JP2024534643A - 抗ＴＧＦβ１、２、３抗体及びその治療的使用 - Google Patents

Abstract

本開示は、新規の抗ＴＧＦβ１、２、３抗体及びそれをコードするポリヌクレオチドを包含する。本開示は、本５発明の新規の抗体及び／又はヌクレオチドの、ＴＧＦβ関連障害の治療及び／又は予防のための、特にイヌ科動物及びネコ科動物の線維症関連障害の管理のための使用を更に提供する。【選択図】なし

Description

本出願は、モノクローナル抗体、それらの産生方法、及びそれらの抗体の治療的使用に関する。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ、ＴＧＦＢ、ＴＧＦｂ、又はＴＧＦベータ）を対象とする。他の実施形態では、抗体は、キメラ又は生物種化された抗体である。他の実施形態では、本発明の抗体を含む治療方法が開示される。

形質転換成長因子ベータ（本明細書で互換的に使用される、ＴＧＦＢ、ＴＧＦβ、又はＴＧＦベータ）は、増殖、分化、生存、移動、及び上皮間葉転移を含む多くの主要な細胞機能を制御するサイトカインである。それは、ＴＧＦβ、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長分化因子、阻害剤、及びアクチビンを含む３８種のサイトカインのスーパーファミリーのメンバーである。ＴＧＦβタンパク質は、細胞外マトリックス形成、創傷治癒、胚発生、骨発生、造血、免疫及び炎症応答、並びに悪性形質転換などの多様な生物学的プロセスを調節する。ＴＧＦβの調節解除は、先天性異常、がん、慢性炎症、自己免疫性及び線維性疾患を含む病理学的状態に繋がる。

ＴＧＦβには３つの既知のアイソフォーム、ＴＧＦβ１、２、及び３がある。３つのアイソフォームは全て、最初にプロペプチドとして翻訳される。アイソフォームは、二量体複合体を形成する大型前駆体タンパク質（プロＴＧＦβ）として小胞体で合成され、その後、カルボキシ末端の近くで開裂され、３つのＴＧＦβアイソフォームにわたって６０～８０％の保存性を共有する成熟１１２－アミノ酸ポリペプチドが得られる。成熟ＴＧＦβ二量体は、不活性潜在型複合体として、前駆体の開裂された潜在型ペプチド部分と会合したままである。小潜在型複合体（ＳＬＣ）を形成する潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）に結合した新たに合成されたＴＧＦβは、生物学的に不活性であり、その受容体であるＴＧＦβＲＩＩに結合することができない。ジスルフィド結合の形成を通じて、この複合体は、潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）に緩く結合して、大潜在型複合体（ＬＬＣ）を形成する。次いで、ＴＧＦβは潜在型状態で分泌され、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に保存される。ＴＧＦβの活性化は、ＴＧＦβシグナル伝達の開始のためのその細胞表面受容体への結合を可能にする、インテグリン、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、活性酸素種（ＲＯＳ）、プラスミン、及び酸を含む多数の異なる因子への曝露後の潜在型複合体からの放出を伴う。

ＴＧＦβ１、２、及び３は、その機能において多面的であり、細胞及び組織型にわたって異なるパターンで発現される。それらは、同様のインビトロ活性を有するが、特定の細胞型における個々のノックアウトは、同じ受容体に結合するためのそれらの共有能力にもかかわらず、インビボでの非同一の役割を示唆する（Ａｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ（２０１２）１１（１０）：７９０－８１１）。ＴＧＦβがＴＧＦβＲＩＩに結合すると、受容体の構成的キナーゼ活性がＴＧＦβＲＩをリン酸化して活性化し、それによりＳＭＡＤ２／３をリン酸化して、ＳＭＡＤ４との会合を可能にする。この複合体は核に局在し、ＴＧＦβ応答性遺伝子の転写因子として機能する。この古典的シグナル伝達カスケードに加えて、非古典的経路は、ｐ３８、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＪＵＮ、ＪＮＫ、及びＮＫ－ＫＢを含む他の因子を介してシグナルを伝達する。最終的な結果は、細胞の状態及び環境を統合するこれらの全てのシグナル伝達経路のクロストークである。

多くの重症疾患は、ＴＧＦβ誘導シグナル伝達経路の機能不全と関連している。本発明は、イヌ科動物とネコ科動物との両方の慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）の潜在的な治療を対象とする。ＣＫＤは、長期にわたる進行プロセスに起因する機能的腎臓組織の喪失を伴う。腎臓の構造的及び機能的変化は、緩やかに相関するに過ぎないが、腎臓の構造の劇的な変化が見られる可能性がある。疾患は、それが臨床的に明らかになる前に、通常、数ヶ月又は数年にわたって存在し、それは必ず不可逆的である。先天性疾患は、３歳超の動物の有病率の一過性の増加をもたらすが、５～６歳以降の年齢の進行に伴い、有病率は増加する。高齢集団において、ＣＫＤは、イヌ科動物のうちの１０％及びネコ科動物のうちの４０～８０％に影響を及ぼしている。獣医学の分野では、ＴＧＦβタンパク質の過剰産生によって影響される状態であることが示唆される、イヌ科動物とネコ科動物との両方におけるＣＫＤを治療するための明確で満たされていない必要性が存在する。

本発明は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に結合する新規の抗形質転換成長因子ベータ（本明細書で定義され、互換的に使用される、ＴＧＦＢ、ＴＧＦベータ、ＴＧＦｂ、又はＴＧＦβ）抗原結合タンパク質（本明細書で定義され、互換的に使用される抗体、抗体断片、アンタゴニスト抗体）を提供する。本発明の抗原結合タンパク質は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３のその受容体への結合を予防することにより、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３の生物学的活性をブロッキングし、結合に関連する経路の活性化を予防する。追加的に、本発明は、本発明の抗体のアンタゴニスト作用が、本明細書で定義されるようなＴＧＦβ関連障害を予防及び／又は治療することを提供する。本発明は、本発明の抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド、並びにベクター及び宿主細胞の産生を更に提供する。本発明は、当該抗体／抗原結合タンパク質を作製及び使用する方法、並びに本発明の抗体を投与することによって、イヌ科動物及びネコ科動物におけるＴＧＦβ障害を治療する治療の方法を更に提供する。

一態様では、本発明は、イヌ科動物ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に特異的に結合し、かつ配列番号２３、配列番号３３、及び配列番号３９を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、それらのバリアントと、を含む抗体を提供し、当該抗体は、配列番号７７に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むイヌ科動物ＩｇＧＢ定常領域を更に含む。

一態様では、本発明は、イヌ科動物ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に特異的に結合し、かつ配列番号４２～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６７～７０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む抗体を提供する。

一実施形態では、抗体はイヌ科動物化抗体を含む。

一態様では、本発明は、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列番号２３、配列番号３３、及び配列番号３９と、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列番号３、配列番号４、及び配列番号５と、それらのバリアントと、を含むネコ科動物ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に特異的に結合する抗体を提供し、当該抗体は、配列番号７５に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むネコ科動物ＩｇＧ１ａ定常領域を含む。

一態様では、本発明は、ネコ科動物ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に特異的に結合する抗体を提供し、抗体は、
ａ．可変重鎖（ＶＨ）であって、
ｉ．配列番号２２（Ｇ－Ｙ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｓ－Ｎ－Ｖ－Ｘ４－Ｘ５）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）であって、
・Ｘ１が、Ｔ又はＧを含み、
・Ｘ２が、Ｆ又はＰを含み、
・Ｘ３が、Ｓ又はＴを含み、
・Ｘ４が、Ｍ又はＩを含み、
・Ｘ５が、Ｈ又はＳを含む、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、
ｉｉ．配列番号３２（Ｘ６－Ｖ－Ｉ－Ｐ－Ｉ－Ｖ－Ｄ－Ｉ－Ａ－Ｘ７－Ｙ－Ａ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｇ－Ｒ）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）であって、
・Ｘ６が、Ｇ、Ｙ、又はＳを含み、
・Ｘ７が、Ｎ、Ｙ、又はＴを含み、
・Ｘ８が、Ｑ又はＲを含み、
・Ｘ９が、Ｒ又はＳを含み、
・Ｘ１０が、Ｆ又はＶを含み、
・Ｘ１１が、Ｋ又はＱを含む、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、
ｉｉｉ．配列番号３８（Ａ－Ｘ１２－Ｔ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｖ－Ｌ－Ｄ－Ａ－Ｍ－Ｄ－Ｙ）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）であって、
・Ｘ１２が、Ｒ又はＳを含む、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、可変重鎖（ＶＨ）と、
ｂ．軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
ｉ．配列番号３を含むアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、
ｉｉ．配列番号４を含むアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、
ｉｉｉ．配列番号５を含むアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、
１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそれらの任意のバリアントと、を含み、当該抗体は、配列番号７５に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むネコ科動物ＩｇＧ１ａ定常領域を含む。

一実施形態では、本発明は、配列番号８７～９４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６～１３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）と、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそれらの任意のバリアントと、を含む抗体を提供する。

一実施形態では、本発明は、ネコ科動物化抗体を含む抗体を提供する。

一実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、四量体抗体、四価抗体、多重特異性抗体、ドメイン特異的抗体、ドメイン欠失抗体、融合タンパク質、ＳｃＦｃ融合タンパク質、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ＳｃＦｖ断片、Ｆｄ断片、単一ドメイン抗体、ｄＡｂ断片、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）ナノボディ、及びＩｇＮＡＲ分子からなる群から選択される抗体を提供する。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体を含む。

１つ以上の実施形態では、本発明は、ＴＧＦβ関連障害の治療に使用するための抗体を提供する。一実施形態では、ＴＧＦβ関連障害は、線維症障害、結合組織障害、骨障害、及び細胞増殖障害からなる群から選択される。一実施形態では、ＴＧＦβ関連障害は、線維症障害を含む。一実施形態では、線維症障害は、腎臓線維症／慢性腎臓疾患、肺線維症、肝硬変、グリア瘢痕、及び全身性硬化症／強皮症からなる群から選択される。一実施形態では、ＴＧＦβ関連障害は腎臓線維症／慢性腎臓疾患である。

一態様では、本発明は、治療有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む薬学的組成物を提供する。

一態様では、本発明は、ＴＧＦβ関連障害について対象を治療する方法であって、治療量の本発明の薬学的組成物を当該対象に投与することによって治療する、方法を提供する。一実施形態では、対象は、イヌ科動物を含む。一実施形態では、対象は、ネコ科動物を含む。１つ以上の実施形態では、ＴＧＦβ関連障害は、線維症障害、結合組織障害、骨障害、及び細胞増殖障害からなる群から選択される。一実施形態では、ＴＧＦβ関連障害は、線維症障害を含む。一実施形態では、線維症障害は、腎臓線維症／慢性腎臓疾患、肺線維症、肝硬変、グリア瘢痕、及び全身性硬化症／強皮症からなる群から選択される。一実施形態では、ＴＧＦβ障害は、腎臓線維症／慢性腎臓疾患である。

一態様では、本発明は、本発明の薬学的組成物を投与することによって、対象におけるＴＧＦβ１、２、及び３活性を阻害する方法を提供する。一実施形態では、対象は、イヌ科動物を含む。一実施形態では、対象は、ネコ科動物を含む。

一態様では、本発明は、本発明の１つ以上の抗体、及び保存的アミノ酸置換をもたらす１つ以上の核酸置換を有するその任意のバリアントをコードする核酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する、単離された核酸配列を提供する。

一態様では、本発明は、本発明の１つ以上の抗体をコードする単離された核酸配列を提供し、当該配列は、配列番号５５～６６に対して９５％の配列同一性を有するＶＨをコードするヌクレオチド配列と、配列番号７１～７４に対して９５％の配列同一性を有するＶＬをコードするヌクレオチド配列を含み、および、保存的アミノ酸置換をもたらす１つ以上の核酸置換を有するそれらの任意のバリアントを含む核酸配列を提供する。

一態様では、本発明は、本発明の１つ以上の抗体をコードする単離された核酸配列を提供し、当該配列は、配列番号９７～１０４に対して９５％の配列同一性を有するＶＨをコードするヌクレオチド配列と、配列番号１４～２１に対して９５％の配列同一性を有するＶＬをコードするヌクレオチド配列を含み、および、保存的アミノ酸置換をもたらす１つ以上の核酸置換を有するそれらの任意のバリアントとを含む核酸配列を提供する。

一態様では、本発明は、本発明の核酸のうちのいずれか１つ以上を含むベクターを提供する。

一態様では、本発明は、本発明の核酸のうちのいずれか１つ以上を含む宿主細胞を提供する。

一態様では、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。

一態様では、本発明は、本発明の抗体を産生する宿主細胞を提供する。

一態様では、本発明は、抗体の産生をもたらす条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞又は宿主細胞の培養培地から抗体を単離することによって、本発明の抗体を産生する方法を提供する。

抗原結合部位を強調する天然マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の一般構造を表す。 マウス：イヌ科動物ＩｇＧの一実施形態の一般構造の略図である。 ヘテロキメラ分子を表す。 マウスＩｇＧの生物種化又はイヌ科動物化を表す。

