutant strain can also be used.

〔発明の効果〕〔The invention's effect〕

本発明の新規変異株は、従来のチゴサッカロミセス・
ルキシーに属する菌株に比し、著しく2−フェニルエタ
ノールの生成能が優れたものであり、本菌株を用いて醤
油製造を行なった場合、得られた醤油は2−フェニルエ
タノール等の高級アルコール成分を著しく多量に含み、
顕著に香気の優れたものである。
The novel mutant of the present invention is a conventional mutant of S. saccharomyces.
Compared to strains belonging to Ruxii, the ability to produce 2-phenylethanol is remarkably excellent. When soy sauce is produced using this strain, the obtained soy sauce contains higher alcohol components such as 2-phenylethanol. Contains a remarkably large amount,
It is remarkably fragrant.

〔実施例〕〔Example〕

以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.

実施例1 親株チゴサッカロミセス・ルキシーATCC13356を、窒
素源としてL−プロリンを含む下記組成のプロリン培地
50mlで、30℃、5日間静置培養した。
Example 1 A parent strain S. saccharomyces luxii ATCC13356 was prepared by using a proline medium having the following composition and containing L-proline as a nitrogen source.
The cells were cultured at 50 ° C for 30 days at 30 ° C.

(プロリン培地) ディフコ・イースト・ナイトロジェン・ベース(アミノ
酸と硫酸アンモニウムを含まない) 0.2%(W/V) L−プロリン 2 mM NaCl 5 %(W/V) 次いで得た培養液を遠心分離して集菌し、これを食塩
5%(W/V)含有の100mMリン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄
したのち、該洗浄菌体を食塩5%(W/V)、グルコース
5%(W/V)含有の100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁
し、さらにMNNGを1mg/mlになるように加えたのち、30℃
で1時間ゆっくりと振盪しならがら変異処理を行なっ
た。続いてこれを遠心分離して集菌し、これを上記プロ
リン培地50mlで、30℃、10時間静置培養したのち、さら
にp−フルオロフェニルアラニンを最終濃度として50μ
g/ml及び寒天を2%(W/V)含有させること以外は上記
プロリン培地と同様の培地に塗沫し、30℃で10日間培養
して、生育した多数の耐性株よりチゴサッカロミセスFP
A−1(FERM P−11115)を得た。
(Proline medium) Difco yeast nitrogen base (excluding amino acid and ammonium sulfate) 0.2% (W / V) L-proline 2 mM NaCl 5% (W / V) Then, the obtained culture solution was centrifuged. The cells were collected, washed with 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 5% salt (W / V), and the washed cells were washed with 5% salt (W / V) and 5% glucose (W / V). / V) suspended in 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), and added with MNNG to a concentration of 1 mg / ml.
For 1 hour while shaking slowly. Subsequently, the cells were collected by centrifugation, and the cells were cultured in 50 ml of the above-mentioned proline medium at 30 ° C. for 10 hours, and then p-fluorophenylalanine was added to a final concentration of 50 μl.
g / ml and agar 2% (W / V) except that it was spread on a medium similar to the above-mentioned proline medium, cultured at 30 ° C. for 10 days, and grown from a number of resistant strains to obtain S. saccharomyces FP.
A-1 (FERM P-11115) was obtained.

実施例2 脱脂大豆100kgを蒸煮変性したものと、小麦105kgを炒
熬割砕したものを混合し、これに種麹を接種し、42時間
の通風製麹を行ない醤油麹を得た。
Example 2 100 kg of defatted soybeans were steam-denatured and 105 kg of wheat crushed in a roasted mushroom were mixed, inoculated with seed koji, and subjected to 42 hours of ventilation koji making to obtain soy sauce koji.

これに15℃に冷却した25%(W/V)食塩水360を加
え、600容密閉仕込タンクに仕込んだ。その際、ペデ
ィオコッカス・ハロフィルス(Pediococcus halophilu
s)IAM1693を生菌数が諸味1g当り1×105となるように
添加した。添加後ときどき撹拌し、仕込後14日目より加
温し、仕込後60日目に、別に下記の方法により得たチゴ
サッカロミセスFPA−1(FERM P−11115)の培養液を、
生菌数が諸味1g当り1×105個となるように添加した。
To this, 360% of a 25% (W / V) saline solution cooled to 15 ° C. was added, and the mixture was charged into a 600-volume closed charging tank. At that time, Pediococcus halophilu
s) IAM1693 was added so that the viable cell count was 1 × 10 5 per g of moromi. The mixture was stirred occasionally after the addition, heated from the 14th day after the preparation, and on the 60th day after the preparation, a culture solution of T. saccharomyces FPA-1 (FERM P-11115) separately obtained by the following method was added.
It was added so that the viable cell count was 1 × 10 5 per g of moromi.

