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JP2678249B2 - Antithrombin-III formulation - Google Patents

Antithrombin-III formulation

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Publication number
JP2678249B2
JP2678249B2 JP63155740A JP15574088A JP2678249B2 JP 2678249 B2 JP2678249 B2 JP 2678249B2 JP 63155740 A JP63155740 A JP 63155740A JP 15574088 A JP15574088 A JP 15574088A JP 2678249 B2 JP2678249 B2 JP 2678249B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antithrombin
iii
heat
aqueous solution
fraction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP63155740A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPH024717A (en
Inventor
佳信 本田
好雄 板垣
康明 森定
亮治 西井
勇彦 松本
Original Assignee
株式会社ミドリ十字
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ミドリ十字 filed Critical 株式会社ミドリ十字
Priority to JP63155740A priority Critical patent/JP2678249B2/en
Priority to CA000597405A priority patent/CA1341379C/en
Priority to DE68925918T priority patent/DE68925918T2/en
Priority to ES89304085T priority patent/ES2084599T3/en
Priority to EP89304085A priority patent/EP0339919B1/en
Priority to EP95108077A priority patent/EP0682949A1/en
Priority to KR1019890005684A priority patent/KR0139049B1/en
Publication of JPH024717A publication Critical patent/JPH024717A/en
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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−II
Iを含有し、ウィルスが不活化され、夾雑物質を実質的
に含まないアンチトロンビン−III製剤に関する。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial application] The present invention relates to antithrombin-II derived from human plasma.
It relates to an antithrombin-III formulation containing I, virus inactivated, and substantially free of contaminants.

[従来の技術] アンチトロンビン−IIIは血漿中に存在するαグロ
ブリンに属する糖蛋白質の一種で、その分子量は65,000
〜68,000であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、トロン
ビンの凝固活性を強く阻害する。
The [Prior Art] antithrombin -III a kind of glycoprotein belonging to the alpha 2 globulin present in the plasma, its molecular weight 65,000
It has a protease inhibitory activity and strongly inhibits the clotting activity of thrombin.

また、トロンビンに対する阻害作用のみならず、その
他の凝固因子、例えば、活性化X因子、活性化IX因子な
どに対する阻害作用をも有している。その他、プラスミ
ンやトリプシンに対する阻害作用のあることも報告され
ている。
In addition, it has an inhibitory effect not only on thrombin but also on other coagulation factors, for example, activated factor X, activated factor IX, and the like. In addition, it has been reported that it has an inhibitory effect on plasmin and trypsin.

これらの阻害作用は、一般にヘパリンの共存下でより
速やかに進行することが知られている。
It is known that these inhibitory effects generally progress more rapidly in the presence of heparin.

このような薬理作用を有するアンチトロンビン−III
は、凝固異常亢進の補正、具体的には汎発性血管異常症
(DIC)を目的として用いられるものである。
Antithrombin-III having such a pharmacological action
Is used for correction of hypercoagulability, specifically for the purpose of generalized vascular abnormalities (DIC).

[発明が解決しようとする課題] ところで、アンチトロンビン−IIIの精製工程におい
て、パイロジェン又は夾雑蛋白の混在が危惧されてお
り、その除去方法が種々検討されている。また、血漿蛋
白成分に混在する可能性のある肝炎ウィルス等を不活化
するために行う60℃、10時間の液状加熱処理により生成
する熱変性蛋白の存在も新たな問題となりつつある。最
近、この熱変性蛋白を除去する方法として、固定化ヘパ
リンを用いて再処理する方法が提案されている(特開昭
63−23896号公報)。しかし、この方法はパイロジェン
の除去等にはあまり有効でないことが判明している。
[Problems to be Solved by the Invention] By the way, in the step of purifying antithrombin-III, there is a concern that pyrogen or contaminant proteins may be present, and various methods for removing the same have been studied. In addition, the presence of heat-denatured protein produced by liquid heat treatment at 60 ° C. for 10 hours, which is performed to inactivate hepatitis virus and the like that may be mixed in plasma protein components, is becoming a new problem. Recently, as a method for removing this heat-denatured protein, a method of reprocessing using immobilized heparin has been proposed (Japanese Patent Laid-Open No. Sho 61-242).
63-23896). However, it has been found that this method is not very effective in removing pyrogens and the like.

