JP2649102B2 - 核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料 - Google Patents
核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は一般に核酸の配列を決定するための方法に関
するもので、さらに特に、ゲル電気泳動によって分離さ
れた同じ大きさに分類されたDNAフラグメントを同定す
るためのローダミン染料の使用に関するものである。
するもので、さらに特に、ゲル電気泳動によって分離さ
れた同じ大きさに分類されたDNAフラグメントを同定す
るためのローダミン染料の使用に関するものである。
背景 DNA配列を決定する能力は遺伝子の機能とコントロー
ルを理解するためおよび分子生物学の基本技術の多くの
応用するために非常に重要である。本来のDNAは２個の
鎖状ポリマー、またはヌクレオチドの連鎖からなる。各
鎖はホスホジエステル結合によって連結したヌクレオチ
ドの鎖である。２つの連鎖は水素結合によって２つの連
鎖のヌクレオチドの相補的塩基：チミジン（Ｔ）をもつ
デオキシアデノシン（Ａ）およびデオキシシチジン
（Ｃ）をもつデオキシグアノシン（Ｇ）、との間で水素
結合によって逆平行の配向で共に保持されている。
ルを理解するためおよび分子生物学の基本技術の多くの
応用するために非常に重要である。本来のDNAは２個の
鎖状ポリマー、またはヌクレオチドの連鎖からなる。各
鎖はホスホジエステル結合によって連結したヌクレオチ
ドの鎖である。２つの連鎖は水素結合によって２つの連
鎖のヌクレオチドの相補的塩基：チミジン（Ｔ）をもつ
デオキシアデノシン（Ａ）およびデオキシシチジン
（Ｃ）をもつデオキシグアノシン（Ｇ）、との間で水素
結合によって逆平行の配向で共に保持されている。
現在DNA配列決定には２つの基本的なアプローチがあ
る：ジデオキシ・チェイン・ターミネーター法、例えば
サンガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、5463
〜5467頁（1977）；および化学分解方法、例えばマキサ
ムら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、560〜564頁
（1977）。鎖末端方法は幾つかの方法で改良され、あら
ゆる一般に入手できる自動化DNA配列決定機器として役
に立っている。例えばサンガーら、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー、第143巻、161〜178頁（1
980）；シュライヤーら、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー、第129巻、169〜172頁（1979）；
スミスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第13
巻、2399〜2412頁（1985）；スミスら、ネイチャー、第
321巻、674〜679頁（1987）；プロバーら、サイエン
ス、第238巻、336〜341頁（1987）、セクションII、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー、第155巻、51〜334頁
（1987）；チャーチら、サイエンス、第240巻、185〜18
8頁（1988）；およびコンネルら、バイオテクニクス、
第５巻、342〜348頁（1987）。
る：ジデオキシ・チェイン・ターミネーター法、例えば
サンガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、5463
〜5467頁（1977）；および化学分解方法、例えばマキサ
ムら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、560〜564頁
（1977）。鎖末端方法は幾つかの方法で改良され、あら
ゆる一般に入手できる自動化DNA配列決定機器として役
に立っている。例えばサンガーら、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー、第143巻、161〜178頁（1
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ラー・バイオロジー、第129巻、169〜172頁（1979）；
スミスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第13
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8頁（1988）；およびコンネルら、バイオテクニクス、
第５巻、342〜348頁（1987）。
鎖末端および化学分解方法は１またはそれ以上のセッ
トの標識を付されたDNAフラグメントの世代を必要と
し、各々は共通の起原をもち各々は既知の塩基を末端と
する。次にフラグメントの単数または複数のセットは大
きさによって分離され配列情報を得る。両者の方法にお
いて、DNAフラグメントは高分解能ゲル電気泳動によっ
て分離される。最も自動化されたDNA配列決定機器で
は、異なる末端塩基を有するフラグメントは異なる蛍光
染料を用いて標識を付され、プライマーに結合するか、
例えばスミスら（1987、上記）、あるいは末端ジデオキ
シヌクレオチドの塩基に結合する、例えばプロバーら
（上記）。標識フラグメントは一緒にされて電気泳動分
離のための同じゲルカラムに装填される。フラグメント
が分離過程の間に静置検出器を通過するときフラグメン
トによって放出される蛍光信号を分析することによって
塩基配列は決定される。
トの標識を付されたDNAフラグメントの世代を必要と
し、各々は共通の起原をもち各々は既知の塩基を末端と
する。次にフラグメントの単数または複数のセットは大
きさによって分離され配列情報を得る。両者の方法にお
いて、DNAフラグメントは高分解能ゲル電気泳動によっ
て分離される。最も自動化されたDNA配列決定機器で
は、異なる末端塩基を有するフラグメントは異なる蛍光
染料を用いて標識を付され、プライマーに結合するか、
例えばスミスら（1987、上記）、あるいは末端ジデオキ
シヌクレオチドの塩基に結合する、例えばプロバーら
（上記）。標識フラグメントは一緒にされて電気泳動分
離のための同じゲルカラムに装填される。フラグメント
が分離過程の間に静置検出器を通過するときフラグメン
トによって放出される蛍光信号を分析することによって
塩基配列は決定される。
異なるフラグメントを標識するための一組の染料を入
手することはこのようなDNA配列決定システムでは主要
な難点である。第１に、有機蛍光染料に対する代表的な
発光バンド半幅は約40〜80ナノメートル（nm）であり可
視スペクトルは約350〜400nmに過ぎないので、有意に重
なる発光バンドを持たない３種またはそれ以上の染料を
見出すことは困難である。第２に、重ならない発光バン
ドをもつ染料を見出したとしても、そのセットはそれぞ
れの発光効率が低すぎる場合DNA配列決定のために未だ
不適であるかも知れない。例えば、プリングルら、DNA
・コア・ファシリティス・ニュースレター、第１巻、15
〜21頁（1988）には、増大したゲル荷重の低い蛍光効率
を補償できないことを示すデータがある。第３に、幾つ
かの蛍光染料を同時に使用する場合、染料の吸収バンド
が広く分離することが多いので励起が難しくなる。最も
有効な励起は各染料をその吸収バンドの最高値に相当す
る波長で発光する場合に生じる。幾つかの染料を使用す
る場合、検出システムの感度と各染料に対する別々の励
起源を与えるコスト増加との間にトレードオフを行うよ
うに強いられることが多い。第４に、ゲルの単一カラム
中の異なる大きさに分類されたフラグメントの数が数百
よりも大きい場合、染料の物理化学的性質、およびフラ
グメントに連結される手段が臨界的に重要になる。染料
およびリンカーの電荷、分子量およびコンホメーション
は接近した大きさに分類されたフラグメントの電気泳動
による移動度に、広範囲なバンドの広がりが起こるよう
にあるいはゲル上のバンドの位置が逆になり、これによ
ってバンドの順序および配列を決定するための核酸中の
塩基の順序との間の一致を壊すように、不利に影響して
はならない。
手することはこのようなDNA配列決定システムでは主要
な難点である。第１に、有機蛍光染料に対する代表的な
発光バンド半幅は約40〜80ナノメートル（nm）であり可
視スペクトルは約350〜400nmに過ぎないので、有意に重
なる発光バンドを持たない３種またはそれ以上の染料を
見出すことは困難である。第２に、重ならない発光バン
ドをもつ染料を見出したとしても、そのセットはそれぞ
れの発光効率が低すぎる場合DNA配列決定のために未だ
不適であるかも知れない。例えば、プリングルら、DNA
・コア・ファシリティス・ニュースレター、第１巻、15
〜21頁（1988）には、増大したゲル荷重の低い蛍光効率
を補償できないことを示すデータがある。第３に、幾つ
かの蛍光染料を同時に使用する場合、染料の吸収バンド
が広く分離することが多いので励起が難しくなる。最も
有効な励起は各染料をその吸収バンドの最高値に相当す
る波長で発光する場合に生じる。幾つかの染料を使用す
る場合、検出システムの感度と各染料に対する別々の励
起源を与えるコスト増加との間にトレードオフを行うよ
うに強いられることが多い。第４に、ゲルの単一カラム
中の異なる大きさに分類されたフラグメントの数が数百
よりも大きい場合、染料の物理化学的性質、およびフラ
グメントに連結される手段が臨界的に重要になる。染料
およびリンカーの電荷、分子量およびコンホメーション
