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JP2024538872A - Ｒｎａワクチン脂質ナノ粒子 - Google Patents

Ｒｎａワクチン脂質ナノ粒子 Download PDF

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JP2024538872A JP2024521174A JP2024521174A JP2024538872A JP 2024538872 A JP2024538872 A JP 2024538872A JP 2024521174 A JP2024521174 A JP 2024521174A JP 2024521174 A JP2024521174 A JP 2024521174A JP 2024538872 A JP2024538872 A JP 2024538872A
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Abstract

RNAワクチンとして有用な組換え発現ベクターが開示される。また、組換え発現ベクターのための薬学的に許容される担体、特に脂質ナノ粒子も開示される。

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、2021年10月7日に出願された米国仮特許出願第63/253,489号の利益を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された資料の参照による組込み
本明細書と同時に提出され、以下の通りに識別されるコンピュータ可読のヌクレオチド/アミノ酸配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる:2022年10月6日の日付の「764862_ST26.XML」という名称の86,367バイトの1つのXMLファイル。
本発明の分野は、RNAワクチン、特に脂質ナノ粒子中に製剤化されたもののための方法及び組成物に関する。
RNAワクチンは、種々の病原体のいずれかによって引き起こされる処置又は予防のために有用でありうる。この分野の進歩にもかかわらず、RNAワクチン開発の課題としては、薬学的に許容される担体の安定性の提供及び維持、組換え発現ベクターの多用途性、並びに実際的な製造方法を挙げることができる。RNAワクチン組成物を首尾良く凍結乾燥させる取り組みは、更なる課題となる可能性がある。したがって、改良されたRNAワクチン組成物及びそれらを製造する方法に対しては需要がある。
本発明の一態様は、(a)ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)5'非翻訳領域(5'-UTR);(b)VEEV非構造タンパク質nsP1、nsP2、nsP3及びnsP4をコードするヌクレオチド配列;(c)VEEV 26Sサブゲノムプロモーター;(d)操作されたマルチクローニングサイト(MCS);(e)VEEV 3'非翻訳領域(3'-UTR);並びに(f)VEEVポリA配列をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本発明の一態様による自己増幅性mRNAのための合成クローニングベクター(PNI V101)のマップである。このベクターは、自己複製機構を、目的の遺伝子を含む裸の陽性鎖アルファウイルスRNAレプリコンを生成しうる大きなサイズのsaRNAの合成を可能にするためにクローニングベクター内に組み込まれた操作されたマルチクローニングサイト(MCS)を有するポリ(A)尾部と共に含む。 SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードする3822bpの遺伝子配列の挿入を伴うPNI V101ベクターの直鎖化を示す概略図である。PmeI直鎖化(図の上部)により、ポリ(A)尾部の後に11ヌクレオチドの平滑末端オーバーハングが生成される。ポリ(A)尾部の末端でのBspQI直鎖化により、3個のチミンヌクレオチドによる付着末端が生じる。 PNI V101に由来するnCoV抗原がコードされた自己増幅性mRNA(saRNA)に関するインビトロ発現レベルを示すゲルの写真である。このゲルは、第1及び第2世代の自己増幅性mRNA(saRNA)がトランスフェクトされたヒト胚性腎細胞におけるSARS-CoV-2スパイクタンパク質発現の差異を示している。ベータアクチン、トランスフェクションなし、及びPNI516 VACCMIX-B LNPにおける陽性対照の市販スパイクタンパク質配列nCov CleanCap AUを対照として用いた。 nCoV抗原がコードされたsaRNA及び対照に関するインビトロ発現レベル、並びにVEEV nsp2に関するタンパク質発現のレベルを示すゲルの写真である。 第1及び第2世代のA1及びA3、並びにA4及びA5タイプのワクチンベクターLNPから合成されたsaRNAのサイズ及びPDIの結果(左のグラフ)及び封入効率(右のグラフ)を示すグラフを示している。 PNI V101ベクター中に種々のnCoVスパイクタンパク質抗原デザインをコードするsaRNAによる処置後の抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質特異的IgGレベルを示すグラフである。 PNI V101ベクター中に種々のnCoVスパイクタンパク質抗原デザインをコードするsaRNAによる処置後のインビボでの抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質特異的IgGレベルを示すグラフである。 PNI V101ベクター中に種々のnCoVスパイクタンパク質抗原デザインをコードするsaRNAによる処置後の血清抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質IgG力価を示すグラフである。 PNI V101ベクター中に種々のnCoVスパイクタンパク質抗原デザインをコードするsaRNAによる処置後の血清抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質IgG力価を示すグラフである。 プソイドビリオン中和アッセイ(PNA)の結果を示すグラフである。 PNI V101ベクター中に種々のnCoVスパイクタンパク質抗原デザインをコードするsaRNAによる処置後の血清抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質特異的IgGレベルのデータを示すグラフである。 SARS-CoV-2武漢株ウイルスに対するCD4陽性T細胞応答に関するIFNガンマ+、TNFアルファ、及びIL2+細胞の頻度(パーセンテージ)を示すグラフである。 種々のマーカー(IL2+;IFNガンマ+、及びTNFアルファ+)にわたる、ワクチンベクターLNP、A4及びA5タイプに対するCD8陽性T細胞応答と、PBS又は裸のsaRNA対照に対するものとの比較を示すグラフである。 NP6及びNP8並びに様々な抗原ベクターワクチンに関する血清抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質特異的IgGレベルを示すグラフである。 種々のイオン化可能脂質に関するワクチンベクターLNPのサイズ及びPDIを示すグラフである。 図13Aに記載された試料に関する封入効率を示すグラフである。 11種類のイオン化可能脂質ワクチンベクターLNPのうちの1つをNP6及びNP8で投与されたマウスの血清中のSARS Cov-2スパイクタンパク質特異的IgGレベルを示すグラフである。特異的抗原成分はA3であった。 陽性対照、陰性対照、eGFP PNI V101 saRNA、及びeGFP B18R PNI V101で処置されたHEK293細胞のエレクトロポレーション24時間後の蛍光顕微鏡試験の結果を示す画像である。 陽性対照、陰性対照、eGFP PNI V101 saRNAにより1ug及び4μgで処置されたHEK293細胞のエレクトロポレーション24時間後の蛍光顕微鏡試験の結果を示す画像である。 リポフェクタミン2000対照で処置されたBHK細胞(上の列)及びeGFP saRNAの明視野及び緑色フィルター蛍光顕微鏡試験の結果を示す画像である。 4μg、1μgのeGFP PNI V101、両方の濃度での陰性対照、GFP陽性対照、及びモックトランスフェクションに関する様々なMFIレベルでの細胞集団の試験の結果を示すグラフである。 PNI-v101に由来するH1N1 HA抗原がコードされたsaRNAに関するインビトロ発現レベルを示すゲルの写真である。 SARS NCov-2ウイルスアルファ変異株に関する血清希釈50でのプラーク減少中和検査を示すグラフである。 SARS NCov-2ウイルスのアルファ変異株に関する血清希釈90でのプラーク減少中和検査を示すグラフである。 SARS NCov-2ウイルスのベータ変異株に関する血清希釈50でのプラーク減少中和検査を示すグラフである。 SARS NCov-2ウイルスのデルタ変異株に関する血清希釈50でのプラーク減少中和検査を示すグラフである。 SARS NCov-2ウイルスのデルタ変異株に関する血清希釈90でのプラーク減少中和検査を示すグラフである。 約-80℃での10週間の貯蔵後の様々なイオン化可能脂質を有するLNPの粒径を示すグラフである。 約-80℃での10週間の貯蔵後の様々なイオン化可能脂質を有する様々なLNPの封入効率を示すグラフである。 -80℃での10週間の貯蔵後の様々なLNP製剤のsaRNAの完全性を示す電気泳動ゲルの画像である。 様々なLNP製剤によるHEK 293細胞の0.25μg/mL処置後のSARS-CoV-2スパイクタンパク質濃度を示すグラフである。 表34のワクチンベクターLNPのサイズ及びPDIを示すグラフである。 表34のワクチンベクターLNPの封入効率を示すグラフである。 貯蔵なし、1週間の貯蔵後、及び1か月間の貯蔵後の、様々なイオン化可能脂質及び構造脂質を用いて調製されたLNPのサイズの安定性及びPDIを示すグラフである。 貯蔵なし、1週間の貯蔵後、及び1か月間の貯蔵後の、様々なイオン化可能脂質及び構造脂質を用いて調製されたLNPの封入効率の安定性を示すグラフである。 1週間の貯蔵後の、様々なイオン化可能脂質(PNI 516、PNI 585、及びPNI 560)及び様々な構造脂質を用いて調製されたLNPから抽出されたA5抗原を示すゲルの写真である。 1か月間の貯蔵後の、様々なイオン化可能脂質(PNI 516、PNI 585、及びPNI 560)及び様々な構造脂質を用いて調製されたLNPから抽出されたA5抗原を示すゲルの写真である。 1週間の貯蔵後(左)及び1か月間の貯蔵後(右)の、様々なイオン化可能脂質(PNI 542、PNI 580、PNI 563、及びPNI 586)及び様々な構造脂質を用いて調製されたLNPから抽出されたA5抗原を示すゲルの写真を示している。 マウス血清中のSARS-CoV-2に対する中和抗体を示すグラフである。記号及び横線はそれぞれ、各試料の個々の力価及び各群の平均力価を表す。血清力価もPRNT90に基づいて計算し、Log2希釈の逆数として表した。 PNI 516 LNP中に封入された種々の抗原がコードされたsaRNAにより処置された動物から得られた血清中のSARS-CoV-2スパイクタンパク質IgGレベルに対するネイティブ及びコドン最適化された抗原遺伝子配列の影響を示すグラフである。 種々の抗原がコードされたsaRNA PNI 516 LNPにより処置された動物から得られた血清中のSARS-CoV-2デルタ変異株を中和する効率を示すグラフである。 種々の抗原がコードされたsaRNA PNI 516 LNPにより処置された動物から得られた血清中のSARS-CoV-2オミクロン変異株を中和する効率を示すグラフである。 2種類のイオン化可能脂質組成物による脂質ナノ粒子中に封入されたPNI A5抗原により処置された非ヒト霊長類(NHP)におけるSARS-CoV-2特異的IgG力価のレベルを示すグラフである。 種々のタイプのイオン化可能脂質組成物による脂質ナノ粒子中に封入されたPNI A5抗原により処置された動物から得られた血清中のSARS-CoV-2デルタ変異株を中和する効率を示すグラフである。 種々のタイプのイオン化可能脂質組成物による脂質ナノ粒子中に封入されたPNI A5抗原により処置された動物から得られた血清中のSARS-CoV-2オミクロン変異株を中和する効率を示すグラフである。 PNI 516 LNP中に封入されたH1N1 HA saRNAによる処置後のinfluenza A/California/07/2009(H1N1)の赤血球凝集抑制(HAI)力価レベルを示すグラフである。 influenza A/California/07/2009(H1N1)HA PNI 516 LNP試料の流体力学的粒径を示すグラフである。 influenza A/California/07/2009(H1N1)HA PNI 516 LNP試料のゼータ電位を示すグラフである。 influenza A/California/07/2009(H1N1)HA PNI 516 LNP試料の封入効率(%EE)を示すグラフである。
本発明の組成物は、種々の利点のうちのいずれか1つ又は複数を提供することができる。RNAワクチンは生産時間が短いことから、COVID-2019ウイルスのような新たな脅威に迅速に対応するのに理想的でありうる。その上、核酸ベースのワクチンは、安全性及び有効性の点で、従来のワクチンを上回る利点がある可能性がある。メッセンジャーRNA(「mRNA」)ワクチンは、機能するために核膜を通過する必要があって、宿主ゲノムへの組込みのリスクがある、DNAベースのワクチンと比較して優れている可能性がある。自己増幅性mRNAワクチンは、各自己増幅性mRNAワクチンが複数のmRNAユニットを生成するため、mRNAワクチンよりも更に低用量で有効でありうる。自己増幅性mRNAは、他のmRNAワクチンと比較して、標的抗原の長期的な翻訳及び高収率という利点を提供しうる。
本発明の一態様は、ワクチンのための任意の所望のmRNA標的抗原をコードするために有用な組換え発現ベクターを提供する。本発明の一態様では、組換え発現ベクターはRNAである。一部の態様では、ベクターは、標的抗原をコードするRNAである。この標的抗原は、標的抗原を認識する免疫応答を誘発して、標的抗原に対する免疫を提供する。
組換え発現ベクターは、(a)ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)5'非翻訳領域(5'-UTR);(b)VEEV非構造タンパク質nsP1、nsP2、nsP3及びnsP4をコードするヌクレオチド配列;(c)VEEV 26Sサブゲノムプロモーター;(d)操作されたマルチクローニングサイト(MCS);(e)VEEV 3'非翻訳領域(3'-UTR);並びに(f)VEEVポリA配列をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含みうる。
本発明の一態様では、VEEVポリA配列をコードするヌクレオチド配列は、38から40塩基対、38から39塩基対、39から40塩基対、又は38、39、又は40塩基対を含む。このポリA塩基対の長さは、所望のポリ(A)尾部の長さを有する様々な目的の遺伝子をコードする自己増幅性mRNA(saRNA)のインビトロ無細胞合成のために有用である。これはまた、任意のインビボ哺乳動物細胞系において様々な目的の遺伝子をコードするレプリコンRNAのマイナス鎖合成をもたらすレプリコンRNAの安定性も助長する。
本発明の一態様では、VEEV 26Sサブゲノムプロモーターは、VEEV TC83株26Sサブゲノムプロモーターである。
本発明の一態様では、目的の遺伝子(GOI)は、MCSで挿入可能である。GOIは限定されない。GOIは、単一の遺伝子エレメント又は複数の遺伝子エレメントカセット形式のいずれかにある、目的の任意のレポーター又は治療標的遺伝子でありうる。GOIは、治療目標、例えば、免疫化を達成するために発現を意図する1つの遺伝子エレメント又は複数の遺伝子エレメントであってもよい。本発明の一態様では、GOIは、ワクチンのための標的抗原をコードする。ベクターの投与後に、RNAはインビボで標的抗原ポリペプチドに翻訳される。標的抗原ポリペプチドは、レシピエントにおいて免疫応答を誘発することができる。
標的抗原は、病原体(例えば、細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫)に対する免疫応答を誘発しうるが、一部の態様では、それはアレルゲン又は腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発する。免疫応答は、抗体応答(通常はIgGを含む)及び/又は細胞媒介性免疫応答を含みうる。標的抗原ポリペプチドは、典型的には対応する病原体(又はアレルゲン若しくは腫瘍)ポリペプチドを認識する免疫応答を誘発するが、一部の態様では、ポリペプチドは糖類を認識する免疫応答を誘発するミモトープとして作用しうる。標的抗原は、典型的には表面ポリペプチド、例えば、アドヘシン、ヘマグルチニン、エンベロープ糖タンパク質、又はスパイク糖タンパク質などである。RNA分子は、単一のポリペプチド標的抗原又は複数のポリペプチドをコードすることができる。複数の標的抗原は、単一の標的抗原ポリペプチド(融合ポリペプチド)として、又は別個のポリペプチドとして提示されうる。標的抗原がレプリコンから別個のポリペプチドとして発現される場合には、これらのうちの1つ又は複数は、上流IRES又は追加のウイルスプロモーターエレメントと共に提供されうる。或いは、複数の標的抗原を、短い自己触媒性プロテアーゼ(例えば、口蹄疫ウイルス2Aタンパク質)と融合した個々の標的抗原をコードするポリタンパク質から、又はインテインとして発現させることもできる。ある特定の態様では、標的抗原ポリペプチド(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はそれ以上の標的抗原)を、単独で、又は1つ若しくは複数の標的抗原(ポリペプチド標的抗原と同じか又は異なる)をコードするRNA分子、例えば、自己複製性RNAと一緒に使用してもよい。