配列の簡単な説明
・配列番号１ ネコ科動物／ヒトキメラ抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨアミノ酸配列
・配列番号２ ネコ科動物／ヒトキメラ抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ核酸配列
・配列番号３ 抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列
・配列番号４ 抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列
・配列番号５ 抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列
・配列番号６ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ１アミノ酸配列
・配列番号７ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ２アミノ酸配列
・配列番号８ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ３アミノ酸配列
・配列番号９ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ４アミノ酸配列
・配列番号１０ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ５アミノ酸配列
・配列番号１１ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ６アミノ酸配列
・配列番号１２ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ７アミノ酸配列
・配列番号１３ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ８アミノ酸配列
・配列番号１４ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ１核酸配列
・配列番号１５ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ２核酸配列
・配列番号１６ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ３核酸配列
・配列番号１７ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ４核酸配列
・配列番号１８ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ５核酸配列
・配列番号１９ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ６核酸配列
・配列番号２０ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ７核酸配列
・配列番号２１ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ８核酸配列
・配列番号２２ 抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸フォーミュラ
・配列番号２３ 抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列
・配列番号２４ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸：ＶＨ８、ＶＨ２．８、ＶＨ３．８
・配列番号２５ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸：ＶＨ９
・配列番号２６ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸：ＶＨ４
・配列番号２７ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸：ＶＨ３
・配列番号２８ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸：ＶＨ３．２
・配列番号２９ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸：ＶＨ２．１
・配列番号３０ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸：ＶＨ６．１
・配列番号３１ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸：ＶＨ２．２
・配列番号３２ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸：フォーミュラ
・配列番号３３ 抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸
・配列番号３４ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸：ＶＨ８、ＶＨ４，３、ＶＨ２．１、ＶＨ６．１、ＶＨ２．８、ＶＨ３．８
・配列番号３５ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸：ＶＨ９
・配列番号３６ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸：ＶＨ３．２
・配列番号３７ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸：ＶＨ２．２
・配列番号３８ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸：フォーミュラ
・配列番号３９ 抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸
・配列番号４０ ＶＨ８、ＶＨ９アミノ酸配列のネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ３
・配列番号４１ ＶＨ３、ＶＨ３．２、ＶＨ２．２アミノ酸配列のネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ ＣＤＲ３
・配列番号４２ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ２アミノ酸配列
・配列番号４３ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ６アミノ酸配列
・配列番号４４ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３アミノ酸配列
・配列番号４５ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ４アミノ酸配列
・配列番号４６ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ４．１１アミノ酸配列
・配列番号４７ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ５．１０アミノ酸配列
・配列番号４８ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ４．５アミノ酸配列
・配列番号４９ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３．１アミノ酸配列
・配列番号５０ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３．５アミノ酸配列
・配列番号５１ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３．６アミノ酸配列
・配列番号５２ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ４．７アミノ酸配列
・配列番号５３ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ４．１１アミノ酸配列
・配列番号５４ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ５．６アミノ酸配列
・配列番号５５ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ２核酸配列
・配列番号５６ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ６核酸配列
・配列番号５７ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３核酸配列
・配列番号５８ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ４核酸配列
・配列番号５９ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ４．１１核酸配列
・配列番号６０ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ５．１０核酸配列
・配列番号６１ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ４．５核酸配列
・配列番号６２ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３．１核酸配列
・配列番号６３ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３．５核酸配列
・配列番号６４ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３．６核酸配列
・配列番号６５ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ４．７核酸配列
・配列番号６６ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ５．６核酸配列
・配列番号６７ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ１アミノ酸配列
・配列番号６８ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ２アミノ酸配列
・配列番号６９ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ３アミノ酸配列
・配列番号７０ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ４アミノ酸配列
・配列番号７１ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ１核酸配列
・配列番号７２ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ２核酸配列
・配列番号７３ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ３核酸配列
・配列番号７４ イヌ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＬ４核酸配列
・配列番号７５：ネコ科動物重鎖定常領域ＩｇＧ１ａアミノ酸配列
・配列番号７６：ネコ科動物重鎖定常領域ＩｇＧ１ａ核酸配列
・配列番号７７：イヌ科動物重鎖定常領域ＩｇＧＢアミノ酸配列
・配列番号７８ イヌ科動物重鎖定常領域ＩｇＧＢ核酸配列
・配列番号７９ ＧＣ１００８ ＶＨアミノ酸配列
・配列番号８０ ＧＣ１００８ ＶＬアミノ酸配列
・配列番号８１ イヌ科動物軽鎖定常領域アミノ酸配列
・配列番号８２ イヌ科動物軽鎖定常領域核酸配列
・配列番号８３ ネコ科動物軽鎖定常領域アミノ酸配列
・配列番号８４ ネコ科動物軽鎖定常領域核酸配列
・配列番号８５ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３アミノ酸配列
・配列番号８６ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ４アミノ酸配列
・配列番号８７ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ８アミノ酸配列
・配列番号８８ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ９アミノ酸配列
・配列番号８９ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３．２アミノ酸配列
・配列番号９０ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ２．１アミノ酸配列
・配列番号９１ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ６．１アミノ酸配列
・配列番号９２ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ２．２アミノ酸配列
・配列番号９３ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ２．８アミノ酸配列
・配列番号９４ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３．８アミノ酸配列
・配列番号９５ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３核酸配列
・配列番号９６ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ４核酸配列
・配列番号９７ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ８核酸配列
・配列番号９８ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ９核酸配列
・配列番号９９ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３．２核酸配列
・配列番号１００ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ２．１核酸配列
・配列番号１０１ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ６．１核酸配列
・配列番号１０２ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ２．２核酸配列
・配列番号１０３ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ２．８核酸配列
・配列番号１０４ ネコ科動物化抗ＴＧＦβ１、２、３ ＶＨ３．８核酸配列

本明細書に開示される本発明は、高い親和性及び特異性によりＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ２に結合する、抗ＴＧＦβ抗体／抗体断片（用語は互換的に使用される）を提供する。本発明は、当該抗体のバリアントである、本明細書に記載されるＴＧＦβ１、２、及び３タンパク質又はポリペプチドにも結合する抗体及びポリペプチド、並びに当該抗体を作製及び使用する方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、本発明はまた、当該抗体及び／又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書に開示される本発明はまた、治療有効量の本明細書に記載される本発明の抗ＴＧＦβ１、２、及び３抗体並びにそれぞれのバリアントの投与による、線維症障害、結合組織障害、骨障害、及び細胞増殖障害の群から選択されるＴＧＦβ関連障害を予防及び／又は治療するための方法を提供する。

一般的な技法及び定義
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、それ自体が変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。別段に定義されない限り、本明細書に記載の本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって別段の必要がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質及びオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの化学及びハイブリダイゼーションと関連して利用される専門用語及びそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されている。異なる技法が記載されているものに置き換えられ得ることは、当該技術分野で周知である。

特定された全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を記載し、開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。

当業者に周知の他の多くの一般的に使用される技法のうち、標準的な技法が組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド合成、組織培養、細胞のトランスフェクション及び形質転換に使用される。当業者に周知の一般的な技法は、製造業者の仕様に従って、又は当該技術分野で一般的に達成されるように、又は本明細書に記載されるように実施される。

本発明を詳細に説明する前に、本発明の文脈において使用されるいくつかの用語を定義する。これらの用語に加えて、他の用語は、必要に応じて本明細書の他の場所で定義される。上記及び本開示を通じて用いられる場合、以下の用語及び略語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有するものと理解されるものとする。本明細書で別段明示的に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語は、それらの技術分野で認識される意味を有する。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」といった単数形は、文脈上別段明らかに指示されない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「抗体」への言及は、複数のそのような抗体を含む。

本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいた（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「からなる」、「からなっていた」、「から本質的になる」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいた（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの用語は、標準的な米国特許法及び国際的な特許法の慣行に従って定義されることに留意されたい。

「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために用いられるデバイス又は方法に関する誤差の標準偏差を含むことを示すために本明細書で使用される。「少なくとも約」という用語は、範囲の下限を示すために本明細書で使用される。例えば、「少なくとも約９５％の配列同一性を有する」という用語の場合、当業者には、これが９５％から１００％の配列同一性を含むことが明らかであるはずである。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されない限り、又は代替物が互いに排他的である場合を除き、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみを指す定義及び「及び／又は」を指す定義を支持する。

「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされたもの、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、限定されないが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能する化学化合物を指す。

アミノ酸は、本明細書において、一般に知られている３文字記号、又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号のいずれかによって言及されることがある。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に受け入れられている１文字コードによって言及されることがある。ポリペプチド構造などの巨大分子構造は、様々なレベルの組織化の観点から説明され得る。「一次構造」はペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」は、ポリペプチド内の局所的に規則正しい三次元構造を指す。これらの構造は、ドメイン、例えば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細孔ドメイン、又は細胞質尾部ドメインとして一般的に知られている。ドメインは、ポリペプチドのコンパクトな単位を形成するポリペプチドの部分である。例示的なドメインとしては、酵素活性を有するドメインが挙げられる。ドメインは、βシートの伸長部及びαヘリックスなどのより小さな組織化切片で構成され得る。「三次構造」は、ポリペプチド単量体の完全な三次元構造を指す。「四次構造」は、独立した三次単位の非共有会合によって形成される三次元構造を指す。

「保存的アミノ酸置換」という用語は、所与のアミノ酸残基に対する任意のアミノ酸置換を示し、置換残基は、所与の残基のものと化学的に非常に類似しているため、ポリペプチド機能（例えば、酵素活性）の実質的な低下は生じない。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野で一般的に知られており、その例は、例えば、米国特許第６７９０６３９号、同第６７７４１０７号、同第６１９４１６７号、又は同第５３５０５７６号に記載されている。好ましい実施形態では、保存的アミノ酸置換は、以下の６つの群のうちの１つ内で生じる任意のものである。
●小さな脂肪族の実質的に非極性の残基：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒ、
●大きな脂肪族の非極性の残基：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌ、Ｍｅｔ、
●負に帯電した極性の残基及びそれらのアミド：Ａｓｐ及びＧｌｕ、
●負に帯電した極性の残基のアミド：Ａｓｎ及びＧｌｎ、Ｈｉｓ、
●正に帯電した極性の残基：Ａｒｇ及びＬｙｓ、Ｈｉｓ、並びに
●大きな芳香族残基：Ｔｒｐ及びＴｙｒ、Ｐｈｅ。

好ましい実施形態では、保存的アミノ酸置換は、天然残基（保存的置換）対として列挙される以下のもののうちのいずれか１つである。Ａｌａ（Ｓｅｒ）；Ａｒｇ（Ｌｙｓ）；Ａｓｎ（Ｇｌｎ；Ｈｉｓ）；Ａｓｐ（Ｇｌｕ）；Ｇｉｎ（Ａｓｎ）；Ｇｌｕ（Ａｓｐ）；Ｇｌｙ（Ｐｒｏ）；Ｈｉｓ（Ａｓｎ；Ｇｌｎ）；Ｉｌｅ（Ｌｅｕ；Ｖａｌ）；Ｌｅｕ（Ｉｌｅ；Ｖａｌ）；Ｌｙｓ（Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ）；Ｍｅｔ（Ｌｅｕ；Ｉｌｅ）；Ｐｈｅ（Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ）；Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）；Ｔｈｒ（Ｓｅｒ）；Ｔｒｐ（Ｔｙｒ）；Ｔｙｒ（Ｔｒｐ；Ｐｈｅ）、及びＶａｌ（Ｉｌｅ；Ｌｅｕ）。

「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状又は分岐状であり得、それは場合により、修飾されたアミノ酸を含み得、それは、非アミノ酸によって中断され得る。これらの用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識化成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作若しくは修飾の、天然で修飾された又は介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、定義内に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、及び当該技術分野で既知の他の修飾を含有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドが抗体に基づくため、ポリペプチドは、一本鎖又は会合鎖として生じ得ることが理解される。

本明細書で使用される場合、「抗体」、「抗原結合タンパク質」などは、抗原に特異的に結合し、かつ認識する免疫グロブリン遺伝子又はその抗体断片によってコードされた領域を含むポリペプチドを指す。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含んでいてもよく、各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対からなり、各対は、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）と、１本の「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）とを有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０個又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖及び可変重鎖という用語は、これらの軽鎖及び重鎖を指す。抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼによる消化によって産生されるいくつかの十分に特徴付けされた断片として存在する。様々な抗体断片は、無傷の抗体の消化の観点から定義されるが、当業者は、そのような断片が、化学的にデノボ合成され得るか、又は組換えＤＮＡ方法論を使用することによってデノボ合成され得るかのいずれかであることを理解するであろう。したがって、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、全抗体の修飾によって産生される抗体断片、又は組換えＤＮＡ方法論を使用してデノボ合成される抗体断片、又は当該技術分野で既知の他の方法を使用して特定される抗体断片のいずれも含む。

本明細書で使用される場合、任意の脊椎動物種からの無傷の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り当てられ得る。全ての軽鎖は、１つの可変ドメイン（Ｖ_L）及び１つの定常ドメイン（Ｃ_L）を含有し、本明細書に記載されるように、抗体のクラス又はアイソタイプを定義するいくつかの異なるタイプの重鎖が存在する。全ての重鎖は、一連の免疫グロブリンドメインを含有し、通常、３つの定常ドメイン（Ｃ_H1、Ｃ_H2、及びＣ_H3）と、抗原の結合に重要な１つの可変ドメイン（Ｖ_H）とを有する。

「可変」領域という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ（別名、「超可変領域」として知られている）を含み、可変ドメインのある特定の部分が抗体間の配列において広範囲に異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均等に分布していない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における、「相補性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）決定領域（ＣＤＲ）」又は「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのうちのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成するループを形成する、３つの超可変領域によって接続されたβシート構成を主に採用する複数のＦＲを含む。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって極めて近接して一緒に保持され、他の鎖からの超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１），ｐａｇｅｓ ６４７－６６９及びＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。定常ドメインは、抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、本明細書に記載されるように、様々なエフェクター機能を示す。

４つのヒトＩｇＧサブクラスの特性は十分に確立されており、各々が異なる特徴を有し、免疫系にかなり異なる関与をする。ヒトＩｇＧサブクラスは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）、及び補体タンパク質Ｃ１ｑを含む免疫エフェクタータンパク質に対するそれらの結合親和性によって分化される。これらの受容体タンパク質は、それぞれ、血清半減期、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）において役割を果たす。これらの受容体に対する親和性は、抗体の機能的特性を特徴付けるためにしばしば使用されている（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。ＦｃγＲ１及びＦｃγＲＩＩＩに対するより高い親和性は、抗体がＡＤＣＣ活性を有することを示すが、一方で、阻害性受容体のＦｃγＲＩＩｂへの結合は、より少ないＡＤＣＣ活性に寄与する（Ｄａｅｒｏｎ，１９９７、Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。同様に、Ｃ１ｑ、補体カスケードにおける第１のタンパク質への結合は、食細胞を活性化し、病原体を破壊するのに役立つ補体活性を示す（Ｓｃｈｉｆｆｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｇａｒｒｅｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＦｃＲｎ結合は、抗体リサイクリングに関連し、インビボ半減期の相関である（Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｉｓｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｐｒａｅｔｏｒ ａｎｄ Ｈｕｎｚｉｋｅｒ，２００２、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，２００７）。ＩｇＧサブクラスの独自の機能は、抗体治療薬の設計を補助する。

１９６７年に、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＶａｕｇｈａｎは、６つのイヌ科動物免疫グロブリンの存在を報告した（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｖａｕｇｈａｎ，１９６７、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９６７）。その後の研究は、ＩｇＧに焦点が絞られ、Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）は、ＩｇＧに富むイヌ科動物血清から４つの画分を単離し、各々をゲル濾過、プロテインＡ／Ｇ結合、及び電気泳動移動度によって分離した。これらの画分を使用して、イヌ科動物ＩｇＧに特異的な抗体試薬を得た（Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。この研究により、様々な疾患状態におけるイヌ科動物ＩｇＧを調査する一連の研究が開始されたが、イヌ科動物免疫グロブリンの機能性及びそれらが免疫エフェクタータンパク質とどのように相互作用するかは依然として不明瞭であった。２００１年に、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）は、これらの疑問の解決を始めるために必要なイヌ科動物ＩｇＧ配列を提供した。ヒトＩｇＧと同様に、イヌ科動物ＩｇＧは４つのサブクラスからなる。受託番号［ＡＦ３５４２６４、ＡＦ３５４２６５、ＡＦ３５４２６６、及びＡＦ３５４２６７］の順によって、Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５７（２０１４）３１－４１）は、これらのイヌ科動物ＩｇＧサブクラスを、それぞれＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤと称した。イヌ科動物のＩｇＧ配列に関連するアルファベット命名法は、体内での有病率に基づく。Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ｅｔ ａｌは、各サブクラスの機能的分析を提供した。

Ｓｔｒｉｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５８（２０１４）２１４－２２３）が、ネコ科動物の脾臓ｃＤＮＡライブラリーから以前に単離されていた２つの既知の配列に関連する機能的特性を開示したときの２０１４年までは、ネコ科動物ＩｇＧについてほとんど知られていなかった。これらの２つのＩｇＧ配列、ＩｇＧ１ａ及びＩｇＧ１ｂは単離されていたが、特徴付けられていなかった（Ｋａｎａｉ，Ｔ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．７３（１），５３－６２）。Ｓｔｒｉｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌは、ＩｇＧ２と称される第３のネコ科動物ＩｇＧ配列を報告し、特定されたネコ科動物ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ及びＣ１ｑとの３つのネコ科動物ＩｇＧの相互作用を記載した。ネコ科動物のカッパ及びラムダ軽鎖領域を、追加的に単離した。

