JP2509536B2 - アルカリセルラ―ゼを産生する微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なアルカリセルラー
ゼを産生する微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、従
来、バイオマス資源、特にセルロース資源の有効利用を
一大目標として進められてきた。セルラーゼ生産菌とし
て分離されてきた菌株は多種類にわたり、アスペルギル
ス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、フザリウム
属、フミコーラ属、アクレモニウム属等の糸状菌を中心
に、シュウドモナス属、セルロモナス属、ルミノコッカ
ス属、バチルス属等の細菌、更に、ストレプトマイセス
属、サーモアクチノマイセス属等の放線菌でも報告され
ている。しかしながら、現時点では、バイオマス用セル
ラーゼの工業的規模での利用は、多くはない。

【０００３】一方、セルラーゼの新規な産業的用途とし
て、衣料用洗浄剤の配合成分としての利用が検討され注
目を集めている（特公昭５９−４９２７９号公報、特公
昭６０−２３１５８号公報、特公昭６０−３６２４０号
公報）。しかし、自然界に於いて、微生物の産生するセ
ルラーゼのほとんどが、中性乃至酸性領域に於いて最大
且つ安定な酵素活性を示す、所謂中性若しくは酸性セル
ラーゼに分類されるものであって、衣料用洗浄剤組成物
中に配合するための条件を有するセルラーゼ、即ち、ア
ルカリ領域で最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐性
を有する、所謂アルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セ
ルラーゼの存在は極めて少ないのが実情である。ここで
アルカリセルラーゼとは、至適pHがアルカリ領域にある
ものをいい、アルカリ耐性セルラーゼとは、至適pHは中
性から酸性領域にあるが、アルカリ領域に於いても至適
pHに於ける活性に比較して十分に活性を有しかつ安定性
を保持するものをいう。また、中性とはpH６〜８の範囲
をいい、アルカリ性とはこれより高いpH範囲を言う。

【０００４】即ち、従来、衣料用洗浄剤組成物に於いて
使用し得るアルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラ
ーゼの生産方法としては、好アルカリ性バチルス属細菌
の培養によりセルラーゼＡを採取する方法（特公昭５０
−２８５１５号公報）、セルロモナス属に属する好アル
カリ性細菌を培養してアルカリセルラーゼ３０１−Ａを
生産する方法（特開昭５８−２２４６８６号公報）、好
アルカリ性バチルスＮｏ．１１３９を培養してカルボキ
シメチルセルラーゼを生産する方法（Ｆｕｋｕｍｏｒ
ｉ，Ｆ．，Ｋｕｄｏ，Ｔ．ａｎｄ Ｈｒｏｉｋｏｓｈ
ｉ，Ｋ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３
１，３３３９（１９８５））及びストレプトマイセス属
の一種を用いてアルカリセルラーゼを生産する方法（特
開昭６１−１９４８３号公報）が報告されているに過ぎ
ず、しかもいずれも工業的発酵生産に適うものでは無か
った。

【０００５】ところが最近、本発明者らは好アルカリ性
細菌の一種であるバチルス エスピー ＫＳＭ−６３５
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−６３５）（ＦＥＲ
ＭＰ−８８７２）が衣料用洗浄剤配合成分として適した
アルカリセルラーゼＫを収率良く生産すること及び更に
培養条件を選択することにより、より生産性が高まり、
アルカリセルラーゼの工業的発酵生産が可能となること
を見出した。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記バ
チルス エスピー ＫＳＭ−６３５の培養条件は、必ず
しも工業的に有利なものといえない。すなわち、好アル
カリ性菌株は培養中、pHをアルカリ性に保ち続ける必要
があるが、現在までのところ、好アルカリ性菌株を用い
る所謂アルカリ性発酵法の歴史は浅く、通常の中性微生
物と比較するとこれら好アルカリ性微生物の生理、生化
学についての知見は十分に蓄積されておらず、工業的発
酵生産を行うにあたっての培地調製、培養方法が操作上
の難点となっていた。更に、前述した報告例のうち、至
適pHがアルカリ領域にある本来のアルカリセルラーゼと
しては、バチルス Ｎ１菌株、Ｎ２菌株、Ｎ３菌株（特
公昭５０−２８５１５号公報）の生産する、至適pHがそ
れぞれ８〜９、９、８〜９の酵素、バチルス Ｎｏ．１
１３９の生産する至適pH９のもの及びバチルス エスピ
ー ＫＳＭ−６３５の産生する至適pH１０のアルカリセ
ルラーゼＫ（特願昭６１−２５７７７６号公報）が存在
するが、更に洗浄剤組成物に配合し用いることのできる
至適pHがアルカリ側にあり、かつその作用pH範囲の広い
アルカリセルラーゼの提供が求められていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】斯かる実情において本発
明者らは中性培地で生育し、しかも作用の優れたアルカ
リセルラーゼを産生することのできる菌株を得べく種々
研究を行った。

