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JP2024534523A - 操作されたｃａｓｘリプレッサー系 - Google Patents

操作されたｃａｓｘリプレッサー系 Download PDF

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JP2024534523A
JP2024534523A JP2024517501A JP2024517501A JP2024534523A JP 2024534523 A JP2024534523 A JP 2024534523A JP 2024517501 A JP2024517501 A JP 2024517501A JP 2024517501 A JP2024517501 A JP 2024517501A JP 2024534523 A JP2024534523 A JP 2024534523A
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Abstract

本開示は、触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、融合タンパク質として触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結された１つ以上の転写リプレッサードメインと、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、を含む遺伝子リプレッサー系、並びにそれを作製及び使用する方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／２４６，５４３号及び２０２２年３月１８日に出願された同第６３／３２１，５１７号に対する優先権を主張し、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組み込み
電子配列表（ＳＣＲＢ＿０３４＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ、サイズ：６３，３９４，３８６バイト、及び作成日：２０２２年９月１６日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法は多様である。哺乳動物系では、細胞は、クロマチン調節因子（ＣＲ）の系、並びに関連するヒストン及びＤＮＡ修飾を使用して、遺伝子発現を調節し、長期的なエピジェネティック記憶を確立する。この系は、発達、加齢、及び疾患において重要であり、合成生物学に調節を組み込むための必須能力を提供し得る。実験系では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などの方法は、標的化遺伝子ノックダウンに有用であり、大規模なライブラリースクリーンに広く使用されている。しかしながら、ＲＮＡｉにはいくつかの制限がある。特に、ＲＮＡｉベースのノックダウンは、標的の不完全なノックダウンとともに、オフターゲット効果に悩まされている（Ｊａｃｋｓｏｎ ＡＬ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡｉ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６３５（２００３））、Ｓｉｇｏｉｌｌｏｔ ＦＤ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ＲＮＡｉ ｓｃｒｅｅｎｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９：９（４）：３６３（２０１２））。転写リプレッサードメインに連結されたジンクフィンガータンパク質又は転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）などの調整されたＤＮＡ結合タンパク質は、選択的遺伝子抑制を媒介することができるが、各所望の標的遺伝子が新しいタンパク質の生成を必要とするという事実によって制限される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の出現及びこれらの系のプログラム可能な性質は、ゲノム操作及びエンジニアリングのための多目的技術としてのそれらの使用を促進している。特定のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、そのような操作に特に適している。例えば、ある特定のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、コンパクトなサイズを有し、送達の容易さを提供し、タンパク質をコードするヌクレオチド配列は比較的短く、細胞送達のためのウイルスベクターへのその組み込みの利点である。しかしながら、ある特定の疾患の兆候では、遺伝子サイレンシング、又は抑制が、遺伝子編集よりも好ましい。ＣａｓＸを触媒不活性型（ｄＣａｓＸ）にする能力が実証されており（ＷＯ２０２０／２４７８８２Ａ１）、これにより、遺伝子サイレンシングが可能な融合タンパク質の生成のための魅力的なプラットフォームになる。したがって、当該技術分野では、様々な治療用途、診断用途、及び研究用途で利用するためのＣａｓ９に基づくものなど、より早期世代の遺伝子リプレッサー系と比べて最適化されている、かつ／又は改善を提供する、追加の遺伝子リプレッサー系（例えば、ｄＣａｓタンパク質＋リプレッサードメイン）に対する必要性がある。
本開示の態様は、細胞中の標的核酸の発現を調節する組成物及び方法を対象とする。
本開示は、融合タンパク質として１つ以上の転写リプレッサードメインと連結された、触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質、例えば、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、細胞中の遺伝子の標的核酸に対して相補的な標的化配列（ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系）と、を含む遺伝子リプレッサー系、融合タンパク質をコードする核酸、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系の成分をコードする又は含むベクター、及びｄＸＲ：ｇＲＮＡ系の成分をコードする又はキャプシドで包む脂質ナノ粒子の組成物、並びにｄＸＲ：ｇＲＮＡ系を作製及び使用する方法を提供する。本開示のｄＸＲ：ｇＲＮＡ系は、遺伝子産物の抑制が疾患の根底にある原因を逆転させるか、又は疾患の兆候若しくは症状を改善するのに有用である疾患における、遺伝子サイレンシング又は遺伝子抑制の方法において有用性を有し、この方法も提供される。
本開示のある特定の実施形態の更なる特徴及び利点は、以下の実施形態の説明及びその図面において、かつ特許請求の範囲から、より十分に明らかになるであろう。
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明及び添付図面を参照することによって得られる。
実施例１に記載されるような、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のｑＰＣＲによって測定された標的ｍＲＮＡの喪失の割合（％）を伴う、非標的化スペーサー及び標的化スペーサー（それぞれ左のバー及び右のバー）を使用した標的化ｄＸＲ分子及び非標的化ｄＸＲ分子を評価するアッセイの結果を示す。データは、生物学的複製からのΔΔＣｔ値を表す。 実施例２に記載されるような、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢＥＧＦ）をコードする遺伝子を標的とするｇＲＮＡを有するいずれかの触媒活性型ＣａｓＸエディター、すなわち、ＣａｓＸ－３４．１９及びＣａｓＸ－３４．２１；ＨＢＥＧＦに標的化された融合タンパク質としてのリプレッサードメインに連結された触媒活性を伴わないＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質（ｄＸＲ融合タンパク質、すなわち、ｄＸＲ１－３４．２８）、又は非標的化ｄＸＲ分子（ＣａｓＸ－ＮＴ若しくはｄＸＲ－ＮＴ）で形質導入された細胞のジフテリア毒素滴定の用量応答結果を示す。データは、２つの生物学的複製の平均及び標準偏差を表す。 実施例３に記載されるような、ガンシクロビル処置後のＴＫ－ＧＦＰ細胞株中のＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の５’ＵＴＲ配列を標的とするｄＸＲ及び３つのスペーサーのアレイ試験からの細胞数を示す。データは、ガンシクロビルを用いた処置後の単一点の細胞数を表す。ＮＴ：非標的化スペーサー。 ｄＸＲが別個のプラスミド上でコードされ、Ｇａｇ成分をコードするプラスミドがＭＳ２コートタンパク質もコードし、プロテアーゼ切断配列部位が矢印によって示されている、ＸＤＰ構築物の生成に利用されたプラスミドを示す概略図を示す。 ｄＸＲがＧａｇ成分をコードするプラスミド上でコードされ、プロテアーゼ切断配列部位が矢印によって示されている、ＸＤＰ構築物の生成に利用されたプラスミドを示す概略図を示す。 実施例５に記載されるような、示されたＰＴＢＰ１標的化スペーサーを有するｄＸＲを含有するレンチウイルス粒子を用いた形質導入の１１日後に採取された、マウス星状細胞中のＰＴＢＰ１タンパク質レベルのウェスタンブロット定量を示す棒グラフである。スペーサー２８．１０又はＮＴスペーサーを有するレンチウイルス粒子を使用してＣａｓＸリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含有するＸＤＰで処置された細胞は、実験対照としての役割を果たした。全タンパク質に対するＰＴＢＰ１タンパク質の比を、グラフ中のＮＴ対照について決定されたものに対して正規化した。 遺伝子抑制活性について試験されたエピジェネティック長期ＣａｓＸリプレッサー（ＥＬＸＲ）分子の様々な構成の概略図を示す。Ｄ３Ａ及びＤ３Ｌは、実施例６に記載されるような、それぞれＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３アルファ（ＤＮＭＴ３Ａ）及びＤＮＭＴ３Ａ様タンパク質（ＤＮＭＴ３Ｌ）を示す。ＣＤ＝触媒ドメイン、ＩＤ＝相互作用ドメイン。Ｌ１～Ｌ４は、リンカーである。ＮＬＳは、核局在化シグナルである。ＥＬＸＲ配列については、表２４及び２５を参照されたい。 実施例６に記載されるような、ＥＬＸＲタンパク質番号１～３のベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）抑制活性（ＨＬＡ陰性細胞の割合として表される）を比較する経時的実験の結果を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。 図８Ａに示されるのと同じ経時的実験の結果を示すが、実施例６に記載されるような、同じ実験対照に対してベンチマークされた、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを含有するＥＬＸＲタンパク質番号１～３のＢ２Ｍ抑制活性を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。 実施例６に記載されるような、ＥＬＸＲタンパク質番号１、番号４、及び番号５のＢ２Ｍサイレンシング活性（ＨＬＡ陰性細胞の割合として表される）を比較する経時的実験の結果を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。 図９Ａに示されるのと同じ経時的実験の結果を示すが、実施例６に記載されるような、同じ実験対照に対してベンチマークされた、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを含有するＥＬＸＲタンパク質番号１、番号４、及び番号５のＢ２Ｍサイレンシング活性を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。 実施例６に記載されるような、示された各実験条件についての、Ｂ２Ｍ遺伝子座の転写開始部位の周囲のＣｐＧ部位のＣｐＧメチル化のパーセントのバイオリンプロットである。 実施例６に記載されるような、触媒活性型ＣａｓＸ４９１及びｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌに対してベンチマークされた、ＥＬＸＲタンパク質番号１～３の相対活性（２１日目のＨＬＡ陰性細胞の平均割合）対特異性（５日目に定量化されたＢ２Ｍ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合）を示すドットプロットである。 実施例６に記載されるような、示された各実験条件についての、ＶＥＧＦＡ遺伝子座の転写開始部位の下流のＣｐＧ部位のＣｐＧメチル化のパーセントのバイオリンプロットである。 実施例６に記載されるような、Ｂ２Ｍ標的化スペーサーを有するＥＬＸＲ番号１、番号４、及び番号５を評価する示された各実験条件についての、ＶＥＧＦＡ遺伝子座の転写開始部位の周囲のＣｐＧ部位のＣｐＧメチル化のパーセントのバイオリンプロットである。 実施例６に記載されるような、非標的化スペーサーを有するＥＬＸＲ番号１、番号４、及び番号５を評価する示された各実験条件についての、ＶＥＧＦＡ遺伝子座の転写開始部位の周囲のＣｐＧ部位のＣｐＧメチル化のパーセントのバイオリンプロットである。 ＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメイン又はＺＩＭ－ＫＲＡＢドメインのいずれかを有するＥＬＸＲタンパク質番号１～５の相対活性（２１日目のＨＬＡ陰性細胞の平均割合）対特異性（５日目に定量化されたＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合の中央値）を示す散布図であり、ＥＬＸＲタンパク質を、実施例６に記載されるような触媒活性型ＣａｓＸ４９１及びｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌに対してベンチマークした。 実施例８に記載されるような、Ｂ２Ｍ標的化スペーサー又は非標的化スペーサーのいずれかを有する示された触媒活性を伴わないＣａｓＸの各々について、Ｂ２Ｍ遺伝子座でのＮＧＳによって検出されたインデル頻度として測定された編集パーセントの定量化である。触媒活性型ＣａｓＸ４９１、触媒不活性型ＣａｓＸ９（ｄＣａｓ９）、及びモックトランスフェクションは、実験対照としての役割を果たした。 実施例４に記載されるような、ＨＢＥＧＦ遺伝子座のｄＸＲ抑制を支持する能力についての選択の前及び後の配列のｌｏｇ２（倍率変化）を示すバイオリンプロットを提供する。プロットは、ＫＲＡＢドメインライブラリー全体、陰性対照配列セット、既知のＫＲＡＢリプレッサーの陽性対照セット、２超のｌｏｇ２（倍率変化）及び０．０１未満のｐ値を有する試験された上位１５９７個のＫＲＡＢドメイン、並びに試験された上位９５個のＫＲＡＢドメインの結果を示す。 実施例４に記載されるような、様々なＫＲＡＢドメインを有するｄＸＲタンパク質のＢ２Ｍサイレンシング活性（ＨＬＡ陰性細胞の割合として表される）を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。 実施例４に記載されるような、様々なＫＲＡＢドメインを有するｄＸＲタンパク質のＢ２Ｍサイレンシング活性（ＨＬＡ陰性細胞の割合として表される）を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。 実施例４に記載されるような、ＫＲＡＢドメインモチーフ１のロゴを提供する。 実施例４に記載されるような、ＫＲＡＢドメインモチーフ２のロゴを提供する。 実施例４に記載されるような、ＫＲＡＢドメインモチーフ３（配列番号５９３４５）のロゴを提供する。 実施例４に記載されるような、ＫＲＡＢドメインモチーフ４（配列番号５９３４６）のロゴを提供する。 実施例４に記載されるような、ＫＲＡＢドメインモチーフ５（配列番号５９３４７）のロゴを提供する。 実施例４に記載されるような、ＫＲＡＢドメインモチーフ６（配列番号５９３４８）のロゴを提供する。 実施例４に記載されるような、ＫＲＡＢドメインモチーフ７（配列番号５９３４９）のロゴを提供する。 実施例４に記載されるような、ＫＲＡＢドメインモチーフ８のロゴを提供する。 実施例４に記載されるような、ＫＲＡＢドメインモチーフ９のロゴを提供する。 実施例９に記載されるような、アッセイされたＥＬＸＲ分子及びｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌ対照のスペーサーによって標的化されたＣＤ１５１配列の相対位置を示す概略図である。ｇＲＮＡによって標的化された位置は、薄灰色（ＥＬＸＲと対）及び濃灰色（ｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌと対）のバーによって示される。 実施例９に記載されるような、示された標的化スペーサーを有するＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを含有するＥＬＸＲタンパク質番号１、番号４、及び番号５のＣＤ１５１抑制活性（ＣＤ１５１ノックダウンを有する総細胞の割合として表される）を比較する経時的実験の結果を示す棒グラフである。各時点（６日目、１５日目、及び２２日目）のデータは重ね合わされ、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。 実施例１０に記載されるような、Ｂ２Ｍ遺伝子のプロモーター領域における約１ＫＢウィンドウにわたってタイル表示された様々なＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡの位置を示す概略図である。数字は、図２１Ｂに示される特定のＢ２Ｍ標的化スペーサーに対応する。標的化ｇＲＮＡは、灰色のバーによって示される。 実施例１０に記載されるような、示されたＢ２Ｍ標的化スペーサーを有するｄＸＲ１又はＥＬＸＲ番号１のいずれかによって媒介される、ＨＬＡ陰性細胞の平均割合として表される、Ｂ２Ｍ抑制の定量化を示す棒グラフである。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。ＮＴ＝非標的化スペーサー。 実施例１１に記載されるような、スペーサー７．３７を使用したＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを有する示されたＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３及びそのバリアントのＢ２Ｍ抑制活性（ＨＬＡ陰性細胞の割合として表される）を比較する経時的実験の結果を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。ＣＤ＝ＤＮＭＴ３Ａの触媒ドメイン。 図２２に示されるのと同じ経時的実験の結果を示すが、実施例１１に記載されるような、スペーサー７．１６０を使用したＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを有する示されたＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３バリアントのＢ２Ｍ抑制活性を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。 図２２に示されるのと同じ経時的実験の結果を示すが、実施例１１に記載されるような、スペーサー７．１６５を使用したＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを有する示されたＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３バリアントのＢ２Ｍ抑制活性を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。 図２２に示されるのと同じ経時的実験の結果を示すが、実施例１１に記載されるような、非標的化ｇＲＮＡを有する示されたＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３バリアントのＢ２Ｍ抑制活性を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。 実施例１１に記載されるような、３つのＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ及び非標的化ｇＲＮＡについての、示された各ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３バリアントのＶＥＧＦＡ遺伝子座の転写開始部位の下流のＣｐＧ部位のＣｐＧメチル化のパーセントのバイオリンプロットである。 実施例１１に記載されるような、示されたＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３バリアントについての、相対活性（スペーサー７．１６０についての２１日目のＨＬＡ陰性細胞の平均割合）対特異性（スペーサー７．１６０についての７日目に定量化されたＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合）を示す散布図である。 