そこで本発明者らはこれらの事情に鑑み、種々研究を
重ねた結果、ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−II
Iを含有し、ウィルスが不活化され、夾雑物質を実質的
に含まないアンチトロンビン−III製剤を調製できるこ
とを見出し、本発明を完成した。
Therefore, in view of these circumstances, the present inventors have conducted various studies, and as a result, antithrombin-II derived from human plasma has been obtained.
It was found that an antithrombin-III preparation containing I, virus inactivated, and substantially free of contaminants can be prepared, and the present invention has been completed.

[課題を解決するための手段] 本発明のアンチトロンビン−III製剤は、以下の性質
を有する。
[Means for Solving the Problems] The antithrombin-III preparation of the present invention has the following properties.

ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−IIIを含有す
る。
Contains antithrombin-III derived from human plasma.

ウィルスは不活化されている。The virus is inactivated.

夾雑物質を実質的に含まない。Substantially free of contaminants.

夾雑物質としては、パイロジェン、熱変性蛋白、アン
チトロンビン−III以外の血漿蛋白(例えば、セルロプ
ラスミン、トランスフェリン、アルブミン、ハプトグロ
ビン、α−マクログロブリン、α−アンチトリプシ
ン、IgA、IgCなど)等が挙げられる。
The contaminants, pyrogen, heat denatured proteins, plasma proteins other than antithrombin -III (e.g., ceruloplasmin, transferrin, albumin, haptoglobin, alpha 2 - macroglobulin, alpha 1 - antitrypsin, IgA, etc. IgC) or the like Can be mentioned.

アンチトロンビン−IIIの比活性は6〜7単位/mg蛋白
程度である。
The specific activity of antithrombin-III is about 6 to 7 units / mg protein.

本発明のアンチトロンビン−III製剤は、具体的に
は、以下のようにアンチトロンビン−III含有水溶液を
疎水性基をリガンドとする不溶性担体を用いるクロマト
処理により精製されたアンチトロンビン−IIIを用いて
調製される。
The antithrombin-III preparation of the present invention specifically uses antithrombin-III purified by a chromatographic treatment using an insoluble carrier having a hydrophobic group as a ligand for an antithrombin-III-containing aqueous solution as follows. Is prepared.

原料として使用されるアンチトロンビン−IIIは、ヒ
ト由来のもので、医薬として使用できる程度に精製され
たものであれば特に制限されるものではなく、例えば、
ヒトの全血、血漿、血清または凝固した血液から圧搾さ
れた血清等から精製することができる。上記アンチトロ
ンビン−IIIを調製するための出発原料としては、例え
ば、血漿、コーンの冷エタノール法で得られる画分IV、
IV−1、IV−4またはIV−1+IV−4、クエン酸含有血
漿から血液凝固第VIII因子を回収した後の残渣画分等が
使用される。アンチトロンビン−IIIの精製法として
は、例えば、特開昭48−35017号公報、特公昭59−7693
号公報に開示の方法が例示される。
Antithrombin-III used as a raw material is of human origin and is not particularly limited as long as it is purified to the extent that it can be used as a medicine.
It can be purified from human whole blood, plasma, serum, serum expressed from coagulated blood, or the like. As a starting material for preparing the antithrombin-III, for example, plasma, Fraction IV obtained by the cold ethanol method of corn,
IV-1, IV-4 or IV-1 + IV-4, a residual fraction after collecting blood coagulation factor VIII from citrate-containing plasma, and the like are used. Examples of the method for purifying antithrombin-III include, for example, JP-A-48-35017 and JP-B-59-7693.
The method disclosed in the publication is exemplified.

アンチトロンビン−III含有水溶液の蛋白濃度として
は、0.1〜10(W/V)%程度が例示される。
The protein concentration of the antithrombin-III-containing aqueous solution is, for example, about 0.1 to 10 (W / V)%.

また、アンチトロンビン−III含有水溶液は、疎水性
クロマト処理に付す前に加熱処理(50〜70℃、5〜30時
間程度)を行っておくことが好ましい。
The antithrombin-III-containing aqueous solution is preferably subjected to a heat treatment (50 to 70 ° C., about 5 to 30 hours) before being subjected to the hydrophobic chromatography treatment.

上記精製に使用される疎水性基をリガンドとする不溶
性担体は以下のようなものである。
The insoluble carrier having a hydrophobic group as a ligand used for the above purification is as follows.