【０００８】斯かる問題点を解決するには、中性領域で
生育する菌株を宿主として、該当するセルラーゼ遺伝子
をクローニングする、所謂遺伝子組換えの手法を取るこ
とも可能であるが、アルカリ領域に至適pHを有するアル
カリセルラーゼを生産する中性微生物を自然界に探索
し、これを分離することがより有効である。しかして、
本発明者らは上記微生物を自然界に求めた結果、一群の
バチルス属に属する微生物は中性培地に於いて生育する
にもかかわらず、一定のアルカリセルラーゼを産生する
ことを見出した。

【０００９】本発明のアルカリセルラーゼを産生する微
生物は、本発明者が栃木県日光市の土壌より分離し、工
業技術院微生物工業技術研究所へ寄託した、バチルス・
エスピー ＫＳＭ−５２２（ＦＥＲＭ Ｐ−９３７０）
である。

【００１０】この菌株は、下に示すような菌学的性質を
示す。なお、菌株の分類には、次に示す１〜２２の培地
を用いた（表示は、重量％）。

【００１１】培地１．肉エキス，１．０；バクトペプト
ン，１．０；ＮａＣｌ，０．５；バクト寒天，１．５
（pH７．２） 培地２．肉エキス，１．０；バクトペプトン，１．０；
ＮａＣｌ，０．５（pH７．２） 培地３．肉エキス，１．０；バクトペプトン，１．０；
ＮａＣｌ，０．５，ゼラチン，１．０（pH７．２） 培地４．バクトリトマスミルク，１０．０ 培地５．バクトプペトン，１．０；ＫＮＯ₃ ，０．１ 培地６．バクトペプトン，１．０；ＮａＮＯ₃ ，０．１ 培地７．バクトペプトン，０．７；ＮａＣｌ，０．５；
ブドウ糖，０．５（pH７．０） 培地８．バクトペプトン，１．０ 培地９．ＴＳＩ寒天（栄研化学社製）：指示量 培地10．肉エキス，１．０；バクトペプトン，１．０；
ＮａＣｌ，０．５；可溶性澱粉，０．２；寒天，１．５

【００１２】培地11．ＮａＮＨ₄ＨＰＯ₄・４Ｈ₂Ｏ，
０．１５；ＫＨ₂ＰＯ₄，０．１；ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，
０．０２；クエン酸ナトリウム，０．２５（pH６．８） 培地12．クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）培
地（栄研化学社製）：指示量 培地13．ブドウ糖，１．０；ＫＨ₂ＰＯ₄，０．１；Ｍｇ
ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．０５；ＫＣｌ，０．０２；窒素
源，０．１（pH７．２） 窒素源は、硝酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムを用い
た。 培地14．キングＡ培地“栄研”（栄研化学社製）：指示
量 培地15．キングＢ培地“栄研”（栄研化学社製）：指示
量 培地16．尿素培地“栄研”（栄研化学社製）：指示量 培地17．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日水
製薬社製） 培地18．３％過酸化水素水 培地19．ＯＦ基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社製）：指示量 培地20．（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄，０．１；ＫＣｌ，０．０
２；ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．０２；酵母エキス，０．
０２；バクト寒天，２．０；ＢＣＰ（０．２％溶液），
０．４

【００１３】培地21．バクト・サブロー・デキストロー
ス寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）：指示量 培地22．スキムミルク，５．０； バクト寒天，１．５

【００１４】（菌学的性質） （ａ）顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、０．５〜０．８μm ×１．０〜２．０
μm の桿菌であり、菌体の中央準端に卵円形又は円柱系
の内生胞子（０．５〜０．８μm ×１．０〜１．２μm
）を作る。周鞭毛を有し運動性がある。グラム染色は
陽性。抗酸性はない。