「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、新生児受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方調節などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、一般に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされるようなＦｃ領域を必要とし、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当該技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価され得る。

「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列に対して同一であるアミノ酸配列を含む。天然Ｆｃ領域配列についての配列の非限定的な例は、配列番号７０及び配列番号７２に対して約８０～９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７０を含む天然Ｆｃ領域を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７２を含む天然Ｆｃ領域を含む。本明細書における天然Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９５％の配列同一性を有する。「バリアントＦｃ領域」、又は「変異した」若しくは「変異型」Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、天然配列Ｆｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含み、天然Ｆｃ領域配列と比較して天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を、保持し得るか、又は保持し得ない。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、約１～約１０個アミノ酸置換を有し、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において約１～約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９５％の配列同一性を有する。バリアント又は変異したＦｃ領域はまた、本質的に、抗体のＦｃ領域の機能を排除し得る。バリアント又は変異したＦｃ領域はまた、抗体のＦｃ領域の機能を付加又は増強し得る。例えば、Ｆｃ領域変異は、抗体のエフェクター機能を排除し得る。別の例では、変異したＦｃ領域は、抗体のエフェクター機能を増強し得る。更に別の例では、変異したＦｃ領域は、抗体の特性を決定し得る細胞内の他の因子の半減期を変化させるか、又は結合に影響を及ぼし得る。一実施形態では、本発明の抗体は、変異したＦｃ領域を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７０に対して約８０～９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含むエフェクター機能に影響を及ぼすバリアント又は変異したＦｃ領域を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７２に対して約８０～９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含むエフェクター機能に影響を及ぼすバリアント又は変異したＦｃ領域を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７０を含むアミノ酸配列を含むエフェクター機能に影響を及ぼすバリアント又は変異したＦｃ領域を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７２を含むアミノ酸配列を含むエフェクター機能に影響を及ぼすバリアント又は変異したＦｃ領域を含む。

本明細書で使用される場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、米国特許第５，５００，３６２号又は同第５，８２１，３３７号に記載されるものなど、インビトロＡＤＣＣアッセイを使用して評価され得る。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＮＫ細胞が挙げられる。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９５：６５２－６５６に開示されるものなどの動物モデルにおいて評価され得る。

「補体依存性細胞傷害性」及び「ＣＤＣ」は、補体の存在下における標的の溶解を指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の、同族抗原と複合した分子（例えば、抗体）への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイが実施され得る。

抗体、例えば、組換え、モノクローナル、又はポリクローナル抗体の調製のために、当該技術分野で既知の多くの技法が使用され得る。目的の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を細胞からクローニングし、組換えモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーも使用され得る。重鎖及び軽鎖遺伝子産物のランダムな組み合わせは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する。一本鎖抗体又は組換え抗体を産生する技術は、当該技術分野で見出され、本発明に係るポリペプチドに対する抗体を産生するように適合され得る。ファージディスプレイ技術は、選択された抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロマー断片を特定するためにも使用され得る。抗体はまた、二重特異性、すなわち、２つの異なる抗原を認識することができるか、又はヘテロコンジュゲート、例えば、２つの共有結合した抗体、又は免疫毒素が作製され得る。

「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽（ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結し、一方、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離隔された鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）及びそのもう一方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインとアライメントされ、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインとアライメントされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている。図１は、抗原結合部位を強調する天然マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の一般構造の例である。

本明細書で使用される場合、本明細書で互換的に使用され得る「抗原結合タンパク質」、「抗体」、「アンタゴニスト抗体」、「抗原結合断片」などという用語は、抗原結合部位を含むポリペプチド又はその断片を指す。したがって、単離された抗体又は断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、合成抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヘテロキメラ抗体、イヌ科動物化抗体、ネコ科動物化抗体、完全イヌ科動物抗体、又は完全ネコ科動物抗体であり得る。

いくつかの実施形態では、「抗原結合タンパク質」「抗体」「アンタゴニスト抗体」などという用語は、好ましくは、ＴＧＦβタンパク質及びその断片に結合し得る、モノクローナル抗体及びそれらの断片、並びにそれらの免疫学的結合同等物を指す。例示的な抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ダイアボディ、それらの抗原認識断片、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）ナノボディ、ＩｇＮＡＲ分子、及び抗体又は抗体断片であることが当業者によって認識される同等物、並びに上述の断片及びそれらの化学的又は遺伝子操作された対応物のうちのいずれか、並びに他の抗体断片及びそれらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、並びに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成が挙げられる。抗体及び抗原結合タンパク質は、例えば、これらに限定されないが、従来のハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９９（１９７５））、組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）、若しくは抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ技法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１））、又は当業者によって用いられ、周知である他の技法を介して作製され得る。

本明細書で定義される場合、「モノクローナル抗体」は、単一の純粋な均質タイプの抗体である。産生される全てのモノクローナル抗体は、同一であり、同じ抗原特異性を有する。モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体が、抗原の選択的結合に関与する（天然に存在する、及び非天然に存在する）アミノ酸から構成される、均質な抗体集団である。モノクローナル抗体の集団は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷のモノクローナル抗体及び全長モノクローナル抗体だけでなく、それらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ダイアボディ、それらの抗原認識断片、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）ナノボディ、ＩｇＮＡＲ分子など）、それらの変異型、抗体部分を含む融合タンパク質、並びに必要な特異性の抗原認識部位、及び抗原に結合する能力を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾構成も包含する。抗体の供給源、又は抗体が作製される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物など）に対して限定されることは意図されない。

抗体のパパイン消化は、各々、単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化するその能力を反映する名称である残りの「Ｆｃ」断片とを産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋結合することが可能なＦ（ａｂ’）₂断片をもたらす。

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、密接な非共有性会合における、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、Ｖ_H－Ｖ_L二量体の表面上の抗原結合部位を画定するのは、この構成においてである。集合的に、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりも低い親和性にあるが、抗原を認識しそれに結合する能力を有する。Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端におけるいくつかの残基の付加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する表記である。Ｆ（ａｂ’）₂抗体断片は、元々、ヒンジシステインをそれらの間に有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。

本明細書に記載されるモノクローナル抗体としては、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体中の対応する配列と同一又は相同であり、一方で、残りの鎖が別の種に由来する抗体中の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が挙げられ、かつそれらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片も挙げられる。典型的には、キメラ抗体は、軽鎖及び重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子操作によって、異なる種に属する抗体可変及び定常領域遺伝子から構築されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体（又はネコ科動物を含む任意の他の種の抗体）からの遺伝子の可変セグメントは、イヌ科動物定常セグメント、例えば、配列番号７２によって本明細書で表されるＩｇＧＢイヌ科動物重鎖定常領域（両方がエフェクター機能変異あり及びなしで）、又は配列番号７０によって本明細書で表されるＩｇＧ１ａネコ科動物重鎖定常領域（両方がエフェクター機能変異あり及びなしで）のアミノ酸配列に連結され得る。追加的に、配列番号７５を含むアミノ酸配列、ネコ科動物重鎖定常領域が別の種の抗体（マウス、イヌ科動物、ネコ科動物など）の可変セグメントに連結されることを除いて、キメラネコ科動物抗体は同じ様式で産生される。図２は、マウス：イヌ科動物ＩｇＧの一実施形態の一般構造の概略図である。この実施形態では、抗原結合部位は、マウスに由来するが、一方で、Ｆｃ部分は、イヌ科動物である。この例示は、特許請求される発明をマウス／イヌ科動物のキメラのみに限定するものではなく、本明細書に記載されるように、いくつかを列挙と、イヌ科動物、ネコ科動物、マウス、及びヒトのいずれかの種の抗体の組み合わせにも適用され得る。

本明細書で定義される場合、「ヘテロキメラ」という用語は、抗体鎖（重鎖又は軽鎖）のうちの一方が生物種化（すなわち、イヌ科動物化又はネコ科動物化）され、他方がキメラである抗体を指す。この実施形態では、イヌ科動物化可変重鎖（ＣＤＲのうちの全てがマウスであり、全てのＦＲがイヌ科動物である）は、キメラ可変軽鎖（ＣＤＲのうちの全てがマウスであり、全てのＦＲがマウスである）と対をなす。この実施形態では、可変重鎖と可変軽鎖との両方がイヌ科動物定常領域に融合される。キメラ抗体と同様に、抗体の種及び部分の組み合わせに制限はない。

「イヌ科動物抗体」、「ネコ科動物抗体」、「ヒト抗体」などという用語は、本明細書で使用される場合、標的に対して生成される抗体及び標的種内からのリンパ球から単離された抗体を指す。これらの抗体は、本明細書に記載されるように、標的種の特定の定常領域を含むようにインビトロで組換え修飾されているか、又はそうでなければ組換え修飾されている。

「組換えイヌ科動物抗体」、「組換えネコ科動物抗体」、「組換えヒト抗体」などという語句は、全て、宿主細胞にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組換えの組み合わせイヌ科動物（若しくはネコ科動物、ヒトなど）抗体ライブラリーから単離された抗体、イヌ科動物、ネコ科動物、又は他の種の免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照されたい）などの組換え手段によって調製、発現、作成、若しくは単離された生物種化された抗体、又はイヌ科動物（若しくはネコ科動物、ヒトなど）免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列に組換えることを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作成、若しくは単離された抗体を含む。

簡潔さの目的のために、以下では「イヌ科動物化」抗体を説明するが、しかしながら、それは、ネコ科動物化、ヒト化、又は任意の他の生物種化された抗体に適用され得る。一例として、「イヌ科動物化」は、非イヌ科動物抗原結合領域をドナー抗体からより低い免疫原性のイヌ科動物抗体アクセプタに移送し、イヌにおける治療薬として有用な治療を生じるための方法として定義される。イヌ科動物化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ニワトリ、ウシ、ウマ、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダ、サメ、非ヒト霊長類、ヒト、ヒト化、組換え配列、又は所望の性質、特異性、親和性、及び能力を有する操作された配列などの非イヌ科動物種（ドナー抗体）からの超可変領域残基によって置き換えられるイヌ科動物抗体配列である。更に、イヌ科動物化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体中に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能を更に向上するために行われる。本明細書に記載されるように、超可変領域及び／又はフレームワーク領域への修飾は、当該実験の前に予測することはできないが、当業者に既知の実験に基づいて、各々の別個に操作された生物種化された（イヌ科動物化）抗体について決定される。イヌ科動物化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはイヌ科動物免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の、全体、又はそのうちの少なくとも一部分を含み得る。図４は、マウスＩｇＧの生物種化又はイヌ科動物化を示す一実施形態の図である。この実施形態では、マウスＣＤＲは、イヌ科動物のフレームワーク上に移植される。場合によっては、超可変領域の外側にあるマウスのフレームワーク又はその残基が維持される。抗体のイヌ科動物化の全ての説明、及びイヌ科動物化抗体の全ての説明は、概念的には、それがイヌ科動物化、ネコ科動物化、ヒト化などであるかどうかにかかわらず、任意の「生物種化された」抗体に適用可能であり得る。

本明細書に記載されるような「親」抗体は、バリアントの調製のために使用されるアミノ酸配列によりコードされる抗体である。好ましくは、イヌ科動物化又はイヌ科動物抗体では、親抗体はイヌ科動物のフレームワーク領域を有し、存在する場合、イヌ科動物抗体定常領域を有する。例えば、親抗体は、イヌ科動物化抗体又はイヌ科動物抗体であり得る。同様のことが、ネコ科動物化、ヒト化、ウマ化、ウシ化抗体にも言える。

「復帰変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎ）」という用語は、イヌ科動物抗体の体細胞で変異したアミノ酸のうちの一部又は全てが相同的な生殖細胞系列抗体配列からの対応する生殖細胞系列残基により置き換えられるプロセスを指す。本発明のイヌ科動物抗体の重鎖及び軽鎖配列は、最も高い相同性を有する配列を同定するために生殖細胞系列配列と別個にアライメントされる。本発明のイヌ科動物抗体における差異は、そのような異なるアミノ酸をコードする定義されたヌクレオチド位置を変異させることにより生殖細胞系列配列に戻される。こうして復帰変異のための候補として同定された各アミノ酸の役割が抗原結合における直接的又は間接的な役割について調査されるべきであり、イヌ抗体の任意の望ましい特徴に影響を与える変異の後に見出されるいかなるアミノ酸も最終のイヌ科動物抗体において含まれるべきではなく、例として、選択的な変異誘発アプローチにより同定された活性増強アミノ酸は復帰変異に供されない。復帰変異に供されるアミノ酸の数を最小限に抑えるために、最も近い生殖細胞系列配列とは異なるが第２の生殖細胞系列配列中の対応するアミノ酸に対して同一であることが見出されたそれらのアミノ酸位置は、第２の生殖細胞系列配列が本発明のイヌ科動物抗体の配列に対して同一かつ共直線性であることを条件として、そのままであることができる。対応するドナー残基への選択された標的フレームワーク残基の復帰変異は、親和性を回復及び又は改善させるために必要とされ得る。

「抗原」は、抗体によって結合されることができる分子又は分子の一部分である。一般に、エピトープは、分子、例えば、アミノ酸又は糖側鎖の化学的に活性な表面の分類からなり、特異的な三次元構造特徴及び特異的な電荷特徴を有する。エピトープは、免疫系によって認識されるタンパク質上の抗原決定基である。免疫系のエピトープを認識する成分は、抗体、Ｔ細胞、及びＢ細胞である。Ｔ細胞エピトープは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に表示され、典型的には、８～１１（ＭＨＣクラスＩ）又は１５以上の（ＭＨＣクラスＩＩ）アミノ酸長である。Ｔ細胞による表示されたＭＨＣ－ペプチド複合体の認識は、それらの活性化にとって重要である。これらの機構は、細菌及びウイルスなどの「自己」対「非自己」タンパク質の適切な認識を可能にする。必ずしも隣接していない独立したアミノ酸残基は、ＡＰＣ結合溝との相互作用、及びＴ細胞受容体によるその後の認識に寄与する（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ．５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ；２００１）。可溶性抗体及び細胞表面関連Ｂ細胞受容体によって認識されるエピトープは、長さ及び連続性の程度において大きく異なる（Ｓｉｖａｌｉｎｇａｍ ａｎｄ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；５１（３－４）：３０４－３０９）。再び、線状エピトープ又はタンパク質配列の連続したストレッチに見出されるエピトープでさえも、抗体パラトープ又はＢ細胞受容体との接触の主要な点を表す不連続なアミノ酸を有することが多い。抗体及びＢ細胞によって認識されるエピトープは、三次元空間内のタンパク質上の共通の接触領域を含むアミノ酸と立体配座的であり得、タンパク質の三次及び四次構造特徴に依存する。これらの残基は、一次アミノ酸配列の空間的に異なる領域に見出されることが多い。