は接近した大きさに分類されたフラグメントの電気泳動
による移動度に、広範囲なバンドの広がりが起こるよう
にあるいはゲル上のバンドの位置が逆になり、これによ
ってバンドの順序および配列を決定するための核酸中の
塩基の順序との間の一致を壊すように、不利に影響して
はならない。
最後に、蛍光染料はフラグメントを造りまたは操作す
るために用いられる化学物質と相溶性がなければならな
い。例えば、鎖末端方法においてプライマーに標識を付
けるために用いられる染料および／またはジデオキシ・
チェイン・ターミネーターは使用したポリメラーゼまた
は逆転写酵素の活性を妨げてはならない。
るために用いられる化学物質と相溶性がなければならな
い。例えば、鎖末端方法においてプライマーに標識を付
けるために用いられる染料および／またはジデオキシ・
チェイン・ターミネーターは使用したポリメラーゼまた
は逆転写酵素の活性を妨げてはならない。
これらのきびしい制約のために、数組の蛍光染料だけ
が、自動化DNA配列決定におよび診断および分析の技術
に使用できることが見出された、例えばスミスら（198
5、上記）；プロバーら（上記）；フードら、ヨーロッ
パ特許出願8500960;およびコンネルら（上記）。
が、自動化DNA配列決定におよび診断および分析の技術
に使用できることが見出された、例えばスミスら（198
5、上記）；プロバーら（上記）；フードら、ヨーロッ
パ特許出願8500960;およびコンネルら（上記）。
上記の観点では、DNA配列決定のような、多くの分析
および診断の技術は、（１）物理化学的に類似のもの、
（２）ゲル上の蜜に配置されたDNAバンドのような空間
的に重なっている標的物質の検出ができるもの、（３）
自動化DNA配列決定の最近の方法によって単一ゲルカラ
ム上で決定することができる塩基の数を広げるもの、
（４）広範囲の予備および手先のテクニックと共に使用
するために影響を受けやすいもの、（５）その他上に挙
げた多くの必要な条件を満足するもの、である新しいセ
ットの蛍光染料の入手容易性によって有意に促進される
であろう。
および診断の技術は、（１）物理化学的に類似のもの、
（２）ゲル上の蜜に配置されたDNAバンドのような空間
的に重なっている標的物質の検出ができるもの、（３）
自動化DNA配列決定の最近の方法によって単一ゲルカラ
ム上で決定することができる塩基の数を広げるもの、
（４）広範囲の予備および手先のテクニックと共に使用
するために影響を受けやすいもの、（５）その他上に挙
げた多くの必要な条件を満足するもの、である新しいセ
ットの蛍光染料の入手容易性によって有意に促進される
であろう。
発明の概要 本発明は電気泳動により分離される異なる３′−末端
ヌクレオチドを有するDNAフラグメントが異なるローダ
ミン染料によって同定されるDNA配列決定の方法にあ
る。特に、本発明は以下に定義したローダミン標識ヌク
レオチドおよび本発明方法におけるそれらの使用を含
む。本発明は一部は、DNAポリメラーゼ、特にTagDNAポ
リメラーゼによって成長DNA鎖に容易に組み込まれる鎖
末端ヌクレオチドに連結したスペクトル分析できるロー
ダミン染料のセットの発見に基づくものである。ここで
使用するように語「鎖末端ヌクレオチド」は、成長DNA
鎖にDNAポリメラーゼによって組み込まれた後は、さら
にポリヌクレオチド鎖が伸長、または付加することを妨
げるヌクレオチドまたはその類似体を指す。通常、この
ようなヌクレオチドの鎖末端性は糖部分の３′ヒドロキ
シルの不在または改良に依存する。好ましくは、鎖末端
ヌクレオチドは２′,3′−ジデオキシヌクレオチドであ
る。
ヌクレオチドを有するDNAフラグメントが異なるローダ
ミン染料によって同定されるDNA配列決定の方法にあ
る。特に、本発明は以下に定義したローダミン標識ヌク
レオチドおよび本発明方法におけるそれらの使用を含
む。本発明は一部は、DNAポリメラーゼ、特にTagDNAポ
リメラーゼによって成長DNA鎖に容易に組み込まれる鎖
末端ヌクレオチドに連結したスペクトル分析できるロー
ダミン染料のセットの発見に基づくものである。ここで
使用するように語「鎖末端ヌクレオチド」は、成長DNA
鎖にDNAポリメラーゼによって組み込まれた後は、さら
にポリヌクレオチド鎖が伸長、または付加することを妨
げるヌクレオチドまたはその類似体を指す。通常、この
ようなヌクレオチドの鎖末端性は糖部分の３′ヒドロキ
シルの不在または改良に依存する。好ましくは、鎖末端
ヌクレオチドは２′,3′−ジデオキシヌクレオチドであ
る。
ここで使用するように染料のセットに関係する語「ス
ペクトル分析できる」は、染料の蛍光放出バンドが充分
に明確であり、すなわち充分に重なっておらず、各染料
が結合している標的物質、例えばポリヌクレオチドを、
例えばバンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシス
テムを用いる標準光検出システムまたはその類似のシス
テムによって発生した蛍光信号に基づいて区別すること
ができることを意味し、前記システムは米国特許4,230,
558号、4,811,218号等、またはホイーレスら、フロー・
シトメトリイ：インストルメンテージョン・アンド・デ
ータ・アナリシス（アカデミック・プレス・ニューヨー
ク、1985）の21〜76頁に記載されたようなシステムが挙
げられる。
ペクトル分析できる」は、染料の蛍光放出バンドが充分
に明確であり、すなわち充分に重なっておらず、各染料
が結合している標的物質、例えばポリヌクレオチドを、
例えばバンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシス
テムを用いる標準光検出システムまたはその類似のシス
テムによって発生した蛍光信号に基づいて区別すること
ができることを意味し、前記システムは米国特許4,230,
558号、4,811,218号等、またはホイーレスら、フロー・
シトメトリイ：インストルメンテージョン・アンド・デ
ータ・アナリシス（アカデミック・プレス・ニューヨー
ク、1985）の21〜76頁に記載されたようなシステムが挙
げられる。
本発明のローダミンを３′−末端ヌクレオチドに標識
を付けるために用いるときはいつでも、本発明の重要な
特徴は４種の染料によって作られたDNAフラグメントの
電気泳動移動度への事実上同等の貢献である。この結果
は、標識と隣接するヌクレオチドとの間の配座相互作用
が主として標識DNAフラグメントの電気泳動移動度にお
ける変動性の原因であると信じられているので予期しな
いことである。染料標識プライマーが常に、染料は常に
ヌクレオチドの同じ配列と相互に作用するので、電気泳
動移動度において一層小さい変異性を生じることが期待
されていた。しかし、本発明の一部は、３′−標識ヌク
レオチドをもつフラグメントが染料標識プライマーをも
つ同等のフラグメントよりも電気泳動移動度において非
常に小さい変異性をもつという発見である。
を付けるために用いるときはいつでも、本発明の重要な
特徴は４種の染料によって作られたDNAフラグメントの
電気泳動移動度への事実上同等の貢献である。この結果
は、標識と隣接するヌクレオチドとの間の配座相互作用
が主として標識DNAフラグメントの電気泳動移動度にお
ける変動性の原因であると信じられているので予期しな
いことである。染料標識プライマーが常に、染料は常に
ヌクレオチドの同じ配列と相互に作用するので、電気泳
動移動度において一層小さい変異性を生じることが期待
されていた。しかし、本発明の一部は、３′−標識ヌク
レオチドをもつフラグメントが染料標識プライマーをも
つ同等のフラグメントよりも電気泳動移動度において非
常に小さい変異性をもつという発見である。
発明の詳細な説明 本発明のローダミン染料のスペクトル分析できるセッ
トはテトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ローダミ
ン110、およびローダミン6Gから成り、これらは、それ
ぞれ式Ｉ〜IVによって表される。全体にわたり、カラー
・インデックス（アソシエーション・オブ・テキスタイ
ル・ケミスツ、第２版、1971）炭素ナンバリング図式を
使用する、すなわちプライムを付した数字はキサンテン
構造の炭素を指し、プライムを付していない数字は９′
−フェニルの炭素を指す。
トはテトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ローダミ
ン110、およびローダミン6Gから成り、これらは、それ
ぞれ式Ｉ〜IVによって表される。全体にわたり、カラー
・インデックス（アソシエーション・オブ・テキスタイ
ル・ケミスツ、第２版、1971）炭素ナンバリング図式を
使用する、すなわちプライムを付した数字はキサンテン
構造の炭素を指し、プライムを付していない数字は９′
−フェニルの炭素を指す。
式中： Ａは結合官能基に変換することができるカルボキシ
ル、スルホニル、またはアミノのような基であり、そし
て Ｂはアニオン酸性基、好ましくはカルボキシルまたは
スルホニルであり、最も好ましくはカルボキシルであ
る。
ル、スルホニル、またはアミノのような基であり、そし
て Ｂはアニオン酸性基、好ましくはカルボキシルまたは
スルホニルであり、最も好ましくはカルボキシルであ
る。
好ましくは、本発明のローダミン標識鎖末端ヌクレオ
チドは次式で表される： XTP−Ｌ−Ｒ 式中、XRPは鎖末端ヌクレオシドトリホスフェートで
あり;Rはテトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ロー
ダミン110、およびローダミン6Gから成る群れから選ば
れたローダミン染料であり；およびＬはヌクレオシドト
