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JP2024536859A - 解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導するトランス代謝分子と組み合わせたキメラ受容体ポリペプチド及びその治療的使用 - Google Patents

解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導するトランス代謝分子と組み合わせたキメラ受容体ポリペプチド及びその治療的使用 Download PDF

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JP2024536859A JP2024518776A JP2024518776A JP2024536859A JP 2024536859 A JP2024536859 A JP 2024536859A JP 2024518776 A JP2024518776 A JP 2024518776A JP 2024518776 A JP2024518776 A JP 2024518776A JP 2024536859 A JP2024536859 A JP 2024536859A
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Abstract

グルコース代謝産物を再誘導する１つ以上の因子と、任意選択的に、目的の標的抗原に結合することができるキメラ受容体ポリペプチド（例えば、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチド、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、又はＴＣＲポリペプチド）と、を発現する、遺伝子操作された造血細胞。また、本明細書に開示されるのは、標的抗原を発現する細胞をそれを必要とする対象において阻害するための操作された造血細胞の使用である。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月２７日に出願された米国仮出願第６３／２４８，６２９号、及び２０２２年８月１９日に出願された米国仮出願第６３／３９９，３２４号の出願日の利益を主張するものであり、これらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、キメラ受容体ポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＡＲ）及び代謝経路から代謝産物を再誘導する因子を発現する遺伝子改変された免疫細胞に関する。本発明は更に、ＣＡＲ－ＮＫ又はＣＡＲ－Ｔに関し、特に、がんを治療するためのその使用に関する。
がん免疫療法は、細胞ベースの療法を含み、正常な組織を温存しながら、腫瘍細胞を攻撃する免疫応答を誘発するために使用される。これは、薬物耐性の遺伝子及び細胞機序を回避し、正常組織を温存しながら腫瘍細胞を標的とする可能性があるため、様々なタイプのがんを治療するための有望な選択肢である。
細胞ベースの療法は、がん細胞に対して偏った反応性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を含み得る（Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９０（２）：７２０－７２４（１９９３）、Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６２（１０）：５９３１－５９３９（１９９９）、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，９（３）：２７９－２８６（２００３）、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１（４）：１６３７－１６４４（２００３）、Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１８（４）：６７６－６８４（２００４））。細胞ベースの免疫療法は、有望な治療効果を示しているが、悪性腫瘍細胞と非形質転換細胞との間の相互作用によって生成される細胞環境である腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の特定の特徴によって引き起こされる課題に直面している。
したがって、ＴＭＥに照らして細胞ベースの免疫療法の有効性を改善するための戦略を開発することは非常に重要である。
本開示は、細胞ベースの免疫療法において使用するための、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチド、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドなどのキメラ受容体ポリペプチドを発現するものを含む、免疫細胞などの造血細胞における解糖経路からグルコース代謝産物を転用又は再誘導するための戦略の開発に基づく。解糖経路からのグルコース代謝産物の再誘導は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、好ましくは免疫細胞（例えば、αβ若しくはγδ Ｔ細胞又はＮＫ細胞）、本明細書に記載されるものなどの１つ以上の因子（例えば、タンパク質又は核酸）を発現させる（例えば、過剰発現させる）ことによって達成され得る。そのような遺伝子操作された免疫細胞は、同じタイプの天然の造血細胞と比較して、例えば、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／又は低酸素環境（例えば、ＴＭＥ）において、増強された代謝活性を有することが予想される。そのため、造血細胞における解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する１つ以上の因子（例えば、ポリペプチド又は核酸）と、キメラ受容体ポリペプチドと、を共発現する造血細胞（例えば、ＨＳＣ）又は免疫細胞は、（例えば、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／又は低酸素条件下で）優れた生物活性、例えば、細胞生存、細胞増殖、その活性化された表現型（例えば、ＩＬ－２又はＩＦＮ－γの産生などのサイトカイン産生の増加）、細胞傷害性活性、及び／又はインビボ抗腫瘍活性を示すであろう。
したがって、同じタイプの野生型免疫細胞と比較してグルコース濃度の細胞内調節が変化した改変された（例えば、遺伝子操作された）造血細胞（例えば、ＨＳＣ、好ましくは免疫細胞（例えば、αβ若しくはγδ Ｔ細胞又はＮＫ細胞）が、本明細書に提供される。いくつかの事例では、改変された免疫細胞は、グルコース代謝産物、例えば、グルコース代謝産物を解糖経路から転用又は再誘導させるポリペプチドを再誘導する因子を発現するか、又は過剰に発現し得る。グルコース代謝産物を再誘導する因子のうちのいずれかを発現する改変された免疫細胞は、その因子をコードする外因性核酸が導入され、その結果、得られた改変された免疫細胞においてコードされた因子が発現されるが、未改変の親細胞はそのような因子を発現しない、遺伝子操作された免疫細胞を指す。グルコース代謝産物を再誘導する因子のうちのいずれかを過剰に発現する改変された免疫細胞は、未改変の親細胞と比較して、因子の発現レベルを増強するように操作されている、遺伝子操作された免疫細胞を指す。いくつかの事例では、改変された免疫細胞は、因子をコードする内因性遺伝子の発現を増強するように操作され得る。代替的に、改変された免疫細胞は、改変された免疫細胞において追加の量の因子を産生するための因子をコードする外因性核酸をトランスフェクトするように操作され得る。
グルコース代謝産物を再誘導する因子は、基質を解糖経路から直接（例えば、グルタミン－フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ１（ＧＦＰＴ１））又は、例えば、解糖経路におけるグルコース分解の速度を低下させることによって、間接的に（例えば、ＴＰ５３誘導性解糖及びアポトーシス調節因子（ＴＩＧＡＲ）、ピルビン酸キナーゼ筋アイソザイムＭ２（ＰＫＭ２）バリアントのＰＫＭ２）転用又は再誘導し得る。解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する例示的なポリペプチドとしては、ピルビン酸キナーゼ筋アイソザイムＭ２（ＰＫＭ２）、グルタミン－フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ１（ＧＦＰＴ１）、ＴＰ５３誘導性解糖及びアポトーシス調節因子（ＴＩＧＡＲ）、及びその機能性バリアント（例えば、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅ、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄ、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒ、及びＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な例では、グルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドは、ＴＩＧＡＲである。
改変された免疫細胞は、キメラ受容体ポリペプチドを更に発現し得、これは、（ａ）細胞外標的結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質ドメイン）を含み得る。一実施形態では、同じタイプの天然の免疫細胞と比較してグルコース代謝が変化した遺伝子操作された免疫細胞であって、免疫細胞が、（ｉ）解糖経路からグルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドと、（ｉｉ）キメラ受容体ポリペプチドと、を発現又は過剰に発現し、キメラ受容体ポリペプチドが、（ａ）細胞外標的結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む、キメラ受容体ポリペプチドを含む、免疫細胞。本明細書に開示されるキメラポリペプチドのうちのいずれかは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを更に含み得る。他の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、共刺激シグナル伝達ドメインを含まなくてもよい。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、細胞外Ｆｃ結合ドメイン（ａ）を含む、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）である。他の実施形態では、キメラ受容体は、細胞外抗原結合ドメイン（ａ）を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。代替的に、又は加えて、細胞質シグナル伝達ドメイン（ｃ）は、キメラ受容体ポリペプチドのＣ末端に位置する。いくつかの実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、これは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε ＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γ ＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δ ＴＣＲサブユニット、又はＣＤ３ζ ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメイン又はその一部を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド、ＣＡＲ、又はＴＣＲポリペプチド）は、（ａ）のＣ末端及び（ｂ）のＮ末端に位置するヒンジドメインを更に含み得る。他の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、いずれのヒンジドメインも含まなくてもよい。更に他の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチド、例えば、ＡＣＴＲポリペプチドは、いずれの非ＣＤ１６Ａ受容体からのヒンジドメインも含まなくてもよい。代替的に、又は加えて、キメラ受容体ポリペプチドは、そのＮ末端にシグナルペプチドを更に含む。別の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメイン（ｃ）は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキメラ受容体ポリペプチドは、Ｆｃ結合ドメイン（ａ）を含むＡＣＴＲポリペプチドであり得る。いくつかの例では、（ａ）のＦｃ結合ドメインは、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、例えば、Ｆｃ－ガンマ受容体、Ｆｃ－アルファ受容体、又はＦｃ－イプシロン受容体の細胞外リガンド結合ドメインであり得る。特定の例では、Ｆｃ結合ドメインは、ＣＤ１６Ａ（例えば、Ｆ１５８ ＣＤ１６Ａ又はＶ１５８ ＣＤ１６Ａ）、ＣＤ３２Ａ、又はＣＤ６４Ａの細胞外リガンド結合ドメインである。他の例では、（ａ）のＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する抗体断片であり得る。例えば、抗体断片は、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ）であり得る。追加的に、（ａ）のＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分又はそのＦｃ結合断片に結合する天然に存在するタンパク質であり得る。例えば、Ｆｃ結合ドメインは、タンパク質Ａ若しくはタンパク質Ｇ、又はそのＦｃ結合断片であり得る。更なる例では、（ａ）のＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分と結合する合成ポリペプチドであり得る。例としては、Ｋｕｎｉｔｚペプチド、ＳＭＩＰ、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、又はアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキメラ受容体ポリペプチドは、細胞外抗原結合ドメイン（ａ）を含むＣＡＲポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、（ａ）の細胞外抗原結合ドメインは、腫瘍抗原、病原性抗原、又は自己抗原に特異的な免疫細胞に結合する単鎖抗体断片である。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、血液腫瘍に関連する。例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＬｅＹ、ＣＤ１３８、ＣＤ５、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＣＤ４０、及びＩＬ－１ＲＡＰが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、固形腫瘍に関連する。例としては、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＦＯＬＲ（例えば、ＦＯＬＲ１又はＦＯＬＲ２）、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥＦＧＲＶＩＩＩ、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦＲ２、ＲＯＲ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤ１７１、ＣＤ１３３、ＰＳＣＡ、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ、ＣＤ７０、ＭＵＣ１６、Ｌ１－ＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、及びＣＡＩＸが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、病原性抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、又は真菌抗原、例えば、本明細書に記載されるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドのうちのいずれか（ｃ）における細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、ＡＣＴＲ又はＣＡＲポリペプチド）は、ＣＤ３ζ又はＦｃεＲ１γの細胞質ドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲ又はＣＡＲポリペプチド）のうちのいずれかのヒンジドメインは、該当する場合、ＣＤ２８、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ８ａ、ＩｇＧ、マウスＣＤ８α、又はＤＡＰ１２のものであり得る。他の例では、ヒンジドメインは、天然に存在しないペプチドである。例えば、天然に存在しないペプチドは、伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎポリペプチド（式中、ｎは、３～１２の整数である）であってもよい。いくつかの例では、ヒンジドメインは、最大６０個のアミノ酸残基を含有し得る短いセグメントである。
特定の例では、本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン、及び（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、又はそれらの組み合わせを含み得る。例えば、ＡＣＴＲポリペプチドは、表４に示される成分（ａ）～（ｅ）を含む。
特定の例では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン若しくは４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及び（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、又はそれらの組み合わせを含み得る。更なる具体的な例では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン若しくは４－１ＢＢ共刺激ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、又はそれらの組み合わせを含み得る。
グルコース代謝産物及び任意選択的にキメラ受容体ポリペプチドを再誘導する因子（例えば、ポリペプチド又は核酸）を発現する、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞は、細胞株又は造血幹細胞又はその子孫であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球／マクロファージ、好中球、好酸球、αβ Ｔ細胞又はγδ Ｔ細胞であり得る。
いくつかの例では、免疫細胞は、内因性Ｔ細胞受容体、内因性主要組織適合複合体、内因性ベータ－２－ミクログロブリン、又はそれらの組み合わせの発現が阻害又は排除されている、Ｔ細胞である。特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、αβ Ｔ細胞、又はγδ Ｔ細胞）は、核酸又は核酸セットを含み得、それが、集合的に、（ａ）グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド又は核酸）をコードする第１のヌクレオチド配列、及び任意選択的に、（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、を含む。核酸又は核酸セットは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子のセットである。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、核酸を含み、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列の両方を含む。いくつかの実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド又は核酸）のコード配列は、ＣＡＲポリペプチドのコード配列の上流にある。いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチドのコード配列は、グルコース代謝産物を再誘導する因子のコード配列の上流にある。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間に位置する第３のヌクレオチド配列を更に含み得、第３のヌクレオチド配列が、リボソームスキッピング部位（例えば、Ｐ２Ａペプチド）、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、又は第２のプロモーターをコードする。
いくつかの実施形態では、核酸又は核酸セットは、ベクター又はベクターのセット内に含まれ、これは、発現ベクター又は発現ベクターのセット（例えば、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターなどのウイルスベクター）であり得る。核酸セット又はベクターセットは、２つ以上の核酸分子又は２つ以上のベクターの群を指し、各々が、目的のポリペプチドのうちの１つをコードする（すなわち、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導するポリペプチド又は核酸、及びＣＡＲポリペプチド）。本明細書に記載の核酸のうちのいずれかもまた、本開示の範囲内である。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の免疫細胞のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。
更に、対象において標的抗原を発現する細胞を阻害する（例えば、そのような細胞の数を低減させる、細胞増殖を遮断する、かつ／又は細胞活性を抑制する）ための方法が本明細書に提供され、本方法は、それを必要とする対象に、グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド又は核酸）及びＣＡＲポリペプチドを共発現し得る、本明細書に記載の免疫細胞の集団を投与することを含む。対象（例えば、がんに罹患しているヒト患者などのヒト患者）は、抗がん療法（例えば、抗がん剤）で治療されたか、又は治療されている可能性がある。いくつかの例では、標的抗原を発現する細胞の少なくとも一部は、低グルコース環境、低アミノ酸（例えば、低グルタミン）環境、低ｐＨ環境、及び／又は低酸素環境、例えば、腫瘍微小環境に位置する。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、自己由来である。他の例では、免疫細胞は、同種である。本明細書に記載の方法のうちのいずれかでは、免疫細胞は、エクスビボで活性化されるか、増殖されるか、又はその両方であり得る。いくつかの事例では、免疫細胞は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ－２、フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、及び操作された人工刺激細胞又は粒子のうちの１つ以上の存在下で活性化される、Ｔ細胞を含む。他の事例では、免疫細胞は、４－１ＢＢリガンド、抗４－１ＢＢ抗体、ＩＬ－１５、抗ＩＬ－１５受容体抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、及びＫ５６２細胞、操作された人工刺激細胞又は粒子のうちの１つ以上の存在下で活性化される、ナチュラルキラー細胞を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって治療される対象は、がん、例えば、がん腫、リンパ腫、肉腫、芽腫、及び白血病に罹患しているヒト患者であり得る。追加の例示的な標的がんとしては、Ｂ細胞起源のがん、乳がん、胃がん、神経芽腫、骨肉腫、肺がん、皮膚がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓がん、頭頸部がん、網膜芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓がん、及び甲状腺がんが挙げられるが、これらに限定されない。Ｂ細胞起源の例示的ながんは、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
本開示はまた、核酸又は核酸セットも提供し、それが、集合的に、（Ａ）グルコース代謝産物を転用又は再誘導する因子をコードする、第１のヌクレオチド配列と、（Ｂ）キメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲ、ＣＡＲ、又はＴＣＲポリペプチド）をコードする、第２のヌクレオチド配列と、を含む。例示的な実施形態は、インビボで改変された免疫細胞を生成するための方法であり、本方法は、それを必要とする対象に、グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド又は核酸）及びＣＡＲポリペプチドを共発現し得る、本明細書に記載の核酸又は核酸セットを投与することを含む。
また、がん又は感染症などの標的疾患又は障害を治療するための、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド又は核酸）と、ＣＡＲポリペプチドと、を共発現する本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞の使用、及び意図された医学的治療剤を製造するためのそれらの使用は、本開示の範囲内である。
本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に示される。本開示の他の特徴又は利点は、いくつかの実施形態の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様を更に示すために含まれており、これは、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによって、よりよく理解することができる。
解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する例示的なポリペプチド（白抜きボックス）の概略図である。ＴＩＧＡＲは、ＰＦＫの活性を低減させる。ＰＫＭ２及びその機能喪失（ＬｏＦ）バリアントは、ＰＫＭ１よりも活性が低い。加えて、ＧＦＰＴ１は、基質に対して糖分解酵素と競合し、それらの生成物は、生合成経路に再誘導される。解糖経路に属する解糖酵素（塗りつぶしたボックス）は、それらの基質及び生成物とともに順序付けられる。 キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞の増殖に対する低グルコース濃度の影響を示すチャートである。 発光の倍率変化の尺度として、モック形質導入対照（ヌル）と比較して、ＧＬＵＴ１、ＧＯＴ２、及びＴＩＧＡＲで形質導入されたＴ細胞によるグルコース取り込みの増加を示すチャート。 発光の倍数変化の尺度として、ＰＭＡ及びイオノマイシンによる刺激の有無で、モック形質導入対照（ヌル）と比較して、ＧＬＵＴ１、ＧＯＴ２、及びＴＩＧＡＲで形質導入されたＴ細胞によって産生された遊離乳酸を示すチャート。 ＮＫ９２細胞におけるモック形質導入対照（ヌル）と比較して、ＣＡＲのみ又はＣＡＲ及び形質導入遺伝子（ＧＯＴ２及びＴＩＧＡＲ）によるレトロウイルス形質導入時の導入遺伝子の発現を示す免疫ブロット。 ＮＫ９２細胞におけるモック形質導入対照（ヌル）と比較して、ＣＡＲのみ又はＣＡＲによるレトロウイルス形質導入時のＣＡＲ発現を示すフローサイトメトリープロットである。 ＮＫ９２細胞におけるモック形質導入対照（ヌル）と比較して、ＣＡＲのみ又は形質導入遺伝子（ＧＯＴ２及びＴＩＧＡＲ）によるレトロウイルス形質導入時のＣＡＲ発現を示すフローサイトメトリープロットである。
遺伝子操作されたＴ細胞を含む免疫細胞療法は、がん療法において有望な効果を示している。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のＴ細胞活性化シグナル伝達ドメインに融合された抗原結合ドメイン（例えば、ＣＡＲ）を有するキメラ受容体の発現を提供する。抗原結合ドメインを介したがん抗原の結合は、Ｔ細胞活性化をもたらし、細胞傷害性を誘発する。キメラ受容体を発現する自己Ｔリンパ球の注入による臨床試験の最近の結果は、それらの臨床的可能性の説得力のある証拠を提供した。（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｌａｔｏｕｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，９（３）：２７９－２８６（２００３）、Ｐｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，１４（１１）：１２６４－１２７０（２００８）、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８（１８）：４８１７－４８２８（２０１１）、Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３６５（８）：７２５－７３３（２０１１）、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１９（１２）：２７０９－２７２０（２０１２）、Ｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１９（１７）：３９４０－３９５０（２０１２）、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，５（１７７）：１７７ｒａ１３８（２０１３））。当初、この分野では、αβ Ｔ細胞に焦点が当てられていた。より最近では、細胞ベースの療法は、正常組織におけるオンターゲット／オフ腫瘍毒性、サイトカイン放出症候群、及び神経毒性のリスクが低いなどの独自の利点により、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれるように拡大した。また、腫瘍細胞に対する天然の細胞傷害性を示す。最後に、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の減少により、既製の細胞療法製品が調製され得る（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１：６１１１６３（２０２０）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，４７２：１７５－１８０（２０２０）、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，５９：１０２９７５（２０２０）、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ，１４（１）：７３（２０２１）、Ｗｒｏｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２２（１１）：（２０２１））。別のサブタイプのＴ細胞、すなわち、γδ Ｔ細胞は、免疫調節機能を追加的に示すＮＫ細胞と同様の利点を共有する細胞療法において非常に大きな可能性を有する（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２１（１０）：（２０２０）、Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，５３（３）：３１８－３２７（２０２１））。加えて、抗原依存性又は独立したＣＡＲ活性化によるこれらのαβ Ｔ細胞の持続的な活性化は、枯渇及び生物活性の低減をもたらし得、これもまた、ＮＫ細胞及びγδ Ｔ細胞などの先天性細胞の利点である。最後に、キメラ受容体ポリペプチドを発現するＮＫ細胞及びγδ Ｔ細胞の両方は、エフェクター機能の増加（例えば、炎症性サイトカインの産生、抗原獲得及び提示の増加、又は適応免疫応答を活性化する能力）を有し得る。
他の実施形態では、造血細胞（例えば、造血幹細胞、ＮＫ細胞又はＴ細胞などの免疫細胞）において抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）タンパク質を発現することが本明細書に提供され、ＡＣＴＲタンパク質が、細胞外Ｆｃ結合ドメインを含有する。ＡＣＴＲ発現造血細胞（例えば、「ＡＣＴＲ Ｔ細胞」とも呼ばれる、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞）が抗がん抗体とともに対象に投与される場合、それらは、抗体のＦｃドメインへの結合を介して、抗体の標的となるがん細胞に対する毒性を増強することができる（Ｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７４（１）：９３－１０３（２０１４））。
更に他の実施形態では、造血細胞（例えば、造血幹細胞、ＮＫ細胞又はＴ細胞又はＮＫＴ細胞などの免疫細胞）において外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質を発現することが本明細書に提供され、ＴＣＲタンパク質は、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε ＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γ ＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ζ ＴＣＲサブユニット、又はＣＤ３δ ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメイン又はその一部を含む。いくつかの事例では、ＴＣＲは、更に改変される（例えば、同じ若しくは異なる標的抗原、又は同じ若しくは異なる抗原上の同じ若しくは異なるエピトープに対して複数のＴＣＲを発現させるか、あるいは標的若しくはアミノ酸置換に対する親和性を増加させて、優先的なＴＣＲ鎖の対合を増加させる）。ＴＣＲ発現造血細胞（例えば、「ＴＣＲ Ｔ細胞」とも呼ばれる、ＴＣＲ発現Ｔ細胞）が対象に投与される場合、それらは、ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合を介して、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体の標的となるがん細胞に対する毒性を増強することができる（Ｓｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：８３５７６２（２０２２）、Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，８：２９２（２０１７））。
腫瘍微小環境は、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／又は低酸素状態などの特定の特徴を有し、そのうちのいくつかは、エフェクターＴ細胞などのエフェクター免疫細胞の活性を制限する可能性がある。本開示は、少なくとも部分的には、腫瘍微小環境におけるエフェクター免疫細胞の活性を増強するための戦略の開発に基づいている。特に、本開示は、エフェクター免疫細胞においてグルコース代謝を転用又は再誘導する（例えば、１つ以上のグルコース代謝産物を解糖経路から転用又は再誘導する）ことによってエフェクター免疫細胞の代謝活性を増強し、それによって、それらの増殖及び生物活性を増強するための方法を特徴とする。グルコース代謝産物は、グルコース代謝における任意の反応で使用される基質及び／又はそのような反応で生成される任意の生成物を含む、グルコース代謝に関与する任意の分子を指す。グルコース代謝産物の再誘導は、基質代謝を再誘導するポリペプチド又は解糖経路によるグルコース分解の速度を低下させるポリペプチドの発現レベルを含む、様々な因子によって調節され得る。本開示は、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導するための様々なアプローチを提供する。いくつかの例が図１に示されており、これには、基質について解糖経路の酵素と競合する酵素を過剰発現させ、それによって、それらの基質を他の生合成経路（例えば、ＧＦＰＴ１）に再誘導すること、基質について解糖経路の酵素と競合するが、基質について解糖経路の酵素（例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２バリアント）よりも活性が低い酵素を過剰発現させること、及び／又は解糖経路（例えば、ＴＩＧＡＲ）における酵素の機能を低減させるポリペプチドを過剰発現させることが含まれる。代替的に、グルコース代謝産物の再誘導は、グルコース代謝の再誘導及び／又はそのようなタンパク質の細胞輸送若しくは活性の調節に関与するタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現を調節することによって増加させることができる。
したがって、本開示は、同じタイプの天然の免疫細胞と比較して変化したグルコース代謝を有する遺伝子操作された免疫細胞（例えば、ＮＫ、αβ Ｔ細胞、又はγδ Ｔ細胞、又はＮＫＴ細胞）を提供する。そのような遺伝子操作された免疫細胞は、免疫細胞における解糖経路からグルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドを発現又は過剰に発現し、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体ポリペプチド（例えば、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチド、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチド）を発現する。好ましい実施形態では、そのようなポリペプチドは、例えば、免疫細胞に導入された導入遺伝子（例えば、宿主細胞に対して外因性）によってコードされる因子（例えば、ポリペプチド）によって、同じタイプの天然の免疫細胞と比較して過剰に発現される。また、本明細書では、必要に応じて（例えば、免疫細胞がＡＣＴＲポリペプチドを発現する場合）、対象（例えば、ヒトがん患者）における免疫細胞の増殖を改善する、かつ／又は例えば、ＡＤＣＣを介して標的細胞（例えば、標的がん細胞）を阻害若しくは低減するための、任意選択的にＦｃを含有する薬剤と組み合わせた、遺伝子操作された免疫細胞の使用も提供される。本開示はまた、記載の遺伝子操作された免疫細胞を含む薬学的組成物及びキットも提供する。
解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現する（例えば、過剰発現する）本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞は、少なくとも以下の利点を付与し得る。グルコース代謝を再誘導する因子の発現は、同じタイプの天然の免疫細胞と比較して、免疫細胞内のグルコース代謝産物を再誘導する。したがって、遺伝子操作された免疫細胞は、グルコース代謝産物を再誘導する因子を発現しない（又は過剰発現しない）免疫細胞と比較して、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／又は低酸素環境（例えば、腫瘍微小環境）において、より良好に増殖し、より多くのサイトカインを産生し、より高い抗腫瘍細胞傷害性を示し、かつ／又はそれぞれのＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、αβ Ｔ細胞、若しくはγδ Ｔ細胞がより高い生存率を示す可能性があり、サイトカイン産生、生存率、細胞傷害性、及び／又は抗腫瘍活性を向上させる。
Ｉ．解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する因子
本明細書で使用される場合、グルコース代謝産物を再誘導する因子は、グルコースが他の生物学的経路で使用され得るように、解糖経路からグルコースを再誘導する任意の因子（例えば、ポリペプチド、タンパク質又は核酸）を指す。例えば、因子は、グルコース代謝産物を、解糖経路から、アルコール代謝、炭水化物及び糖代謝、脂質及び脂肪酸代謝、ホルモン代謝、タンパク質及びアミノ酸代謝、ステロイド代謝、並びに／又はビタミン及び補酵素代謝の経路に再誘導し得る。当該生物学的経路としては、グリシン、セリン、及びスレオニン代謝、アラニン、アスパラギン酸、及びグルタミン代謝、リジン生合成、アルギニン及びプロリン代謝、ペントースリン酸経路、ガラクトース代謝、フルクトース及びマンノース代謝、プロパン酸代謝、ブタン酸代謝、グリオキシル酸及びジカルボン酸代謝、クエン酸回路（ＴＣＡ）、アミノ糖及びヌクレオチド糖代謝、デンプン及びスクロース代謝、メタン代謝、酸化的リン酸化、脂肪酸代謝、グルタチオン代謝、２－オキソカルボン酸代謝、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰｉ）－アンカー生合成、Ｎ－グリカン生合成、パントテン酸及びＣｏＡ生合成、テルペノイド骨格生合成、ピリミジン代謝、及び／プリン代謝が挙げられるが、これらに限定されない。そのような因子は、解糖経路から任意のメカニズムを介してグルコースを再誘導することができる。
いくつかの事例では、グルコース代謝産物を再誘導する因子は、ポリペプチドであり得る。図１に例示されるように、グルコース代謝産物を再誘導する因子は、以下のポリペプチドであり得る：（ｉ）基質について解糖経路の酵素（例えば、ＧＦＰＴ１）と競合し、それによって、それらの基質を他の生合成経路に再誘導し（例えば、ペントースリン酸経路を介したヌクレオチド、セリン合成経路を介したアミノ酸、グリセロール－３Ｐシャトルを介した脂肪酸、又はヘキソサミン合成経路を介したグリコシル化タンパク質）、（ｉｉ）基質について解糖経路の酵素（例えば、ＰＫＭ２）と競合し、それよりも活性が低く、かつ／又は（ｉｉｉ）解糖経路における酵素（例えば、ＴＩＧＡＲ）の機能を低減させる。
いくつかの実施形態では、グルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドが遺伝子操作される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、グルコース代謝産物を再誘導する活性化ポリペプチドを模倣するように変異導入されてもよく（例えば、リン酸化模倣物）、又はポリペプチドの活性が増加若しくは減少するように、その細胞内輸送（例えば、細胞表面への輸送）に影響を与えるように変異導入されてもよい。
任意の好適な種（例えば、ヒトなどの哺乳類）であり得る任意のそのようなポリペプチドは、本明細書に記載の組成物及び方法で使用するために企図され得る。
したがって、一例では、グルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドは、ＰＫＭ２である。別の例では、グルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドは、ＧＦＰＴ１である。更に別の例では、グルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドは、ＴＩＧＡＲである。
ＧＦＰＴ１は、ヘキソサミン経路における最初の酵素であり、ヘキソサミン経路へのグルコースの輸入、すなわち、グルコース代謝の再誘導を制御する。具体的には、ＧＦＰＴ１は、Ｌ－グルタミンとＤ－フルクトース６－リン酸（フルクトース－６Ｐ）との間の反応を触媒して、Ｌ－グルタミン酸及びＤ－グルコサミン６－リン酸を生成する。追加的に、ＧＦＰＴ１は、タンパク質のＮ及びＯ結合グリコシル化のための前駆体の調節に関与する。フルクトース－６Ｐは、ＧＦＰＴ１と、解糖経路における酵素であるＰＦＫとの間の共有基質である。したがって、フルクトース－６Ｐを枯渇させるＧＦＰＴ１による酵素活性は、グルコース代謝産物を解糖経路から、代わりにヘキソサミン及びタンパク質グリコシル化経路に効果的に再誘導する。ＧＦＰＴ１の発現又は活性レベルの上昇は、解糖経路から離れたグルコース代謝産物の再誘導を増加させる。例示的なヒトＧＦＰＴ１酵素のアミノ酸配列（配列番号６８）を、以下に提供する。