実施例１４に記載されるような、６日目の細胞内ＰＣＳＫ９に対して陰性に染色された、示されたＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡと対になったｄＸＲ１又はＥＬＸＲ１－ＺＩＭ３ ｍＲＮＡのいずれかで処置された、マウスＨｅｐａ１－６細胞の割合を示す棒グラフである。ヒトＰＣＳＫ９遺伝子座を標的とするスペーサー６．７は、非標的化対照としての役割を果たした。 実施例１４に記載されるような、送達後６、１３、及び２５日目の細胞内ＰＣＳＫ９に対して陰性に染色された、示されたＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡと対になったｄＸＲ１ ｍＲＮＡで処置された、マウスＨｅｐａ１－６細胞の割合を示す経時プロットである。ヒトＰＣＳＫ９遺伝子座を標的とするスペーサー６．７は、非標的化対照としての役割を果たし、水を用いた処置は、陰性対照としての役割を果たした。 実施例１４に記載されるような、送達後６、１３、及び２５日目の細胞内ＰＣＳＫ９に対して陰性に染色された、示されたＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡと対になったＥＬＸＲ１－ＺＩＭ３ ｍＲＮＡで処置された、マウスＨｅｐａ１－６細胞の割合を示す経時プロットである。ヒトＰＣＳＫ９遺伝子座を標的とするスペーサー６．７は、非標的化対照としての役割を果たし、水を用いた処置は、陰性対照としての役割を果たした。 実施例１４に記載されるような、７日目の細胞内ＰＣＳＫ９に対して陰性に染色された、示されたＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡと対になったＥＬＸＲ１－ＺＩＭ３、ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３、触媒活性型ＣａｓＸ４９１、又はｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ ｍＲＮＡで処置された、マウスＨｅｐａ１－６細胞の割合を示す棒グラフである。ヒトＰＣＳＫ９遺伝子座を標的とするスペーサー６．７は、非標的化対照としての役割を果たした。社内ＩＶＴ又は第三者によるｍＲＮＡの産生は、括弧内に示される。 実施例１４に記載されるような、送達後７及び１４日目の細胞内ＰＣＳＫ９に対して陰性に染色された、示されたＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡと対になったＩＶＴ産生ＥＬＸＲ１－ＺＩＭ３対ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ５ ｍＲＮＡで処置された、マウスＨｅｐａ１－６細胞の割合を示す経時プロットである。 実施例１４に記載されるような、送達後７及び１４日目の細胞内ＰＣＳＫ９に対して陰性に染色された、示されたＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡと対になった第三者産生ＥＬＸＲ１－ＺＩＭ３対ｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ ｍＲＮＡで処置された、マウスＨｅｐａ１－６細胞の割合を示す経時プロットである。 実施例１２に記載されるような、様々な濃度でのＤＮＭＴ１阻害剤５－ａｚａｄＣを用いた処置の６日後にＢ２Ｍを発現した、示されたＣａｓＸ又はＥＬＸＲ：ｇＲＮＡ構築物をコードするプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の割合を示すプロットである。 実施例１２に記載されるような、示されたＣａｓＸ又はＥＬＸＲ：ｇＲＮＡ構築物をコードするプラスミドでトランスフェクトされ、５８日間培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＢ２Ｍ抑制の定量化を、５－ａｚａｄＣでトランスフェクトされた細胞の処置時のＢ２Ｍ再活性化の定量化と並置するプロットである。 実施例１１に記載されるような、追加のＤＮＭＴ３Ａドメインが組み込まれた、様々なＥＬＸＲ番号５アーキテクチャの概略図を示す。追加のＤＮＭＴ３Ａドメインは、ＤＮＭＴ３ＡのＡＤＤドメイン（「Ｄ３Ａ ＡＤＤ」）及びＤＮＭＴ３ＡのＰＷＷＰドメイン（「Ｄ３Ａ ＰＷＷＰ」）であった。「Ｄ３Ａ ｅｎｄｏ」は、ＤＮＭＴ３Ａ ＰＷＷＰドメインとＡＤＤドメインとの間で生じる内在性配列をコードする。「Ｄ３Ａ ＣＤ」及び「Ｄ３Ｌ ＩＤ」は、それぞれＤＮＭＴ３Ａの触媒ドメイン及びＤＮＭＴ３Ｌの相互作用ドメインを示す。「Ｌ１～Ｌ３」は、リンカーである。「ＮＬＳ」は、核局在化シグナルである。ＥＬＸＲ配列については、表３３を参照されたい。 実施例１３で試験されたＥＬＸＲ構成番号１、番号４、及び番号５のＡＤＤドメインを有するＥＬＸＲ分子の一般的なアーキテクチャの概略図を示す。「Ｄ３Ａ ＡＤＤ」、「Ｄ３Ａ ＣＤ」、及び「Ｄ３Ｌ ＩＤ」は、実施例１３に記載されるように、それぞれＤＮＭＴ３ＡのＡＤＤドメイン、ＤＮＭＴ３Ａの触媒ドメイン、及びＤＮＭＴ３Ｌの相互作用ドメインを示す。「Ｌ１～Ｌ４」は、リンカーである。「ＮＬＳ」は、核局在化シグナルである。ＥＬＸＲ配列については、表３５を参照されたい。 実施例１に記載されるような一般的なｄＸＲ構成の概略図を示す。ＮＬＳは、核局在化シグナルであり、Ｌ３は、リンカー３である（ＡＡ配列については、表２４を参照されたい）。 実施例１３に記載されるような、スペーサー７．１６０を有するＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡと対になった場合の、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインあり又はなしの構成番号１、番号４、又は番号５を有するＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲのＢ２Ｍ抑制活性（ＨＬＡ陰性細胞の割合として表される）を比較する経時的実験の結果を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。「ＮＴ」は、非標的化スペーサーを有するｇＲＮＡである。 図３９Ａに示されるのと同じ経時的実験の結果を示すプロットであるが、実施例１３に記載されるような、スペーサー７．１６０を有するＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡと対になった、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインあり又はなしのＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメイン又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ番号５のＢ２Ｍ抑制活性を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。「ＮＴ」は、非標的化スペーサーを有するｇＲＮＡである。 図３９Ａに示されるのと同じ経時的実験の結果を示すプロットであるが、実施例１３に記載されるような、示されたスペーサーを有するＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡと対になった、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインあり又はなしのＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３についてのＢ２Ｍ抑制活性を示す。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。「ＮＴ」は、非標的化スペーサーを有するｇＲＮＡである。 実施例１３に記載されるような、示されたｇＲＮＡのＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインあり又はなしの構成番号１を有するＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメイン又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインのいずれかを有するＥＬＸＲについての、トランスフェクション後２７日目のＢ２Ｍ抑制活性の結果を示すプロットである。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。「ＮＴ」は、非標的化スペーサーを有するｇＲＮＡである。 実施例１３に記載されるような、示されたｇＲＮＡのＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインあり又はなしの構成番号４を有するＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメイン又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインのいずれかを有するＥＬＸＲについての、トランスフェクション後２７日目のＢ２Ｍ抑制活性の結果を示すプロットである。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。「ＮＴ」は、非標的化スペーサーを有するｇＲＮＡである。 実施例１３に記載されるような、示されたｇＲＮＡのＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインあり又はなしの構成番号５を有するＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメイン又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインのいずれかを有するＥＬＸＲについての、トランスフェクション後２７日目のＢ２Ｍ抑制活性の結果を示すプロットである。データは、標準偏差を伴う平均、Ｎ＝３として表される。「ＮＴ」は、非標的化スペーサーを有するｇＲＮＡである。 実施例１３に記載されるような、示されたｇＲＮＡのＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインあり又はなしの構成番号１を有するＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメイン又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインのいずれかを有するＥＬＸＲについての、トランスフェクション後５日目のＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットメチル化を決定するために使用されたバイサルファイトシーケンシングの結果を示すプロットである。データは、ＶＥＧＦＡ遺伝子座付近のＣｐＧ部位のＣｐＧメチル化の平均割合として表され、平均の標準誤差も表され、Ｎ＝３である。「ＮＴ」は、非標的化スペーサーを有するｇＲＮＡである。 実施例１３に記載されるような、示されたｇＲＮＡのＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインあり又はなしの構成番号４を有するＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメイン又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインのいずれかを有するＥＬＸＲについての、トランスフェクション後５日目のＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットメチル化を決定するために使用されたバイサルファイトシーケンシングの結果を示すプロットである。データは、ＶＥＧＦＡ遺伝子座付近のＣｐＧ部位のＣｐＧメチル化の平均割合として表され、平均の標準誤差も表され、Ｎ＝３である。「ＮＴ」は、非標的化スペーサーを有するｇＲＮＡである。 実施例１３に記載されるような、示されたｇＲＮＡのＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインあり又はなしの構成番号５を有するＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメイン又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインのいずれかを有するＥＬＸＲについての、トランスフェクション後５日目のＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットメチル化を決定するために使用されたバイサルファイトシーケンシングの結果を示すプロットである。データは、ＶＥＧＦＡ遺伝子座付近のＣｐＧ部位のＣｐＧメチル化の平均割合として表され、平均の標準誤差も表され、Ｎ＝３である。「ＮＴ」は、非標的化スペーサーを有するｇＲＮＡである。 実施例１３に記載されるような、スペーサー７．１６０を有するＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡについての、構成番号１、番号４、及び番号５を有するＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ分子の相対活性（２７日目のＨＬＡ陰性細胞の平均割合）対特異性（５日目に定量化されたＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合）を示すドットプロットである。 実施例１３に記載されるような、スペーサー７．１６０を有するＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡについての、構成番号１、番号４、及び番号５を有するＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ分子の相対活性（２７日目のＨＬＡ陰性細胞の平均割合）対特異性（５日目に定量化されたＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合）を示すドットプロットである。 実施例１３に記載されるような、スペーサー７．３７を有するＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡについての、構成番号１、番号４、及び番号５を有するＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ分子の相対活性（２７日目のＨＬＡ陰性細胞の平均割合）対特異性（５日目に定量化されたＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合）を示すドットプロットである。 実施例１３に記載されるような、スペーサー７．３７を有するＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡについての、構成番号１、番号４、及び番号５を有するＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ分子の相対活性（２７日目のＨＬＡ陰性細胞の平均割合）対特異性（５日目に定量化されたＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合）を示すドットプロットである。 実施例１３に記載されるような、スペーサー７．１６５を有するＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡについての、構成番号１、番号４、及び番号５を有するＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ分子の相対活性（２７日目のＨＬＡ陰性細胞の平均割合）対特異性（５日目に定量化されたＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合）を示すドットプロットである。 実施例１３に記載されるような、スペーサー７．１６５を有するＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡについての、構成番号１、番号４、及び番号５を有するＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ分子の相対活性（２７日目のＨＬＡ陰性細胞の平均割合）対特異性（５日目に定量化されたＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合）を示すドットプロットである。 ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤの組み込みを伴うＥＬＸＲ分子の様々な構成の概略図を示す。「Ｄ３Ａ ＡＤＤ」、「Ｄ３Ａ ＣＤ」、及び「Ｄ３Ｌ ＩＤ」は、それぞれＤＮＭＴ３ＡのＡＤＤドメイン、ＤＮＭＴ３Ａの触媒ドメイン、及びＤＮＭＴ３Ｌの相互作用ドメインを示す。Ｌ１～Ｌ３は、リンカーである。ＮＬＳは、核局在化シグナルである。
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態がほんの一例として提供されることが、当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、多数の変形例、変更、及び置換がここで、当業者に想起されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明を実践する際に採用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求及びそれらの均等物の範囲内の方法及び構造は、その対象となることが意図される。
別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を、本実施形態の実践又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料が以下に記載される。矛盾がある場合、定義を含む特許明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は、例証的にすぎず、限定的であることを意図していない。本発明から逸脱することなく、多数の変形例、変更、及び置換がここで、当業者に想起されるであろう。
定義
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、多重鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、多重鎖ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、並びにプリン及びピリミジン塩基、あるいは他の天然、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然、又は誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
「ハイブリダイズ可能」又は「相補的」は、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）がヌクレオチドの配列を含み、これが、温度及び溶液イオン強度の適切なインビトロ及び／又はインビボ条件下で、配列特異的な逆平行様式で（すなわち、核酸が相補的核酸に特異的に結合する）別の核酸に非共有的に結合する、すなわち、ワトソン・クリック対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を形成することを可能にすることを意味するために、互換的に使用される。ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はなく、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有し、依然として標的核酸配列にハイブリダイズすることができることが理解される。更に、ポリヌクレオチドは、介在又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズし得る（例えば、ループ構造又はヘアピン構造、「バルジ」、「バブル」など）。
「遺伝子」は、本開示の目的のために、遺伝子産物（例えば、タンパク質、又はＲＮＡ）をコードするＤＮＡ領域、並びに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、そのような調節要素配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接するかどうかに関わりない。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリクス付着部位、並びに遺伝子座制御領域を含むがこれらに限定されない、調節配列を含み得る。コード配列は、転写又は転写及び翻訳時に遺伝子産物をコードし、本開示のコード配列は、断片を含み得、完全長オープンリーディングフレームを含有する必要はない。遺伝子は、転写される鎖、例えば、コード配列を含有する鎖、並びに相補鎖の両方を含み得る。
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の３’に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、コード領域又は転写開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは、転写開始部位の上流に位置する。