一部の態様では、標的抗原は、コロナウイルスに対する免疫応答を誘発する。コロナウイルス標的抗原としては、SARS CoV-1及びSARS-CoV-2に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、標的抗原は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の完全長の融合前形態であってもよい。GOIは、SARS-CoV-2アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、例えば、配列番号2～7のいずれか1つのヌクレオチド配列であってもよい。この点に関して、組換え発現ベクターは、操作されたMCSに挿入された配列番号2～7のいずれか1つのヌクレオチド配列を更に含みうる。一態様では、GOIは、コドン最適化されたヌクレオチド配列、例えば、配列番号3～7のいずれか1つのヌクレオチド配列であってもよい。コドン最適化されたSARS-CoV-2ヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞系において抗原発現の増加、中和抗体産生の増加、及びSARS-CoV-2感染に対する長期T細胞応答の改善のうちのいずれか1つ又は複数を提供しうる。
本発明の一態様では、組換え発現ベクターは、操作されたMCSに挿入された2シストロン性遺伝子エレメントを更に含み、ここで2シストロン性遺伝子エレメントは、(i)配列番号2～7のいずれか1つのヌクレオチド配列、及び(ii)配列番号9のヌクレオチド配列を含む。そのような2シストロン性遺伝子エレメントは、蛍光ベースの検出手法を使用した、哺乳動物細胞系におけるSARS-CoV-2スパイクタンパク質発現の検出を提供しうる。
本発明の一態様では、組換え発現ベクターは、操作されたMCSに挿入された2シストロン性遺伝子エレメントを更に含み、ここで2シストロン性遺伝子エレメントは、(i)SARS-CoV-2スパイクタンパク質アミノ酸配列又は改変されたSARS-CoV-2スパイクタンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、及び(ii)リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。改変されたSARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、改変されたSARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列が参照配列NC_045512.2(配列番号14)に比して1つ又は複数の変異を組み込んでいることを除き、参照配列NC_045512.2(配列番号14)のものと同じである。SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、SARS-CoV-2ウイルスの任意の株由来のSARS-CoV-2スパイクタンパク質でありうる。リーダー配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号8若しくは11のヌクレオチド配列、又は配列番号8若しくは11のヌクレオチド配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一な配列を含みうる。そのようなヌクレオチド配列は、翻訳された抗原タンパク質における抗原発現及び/又は免疫応答の強化を増強しうる。
本発明の一態様では、組換え発現ベクターは、操作されたMCSに挿入された2シストロン性遺伝子エレメントを更に含み、2シストロン性遺伝子エレメントは、(i)SARS-CoV-2スパイクタンパク質アミノ酸配列又は改変されたSARS-CoV-2スパイクタンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、及び(ii)3'非翻訳領域(UTR)を含む。改変されたSARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本発明の他の態様に関しては本明細書に記載された通りであってもよい。一態様では、3'UTRは、配列番号12又は配列番号13のヌクレオチド配列を含む。そのようなヌクレオチド配列は、抗原タンパク質の転写後RNA安定性及び/又は適正な翻訳の強化を増強しうる。
一部の態様では、標的抗原は、ヒトインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する。一部の態様では、標的抗原は、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)に対する免疫応答を誘発する。髄膜炎菌標的抗原としては、アドヘシン等の膜タンパク質、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、及びH因子結合性タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。3種の有用な髄膜炎菌ポリペプチドの組合せが、Giuliani et al., PNAS, 103(29): 10834-9 (2006)に開示されている。一部の態様では、標的抗原は、肺炎球菌(Streptococcus pneumonia)に対する免疫応答を誘発する。肺炎球菌標的抗原としては、WO2009/016515に開示されているもの、RrgB線毛サブユニット、ベータ-N-アセチル-ヘキソサミニダーゼ前駆体(spr0057)、spr0096、一般的なストレスタンパク質GSP-781(spr2021、SP2216)、セリン/トレオニンキナーゼStkP(SP1732)、及び肺炎球菌表面アドヘシンPsaAが挙げられる。
一部の態様では、標的抗原は、肝炎ウイルスに対する免疫応答を誘発する。肝炎ウイルス標的抗原としては、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)、C型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、又は肝炎Gウイルス抗原が挙げられる。一部の態様では、標的抗原は、ラブドウイルスに対する免疫応答を誘発する。ラブドウイルス標的抗原としては、ラブドウイルス、例えば、リッサウイルス(例えば、狂犬病ウイルス)及びベシクロウイルス(VSV)に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様では、標的抗原は、カリシウイルス(Caliciviridae)に対する免疫応答を誘発する。カリシウイルス標的抗原としては、カリシウイルス、例えば、ノーウォークウイルス(ノロウイルス)、並びにノーウォーク様ウイルス、例えば、ハワイウイルス及びスノーマウンテンウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の態様では、標的抗原は、トリ伝染性気管支炎(IBV)、マウス肝炎ウイルス(MHV)、及びブタ伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)に対する免疫応答を誘発する。一部の態様では、標的抗原は、レトロウイルスに対する免疫応答を誘発する。レトロウイルス標的抗原としては、オンコウイルス、レンチウイルス(例えば、HIV-I又はHIV-2)又はスプマウイルスに由来するものが挙げられる。一部の態様では、標的抗原は、レオウイルスに対する免疫応答を誘発する。レオウイルス標的抗原としては、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、又はコルティウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様では、標的抗原は、パルボウイルスに対する免疫応答を誘発し、その標的抗原としては、パルボウイルスB19に由来するものが挙げられる。
一部の態様では、標的抗原は、ヘルペスウイルスに対する免疫応答を誘発し、その標的抗原としては、ヒトヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)(例えば、HSV I型及び2型)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、エプスタイン・バー(EpsteinBarr)ウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6(HHV6)、ヒトヘルペスウイルス7(HHV7)、及びヒトヘルペスウイルス8(HHV8)に由来するものが挙げられる。
一部の態様では、標的抗原は、パポーバウイルスに対する免疫応答を誘発し、その標的抗原としては、パピローマウイルス及びアデノウイルスに由来するものが挙げられる。一部の態様では、標的抗原は、チクングニヤウイルスに対する免疫応答を誘発する。一部の態様では、標的抗原は、ジカウイルスに対する免疫応答を誘発する。
一部の態様では、標的抗原は、魚に感染するウイルスに対する免疫応答を誘発する。
真菌標的抗原は、皮膚糸状菌及び他の日和見菌に由来しうる。
一部の態様では、標的抗原は、プラスモジウム(Plasmodium)属由来の寄生虫、例えば、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、三日熱マラリア原虫(P. vivax)、四日熱マラリア原虫(P. malariae)又は卵形マラリア原虫(P. ovale)に対する免疫応答を誘発する。したがって、本発明の組成物は、マラリアに対する免疫化のために有用でありうる。一部の態様では、標的抗原は、ウオジラミ(Caligidae)科由来の寄生虫、特にレペオフティルス(Lepeophtheirus)属及びウオジラミ(Caligus)属由来のもの、例えば、シーライス、例えば、サケジラミ(Lepeophtheirus salmonis)又はウミシラミ(Caligus rogercresseyi)に対する免疫応答を誘発する。
一部の態様では、標的抗原は、がん細胞又は固形腫瘍に対して特異的なネオ抗原である。Peng, et al., Mol. Cancer, 18: 128 (2019)。
一部の態様では、標的抗原は、以下のものから選択される:(a)がん-精巣抗原、例えば、NY-ESO-I、SSX2、SCPI、並びにRAGE、BAGE、GAGE及びMAGEファミリーのポリペプチド、例えば、GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、及びMAGE-12(これらを使用して、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、NSCLC、乳房、胃腸、及び膀胱の腫瘍に対処することができる);(b)変異した抗原、例えば、p53(様々な固形腫瘍、例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がんと関連がある)、p21/Ras(例えば、黒色腫、膵がん及び結腸直腸がんと関連がある)、CDK4(例えば、黒色腫と関連がある)、MUMI(例えば、黒色腫と関連がある)、カスパーゼ-8(例えば、頭頸部がんと関連がある)、CIA 0205(例えば、膀胱がんと関連がある)、HLA-A2-R1701、ベータカテニン(例えば、黒色腫と関連がある)、TCR(例えば、T細胞非ホジキンリンパ腫と関連がある)、BCR-abl(例えば、慢性骨髄性白血病と関連がある)、トリオースリン酸イソメラーゼ、KIA 0205、CDC-27、及びLDLRFUT;(c)過剰発現される抗原、例えば、ガレクチン4(例えば、結腸直腸がんと関連がある)、ガレクチン9(例えば、ホジキン病と関連がある)、プロテイナーゼ3(例えば、慢性骨髄性白血病と関連がある)、WT I(例えば、様々な白血病と関連がある)、炭酸脱水酵素(例えば、腎がんと関連がある)、アルドラーゼA(例えば、肺がんと関連がある)、PRAME(例えば、黒色腫と関連がある)、HER-2/neu(例えば、乳がん、結腸がん、肺がん及び卵巣がんと関連がある)、マクログロブリン、アルファ-フェトプロテイン(例えば、肝細胞腫と関連がある)、KSA(例えば、結腸直腸がんと関連がある)、ガストリン(例えば、膵がん及び胃がんと関連がある)、テロメラーゼ触媒タンパク質、MUC-I(例えば、乳がん及び卵巣がんと関連がある)、G-250(例えば、腎細胞癌と関連がある)、p53(例えば、乳がん、結腸がんと関連がある)、及びがん胎児性抗原(例えば、乳がん、肺がん、及び消化管のがん、例えば、結腸直腸がんと関連がある);(d)共通抗原、例えば、黒色腫-メラノサイト抗原、例えば、MART-1/メランA、gp100、MCIR、メラノサイト刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質-I/TRPI及びチロシナーゼ関連タンパク質-2/TRP2(例えば、黒色腫と関連がある);(e)前立腺関連抗原、例えば、PAP、PSA、PSMA、PSH-PI、PSM-PI、PSM-P2、これらは例えば、前立腺がんと関連がある;(f)免疫グロブリンイディオタイプ(例えば、黒色腫及びB細胞リンパ腫と関連がある)。ある特定の態様では、腫瘍標的抗原としては、p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、エプスタイン・バーウイルス抗原、EBNA、E6及びE7を含むヒトパピローマウイルス(HPV)抗原、B型肝炎及びCウイルス抗原、ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23HI、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791 Tgp72、beta-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29&BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68&KPI、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-I、RCASI、SDCCAG16、TA-90(Mac-2結合タンパク質/シクロフィリンC関連タンパク質)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一態様では、組換え発現ベクターは、5'から3'の順に、以下の成分を含む:(a)VEEV 5'非翻訳領域(5'-UTR);(b)VEEV非構造タンパク質nsP1、nsP2、nsP3及びnsP4をコードするヌクレオチド配列;(c)VEEV 26Sサブゲノムプロモーター;(d)操作されたMCS;(e)VEEV 3'非翻訳領域(3'-UTR);並びに(f)VEEVポリA配列をコードするヌクレオチド配列。本発明の一態様では、MCSは、VEEVポリA配列をコードするヌクレオチド配列の5'末端又は3'末端に直接隣接して位置する。
本発明の一態様では、組換え発現ベクターは、ベクター骨格ColE、複製起点(ori)、tetプロモーター、及び1つ又は複数の抗生物質耐性遺伝子のうち1つ又は複数を含む。本発明の一態様では、組換え発現ベクターは、細菌ベクター骨格又は改変された細菌ベクター骨格を含む。本発明の一態様では、組換え発現ベクターは、5'UTRの5'末端に隣接するT7プロモーターを含む。
本発明の一態様による組換え発現ベクターの一例は、図1に示されている。図1は、「PNI V101」と命名されたベクターのベクターマップである。PNI V101は、任意のmRNA抗原に使用することができる自己集合性レプリコンを含む。好ましい一態様では、組換え発現ベクターは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスTC83レプリコンを、任意のGOIを挿入するためのマルチクローニングサイトを含むサブゲノムプロモーターと共に含む。PNI V101クローニングベクターの完全配列は、配列番号1に記載されている。本発明の一態様では、組換え発現ベクターは、配列番号1と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一なヌクレオチド配列を含む。
一部の態様では、ベクターは、自己増幅性RNA(「saRNA」)を含む。一部の態様では、核酸は、自己増幅性RNAを含むベクターを指す。組換え発現ベクターのインビボ投与後に、送達されたRNAは放出され、細胞の内部で翻訳されて、インサイチューで標的抗原をもたらす。ある特定の態様では、RNAはプラス("+")鎖であり、そのため、逆転写のような介在する複製工程を必要とすることなく細胞によって翻訳されうる。ある特定の態様では、RNAは自己複製性RNAである。自己複製性RNA分子(レプリコン)は、脊椎動物細胞に送達されるとタンパク質なしでも、それ自体からの転写によって(それ自体から生成されるアンチセンスコピーを介して)複数の娘RNAの産生を導く。自己複製性RNA分子は、したがって、ある特定の態様では、細胞への送達後に直接翻訳されうる(+)鎖分子であり、この翻訳はRNA依存性RNAポリメラーゼをもたらし、それは続いて、送達されたRNAからアンチセンス転写物及びセンス転写物の両方を産生する。したがって、送達されたRNAは、複数の娘RNAの産生を導く。これらの娘RNA、並びに同一線上にあるサブゲノム転写物は、それ自体に翻訳されて、コードされた標的抗原のインサイチュー発現をもたらすことができ、又は転写されて、送達されたRNAと同じセンスを有する更なる転写物をもたらし、それらが翻訳されて標的抗原のインサイチュー発現をもたらすこともできる。この一連の転写の全体的な結果は、導入されたレプリコンRNAの数の増幅であり、そのようにして、コードされた標的抗原は宿主細胞の主要なポリペプチド産物となる。