疎水性基としては、アルキル基(炭素数1〜10程度、
好ましくは3〜5程度)、置換基を有していてもよいフ
ェニル基等が挙げられる。
As the hydrophobic group, an alkyl group (about 1 to 10 carbon atoms,
(Preferably about 3 to 5), and a phenyl group which may have a substituent.

不溶性担体としては、セルロース、アガロース、デキ
ストラン、ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体、ポ
リビニル系、ポリスチレン系等が挙げられる。
Examples of the insoluble carrier include cellulose, agarose, dextran, polyacrylamide, amino acid copolymer, polyvinyl, and polystyrene.

疎水性基をリガンドとする不溶性担体としては、アル
キル型セファロース(冷えば、オクチル型セファロース
等)、フェニル型セファロース、アルキル型ポリビニル
(例えば、ブチル型ポリビニル等)等が市販されてお
り、これら以外のものについても市販品と同様な方法ま
たはこれに準ずる方法によって容易に製造することがで
きる。
As the insoluble carrier having a hydrophobic group as a ligand, alkyl-type sepharose (octyl-type sepharose, etc. when cold), phenyl-type sepharose, alkyl-type polyvinyl (eg, butyl-type polyvinyl) and the like are commercially available. The product can be easily manufactured by the same method as a commercially available product or a method analogous thereto.

上記不溶性担体を用いる精製工程は、一般にアンチト
ロンビン−III含有水溶液を、疎水性基をリガンドとす
る不溶性担体に接触させることにより行われるが、その
方法としてはカラム法、バッチ法の何れにて行ってもよ
い。
The purification step using the insoluble carrier is generally carried out by contacting an antithrombin-III-containing aqueous solution with an insoluble carrier having a hydrophobic group as a ligand, and the method is a column method or a batch method. May be.

接触条件は、pH6〜9程度、塩濃度1〜5M程度が例示
される。このような条件を具備する溶媒としては、3M塩
化ナトリウム含有20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.
5)、2M塩化ナトリウム含有50mMリン酸緩衝液(pH7.5)
等が例示される。
Examples of the contact conditions include a pH of about 6 to 9 and a salt concentration of about 1 to 5M. As a solvent satisfying such conditions, a 20 mM sodium citrate buffer containing 3 M sodium chloride (pH 7.
5), 50mM phosphate buffer containing 2M sodium chloride (pH7.5)
Etc. are exemplified.

上記の精製方法を具体的に説明すると、バッチ法にて
行う場合、上記条件に調整したアンチトロンビン−III
含有水溶液を、同じ条件で平衡化した当該疎水性クロマ
ト用担体に接触させる。その条件としては、該担体1ml
に対して該水溶液1〜100mlを用い、2〜20℃で30分〜
2時間程度混和させる方法が挙げられる。その後に遠心
分離にて上澄を回収する。
The above-mentioned purification method will be specifically described. When the batch method is used, antithrombin-III adjusted to the above conditions is used.
The contained aqueous solution is brought into contact with the hydrophobic chromatography carrier equilibrated under the same conditions. The condition is 1 ml of the carrier
To 1 to 100 ml of the aqueous solution at 2 to 20 ° C. for 30 minutes
A method of mixing for about 2 hours can be used. Thereafter, the supernatant is recovered by centrifugation.

カラム法にて行う場合、上記条件に調整したアンチト
ロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で平衡化され且
つカラム充填された当該疎水性クロマト用担体にて展開
し、非吸着画分を回収する。
When the column method is used, the antithrombin-III-containing aqueous solution adjusted to the above conditions is developed on the hydrophobic chromatography carrier equilibrated under the same conditions and packed in a column, and a non-adsorbed fraction is collected.

好ましくは、上記で得られた非吸着画分を、さらに陰
イオン交換体で処理し吸着画分を回収する工程に付して
精製するのがよい。
Preferably, the non-adsorbed fraction obtained above is further purified by being subjected to a step of further treating with an anion exchanger to recover the adsorbed fraction.

陰イオン交換体としては、DEAE系(例えば、DEAE−ア
ガロース、DEAE−デキストラン、DEAE−セルロースな
ど)、QAE系(例えば、QAE−アガロース、QAE−デキス
トランなど)等が挙げられる。
Examples of the anion exchanger include DEAE systems (eg DEAE-agarose, DEAE-dextran, DEAE-cellulose etc.), QAE systems (eg QAE-agarose, QAE-dextran etc.) and the like.