「調節要素」という用語は、本明細書では「調節配列」という用語と互換的に使用され、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）を含むことを意図している。例示的な調節要素としては、転写プロモーター、例えば、限定されないが、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ－Ｌｔｒ、伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）、ＭＭＬＶ－ｌｔｒ、単一の転写産物からの複数の遺伝子の翻訳を可能にするための内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又はＰ２Ａペプチド、メタロチオネイン、転写エンハンサー要素、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳開始の最適化のための配列、及び翻訳終結配列が挙げられる。適切な調節要素の選択は、発現されるコードされた成分（例えば、タンパク質若しくはＲＮＡ）、又は核酸が異なるポリメラーゼを必要とするか、若しくは融合タンパク質として発現されることを意図していない複数の成分を含むかどうかに依存することが理解されるであろう。
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、ＴＡＴＡボックス、及び／又はＢ認識要素を含有し、関連する転写可能なポリヌクレオチド配列及び／又は遺伝子（又は導入遺伝子）の転写及び発現を補助又は促進するＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、合成的に産生することができるか、又は既知若しくは自然に存在するプロモーター配列、あるいは別のプロモーター配列に由来し得る。プロモーターは、転写される遺伝子の近位又は遠位にあり得る。プロモーターはまた、ある特定の特性を付与するための２つ以上の異種配列の組み合わせを含む、キメラプロモーターを含むことができる。本開示のプロモーターは、既知であるか、又は本明細書で提供される他のプロモーターと組成が類似しているが、それと同一ではないプロモーター配列のバリアントを含むことができる。プロモーターは、構成的、発生的、組織特異的、誘導性など、プロモーターに作動可能に連結された関連するコード配列若しくは転写可能な配列又は遺伝子の発現パターンに関する基準に従って分類され得る。
「エンハンサー」という用語は、転写因子と呼ばれる特定のタンパク質によって結合されたとき、関連する遺伝子の発現を調節する調節要素ＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、遺伝子のイントロン、又は遺伝子のコード配列の５’若しくは３’に位置してもよい。エンハンサーは、遺伝子の近位にあってもよく（すなわち、プロモーターの数十若しくは数百塩基対（ｂｐ）以内）、又は遺伝子の遠位に位置してもよい（すなわち、プロモーターから数千ｂｐ、数十万ｂｐ、又は更には数百万ｂｐ離れている）。単一の遺伝子は、２つ以上のエンハンサーによって調節されてもよく、その全てが本開示の範囲内であると想定される。
「作動可能に連結された」とは、２つ以上の成分（配列要素など）の並置を参照して、両方の成分が正常に機能し、成分のうちの少なくとも１つが、他の成分、例えば、プロモーター及びコード配列のうちの少なくとも１つに及ぼされる機能を媒介することができるように成分が配置されていることを意味する。
「リプレッサードメイン」は、ＤＮＡの転写を阻害、抑制、又は遮断するＤＮＡ上の調節要素として作用し、遺伝子発現の抑制をもたらすポリペプチド因子を指す。リプレッサードメインは、リプレッサーのサブユニットであり得、個々のドメインは、異なる機能特性を有し得る。本開示の文脈において、標的核酸のある特定の領域への結合親和性を有するガイドＲＮＡとリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として対になった触媒不活性型ＣＲＩＳＰＲタンパク質へのリプレッサードメインの連結は、標的核酸に結合されたとき、プロモーターからの転写を防止するか、又はそうでなければ遺伝子の発現を阻害することができる。理論によって束縛されることを望むものではないが、転写リプレッサーは、立体障害によってＲＮＡポリメラーゼの通過を物理的に遮断すること、ポリメラーゼの翻訳後修飾状態を変化させること、新生ＲＮＡのエピジェネティック状態を修飾すること、メチル化を通してＤＮＡのエピジェネティック状態を変化させること、ヒストン脱アセチル化を通してＤＮＡのエピジェネティック状態を変化させるか、若しくはヌクレオソームリモデリングを調節すること、又はエンハンサー－プロモーター相互作用を防止し、それによって、遺伝子サイレンシング若しくは遺伝子発現レベルの低減をもたらすことを含む、様々な機構によって機能することができると考えられる。
本明細書で使用される場合、「触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質」は、エンドヌクレアーゼ活性を欠くＣＲＩＳＰＲタンパク質を指す。当業者であれば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が触媒活性を伴わない可能性があるが、依然としてＤＮＡ結合などの追加のタンパク質機能を実行することができることを理解するであろう。同様に、「触媒活性を伴わないＣａｓＸ」は、エンドヌクレアーゼ活性を欠くが、依然としてＤＮＡ結合などの追加のタンパク質機能を実行することができるＣａｓＸタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、「組換え」とは、特定の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が、クローニング、制限、及び／又はライゲーション工程の様々な組み合わせの産物であり、天然系に見出される内在性核酸と区別可能な構造コード配列又は非コード配列を有する構築物をもたらすことを意味する。概して、構造コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片及び短いオリゴヌクレオチドリンカーから、又は一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てられて、細胞又は無細胞転写及び翻訳系に含まれる組換え転写単位から発現することが可能である合成核酸を提供することができる。そのような配列は、典型的には真核性遺伝子に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されていないオープンリーディングフレームの形態で提供することができる。関連配列を含むゲノムＤＮＡもまた、組換え遺伝子又は転写単位の形成に使用することができる。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’又は３’に存在し得、そのような配列は、コード領域の操作又は発現に干渉せず、実際には、様々な機構による所望の産物の産生を調節するように作用し得る（上記の「エンハンサー」及び「プロモーター」を参照）。
「組換えポリヌクレオチド」又は「組換え核酸」という用語は、自然に存在しないもの、例えば、ヒトの介入を通した配列の２つの別様に分離されたセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせは、しばしば、化学合成手段によって、又は核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子工学技術によってのいずれかで達成される。そのようなものは、通常、典型的には配列認識部位を導入又は除去しながら、コドンを、同じ又は保存的アミノ酸をコードする冗長コドンで置き換えるために行われる。代替的に、これは、所望の機能の核酸セグメントをともに接合して、機能の所望の組み合わせを生成するように実施される。この人工的な組み合わせは、しばしば、化学合成手段によって、又は核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子工学技術によってのいずれかで達成される。
同様に、「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」という用語は、自然に存在しないもの、例えば、ヒトの介入を通したアミノ配列の２つの別様に分離されたセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるポリペプチド又はタンパク質を指す。したがって、例えば、異種アミノ酸配列を含むタンパク質は、組換えである。
本明細書で使用される場合、「接触させること」という用語は、２つ以上の実体間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、標的核酸配列をガイド核酸と接触させることは、標的核酸配列及びガイド核酸が物理的接続を共有するように作製され、例えば、配列が配列類似性を共有する場合、ハイブリダイズすることができることを意味する。
「解離定数」又は「Ｋｄ」は、互換的に使用され、リガンド「Ｌ」とタンパク質「Ｐ」との間の親和性、すなわち、リガンドが特定のタンパク質にどれだけ緊密に結合するかを意味する。これは、式Ｋｄ＝［Ｌ］［Ｐ］／［ＬＰ］を使用して計算することができ、式中、［Ｐ］、［Ｌ］、及び［ＬＰ］は、それぞれ、タンパク質、リガンド、及び複合体のモル濃度を表す。
本明細書で使用される場合、「相同性指向修復」（ＨＤＲ）は、細胞における二本鎖切断の修復中に行われるＤＮＡ修復の形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、標的ＤＮＡを修復又はノックアウトするためにドナーテンプレートを使用し、ドナー（ドナーテンプレートなど）から標的への遺伝子情報の伝達につながる。ドナーテンプレートが標的ＤＮＡ配列とは異なり、ドナーテンプレートの配列の一部又は全てが標的ＤＮＡに組み込まれる場合、相同性指向修復は、挿入、欠失、又は変異による標的核酸配列の配列の変化をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」（ＮＨＥＪ）は、（修復を誘導するために相同配列を必要とする、相同性指向修復とは対照的に）相同テンプレートを必要とすることなく、互いへの切断末端の直接ライゲーションによってＤＮＡの二本鎖切断の修復を指す。ＮＨＥＪは、しばしば、二本鎖切断の部位の付近のヌクレオチド配列の損失（欠失）をもたらす。
本明細書で使用される場合、「マイクロホモロジー媒介末端結合」（ＭＭＥＪ）は、（修復を誘導するために相同配列を必要とする、相同性指向修復とは対照的に）相同テンプレートを必要とすることなく、切断部位に隣接する欠失と常に関連する、変異原性ＤＳＢ修復機構を指す。ＭＭＥＪは、しばしば、二本鎖切断の部位の付近のヌクレオチド配列の損失（欠失）をもたらす。
ポリヌクレオチド又はポリペプチド（又はタンパク質）は、別のポリヌクレオチド又はポリペプチドとある特定の割合の「配列類似性」又は「配列同一性」を有し、これは、アラインメントされると、塩基又はアミノ酸の割合が同一であり、２つの配列を比較するときに同じ相対位置にあることを意味する。配列類似性（類似性率、同一性率、又は相同性と称されることもある）は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列類似性を決定するために、配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴにおいてワールドワイドウェブ上で利用可能である、ＢＬＡＳＴを含む当該技術分野で既知である方法及びコンピュータプログラムを使用してアラインメントすることができる。任意の便宜的な方法を使用して、核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間の相補性率を決定することができる。例示的な方法としては、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的ローカルアラインメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）、又はＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用すること、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）を使用するデフォルト設定を使用することによるものが挙げられる。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、コードされたアミノ酸及びコードされていないアミノ酸、化学的若しくは生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸、並びに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。本用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれらに限定されない、融合タンパク質を含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」は、別のＤＮＡセグメント、すなわち、「インサート」が、細胞において付着したセグメントの複製又は発現を引き起こすように付着され得る、プラスミド、ファージ、ウイルス、又はコスミドなどのレプリコンである。
核酸、ポリペプチド、細胞、又は生物に適用される、本明細書で使用される場合の「自然に存在する」、又は「非修飾」、若しくは「野生型」という用語は、自然界で見出される核酸、ポリペプチド、細胞、又は生物を指す。
本明細書で使用される場合、「変異」は、野生型若しくは参照アミノ酸配列、又は野生型若しくは参照ヌクレオチド配列と比較した、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又はポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は細胞が自然に存在する環境とは異なる環境にある、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は細胞を説明するように意図されている。単離された遺伝子組換え宿主細胞が、遺伝子組換え宿主細胞の混合集団に存在し得る。
「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、真核細胞、原核細胞、又は単細胞実体として培養された多細胞生物（例えば、細胞株中）由来の細胞を意味し、その真核細胞又は原核細胞は、核酸（例えば、発現ベクター）のレシピエントとして使用され、核酸によって遺伝子組換えされた元の細胞の子孫を含む。単一の細胞の子孫は、自然、偶発的、又は意図的な変異に起因して、形態又はゲノム若しくは全ＤＮＡ補体において、元の親と必ずしも完全に同一ではない場合がある。「組換え宿主細胞」（遺伝子修飾宿主細胞とも呼ばれる）は、宿主である。
本明細書で使用される場合、「指向性」という用語は、ある特定の細胞若しくは組織型へのウイルス様粒子（ＶＬＰ若しくはＸＤＰ）の優先的な侵入、並びに／又はある特定の細胞若しくは組織型への侵入を促進する細胞表面との優先的な相互作用、及び任意選択的にかつ好ましくは、その後のＶＬＰ若しくはＸＤＰによって細胞中に運ばれる配列の発現（例えば、転写及び任意選択的に翻訳）を指す。
本明細書で使用される場合、「シュードタイプ」又は「シュードタイピング」という用語は、好ましい特徴を有する別のウイルスのものと置換されたウイルスエンベロープタンパク質を指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧ－タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質（特に、本明細書において以下に記載される）でシュードタイピングされ得、これは、ＨＩＶエンベロープタンパク質が主にＣＤ４＋提示細胞にウイルスを標的化するため、ＨＩＶがより広範な細胞に感染することを可能にする。
本明細書で使用される場合、「指向性因子」という用語は、ある特定の細胞又は組織型に指向性を提供するＸＤＰ又はＶＬＰの表面に組み込まれた成分を指す。指向性因子の非限定的な例としては、標的細胞マーカーに対する糖タンパク質、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、ナノボディ、線状抗体など）、受容体、及びリガンドが挙げられる。
「標的細胞マーカー」は、細胞表面受容体、サイトカイン受容体、抗原、腫瘍関連抗原、糖タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、又は指向性因子のリガンドとしての役割を果たし得る標的組織若しくは細胞の表面上に存在し得る結合部位を含むがこれらに限定されない、標的細胞によって発現される分子を指す。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、同様の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなり、脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンからなり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンからなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン群は、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンである。
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」は、本明細書では互換的に使用され、治療的利益及び／又は予防利益を含むがこれに限定されない、有益な結果又は望ましい結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、治療されている基礎疾患又は疾患の根絶又は改善を意味する。治療的利益はまた、対象が依然として基礎疾患に罹患している場合があるにもかかわらず、改善が対象で観察されるように、基礎疾患に関連する１つ以上の症状の根絶若しくは改善、又は１つ以上の臨床パラメータの改善によって達成することもできる。
本明細書で使用される場合の「治療有効量」及び「治療有効用量」という用語は、ヒト又は実験動物などの対象に１回又は反復用量で投与されると、疾患状態又は状態の任意の症状、態様、測定されたパラメータ、又は特徴に対して任意の検出可能で有益な効果を及ぼすことが可能である、ある量の薬物又は生物学的物質を単独で、又は組成物の一部として指す。そのような効果は、有益であるために絶対的である必要はない。
本明細書で使用される場合、「投与すること」とは、ある投与量の化合物（例えば、本開示の組成物）又は組成物（例えば、医薬組成物）を対象に与える方法を意味する。
「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜動物、非ヒト霊長類、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、及び他の齧歯類が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
Ｉ．一般的な方法
本発明の実施は、別段の指示がない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、及び組換えＤＮＡの従来の技術を採用し、これらは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）、及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準的教科書で見出され得、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
値の範囲が提供される場合、終点が含まれ、文脈が別途明確に決定付けない限り、その範囲の上限と下限との間、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値の間に、下限の単位の１０分の１までの各介在値が包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれ得、また、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を受けて包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれた限界のいずれか一方又は両方を除外する範囲も含まれる。
別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されるものに関連する方法及び／又は材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別様に明確に決定付けない限り、複数の参考文献を含むことに留意しなければならない。