ＴＩＧＡＲは、解糖を遮断し、グルコース代謝産物をペントースリン酸シャント経路に再誘導するように機能する。ＴＩＧＡＲは、解糖経路酵素ＰＦＫの活性を増加させる分子であるフルクトース－２，６－二リン酸のそれらの共有調節に関してＰＦＫＦＢ３と直接対立している。ＴＩＧＡＲは、フルクトース－２，６－二リン酸を分解し、ＰＦＫの酵素速度を効果的に低下させる。これにより、より多くのグルコース代謝産物をヌクレオチド合成及びグリコシル化経路、例えば、ペントースリン酸シャント経路に再誘導することが可能になる。ＴＩＧＡＲの発現又は活性レベルの上昇は、解糖経路から離れたグルコース代謝産物の再誘導を増加させる。例示的なヒトＴＩＧＡＲ酵素のアミノ酸配列（配列番号６９）を、以下に提供する。
特定の実施形態では、免疫細胞などの改変造血細胞のうちのいずれかに使用される解糖経路からグルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドは、ＴＩＧＡＲである。より具体的には、ヒトＴＩＧＡＲ（配列番号６９）である。遊離Ｌ－乳酸の発光読み出しとして測定される乳酸産生は、遊離２－デオキシグルコース－６－リン酸（２ＤＧ６Ｐ）の発光読み出しとして測定されるグルコース取り込み速度を補完する解糖を介したグルコース代謝と直接的に相関する。ＴＩＧＡＲを共発現するＴ細胞は、共発現されるＧＬＵＴ１（ＷＯ２０２０／０１０１１０を参照。その関連開示は、本明細書で参照される主題及び目的について参照により組み込まれる）又はＧＯＴ２（ＷＯ２０２０／０３７０６６を参照。その関連開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために、参照により組み込まれる）と比較して、優れたグルコース取り込み及び乳酸産生を示し、そのような細胞は、腫瘍微小環境に見られる低グルコース条件下での生存率の改善を示すことが本明細書で報告された。したがって、本明細書に開示されるキメラ受容体ポリペプチド（ＣＡＲ又はＡＣＴＲポリペプチドなど）と、ＴＩＧＡＲと、を共発現する治療用ＮＫ細胞、αβ Ｔ細胞、又はγδ Ｔ細胞は、（例えば、栄養素が不足している）腫瘍微小環境により良好に適合され、外因性ＴＩＧＡＲ遺伝子を共発現しない対応するＮＫ細胞、αβ Ｔ細胞、又はγδ Ｔ細胞と比較してより良好な治療活性を示すであろう。
「ＴＩＧＡＲ」という用語は、実施例１０に示されるように、Ｔ細胞で発現された場合、同じ又は実質的に同じレベルのグルコース取り込み及び／又は乳酸産生を示す、ＴＩＧＡＲ（配列番号６９）の機能的均等物を包含する。実質的に同じレベルとは、酵素活性又は機能アッセイの文脈で、アッセイのそれぞれの読み出しが±２５％、好ましくは±２０％、より好ましくは±１０％を意味する。
ＰＫＭ２は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）をピルビン酸に変換する酵素のファミリーであるピルビン酸キナーゼのアイソザイムであり、これは、解糖経路の最後のステップである。他のピルビン酸キナーゼのアイソザイム（例えば、ＰＫＭ１）と比較して、ＰＫＭ２は、触媒的に遅い。したがって、他のアイソザイムと比較して、ＰＫＭ２の相対量を増加させることは、他の生合成経路（例えば、ＮＦＡＴ経路及びＩＬ－２産生）へのＰＥＰの利用可能性を増加させ、グルコース代謝産物を再誘導する。ＰＳＡＴ１の発現又は活性レベルの上昇は、解糖経路から離れたグルコース代謝産物の再誘導を増加させる。例示的なＰＫＭ２酵素のアミノ酸配列（配列番号７０）を、以下に提供する。グルコース代謝産物を再誘導するポリペプチドは、好適な種（例えば、ヒト又は非ヒト霊長類）由来の天然に存在するポリペプチド（哺乳類ポリペプチドに由来するものなど）であり得る。そのような天然に存在するポリペプチドは、当該技術分野で既知であり、例えば、上述のアミノ酸配列のうちのいずれかをクエリとして使用して入手して、公的に利用可能な遺伝子データベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）を検索することができる。本開示で使用するためにグルコース代謝産物を再誘導するポリペプチドは、上述の例示的なタンパク質のうちのいずれかと少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）の配列同一性を共有し得る。
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８７（６）：２２６４－２２６８（１９９０）のアルゴリズム、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９０（１２）：５８７３－５８７７（１９９３）のように修正されたアルゴリズムを使用して決定することができる。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２１５（３）：４０３－４１０（１９９０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行われ得る。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５（１７）：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されているＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
代替的に、グルコース代謝産物を再誘導するポリペプチドは、天然の対応物の機能性バリアントであり得る。そのような機能性バリアントは、天然の対応物の機能性ドメイン（複数可）の外側に１つ以上の変異を含有し得る。グルコース代謝産物を再誘導する天然ポリペプチドの機能性ドメインは、当該技術分野で既知であり得るか、又はそのアミノ酸配列に基づいて予測することができる。機能性ドメイン（複数可）の外側の変異は、タンパク質の生物活性に実質的に影響を与えるとは予想されない。いくつかの事例では、機能性バリアントは、天然の対応物と比較して、グルコース取り込みにおける活性の増加を示し得る。代替的に、機能性バリアントは、天然の対応物と比較して、グルコース取り込みにおける活性の低下を示し得る。更に、機能性バリアントは、細胞表面への輸送を増加させ得る。代替的に、機能性バリアントは、細胞表面への輸送を減少させ得る。
例えば、いくつかの実施形態では、グルコース代謝産物経路を再誘導するポリペプチドは、ＰＫＭ２の機能性バリアントであり得る。例えば、フルクトース１，６－二リン酸への結合の阻害を介して、又はＰＫＭ２の触媒構造の阻害を介して、ＰＫＭ２の機能を阻害する変異体、例えば、Ｙ１０５Ｅ、Ｙ１０５Ｄ、Ｋ４２２Ｒ、及びＨ３９１Ｙ（例えば、Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８５（２２）：１６８６４－１６８７３（２０１０）、Ｉｑｂａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８９（１２）：８０９８－８１０５（２０１４）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ，６（４）：２７５－２８７（２０１５）、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７８（９）：２２４８－２２６１（２０１８））は、以前に記載されている。これらのバリアントは、ＰＫＭ２と比較して活性が低減していると予想され、そのため、活性又は過剰発現ＰＫＭ２ポリペプチドを調節する方法として使用することができる。いくつかの実施形態では、ＰＫＭ２機能性バリアントは、Ｙ１０５Ｅ、Ｙ１０５Ｄ、Ｋ４２２Ｒ、及びＨ３９１Ｙからなるリストから選択される少なくとも１つの変異を含む。例示的なヒトＰＫＭ２バリアント酵素のアミノ酸配列は、以下に提供される：ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅは、配列番号７１である。ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄは、配列番号７２である。ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒは、配列番号７３である。ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙは、配列番号７４である。
代替的に、又は加えて、機能性バリアントは、天然の対応物における１つ以上の位置（例えば、最大２０の位置、最大１５の位置、最大１０の位置、最大５、４、３、２、１の位置）に保存的変異（複数可）を含有し得る。本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷又はサイズ特性を変化させないアミノ酸置換を指す。バリアントは、当業者に既知のポリペプチド配列を改変するための方法に従って調製され得る。例えば、そのような方法をまとめた参考文献、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出される。アミノ酸の保存的置換には、以下のグループ内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。
いくつかの実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子は、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する内因性ポリペプチドの発現を調節する分子であり得る。そのような因子は、転写因子又はマイクロＲＮＡであり得る。いくつかの事例では、グルコース代謝産物を再誘導する因子は、グルコース代謝に関与する１つ以上の酵素（例えば、解糖経路における酵素）の発現を調節する核酸（例えば、ＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡなど）、又はアンチセンス核酸）であり得る。更なる実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子は、グルコース代謝に関与する１つ以上の酵素の発現を調節する転写因子であり得る。他の実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子は、本明細書に開示されるものなどの内因性因子の分解を媒介する分子（例えば、ユビキチン／プロテアソーム経路の一部であるＥ３リガーゼ）であり得る。追加的に、グルコース代謝産物を再誘導する因子の輸送は、例えば、特定のオルガネラ又は表面への輸送を増加させるポリペプチドを発現させることによって調節され得る。
以下の表１は、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する例示的なポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。
ＩＩ．キメラ受容体ポリペプチド
本明細書で使用される場合、キメラ受容体ポリペプチドとは、宿主細胞、好ましくは免疫細胞の表面に発現され得る天然に存在しない分子を指す。キメラ受容体ポリペプチドの細胞外標的結合ドメインは、目的の抗原（例えば、がんなどの疾患に関連する抗原又は病原体に関連する抗原；本明細書の考察を参照）を標的とする。細胞外標的結合ドメインは、目的の抗原（例えば、本明細書に開示されるＣＡＲポリペプチドにおける細胞外抗原結合ドメイン）に直接結合することができる。代替的に、細胞外標的結合ドメインは、中間体（例えば、抗体などのＦｃを含有する薬剤）を介して目的の抗原に結合することができる。更に、細胞外標的結合は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に特異的なＴＣＲ－ＣＤ３複合体間の関与によって（例えば、本明細書に開示されるＴＣＲポリペプチドを発現する遺伝子操作されたＴ細胞の、ペプチド－ＭＨＣ複合体を呈する腫瘍細胞などの抗原提示細胞との結合を介して）起こり得る。キメラ受容体ポリペプチドは、ヒンジドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、又はそれらの組み合わせを更に含んでもよい。いくつかの事例では、キメラ受容体ポリペプチドは、共刺激ドメインを含まなくてもよい。キメラ受容体ポリペプチドは、宿主細胞で発現された場合、細胞外標的結合ドメインが、標的抗原に直接的又は間接的に結合するために、細胞外に位置するように構成される。任意選択的な共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化及び／又はエフェクターシグナル伝達を誘発するために、細胞質に位置し得る。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、以下の特徴のうちの１つ以上を含む：（ｉ）キメラ受容体ポリペプチドは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを更に含むか、又は共刺激シグナル伝達ドメインを含まない、（ｉｉ）細胞質シグナル伝達ドメイン（ｃ）は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、（ｉｉｉ）細胞質シグナル伝達ドメイン（ｃ）は、キメラ受容体ポリペプチドのＣ末端に位置する、（ｉｖ）キメラ受容体ポリペプチドは、（ａ）のＣ末端と（ｂ）のＮ末端に位置するヒンジドメインを更に含む、（ｖ）キメラ受容体ポリペプチドは、いずれのヒンジドメインも含まない、かつ（ｖｉ）キメラ受容体ポリペプチドは、そのＮ末端にシグナルペプチドを更に含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、細胞外標的結合ドメインのＣ末端及び膜貫通ドメインのＮ末端に位置し得るヒンジドメインを更に含み得る。ヒンジは、任意の好適な長さであり得る。他の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、ヒンジドメインをまったく有しない場合がある。更に他の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、短縮されたヒンジドメイン（例えば、最大２５個のアミノ酸残基を含む）を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、及び少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドであり得る。本明細書で使用される場合、ＡＣＴＲポリペプチド（別名、ＡＣＴＲ構築物）は、宿主細胞の表面に発現され得、免疫グロブリンのＦｃ部分に対する結合親和性及び特異性を有する細胞外ドメイン（「Ｆｃ結合剤」又は「Ｆｃ結合ドメイン」）、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含む天然に存在しない分子を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを更に含み得る。
他の実施形態では、本明細書に開示されるキメラ受容体ポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであり得る。本明細書で使用される場合、ＣＡＲポリペプチド（別名、ＣＡＲ構築物）は、宿主細胞の表面に発現することができ、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含む天然に存在しない分子を指す。本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを更に含み得る。
細胞外抗原結合ドメインは、標的抗原に特異的に結合する任意のペプチド又はポリペプチドであり得、医学的状態（例えば、疾患）に関連する天然に存在する抗原、又は疾患関連抗原を標的とする治療剤にコンジュゲートされた抗原性部分を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを更に含み得る。ＣＡＲポリペプチドは、宿主細胞上で発現された場合、細胞外抗原結合ドメインが、標的分子及び細胞質シグナル伝達ドメインに結合するために、細胞外に位置するように構成される。任意選択的な共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化及び／又はエフェクターシグナル伝達を誘発するために、細胞質に位置し得る。
本明細書で使用される場合、「タンパク質Ｘ膜貫通ドメイン」（例えば、ＣＤ８膜貫通ドメイン）という語句は、膜において熱力学的に安定である、所与のタンパク質（すなわち、膜貫通タンパク質Ｘ）の任意の部分を指す。
本明細書で使用される場合、「タンパク質Ｘの細胞質シグナル伝達ドメイン」、例えば、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインという語句は、細胞又はオルガネラの内部と相互作用し、当該技術分野で既知の、免疫細胞の増殖及び／又は活性化をもたらす一次シグナルを中継することができるタンパク質（タンパク質Ｘ）の任意の部分を指す。本明細書に記載される細胞質シグナル伝達ドメインは、免疫細胞を完全に活性化するための二次シグナルを中継する共刺激シグナル伝達ドメインとは異なる。
本明細書で使用される場合、「タンパク質Ｘの共刺激シグナル伝達ドメイン」、例えば、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインという語句は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に共刺激シグナル（二次シグナル）を伝達し、免疫細胞の完全な活性化をもたらすことができる所与の共刺激タンパク質（タンパク質Ｘ、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、又はＩＣＯＳ）の部分を指す。
いくつかの実施形態では、細胞外標的結合ドメイン、好ましくは抗原結合ドメインは、腫瘍抗原、病原性抗原、又は自己抗原に特異的な免疫細胞に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は単一ドメイン抗体である。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み得る。いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲは、α鎖及び／又はβ鎖、並びに１つ以上のＣＤ３鎖（例えば、γ、δ、ｅ、又はｚ）鎖を含むヘテロ二量体を含んでもよく、任意選択的に、標的細胞（例えば、ＷＴ１又はＮＹ－ＥＳＯ－１を発現する腫瘍細胞、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質などの病原体に感染した細胞）上のＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩなどの抗原提示分子と複合体化した抗原特異的ペプチドに結合するように操作され得る。
Ａ．細胞外標的結合ドメイン
本明細書に開示されるキメラ受容体ポリペプチドは、直接的な結合を介して又は間接的な結合を介して（抗体などの中間体を介して）のいずれかで、目的の抗原（例えば、本明細書に記載のもの）を標的とする細胞外ドメインを含む。キメラ受容体ポリペプチドは、Ｆｃ結合ドメインを含むＡＣＴＲポリペプチドであり得る。代替的に、キメラ受容体ポリペプチドは、細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドであり得る。
（ｉ）Ｆｃ結合ドメイン
本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドは、Ｆｃ結合ドメインである（すなわち、好適な哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、又はサル）の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥ）のＦｃ部分に結合することができる）細胞外ドメインを含む。好適なＦｃ結合ドメインは、哺乳類のＦｃ受容体などの天然に存在するタンパク質又は特定の細菌タンパク質（例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ）に由来し得る。追加的に、Ｆｃ結合ドメインは、本明細書に記載の抗体のうちのいずれかのＦｃ部分と高い親和性かつ高い特異性で結合するように特異的に操作された合成ポリペプチドであり得る。例えば、そのようなＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であり得る。例としては、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、又は単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ）が挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、Ｆｃ結合ドメインは、Ｆｃ部分に特異的に結合する合成ペプチド、例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、アドネクチン、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、又はアンチカリンであり得、これらは、Ｆｃへの結合活性についてペプチドコンビナトリライブラリをスクリーニングすることによって特定され得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、哺乳動物Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。本明細書で使用される場合、「Ｆｃ受容体」は、多くの免疫細胞（Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、肥満細胞、及び好酸球を含む）の表面に発現され、抗体のＦｃドメインに対する結合特異性を示す、細胞表面結合受容体である。Ｆｃ受容体は、典型的には、抗体のＦｃ（結晶化可能な断片）部分に対する結合特異性を有する少なくとも２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインからなる。いくつかの事例では、抗体のＦｃ部分へのＦｃ受容体の結合は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を誘発し得る。本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドを構築するために使用されるＦｃ受容体は、天然に存在する多型バリアント（例えば、ＣＤ１６ Ｖ１５８バリアント）であり得、これは、野生型対応物と比較して、Ｆｃに対する親和性が増加又は減少している場合がある。代替的に、Ｆｃ受容体は、Ｉｇ分子のＦｃ部分に対する結合親和性を変化させる、１つ以上の変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の変異を含む最大１０個のアミノ酸残基置換）を担持する、野生型対応物の機能性バリアントであり得る。いくつかの事例では、変異は、Ｆｃ受容体のグリコシル化パターン、したがって、Ｆｃに対する結合親和性を変化させ得る。
表２は、Ｆｃ受容体の細胞外ドメインにおけるいくつかの例示的な多型を列挙している（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，５３（１）：１－９（２００１）を参照されたい）。これらは、本明細書に記載の方法又は構築物のうちのいずれかで使用され得る。
Ｆｃ受容体は、それが結合することができる抗体のアイソタイプに基づいて分類される。例えば、Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、一般に、ＩｇＧ抗体、例えば、その１つ以上のサブタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）に結合し、Ｆｃ－アルファ受容体（ＦｃαＲ）は、一般に、ＩｇＡ抗体に結合し、Ｆｃ－イプシロン受容体（ＦｃεＲ）は、一般に、ＩｇＥ抗体に結合する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ、又はＦｃεＲである。ＦｃγＲの例としては、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６Ａ、及びＣＤ１６Ｂが挙げられるが、これらに限定されない。ＦｃαＲの例は、ＦｃαＲ１／ＣＤ８９である。ＦｃεＲの例としては、限定されないが、ＦｃεＲＩ及びＦｃεＲＩＩ／ＣＤ２３が挙げられる。表３は、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドの構築に使用するための例示的なＦｃ受容体、及び対応するＦｃドメインへのそれらの結合活性を列挙している。
本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドで使用するためのＦｃ受容体のリガンド結合ドメインの選択は、当業者には明らかであろう。例えば、それは、Ｆｃ受容体の結合が所望される抗体のアイソタイプ、及び結合相互作用の所望の親和性などの要因に依存し得る。
いくつかの例では、Ｆｃ結合ドメインは、ＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインであり、これは、Ｆｃに対する親和性を調節し得る天然に存在する多型を組み込まれ得る。いくつかの例では、Ｆｃ結合ドメインは、１５８位に多型（例えば、バリン又はフェニルアラニン）を組み込んだＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、そのグリコシル化状態及びＦｃに対するその親和性を変化させる条件下で産生される。
本明細書では、ヒトＣＤ１６Ａ Ｆ１５８（配列番号７５）及びＣＤ１６Ａ Ｖ１５８（配列番号７６）バリアントのアミノ酸配列に、Ｆ１５８及びＶ１５８残基が太字／下線で示されている。
ＣＤ１６Ａ Ｆ１５８（Ｆ１５８太字／下線）
（配列番号７５）
ＣＤ１６Ａ Ｖ１５８（Ｖ１５８太字／下線）
（配列番号７６）
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、ＡＣＴＲポリペプチドをＩｇＧ抗体のサブセットに特異的にする修飾を組み込んだＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。例えば、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）に対する親和性を増加又は減少させる変異が組み込まれ得る。
本明細書に記載のＦｃ結合ドメインのうちのいずれかは、治療用抗体のＦｃ部分に対する好適な結合親和性を有し得る。本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、見かけの会合定数又はＫＡを指す。ＫＡは、解離定数ＫＤの逆数である。本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドのＦｃ受容体ドメインの細胞外リガンド結合ドメインは、抗体のＦｃ部分に対して、少なくとも１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０Ｍ、又はそれ以下の結合親和性Ｋｄを有し得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、別の抗体、抗体のアイソタイプ（複数可）、又はそのサブタイプ（複数可）に対するＦｃ結合ドメインの結合親和性と比較して、抗体、抗体のアイソタイプ（複数可）、又はそのサブタイプ（複数可）に対して高い結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、別の抗体、抗体のアイソタイプ（複数可）、又はそのサブタイプ（複数可）に対するＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインの結合と比較して、抗体、抗体のアイソタイプ（複数可）、又はそのサブタイプ（複数可）に対して特異性を有する。
当該技術分野で既知の他のＦｃ結合ドメインはまた、例えば、ＷＯ２０１５／０５８０１８Ａ１及びＷＯ２０１８／１４０９６０に記載されているものを含む、本明細書に記載のＡＣＴＲ構築物で使用され得る（これらの各々の関連する開示は、本明細書で言及される目的及び主題のために、参照により組み込まれる）。
（ｉｉ）細胞外抗原結合ドメイン
本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、αβ Ｔ細胞、又はγδ Ｔ細胞）の特異性を再誘導する細胞外抗原結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「細胞外抗原結合ドメイン」とは、目的の標的抗原に対する結合特異性を有するペプチド又はポリペプチドを指し、これは、医学的状態に関連する天然に存在する抗原（例えば、疾患、状態、又は細胞型で発現される）であり得る。細胞外抗原結合ドメインの非限定的な例は、腫瘍抗原、病原性抗原、及び自己抗原に特異的な免疫細胞である（Ｇｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２５（９）：３４１３－３４２１（２０１５）、Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２１（１）：８１－８５（２０１５））。治療されるそれぞれの疾患及び／又は状態には、腫瘍、炎症状態、及び自己免疫障害が含まれる。いくつかの実施形態では、抗原は、正常又は非標的化細胞又は組織と比較して、疾患又は状態の細胞、例えば、腫瘍又は病原性細胞上で選択的に発現又は過剰発現される。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、血液腫瘍又は固形腫瘍に関連する腫瘍抗原に結合する。
血液腫瘍の細胞外結合ドメインの非限定的な例は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＬｅＹ、ＣＤ１３８、ＣＤ５、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＣＤ４０、及びＩＬ－１ＲＡＰのドメインである。固形腫瘍の細胞外結合ドメインの非限定的な例は、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＦＯＬＲ（例えば、ＦＯＬＲ１又はＦＯＬＲ２）、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥＦＧＲＶＩＩＩ、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦＲ２、ＲＯＲ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤ１７１、ＣＤ１３３、ＰＳＣＡ、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ、ＣＤ７０、ＭＵＣ１６、Ｌ１－ＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、及びＣＡＩＸのドメインである。他の事例では、腫瘍抗原としては、ＨＥＲ２発現などの腫瘍関連抗原の発現を特徴とするがんに由来する腫瘍抗原が挙げられる。抗原には、腫瘍細胞で変異した遺伝子に由来するか、又は正常細胞と比較して腫瘍細胞で異なるレベルで転写される遺伝子に由来するエピトープ領域若しくはエピトープペプチド、エピトープペプチド（例えば、サバイビン、変異型Ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再配列、ＨＥＲ２、変異型又は野生型ｐ５３）が含まれ得る。
次に、抗原性部分は、疾患関連抗原を標的とする治療剤にコンジュゲートされ得る。本明細書に記載される細胞外抗原結合ドメインは、Ｆｃ受容体の細胞外ドメインを含まず、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合しない場合がある。Ｆｃ断片に結合しない細胞外ドメインとは、２つの間の結合活性が従来のアッセイを使用して検出できないこと、又はバックグラウンド若しくは生物学的に有意でない結合活性のみが従来のアッセイを使用して検出されることを意味する。
いくつかの事例では、本明細書に記載の任意のＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、細胞表面抗原（例えば、天然及び変異型腫瘍抗原）に結合することができるペプチド若しくはポリペプチド、又は主要組織適合複合体と複合体化しており、抗原提示細胞の細胞表面に提示され得る抗原（若しくはその断片）である。そのような細胞外抗原結合ドメインは、単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）であってもよく、これは、高い結合親和性で標的細胞の表面抗原に結合する抗体に由来し得る。表４は、例示的な細胞表面の標的抗原及びそれに結合する例示的な抗体を列挙している。

細胞外抗原結合ドメインは、目的の標的抗原に応じて、表４に列挙されている抗体のうちのいずれかに由来する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含み得る。いくつかの実施形態では、抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、目的の標的抗原に応じて、表４に列挙されている抗体と同じ重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。いくつかの例では、抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、目的の標的抗原に応じて、表４に列挙されている抗体と同じ重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。
他の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかの細胞外抗原結合ドメインは、細菌抗原、ウイルス抗原、又は真菌抗原などの病原性抗原に特異的であり得る。いくつかの例を、以下に提供する：インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、ヘマグルチニン若しくはＭ２タンパク質、ヒト呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ糖タンパク質若しくはＧ糖タンパク質、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、若しくはｇＥ、クラミジアＭＯＭＰ若しくはＰｏｒＢタンパク質、デング熱ウイルスコアタンパク質、マトリックスタンパク質若しくは糖タンパク質Ｅ、麻疹ウイルスヘマグルチニン、単純ヘルペスウイルス２型糖タンパク質ｇＢ、ポリオウイルスＩ ＶＰ１、ＨＩＶ１のエンベロープ糖タンパク質、Ｂ型肝炎コア抗原若しくは表面抗原、ジテリア毒素、連鎖球菌２４Ｍエピトープ、淋菌性ピリン、仮性狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩＩ（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、コロナウイルスポリプチド、感染性胃腸炎糖タンパク質１９５、感染性胃腸炎マトリックスタンパク質、ヒトパピローマウイルスＥ６若しくはＥ７、又はヒトＣ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｅ１若しくはＥ２。
加えて、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、疾患又は障害に関連する抗原（例えば、本明細書に記載される腫瘍抗原又は病原性抗原）を標的とする治療剤にコンジュゲートされたタグに特異的であり得る。いくつかの事例では、治療剤にコンジュゲートされたタグは、抗原性であり得、ＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、抗原性タグに対して高い結合親和性及び／又は特異性を有する抗体の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）であり得る。例示的な抗原タグとしては、ビオチン、アビジン、蛍光分子（例えば、ＧＦＰ、ＹＲＰ、ルシフェラーゼ、又はＲＦＰ）、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ、Ｈｉｓ（例えば、６×ＨｉｓなどのポリＨｉｓ）、ＨＡ（ヘミアグルチニン）、ＧＳＴ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ｔｒｘ、Ｔ７、ＨＳＶ、ＶＳＶ（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、Ｖ５、ｅタグ、Ｓタグ、ＫＴ３、Ｅ２、Ａｕ１、Ａｕ５、及び／又はチオレドキシンが挙げられるが、これらに限定されない。
他の事例では、治療剤にコンジュゲートされたタグは、リガンド－受容体対のメンバーであり、細胞外抗原結合ドメインは、タグに結合するリガンド－受容体対の他のメンバー又はその断片を含む。例えば、治療剤にコンジュゲートされたタグは、ビオチンであり得、ＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、アビジンのビオチン結合断片を含むことができる。例えば、Ｕｒｂａｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７２（７）：１８４４－１８５２（２０１２）、Ｌｏｈｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７（１）：ｅ１３６８６０４（２０１７）を参照されたい。他の例としては、抗Ｔａｇ ＣＡＲが挙げられ、その細胞外抗原結合ドメインが、ＦＩＴＣ（Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１８（２３）：６４３６－６４４５（２０１２）、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１３７（８）：２８３２－２８３５（２０１５）、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ，５５（２６）：７５２０－７５２４（２０１６）、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１３（４）：Ｅ４５０－４５８（２０１６））、ＰＮＥ（Ｒｏｄｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１３（４）：Ｅ４５９－４６８（２０１６））、Ｌａ－ＳＳ－Ｂ（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ，６（８）：ｅ４５８（２０１６））、ビオチン（Ｌｏｈｍｕｅｌｌｅｒ，Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７（１）：ｅ１３６８６０４（２０１７））、及びロイシンジッパー（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７３（６）：１４２６－１４３８．ｅ１４１１（２０１８））などのタンパク質タグに特異的なｓｃＦｖ断片である。本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドで使用するための抗原結合ドメインの選択は、当業者には明らかであろう。例えば、標的抗原のタイプ及び結合相互作用の所望の親和性などの要因に依存する場合がある。
本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかの細胞外抗原結合ドメインは、標的抗原（例えば、本明細書に記載の標的のうちのいずれか１つ）又はその抗原性エピトープに対する好適な結合親和性を有し得る。本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、見かけの会合定数又はＫＡ又はＫＤを指す。ＫＡは、解離定数（ＫＤ）の逆数である。本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドで使用するための細胞外抗原結合ドメインは、標的抗原又は抗原エピトープと少なくとも１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０Ｍ、又はそれ以下の結合親和性（ＫＤ）を有し得る。結合親和性の増加は、ＫＤの減少に対応する。第２の抗原と比較した第１の抗原に対する細胞外抗原結合ドメインのより高い親和性結合は、第２の抗原に結合するためのＫＡ（又は数値ＫＤ）よりも、第１の抗原に結合するためのより高いＫＡ（又はより小さい数値ＫＤ）によって示され得る。そのような場合、細胞外抗原結合ドメインは、第２の抗原（例えば、第２のコンフォメーション又はその模倣物の同じ第１のタンパク質；又は第２のタンパク質）と比較して、第１の抗原（例えば、第１のコンフォメーション又はその模倣物の第１のタンパク質）に対する特異性を有する。結合親和性の違い（例えば、特異性又は他の比較）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００、又は１００，０００倍であり得る。
結合親和性（又は結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、又は分光法を含む様々な方法によって（例えば、蛍光アッセイを使用して）、決定することができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）中である。これらの技術を使用して、標的タンパク質濃度の関数として、結合した結合タンパク質の濃度を測定することができる。結合した結合タンパク質（［結合］）の濃度は、一般に、以下の方程式によって遊離標的タンパク質（［遊離］）の濃度に関連する：
［結合］＝［遊離］／（Ｋｄ＋［遊離］）
必ずしもＫＡの正確な決定を行う必要はないが、例えば、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ分析などの方法を使用して決定される親和性の定量的測定値を得ることが十分であり、ＫＡに比例するため、したがって、より高い親和性が、例えば、２倍高いかどうかを決定するなど、親和性の定性的測定値を得るため、又は例えば、機能アッセイ（例えば、インビトロ又はインビボアッセイ）における活性によって親和性の推論を得るための、比較に使用することができる。
Ｂ．膜貫通ドメイン
本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド又はＣＡＲポリペプチド）の膜貫通ドメインは、当該技術分野で既知の任意の形態であり得る。本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜、好ましくは真核細胞膜において熱力学的に安定である任意のタンパク質構造を指す。本明細書で使用されるキメラ受容体ポリペプチドでの使用に適合する膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得ることができる。代替的に、それは、合成された、天然に存在しないタンパク質のセグメント、例えば、細胞膜において熱力学的に安定である疎水性タンパク質のセグメントであり得る。
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの三次元構造に基づいて分類される。例えば、膜貫通ドメインは、アルファヘリックス、複数のアルファヘリックスの複合体、ベータバレル、又は細胞のリン脂質二重層にまたがることができる任意の他の安定な構造を形成し得る。更に、膜貫通ドメインはまた、又は代替的に、膜貫通ドメインが膜を横断するパスの数及びタンパク質の向きを含む、膜貫通ドメインのトポロジーに基づいて分類され得る。例えば、シングルパス膜タンパク質は、細胞膜を１回通過し、マルチパス膜タンパク質は、細胞膜を少なくとも２回（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、又はそれ以上）通過する。