本明細書で使用される場合、「ＴＧＦベータ」、「ＴＧＦβ」、及び「ＴＧＦＢ」という用語は、本明細書で互換的に使用される場合、形質転換成長因子ベータタンパク質１（ＴＧＦβ１）、形質転換成長因子ベータタンパク質２（ＴＧＦβ２）及び形質転換成長因子ベータタンパク質３（ＴＧＦβ３）を指す。ＴＧＦβタンパク質は、細胞増殖及び移動、細胞分化、アポトーシス、ＥＣＭ（細胞外マトリックス）産生、並びに免疫調節を調節することによって、創傷治癒に多面的効果を発揮する関連成長因子のスーパーファミリーの一部である。本明細書で使用される場合、本発明の抗体の使用によるＴＧＦβタンパク質の阻害は、線維症障害、骨障害、及び細胞増殖障害などのＴＧＦβ関連障害を治療するために使用される。

本明細書で使用される場合、「抗ＴＧＦβ抗体」は、「抗ＴＧＦβ抗原結合タンパク質」及び「抗ＴＧＦβアンタゴニスト抗体」、「抗ＴＧＦβ抗原結合断片」、「抗ＴＧＦβ抗原結合部分」などと互換的に称することができ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３のその特異的受容体への結合を阻害する任意の機能性分子を記載し、したがって、それらに関連するＴＧＦβシグナル伝達経路の生物学的機能を阻害する。好ましい実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体は、ＴＧＦβ１、２、及び３タンパク質に結合する。本発明の抗ＴＧＦβ抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３シグナル伝達によって媒介される下流経路を含む、ＴＧＦβ生物学的活性をブロッキングする、アンタゴナイズする、抑制する、若しくは低減させる（著しく低減させることを含む）、並びに／又は受容体結合及び／若しくはＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３タンパク質への細胞応答の誘発などの、ＴＧＦβタンパク質がＴＧＦＲ２受容体を結合することを阻害する、結合タンパク質及び抗体を包含する。本発明の目的のために、「抗ＴＧＦβ抗体」又は「抗ＴＧＦβアンタゴニスト抗体」又は「ＴＧＦβ Ｂ抗原結合タンパク質」という用語は、全ての以前に特定された用語、表題、並びに機能的状態及び特徴を包含し、それにより、線維症障害、骨障害、及び／若しくは細胞増殖障害などのＴＧＦβ関連障害の発症若しくは治療の任意の態様を媒介するその能力を含むがこれらに限定されないＴＧＦβ自体の生物学的活性、又は生物学的活性の結果が、実質的に無化され、減少し、又は任意の意味のある程度まで中和されることが明示的に理解される。抗ＴＧＦβ抗体の例は、本明細書で提供される。

本明細書において、「バリアント」抗ＴＧＦβ抗体は、親抗体配列中の１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失、及び／又は置換によって、「親」抗ＴＧＦβ抗体アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なり、親抗ＴＧＦβ抗体の少なくとも１つの所望な活性を保持する分子を指す。所望の活性には、抗原に特異的に結合する能力、動物におけるＴＧＦβ活性を低減、阻害又は中和する能力、及び細胞ベースのアッセイにおけるＴＧＦβ媒介性ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害する能力が含まれ得る。一実施形態では、バリアントは、親抗体の１つ以上の超可変及び／又はフレームワーク領域における１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、バリアントは、親抗体の１つ以上の超可変及び／又はフレームワーク領域における、少なくとも１個、又は約１～約１０個、又は約２～約５個の置換を含み得る。通常、バリアントは、親抗体の重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、又は親抗体と少なくとも約６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の間の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性又は相同性は、配列をアライメントし、必要な場合ギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後、親抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書で定義される。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸長、欠失、又は挿入のいずれも、全体的な配列同一性又は相同性に影響を及ぼすと解釈されるべきではない。バリアントは、ＴＧＦβバリアントに結合する能力を保持し、より強力な結合親和性、動物におけるＴＧＦβ活性を低減、阻害、若しくは中和するための増強された能力、及び／又は細胞ベースのアッセイにおけるＴＧＦβ媒介性ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害するための増強された能力を有し得る。

「ＴＧＦβ受容体」は、ＴＧＦβタンパク質により結合されるか、又は活性化されるポリペプチドを指す。ＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦβ受容体ファミリーに属する１回貫通型セリン／スレオニンキナーゼ受容体である。それらは、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得るいくつかの異なるアイソフォームに存在する。ＴＧＦβタンパク質に特異的な３つのＴＧＦβ受容体は、それらの構造的及び機能的特性によって区別され得る。ＴＧＦβＲ１（ＡＬＫ５）及びＴＧＦβＲ２は、同様のリガンド結合親和性を有する。ＴＧＦβ Ｒ１とＴＧＦβ Ｒ２との両方が、ＴＧＦβ１に対する高い親和性及びＴＧＦβ２に対する低い親和性を有する。ＴＧＦβＲ３（β－グリカン）は、ホモ二量体ＴＧＦβ１とＴＧＦβ２との両方に対して、かつヘテロ二量体ＴＧＦβ１、２に加えて高い親和性を有する。ＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦβ３にも結合する。機構的には、ＴＧＦβタンパク質は、ＴＧＦβＲ１を動員し、リン酸化するＴＧＦβＲ２受容体に最初に結合する。ＴＧＦβＲ１は次いで、受容体調節ＳＭＡＤ（Ｒ－ＳＭＡＤ）をリン酸化し、これは次いで、ｃｏ－ＳＭＡＤ ＳＭＡＤ４に結合し得る。Ｒ－ＳＭＡＤ／ｃｏ－ＳＭＡＤ複合体は、転写因子として機能し、標的遺伝子発現の調節に関与する核内に蓄積する。

本発明のモノクローナル抗体の活性に関して本明細書で使用される「中和する」という用語は、生物学的活性又は特性、疾患又は状態を含む（これらに限定されない）、阻害されるものの進行又は重症度を実質的にアンタゴナイズ、禁止、予防、制限、遅延、破壊、排除、停止、低減、又は逆行させる能力を意味する。阻害又は中和は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上である。抗体は、抗原に結合する抗体が、抗原の生物学的機能の部分的又は完全な阻害又は低減をもたらす場合、その抗原を「中和する」と言われる。ＴＧＦβタンパク質の生物学的活性の中和は、ＴＧＦβ受容体結合及びシグナル伝達経路における差異などの、ＴＧＦβ活性の１つ以上のインビトロ又はインビボ指標の、部分的又は完全な阻害又は低減を測定することによって評価される。ＴＧＦβ活性を中和する能力は、本明細書に記載されるインビトロアッセイに記載されるように、Ｓｍａｄ２リン酸化の阻害を測定することによって本明細書に記載されるように評価される。ＴＧＦβのインビボでの中和は、疾患の状態におけるＴＧＦβに起因する細胞表現型の切り替え、細胞増殖、及び細胞生存の阻害をもたらし得る。

本明細書で使用される場合、抗体の「免疫特異的」結合は、抗体の抗原組み合わせ部位とその抗体により認識される特定の抗原との間で起こる抗原特異的な結合相互作用を指す（すなわち、抗体はＥＬＩＳＡ又は他のイムノアッセイにおいてタンパク質と反応し、無関係のタンパク質とは検出可能に反応せず、追加的に、本発明の抗体が、インビボでエピトープで標的抗原に結合するであろうことも意味する）。抗体又はポリペプチドに「特異的に結合する」、又は「優先的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）エピトープは、当該技術分野でよく理解された用語であり、そのような特異的又は優先的な結合を決定する方法もまた当該技術分野で周知である。分子が、代替的な細胞又は物質と比較して、当該抗原を含む特定の細胞又は物質とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、及び／又はより高い親和性で反応する又は会合する場合、その分子は、「特異的結合」又は「優先的結合」を示すと言われる。抗体が、他の物質に結合するよりも高い親和性、アビディティで、より容易に、かつ／又はより長い持続時間で結合する場合、その抗体は、標的に「特異的に結合する」又は「優先的に結合する」。例えば、ＴＧＦβエピトープに特異的又は優先的に結合する抗体は、それが他のエピトープ又は非ＴＧＦＢエピトープに結合するよりも高い親和性、アビディティ、より容易に、かつ／又はより長い継続期間によりこのエピトープに結合するタンパク質である。

抗体結合の文脈における「特異的に」という用語は、特定の抗原、すなわち、ポリペプチド、又はエピトープへの抗体の高アビディティ及び／又は高親和性の結合を指す。抗原に特異的に結合する抗体は、他の抗原への同じ抗体の結合よりも強い。ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、弱いが検出可能なレベル（例えば、目的のポリペプチドに対して示される結合の１０％以下）において他のポリペプチドに結合することが可能であり得る。そのような弱い結合、又はバックグラウンド結合は、例えば、適切な対照の使用により、特異的抗体の対象ポリペプチドへの結合から容易に識別可能である。一般に、特異的抗体は、１０^-7Ｍ以下、１０^-8Ｍ以下、１０^-9Ｍ以下、１０^-10Ｍ以下、１０^-11Ｍ以下、１０^-12Ｍ以下、又は１０^-13Ｍ以下などのＫ_Dを有する結合親和性で抗原に結合する。

本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、抗原決定基との単一の抗原組み合わせ部位の結合の強度を指す。親和性は、抗体と抗原決定基との間の立体化学的適合の緊密性、それらの間の接触面積のサイズ、荷電性及び疎水性基の分布などに依存する。抗体親和性は、平衡分析又は表面プラズモン共鳴「ＳＰＲ」方法（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））により測定し得るＳＰＲ方法は、表面プラズモン波が金属／液体境界面において励起された場合に起こる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の現象に依拠する。光は、試料と接触していない表面の側に方向付けられ、そこから反射されて、ＳＰＲは、角度及び波長の特定の組み合わせにおいて反射光強度の低減を引き起こす。二分子結合事象は、表面層において屈折率の変化を引き起こし、それがＳＰＲシグナルの変化として検出される。

「Ｋ_D」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体－抗原相互作用の解離定数を指すことが意図される。解離定数Ｋ_D、及び会合定数Ｋ_aは、親和性の定量的尺度である。平衡において、遊離抗原（Ａｇ）及び遊離抗体（Ａｂ）は、抗原－抗体複合体（Ａｇ－Ａｂ）と平衡にあり、速度定数ｋ_a及びｋ_dは、個々の反応の速度を定量化する。平衡において、ｋａ［Ａｂ］［Ａｇ］＝ｋｄ［Ａｇ－Ａｂ］。解離定数、Ｋ_dは、Ｋ_D＝ｋｄ／ｋａ＝［Ａｇ］［Ａｂ］／［Ａｇ－Ａｂ］により与えられる。Ｋ_Dは、濃度の単位、最も典型的には、Ｍ、ｍＭ、μＭ、ｎＭ、ｐＭなどを有する。Ｋ_Dとして表現される抗体親和性を比較する場合、ＴＧＦβについてより高い親和性を有することは、より低い値により示される。会合定数Ｋ_aは、Ｋａ＝ｋａ／ｋｄ＝［Ａｇ－Ａｂ］／［Ａｇ］［Ａｂ］により与えられる。Ｋ_aは、濃度の逆数の単位、最も典型的には、Ｍ^-1、ｍＭ^-1、μＭ^-1、ｎＭ^-1、ｐＭ^-1などを有する。本明細書で使用される場合、「アビディティ」という用語は、可逆的な複合体の形成後の抗原－抗体結合の強度を指す。抗ＴＧＦβ抗体は、「約（より低いＫ_D値）～約（より高いＫ_D値）の範囲内の解離定数（Ｋ_D）を有する」結合として、ＴＧＦβタンパク質へのそれらの結合についてのＫ_Dに関して特徴付けられ得る。

「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」などの用語は、本明細書で互換的に使用され得、ＤＮＡ及びＲＮＡ中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）を指す。核酸は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はそれらの類似体を含有し得る。「核酸」という用語は、例えば、一本鎖及び二本鎖分子を含む。核酸は、例えば、遺伝子又は遺伝子断片、エクソン、イントロン、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、組換え核酸、プラスミド、並びに他のベクター、プライマー及びプローブであり得る。５’→３’（センス）及び３’→５’（アンチセンス）ポリヌクレオチドの両方が含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、標識化成分とのコンジュゲーションによって、重合後に更に修飾され得る。他の種類の修飾としては、例えば、「キャッピング」、類似体による天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の置換、ヌクレオチド間の修飾、例えば、非荷電性連結（例えば、メチルホスホネート、リン酸トリエステル、ホスホアミデート、カバメートなど）を有するもの及び荷電性連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するものなど、ペンダント部分、例えば、タンパク質など（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジンなど）を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結（例えば、アルファアノマー核酸など）を有するもの、並びにポリヌクレオチドの非修飾形態が挙げられる。更に、通常は糖中に存在するヒドロキシル基のうちのいずれかは、例えば、ホスホネート基、リン酸基により置き換えられるか、標準的な保護基により保護されるか、若しくは追加のヌクレオチドへの追加の連結を調製するために活性化されてもよいか、又は固体支持体にコンジュゲートされてもよい。５’及び３’末端のＯＨはリン酸化され得るか、又はアミン若しくは１～２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分により置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドはまた、当該技術分野で一般に既知であるリボース又はデオキシリボース糖の類似形態を含有し得、形態としては、例えば、２’－０－メチル－、２’－０－アリル、２’－フルオロ－又は２’－アジド－リボース、炭素環糖類似体、アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース若しくはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが挙げられる。１つ以上のホスホジエステル連結は、代替的な連結基によって置き換えられてもよい。これらの代替的な連結基としては、限定されないが、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、「（Ｏ）ＮＲ₂（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、又はＣＨ₂（「ホルムアセタール」）により置き換えられる実施形態が挙げられ、式中、各Ｒ又はＲ’は、独立して、Ｈ、又は任意選択的にエーテル（－０－）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル若しくはアラルジルを含む置換若しくは非置換のアルキル（１～２０個のＣ）である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞において目的の１つ以上の遺伝子又は配列を送達し、好ましくは発現させることができる構築物を意味する。ベクターの例としては、限定されないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤に関連するＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及びプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が挙げられる。ベクターは、本明細書に記載されるように、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する発現制御配列を有する。発現制御配列は、構成的プロモーター若しくは誘導性プロモーターなどのプロモーター、又はエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に「作動可能に連結されている」。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に配置されるときに、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結され、又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続しておりかつ読み取り段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要はない。

ポリペプチドが保存的アミノ酸置換を含有し得るのと同様に、そのポリヌクレオチドは保存的コドン置換を含有し得る。コドン置換は、発現されるときに、上述のような保存的アミノ酸置換を産生する場合、保存的であるとみなされる。アミノ酸置換をもたらさない縮退コドン置換もまた、本発明のポリヌクレオチドにおいて有用であり得る。したがって、例えば、本発明の一実施形態で有用な選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それとともに形質転換される発現宿主細胞によって示されるコドン使用頻度に近似させるために、又はそれ以外の方法でその発現を改善するために、縮退コドン置換によって変異され得る。

本明細書において、「バリアント」核酸は「親」核酸と配列が異なる分子を指す。ポリヌクレオチド配列の多様性は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、又は付加などの変異性変化から生じ得る。これらの変化の各々は、単独で、又は組み合わせて、所与の配列において１回以上発生し得る。