リホスフェートの塩基とローダミン染料との間の連結基
である。
チドは次式で表される： XTP−Ｌ−Ｒ 式中、XRPは鎖末端ヌクレオシドトリホスフェートで
あり;Rはテトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ロー
ダミン110、およびローダミン6Gから成る群れから選ば
れたローダミン染料であり；およびＬはヌクレオシドト
リホスフェートの塩基とローダミン染料との間の連結基
である。
XTPは、組み込まれた後にさらに鎖が伸長することを
妨げるのに用いられたDNAポリメラーゼの天然のヌクレ
オシドトリホスフェートの類似体である。幾つかのこの
ような類似体は４種の天ヌクレオシドトリホスフェート
の各々に対して入手でき、例えばホッブズら（上記）は
リストを示している。好ましくは、XTPは２′,3′−ジ
デオキシヌクレオシドトリホスフェートである。さらに
好ましくは、XTPは２′,3′−ジデオキシ−７−デアザ
アデノシントリホスフェート、２′,3′−ジデオキシシ
チジントリホスフェート、２′,3′−ジデオキシ−７−
デアザグアノシン、２′,3′−ジデオキシウリジントリ
ホスフェート、および２′,3′−ジデオキシ−７−デア
ザイノシントリホスフェートから成る群れから選ばれ
る。ここで使用するように語「ジデオキシヌクレオシ
ド」は糖部分が環式または非環式であるヌクレオシド類
似体を含む。従来のナンバリングは、ヌクレオシドの塩
基または糖の特定の炭素原子に例えばコーンバーグ、DN
Aレプリケーション（フリーマン、サンフランシスコ、1
980）を引用するときはいつでも使用される。
妨げるのに用いられたDNAポリメラーゼの天然のヌクレ
オシドトリホスフェートの類似体である。幾つかのこの
ような類似体は４種の天ヌクレオシドトリホスフェート
の各々に対して入手でき、例えばホッブズら（上記）は
リストを示している。好ましくは、XTPは２′,3′−ジ
デオキシヌクレオシドトリホスフェートである。さらに
好ましくは、XTPは２′,3′−ジデオキシ−７−デアザ
アデノシントリホスフェート、２′,3′−ジデオキシシ
チジントリホスフェート、２′,3′−ジデオキシ−７−
デアザグアノシン、２′,3′−ジデオキシウリジントリ
ホスフェート、および２′,3′−ジデオキシ−７−デア
ザイノシントリホスフェートから成る群れから選ばれ
る。ここで使用するように語「ジデオキシヌクレオシ
ド」は糖部分が環式または非環式であるヌクレオシド類
似体を含む。従来のナンバリングは、ヌクレオシドの塩
基または糖の特定の炭素原子に例えばコーンバーグ、DN
Aレプリケーション（フリーマン、サンフランシスコ、1
980）を引用するときはいつでも使用される。
Ｌはジデオキシヌクレオチドと染料との間の結合の長
さと剛性を大きく変えることができるように幾らかの異
なる形態に従う。例えば本発明と共に使用できる幾つか
の適当な塩基標識方法は、例えば、ギブソンら、ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ、第15巻、6455〜6467頁
（1987）；ゲベイエフら、ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ、第15巻、4513〜4535頁（1987）；ハララムビジ
スら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第15巻、48
56〜4876頁（1987）等に報告された。好ましくは、Ｌは
本発明の染料のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）
エステルをジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ
誘導塩基と反応されて形成される。この場合において、
Ｌは、（１）ローダミンの５−または６−炭素と（２）
ローダミンを結合する塩基の炭素との間の部分として使
われる。好ましくは、Ｌは３−カルボキシアミノ−１−
プロピニルである。シトシン・チミン、およびアデニン
のこのようなアルキルアミノ誘導ジデオキシヌクレオチ
ドの合成はホップスらによるヨーロッパ特許出願番号87
305844.0およびここに引例として挙げるホッブス、ジャ
ーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、第54巻、
3420頁（1989）によって教示される。簡単には、アルキ
ニルアミノ誘導ジデオキシヌクレオチドは適当なハロジ
デオキシヌクレオシド（通常はホップスら（上記）によ
って教示されているような５−ヨードピリミジンおよび
７−ヨード−７−デアザプリンジオキシヌクレオシド）
およびCu（Ｉ）をフラスコに入れ、空気を除くようにAr
を吹き込み、乾燥DMFを添加し、続いてアルキニルアミ
ン、トリエチルアミンおよびPd（０）を添加して生成さ
れる。反応混合物を数時間、または薄層クロマトグラフ
ィがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、攪
拌することができる。保護されていないアルキニルアミ
ンを使用する場合、アルキニルアミノヌクレオシドを、
反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生成したハイ
ドロハライドを中和するように水酸化アンモニウムを含
む溶出溶媒を用いるシルカゲルでクロマトグラフ処理を
行って単離することができる。保護されたアルキニルア
ミンを使用する場合、メタノール／塩化メチレンを反応
混合物に添加し、強塩基性アニオン交換樹脂の重炭酸塩
の形によって続ける。次にスラリーを約45分間攪拌し、
濾過し、追加のメタノール／塩化メチレンを用いて樹脂
を洗うことができる。一緒に合わせた濾液を濃縮しメタ
ノール−塩化メチレングラディエントを用いるシリカゲ
ルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製するこ
とができる。トリホスフェートが標準技術によって得ら
れる。
さと剛性を大きく変えることができるように幾らかの異
なる形態に従う。例えば本発明と共に使用できる幾つか
の適当な塩基標識方法は、例えば、ギブソンら、ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ、第15巻、6455〜6467頁
（1987）；ゲベイエフら、ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ、第15巻、4513〜4535頁（1987）；ハララムビジ
スら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第15巻、48
56〜4876頁（1987）等に報告された。好ましくは、Ｌは
本発明の染料のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）
エステルをジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ
誘導塩基と反応されて形成される。この場合において、
Ｌは、（１）ローダミンの５−または６−炭素と（２）
ローダミンを結合する塩基の炭素との間の部分として使
われる。好ましくは、Ｌは３−カルボキシアミノ−１−
プロピニルである。シトシン・チミン、およびアデニン
のこのようなアルキルアミノ誘導ジデオキシヌクレオチ
ドの合成はホップスらによるヨーロッパ特許出願番号87
305844.0およびここに引例として挙げるホッブス、ジャ
ーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、第54巻、
3420頁（1989）によって教示される。簡単には、アルキ
ニルアミノ誘導ジデオキシヌクレオチドは適当なハロジ
デオキシヌクレオシド（通常はホップスら（上記）によ
って教示されているような５−ヨードピリミジンおよび
７−ヨード−７−デアザプリンジオキシヌクレオシド）
およびCu（Ｉ）をフラスコに入れ、空気を除くようにAr
を吹き込み、乾燥DMFを添加し、続いてアルキニルアミ
ン、トリエチルアミンおよびPd（０）を添加して生成さ
れる。反応混合物を数時間、または薄層クロマトグラフ
ィがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、攪
拌することができる。保護されていないアルキニルアミ
ンを使用する場合、アルキニルアミノヌクレオシドを、
反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生成したハイ
ドロハライドを中和するように水酸化アンモニウムを含
む溶出溶媒を用いるシルカゲルでクロマトグラフ処理を
行って単離することができる。保護されたアルキニルア
ミンを使用する場合、メタノール／塩化メチレンを反応
混合物に添加し、強塩基性アニオン交換樹脂の重炭酸塩
の形によって続ける。次にスラリーを約45分間攪拌し、
濾過し、追加のメタノール／塩化メチレンを用いて樹脂
を洗うことができる。一緒に合わせた濾液を濃縮しメタ
ノール−塩化メチレングラディエントを用いるシリカゲ
ルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製するこ
とができる。トリホスフェートが標準技術によって得ら
れる。
上記参照によるアルキニルアミン誘導ジデオキシグア
ノシンは特に改良されたグアニン先駆物質（６−メトキ
シ−２−メチルチオ−７−デアザプリン、Ｘ）を必要と
し、これは出発物質、６−ヒドロキシ−２−メチルチオ
−７−ジアザプリン、XXから得られる。XXの６−クロロ