自己複製を達成するための1つの好適な系は、アルファウイルスをベースとするRNAレプリコンを使用することである。これらの(+)鎖レプリコンは細胞への送達後に翻訳されて、レプリカーゼ(又はレプリカーゼ-トランスクリプターゼ)を生じる。レプリカーゼはポリタンパク質として翻訳され、これは自己切断して複製複合体をもたらし、これが送達されたRNAの(+)鎖のゲノム(-)鎖コピーを作り出す。これらの(-)鎖転写物はそれ自体が転写されて、(+)鎖親RNAの更なるコピーを与え、また標的抗原をコードするサブゲノム転写物も与えることができる。このようにしてサブゲノム転写物の翻訳は、感染細胞による標的抗原のインサイチュー発現を導く。好適なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、又はより好ましくは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス等由来のレプリカーゼを使用することができる。このシステムは、一部の態様では、ハイブルッド性又はキメラ性レプリカーゼでありうる。図1は、本発明の一態様によるレプリコンを示し、哺乳動物細胞において自己増幅することができ、集合したmRNAを介して、免疫原性タンパク質、例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現することができる、PNI V101レプリコンを示している。図2には、ワクチンレプリコンのPme I及びBsPQI/Sap1サブタイプが示されている。
変異型又は野生型ウイルス配列、例えば、VEEVの弱毒化TC83変異体を、レプリコンに使用することができる。好ましい自己複製性RNA分子は、したがって、(I)自己複製性RNA分子からのRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼ、及び(ii)標的抗原をコードする。ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質nsPI、nsP2、nsP3及びnsP4のうちの1つ又は複数を含むアルファウイルスレプリカーゼでありうる。天然のアルファウイルスゲノムは、特定の態様では、非構造性レプリカーゼポリタンパク質に加えて構造ビリオンタンパク質をコードするが、本発明の態様の自己複製性RNA分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしない。したがって、特定の自己複製性RNAは、細胞内でそれ自体のゲノムRNAコピーの産生を導くことはできるが、RNAを含むビリオンの産生は導かない。野生型ウイルスにおける永続化のために必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明の態様の自己複製性RNAには存在せず、それらの場所は目的の標的抗原をコードする遺伝子によって占められ、その結果、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく標的抗原をコードする。本出願の後の部分では、これらの2種のレプリコンタイプであるPME及びBsPQI/Sap1は、抗原の後に「第1世代」又は「第2世代」と注記される。
したがって、本発明の態様で有用な自己複製性RNA分子は、2つのオープンリーディングフレームを有することができ、その一方はレプリカーゼをコードする、例えば、第1の(5')オープンリーディングフレームであり;他方のオープンリーディングフレームは、標的抗原をコードする、例えば、第2の(3')オープンリーディングフレームである。一部の態様では、RNAは、例えば、更なる標的抗原をコードするため、又はアクセサリーポリペプチドをコードするために、追加の(例えば、下流)オープンリーディングフレームを有しうる。自己複製性RNA分子は、コードされたレプリカーゼと適合性のある5'配列を有することができる。自己複製性RNA分子は、様々な長さを有することができるが、それらは典型的には約5000～25000ヌクレオチド、例えば、8000～15000ヌクレオチド、又は9000～12000ヌクレオチドの長さである。したがって、RNAは、従来のmRNA送達で見られるよりも長い。一部の態様では、自己複製性RNAは、約2000ヌクレオチドよりも長く、例えば約9,000、約12,000、約15,000、約18,000、約21,000、約24,000ヌクレオチドよりも長いか、又はそれ以上の長さである。
メッセンジャーRNA(mRNA)は、修飾されていても修飾されていなくてもよく、塩基修飾されていてもよく、様々な種類のキャッピング構造、例えば、Cap1を含んでもよい。RNA分子は、5'キャップ(例えば、7-メチルグアノシン)を有してもよい。このキャップは、RNAのインビボ翻訳を強化することができる。本発明で有用なRNA分子の5'ヌクレオチドは、5'三リン酸基を有してもよい。キャッピングされたRNAにおいて、これは5'から5'への架橋を介して7-メチルグアノシンと連結されていてもよい。5'三リン酸は、RIG-I結合を強化し、それ故にアジュバント効果を促進することができる。RNA分子は、3'ポリA尾部を有してもよい。これがまた、ポリAポリメラーゼ認識配列(例えば、AAUAAA)をその3'末端の近くに含んでもよい。免疫化の目的に本発明で有用なRNA分子は、典型的には一本鎖であると考えられる。一本鎖RNAは一般に、TLR7、TLR8、RNAヘリカーゼ及び/又はPKRに結合することによってアジュバント効果を開始することができる。二本鎖形態(dsRNA)で送達されたRNAは、TLR3に結合することができ、この受容体はまた、一本鎖RNAの複製中に又は一本鎖RNAの二次構造内のいずれかで形成されるdsRNAによっても誘発されうる。
RNA分子は、インビトロ転写(IVT)によって都合良く調製することができる。IVTは、細菌内でプラスミド形態で作成及び増殖されたか、又は合成的に作成された(例えば、遺伝子合成及び/又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)工学的方法によって)(cDNA)テンプレートを使用することができる。WO2011/005799で考察されているように、自己複製性RNAは、(任意の5'キャップ構造に加えて)修飾された核酸塩基を有する1つ又は複数のヌクレオチドを含むことができる。例えば、自己複製性RNAは、1つ又は複数の修飾されたピリミジン核酸塩基、例えば、プソイドウリジン及び/又は5メチルシトシン残基を含むことができる。しかし、一部の態様では、RNAは修飾された核酸塩基を全く含まず、修飾されたヌクレオチドも全く含まなくてもよく、すなわち、RNA中のヌクレオチドの全ては、標準的なA、C、G及びUリボヌクレオチドである(任意の5'キャップ構造は例外であり、これは7'メチルグアノシンを含んでもよい)。他の態様では、RNAは7'メチルグアノシンを含む5'キャップを含んでもよく、最初の1つ、2つ又は3つの5'リボヌクレオチドは、リボースの2'位でメチル化されてもよい。RNAは、ヌクレオシド間にホスホジエステル結合のみを含みうるが、一部の態様では、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、及び/又はメチルホスホネート結合を含む。RNAの異なるクラス(例えば、mRNA、siRNA、自己複製性RNA、及びそれらの組合せ)を含む、RNAの複数の種、例えば、RNAの2つ、3つ、4つ又はそれ以上の種を、単一の組成物の中に配合してもよい。
本発明の一態様によれば、レプリコン、ウイルス抗原をコードする自己増幅性mRNA、及び合成脂質ベースのナノ粒子を含むワクチンが提供される。一部の態様では、ウイルス抗原は、SARS-CoV-2ウイルスの元の武漢株、並びにSARS-CoV-2ウイルスのD614G優性変異から生じる新たな注目される変異株(VOI)又は懸念される変異株(VoC)の両方を標的とする、3822bp長の完全長コドン最適化SARS-CoV-2スパイクタンパク質配列、を組み込んでいる。一部の態様では、ウイルス抗原は、SARS-CoV-2ウイルスの欠失及び挿入変異から生じる新たな懸念される変異株(VoC)を標的とする、3813～4019bp長の完全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質配列デザインを組み込んでいる。一部の態様では、ウイルス抗原は、哺乳動物の組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)、フィブリチン、フィブロネクチン、又はグロブリンタンパク質のN末端領域から生じる63～71bpのリーダー配列を含む完全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質を組み込んでいる。他の態様では、ウイルス抗原は、SARS-CoV-2ウイルスの欠失及び挿入変異から生じる新たな懸念される変異株(VoC)を標的とする3813～4019bp長の完全長コドン最適化SARS-CoV-2スパイクタンパク質配列デザインを組み込んでいる。更に他の態様では、ウイルス抗原は、哺乳動物の組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)、フィブリチン、フィブロネクチン、又はグロブリンタンパク質のN末端領域から生じる63～71bpのリーダー配列を含む完全長コドン最適化SARS-CoV-2スパイクタンパク質を組み込んでいる。
諸態様において、ウイルス抗原は、ヒト及び非ヒト霊長類の組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)、フィブリチン、フィブロネクチン、又はグロブリンタンパク質のN末端領域から生じる63～71bpのリーダー配列を含む完全長コドン最適化SARS-CoV-2スパイクタンパク質を組み込んでいる。他の態様では、ウイルス抗原は、SARS-CoV-2ウイルスを標的とする、N末端ドメイン(NTD)、シグナル配列(SS)、天然の受容体結合ドメイン(RBD)、リンカー配列、フィブリチン-フォルドン及び膜貫通ドメイン(TMD)を組み込んだ、コドン最適化された切断型SARS-CoV-2スパイクタンパク質配列を組み込んでいる。一部の態様では、ウイルス抗原は、SARS-CoV-2ウイルスの欠失及び/又は挿入変異から生じる新たな注目される変異株(VoI)及び懸念される変異株(VoC)を標的とする、N末端ドメイン(NTD)、シグナル配列(SS)、変異型受容体結合ドメイン(mut-RBD)、リンカー配列、フィブリチン-フォルドン及び膜貫通ドメイン(TMD)を組み込んだ、コドン最適化された切断型SARS-CoV-2スパイクタンパク質配列を組み込んでいる。他の態様では、ウイルス抗原は、SARS-CoV-2ウイルスの欠失及び/又は挿入変異から生じる新たな注目される変異株(VoI)及び懸念される変異株(VoC)を標的とする、N末端ドメイン(NTD)、シグナル配列(SS)、変異型受容体結合ドメイン(mut-RBD)、リンカー配列、フィブリチン-フォルドン及び膜貫通ドメイン(TMD)を組み込んだ、コドン最適化された切断型SARS-CoV-2スパイクタンパク質配列を組み込んでいる。
本発明の諸態様では、ウイルス抗原が、SARS-CoV-2ウイルスを標的とする、N末端ドメイン(NTD)、シグナル配列(SS)、受容体結合ドメイン(RBD)、リンカー配列、フィブリチン-フォルドン及び膜貫通ドメイン(TMD)をSAR-CoV-2ヌクレオプロテイン配列と共に組み込んだ、切断型SARS-CoV-2スパイクタンパク質配列を有する2シストロン性遺伝子カセットを組み込んでいるワクチンが提供される。
諸態様では、ウイルス抗原は、SARS-CoV-2ウイルスの欠失及び/又は挿入変異から生じる新たな注目される変異株(VoI)及び懸念される変異株(VoC)を標的とする、N末端ドメイン(NTD)、シグナル配列(SS)、変異型受容体結合ドメイン(mut-RBD)、リンカー配列、フィブリチン-フォルドン及び膜貫通ドメイン(TMD)をSAR-CoV-2ヌクレオプロテイン配列と共に組み込んだ、切断型SARS-CoV-2スパイクタンパク質配列を有する2シストロン性遺伝子カセットを組み込んでいる。本発明の諸態様では、IVT転写された自己増幅性mRNAベースのワクチン製剤原料が、標準的な低剪断速度接線流濾過又は塩化リチウム沈殿を使用して精製され、0.5～2mMクエン酸緩衝液(pH 6.1～6.6)中に再懸濁される。更に他の態様では、精製されたIVT転写された自己増幅性mRNAベースのワクチン製剤原料は、0.5～2mMクエン酸緩衝液、100mM～500mMスクロース、0.1～6%マンニトール(pH 6.1～6.6)で構成される凍結保護剤緩衝液中に再懸濁される。更に他の態様では、精製されたIVT転写された自己増幅性mRNAベースのワクチン製剤原料が、0.5～2mMクエン酸緩衝液、100mM～500mMスクロース、0.1～6%マンノース(pH 6.1～6.6)で構成される凍結保護剤緩衝液中に再懸濁されるワクチンが本明細書で提供される。諸態様において、精製されたIVT転写された自己増幅性mRNAベースのワクチン製剤原料は、0.5～2mMクエン酸緩衝液、100mM～500mMスクロース、0.1～6%マンニトール(pH 6.1～6.6)で構成される凍結保護剤緩衝液中に再懸濁され、-45℃から-60℃への一次乾燥温度及び10℃～25℃へのランピングによる二次乾燥温度を使用して凍結乾燥される。
諸態様において、精製されたIVT転写された自己増幅性mRNAベースのワクチン製剤原料は、0.5～2mMクエン酸緩衝液、100mM～500mMスクロース、0.1～6%マンノース(pH 6.1～6.6)で構成される凍結保護剤緩衝液中に再懸濁され、-45℃から-60℃への一次乾燥温度及び10℃～25℃へのランピングによる二次乾燥温度を使用して凍結乾燥される。本発明の諸態様では、イオン化可能脂質、構造脂質、ステロール、及び安定剤を含む合成脂質ベースのナノ粒子が提供される。諸態様において、イオン化可能脂質の自己増幅性mRNAに対する比が4～9の、8の、6のN/P比をもたらす、記載されたワクチンが提供される。
本発明の一態様によれば、ワクチンが凍結乾燥されている、本明細書に記載のワクチンが提供される。
本発明の態様の組換え発現ベクターは、薬学的に許容される担体と共に提供されうる。本発明の一態様では、医薬組成物は、組換え発現ベクター及び薬学的に許容される担体を含む。
RNAワクチンのための薬学的に許容される担体は、インビボでのエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼによるRNAワクチンの分解を低減するか又は回避することができる。本発明の一態様では、薬学的に許容される担体は脂質ナノ粒子(LNP)である。LNPは、それぞれが異なる機能を果たす異なる脂質の組合せでできた脂質二重層シェルによって囲まれた脂質性又は水性コアを含みうる。本発明の一態様では、脂質ナノ粒子は、(a)イオン化可能なカチオン性脂質;(b)構造脂質;(c)安定剤;及び(d)ステロールを含む。イオン化可能なカチオン性脂質は、負に荷電したmRNAを、RNAとの誘引性の静電的相互作用及び疎水性相互作用を介して自発的に封入する。構造脂質は荷電関連毒性を低減し、LNPの構造を維持する。ステロールは、LNPを安定化して、細胞移入を助長することができる。
個々のLNPの特性は、それらがどのように作られるかによって影響を受ける可能性がある。拡散又はバルク混合は、可変性の組成を有するLNPを導くことができる。過剰な水中でのエタノール-脂質相とmRNAとの急速混合により、小さく均一なLNPが生成されうる。LNPを生成させるには、Precision NanoSystems社のNANOASSEMBLR(登録商標)シリーズのミキサーが推奨される。
本発明の態様のLNPは、組換え発現ベクターの全身性又は局所性の送達のために有用でありうる。LNPは、i)細胞及び組織系における高い生体適合性及び低い毒性、ii)製造が比較的容易であること、並びにiii)それらが免疫系から不可視であることに起因するインビボでの循環半減期の延長を含む、いくつかの利点を有しうる。
脂質は、脂肪酸誘導体又はステロールである有機化合物の構造的に多様な群である。脂質には、脂質様材料、例えば、リピドイドが含まれる。脂質は、水に不溶性であるが多くの有機溶媒には可溶性であることによって特徴付けられる。
「脂質混合組成物」は、成分の種類、成分の比率、及び全成分の組換え発現ベクター(核酸ペイロード)に対する比を指す。例えば、40Mol%のイオン化可能脂質、20Mol%の構造脂質、17Mol%のステロール、及び2.5Mol%の安定化剤という脂質混合組成物は、脂質混合組成物の1つであると考えられる。好ましい態様では、脂質混合組成物は、47.5mol%のIL/12.5mol%のDSPC/38.5mol%のコレステロール/1.5mol%のPEG-DMGである。他の好ましい態様では、12.5mol%のDSPCが等量のDOPEで置き換えられる。
本明細書で使用される場合、「N/P」は、イオン化可能脂質のアミノ基のモル数の、核酸のリン酸基のものに対する比である。本発明の諸態様では、N/P比は6から10であり、最も好ましい比はN/P 4～12である。一態様では、N/P比は6、8、又は10である。核酸成分は、この脂質混合組成物と一緒にされて、脂質核酸粒子、又はLNPを、前もって計画された比で、例えば、イオン化可能脂質アミン(N)の核酸リン酸に対する比(P)としてN/P 4、N/P 6、N/P 8、N/P 10、N/P 12で、又は別の妥当な特定のN/P比で形成する。好ましい態様では、N/Pは6である。
本発明の態様は、本明細書に記載の脂質混合組成物から製造されるLNP(「脂質粒子」、「脂質ナノ粒子」、又は「脂質核酸粒子」とも称される)を提供する。LNPは、脂質混合組成物と成分中の核酸との物理的構成物を表す。LNPは一般に、脂質、核酸、コレステロール、及び安定化剤の球状集合体である。正及び負の電荷、比、並びに親水性及び疎水性は、LNPの物理的構造を成分のサイズ及び配向の点から規定する。これらの脂質粒子の構造的構成は、リポソームの場合のように最小の二重層を有する水性内部を導くこともあれば、又は固体核酸脂質ナノ粒子の場合のように固体内部を有することもある。リン脂質単層又は二重層が、単一又は複数の形態で存在してもよい。脂質粒子は1から1000μmのサイズでありうる。