明確にするために、別個の実施形態との関連で記載される本開示のある特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることが理解されるであろう。他の場合において、簡潔にするために、単一の実施形態との関連で記載される本開示の様々な特徴もまた、別個に、又は任意の好適な副次的組み合わせで提供され得る。本開示に関する実施形態の全ての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別かつ明示的に開示された場合と同じように本明細書に開示されることが意図される。加えて、様々な実施形態及びそれらの要素の全ての副次的組み合わせもまた、本開示によって具体的に包含され、ありとあらゆるそのような副次的組み合わせが個別かつ明示的に本明細書に開示された場合と同じように本明細書に開示される。
ＩＩ．リプレッサー及びエピジェネティック長期Ｘ－リプレッサー（ＥＬＸＲ）系
第１の態様では、本開示は、１つ以上のリプレッサードメインに連結された触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質と、抑制、サイレンシング、又は下方調節のために標的化された遺伝子の標的核酸配列に対して相補的な標的化配列を含む１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、を含む遺伝子リプレッサー系を提供し、この系は、遺伝子の標的核酸に結合し、遺伝子の転写を抑制することができる。
本開示の文脈において、かつ遺伝子に関して、遺伝子又はその一部分の転写の阻害又は遮断を指すために、「抑制」、「抑制すること」、「遺伝子発現の阻害」、「下方調節」、及び「サイレンシング」が本明細書で互換的に使用される。本開示の系によって抑制され得る遺伝子産物としては、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、構造ＲＮＡ、又はｍＲＮＡによってコードされるタンパク質が挙げられる。したがって、遺伝子の抑制は、遺伝子産物の産生の減少をもたらし得る。転写を減少させる遺伝子抑制プロセスの例としては、転写開始複合体の形成を阻害するもの、転写開始速度を減少させるもの、転写伸長速度を減少させるもの、転写の前進性を減少させるもの、及び転写活性化に拮抗するもの（例えば、転写活性化因子の結合を遮断することによる）が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子抑制は、例えば、活性化の防止並びに既存のレベルを下回る発現の阻害を構成し得る。転写抑制には、遺伝子転写の可逆的不活性化及び不可逆的不活性化の両方が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の系による抑制は、細胞中の遺伝子産物の産生の任意の検出可能な減少、好ましくは、未処置細胞、又は非標的化スペーサーを含む同等の系で処置された細胞と比較した場合の、遺伝子産物の産生の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％、又はそれらの間の任意の整数の減少を含む。最も好ましくは、遺伝子抑制は、遺伝子産物が検出されないような遺伝子発現の完全な阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、実施形態の系による転写の抑制は、細胞ベースのアッセイを含むインビトロアッセイで評価された場合、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、又は少なくとも約３か月、又は少なくとも約６か月維持される。いくつかの実施形態では、実施形態の遺伝子リプレッサー系による転写の抑制は、本明細書に記載される実施形態の系の治療有効用量を投与された対象において評価された場合、少なくとも約１日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、又は少なくとも約３か月、又は少なくとも約６か月維持される。いくつかの実施形態では、系による遺伝子抑制は、インビトロアッセイで評価された場合、検出可能なオフターゲットメチル化又はオフターゲット活性を全くもたらさないか、又は最小限もたらす。他の実施形態では、系による遺伝子抑制は、本明細書に記載される実施形態の系の治療有効用量を投与された対象において評価された場合、検出可能なオフターゲットメチル化又はオフターゲット活性を全くもたらさないか、又は最小限もたらす。
いくつかの実施形態では、本開示は、コード領域及び非コード領域を含む、標的核酸の抑制に使用するための、融合タンパク質としての１つ以上のリプレッサードメインに連結された触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質と、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）との系を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、コード領域及び非コード領域を含む、標的核酸の抑制に使用するための、融合タンパク質としての１つ以上のリプレッサードメイン（ｄＸＲ）に連結された触媒活性を伴わないＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質と、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）との系、集合的にｄＸＲ：ｇＲＮＡ系を提供する。ｇＲＮＡバリアント及び標的化配列、並びに実施形態のいずれかのｄＣａｓＸバリアントタンパク質及び連結されたリプレッサードメインは、複合体を形成し、本明細書ではリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体と称される非共有結合相互作用を介して結合することができる。いくつかの実施形態では、予め複合体化されたｄＸＲ：ｇＲＮＡ ＲＮＰの使用は、標的核酸の抑制のための細胞又は標的核酸への系成分の送達において利点をもたらす。ＲＮＰでは、ｇＲＮＡは、標的核酸の配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を有する標的化配列（「スペーサー」とも称される）を含むことによって、標的特異性をＲＮＰ複合体に提供し得る。ＲＮＰでは、予め複合体化されたｄＸＲ：ｇＲＮＡのｄＣａｓＸタンパク質及び連結されたリプレッサードメインは、部位特異的活性を提供し、ｇＲＮＡとのその会合によって修飾される標的核酸配列内の標的部位に誘導される（かつ標的部位で更に安定化される）。ＲＮＰ複合体のｄＣａｓＸタンパク質及び連結されたリプレッサードメインは、ｄＣａｓＸタンパク質による標的配列の結合などの複合体の部位特異的活性を提供し、連結されたリプレッサードメインは、直接又は他の細胞因子の動員のいずれかによって抑制活性を提供する。
本明細書において、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質及び連結されたリプレッサードメイン（ｄＸＲ）、ｇＲＮＡバリアント、並びにｄＸＲ及びｇＲＮＡの任意の組み合わせのｄＸＲ：ｇＲＮＡ遺伝子抑制対、ｄＸＲ及びｇＲＮＡをコードする核酸を含むか、又はそれらをコードする組成物、並びにｄＸＲ：ｇＲＮＡ又はコード核酸を含む送達モダリティが提供される。また本明細書において、ｄＣａｓＸタンパク質及び連結されたリプレッサードメイン及びｇＲＮＡを作製する方法、並びに遺伝子抑制方法及び治療方法を含む、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡを使用する方法が提供される。ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系のｄＣａｓＸタンパク質及び連結されたリプレッサードメイン及びｇＲＮＡ成分、及びそれらの特徴、並びに遺伝子の抑制、下方調節、又はサイレンシングのために組成物を使用する送達モダリティ及び方法が、以下により十分に記載される。
ＩＩＩ．ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系のリプレッサードメイン融合タンパク質
一態様では、本開示は、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質、例えば、触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結された１つ以上のリプレッサードメインを含む融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質である。いくつかの実施形態では、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質は、クラス２、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を含む。他の場合では、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃａｓ１２ｌ、Ｃａｓ１４、及び／又はＣａｓΦなどのクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、１つ以上のリプレッサードメインに連結され、ｄＸＲ融合タンパク質をもたらす、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列の群から選択される触媒活性を伴わないＣａｓＸタンパク質（ｄＣａｓＸ）である。いくつかの実施形態では、触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、１つ以上のリプレッサードメインに連結され、ｄＸＲ融合タンパク質をもたらす、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列の群から選択される触媒活性を伴わないＣａｓＸタンパク質（ｄＣａｓＸ）である。
いくつかの実施形態では、本開示は、融合タンパク質として第１のリプレッサードメインを含む融合タンパク質を提供し、第１のリプレッサードメインは、本明細書に開示されるリンカーペプチドによって触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質に融合され得るクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインである。いくつかの実施形態では、本開示は、融合タンパク質として第１のリプレッサードメインを含むｄＸＲ融合タンパク質を提供し、第１のリプレッサードメインは、本明細書に開示されるリンカーペプチドによってｄＣａｓＸに融合され、ｄＸＲ融合タンパク質をもたらし得る、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインである。
遺伝子を抑制又はサイレンシングする能力を有するリプレッサードメインの中でも、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）リプレッサードメインは、ヒトゲノム系において最も強力なものの１つである（Ａｌｅｒａｓｏｏｌ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＫＲＡＢ ｄｏｍａｉｎ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲｉ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７：１０９３（２０２０））。ＫＲＡＢドメインは、標的核酸へのｄＸＲの結合時に、Ｔｒｉｍ２８（Ｋａｐ１又はＴｉｆ１－ベータとしても既知）などであるがこれに限定されない追加のリプレッサードメインを動員することができ、これが次いで、遺伝子の転写の抑制を誘導するＣＢＸ５／ＨＰ１α及びＳＥＴＤＢ１などのクロマチン調節因子とともにタンパク質複合体を組み立てる、およそ４００個のヒトジンクフィンガータンパク質ベースの転写因子中に存在する。ＳＥＴＤＢ１は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３マークをヒストン上に堆積させるヒストンメチルトランスフェラーゼであり、これは、ヘテロクロマチンのマークである（ヒストンをアセチル化し、活性Ｈ３Ｋ９ａｃマークを堆積させる複合体は置き換えられる）。いくつかの場合では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴドメインＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｌ）は、その後、ＤＮＡ上にメチル化マークを堆積させるために動員され、その結果、系複合体が標的核酸にもはや結合されなくなった後に遺伝子のサイレンシングが持続する。哺乳動物細胞中のＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧ）のメチル化は、ＤＮＡメチル化パターンを確立するＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤＮＭＴ３ａ及び３ｂ、並びにＤＮＡ複製後にメチル化パターンを維持するＤＮＭＴＬによって触媒される（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｄｎｍｔ３ａ ａｎｄ Ｄｎｍｔ３ａ／３Ｌ ｉｓ ｇｕｉｄｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＤ ｄｏｍａｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３ ｔａｉｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８：４２４６（２０１０））。したがって、ＫＲＡＢドメインによって動員されたＳＥＴＤＢ１及びＤＮＭＴ３は、ｄＸＲ融合タンパク質のコリプレッサーとして作用する（Ｔａｔｓｕｍｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．ＤＮＭＴｓ ａｎｄ ＳＥＴＤＢ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ｃｏ－ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｉｎ ＭＡＸ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １３（１１）：ｅ０２０５９６９（２０１８））。
本開示のｄＸＲに含むのに好適な他のリプレッサードメインとしては、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３アルファ（ＤＮＭＴ３Ａ又はそのサブドメイン）、ＤＮＭＴ３Ａ様タンパク質（ＤＮＭＴ３Ｌ又はそのサブドメイン）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ベータ（ＤＮＭＴ３Ｂ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、フレンドオブＧＡＴＡ－１（Ｆｒｉｅｎｄ ｏｆ ＧＡＴＡ－１）（ＦＯＧ）、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、強化型ＳＩＤ（ＳＩＤ４Ｘ）、核受容体コリプレッサー（ＮｃｏＲ）、核エフェクタータンパク質（ＮｕＥ）、ＫＯＸ１抑制ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ＳＲＤＸ抑制ドメイン、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ、例えば、ＰＲ／ＳＥＴドメイン含有タンパク質（Ｐｒ－ＳＥＴ）７／８、リジンメチルトランスフェラーゼ５Ｂ（ＳＵＶ４－２０Ｈ１）、ＰＲ／ＳＥＴドメイン２（ＲＩＺ１）、ヒストンリジンデメチラーゼ、例えば、リジンデメチラーゼ４Ａ（ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ）、リジンデメチラーゼ４Ｂ（ＪＭＪＤ２Ｂ）、リジンデメチラーゼ４Ｃ（ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１）、リジンデメチラーゼ４Ｄ（ＪＭＪＤ２Ｄ）、リジンデメチラーゼ５Ａ（ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２）、リジンデメチラーゼ５Ｂ（ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１）、リジンデメチラーゼ５Ｃ（ＪＡＲＩＤ １Ｃ／ＳＭＣＸ）、リジンデメチラーゼ５Ｄ（ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ）、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）、ＳＩＲＴ２、ＤＮＡメチラーゼ、例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、メチルトランスフェラーゼ１（ＭＥＴ１）、ヒストンＨ３リジン９メチルトランスフェラーゼＧ９ａ（Ｇ９ａ）、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼスーパーファミリータンパク質（ＤＲＭ３）、ＤＮＡシトシンメチルトランスフェラーゼＭＥＴ２ａ（ＺＭＥＴ２）、メチル－ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）結合ドメイン２（ｍｅＣＰ２）、スイッチ独立３転写調節因子ファミリーメンバーＡ（ＳＩＮ３Ａ）、ヒストンデアセチラーゼＨＤＴ１（ＨＤＴ１）、メチル－ＣｐＧ結合ドメインタンパク質２のｎ末端短縮（ＭＢＤ２Ｂ）、タンパク質ホスファターゼ－１の核阻害剤（ＮＩＰＰ１）、ＧＬＰ、クロモメチラーゼ１（ＣＭＴ１）、クロモメチラーゼ２（ＣＭＴ２）、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１Ａ）、混合系統白血病タンパク質－５（ＭＬＬ５）、ヒストン－リジンＮ－メチルトランスフェラーゼＳＥＴＤＢ１（ＳＥＴＢ１）、斑入り３－９相同体１のサプレッサー（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ＳＵＶ３９Ｈ２、真正染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ１（ＥＨＭＴ１）、ヒストン－リジンＮ－メチルトランスフェラーゼＥＺＨ１（ＥＺＨ１）、ＥＺＨ２、核受容体結合ＳＥＴドメインタンパク質１（ＮＳＤ１）、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＡＳＨ１様ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（ＡＳＨ１Ｌ）、三要素モチーフ含有２８（ＴＲＩＭ２８）、メチルトランスフェラーゼ様３（ＭＥＴＴＬ３）、ＭＥＴＴＬ４、配列類似性を有するファミリー２０８メンバーＡ（ＦＡＭ２０８Ａ）、Ｍ相リンタンパク質８（ＭＰＨＯＳＰＨ８）、ＳＥＴドメイン含有２（ＳＥＴＤ２）、ヒストンデアセチラーゼ１（ＨＤＡＣ１）、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ペリフィリン１（ＰＰＨＬＮ１）、及びそれらのサブドメインが挙げられる。