−２−メチルチオ−７−デアザプリン、XXXへの転換は
ロビンズとノエル（ジャーナル・オブ・ヘテロサイクリ
ック・ケミストリー、第１巻、34頁（1964）に従い、続
いてクロロ置換体をメトキサイド（還流メタノール中の
ナトリウム塩）を用いて置換しＸを生成する： 好ましくは、ローダミンNHSエステルを米国特許出願
第06/941、985号の教示に従って合成する。ローダミンN
HSエステルを合成する方法の重要な特徴は、（１）高収
率の生成物を室温で生成するようにローダミン染料の５
−または６−形態のエステル化のために存在する実質的
に計算量のジ−Ｎ−スクシンイミジルカーボネート（DS
C）および４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）を有す
る反応条件、および（２）反応体への転換逆行を妨げる
ように、好ましくは５以下のpKaを有する酸性化合物を
用いて新しく合成された生成物を処理することである。
本発明の一般的な反応図は式IXによって定義される： これらの方法は酸の形の５−または６−カルボキシロ
ーダミン（異性体の混合物として、または純異性体とし
て）を当量のDSCおよびDMAPの極性アプロチック溶媒の
溶液を用いて反応させ、カルボキシル Ｎ−ヒドロキシ
サクシンイミドエステルを生成することからなる。適当
な極性アプロチック溶媒はN,N−ジメチルホルムアミド
（DMF）、ピリジン、ヘキサメチルホスホルアミド（HMP
A）等を含む。最も好ましくは、DMFは反応溶媒として用
いられる。異性体として混合されるNHSエステルはさら
に使用するために各異性体に分離することができる。最
も好ましくは、試料を保存するために、酸の形の５−ま
たは６−カルボキシルローダミンをまず標準の分離技
術、例えばエドムンドソンら、モレキュラー・イムノロ
ジー、第21巻、561頁（1984）によって各異性体に分離
し、次いで各５−または６−カルボキシル異性体を上述
のように反応されて、それぞれ、５−または６−カルボ
キシルNHSエステルを形成し、これらを反応混合物から
分離し、再び標準技術を用いる。
ノシンは特に改良されたグアニン先駆物質（６−メトキ
シ−２−メチルチオ−７−デアザプリン、Ｘ）を必要と
し、これは出発物質、６−ヒドロキシ−２−メチルチオ
−７−ジアザプリン、XXから得られる。XXの６−クロロ
−２−メチルチオ−７−デアザプリン、XXXへの転換は
ロビンズとノエル（ジャーナル・オブ・ヘテロサイクリ
ック・ケミストリー、第１巻、34頁（1964）に従い、続
いてクロロ置換体をメトキサイド（還流メタノール中の
ナトリウム塩）を用いて置換しＸを生成する： 好ましくは、ローダミンNHSエステルを米国特許出願
第06/941、985号の教示に従って合成する。ローダミンN
HSエステルを合成する方法の重要な特徴は、（１）高収
率の生成物を室温で生成するようにローダミン染料の５
−または６−形態のエステル化のために存在する実質的
に計算量のジ−Ｎ−スクシンイミジルカーボネート（DS
C）および４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）を有す
る反応条件、および（２）反応体への転換逆行を妨げる
ように、好ましくは５以下のpKaを有する酸性化合物を
用いて新しく合成された生成物を処理することである。
本発明の一般的な反応図は式IXによって定義される： これらの方法は酸の形の５−または６−カルボキシロ
ーダミン（異性体の混合物として、または純異性体とし
て）を当量のDSCおよびDMAPの極性アプロチック溶媒の
溶液を用いて反応させ、カルボキシル Ｎ−ヒドロキシ
サクシンイミドエステルを生成することからなる。適当
な極性アプロチック溶媒はN,N−ジメチルホルムアミド
（DMF）、ピリジン、ヘキサメチルホスホルアミド（HMP
A）等を含む。最も好ましくは、DMFは反応溶媒として用
いられる。異性体として混合されるNHSエステルはさら
に使用するために各異性体に分離することができる。最
も好ましくは、試料を保存するために、酸の形の５−ま
たは６−カルボキシルローダミンをまず標準の分離技
術、例えばエドムンドソンら、モレキュラー・イムノロ
ジー、第21巻、561頁（1984）によって各異性体に分離
し、次いで各５−または６−カルボキシル異性体を上述
のように反応されて、それぞれ、５−または６−カルボ
キシルNHSエステルを形成し、これらを反応混合物から
分離し、再び標準技術を用いる。
好ましくは、新しく合成されたローダミンNHSエステ
ルを揮発性の、pKa＜５の有機可溶性酸、およびさらに
好ましくは、揮発性の、pKa＜１の有機可溶性酸化合
物、例えばHClまたはHBrのメタノール溶液、または最も
好ましくは、トリフルオロ酢酸を用いて処理する。
ルを揮発性の、pKa＜５の有機可溶性酸、およびさらに
好ましくは、揮発性の、pKa＜１の有機可溶性酸化合
物、例えばHClまたはHBrのメタノール溶液、または最も
好ましくは、トリフルオロ酢酸を用いて処理する。
本発明に使用するためのローダミン染料の若干の異性
体混合物は市販品として入手することができ、例えばモ
レキュラー・プローブス・インコーポレーテッド（Euge
ne,OR）、および他のものは米国特許2,242,572;2,153,0
59;3,822,270）;3,932,415;および4,005,092;の技術に
従って合成でき、これらすべては参照文献に加えられ
る。
体混合物は市販品として入手することができ、例えばモ
レキュラー・プローブス・インコーポレーテッド（Euge
ne,OR）、および他のものは米国特許2,242,572;2,153,0
59;3,822,270）;3,932,415;および4,005,092;の技術に
従って合成でき、これらすべては参照文献に加えられ
る。
本発明のローダミンは、類似の物理化学的な性質、例
えば大きさ、配座、電荷、疎水性等を有するポリヌクレ
オチドの一連の接近した間隔バンドまたはスポットが線
状または二次元の配置に存在する、ゲル電気泳動のよう
な、生物化学的分離方法に委ねられたポリヌクレオチド
の種類を同定するために特に良く適している。ここで使
用するように、「バンド」の語は類似のまたは同一の物
理化学的性質に基づいたポリヌクレオチドの空間的配置
または凝集を含む。通常のバンドはゲル電気泳動によっ
て染料−ポリヌクレオチドの共役体を分離する際に生じ
る。
えば大きさ、配座、電荷、疎水性等を有するポリヌクレ
オチドの一連の接近した間隔バンドまたはスポットが線
状または二次元の配置に存在する、ゲル電気泳動のよう
な、生物化学的分離方法に委ねられたポリヌクレオチド
の種類を同定するために特に良く適している。ここで使
用するように、「バンド」の語は類似のまたは同一の物
理化学的性質に基づいたポリヌクレオチドの空間的配置
または凝集を含む。通常のバンドはゲル電気泳動によっ
て染料−ポリヌクレオチドの共役体を分離する際に生じ
る。
好ましくは、本発明に従って同定されたポリヌクレオ
チドの種類は、対応が４種の可能な末端塩基と４種のス
ペクトル分析できる染料との間に確立されるように末端
ヌクレオチドの語において定義される。特に、ポリヌク
レオチドの種類はDNA配列のチェイン・ターミネーター
法の関係において生じ、この方法は染料−ポリヌクレオ
チドの共役体をゲル電気泳動によって大きさに従って分
離する。例えばゴールドおよびマシューズ、上述した；
リックウッドおよびハメス著、核酸のゲル電気泳動：実
際のアプローチ（IRLプレス・リミテッド、ロンドン、1
981）；またはオスターマン、プロティンと核酸の研究
方法、第１巻（スプリンガー−ベルラク、ベルリン、19
84）。好ましくはゲルのタイプは約２〜20パーセントの
間の濃度（重量対容量）を有するポリアクリルアミドで
ある。さらに好ましくは、ポリアクリルアミドゲル濃度
が約４〜８パーセントの間にある。好ましくはゲルはス
トランド分離または変性剤を含む。このようなゲルを構
成するための詳細な方法はマニアチスら、メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー、第65巻、299〜305頁（1980）の
「98％ホルムアミドまたは7M尿素を含有するポリアクリ
ルアミドゲルにおける低分子量DNAおよびRNAの分別」；
マニアチスら、バイオケミストリー、第14巻、3787〜37
94頁（1975）の「ポリアクリルアミドゲルにおける電気
泳動による小さい二重鎖および一重鎖DNA分子の鎖長決
定」；およびマニアチスら、モレキュー・クローニン
グ：実験室手法（コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリイ、ニューヨーク、1982）179〜185頁によって
与えられる。従って、これらの参照文献を参考として組
み込まれる。特別な分離に用いられる最適ゲル濃度、p
H、温度、変性剤の濃度等は、分離すべき核酸の大きさ
の範囲、それらの塩基組成；それらが一重鎖かまたは二
重鎖か、情報を電気泳動によって捜すための種類の性質
を含めて、多くのファクターに依存する。従って本発明
の応用は特定の分離のための条件を最適にするための標
準の予備試験を必要とするかも知れない。好ましくは、
ポリヌクレオチド鎖の伸長の間にデオキシイノシントリ
ホスフェートを、電気泳動中のいわゆる「バンド圧縮」
を避けるためデオキシグアノシントリホスフェートの代
わりに用いる。例えば、ミルスら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミク・サイエンシーズ、第
76巻、2232〜2235（1979）。例として、約10〜500塩基
の間の範囲の大きさを有するポリヌクレオチドを分離
