JP2641228B2

JP2641228B2 - 抗体およびそれを有効成分とするう蝕予防剤、並びにこれらの製造方法

Info

Publication number: JP2641228B2
Application number: JP63010853A
Authority: JP
Inventors: 俊雄堀越; 淳一郎平岡; 勇藤田; 透所; 義勝児玉; 英明横山
Original assignee: GEN KOOHOREESHON KK; Kanebo Ltd
Current assignee: GEN KOOHOREESHON KK; Kanebo Ltd
Priority date: 1988-01-22
Filing date: 1988-01-22
Publication date: 1997-08-13
Anticipated expiration: 2012-08-13
Also published as: CN1033865C; EP0334467A2; DE68921908D1; CA1325192C; EP0334467A3; US5439680A; KR890011996A; CN1036036A; DE68921908T2; JPH01190635A; EP0334467B1; KR940010861B1

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、う蝕を誘発する病原菌であるストレプトコ
ッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）に対
して免疫活性を有する抗体及び該抗体を有効成分として
含むう蝕予防剤、並びにこれらの製造方法に関する。

［従来の技術］う蝕の発生において、Ｓ．mutansの歯面への付着過程
が重要な役割を果していることが既に知られており、
Ｓ．mutansの口腔内への定着（特に歯面への付着）を制
御して、う蝕を予防しようとする種々の試みがなされて
いる。

例えば、Ｓ．mutansに対する免疫活性を有する抗体を
用いたう蝕予防方法が知られており、英国特許第150551
3号明細書には、Ｓ．mutansの菌体で免疫した牛から得
られた母乳をＳ．mutansの口腔内への定着の制御に用い
る方法が、また特開昭60−38327号公報には、Ｓ．mutan
sの培養から得た細胞壁等の画分を哺乳動物に免疫する
ことによって得られた抗血清及び／または乳と、グルコ
シルトランスフェラーゼインヒビター、プロテアーゼ及
びデキストラナーゼからなる群より得らばれる１種以上
のシネルギストとを組み合せたう蝕予防剤が記載されて
いる。

［発明が解決しようとする課題］しかしながら、従来のＳ．mutansに対する免疫活性を
有する抗体のう蝕予防効果は必ずしも十分ではなく、ま
た、従来の抗体は、免疫した哺乳動物の乳やその抗血清
から調製されるので、量産性に欠け、生産コストも高い
などの欠点を有し、実用的ではない場合が多い。

本発明者らは、このような従来技術における問題を解
決すべく種々の検討を行なった結果、鶏を用いた抗体の
調製法に、後述の理化学的特性を有するＳ．mutansの菌
体結合型グルコシルトランスフェラーゼ抗原として組合
せて用いることによって、Ｓ．mutansの歯面への付着に
対する十分な阻害効果を有し、上述したような欠点のな
い抗体を調製し得るとの新たな知見を得るに至り、本発
明を完成した。

なお、鶏を用いた抗体の調製においては、抗原の種類
によっては必ずしも十分な抗体価が得られるとは限らな
い。例えば、ウイルスを抗原として用いたところ十分な
抗体価が得られなかった。

従って、菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼで
鶏を免疫して、十分に高い抗体価を有する抗体が得られ
るという知見は、本発明者らにより始めて得られたもの
である。

本発明の目的は、Ｓ．mutansに対する免疫活性を示
し、Ｓ．mutansの歯面へ付着に対する十分な阻害効果を
有し、量産性にも優れ、生産コストが低く、う蝕予防剤
の有効成分として有用な抗体及び該抗体を含むう蝕予防
剤、並びにこれらの製造方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］本発明のＳ．mutansに対する免疫活性を有する抗体
は、下記理化学的特性を有する血清型がｃ、ｅまたはｆ
であるＳ．mutansの菌体結合型グルコシルトランスフェ
ラーゼ（以後CA−GTF−Ｉと略称する）を免疫した鶏が
産生する卵より調製された免疫グロブリンとして得るこ
とができる。

作用及び基質特異性；スクロースに作用し、水に不溶性のグルカンを合成す
る。

至適pH; pH6.7〜7.0 作用適温の範囲； 15〜50℃ 失活の条件 80℃、５分間の処理で失活する。

分子量； SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し
た分子量が、150k〜165kダルトンである。

免疫原性；動物において免疫原となり、該酵素に対する特異抗体
を生成させ得る。

本発明のう蝕予防剤は、う蝕誘発の病原菌としての血
清型がｃ、ｅまたはｆであるＳ．mutansの上記理化学的
特性を有する菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼ
を免疫した鶏が産生する卵より調製された免疫グロブリ
ンであって、前記Ｓ．mutansに対して免疫活性を有する
抗体を有効成分として含むことを特徴とする。