ＫＲＡＢジンク－フィンガータンパク質をコードするヒト遺伝子としては、ＫＯＸ１／ＺＮＦ１０、ＫＯＸ８／ＺＮＦ７０８、ＺＮＦ４３、ＺＮＦ１８４、ＺＮＦ９１、ＨＰＦ４、ＨＴＦ１０、ＨＴＦ３４、及び配列番号３５５～８８８の配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系のＫＲＡＢ転写リプレッサードメイン、ＺＮＦ３４３、ＺＮＦ１０、ＺＮＦ３３７、ＺＮＦ３３４、ＺＮＦ２１５、ＺＮＦ５１９、ＺＮＦ４８５、ＺＮＦ２１４、ＺＮＦ３３Ｂ、ＺＮＦ２８７、ＺＮＦ７０５Ａ、ＺＮＦ３７Ａ、ＫＲＢＯＸ４、ＺＫＳＣＡＮ３、ＺＫＳＣＡＮ４、ＺＮＦ５７、ＺＮＦ５５７、ＺＮＦ７０５Ｂ、ＺＮＦ６６２、ＺＮＦ７７、ＺＮＦ５００、ＺＮＦ５５８、ＺＮＦ６２０、ＺＮＦ７１３、ＺＮＦ８２３、ＺＮＦ４４０、ＺＮＦ４４１、ＺＮＦ１３６、小核リボ核タンパク質ポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）、ＺＮＦ７３５、ＺＫＳＣＡＮ２、ＺＮＦ６１９、ＺＮＦ６２７、ＺＮＦ３３３、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー１１（ＡＢＣＡ１１Ｐ）、ＰＬＤ５偽遺伝子１（ＰＬＤ５Ｐ１）、ＺＮＦ２５、ＺＮＦ７２７、ＺＮＦ５９５、ＺＮＦ１４、ＺＮＦ３３Ａ、ＺＮＦ１０１、ＺＮＦ２５３、ＺＮＦ５６、ＺＮＦ７２０、ＺＮＦ８５、ＺＮＦ６６、ＺＮＦ７２２Ｐ、ＺＮＦ４８６、ＺＮＦ６８２、ＺＮＦ６２６、ＺＮＦ１００、ＺＮＦ９３、ＺＫＳＣＡＮ１、ＺＮＦ２５７、ＺＮＦ７２９、ＺＮＦ２０８、ＺＮＦ９０、ＺＮＦ４３０、ＺＮＦ６７６、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４２９、ＺＮＦ６７５、ＺＮＦ６８１、ＺＮＦ９９、ＺＮＦ４３１、ＺＮＦ９８、ＺＮＦ７０８、ＺＮＦ７３２、ＳＳＸファミリーメンバー２（ＳＳＸ２）、ＺＮＦ７２１、ＺＮＦ７２６、ＺＮＦ７３０、ＺＮＦ５０６、ＺＮＦ７２８、ＺＮＦ１４１、ＺＮＦ７２３、ＺＮＦ３０２、ＺＮＦ４８４、ＳＳＸ２Ｂ、ＺＮＦ７１８、ＺＮＦ７４、ＺＮＦ１５７、ＺＮＦ７９０、ＺＮＦ５６５、ＺＮＦ７０５Ｇ、鋤鼻１受容体１０７偽遺伝子（ＶＮ１Ｒ１０７Ｐ）、溶質担体ファミリー２７メンバー５（ＳＬＣ２７Ａ５）、ＺＮＦ７３７、ＳＳＸ４、ＺＮＦ８５０、ＺＮＦ７１７、ＺＮＦ１５５、ＺＮＦ２８３、ＺＮＦ４０４、ＺＮＦ１１４、ＺＮＦ７１６、ＺＮＦ２３０、ＺＮＦ４５、ＺＮＦ２２２、ＺＮＦ２８６Ａ、ＺＮＦ６２４、ＺＮＦ２２３、ＺＮＦ２８４、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ７４９、ＺＮＦ６１５、ＺＦＰ９０、ＺＮＦ２２５、ＺＮＦ２３４、ＺＮＦ５６８、ＺＮＦ６１４、ＺＮＦ５８４、ＺＮＦ４３２、ＺＮＦ４６１、ＺＮＦ１８２、ＺＮＦ６３０、ＺＮＦ６３０－ＡＳ１、ＺＮＦ１３２、ＺＮＦ４２０、ＺＮＦ３２４Ｂ、ＺＮＦ６１６、ＺＮＦ４７１、ＺＮＦ２２７、ＺＮＦ３２４、ＺＮＦ８６０、ＺＦＰ２８ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＺＦＰ２８）、ＺＮＦ４７０、ＺＮＦ５８６、ＺＮＦ２３５、ＺＮＦ２７４、ＺＮＦ４４６、ＺＦＰ１、ＺＩＭ３、ＺＮＦ２１２、ＺＮＦ７６６、ＺＮＦ２６４、ＺＮＦ４８０、ＺＮＦ６６７、ＺＮＦ８０５、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ７８３、ＺＮＦ６２１、ＺＮＦ８－ＤＴ、ＺＮＦ８８０、ＺＮＦ２１３－ＡＳ１、ＺＮＦ２１３、ＺＮＦ２６３、ジンクフィンガー及びＳＣＡＮドメイン含有３２（ＺＳＣＡＮ３２）、ＺＩＭ２、ＺＮＦ５９７、ＺＮＦ７８６、ＫＲＡＢ－Ａドメイン含有１（ＫＲＢＡ１）、ＺＮＦ４６０、ＺＮＦ８、ＺＮＦ８７５、ＺＮＦ５４３、ＺＮＦ１３３、ＺＮＦ２２９、ＺＮＦ５２８、ＳＳＸ１、ＺＮＦ８１、ＺＮＦ５７８、ＺＮＦ８６２、ＺＮＦ７７７、ＺＮＦ４２５、ＺＮＦ５４８、ＺＮＦ７４６、ＺＮＦ２８２、ＺＮＦ３９８、ＺＮＦ５９９、ＺＮＦ２５１、ＺＮＦ１９５、ＺＮＦ１８１、ＲＢＡＫ－ＲＢＡＫＤＮリードスルー（ＲＢＡＫ－ＲＢＡＫＤＮ）、ＺＦＰ３７、ＲＮＡ、７ＳＬ、細胞質５２６、偽遺伝子（ＲＮ７ＳＬ５２６Ｐ）、ＺＮＦ８７９、ＺＮＦ２６、ＺＳＣＡＮ２１、ＺＮＦ３、ＺＮＦ３５４Ｃ、ＺＮＦ１０、ＺＮＦ７５Ｄ、ＺＮＦ４２６、ＺＮＦ５６１、ＺＮＦ５６２、ＺＮＦ８４６、ＺＮＦ７８２、ＺＮＦ５５２、ＺＮＦ５８７Ｂ、ＺＮＦ８１４、ＺＮＦ５８７、ＺＮＦ９２、ＺＮＦ４１７、ＺＮＦ２５６、ＺＮＦ４７３、ＺＦＰ１４、ＺＦＰ８２、ＺＮＦ５２９、ＺＮＦ６０５、ＺＦＰ５７、ＺＮＦ７２４、ＺＮＦ４３、ＺＮＦ３５４Ａ、ＺＮＦ５４７、ＳＳＸ４Ｂ、ＺＮＦ５８５Ａ、ＺＮＦ５８５Ｂ、ＺＮＦ７９２、ＺＮＦ７８９、ＺＮＦ３９４、ＺＮＦ６５５、ＺＦＰ９２、ＺＮＦ４１、ＺＮＦ６７４、ＺＮＦ５４６、ＺＮＦ７８０Ｂ、ＺＮＦ６９９、ＺＮＦ１７７、ＺＮＦ５６０、ＺＮＦ５８３、ＺＮＦ７０７、ＺＮＦ８０８、ＺＫＳＣＡＮ５、ＺＮＦ１３７Ｐ、ＺＮＦ６１１、ＺＮＦ６００、ＺＮＦ２８、ＺＮＦ７７３、ＺＮＦ５４９、ＺＮＦ５５０、ＺＮＦ４１６、ＺＩＫ１、ＺＮＦ２１１、ＺＮＦ５２７、ＺＮＦ５６９、ＺＮＦ７９３、ＺＮＦ５７１－ＡＳ１、ＺＮＦ５４０、ＺＮＦ５７１、ＺＮＦ６０７、ＺＮＦ７５Ａ、ＺＮＦ２０５、ＺＮＦ１７５、ＺＮＦ２６８、ＺＮＦ３５４Ｂ、ＺＮＦ１３５、ＺＮＦ２２１、ＺＮＦ２８５、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ３０、ＺＮＦ３０４、ＺＮＦ２５４、ＺＮＦ７０１、ＺＮＦ４１８、ＺＮＦ７１、ＺＮＦ５７０、ＺＮＦ７０５Ｅ、ＫＲＢＯＸ１、ＺＮＦ５１０、ＺＮＦ７７８、ＰＲ／ＳＥＴドメイン９（ＰＲＤＭ９）、ＺＮＦ２４８、ＺＮＦ８４５、ＺＮＦ５２５、ＺＮＦ７６５、ＺＮＦ８１３、ＺＮＦ７４７、ＺＮＦ７６４、ＺＮＦ７８５、ＺＮＦ６８９、ＺＮＦ３１１、ＺＮＦ１６９、ＺＮＦ４８３、ＺＮＦ４９３、ＺＮＦ１８９、ＺＮＦ６５８、ＺＮＦ５６４、ＺＮＦ４９０、ＺＮＦ７９１、ＺＮＦ６７８、ＺＮＦ４５４、ＺＮＦ３４、ＺＮＦ７、ＺＮＦ２５０、ＺＮＦ７０５Ｄ、ＺＮＦ６４１、ＺＮＦ２、ＺＮＦ５５４、ＺＮＦ５５５、ＺＮＦ５５６、ＺＮＦ５９６、ＺＮＦ５１７、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ１８、ＺＮＦ８２９、ＺＮＦ７７２、ＺＮＦ１７、ＺＮＦ１１２、ＺＮＦ５１４、ＺＮＦ６８８、ＰＲＤＭ７、ＺＮＦ６９５、ＺＮＦ６７０－ＺＮＦ６９５、ＺＮＦ１３８、ＺＮＦ６７０、ＺＮＦ１９、ＺＮＦ３１６、ＺＮＦ１２、ＺＮＦ２０２、ＲＢＡＫ、ＺＮＦ８３、ＺＮＦ４６８、ＺＮＦ４７９、ＺＮＦ６７９、ＺＮＦ７３６、ＺＮＦ６８０、ＺＮＦ２７３、ＺＮＦ１０７、ＺＮＦ２６７、ＺＫＳＣＡＮ８、ＺＮＦ８４、ＺＮＦ５７３、ＺＮＦ２３、ＺＮＦ５５９、ＺＮＦ４４、ＺＮＦ５６３、ＺＮＦ４４２、ＺＮＦ７９９、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ７０９、ＺＮＦ５６６、ＺＮＦ６９、ＺＮＦ７００、ＺＮＦ７６３、ＺＮＦ４３３－ＡＳ１、ＺＮＦ４３３、ＺＮＦ８７８、ＺＮＦ８４４、ＺＮＦ７８８Ｐ、ＺＮＦ２０、ＺＮＦ６２５－ＺＮＦ２０、ＺＮＦ６２５、ＺＮＦ６０６、ＺＮＦ５３０、ＺＮＦ５７７、ＺＮＦ６４９、ＺＮＦ６１３、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ３１７、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ１８０、ＺＮＦ４１５、鋤鼻１受容体１（ＶＮ１Ｒ１）、ＺＮＦ２６６、ＺＮＦ７３８、ＺＮＦ４４５、ＺＮＦ８５２、ＺＫＳＣＡＮ７、ＺＮＦ６６０、ミオシンホスファターゼＲｈｏ相互作用タンパク質偽遺伝子１（ＭＰＲＩＰＰ１）、ＺＮＦ１９７、ＺＮＦ５６７、ＺＮＦ５８２、ＺＮＦ４３９、ＺＦＰ３０、ＺＮＦ５５９－ＺＮＦ１７７、ＺＮＦ２２６、ＺＮＦ８４１、ＺＮＦ５４４、ＺＮＦ２３３、ＺＮＦ５３４、ＺＮＦ８３６、ＺＮＦ３２０、ＫＲＢＡ２、ＺＮＦ７６１、ＺＮＦ３８３、ＺＮＦ２２４、ＺＮＦ５５１、ＺＮＦ１５４、ＺＮＦ６７１、ＺＮＦ７７６、ＺＮＦ７８０Ａ、ＺＮＦ８８８、ＺＮＦ８１６－ＺＮＦ３２１Ｐ、ＺＮＦ３２１Ｐ、ＺＮＦ８１６、ＺＮＦ３４７、ＺＮＦ６６５、ＺＮＦ６７７、ＺＮＦ１６０、ＺＮＦ１８４、ＺＮＦ１４０、ＺＮＦ５８９、ＺＮＦ８９１、ＺＦＰ６９Ｂ、ＺＮＦ４３６、ＫＲＡＢドメインに由来するｐｏｇｏ転位可能要素（ＰＯＧＫ）、ＺＮＦ６６９、ＺＦＰ６９、ＺＮＦ６８４、ＺＮＦ１２４、及びＺＮＦ４９６、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントからなる群から選択される（全ての場合において、ＺＮＦ＝ジンクフィンガータンパク質、ＫＲＢＯＸ＝ＫＲＡＢボックスドメイン含有、ＺＫＳＣＡＮ＝ＫＲＡＢドメイン及びＳＣＡＮドメインを有するジンクフィンガー、ＳＳＸ＝ＳＳＸファミリーメンバー、ＫＲＢＡ＝ＫＲＡＢ－Ａドメイン含有、ＺＦＰ＝ジンクフィンガータンパク質）。
いくつかの実施形態では、遺伝子リプレッサー系は、融合タンパク質として触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。いくつかの実施形態では、系は、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９からなる配列の群から選択される。いくつかの実施形態では、系の融合タンパク質は、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５９３４２、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。いくつかの実施形態では、系の融合タンパク質は、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７８４０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。いくつかの実施形態では、系の融合タンパク質は、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。特定の実施形態では、系の融合タンパク質は、触媒活性を伴わないＣａｓ９タンパク質に作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。
いくつかの実施形態では、系の融合タンパク質は、ペプチドリンカーによって、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又はｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上のモチーフを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５９３４２からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態では、系の融合タンパク質は、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ又はＲであり、Ｘ２は、Ｄ又はＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、又はＲであり、Ｘ４は、Ｎ又はＴであり、Ｘ５は、Ｆ又はＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、又はＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、又はＮであり、Ｘ８は、Ｌ又はＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、又はＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、又はＳである）を含む第１のドメインを含み、第２の配列モチーフは、配列ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、又はＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、又はＴであり、Ｘ３は、Ｉ又はＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、又はＹであり、Ｘ５は、Ｓ又はＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、又はＷであり、Ｘ７は、Ｄ又はＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、又はＲである）を含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５９３４２からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態では、系の融合タンパク質は、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ又はＲであり、Ｘ２は、Ｄ又はＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、又はＲであり、Ｘ４は、Ｎ又はＴであり、Ｘ５は、Ｆ又はＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、又はＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、又はＮであり、Ｘ８は、Ｌ又はＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、又はＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、又はＳである）を含む第１のドメインを含み、第２の配列モチーフは、配列ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、又はＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、又はＴであり、Ｘ３は、Ｉ又はＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、又はＹであり、Ｘ５は、Ｓ又はＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、又はＷであり、Ｘ７は、Ｄ又はＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、又はＲである）を含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７８４０からなる群から選択される配列を含む。更に他の実施形態では、系の融合タンパク質は、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ又はＲであり、Ｘ２は、Ｄ又はＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、又はＲであり、Ｘ４は、Ｎ又はＴであり、Ｘ５は、Ｆ又はＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、又はＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、又はＮであり、Ｘ８は、Ｌ又はＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、又はＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、又はＳである）を含む第１のドメインを含み、第２の配列モチーフは、配列ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、又はＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、又はＴであり、Ｘ３は、Ｉ又はＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、又はＹであり、Ｘ５は、Ｓ又はＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、又はＷであり、Ｘ７は、Ｄ又はＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、又はＲである）を含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系は、融合タンパク質としての触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるｄＣａｓＸであり、ＫＲＡＢドメインは、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。いくつかの実施形態では、系は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列の群から選択されるｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９からなる配列の群から選択される。いくつかの実施形態では、系のｄＸＲ融合タンパク質は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列の群から選択されるｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５９３４２、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。いくつかの実施形態では、系のｄＸＲ融合タンパク質は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列の群から選択されるｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７８４０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。いくつかの実施形態では、系のｄＸＲ融合タンパク質は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列の群から選択されるｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。特定の実施形態では、系のｄＸＲ融合タンパク質は、表４に記載される配列番号１８のｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。別の特定の実施形態では、系のｄＸＲ融合タンパク質は、表４に記載される配列番号２５のｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。別の特定の実施形態では、系のｄＸＲ融合タンパク質は、表４に記載される配列番号５９３５７のｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。別の特定の実施形態では、系のｄＸＲ融合タンパク質は、表４に記載される配列番号５９３５８のｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。
いくつかの実施形態では、系のｄＸＲ融合タンパク質は、ペプチドリンカーによって、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列の群から選択されるｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又はｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上のモチーフを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５９３４２からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態では、系のｄＸＲ融合タンパク質は、ｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ又はＲであり、Ｘ２は、Ｄ又はＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、又はＲであり、Ｘ４は、Ｎ又はＴであり、Ｘ５は、Ｆ又はＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、又はＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、又はＮであり、Ｘ８は、Ｌ又はＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、又はＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、又はＳである）を含む第１のドメインを含み、第２の配列モチーフは、配列ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、又はＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、又はＴであり、Ｘ３は、Ｉ又はＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、又はＹであり、Ｘ５は、Ｓ又はＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、又はＷであり、Ｘ７は、Ｄ又はＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、又はＲである）を含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５９３４２からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態では、系のｄＸＲ融合タンパク質は、ｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ又はＲであり、Ｘ２は、Ｄ又はＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、又はＲであり、Ｘ４は、Ｎ又はＴであり、Ｘ５は、Ｆ又はＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、又はＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、又はＮであり、Ｘ８は、Ｌ又はＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、又はＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、又はＳである）を含む第１のドメインを含み、第２の配列モチーフは、配列ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、又はＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、又はＴであり、Ｘ３は、Ｉ又はＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、又はＹであり、Ｘ５は、Ｓ又はＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、又はＷであり、Ｘ７は、Ｄ又はＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、又はＲである）を含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７８４０からなる群から選択される配列を含む。