接触条件はpH6〜8程度、塩濃度0.01〜0.1M程度が例
示され、このような条件を具備する溶媒としては、0.05
M塩化ナトリウム含有0.01Mクエン酸緩衝液(pH7)等が
挙げられる。
The contact conditions are, for example, pH 6 to 8 and salt concentration of 0.01 to 0.1 M, and a solvent satisfying such conditions is 0.05
An example is 0.01 M citrate buffer (pH 7) containing M sodium chloride.

また溶出条件はpH6〜8程度、塩濃度0.1〜0.3M程度が
例示され、このような条件を具備する溶媒としては、0.
17M塩化ナトリウム含有0.01Mクエン酸緩衝液(pH7)等
が挙げられる。
The elution conditions are, for example, about pH 6 to 8 and salt concentration about 0.1 to 0.3 M, and a solvent satisfying such conditions is 0.1.
An example is 0.01M citrate buffer (pH 7) containing 17M sodium chloride.

その方法としてはカラム法、バッチ法のいずれで行っ
てもよい。
The method may be a column method or a batch method.

バッチ法にて行う場合、上記接触条件に調製したアン
チトロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で平衡化し
た当該陰イオン交換体に接触させる。その条件として
は、該交換体1mlに対して該水溶液1〜100mlを用い、2
〜20℃で30分〜2時間程度混和した後に遠心分離して、
該交換体を回収する。さらに、該交換体に上記溶出用溶
媒を添加する。混和条件は接触時と同じであるが、遠心
分離して上澄を回収する。
When the batch method is used, the antithrombin-III-containing aqueous solution prepared under the above contact conditions is brought into contact with the anion exchanger equilibrated under the same conditions. As the condition, 1 to 100 ml of the aqueous solution is used for 1 ml of the exchanger, and 2
After mixing for 30 minutes to 2 hours at -20 ℃, centrifuge,
Collect the exchanger. Further, the above-mentioned elution solvent is added to the exchanger. The mixing conditions are the same as for the contact, but the supernatant is recovered by centrifugation.

一方、カラム法にて行う場合、上記の接触条件に調製
したアンチトロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で
平衡化され、且つカラムに充填された当該陰イオン交換
体に通し、非吸着画分を廃棄する。必要に応じてカラム
洗浄した後、溶出用溶媒を流して溶出画分を回収する。
On the other hand, when the column method is used, the antithrombin-III-containing aqueous solution prepared under the above contact conditions is equilibrated under the same conditions and passed through the anion exchanger packed in the column to remove the non-adsorbed fraction. Discard. After washing the column as needed, the elution solvent is flowed to collect the elution fraction.

こうして得られたアンチトロンビン−IIIは、必要に
応じてさらに精製した後、製剤化される。製剤として
は、水溶液、懸濁剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、これ
ら製剤化は、医薬上許容される添加剤(希釈剤、等張化
剤、界面活性剤等)を適宜混合し、製剤上の常套手段に
より行うことができる。また、該製剤は静注、皮下注射
等の注射剤として用いられ、凍結乾燥製剤は用時に注射
用蒸留水等に溶解して用いられる。
The antithrombin-III thus obtained is further formulated, if necessary, and then formulated. Examples of the preparation include an aqueous solution, a suspension, a lyophilized preparation, and the like. These preparations are prepared by appropriately mixing pharmaceutically acceptable additives (diluent, tonicity agent, surfactant, etc.). It can be carried out by the above conventional means. The preparation is used as an injection such as intravenous injection and subcutaneous injection, and the lyophilized preparation is used by dissolving it in distilled water for injection before use.

[発明の効果] 本発明の製剤によれば、アンチトロンビン−III含有
水溶液に含まれるパイロジェン、夾雑蛋白、加熱処理に
より生成した熱変性蛋白等が効果的に除去された精製ア
ンチトロンビン−IIIを含有するので、安全性に優れた
アンチトロンビン−III製剤を提供することができる。
[Effects of the Invention] According to the formulation of the present invention, the antithrombin-III-containing aqueous solution contains purified antithrombin-III in which pyrogen, contaminant proteins, heat-denatured proteins produced by heat treatment, etc. are effectively removed. Therefore, an antithrombin-III preparation having excellent safety can be provided.