【００１５】（ｂ）各種培地に於ける生育状態 １．肉汁寒天平板培養（培地１） 良く生育する。集落の形状は円形であり、表面は粗造、
周縁は円滑又は波状である。また、集落の色調は淡黄色
半透明で、硬度は脂状である。 ２．肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育する。その状態は拡布状で光沢が有り、乳白色又は
淡黄色で半透明である。 ３．肉汁液体培養（培地２） 生育し混濁する。 ４．肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 上層部に生育し、ゼラチンの液化が認められる。 ５．リトマスマルク培地（培地４） ミルクの液化が認められるがリトマスの変色は認められ
ない。

【００１６】（ｃ）生理学的性質 １．硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５，６） ともに陰性。 ２．ＭＲテスト（培地７） 陽性。 ３．ＶＰテスト（培地７） 陽性。 ４．インドールの生成（培地８） 陰性。 ５．硫化水素の生成（培地９） 陰性。

【００１７】６．澱粉の加水分解（培地１０） 陰性。 ７．クエン酸の利用（培地１１，１２） クリステンセン培地で陽性、コーサ培地では陰性か陽性
か特定できない。 ８．無機窒素源の利用（培地１３） 硝酸塩、アンモニウム塩とも陰性。 ９．色素の生成（培地１４，１５） キングＢ培地で水溶性の黄色色素を生成する。 10．ウレアーゼ（培地１６） 陰性。

【００１８】11．オキシダーゼ（培地１７） 陰性、陽性ははっきりせず。 12．カタラーゼ（培地１８） 陽性。 13．生育の範囲（培地２） 生育の温度範囲は１０〜５０℃で、生育最適温度範囲は
２０〜４０℃である。生育のpH範囲は５〜１０で、生育
最適pH範囲はpH６〜１０である。

【００１９】14．酸素に対する態度 好気性 15．Ｏ−Ｆテスト（培地１９） 酸化。 16．糖類からの酸及びガスの生成（培地２０） （＋：生成、−：生成せず）

【００２０】

【表１】 酸の生成 ガスの生成 １．Ｌ−アラビノール ＋ − ２．Ｄ−キシロース ＋ − ３．Ｄ−グルコース ＋ − ４．Ｄ−マンノール ＋ − ５．フラクトース ＋ − ６．Ｄ−ガラクトース ＋ − ７．麦芽糖 − − ８．ショ糖 ＋ − ９．乳糖 − − 10．トレハロース ＋ − 11．Ｄ−ソルビット − − 12．Ｄ−マンニット ＋ − 13．イノシット − − 14．グリセリン ＋ − 15．デンプン − −

【００２１】17．ＶＰ培地に於けるpH（培地７） pH５．０〜５．２（７日目）。 18．食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変） ５％，７％及び１０％ＮａＣｌ存在中でいずれも生育す
る。 19. pH５．７に於ける生育（培地２１） 生育する。 20．カゼインの分解（培地２２） 陽性。

【００２２】以上の分類学的考察から判断して、ＫＳＭ
−５２２株は容易に有胞子桿菌であるバチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属の一種であると認められる。そして更
に、菌学的性質について、バージーズ・マニュアル・オ
ブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ Ｍａｎｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版及びザ・
ジーナス・バチルス（“Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ”Ｒｕｔｈ，Ｅ．Ｇｏｒｄｏｎ Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｈａｎｄ−ｂｏｏｋ Ｎｏ．４２７，Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉ
ｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒｅ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，
（１９７３））を参照し比較、検索すると、この菌株
は、最近、掘越と秋葉（“Ａｌｋａｏｌｐｈｉｌｉｃ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”，Ｊａｐａｎ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｔｏｋ
ｙｏ），１９８２年刊）の主張している、所謂好アルカ
リ性（Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ）微生物、即ちpH８以
上のアルカリ培地に於いて生育し、これ以下の中性pH領
域で生育出来ない微生物に属するものでなく、弱酸性領
域からアルカリ領域（pH５〜１０）に於いて生育可能
な、一般的な中性で生育するバチルス属微生物と判断で
きる。