「単離された」という用語は、材料（例えば、本明細書に記載されるような抗体又は核酸）がその天然の環境の成分から分離及び／又は回収されることを意味する。その天然の環境の混入成分は、材料についての診断的又は治療的使用を妨げるであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を挙げることができる。核酸に関して、単離された核酸は、それが染色体中で通常会合している５’から３’への配列から分離されているものを含んでもよい。好ましい実施形態では、材料は、材料の９５質量％超、最も好ましくは９９質量％超まで精製される。材料の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離された材料は、材料を組換え細胞内にインサイチュで含む。しかしながら、通常、単離された材料は、本明細書で使用される少なくとも１つの精製ステップにより調製される。

「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という用語は互換的に使用され得る。これらの用語はまた、全ての後続世代であるその子孫を含む。全ての子孫は、計画的又は偶発的な変異に起因して同一ではない可能性があることが理解される。異種核酸配列の発現の文脈において、「宿主細胞」は、インビトロ又はインビボのいずれにあろうと、原核細胞又は真核細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、及び昆虫細胞）を指す。例えば、宿主細胞は、トランスジェニック動物中に位置し得る。宿主細胞は、ベクター用のレシピエントとして使用することができ、ベクターを複製することができ、及び／又はベクターによりコードされる異種核酸を発現することができる任意の形質転換可能な生物を含み得る。

本明細書で使用される場合、「標識」という語は、抗体又は核酸に直接的又は間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物又は組成物を指す。標識はそれ自体が検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識若しくは蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物若しくは組成物の化学的変化を触媒してもよい。

「対象」又は「患者」は、本発明の分子によって影響され得る治療を必要とする動物を指す。本発明に従って治療され得る動物としては脊椎動物が挙げられ、具体的には、イヌ科動物又はネコ科動物などの哺乳類が特に好ましい例である。

「組成物」は、化学組成物、生物学的組成物、又は生物学的治療（特に、本明細書に記載されるような抗体）のいずれであろうと、活性薬剤と、不活性（例えば、標識）又は活性、例えばアジュバントであり得る別の化合物又は組成物との組み合わせを意味することが意図される。

本明細書で定義される場合、本発明における使用に好適な「薬学的に許容される担体」は、当業者に周知である。そのような担体としては、水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液、アルコール／水性溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。他の従来用いられている希釈剤、アジュバント及び賦形剤は、従来の技法に従って添加され得る。そのような担体としては、エタノール、ポリオール、及びそれらの好適な混合物、植物油、及び注射可能な有機エステルを挙げることができる。緩衝液及びｐＨ調整剤もまた用いられてもよい。緩衝液としては、有機酸又は塩基から調製された塩が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な緩衝液としては、有機酸塩、例えば、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）、シトラート、アスコルビン酸、グルコン酸、ヒスチジン－Ｈｅｌ、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、若しくはフタル酸の塩、トリス、トリメタンミン塩酸塩、又はホスファート緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。非経口担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、トレハロース、スクロース、及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は固定油が含まれ得る。静脈内担体には、ビヒクルには、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが含まれ得る。防腐剤及び他の添加物、例えば、抗菌物質、酸化防止剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、不活性ガスなどもまた、薬学的担体中に提供されてもよい。本発明は、担体の選択によって限定されない。適切なｐＨ等張性、安定性、及び他の従来の特徴を有する上述の成分からのこれらの薬学的に許容される組成物の調製は、当該技術分野内にある。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐｕｂｌ．，２０００、及びＴｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，４．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔ．，ｅｄｓ．Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ，ＡＰｈＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００３などのテキストを参照されたい。

「治療有効量」（又は「有効量」）は、対象又は患者に投与された場合に有益な又は所望の結果をもたらすために十分な活性成分、例えば、本発明による薬剤の量を指す。有効投与量は、１回以上の投与で投与することができる。本発明による組成物の治療有効量は、当業者によって容易に決定され得る。本発明の文脈において、「治療有効量」は、疼痛感覚の緩和又は低減などの臨床結果を含む有益な又は所望の結果をもたらすために十分なＴＧＦＢ関連状態に関連付けられる１つ以上のパラメータにおける客観的に測定される変化を生じさせるものである。有効投与量は、１回以上の投与で投与することができる。本発明の目的のために、組成物の有効量は、本明細書において線維症障害、骨障害、又は細胞増殖障害として定義されるＴＧＦβ関連障害を予防、治療、低減、又は排除するのに十分な量である。治療有効量は、治療される特定の対象及び状態、対象の体重及び年齢、状態の重症度、選択される特定の組成物、従うべき投薬レジメン、投与のタイミング、投与の様式などに応じて変化し、これらのうちの全ては、当業者によって容易に決定され得る。

本明細書で使用される場合、「治療的」という用語は、疾患、状態、又は障害に対する治療の全スペクトルを包含する。本発明の「治療的」薬剤は、リスクがあると同定され得る対象を標的とするように設計された手順を組み込んだものを含む予防的若しくは防止的な様式で作用してもよく、又は治療されている疾患若しくは障害のうちの少なくとも１つの症状の進行の速度又は程度を遅延させるように作用してもよい。

更なる態様では、本発明は、本発明の抗体が治療的又は予防的使用のために提供される獣医学的組成物を特徴とする。本発明は、特定の抗原、例えば、疾患又は状態に関連する抗原を有するイヌ科動物又はネコ科動物対象を治療するための方法を特徴とする。方法は、本明細書に記載されるような本発明の抗体を伴う、１つ以上のＴＧＦβタンパク質に特異的な治療有効量の抗体を投与することを含む。

本発明の抗体を、対象への投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。本発明の化合物は、単一又は複数投薬において、単独で投与され得るか、又は薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／若しくは賦形剤と組み合わせて投与され得る。投与用組成物は、選択された投与の方式に適しているように設計されており、薬学的に許容される希釈剤、担体、及び／又は賦形剤、例えば分散剤、緩衝液、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定剤などが適宜使用される。

本発明の抗体を含む組成物は、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下、又は坐剤投与を含む標準的な投与技法を使用して、本明細書に記載されるような病態又は障害を示す対象に投与され得る。本発明の抗体の投与の経路は、非経口であってもよい。注入は、典型的には、静脈内経路によって与えられる。好ましくは、本発明の抗体は、非経口投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、非経口という用語は、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣、又は腹腔内投与を含む。静脈内又は腹腔内又は皮下注射による末梢全身送達が好ましい。更に、本発明の方法の対象はまた、患者とも称され、イヌ科動物又はネコ科動物として本明細書に記載される。

本明細書で使用される場合、ＴＧＦβ関連障害は、１つ以上のＴＧＦβタンパク質の調節又は全体的なレベルが、結合組織障害、線維症／線維性障害、骨障害、又は細胞増殖障害をもたらす障害である。ＴＧＦβは、増殖、アポトーシス、分化、及び炎症を含む多様な細胞機能を調節し、したがって、これらのタンパク質の調節不全は、いくつかの名前の付けられた障害をもたらす可能性がある。

本明細書で使用される場合、結合組織障害は、臓器及び身体の他の部分を支持するタンパク質豊富な組織を伴う障害の群を指す。結合組織の例は、脂肪、骨、及び軟骨である。これらの障害には、関節、筋肉、及び皮膚がしばしば関与するが、それらにはまた、眼、心臓、肺、腎臓、消化管、及び血管を含む他の臓器及び臓器系が関与し得る。

線維症関連疾患は、本明細書に記載されるように、組織損傷への応答として、瘢痕形成及び結合組織による細胞外マトリックスの過剰産生を含む病理学的プロセスに関する。分子プロセスは、正常な臓器における結合組織及び細胞外マトリックスの正常な形成とは異ならない。生理学的には、線維症は結合組織を沈着させるように作用し、これは、基礎にある臓器又は組織の正常なアーキテクチャ及び機能を妨げるか、又は完全に阻害し得る。線維症は、線維組織の過剰沈着の病理学的状態、及び治癒における結合組織沈着のプロセスを記載するために使用され得る。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の病理学的蓄積によって定義される場合、線維症は罹患組織の瘢痕化及び肥厚をもたらし、それは本質的に、正常な臓器機能を妨げる誇大な創傷治癒応答である。線維症の形成は、多くの細胞型とサイトカインとの間の相互作用を含み、均衡が線維化になると、線維症の形成が起こる。線維症は、どちらもコラーゲン及びグリコサミノグリカンを含む結合組織の下にある刺激された線維芽細胞が関与するという点で瘢痕のプロセスに類似している。このプロセスは、マクロファージなどの免疫細胞が線維芽細胞を刺激する可溶性因子を放出するときに開始される。最もよく特徴付けられる線維症促進メディエーターはＴＧＦβであり、これは、マクロファージ、及び間質と呼ばれる表面間の任意の損傷組織によって放出される。本明細書で定義される場合、線維性状態は、嚢胞性肺線維症と特発性肺線維症との両方を含む肺線維症、肝硬変、脳内のグリア瘢痕、膝、肩及び他の関節における関節線維症、後腹膜線維症、全身性硬化症（強皮症）、並びに特に慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）に繋がる腎臓線維症からなる群から選択される。線維症は、血管、皮膚、肺、腎臓、心臓、及びＧＩ管の進行性変性障害であり、現在まで不可逆的なプロセスと考えられており、古典的には抗炎症及び免疫抑制薬剤によって治療されており、それは何度も害を引き起こす。

慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）は、本明細書に記載されるように、長期にわたる進行性線維性プロセスに起因する機能的腎臓組織の喪失を伴う。腎臓の構造的及び機能的変化は、緩やかに相関するに過ぎないが、腎臓の構造の劇的な変化が見られる可能性がある。疾患は、それが臨床的に明らかになる前に、通常、数ヶ月又は数年にわたって存在し、それは常に不可逆的である。ＣＫＤの多くの原因は進行性間質性線維症に関連している。間質性線維症の重症度は、ＧＦＲの減少の大きさに対して正に相関があり、予後と負の相関がある。全身性ＣＫＤを有する動物に見られる糸球体、尿細管間質性、及び血管性病変は、開始原因に関係なく、多くの場合、類似している。ＴＧＦβは、筋線維芽細胞活性化を担う最も重要な線維症促進メディエーターとして記載されている。それは、多くの他の線維形成因子の効果を統合する収束経路を駆動する。ＴＧＦβ１は、最も豊富なアイソフォームであり、腎臓の全ての細胞型によって合成される。ＴＧＦβは、論じたように線維症促進サイトカインとして機能するとともに、骨リモデリングを制御し、適切な骨量を維持するために、骨芽細胞及び破骨細胞の形成、機能、及び細胞－細胞相互作用に影響を与える豊富な骨マトリックスタンパク質でもあり、それは、ＴＧＦβ阻害がＣＫＤに起因する二次性腎性副甲状腺機能亢進症（ＳＲＨＰ）中の骨の脱ミネラルを減少させるための潜在的な機構であることが示されている。

「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方を指す。治療を必要としている動物には、既に障害を患っている動物、及び障害が発症する又は進行することを予防するべき動物が含まれる。治療はまた、症状又は状態の発症を遅延させるか、又は発症の重症度を遅延させると説明されてもよい。疾患又は障害の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患若しくは障害に対する予防若しくは保護（すなわち、臨床症状の原因を引き起こさない）、疾患若しくは障害の阻害（すなわち、臨床症状の発生を阻止若しくは抑制する、及び／又は疾患若しくは障害の緩和（すなわち、臨床症状の退縮を引き起こす）を含む。理解されるように、最終的な誘導事象が不明であり得るか、又は潜在し得るため、疾患又は障害を「予防する」ことと、「抑制する」こととの間を区別することは必ずしも可能ではない。したがって、「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」という用語は、「予防する」ことと「抑制する」こととの両方を包含する「治療」の一種を構成すると理解されるであろう。したがって、「治療」という用語は「予防」を包含する。

本方法を説明する前に、本発明は、記載される特定の方法、及び実験条件に限定されず、かかる方法、及び条件は変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様又は同等の任意の方法及び材料は、本開示の実施又は試験においても使用され得るが、好ましい方法及び材料が、これより記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に開示される本発明は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３タンパク質に特異的に結合する抗体（本明細書に記載されるように、「抗原結合タンパク質」、「アンタゴニスト抗体」、「抗体断片」などという用語と互換的に使用される）、特に、それがイヌ科動物又はネコ科動物にかかわらず、イヌ科動物又はネコ科動物ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に特異的に結合し、したがって、全てがＴＧＦβＲＩＩ受容体に結合するのを予防し、したがって、シグナル伝達経路がＴＧＦβタンパク質のうちの１つによって活性化されるのを予防するという点でアンタゴニストとして機能する、組換え方法、ハイブリドーマ技術若しくはファージディスプレイ技術によって産生されるイヌ科動物化若しくはネコ科動物化された抗体、又は完全に生物種化されたモノクローナル抗体に関する。好ましい実施形態では、本発明は、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３に結合する抗体を提供する。

抗体の特性はこの抗体を非常に魅力的な治療的薬剤とするが、一方で多数の制限がある。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の大部分は、前述したように、げっ歯類起源である。そのような抗体が異なる種において投与される場合、患者／対象は、そのような異種抗体に対してそれら自身の抗体応答を増大させる可能性がある。そのような応答は、抗体の最終的な中和及び排除をもたらし得る。上記のように、抗体の産生はマウスに限定されないが、マウスは、モノクローナル抗体の産生に広く使用される。イヌ科動物などの種は、抗原及び回収され特徴付けられた抗体により免疫化され得る特定の種によって産生された抗体の使用における１つの問題は、例えば、元々マウスで生成された場合、当該抗体により治療されている非マウス対象が、マウス抗体に対してそれらが外来物質であるかのように反応し、したがって、マウス抗体に対する新しい抗体のセットを生成することである。マウス抗体は、非マウス、例えば、イヌ科動物（又は任意の他の非マウス種）の免疫系によって外来物として異種抗体であると「見なされ」、次いで、その分子に対する免疫応答を増大させ得る。当業者は、抗原特異的抗体を用いて対象を治療できる必要性を認識するであろうが、使用のためにその抗体が種特異的である必要性を認識するであろう。種間抗体投与、例えば、イヌ科動物に投与されるマウスモノクローナル抗体から生成される反応の部分は、発疹のような軽度の形態から、腎不全などのより極端かつ生命を脅かす応答までの範囲であり得る。この免疫応答はまた、治療の有効性を減少させ、又はマウス抗体を含有するその後の治療を対象が与えられる場合に将来的な反応を生じさせる可能性がある。したがって、本発明に記載のように、本発明の抗体の「イヌ科動物化」又は「ネコ科動物化」により、この欠点を克服することを記載する。特に、このプロセスは、免疫グロブリン可変ドメインのフレームワーク領域に焦点を当てるが、可変ドメインの相補性決定基領域（ＣＤＲ）も含み得る。このプロセスを実施するための可能化ステップ及びその実施は、本開示に記載されており、ＣＤＲの配列を中心とした親和性成熟のプロセスは、当該分野で周知である。