[実施例] 本発明をより詳細に説明するため実施例を挙げて説明
するが、本発明はこれらによってなんら限定されるもの
ではない。
[Examples] The present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.

実施例1 コーンの冷アルコール分画法で得られた画分IV−1の
ペースト10kgを生理食塩水100に懸濁し、硫酸バリウ
ムを5(W/V)%になるように加え、室温で30分間撹拌
し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バリウムに吸
着させて除去した。この上澄液をpH6.5に調整し、ポリ
エチレングリコール#4,000を13(W/V)%になるように
加え、生じた沈澱を遠心分離して除き、さらにポリエチ
レングリコール#4,000を30(W/V)%になるように加
え、生じた沈澱を遠心分離して回収した。この沈澱を冷
生理食塩水約20に溶解し、予め生理食塩水で調整され
たヘパリンセファロースのカラムに注入し、アンチトロ
ンビン−IIIをカラムに吸着させた。このカラムを0.4M
の塩化ナトリウム溶液で洗浄して不純蛋白を除いた後、
2.0Mの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出してく
る部分を回収した。
Example 1 10 kg of a paste of the fraction IV-1 obtained by the cold alcohol fractionation method using corn was suspended in 100 physiological saline, and barium sulfate was added thereto at a concentration of 5 (W / V)%, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. After stirring for a minute, a small amount of prothrombin was adsorbed on barium sulfate to be removed. The pH of the supernatant was adjusted to 6.5, polyethylene glycol # 4,000 was added to 13 (W / V)%, the resulting precipitate was removed by centrifugation, and polyethylene glycol # 4,000 was further added to 30 (W / V). V)%, and the resulting precipitate was collected by centrifugation. This precipitate was dissolved in about 20 cold physiological saline and injected into a column of heparin sepharose previously adjusted with physiological saline to adsorb antithrombin-III on the column. 0.4M
After washing with sodium chloride solution to remove impure proteins,
A 2.0 M sodium chloride solution was passed through the column to collect the eluted portion.

このアンチトロンビン−IIIの水溶液にクエン酸ナト
リウムを0.6Mの濃度に加え、pH7.8に調整した後、60℃
で10時間の加熱処理を施した後、塩化ナトリウム(最終
濃度3M)及びクエン酸ナトリウム(最終濃度20mM)を添
加し、pH7.5に調整した。一方、3M塩化ナトリウム含有2
0mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)で平衡化したブ
チル型ポリビニル系担体(ブチル−トヨパール650、東
洋曹達(株)製)にアンチトロンビン−III含有水溶液
を接触させたのちに上記緩衝液で展開し、未吸着画分を
回収した。続いて、0.9%塩化ナトリウム溶液に対して
一夜透析を行いつつ濃縮してアンチトロンビン−IIIの
1(W/V)%水溶液を得、必要に応じて、濾過又は遠心
分離を行って澄明な液とした。
Sodium citrate was added to the aqueous solution of antithrombin-III to a concentration of 0.6 M and adjusted to pH 7.8.
After heating for 10 hours, sodium chloride (final concentration 3M) and sodium citrate (final concentration 20 mM) were added to adjust the pH to 7.5. On the other hand, 3M sodium chloride containing 2
After contacting an aqueous solution containing antithrombin-III with a butyl-type polyvinyl carrier (butyl-Toyopearl 650, manufactured by Toyo Soda Co., Ltd.) equilibrated with 0 mM sodium citrate buffer (pH 7.5), It was developed and the unadsorbed fraction was collected. Subsequently, the solution was concentrated while performing dialysis overnight against a 0.9% sodium chloride solution to obtain a 1% (W / V) aqueous solution of antithrombin-III. If necessary, the solution was filtered or centrifuged to obtain a clear solution. And

このアンチトロンビン−IIIの1(W/V)%水溶液にマ
ンニトール2(W/V)%とクエン酸ナトリウム0.2(W/
V)%を加え、塩化ナトリウムが0.5%になるように少量
の冷蒸留水希釈し、1Nの水酸化ナトリウムでpH7.6に調
整した後、滅菌したミリポアフィルターで除菌濾過し、
500単位ずつ分注し、凍結乾燥を行って乾燥製剤とし
た。
A 1 (W / V)% aqueous solution of antithrombin-III was added to 2 (W / V)% mannitol and 0.2 (W / V) sodium citrate.
V)%, diluted with a small amount of cold distilled water so that sodium chloride becomes 0.5%, adjusted to pH 7.6 with 1N sodium hydroxide, and then sterilized and filtered with a sterilized Millipore filter.
Dispensed 500 units each, and lyophilized to give a dried preparation.