【００２３】更にこの菌株を他の公知のバチルス属の菌
株と比較すると、最も類縁の種としてバチルス・プミル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）が挙げられ
る。しかしながら、公知のバチルス・プミルスに属する
菌株は、少なくともアルカリセルラーゼを産生しないの
で、本菌株は新菌株と判断し、バチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−５２２と命名して工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託した（ＦＥＲＭＰ−９３７０）。本発明の菌株
を用いてアルカリセルラーゼを得るには、培地に菌株を
接種し、常法に従って培養すれば良い。培地中には、資
化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくこ
とが好ましい。この炭素源及び窒素源については特に制
限はないが、その例としては、窒素源としてコーングル
テンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ
酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉
エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンソイ
ビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベータ、
アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、アジックスな
どが挙げられる。また、炭素源としては、籾殻、麩、濾
紙、一般紙類、おが屑等の植物繊維質、廃糖蜜、転化
糖、ＣＭＣ、アビセル、セルロース綿、キシラン、ペク
チンに加え、資化し得る炭素源、例えばアラビノース、
キシロース、グルコース、マンノース、フラクトース、
ガラクトース、ショ糖、トレハロース、マンニット、グ
リセリンや資化し得る有機酸、例えば、クエン酸や酢酸
などが挙げられる。また、その他、リン酸、Ｍｇ²⁺，Ｃ
ａ²⁺，Ｍｎ²⁺，Ｚｎ²⁺，Ｃｏ²⁺，Ｎａ⁺，Ｋ⁺等の無機塩
や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適
宜添加することもできる。

【００２４】斯して得られた培養物中からの目的物質で
あるアルカリセルラーゼの採取及び精製は、一般の酵素
の採取及び精製の手段に準じて行うことができる。即
ち、遠心分離又は濾過等の通常の固液分離手段により菌
体を培養液から除去して粗酵素液を得ることができる。
この粗酵素液は、そのまま使用することもできるが、必
要に応じて塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段に
より粗酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化し
て、精製酵素として使用することも可能である。

【００２５】斯くして得られた本発明のアルカリセルラ
ーゼ Ｋ−５２２は、以下に示す酵素学的性質を有す
る。なお、酵素活性の測定は、以下の方法に従って行
い、次の緩衝液を用いた。

【００２６】pH３〜８ マクルベイン緩衝液 pH８〜１１ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 pH１２〜１３ 塩化カルシウム−水酸化ナトリウム緩衝
液

【００２７】酵素活性測定法： （１）ＣＭＣアーゼ活性 １０mgＣＭＣ（Ａ−０１Ｌ，山陽国策パルプ社製）、１
００μmol 各種緩衝液（マクルベイン、リン酸、グリシ
ン−ＮａＯＨ等）を含む基質溶液０．９mlに０．１mlの
酵素溶液を加え、３０℃、２０分反応した。反応後、
３，５−ジニトロ−サリチル酸（３．５−ｄｉｎｉｔｒ
ｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮＳ））法にて
還元糖の定量を行った。すなわち、反応液１．０mlにＤ
ＮＳ試薬１．０mlを加え、５分間、１００℃で加熱発色
させ、冷却後、４．０mlの脱イオン水を加えて希釈し
た。これを波長５３５nmで比色定量した。酵素力価は、
上記の条件下で１分間に１μmol のグルコースに相当す
る還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

【００２８】 （２）ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性 ０．１μmol ｐ−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ
社製）と、５０μmolリン酸緩衝液（pH７．０）又は１
００μmol グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（pH９．０）とを
含む反応液１．０ml中に適当量の酵素液を３０℃で作用
させた後、１ＭＮａ₂ＣＯ₃を０．３ml、脱イオン水を
１．７ml順次加え、遊離するｐ−ニトロフェノールを４
００nmで比色定量した。酵素力価は上記の条件下で１分
間に１μmol のｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素
量を１単位とした。