動物からのモノクローナル抗体（本明細書に記載されるような抗体、アンタゴニスト抗体など、及び互換的に使用される用語）を修飾して、異なる種への治療的投与のためにそれをより低い免疫原性とするプロセスは積極的に追及され、多数の刊行物において記載されている（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ．Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ｅｄ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）。しかしながら、このプロセスは、非ヒトに対する治療的又は診断の開発のために近年まで日常的に適用されていない。実際、イヌ科動物、ネコ科動物、又は他の種特異的可変ドメインに関しては、ほとんど発表されていない。Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．６，３１６０（１９７７）は、両方のイヌ科動物重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定した。Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．１５，３０３（１９７８）は、イヌ科動物ＩｇＡからのκ軽鎖のアミノ酸配列を決定した。ＭｃＣｕｍｂｅｒ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６，５６５（１９７９）は、イヌ科動物ミュー鎖の完全なアミノ酸配列を開示する。Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８０，２５９（２００１）は、単一のイヌ科動物ＩｇＧ－Ａ ｙ鎖ｃＤＮＡ及び４つのイヌ科動物ＩｇＧ－Ａ ｙ鎖タンパク質配列を開示する。Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．は、４つのイヌ科動物重鎖の機能的特性を記載する。これまで、イヌ科動物抗体に関する入手可能な情報の不足は、イヌ科動物疾患の治療のための治療薬としてのイヌ科動物抗体の開発を妨げていた。

これらの注目すべき制限は、治療的抗体の「ヒト化」に関して当業者に周知の「生物種化」として知られる操作技術の開発を促した。抗体の「イヌ科動物化」、「ネコ科動物化」、「ヒト化」は、「生物種化」の技法のうちのいくつかの例であり、これらの分子は、非標的免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有する抗体又は断片として生成される。一例として、レシピエント／標的の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、特異性、親和性、及び効力などの所望の特性を有するマウスなどの非標的種（すなわち、「ドナー抗体」又は「起源種抗体」）のＣＤＲからの残基によって置き換えられる、イヌ科動物化抗体（「標的種抗体」）。この戦略は、最も適切な標的（ＣＤＲ移植のための生殖細胞系列抗体配列）を同定することに基づいている。可変重鎖と可変軽鎖との両方についての全ての利用可能な生殖細胞系列配列の広範な分析の後、マウス／ドナーｍＡｂに対するそれらの相同性に基づいて生殖細胞系列の候補を選択し、マウス／ドナー前駆体ｍＡｂからのＣＤＲを使用して、天然のイヌ科動物ＣＤＲを置き換えた。目的は、治療薬として使用される場合、常に高い親和性及び最終的なインビボ有効性を保持することである。イヌ科動物抗体フレームワークを使用することは、一般に、イヌに投与されるときのインビボでの免疫原性の可能性を最小限に抑える。しかしながら、いくつかの事例では、イヌ科動物免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、低減された親和性又は機能が観察される場合、対応する非イヌ科動物残基によって置き換えられる。対応するドナー残基への選択された標的フレームワーク残基の復帰変異は、注目されるような親和性を回復及び又は改善させるために必要とされ得る。構造ベースの方法も、米国特許第７，２６１，８９０号に記載されているように、イヌ科動物化及び親和性成熟のために用いられてもよい。上記の説明は、標的種としてのイヌ科動物、及びドナー種としてのマウスを使用する。生物種化された抗体は、これらの標的及びドナーに限定されない。標的種としては、ネコ科動物などを使用することができる。

タンパク質を標的化する治療的抗体を開発するための別の課題は、異なる種における相同タンパク質上のエピトープが頻繁に異なり、他のタンパク質との交差反応性についての可能性もまた異なることである。結果として、抗体は、治療される特定の種における特定の標的のために作製、試験及び開発されなければならない。異なる種における相同標的間の抗体結合は予測不可能であり、有効性の試験及び評価を必要とする。

抗体は、抗体分子の可変領域との相互作用による抗原上の特定のエピトープのその結合を通じて抗原を標的とする。更に、抗体は、様々な生物学的活性を媒介し、（本発明のアンタゴニスト抗ＴＧＦβ抗体の場合と同様に）阻害し、かつ／又は開始させる能力を有する。治療的抗体について広範囲の機能があり、例えば、抗体は、アゴニスト又はアンタゴニストとして受容体－リガンド相互作用を調節し得る。抗体結合は、細胞内シグナル伝達を開始させて、細胞成長、サイトカイン産生、又はアポトーシスを刺激し得る。抗体は、Ｆｃ領域に結合した薬剤を特定の部位に送達し得る。抗体はまた、ＡＤＣＣ、ＣＤＣなどを誘発する細胞内のそれぞれの分子に対する抗体のＦｃ領域の結合を通じて、抗体媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）、及び食作用を誘発する。ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、Ｃ１ｑ結合及び食作用機能が排除されるように変化させている抗体もある。一実施形態では、本発明は、当該抗体のエフェクター機能を変化させる抗体のＦｃ領域における変化を含む抗体を提供する。本発明は、本発明の抗体を発現する細胞及び細胞株を更に提供する。代表的な宿主細胞としては、細菌、酵母、哺乳類及びヒト細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ－１細胞、及びＣＯＳ細胞が挙げられる。宿主細胞への異種構築物の形質転換後に安定な細胞株を生成するための方法は当該技術分野で周知である。代表的な非哺乳動物宿主細胞としては、昆虫細胞が挙げられる（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２－３）：１０３－１１２）。抗体はまた、トランスジェニック動物（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（６）：６２５－６２９）及びトランスジェニック植物（Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０（３）：４３３－４５）において産生されてもよい。

上で論じたように、例えば、抗体の他の部分、例えば、定常領域の、欠失、付加、又は置換により修飾されている、モノクローナル、キメラ、種特異的及び生物種化抗体もまた本発明の範囲内である。例えば、抗体は、以下のとおりに修飾され得る：（ｉ）定常領域を欠失させること、（ｉｉ）別の定常領域、例えば、抗体の半減期、安定性若しくは親和性を増加させることを意味する定常領域、若しくは別の種若しくは抗体クラスからの定常領域により定常領域を置き換えること、又は（ｉｉｉ）定常領域中の１つ以上のアミノ酸を修飾して、例えば、とりわけ、グリコシル化部位の数、エフェクター細胞機能、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、補体固定を変化させること。本発明の一実施形態では、本発明の抗体は、抗体のエフェクター機能を変化させる変化したＦｃ領域を含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、置き換え、修飾、又は除去されている。

抗体定常領域を変化させるための方法は、当該技術分野で知られている。変化した機能、例えば、細胞上のＦｃＲ、又は補体のＣ１成分などのエフェクターリガンドに対する変化した親和性を有する抗体は、抗体の定常部分における少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基により置き換えることにより産生され得る（例えば、ＥＰ３８８１５１Ａ１、米国特許第５，６２４，８２１号、及び米国特許第５，６４８，２６０号を参照されたく、これらの全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる）。

例えば、指定された残基をその側鎖上に適切な官能基を有する残基により置き換えることにより、あるいは荷電性官能基、例えば、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸、又はおそらくは芳香族非極性残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン若しくはアラニンを導入することにより、ＦｃＲ（例えば、Ｆｃ．ガンマＲ１）、又はＣ１ｑ結合についての抗体のＦｃ領域の親和性を変化させることが可能である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号を参照されたい）。抗体又はその結合断片は、細胞毒素、治療的薬剤、又は放射性金属イオンとコンジュゲートされ得る。一実施形態では、コンジュゲートされるタンパク質は、抗体又はその断片である。細胞毒素又は細胞障害性薬剤としては、細胞に有害である任意の薬剤が挙げられる。非限定的な例としては、カリケアマイシン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、及びその類似体、又は相同体が挙げられる。治療的薬剤としては、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、及び５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンＣ、及びシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン）、並びに抗有糸分裂薬剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられるが、これら限定されない。そのような部分をコンジュゲートするための技術は、当該技術分野で周知である。

組成物、誘導組成物、及び組成物を作製する方法
本発明は、抗体（本明細書で互換的に使用されるような、「抗原結合タンパク質」、「抗体断片」、「アンタゴニスト抗体」など）、ポリペプチド並びに本発明の抗体又はポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物を含む組成物を包含する。

本明細書で使用される場合、組成物は、ＴＧＦβタンパク質のうちの１つ以上に結合する１つ以上の抗体若しくは抗原、及び／又はＴＧＦβタンパク質のうちの１つ以上に結合する１つ以上の抗体若しくはポリペプチドをコードする配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、緩衝液を含む薬学的／獣医学的に許容される賦形剤などの好適な賦形剤を更に含んでもよく、賦形剤は当該技術分野で周知である。本発明はまた、単離された抗体、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの実施形態を包含する。本発明はまた、実質的に純粋な抗体、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの実施形態を包含する。

１つ以上の実施形態では、本発明は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３タンパク質に結合する単離された組換え抗体を提供し、可変重鎖は、本明細書に記載されるような本発明の抗体のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、可変軽鎖は、本明細書に記載されるような本発明の抗体を含むアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び当該抗体の可変軽鎖又は可変重鎖のうちのいずれかにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３のうちの少なくとも１つにおいて１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するその任意のバリアントを含む。

本発明は、組換え抗体、本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、モノクローナル抗体、及び抗体断片、並びに臨床的投与及び診断手順を含む科学的手順におけるその使用を提供する。分子生物学の方法及び組換え技術を使用することにより、組換え手段により抗体及び抗体様分子を産生すること、並びにそれによって抗体のポリペプチド構造中に見出される特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を生成することができる。そのような抗体は、当該抗体のポリペプチド鎖をコードする遺伝子配列をクローニングするか、又は当該ポリペプチド鎖を直接合成し、合成された鎖を組み立てて、特定のエピトープ及び抗原決定基に対する親和性を有する活性四量体（Ｈ２Ｌ２）構造を形成することのいずれかによって生成され得る。これは、異なる種及び供給源からの抗体を中和することを特徴とする配列を有する抗体の即時生成を可能にした。

抗体の供給源、どのようにそれらを構築するのか、若しくはどのようにそれらを合成するのか、インビトロ若しくはインビボであるのか、トランスジェニック動物を使用するのか、実験室の大規模細胞培養若しくは商業用のサイズであるのか、トランスジェニック植物を使用するのか、又はプロセスのうちのいずれかのステージにおいても生きた生物を用いない直接的な化学合成によるのかに関係なく、全ての抗体は類似の全体的な三次元構造を有する。この構造は、多くの場合、Ｈ２Ｌ２として与えられ、抗体が、一般的に、２つの軽鎖（Ｌ）アミノ酸及び２つの重鎖（Ｈ）アミノ酸を含むという事実を指す。両方の鎖は、構造的に相補的な抗原標的と相互作用することが可能な領域を有する。標的と相互作用する領域は、「可変」又は「Ｖ」領域と称され、異なる抗原特異性の抗体からのアミノ酸配列における差異により特徴付けられる。Ｈ又はＬ鎖のいずれかの可変領域は、抗原標的に特異的に結合することが可能なアミノ酸配列を含有する。

本明細書で使用される場合、「抗原結合領域」という用語は、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異性及び親和性を抗体に付与するアミノ酸残基を含有する、抗体分子の一部分を指す。抗体結合領域は、抗原結合残基の適切なコンフォメーションを維持するために必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。抗原結合領域を提供するＨ又はＬ鎖の可変領域内には、異なる特異性の抗体間の極端な可変性の理由である、「超可変」と称されるより小さい配列が存在する。そのような超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」とも称される。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原決定基構造に対する抗体の基本的な特異性を担う。

ＣＤＲは、可変領域内のアミノ酸の非連続的な一続きの範囲を表すが、種にかかわらず、可変重鎖及び軽鎖領域内のこれらの重要なアミノ酸配列が配置される位置は、可変鎖のアミノ酸配列内の同様の位置を有することが見出されている。全ての抗体の可変重鎖及び軽鎖は、各々３つのＣＤＲ領域を有し、各々が他と非連続である。全ての哺乳類種において、抗体ペプチドは定常（すなわち、高度に保存された）領域及び可変領域を含有し、後者の中には、ＣＤＲおよび、重鎖又は軽鎖の可変領域内であるがＣＤＲの外側にあるアミノ酸配列で構成される、いわゆる「フレームワーク領域」が存在する。

本発明は、上述の核酸のうちの少なくとも１つを含むベクターを更に提供する。遺伝コードは縮退しているので、特定のアミノ酸をコードするために２つ以上のコドンが使用され得る。遺伝コードを使用して、１つ以上の異なるヌクレオチド配列が同定され得、これらの各々がアミノ酸をコードすることが可能であろう。特定のオリゴヌクレオチドが実際のコーディング配列を構成する事実上の確率は、異常な塩基対の関係性及び抗ＴＧＦβ抗体又は部分を発現する真核又は原核細胞において（特定のアミノ酸をコードするために）特定のコドンが実際に使用される頻度を考慮することにより推定することができる。そのような「コドン使用規則」は、Ｌａｔｈｅ，ｅｔ ａＩ．，１８３ Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１－１２（１９８５）によって開示されている。Ｌａｔｈｅの「コドン使用規則」を使用して、抗ＴＧＦΒ配列をコードすることができる理論的に「最も可能性の高い」ヌクレオチド配列を含有する単一のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド配列のセットを同定することができる。また、本発明における使用のための抗体コード領域は、本明細書に記載される抗体及びペプチドのバリアント（アゴニスト）をもたらす標準的な分子生物学技法を使用して既存の抗体遺伝子を変化させることによっても提供され得ることが意図される。そのようなバリアントとしては、抗ＴＧＦΒ抗体又はペプチドのアミノ酸配列における欠失、付加、及び置換が挙げられるが、これらに限定されない。

抗体誘導体
本発明の範囲内には、抗体誘導体が含まれる。抗体の「誘導体」は、通常はタンパク質の一部ではない追加の化学的部分を含有する。タンパク質の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。そのような修飾は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖又は末端残基と反応可能である有機誘導体化剤と反応させることによって、分子に導入され得る。例えば、当該技術分野で周知の二官能性薬剤を用いる誘導体化は、抗体又は断片を水不溶性支持体マトリックス又は他の巨大分子担体に架橋するのに有用である。

誘導体はまた、標識される放射標識されたモノクローナル抗体を含む。例えば、放射性ヨウ素（１２５，１３１Ｉ）、炭素（４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、インジウム、トリチウム（³Ｈ）など；ビオチン又はアビジンを含むモノクローナル抗体と、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カルボン酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、又はグルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素とのコンジュゲート；及びまたモノクローナル抗体と、生物発光剤（ルシフェラーゼなど）、化学発光剤（アクリジンエステルなど）、又は蛍光剤（フィコビルタンパク質など）とのコンジュゲートが用いられる。

本発明の別の誘導体二官能性抗体は、２つの異なる抗原基を認識する２つの別個の抗体の一部を組み合わせることによって生成される、二重特異性抗体である。これは、架橋又は組換え技法によって達成され得る。追加的に、インビボでの半減期を増加させる（例えば、血流からのクリアランスまでの時間を長期化させることによる）ための部分が抗体又はその部分に付加されてもよい。そのような技法としては、例えば、ＰＥＧ部分を付加すること（ペグ化とも称される）が挙げられ、当該技術分野で周知である。米国特許出願公開第２００３００３１６７１号を参照されたい。