実施例2 画分IV−1ペーストの代わりに、画分IV−1+IV−4
を用いる以外は全て実施例1に準じて処理を行い、実施
例1と同様なアンチトロンビン−III製剤を得た。
Example 2 Instead of Fraction IV-1 paste, Fraction IV-1 + IV-4
The treatment was carried out in the same manner as in Example 1 except for using, to obtain the same antithrombin-III preparation as in Example 1.

実施例3 画分IV−1ペーストの代わりに、クエン酸含有血漿を
低温で処理して血液凝固第VIII因子を回収した後の残渣
画分を用いる以外は全て実施例1に準じて処理を行い、
実施例1と同様なアンチトロンビン−III製剤を得た。
Example 3 Instead of the fraction IV-1 paste, the treatment was carried out in the same manner as in Example 1 except that the citrate-containing plasma was treated at a low temperature to collect the blood coagulation factor VIII, and the residual fraction was used. ,
The same antithrombin-III preparation as in Example 1 was obtained.

実施例4 実施例1と同様にして疎水性クロマト処理を行った
後、DEAE−デキストラン処理を施した。
Example 4 A hydrophobic chromatographic treatment was carried out in the same manner as in Example 1, followed by a DEAE-dextran treatment.

即ち、実施例1で得られた疎水性クロマト処理アンチ
トロンビン−III含有水溶液を、塩化ナトリウム0.05M、
クエン酸ナトリウム0.01M、pH7となるように調製した
後、0.05M塩化ナトリウム含有0.01Mクエン酸緩衝液(pH
7)で平衡化したDEAE−デキストラン(DEAE−セファデ
ックスA−50、ファルマシア社製)に通した。さらに同
じ溶媒でカラムを洗浄した後、0.17M塩化ナトリウム含
有0.01Mクエン酸緩衝液(pH7)で溶出し、溶出画分を回
収した。以下、実施例1に準じて製剤化処理を行いアン
チトロンビン−III製剤を調製した。
That is, the hydrophobic chromatographically treated antithrombin-III-containing aqueous solution obtained in Example 1 was treated with sodium chloride 0.05M,
Sodium citrate was adjusted to 0.01M, pH 7, and then 0.01M citrate buffer containing 0.05M sodium chloride (pH
It was passed through DEAE-dextran (DEAE-Sephadex A-50, manufactured by Pharmacia) equilibrated in 7). After further washing the column with the same solvent, elution was performed with a 0.01M citrate buffer solution (pH 7) containing 0.17M sodium chloride, and the eluted fractions were collected. Hereinafter, formulation treatment was performed according to Example 1 to prepare an antithrombin-III formulation.

実施例5 実施例4で得られたアンチトロンビン−III 乾燥粉末 500単位 塩化ナトリウム 50mg クエン酸ナトリウム 52mg 上記処方の製剤を、用時、注射用蒸留水20mlに溶解し
て、静注又は点滴静注する。なお、1単位は、正常人血
漿1mlに含まれるアンチトロンビン−III量に相当する。
Example 5 Antithrombin-III dry powder obtained in Example 4 500 units Sodium chloride 50 mg Sodium citrate 52 mg The formulation of the above formulation was dissolved in 20 ml of distilled water for injection at the time of use to be injected intravenously or intravenously. To do. One unit corresponds to the amount of antithrombin-III contained in 1 ml of normal human plasma.

実験例1 (1)パイロジェンの除去 実施例1に準じて、疎水性クロマト処理を行い、その
前後のアンチトロンビン−III含有画分中のパイロジェ
ンを調べる試験を2回行った(各々第1サンプル及び第
2サンプルと称する)。なお、試験方法は日本薬局方収
載の発熱性物質試験法によった。その結果を第1表に示
す。
Experimental Example 1 (1) Removal of pyrogen According to Example 1, a hydrophobic chromatographic treatment was carried out, and a test for examining pyrogen in the antithrombin-III-containing fraction before and after that was performed twice (the first sample and the first sample, respectively). Referred to as a second sample). In addition, the test method was based on the pyrogenic substance test method listed in the Japanese Pharmacopoeia. Table 1 shows the results.