膜タンパク質は、細胞の内側及び外側に対するそれらの末端及び膜貫通セグメント（複数可）のトポロジーに応じて、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型として定義され得る。Ｉ型膜タンパク質は、単一の膜貫通領域を有し、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側にあり、タンパク質のＣ末端が細胞質側にあるように配向している。ＩＩ型膜タンパク質はまた、単一の膜貫通領域を有し、タンパク質のＣ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側にあり、タンパク質のＮ末端が細胞質側にあるように配向している。ＩＩＩ型膜タンパク質は、複数の膜貫通セグメントを有し、膜貫通セグメントの数及びＮ末端及びＣ末端の位置に基づいて、更に細分類され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドの膜貫通ドメインは、Ｉ型シングルパス膜タンパク質に由来する。好ましくは、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６Ａ、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ２Ｂ、ＣＤ２、ＩＬ１５、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ２１、ＤＮＡＭ－１、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６からなる群から選択される膜タンパク質のものである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、以下から選択される膜タンパク質に由来する：ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６Ａ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ３ｄ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ２Ｂ、ＤＮＡＭ－１、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６。いくつかの例では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８のものである（例えば、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αのものである）。一部の例では、膜貫通ドメインは、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７のものである。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８のものである。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、又はＮＫｐ４６のものである。他の例では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３４のものである。更に他の例では、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８ａに由来しない。いくつかの実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドの膜貫通ドメインは、シングルパスアルファヘリックスである。
表５に、例示的な膜貫通ドメインのアミノ酸配列を提供する：
マルチパス膜タンパク質からの膜貫通ドメインはまた、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドでの使用に適合し得る。マルチパス膜タンパク質は、複合体アルファヘリックス構造（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又はそれ以上のアルファヘリックス）又はベータシート構造を含み得る。好ましくは、マルチパス膜タンパク質のＮ末端及びＣ末端は、脂質二重層の反対側に存在する。例えば、タンパク質のＮ末端は、脂質二重層の細胞質側に存在し、タンパク質のＣ末端は、細胞外側に存在する。いくつかの事例では、そのような天然の膜貫通タンパク質の逆配向は、免疫細胞膜内のキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＣＡＲ）の効率的な配向のために構築され得る。マルチパス膜タンパク質からの１つ又は複数のヘリックスパスのいずれかを使用して、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドを構築することができる。
本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドで使用するための膜貫通ドメインはまた、合成の、天然に存在しないタンパク質セグメントの少なくとも一部分を含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、合成の、天然に存在しないアルファヘリックス又はベータシートである。いくつかの実施形態では、タンパク質セグメントは、少なくともおよそ２０個のアミノ酸、例えば、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、又はそれ以上のアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例は、当該技術分野、例えば、ＵＳ７，０５２，９０６Ｂ１及びＷＯ２０００／０３２７７６Ａ２号において既知であり、これらの各々の関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、システイン残基を含まない。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、１つのシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、２つのシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、２つ超（例えば、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上）のシステイン残基を含む。
膜貫通ドメインは、膜貫通領域と、膜貫通ドメインのＣ末端側に位置する細胞質領域と、を含み得る。膜貫通ドメインの細胞質領域は、３つ以上のアミノ酸を含み得、いくつかの実施形態では、脂質二重層内の膜貫通ドメインの配向を助ける。いくつかの実施形態では、１つ以上のシステイン残基は、膜貫通ドメインの膜貫通領域に存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上のシステイン残基は、膜貫通ドメインの細胞質領域に存在する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アルギニン、セリン、及びリジンのアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、主に、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はバリンなどの疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、疎水性である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ポリロイシン－アラニン配列を含む。
タンパク質又はタンパク質セグメントの疎水性又は親水性の特徴であるヒドロパシーは、例えば、Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシー分析を含む、当該技術分野で既知の任意の方法によって評価することができる。
Ｃ．共刺激シグナル伝達ドメイン
多くの免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞又はＴ細胞）は、抗原特異的シグナルの刺激に加えて、細胞の増殖、分化、及び生存を促進するために、並びに細胞のエフェクター機能を活性化するために、共刺激を必要とする。「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞内でシグナル伝達を媒介して、エフェクター機能（二次シグナル）などの免疫応答を誘導する共刺激シグナル伝達タンパク質のうちの少なくとも１つの断片を指す。当該技術分野で既知のように、Ｔ細胞などの免疫細胞の活性化は、多くの場合、２つのシグナル：（１）抗原提示細胞によって提示されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体の関与によって誘発される抗原特異的シグナル（一次シグナル）であって、典型的には、ＴＣＲ複合体の成分としてＣＤ３ζによって駆動される、抗原特異的シグナルと、（ｉｉ）共刺激受容体とそのリガンドとの間の相互作用によって誘発される共刺激シグナル（二次シグナル）と、を必要とする。共刺激受容体は、ＴＣＲ誘発シグナル伝達に加えて、共刺激シグナル（二次シグナル）を伝達し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、又は好酸球などの免疫細胞によって媒介される応答を調節する。
宿主細胞（例えば、免疫細胞）における共刺激性シグナル伝達ドメインの活性化は、サイトカイン、食作用、増殖、分化、生存、及び／又は細胞傷害性の産生及び分泌を増加又は減少させるように細胞を誘導することができる。任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドでの使用に適合し得る。共刺激シグナル伝達ドメインのタイプ（複数可）は、キメラ受容体ポリペプチドが発現されるであろう免疫細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、又は好酸球）及び所望の免疫エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）などの要因に基づいて選択される。したがって、一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞のキメラ受容体ポリペプチドが、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。キメラ受容体ポリペプチドで使用するための共刺激シグナル伝達ドメインの例は、限定されないが、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、ＰＤＣＤ６）、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４－１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４／ＣＤ２５２５、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－アルファ、及びＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、並びに任意の他の共刺激分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡ ＣｌａｓｓＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、イカロス、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＪＡＭＡＬ）を含む共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。特定の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン又は４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激シグナル伝達ドメインを含有し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ８α、２Ｂ４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、ＣＤ２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＪＡＭＡＬ、又はそれらの任意のバリアントからなる群から選択される。
また、共刺激シグナル伝達ドメインが免疫細胞の免疫応答を調節することができるように、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインのうちのいずれかの機能性バリアントも本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、野生型の対応物と比較して、最大１０個（例えば、１、２、３、４、５、又は８つ）のアミノ酸残基の変異、例えば、アミノ酸置換、欠失、又は付加などを含む。１つ以上のアミノ酸バリエーション（例えば、アミノ酸の置換、欠失、又は付加）を含むそのような共刺激シグナル伝達ドメインは、バリアントと称され得る。
共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達形質導入の増加及び免疫応答の刺激の増強をもたらし得る。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達形質導入の減少及び免疫応答の刺激の低減をもたらし得る。例えば、天然のＣＤ２８のアミノ酸配列の残基１８６及び１８７の変異は、共刺激活性の増加及びキメラ受容体ポリペプチドの共刺激ドメインによる免疫応答の誘導をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＤ２８共刺激ドメインの位置１８６及び１８７の各々のリジンのグリシン残基による置換であり、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアントと称される。したがって、ＣＤ２８の好適なバリアントは、ＣＤ２８ＬＬaＧＧバリアントである。
追加の変異が、ドメインの共刺激活性を増強又は低減し得る共刺激シグナル伝達ドメインにおいて作成され得ることは、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及びＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアントの群から選択される。一実施形態では、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン又は４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインである。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、単一の共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２７共刺激ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、ＯＸ４０共刺激ドメイン、ＯＸ４０Ｌ共刺激ドメイン、２Ｂ４共刺激ドメイン、ＧＩＴＲ共刺激ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ共刺激ドメイン、ＮＫｐ３０共刺激ドメイン、ＮＫｐ４４共刺激ドメイン、ＮＫｐ４６共刺激ドメイン、ＤＡＰ１０共刺激ドメイン、ＤＡＰ１２共刺激ドメイン、ＤＮＡＭ１共刺激ドメイン、ＬＦＡ－１共刺激ドメイン、ＨＶＥＭ共刺激ドメイン、又はＪＡＭＡＬ共刺激ドメインを含有し得る。
共刺激シグナル伝達ドメインのタイプ（複数可）の選択は、キメラ受容体ポリペプチド（例えば、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、又はＮＫ細胞）とともに使用される宿主細胞のタイプ、及び所望の免疫エフェクター機能などの要因に基づき得る。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、複数の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、２つ、３つ、又はそれ以上）を含み得る。一実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、少なくとも２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。好ましい一実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、２つ以上の同じ共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、２つのコピーのＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、本明細書に記載の任意の２つ以上の共刺激タンパク質などの異なる共刺激タンパク質からの２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、本明細書に記載の任意の２つ以上の共刺激受容体、例えば、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ、ＣＤ２８及びＣＤ２７、ＣＤ２８及びＩＣＯＳ、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント及び４－１ＢＢ、ＣＤ２８及びＯＸ４０、又はＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント及びＯＸ４０などの、異なる共刺激受容体からの２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８及び４－１ＢＢである。いくつかの実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント及び４－１ＢＢである。いくつかの実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８及びＯＸ４０である。いくつかの実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント及びＯＸ４０である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、ＣＤ２８とＩＣＯＳＬとの組み合わせを含有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、ＣＤ２８とＣＤ２７との組み合わせを含有し得る。特定の実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、ＣＤ２８又はＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に位置する。
いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインのうちの一つは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインであり、共刺激ドメインの他方は、ＣＤ８α、４－１ＢＢ、２Ｂ４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、ＣＤ２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＪＡＭＡＬ共刺激シグナル伝達ドメインからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインのうちの一つは、ＣＤ８α共刺激シグナル伝達ドメインであり、共刺激ドメインの他方は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、２Ｂ４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、ＣＤ２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＪＡＭＡＬ共刺激シグナル伝達ドメインからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインのうちの一つは、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインであり、共刺激ドメインの他方は、ＣＤ８α、ＣＤ２８、２Ｂ４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、ＣＤ２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＪＡＭＡＬ共刺激シグナル伝達ドメインからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。
表６に、例示的な共刺激ドメインのアミノ酸配列を提供する。
代替的に、キメラ受容体ポリペプチドのうちのいずれかは、いずれの共刺激シグナル伝達ドメインも含まなくてもよい。
Ｄ．細胞質シグナル伝達ドメイン
任意の細胞質シグナル伝達ドメインを使用して、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド又はＣＡＲポリペプチド）を生成することができる。そのような細胞質ドメインは、免疫細胞の増殖及び／又は活性化をもたらす細胞シグナル伝達（一次シグナル伝達）の誘発に関与する任意のシグナル伝達ドメインであり得る。本明細書に記載される細胞質シグナル伝達ドメインは、当該技術分野で既知のように、免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ）を完全に活性化するための共刺激又は二次シグナルを中継する共刺激シグナル伝達ドメインではない。
本明細書に記載の細胞質シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）ドメイン（例えば、少なくとも１つのＩＴＡＭドメイン、少なくとも２つのＩＴＡＭドメイン、又は少なくとも３つのＩＴＡＭドメイン）を含んでもよく、又はＩＴＡＭがなくてもよい。本明細書で使用される「ＩＴＡＭ」とは、多くの免疫細胞で発現されるシグナル伝達分子の尾部に一般に存在する保存されたタンパク質モチーフである。モチーフは、６～８個のアミノ酸によって分離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つの反復を含んでよく、式中、各ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、保存されたモチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６～８）ＹｘｘＬ／Ｉを生成する。シグナル伝達分子内のＩＴＡＭは、シグナル伝達分子の活性化後のＩＴＡＭにおけるチロシン残基のリン酸化によって少なくとも部分的に媒介される、細胞内のシグナル伝達に重要である。ＩＴＡＭは、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキング部位としても機能し得る。限定されないが、細胞質シグナル伝達ドメイン内に含まれるキメラ受容体ポリペプチドで使用するためのＩＴＡＭの例は、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δであり得、各々が、単一のＩＴＡＭモチーフを含有し、一方、各ζ鎖は、３つの異なるＩＴＡＭドメイン（ζａ、ζｂ、及びζｃ）を含有する。数及びＩＴＡＭ配列は、ＣＡＲの設計においても重要である（Ｂｅｔｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９（５）：１５５５－１５６０（２０１７）、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，５８：１０２９３１（２０２０））。
いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ又はＦｃεＲ１γのものである。ヒトＣＤ３ζの１つの例示的な細胞質シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列を、以下に提供する：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号６６）
他の例では、細胞質シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζに由来しない。更に他の例では、同じキメラ受容体ポリペプチドの細胞外Ｆｃ結合ドメインがＣＤ１６Ａに由来する場合、細胞質シグナル伝達ドメインは、Ｆｃ受容体に由来しない。
特定の一実施形態では、いくつかのシグナル伝達ドメインは、相加的又は相乗的な効果のために一緒に融合され得る。有用な追加のシグナル伝達ドメインの非限定的な例としては、ＴＣＲζ鎖、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ２Ｒα／ＣＤ１２２、ＩＬ－２Ｒγ／ＣＤ１３２、及びＣＤ４０のうちの１つ以上の一部又は全てが挙げられる。
他の実施形態では、本明細書に記載の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含まない。例としては、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ、Ｔｏｌｌ－インターロイキン受容体（ＴＩＲ）、及びチロシンキナーゼの細胞質シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｅ．ヒンジドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチド又はＣＡＲポリペプチドなどのキメラ受容体ポリペプチドは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメインを更に含む。ヒンジドメインは、一般に、タンパク質の２つのドメイン間に見出されるアミノ酸セグメントであり、タンパク質の柔軟性及び一方又は両方のドメインの互いに対する移動を可能にし得る。キメラ受容体ポリペプチドの膜貫通ドメインに対する細胞外リガンド結合ドメインのそのような柔軟性及び移動を提供する任意のアミノ酸配列を使用することができる。
ヒンジドメインを含むことが当該技術分野で既知の任意のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドでの使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、キメラ受容体ポリペプチドに柔軟性を付与する。一実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、ヒンジドメインを含み、これは、ＣＤ２８、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ８、ＩｇＧ、マウスＣＤ８ａ、及びＤＡＰ１２のリストから選択されるヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８のものである（例えば、ヒンジドメインが、ＣＤ８αのものである）。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８のヒンジドメインの一部、例えば、ＣＤ８のヒンジドメインの少なくとも１５個（例えば、２０、２５、３０、３５、又は４０個）の連続したアミノ酸を含有する断片である。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８のものである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８の一部、例えば、ＣＤ２８のヒンジドメインの少なくとも１５個（例えば、２０、２５、３０、３５、又は４０個）の連続したアミノ酸を含有する断片である。ヒンジドメイン及び／又は膜貫通ドメインは、Ｎ末端部分、Ｃ末端部分、又はその両方で追加のアミノ酸（例えば、１５ａａ、１０ａａ、８ａａ、６ａａ、又は４ａａ）に連結されてもよい。その例は、例えば、Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２５（６）：９４７－９５３（２０１９）に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ１６Ａ受容体のもの、例えば、ＣＤ１６Ａ受容体の全ヒンジドメイン又はその一部であり、これは、ＣＤ１６Ａ受容体の最大４０個（例えば、２０、２５、３０、３５、又は４０個）の連続したアミノ酸残基からなり得る。そのようなキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド）は、異なる受容体（非ＣＤ１６Ａ受容体）からのヒンジドメインを含有しない場合がある。ある場合には、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、任意の非ＣＤ１６Ａ受容体からヒンジドメインを含まない場合がある。いくつかの事例では、そのようなキメラ受容体ポリペプチドは、いずれのヒンジドメインを含まなくてもよい。
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤ抗体などのＩｇＧ抗体のヒンジドメインは、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドでの使用にも適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１及びＣＨ２を結合するヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインと、抗体の１つ以上の定常領域と、を含む抗体である。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインと、抗体のＣＨ３定常領域と、を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインと、抗体のＣＨ２及びＣＨ３定常領域と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体、好ましくはＩｇＧ１及びＩｇＧ４である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域と、ＣＨ２及びＣＨ３定常領域と、を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域と、ＣＨ３定常領域と、を含む。
天然に存在しないペプチドを、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドのヒンジドメインとして使用してもよい。いくつかの実施形態では、細胞外標的結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジドメインは、（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカーなどのペプチドリンカーであり、式中、ｘ及びｎは、独立して、３～１２の整数（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２を含む）又はそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり、式中、ｎは、３～６０の整数（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０を含む）であり得る。特定の実施形態では、ｎは、６０より大きい整数であり得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６である。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９である。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１２である。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１５である。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３０である。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４５である。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６０である。
他の実施形態では、ヒンジドメインは、様々な長さの親水性残基（例えば、１０～８０個のアミノ酸残基）からなる非構造化ポリペプチドである、伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）である。ＸＴＥＮペプチドのアミノ酸配列は、当業者に明らかであり、例えば、ＵＳ８，６７３，８６０に見出すことができる（その関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、６０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、３０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、４５アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、１５アミノ酸を含む。
本明細書に記載されるキメラ受容体ポリペプチドを作製するために使用されるヒンジドメインのうちのいずれかは、最大２５０個のアミノ酸残基を含有し得る。いくつかの事例では、キメラ受容体ポリペプチドは、比較的長いヒンジドメイン、例えば、１５０～２５０個のアミノ酸残基（例えば、１５０～１８０個のアミノ酸残基、１８０～２００個のアミノ酸残基、又は２００～２５０個のアミノ酸残基）を含有し得る。他の事例では、キメラ受容体ポリペプチドは、６０～１５０アミノ酸残基（例えば、６０～８０、８０～１００、１００～１２０、又は１２０～１５０アミノ酸残基）を含有し得る、中サイズのヒンジドメインを含有し得る。いくつかの事例では、ヒンジドメインは、１５～６０個のアミノ酸の長さを有するグリシンアミノ酸及びセリンアミノ酸からなる可撓性リンカーであってもよく、好ましくは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ単位、特に、配列番号１５～配列番号１７のリンカーのうちの１つから構成される。代替的に、キメラ受容体ポリペプチドは、６０個未満のアミノ酸残基（例えば、１～３０個のアミノ酸又は３１～６０個のアミノ酸）を含有し得る短いヒンジドメインを含有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド）は、ヒンジドメインを含有しないか、又は非ＣＤ１６Ａ受容体からのヒンジドメインを含有しない。表７に、例示的なヒンジドメインのアミノ酸配列を提供する。
Ｆ．シグナルペプチド
いくつかの実施形態では、キメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド又はＣＡＲポリペプチド）はまた、ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチド（シグナル配列としても知られている）を含んでもよい。一般に、シグナル配列は、細胞における所望の部位にポリペプチドを標的化するペプチド配列である。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、キメラ受容体ポリペプチドを細胞の分泌経路に標的化し、キメラ受容体ポリペプチドの脂質二重層への組み込み及び繋留を可能にする。本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドでの使用に適合する、天然に存在するタンパク質のシグナル配列又は合成の天然に存在しないシグナル配列を含むシグナル配列は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、ＣＤ８α由来である（配列番号１）。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、ＣＤ２８由来である（配列番号２）。他の実施形態では、シグナル配列は、マウスカッパ鎖由来である。更に他の実施形態では、シグナル配列は、ＣＤ１６由来である。表８を参照されたい。
いくつかの事例では、本明細書に開示されるキメラ受容体ポリペプチドのうちのいずれかは、タンパク質タグを更に含み得る。以下の表９に、その例を提供する。
Ｇ．ＡＣＴＲポリペプチドの例
本明細書に記載の方法及び組成物とともに使用するための例示的なＡＣＴＲ構築物は、例えば、本明細書の説明及び図面に見出すことができ、又はＷＯ２０１６／０４０４４１Ａ１、ＷＯ２０１７／１６１３３３、及びＷＯ２０１８／１４０９６０（これらの各々は、この目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドは、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に対する結合親和性及び特異性を有するＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＣＴＲポリペプチドは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを更に含んでもよく、そのうちの１つは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン又は４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインであってもよい。ＡＣＴＲポリペプチドは、宿主細胞上で発現された場合、細胞外リガンド結合ドメインが、標的分子及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインに結合するために細胞外に位置するように構成される。共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化及び／又はエフェクターシグナル伝達を誘発するために細胞質に位置し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｃ結合ドメイン（例えば、ＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン）、膜貫通ドメイン、任意選択的な１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメイン、又はＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメイン）、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。
代替的に、又は加えて、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドは、２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含有し得、これらは、互いに連結され得るか、又は細胞質シグナル伝達ドメインによって分離され得る。ＡＣＴＲポリペプチドにおける細胞外Ｆｃ結合剤、膜貫通ドメイン、任意選択的な共刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）、及び細胞質シグナル伝達ドメインは、互いに直接的に、又はペプチドリンカーを介して連結され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドのうちのいずれかは、Ｎ末端にシグナル配列を含み得る。
表１０は、本明細書に記載の例示的なＡＣＴＲポリペプチドを提供する。これらの例示的な構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ順に、シグナル配列、Ｆｃ結合ドメイン（例えば、Ｆｃ受容体の細胞外ドメイン）、ヒンジドメイン、及び膜貫通を有するが、任意選択的な共刺激ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインの位置を切り替えることができる。
Ｈ．ＣＡＲポリペプチドの例
本明細書に記載の方法及び組成物とともに使用するための例示的なＣＡＲポリペプチドは、例えば、本明細書の説明及び図、又は当該技術分野で既知のものとして見出すことができる。本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、目的の抗原に対する結合親和性及び特異性を有する一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）（例えば、表４に列挙されているもの、膜貫通ドメイン（例えば、表５に列挙されているもの）、好ましくはＣＤ８ａ膜貫通ドメイン）、共刺激ドメイン（例えば、表６に列挙されているもの）、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む細胞外ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ヒンジドメイン（例えば、表７に列挙されているもの）を更に含み得る。
特定の例では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン若しくは４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及び（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、又はそれらの組み合わせを含み得る。更なる具体的な例では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン若しくは４－１ＢＢ共刺激ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、又はそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを更に含んでもよく、そのうちの１つは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン又は４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインであってもよい。他の例では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４－１ＢＢ共刺激ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、又はそれらの組み合わせを含み得る。
例示的な実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ８αヒンジドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン、（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン若しくは４－１ＢＢ共刺激ドメイン、（ｉｖ）ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、２つの共刺激ドメインを含むＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ８α若しくはＣＤ２８ヒンジドメイン（ｉｉ）ＣＤ８α若しくはＣＤ２８膜貫通ドメイン、（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン若しくは４－１ＢＢ共刺激ドメイン、（ｉｖ）ＯＸ４０Ｌ共刺激ドメイン、若しくは２Ｂ４共刺激ドメイン、若しくはＤＡＰ１０共刺激ドメイン、若しくはＤＮＡＭ－１共刺激ドメイン、若しくはＮＫＧ２Ｄ共刺激ドメイン、若しくはＮＫｐ３０共刺激ドメイン、若しくはＮＫｐ４４共刺激ドメイン、若しくはＮＫｐ４６共刺激ドメイン、若しくはＪＡＭＡＬ共刺激ドメイン、（ｖ）ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせを更に含む。別の例示的な実施形態では、２つの共刺激ドメインを含むＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ８αヒンジドメイン、（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン若しくは４－１ＢＢ共刺激ドメイン、（ｉｖ）ＯＸ４０Ｌ共刺激ドメイン、若しくは２Ｂ４共刺激ドメイン、若しくはＤＡＰ１０共刺激ドメイン、若しくはＤＮＡＭ－１共刺激ドメイン、若しくはＪＡＭＡＬ共刺激ドメイン、（ｖ）ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせを更に含む。