本発明の組成物は、イオン化可能なカチオン性脂質を成分として含みうる。本明細書で使用される場合、「イオン化可能なカチオン性脂質」という用語は、カチオン性であるか、又はpHが脂質のイオン化可能基のpKa未満に低下した場合にイオン化可能になる(プロトン化される)が、より高いpH値ではより中性である脂質を指す。pKa未満のpH値では、脂質は、負に荷電した核酸(例えば、オリゴヌクレオチド)と会合することが可能である。本明細書で使用される場合、「イオン化可能なカチオン性脂質」という用語には、pHが生理的pHよりも低下した場合に正電荷を帯びる脂質、及び選択的pH、例えば生理的pHで正味の正電荷を保有するいくつかの脂質種のうち任意のものが含まれる。好適なイオン化可能なカチオン性脂質の例は、PCT公開第WO20252589号及び同第WO21000041号に見出される。イオン化可能なカチオン性脂質は、LNP中に、20mol%、約21mol%、約22mol%、約23mol%、約24mol%、約25mol%、約26mol%、約27mol%、約28mol%、約29mol%、約30mol%、約31mol%、約32mol%、約33mol%、約34mol%、約35mol%、約36mol%、約37mol%、約38mol%、約39mol%、約40mol%、約41mol%、約42mol%、約43mol%、約44mol%、約45mol%、約46mol%、約47mol%、約48mol%、約49mol%、約50mol%、約51mol%、約52mol%、約53mol%、約54mol%、約55mol%、約56mol%、約57mol%、約58mol%、約59mol%、約60mol%、約61mol%、約62mol%、約63mol%、約64mol%、約65mol%、約66mol%、約67mol%、約68mol%、約69mol%、約70mol%の比で、又は前記の値のいずれか2つによって規定される範囲で(「Mol%」は、特定の成分の全モル数に占めるパーセンテージを意味する)、又は前記の値のいずれか2つによって規定される範囲で存在しうる。本発明の一態様では、脂質ナノ粒子は、約20mol%から約70mol%、約25mol%から約65mol%、約30mol%から約60mol%、約35mol%から約55mol%、又は約40mol%から約50mol%のイオン化可能なカチオン性脂質を含む。DODMA、又は1,2-ジオレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパンは、イオン化可能脂質の1つであり、DLin-MC3-DMA又はO-(Z,Z,Z,Z-ヘプタトリアコンタ-6,9,26,29-テトラエン-19-イル)-4-(N,N-ジメチルアミノ)(「MC3」)も同様である。
構造脂質は、「ヘルパー脂質」又は「中性脂質」としても知られ、一部の態様では、本発明のLNPに組み込まれてもよい。LNPは、1つ又は複数の構造脂質を、LNPの約5mol%から約45mol%、約10mol%から約40mol%、約15mol%から約35mol%、約20mol%から約30mol%、約10から40Mol%で、又はLNPの約5mol%、約6mol%、約7mol%、約8mol%、約9mol%、約10mol%、約11mol%、約12mol%、約13mol%、約14mol%、約15mol%、約16mol%、約17mol%、約18mol%、約19mol%、約20mol%、約21mol%、約22mol%、約23mol%、約24mol%、約25mol%、約26mol%、約27mol%、約28mol%、約29mol%、約30mol%、約31mol%、約32mol%、約33mol%、約34mol%、約35mol%、約36mol%、約37mol%、約38mol%、約39mol%、約40mol%、約41mol%、約42mol%、約43mol%、約44mol%、約45mol%で、又は前記の値のいずれか2つによって規定される範囲で含みうる。
好適な構造脂質は、製造中にLNPの形成を支えうる。構造脂質は、生理的pHでアニオン性、非荷電又は中性双性イオン形態のいずれかで存在するいくつかの脂質種のうちのいずれか1つを指す。代表的な構造脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン及びセレブロシドが挙げられる。例示的な構造脂質としては、双性イオン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)及びジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(DOPE-mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-trans PE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)、及び1,2-ジエライドイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(トランスDOPE)が挙げられる。好ましい一態様では、構造脂質はジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)である。好ましい態様では、構造脂質はDOPEである。好ましい態様では、構造脂質はDSPCである。
別の態様では、構造脂質は、生理的pHで負に荷電している任意の脂質である。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール類、例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、パルミトイルレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、及び中性脂質と結合した他のアニオン性修飾基が挙げられる。他の好適な構造脂質としては、糖脂質(例えば、モノシアロガングリオシドGM1)が挙げられる。
「安定剤」又は安定化剤は、脂質組成物を形成するイオン化可能脂質、構造脂質、及びステロールに加えられる剤を同定するために使用される用語である。非イオン性安定化剤の例としては、ポリソルベート(Tween)、Brij(商標)S20(ポリオキシエチレン(20)ステアリルエーテル)、Brij(商標)35(ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリエチレングリコールラウリルエーテル)、Brij(商標)S10(ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル、ポリオキシエチレン(10)ステアリルエーテル)、及びMyrj(商標)52(ポリオキシエチレン(40)ステアリン酸)が挙げられる。
一部の態様では、安定剤は、TPGS 1000(D-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000コハク酸);又は等しい比にあるTween 20/ポリソルベート80/トリデシル-D-マルトシド(表15で脂質Hと呼ばれる)である。他の好ましい態様では、安定化剤としては、PEG-DMG 2000(「PEG-DMG」)を含むPEG化脂質が挙げられる。ポリエチレングリコールコンジュゲート脂質を使用することもできる。安定化剤は、単独で、又は互いに組み合わせて使用することができる。
一部の態様では、安定化剤は、約0.1から約3Mol%のLNPを含む。一部の態様では、安定化剤は、約0.5から約2.5Mol%のLNPを含む。一部の態様では、安定化剤は、約2.5Mol%を上回って存在する。一部の態様では、安定化剤は約5Mol%で存在する。一部の態様では、安定化剤は約10Mol%で存在する。一部の態様では、安定化剤は、LNP中に、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0のMol%で、又は前記の値のいずれか2つによって規定される範囲で存在する。他の態様では、安定化剤は、LNPの約2.6から約10Mol%である。他の態様では、安定化剤は、LNPの約10Mol%を上回って存在する。一態様では、脂質ナノ粒子は、約0.2mol%から約5mol%の安定剤を含む。
ステロールをLNPに含めてもよい。ステロールとしては、コレステロール、ベータ-シトステロール、及び20-アルファ-ヒドロキシステロール、及び植物ステロールが挙げられる。一部の態様では、ステロールは、一部の態様における最終的な脂質混合物の約30から約50Mol%で存在する。或いは、コレステロールは、最終的な脂質混合物の約35から約41Mol%で存在する。一部の態様では、ステロールは約17mol%から約38.5mol%で存在する。他の態様では、ステロールは存在しない。一部の態様では、修飾ステロール又は合成的に導出されたステロールが存在する。一態様では、脂質ナノ粒子は、約15mol%から約45mol%、約20mol%から約40mol%、約25mol%から約35mol%のステロールを含む。一態様では、ステロールは、LNP中に、15mol%、約16mol%、約17mol%、約18mol%、約19mol%、約20mol%、約21mol%、約22mol%、約23mol%、約24mol%、約25mol%、26mol%、約27mol%、約28mol%、約29mol%、約30mol%、約31mol%、約32mol%、約33mol%、約34mol%、約35mol%、約36mol%、約37mol%、約38mol%、約39mol%、約40mol%、約41mol%、約42mol%、約43mol%、約44mol%、約45mol%で、又は前記の値のいずれか2つによって規定される範囲で存在する。
本発明の態様のLNPは、溶液中の粒子のサイズを決定するデバイス、例えば、Malver(商標) Zetasizer(商標)を使用して、サイズについて評価することができる。本発明の一態様では、LNPは、約50nmから約130nm、約55nmから約125nm、約60nmから約120nm、約65nmから約115nm、約70nmから約110nm、約75nmから約100nm、又は約80nmから約100nmのサイズを有する。一部の態様では、LNPは、約50nm、約51nm、約52nm、約53nm、約54nm、約55nm、約56nm、約57nm、約58nm、約59nm、約60nm、約61nm、約62nm、約63nm、約64nm、約65nm、約66nm、約67nm、約68nm、約69nm、約70nm、約71nm、約72nm、約73nm、約74nm、約75nm、約76nm、約77nm、約78nm、約79nm、約80nm、約81nm、約82nm、約83nm、約84nm、約85nm、約86nm、約87nm、約88nm、約89nm、約90nm、約91nm、約92nm、約93nm、約94nm、約95nm、約96nm、約97nm、約98nm、約99nm、約100nm、約101nm、約102nm、約103nm、約104nm、約105nm、約106nm、約107nm、約108nm、約109nm、約110nm、約111nm、約112nm、約113nm、約114nm、約115nm、約116nm、約117nm、約118nm、約119nm、約120nm、約121nm、約122nm、約123nm、約124nm、約125nm、約126nm、約127nm、約128nm、約129nm、約130nmのサイズ、又は前記の値のいずれか2つによって規定される範囲のサイズを有する。より小さい粒子は一般に、より大きい粒子と比較して、インビボでの循環寿命の延長を示す。より小さい粒子は、より大きいナノ粒子よりも腫瘍部位に到達する能力が高い。
本発明の態様による脂質粒子は、標準的なT字管混合手法、乱流混合、研和混合、秩序のある自己集合を促進する撹拌、又はエレメントのナノ粒子への自己集合を伴う全てのエレメントの受動的混合によって調製することができる。遺伝子薬を含有する脂質ナノ粒子(LNP)を製剤化するために種々の方法が開発されている。好適な方法は、例を挙げると、米国特許第5,753,613号及び米国特許第6,734,171号に開示されている。これらの方法は、エタノールの存在下で、前もって形成された脂質粒子を核酸と混合すること、又はエタノール中に溶解された混合脂質を、核酸を含有する水性媒体と混合することを含み、その結果、核酸封入効率が65～99%である脂質粒子が生じる。これらの方法は両方とも、核酸の封入を達成するためのイオン化可能脂質、並びに凝集及び大きな構造の形成を阻害するための安定化剤の存在に依拠している。サイズ及び核酸封入効率を含む、生成される脂質粒子系の特性は、種々の脂質混合組成物パラメーター、例えば、イオン強度、脂質及びエタノールの濃度、pH、核酸濃度並びに混合速度に対して感受性がある。
マイクロ流体二相液滴手法は、薬物送達のための単分散ポリマー微粒子を生成させるため、又は細胞、タンパク質、若しくは他の生体分子の封入のための大きな小胞を生成させるために適用されている。一般的なマイクロ流体手法である流体力学的フローフォーカシングを使用して、試薬の急速混合がもたらされ、制御されたサイズの単分散リポソームが作製されることが実証されている。
一般に、混合時の相対的な脂質及び核酸の濃度、並びに混合速度等のパラメーターを現在の製剤化手順を使用して制御することは困難である可能性があり、その結果、調製物の内部及び調製物間の両方で、生成される核酸の特性にばらつきが生じる。自動マイクロ混合機器、例えば、NanoAssemblr(登録商標)機器(Precision NanoSystems社、Vancouver、Canada)は、ナノ医薬(リポソーム、脂質ナノ粒子、及びポリマーナノ粒子)の迅速且つ制御された製造を提供する。NanoAssemblr(登録商標)機器は、ナノリットル、マイクロリットル、又はより大きなスケールでのナノ粒子成分のミリ秒混合をカスタマイズ性又は並列化を伴って可能にするマイクロ流体混合カートリッジを介して、ナノ粒子の制御された分子自己集合を達成することができる。小規模での急速混合により、粒子の合成及び品質に対して、より大きな機器では不可能な再現性のある制御が可能になる。
好ましい方法は、核酸の100%近くを1つの工程で封入するために、NanoAssemblr(登録商標)Spark(商標)、Ignite(商標)、Benchtop(商標)及びNanoAssemblr(登録商標)Blaze(商標)機器のようなマイクロ流体混合デバイスを組み込む。一態様では、脂質粒子は、形成プロセスに使用される核酸の約90から約100%が粒子中に封入されるプロセスによって調製される。
米国特許第9,758,795号及び同第9,943,846号は、小容量混合技術及びそれによって導出される新規製剤を使用する方法を記載している。米国特許第10,159,652号は、種々の材料を製剤化するために小容量混合技術を使用する、より進歩した方法及び生成物を記載している。Walshらによる米国特許第9,943,846号は、混合しようとするエレメントに対して異なる経路及びウェルを有するマイクロ流体ミキサーを開示している。Wild、Leaver及びTaylorによるPCT公開第WO 2017117647号は、使い捨ての無菌経路を有するマイクロ流体ミキサーを開示している。Wild、Leaver及びTaylorによる米国特許第10,076,730号は、分岐トロイダルマイクロ混合幾何形状及びそれらのマイクロ流体混合への適用を開示している。Chang、Klaassen、LeaverらによるPCT公開第WO2018006166号は、プログラム可能な自動マイクロミキサー及びそのための混合チップを開示している。Wild及びLeaverによる米国意匠登録第D771834号、同第D771833号、同第D772427号、及び同第D803416号、並びにChangらによる米国意匠登録第D800335号、同第D800336号及び同第D812242号は、Precision NanoSystems社によって販売されている、ミキサー機器のためのマイクロチャネル及び混合幾何形状を有する混合カートリッジを開示している。
本発明の諸態様では、生物学的マイクロ流体混合のためのデバイスが、本発明の態様による脂質粒子を調製するために使用される。デバイスは、マイクロ流体ミキサーに供給される試薬の第1及び第2の流れを含み、脂質粒子は出口から収集されるか、又は無菌環境に出現する。
第1の流れは、第1の溶媒中に核酸を含む。好適な第1の溶媒としては、核酸が可溶性であって、第2の溶媒と混和性である溶媒が挙げられる。好適な第1の溶媒には、水性緩衝液が含まれる。代表的な第1の溶媒としては、クエン酸及び酢酸緩衝液、又は他の低pH緩衝液が挙げられる。
第2の流れは、第2の溶媒中に脂質混合材料を含む。好適な第2の溶媒としては、本発明の態様によるイオン化可能脂質が可溶性であって、第1の溶媒と混和性である溶媒が挙げられる。好適な第2の溶媒としては、1,4-ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、酸及びアルコールが挙げられる。代表的な第2の溶媒としては、水性エタノール90%又は無水エタノールが挙げられる。
本発明の一態様では、好適なデバイスは、1つ又は複数のマイクロチャネル(すなわち、その最大寸法が1ミリメートル未満であるチャネル)を含む。一例では、マイクロチャネルは、約20から約300μmの直径を有する。複数の例において、マイクロチャネルの少なくとも1つの領域は、米国特許第9,943,846号に記載されているように、主な流れ方向と、少なくとも1つの溝若しくは突出が内部に画定された1つ若しくは複数の表面とを有し、溝若しくは突出が、主な方向に対してある角度を形成する方向を有するか(例えば、スタッガードヘリンボーンミキサー)、又は米国特許第10,076,730号に記載されているような分岐トロイダル流を有する。最大の混合速度を達成するためには、混合領域の前に過度の流体抵抗を回避することが有利でありうる。したがって、デバイスの一例は、流体を単一の混合チャネルに送達するために、1000μmを上回る寸法を有する非マイクロ流体チャネルを有する。