上記第1表に示されるように、疎水性クロマト処理に
より合計温度が低下し、パイロジェンが実質的に除去さ
れていることが判明した。
As shown in Table 1 above, it was found that the total temperature was lowered and the pyrogen was substantially removed by the hydrophobic chromatographic treatment.

(2)夾雑蛋白の除去 (a)比活性 実施例1に準じて疎水性クロマト処理を行い、その前
後のアンチトロンビン−III含有画分中の総蛋白量及び
アンチトロンビン−III活性を測定し、比活性を算出し
た。総蛋白量はケルダール法により測定した。また、ア
ンチトロンビン−III活性(AT−III活性)はトロンビン
と試料とを28℃で5分間反応させ、これにフィブリンを
加えた時に凝固時間がどの程度延長されるかを測定し、
予め作製しておいた検量線よりその力価を算出したもの
である。但し、1単位は正常人血漿1ml中に含まれるア
ンチトロンビン−III量に相当する。得られた結果を第
2表に示す。
(2) Removal of contaminating proteins (a) Specific activity A hydrophobic chromatographic treatment was carried out according to Example 1, and the total protein amount and antithrombin-III activity in the antithrombin-III-containing fraction before and after the treatment were measured. The specific activity was calculated. The total protein amount was measured by the Kjeldahl method. The antithrombin-III activity (AT-III activity) was determined by reacting thrombin with a sample at 28 ° C. for 5 minutes and measuring the extent of prolongation of coagulation time when fibrin was added thereto.
The titer was calculated from a calibration curve prepared in advance. However, one unit corresponds to the amount of antithrombin-III contained in 1 ml of normal human plasma. Table 2 shows the obtained results.

第2表に示されるように、疎水性クロマト処理によ
り、AT−III活性及び比活性の上昇が認められ、特に比
活性は4.9(単位/mg蛋白)から6.4(単位/mg蛋白)とな
った。
As shown in Table 2, an increase in AT-III activity and specific activity was observed by the hydrophobic chromatography treatment, and the specific activity was particularly increased from 4.9 (units / mg protein) to 6.4 (units / mg protein). .

(b)夾雑血漿蛋白の除去 実施例1に準じて疎水性クロマト処理を行い、その前
後のアンチトロンビン−III含有画分中に夾雑する血漿
蛋白の有無をオクタロニー法により調べた。その結果を
第3表に示す。
(B) Removal of contaminating plasma proteins Hydrophobic chromatography treatment was performed according to Example 1, and the presence or absence of contaminating plasma proteins in the antithrombin-III-containing fraction before and after the treatment was examined by the Ouchterlony method. Table 3 shows the results.

(c)ゲル濾過 実施例1に準じて疎水性クロマト処理を行い、その前
後のアンチトロンビン−III含有画分をゲル濾過にか
け、その溶出パターンを比較した、その結果を第1図に
示す。なお、ゲル濾過の条件は次のとおりである。
(C) Gel filtration Hydrophobic chromatography was performed according to Example 1, and the fractions containing antithrombin-III before and after that were subjected to gel filtration, and the elution patterns were compared. The results are shown in FIG. The conditions for gel filtration are as follows.

担体:TSKゲルG3000SW−XL(東ソー社製) 溶出液:0.2M塩化ナトリウム含有0.1Mリン酸緩衝液(pH
6.8) 検出法:280nmの吸光度 第1図に示されるように、処理前の画分は二峰性を示
す。このうち、高分子画分は加熱処理前の溶出パターン
からみて、熱変性蛋白に基づくものと考えられる。疎水
性クロマト処理によりこの高分子画分は消失し、一峰性
となることが判明した。
Carrier: TSK gel G3000SW-XL (manufactured by Tosoh Corporation) Eluent: 0.1 M phosphate buffer containing 0.2 M sodium chloride (pH
6.8) Detection method: absorbance at 280 nm As shown in FIG. 1, the fraction before treatment shows bimodality. Among these, the polymer fraction is considered to be based on the heat-denatured protein in view of the elution pattern before the heat treatment. It was found that this high molecular fraction disappeared by the hydrophobic chromatography treatment and became monomodal.