【００２９】（３）アビセル、セルロース粉末、リン酸
膨潤セルロース、アルカリ膨潤セルロース及び濾紙分解
活性 １５mgアビセル（メルク社製）、１５０μmol グリシン
−ＮａＯＨ緩衝液（pH９．０）を含む反応液１．５ml中
に適当量の酵素液を加え、３０℃、２８０rpmで振とう
しながら作用させた。反応後、冷却遠心分離（５℃、３
０００rpm 、２０分）を行い、その上清１．０mlを３，
５−ジニトロ−サリチル酸（３，５−ｄｉｎｉｔｒｏ−
ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮＳ））法にて還元
糖の定量を行った。セルロース粉末分解活性はセルロー
ス粉末（東洋濾紙社製）をリン酸膨潤セルロース分解活
性、アルカリ膨潤セルロース分解活性はトミタらの方法
（Ｔｏｍｉｔａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎ
ｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．；５２，２３５，１９７４）によ
り処理したセルロースを、濾紙分解活性は濾紙（セルラ
ーゼ活性度検定用濾紙、東洋Ｎｏ．５１−特）をそれぞ
れ用い、アビセラーゼ活性の時と同様に行った。酵素力
価は、上記の条件下で１分間に１μmol のグルコースに
相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

【００３０】（４）セロビアーゼ活性 １０mgセロビオース（関東化学社製）、１００μmol グ
リシン−ＮａＯＨ緩衝液（pH９．０）を含む反応液１．
０ml内に適当量の酵素液を３０℃で作用させた後、１０
０℃、５分間処理して酵素を失活させた後、生成グルコ
ース量をムタロターゼ・ＧＯＤ法（Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｃ
−Ｔｅｓｔ、和光純薬工業社製）で測定した。酵素力価
は、上記の条件下で１分間に２μmol のグルコースを生
成する酵素量を１単位とした。

【００３１】（酵素学的性質） （１）作用 ＣＭＣ、セルロース粉末、濾紙、アビセル等の繊維素に
よく作用し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元
糖を生成する。

【００３２】（２）基質特異性 本酵素は、ＣＭＣのほかにも、セルロース粉末、リン酸
膨潤セルロース、アルカリ膨潤セルロース、アビセル、
濾紙及びｐ−ニトロフェニルセロビオシドに対する活性
を有していた。

【００３３】（３）作用pH及び至適pH 作用pH範囲は、３〜１２．５と極めて広範囲であった。
至適pHは、７〜１０と幅広く、pH４．５〜１０．５の範
囲に於いても至適pHに於ける活性の５０％以上の相対活
性を有しており、従って過去に研究されたアルカリセル
ラーゼの中でも最もアルカリ側で十分活性が発揮される
酵素といえる（図１）。

【００３４】（４）pH安定性 各々のpHで３０℃、１時間保持した後の残存活性を測定
し、pH安定性を調べた。その結果、pH５〜１２で極めて
安定で失活せず、pH４．５〜１２．５に於いても、約５
０％以上の活性を維持していた。本酵素は、このように
高アルカリ領域に於いても十分に安定である（図２）。

【００３５】（５）最適温度 作用温度は、１５〜８０℃の広範囲にわたり、その至適
温度は６０℃であった。また、４５〜６５℃の範囲に於
いても、至適温度での活性の５０％以上を有していた
（図３）。

【００３６】（６）温度安定性 至適pHに於いて、３０分間各温度で処理した後、残存活
性を測定した結果、４０℃では安定しており、５５℃に
於いても約５０％の残存活性を有していた（図４）。

【００３７】（７）分子量 本酵素をバイオゲルＰ−１５０（バイオラッドラボラト
リーズ社製）によるゲル濾過法に基づき分子量を測定し
たところ、約３．５万であった。

【００３８】（８）金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン（Ａｌ³⁺，Ｆｅ³⁺，Ｂ
ａ²⁺，Ｃａ²⁺，Ｃｄ²⁺，Ｃｏ²⁺，Ｃｒ²⁺，Ｃｕ²⁺，Ｆｅ
²⁺，Ｈｇ²⁺，Ｍｎ²⁺，Ｍｏ²⁺，Ｎｉ²⁺，Ｐｂ²⁺，Ｚ
ｎ²⁺，Ｌｉ⁺，Ｋ⁺，Ｎａ⁺）を活性測定時に共存させ
て、その影響を検討した（Ｋ⁺，Ｎａ⁺については濃度を
５０mMとし、他のイオンについては、１mMとした）。そ
の結果、Ｈｇ²⁺で阻害が認められた。

【００３９】（９）界面活性剤の影響 各種界面活性剤（例えば、ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯ
Ｓ、α−ＳＦＥ、ＳＡＳ、石鹸、ポリオキシエチレンセ
カンダリアルキルエーテル）の酵素活性に及ぼす影響を
調べた。本酵素を界面活性剤０．０５％溶液で３０℃、
１５分間処理後、活性測定を行った。その結果、何れの
界面活性剤によってもほとんど阻害を受けなかった。強
力なデタージエントであるソデイウム・ドデシルサルフ
ェートによっても活性の阻害は認められなかった。