抗体の組換え発現
いくつかの実施形態では、本発明の抗体をコードする核酸は宿主細胞に直接的に導入され、かつ、細胞は、コードされる抗体の発現を誘導するために十分な条件下でインキュベートされる。主題の核酸が細胞に導入された後に、細胞は、典型的には、通常は３７℃において、時々選択下で、抗体の発現を可能にするために約１～２４時間の期間にわたりインキュベートされる。一実施形態では、抗体は、細胞が増殖している培地の上清に分泌される。従来的には、モノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ株において天然分子として生成されている。その技術に加えて、本発明は、モノクローナル抗体の組換えＤＮＡ発現を提供する。これによって、選択された宿主種における当該抗体の産生、並びに抗体誘導体及び融合タンパク質のスペクトルの生成を可能にする。

ＤＮＡなどの核酸分子は、転写及び翻訳調節情報を含有するヌクレオチド配列を含有し、そのような配列が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結されている」場合、ポリペプチドを「発現することが可能である」と言われる。操作可能な連結は、調節ＤＮＡ配列と発現させようとするＤＮＡ配列とが、回収可能な量で抗ＴＧＦβ抗体又は抗体断片としての遺伝子発現を可能にするような方式で接続される連結である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は、類似の技術において周知であるように、生物によって変動し得る。

したがって、本発明は、抗ＴＧＦβ抗体の発現、すなわち原核細胞又は真核細胞のいずれにおける発現も包含する。好適な宿主としては、インビボ若しくはインサイチュでの、又は哺乳類、昆虫、鳥類、若しくは酵母起源の宿主細胞のいずれかにおける細菌、酵母、昆虫、真菌、鳥類、及び哺乳類細胞を含む、細菌又は真核生物宿主が挙げられる。哺乳類細胞又は組織は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌ、又はネコ起源のものであり得るが、任意の他の哺乳類細胞が制限なく使用され得る。

本発明のキメラ、生物種化抗体構築物、又は抗ＴＧＦβ抗体を保有する発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、コンジュゲート化、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿などの生化学的手段、及びジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランなどのポリカチオンによる適用、並びにエレクトロポレーション、直接的なマイクロインジェクション、及び微粒子銃などの機械的手段を含む様々な好適な手段のうちのいずれかによって、適切な宿主細胞に導入することができる。限定されないが、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｔ，２４０ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５３８（１９８８）又は当業者に既知の他の技法。

組換え抗体の長期的な高収率の生成のために、安定発現が使用され得る。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株が操作され得る。複製物の起源を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞が、免疫グロブリン発現カセット及び選択可能なマーカーにより形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞を濃縮培地で成長させてもよく、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定的に組み込み増殖して、ひいては細胞株にクローニング及び拡大することができるフォーカスを形成することを可能にする。そのような操作された細胞株は、抗体分子と直接又は間接的に相互作用する化合物／成分のスクリーニング及び評価において特に有用であり得る。

本発明の抗体が産生されると、それは、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特定の抗原に対する親和性、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差異によって、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技法によって精製され得る。多くの実施形態では、抗体は、細胞から培養培地に分泌され、培養培地から採取される。

薬学的及び獣医学的用途
本明細書に記載されるような本発明の抗ＴＧＦβ抗体又は抗体断片は、例えば、イヌ科動物及びネコ科動物におけるＴＧＦβ関連障害の治療において使用され得る。より具体的には、本発明は、薬学的に許容される担体又は希釈剤、及び活性成分として、本発明による抗体又は抗体断片を含む薬学的組成物を更に提供する。抗体は、異なる非ヒト種に適合するためのキメラ、ヘテロキメラ、イヌ科動物化、又はネコ科動物化抗体であり得る。無傷の免疫グロブリン又はそれらの結合断片も想定される。本発明の抗体及びその薬学的組成物は、非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、又は静脈内投与のために有用である。

いくつかの望ましい実施形態では、本発明の抗体は、非経口注射によって投与される。非経口投与のために、抗ＴＧＦβ抗体又は断片は、薬学的に許容される非経口ビヒクルと関連する、溶液、懸濁液、エマルション、又は凍結乾燥粉末として製剤化され得る。例えば、ビヒクルは、限定されないが、水性担体などの許容される担体に溶解された抗体又はそのカクテルの溶液であり得、そのようなビヒクルは、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、トレハロース若しくはスクロース溶液、又は血清アルブミン、グリシンなどである。リポソーム及び固定油などの非水性ビヒクルもまた使用され得る。これらの溶液は、無菌であり、概して、粒子状物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌され得る。組成物は、ｐＨ調整剤、及び緩衝液、毒性調整剤などの生理学的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中の抗体の濃度は、例えば、約０．５質量％未満、通常、約１質量％以上～最大で１５質量％又は２０質量％と広範に変動し得、選択される特定の投与形態に従って、主に流体体積、粘度などに基づいて選択されるであろう。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学的安定性（例えば、緩衝液及び防腐剤）を維持する添加剤を含有し得る。製剤は、一般的に使用される技法によって滅菌される。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に既知であるか、又は明らかであり、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡ．ＳＣＩ．（１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）により詳細に記載されている。

本発明の抗体は、保存のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体中で再構成され得る。この技法は、従来の免疫グロブリンに対して有効であることが示されている。任意の好適な凍結乾燥及び再構成技法が用いられ得る。凍結乾燥及び再構成が多様な程度の抗体活性損失をもたらし得、使用レベルを調整して相殺する必要があり得ることを当業者は理解するであろう。本発明の抗体組成物は、既存の疾患についての再発の予防及び／又は治療的処置のために投与され得る、そのカクテルを提供し得る。好適な薬学的担体は、とりわけ、当業者に周知の当該技術分野の参考文献において標準的な参考文献テキストであるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳの最新版に記載されている。治療的用途において、組成物は、疾患又は状態、及びその合併症を治癒するか、又は少なくとも部分的に阻止するか、若しくは緩和するために十分な量で、疾患又は状態を既に患っている対象に投与される。これを達成するために十分な量は、「治療有効用量」又は「治療有効量」として定義される。

投与される投薬量は、当然ながら既知の要因に依存して変動し、この要因は、例えば、特定の薬剤の薬力学的特徴、及びその投与の方式及び経路；レシピエントの年齢、健康、及び体重；症状の性質及び程度、同時治療の種類、治療の頻度、並びに所望の効果である。

非限定的な例として、イヌ及びネコにおけるＴＧＦβ関連病態の治療は、必要に応じた投与量範囲で提供され得る。イヌ科動物又はネコ科動物の治療的使用のための例示的な抗体は、本発明による強力なインビボ抗ＴＧＦＢ活性を有する高親和性抗体、並びにその断片、領域及び誘導体である。組成物の単回又は複数回の投与は、治療する獣医師によって選択される用量レベル及びパターンで実行され得る。いずれにせよ、薬学的製剤は、対象を効果的に治療するのに十分な量の本発明の抗体を提供すべきである。

診断用途
本発明はまた、ＴＧＦβ関連障害であることが既知の又はそれを有することが疑われる種、特にイヌ科動物及びネコ科動物においてＴＧＦβを検出するための診断方法において使用するための上記の抗ＴＧＦβ抗体を提供する。本発明の抗ＴＧＦβ抗体は、試料中の１つ以上のＴＧＦβ、又は抗ＴＧＦβ抗体を検出又は定量化するイムノアッセイのために有用である。ＴＧＦβのためのイムノアッセイは、典型的には、ＴＧＦβに選択的に結合することができる本発明の検出可能に標識された高親和性（又は高アビディティ）抗ＴＧＦβ抗体の存在下で、臨床又は生物学的試料をインキュベートすることと、試料中に結合する標識されたペプチド又は抗体を検出することと、を含む。様々な臨床アッセイ手順は、当該技術分野で周知である。そのような試料としては、当業者に既知のように、組織生検、血液、血清、及び糞便試料、又は動物対象から収集され、ＥＬＩＳＡ分析に供される液体が挙げられる。

「固相支持体」又は「担体」は、ペプチド、抗原、又は抗体に結合することができる任意の支持体を指す。周知の支持体又は担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、並びにマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性であり得るか、又は不溶性であり得る。支持体材料は、カップリングした分子が１つ以上のＴＧＦβタンパク質又は抗ＴＧＦβ抗体に結合することができる限り、実質上任意の可能な構造的構成を有し得る。したがって、支持体の構成は、ビーズにおけるように球状、又は試験管の内側表面におけるように円筒形、又は棒状の外的表面であり得る。代替的に、表面は、シート、培養皿、試験ストリップなどの平坦であり得る。例えば、支持体は、ポリスチレンビーズを含んでもよい。当業者は、抗体、ペプチド若しくは抗原に結合するための多くの他の好適な担体を知っているか、又は日常的な実験によりそれを確認することができる。周知の方法ステップは、抗ＴＧＦＢペプチド及び／又は抗体の所与のロットの結合活性を決定することができる。当業者は、日常的な実験によって操作的及び最適なアッセイ条件を決定することができる。

ＴＧＦβ特異的ペプチド及び／又は抗体を検出可能に標識することは、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において使用するための酵素に連結することにより達成され得る。連結された酵素は、曝露された基質と反応して、例えば、限定されないが、分光光度、蛍光定量又は視覚的手段により検出され得る化学的部分を生成する。本発明のＴＧＦβ特異的抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ５－ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α－グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＧＦβ特異的抗体を放射標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を通じてＴＧＦβを検出することが可能である。放射性同位体は、ガンマーカウンター又はシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、又はオートラジオグラフィーによって検出され得る。本発明の目的のために特に有用な同位体としては、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓ、及び¹⁴Ｃが挙げられる。

蛍光化合物を用いてＴＧＦβ特異的抗体を標識することも可能である。蛍光標識された抗体が適切な波長の光に曝露される場合、次いで、その存在は蛍光に起因して検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物には、当業者に既知のもののうち、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルデヒド、及びフルオレスカミンがある。ＴＧＦβ特異的抗体はまた、¹²⁵Ｅｕ、又はランタニド系列の他のものなどの蛍光放出金属を使用しておいしく（ｄｅｌｅｃｔａｂｌｙ）標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン－テトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基などを使用してＴＧＦβ特異的抗体に取り付けることができる。

ＴＧＦβ特異的抗体はまた、化学発光化合物にカップリングすることによって検出可能に標識することができる。化学発光的に標識された抗体の存在は、次いで、化学反応の過程の間に生じる発光の存在を検出することにより決定される。有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、及びシュウ酸エステルである。

同様に、本発明のＴＧＦβ特異的抗体、部分、断片、ポリペプチド、又は誘導体を標識するために生物発光化合物を使用することができる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的な系において見出される化学発光の一種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識化の目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びエクオリンである。

ＴＧＦβ特異的抗体、部分、断片、ポリペプチド、又は誘導体の検出は、例えば、検出可能な標識が放射性ガンマ放出体である場合にはシンチレーションカウンターにより、又は例えば、標識が蛍光材料である場合には蛍光光度計により達成することができる。酵素標識の場合、検出は、酵素に対する基質を用いる比色法（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）により達成することができる。検出はまた、同様に調製された標準物質との比較における基質の酵素反応の程度の視覚的比較によっても達成することができる。

本発明の目的のために、上記のアッセイによって検出されるＴＧＦβは、生物学的試料中に存在することができる。ＴＧＦβを含有する任意の試料が使用され得る。例えば、試料は、例えば、血液、血清、リンパ液、尿、糞便、炎症性滲出液、脳脊髄液、羊水、組織抽出物、又はホモジネートなどの生体液、及び任意の生検関連材料である。本発明は、これらの試料のみを使用するアッセイに限定されないが、しかしながら、本明細書に照らして、当業者は他の試料の使用を可能にする好適な条件を決定することが可能である。

インサイチュ検出は、動物対象から組織学的検体を取り出し、本発明の標識された抗体の組み合わせをそのような検体に提供することによって達成され得る。抗体（又はその部分）は、標識された抗体（又はその部分）を生物学的試料に適用するか、又はそれに重ねることによって提供され得る。そのような手順の使用を通じて、ＴＧＦβの存在だけでなく、検査した組織中のＴＧＦβの分布も決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、多様な組織学的方法のうちのいずれか（例えば、染色手順）をそのようなインサイチュ検出を達成するために改変することができることを容易に認識する。

本発明の抗体、断片又は誘導体は、「２部位」又は「サンドイッチ」アッセイとしても既知の免疫測定アッセイにおける利用のために適合させることができる。典型的な免疫測定アッセイでは、ある量の非標識抗体（又は抗体の断片）を、試験されている液体中に不溶性である固体支持体に結合させ、ある量の検出可能に標識された可溶性の抗体を加えて、固相抗体と、抗原と、及び標識された抗体との間で形成された三元複合体の検出及び／又は定量化を可能にする。

抗体は、試料中の１つ以上のＴＧＦβタンパク質を定量的若しくは定性的に検出するために、又はＴＧＦβタンパク質のうちの１つ以上を発現する細胞の存在を検出するために使用され得る。これは、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、又は蛍光測定検出とカップリングさせた、蛍光標識された抗体を用いる免疫蛍光技法（以下を参照されたい）によって達成することができる。診断目的に関して、抗体は標識又は非標識のいずれかであり得る。非標識抗体は、イヌ科動物免疫グロブリン定常領域に特異的な抗体などの抗体と反応性である他の標識された抗体（第２の抗体）と組み合わせて使用することができる。代替的に、抗体は直接的に標識することができる。放射性核種、フルオール（ｆｌｕｏｒ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、リガンド（特にハプテン）などの多様な標識を用いてもよい。先に論じたものなどの多数の種類のイムノアッセイが利用可能であり、当業者には周知である。重要なことに、本発明の抗体は、イヌ科動物及びネコ科動物におけるＴＧＦβ関連障害の診断において役立ち得る。より具体的には、抗体／本発明の抗体は、コンパニオン動物におけるＴＧＦβの過剰発現を同定し得る。したがって、本発明の抗体は、重要な免疫組織化学ツールを提供し得る。本発明の抗体は、遺伝子発現プロファイル及び当業者に周知の他の診断ツールを測定するのに非常に好適である、抗体アレイにおいて使用されてもよい。

キット
本発明の範囲内には、主題の方法を実施するためのキットも含まれる。キットは少なくとも、本発明の抗体、それをコードする核酸、又はそれを含有する細胞のうちの１つ以上を含む。本発明の抗体は、容器中で、通常は凍結乾燥形態で提供され得る。標識若しくは毒素にコンジュゲートされ得るか、又は非コンジュゲートされ得る抗体は、典型的には、トリス、ホスファート、カルボナートなどの緩衝液、安定化剤、殺生物剤、不活性タンパク質、例えば、血清アルブミンなどを伴うキット中に含まれる。一般に、これらの材料は、活性抗体の量に基づいて５質量％未満で存在し、通常、再び抗体濃度に基づいて少なくとも約０．００１質量％の総量で存在する。頻繁に、活性成分を希釈するための不活性の増量剤又は賦形剤を含むことが望ましく、賦形剤は、全組成物の約１質量％～９９質量％で存在し得る。一次抗体に結合することができる第２の抗体がアッセイに用いられる場合、これは通常、別個のバイアル中に存在する。第２の抗体は、典型的には、標識にコンジュゲートされ、上記の抗体製剤と類似の様式で製剤化される。キットはまた、一般に、使用説明書のセットを含む