また、本発明のＳ．mutansに対する免疫活性を有する
抗体の製造方法は、Ａ）上記理化学的特性を有する菌体結合型グルコシルト
ランスフェラーゼを生産する血清型がｃ、ｅまたはｆで
あるＳ．mutansを培養し、培養菌体を培養液と分離する
工程と、Ｂ）該培養菌体から前記菌体結合型グルコシルトランス
フェラーゼを抽出する過程と、Ｃ）該菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼを鶏に
免疫する工程と、Ｄ）該免疫された鶏が産生する卵から、該菌体結合型グ
ルコシルトランスフェラーゼに対する抗体としての免疫
グロブリンを調製する工程と、を有することを特徴とする。

更に、本発明のう蝕予防剤の製造方法は、Ａ）上記の理化学的特性を有する菌体結合型グルコシル
トランスフェラーゼを生産する血清型がｃ、ｅまたはｆ
であるＳ．mutansを培養し、培養菌体を培養液と分離す
る工程と、Ｂ）該培養菌体から前記菌体結合型グルコシルトランス
フェラーゼを抽出する過程と、Ｃ）該菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼを鶏に
免疫する工程と、Ｄ）該免疫された鶏が産生する卵から、該菌体結合型グ
ルコシルトランスフェラーゼに対する抗体としての免疫
グロブリンを調製する工程と、Ｅ）該菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼに対す
る抗体としての免疫グロブリンを有効成分としてう蝕予
防剤を製剤化する工程を有することを特徴とする。

なお、上記SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（S
DS−PAGE）は以下の操作に従って行なったものである。

SDS−PAGE操作条件； SDS−PAGEはレムリー（Laemmli）らの方法により行な
う。

すなわち、後述の粗抽出標品または精製標品（0.2〜3
5μｇ）を個々に２％SDS、５％２−メルカプトエタノー
ル及び20％グリセロールを含む62.5mMのトリス塩酸緩衝
液（pH6.8）中で100℃、３分間処理する。

電気泳動は、0.1％のSDSを含む7.5％の分離ゲルと、
４％の濃縮ゲル中、室温下、10mA、２時間の条件で行な
う。なお、分子量マーカーとしては、フェリチン（ferr
itin、220kダルトン）、ホスフォリラーゼ（phosphoryl
ase、94kダルトン）、牛血清アルブミン（bovine serum
albumin、67kダルトン）、カタラーゼ（catalase、60k
ダルトン）、オブアルブミン（ovalbumin、43kダルト
ン）および乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase、3
6kダルトン）（いずれもファルマシア社製）を用い、バ
ンドの検出はクマシブリリアントブルー（CBB）に
よる染色によって行なうことができる。

また、CA−GTF−Ｉが水不溶性グルカンを生成するこ
とは、例えば以下のような操作により確認できる。

適当量（50mU酵素活性量程度）の酵素標品を、最終濃
度で１％スクロース及び0.1％のアジ化ナトリウムを含
む0.1Mのリン酸緩衝液（pH6.0）に加え、蒸留水で3mlに
容量を調整した後、混合し、37℃、18時間酵素反応を行
なわせ、酵素反応を反応溶液を氷冷して４℃にすること
により停止させる。

酵素反応終了後、反応生成物を1600×ｇの遠心分離で
処理し、沈殿した水不溶性画分と上清液に分ける。

次に、水不溶性画分を蒸留水で２度洗浄し、3mlの蒸
留水に懸濁して、水不溶性グルカン標品とする。

また、上清液にその2.5倍容量のエタノールを加え、
４℃で１時間放置後、生じた沈殿を1600×ｇの遠心分離
で回収し、それを3mlの蒸留水に溶解させ、更に同様の
沈殿処理を再度行なって回収された沈殿を再び3mlの蒸
留水に溶解し水溶性グルカン標品とする。

次に、これらの標品に含まれるグルカンの量をアンス
ロン法により定量分析して該酵素標品の作用によって合
成されるグルカンの種類を調べて、該精製酵素標品が水
不溶性グルカンを合成する作用を有することが確認でき
る。

本発明の抗体（以後抗CA−GTF−Ｉ抗体と称する）を
得るために用いるCA−GTF−Ｉとしては、上記特性を有
する酵素であればどのようなものでも利用でき、例えば
以下のようにしてＳ．mutansの菌体に結合した状態で生
産されたCA−GTF−Ｉを菌体から分離して得ることがで
きる。

すなわち、血清型がｃ、ｅまたはｆ型であるＳ．muta
nsを適当な培地で培養し、得られた菌体を集菌し、必要
に応じて洗浄する。

ここで用いるｃ型菌としては、Ｓ．mutans MT8148
株、Ingbritt株、10449株等の公知で、容易に入手可能
な菌を用いることができ、例えば、Ｓ．mutans MT8148
株、Ingbritt株は大阪大学歯学部から、10499株はナシ
ョナルコレクションオブタイプカルチャーズ
［National Collection of Type Cultures（NCTC）］か
ら入手できる。また、ｅ型菌やｆ型菌についても公知の
菌株を同様に入手して用いれば良い。