別の例示的な実施形態では、２つの共刺激ドメインを含むＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ８αヒンジドメイン、（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、若しくはＮＫｐ４４膜貫通ドメイン、若しくはＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、若しくはＮＫｐ４６膜貫通ドメイン、（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン、若しくは４－１ＢＢ共刺激ドメイン、若しくは２Ｂ４共刺激ドメイン、若しくはＤＡＰ１０共刺激、（ｉｖ）ＯＸ４０Ｌ共刺激ドメイン、若しくは２Ｂ４共刺激ドメイン、若しくはＤＡＰ１０共刺激ドメイン、若しくはＤＡＰ１２、若しくはＤＮＡＭ－１共刺激、若しくはＪＡＭＡＬ共刺激ドメイン、（ｖ）ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、若しくはＤＡＰ１２細胞質シグナル伝達ドメイン、若しくは２Ｂ４細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせを更に含む。例示的な実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ８αヒンジドメイン、（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン若しくは４－１ＢＢ共刺激ドメイン、（ｉｖ）ＯＸ４０Ｌ共刺激ドメイン若しくはＯＸ４０共刺激ドメイン、（ｖ）ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせを含む。
例えば、ＣＡＲポリペプチドは、以下に提供される配列番号７８又は配列番号７９から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
ＣＡＲポリペプチドは、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）で発現された場合、細胞外抗原結合ドメインが、標的分子（例えば、腫瘍抗原）及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインに結合するために細胞外に位置するように構成される。共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化及び／又はエフェクターシグナル伝達を誘発するために細胞質に位置し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、任意選択的な１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０Ｌ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメイン、２Ｂ４共刺激シグナル伝達ドメイン、又はＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメイン）、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。
代替的に、又は加えて、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含有し得、これらは、互いに連結され得るか、又は細胞質シグナル伝達ドメインによって分離され得る。ＣＡＲポリペプチドにおける細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、任意選択的な共刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）、及び細胞質シグナル伝達ドメインは、互いに直接、又はペプチドリンカーを介して連結され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかは、Ｎ末端にシグナル配列を含み得る。
表１１～１３は、本明細書に記載のＣＡＲ－αβ Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、及びＣＡＲ－γδ Ｔ細胞のための例示的なＣＡＲポリペプチドを提供する。これらの例示的な構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、順番に、シグナル配列、抗原結合ドメイン（例えば、腫瘍抗原又は病原性抗原などの抗原を標的とするｓｃＦｖ断片）、ヒンジドメイン、及び膜貫通を有するが、任意選択的な共刺激ドメイン（複数可）及び細胞質シグナル伝達ドメインの位置を切り替えることができる。
抗ＧＰＣ ＣＡＲ構築物を構築するための例示的な抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖのアミノ酸配列、並びにそれを含む例示的な抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ構築物を以下に提供する。
抗ＧＰＣ３ ｓｃＦＶ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＲＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＮＴＨＶＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＬＤＰＫＴＧＤＴＡＹＳＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＦＹＳＹＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７７）
抗ＧＰＣ３－ＣＡＲ１
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＲＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＮＴＨＶＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＬＤＰＫＴＧＤＴＡＹＳＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＦＹＳＹＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号７８）
抗ＧＰＣ３－ＣＡＲ２
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＲＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＮＴＨＶＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＬＤＰＫＴＧＤＴＡＹＳＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＦＹＳＹＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号７９）
Ｉ．ＴＣＲポリペプチド
本開示は、標的細胞上の外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む改変された免疫細胞（例えば、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、又はＮＫＴ細胞）を提供する（例えば、がんなどの疾患に関連する主要組織適合（ＭＨＣ）分子上に提示されるペプチド抗原を認識する；本明細書の考察を参照されたい）。本明細書で使用される場合、ＴＣＲ複合体は、Ｔ細胞又はＮＫＴ細胞上で発現され、ＣＤ３複合体と会合する。ＴＣＲ複合体の関与は、増殖、サイトカイン分泌、及び細胞溶解活性の形態でＴ細胞活性化をもたらす。細胞免疫療法を改善するために使用することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫＴ細胞）が本明細書に提供される。例えば、本開示は、（ｉ）エピトープ（例えば、腫瘍（ネオ）エピトープ又は腫瘍関連抗原）に特異的に結合する細胞外一本鎖バリアント断片、（ｉｉ）細胞内活性化ドメイン、及び（ｉｉｉ）細胞外一本鎖バリアント断片を細胞内活性化ドメインに結合する膜貫通リンカーを含む、キメラポリペプチドをコードするベクターを含有する、改変された免疫細胞を提供する。最も典型的には、第１、第２、及び第３のセグメントは、細胞外一本鎖バリアント断片、細胞内活性化ドメイン、及びリンカーが単一のキメラポリペプチドを形成するように配置される。
（ｉ）ペプチド－ＭＨＣ複合体
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、ペプチド抗原を細胞表面に送達する糖タンパク質を指す。ヒトＭＨＣは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称される。ＭＨＣクラスＩ分子は、ヘテロ二量体であり、膜を貫通するα鎖（３つのαドメインを有する）と、非共有結合的に会合したβ２マイクログロブリンと、を有する。ＭＨＣＩは、ＨＬＡ Ａ、Ｂ、及びＣ、並びにＢ２マイクログロブリンからなる。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、膜を貫通する２つの膜貫通糖タンパク質α及びβで構成される。各鎖には、２つのドメインを有する。ＭＨＣＩＩは、いくつかのＨＬＡ（ＨＬＡ－ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ）のヘテロ二量体である。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞質に由来するペプチドを細胞表面に送達し、そこでペプチド－ＭＨＣ複合体が、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞系に由来するペプチドを細胞表面に送達し、そこでそれらが、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される。ＴＣＲは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、がん生殖系抗原（ＣＧＡ）、並びにウイルス抗原及びネオ抗原を含む腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を含む一連のペプチド抗原を認識することができる（Ｓｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：８３５７６２（２０２２）の表１に列挙されている）。
（ｉｉ）ＣＤ３複合体
ＣＤ３は、本明細書で使用される場合、Ｔ細胞における抗原シグナル伝達に関連する６本の鎖のマルチタンパク質複合体を指す。哺乳動物では、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、及びＣＤ３ζ鎖のホモ二量体を含む。ＣＤ３γ、ＣＤ３β、及びＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの非常に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ、ＣＤ３β、ＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は、負に帯電しており、これらの鎖が正に帯電したＴＣＲ鎖と会合することを可能にする特性である。ＣＤ３γ、ＣＤ３β、及びＣＤ３ε鎖の細胞内尾部は、各々、免疫受容体チロシン活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られる単一の保存されたモチーフを含有し、一方、各ＣＤ３ζ鎖は、３つを有する。理論に束縛されることを望むものではないが、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力にとって重要であると考えられる。本開示で使用されるＣＤ３は、好ましくは、細胞療法に使用されるＴ細胞又はＮＫＴ細胞の内因性複合体である。次に、Ｔ細胞又はＮＫＴ細胞は、ヒト、マウス、ラット、又は他の哺乳動物を含む様々な動物種に由来し得る。
（ｉｉｉ）ＴＣＲ複合体
本明細書で使用されるＴＣＲ複合体は、ＣＤ３とＴＣＲとの会合によって形成される複合体を指す。ＴＣＲは、２つのヘテロ二量体ＴＣＲ鎖、（αβ Ｔ細胞では）ＴＣＲα、ＴＣＲβ、又は（γδ Ｔ細胞では）ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、及びＭＨＣ上に提示されるペプチド抗原を認識するマルチタンパク質複合体のための６つのＣＤ３鎖からなる。ＴＣＲ複合体は、リガンド結合部位を形成し、ＣＤ３複合体タンパク質は、シグナル伝達及びその後のＴ細胞活性化を媒介する。ＴＣＲαは、ＴＲＡ遺伝子によってコードされ、β鎖はＴＲＢによってコードされ、γ鎖はＴＲＧによってコードされ、δ鎖はＴＲＤによってコードされる。
生理学的ＴＣＲ複合体の構成要素は、ＴＣＲ鎖（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、又はＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（すなわち、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、又はＣＤ３ζ）、又は２つ以上のＴＣＲ鎖若しくはＣＤ３鎖（例えば、ＴＣＲα及びＴＣＲβの複合体、ＴＣＲγ及びＴＣＲδの複合体、ＣＤ３ε及びＣＤ３δの複合体、ＣＤ３γ及びＣＤ３εの複合体、又はＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及び２つのＣＤ３ε鎖のサブＴＣＲ複合体）によって形成される複合体を指す。いくつかの事例では、複合体は、２つ以上のＴＣＲ鎖又はＣＤ３鎖（例えば、ＴＣＲα及びＴＣＲβの複合体、ＴＣＲγ及びＴＣＲδの複合体、ＣＤ３ε及びＣＤ３δの複合体、ＣＤ３γ及びＣＤ３εの複合体、又はＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δのサブＴＣＲ複合体、及び２つのＣＤ３ε鎖）によって形成され得る。
ＴＣＲは、ジスルフィド結合（α／β又はγ／δ ＴＣＲ）によって連結され、ＣＤ３鎖と非共有結合性マルチタンパク質複合体を形成するヘテロ二量体ＴＣＲから構成される。ＴＣＲ鎖は、細胞外領域、膜貫通領域、及び短い細胞質尾部からなるＩ型タンパク質である。細胞外ドメインは、抗原認識に関与する超可変Ｖ領域と、膜の近位にある定常Ｃ領域と、を含有する。膜貫通及び細胞質ドメインは、ＣＤ３鎖と非共有結合性の相互作用を形成して、ＴＣＲ複合体を安定化し、下流シグナル伝達を媒介する（Ｋｕｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ，２５０（２０１２）、Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ，２：ａ００５１４０（２０１０））。ＴＣＲ及びそれらの設計の概説は、Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３３：１１２－９（２０１５）（本明細書で参照される主題及び目的のために、参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。操作されたＴＣＲを産生するための方法は、例えば、Ｂｏｗｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４６：３０００－８（２００９）（その技法は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。更に、特定の抗原に結合するＴＣＲは、それぞれ、相補的なＶα又はＶβドメインのライブラリをスクリーニングするために、抗原に結合するＴＣＲからのＶα又はＶβドメインを使用して単離され得る。特定の実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞の表面に見出され、ＣＤ３複合体と会合する。本開示で使用されるＴＣＲの供給源は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、又は他の哺乳動物などの様々な動物種に由来し得る。
ＴＣＲ複合体は、（ａ）細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞質ドメインを更に含む。細胞外ドメインは、天然又は組換え源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意のタンパク質に由来し得るが、膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質である。一態様では、細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと会合することができる。本開示における特定の使用の細胞外ドメインの非限定的な例としては、ＴＣＲのα、β、γ、若しくはδ鎖、又はＣＤ３ε、ＣＤ３γ、若しくはＣＤ３δ、又は代替的な実施形態では、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、相互作用対の１つのメンバーを含むことができ、例えば、抗原結合ドメインは、受容体と、リガンドと、を含む相互作用対の１つのメンバー又はその断片であり得る。受容体若しくはリガンド、又はその断片のいずれかは、抗原結合ドメインと称され得る。抗原結合ドメインとは称されない他のメンバーは、抗原結合ドメインが特異的に結合するエピトープを含むことができる。
第２の抗原結合ドメインは、ＴＣＲ複合体の任意のメンバーに連結され得、ＴＣＲは、α／β又はγ／δ ＴＣＲであり得る。第２の抗原結合ドメインは、ＴＣＲ鎖、表面抗原分類３（ＣＤ３）鎖、又はＣＤ３ζ鎖のうちの少なくとも１つに連結され得る。第２の抗原結合ドメインは、ＴＣＲ、例えば、ＴＣＲδ、ＴＣＲγ、ＴＣＲα、又はＴＣＲβの膜貫通受容体に連結され得る。第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３鎖、例えば、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、又はＣＤ３γに連結され得る。第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３ζ鎖と連結され得る。
いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ複合体は、ＣＤ３ε鎖に融合された第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３δ鎖に融合された第２の抗原結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ複合体は、ＣＤ３δ鎖に融合された第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ鎖に融合された第２の抗原結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ複合体は、ＣＤ３α鎖又はＣＤ３β鎖に融合された第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３ε鎖に融合された第２の抗原結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ複合体は、ＣＤ３β鎖又はＣＤ３δ鎖に融合された第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３ε鎖に融合された第２の抗原結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ複合体は、α鎖又はＴＣＲγ鎖に融合された第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ鎖に融合された第２の抗原結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ複合体は、ＴＣＲβ鎖又はＴＣＲδ鎖に融合された第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ鎖に融合された第２の抗原結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ複合体は、ＴＣＲα鎖又はＴＣＲγ鎖に融合された第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３δ鎖に融合された第２の抗原結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＴＣＲ複合体は、ＴＣＲβ鎖又はＴＣＲδ鎖に融合された第１の抗原結合ドメインと、δ鎖に融合された第２の抗原結合ドメインと、を含む。
次に、膜貫通ドメインは、天然又は組換え源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。一態様では、膜貫通ドメインは、ＴＣＲ複合体が標的に結合しているときはいつでも、細胞内ドメイン（複数可）にシグナル伝達することができる。本開示における特定の使用の膜貫通ドメインの非限定的な例としては、ＴＣＲのα、β、γ、又はδ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４が挙げられ得る。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域に会合する１つ以上のアミノ酸を含むことができる。一態様では、膜貫通ドメインは、使用されるＴＣＲの他のドメインのうちの１つと会合しているドメインである。いくつかの事例では、膜貫通ドメインは、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避け、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択又は改変され得る。
一般に、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインは、単一のゲノム配列によってコードされ得る。代替的な実施形態では、配列は、細胞外ドメインに対して異種である膜貫通ドメインを含むように設計することができる。
任意選択的に、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーは、膜貫通ドメインとＴＣＲポリペプチドの細胞質領域との間の結合を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、特に好適なリンカー（例えば、配列番号１５～１７）を提供する。
ＴＣＲの細胞質ドメインは、細胞内ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、又はＴＣＲδ由来である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ複合体がＣＤ３γ、δ、εポリペプチドを含有する場合、細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含み、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、及びＴＣＲδサブユニットは、一般に、短い（例えば、１～１９アミノ酸長）細胞内ドメインを有し、一般に、シグナル伝達ドメインを欠く。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、ＴＣＲが導入された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関与している。ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、及びＴＣＲδの細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを有しないが、それらは、本明細書に記載の一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインとして機能するＣＤ３ｚを有するタンパク質を動員することができる。
いくつかの事例では、ＴＣＲサブユニットは、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つが、同じＴＣＲサブユニットに由来する。いくつかの事例では、ＴＣＲ細胞外ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε ＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γ ＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δ ＴＣＲサブユニット、及びその機能的断片の細胞外ドメイン又はその一部を含む。
いくつかの事例では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ｚ ＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ε ＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γ ＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δ ＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通ドメイン、及びそれらの機能的断片を含む、膜貫通ドメインを含む。
いくつかの事例では、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、又はＴＣＲδのＴＣＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δの細胞内シグナル伝達ドメイン及びその機能的断片を含むタンパク質の刺激ドメインを含む。
本明細書の態様の様々な実施形態では、改変されたＴＣＲ複合体は、以前に特定されたＴＣＲを含む。ある場合には、ＴＣＲは、全エキソーム配列決定を使用して特定することができる。例えば、ＴＣＲは、標的細胞の全エキソーム配列決定によって特定されるネオ抗原又はネオエピトープを標的とすることができる。代替的に、ＴＣＲは、自己、同種、又は異種のレパートリーから特定され得る。
改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体は、第２のエピトープへの結合を示す第２の抗原結合ドメインを含むことができる。第２の抗原結合ドメインは、エピトープに結合することができる任意のタンパク質又は分子を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、第２のエピトープへの結合を示す異種配列を含む。ＴＣＲ複合体の第２の抗原結合ドメインの非限定的な例としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はその機能的誘導体、バリアント、若しくは断片が挙げられるが、これらに限定されない。それらには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、及び単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ科動物由来のナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び可変ドメイン（ＶＨ Ｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。
ＴＣＲは、胸腺選択により、約１～１００μＭの範囲の天然に比較的低い親和性を有する。可変領域におけるアミノ酸置換は、低μＭ及びｎＭ範囲への親和性を増加させることができる。酵母及びバクテリオファージのディスプレイ方法は、ｐＭ範囲で非常に高い親和性のＴＣＲを生成するために使用されている。ＴＣＲ親和性を増加させることもまた、特異性の喪失をもたらし得るが、より微妙な構造ガイド設計アプローチを使用して、特異性を低下させることなく親和性を増加させることができる。ＴＣＲはまた、抗原認識ドメイン及びＣＤ３ｚドメインのペプチドリンカーによって融合されたＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖からの可変領域を含有数ｒ単鎖タンパク質に操作されて、シグナル伝達を付与することができる。追加の共刺激ドメインもまた、シグナル伝達を改善するために含まれ得る（Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，７：１３６９－７７（２０００）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１１：４８７－９６（２００４）、Ｐｌａｋｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：２２１８－２７（１９９７）、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，９１：１２６５４－８（１９９４））。
ＩＩＩ．グルコース代謝産物を再誘導する因子及び
任意選択的に、キメラ受容体ポリペプチドを発現する造血細胞
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるように、グルコース代謝産物を再誘導する（例えば、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する）因子のうちの１つ以上を発現する遺伝子操作された宿主細胞（例えば、ＨＳＣ及び免疫細胞などの造血細胞、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）である。いくつかの実施形態では、因子（例えば、ポリペプチド）は、宿主細胞に導入された導入遺伝子（例えば、宿主細胞に対して外因性）によってコードされる。遺伝子操作された宿主細胞は、また、本明細書に記載されるように、キメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲ発現細胞、例えば、ＡＣＴＲ Ｔ細胞、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＴＣＲ発現細胞、例えば、ＴＣＲ－Ｔ細胞）を更に発現し得る。いくつかの態様では、宿主細胞は、造血細胞又はその子孫である。いくつかの実施形態では、造血細胞は、造血幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、単球／マクロファージ、好中球、好酸球、αβ Ｔ細胞又はγδ Ｔ細胞であり得る。他の実施形態では、宿主細胞は、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、二重陰性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、ＴｈＩ細胞、ＴｈＩＩ細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞）、又はＮＫ細胞などの免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、αβ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、γδ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞はＶγ９δ２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞はＶδ１ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞は、Ｖγ９δ２ ＴＣＲ、Ｖγ１０／Ｖδ２ ＴＣＲ、及び／又はＶγ２／Ｖδ２ ＴＣＲを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＮＫＴ細胞である。
好ましい実施形態では、免疫細胞は、αβ Ｔ細胞であり、キメラ受容体ポリペプチドは、表１１に示される成分を含むＣＡＲポリペプチドである。別の好ましい実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞であり、キメラ受容体ポリペプチドは、表１２に示される成分を含むＣＡＲポリペプチドである。更に別の好ましい実施形態では、免疫細胞は、γδ Ｔ細胞であり、キメラ受容体ポリペプチドは、表１３に示される成分を含むＣＡＲポリペプチドである。
いくつかの他の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞は、例えば、ＮＫ－９２、ＮＫ－９２ＭＩ、ＹＴＳ、及びＫＨＹＧ－１から選択される細胞株、好ましくはＮＫ－９２細胞に由来し得る。他の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、臍帯血幹細胞（ＣＢＳＣ）、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来し得る。
いくつかの実施形態では、ＨＳＣ又は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）などの遺伝子操作された造血細胞は、本明細書に開示されるものなどのＣＡＲ構築物のうちのいずれかを、グルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドなどのグルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ＰＫＭ２、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ）のうちのいずれかと共発現し得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ構築物は、４－１ＢＢ又はＣＤ２８からの共刺激ドメインを含み得、グルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドは、ＰＫＭ２、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲである。ＣＡＲ構築物は、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８α）又はＣＤ２８からのヒンジ及び膜貫通ドメインを更に含み得る。
いくつかの例では、ＨＳＣ又は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）などの遺伝子操作された造血細胞は、ＣＡＲ構築物（例えば、本明細書に開示される抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ）のうちのいずれかを、ＴＩＧＡＲと共発現するように操作され得る。特定の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＣＡＲと、ＴＩＧＡＲと、を共発現するＴ細胞を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＣＡＲと、ＴＩＧＡＲと、を共発現するＮＫ細胞を含む。
他の実施形態では、ＨＳＣ又は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）などの遺伝子操作された造血細胞は、本明細書に開示されるものなどのＡＣＴＲ構築物のうちのいずれかを、グルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドなどのグルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ＰＫＭ２、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ）のうちのいずれかと共発現し得る。いくつかの実施形態では、ＡＣＴＲ構築物は、４－１ＢＢ又はＣＤ２８からの共刺激ドメインを含み得、グルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドは、ＰＫＭ２、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲである。ＡＣＴＲ構築物は、ＣＤ８又はＣＤ２８からのヒンジ及び膜貫通ドメインを更に含み得る。
いくつかの例では、ＨＳＣ又は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）などの遺伝子操作された造血細胞は、ＡＣＴＲ構築物（例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ１６Ａ－Ｖ１５８ ＡＣＴＲ）のうちのいずれかを、ＴＩＧＡＲと共発現するように操作され得る。特定の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＡＣＴＲと、ＴＩＧＡＲと、を共発現するＴ細胞を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＡＣＴＲと、ＴＩＧＡＲと、を共発現するＮＫ細胞を含む。
代替的に、本明細書に開示される遺伝子操作された宿主細胞は、いずれのキメラ受容体ポリペプチドも発現しない場合がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、グルコース代謝産物を再誘導する１つ以上の因子を過剰に発現し得る遺伝子操作された免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来し得る。グルコース代謝産物を再誘導する因子の過剰発現は、腫瘍微小環境における抗腫瘍活性又はＴＩＬを増強し得る。特定の実施形態では、ＭＨＣ複合体を提示する特定のペプチドに対して反応性／標的であるＴＩＬが選択される。
遺伝子改変されたＴＣＲを発現するＴＩＬ及び／又はＴ細胞は、ペプチドが病原体、腫瘍抗原、又は自己抗原に由来し得るペプチド－ＭＨＣ複合体を標的とし得る。以下の表１５に、いくつかの例を提供する。
本明細書に開示されるＣＡＲ構築物のうちのいずれか、又はＡＣＴＲ Ｔ細胞と共用される抗体はまた、そのようなペプチド／ＭＨＣ複合体におけるペプチドのいずれかを標的とすることができる。
他の実施形態では、ＨＳＣ又は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫＴ細胞）などの遺伝子操作された造血細胞は、ＴＣＲポリペプチドを、グルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチドなどのグルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ＰＫＭ２、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ）のうちのいずれかと共発現し得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞又はＮＫなどの免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパー細胞又はＣＤ８＋細胞傷害性細胞、又はそれらの組み合わせであり得る。代替的に、又は加えて、Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞などの抑制Ｔ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。他の実施形態では、免疫細胞は、由来細胞株、例えば、ＮＫ－９２細胞であり得る。免疫細胞の集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、又は脾臓、リンパ節、胸腺、若しくは腫瘍組織などの組織など、任意の供給源から得ることができる。一実施形態では、リンパ球は、腫瘍組織、すなわち、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から得られる。代替的に、免疫細胞集団は、幹細胞、例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）、臍帯血幹細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来し得る。所望のタイプの宿主細胞を得るのに好適な供給源は、当業者には明らかであろう。いくつかの例では、免疫細胞は、当該技術分野で既知の異なるタイプのＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の混合物であり得る。例えば、免疫細胞は、好適なドナー（例えば、ヒト患者）から単離された免疫細胞の集団であり得る。好ましい実施形態では、免疫細胞の集団は、本明細書に記載の治療を必要とする患者（例えば、ヒト患者）から得られ得る、ＰＢＭＣに由来する。所望の宿主細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）のタイプは、細胞を刺激分子と共インキュベートすることによって得られた細胞の集合内で増殖され得る。非限定的な例として、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体は、Ｔ細胞の増殖のために使用され得る。
本発明の更なる実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞は、集合的に、グルコース代謝産物を転用又は再誘導する因子をコードする、第１のヌクレオチド配列と、キメラ受容体ポリペプチドをコードする、第２のヌクレオチド配列と、を含む、核酸又は核酸セットを含む。いくつかの事例では、宿主細胞に導入されるグルコース代謝産物を再誘導する因子は、宿主細胞の内因性タンパク質と同一である。宿主細胞にグルコース代謝産物を再誘導する因子のコード配列の追加のコピーを導入すると、天然の対応物と比較して、ポリペプチドの発現レベルが増強される（すなわち、過剰に発現される）であろう。いくつかの事例では、宿主細胞に導入されるグルコース代謝産物を再誘導する因子は、宿主細胞に対して異種であり、すなわち、宿主細胞に存在しないか又は発現されない。グルコース代謝産物を再誘導するそのような異種因子は、天然には宿主細胞で発現されない（例えば、異なる種由来又は同じ種の異なる細胞型由来の）天然に存在するタンパク質であり得る。代替的に、グルコース代謝産物を再誘導する異種因子は、本明細書に記載のものなどの天然のタンパク質のバリアントであり得る。いくつかの例では、コード核酸の外因性（すなわち、宿主細胞に対して天然ではない）コピーは、染色体外に存在し得る。他の例では、コード配列の外因性コピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれ得、内在性遺伝子の天然の遺伝子座とは異なる部位に位置し得る。
そのような遺伝子操作された宿主細胞は、増強された解糖速度を有する能力を有し、例えば、環境からグルコースを取り込む増強された能力を有し得る。したがって、これらの遺伝子操作された宿主細胞は、例えば、腫瘍微小環境において、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／又は低酸素条件下で、より良い増殖及び／又は生物活性を示し得る。
遺伝子操作された細胞は、本明細書に開示されるキメラ受容体ポリペプチドを発現している場合、直接的に（例えば、ＣＡＲを発現する免疫細胞若しくはＴＣＲを発現するＴ細胞によって）、又は抗腫瘍抗体などのＦｃを含有する治療剤を介して（例えば、ＡＣＴＲを発現する免疫細胞によって）、標的細胞を認識及び阻害することができる。低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／又は低酸素環境（例えば、腫瘍微小環境）におけるそれらの予想される高い増殖率、生物活性、及び／又は生存率を考慮すると、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞などの遺伝子操作された細胞は、グルコース代謝産物を再誘導する因子を発現しないか、又は低レベル若しくはあまり活性ではない形態の因子を発現するキメラ受容体ポリペプチドＴ細胞、ＮＫＴ細胞、又はＮＫ細胞と比較して、より高い治療有効性を有することが期待されるであろう。