脂質粒子の粒径及び「多分散性指数」(PDI)は、動的光散乱(DLS)によって測定することができる。PDIは粒子分布の幅を示す。これは、単一粒径モード及び自動相関関数に対する単一指数関数適合を仮定して、(DLS)で測定された強度自動相関関数の累積解析から計算されるパラメーターである。生物物理学的観点からは、0.1未満のPDIは、試料が単分散性であることを示す。機械的マイクロミキサー、例えば、NanoAssemblr(登録商標)Spark(商標)及びNanoAssemblr(登録商標)Ignite(商標)(Precision Nanosystems社)によって生成された粒子は、他の全ての変数が中立であると仮定すると、サイズが実質的に均一である。より低いPDIは、脂質粒子のより均一な集団を示す。Spark(商標)機器は、リード組成物を同定するためにスクリーニング環境で使用される。ひとたび組成物が選択されると、NanoAssemblr(登録商標)Ignite(商標)機器を使用して脂質粒子を微調整することができる。ひとたび特定のナノ粒子組成物についてプロセスパラメーターである流量比及び全流量が同定されると、同じプロセスパラメーター値を使用してナノ粒子技術をスケールアップすることができる。
米国公開特許出願第20040262223号に開示されているもののような、より複雑でない混合方法及び機器も、本発明の脂質粒子組成物を作製するのに有用である。
ある特定の態様では、本発明は、核酸を細胞に導入するための方法(すなわち、トランスフェクション)を提供する。本開示において、「トランスフェクション」は、実験室及び臨床環境の両方における目的の特定の遺伝子の発現を誘導する目的での核酸の細胞内への移入を意味する。これは典型的には、核酸と会合させるためのイオン化可能脂質、及び構造脂質を含む。LIPOFECTIN(商標)及びLIPOFECTAMINE(商標)はThermoFisher Scientific社によって販売されている、確立された市販のトランスフェクション試薬である。これらの研究用試薬は永続的なカチオン性脂質を含有しており、インビボ又はエクスビボでの使用には適さない。
トランスフェクション効率は一般的に、i)生細胞若しくは固定細胞の画像化(蛍光タンパク質の検出のため)、及びフローサイトメトリーによって測定される、送達された遺伝子の陽性発現を示す細胞の全処置集団中のパーセンテージ、又はii)生細胞若しくは固定細胞の画像化若しくはフローサイトメトリーによって分析される、処置細胞によって発現されるタンパク質の強度若しくは量、又はiii)タンパク質定量手法、例えば、ELISA、若しくはウエスタンブロット法の使用のいずれかとして定義される。これらの方法は、本発明の粒子又は脂質混合組成物を、細胞内送達が起こるのに十分な期間にわたって細胞と接触させることによって実施されうる。
インビボ投与のためには、医薬組成物は、好ましくは、非経口的に(例えば、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、髄腔内、皮内、気管内、骨内、筋肉内、腫瘍内、又は組織の間質空間に)投与される。特定の態様では、医薬組成物は、ボーラス注射によって静脈内、髄腔内、又は腹腔内に投与される。代替的な送達経路としては、直腸、経口(例えば、錠剤、液滴、スプレー)、頬側、舌下、膣、局所皮膚、眼、粘膜)、経皮的(transdermal or transcutaneous)、鼻腔内、眼、耳、肺、又は他の粘膜投与が挙げられる。皮内及び筋肉内投与は、2つの好ましい経路である。注射は、針(例えば、皮下注射針)を介してもよいが、針を使用しない注射を代替的に使用してもよい。典型的な筋肉内用量は0.5mlである。
別の例では、本発明の脂質混合物組成物を、エクスビボの患者細胞の試料への核酸の送達のために使用して、続いて患者に戻すことができる。
本発明の組成物は、免疫化のために有用でありうる。免疫化の目的で、本発明の組成物は一般に、注射剤、肺若しくは鼻エアロゾルとして、又は送達デバイス(例えば、シリンジ、ネブライザー、噴霧器、吸入器、皮膚パッチ等)の中で調製される。この送達デバイスは、免疫化のために、対象、例えばヒトに医薬組成物を投与するために使用することができる。
RNAを、本発明の脂質組成物(例えば、リポソーム又はLNPとして製剤化されている)と共に送達してもよい。一部の態様では、本発明は、標的抗原をコードするRNAが内部に封入されているLNPを利用する。LNP内への封入により、RNAをRNアーゼ消化から保護することができる。封入効率は100%である必要はない。外部RNA分子(例えば、リポソーム又はLNPの外表面上)又は「裸の」RNA分子(リポソーム又はLNPと会合していないRNA分子)の存在は許容される。好ましくは、脂質及びRNA分子を含む組成物について、RNA分子の少なくとも半分(例えば、RNA分子の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも99%)は、LNP又は複合体を形成したLNPの中に封入される。
標的抗原をコードするRNAの送達のために、LNP直径の好ましい範囲は60～180nmの範囲であり、より特定的な態様では80～160nmの範囲である。LNPは、LNPの集団を含む組成物の一部であることができ、集団内のLNPはある範囲の直径を有することができる。種々の直径を有するLNPの集団を含む組成物については、(I)LNPの数にして少なくとも80%が60～180nmの範囲、例えば、80～160nmの範囲にある直径を有すること、(ii)集団の平均直径(強度による、例えば、Z-平均)が理想的には60～180nmの範囲、例えば、80～160nmの範囲にあること;及び/又は複数のものにおける直径が0.2未満の多分散性指数を有することが好ましい。所望の直径のLNPを得るために、水性RNA溶液の2つの供給流が単一の混合ゾーン内でエタノール性脂質溶液の1つの流れと、全て同じ流速で、例えば、マイクロ流体チャネル内で組み合わされるプロセスを使用して、混合を行うことができる。Precision Nanosystems社、Vancouver、Canadaによって販売されているNanoAssemblr(登録商標)マイクロ流体ミキサーに関する他の記載を参照のこと。
ある特定の態様では、本発明によって提供される脂質組成物(例えば、LNP)は、アジュバント活性を、すなわち、タンパク質抗原又は核酸(DNA又はRNA)、例えば、そのような抗原をコードする核酸のような標的抗原の非存在下で有する。
本発明の医薬組成物、特に免疫化のために有用なものは、1つ又は複数の小分子免疫賦活薬を含みうる。本発明の医薬組成物は、1つ又は複数の保存料、例えば、チオメルサール又は2フェノキシエタノールを含みうる。水銀を含まず保存料を含まないワクチンを調製することができる。
組成物は、本明細書に記載の脂質組成物(例えば、LNP)の有効量、並びに必要に応じて任意の他の成分を含む。免疫学的有効量は、単回用量又は一連の用量の一部のいずれかとして個体に投与される、処置(例えば、病原体に対する予防的免疫応答)のために有効な量を指す。この量は、処置される個体の健康及び身体的状態、年齢、処置される個体の分類群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類等)、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、処置する医師による医学的状況の評価、並びに他の関連する要因に応じて変化する。この量は、慣行的な試験によって決定することができる比較的広い範囲に収まると予想される。
本発明の組成物は一般に、用量当たりのRNAの量に関して表される。好ましい用量は、約1000pgのRNA(例えば、10～1000pg、例えば、約10pg、25pg、50pg、75pg又は100pg等)を有するが、発現は、はるかに低いレベル、例えば、約1pg/用量、約100ng/用量、約10ng/用量、約1ng/用量等でも見られる。一部の態様では、好ましい用量は100μgである。他の態様では、好ましい用量は最大250μgである。本発明はまた、本発明の医薬組成物を含有する送達デバイス(例えば、シリンジ、ネブライザー、噴霧器、吸入器、皮膚パッチ等)も提供する。このデバイスを使用して、脊椎動物対象に組成物を投与することができる。
本明細書に記載のLNP製剤化されたRNA及び医薬組成物は、目的の標的抗原に対する免疫応答を誘導するためにインビボで使用される。本発明は、本明細書に記載されるようなLNP製剤化されたRNA、又は医薬組成物の有効量を投与することを含む、脊椎動物において免疫応答を誘導するための方法を提供する。免疫応答は好ましくは保護的であり、好ましくは抗体及び/又は細胞媒介性免疫を伴う。組成物は、プライミング及びブーストの両方の目的に使用することができる。或いは、プライム-ブースト免疫化スケジュールが、RNA及び対応するポリペプチド標的抗原の混合(例えば、RNAがプライム、タンパク質がブースト)であることもできる。
本発明の一態様はまた、脊椎動物において免疫応答を誘導するのに使用するためのLNP又は医薬組成物も提供する。本発明はまた、脊椎動物において免疫応答を誘導するための医薬の製造におけるLNP又は医薬組成物の使用も提供する。これらの使用及び方法によって脊椎動物において免疫応答を誘導することによって、脊椎動物を様々な疾患及び/又は感染症に対して、例えば、以上で考察したような細菌性及び/又はウイルス性疾患に対して保護することができる。本発明によるワクチンは、予防的(すなわち、感染症を予防するため)又は治療的(すなわち、感染症を処置するために)のいずれであってもよいが、典型的には予防的であると考えられる。脊椎動物は、好ましくは哺乳動物、例えば、ヒト又は大型の獣医学的哺乳動物(例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ブタ)である。
本発明は、全身性及び/又は粘膜免疫を誘導するため、好ましくは強化された全身性及び/又は粘膜免疫を誘発するために使用することができる。投薬は、単回投薬スケジュール又は複数回投薬スケジュールによることができる。複数回投薬は、一次免疫化スケジュール及び/又はブースター免疫化スケジュールにおいて使用することができる。
複数回投薬スケジュールでは、様々な用量を、同一又は異なる経路により、例えば、非経口プライム及び粘膜ブースト、粘膜プライム及び非経口ブースト等によって与えることができる。複数回投薬は、典型的には、少なくとも1週間(例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間等)を隔てて投与されると考えられる。一態様では、複数回投薬は、世界保健機関の予防接種拡大プログラム(「EPI」)でしばしば使用されるように、生後およそ6週、10週及び14週で、例えば、6週、10週及び14週の齢数で投与することができる。代替的な一態様では、2回の一次投薬が約2か月間を隔てて、例えば、約7、8又は9週間を隔てて投与され、続いて第2の一次投薬の約6か月～1年後、例えば、第2の一次投薬の約6、8、10又は12か月後に1回又は複数回のブースター投薬が行われる。更なる一態様では、3回の一次投薬が約2か月間を隔てて、例えば、約7、8又は9週間を隔てて投与され、続いて第3の一次投薬の約6か月～1年後に1回又は複数回のブースター投薬が行われる。
本開示による医薬組成物は、バルクで、単一単位用量として、及び/又は複数の単一単位用量として、調製、包装、及び/又は販売することができる。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の分離した量を指す。活性成分の量は一般に、対象に投与されると考えられる活性成分の投与量に等しくてもよく、及び/又はそのような投与量の好都合な部分、例えば、そのような投与量の半分又は3分の1を含むが、これらに限定されないものであってもよい。
本開示による医薬組成物における核酸、薬学的に許容される賦形剤、及び/又は任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の実体、サイズ、及び/又は状態に応じて、並びに更に組成物が投与される経路に応じて変化しうる。
医薬製剤は、所望の特定の剤形に適した、薬学的に許容される賦形剤を更に含むことができ、本明細書で使用される場合、これには任意の及び全ての溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散又は懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、保存料等が含まれるが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤及び組成物を調製するための手法は、当技術分野で公知である(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 2006を参照)。従来の賦形剤媒体の使用は、任意の従来の賦形剤媒体が、何らかの望ましくない生物学的影響を生じること、又は医薬組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用すること等によって、物質又はその誘導体と適合しない可能性がある場合を除いて、本明細書において想定される。
一部の態様では、脂質粒子の粒径を、増加及び/又は減少させてもよい。粒径の変化は、限定されないが炎症等の生体反応に対抗するのを助けることができるか、又は体内分布を変化させることによって哺乳動物に送達されたNATの生物学的効果を高めることができる。サイズも、標的組織を決定するために使用することができ、より大きい粒子は速やかに除去され、より小さいものは種々の臓器系に到達する。
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、当然ながら、これらは本発明の範囲を決して限定するものとみなされるべきではない。
実施例に記載されている全ての溶媒及び試薬は市販品であり、特に記載のない限り、そのまま使用した。温度は摂氏で示される。
略語及び用語
Deg.C=摂氏
EPO=エリスロポエチン
g=グラム
GOI=「目的の遺伝子」
h=時間
HPLC=高速液体クロマトグラフィー
IL=イオン化可能脂質
MFI=蛍光強度中央値
min=分
mL=ミリリットル
mmol=ミリモル
PBS=リン酸緩衝液
安定化剤=PEG-DMG 2000を含む任意の安定化剤
Tween20=ポリソルベート20
Tween80=ポリソルベート80
ug=μg
wt=質量
脂質混合物の成分には、イオン化可能脂質、構造脂質、コレステロール、及び安定化剤が含まれる。低pH緩衝液(3～6)を使用してもよい。イオン化可能なアミノ脂質については、緩衝液のpHは典型的には、脂質のpKa未満である。
GOIは、免疫化を含む治療目標を達成するために発現を意図した1つの遺伝子エレメント又は複数の遺伝子エレメントを意味する。A1～A19 SARS Cov-2抗原をコードするエレメントは、本発明の態様におけるGOIである。
ILは、相対的に高いpHでカチオン性であり、相対的に低いpHでは非荷電性に変わる脂質である。
PNI V101 nCoVは、SARS nCOV-2抗原性が組み込まれたレプリコンである。
PNI V101 nCoV PNI A5 saRNAは、SARS nCoV-2ワクチンの特定のA5抗原型である。
PNI V101 nCoV PNI A5 saRNA PNI 516 LNPは、PNI 516イオン化可能脂質ナノ粒子のA5抗原型である。
PNI 516-VACCMIX-A-LMは、47.5mol%の(Z)-3-(2-((1,17-ビス(2-オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン-9-イル)オキシ)-2-オキソエチル)-2-(ペンタ-2-エン-1-イル)シクロペンチル4-(ジメチルアミノ)ブタノエートを、12.5mol%のDOPE、38.5mol%のコレステロール、及び1.5mol%のPEG-DMG 2000と共に含む特定の脂質混合物である。
VACCMIX-Aは、47.5mol%のイオン化可能脂質、12.5mol%の構造脂質、38.5mol%のコレステロール、及び1.5mol%のPEG-DMG 2000を含む任意の製剤を記載する。イオン化可能脂質及び構造脂質は指定される。
(実施例1)
本実施例は、本発明の態様による組換え発現ベクターの調製方法を示す。
自己増幅性mRNAの合成のための方法
SARS CoV 2スパイクタンパク質をコードする環状プラスミドの制限酵素消化を、BspQI(New England BioLabs社、カタログ番号R0712S)又はPmeI(New England BioLabs社、カタログ番号R0560S)に関する製造元の指示に従って、所定の緩衝液中で実施した。
直鎖化されたベクターを、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)及び酢酸ナトリウム沈殿を使用して精製した。手短に述べると、等容量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液を直鎖化ベクターに添加して20秒間ボルテックス処理し、室温で2分間インキュベートした。混合物を16,000g、室温で5分間遠心分離して、その後に直鎖化ベクターを含有する上部水相を清潔なRNアーゼ/DNアーゼ非含有チューブに慎重にピペットで入れ、0.3Mの酢酸ナトリウム及びグリコーゲンを使用して沈殿させた。3倍容量の100%エタノールを添加し、よく混合して、-20℃の冷凍庫で一晩インキュベートした。翌日、混合物を4℃で最大速度で遠心分離し、ペレットを氷冷70%エタノールで2回洗浄した。エタノールを慎重に除去し、DNAペレットを風乾させて、ヌクレアーゼ非含有水に再懸濁させた。直鎖化ベクターの濃度及び純度は、NANODROP分光光度計(Thermo Fisher Scientific社、Waltham, MA)を使用して調べた。