また、培地としては、少なくともグルコースを含む培
地が利用でき、例えば、TTY培地（Trypticase、Tryptos
e、Yeast extractの複合培地）、BHI（Brain Heart Inf
usion）培地、FMC培地などを用いることができる。

また、培養温度は、菌体増殖が得られ、かつCA−GTF
−Ｉの生産に適した範囲内であれば良いが、良好な菌体
増殖とCA−GTF−Ｉの生産という点からは、通常37℃程
度とすると良い。

また、培養時間は、培養温度、培地の種類等の培養条
件によって異なるが、CA−GTF−Ｉの最適収量に達する
時期を選択して決定すれば良く、通常18〜20時間程度と
すれば良い。

また、その他の培養条件についても、上記の観点から
適宜選択すれば良い。

次に、菌体からCA−GTF−Ｉを抽出する。

菌体からのCA−GTF−Ｉの抽出は、尿素溶液、グアニ
ジン塩酸溶液などの抽出用溶液と菌体とを接触させる方
法などにより行なうことができる。

抽出用溶液中の懸濁菌体濃度、抽出用溶液の濃度、抽
出の温度および時間等の抽出条件は、目的とする酵素の
十分な抽出が可能であるように、用いる抽出用溶液の種
類等に応じて適宜選択して設定すれば良い。

なお、高比活性の抽出物を高回収率で得るという点か
らは、好ましくは６〜10M、より好ましくは8Mの尿素溶
液を用いた、好ましくは20〜30℃、より好ましくは25℃
で、15分〜２時間程度の処理を行なうと良い。

抽出操作が終了したところで、抽出液から菌体等の固
形物を遠心分離法などの方法により除いた後、これを透
析、限外濾過、ゲル濾過等の手段で処理して尿素や低分
子量の不純物等を該抽出液から除去して、CA−GTF−Ｉ
粗抽出標品を得ることができる。

なお、この透析等の処理の際に沈殿が生じた場合に
は、それを遠心分離法などの手段によって除去すれば良
い。

更に、粗抽出標品を、精製してCA−GTF−Ｉ精製標品
を得ることができる。

この精製には、通常酵素の精製に用いられている各種
の精製方法を用いることができるが、例えば以下に述べ
る陰イオン交換体を用いた吸着法と、ヒドロキシアパタ
イトを用いた吸着法を組み合せた方法が好適に適用でき
る。

粗抽出標品の精製に用いる陰イオン交換体としては、
ジエチルアミノエチル［Diethylaminoethyl（DEAE）］
等の官能基を有する陰イオン交換体が利用でき、具体的
には、DEAE−セファセル（DEAE−Sephacel、ファルマシ
ア社製）などを挙げることができる。

また、ヒドロキシアパタイトとしては、Bio−Gel HTP
［バイオラッド（Bio−Rad）社製］等を用いることがで
きる。

陰イオン交換体を用いた精製処理は、粗抽出標品に含
まれる抽出物（粗タンパク質を）を陰イオン交換体に接
触させた後、陰イオン交換体に吸着した画分から、目的
とする酵素を含む画分を選択的に溶出させて分画するこ
とによって行なうことができる。

目的とする酵素を含む画分は、例えば溶出液の塩濃度
を調節することによって得ることができる。

この塩濃度は、用いる陰イオン交換体の種類や溶出条
件等に応じて異なるが、GTF（−Ｉ）活性を有する画分
を選択的に分画できる濃度範囲を選択して決定すれば良
い。

例えば、DEAE−セファセルを用いた場合には、リン酸
緩衝液中のNaCl濃度が0.45〜1.0Mの範囲でGTF（−Ｉ）
活性を有する画分を得ることができる。

なお、陰イオン交換体と接触させる試料は、粗抽出標
品から硫安、エタノール沈殿等の塩の溶液や有機溶媒を
用いた沈殿法などによって得た沈殿粗タンパク質を、遠
心分離法等により回収した後に、適当な溶媒に溶解し、
これを必要に応じて透析等で処理して該沈殿物から低分
子量の不純物を除くことによって調製することができ
る。

陰イオン交換体での処理が終了たところで、GTF（−
Ｉ）活性を有する画分を集め、これを透析等の手段で脱
塩処理した後、ヒドロキシアパタイトと接触させる。

次に、ヒドロキシアパタイトに吸着した画分からCA−
GTF−Ｉを選択的に分離溶出させて、CA−GTF−Ｉ画分を
得、該画分を必要に応じて透析等で処理して、CA−GTF
−Ｉ精製標品を得ることができる。