し、次に示すゲル中で本発明に従って検出する:19部対
１部のアクリルアミドとビスアクリルアミドから作ら
れ、48パーセント（重量／容量）尿素を用いて、pH8.3
（25℃で測定した）にてトリス−ボレートEDTA緩衝液に
形成した６パーセントポリアクリルアミド。このゲルは
約50℃にて実施される。
チドの種類は、対応が４種の可能な末端塩基と４種のス
ペクトル分析できる染料との間に確立されるように末端
ヌクレオチドの語において定義される。特に、ポリヌク
レオチドの種類はDNA配列のチェイン・ターミネーター
法の関係において生じ、この方法は染料−ポリヌクレオ
チドの共役体をゲル電気泳動によって大きさに従って分
離する。例えばゴールドおよびマシューズ、上述した；
リックウッドおよびハメス著、核酸のゲル電気泳動：実
際のアプローチ（IRLプレス・リミテッド、ロンドン、1
981）；またはオスターマン、プロティンと核酸の研究
方法、第１巻（スプリンガー−ベルラク、ベルリン、19
84）。好ましくはゲルのタイプは約２〜20パーセントの
間の濃度（重量対容量）を有するポリアクリルアミドで
ある。さらに好ましくは、ポリアクリルアミドゲル濃度
が約４〜８パーセントの間にある。好ましくはゲルはス
トランド分離または変性剤を含む。このようなゲルを構
成するための詳細な方法はマニアチスら、メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー、第65巻、299〜305頁（1980）の
「98％ホルムアミドまたは7M尿素を含有するポリアクリ
ルアミドゲルにおける低分子量DNAおよびRNAの分別」；
マニアチスら、バイオケミストリー、第14巻、3787〜37
94頁（1975）の「ポリアクリルアミドゲルにおける電気
泳動による小さい二重鎖および一重鎖DNA分子の鎖長決
定」；およびマニアチスら、モレキュー・クローニン
グ：実験室手法（コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリイ、ニューヨーク、1982）179〜185頁によって
与えられる。従って、これらの参照文献を参考として組
み込まれる。特別な分離に用いられる最適ゲル濃度、p
H、温度、変性剤の濃度等は、分離すべき核酸の大きさ
の範囲、それらの塩基組成；それらが一重鎖かまたは二
重鎖か、情報を電気泳動によって捜すための種類の性質
を含めて、多くのファクターに依存する。従って本発明
の応用は特定の分離のための条件を最適にするための標
準の予備試験を必要とするかも知れない。好ましくは、
ポリヌクレオチド鎖の伸長の間にデオキシイノシントリ
ホスフェートを、電気泳動中のいわゆる「バンド圧縮」
を避けるためデオキシグアノシントリホスフェートの代
わりに用いる。例えば、ミルスら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミク・サイエンシーズ、第
76巻、2232〜2235（1979）。例として、約10〜500塩基
の間の範囲の大きさを有するポリヌクレオチドを分離
し、次に示すゲル中で本発明に従って検出する:19部対
１部のアクリルアミドとビスアクリルアミドから作ら
れ、48パーセント（重量／容量）尿素を用いて、pH8.3
（25℃で測定した）にてトリス−ボレートEDTA緩衝液に
形成した６パーセントポリアクリルアミド。このゲルは
約50℃にて実施される。
ゲル上の染料−ポリヌクレオチド共約体は標準手段、
例えば高光度水銀蒸気ランプ、レーザー等によって発光
される。好ましくは、ゲル上の染料−ポリヌクレオチド
はアルゴンイオンレーザーによって発生したレーザー
光、特に、アルゴンイオンレーザーの488〜514nmの発光
ラインによって発光される。
例えば高光度水銀蒸気ランプ、レーザー等によって発光
される。好ましくは、ゲル上の染料−ポリヌクレオチド
はアルゴンイオンレーザーによって発生したレーザー
光、特に、アルゴンイオンレーザーの488〜514nmの発光
ラインによって発光される。
これらのラインで同時にレーザー用として使える幾つ
かのアルゴンイオンレーザーは市販品として入手でき
る、例えばシオニクス社（サニイベール、CA）モデル20
01等。
かのアルゴンイオンレーザーは市販品として入手でき
る、例えばシオニクス社（サニイベール、CA）モデル20
01等。
本発明の重要な特徴はDNA配列決定方法における鎖伸
長のために使用されるDNAポリメラーゼである。好まし
くは、本発明の方法として使用されるポリメラーゼは、
マンガンまたはマグネシウム緩衝液を用いたTaqDNAポリ
メラーゼ、イニスらによって記載された、プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・サイエン
シーズ、第85巻、9436〜9440頁（1988）；およびマンガ
ン緩衝液を用いたT7DNAポリメラーゼ、デーバーらによ
って記載された、プロシーディングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・サイエンシーズ、第86巻、4076〜
4080頁（1989）、から成る群から選ばれる。一般に、未
知の配列を含む一重鎖DNA鋳型は標準技術によって、例
えばアプライド・バイオシステムズ・モデル370ADNA配
列決定システムのためのマニュアルに記載されているよ
うなM13mp18において調製される。同様に、プライマー
を鋳型に結合する、アニーリング反応は、標準プロトコ
ールによって行われている。異なる大きさに分類したDN
Aフラグメントを発生する伸長反応は、本発明のローダ
ミン標識ジデオキシヌクレオチドおよび使用した特定の
DNAポリメラーゼに対して最も効果的にする。
長のために使用されるDNAポリメラーゼである。好まし
くは、本発明の方法として使用されるポリメラーゼは、
マンガンまたはマグネシウム緩衝液を用いたTaqDNAポリ
メラーゼ、イニスらによって記載された、プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・サイエン
シーズ、第85巻、9436〜9440頁（1988）；およびマンガ
ン緩衝液を用いたT7DNAポリメラーゼ、デーバーらによ
って記載された、プロシーディングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・サイエンシーズ、第86巻、4076〜
4080頁（1989）、から成る群から選ばれる。一般に、未
知の配列を含む一重鎖DNA鋳型は標準技術によって、例
えばアプライド・バイオシステムズ・モデル370ADNA配
列決定システムのためのマニュアルに記載されているよ
うなM13mp18において調製される。同様に、プライマー
を鋳型に結合する、アニーリング反応は、標準プロトコ
ールによって行われている。異なる大きさに分類したDN
Aフラグメントを発生する伸長反応は、本発明のローダ
ミン標識ジデオキシヌクレオチドおよび使用した特定の
DNAポリメラーゼに対して最も効果的にする。
実施例 以下の実施例は本発明を説明するためのものである。
試薬の濃度、温度、および他の種々のパラメータの値は
単に本発明を例示するためのものであり、それを制限的
に考えるためのものではない。
試薬の濃度、温度、および他の種々のパラメータの値は
単に本発明を例示するためのものであり、それを制限的
に考えるためのものではない。
実施例1.6−TMR−NHS ６−TMR酸をカラムクロマトグラフィーによって５−
および６−TMR酸異性体の混合物から分離した。8.82mg
の６−TMR酸と10.5mgのDSCを0.5mlの乾燥DMF中にアルゴ
ン下に溶解した。テトラヒドロフラン（THF）に溶解し
たDMAPの0.5モル溶液の0.09mlを一滴ずつ添加した。室
温で２時間後、混合物を50mlのクロロホルムに入れ、1:
1のブラインと水の溶液を用いて３回洗浄した。クロロ
ホルムを蒸発させて残渣を20gのシルカゲルカラム（30
0:30:8の塩化メチレンとメタノールと酢酸溶離液）で精
製した。約0.4のRfの画分を乾燥するまで蒸発させ、酢
酸塩として8.6mgの６−TMR−NHSを生成した。
および６−TMR酸異性体の混合物から分離した。8.82mg
の６−TMR酸と10.5mgのDSCを0.5mlの乾燥DMF中にアルゴ
ン下に溶解した。テトラヒドロフラン（THF）に溶解し
たDMAPの0.5モル溶液の0.09mlを一滴ずつ添加した。室
温で２時間後、混合物を50mlのクロロホルムに入れ、1:
1のブラインと水の溶液を用いて３回洗浄した。クロロ
ホルムを蒸発させて残渣を20gのシルカゲルカラム（30
0:30:8の塩化メチレンとメタノールと酢酸溶離液）で精
製した。約0.4のRfの画分を乾燥するまで蒸発させ、酢
酸塩として8.6mgの６−TMR−NHSを生成した。
実施例2.5−TMR−NHS ５−TMR−NHSを、実施例１に記載したように、2mlの
乾燥DMF中、82.3mgの５−TMR酸、75mgのDSC、2mlの0.5
モルDMAPのTHF溶液0.70mlから調製した。
乾燥DMF中、82.3mgの５−TMR酸、75mgのDSC、2mlの0.5
モルDMAPのTHF溶液0.70mlから調製した。
実施例3.6−ROX−NHS ６−ROX酸をカラムクロマトグラフィーによって５−
および６−酸異性体の混合物から分離した。46.2mgの６
−ROX酸および58mgのDSCを2mlの乾燥DMF中にアルゴン下
に溶解し、0.5モルのDMAPのTHF溶液0.45mlを一滴ずつ添
加した。室温で1.5時間後、混合物を100mlのクロロホル
ムに入れ、1:1のブラインと水の溶液を用いて４回洗浄
した。クロロホルムを蒸発させて残渣を40gのシリカゲ
ルカラム（300:30:8の塩化メチレンとメタノールと酢酸