グルコース代謝産物を再誘導する因子のうちのいずれか及び任意選択的に本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞を構築するために、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドの安定した発現又は一過的な発現のための発現ベクターは、本明細書に記載される従来の方法を介して作製され、免疫宿主細胞に導入され得る。例えば、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸は、好適なプロモーターに作動可能に連結されたウイルスベクター又は非ウイルスベクターなどの１つ又は２つの好適な発現ベクターにクローニングされ得る。いくつかの事例では、キメラ受容体ポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子のコード配列の各々は、２つの別個の核酸分子上にあり、２つの別個のベクターにクローニングされ得、これらは、好適な宿主細胞に同時に又は順次導入され得る。他の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子のコード配列は、１つの核酸分子上にあり、１つのベクターにクローニングすることができる。したがって、免疫細胞が、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との両方を含む核酸を含むことが一実施形態である。キメラ受容体ポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子のコード配列は、２つのポリペプチドの発現が異なるプロモーターによって制御されるように、２つの異なるプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、キメラ受容体ポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子のコード配列は、２つのポリペプチドの発現が単一のプロモーターによって制御されるように、１つのプロモーターに作動可能に連結され得る。好適な配列は、２つの別個のポリペプチドが単一のｍＲＮＡ分子から翻訳され得るように、２つのポリペプチドのコード配列の間に挿入され得る。そのような配列、例えば、ＩＲＥＳ又はリボソームスキッピング部位は、当該技術分野で周知である。したがって、核酸は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間に位置する第３のヌクレオチド配列を更に含み、第３のヌクレオチド配列が、リボソームスキッピング部位、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、又はプロモーターをコードすることが一実施形態である。追加の説明を以下に提供する。
更なる実施形態では、核酸又は核酸セットは、１つ以上のウイルスベクター内に含まれる。核酸及びベクター（複数可）は、好適な条件下で、制限酵素と接触させて、各分子上に相補的な末端を作製し、各分子が、互いに対合し、リガーゼで結合され得る。代替的に、合成核酸リンカーは、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸の末端にライゲーションされ得る。合成リンカーは、ベクター内の特定の制限部位に対応する核酸配列を含有し得る。発現ベクター／プラスミド／ウイルスベクターの選択は、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドの発現のための宿主細胞のタイプに依存するであろうが、真核細胞での組み込み及び複製に好適であるべきである。
様々なプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモーター、ウイルスＬＴＲ（例えば、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ－ＬＴＲ、ＨＴＬＶ－１ ＬＴＲ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ヒトＥＦ１－アルファプロモーター、又は単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない、本明細書に記載のグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドの発現のために使用することができる。グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドの発現のための追加のプロモーターには、免疫細胞における任意の構成的に活性なプロモーターが含まれる。代替的に、その発現が免疫細胞内で調節され得るように、任意の調節可能／誘導可能なプロモーターを使用してもよい。好適な誘導システムは、当該技術分野で既知である。例えば、Ｋａｌｌｕｎｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｌｌｕｎｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ，８（８）：７９６（２０１９））を参照されたい。
更に、ベクターは、例えば、宿主細胞における安定した又は一過的なトランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子又はカナマイシン遺伝子などの選択可能なマーカー遺伝子、高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列、ヒトＥＦ１－アルファ遺伝子からのイントロン配列、ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写終結シグナル及びＲＮＡプロセシングシグナル、ＳＶ４０又はポリオマウイルス複製起点及び適切なエピソーム複製のためのＣｏｌＥ１、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳｅ）、多用途多重クローニング部位、センス及びアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７及びＳＰ６ ＲＮＡプロモーター、作動するとベクターを保有する細胞を死滅させる「自殺スイッチ」又は「自殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ又はｉＣａｓｐ９などの誘導性カスパーゼ）、並びにグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドの発現を評価するためのレポーター遺伝子（複数可）のうちのいくつか又は全てを含有し得る。
特定の一実施形態では、そのようなベクターは、自殺遺伝子も含む。本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子が発現される細胞に対して薬剤（例えば、薬物）に対する感受性を付与し、細胞が薬剤に接触又は曝露された場合に細胞を死滅させる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野で既知であり（例えば、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｊ．（Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）を参照）、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼ、及びカスパーゼ（例えば、カスパーゼ８）が含まれる。
導入遺伝子を含有するベクターを産生するための好適なベクター及び方法は、当該技術分野で周知であり、かつ入手可能である。グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドの発現のためのベクターの調製の例は、例えば、ＵＳ２０１４／０１０６４４９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
本明細書に記載のグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターのうちのいずれかも、本開示の範囲内である。そのようなベクター、又はそこに含有されるグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドをコードする配列は、任意の好適な方法によって宿主免疫細胞などの宿主細胞に送達され得る。ベクターを免疫細胞に送達する方法は、当該技術分野で周知であり、ＤＮＡエレクトロポレーション、ＲＮＡエレクトロポレーション、試薬（例えば、リポソーム）を使用するトランスフェクション、又はウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入などのレトロウイルス形質導入）を含み得る。
いくつかの実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドの発現のためのベクターは、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス又はガンマレトロウイルス形質導入などのレトロウイルス形質導入）によって宿主細胞に送達される。送達のための例示的なウイルス方法としては、組換えレトロウイルス（例えば、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、及びＷＯ９１／０２８０５、ＵＳ５，２１９，７４０、及びＵＳ４，７７７，１２７、ＧＢ２，２００，６５１、及びＥＰ０３４５２４２を参照）、アルファウイルスベースのベクター、並びにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、及びＷＯ９５／００６５５を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドの発現のためのベクターは、レトロウイルスである。いくつかの実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドの発現のためのベクターは、レンチウイルスである。
レトロウイルス形質導入を記載する参考文献の例としては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ５，３９９，３４６、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３（１）：１５３－１５９（１９８３）、ＵＳ４，６５０，７６４、ＵＳ４，９８０，２８９、Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，６２（４）：１１２０－１１２４（１９８８）、ＵＳ５，１２４，２６３、ＷＯ９５／０７３５８、及びＫｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８２（３）：８４５－８５２（１９９３）が挙げられる。ＷＯ９５／０７３５８は、高効率の初代Ｂリンパ球の形質導入を記載している。また、ＷＯ２０１６／０４０４４１Ａ１（本明細書で参照される目的及び主題のために、全て参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
ウイルスベクターを使用してグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドをコードするベクターが宿主細胞に導入される例では、免疫細胞に感染することができ、ベクターを保有するウイルス粒子は、当該技術分野で既知の任意の方法によって産生され得、例えば、ＷＯ９１／０２８０５Ａ２、ＷＯ９８／０９２７１Ａ１、及びＵＳ６，１９４，１９１に見出すことができる。ウイルス粒子を細胞培養上清から採取し、ウイルス粒子を免疫細胞と接触させる前に単離及び／又は精製され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるグルコース代謝産物を再誘導する因子のうちのいずれか及び／又はキメラ受容体ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子は、従来の方法（例えば、インビトロ転写）によって調製され、次いで、既知の方法、例えば、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，Ｋｏｍａｒｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（１０）：１０２７－１０３５（２００６））を介して、好適な宿主細胞（例えば、本明細書に記載のもの）に導入され得る。
いくつかの事例では、グルコース代謝産物を再誘導する因子をコードする核酸と、好適なキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸と、を別個の発現ベクターにクローニングしてもよく、これを好適な宿主細胞に同時又は順次導入してもよい。例えば、グルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するための発現ベクター（又はＲＮＡ分子）を最初に宿主細胞に導入してもよく、グルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するトランスフェクションされた宿主細胞を単離してインビトロで培養してもよい。次いで、好適なキメラ受容体ポリペプチドを発現するための発現ベクター（又はＲＮＡ分子）を、グルコース代謝産物を再誘導する因子を発現する宿主細胞に導入することができ、両方のポリペプチドを発現するトランスフェクトされた細胞を単離することができる。別の例では、グルコース代謝産物を再誘導する因子及びキメラ受容体ポリペプチドを発現するための発現ベクター（又はＲＮＡ分子）は、同時に宿主細胞に導入され得、両方のポリペプチドを発現するトランスフェクトされた宿主細胞は、日常的な方法論を介して単離され得る。
他の事例では、グルコース代謝産物を再誘導する因子をコードする核酸及びキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸は、同じ発現ベクターにクローニングしてもよい。キメラ受容体ポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現のためのポリヌクレオチド（そのようなポリヌクレオチドが少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結されているベクターを含む）も、本開示の範囲内である。本開示の有用なベクターの非限定的な例として、例えば、ガンマレトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクター、並びにアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）などのウイルスベクターが挙げられる。
いくつかの事例では、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸（複数可）は、トランスポゾン（例えば、ｐｉｇｇｙｂａｃ）を介して宿主細胞に送達され得る。いくつかの事例では、コード核酸（複数可）は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はメガヌクレアーゼによって、遺伝子編集を介して宿主細胞に送達され得る。
いくつかの事例では、本明細書に記載の核酸は、２つのコード配列を含み得、一方は、本明細書に記載されるキメラ受容体ポリペプチドをコードし、他方は、解糖経路からグルコースを再誘導することができるポリペプチド（すなわち、グルコース代謝産物を再誘導する因子）をコードする。いくつかの事例では、ＴＣＲ鎖（例えば、α及びβ ＴＣＲ鎖）を含む組換えＴＣＲは、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａなどの自己切断２Ａペプチドによって分離される。本明細書に記載の２つのコード配列を含む核酸は、２つのコード配列によってコードされるポリペプチドが独立した（かつ物理的に別個の）ポリペプチドとして発現され得るように構成され得る。この目的を達成するために、本明細書に記載の核酸は、第１のコード配列と第２のコード配列との間に位置する第３のヌクレオチド配列を含有し得る。この第３のヌクレオチド配列は、例えば、リボソームスキッピング部位をコードし得る。リボソームスキッピング部位は、正常なペプチド結合形成を損なう配列である。この機構は、１つのメッセンジャーＲＮＡからの追加のオープンリーディングフレームの翻訳をもたらす。この第３のヌクレオチド配列は、例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、又はＦ２Ａペプチドをコードし得る（例えば、Ｋｉｍ，Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６（４）：ｅ１８５５６（２０１１）を参照されたい）。以下の表１６を参照されたい。
別の実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードし得る。ＩＲＥＳは、末端に依存しない様式での翻訳の開始を可能にし、また、１つのメッセンジャーＲＮＡからの追加のオープンリーディングフレームの翻訳を可能にするＲＮＡエレメントである。代替的に、第３のヌクレオチド配列は、第２のポリペプチドの発現を制御するプロモーターをコードし得る。第３のヌクレオチド配列はまた、複数のリボソームスキッピング配列、ＩＲＥＳ配列、追加のプロモーター配列、又はそれらの組み合わせをコードし得る。
核酸はまた、追加のコード配列（第４及び第５のコード配列を含むが、これらに限定されない）を含んでもよく、追加のコード配列によってコードされるポリペプチドが更なる独立した物理的に別個のポリペプチドとして発現されるように構成されてもよい。この目的のために、追加のコード配列は、１つ以上のリボソームスキッピング配列、ＩＲＥＳ配列、又は追加のプロモーター配列をコードする１つ以上のヌクレオチド配列によって他のコード配列から分離され得る。
例示的なＩＲＥＳ配列を、以下に提供する（配列番号８５）：
ＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＧＧＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＣＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＴＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡ
いくつかの例では、核酸（例えば、本明細書に記載される発現ベクター又はＲＮＡ分子）は、グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、本明細書に記載のもの）と好適なキメラ受容体ポリペプチドとの両方のコード配列を含み得、２つのコード配列は、任意の順序で、Ｐ２Ａペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列（例えば、配列番号６７）によって分離される。その結果、グルコース代謝産物を再誘導する因子及びキメラ受容体の２つの別個のポリペプチドは、そのような核酸から産生され得、Ｐ２Ａ部分（配列番号６７）は、上流のポリペプチド（上流のコード配列によってコードされている）に連結され、Ｐ２Ａペプチドからの残基Ｐは、下流のポリペプチド（下流のコード配列によってコードされている）に連結されている。いくつかの例では、キメラ受容体ポリペプチドは、上流のものであり、グルコース代謝産物を再誘導する因子は、下流のものである。他の例では、グルコース代謝産物を再誘導する因子は、上流のものであり、キメラ受容体ポリペプチドは、下流のものである。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、本明細書に記載される発現ベクター又はＲＮＡ分子）は、グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、本明細書に記載のもの）と、好適なＴＣＲ、ＡＣＴＲ、又はＣＡＲポリペプチドとの両方のコード配列を含み得、２つのコード配列は、任意の順序で、Ｐ２Ａペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列（例えば、配列番号６７）によって分離されている。その結果、グルコース代謝産物を再誘導する因子並びにＴＣＲ、ＡＣＴＲ、又はＣＡＲの２つの別個のポリペプチドは、そのような核酸から産生され得、Ｐ２Ａ部分（配列番号６７）は、上流のポリペプチド（上流のコード配列によってコードされている）に連結され、Ｐ２Ａペプチドからの残基Ｐは、下流のポリペプチド（下流のコード配列によってコードされている）に連結されている。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ、ＡＣＴＲ、又はＣＡＲポリペプチドは、上流のものであり、グルコース代謝産物を再誘導する因子は、下流のものである。他の実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子は、上流のものであり、ＴＣＲ、ＡＣＴＲ、又はＣＡＲポリペプチドは、下流のものである。
いくつかの例では、上記の核酸は、コードされた配列の２つのセグメント間（例えば、上流ポリペプチドとＰ２Ａペプチドとの間）に、リンカー（例えば、ＧＳＧリンカー）を更にコードし得る。
特定の例では、本明細書に記載の核酸は、核酸がトランスフェクトされる宿主細胞において以下の２つの別個のポリペプチドを発現するように構成される：（ｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、好適なＣＡＲ（例えば、表１１～１４又は配列番号７８～配列番号７９に列挙されている）、ペプチドリンカー（例えば、ＧＳＧリンカー）、及びＰ２Ａペプチドに由来するＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号６７）セグメントを含有する、第１のポリペプチド、並びに（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ２Ａペプチドに由来するＰ残基及びグルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、配列番号６８～配列番号７４のうちのいずれか）を含有する、第２のポリペプチド。
特定の例では、本明細書に記載の核酸は、核酸がトランスフェクトされる宿主細胞において以下の２つの別個のポリペプチドを発現するように構成される：（ｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、好適なＡＣＴＲ（表７を参照）、ペプチドリンカー（例えば、ＧＳＧリンカー）、及びＰ２Ａペプチドに由来するＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号６７）セグメントを含有する、第１のポリペプチド、並びに（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ２Ａペプチドに由来するＰ残基及びグルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、配列番号６８～配列番号７４のうちのいずれか）を含有する、第２のポリペプチド。いくつかの事例では、目的の追加のポリペプチドも、宿主の免疫細胞に導入され得る。
本明細書に提供されるグルコース代謝産物を再誘導する因子のうちのいずれか及び／若しくはキメラ受容体ポリペプチドをコードするベクター、又はキメラ受容体ポリペプチド及び／若しくはグルコース代謝産物を再誘導する因子をコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子）を宿主細胞に導入した後、細胞は、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／若しくはキメラ受容体ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養され得る。グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸が調節可能なプロモーターによって調節される例では、宿主細胞は、調節可能なプロモーターが活性化される条件下で培養され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり、免疫細胞は、誘導分子の存在下で、又は誘導分子が産生される条件下で培養される。グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドが発現されるかどうかを決定することは、当業者には明らかであり、任意の既知の方法、例えば、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によるグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／若しくはキメラ受容体ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検出、又はウェスタンブロット、蛍光顕微鏡、及びフローサイトメトリーを含む方法によるグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／若しくはキメラ受容体ポリペプチドタンパク質の検出によって評価され得る。
代替的に、キメラ受容体ポリペプチドの発現は、免疫細胞が対象に投与された後、インビボで行われ得る。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト、サル、マウス、ウサギ、又は家畜哺乳動物などの任意の哺乳動物を指す。例えば、対象は、霊長類であり得る。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
代替的に、本明細書に開示される免疫細胞のうちのいずれかにおいてグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドの発現は、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を導入することによって達成することができる。そのようなＲＮＡ分子は、インビトロ転写によって、又は化学合成によって調製され得る。次いで、ＲＮＡ分子は、例えば、エレクトロポレーションによって、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）などの好適な宿主細胞に導入することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、以下のＲａｂｉｎｏｖｉｃｈ，Ｋｏｍａｒｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（１０）：１０２７－１０３５（２００６）及びＷＯ２０１３／０４０５５７に記載されている方法に従って、合成され、宿主免疫細胞に導入することができる。
特定の実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドを含むベクター（複数可）又はＲＮＡ分子（複数可）を、インビボで宿主細胞又は免疫細胞に導入することができる。非限定的な例として、これは、対象に、本明細書に記載のグルコース代謝産物を再誘導する１つ以上の因子及び／又は１つ以上のキメラ受容体ポリペプチド子をコードするベクター又はＲＮＡ分子を直接（例えば、静脈内投与によって）投与し、インビボでグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドを含む宿主細胞を産生することによって達成され得る。
本明細書に記載のグルコース代謝産物を再誘導する因子のうちのいずれか及び／又はキメラ受容体ポリペプチドを発現する宿主細胞を調製するための方法は、宿主細胞をエクスビボで活性化することも含み得る。宿主細胞を活性化することは、宿主細胞を刺激して、細胞がエフェクター機能を行うことができる活性化状態にすることを意味する。宿主細胞を活性化する方法は、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドの発現に使用される宿主細胞のタイプに依存することになる。例えば、Ｔ細胞は、限定されないが、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ－２、フィトヘマグルチニン、操作された人工刺激細胞若しくは粒子、又はそれらの組み合わせを含む１つ以上の分子の存在下で、エクスビボで活性化され得る。操作された人工刺激細胞は、当該技術分野で既知の人工抗原提示細胞であり得る。例えば、Ｎｅａｌ，Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ，２（１）：６８－７９（２０１７）及びＴｕｒｔｌｅ ａｎｄ Ｒｉｄｄｅｌｌ Ｃａｎｃｅｒ ｊｏｕｒｎａｌ（Ｓｕｄｂｕｒｙ，Ｍａｓｓ．），１６（４）：３７４－３８１（２０１０）（これらの各々の関連する開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
他の例では、ＮＫ細胞は、４－１ＢＢリガンド、抗４－１ＢＢ抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、抗ＩＬ－１５受容体抗体、ＩＬ１２、ＩＬ－２１、Ｋ５６２細胞、及び／又は操作された人工刺激細胞若しくは粒子などの１つ以上の分子の存在下で、エクスビボで活性化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のグルコース代謝産物を再誘導する因子のいずれか及び／又はキメラ受容体ポリペプチド（ＡＣＴＲ－／ＣＡＲ－／ＴＣＲ－及び／又はグルコース代謝産物を発現する細胞を再誘導する因子）を発現する宿主細胞は、対象への投与前にエクスビボで活性化される。宿主細胞が活性化されているかどうかを決定することは、当業者には明らかであり、細胞活性化、サイトカインの発現又は分泌、及び細胞形態に関連する１つ以上の細胞表面マーカーの発現を評価することを含み得る。
本明細書に記載のグルコース代謝産物を再誘導する因子のうちのいずれか及び／又はキメラ受容体ポリペプチドを発現する宿主細胞を調製するための方法は、宿主細胞をエクスビボで増殖させることを含み得る。宿主細胞を増殖することは、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドを発現する細胞の数の増加をもたらし、例えば、宿主細胞を増殖させるか、又は宿主細胞を刺激して増殖させる、任意の方法を含み得る。宿主細胞の増殖を刺激するための方法は、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドの発現に使用される宿主細胞のタイプに依存し、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のグルコース代謝産物を再誘導する因子のいずれか及び／又はキメラ受容体ポリペプチドを発現する宿主細胞は、細胞を対象に投与する前に、エクスビボで増殖される。
いくつかの実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドを発現する宿主細胞は、細胞を対象に投与する前に、エクスビボで増殖及び活性化される。宿主細胞の活性化及び増殖は、本明細書に記載されるグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドをコードする遺伝子の、ウイルスベクターのゲノムへの組み込み及び発現を可能にするために使用され得る。ｍＲＮＡのエレクトロポレーションが使用される場合、エレクトロポレーションが活性化された細胞に対して行われるときにより効果的であり得るが、活性化及び／又は増幅が必要とされない場合がある。いくつかの事例では、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドは、好適な宿主細胞において一過的に（例えば、３～５日間）発現される。一過的な発現は、潜在的な毒性が存在する場合に有利であり得、可能性のある副作用についての臨床試験の初期段階で役立つはずである。グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はキメラ受容体ポリペプチドを発現する宿主細胞のうちのいずれかを、薬学的に許容される担体と混合して、薬学的組成物を形成することができ、これも本開示の範囲内である。したがって、本発明の遺伝子操作された免疫細胞を含む薬学的組成物は、別の実施形態である。遺伝子操作された免疫細胞は、好ましくは薬学的に許容される担体と混合される。
「薬学的に許容される」という語句は、本開示の組成物に関連して使用されるとき、生理学的に許容され、典型的には、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合に有害な反応を生じない、分子実体及びそのような組成物の他の成分を指す。好ましくは、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトにおいて使用するために、連邦政府若しくは州政府の規制当局によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。「許容される」とは、担体が組成物の活性成分（例えば、核酸、ベクター、細胞、又は治療用抗体）と適合性であり、組成物（複数可）が投与される対象に悪影響を及ぼさないことを意味する。本方法で使用される薬学的組成物のうちのいずれかは、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤を含むことができる。
緩衝剤を含む薬学的に許容される担体は、当該技術分野で周知であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質；防腐剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物；金属錯体；並びに／又は非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照されたい。
本開示の薬学的組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な１つ以上の追加の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。可能性のある追加の活性化合物の非限定的な例としては、例えば、ＩＬ－２、並びに当該分野で既知であり、以下の併用治療の考察に列挙されている様々な薬剤が挙げられる。
ＩＶ．本明細書に記載の遺伝子操作された造血細胞を使用した免疫療法
本明細書に開示される遺伝子操作された造血細胞（例えば、造血幹細胞、ＮＫ細胞、又はＴ細胞などの免疫細胞）は、様々な障害（例えば、がん、感染症、及び自己免疫疾患に）対する免疫療法に使用され得る。したがって、本発明の別の実施形態は、対象において標的抗原を発現する細胞を阻害する方法であり、本方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団、又は本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団を含む薬学的組成物を投与することを含む。
Ａ．ＡＣＴＲポリペプチド及びＦｃ含有治療剤を発現する遺伝子操作された造血細胞の併用免疫療法
本開示の例示的なＡＣＴＲポリペプチドは、Ｔリンパ球に抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）能力を付与し、ＮＫ細胞におけるＡＤＣＣを増強する。細胞に結合した抗体によって受容体が関与すると、Ｔ細胞の活性化、持続的な増殖、及び結合した細胞に対して特異的な細胞傷害が誘発される。
ＩｇのＦｃ部分に対するＣＤ１６の親和性の程度は、ＡＤＣＣの重要な決定要因であり、したがって、抗体免疫療法に対する臨床応答に対する決定要因である。例として、Ｖ１５８多型を有するＣＤ１６を選択した。これは、Ｉｇに対する結合親和性が高く、Ｆ１５８多型を有するＣＤ１６と比較して、優れたＡＤＣＣを媒介する。Ｆ１５８受容体は、Ｔ細胞増殖及びＡＤＣＣの誘導において、Ｖ１５８受容体よりも効力が低いが、Ｆ１５８受容体は、Ｖ１５８受容体よりもインビボ毒性が低いため、一部の臨床状況で有用であり得る。
免疫細胞においてＡＣＴＲポリペプチドと共発現されるグルコース代謝産物を再誘導する因子は、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／又は低酸素環境において細胞を効果的に増殖及び／又は機能させることによって、Ｔ細胞療法又はＮＫ細胞療法などの細胞ベースの免疫療法を容易にするであろう。抗体指向性細胞傷害は、抗体投与を中止するだけで、必要に応じて、いつでも止めることができる。臨床安全性は、ｍＲＮＡエレクトロポレーションを使用して、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＡＣＴＲポリペプチドを一過的に発現し、任意の潜在的な自己免疫反応性を制限することによって更に増強することができる。
したがって、一実施形態では、本開示は、抗原を発現する細胞に結合することができる治療用抗体などのＦｃ含有治療剤で対象が治療されるがんの抗体ベースの免疫療法を必要とする対象において、その有効性を増強するための方法を提供する。Ｆｃ含有治療剤は、遺伝子操作された免疫細胞上で発現されるＡＣＴＲのＦｃ結合部分（例えば、ヒトＣＤ１６Ａの細胞外ドメイン）によって認識及び結合され得るＦｃ部分（例えば、ヒトＦｃ部分又はヒト化Ｆｃ部分）を含有する。例示的なＡＣＴＲ構築物は、上記の表１０に提供されている。
本明細書に記載の方法は、治療有効量の抗体と、本開示のグルコース代謝産物を再誘導する因子と、ＡＣＴＲポリペプチドと、を共発現する治療有効量の造血細胞（例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞））などの遺伝子操作された宿主細胞と、を、対象に導入することを含み得る。対象（例えば、ヒトがん患者などのヒト患者）は、標的抗原に特異的なＦｃ含有治療剤で治療されたか、又は治療されている。標的抗原は、腫瘍抗原、病原性抗原（例えば、細菌、真菌、若しくはウイルス）、又は疾患細胞上に存在する抗原（例えば、本明細書に記載のもの）を含むがこれらに限定されない、疾患又は状態に関連する任意の分子であり得る。
本明細書に列挙される疾患状態のうちのいずれかに関連する限り、本開示の文脈において、「治療する」、「治療」などの用語は、そのような状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和若しくは軽減するか、又はそのような状態の進行を遅延若しくは逆転することを意味する。本開示の意味の範囲内で、「治療する」という用語はまた、発症の停止、遅延（すなわち、疾患の臨床症状の前の期間）、及び／又は疾患の発症若しくは悪化のリスクの低減を意味する。例えば、がんに関連して、「治療する」という用語は、患者の腫瘍負荷を排除若しくは低減すること、又は転移を予防、遅延、若しくは阻害することなどを意味し得る。
本明細書で使用される場合、用量又は量に適用される「治療有効」という用語は、それを必要とする対象に投与するときに所望の活性をもたらすのに十分な化合物又は薬学的組成物の量を指す。活性成分の組み合わせ（例えば、抗体を含む第１の薬学的組成物、並びにグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又は抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）構築物を発現するＴ細胞又はＮＫ細胞の集団を含む第２の薬学的組成物）を投与する場合、有効量の組み合わせは、個別に投与した場合に有効であったであろう一定量の各成分を含んでいても、含んでいなくてもよいことに留意されたい。本開示の文脈において、「治療有効」という用語は、本開示の方法によって治療される障害の症状のうちの少なくとも１つを遅延、進行を停止、緩和、又は軽減するのに十分な量の化合物又は薬学的組成物を指す。
本明細書に記載のグルコース代謝産物を再誘導する因子及びＡＣＴＲ又はＣＡＲポリペプチドを発現する宿主細胞（例えば、造血細胞、例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞などの免疫細胞）は、対象におけるＡＤＣＣを増強する、かつ／又は抗体ベースの免疫療法の有効性を増強する、かつ／又は低グルコース環境における免疫細胞の成長及び／若しくは増殖を増強するのに有用である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、サル、マウス、ウサギ、又は家畜哺乳動物などの哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトがん患者である。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載の治療用抗体のうちのいずれかで治療されたか、又は治療されている。
本明細書に記載の方法を実施するために、治療を必要とする対象に、有効量の宿主細胞、例えば、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドのうちのいずれかを発現する免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞及び／又はＴリンパ球）、並びに有効量の抗体又はその組成物を、静脈内投与などの好適な経路を介して投与することができる。本明細書で使用される場合、有効量とは、投与時に対象に治療効果を付与するそれぞれの薬剤（例えば、グルコース代謝産物を再誘導する因子、ＡＣＴＲポリペプチド、抗体、又はそれらの組成物を発現するＮＫ細胞及び／又はＴリンパ球）の量を指す。本明細書に記載の細胞又は組成物の量が治療効果を達成したかどうかを決定することは、当業者には明らかであろう。有効量は、当業者によって認識されるように、治療される特定の状態、状態の重症度、個々の患者のパラメータ（年齢、身体状態、サイズ、性別、性別、及び体重を含む）、治療の期間、（もしあれば）同時療法の性質、特定の投与経路、並びに医療従事者の知識及び専門知識内の同様の要因に応じて変動する。いくつかの実施形態では、有効量は、対象における任意の疾患又は障害の症状を、軽減、緩和、改善、向上、低減するか、又はその進行を遅延する。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は、ヒトがん患者である。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は、１つ以上の病原性感染症（例えば、ウイルス、細菌、及び／又は真菌感染症）に罹患している。
本開示の方法は、任意のがん又は任意の病原体の治療に使用され得る。本開示の方法によって治療することができるがんの特定の非限定的な例としては、例えば、リンパ腫、乳がん、胃がん、神経芽腫、骨肉腫、肺がん、皮膚がん、前立腺がん、大腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓がん、頭頸部がん、網膜芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、甲状腺がん、肝細胞がん、食道がん、及び子宮頸がんが挙げられる。特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍であり得る。
本開示の方法はまた、細菌感染、ウイルス感染、又は真菌感染によって引き起こされ得る感染症を治療するために使用され得る。そのような場合、遺伝子操作された免疫細胞は、病原性抗原（例えば、感染を引き起こす細菌、ウイルス、又は真菌に関連する抗原）を標的とするＦｃ含有治療剤（例えば、抗体）と共用することができる。病原性抗原の特定の非限定的な例としては、細菌抗原、ウイルス抗原、及び／又は真菌抗原が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例を、以下に提供する：インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、ヘマグルチニン若しくはＭ２タンパク質、ヒト呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ糖タンパク質若しくはＧ糖タンパク質、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、若しくはｇＥ、クラミジアＭＯＭＰ若しくはＰｏｒＢタンパク質、デング熱ウイルスコアタンパク質、マトリックスタンパク質若しくは糖タンパク質Ｅ、麻疹ウイルスヘマグルチニン、単純ヘルペスウイルス２型糖タンパク質ｇＢ、ポリオウイルスＩ ＶＰ１、ＨＩＶ１のエンベロープ糖タンパク質、Ｂ型肝炎コア抗原若しくは表面抗原、ジテリア毒素、連鎖球菌２４Ｍエピトープ、淋菌性ピリン、仮性狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩＩ（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、感染性胃腸炎糖タンパク質１９５、感染性胃腸炎マトリックスタンパク質、又はヒトＣ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｅ１若しくはＥ２。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＡＤＣＣ活性を、少なくとも２０％及び／又は少なくとも２倍増強する、例えば、ＡＤＣＣを、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、又はそれ以上増強するのに有効な量で対象に投与される。