(d)夾雑血漿蛋白の除去 実施例4に準じて疎水性クロマト処理及び陰イオン交
換体処理を行って得られたアンチトロンビン−III含有
画分と、上記疎水性クロマト処理前のアンチトロンビン
−III含有水溶液について、夾雑血漿蛋白の有無をオク
タロニー法により調べた。蛋白濃度100mg/mlで実施し
た。その結果を第4表に示す。
(D) Removal of Contaminant Plasma Proteins An antithrombin-III-containing fraction obtained by performing hydrophobic chromatography treatment and anion exchanger treatment according to Example 4, and antithrombin-III before the above hydrophobic chromatography treatment. The contained aqueous solution was examined for the presence or absence of contaminated plasma proteins by the Ouchterlony method. It was carried out at a protein concentration of 100 mg / ml. Table 4 shows the results.

実験例2 実施例1で得られたアンチトロンビン−III凍結乾燥
製剤を注射用蒸溜水に溶解し、5匹のマウスに4,000単
位/kg相当量を尾静脈より投与して7日間観察を続けた
が、なんら異常は認められなかった。また、同じ溶解液
を家兎に5,000単位/kg投与し24時間観察したが、体温の
異常は認められなかった。
Experimental Example 2 The antithrombin-III freeze-dried preparation obtained in Example 1 was dissolved in distilled water for injection, and 4,000 units / kg equivalent amount was administered to 5 mice through the tail vein, and observation was continued for 7 days. However, no abnormality was found. The same solution was administered to rabbits at 5,000 units / kg and observed for 24 hours, but no abnormal body temperature was observed.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第1図は、疎水性クロマト処理の前後でのアンチトロン
ビン−III含有画分のゲル濾過溶出パターンを示す。
FIG. 1 shows gel filtration elution patterns of antithrombin-III-containing fractions before and after hydrophobic chromatography.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−222421(JP,A) 特開 昭63−23896(JP,A) 特開 昭55−100319(JP,A) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (56) Reference JP-A-59-222421 (JP, A) JP-A-63-23896 (JP, A) JP-A-55-100319 (JP, A)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項1】ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−II
I含有水溶液を、夾雑可能性のあるウイルスが不活化さ
れるのに十分な条件下で加熱処理を施した後、疎水基を
リガンドとする不溶性担体で処理し、夾雑物質を該担体
に吸着させ、未吸着画分を回収することからなる、ウイ
ルスが不活化され、夾雑物質として少なくともパイロジ
ェン及び不活化処理により生成した熱変性蛋白を実質的
に含まないアンチトロンビン−III製剤。
1. Antithrombin-II derived from human plasma
The aqueous solution containing I is subjected to heat treatment under conditions sufficient to inactivate viruses that may be contaminated, and then treated with an insoluble carrier having a hydrophobic group as a ligand to adsorb the contaminants to the carrier. An antithrombin-III preparation in which a virus is inactivated and which is substantially free of at least a pyrogen as a contaminant and a heat-denatured protein produced by the inactivation treatment, which comprises recovering an unadsorbed fraction.
【請求項2】夾雑物質として、パイロジェン、熱変性蛋
白及びアンチトロンビン−III以外の血漿蛋白を実質的
に含まない請求項(1)記載のアンチトロンビン−III
製剤。
2. The antithrombin-III according to claim 1, which is substantially free of pyrogens, heat-denatured proteins and plasma proteins other than antithrombin-III as contaminants.
Formulation.
【請求項3】夾雑物質として、パイロジェン、熱変性蛋
白、アルブミン、ハプトグロビン、α−マクログロブ
リン、α−アンチトリプシン及びIgAを実質的に含ま
ない請求項(1)又は請求項(2)記載のアンチトロン
ビン−III製剤。
3. The claim (1) or claim (2), which is substantially free of pyrogen, heat-denatured protein, albumin, haptoglobin, α 2 -macroglobulin, α 1 -antitrypsin and IgA as contaminants. Antithrombin-III formulation.
【請求項4】疎水基をリガンドとする不溶性担体の疎水
基がアルキル基である請求項(1)記載のアンチトロン
ビン−III製剤。
4. The antithrombin-III preparation according to claim 1, wherein the hydrophobic group of the insoluble carrier having a hydrophobic group as a ligand is an alkyl group.
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