〔チゴサッカロミセスFPA−1(FERM P−11115)の培養
液: 上記の仕込後20日目の醤油諸味液汁を食塩15%(W/
V)に調整したのち、無菌濾過して得た培地(pH5.2)
に、実施例1で得たチゴサッカロミセスFPA−1(FREM
P−11115)を接種し、30℃で4日間培養して培養液を得
た。〕 その後さらに6か月間通常の諸味管理を行なって熟成
諸味を得た。
[Culture solution of C. saccharomyces FPA-1 (FERM P-11115): The soy sauce moromi sap on the 20th day after the above preparation was added to a 15% salt (W /
After adjusting to V), the medium obtained by aseptic filtration (pH 5.2)
Next, the strawberry Saccharomyces FPA-1 obtained in Example 1 (FREM
P-11115) and cultured at 30 ° C. for 4 days to obtain a culture solution. After that, normal moromi management was carried out for another 6 months to obtain an aged moromi.

これを常法により圧搾した後、NaCl 17.0%(W/V)、
T.N 1.57%(W/V)に調整し、80℃で4時間の火入を行
ない、火入醤油(本製品)を得た。
After squeezing this by the usual method, NaCl 17.0% (W / V),
The TN was adjusted to 1.57% (W / V), and the mixture was heated at 80 ° C. for 4 hours to obtain a burned soy sauce (this product).

一方上記チゴサッカロミセスFPA−1の代りに、チゴ
サッカロミセス・ルキシーATCC13356を用いる以外は、
上記と全く同様にして火入醤油(対照製品)を得た。
On the other hand, except that the above-mentioned T. saccharomyces FPA-1 is replaced with T. saccharomyces luxii ATCC13356,
Fired soy sauce (control product) was obtained in exactly the same manner as above.

上記火入醤油の一般分析を醤油技術会編「しょうゆ基
準分析法」に従って行ない、併せて2−フェニルエタノ
ールも定量した。その結果を表1に示す。
A general analysis of the fired soy sauce was performed in accordance with "Soy sauce standard analysis method" edited by Soy Sauce Technical Society, and 2-phenylethanol was also quantified. Table 1 shows the results.

なお、2−フェニルエタノールの定量法は、常法によ
りガスクロマトグラフィーによった。
In addition, the gas chromatography was used for the quantification method of 2-phenylethanol by an ordinary method.

また、上記火入醤油について、24名のパネルにより、
トライアングル法で官能検査を実施した。その結果を表
2に示す。
In addition, about the above-mentioned hot soy sauce, panel of 24 people,
Sensory tests were performed by the triangle method. Table 2 shows the results.

表1に示されるようにアルコールが十分に生成され、
いずれの製品にても正常な酵母発酵が行なわれた。そし
て2−フェニルエタノールは、本製品にて対照製品に比
べ約20倍に増加していることが確認された。
As shown in Table 1, alcohol is sufficiently generated,
Normal yeast fermentation was performed for all products. Then, it was confirmed that the amount of 2-phenylethanol was increased about 20 times in this product as compared to the control product.

また表2の結果より明らかな如く、本製品は対照製品
に比べ香気に著しく優れている製品であった。
Also, as is clear from the results in Table 2, this product was a product having a remarkably superior aroma compared to the control product.

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項1】チゴサッカロミセス・ルキシーに属し、フ
ルオロフェニルアラニン耐性を有する新規変異株。
1. A novel mutant strain belonging to T. saccharomyces luxii and having resistance to fluorophenylalanine.
【請求項2】請求項(1)記載の新規変異株を醤油製造
における発酵熟成工程中に用いることを特徴とする醤油
の製造法。
2. A method for producing soy sauce, wherein the novel mutant strain according to (1) is used during a fermentation ripening step in soy sauce production.
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