インビトロ転写は、HiScribe(商標)T7高収率RNA合成キット(New England BioLabs社、カタログ番号E2040S)を使用して実施した。続いて、TURBO DNアーゼ(Thermofisher Scientific社、カタログ番号AM2238)を使用して直鎖化DNAテンプレートの消化を行った。最終的なインビトロ転写された自己増幅性RNA(saRNA)に、Vaccina Capping System(New England Biolabs社、カタログ番号M2080S)を使用してキャッピングを行った。これらのプロセスは全て、ベクター直鎖化戦略から得られたDNAテンプレートを利用して自己増幅性RNAを作製するために製造元のプロトコールに従って行った。キャッピングされたsaRNAの精製は、標準的なLiCl沈殿、続いて70%エタノール洗浄、及びRNA貯蔵溶液(Thermofisher社)中でのRNAペレットの再懸濁を使用して行った。
PNI V101ベクターに関するクローニングベクターの設計及び直鎖化戦略
PNI V101クローニングベクターは、アルファウイルスサブファミリーであるベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)の単一ポリタンパク質ウイルスRNA複製機構をコードする遺伝子を組み込んだ10,005塩基対(bp)の合成プラスミドDNAである。ウイルスRNA複製機構は、VEEV 5'非翻訳領域(5'-UTR)、及び非構造タンパク質(nsP1、nsP2、nsP3及びnsP4)を、7541～7593bpに位置する操作されたマルチクローニングサイト(MCS)を有するVEEVのTC83株由来の26Sサブゲノムプロモーターと共に含み、このMCSは、ColE、複製起点(ori)、tetプロモーター、合成AmpR及びKanR遺伝子をコードする改変された細菌pUC57ベクター中にコードされる3'非翻訳領域(3'-UTR)及び38～40bpのポリA配列の後に、目的の遺伝子のシームレスな挿入を可能にする。T7プロモーターは、5'-UTR配列の5'領域でコードされる。PNI V101クローニングベクターの完全な配列は、Table 1(表1)の配列番号1に記載されている。配列の下線領域は、操作されたマルチクローニングサイト(MCS)の位置を表す。
PNI V101ベクターのマップを図1に示す。ここで使用したT7 RNAポリメラーゼベースのインビトロ転写は酵素プロセシビティが高く、これにより、環状プラスミドは長い不均一なRNA転写物をより大量に生成する。したがって、環状プラスミドの完全な直鎖化は、規定の長さの転写物の効率的な合成を確実にするために有用である。加えて、この目的で使用される制限酵素は、プラスミドの全長にわたって単一の二本鎖切断のみが行われなければならないことを考慮して、慎重に選択されなければならない。SapI、BspQI、PmlI、EcoRV又はPmeIを含む様々なタイプの制限エンドヌクレアーゼ切断配列を、PNI V101ベクターデザイン中の7,749～7,767bpに位置してコードされるポリA尾部配列の近く又は後に組み込むことが可能である。これにより、単一の二本鎖DNA切断が可能となり、それによって、ポリA尾部の箇所又はその後で終結する直鎖化DNAテンプレートが生成される。ベクターに組み込まれる上記の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に対応するユニーク配列をTable A(表2)に列挙する。
制限エンドヌクレアーゼ配列の方向は、それが5'→3'又は3'→5'のいずれであっても、目的の特定の遺伝子をコードするPNI V101ベクターから目的のタンパク質を生成するための自己増幅性RNAのマイナス鎖合成及びその後のmRNA発現に必要とされるよりも、ポリA尾部の近くでの切断を可能にしうる。
図2は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードする3822bpの遺伝子配列の挿入を有するPNI V101ベクターの直鎖化を示す概略図である。PmeI制限酵素直鎖化(図の上部に示す)により、ポリ(A)尾部の後に11ヌクレオチドの平滑末端オーバーハングが生じる。BspQI制限酵素(図の下部に示す)はポリ(A)尾部の末端で直鎖化を行い、3個のチミンヌクレオチドによる付着末端を生じる。3個のチミンヌクレオチドの存在は、最終的な自己増幅性mRNAにおける11ヌクレオチドの付着性平滑末端の存在と比較して、より良好なmRNA発現を促進するように思われる。
抗原デザイン
PNI A1
PNI A1は、ヒトにおける発現のためにコドンが最適化された、NCBIデータベース参照MN908947.3からの完全長SARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。元の配列(配列番号2及びTable 2(表3))及びコドン最適化配列(配列番号3及びTable 3(表4))を以下に示す。
ヒト化SARS-CoV-2スパイクタンパク質PNI A1を作製するために、コドン変更を行った。コドン変化をTable 4(表5)に示す。
PNI A2
PNI A2は、ヒトにおける発現のためにコドンが最適化された、NCBIデータベース参照MN908947.3からの完全長SARS-CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく(上に示すように)。スパイクタンパク質の融合前バージョンをコードさせ、SARS-CoV-2ウイルスのD614G優性変異系統を標的とするために、コドン最適化された配列において以下の点変異を作成した。変異を組み込んだ完全なコドン最適化配列を以下のTable 5(表6)に示す。コドン配列の主要な変化を以下のTable 6(表7)に示す。
Table 6(表7)は、ヒト化された融合前SARS-CoV-2スパイクタンパク質PNI A2を作製するために行われたコドン変更を示す。
PNI A3
PNI A3は、NCBIデータベース参照MN908947.3からの完全長SARS CoV 2表面糖タンパク質Sに基づく。完全なコドン最適化配列を以下のTable 7(表8)に示す。コドン配列に対する重要な変更をTable 8(表9)に示す。
Table 8(表9)は、PNI A3において行われたコドン最適化を示す。
PNI A4
PNI A4は、NCBIデータベース参照MN908947.3からの完全長SARS CoV 2表面糖タンパク質Sに基づき、D614G優性変異が組み込まれて哺乳動物細胞発現用にコドンが最適化されている。完全なコドン最適化配列を以下のTable 9(表10)に示す。
PNI A5
PNI A5は、NCBIデータベース参照MN908947.3からの完全長SARS CoV 2表面糖タンパク質Sに基づき、PNI A4について記載したように、D614G優性変異を組み込んで哺乳動物細胞発現用にコドンが最適化されている。しかし、PNI A5では完全なコドン最適化配列に追加の一ヌクレオチド塩基変化も作成されている(Table 10(表11))。
変化を伴う完全なコドン最適化配列を以下に示す。
PNI A6
PNI A6は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。以下の変異(Table 11(表13)に示す)を、元の配列に作成して、所望のE484K、N501Y、D614G、K986P及びK987Pを得た。
PNI A8
PNI A8は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。以下の変異(Table 12(表14))を、元の配列に作成して、所望のdel19H、del20V、delL144Y、S155P、E484K、N501Y、D614G、K986P及びK987Pを達成した。
PNI A9
PNI A9は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。詳細には、これはN末端にtPAシグナル配列(ATGgacgccatgaagcggggcctctgctgtgttctgctgctctgcggcgccgtgttcgtgagtaactcg)(配列番号8)を有するPNI A6の改変バージョンである。
PNI A10
PNI A10は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からの参照SARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。これはC末端にP2A sfGFP配列(Table 13(表15))を有する、NC_45512.2をコードする改変配列である。
PNI A11
PNI A11は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からの参照SARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。これは元のNC_45512.2配列のN末端ドメイン(NTD)、受容体結合ドメイン(RBD)、膜貫通ドメイン(TM)及びC末端ドメイン(CTD)を有する(Table 14(表16))。
PNI A12
PNI A12は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。これは、L18F、T20N、P26S、del 69-70HV、del144Y、D138Y、R190S、K417N、E484K及びN501Y改変を有するPNI A11配列の改変バージョンである(RBD Mut)。
PNI A13
PNI A13(Table 17(表19))は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。これは、N末端にtPAシグナル配列(69bp:PNI A9配列に関して記載した通り)を有し、RBDとTM-CTDドメインとの間にリンカー-フィブリチンフォルドン配列(Table 16(表18))を有する、PNI A12配列の改変バージョンである。
PNI A14
PNI A14(Table 19(表21))、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV-2表面糖タンパク質S。これは、N末端にtPAシグナル配列(69bp:PNI A9に関して前述した通り)を有し、NC_45512.2と同様のSS(Table 18(表20))、WT RBD及びTM-CTDを有する、PNI A11配列の改変バージョンである。
PNI A15
PNI A15(Table 20(表22))は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。これは、N末端にtPAシグナル配列(69bp:PNI A9に関して記載)を有し、NC_45512.2からのシグナル配列(SS)、RBD Mut(PNI A12 RBD)及びTM-CTDを有する、PNI A12配列の改変バージョンである。
PNI A16
PNI A16は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。これは、amino enhancer of split(AES)由来の2つの追加の3'非翻訳領域(UTR)(Table 21(表23))及びミトコンドリアにコードされる12S RRNA(mt-RNR1)(Table 22(表24))を有する、PNI A15の改変バージョンである。
PNI A17
PNI A17(Table 23(表25))は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。これは、以下の変異株の変異を組み込んでいる:
P1:K417N/T、E484K、N501Y、D614G
B.1.351:K417N、E484K、N501Y、D614G
B.1.427:L452R、D614G
B.1.429:S13I、W152C、L452R、D614G K986P、V987P
PNI A18
PNI A18は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV2表面糖タンパク質Sに基づく。これは、以下の変異株の変異を組み込んでいる:B 1.351株の変異:D80A、D215G、del 241、del 242、del 243、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V、K986P、及びV987P。
PNI A19
PNI A19(Table 25(表27))は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。これは、以下の変異株の変異を組み込んでいる:B 1.617株‐452R、484Q、K986P、V987P、144del、478K、69del、及び70del。
PNI A20
PNI A20は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。これは、N末端にtPAシグナル配列を有し、終止コドンの後の末端に3'AES UTR及び3'mtRNR1 UTRを有する、改変されたPNI A19である。
PNI A21
PNI A21(Table 26(表28))は、NCBIデータベース参照NC_45512.2からのSARS CoV-2表面糖タンパク質Sに基づく。これは、以下の変異株の変異を組み込んでいる:B.1.617.2株: T19R、(G142D*)、156del、157del、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、及びD950N。
(実施例2)
本実施例は、核酸治療薬(NAT)の脂質ナノ粒子(LNP)へのマイクロ流体混合を示す。
実施例1に記載されたベクターを、酢酸ナトリウム緩衝液を使用して独立に希釈して、必要な濃度にした。続いて、NANOASSEMBLR機器を使用して両方の流体を流すことによって、記載された通りの脂質核酸粒子(LNAP)試料を調製した。手短に述べると、総容量32μLの100mM酢酸ナトリウム緩衝液中の10～20μgの核酸を、NANOASSEMBLR Spark(商標)機器中で、N/P比(示される例では4、6又は10)によって必要とされるように、37.5mM脂質混合溶液16μLと混合した(Table 27(表29)参照)。得られた脂質核酸粒子(LNAP)を、水性アウトプットウェル中で、Ca++及びMg++を含まないpH 7.4の1X PBS 48μLで直ちに希釈した。これらのLNAPを、pH 7.4の同じ緩衝液96μLを含むマイクロ遠心管に直ちに収集した。封入効率は、改良Ribogreen(商標)アッセイ(Quanti-iT RiboGreen(商標) RNAアッセイキット、Fisher社)によって測定した。この情報を使用して、所望の用量を設定した。
脂質粒子を、試験のために、より大きなマイクロ流体ミキサー機器であるNANOASSEMBLR Ignite(商標)機器によっても製造した。手短に述べると、350μLのmRNAを、100mM酢酸ナトリウム緩衝液を使用して希釈して、0.2から0.3mg/mの必要な濃度にした。典型的には、12.5又は25mMの脂質混合溶液を使用した。続いて、両方の流体、すなわち水性溶媒中の核酸及びエタノール中の脂質混合物を流量比3:1及び総流量12ml/分でマイクロ流体ミキサー中に流すことによって、LNAPを調製した。マイクロ流体デバイス中で混合した後に、カートリッジ後の脂質核酸粒子試料を、3から40倍容量のpH 7.4のPBSを含有するRNアーゼ非含有チューブ内で希釈した。エタノールは、pH 7のPBS中での透析、Amicon(商標)遠心フィルター(Millipore, USA)の3000RPMでの使用、又はTFFシステムの使用のいずれかによって最終的に除去した。必要な濃度が達成されたところで、脂質核酸粒子を無菌条件下で0.2μmフィルターを使用して濾過滅菌した。最終的な封入効率は、Ribogreen(商標)アッセイによって測定した。Quant-iT(商標) RIBOGREEN RNA試薬及びキット(Invitrogen社)は、製造元の指示に従った。自己増幅性mRNA LNPの調製については、以下に記載する。観察された粒子特性は、脂質組成に応じて、mRNAについては一般に50～200nmのサイズであった。
Table 27(表29)に、本発明の態様によるワクチンと共に使用するための可能性のある脂質混合物を列挙する。VACCMIX-A又はVACCMIX-Bを、記載した実験に使用した。iL=イオン化可能脂質。他の頭字語はTable 27(表29)の下に定義している。
(実施例3)
本実施例は、脂質核酸粒子又は「LNP」の特性決定及び封入を示す。
上記のように脂質粒子を作成した後に、ZetaSizer(商標) Nano ZS(商標)機器(Malvern Instruments社、UK)を使用した動的光散乱(DLS)によって、LNAPの粒径(粒子の流体力学的直径)を測定した。波長633nmのHe/Neレーザーを光源として使用した。データは、後方散乱検出モード(測定角度=173)で実施した散乱強度データから測定した。測定は試料毎に平均10回ずつ行った。Z-平均サイズが粒径として報告され、高調波強度平均粒径として定義される。封入効率は、改良Ribogreen(商標)アッセイ(QuantiT RiboGreen(商標) RNAアッセイキット、Fisher社)によって測定した。全ての製剤において封入は良好であり、多分散性(PDI)は0.3未満であった。比較試験が必要とされた特定の製剤についてのサイズ測定、PDI、及び封入効率の結果を、図13A、図13B、及び図14に示す。他の状況では、サイズ、PDI及びEEは予想通りであったか、又は表形式で示される。
(実施例4)
本実施例は、ベクターPNI V101の調製を示す。