溶離液）上で精製した。約0.5のRfの画分を乾燥するま
で蒸発させ、酢酸塩として56.4mgの６−ROX−NHSを生成
した。
および６−酸異性体の混合物から分離した。46.2mgの６
−ROX酸および58mgのDSCを2mlの乾燥DMF中にアルゴン下
に溶解し、0.5モルのDMAPのTHF溶液0.45mlを一滴ずつ添
加した。室温で1.5時間後、混合物を100mlのクロロホル
ムに入れ、1:1のブラインと水の溶液を用いて４回洗浄
した。クロロホルムを蒸発させて残渣を40gのシリカゲ
ルカラム（300:30:8の塩化メチレンとメタノールと酢酸
溶離液）上で精製した。約0.5のRfの画分を乾燥するま
で蒸発させ、酢酸塩として56.4mgの６−ROX−NHSを生成
した。
実施例4.5−ROX−NHS ５−ROX−NHSを実施例３に記載したように、1.0mlの
乾燥DMF中、27.4mgの５−ROX酸、30.2mgのDSC、0.5モル
のDMAPのTHF溶液0.24mlから調製した。
乾燥DMF中、27.4mgの５−ROX酸、30.2mgのDSC、0.5モル
のDMAPのTHF溶液0.24mlから調製した。
実施例5.ローダミンNHSエステルの安定な配合物 ａ）実施例３からの0.44mgの６−カルボキシ−Ｘ−ロー
ダミンNHSエステルおよび0.01モルのエタノールアミン
のメタノール溶液80μｌを混合した。反応混合物とアセ
トニルおよび0.1モルのトリエチルアンモニウムアセテ
ート緩衝液（pH＝7.0）の逆相HPLCは、生成物が70％の
Ｘ−ローダミン酸および30％のＸ−ローダミンNHSエス
テル（エタノールアミンを用いたその反応から６−カル
ボキシ−Ｘ−ローダミンのエタノールアミドとして観察
された）から成っていることを示した。
ダミンNHSエステルおよび0.01モルのエタノールアミン
のメタノール溶液80μｌを混合した。反応混合物とアセ
トニルおよび0.1モルのトリエチルアンモニウムアセテ
ート緩衝液（pH＝7.0）の逆相HPLCは、生成物が70％の
Ｘ−ローダミン酸および30％のＸ−ローダミンNHSエス
テル（エタノールアミンを用いたその反応から６−カル
ボキシ−Ｘ−ローダミンのエタノールアミドとして観察
された）から成っていることを示した。
ｂ）実施例３からの0.15mgの６−カルボキシ−Ｘ−ロー
ダミンNHSエステルを100mlのクロロホルムに溶解した；
クロロホルム溶液を0.5モルの重炭酸ナトリウムを用い
て２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、0.1m
lの酢酸で処理し、乾燥するまで蒸発させた。0.35mgの
生成物をａ）と同様に正確に処理した；逆相HPLCは20％
の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸および80％の６−
カルボキシ−Ｘ−ローダミンNHSエステルを示した。
ダミンNHSエステルを100mlのクロロホルムに溶解した；
クロロホルム溶液を0.5モルの重炭酸ナトリウムを用い
て２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、0.1m
lの酢酸で処理し、乾燥するまで蒸発させた。0.35mgの
生成物をａ）と同様に正確に処理した；逆相HPLCは20％
の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸および80％の６−
カルボキシ−Ｘ−ローダミンNHSエステルを示した。
ｃ）酢酸の代わりにトリフルオロ酢酸を用いた以外は、
実施例３からの0.15mgの６−カルボキシ−Ｘ−ローダミ
ンNHSエステルをｂ）と同様に正確に処理した。0.19mg
の得られた固体をａ）と同様に正確に処理した；逆相HP
LCは＜５％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸および
＞95％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンNHSエステル
を示した。
実施例３からの0.15mgの６−カルボキシ−Ｘ−ローダミ
ンNHSエステルをｂ）と同様に正確に処理した。0.19mg
の得られた固体をａ）と同様に正確に処理した；逆相HP
LCは＜５％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸および
＞95％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンNHSエステル
を示した。
実施例6.R6G標識７−デアザ−２′,3′−ジデオキシア
デノシントリホスフェート（ddA−5R6G）の調製 上記のようにして得られた2.0μモルの７−（３″−
アミノ−１″−プロピニル）−７−デアザ−２′,3′−
ジデオキシアデノシントリホスフェート（凍結乾燥し
た）に、100μｌのDMF、3mgの５−ローダミン6G−NHSエ
ステルおよび50μｌの1.0Mトリエチルアンモニウムカー
ボネートをpH8.95で添加する。これを渦巻攪拌し室温で
そのまま終夜放置した。
デノシントリホスフェート（ddA−5R6G）の調製 上記のようにして得られた2.0μモルの７−（３″−
アミノ−１″−プロピニル）−７−デアザ−２′,3′−
ジデオキシアデノシントリホスフェート（凍結乾燥し
た）に、100μｌのDMF、3mgの５−ローダミン6G−NHSエ
ステルおよび50μｌの1.0Mトリエチルアンモニウムカー
ボネートをpH8.95で添加する。これを渦巻攪拌し室温で
そのまま終夜放置した。
次いで混合物をAX−300 220X4.6mmの７ミクロンカラ
ム上で１分間につき1.5mlの流速でHPLCによる精製をし
た。最初の溶出液は、60％の0.1Mトリエチルアンモニウ
ムカーボネート、pH7.0、40％のCH3CNであり、60％の0.
2Mトリエチルアンモニウムカーボネート、pH7.5、40％
のCH3CNへの線勾配で40分かけた。溶媒は収集生成物か
ら真空下に蒸発させて除去した。残渣を0.01Mトリエチ
ルアンモニウムアセテートpH7.0に溶解し、定量した。
ム上で１分間につき1.5mlの流速でHPLCによる精製をし
た。最初の溶出液は、60％の0.1Mトリエチルアンモニウ
ムカーボネート、pH7.0、40％のCH3CNであり、60％の0.
2Mトリエチルアンモニウムカーボネート、pH7.5、40％
のCH3CNへの線勾配で40分かけた。溶媒は収集生成物か
ら真空下に蒸発させて除去した。残渣を0.01Mトリエチ
ルアンモニウムアセテートpH7.0に溶解し、定量した。
実施例7.ROX標識２′,3′−ジデオキシシチジントリホ
スフェート（ddC−6ROX）の調製 150μｌの水に溶解した3.6μモルの５−（３″−アミ
ノ−１″−プロピニル）−２′,3′−ジデオキシシチジ
ントリホスフェート（上記のように得られた）に、60μ
ｌのDMSOに溶解した5mgの６−ローダミンＸ−NHSエステ
ルおよび50μｌの1.0Mトリエチルアンモニウムカーボネ
ートpH8.95を添加した。これを渦巻攪拌し室温でそのま
ま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に調製した。
スフェート（ddC−6ROX）の調製 150μｌの水に溶解した3.6μモルの５−（３″−アミ
ノ−１″−プロピニル）−２′,3′−ジデオキシシチジ
ントリホスフェート（上記のように得られた）に、60μ
ｌのDMSOに溶解した5mgの６−ローダミンＸ−NHSエステ
ルおよび50μｌの1.0Mトリエチルアンモニウムカーボネ
ートpH8.95を添加した。これを渦巻攪拌し室温でそのま
ま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に調製した。
実施例8.R110−標識２′,3′−ジデオキシイノシントリ
ホスフェート（ddG−5R110）の調製 上記のようにして得られた1.3μモルの７−（３″−
アミノ−１″−プロピニル）−７−デアザ−２′,3′−
ジデオキシグアノシントリホスフェート（凍結乾燥し
た）に100μｌのDMF、4mgの５−ローダミン110−NHSエ
ステル、および100μｌの1.0Mトリエチルアンモニウム
カーボネートpH8.95を添加した。これを渦巻攪拌し室温
にてそのまま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に
精製した。
ホスフェート（ddG−5R110）の調製 上記のようにして得られた1.3μモルの７−（３″−
アミノ−１″−プロピニル）−７−デアザ−２′,3′−
ジデオキシグアノシントリホスフェート（凍結乾燥し
た）に100μｌのDMF、4mgの５−ローダミン110−NHSエ
ステル、および100μｌの1.0Mトリエチルアンモニウム
カーボネートpH8.95を添加した。これを渦巻攪拌し室温
にてそのまま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に
精製した。
実施例9.TMR標識２′,3′−ジデオキシチミジントリホ
スフェート（ddT−6TMR）の調製 上記と同様にして得られた150μｌのH2Oに溶解した3.
1μモルの５−（３″−アミノ−１″−プロピニル）−
２′,3′−ジデオキシウリジントリホスフェートを、15
0μｌのDMF、100μｌの1.0Mトリエチルアンモニウムカ
ーボネートpH8.95、および4mgの６−TMR−NHSエステル
と共に混合した。これを渦巻攪拌し室温にてそのまま終
夜放置した。生成物を実施例６と同様に精製した。
スフェート（ddT−6TMR）の調製 上記と同様にして得られた150μｌのH2Oに溶解した3.