このようにして得られたCA−GTF−Ｉ精製標品は、SDS
−PAGEにおいて分子量150k〜165kダルトンに相当する位
置に単一バンドを与える。

なお、CA−GTF−Ｉの酵素活性は、［¹⁴C−グルコー
ス］スクロース（［¹⁴C−glucose］sucrose）を基質と
して反応させた際に生成されるグルカンへの放射能の取
り込み量を計測することにより測定できる。

抗体を得るための抗原として、以上の操作で得られた
菌体からの抽出物もしくは粗精製標品などに含まれた状
態のCA−GTF−Ｉ、または精製標品として得られたCA−G
TF−Ｉ等を用いることができる。

次に、本発明の抗CA−GTF−Ｉ抗体の調製方法につい
て詳述する。

本発明の抗CA−GTF−Ｉ抗体は、上述のCA−GTF−Ｉで
免疫した鶏の卵から調製することができる。

免疫される鶏としては、特に制限はないが、抗体の量
産性という点からは、白色レグホーン等の卵用種を用い
ると良い。

また、CA−GTF−Ｉによる免疫方法としては、皮下注
射、腹腔内投与、筋肉注射等による通常の方法や、点
鼻、点眼等の方法によって行なうことができる。更に、
CA−GTF−Ｉの投与量は、所望の抗体価が得られ、かつ
鶏に対して悪影響を与えない量を適宜選択して用いれば
良い。

通常、初回免疫から数週間で投与抗原に対して特異的
に反応する抗体が卵（卵黄）中に得られる。

なお、必要に応じて例えばFCA（フロイント完全アジ
ュバント）、FIA（フロイント不完全アジュバント）な
どのアジュバントをCA−GTF−Ｉと併用しても良い。

免疫から約１箇月以上経過した鶏から採取した卵から
本発明の抗CA−GTF−Ｉ抗体を調製することができる。

なお、卵黄中の抗体価は、酵素免疫吸着法（ELIS
A）、ラジオイムノアッセイ等を用いて測定することが
でき、免疫後に２週程度の間隔で抗体価を測定すること
により抗体価の推移を追跡できる。

後述の実地例においては、ELISAでの測定により抗体
価の推移を追跡し、抗体価が十分に上昇した段階の卵を
採取して、本発明の抗CA−GTF−Ｉ抗体を調製した。

また、通常、約３箇月間にわたって高抗体価を得るこ
とができる。

なお、免疫後、抗体価の減少が見られた場合、適当な
間隔で適宜追加免疫することにより抗体価を高くするこ
とができる。

本発明の抗CA−GTF−Ｉ抗体は、例えば上記のように
して免疫した鶏の卵黄に含まれる免疫グロブリンを抽出
・分離することによって得ることができる。

この抽出・分離方法としては、例えば、デキストラン
硫酸やポリエチレングリコール（PEG）を用いた沈殿法
や、プロパノールやクロロホルムを用いた抽出法など通
常用いられている免疫グロブリンを抽出・分離できる種
々の方法等が利用できる。

以上のようにして得られた本発明の抗CA−GTF−Ｉ抗
体は、Ｓ．mutansの菌体に結合して存在するCA−GTF−
Ｉに対して特異的に抗体として反応する。すなわちＳ．
mutansに対して免疫活性を有する。

Ｓ．mutansに対して免疫活性を有する本発明の抗CA−
GTF−Ｉ抗体は、Ｓ．mutansの歯面への付着を阻害する
効果を有し、該抗体を口腔内に投与することによって、
Ｓ．mutansの口腔内での活動を制御し、う蝕を予防する
ことができる。

本発明のう蝕予防剤は、上述の抗CA−GTF−Ｉ抗体を
有効成分として含み、その口腔への投与形態に応じて種
々の形に調製される。

例えば、マウスウォッシュや練り歯磨き等として利用
する場合には、各種成分を用いてこれらを調製する際
に、本発明の抗CA−GTF−Ｉ抗体の有効量を含有させれ
ば良い。

抗CA−GTF−Ｉ抗体のう蝕予防剤への配合量は、その
投与形態に応じた投与量に従って適宜選択すれば良く、
例えば、10³以上の抗体価を有する抗体を0.0001〜10重
量％程度とすることができる。

［実施例］以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。な
お、以下における％表示は、特に指定されていない場合
には、重量／容量％を示す。

実施例１（抗原の調製）Ｓ．mutans Ingbritt株（血清型ｃ、大阪大学歯学部
から入手）を15lのTTY培地で37℃、18時間培養し、得ら
れた培養菌体を生理食塩水で２度洗浄した。

次に、洗浄菌体を400mlの8M尿素溶液に懸濁した菌体
懸濁液を、25℃で１時間撹拌処理した。その後、この菌
体懸濁液から遠心分離法により菌体を除去し、得られた
上清液を10mMリン酸緩衝液（pH6.0）に対して透析し
た。