自己増幅性mRNA(saRNA)ワクチンのためのカスタム合成クローニングベクターPNI V101は、自己増幅性mRNAが内部に組み込まれる遺伝子機構である。本明細書では、この生成物を「nCoV PNI V101」と称する。これは、クローニングベクターnCoVPNI V101の内部に組み込まれた、ポリ(A)尾部を伴う自己複製機構とマルチクローニングサイトとの新規の組合せである。レプリコンの構造の図解を図1に示す。クローニングベクターnCoVPNI V101の内部に組み込まれた、ポリ(A)尾部を伴う自己複製機構とマルチクローニングサイトとの組合せにより、より大きなサイズのsaRNAの合成が可能になり、このsaRNAはインビトロ又はインビボで、目的の遺伝子(GOI)を含む裸のプラス鎖アルファウイルスRNAレプリコンを生成することができる。図2には、PmeI直鎖化を受ける、SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードする3822bpの遺伝子配列がPNI V101プラスミドに挿入されている代替的なnCoVPNI V101が示されている。このベクターは、ポリ(A)尾部の後に11ヌクレオチドの平滑末端オーバーハングを生成するが(図2の上部)、BspQI制限酵素は、3個のチミンヌクレオチドによる付着末端を生じるポリ(A)尾部の末端で直鎖化を行う(図2の下部)。
初期の試験には、NanoOrange(商標)タンパク質定量キット(Invitrogen社)を使用したが、最終的な生成物は、CEフラグメントアナライザーにより、5'UTR及び3'UTRを有するeGFP PNI V101 saRNAであると評価された。生成物はeGFP PNI V101 saRNAプラスミドDNA 8463ntである。
(実施例5)
本実施例は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするsaRNAベースのワクチンのインビトロ効力、サイズ、PDI及び封入効率を示す。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするsaRNAベースのワクチンを、LNP内で製剤化するためのNATとして作製した。抗原は製造可能性に従って選択した。抗原をコードする核酸をコドン最適化して試験した。PNI A1、A2及びA4は、プラスミドを直鎖化する能力のために、製造可能であることが証明されなかった。配列は実施例1に示されている。
ATCCから増殖させたHEK293及びBHK-570細胞を使用して、インビトロ効力アッセイを行った。βアクチン、トランスフェクションなし、及び陽性対照の市販スパイクタンパク質配列nCov CleanCap AU(Trilink社)を対照として使用して、電気泳動ゲルを行った。nCoV抗原をコードするPNI-v101(NAT)を、上記のようにPNI 516 VACCMIX-Aとマイクロ流体的に組み合わせた。図3A中のゲルは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質発現の差異が、Pme1及びBspQ1制限部位を有するベクターの間で観察されたことを示す。図3Bに示されるタンパク質バンドは、ベクターが無傷であることを示しており、これらはVEEV nsp2並びに抗原A1及びA3のタンパク質発現に対応する。
nCov PNI V101 A3のサイズ、PDI及び封入効率を図4に示す。他の抗原も同様の成績であった(結果は示されず)。
(実施例6)
本実施例は、実施例2のLNPワクチンをインビボでマウスに投与した結果を示す。
目的のsaRNA生成遺伝子、第1及び第2世代のA1、A3並びにA2、A4及びA5を含むベクターNCOV PNI V101 LNPワクチンを、インビボでスクリーニングした。マウスに第0日に接種し、続いて第28日にブースト接種を行った。血清をプライム接種の21、42及び50日後に採取した。
目的の遺伝子をコードするベクターNCOV PNI V101を独立に接種したマウスのIgGレベルを測定し、結果をプロットした。各群にはマウス5匹がおり、値は対数とした。図5は、LNPにおいて種々のmRNA nCoVスパイクタンパク質抗原デザインを独立してコードするベクターNcov PNI V101による処置後の抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質特異的IgGレベルの発現を示す。測定は、ELISAを使用して第42日及び第50日の血清試料で行った。
同様の試験において、他の対照を使用して、スパイク特異的IgGを測定した。この場合には、裸のPNI A3を対照として含めた。結果を図6に示す。図5及び図6の両方において、A3及びA5が最も優れた成績であった。更なるデータを図32に提示する。
結論:[VACCMIX-B PNI 516 LNPにおけるPNI V nCoV A3及びA5 saRNA]で処置された動物は、マウスモデルにおいて強力な抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質特異的IgGを誘発するように思われた。驚くべきことに、類似の抗原配列は同様の成績ではなかった。このことは、特定のスパイクタンパク質saRNAにより主導される抗原配列のみが有効なワクチン成分であることを示唆する。
(実施例7)
本実施例は、プソイドビリオン中和アッセイを示す。
プソイドビリオンは、レプリコン又はエンベロープタンパク質及びスパイクタンパク質成分の援助の上乗せなしに被験抗原配列が埋め込まれた対照ワクチン配列である。これは特異的ウイルスの他の成分の非存在下で抗原を試験するものであり、抗原の有効性の別の尺度となる。
マウスにベクターnCoV PNI V101プソイドビリオンワクチンを接種した。50日後にマウスを鎮静させ、失血により殺処理を行った。血液を遠心分離し、血清を96ウェルプレート上でウェル当たり50μlの容量で2倍ずつ連続希釈した。偽ウイルスpsV-SARS-CoV-2を各ウェルにTCID50でウェル当たり50μl添加し、37℃で1時間インキュベートした。続いて細胞株Vero E6細胞をウェル当たり100μL添加した。
プレートを再び37℃で72時間インキュベートした。この後に上清を除去し、50μlのビート根汁溶解緩衝液を各ウェルに添加した。
プレートリーダーで発光を測定し、結果を収集して分析した。試験の結果を図7A～図7B及び図8に示す。この結果は、PNI A5に関する完全なsaRNAワクチンという知見を裏付ける。
(実施例8)
本実施例は、実施例1のベクターをマウスに投与した後のSARS-CoV-2武漢株ウイルスに対する中和抗体価を示す。
Gen PNI V nCoV(PNI A5)saRNA PNI 516 LNPを接種した5匹の動物の別の試験において、SARS-CoV-2武漢株ウイルスに対する中和抗体価をアッセイした。
マウスにベクターnCoV PNI V101ワクチンを接種して、50日後に鎮静させ、失血により殺処理を行った。血液を遠心分離し、血清を96ウェルプレート上でウェル当たり50μlの容量で2倍ずつ連続希釈した。偽ウイルスpsV-SARS-CoV-2を各ウェルにTCID50でウェル当たり50μL添加し、37℃で1時間インキュベートした。続いて細胞株Vero E6細胞をウェル当たり100μL添加した。
プレートを再び37℃で72時間インキュベートし、その後に上清を除去して、50μlのビート根汁溶解緩衝液を各ウェルに添加した。
プレートリーダーで発光を測定し、結果を収集して分析した。試験の結果を図7A～図7B及び図8に示す。この結果は、PNI A5に関する完全なsaRNAワクチンという知見を裏付ける。
図9に示すように、結果はp<0.0001、二元配置ANOVAで統計的に有意であった。PNI V101 nCoV PNI A5 saRNA PNI 516 LNPは、他のnCoV saRNA PNI 516 LNP候補と比較して、マウスにおいて優れた体液性免疫応答(血清中のSARS CoV2特異的IgG)を誘発し、元のSARS-CoV-2(武漢)ウイルス株に対して高い中和抗体価を誘導した。
変異株についても検討した。プラーク減少中和試験(PRNT)では、アルファ変異株hCov-19/Japan/TY7-503/2021(BRAZIL P.1)/BEI/NR-54982、PNI V101 nCov A5 PNI 516 LNPが、陽性対照(回復期ヒト血清)及び陰性対照(非感染マウス血清)と比較して優れていた。結果を図20A及び図20Bに示す。ベータ変異株SARS Cov2 South Africa/KRISPECKOO5321/2020/NR-54008(ベータ)に対する類似の試験も、対照と比較して優れていた。ベータ変異株に関する結果を図20Cに示す。デルタ変異株hCov19 USA/PHC658/2021 BEI/NR 55116についても、A5抗原型が対照より優れていた。結果を図20D及び図20Eに示す。無血清ウイルスと比較してプラーク数を50%減少させる血清濃度は、抗体がどの程度存在するか、又はそれがどの程度有効であるかの尺度となる。この測定値をPRNT50値と呼ぶ。対照と比較してプラークを90%減少させる希釈がPRNT90である。
SARS-CoV-2デルタ変異株に関する追加の中和データを図33及び図36に示す。
SARS-CoV-2オミクロン変異株に関する追加の中和データを図34及び図37に示す。
SARS-CoV-2特異的IgG力価の発現についても、2つの異なるイオン化可能脂質組成物からの脂質ナノ粒子中に封入されたPNI A5抗原により処置された非ヒト霊長類(NHP)において試験した(図35)。
(実施例9)
本実施例は、マウスのT細胞に対する実施例2のLNPによる接種の影響を示す。
LNP中にある種々の抗原形態(Table 28(表30))が接種されたマウスの血清を処理して、T細胞を単離した。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質特異的IgGの産生は、インビボでのワクチンの有効性を調べるための直接的な試験である。直接的な酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して、脂質ナノ粒子(LNP)ベースのワクチンの有効性を検出した。マウスに指定の時間間隔でワクチンを2回筋肉内投与し、2回目の投薬(ブースター)の2週後に血清を採取した。血清を連続希釈して(1:100,000)、アッセイの検出限界(LOD)内で検出するための所望の濃度を達成した。原則として、組換えSARS CoV2スパイクタンパク質を使用してELISAプレート上にコーティングし、続いてそれを希釈した血清に曝露させた。ワクチン接種後にSARS CoV2スパイクタンパク質に対してマウスで生成された抗体は、コーティングされたタンパク質に結合すると考えられる。SARS CoV2スパイクタンパク質に対する十分に立証された中和マウスモノクローナル抗体を、アッセイの標準物質として使用した。全ての血清を定量し、抗マウスIgG HRPを使用して、標準抗体の様々な濃度に対して試験した。抗体-リガンド相互作用を、無色のTMB基質の青色溶液へのHRP変換に基づく明確な比色法を使用して特異的に検出した。この時間依存的な色形成を、酸溶液によって更に停止し、450nmで分光光度計で検出した。光学密度(OD)の読み取り値をExcelファイルに変換し、各データポイントを標準物質から作成された勾配を使用して定量した。
マウスのCD4陽性又はCD8陽性T細胞に対する接種の影響を調べた。SARS-CoV-2武漢株ウイルスに対して特異的な生細胞(T細胞)のパーセンテージとしてのCD4陽性T細胞を図10に示す。
生細胞のパーセンテージとしてのCD4+IFNガンマ陽性細胞頻度を図10に示す。生細胞のパーセンテージとしてのCD4+TNFアルファ陽性細胞頻度を図10に示し、生細胞のパーセンテージとしてのCD4+IFNガンマ陽性TNFアルファ陽性細胞頻度を測定して、図10に示す。多機能性CD4陽性T細胞応答はウイルスの排除を裏付け、抗ウイルスCD8陽性を助長する。第2世代PNI V101 nCoV(PNI A5)saRNA PNI 516 LNPにより処置された動物は、元のSARS-CoV-2(武漢株)ウイルスに対して多機能性CD4陽性T細胞応答を誘導するように思われる。種々のワクチン接種条件に対するPMA、スパイクタンパク質及びRPMI発現を、Table 29(表31)に示す。
(実施例10)
本実施例は、実施例2のLNPによるワクチン接種を受けたマウスにおけるSARS-CoV-2武漢株ウイルスに対するCD8陽性T細胞応答を示す。
CD8+パーセンテージのみに関する、CD8陽性T細胞に対するワクチン候補の効果に関するインビトロ試験において、IFNガンマ陽性のみ、TNFアルファ陽性のみ、IFNガンマ陽性及びTNFアルファ陽性、並びにIFNガンマ陽性、TNFアルファ陽性及びIL2+陽性を共に測定した。IFNガンマ、TNFアルファ、及びIL2+レベルを有する多機能性CD8+T細胞を測定した。
図11は、Table 30(表32)の条件下で測定されたIFNガンマ陽性、TNFアルファ陽性、及びIL2+陽性CD8陽性T細胞のパーセンテージを示す。第2世代PNI V101 nCoV(PNI A5)saRNA PNI 516 LNP及びPNIリードsaRNA PNI 516 LNPの両方により処置された動物は、元のSARS-CoV-2(武漢株)ウイルスに対して多機能性CD8陽性T細胞応答を誘発するように思われる。
元のSARS-CoV-2(武漢株)ウイルス株に対するCD4陽性及びCD8陽性T細胞免疫応答の両方が、第2世代PNI V101 nCoV(PNI A5)saRNA PNI 516 LNPにおいて観察された。
(実施例11)
本実施例は、実施例2のLNPに対するイオン化可能脂質の効果を示す。
PNI 516の代わりにいくつかの異なるイオン化可能脂質をNP 6及びNP 8で試験し、その変化が効力及び他の特性にどのような効果を及ぼすかを調べた。
種々のイオン化可能脂質構造を含むLNPの効力を試験した。LNPは、PNI A3抗原をコードするnCov PNI V101自己増幅性mRNAを含んでいた。VACCMIX-A及びVACCMIX-B(Table 27(表29)参照)は、試験したうちで最良の製剤比であった(有効性の低い製剤の結果は示されず)。窒素のリン酸に対する比がN/P 8又はN/P 6のいずれかで、PNI 516、PNI 541、PNI 568、PNI 550、PNI 560、PNI 542、PNI 580、PNI 586、PNI 585、PNI 584、及びPNI 563により作成された製剤について、接種されたマウスにおける血清中の抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質特異的IgGレベルを図12に示す。これらの化合物の構造は、PCT公開第WO20252589号又は同第WO21000041号に開示されている。各動物の血清を黒丸印で示す。対照には、裸のA3 saRNA及び陰性対照が含まれる。結果のグラフを図12に示す。種々のイオン化可能脂質がA3 nCoV-PNIワクチン血清について有効であった。A3活性は、図12に示すように、種々のイオン化可能脂質によって強化された。
他の場合と同様に、N/P 6試料はより大きな粒子を生成した。EEは典型的には86%から99%の範囲であった。N/P 6比の試料はわずかにより低い封入効率を有した。これらの結果を図13A及び図13Bに示す。
約-80℃で10週間貯蔵した後に、粒径及びPDIの有意な変化は観察されなかった(図21A)。約-80℃(図21B)で10週間貯蔵した後に、封入効率の有意な変化は観察されなかった。
-80℃で約10週間貯蔵した後に、試料を解凍した。saRNAの完全性をゲル電気泳動で試験した。結果を図22に示す。ほとんどの試料について、saRNAバンドは裸のA3と同等であった。
(実施例12)
本実施例は、PNI抗原、イオン化可能脂質及び実施例2のLNPのN/P比についてのインビボスクリーニングを示す。
VACCMIX-Aベクター中の2μg/mLのPNI抗原のインビトロ発現のウエスタンブロット検査において、ほとんどのイオン化可能脂質について、N/P 8と比較してN/P 6で、同等又はより良好なスパイクタンパク質発現が認められた(Table 31(表33))。
(実施例13)
本実施例は、マウス血清におけるスパイクタンパク質IgGの発現を示す。
接種を受けたマウスにおけるスパイクタンパク質IgG発現について、粒径は70～95nmの範囲であり、PDIは0.115未満であった。第2世代saRNAが封入されたLNPはわずかにより大きく、封入効率(EE)は96.5～99%であった。全てのLNPは、許容可能なサイズ、PDI範囲及びEEの範囲内であった。全体的な結果では、A5が他の抗原よりも優れていた(Table 32(表34))。
(実施例14)
本実施例は、エレクトロポレーション(1つのB18R変異株)モデルにおけるeGFP PNI V101レプリコンの有効性を示す。
2種類のeGFP PNI V101レプリコンを、HEK293細胞で試験した。両方の種類について、エレクトロポレーションの24時間後に蛍光顕微鏡検査を行った。図15は、対照(非処置)、陽性対照(eGFP)、PNI V101レプリコン、及び変異株B18Rレプリコンに関するエレクトロポレーション後の結果を示す。PNI V101レプリコンは非常に有効であり、対照よりも多くのシグナルを与えた。
(実施例15)
本実施例は、eGFP PNI V101レプリコンの有効性を示す。
BHK細胞を、リポフェクタミンと会合させたeGFP PN101に曝露させた。蛍光顕微鏡検査を、明視野分析と並んで緑色フィルターを用いても実施した。図17に示すように、対照及びPNI V101トランスフェクト試験の両方で細胞は健康に見え、eGFP発現は4μgの用量で良好であった。
(実施例16)
本実施例は、eGFP PNI V101レプリコンの有効性を示す。
HEK293細胞に対してインビトロで、4及び1μgのeGFP-PNI V101、4及び1μgの陰性対照、陽性対照GFPによるトランスフェクション、及びモックトランスフェクションを行った。MFIを領域毎に測定し、各集団についてGFP発現を示す。PNI V101は、インビトロでのGFP発現について成績が良好であった。結果を図16及びTable 33(表35)に示す。