免疫細胞は、Ｆｃ含有治療剤が結合する抗原を発現する細胞を標的とするために、治療用抗体などのＦｃ含有治療剤とともに投与される。いくつかの実施形態では、複数の抗体などの複数のＦｃ含有治療剤を免疫細胞と併用することができる。抗体ベースの免疫療法を使用して、免疫療法が対象に有用であると考えられる任意の疾患又は障害の症状を、治療、軽減、又は低減することができる。
抗体（複数の形態で互換的に使用される）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷（すなわち、完全長）のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体だけでなく、その抗原結合断片（これには、Ｆｃ領域、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ）、直鎖状抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、並びに免疫グロブリン分子の任意の他の改変された構成（必要な特異性の抗原認識部位及びＦｃ領域（抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、及び共有結合的に改変された抗体を含む）を含む）も包含する。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ（又はそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、抗体は、任意の特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構造は、周知である。本開示で使用するための抗体は、共用されるＡＣＴＲを発現する免疫細胞及び／又はグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現する免疫細胞によって認識可能なＦｃ領域を含有する。Ｆｃ領域は、ヒト又はヒト化Ｆｃ領域であり得る。
本明細書に記載の抗体のうちのいずれかは、モノクローナル又はポリクローナルのいずれかであり得る。「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体集団を指し、「ポリクローナル抗体」は、不均一な抗体集団を指す。これらの２つの用語は、抗体の供給源又は抗体が作製される様式を限定しない。
一例では、本明細書に記載の方法で使用される抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有する、特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその抗原結合断片である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置換れているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの事例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されないが、抗体性能を更に精緻化及び最適化するために含まれる残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的な全てを含み、ＣＤＲの全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、フレームワーク領域の全て、又は実質的に全てが関連するヒトコンセンサス配列のものに対応する。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むであろう。抗体は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されているように、改変されたＦｃ領域を有し得る。本明細書で使用される抗体は、グリコシル化（例えば、フコシル化）又はアフコシル化され得る。他の形態のヒト化抗体は、元の抗体に対して改変された１つ以上（１、２、３、４、５、６つ）のＣＤＲを有し、これらは元の抗体からの１つ以上のＣＤＲに「由来する」１つ以上のＣＤＲとも呼ばれる。ヒト化抗体はまた、親和性成熟を伴い得る。
別の例では、本明細書に記載の抗体は、キメラ抗体であり、これは、ヒト抗体からの重定常領域及び軽定常領域を含むことができる。キメラ抗体とは、第１の種からの可変領域又は可変領域の一部と、第２の種からの定常領域と、を有する抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体では、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、１つの種の哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、及びラットなどの非ヒト哺乳動物）に由来する抗体の可変領域を模倣し、一方、定常部分は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体の配列と相同である。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、可変領域及び／又は定常領域で行われ得る。
造血細胞、例えば、本明細書に開示されるグルコース代謝産物を再誘導する因子のうちのいずれか及び／又はＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞）又はＨＳＣは、Ｆｃ含有抗体で治療された又は治療されている対象に投与され得る。例えば、免疫細胞は、抗体と同時にヒト対象に投与され得る。代替的に、免疫細胞は、抗体ベースの免疫療法の過程で、ヒト対象に投与され得る。いくつかの例では、免疫細胞及び抗体は、ヒト対象に、少なくとも４時間の間隔、例えば、少なくとも１２時間の間隔、少なくとも１日の間隔、少なくとも３日の間隔、少なくとも１週間の間隔、少なくとも２週間の間隔、又は少なくとも１ヶ月の間隔で投与され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、対応する標的抗原又はそのエピトープに特異的に結合する。抗原又はエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当該技術分野でよく理解されている用語である。分子が、代替的な標的と比較して、特定の標的抗原と、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、及び／又はより高い親和性で反応する場合、その分子は、「特異的結合」を示すといわれる。抗体が、他の物質に結合するよりも高い親和性、アビディティで、より容易に、及び／又はより長い持続時間で結合する場合、その抗体は、標的抗原又はエピトープに「特異的に結合する」。例えば、抗原又はその中の抗原エピトープに特異的に（又は優先的に）結合する抗体は、他の抗原又は同じ抗原における他のエピトープに結合するよりも高い親和性、アビディティで、より容易に、かつ／又はより長い時間この標的抗原に結合する抗体である。また、この定義では、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体が、第２の標的抗原に特異的に又は優先的に結合しても、しなくてもよいことが理解される。したがって、「特異的な結合」又は「優先的な結合」は、排他的な結合を必ずしも必要としない（ただし、それを含むことができる）。いくつかの例では、標的抗原又はそのエピトープに「特異的に結合する」抗体は、他の抗原又は同じ抗原における他のエピトープに結合しない場合がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、標的抗原（例えば、本明細書に記載の標的のうちのいずれか１つ）又はその抗原エピトープに対して好適な結合親和性を有する。本明細書に記載の免疫療法の方法で使用するための抗体は、目的の標的抗原、又はその中の特定の領域又は抗原エピトープに結合（例えば、特異的に結合）し得る。例示的な目的の標的抗原及びそれに特異的な例示的な抗体は、上記の表４に列挙されている。
Ｂ．ＣＡＲを発現する遺伝子操作された造血細胞の免疫療法
ポリペプチド
本明細書に記載のグルコース代謝産物を再誘導する因子と、ＣＡＲポリペプチドと、を共発現する遺伝子操作された造血細胞（例えば、造血幹細胞、Ｔ細胞又はＮＫ細胞などの免疫細胞）は、ＣＡＲポリペプチドが標的とする抗原を発現する疾患細胞を直接的又は間接的に（例えば、ＣＡＲポリペプチドが結合するタグにコンジュゲートされた治療剤を介して）阻害するためのＴ細胞療法（αβ Ｔ細胞及びγδ Ｔ細胞の両方）又はＮＫ細胞療法などの免疫療法に使用することができる。免疫細胞においてＣＡＲポリペプチドと共発現されるグルコース代謝産物を再誘導する因子は、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／又は低酸素環境において（例えば、腫瘍微小環境において）、細胞を効果的に増殖及び／又は機能させることによって、細胞ベースの免疫療法を容易にするであろう。臨床安全性は、ｍＲＮＡエレクトロポレーションを使用して、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＣＡＲポリペプチドを一過的に発現し、任意の潜在的な非腫瘍特異的反応性を制限することによって更に増強することができる。
本明細書に記載の方法は、治療有効量の、本開示のグルコース代謝産物を再誘導する因子と、ＣＡＲポリペプチドと、を共発現する造血細胞（例えば、免疫細胞（例えば、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、又はＮＫ細胞）などの遺伝子操作された宿主細胞を、対象に導入することを含み得る（表１１～表１４の例示的な例を参照されたい）。対象（例えば、ヒトがん患者などのヒト患者）は、更に、抗がん剤又は抗感染剤を含むがこれらに限定されない、抗がん療法又は抗感染療法で治療されていてもよく、又は治療されていてもよい。ＣＡＲは、任意の標的抗原に結合し得る抗原結合ドメインを有する。そのような標的抗原は、腫瘍抗原、病原性抗原（例えば、細菌、真菌、若しくはウイルス）、又は疾患細胞上に存在する抗原（例えば、本明細書に記載のもの）を含むがこれらに限定されない、疾患又は状態に関連する任意の分子であり得る。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、天然の腫瘍抗原タンパク質を標的とする。他の実施形態では、標的抗原結合ドメインは、腫瘍抗原タンパク質のバリアント（例えば、変異）を標的とする。いくつかの例としては、ＥＧＦＲの腫瘍特異的バリアントを認識するＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖが挙げられる（Ｗａｎｇ，Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，４７２：１７５－１８０（２０２０））。
本明細書に記載のグルコース代謝産物を再誘導する因子及びＣＡＲポリペプチドを発現する宿主細胞（例えば、造血細胞、例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞などの免疫細胞）は、低グルコース環境、低アミノ酸環境、低ｐＨ環境、及び／又は低酸素環境において（例えば、腫瘍微小環境において）、標的抗原を発現する細胞を阻害する、かつ／又は免疫細胞の成長及び／若しくは増殖を促進するために有用である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、サル、マウス、ウサギ、又は家畜哺乳動物などの哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトがん患者である。いくつかの実施形態では、加えて、対象は、本明細書に記載の治療用抗体のうちのいずれかで治療されているか、又は治療されている。
本明細書に記載の方法を実施するために、有効量の造血細胞、例えば、グルコース代謝産物を再誘導する因子のうちのいずれか、並びに本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞（ＮＫ及び／若しくはＴ細胞）、又はそれらの組成物を、静脈内、皮下、及び皮内投与などの好適な経路を介して、治療を必要とする対象に投与することができる。本明細書で使用される場合、有効量は、投与時に対象に治療効果を付与するそれぞれの薬剤（例えば、グルコース代謝産物を再誘導する因子、ＣＡＲポリペプチド、又はそれらの組成物を発現するＮＫ細胞及び／又はＴ細胞）の量を指す。本明細書に記載の細胞又は組成物の量が治療効果を達成したかどうかを決定することは、当業者には明らかであろう。有効量は、当業者によって認識されるように、治療される特定の状態、状態の重症度、個々の患者のパラメータ（年齢、身体状態、サイズ、性別、性別、及び体重を含む）、治療の期間、（もしあれば）同時療法の性質、特定の投与経路、並びに医療従事者の知識及び専門知識内の同様の要因に応じて変動する。いくつかの実施形態では、有効量は、対象における任意の疾患又は障害の症状を、軽減、緩和、改善、向上、低減するか、又はその進行を遅延する。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は、ヒトがん患者である。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は、１つ以上の病原性感染症（例えば、ウイルス、細菌、及び／又は真菌感染症）に罹患している。
本開示の方法は、任意のがん又は任意の病原体の治療に使用され得る。本開示の方法によって治療することができるがんの特定の非限定的な例としては、例えば、リンパ腫、乳がん、胃がん、神経芽腫、骨肉腫、肺がん、皮膚がん、前立腺がん、大腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓がん、頭頸部がん、網膜芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、甲状腺がん、肝細胞がん、食道がん、及び子宮頸がんが挙げられる。特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍であり得る。特定の実施形態では、がんは、液性腫瘍であり得る。したがって、好ましい実施形態は、対象において標的抗原を発現する細胞を阻害するための方法であり、対象は、がんに罹患しているヒト患者であり、標的抗原は、腫瘍抗原であり、がんは、がん種、リンパ腫、肉腫、芽腫、及び白血病からなる群から選択され、がんが、好ましくは、Ｂ細胞起源のがん、乳がん、胃がん、神経芽腫、骨肉腫、肺がん、皮膚がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓がん、頭頸部がん、網膜芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓がん、及び甲状腺がんからなる群から選択されるか、又はＢ細胞起源のがんが、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
本開示の方法はまた、細菌感染、ウイルス感染、又は真菌感染によって引き起こされ得る感染症を治療するために使用され得る。そのような事例では、病原性抗原（例えば、感染を引き起こす細菌、ウイルス、又は真菌に関連する抗原）に特異的なＣＡＲポリペプチドを発現する遺伝子操作された免疫細胞を使用して、感染細胞を排除することができる。病原性抗原の特定の非限定的な例としては、細菌抗原、ウイルス抗原、及び／又は真菌抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、対象に、標的抗原を発現する細胞を、少なくとも２０％及び／又は少なくとも２倍阻害する、例えば、標的抗原を発現する細胞を５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、又はそれ以上阻害するのに有効な量で投与される。
追加の治療剤（例えば、抗体ベースの免疫療法剤）を使用して、治療剤が対象において有用であると考えられる任意の疾患又は障害の症状を、治療、軽減、又は低減することができる。
本明細書に記載される細胞ベースの免疫療法の有効性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって評価され得、熟練した医療専門家には明らかであろう。例えば、細胞ベースの免疫療法の有効性は、対象又はその組織若しくは試料における対象の生存率又は腫瘍若しくはがん負荷によって評価され得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞の不在下での有効性と比較して、細胞ベースの免疫療法の有効性を少なくとも２０％及び／又は少なくとも２倍増強する、例えば、抗体ベースの免疫療法の有効性を５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、又はそれ以上増強するのに有効な量で、治療を必要とする対象に投与される。
本明細書に記載の組成物又は方法のうちのいずれかでは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞）は、対象にとって自己由来であり得、すなわち、免疫細胞が、治療を必要とする対象から得られ、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＣＡＲポリペプチドの発現のために遺伝子操作され、次いで、同じ対象に投与され得る。特定の一実施形態では、対象への再導入の前に、自己免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、エクスビボで活性化及び／又は増殖される。対象への自己細胞の投与は、非自己細胞の投与と比較して、宿主細胞の拒絶反応の低減をもたらし得る。
代替的に、宿主細胞は、同種細胞であり、すなわち、細胞は、第１の対象から得られ、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＣＡＲポリペプチドの発現のために遺伝子操作され、第１の対象とは異なるが同じ種の第２の対象に投与される。例えば、同種免疫細胞は、ヒトドナーに由来し、ドナーとは異なるヒトレシピエントに投与され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体の発現が阻害又は排除された同種Ｔ細胞である。特定の一実施形態では、対象に導入される前に、同種Ｔ細胞は、エクスビボで活性化及び／又は増殖される。Ｔリンパ球は、当該技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、フィトヘマグルチニン、操作された人工刺激細胞若しくは粒子、又はそれらの組み合わせの存在下で活性化され得る。特定の態様では、ＮＫ細胞又はＴ細胞の出発集団は、ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ密度勾配を使用して単核細胞を単離することから得られる。いくつかの態様では、本方法は、ＣＤ３、ＣＤ１４、及び／又はＣＤ１９細胞の単核細胞を枯渇させて、ＮＫ細胞の出発集団を得ることを更に含む。いくつかの態様では、本方法は、単核細胞ＣＤ３、ＣＤ１４、及びＣＤ１９細胞を枯渇させて、ＮＫ細胞の出発集団を得ることを更に含む。特定の態様では、枯渇は、磁気選別を行うことを含む。他の態様では、ＮＫ細胞の出発集団を得るために、選別、磁気ビーズ選択又は他の方法を使用して、ＮＫ細胞を正に選択することができる。
更に、ＮＫ細胞などの免疫細胞は、免疫療法のための「市販の」供給源から提供される臍帯血幹細胞又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２３（２）：１８１－１９２．ｅ１８５（２０１８）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，３２（２）：５２０－５３１（２０１８）、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１：１９６５（２０２０）、Ｗｒｏｎａ，Ｂｏｒｏｗｉｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２２（１１）：（２０２１））。特定の実施形態では、ＮＫ細胞の出発集団は、臍帯血から得られる。他の実施形態では、臍帯血は、以前に凍結されている。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞株（例えば、ＮＫ－９２及びＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）に由来する。
ＮＫ細胞及びＴ細胞（αβ Ｔ細胞又はγδ Ｔ細胞）は、当該技術分野で既知の任意の方法によって活性化され得、例えば、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５受容体抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、及びＫ５６２細胞株由来の細胞、及び／又は操作された人工刺激細胞若しくは粒子からなる群から選択される１つ以上の薬剤の存在下で活性化され得る。例えば、ＮＫ細胞を増殖させるための有用な方法の記載については、ＵＳ７，４３５，５９６及びＵＳ８，０２６，０９７を参照されたい。例えば、本明細書に開示される組成物又は方法で使用されるＮＫ細胞は、主要組織適合複合体Ｉ及び／又はＩＩ分子が欠如しているか又は低発現であり、膜結合ＩＬ－１５及び４－１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ）を発現するように遺伝子改変された細胞への曝露によって優先的に増殖され得る。そのような細胞株としては、必ずしもこれらに限定されないが、Ｋ５６２［ＡＴＣＣ、ＣＣＬ２４３；Ｌｏｚｚｉｏ ａｎｄ Ｌｏｚｚｉｏ，Ｂｌｏｏｄ，４５（３）：３２１－３３４（１９７５）、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１８（４）：４２１－４３１（１９７６））］、及びＷｉｌｍｓ腫瘍細胞株ＨＦＷＴ（Ｆｅｈｎｉｇｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０（３－４）：５０３－５３４（２００１）、Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ、３２（７）：６１４－６２１（２００４））、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ－ＩＩ、肝芽腫細胞株ＨｕＨ－６、小細胞肺がん細胞株Ｌｕ－１３０及びＬｕ－１３４－Ａ、神経芽腫細胞株ＮＢ１９及びＮ１３６９、精巣由来胚性がん細胞株ＮＥＣ１４、子宮頸がん細胞株ＴＣＯ－２、及び骨髄転移神経芽腫細胞株ＴＮＢ１（Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，９３（３）：３１３－３１９（２００２））が挙げられる。好ましくは、使用される細胞株は、Ｋ５６２及びＨＦＷＴ細胞株などのＭＨＣＩ及びＩＩ分子の両方を欠くか、又はほとんど発現しない。細胞株の代わりに、固体支持体を使用してもよい。そのような支持体は、好ましくは、ＮＫ細胞に結合し、一次活性化事象及び／若しくは増殖応答を誘導することができるか、又はそのような影響を有する分子に結合し、それによって、足場として機能することができる、少なくとも１つの分子がその表面に結合されている必要がある。支持体は、その表面に、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ－１５タンパク質、又はＩＬ－１５受容体抗体が結合されていてもよい。好ましくは、支持体は、その表面に結合したＩＬ－１５受容体抗体及びＣＤ１３７抗体を有するであろう。
記載の組成物又は方法の一実施形態では、対象へのＴリンパ球、ＮＫ細胞、又はＴリンパ球及びＮＫ細胞の導入（又は再導入）に続いて、治療有効量のＩＬ－２が対象に投与される。
追加の態様では、本方法は、操作されたＮＫ細胞又はＴ細胞の集団を凍結保存することを更に含む。いくつかの事例では、操作されたＮＫ細胞又はγδ Ｔ細胞は、凍結保存される。凍結保存されたＮＫ細胞又はＴ細胞の遺伝子操作された集団が更に本明細書に提供される。
本開示によれば、患者は、体重１キログラム当たり約１０５～１０１０個又はそれ以上の細胞（細胞／Ｋｇ）の範囲で、本開示のグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＣＡＲポリペプチドを含む、治療有効用量のＴ細胞又はＮＫ細胞などの免疫細胞を注入することによって治療することができる。注入は、所望の応答が達成されるまで、患者が耐えることができる頻度及び回数だけ繰り返すことができる。適切な注入用量及びスケジュールは、患者によって異なるが、特定の患者の治療医によって決定され得る。典型的には、およそ１０６個の細胞／ｋｇの初回用量が注入され、１０８個又はそれ以上の細胞／ｋｇに漸増する。ＩＬ－２は、注入された細胞を増殖させるために同時投与され得る。ＩＬ－２の量は、体表面積１平方メートル当たり約１～５×１０６国際単位であり得る。
「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が、どのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの制限に一部依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野における慣例に従って、許容される標準偏差以内を意味し得る。代替的に、「約」とは、所与の値の±２０％まで、好ましくは±１０％まで、より好ましくは±５％まで、更により好ましくは±１％までの範囲を意味し得る。代替的に、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、より好ましくは２倍以内であることを意味し得る。本出願及び特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、別段の記載がない限り、「約」という用語は、暗黙的であり、この文脈では、特定の値について許容可能な誤差範囲内であることを意味する。
本明細書に記載の組成物又は方法の有効性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって評価され得、熟練した医療専門家には明らかであろう。例えば、本明細書に記載の組成物又は方法の有効性は、対象の生存率、あるいは対象又はその組織若しくは試料におけるがん又は病原体負荷によって評価され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、対象における療法の安全性又は毒性（例えば、グルコース代謝産物を再誘導する因子及びＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞の投与）に基づいて、例えば、対象の全体的な健康状態及び／又は有害事象若しくは重篤な有害事象の存在によって評価され得る。
Ｃ．他の免疫療法
いくつかの実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ＰＫＭ２、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ）のうちの１つ以上を発現する遺伝子操作された免疫細胞は、疾患細胞（例えば、がん細胞又は病原体感染細胞）に特異的な天然の免疫細胞に由来し得る。そのような遺伝子操作された免疫細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球又はＴＩＬ）は、任意のキメラ受容体ポリペプチドを共発現せず、標的疾患細胞、例えば、がん細胞を破壊するために使用することができる。グルコース代謝産物を再誘導する１つ以上の因子を発現するが、キメラ受容体を発現しない遺伝子操作されたＴＩＬは、標的腫瘍細胞及びＴＩＬ（ＢｉＴＥ）に結合することができる二重特異性抗体と共用され得る。
いくつかの実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ＰＫＭ２、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ）のうちの１つ以上を発現する遺伝子操作された免疫細胞は、Ｔｒｅｇ細胞であり得る。そのようなＴｒｅｇ細胞は、本明細書に開示されるキメラ受容体ポリペプチドを共発現し得る。代替的に、Ｔｒｅｇ細胞は、いずれのキメラ受容体ポリペプチドも共発現せず、意図された療法に使用することができる。
いくつかの実施形態は、対象における疾患又は障害の治療に使用するための、有効量の本実施形態の操作されたＮＫ細胞又はＴ細胞を含む組成物を提供する。また、対象における免疫関連障害の治療のための有効量の本実施形態の操作されたＮＫ細胞又はＴ細胞を含む組成物の使用も本明細書に提供される。更なる実施形態は、対象における免疫関連障害を治療する方法を提供し、本方法は、有効量の本実施形態の操作されたＮＫ細胞又はγδ Ｔ細胞を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、本方法は、ＨＬＡマッチングを行うことを含まない。特定の実施形態では、ＮＫ細胞又はγδ Ｔ細胞は、対象とドナーとの間でＫＩＲリガンドがミスマッチしている。更なる特定の実施形態では、本方法は、ＨＬＡマッチングを行うことを含まない。特定の実施形態では、ＨＬＡマッチングの不在は、移植片対宿主病又は毒性をもたらさない。
Ｄ．ＴＣＲポリペプチドを発現する遺伝子操作された造血細胞の免疫療法
本明細書に記載のグルコース代謝産物を再誘導する因子と、ＴＣＲポリペプチドと、を共発現する遺伝子操作された造血細胞（例えば、造血幹細胞、Ｔ細胞又はＮＫＴ細胞、ｉＰＳＣなどの免疫細胞）は、ＴＣＲポリペプチドが標的とする抗原を発現する疾患細胞を直接（例えば、特定のペプチド－ＭＨＣの認識を介して）阻害するための、Ｔ細胞療法（αβ Ｔ細胞及びγδ Ｔ細胞の両方）又はＮＫＴ細胞療法などの免疫療法に使用され得る。免疫細胞においてＴＣＲポリペプチドと共発現されるグルコース代謝産物を再誘導する因子は、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／又は低酸素環境において（例えば、腫瘍微小環境において）、細胞を効果的に増殖及び／又は機能させることによって、細胞ベースの免疫療法を容易にするであろう。臨床安全性は、ｍＲＮＡエレクトロポレーションを使用して、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＴＣＲポリペプチドを一過的に発現し、任意の潜在的な非腫瘍特異的反応性を制限することによって更に増強することができる。
本明細書に記載の方法は、治療有効量の、本開示のグルコース代謝産物を再誘導する因子と、ＴＣＲポリペプチドと、を共発現する造血細胞（例えば、免疫細胞（例えば、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、又はＮＫＴ細胞）などの遺伝子操作された宿主細胞を、対象に導入することを含み得る。対象（例えば、ヒトがん患者などのヒト患者）は、更に、抗がん剤又は抗感染剤を含むがこれらに限定されない、抗がん療法又は抗感染療法で治療されていてもよく、又は治療されていてもよい。
ＴＣＲは、プロセシングされたペプチド－ＭＨＣ複合体を介して任意の標的抗原に結合し得る抗原結合ドメインを有する。そのような標的抗原は、腫瘍抗原、病原性抗原（例えば、細菌、真菌、若しくはウイルス）、又は疾患細胞上に存在する抗原（例えば、本明細書に記載のもの）を含むがこれらに限定されない、疾患又は状態に関連する任意の分子であり得る。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、天然の腫瘍抗原タンパク質を標的とする。他の実施形態では、標的抗原結合ドメインは、腫瘍抗原タンパク質のバリアント（例えば、変異）を標的とする。
本明細書に記載のグルコース代謝産物を再誘導する因子及びＴＣＲポリペプチドを発現する宿主細胞（例えば、造血細胞、例えば、Ｔ細胞及びＮＫＴ細胞などの免疫細胞）は、低グルコース環境、低アミノ酸環境、低ｐＨ環境、及び／又は低酸素環境において（例えば、腫瘍微小環境において）、標的抗原を発現する細胞を阻害する、かつ／又は免疫細胞の成長及び／若しくは増殖を促進するために有用である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、サル、マウス、ウサギ、又は家畜哺乳動物などの哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトがん患者である。いくつかの実施形態では、加えて、対象は、本明細書に記載の治療用抗体のうちのいずれかで治療されているか、又は治療されている。
本明細書に記載の方法を実施するために、有効量の造血細胞、例えば、グルコース代謝産物を再誘導する因子のうちのいずれか、並びに本明細書に記載のＴＣＲポリペプチドを発現する免疫細胞（ＮＫＴ及び／若しくはＴ細胞）、又はそれらの組成物を、静脈内又は皮下投与などの好適な経路を介して、治療を必要とする対象に投与することができる。本明細書で使用される場合、有効量は、投与時に対象に治療効果を付与するそれぞれの薬剤（例えば、グルコース代謝産物を再誘導する因子、ＴＣＲポリペプチド、又はそれらの組成物を発現するＮＫＴ細胞及び／又はＴ細胞）の量を指す。ある量の本明細書に記載の細胞又は組成物が治療効果を達成したかどうかの決定は、当業者には明らかであり、本明細書に開示されている。
本開示の方法は、任意のがん又は任意の病原体の治療に使用され得る。本開示の方法によって治療することができるがんの特定の非限定的な例としては、例えば、リンパ腫、乳がん、胃がん、神経芽腫、骨肉腫、肺がん、皮膚がん、前立腺がん、大腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓がん、頭頸部がん、網膜芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、甲状腺がん、肝細胞がん、食道がん、及び子宮頸がんが挙げられる。特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍であり得る。本開示の方法はまた、ウイルス感染であり得る感染症を治療するためにも使用され得る。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、対象に、標的ペプチド抗原を発現する細胞を、少なくとも２０％及び／又は少なくとも２倍阻害する、例えば、標的抗原を発現する細胞を５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、又はそれ以上阻害するのに有効な量で投与される。追加の治療剤（例えば、抗体ベースの免疫療法剤）を使用して、治療剤が対象において有用であると考えられる任意の疾患又は障害の症状を、治療、軽減、又は低減することができる。
本明細書に記載される細胞ベースの免疫療法の有効性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって評価され得、熟練した医療専門家には明らかであろう。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＴＣＲポリペプチドを発現する免疫細胞の不在下での有効性と比較して、細胞ベースの免疫療法の有効性を少なくとも２０％及び／又は少なくとも２倍増強する、例えば、抗体ベースの免疫療法の有効性を５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、又はそれ以上増強するのに有効な量で、治療を必要とする対象に投与される。
本明細書に記載の組成物又は方法のうちのいずれかでは、免疫細胞（例えば、ＮＫＴ細胞及び／又はＴ細胞）は、対象にとって自己由来であり得、すなわち、免疫細胞が、治療を必要とする対象から得られ、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＴＣＲポリペプチドの発現のために遺伝子操作され、次いで、同じ対象に投与され得る。特定の一実施形態では、対象への再導入の前に、自己免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫＴ細胞）は、エクスビボで活性化及び／又は増殖される。対象への自己細胞の投与は、非自己細胞の投与と比較して、宿主細胞の拒絶反応の低減をもたらし得る。ＮＫＴ細胞及びＴ細胞（αβ Ｔ細胞又はγδ Ｔ細胞）は、当該技術分野で既知の任意の方法によって活性化することができる。
記載の組成物又は方法の一実施形態では、対象へのＴ細胞又はＮＫＴ細胞の導入（又は再導入）に続いて、治療有効量のＩＬ－２が対象に投与される。追加の態様では、本方法は、操作されたｉＰＳＣ、ＮＫＴ、又はＴ細胞の集団を凍結保存することを更に含む。
本開示によれば、患者は、体重１キログラム当たり約１０５～１０１０個又はそれ以上の細胞（細胞／Ｋｇ）の範囲で、本開示のグルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＴＣＲポリペプチドを含む、治療有効用量のＴ細胞又はＮＫＴ細胞などの免疫細胞を注入することによって治療することができる。注入は、所望の応答が達成されるまで、患者が耐えることができる頻度及び回数だけ繰り返すことができる。適切な注入用量及びスケジュールは、患者によって異なるが、特定の患者の治療医によって決定され得る。典型的には、およそ１０６個の細胞／ｋｇの初回用量が注入され、１０８個又はそれ以上の細胞／ｋｇに漸増する。
本明細書に記載の組成物又は方法の有効性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって評価され得、熟練した医療専門家には明らかであろう。例えば、本明細書に記載の組成物又は方法の有効性は、対象の生存率、あるいは対象又はその組織若しくは試料におけるがん又は病原体負荷によって評価され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、対象における療法の安全性又は毒性（例えば、グルコース代謝産物を再誘導する因子及びＴＣＲポリペプチドを発現する免疫細胞の投与）に基づいて、例えば、対象の全体的な健康状態及び／又は有害事象若しくは重篤な有害事象の存在によって評価され得る。
Ｖ．併用療法
本開示に記載の組成物及び方法は、化学療法、手術、放射線療法、遺伝子療法などの他のタイプのがん療法、又は抗感染療法と併せて利用され得る。そのような療法は、本開示による免疫療法と同時に又は逐次（任意の順序で）投与され得る。追加の治療剤と併用投与される場合、相加作用又は相乗作用により、各薬剤の好適な治療有効用量が低下する可能性がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるグルコース代謝産物を再誘導する因子のうちのいずれか及び／又はキメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞）は、追加の治療剤（例えば、追加の抗がん治療剤）で治療された又は治療されている対象に投与され得る。例えば、免疫細胞は、追加の治療剤と同時にヒト対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、追加の治療剤の前にヒト対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、追加の治療剤の後にヒト対象に投与され得る。
グルコース代謝産物を再誘導する因子と、タグに特異的なＣＡＲポリペプチドと、を共発現する遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、タグにコンジュゲートされた治療剤と共用され得る。腫瘍細胞などの疾患細胞に関連する抗原に結合することができる治療剤を介して、そのような遺伝子操作された免疫細胞は、疾患細胞に関与し、それらの増殖を阻害することができる。上記の表４に列挙されている抗体のうちのいずれか、又は表４にも列挙されている同じ標的抗原に特異的な他の抗体を、好適なタグ（例えば、本明細書に記載のもの）にコンジュゲートし、グルコース代謝産物を再誘導する因子と、タグに特異的なＣＡＲポリペプチドと、を共発現する免疫細胞と共用することができる。
本開示の治療は、例えば、治療用ワクチン（ＧＶＡＸ、樹状細胞（ＤＣ）ベースのワクチンなどを含むが、これらに限定されない）、チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３などを遮断する薬剤を含むが、これらに限定されない）、又は活性化因子（４１ＢＢ、ＯＸ４０などを増強する薬剤を含むが、これらに限定されない）などの他の免疫調節治療と併用することができる。いくつかの実施形態では、グルコース代謝産物を再誘導する因子と、ＣＡＲポリペプチドと、を共発現する遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、免疫調節治療と併用される。
本開示の免疫療法と併用するのに有用な他の治療剤の非限定的な例としては、（ｉ）抗血管新生剤（例えば、ＴＮＰ－４７０、血小板因子４、トロンボスポンジン－１、メタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ１及びＴＩＭＰ２）、プロラクチン（１６－Ｋｄ断片）、アンジオスタチン（プラスミノーゲンの３８－Ｋｄ断片）、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、形質転換増殖因子ベータ、インターフェロンアルファ、可溶性ＫＤＲ、及びＦＬＴ－１受容体、胎盤プロリフェリン関連タンパク質、並びにＣａｒｍｅｌｉｅｔ ａｎｄ Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７（６８０１）：２４９－２５７（２０００）に列挙されているもの、（ｉｉ）ＶＥＧＦアンタゴニスト又はＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤、及びこれらの任意の組み合わせ）、並びに（ｉｉｉ）化学療法化合物（例えば、ピリミジン類似体（５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン、及びシタラビン）、プリン類似体、葉酸アンタゴニスト及び関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、及び２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））、抗増殖／有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン）などの天然物、微小管破壊剤（例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、及びナベルビン、エピディポドフィロトキシン（エトポシド及びテニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミン、オキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メルクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びエトポシド（ＶＰ１６））、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、及びマイトマイシン）、酵素（Ｌ－アスパラギンを全身的に代謝し、細胞を枯渇させ、自身のアスパラギンを合成する能力を持たないＬ－アスパラギナーゼ）、抗血小板剤、抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド及び類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン及びメチルメラミン（ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、アルキルスルホネート－ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）及び類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン－ダカルバジニン（ＤＴＩＣ）、抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗剤（例えば、葉酸類似体（メトトレキサート））、白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド、ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）及びアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）、抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩、及び他のトロンビン阻害剤）、線維素溶解剤（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、及びウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ、抗遊走剤、抗分泌剤（ブレフェルジン）、免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、抗血管新生化合物（例えば、ＴＮＰ－４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ）、及び増殖因子阻害剤（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤）、アンジオテンシン受容体遮断薬、一酸化窒素供与体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体（トラスツズマブ）、細胞周期阻害剤及び分化誘導剤（トレチノイン）、ＡＫＴ阻害剤（ＭＫ－２２０６ ２ＨＣｌ、ペリフォシン（ＫＲＸ－０４０１）、ＧＳＫ６９０６９３、イパタセルチブ（ＧＤＣ－００６８）、ＡＺＤ５３６３、ウプロセルチブ、アフレセルチブ、又はトリシリビン）、ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、及びイリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、及びプレドニゾロン）、増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤、ミトコンドリア機能不全誘発剤、及びカスパーゼ活性化因子、並びにクロマチン破壊剤が挙げられる。