【００４０】（10）プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ−２１（昭和電工社
製）、マクサターゼ（ギスト社製）及びアルカラーゼ
（ノボ社製）を、活性測定時に共存（０．１mg／ml）さ
せてその影響を調べたところ、何れのプロテアーゼに対
しても強い耐性を有することがわかった。

【００４１】（11）キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、トリポリリン酸
ソーダ、ゼオライト、クエン酸を活性測定時に共存さ
せ、その影響を検討したが、ほとんど阻害が認められな
かった。

【００４２】

【発明の効果】本発明の微生物により得られるアルカリ
セルラーゼは、従来のアルカリセルラーゼに比較して高
アルカリ側（pH１０）に至適pHを有している。その上、
pH７．０〜１０の範囲に於いて、至適pHを有しており、
更に広い範囲に於いて極めて安定である。また、界面活
性剤、プロテアーゼ、キレート剤等の洗浄剤配合成分に
よってもほとんど阻害を受けない。従って、本酵素は洗
浄剤組成物の配合成分として有利に使用することができ
るものである。

【００４３】更に、本発明の微生物は中性で生育するの
で、好アルカリ性菌株と比べ容易にアルカリセルラーゼ
を工業的に生産することができる。

【００４４】

【実施例】以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明する。

【００４５】実施例１ 栃木県日光市の土壌を薬匙一杯（約０．５ｇ）取り、こ
れを滅菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理
した。この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒
天培地（培地１）に塗布した。次いで、これを３０℃に
て３日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にＣＭ
Ｃの溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、ＣＭ
Ｃアーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を液体培地
（培地２）に接種し、３０℃で３日間振とう培養した。
培養後、遠心分離した上清液についてＣＭＣアーゼ活性
を、pH３〜１３にて測定し、アルカリセルラーゼ生産菌
をスクリーニングした。上述の方法により、本発明のＫ
ＳＭ−５２２株（ＦＥＲＭ Ｐ−９３７０）を取得する
ことができた。

【００４６】

【表２】 培地１． ＣＭＣ ２％ ポリペプトン ０．５％ 酵母エキス ０．０５％ ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ ０．２５％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２％ 寒天 ０．７５％ pH６．８

【００４７】

【表３】 培地２． ＣＭＣ １％ ポリペプトン １％ 酵母エキス ０．５％ ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ ０．２５％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２％ pH６．８

【００４８】参考例１ 実施例１で得たバチルス エスピー ＫＳＭ−５２２株
を同実施例の液体培地２に接種し、３０℃で３日間振と
う培養した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素
液を得た。この粗酵素液１リットルに対してドライアイ
ス−エタノール中で、３リットルのエタノールを加え、
生じた沈澱を遠心分離し、更に凍結乾燥を行い、乾燥粉
末として、アルカリセルラーゼ Ｋ−５２２（比活性＊
２３単位／ｇ）８ｇを得た。 ＊酵素活性はpH９に於ける測定値である（以下同じ）。

【００４９】参考例２ ＣＭＣを１％ショ糖に代え、ポリペプトンを７％ＣＳＬ
に代える以外は実施例１の液体培地２と同じ組成の培地
にＫＳＭ−５２２株を接種し、３０℃で２日間振とう培
養した。この培養物を遠心分離し、得られた上清のＣＭ
Ｃアーゼ活性を測定したところ１５０単位／ｌであっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】アルカリセルラーゼ Ｋ−５２２の酵素反応pH
と相対活性の関係を示す図面である。

【図２】同酵素の処理pHと相対活性の関係を示す図面で
ある。

【図３】同酵素の反応温度と相対活性の関係を示す図面
である。

【図４】同酵素の処理温度と相対活性の関係を示す図面
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 伊藤 進 栃木県宇都宮市東峰町3441−64 (72)発明者 岡本 暉公彦 埼玉県越谷市七左町１−229−８

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルカリセルラーゼ Ｋ−５２２を生産
   する能力を有し、微工研菌寄第９３７０号として寄託さ
   れたバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．) Ｋ
   ＳＭ−５２２。