透析終了後、上清液中に生じた沈殿物を遠心分離法に
より除去した後、該上清液に対して60％飽和の硫安沈殿
処理を行ない、得られた沈殿物を遠心分離法により回収
した。次にこの沈殿物を10mMリン酸緩衝液（pH6.0）に
溶解した溶液を同様の緩衝液に対して透析し、更に該溶
液中に生じた沈殿を遠心分離法により除去して上清液を
得た。この上清液を粗精製（免疫抗原）標品とした。

該標品のタンパク質濃度及びタンパク質全量をCBB−
Ｇ法（Branford,M.M.,Anal.Biochem.,72,248（1976）］
により測定したところ、タンパク質濃度が5.1mg/ml、タ
ンパク質全量が141mgであった。

更に、該標品を前述のSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（SDS−PAGE）にかけ、クマシブリリアント
ブルー（CBB）での染色を行なったところ、155kダル
トンの位置のバンドを含む数個のバンドが検出された。

これとは別に、該標品をトリス塩酸緩衝液中での処理
を37℃、30分で行ない、かつ電気泳動を４℃で行なう以
外は前述と同様の操作によるSDS−PAGEにかけた後、ゲ
ルを37℃の１％スクロース及び0.05％アジ化ナトリウム
を含むリン酸緩衝液（pH6.0）中に18時間浸漬した。次
に、浸漬処理したゲルをPAS（Periodicacid Schiff）反
応により染色したところ、155kダルトンの位置にグルカ
ンの生成を示す顕著な染色バンドが検出された。

また、上記のSDS−PAGEの結果から算出された該標品
中のCA−GTF−Ｉ含有率は40重量％であった。

実施例２（CA−GTF−Ｉ精製標品の調製）実施例１と同様の条件で、Ingbritt株をTTY培地（8
l）で培養し、得られた菌体を集菌、洗浄し、それを300
mlの8M尿素溶液に懸濁した。

次に、該懸濁液を25℃、１時間撹拌して抽出を行なっ
た。

抽出処理終了後、抽出液から菌体を遠心分離法により
除去して得た上清液を、10mMリン酸緩衝液（pH6.0）に
対して透析した。

透析終了後、上清液中に生じた不溶物を遠心分離法に
より除去し、CA−GTF−Ｉ粗抽出標品を得た。

次に、粗抽出標品から60％飽和の硫安による沈殿物を
調製し、この沈殿物を更に20mlの50mMリン酸緩衝液（pH
7.5）に溶解させ、同緩衝液に対して透析した。

透析終了後、透析処理中に生じた不溶物を溶液から遠
心分離法により除去したのち、その上清液をDEAE−セフ
ァセル（DEAE−Sephacel、ファルマシア社製）の2.5〜1
3cmのカラムにかけた。

カラムに吸着した画分は、リン酸緩衝液（pH7.5）中
のNaClの濃度勾配によって選択的に溶出させた。

溶出された各画分のGTF活性を以下に記載した方法
で、またタンパク質含量を280nmの紫外吸収法で測定し
たところ、0.45〜1.0MのNaCl濃度画分中に顕著なGTF活
性が認められた。

GTF活性の測定；試料10μを、基質としての20mMの［¹⁴C−グルコー
ス］スクロース（［¹⁴C−glucose］sucrose）（0.05Ci/
mol）を含む0.2Mリン酸緩衝液（pH6.0）の10μと混合
し、37℃で１時間反応後、反応液全量を濾紙（0.1×2.0
cm）にスポットし、これをメタノールで洗浄後、濾紙上
に残ったメタノールに不溶性のグルカン中に取り込まれ
た放射能量を測定し、GTF活性を算出し、１分間に１μm
olのグルコースをグルカンに転移させる活性を１単位
（Ｕ）とした。

次に、0.45〜1.0MのNaCl濃度による溶出画分を集め、
それを10mMリン酸緩衝液（pH6.0）に対して透析し、次
いで10mMリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したヒドロキ
シアパタイト［Bio Gel HTP、バイオラッド（Bio−Ra
d）社製］のカラム（1.0×13cm）にかけた。

カラムに吸着した画分は、0.01M、0.2M、0.26Mおよび
0.5Mのリン酸緩衝液（pH6.0）でそれぞれ溶出させた。

各画分の、GTF活性およびタンパク質含量を上述と同
様の方法で測定した結果、0.5Mのリン酸緩衝液（pH6.
0）による画分中にGTF活性が認められた。

次に、0.5Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）によ
る高活性を示す溶出画分を集め、それを10mMリン酸緩衝
液（pH6.0）に対して透析し、精製酵素標品を得た。

更に、この精製酵素標品を前述の条件のSDS−PAGEに
かけ、CBBでタンパク質を染色したところ、分子量155k
ダルトンの位置に単一のバンドが検出され、該精製酵素
標品が分子量155kダルトンの酵素タンパク質であること
が確認された。