追加の有用な薬剤の例については、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｐ Ｄ Ｒ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ Ｎ．Ｊ．、Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍｄ．、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，ＮＹ、Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ Ｎ．Ｊ．も参照されたい。
追加の治療剤の投与は、全身投与並びに疾患の部位（例えば、腫瘍）への直接投与を含む任意の好適な経路によって行うことができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、対象に、追加の治療剤（例えば、抗体）を、１回の用量で投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象に、追加の治療剤（例えば、抗体）を、複数回用量（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８回用量）で投与することを含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤（例えば、抗体）は、複数回用量で対象に投与され、追加の治療剤（例えば、抗体）の初回用量が、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞の投与の約１、２、３、４、５、６、又は７日前に対象に投与される。いくつかの実施形態では、追加の治療剤（例えば、抗体）の初回用量は、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞の投与の約２４～４８時間前の間に対象に投与される。いくつかの事例では、追加の治療剤は、目的の標的抗原に特異的な抗体（例えば、表４に列挙されているもの）及び同じ標的に特異的な他の抗体であり得る。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤（例えば、抗体）の初回用量は、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞を投与する前に対象に投与される。いくつかの実施形態では、追加の治療剤（例えば、抗体）は、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞を投与する前に対象に投与され、次いで、約２週間ごとに投与される。いくつかの実施形態では、追加の治療剤（例えば、抗体）の最初の２回の用量は、約１週間（例えば、約６、７、８、又は９日）の間隔で投与される。特定の実施形態では、３回目及び次の用量は、約２週間ごとに投与される。
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、追加の治療剤（例えば、抗体）の投与のタイミングは、おおよそであり、示された日の３日前及び３日後を含む（例えば、３週間ごとの投与は、１８日目、１９日目、２０日目、２１日目、２２日目、２３日目、又は２４日目の投与を包含する）。
疾患療法のための免疫系誘導の有効性は、例えば、ＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫの投与前に腫瘍負荷を低減する他の薬剤との併用によって増強され得る。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、多くのタイプのがんにおける腫瘍負荷を効率的に低減することができる。多数の例示的なＡＤＣが、当該技術分野で既知である（Ｍｕｌｌａｒｄ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，１２（５）：３２９－３３２（２０１３）、Ｃｏａｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５（１８）：５４４１－５４４８（２０１９）、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ，１０（９）：１５８９－１６００（２０２０）、Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，７（１）：９３（２０２２））。任意のそのような既知のＡＤＣは、本明細書に記載されるＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫ構築物と組み合わせて使用され得る。したがって、ＡＤＣがＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫと組み合わせて使用されるいくつかの実施形態では、ＡＤＣは、ＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫの前に投与される。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、初回用量のＡＤＣは、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び／又はＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞を投与する前に、対象に投与される。
別の実施形態では、疾患療法に対する免疫系誘導の有効性は、他の免疫療法剤、例えば、インビボでＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を刺激するサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５（ＩＬ－２／ＩＬ－１５スーパーアゴニスト）、ＩＬ－７、若しくはＩＬ－１２、若しくはその誘導体などのＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγのアゴニスト）又は免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、若しくは抗ＴＩＭ３抗体）と併用することによって増強され得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、好ましくはシクロホスファミド及びフルダラビンから選択されるリンパ球減少治療を投与することを更に含む。そのようなリンパ枯渇治療は、好ましくは、注入された細胞のより大きなＴ細胞の増殖を可能にするために、ＣＡＲを発現する造血細胞の注入前に適用される（Ｓｈａｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，３７（３）：３３４－３４５（２０１７））。
本明細書に記載される方法の有効性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって評価され得、熟練した医療専門家及び／又は本明細書に記載されるものには明らかであろう。例えば、抗体ベースの免疫療法の有効性は、対象の生存率あるいは対象又はその組織若しくは試料におけるがん負荷によって評価され得る。いくつかの実施形態では、抗体ベースの免疫療法は、対象における療法の安全性又は毒性に基づいて、例えば、対象の全体的な健康状態及び／又は有害事象若しくは重度の有害事象の存在によって評価される。
ＶＩ．治療用のキット
本開示は、本明細書に記載の組成物を使用するためのキットも提供する。例えば、本開示はまた、低グルコース環境、低アミノ酸環境、低ｐＨ環境、及び／又は低酸素環境において（例えば、腫瘍微小環境において）、疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）の増殖を阻害する、かつ／又は免疫細胞の成長及び／若しくは増殖を増強する際の使用のための、グルコース代謝産物を再誘導する因子及び任意選択的にキメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞の集団（例えば、インビトロ又はインビボで構築されたＴ細胞又はＮＫ細胞）を含むキットを提供する。キットは、免疫細胞上に発現されるキメラ受容体ポリペプチドが結合する、治療剤又はタグ（例えば、本明細書に記載のもの）にコンジュゲートされた治療剤を更に含んでもよい。そのようなキットは、本明細書に記載のものなどのグルコース代謝産物を再誘導する因子と、キメラ受容体ポリペプチドと、を共発現する本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞）の集団を含み、任意選択的に治療剤又はタグにコンジュゲートされた治療剤を含む、１つ以上の容器を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、エクスビボで増殖される、グルコース代謝産物を再誘導する因子を発現し、かつキメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞を含む。別の実施形態では、キットは、グルコース代謝産物を再誘導する因子を発現し、かつキメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞、並びに活性化されたＴ細胞上に存在する細胞表面抗体（例えば、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ３８抗体、又は抗ＣＤ７抗体）に特異的な抗体を含む。例示的な実施形態では、キットは、グルコース代謝産物を再誘導する因子を発現し、かつＣＡＲを発現する、ＮＫ細胞又はＴ細胞を含む。グルコース代謝産物を再誘導する因子を発現し、かつキメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞は、当該技術分野で既知であるか又は本明細書に開示されているキメラ受容体ポリペプチド構築物のうちのいずれかを発現し得る。
代替的に、本明細書に開示されるキットは、本明細書にまた記載されているキメラ受容体ポリペプチドのうちのいずれか及びグルコース代謝産物を再誘導する因子のうちのいずれかを集合的にコードする、本明細書に記載される核酸又は核酸セットを含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかにおいて使用するための説明書を更に含む。含まれる説明書は、意図された活性（例えば、対象における標的細胞の増殖の阻害、並びに／又は低グルコース環境、低アミノ酸（例えば、低グルタミン環境）環境、低ｐＨ環境、及び／若しくは低酸素環境（例えば、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、若しくは低酸素の腫瘍微小環境）における免疫細胞の成長及び／若しくは増殖の増強）を達成するための、対象への第１及び第２の薬学的組成物の投与の説明を含み得る。キットは、対象が治療を必要としているかどうかの特定に基づいて、治療に好適な対象を選択する説明を更に含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、対象が治療を必要としているかどうかの特定に基づいて、治療に好適な対象を選択する説明を更に含み得る。そのような特定方法の非限定的な例としては、血液、ＤＮＡ、又は組織における標的の発現（例えば、免疫組織化学）が挙げられ得る。更に、いくつかの事例では、治療用量を調整するために、カットオフ範囲を使用することができる。
いくつかの実施形態では、説明書は、遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の集団を投与することの説明、及び任意選択的に、タグにコンジュゲートされた治療剤を投与することの説明を含む。本明細書に記載の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）及び任意選択的にタグにコンジュゲートされた治療剤の使用に関する説明書には、一般に、意図された治療のための投与量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報が含まれる。容器は、単位剤形、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）又はサブ単位用量であり得る。本開示のキットで提供される使用説明書は、典型的には、ラベル又はパッケージインサートに記載された説明書である。ラベル又はパッケージインサートは、薬学的組成物が、対象における疾患又は障害を治療する、発病を遅延する、かつ／又は軽減するために使用されることを示す。
本明細書に提供されるキットは、好適なパッケージに入っている。好適なパッケージとしては、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性パッケージなどが挙げられるが、これらに限定されない。吸入器、経鼻投与装置、又は注入装置などの特定の装置と組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器はまた、滅菌アクセスポートを有し得る。第２の薬学的組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載される抗体である。第１の薬学的組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載されるキメラ受容体ポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球又はＮＫ細胞）の集団である。
キットは、任意選択的に、緩衝剤及び解釈情報などの追加の構成要素を提供する場合がある。通常、キットは、容器、及び容器上若しくは容器に付随するラベル又はパッケージインサート（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記のキットの内容物を含む製品を提供する。
本発明の更なる実施形態は、集合的に、上記のグルコース代謝産物を転用又は再誘導する因子をコードする、第１のヌクレオチド配列と、上記のキメラ受容体ポリペプチドをコードする、第２のヌクレオチド配列と、を含む、核酸又は核酸セットである。単離された核酸又は核酸セットは、本発明の遺伝子操作された免疫細胞を製造するために使用され得る。したがって、更なる実施形態は、免疫細胞を核酸又は核酸セットでトランスフェクトし、トランスフェクトされた免疫細胞を選択／濃縮することによって、インビトロで改変された免疫細胞を製造する方法である。トランスフェクトされた細胞の選択は、当該技術分野で既知の方法（例えば、フローサイトメトリー）によって、免疫細胞の表面のキメラ受容体ポリペプチドの発現のために選択することによって行われ得る。免疫細胞は、任意選択的に、ＮＫ細胞及びＴ細胞について上で記載したような当該技術分野で既知の任意の方法によってインビトロで活性化され得る。
そのような単離された核酸又は核酸セットは、ベクター又はベクターのセットの形態であり得る。したがって、インビボで改変された免疫細胞を生成するための方法であって、それを必要とする対象に、本発明による核酸又は核酸セット、好ましくはベクター又はベクターのセットを投与することを含む、方法。対象のそれぞれの免疫細胞は、核酸又は核酸セット（例えば、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス）でトランスフェクトされ、解糖経路からグルコース代謝産物を転用又は再誘導するポリペプチド及びキメラ受容体ポリペプチドの発現又は過剰発現をもたらすであろう。
一般的な技術
本発明の実施は、別段の明記がない限り、当該技術分野の範囲内にある、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技法を用いる。そのような技法は、例えば、以下の文献で詳しく説明されている；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４→、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）。
更に詳述することなく、当業者であれば、上記の説明に基づいて、本開示を最大限に活用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的又は主題のために、参照により組み込まれる。
以下の実施例は、本発明による方法及び実施形態を例示することのみを意図しており、したがって、特許請求の範囲に限定を課すものとして解釈されるべきではない。
実施例１：低グルコース環境でＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞の機能に対する、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現の影響
グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド）をコードする導入遺伝子を、同じＴ細胞及び／又はＮＫ細胞において、ＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ（例えば、配列番号６８～配列番号７４）である。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離された、ＡＣＴＲポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子をコードするウイルスで形質導入する。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、腫瘍標的細胞（例えば、ＩＧＲＯＶ－１細胞）及び腫瘍標的化抗体（例えば、抗ＦＯＬＲα抗体）と、所与のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で混合する。次いで、反応物を、５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で、一定期間（例えば、６～８日間）、異なる開始濃度のグルコース（例えば、０～２０ｍＭ）とインキュベートする。次いで、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の機能を、例えば、サイトカイン産生又は増殖アッセイを使用して、又は慢性刺激に対する耐性について評価する。反応上清からのサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２及び／又はＩＦＮ－γ）を測定する。増殖実験では、共培養物を採取し、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ５６抗体及び生死細胞染色で染色する。Ｔ細胞増殖の尺度として、生存Ｔ細胞を、ＣＤ４５＋ＣＤ３３－ＣＤ３＋ＣＤ１４－ＣＤ５６－細胞として計数し、生死細胞染色をフローサイトメトリーによって評価する。また、ＮＫ細胞の場合、ＣＤ４５＋ＣＤ３３－ＣＤ３－ＣＤ１４－ＣＤ５６＋に対して計数を行い、生死細胞染色をフローサイトメトリーによって評価する。
ＡＣＴＲポリペプチドに加えてグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、例えば、増強されたサイトカイン産生又は増強された増殖を含む、ＡＣＴＲのみを発現するＴ細胞と比較して、増強されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞機能を示す。この増強された機能は、より低いグルコース濃度でより顕著であり得る。これらの実験は、免疫（例えば、Ｔ及び／又はＮＫ）におけるグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現が、免疫細胞の活性にプラスの影響を及ぼすことを実証する。
実施例２：可溶性阻害剤濃度がより高い環境における、ＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞の機能に対する、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現の影響
グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド）をコードする導入遺伝子を、同じＴ細胞及び／又はＮＫ細胞において、ＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ（例えば、配列番号６８～配列番号７４）である。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離された、ＡＣＴＲポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子をコードするウイルスで形質導入する。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、腫瘍微小環境に存在する異なる濃度の可溶性阻害剤（例えば、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２、キヌレニン、及び／又はアデノシン）を含有する培地で、腫瘍標的細胞（例えば、ＩＧＲＯＶ－１細胞）及び腫瘍標的化抗体（例えば、抗ＦＯＬＲα抗体）と、所与のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で混合する。次いで、反応物を、５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で、一定期間（例えば、６～８日間）インキュベートする。次いで、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞の機能を、例えば、サイトカイン産生又は増殖アッセイを使用して、又は慢性刺激に対する耐性について評価する。反応上清からのサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２及び／又はＩＦＮ－γ）を測定する。増殖実験の場合、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞の共培養物を採取し、染色し、フローサイトメトリーによって評価する（実施例１を参照されたい）。
ポリペプチドに加えてグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、例えば、増強されたサイトカイン産生を含む、ＡＣＴＲのみを発現するＮＫ細胞及び／又はＴ細胞と比較して、増強された細胞機能を示す。この増強された機能は、より高い可溶性阻害剤濃度で達成され得る。これらの実験は、免疫（例えば、Ｔ又はＮＫ）細胞におけるグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現が、免疫細胞の活性にプラスの影響を及ぼすことを実証する。
実施例３：免疫抑制細胞がより多く存在する環境における、ＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞の機能に対する、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現の影響
グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド）をコードする導入遺伝子を、同じＴ細胞及び／又はＮＫ細胞において、ＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ（例えば、配列番号６８～配列番号７４）である。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離された、ＡＣＴＲポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子をコードするウイルスで形質導入する。免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来サプレッサー細胞及び／又は制御性Ｔ細胞）の存在下で、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、腫瘍標的細胞（例えば、ＩＧＲＯＶ－１細胞）及び腫瘍標的化抗体（例えば、抗ＦＯＬＲα抗体）と、所与のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で混合する。次いで、反応物を、５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で、一定期間（例えば、３～１０日間）インキュベートする。次いで、免疫細胞（ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞）の機能を、例えば、サイトカイン産生又は細胞増殖アッセイを使用して、又は慢性刺激に対する耐性について評価する。反応上清からのサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２及び／又はＩＦＮ－γ）を測定する。実施例１に記載のように、増殖実験を行い、評価する。
ＡＣＴＲ又はＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、例えば、増強されたサイトカイン産生又は増強された増殖を含む、ＡＣＴＲ又はＣＡＲのみを発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞と比較して、増強されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞機能を示す。この増強された機能は、増加した量（例えば、より多くの数又は割合）の免疫抑制細胞の存在下で達成され得る。これらの実験は、免疫（例えば、Ｔ及び／又ＮＫ）細胞におけるグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現が、免疫細胞の活性にプラスの影響を及ぼすことを実証する。
実施例４：腫瘍モデルにおける、ＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞の機能に対する、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現の影響
グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド）をコードする導入遺伝子を、同じＴ細胞及び／又はＮＫ細胞において、ＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ（例えば、配列番号６８～配列番号７４）である。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離された、ＡＣＴＲポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子をコードするウイルスで形質導入する。形質導入されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を、マウス腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性について評価する。これらの実験では、腫瘍細胞株（例えば、ＩＧＲＯＶ－１）を、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ，ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種する。続いて、腫瘍を有するマウスに、腫瘍標的化抗体（例えば、抗ＦＯＬＲα抗体）、並びにＡＣＴＲのみ、又はＡＣＴＲと、グルコース代謝産物を再誘導する因子と、を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を投与する。腫瘍増殖を、実験の全過程を通して監視する。
腫瘍標的化抗体と組み合わせると、ＡＣＴＲポリペプチドに加えてグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、ＡＣＴＲポリペプチドのみを発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞と比較して、増強された抗腫瘍活性を示す。更に、腫瘍標的化抗体と組み合わせると、ＡＣＴＲポリペプチドに加えてグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、例えば、ＡＣＴＲポリペプチドのみを発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞と比較して、増強された増殖、増強されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞持続性、並びに／又は増強されたサイトカイン産生を含む、増強されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞活性を示し得る。これらの実験は、ＡＣＴＲを発現する免疫（例えば、Ｔ及び／又はＮＫ）細胞におけるグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現が、インビボで免疫細胞の機能にプラスの影響を及ぼすことを実証する。
実施例５：Ｔ細胞の機能に対する、グルコース濃度の低下の影響
配列番号７８の例示的なＧＰＣ３標的化ＣＡＲ発現構築物をコードするガンマレトロウイルスを、組換え技術によって生成し、それらの細胞表面にＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチドを発現する細胞を生成するための初代ヒトＴ細胞を感染させるために使用した。次いで、６日間のフローベースの増殖アッセイを使用して、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ発現細胞の機能性を試験した。具体的には、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ構築物を発現する２００，０００個の非形質導入モックＴ細胞又はＴ細胞を、５０，０００個のＧＰＣ３＋肝細胞がんＪＨＨ７又はＨｅｐ３Ｂ腫瘍細胞のいずれかと、４：１の比（エフェクター細胞／ＣＡＲ発現Ｔ細胞：標的細胞）でインキュベートした。共培養物を、異なる濃度のグルコースの存在下で、６日間、５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃でインキュベートした。６日目の終わりに、共培養物を採取し、抗ＣＤ３抗体で染色した。ＣＤ３陽性細胞の数を、Ｔ細胞増殖の尺度として、フローサイトメトリーによって評価した。より低いグルコース濃度では、より少ないＣＡＲ－Ｔ増殖が観察された（図２）。これらの実験は、低グルコース環境が、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖活性に悪影響を及ぼす可能性があることを実証する。
実施例６：ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫ発現構築物を使用した、免疫細胞の機能に対する、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現の影響
例示的なＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド発現構築物（配列番号７８又は配列番号７９）をコードするガンマレトロウイルスは、組換え技術を介して生成され、初代ヒトＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を感染させて、それらの細胞表面にＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチドを発現する細胞を生成するために使用される。更に、例示的なＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド及び解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する因子（ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ）（配列番号６８～配列番号７４）をコードするガンマレトロウイルスは、組換え技術によって生成され、ＧＰＣ３標的化ポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現する細胞を生成するために初代ヒトＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を感染させるために使用される。ＣＡＲポリペプチドとグルコース代謝産物を再誘導する因子との両方をコードする構築物では、２つのポリペプチドは、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離される。発現されるバリアントは、配列番号６８～配列番号７４（例えば、ＣＡＲ＋ＰＫＭ２、ＣＡＲ＋ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅ、ＣＡＲ＋ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄ、ＣＡＲ＋ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒ、ＣＡＲ＋ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙ、ＣＡＲ＋ＧＦＰＴ１、又はＣＡＲ＋ＴＩＧＡＲの場合）である。次いで、６日間のフローベースの増殖アッセイを使用して、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ発現細胞の機能性を試験する。具体的には、２００，０００個の非形質導入モックＴ細胞若しくはＮＫ細胞、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞若しくはＮＫ細胞、又はＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するＴ細胞若しくはＮＫ細胞を、５０，０００個のＧＰＣ３＋肝細胞がんＪＨＨ７腫瘍細胞と、４：１の比率（エフェクター細胞／ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞：標的細胞）で一緒にインキュベートする。共培養物を、１．２５ｍＭグルコース（腫瘍関連）及び１０ｍＭグルコース（おおよその末梢血レベル）の存在下、３７℃、５％ＣＯ２で、６日間インキュベートする。６日目の終わりに、共培養物を採取し、共培養物を採取し、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ５６抗体及び生死細胞染色で染色する。Ｔ細胞増殖の尺度として、生存Ｔ細胞を、ＣＤ４５＋ＣＤ３３－ＣＤ３＋ＣＤ１４－ＣＤ５６－細胞として計数し、生死細胞染色をフローサイトメトリーによって評価する。また、ＮＫ細胞の場合、ＣＤ４５＋ＣＤ３３－ＣＤ３－ＣＤ１４－ＣＤ５６＋に対して計数を行い、生死細胞染色をフローサイトメトリーによって評価する。
ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現する免疫細胞は、ＣＡＲ構築物のみを発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞と比較して、増強されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞増殖を示す。この増強された増殖は、腫瘍関連の低グルコース濃度でも起こる。これらの実験は、免疫（例えば、Ｔ及び／又ＮＫ）細胞におけるグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現が、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞の増殖活性にプラスの影響を及ぼすことを実証する。
実施例７：可溶性阻害剤濃度がより高い環境における、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現させることが、ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞機能に及ぼす影響
グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド）をコードする導入遺伝子を、同じＴ細胞及び／又はＮＫ細胞において、ＣＡＲポリペプチドと共発現する。導入遺伝子は、例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ（例えば、配列番号６８～配列番号７４）である。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離された、ＣＡＲポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子をコードするウイルスで形質導入する。形質導入されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を、腫瘍微小環境に存在する異なる濃度の可溶性阻害剤（例えば、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２、キヌレニン、及び／又はアデノシン）を含有する培地で、腫瘍標的細胞（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）と、所与のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で混合する。次いで、反応物を、５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で、一定期間（例えば、６～８日間）インキュベートする。次いで、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞の機能を、例えば、サイトカイン産生又は増殖アッセイを使用して、又は慢性刺激に対する耐性について評価する。反応上清からのサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２及び／又はＩＦＮ－γ）を測定する。増殖実験の場合、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞の共培養物を採取し、染色し、フローサイトメトリーによって評価する（実施例１を参照されたい）。
ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、例えば、増強されたサイトカイン産生又は増強された増殖を含む、ＣＡＲのみを発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞と比較して、増強されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞機能を示す。この増強された機能は、より高い可溶性阻害剤濃度で達成され得る。これらの実験は、免疫（例えば、Ｔ及び／又ＮＫ）細胞におけるグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現が、免疫細胞の活性にプラスの影響を及ぼすことを実証する。
実施例８：免疫抑制細胞がより多く存在する環境における、ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞の機能に対する、解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現の影響
グルコース代謝産物を再誘導する因子をコードする導入遺伝子を、同じＴ細胞及び／又はＮＫ細胞において、ＣＡＲポリペプチドと共発現する。導入遺伝子は、例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ（例えば、配列番号６８～配列番号７４）である。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離された、ＣＡＲポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子をコードするウイルスで形質導入する。免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来サプレッサー細胞及び／又は調節Ｔ細胞）の存在下で、形質導入されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を、腫瘍標的細胞（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）と、所与のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で混合する。次いで、反応物を、５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で、一定期間（例えば、３～１０日間）インキュベートする。次いで、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の機能を、例えば、サイトカイン産生又は細胞増殖アッセイを使用して、又は慢性刺激に対する耐性について評価する。反応上清からのサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２及び／又はＩＦＮ－γ）を測定する。実施例１に記載のように、増殖実験を行い、評価する。
ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、例えば、増強されたサイトカイン産生又は増強された増殖を含む、ＣＡＲのみを発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞と比較して、増強されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞機能を示す。この増強された機能は、増加した量（例えば、より多くの数又は割合）の免疫抑制細胞の存在下で達成され得る。これらの実験は、免疫（例えば、Ｔ及び／又ＮＫ）細胞におけるグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現が、免疫細胞の活性にプラスの影響を及ぼすことを実証する。