本発明の組成物及び方法を説明する前に、本発明は、記載される特定の組成物、方法、及び実験条件に限定されず、かかる組成物、方法、及び条件は変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。ここで本発明を、以下の非限定的な実施例によって更に記載する。

本発明は、以下の実施例によって更に例示され、裏付けられる。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を更に制限するために決して考慮されるべきではない。それどころか、当業者は、本発明の趣旨及び／又は付属の特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態、修正、及び同等物が存在することを容易に理解するであろう。

実施例１：
抗ＴＧＦβ１、２、３抗体
抗ＴＧＦβ１、２、３ ＧＣ１００８抗体（ＶＨ：配列番号７４及びＶＨ：配列番号７５）を、本明細書に記載されるように、イヌ科動物化及びネコ科動物化の両方の技術を使用して生物種化した。

ＧＣ１００８モノクローナル抗体についての６つのＣＤＲは次のとおりである。

組換えヒト：ネコ科動物キメラの構築
抗体可変ドメインは抗原結合に関与し、したがって、ＧＣ１００８抗体の完全な可変ドメインの、異なる定常領域、例えば、異なる種の定常領域への移植は、ネコ科動物ＴＧＦβタンパク質に結合する抗体の能力にほとんど又はまったく影響を及ぼさないはずである。そのようなものであるから、発現ベクターを、哺乳類発現系において組換えキメラ抗体を産生するように設計した。本明細書に記載されるキメラ抗体は、異なる種からのＩｇＧ分子のそれぞれの重鎖及び軽鎖定常領域上に移植された、宿主種抗体からの可変配列（ＣＤＲとフレームワークとの両方）からなる。例えば、ヒト化抗体、例えば、配列番号７９及び配列番号８０からの可変領域、並びにネコ科動物種（アミノ酸配列番号７５）からの重鎖定常領域であり、ヒト：ネコ科動物キメラと本明細書で称されるであろう。所望のキメラ抗体を産生するために、固有の制限エンドヌクレアーゼ部位、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、及びＮ末端分泌リーダーを含有する選択された抗体の可変重（ＶＨ）配列及び可変軽（ＶＬ）配列のための合成ＤＮＡ配列を構築して、哺乳類細胞株からの組換え抗体の発現及び分泌を容易にした。

本明細書でｆｅｌｃｈｉｍＧＣ１００８と称される、ヒト：ネコ科動物ＧＣ１００８キメラについて、ヒト可変領域（配列番号７９及び８０）を、ネコ科動物ＩｇＧ重鎖（配列番号７５）又は軽鎖（配列番号８３）定常領域のいずれかを含有する哺乳類発現プラスミドにクローニングした。ＣＭＶプロモーターの制御下で、各重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドを、標準的な方法を使用してＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションした（配列番号１及び配列番号２）。６日間の発現後、キメラｍＡｂを、タンパク質精製のための標準的な方法に従って、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕｒｅプロテインＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、５０ｍｌの一過性トランスフェクションしたＨＥＫ２９３ＦＳ細胞上清から精製した。溶出した画分を中和し、公称で１０，０００ＭＷカットオフのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用して約０．５～１．０ｍＬまで濃縮し、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、８５ｇ／Ｌのスクロース、＋／－０．０５ｇ／ＬのＥＤＴＡ中で４℃にて一晩透析し、更なる使用のために４℃で保存した。

抗体ＧＣ１００８のイヌ科動物化
抗薬物抗体（ＡＤＡ）の生成は、モノクローナル抗体を含む任意の生物学的治療タンパク質についての有効性の喪失と関連付けられている。免疫原性完全ヒトｍＡｂ及び非免疫原性キメラｍＡｂの例を見出し得るが、モノクローナル抗体の生物種化は、ｍＡｂについて免疫原性になる傾向を低減させ得る。本明細書に提供されるＧＣ１００８モノクローナル抗体においてＡＤＡ形成に関連するリスクを軽減するのに役立つために、イヌ科動物化戦略を用いた。このイヌ科動物化戦略は、ＣＤＲ移植のための最も適切なイヌ科動物生殖細胞系列抗体の配列を同定することに基づいている。可変重鎖と可変軽鎖との両方について利用可能なイヌ科動物生殖細胞系列配列の広範な分析の後、ＧＣ１００８抗体可変領域のフレームワーク領域に対するそれらの相同性に基づいて生殖細胞系列の候補を選択し、ＣＤＲ（ＶＨ配列番号２３、３３、及び３９並びにＶＬ配列番号３、４、５）を使用して、天然のイヌ科動物ＣＤＲを置き換えた。その目的は、インビボでの免疫原性の可能性を最小限に抑えるために、イヌ科動物抗体フレームワークを使用して高い親和性及び細胞ベースの活性を保持することであった。

イヌ科動物化ＧＣ１００８抗体についてのイヌ科動物化可変重鎖及び軽鎖を表す合成ヌクレオチド構築物を作製した。当初、４つのイヌ科動物可変重鎖（ＶＨ２、３、４、及び６）及び４つのイヌ科動物カッパ軽鎖（ＶＬ１－４）を表す合成ヌクレオチド構築物に焦点を当てたＧＣ１００８抗体によるイヌ科動物化努力を、初期のイヌ科動物化のために選択した。各可変鎖を、それぞれのイヌ科動物の重（配列番号７７）又はカッパ（配列番号８１）定常領域を含有するプラスミドにサブクローニングした後、プラスミドを、多数のイヌ科動物化抗体構築物を作製するために全ての可能な組み合わせにおいてＨＥＫ２９３細胞における抗体発現のために同時トランスフェクションした。２つを除く全てのイヌ科動物化構築物が一過性のＨＥＫ２９３発現系で発現した。発現後、全ての３つＴＧＦβアイソフォームへの結合を評価した。以下を参照されたい。驚くべきことに、インビトロ結合又は機能的活性は観察されなかった。ＣＤＲ及びフレームワーク領域内のアミノ酸を変異させ、挿入又は欠失させて、ｍＡｂ結合界面を標的アイソタイプに微調整した。イヌ科動物のフレームワーク上に移植された予め決定された標準的なヒト相補性決定領域は、標的アイソタイプに対する親和性を著しく低減したため、完全種テンプレートｍＡｂの標的に対する同等の親和性を取り戻すために追加の操作が必要であった。再操作されたＶＨ及びＶＬは、以下の表２において＊で示される。

ＧＣ１００８のネコ科動物化
ＧＣ１００８抗体のイヌ科動物化と同様に、イヌ科動物化に使用されたのと同じＣＤＲ領域配列を採取し、それらをネコ科動物可変フレームワーク配列と組み込むことによって、ネコ科動物化抗体を生成した。ネコ科動物のデータベースを、調査するネコ科動物生殖細胞系列を同定するために、キメラ及び／又はイヌ科動物化抗体に対して同様のフレームワークについて検索した。最初に、２つの重鎖フレームワーク及び４つの軽鎖フレームワークを選択し、以下のネコ科動物化可変領域の産生をもたらした。

各可変鎖を、それぞれのネコ科動物の重鎖（配列番号７５）又はカッパ鎖（配列番号８３）定常領域を含有するプラスミドにサブクローニングした後、プラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞における抗体発現のために同時トランスフェクションした。重鎖及び軽鎖の組み合わせを得るために、同時トランスフェクションを実施した。結合及び機能的アッセイ（以下に記載）を、イヌ科動物化及びネコ科動物化バージョンにおいて、元のＶＨ及びＶＬに対して実施した。驚くべきことに、インビトロ結合又は機能的活性は観察されなかった。ＣＤＲ及びフレームワーク領域内のアミノ酸を変異させ、挿入又は欠失させて、ｍＡｂ結合界面を標的アイソタイプに微調整した。ネコ科動物のフレームワーク上に移植された予め決定された標準的なヒト相補性決定領域は、標的アイソタイプに対する親和性を著しく低減したため、完全種テンプレートｍＡｂの標的に対する同等の親和性を取り戻すために追加の操作が必要であった。再操作されたＶＨ及びＶＬは、以下の表３において＊で示される。

インビトロ結合及び機能的アッセイ
ｆｅｌｃｈｉｍＧＣ１００８並びに全てのイヌ科動物化及びネコ科動物化抗体０４Ｈ０９及びｃｈｉ０４Ｈ０９の親和性及び細胞ベースの効力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価した。候補モノクローナル抗体（ｍＡｂ）がＴＧＦβ１、２、及び３に結合する親和性を特徴付けるために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システム（Ｂｉｏｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して評価した。抗体を表面に固定化するときに生じ得る異なる表面調製に関連する親和性の差異を回避するために、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を個々の表面に直接コンジュゲートした。固定化は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）／１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）化学を使用して、５μｇ／ｍＬのアミンカップリングによって得た。チップをエタノールアミンによりクエンチし、固定化されたＴＧＦβに結合した全ての候補ｍＡｂとの親和性を評価した。全ての曲線を１：１のモデルに適合させた。＜１０－１１の親和性を機器に対する検出の定量下限未満とする。

効力についてアッセイするために、イヌ科動物僧帽弁間細胞（ＣＭＶＩＣ）におけるＴＧＦβ１誘導ＳＭＡＤ３リン酸化の阻害を測定する一次細胞ベースのアッセイ。このアッセイのために、抗体を有するか又は有しない細胞に、ＴＧＦβ１、２、又は３を添加し、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ検出キットを介してＳＭＡＤ３シグナル伝達を決定した。ＴＧＦβ１、２、及び３表面に対する全てのｍＡｂの親和性、並びに各抗体の効力を、表６及び７（以下）に示す（それぞれ、ＫＤデータ及びＣＭＶＩＣデータ）。

実施例２
ＺＴＳ－１２２及びＺＴＳ－２０７の薬物動態
イヌ科動物化ＺＴＳ－１２２（ＶＨ３．１及びＶＬ２［それぞれ、配列番号４９及び配列番号６８］）及びＺＴＳ－２０７（ＶＨ４．５－ＶＬ２［それぞれ、配列番号４８及び配列番号６８］）の皮下薬物動態を決定するための研究を実施した。各分子を、０日目及び２８日目に１ｍｇ／ｋｇの皮下投与で４匹のイヌに与えた。投与前、１、３、７、１０、１４、２１、２８、２９、３１、３５、３８、４３、４９、及び５６日目に、動物から血漿試料を収集した。血漿中の各モノクローナル抗体の曝露を、リガンド結合方法を使用して評価した。それらの薬物動態特性を、期間１（０日目の用量）及び期間２（２８日目の用量）のノンコンパートメント解析を使用して評価した。表８（以下）を参照されたい。

Claims (28)

1. イヌ科動物ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に特異的に結合するイヌ科動物化抗体であって、配列番号２３、配列番号３３、及び配列番号３９を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、を含むイヌ科動物化抗体、およびそれらのバリアント。
2. 配列番号７７に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むイヌ科動物ＩｇＧＢ定常領域を更に含む、請求項１に記載のイヌ科動物化抗体。
3. イヌ科動物ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に特異的に結合するイヌ科動物化抗体であって、配列番号４２～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６７～７０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、イヌ科動物化抗体。
4. 配列番号４９を含むアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項３に記載のイヌ科動物化抗体。
5. 配列番号４９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、かつ配列番号６８を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項３に記載のイヌ科動物化抗体。
6. 配列番号４８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、かつ配列番号６８を含むアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項３に記載のイヌ科動物化抗体。
7. 配列番号４９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、かつ配列番号６８を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項３に記載のイヌ科動物化抗体。
8. ＴＧＦβ関連障害の治療における使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
9. ＴＧＦβ関連障害が、線維症障害、結合組織障害、骨障害、及び細胞増殖障害からなる群から選択される、請求項８に記載の抗体。
10. ＴＧＦβ関連障害が、線維症障害を含む、請求項９に記載の抗体。
11. 線維症障害が、腎臓線維症／慢性腎臓疾患、肺線維症、肝硬変、グリア瘢痕、及び全身性硬化症／強皮症からなる群から選択される、請求項１０に記載の抗体。
12. ＴＧＦβ関連障害が、腎臓線維症／慢性腎臓疾患である、請求項１１に記載の抗体。
13. 治療有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
14. ＴＧＦβ関連障害についてイヌ科動物を治療する方法であって、治療量の請求項８に記載の薬学的組成物を前記イヌ科動物に投与することによって治療する方法。
15. ＴＧＦβ関連障害が、線維症障害、結合組織障害、骨障害、及び細胞増殖障害からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. ＴＧＦβ関連障害が、線維症障害を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 線維症障害が、腎臓線維症／慢性腎臓疾患、肺線維症、肝硬変、グリア瘢痕、及び全身性硬化症／強皮症からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. ＴＧＦβ障害が、腎臓線維症／慢性腎臓疾患である、請求項１７に記載の方法。
19. 請求項８に記載の薬学的組成物を投与することによって、イヌ科動物におけるＴＧＦβ１、２、及び３活性を阻害する方法。
20. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する単離された核酸配列、及び、保存的アミノ酸置換をもたらす１つ以上の核酸置換を有するその任意のバリアント。
21. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸配列であって、配列番号５５～６６に対して９５％の配列同一性を有する前記ＶＨをコードするヌクレオチド配列と、配列番号７１～７４に対して９５％の配列同一性を有する前記ＶＬをコードするヌクレオチド配列、とを含む、前記単離された核酸配列、及び、保存的アミノ酸置換をもたらす１つ以上の核酸置換を有するそれらの任意のバリアント。
22. 請求項２１に記載の抗体をコードする単離された核酸配列であって、配列番号６２に対して９５％の配列同一性を有する前記ＶＨをコードするヌクレオチド配列と、配列番号７２に対して９５％の配列同一性を有する前記ＶＬをコードするヌクレオチド配列、とを含む、前記単離された核酸配列、及び、保存的アミノ酸置換をもたらす１つ以上の核酸置換を有するそれらの任意のバリアント。
23. 請求項２１に記載の抗体をコードする単離された核酸配列であって、配列番号６１に対して９５％の配列同一性を有する前記ＶＨをコードするヌクレオチド配列と、配列番号７２に対して９５％の配列同一性を有する前記ＶＬをコードするヌクレオチド配列、とを含む、前記単離された核酸配列、及び、保存的アミノ酸置換をもたらす１つ以上の核酸置換を有するそれらの任意のバリアント。
24. 請求項２０～２３のいずれか一項に記載の核酸配列を含む、ベクター。
25. 請求項２０～２３のいずれか一項に記載の核酸配列を含む、宿主細胞。
26. 請求項２４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
27. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体を産生する、宿主細胞。
28. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の宿主細胞を、前記抗体の産生をもたらす条件下で培養することと、前記宿主細胞又は前記宿主細胞の培養培地から前記抗体を単離することとを含む、前記方法。