また、該精製酵素標品を用いて、常法により該酵素の
GTF活性の至適pH、作用適温の範囲、失活の条件を検討
したところ、CA−GTF−Ｉが先に示した理化学的特性
〜を有することが確認された。

更に、50mU酵素活性量に相当する量の精製酵素標品
を、最終濃度で１％スクロース及び0.1％のアジ化ナト
リウムを含む0.1Mのリン酸緩衝液（pH6.0）に加え、蒸
留水で3mlに容量を調整した後、混合し、37℃、18時間
酵素反応を行なわせた。なお、酵素反応は、反応溶液を
氷冷して４℃にすることにより停止させた。

酵素反応終了後、反応生成物を1600×ｇの遠心分離で
処理し、沈殿した水不溶性画分と上清液に分けた。

水不溶性画分は蒸留水で２度洗浄し、3mlの蒸留水に
懸濁して、水不溶性グルカン標品とした。

また、上清液にその2.5倍容量のエタノールを加え、
４℃で１時間放置後、生じた沈殿を1600×ｇの遠心分離
で回収し、それを3mlの蒸留水に溶解させ、更に同様の
沈殿処理を再度行なって回収された沈殿を再び3mlの蒸
留水に溶解し水溶性グルカン標品とした。

更に、これらの標品に含まれるグルカンの量をアンス
ロン法により定量分析して該精製酵素標品の作用によっ
て合成されるグルカンの種類を調べたところ、該精製酵
素標品は水不溶性グルカンを合成する作用を有するCA−
GTF−Ｉであることが明らかとなった。

なお、得られた該精製酵素標品のタンパク質量を上述
の方法で測定したところ、9.7mgであった。

実施例３（抗体の調製）実施例１で得た粗精製免疫抗原標品0.5ml（CBB−Ｂ法
で測定した場合の1mgタンパク質量を含む）とFCA（フロ
イント完全アジュバント）0.05mlを1:1の割合で混合し
てW/O型のエマルジョンとした。

得られたエマルジョンを鶏の左右の胸筋に0.5mlずつ
注射し、初回免疫を行なった後、下記の方法に従って、
採取した卵から得たWSF（後述）の抗体価を測定し、そ
の推移を観察した。

（１）卵からの抗体の取得方法；卵から分離した卵黄とこれと同容量のPBS（リン酸緩
衝液、pH7.4）を混合し、得られた混合溶液に更にPBSの
２倍容量に相当する量のクロロホルムを加えてこれをよ
く撹拌した。

撹拌終了後、混合液を室温下で30分間放置した後、こ
れを3,000rpm、20分間の遠心分離にかけ、最上層の透明
画分を回収し、抗体含有画分（Water Soluble Fractio
n、WSF）とした。

（２）抗体価の測定方法；抗体価の測定は、ELISAよって行なった。

まず、実施例１で得た粗精製免疫抗原標品をSDS−PAG
Eにかけ、得られた155kダルトンに相当する部分から電
気溶出法によりタンパク質を含む画分を分離した。な
お、この画分を更にSDS−PAGEにかけ、CBBによる染色を
行なったところ、155kダルトンに相当する位置に単一の
バンドが検出された。

次に、得られた該画分を、タンパク質濃度が1.25μg/
mlとなるように50mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）に
溶解させて得られた溶液を、96穴プレート［イムロン
（Immulon）２、ダイナテック社製］の各ウエルに100μ
ずつ入れ、４℃で一晩放置し、該画分に含まれる精製
抗原をプレートに吸着させた。

次に、プレートをPBS−Ｔ［0.05％Tween−20含有PBS
（pH7.4）］で５回洗浄した。

洗浄終了後、プレートを３％BSA（牛血清アルブミ
ン）を含むPBS（pH7.4）と37℃で１時間接触させて、ブ
ロッキングを行なった後、PBS−Ｔでプレートを５回洗
浄した。

ここで、先に得たWSFのPBS−Ｔによる２段階希釈液の
100μを各ウエルに加え、37℃１時間で反応を行なわ
せた。

反応終了後、プレートをPBS−Ｔで５回洗浄し、更
に、プレートに２次抗体としてのペルオキシダーゼ結合
抗ニワトリIgG抗体（タンパク質量1.67μg/ml）の100μ
を各ウエルに加え25℃で30分間反応させた後、PBS−
Ｔで５回洗浄した。

次に、プレートの各ウエルに0.2Mリン酸２ナトリウム
−0.1Mクエン酸緩衝液（pH5.0）50mlに基質であるｏ−
フェニレンジアミン20mg及び過酸化水素10μを溶解し
た溶液を100μ加え、25℃で20分間反応させた。反応
停止は3N硫酸溶液を100μ加えることで行なった。

反応終了後、各ウエルの吸光度（OD₄₉₂）を測定する
ことによって抗体価を測定した。抗体価はエンドポイン
トタイター法により求め、吸光度が0.2となる希釈倍率
とした。