実施例９：腫瘍モデルにおける、Ｔ細胞機能に対する解糖経路からグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現の影響
グルコース代謝産物を再誘導する因子をコードする導入遺伝子を、同じＴ細胞及び／又はＮＫ細胞において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ（例えば、配列番号６８～配列番号７４）である。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離された、ＣＡＲポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子をコードするウイルスで形質導入する。形質導入されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を、マウス腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性について評価する。これらの実験では、腫瘍細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２）を、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ，ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２ｒｇｔｍＷｊ１／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種する。続いて、腫瘍を有するマウスに、ＣＡＲのみ、又はＣＡＲと、グルコース代謝産物を再誘導する因子と、を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を投与する。腫瘍増殖を、実験の全過程を通して監視する。
ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、ＣＡＲポリペプチドのみを発現するＴ細胞又はＮＫ細胞と比較して、増強された抗腫瘍活性を示す。更に、ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、例えば、ＣＡＲポリペプチドのみを発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞と比較して、増強された増殖、持続性、及び／又はサイトカイン産生を含む、増強されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞活性を示し得る。これらの実験は、ＣＡＲを発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞におけるグルコース代謝産物を再誘導する因子の発現が、インビボでＴ細胞又はＮＫ細胞の機能にプラスの影響を及ぼすことを実証する。
実施例１０：ＧＬＵＴ１、ＧＯＴ２、及びＴＩＧＡＲの発現によるグルコース取り込み及び乳酸産生の上昇
健常なドナーのＰＢＭＣを、２日目まで抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で刺激し、続いて、レンチウイルスベクターにパッケージングされたＶ５タグ付き導入遺伝子による形質導入を行った。導入遺伝子は、ＧＬＵＴ１（配列番号８０）、ＧＯＴ２（配列番号８１）、又はＴＩＧＡＲ（配列番号６９）をコードする。形質導入された細胞に、１０日目まで毎日新鮮なＩＬ－２を補充した。１０，０００細胞／ウェル（３８４ウェルプレート）をＰＢＳに再懸濁し、グルコース取り込みについてアッセイした。各導入遺伝子について、発光読み出しを倍率変化として評価し、同じ条件下で、ヌル（非形質導入対照；倍率変化１としてのベースライン）Ｔ細胞と比較した。ＧＬＵＴ１、ＧＯＴ２又はＴＩＧＡＲで形質導入された細胞は、グルコース取り込みのレベルの上昇を示した。これは、より高い代謝活性を示す。データは、３人のドナーを表す。図３を参照されたい。
更に、健康なドナーのＰＢＭＣを、２日目まで抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で刺激し、続いて、レンチウイルスベクターにパッケージングされたＶ５タグ付き導入遺伝子（上記）による形質導入を行った。形質導入された細胞に、９日目まで毎日新鮮なＩＬ－２を補充した。９日目に、Ｔ細胞のサブセットをＰＭＡ及びイオノマイシンで２４時間刺激した。１０，０００個の採取した細胞／ウェル（３８４ウェルプレート）を、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ中に再懸濁し、３７℃で２時間インキュベートして、培地から残留乳酸を除去し、乳酸産生についてアッセイした。各導入遺伝子について、発光読み出しを倍率変化として評価し、同じ条件下で、ヌル（非形質導入対照；倍率変化１としてのベースライン）Ｔ細胞と比較した。ＧＬＵＴ１、ＧＯＴ２、及びＴＩＧＡＲで形質導入された刺激細胞は、栄養欠乏環境におけるより高い代謝適応性を示す乳酸産生のレベルの上昇を示した。図４を参照されたい。
要するに、この実施例の結果は、ＧＬＵＴ１、ＧＯＴ２、又はＴＩＧＡＲで形質導入されたＴ細胞が、栄養欠乏環境において増強された代謝活性及び適応性を示し、ＴＩＧＡＲが３つの中で最良の効果を示すことを示す。これは、ＧＬＵＴ１、ＧＯＴ２、又はＴＩＧＡＲ（具体的にはＴＩＧＡＲ）を共発現する治療用Ｔ細胞（例えば、本明細書に開示されるＡＣＴＲ又はＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞）が、（栄養素が不足している可能性がある）腫瘍微小環境によりよく適応し、ＧＬＵＴ１、ＧＯＴ２、又はＴＩＧＡＲ遺伝子で形質導入されない対応するＴ細胞と比較して、より優れた治療活性を示すことを示す。また、ＷＯ２０２０／０１０１１０及びＷＯ２０２０／０３７０６６を参照されたい。これらの各々の関連する開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために、参照により組み込まれる。
実施例１１：ＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞におけるグルコース代謝を再誘導する因子の発現の影響
グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド）をコードする導入遺伝子を、ＡＣＴＲポリペプチドを発現する同じＴ細胞及び／又はＮＫ細胞において共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ（例えば、配列番号６８～配列番号７４）である。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で一定期間（例えば、１～４日間）刺激し、続いて、ＡＣＴＲポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子（これらは、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離され得る）をコードするウイルス（例えば、レンチウイルス又はガンマレトロウイルス）で形質導入する。形質導入された細胞に、３～１０日間、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）を補充する。全ての反応を、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。グルコース取り込み測定の場合、細胞を採取し、グルコース取り込みＧｌｏキットを使用してグルコース取り込みについてアッセイする。この発光ベースのアッセイを評価し、データを倍率変化として表す。シーホース（ｓｅａｈｏｒｓｅ）細胞外フラックスアナライザーを使用して、基礎酸素消費率（ＯＣＲ）の変化を捕捉するために、コンプリメンタリー（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）細胞代謝フラックスアッセイを行う。
ＡＣＴＲポリペプチドに加えてグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、グルコース取り込みの増強を示すと予想される。この増強された機能は、代謝適合性の増加を示唆し、免疫細胞の活性にプラスの影響を及ぼす。
実施例１２：ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞におけるグルコース代謝を再誘導する因子の発現の影響
グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド）をコードする導入遺伝子を、ＣＡＲポリペプチドを発現する同じＴ細胞及び／又はＮＫ細胞において共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ（例えば、配列番号６８～配列番号７４）である。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で一定期間（例えば、１～４日間）刺激し、続いて、ＣＡＲポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子（これらは、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離され得る）をコードするウイルス（例えば、レンチウイルス又はガンマレトロウイルス）で形質導入する。形質導入された細胞に、３～１０日間、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）を補充する。全ての反応を、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。グルコース取り込み測定の場合、細胞を採取し、グルコース取り込みＧｌｏキットを使用してグルコース取り込みについてアッセイする。この発光ベースのアッセイを評価し、データを倍率変化として表す。シーホース細胞外フラックスアナライザーを使用して、基礎酸素消費率（ＯＣＲ）の変化を捕捉するために、コンプリメンタリー細胞代謝フラックスアッセイを行う。
ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース代謝産物を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、グルコース取り込みの増強を示すと予想される。この増強された機能は、代謝適合性の増加を示唆し、免疫細胞の活性にプラスの影響を及ぼす。
実施例１３：ＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞における乳酸産生を再誘導する因子の発現の影響
乳酸産生を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド）をコードする導入遺伝子を、同じＴ細胞及び／又はＮＫ細胞において、ＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ（例えば、配列番号６８～配列番号７４）である。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で一定期間（例えば、１～４日間）刺激し、続いて、ＡＣＴＲポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子（これらは、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離される）をコードするウイルス（例えば、レンチウイルス又はガンマレトロウイルス）で形質導入する。形質導入された細胞に、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）を補充し、３～１０日間、刺激剤（例えば、ＰＭＡ及び／又はイオマイシン）を更に補充する。全ての反応を、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。細胞を回収し、乳酸グローアッセイを使用して乳酸産生についてアッセイする。この発光ベースのアッセイを評価し、データを倍率変化として表した。
ＡＣＴＲポリペプチドに加えて乳酸産生を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、増強された乳酸産生を示すと予想される。この増強された機能は、代謝適合性の増加を示唆し、免疫細胞の活性にプラスの影響を及ぼす。
実施例１４：ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞における乳酸産生を再誘導する因子の発現の影響
乳酸産生を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド）をコードする導入遺伝子を、同じＴ細胞及び／又はＮＫ細胞において、ＣＡＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ（例えば、配列番号６８～配列番号７４）である。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で一定期間（例えば、１～４日間）刺激し、続いて、ＣＡＲポリペプチド及びグルコース代謝産物を再誘導する因子（これらは、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離される）をコードするウイルス（例えば、レンチウイルス又はガンマレトロウイルス）で形質導入する。形質導入された細胞に、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）を補充し、３～１０日間、刺激剤（例えば、ＰＭＡ及び／又はイオマイシン）を更に補充する。全ての反応を、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。細胞を回収し、乳酸グローアッセイを使用して乳酸産生についてアッセイする。この発光ベースのアッセイを評価し、データを倍率変化として表した。
ＣＡＲポリペプチドに加えて乳酸産生を再誘導する因子を発現するＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、増強された乳酸産生を示すと予想される。この増強された機能は、代謝適合性の増加を示唆し、免疫細胞の活性にプラスの影響を及ぼす。
実施例１５：レトロウイルス粒子の産生
１日目に、１２×１０６個の低継代数ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に、１５ｃｍのコーティングされた組織培養プレートに播種した。翌日（すなわち、２日目に）、細胞は、８０％コンフルエントであった。３日目に、細胞を、トランスフェクションに供した。１０μｇのＧＡＧ／Ｐｏｌ、６．６μｇのＧＡＬＶヘルパー、２０μｇの導入プラスミド、及び７４μｌのＰＥＩＰｒｏトランスフェクション試薬（カタログ番号１１５－０１０、ＰｏｌｙＰｌｕｓ）を含有する３ｍｌのトランスフェクションミックスを調製し、細胞培養プレートに添加した。トランスフェクションした細胞に、トランスフェクションの６時間後、１０％ＦＢＳ培地を含有する新鮮なＤＭＥＭ培地を補充した。ウイルス上清を、トランスフェクション２４時間後及び３６時間後に回収し、０．４５μｍフィルターを通して濃縮し、更なる使用まで－８０℃で保管した。
実施例１６：免疫細胞の惹起及び形質導入
免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞）は、新鮮な血液試料から単離されるか、又は細胞株に由来する。
免疫細胞を含有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅを使用した密度勾配法により単離した。簡潔に述べると、等量の全血及びＰＢＳを反転させて慎重に混合し、Ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ上に重層し、続いて、室温で、４００ｇで３０分間遠心分離した。ＰＢＭＣをバフィー層から回収した（Ｌｏｗ ａｎｄ Ｗａｎ Ａｂａｓ，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ，２０１５：２３９３６２（２０１５）を参照）。形質導入の前の２日目までに、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で刺激した。
ＮＫ－９２細胞株を、ＮＫ細胞の機能の評価に使用した。１×１０６個のＮＫ－９２細胞を、Ｔ７５フラスコで増殖させ、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中、ＩＬ－２（１００ＵＩ／ｍｌ）で刺激した。４８時間ごとに、ＩＬ－２（１００ＵＩ／ｍｌ）を補充することによって、細胞を１週間維持した。
グルコース代謝産物を再誘導する因子（例えば、ポリペプチド）をコードする導入遺伝子を、同じ免疫（ＮＫ及び／又はＴ）細胞において、ＡＣＴＲ（表７を参照）又はＣＡＲ（表８～表１１を参照）ポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＫＭ２、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｅバリアント、ＰＫＭ２ Ｙ１０５Ｄバリアント、ＰＫＭ２ Ｋ４２２Ｒバリアント、ＰＫＭ２ Ｈ３９１Ｙバリアント、ＧＦＰＴ１、又はＴＩＧＡＲ（例えば、配列番号６８～配列番号７４）である。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、ＡＣＴＲ又はＣＡＲポリペプチドをコードするウイルスで形質導入した。グルコース代謝産物を再誘導する因子は、例えば、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離された。簡単に説明すると、１×１０６細胞を、１ｍｌのウイルス上清（実施例１を参照）と２ｍｌの総体積で混合し、１２００ｇで４５分間遠心分離した後、２４ウェルプレートに播種した。次いで、細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。ＮＫ－９２を形質導入された細胞の場合、培養物を、４８時間ごとに、その増殖について監視し、４８時間ごとに、ＩＬ－２（１００ＵＩ／ｍｌ）を補充することによって、０．５×１０６細胞／ｍｌの最終濃度に分割した。
形質導入された免疫細胞を、免疫ブロットによって、導入遺伝子の発現について評価した。形質導入された細胞（例えば、ＮＫ－９２）を、室温で、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって回収した。上清を除去し、細胞ペレットを１×ＰＢＳで２回洗浄した後、液体窒素中で急速冷凍し、更なる使用まで－８０℃で保管した。その後、細胞ペレットを、１×ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ番号７８４３０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含有する２００μｌのＳＤＳ溶解緩衝液（カタログ番号ＮＰ０００８；Ｎｏｖｅｘ）中で溶解させ、続いて、超音波処理した。懸濁液を、室温で、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、総タンパク質を含有する上清を回収した。Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍタンパク質アッセイ（カタログ番号１８６１４２６；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、総タンパク質濃度を測定し、続いて、イムノブロッティングを行った。１０μｇの総タンパク質を、Ｎｏｖｅｘ（商標）４～１２％Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｐｌｕｓ、１．０ｍｍ、２０ウェルのＭｉｄｉタンパク質ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の各レーンにロードし、Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用してＰＶＤＦ膜に転写し、ＬＩＣＯＲブロッキング緩衝液を使用して、室温で１時間ブロッキングした。膜を、マウス抗アクチン（３７００Ｓ、ＣＳＴ；希釈１：２０００）、ウサギ抗ＴＩＧＡＲ（１４７５１Ｓ ＣＳＴ；希釈１：１０００）、及びウサギ抗Ｇｏｔ２（ＮＢＰ２３２２４１，Ｎｏｖｕｓ；希釈１：２０００）抗体を使用して、４℃で一晩（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋ＬＩＣＯＲブロッキング緩衝液中）、導入遺伝子（例えば、ＧＯＴ２、ＴＩＧＡＲ）についてプローブした。翌日、膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０洗剤（ｗ／ｖ）を含有する１×ＴＢＳで３回、それぞれ５分間洗浄した。その後、膜を、標準的なウサギ又はマウスの二次抗体（ＬＩＣＯＲ；希釈１：１０，０００）と１時間インキュベートした。膜を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０洗剤（ｗ／ｖ）を含有する１×ＴＢＳで３回、それぞれ５分間洗浄した。イムノブロットをＣＬＸイメージャ（ＬＩＣＯＲ）を使用して画像化し、Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（ｖ５．２；ＬＩＣＯＲ）で処理した。
実施例１７：形質導入された免疫細胞におけるＣＡＲ発現の分析
免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞）を、新鮮な血液試料から単離されるか、又は細胞株に由来し、実施例１６に記載のように形質導入した。形質導入後７日目に、細胞を、室温で、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって回収した。上清を除去し、細胞ペレットを、１×ＰＢＳで２回洗浄し、続いて、Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（カタログ番号Ｌ３４９６６；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）で、室温で１０分間染色した。細胞を、１×ＰＢＳで２回洗浄し、続いて、ＣＡＲ発現を評価するために、２％ＦＢＳを含む１×ＰＢＳ中の一次抗体及び二次抗体で染色した。生存単一細胞を選択し、ＣＡＲ発現を、非形質導入対照（ヌル）と比較して決定した。ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．７．１ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ）を用いて、データを分析した。
ＣＡＲ構築物のみ、又はＴＩＧＡＲ若しくはＧＯＴ２との共発現は、ＮＫ９２細胞（リンパ腫の患者に由来するＩＬ－２依存性ＮＫ細胞株である）において実証されている。７日目に回収した細胞について、導入遺伝子の過剰発現を、免疫ブロットによって分析した（図５参照）。ＧＯＴ２の内因性発現のために、全ての構築物及び対照でＧＯＴ２発現が観察されたが、ＣＡＲとのＧＯＴ２の共発現の場合、より強いバンドが観察された。これらの条件下では、内因性ＴＩＧＡＲの発現は観察されなかった。ＴＩＧＡＲをＣＡＲと共発現させると、強い発現が見られた。加えて、回収した細胞を、ＣＡＲのＦｃ部分に対する組換え抗体で染色し、フローサイトメトリーを使用して、ＮＫ細胞の表面上のＣＡＲの存在を評価した。図６は、全ての構築物がＮＫ９２細胞の表面にＣＡＲが発現されたことを示す。
他の実施形態
本明細書に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特徴は、同一、同等、又は同様の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられ得る。したがって、別段の明示的な記載がない限り、開示された各機能は、一般的な一連の同等又は類似の機能の例にすぎない。
上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な用途及び条件に適応するために本発明の様々な変更及び修正を行うことができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
均等物
いくつかの本発明の実施形態が本明細書に記載され、例示されてきたが、当業者は、機能を実行するための様々な他の手段及び／又は構造、及び／又は本明細書に記載の結果及び／又は１つ以上の利点を得るための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定し、そのような変形及び／又は修正の各々は、本明細書に記載の本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般に、当業者は、本明細書に記載されている全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成が、例示的であることを意図しており、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成が、本発明が使用される特定の用途（複数可）に依存するであろうことを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載される特定の本発明の実施形態に対する多くの均等物を、日常的な実験のみを使用して認識するか、又は確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は、単なる例として提示され、添付の特許請求の範囲及びそれと均等物の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に記載されるか、特許請求されるもの以外で実施されてもよいことを理解されたい。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載の各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法に関する。加えて、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が、相互に矛盾しない場合、本開示の発明の範囲内に含まれる。
本明細書で定義及び使用されるような全ての定義は、辞書定義、参照によって組み込まれる文書中の定義、及び／又は定義された用語の通常の意味を統制するように理解されるものとする。
本明細書に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が引用される主題に関して、参照により組み込まれ、場合によっては文書全体が包含され得る。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、明確にそれに反して示されない限り、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、「及び／又は」という語句は、そのように結合された要素、すなわち、場合によっては連結的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれか又は両方」を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」で列挙される複数の要素は、同じ様式、すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」で解釈されるべきである。「及び／又は」条項によって特異的に特定される要素以外の他の要素は、特異的に特定されるそれらの要素に関連するか、又は関連しないかにかかわらず、任意選択的に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンド言語と併用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、また別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（任意に他の要素を含む）などを指すことができる。
本明細書において、及び特許請求の範囲において本願で使用されるとき、「又は」は、上記で画定された「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「又は」又は「及び／又は」は、包括的であると解釈され、すなわち、要素の数又はリストの少なくとも１つを含むが、１つを超えるもの、及び、任意選択的に、追加のリストされていない項目を含むと解釈される。例えば、「のうちの１つのみ」若しくは「のうちの正確に１つ」、又は、特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」などの、そうでないことが明確に示されている用語のみが、要素の数又はリストの正確に１つの要素の包含を指すであろう。一般に、本明細書で使用される場合、「又は」という用語は、排他性の用語、例えば、「いずれか」、「そのうちの１つ」、「そのうちの１つのみ」、又は「そのうちの正確に１つ」が先行する場合にのみ、排他的代替（すなわち、「１つ又は他方、両方ではない」）を示すものとして解釈されるべきである。「本質的に～からなる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
本明細書において、及び特許請求の範囲において本願で使用されるとき、語句「少なくとも１つ」は、１つ以上の要素のリストに関して、要素のリスト内の要素のうちの任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙され、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外しない各要素の少なくとも１つを含むとは限らない。この画定はまた、具体的に識別される要素に関連するかどうかにかかわらず、語句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で具体的に識別される要素以外の要素が任意選択的に存在し得ることも可能にする。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は同等に、「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、又は同等に、「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つの、任意選択的に、２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（かつ、任意選択的に、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択的に、２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（かつ、任意選択的に、Ａ以外の要素を含む）；また別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択的に、２つ以上のＡ、並びに少なくとも１つの、任意選択的に、２つ以上のＢを含む（かつ、任意選択的に、他の要素を含む）；などを指すことができる。
また、明確に反対が示されない限り、２つ以上のステップ又は行動を含む本明細書に特許請求される任意の方法において、方法のステップ又は行為の順序は、必ずしも方法のステップ又は行為が列挙される順序に限定されないことも理解されるべきである。

Claims (29)

  1. 同じタイプの天然の免疫細胞と比較してグルコース代謝が変化した遺伝子操作された免疫細胞であって、前記免疫細胞が、
    （ｉ）解糖経路からグルコース代謝産物を転用又は再誘導する、ポリペプチドと、
    （ｉｉ）キメラ受容体ポリペプチドであって、前記キメラ受容体ポリペプチドが、
    （ａ）細胞外標的結合ドメイン、
    （ｂ）膜貫通ドメイン、及び
    （ｃ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む、キメラ受容体ポリペプチドと、を発現又は過剰に発現する、遺伝子操作された免疫細胞。
  2. グルコース代謝産物を転用又は再誘導する前記ポリペプチド（ｉ）が、ピルビン酸キナーゼ筋アイソザイムＭ２（ＰＫＭ２）、グルタミン－フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ１（ＧＦＰＴ１）、並びにＴＰ５３誘導性解糖及びアポトーシス調節因子（ＴＩＧＡＲ）からなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  3. グルコース代謝産物を転用又は再誘導する前記ポリペプチドが、ＴＩＧＡＲである、請求項２に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  4. 前記キメラ受容体ポリペプチドが、以下の特徴：
    （ｉ）前記キメラ受容体ポリペプチドが、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを更に含むか、又は共刺激シグナル伝達ドメインを含まないこと、
    （ｉｉ）前記細胞質シグナル伝達ドメイン（ｃ）が、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むこと、
    （ｉｉｉ）前記細胞質シグナル伝達ドメイン（ｃ）が、前記キメラ受容体ポリペプチドのＣ末端に位置すること、
    （ｉｖ）前記キメラ受容体ポリペプチドが、（ａ）のＣ末端及び（ｂ）のＮ末端に位置するヒンジドメインを更に含むこと、
    （ｖ）前記キメラ受容体ポリペプチドが、いずれのヒンジドメインも含まないこと、並びに
    （ｖｉ）前記キメラ受容体ポリペプチドが、そのＮ末端にシグナルペプチドを更に含むこと、のうちの１つ以上を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  5. 前記キメラ受容体ポリペプチドが、好ましくは、キメラ受容体抗原（ＣＡＲ）ポリペプチドであり、（ｉｉ）（ａ）が、細胞外抗原結合ドメインである、請求項３又は４に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  6. （ｉｉ）（ａ）の前記細胞外抗原結合ドメインが、腫瘍抗原、病原性抗原、又は自己抗原に特異的な免疫細胞に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は単一ドメイン抗体である、請求項５に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  7. （ｉｉ）（ａ）の前記細胞外抗原結合ドメインが、血液腫瘍又は固形腫瘍に関連する前記腫瘍抗原に結合する、請求項６に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  8. （ｉｉ）（ａ）の前記細胞外抗原結合ドメインが、細菌抗原、ウイルス抗原、又は真菌抗原である前記病原性抗原に結合する、請求項６に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  9. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６Ａ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ２Ｂ、ＣＤ２、ＩＬ１５、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ２１、ＤＮＡＭ－１、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６からなる群から選択される膜タンパク質のものである、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  10. 前記キメラ受容体ポリペプチドが、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含み、それが、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ８α、２Ｂ４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、ＣＤ２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＪＡＭＡＬ又はそれらの機能性バリアントからなる群から選択される共刺激分子のものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  11. 前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン又は４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  12. 前記キメラ受容体ポリペプチドが、２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  13. （ｉ）前記共刺激シグナル伝達ドメインのうちの１つが、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインであり、前記共刺激ドメインの他方が、ＣＤ８α、４－１ＢＢ、２Ｂ４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、ＣＤ２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＪＡＭＡＬ共刺激シグナル伝達ドメインからなる群から選択されるか、
    （ｉｉ）前記共刺激シグナル伝達ドメインのうちの１つが、ＣＤ８α共刺激シグナル伝達ドメインであり、前記共刺激ドメインの前記他方が、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、２Ｂ４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、ＣＤ２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＪＡＭＡＬ共刺激シグナル伝達ドメインからなる群から選択されるか、又は
    （ｉｉｉ）前記共刺激シグナル伝達ドメインのうちの１つが、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインであり、前記共刺激ドメインの前記他方が、ＣＤ８α、ＣＤ２８、２Ｂ４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、ＣＤ２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＪＡＭＡＬ共刺激シグナル伝達ドメインからなる群から選択される、請求項１２に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  14. （ｃ）の前記細胞質シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ又はＦｃεＲ１γの細胞質ドメインである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  15. 前記キメラ受容体ポリペプチドが、前記ヒンジドメイン（ｉｖ）を含み、それが、ＣＤ２８、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ８α、ＩｇＧ、マウスＣＤ８α、及びＤＡＰ１２のリストから選択されるヒンジドメインである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  16. 前記免疫細胞が、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  17. 前記免疫細胞が、αβ Ｔ細胞であり、前記キメラ受容体ポリペプチドが、表８に示される成分を含むＣＡＲポリペプチドである、請求項１６に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  18. 前記免疫細胞が、ＮＫ細胞であり、前記キメラ受容体ポリペプチドが、表９に示される成分を含むＣＡＲポリペプチドである、請求項１６に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  19. 前記免疫細胞が、γδ Ｔ細胞であり、前記キメラ受容体ポリペプチドが、表１０に示される成分を含むＣＡＲポリペプチドである、請求項１６に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  20. （ｉ）前記免疫細胞が、細胞株に由来するか、又は
    （ｉｉ）前記免疫細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、臍帯血幹細胞、若しくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  21. 前記免疫細胞が、核酸又は核酸セットを含み、それが、集合的に、
    （Ａ）グルコース代謝産物を転用又は再誘導する因子をコードする、第１のヌクレオチド配列と、
    （Ｂ）前記キメラ受容体ポリペプチドをコードする、第２のヌクレオチド配列と、を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  22. 前記免疫細胞が、前記第１のヌクレオチド配列及び前記第２のヌクレオチド配列の両方を含む前記核酸を含む、請求項２１に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  23. 前記核酸が、前記第１のヌクレオチド配列と前記第２のヌクレオチド配列との間に位置する第３のヌクレオチド配列を更に含み、前記第３のヌクレオチド配列が、リボソームスキッピング部位、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、又はプロモーターをコードする、請求項２１又は２２に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  24. 前記核酸又は核酸セットが、１つ以上のウイルスベクター内に含まれる、請求項２３に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
  25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞を含む、薬学的組成物。
  26. 対象において標的抗原を発現する細胞を阻害するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項１～２４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団又は請求項２５に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団を含む薬学的組成物を投与することを含む、方法。
  27. 前記対象が、がんに罹患しているヒト患者であり、前記標的抗原が、腫瘍抗原であり、前記がんが、がん腫、リンパ腫、肉腫、芽腫、及び白血病からなる群から選択され、好ましくは、
    （ｉ）前記がんが、Ｂ細胞起源のがん、乳がん、胃がん、神経芽腫、骨肉腫、肺がん、皮膚がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓がん、頭頸部がん、網膜芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓がん、及び甲状腺がんからなる群から選択されるか、又は
    （ｉｉ）前記Ｂ細胞起源のがんが、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項２６に記載の対象において標的抗原を発現する細胞を阻害するための方法。
  28. 核酸又は核酸セットであって、集合的に、
    （Ａ）請求項１～３のいずれか一項に記載のグルコース代謝産物を転用又は再誘導する因子をコードする、第１のヌクレオチド配列と、
    （Ｂ）請求項４～２４のいずれか一項に記載のキメラ受容体ポリペプチドをコードする、第２のヌクレオチド配列と、を含む、核酸又は核酸セット。
  29. インビボで改変された免疫細胞を生成するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項２８に記載の核酸又は核酸セットを投与することを含む、方法。
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