1μモルの５−（３″−アミノ−１″−プロピニル）−
２′,3′−ジデオキシウリジントリホスフェートを、15
0μｌのDMF、100μｌの1.0Mトリエチルアンモニウムカ
ーボネートpH8.95、および4mgの６−TMR−NHSエステル
と共に混合した。これを渦巻攪拌し室温にてそのまま終
夜放置した。生成物を実施例６と同様に精製した。
実施例10.ローダミン標識ジデオキシヌクレオチドおよ
びTaqDNAポリメラーゼとマグネシウム緩衝液を用いるDN
A配列分析 実施例６〜９において調製されたローダミン標識ジデ
オキシヌクレオチドを使用して、アプライド・バイオシ
ステムス（フォスター市、CA）モデル370 A自動化DNAシ
ーケンサーを用いる鎖末端配列決定のDNAフラグメント
に標識を付した。この製造業者のプロトコール（参照、
ユーザー・ブレタン・DNAシーケンサー・モデル370、発
行第２号、1987年８月12日）をM13mp18一重鎖鋳型を得
るために続けた。（このM13自身は試験配列として使っ
た）。M13ユニバーサルプライマーを用いた。次の溶液
を調製した:5X Taq Mg緩衝液（50mMトリス−C1 pH8.5、
50mMのMgCl2、250mMのNaCl）；染料−ターミネーターミ
ックス（2.7μＭのddG−5R110、9.00μＭのddA−5R6G、
216.0μＭのddT−6TMR、および54.0μＭのddC−6RO
X）；およびdNTPミックス（500μＭのdITP、100μＭのd
ATP、100μＭのdTTP、および100μＭのdCTP）。アニー
ル反応は、マイクロ遠心管に3.6μｌの5X Taq Mg緩衝
液、0.4pモルのDNA鋳型、0.8pモルのプライマー、およ
び容量12.0μｌまでの水を一緒にして行われた。混合物
を55〜65℃にて５〜10分間インキューベートし、20〜30
分かけて４〜20℃の温度までゆっくり冷却し、次いで一
度遠心分離して濃縮物を集め、混合し、氷上に置いた。
混合物に次に1.0μｌのdNTPミックス、2.0μｌの染料−
ターミネーターミックス、４ユニットのTaqポリメラー
ゼ、および容量18.0μｌまでにする水を添加した。混合
物を30分間60℃にてインキュべートし、次いで氷上に置
き、25.0μｌの10mMのEDTApH8.0と一緒にして反応物を
終わらせた。混合物中のDNAを次にスピンカラム（例え
ば1mlのセファデックスＧ−50カラム、例として５プラ
イムから３プライムまでのセレクト−Ｄ、ウェスト・チ
ェスター、PA）で精製し、エタノール沈澱をした（４μ
ｌの3M酢酸ナトリウムpH5.2および120μｌの95％エタノ
ールを添加した。氷上で10分間インキュベートし、15分
間遠心分離を行い、上澄液をデカントして排出し、70％
エタノールに懸濁し、攪拌し、遠心分離を15分間行い、
上澄液をデカントして排出し、真空遠心分離機で５分間
乾燥することによって）。沈澱したDNAを次に５部の脱
イオンホルムアミドおよび１部の50mMのEDTApH8.0から
成る溶液３μｌに再懸濁させて完全に渦巻攪拌をした。
ゲル上に装填する前に、混合物を90℃にて２分間インキ
ュベートしてDNAを変性させた。M13プラスミドのうち45
0個以上の塩基がモデル370A自動化シーケンサーの塩基
コーリングルーチンによって正確に同定された。
びTaqDNAポリメラーゼとマグネシウム緩衝液を用いるDN
A配列分析 実施例６〜９において調製されたローダミン標識ジデ
オキシヌクレオチドを使用して、アプライド・バイオシ
ステムス（フォスター市、CA）モデル370 A自動化DNAシ
ーケンサーを用いる鎖末端配列決定のDNAフラグメント
に標識を付した。この製造業者のプロトコール（参照、
ユーザー・ブレタン・DNAシーケンサー・モデル370、発
行第２号、1987年８月12日）をM13mp18一重鎖鋳型を得
るために続けた。（このM13自身は試験配列として使っ
た）。M13ユニバーサルプライマーを用いた。次の溶液
を調製した:5X Taq Mg緩衝液（50mMトリス−C1 pH8.5、
50mMのMgCl2、250mMのNaCl）；染料−ターミネーターミ
ックス（2.7μＭのddG−5R110、9.00μＭのddA−5R6G、
216.0μＭのddT−6TMR、および54.0μＭのddC−6RO
X）；およびdNTPミックス（500μＭのdITP、100μＭのd
ATP、100μＭのdTTP、および100μＭのdCTP）。アニー
ル反応は、マイクロ遠心管に3.6μｌの5X Taq Mg緩衝
液、0.4pモルのDNA鋳型、0.8pモルのプライマー、およ
び容量12.0μｌまでの水を一緒にして行われた。混合物
を55〜65℃にて５〜10分間インキューベートし、20〜30
分かけて４〜20℃の温度までゆっくり冷却し、次いで一
度遠心分離して濃縮物を集め、混合し、氷上に置いた。
混合物に次に1.0μｌのdNTPミックス、2.0μｌの染料−
ターミネーターミックス、４ユニットのTaqポリメラー
ゼ、および容量18.0μｌまでにする水を添加した。混合
物を30分間60℃にてインキュべートし、次いで氷上に置
き、25.0μｌの10mMのEDTApH8.0と一緒にして反応物を
終わらせた。混合物中のDNAを次にスピンカラム（例え
ば1mlのセファデックスＧ−50カラム、例として５プラ
イムから３プライムまでのセレクト−Ｄ、ウェスト・チ
ェスター、PA）で精製し、エタノール沈澱をした（４μ
ｌの3M酢酸ナトリウムpH5.2および120μｌの95％エタノ
ールを添加した。氷上で10分間インキュベートし、15分
間遠心分離を行い、上澄液をデカントして排出し、70％
エタノールに懸濁し、攪拌し、遠心分離を15分間行い、
上澄液をデカントして排出し、真空遠心分離機で５分間
乾燥することによって）。沈澱したDNAを次に５部の脱
イオンホルムアミドおよび１部の50mMのEDTApH8.0から
成る溶液３μｌに再懸濁させて完全に渦巻攪拌をした。
ゲル上に装填する前に、混合物を90℃にて２分間インキ
ュベートしてDNAを変性させた。M13プラスミドのうち45
0個以上の塩基がモデル370A自動化シーケンサーの塩基
コーリングルーチンによって正確に同定された。
実施例11.ローダミン標識ジデオキシヌクレオチドおよ
びT7DNAポリメラーゼとマンガン緩衝液を用いるDNA配列
分析 実施例10と同様に配列決定反応を行ったが、（１）Ta
q DNAポリメラーゼの代わりに修飾T7DNAポリメラーゼ
（シーケナーゼ（登録商標Sequenase、米国のバイオケ
ミカル社から入手できる）を使用する、例えばタボール
ら、プロシーディンング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンシーズ、第86巻、4076〜4080頁
（1989）および第84巻、4767〜4771頁（1987）、および
（２）5X Taq Mg緩衝液の代わりに5X T7 Mn緩衝液（100
mMのトリス−Cl pH7.5、75mMのイソクエン酸ナトリウ
ム、10mM MnCl2、250mMのNaCl）を使用し、染料−ター
ミネーターミックスは1.8μＭのddG−5R110、5.4μＭの
ddA−5R6G、5.8μＭのddT−6TMR、および9.0μＭのddC
−6ROMから成り、dNTPミックスは750μＭのdITP、150μ
ＭのdATP、150μMdTTP、および150μＭのdCTPから成
り、伸長反応は37℃にて10分間行った。
びT7DNAポリメラーゼとマンガン緩衝液を用いるDNA配列
分析 実施例10と同様に配列決定反応を行ったが、（１）Ta
q DNAポリメラーゼの代わりに修飾T7DNAポリメラーゼ
（シーケナーゼ（登録商標Sequenase、米国のバイオケ
ミカル社から入手できる）を使用する、例えばタボール
ら、プロシーディンング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンシーズ、第86巻、4076〜4080頁
（1989）および第84巻、4767〜4771頁（1987）、および
（２）5X Taq Mg緩衝液の代わりに5X T7 Mn緩衝液（100
mMのトリス−Cl pH7.5、75mMのイソクエン酸ナトリウ
ム、10mM MnCl2、250mMのNaCl）を使用し、染料−ター
ミネーターミックスは1.8μＭのddG−5R110、5.4μＭの
ddA−5R6G、5.8μＭのddT−6TMR、および9.0μＭのddC
−6ROMから成り、dNTPミックスは750μＭのdITP、150μ
ＭのdATP、150μMdTTP、および150μＭのdCTPから成
り、伸長反応は37℃にて10分間行った。
実施例12.ローダミン標識ジデオキシヌクレオチドおよ
びTaqDNAポリメラーゼとマンガン緩衝液を用いるDNA配
列分析 実施例10と同様に配列決定反応を行ったが、5X Taq M
g緩衝液の代わりに5X Taq Mn緩衝液（100mMのトリス−C
l pH7.5、75mMのイソクエン酸ナトリウム、10mM MnC
l2、250mMの塩化ナトリウム）を使用し、染料−ターミ
ネーターミックスは、3.6μＭのddG−5R110、2.7μＭの
ddA−5R6G、43.2μＭのddT−6TMR、および28.8μＭのdd
C−6ROXから成った。M13プラスミドのうち450個以上の
塩基がモデル370A自動化シーケンサーの塩基コーリング
ルーチンによって正確に同定された。
びTaqDNAポリメラーゼとマンガン緩衝液を用いるDNA配
列分析 実施例10と同様に配列決定反応を行ったが、5X Taq M
g緩衝液の代わりに5X Taq Mn緩衝液（100mMのトリス−C
l pH7.5、75mMのイソクエン酸ナトリウム、10mM MnC
l2、250mMの塩化ナトリウム）を使用し、染料−ターミ
ネーターミックスは、3.6μＭのddG−5R110、2.7μＭの
ddA−5R6G、43.2μＭのddT−6TMR、および28.8μＭのdd
C−6ROXから成った。M13プラスミドのうち450個以上の
塩基がモデル370A自動化シーケンサーの塩基コーリング
ルーチンによって正確に同定された。
前述の本発明の好適例の開示は説明と解説のために示
した。この開示された正確な形に本発明を網羅または制
限するものではなく、多くの改変および変形が上述の教
示の観点から可能であることは明らかである。これらの
例は本発明の原理およびその実際の応用を最良に説明す
るために選択され記載されたものであり、これによって
当該技術分野における他の熟練者が予期された特定の用
途に適合するように種々の具体化および種々の改変にお
いて本発明の範囲はここに添付する特許請求の範囲によ
って明確にするつもりである。
した。この開示された正確な形に本発明を網羅または制
限するものではなく、多くの改変および変形が上述の教
示の観点から可能であることは明らかである。これらの
例は本発明の原理およびその実際の応用を最良に説明す
るために選択され記載されたものであり、これによって
当該技術分野における他の熟練者が予期された特定の用
途に適合するように種々の具体化および種々の改変にお
いて本発明の範囲はここに添付する特許請求の範囲によ