次に、第１図に示すように初回免疫後８週後に卵黄中
の抗体価が下がり始めたのを確認して、前回と同様にし
て２次免疫を行なった。

２次免疫終了後約１箇月経過後に採卵し、上述の方法
により抗体価を求めた。

その結果、初回免疫から12週（２次免疫から４週）経
過後に8.4×10³の抗体価を有するWSFが得られた。

なお、該8.4×10¹³の抗体価を示すWSF（13ml、13mlの
卵黄から調製）のタンパク質含有濃度をビューレット法
により測定し、該WSF中の全タンパク質量を求めたとこ
ろ約26mgという値を得た（約2.0mg/ml×13ml）。

実施例４（抗体によるＳ．mutansの平滑面への付着阻害効果の確
認）Ｓ．mutansの歯面への付着のモデル実験として、ガラ
ス面への付着実験を行なった。

すなわち、実施例３で得た抗体を加えることで、Ｓ．
mutansのガラス面への付着がどの程度阻害されるかを評
価するものであり、その詳細を以下に述べる。

まず、実施例３で得た抗体価8.4×10³を示したWSF及
びその10倍希釈液を試験溶液とした。

これとは別に、免疫をしていない鶏（実施例２と同様
の鶏）の卵から実施例３と同様にしてWSFを調製し試験
溶液とした。なお、該WSFがCA−GTF−Ｉに対して特異的
に反応しないことを確認した。

次に、これらの各試験溶液を13mmφ×100mmの試験管
に1ml分注した後、更に1.5％スクロースを含む1.5倍濃
度のBHI培地2mlをそれぞれの試験管に加えた。

更に、各試験管にBHI培地で前培養したＳ．mutans In
gbritt株の懸濁液0.1mlを加えて、30゜に傾斜させた状
態で、37℃の温度下で18時間静置培養した。

表１に各試験管内に調製した調製物の組成を示す。

静置培養終了後、各試験管を以下の操作に従って処理
し、菌体の試験管壁への付着率を求めた。

静置培養終了後の試験管（この試験管を第１の試験管
とする）を静かに回転させ、試験管壁に付着していない
菌体を含んだ溶液の全量を第２の試験管に移した。次
に、菌体が付着している第１の試験管に50mMリン酸緩衝
液（pH6.8）の3mlを加え、これを再び回転させ、解離し
た菌体含む緩衝液の全量を第３の試験管に移した後、こ
の第１の試験管に、50mMリン酸緩衝液（pH6.8）の3mlを
加えた。

更に、第１〜第３の試験管を超音波処理し、各試験管
内に均一な菌体浮遊液を調製し、各浮遊液の吸光度（OD
₅₅₀）を測定し、以下の式に従って付着率を求めた。

得られた結果を表１に示す。

実施例５実施例２で得たCA−GTF−Ｉ精製標品を抗原として用
いる以外は実施例３と同様にして抗体の調製を行なった
ところ、同様にCA−GTF−Ｉと特異的に反応する抗体が
得られた。

更に、得られた抗体の菌体付着阻害効果を実施例４と
同様の方法で試験した結果、同様に優れた効果が認めら
れた。

実施例６実施例３で得た抗体価8.4×10³を示したWSFを表２及
び表３に示す組成の組成物及び溶液に対し、0.5重量％
加えて、練り歯磨き及びマウスウォッシュを調製した。

表２成分組成（重量％）ピロリン酸カルシウム 42 グリセリン 15 ソルビット（70％） 10 カルボキシメチルセルロース 12 サッカリンナトリウム 0.1 ラウリル硫酸ナトリウム 20 香料 1.0 水残り 100％表３成分組成（重量％）エタノール 22.5 サッカリンナトリウム 0.05 ラウリルジエタノールアミド 0.3 香料 1.0 水残り 100％［発明の効果］本発明により、Ｓ．mutansの歯面への付着に対する十
分な阻害効果を有し、量産性にも優れ、生産コストが低
く、う蝕予防剤の有効成分として有用な抗体及び該抗体
を含むう蝕予防剤が提供された。

特に、本発明のＳ．mutansに対する免疫活性を有する
抗体は、従来の哺乳動物を免疫して得る抗体と比較して
以下のような利点を有する。

（１）本発明の抗体は、免疫した鶏の卵中に得られ、採
卵、卵の取り扱いおよび卵からの抗体の取得に特別な、
あるいは熟練した技術を必要としない。しかも、卵黄に
は免疫グロブリンのうちIgGクラスしか移行しないの
で、IgGのみを容易に得ることができる。

これに対して、免疫した哺乳動物から採血により抗体
を得る場合には、採血に熟練した技術が必要とされ、し
かも血清から大量のIgGを分離・精製することは未だ困
難である。