(実施例17)
本実施例は、単なるSARS nCov-2ワクチンエレメントを上回るものを送達するPNI V101レプリコンの能力を示す。
WB中のインフルエンザA H1N1 HAポリクローナル抗体(カタログ番号:PA5-34929、Invitrogen社)を、PNI V101レプリコンによって細胞に送達した。BHK-570細胞を被験薬剤によりインビトロ処置し、続いて24時間後に処理して、タンパク質をゲル上で泳動させた。ベータアクチンを対照とし、非処置のものを陰性対照とした。PNI 516 VACCMIX-A LNPが担体であった。HA発現は用量依存的であった。結果を図19に示す。
(実施例18)
本実施例は、LNP中のイオン化可能及び構造脂質のスクリーニングを示す。
これらの実験のための試験群をTable 34(表36)に示す。
HEK 293細胞を、Table 34(表36)のLNPにより0.25μg/mLで処置した。SARS-CoV-2スパイクタンパク質濃度を測定した。一般的な傾向は、最も高いタンパク質濃度がDOPCを含むLNPで見出され、次に高いタンパク質濃度がDPPCを含むLNPで見出され、3番目に高いタンパク質濃度がDSPCを含むLNPで見出されるというものであった(図23)。
Table 34(表36)のLNPについてのサイズ測定、PDI、及び封入効率(EE)の結果を、図24(サイズ及びPDI)及び図25(EE)に示す。サイズの範囲は60から100nmであると決定された。PDIの範囲は0.1未満であった。DOPCを含むLNPは、より大きなLNPを生じた。EEの範囲は90から99%であった。DOPCを含むLNPは、わずかにより低いEE値を提供した。
(実施例19)
本実施例は、LNPのサイズ及びPDIの安定性を示す。
LNPを、以下の一般的な処方に従って、様々なイオン化可能脂質及び構造脂質を用いて調製した:47.5%のイオン化可能脂質、38.5%のコレステロール、12.5%n構造脂質、及び1.5%のPEG-DMG。ペイロードはPNI A5であった。構造脂質はDSPC、DOPC、又はDPPCであった。イオン化可能脂質は、Table 34(表36)に記載されているものの1つとした。サイズ及びPDIの安定性を、貯蔵時間なし(新鮮な製剤)、1週間の貯蔵後及び1か月間の貯蔵後に測定した。結果を図26に示す。
封入効率の安定性を、貯蔵時間なし(新鮮な製剤)、1週間の貯蔵後、及び1か月間の貯蔵後に測定した。結果を図27に示す。
種々のイオン化可能脂質及び構造脂質を用いて調製したLNPから抽出されたA5抗原の量を、1週間の貯蔵後(図28及び図30)、及び1か月間の貯蔵後(図29～図30)に、ゲル電気泳動によって測定した。
製剤PNI 541 LNPの安定性を、4℃で5か月間貯蔵した後に測定した。4℃で5か月間貯蔵したLNPの安定性分析による脂質のクロマトグラムを示すグラフを作成して検討した。LNPの各脂質成分、例えば、ステロール、DSPC、PEG-DMG及びPNI 541の無傷の分子シグネチャーが観察された。
(実施例20)
本実施例は、nCoV saRNA LNPが接種されたBALB/cマウスにおいてSARS-CoV-2に対する中和抗体が産生されることを示す。
nCoV saRNA LNPが接種されたマウス由来の血清を、プラーク減少中和試験(PRNT)又はプソイドビリオン中和に基づくアッセイに使用した。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2の分離株WA1(SARS-CoV-2/WA1/2020)(BEI:NR-52281)に対して誘導された中和抗体を、48匹のマウス血清においてプラーク減少中和試験(PRNT)によって評価した。SARS-CoV-2ワクチンを十分に接種された男性個体から採取した2人分のヒト血清及び回復期の非霊長類ヒト(NPH)血清を陽性SARS-CoV-2 Ab血清として使用した。ナイーブマウス血清を陰性SARS-CoV-2 Ab血清として使用した。
血清を56℃で30分間インキュベートした。各血清の連続2倍希釈物(1/2から1/64)を調製した。各希釈物の15μlと、30プラーク形成単位(PFU)のウイルスを含有するSARS-CoV-2原液15μlを混合して、37℃で1時間インキュベートした。SARS-CoV-2の力価は、Vero E6細胞に対するプラークアッセイによって決定した。12ウェルプレート中のVero E6細胞の単層の上清を除去して、200μlのdouble minimum essential eagle medium(DMEM)を各ウェルに添加した。続いて、100μlのDMEMをウイルスと血清との各30μlの混合物に添加し、各ウェルの全混合物を単層Vero-E6に添加して、37℃でインキュベートした。インキュベーション時間中はプレートを10～15分間毎に振盪した。1時間のインキュベーションの後に、2X DMEM及び0.6%アガロースを1:1の比率で含有する1.5mlの上層を各ウェルに添加し、37℃でインキュベートした。インキュベーションの72時間後に、細胞の固定のために10%ホルムアルデヒド0.5mlを各ウェルに添加し、プレートをバイオセーフティキャビネット下で一晩室温に保った。固定後に、10%ホルムアルデヒドを回収し、ホルマリン廃棄物用のラベル付きボトルで保存した。アガロースのパレットをウェルから除去し、各ウェルに十分な量の1%クリスタルバイオレットを添加して10～15分間置いて細胞を染色した。クリスタルバイオレットを回収し、漂白剤を含有する廃棄用容器に廃棄した。ウェルを水洗いして、各ウェルのSARS-COV-2プラークを計数した。
力価は、プラーク数の90%減少(PRNT90)に基づいて計算した。本試験では、より低いカットオフ値(PRNT50)を使用した抗体価よりもPRNT90力価の方が好ましいが、これは、ウイルス中和試験で通常推奨される100PFUではなく、30PFUのウイルスのみを使用したためである。
各マウス血清について、30PFUのSARS-CoV-2/WA1/2020に対する中和抗体の力価を、図31及びTable 35(表37)に示す。ウイルスのPFUを3PFU以下に低下させる血清の最大希釈度を、PRNT90に基づくSARS-CoV-2に対する中和抗体の力価とした。結果は、血清の希釈にかかわらず、ナイーブマウス血清の各希釈物について約30PFUのウイルスが存在することを示した。陽性対照血清ではPRNT90に基づく中和抗体の高い力価は検出されなかったが、ヒト陽性対照血清及びNPH陽性対照血清の両方でウイルス粒子の数が減少した。
(実施例21)
本実施例は、配列番号1のカスタマイズ可能なベクターの汎用性を示す。
influenza A/California/07/2009(H1N1)の赤血球凝集抑制(HAI)力価レベルを、PNI 516 LNP中に封入されたH1N1 HA saRNAにより6～8週齢の雌BALB/cマウスを処置した後に測定した。結果を図38に示す。
influenza A/California/07/2009(H1N1)HA PNI 516 LNP試料の物理化学的特性の試験により、流体力学的粒径が100nm未満の範囲にあることが示された(図39)。粒子のゼータ電位はほぼ中性であったが、幾分負に荷電していた(図40)。封入効率(%EE)は、90%よりも大きかった(図41)。
本明細書に引用された刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれることが個別に且つ具体的に示され、その全体が本明細書に記載されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明を説明する文脈における用語「1つの(a)」及び「1つの(an)」及び「その(the)」及び「少なくとも1つ」並びに同様の指示対象の使用(特に以下の特許請求の範囲の文脈において)は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾する場合を除いて、単数形及び複数形の両方をカバーするものと解釈されるべきである。「少なくとも1つ」という用語の後に続く1つ又は複数の項目のリスト(例えば、「A及びBの少なくとも1つ」)の使用は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾する場合を除いて、列挙された項目(A又はB)から選択された1つの項目、又は列挙された項目(A及びB)の2つ以上の任意の組合せを意味するものと解釈される。「含むこと(comprising)」、「有すること(having)」、「含むこと(including)」、及び「含むこと(containing)」という用語は、別段の指示がない限り、制約のない用語(すなわち、「を含むが、これに限定されない」を意味する)として解釈される。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、その範囲内に収まるそれぞれの別個の値を個別に参照するための簡便な方法として役立つことを単に意図しており、それぞれの個別の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾する場合を除いて、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供される任意及び全ての例、又は例示的な言葉(例えば、「等」)の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、別段の主張がない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠なものとして特許請求の範囲に記載されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
本発明の好ましい態様は、本発明を実施するために本発明者に公知である最良の形態を含めて、本明細書に記載される。これらの好ましい態様の変形は、前述の説明を読むことによって当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変形を適宜使用することを期待しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載された以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用される法律によって認められるように、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正及び同等物を含む。更に、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に矛盾する場合を除き、全ての可能な変形における上記の要素の任意の組合せは、本発明による範囲に含まれる。

Claims (26)

  1. (a)ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)5'非翻訳領域(5'-UTR);
    (b)VEEV非構造タンパク質nsP1、nsP2、nsP3及びnsP4をコードするヌクレオチド配列;
    (c)VEEV 26Sサブゲノムプロモーター;
    (d)操作されたマルチクローニングサイト(MCS);
    (e)VEEV 3'非翻訳領域(3'-UTR);並びに
    (f)VEEVポリA配列をコードするヌクレオチド配列
    を含むヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
  2. VEEVポリA配列をコードするヌクレオチド配列が、38から40塩基対を含む、請求項1に記載の組換え発現ベクター。
  3. VEEV 26Sサブゲノムプロモーターが、VEEV TC83株26Sサブゲノムプロモーターである、請求項1又は2に記載の組換え発現ベクター。
  4. 目的の遺伝子が、操作されたMCSに挿入可能である、請求項1～3のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  5. 5'から3'の順に、以下の成分を含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター:
    (a)VEEV 5'非翻訳領域(5'-UTR);
    (b)VEEV非構造タンパク質nsP1、nsP2、nsP3及びnsP4をコードするヌクレオチド配列;
    (c)VEEV 26Sサブゲノムプロモーター;
    (d)操作されたMCS;
    (e)VEEV 3'非翻訳領域(3'-UTR);並びに
    (f)VEEVポリA配列をコードするヌクレオチド配列。
  6. MCSが、VEEVポリA配列をコードするヌクレオチド配列の5'末端又は3'末端に直接隣接して位置する、請求項1～4のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  7. ColE、複製起点(ori)、tetプロモーター、及び1つ又は複数の抗生物質耐性遺伝子のうちの1つ又は複数を含むベクター骨格を含む、請求項1～6のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  8. 細菌ベクター骨格又は改変された細菌ベクター骨格を含む、請求項1～7のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  9. 5'UTRの5'末端に隣接するT7プロモーターを含む、請求項1～8のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  10. 配列番号1と少なくとも85%同一なヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の組換え発現ベクター。
  11. 配列番号1と少なくとも95%同一なヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の組換え発現ベクター。
  12. 配列番号1のヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の組換え発現ベクター。
  13. 操作されたMCSに挿入された配列番号2～7のいずれか1つのヌクレオチド配列を更に含む、請求項1～12のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  14. 操作されたMCSに挿入された2シストロン性遺伝子エレメントを更に含み、2シストロン性遺伝子エレメントが、(i)配列番号2～7のいずれか1つのヌクレオチド配列、及び(ii)配列番号9のヌクレオチド配列を含む、請求項1～12のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  15. 操作されたMCSに挿入された2シストロン性遺伝子エレメントを更に含み、2シストロン性遺伝子エレメントが、(i)SARS-CoV-2スパイクタンパク質アミノ酸配列又は改変されたSARS-CoV-2スパイクタンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、及び(ii)リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1～12のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  16. リーダー配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号8又は11のヌクレオチド配列を含む、請求項15に記載の組換え発現ベクター。
  17. 操作されたMCSに挿入された2シストロン性遺伝子エレメントを更に含み、2シストロン性遺伝子エレメントが、(i)SARS-CoV-2スパイクタンパク質アミノ酸配列又は改変されたSARS-CoV-2スパイクタンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、及び(ii)3'非翻訳領域(UTR)を含む、請求項1～12のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  18. 3'UTRが、配列番号12又は配列番号13のヌクレオチド配列を含む、請求項17に記載の組換え発現ベクター。
  19. 請求項1～18のいずれか一項に記載の組換え発現ベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  20. 薬学的に許容される担体が、脂質ナノ粒子である、請求項19に記載の医薬組成物。
  21. 脂質ナノ粒子が、
    (a)イオン化可能なカチオン性脂質;
    (b)構造脂質;
    (c)安定剤;及び
    (d)ステロール
    を含む、請求項20に記載の医薬組成物。
  22. 脂質ナノ粒子が、約20mol%から約70mol%のイオン化可能なカチオン性脂質を含む、請求項20又は21に記載の医薬組成物。
  23. 脂質ナノ粒子が、約5mol%から約45mol%の構造脂質を含む、請求項20～22のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  24. 脂質ナノ粒子が、約15mol%から約45mol%のステロールを含む、請求項20～23のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  25. 脂質ナノ粒子が、約0.2mol%から約5mol%の安定剤を含む、請求項20～24のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  26. ナノ粒子が、約50nmから約130nmのサイズを有する、請求項20～25のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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