って明確にするつもりである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャールス アール コンネル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94062 レッドウッド シティ，キング ストリート 167 (72)発明者 ジェイ スコット イーデイ アメリカ合衆国 インディアナ州 46236 インディアナポリス，ブリッタ ニイ シティ，ノース 8531 (72)発明者 ステベン フング アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94306 パロ アルト，アドベ プレイ ス 420 (72)発明者 エヌ デービス ハーシー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94303 サン カルロス，エルム スト リート 800，208号 (72)発明者 リンダ ジー リー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94303 パロ アルト，ステリング ド ライブ 3187 (72)発明者 ステベン エム メンシェン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94526 フレモント，バンダ ウエイ 768 (72)発明者 サム エル ウー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94061 レッドウッド シティ，カルロ ス アベニュ 450 (56)参考文献 特開 平１−180455（ＪＰ，Ａ) 欧州公開272007（ＥＰ，Ａ１) Ｊ．ＯＲＧ．ＣＨＥＭ．，54（14) （1989）Ｐ．3420−3422 ＣＨＥＭＩＣ ＡＬ ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ，93：249411
Claims (11)
- 【請求項１】異なる３′−末端ジデオキシヌクレオチド
を有するポリヌクレオチドをDNA配列決定のチェインタ
ーミネーション法において識別する方法において、この
方法が： 第１、第２、第３、および第４の種類のポリヌクレオチ
ドの混合物を形成し、第１の種類の各ポリヌクレオチド
が３′−末端ジデオキシアデノシンを有し、テトラメチ
ルローダミン、ローダミンＸ、ローダミン6G、およびロ
ーダミン110から成る群から選ばれる第１の染料を用い
て標識を付され；第２の種類の各ポリヌクレオチドが
３′−末端ジデオキシシチジンを有し、テトラメチルロ
ーダミン、ローダミンＸ、ローダミン6G、およびローダ
ミン110から成る群から選ばれる第２の染料を用いて標
識を付され；第３の種類の各ポリヌクレオチドが３′−
末端ジデオキシグアノシンを有し、テトラメチルローダ
ミン、ローダミンＸ、ローダミン6G、およびローダミン
110から成る群から選ばれる第３の染料を用いて標識を
付され；第４の種類の各ポリヌクレオチドが３′−末端
ジデオキシチミジンを有し、テトラメチルローダミン、
ローダミンＸ、ローダミン6G、およびローダミン110か
ら成る群から選ばれる第４の染料を用いて標識を付さ
れ； 混合物中の各種類のポリヌクレオチドが異なる染料を用
いて標識を付されており； 同じ大きさに分類されたポリヌクレオチドのバンドを形
成するように混合物中のポリヌクレオチドをゲル上に電
気泳動によって分離し； ゲル上のバンドを照明ビームを用いて発光させ、この照
明ビームは染料に蛍光を生じさせることをが出来；そし
て バンド中のポリヌクレオチドの種類を染料の蛍光または
吸収スペクトルによって同定する、 工程から成るポリヌクレオチドの識別方法。 - 【請求項２】前記３′−末端ジデオキシアデノシンが
２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンであり、
前記第１の染料が結合基のためにその７炭素原子に結合
しており；前記３′−末端ジデオキシシチジンが２′,
3′−ジオキシシチジンであり、前記第２の染料が結合
基のためにその５炭素原子に結合しており；前記３′−
末端ジデオキシグアノシンが２′,3′−ジデオキシ−７
−デアザグアノシンおよび２′,3′−ジデオキシ−７−
デアザイノシンから成る群から選ばれ、前記第３の染料
が結合基のためにその７炭素原子に結合しており；前記
３′−末端ジデオキシチミジンが２′,3′−ジデオキシ
ウリジンであり、前記第４の染料が結合基のためにその
５炭素原子に結合している特許請求の範囲第１項記載の
方法。 - 【請求項３】前記結合基が３−カルボキシアミノ−１−
ポロピニルであり、前記２′,3′−ジデオキシ−７−デ
アザアデノシン、および２′,3′−ジデオキシ−７−デ
アザグアノシンおよび２′,3−ジデオキシ−７−デアザ
イノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノ
シンの、７炭素原子を、前記第１および第３の染料の５
または６炭素原子に、それぞれ結合し、前記ジデオキシ
シチジンおよび前記ジデオキシウリジンの５炭素原子を
前記第２および第４の染料の５または６炭素原子に、そ
れぞれ結合している特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】さらにプライマーから複数のポリヌクレオ
チドをDNAポリメラーゼによって、ジデオキシアデノシ
ントリホスフェート、ジデオキシシチジントリホスフェ
ート、ジデオキシグアノシントリホスフェート、および
ジデオキシチミジントリホスフェートの存在で伸長し、
前記第１、第２、第３、および第４の種類のポリヌクレ
オチドを形成する工程を含む特許請求の範囲第３項記載
の方法。 - 【請求項５】前記DNAポリメラーゼがTaq DNAポリメラー
ゼおよびT7DNAポリメラーゼから成る群から選ばれる特
許請求の範囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】前記２′,3′−ジデオキシ−７−デアザア
デノシンがローダミン6Gの５炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシシチジンがローダミンＸの６炭素
原子に結合し、２′,3′−ジデオキシ−７−デアザグア
ノシンおよび２′,3′−ジデオキシ−７−デアザイノシ
ンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンが
ローダミン110の５炭素原子に結合し、前記２′,3′−
ジデオキシウリジンがテトラメチルローダミンの６炭素
原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】前記２′,3′−ジデオキシ−７−デアザア
デノシンがローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシシチジンがローダミン6Gの５炭素
原子に結合し、２′,3′−ジデオキシ−７−デアザグア
ノシンおよび２′,3′−ジデオキシ−７−デアザイノシ
ンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンが
ローダミン110の５炭素原子に結合し、前記２′,3′−
ジデオキシウリジンがテトラメチルローダミンの６炭素
原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項８】前記２′,3′−ジデオキシ−７−デアザア
デノシンがローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシシチジンがローダミン110の５炭
素原子に結合し、２′,3′−ジデオキシ−７−デアザグ
アノシンおよび２′,3′−ジデオキシ−７−デアザイノ
シンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシン
がテトラメチルローダミンの６炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシウリジンがローダミン6Gの５炭素
原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項９】前記２′,3′−ジデオキシ−７−デアザア
デノシンがローダミン6Gの５炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシシチジンがローダミン110の５炭
素原子に結合し、２′,3′−ジデオキシ−７−デアザグ
アノシンおよび２′,3′−ジデオキシ−７−デアザイノ
シンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシン
がローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記２′,3′−
ジデオキシウリジンがテトラメチルローダミンの６炭素
原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項１０】前記２′,3′−ジデオキシ−７−デアザ
アデノシンがローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシシチジンがテトラメチルローダミ
ンの６炭素原子に結合し、２′,3′−ジデオキシ−７−
デアザグアノシンおよび２′,3′−ジデオキシ−７−デ
アザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグ
アノシンがローダミン6Gの５炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシウリジンがローダミン110の５炭
素原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方
法。 - 【請求項１１】次の群から選ばれるローダミン標識化合
物。 （式中のR1は５−および６−カルボキシローダミンＸ、
５−および６−カルボキシローダミン6G、５−および６
−カルボキシローダミン110、および５−および６−カ
ルボキシテトラメチルローダミンから成る群から選ば
れ、R2はトリホスフェート、１−チオトリホスフェー
ト、または10〜600塩基のポリヌクレオチドである。）
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/415,050 US5366860A (en) | 1989-09-29 | 1989-09-29 | Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination |
| US415,050 | 1989-09-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05502371A JPH05502371A (ja) | 1993-04-28 |
| JP2649102B2 true JP2649102B2 (ja) | 1997-09-03 |
Family
ID=23644158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2513838A Expired - Lifetime JP2649102B2 (ja) | 1989-09-29 | 1990-09-27 | 核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5366860A (ja) |
| EP (1) | EP0496749B1 (ja) |
| JP (1) | JP2649102B2 (ja) |
| AT (1) | ATE131210T1 (ja) |
| DE (1) | DE69024061T2 (ja) |
| WO (1) | WO1991005060A2 (ja) |
Families Citing this family (223)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1223831A (en) | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
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| USRE43096E1 (en) | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
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