（２）本発明の抗体の調製に用いられる鶏は、管理が容
易であり、例えばラット等と比較してもその管理費用が
安い。

しかも、哺乳動物から継続的に多量の血液や乳を得る
ことは困難であり、哺乳動物を用いる方法は抗体の量産
には適さないが、鶏は長期間にわたって安定して卵を生
み続けるので、本発明の抗体は量産可能であり、かつ生
産コストが低い。

（３）免疫した哺乳動物の血液や乳から調製した抗体の
安定性は必ずしも良好でなく、血清中で、あるいは精製
した状態でも−80℃程度の温度条件下での保存が必要と
される。

本発明の抗体は、良好な安定性を有し、また保存性も
良く、例えば卵の状態で４℃で１〜２箇月間保存でき
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３における免疫した鶏の抗体価の推移
を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者児玉義勝岐阜県岐阜市御望951―201 (72)発明者横山英明岐阜県各務原市蘇原宮代町２丁目115番２ (56)参考文献う蝕と歯周病−研究の進歩、浜田茂幸編集、日本歯科評論社1985年刊、３巻、第119−141ページＲｅｓｅａｒｃｈｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ. 18（1975），ＰＰ．117−120

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】う蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ、ｅ
またはｆであるストレプトコッカス・ミュータンスの下
記理化学的特性を有する菌体結合型グルコシルトランス
フェラーゼを免疫した鶏が産生する卵より調製された免
疫グロブリンであって、前記ストレプトコッカス・ミュ
ータンスに対して免疫活性を有する抗体。作用及び基質特異性；スクロースに作用し、水に不溶性のグルカンを合成す
る。至適pH: pH6.7〜7.0 作用適温の範囲； 15〜50℃ 失活の条件； 80℃、５分間の処理で失活する。分子量； SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した
分子量が、150k〜165kダルトンである。免疫原性；動物において免疫原となり、該酵素に対する特異抗体を
生成させ得る。
【請求項２】う蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ、ｅ
またはｆであるストレプトコッカス・ミュータンスの下
記理化学的特性を有する菌体結合型グルコシルトランス
フェラーゼを免疫した鶏が産生する卵より調製された免
疫グロブリンであって、前記ストレプトコッカス・ミュ
ータンスに対して免疫活性を有する抗体を有効成分とし
て含むう蝕予防剤。作用及び基質特異性；スクロースに作用し、水に不溶性のグルカンを合成す
る。至適pH: pH6.7〜7.0 作用適温の範囲； 15〜50℃ 失活の条件； 80℃、５分間の処理で失活する。分子量； SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した
分子量が、150k〜165kダルトンである。免疫原性；動物において免疫原となり、該酵素に対する特異抗体を
生成させ得る。
【請求項３】請求項１に記載の抗体の製造方法であっ
て、Ａ）以下の理化学的特性：作用及び基質特異性；スクロースに作用し、水に不溶性のグルカンを合成す
る。至適pH: pH6.7〜7.0 作用適温の範囲； 15〜50℃ 失活の条件； 80℃、５分間の処理で失活する。分子量； SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した
分子量が、150k〜165kダルトンである。免疫原性；動物において免疫原となり、該酵素に対する特異抗体を
生成させ得る。を有する菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼを生
産する血清型がｃ、ｅまたはｆであるストレプトコッカ
ス・ミュータンスを培養し、培養菌体を培養液と分離す
る工程と、Ｂ）該培養菌体から前記菌体結合型グルコシルトランス
フェラーゼを抽出する過程と、Ｃ）該菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼを鶏に
免疫する工程と、Ｄ）該免疫された鶏が産生する卵から、該菌体結合型グ
ルコシルトランスフェラーゼに対する抗体としての免疫
グロブリンを調製する工程と、を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体の製造
方法。
【請求項４】請求項１に記載の抗体を有効成分とするう
蝕予防剤の製造方法であって、Ａ）以下の理化学的特性：作用及び基質特異性；スクロースに作用し、水に不溶性のグルカンを合成す
る。至適pH: pH6.7〜7.0 作用適温の範囲； 15〜50℃ 失活の条件； 80℃、５分間の処理で失活する。分子量； SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した
分子量が、150k〜165kダルトンである。免疫原性；動物において免疫原となり、該酵素に対する特異抗体を
生成させ得る。を有する菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼを生
産する血清型がｃ、ｅまたはｆであるストレプトコッカ
ス・ミュータンスを培養し、培養菌体を培養液と分離す
る工程と、Ｂ）該培養菌体から前記菌体結合型グルコシルトランス
フェラーゼを抽出する過程と、Ｃ）該菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼを鶏に
免疫する工程と、Ｄ）該免疫された鶏が産生する卵から、該菌体結合型グ
ルコシルトランスフェラーゼに対する抗体としての免疫
グロブリンを調製する工程と、Ｅ）該菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼに対す
る抗体としての免疫グロブリンを有効成分としてう蝕予
防剤を製剤化する工程を有することを特徴とするう蝕予防剤の製造方法。