更に他の実施形態では、系のｄＸＲ融合タンパク質は、ｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ又はＲであり、Ｘ２は、Ｄ又はＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、又はＲであり、Ｘ４は、Ｎ又はＴであり、Ｘ５は、Ｆ又はＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、又はＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、又はＮであり、Ｘ８は、Ｌ又はＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、又はＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、又はＳである）を含む第１のドメインを含み、第２の配列モチーフは、配列ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、又はＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、又はＴであり、Ｘ３は、Ｉ又はＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、又はＹであり、Ｘ５は、Ｓ又はＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、又はＷであり、Ｘ７は、Ｄ又はＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、又はＲである）を含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５からなる群から選択される配列を含む。特定の実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質は、配列番号５９５０８～５９５６７及び５９６７３～６００１２からなる群から選択される配列を含む。本段落の前述の実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質は、レポーター遺伝子を標的とするｇＲＮＡと一緒に、インビトロ細胞アッセイでアッセイされた場合、ＺＮＦ１０ ＫＲＡＢドメイン（配列番号５９６２６）を含む同等の融合タンパク質よりも大きい程度までレポーター遺伝子の発現を抑制することができる。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、ＨＥＫ２９３細胞などであるがこれに限定されない真核細胞のＢ２Ｍ遺伝子座である。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子の発現は、インビトロアッセイにおいてアッセイの７日目に、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％抑制される。レポーター遺伝子の抑制を測定する例示的な方法
は、実施例、例えば、実施例４に提供される。
いくつかの実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質は、ｇＲＮＡとともにリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができ、細胞アッセイにおいて細胞の標的核酸に結合すると、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系は、標的核酸によってコードされる遺伝子の転写を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％抑制することができる。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質は、ｇＲＮＡとともにリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができ、細胞アッセイにおいて細胞の標的核酸に結合すると、系は、標的核酸によってコードされる遺伝子の転写を抑制することができ、遺伝子の転写の抑制は、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約７日、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、又は少なくとも約２か月維持される。
いくつかの実施形態では、本開示は、融合タンパク質として触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結された第１及び第２のリプレッサードメインを含む系と、サイレンシングのために標的化された遺伝子の標的核酸配列に対して相補的な標的化配列を含む１つ以上のｇＲＮＡと、を含む系を提供し、系は、遺伝子の長期のエピジェネティック修飾をもたらす様式で標的核酸に結合することができ、その結果、系が標的核酸上にもはや存在しない後でさえ、抑制が持続する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のリプレッサードメインは、本明細書に記載される実施形態のｄＣａｓＸになど、融合タンパク質として作動可能に連結されている。本明細書で使用される場合、「エピジェネティック修飾」とは、ＤＮＡ又はＤＮＡに関連するヒストンのいずれかに対する修飾を意味し、修飾は、系の成分による直接的な修飾であるか、又は１つ以上の追加の細胞成分の動員により間接的であるが、ＤＮＡ標的核酸配列自体は、編集されない。例えば、ＤＮＭＴ３Ａ（又はその触媒ドメイン）が、それをメチル化することによってＤＮＡを直接修飾する一方で、ＫＲＡＢは、強力な転写リプレッサーとして作用することができるＫＡＰ－１／ＴＩＦ１βコリプレッサー複合体を動員し、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、ヒストンデアセチラーゼ、及びヒストンメチルトランスフェラーゼなどの、ＤＮＡメチル化及び抑制性クロマチンの形成に関連する因子を更に動員することができる（Ｙｉｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｋｒｕｐｐｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｎｄ ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｔａｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３（３）：１５４９（２０１５））。一緒に、系の第１及び第２のリプレッサー成分は、同調して作用して、標的遺伝子の転写サイレンシングに相加的又は相乗的な効果をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示は、ｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１及び第２のリプレッサードメインを含む系を提供し、第１のリプレッサーは、前述の実施形態のいずれかのＫＲＡＢドメインであり、第２のリプレッサーは、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ１、ＦＯＧ、ＳＩＤ４Ｘ、ＳＩＤ、ＮｃｏＲ、ＮｕＥ、ヒストンＨ３リジン９メチルトランスフェラーゼＧ９ａ（Ｇ９ａ）、メチル－ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）結合ドメイン２（ｍｅＣＰ２）、スイッチ独立３転写調節因子ファミリーメンバーＡ（ＳＩＮ３Ａ）、ヒストンデアセチラーゼＨＤＴ１（ＨＤＴ１）、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン含有タンパク質２のｎ末端短縮（ＭＢＤ２Ｂ）、タンパク質ホスファターゼ－１の核阻害剤（ＮＩＰＰ１）、ＧＬＰ、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１Ａ）、混合系統白血病タンパク質－５（ＭＬＬ５）、ヒストン－リジンＮ－メチルトランスフェラーゼＳＥＴＤＢ１（ＳＥＴＢ１）、斑入り３－９相同体１のサプレッサー（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ＳＵＶ３９Ｈ２、真正染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ１（ＥＨＭＴ１）、ヒストン－リジンＮ－メチルトランスフェラーゼＥＺＨ１（ＥＺＨ１）、ＥＺＨ２、核受容体結合ＳＥＴドメインタンパク質１（ＮＳＤ１）、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＡＳＨ１様ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（ＡＳＨ１Ｌ）、三要素モチーフ含有２８（ＴＲＩＭ２８）、メチルトランスフェラーゼ様３（ＭＥＴＴＬ３）、ＭＥＴＴＬ４、配列類似性を有するファミリー２０８メンバーＡ（ＦＡＭ２０８Ａ）、Ｍ相リンタンパク質８（ＭＰＨＯＳＰＨ８）、ＳＥＴドメイン含有２（ＳＥＴＤ２）、ヒストンデアセチラーゼ１（ＨＤＡＣ１）、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ペリフィリン１（ＰＰＨＬＮ１）、及びそれらのサブドメイン（例えば、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン及びＡＴＲＸ－ＤＮＭＴ３－ＤＮＭＴ３Ｌ（ＡＤＤ）ドメインが、ＤＮＭＴ３Ａのサブドメインであり、ＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインは、ＤＮＭＴ３Ｌのサブドメインである）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１及び第２のリプレッサードメインを含むｄＸＲ：ｇＲＮＡ系を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるｄＣａｓＸを含むｄＸＲ融合タンパク質を提供し、第１のリプレッサーは、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択されるＫＲＡＢドメインであり、第２のリプレッサーは、調節サブドメインを欠き、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０からなる群から選択される触媒ドメインのみを維持するＤＮＭＴ３Ａドメインであり、転写リプレッサードメインは、リンカーペプチド配列によって、触媒活性を伴わないＣａｓＸタンパク質又はもう一方のリプレッサードメインに連結されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインを含むｄＸＲは、ＣｐＧ配列でのみメチル化に影響を及ぼす。特定の実施形態では、本開示は、配列番号１８の配列、又はそれに対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１及び第２のリプレッサードメインを含む系を提供し、第１のリプレッサーは、配列番号５７７４６～５９３４２からなる配列の群から選択されるＫＲＡＢドメインであるか、あるいは配列番号５７７４６～５７８４０からなる群から選択されるか、あるいは配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択され、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択されるＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、転写リプレッサードメインは、リンカーペプチド配列によって、触媒活性を伴わないＣａｓＸタンパク質又はもう一方のリプレッサードメインに連結されている。特定の実施形態では、本開示は、配列番号１８の配列を含むｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１及び第２のリプレッサードメインを含む系を提供し、第１のリプレッサーは、配列番号５７７４６～５９３４２からなる配列の群から選択されるＫＲＡＢドメインであるか、又は配列番号５７７４６～５７８４０からなる群から選択され、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０からなる群から選択されるＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、転写リプレッサードメインは、リンカーペプチド配列によって、触媒活性を伴わないＣａｓＸタンパク質又はもう一方のリプレッサードメインに連結されている。前述の実施形態では、融合タンパク質は、ＫＲＡＢを含み、第２の転写リプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインを含み、標的核酸への融合タンパク質及びｇＲＮＡのＲＮＰの結合時に、系は、標的核酸によってコードされる遺伝子の転写の抑制に影響を与えるために、本明細書に列挙されるリプレッサードメインを含む、細胞の追加のリプレッサードメインのうちの１つ以上を動員することができ、その結果、標的核酸への融合タンパク質及びｇＲＮＡのＲＮＰの結合時に、細胞中の遺伝子の転写が、細胞ベースのアッセイを含むインビトロアッセイでアッセイされた場合、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、若しくは少なくとも９９％、又はそれらの間の任意のパーセンテージ抑制される。最も好ましくは、エピジェネティック修飾は、遺伝子産物が検出されないような遺伝子発現の完全なサイレンシングをもたらす。いくつかの実施形態では、実施形態の系による転写の抑制は、インビトロアッセイで評価された場合、少なくとも約１日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、又は少なくとも約３か月、又は少なくとも約６か月維持される。いくつかの実施形態では、実施形態の系による転写の抑制は、本明細書に記載される実施形態の系の治療有効用量を投与された対象において評価された場合、少なくとも約１日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、又は少なくとも約３か月、少なくとも約６か月、又は少なくとも約１年維持される。いくつかの実施形態では、系の使用は、インビトロアッセイで評価された場合、検出可能なオフターゲットメチル化又はオフターゲット活性を全くもたらさないか、又は最小限もたらす。いくつかの実施形態では、系の使用は、細胞中で約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満であるオフターゲットメチル化又はオフターゲット活性をもたらす。他の実施形態では、系の使用は、本明細書に記載される実施形態の系の治療有効用量を投与された対象において評価された場合、検出可能なオフターゲットメチル化又はオフターゲット活性を全くもたらさないか、又は最小限もたらす。
他の実施形態では、本開示は、融合タンパク質が、第１、第２、及び第３の転写リプレッサードメインを含み、第３の転写リプレッサードメインが、第１及び第２の転写リプレッサードメインとは異なる、遺伝子リプレッサー系を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｄＸＲが、第１のリプレッサードメインとして本明細書に記載される実施形態のいずれかのＫＲＡＢドメイン、第２のリプレッサードメインとしてＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン、及び第３のリプレッサードメインとしてＤＮＭＴ３Ｌドメインを含む、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系を提供する。そのようなｄＸＲ融合タンパク質は、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系で使用される場合、標的核酸の転写のエピジェネティックな長期抑制をもたらすことが発見されている（そのような融合タンパク質は、本明細書では代替的に「ＥＬＸＲ」と称される）。前述では、ＤＮＭＴ３Ｌは、ＤＮＡ複製後にメチル化パターンを維持するのに役立つ。前述の例示的な実施形態では、触媒活性を伴わないクラス２タンパク質は、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、例えば、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるｄＣａｓＸであり、第１のリプレッサードメインは、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるＫＲＡＢリプレッサードメインであり、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを含む、ＤＮＭＴ３ＡのＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン、又はその配列バリアントであり、第３のリプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、配列番号５９６２５、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントであり、融合タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のリンカーペプチドを含み、融合タンパク質は、標的核酸に結合する系のｇＲＮＡとともにＲＮＰを形成することができる。特定の実施形態では、本開示は、配列番号１８の配列、又はそれに対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１、第２、及び第３のリプレッサードメインを含む系を提供し、第１のドメインは、ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ５は、ＣでＦ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又はｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上のモチーフを含むＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５９３４２、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含み、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントからなる群から選択される配列を含むＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサーは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを含むＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、融合タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のリンカーペプチドを含み、融合タンパク質は、標的核酸に結合する系のｇＲＮＡとともにＲＮＰを形成することができる。特定の実施形態では、本開示は、配列番号１８の配列、又はそれに対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１、第２、及び第３のリプレ
ッサードメインを含む系を提供し、第１のドメインは、ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ５は、ＣでＦ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又はｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上のモチーフを含むＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７８４０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含み、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントからなる群から選択される配列を含むＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサーは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、融合タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のリンカーペプチドを含み、融合タンパク質は、標的核酸に結合する系のｇＲＮＡとともにＲＮＰを形成することができる。特定の実施形態では、本開示は、配列番号１８の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１、第２、及び第３のリプレッサードメインを含む系を提供し、ＫＲＡＢドメインは、ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ５は、ＣでＦ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであ
る）、ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又はｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上のモチーフを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含み、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサーは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、融合タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のリンカーペプチドを含み、融合タンパク質は、標的核酸に結合する系のｇＲＮＡとともにＲＮＰを形成することができる。別の実施形態では、本開示は、配列番号２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１、第２、及び第３のリプレッサードメインを含む系を提供し、ＫＲＡＢドメインは、ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ５は、ＣでＦ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又はｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上のモチーフを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含み、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサーは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、融合タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のリンカーペプチドを含み、融合タンパク質は、標的核酸に結合する系のｇＲＮＡとともにＲＮＰを形成することができる。別の実施形態では、本開示は、配列番号５９３５７の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも
約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１、第２、及び第３のリプレッサードメインを含む系を提供し、ＫＲＡＢドメインは、ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ５は、ＣでＦ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又はｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上のモチーフを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含み、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサーは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、融合タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のリンカーペプチドを含み、融合タンパク質は、標的核酸に結合する系のｇＲＮＡとともにＲＮＰを形成することができる。別の実施形態では、本開示は、配列番号５９３５８の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１、第２、及び第３のリプレッサードメインを含む系を提供し、ＫＲＡＢドメインは、ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ５は、ＣでＦ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、
若しくはＮであり、Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又はｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上のモチーフを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含み、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサーは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、融合タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のリンカーペプチドを含み、融合タンパク質は、標的核酸に結合する系のｇＲＮＡとともにＲＮＰを形成することができる。系のいくつかの実施形態では、系の融合タンパク質成分は、図７に概略的に示される構成に従って構成されている。いくつかの実施形態では、リプレッサードメイン及びｄＣａｓＸの各々は、本明細書に記載されるように、場合によってはリンカーを介して作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質は、構成１（ＮＬＳ－リンカー４－ＤＮＭＴ３Ａ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ－リンカー１－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ）、構成２（ＮＬＳ－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ－リンカー１－ＤＮＭＴ３Ａ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ）、構成３（ＮＬＳ－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー１－ＤＮＭＴ３Ａ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ）、構成４（ＮＬＳ－ＫＲＡＢ－リンカー３－ＤＮＭＴ３Ａ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ－リンカー１－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＮＬＳ）、又は構成５（ＮＬＳ－ＤＮＭＴ３Ａ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ－リンカー３－ＫＲＡＢ－リンカー１－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＮＬＳ）のＮ末端からＣ末端（表４５の成分を参照して）の構成を有する。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質は、配列番号５９５０８～５９５１７、５９５２８～５９５３７、５９５４８～５９５５７、及び５９６７３～５９８４２、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列若しくは有する配列からなる群から選択される配列を含み、融合タンパク質は、構成１、４、又は５にある。
いくつかの実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質は、第４のドメインとしてＡＤＤドメインを含み、ＡＤＤドメインのＣ末端は、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインのＮ末端に対して作動可能であり、その代表的な構成は、図４５に概略的に示されている。いくつかの実施形態では、ｄＸＲは、ｄＣａｓＸと、第１、第２、第３、及び第４のリプレッサーとを含み、ｄＸＲは、配列番号５９５０８～５９５６７及び５９６７３～６００１２、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列若しくは有する配列からなる群から選択される配列を含み、融合タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のリンカーペプチドを含み、融合タンパク質は、標的核酸に結合する系のｇＲＮＡとともにＲＮＰを形成することができる。構成１～５の構築物を含む、ｄＣａｓＸバリアント、第１、第２、第３のリプレッサードメインを含む系のいくつかの実施形態では、標的核酸への融合タンパク質及びｇＲＮＡのＲＮＰの結合時に、遺伝子は、エピジェネティックに修飾され、遺伝子の転写は、抑制される。いくつかの実施形態では、遺伝子の転写は、細胞ベースのアッセイを含むインビトロアッセイでアッセイされた場合、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％抑制される。いくつかの実施形態では、構成１～５の構築物を含む系の組成物による遺伝子の転写の抑制は、細胞ベースのアッセイを含むインビトロアッセイでアッセイされた場合、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約７日、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、又は少なくとも約２か月維持される。特定の実施形態では、ｄＸＲ構成４及び５は、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系で使用される場合、構成１（図７及び４５に示すとおり）と比較して、インビトロアッセイにおいてより少ないオフターゲットメチル化又はオフターゲット活性をもたらす。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ構成４及び５（図７及び４５に示すとおり）の使用は、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系で使用される場合、細胞中で約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満であるオフターゲットメチル化又はオフターゲット活性をもたらす。
更に他の実施形態では、本開示は、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系を提供し、ｄＸＲは、ｄＣａｓＸと、第１、第２、第３、及び第４のリプレッサードメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ｄＸＲは、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるｄＣａｓＸを含み、第１のリプレッサードメインは、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるＫＲＡＢリプレッサードメインであり、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサードメインは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを有するＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、第４のドメインは、配列番号５９４５２、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントのＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインである。特定の実施形態では、ｄＸＲは、表４に記載される配列番号１８の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを含み、第１のリプレッサードメインは、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるＫＲＡＢリプレッサードメインであり、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサードメインは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを有するＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、第４のドメインは、配列番号５９４５２、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントのＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインである。別の実施形態では、ｄＸＲは、表４に記載される配列番号２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを含み、第１のリプレッサードメインは、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるＫＲＡＢリプレッサードメインであり、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサードメインは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを有するＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、第４のドメインは、配列番号５９４５２、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントのＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインである。別の実施形態では、ｄＸＲは、表４に記載される配列番号５９３５７の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを含み、第１のリプレッサードメインは、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるＫＲＡＢリプレッサードメインであり、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサードメインは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを有するＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、第４のドメインは、配列番号５９４５２、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントのＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインである。別の実施形態では、ｄＸＲは、表４に記載される配列番号５９３５８の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを含み、第１のリプレッサードメインは、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるＫＲＡＢリプレッサードメインであり、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントの群から選択されるＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサードメインは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを有するＤＮＭＴ３Ｌ相互作
用ドメインであり、第４のドメインは、配列番号５９４５２、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントのＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインである。ＡＤＤドメインは、２つの主要な機能を有することが知られている：１）メチルトランスフェラーゼ自己阻害ドメインとして機能することによってＤＮＭＴ３Ａの触媒活性をアロステリックに調節する、及び２）非メチル化Ｈ３Ｋ４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ０）を認識する。理論によって束縛されることを望むものではないが、Ｈ３Ｋ４ｍｅ０マークとＡＤＤドメインの相互作用は、ＤＮＭＴ３Ａの触媒部位を明らかにし、それによって、活性ＤＮＭＴ３Ａをクロマチンに動員して、これらの部位でデノボメチル化を行うと考えられる。驚くべき結果では、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン及びＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインを含むｄＸＲ構築物へのＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインの付加は、ＡＤＤドメインを欠くｄＸＲ構築物と比較して、標的核酸の抑制を大幅に強化することが発見されている。改善された抑制についての例示的なデータを実施例に示す。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号１８の配列、又はそれに対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１、第２、第３、及び第４のリプレッサードメインを含む系を提供し、ＫＲＡＢドメインは、ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ５は、ＣでＦ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又はｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上のモチーフを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５９３４２、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含み、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントからなる群から選択されるＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン配列であり、第３のリプレッサーは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを含むＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、第４のリプレッサーは、配列番号５９４５２の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを含むＡＤＤドメインであり、融合タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のリンカーペプチドを含み、融合タンパク質は、標的核酸に結合する系のｇＲＮＡとともにＲＮＰを形成することができる。本開示は、配列番号１８の配列、又はそれに対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１、第２、第３、及び第４のリプレッサードメインを含む系を提供し、第１のリプレッサードメインは、ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ５は、ＣでＦ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくは
Ｖであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又はｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上のモチーフを含むＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７８４０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含み、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントからなる群から選択される配列を含むＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサーは、配列番号５９６２５のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを含むＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、第４のリプレッサーは、配列番号５９４５２の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを含むＡＤＤドメインであり、融合タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のリンカーペプチドを含み、融合タンパク質は、標的核酸に結合する系のｇＲＮＡとともにＲＮＰを形成することができる。本開示は、配列番号１８の配列、又はそれに対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むｄＣａｓＸに作動可能に連結された第１、第２、第３、及び第４のリプレッサードメインを含む系を提供し、第１のリプレッサードメインは、ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ５は、ＣでＦ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又はｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上のモチーフを含むＫＲＡＢドメインを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なく
とも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含み、第２のリプレッサードメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントからなる群から選択される配列を含むＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のリプレッサーは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを含むＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、第４のリプレッサーは、配列番号５９４５２の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列バリアントを含むＡＤＤドメインであり、融合タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のリンカーペプチドを含み、融合タンパク質は、標的核酸に結合する系のｇＲＮＡとともにＲＮＰを形成することができる。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質は、ＡＤＤドメインとＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインとを含み、ＡＤＤドメインのＣ末端は、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインのＮ末端に対して作動可能である。いくつかの実施形態では、リプレッサードメイン及びｄＣａｓＸの各々は、本明細書に記載されるように、場合によってはリンカーを介して作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質は、構成１（ＮＬＳ－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ａ－リンカー１－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ）、構成２（ＮＬＳ－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ－リンカー１－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ）、構成３（ＮＬＳ－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー１－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ）、構成４（ＮＬＳ－ＫＲＡＢ－リンカー３－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ－リンカー１－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＮＬＳ）、又は構成５（ＮＬＳ－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ－リンカー３－ＫＲＡＢ－リンカー１－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＮＬＳ）のＮ末端からＣ末端の構成を有する。系のいくつかの実施形態では、系の融合タンパク質成分は、図４５に概略的に示されるように構成されている。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質は、配列番号５９５１８～５９５２６、５９５３８～５９５４７、５９５５８～５９５６７、及び５９８４３～６００１２、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列若しくは有する配列からなる群から選択される配列を含み、融合タンパク質は、構成１、４、又は５にある。
ｄＣａｓＸバリアント、第１、第２、第３、及び第４のリプレッサードメインを含む系のいくつかの実施形態では、標的核酸への融合タンパク質及びｇＲＮＡのＲＮＰの結合時に、標的核酸によってコードされる遺伝子は、エピジェネティックに修飾され、遺伝子の転写は、抑制される。いくつかの実施形態では、遺伝子の転写は、細胞ベースのアッセイを含むインビトロアッセイでアッセイされた場合、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％抑制される。いくつかの実施形態では、系の組成物による遺伝子の転写の抑制は、細胞ベースのアッセイを含むインビトロアッセイでアッセイされた場合、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約７日、少なくとも２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、又は少なくとも約２か月維持される。特定の実施形態では、ｄＸＲ構成４及び５は、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系で使用される場合、構成１と比較して、インビトロアッセイにおいてより少ないオフターゲットメチル化又はオフターゲット活性をもたらす。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ構成４及び５の使用は、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系で使用される場合、細胞中で約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満であるオフターゲットメチル化又はオフターゲット活性をもたらす。
いくつかの実施形態では、転写リプレッサードメインは、互いに、又はリンカーペプチド配列によって融合タンパク質内の触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質若しくは触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｄＣａｓＸ）に連結されている。いくつかの場合では、１つ以上の転写リプレッサードメインは、リンカーペプチド配列によって触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｄＣａｓＸ）のＣ末端で又はその近くで連結されている。他の場合では、１つ以上の転写リプレッサードメインは、リンカーペプチド配列によって触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｄＣａｓＸ）のＮ末端で又はその近くで連結されている。更に他の場合では、第１の転写リプレッサードメインは、リンカーペプチド配列によって触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｄＣａｓＸ）のＣ末端で又はその近くで連結されており、第２、第３、及び任意選択的に、第４の転写リプレッサードメインは、触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端で又はその近くで連結されている。代表的であるが非限定的な構成は、図７、図３８、及び図４５に概略的に示されている。前述では、リンカーペプチドは、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号３３２４０）、（ＧＳ）ｎ（配列番号３３２４１）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４３）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４４）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４５）、ＧＧＳＧ（配列番号３３２４６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３３２４７）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３３２４８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３３２４９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３３２５０）、ＧＳＳＳＧ（配列番号３３２５１）、（ＧＰ）ｎ（配列番号３３２５２）、ＧＰＧＰ（配列番号３３２５３）、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３２５４）、ＧＳＧＳＧＧＧ（配列番号５７６２８）、ＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣ（配列番号５７６２４）、ＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号５７６２５）、ＧＧＡＴＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡ（配列番号５７６２７）、ＧＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＡＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＧＣＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＧＴＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＧ（配列番号５７６２０）、ＳＳＧＮＳＮＡＮＳＲＧＰＳＦＳＳＧＬＶＰＬＳＬＲＧＳＨ（配列番号５７６２３）、ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥ（配列番号５７６２１）、ＴＣＴＡＧＣＧＧＣＡＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＴＡＡＣＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴ（配列番号５７６２２）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号３３２５５）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号３３２５６）、ＰＰＰＧ（配列番号３３２５７）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２５８）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号３３２５９）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６０）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６１）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３３２６２）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号３３２６３）からなる群から選択され、ｎは、１～５の整数である。
ＩＶ．系のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）
別の態様では、本開示は、ｇＲＮＡの設計によって標的化される遺伝子の転写の抑制において、遺伝子リプレッサー系の他の成分とともに有用性を有する、本開示の遺伝子リプレッサー系で利用されるガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を提供する。本開示は、遺伝子抑制系の成分として、標的核酸に対して相補的である（したがって、それとハイブリダイズすることができる）標的化配列（又は「スペーサー」）を有する特異的に設計されたｇＲＮＡを提供し、ｇＲＮＡは、融合タンパク質の触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｄＣａｓＸ）とともにリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができる。本開示の系で採用される連結されたリプレッサードメインを有するｄＣａｓＸバリアントの場合、ｄＣａｓＸバリアントは、相補的な非標的鎖中にＴＣモチーフを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対して特異性を有し、ＰＡＭ配列は、標的核酸の標的鎖中の標的核酸配列に対して相補的である非標的鎖の配列の１ヌクレオチド５’に位置する。予め複合体化されたＲＮＰの使用は、標的核酸配列の転写の抑制のための細胞又は標的核酸配列への系成分の送達において利点をもたらす。ＲＮＰのｄＣａｓＸバリアントタンパク質成分は、標的核酸の所望の特異的位置に対して相補的であり、かつＰＡＭ配列の近位である標的化配列を含むガイドＲＮＡとのその会合によって、標的核酸配列内の標的部位に誘導される（例えば、標的部位で安定化される）部位特異的活性を提供する。
いくつかの実施形態では、複数のｇＲＮＡ（例えば、複数のｇＲＮＡ）が、遺伝子の異なる領域での抑制のために系によって送達され、以下により十分に記載されるように、抑制の効率及び／又は持続時間を増加させることが想定される。
ａ．参照ｇＲＮＡ及びｇＲＮＡバリアント
本開示の遺伝子リプレッサー系への組み込みのためのｇＲＮＡの設計において、Ｄｅｅｐ Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＭＥ）、ディープ変異スキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異導入、ランダム変異導入、互い違い伸長ＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、又はドメインスワッピングと呼ばれる包括的なアプローチを利用して、最初の自然に存在するｇＲＮＡ（「参照ｇＲＮＡ」）の核酸配列に変異及び変形を体系的な方法で導入し、改善された特性を有するｇＲＮＡバリアントをもたらし、次いで、ｇＲＮＡバリアントへのアプローチを再適用して、結果として生じるｇＲＮＡバリアントを更に進化させ、かつ改善した。ｇＲＮＡバリアントはまた、１つ以上の化学修飾を含むバリアントを含む。参照ｇＲＮＡの活性は、ｇＲＮＡバリアントの活性が比較され、それによって、ｇＲＮＡバリアントの機能又は他の特徴の改善を測定する、ベンチマークとして使用され得る。他の実施形態では、参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡバリアント、例えば、合理的に設計されたバリアントを産生するために、１つ以上の意図的な標的変異を受け得る。
本開示のｇＲＮＡは、標的化配列及びタンパク質結合セグメントという２つのセグメントを含む。ｇＲＮＡの標的化セグメントは、以下により十分に記載される、標的核酸配列（例えば、標的ｓｓＲＮＡ、標的ｓｓＤＮＡ、二本鎖標的核酸の鎖など）内の特異的配列（標的部位）に対して相補的である（したがって、それとハイブリダイズする）、ヌクレオチド配列（ガイド配列、スペーサー、標的化因子、又は標的化配列と互換的に称される）を含む。ｇＲＮＡの標的化配列は、コード配列、コード配列の補体、非コード配列、及び調節要素を含む、標的核酸配列に結合することが可能である。タンパク質結合セグメント（又は「活性化因子」若しくは「タンパク質結合配列」）は、複合体としてｄＣａｓＸタンパク質と相互作用し（例えば、それに結合し）、ＲＮＰを形成する（以下により十分に記載される）。タンパク質結合セグメントは、以下により十分に記載される、いくつかの領域で構成される「足場」と本明細書では代替的に称される。
デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）の場合、標的因子（ｔａｒｇｅｔｅｒ）部分及び活性化因子部分は各々、二本鎖形成セグメントを有し、標的因子の二本鎖形成セグメント及び活性化因子の二本鎖形成セグメントは、互いと相補性を有し、互いにハイブリダイズして二本鎖の二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）（ｇＲＮＡのｄｓＲＮＡ二本鎖）を形成する。本明細書では、「標的因子」又は「標的因子ＲＮＡ」という用語は、ＣａｓＸデュアルガイドＲＮＡの（したがって、「活性化因子」及び「標的因子」が、例えば、介在するヌクレオチドによって一緒に連結されたときの、ＣａｓＸシングルガイドＲＮＡの）ｃｒＲＮＡ様分子（ｃｒＲＮＡ：「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）を指すために使用される。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ、続いて、標的化配列のヌクレオチドとアニーリングする５’領域を有する。したがって、例えば、ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）は、ガイド配列とｃｒＲＮＡの二本鎖形成セグメントとを含み、これは、ｃｒＲＮＡ反復とも称され得る。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（活性化因子）はまた、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖の残りの半分を形成する、ヌクレオチドの二本鎖形成ストレッチを含む。したがって、標的因子及び活性化因子は、対応する対としてハイブリダイズして、本明細書では「デュアル分子ｇＲＮＡ」又は「ｄｇＲＮＡ」と称されるデュアルガイドＲＮＡを形成する。ｄＣａｓＸタンパク質及び連結されたリプレッサードメインによる標的核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）の部位特異的結合は、ｇＲＮＡの標的化配列と標的核酸配列との間の塩基対合相補性によって決定される１つ以上の位置（例えば、標的核酸の配列）で生じ得る。したがって、例えば、本開示のｇＲＮＡは、ＴＣ ＰＡＭモチーフ又はＰＡＭ配列、例えば、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣに対して相補的な配列に隣接する標的核酸に対して相補性を有し、したがって、それとハイブリダイズすることができる。ガイド配列の標的化配列は、標的核酸配列の配列とハイブリダイズするため、標的化配列は、ＰＡＭ配列の位置が考慮される限り、特定の標的核酸配列とハイブリダイズするようにユーザによって修飾され得る。他の実施形態では、ｇＲＮＡの活性化因子及び標的因子は、互いに共有結合しており（互いにハイブリダイズするのではなく）、本明細書において「単一分子ｇＲＮＡ」、「一分子ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」、又は「一分子ガイドＲＮＡ」と称される単一分子を含む。
集合的に、本開示の組み立てられたｇＲＮＡは、４つの異なる領域又はドメイン、すなわち、ＲＮＡ三重鎖、足場ステム、伸長ステム、及び本開示の実施形態では標的核酸に特異的であり、かつｇＲＮＡの３’末端に位置する標的化配列を含む。ＲＮＡ三重鎖、足場ステム、及び伸長ステムは、一緒に、ｇＲＮＡの「足場」と称される。ｇＲＮＡの前述の成分は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０２０／２４７８８２Ａ１及びＷＯ２０２２／１２００９５に記載されている。
ｂ．標的化配列
本開示のｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、伸長ステムループの後に、三重鎖の一部を形成する領域が続き、次いで、ｇＲＮＡの３’末端の標的化配列（又は「スペーサー」）が続き、足場は、標的化配列に対してガイド５’のその領域である。標的化配列は、ＣａｓＸリボ核タンパク質ホロ複合体を、ＲＮＰの結合に対して３’で、抑制される遺伝子の標的核酸配列の特定の領域に標的化する。したがって、例えば、本開示のｇＲＮＡ標的化配列は、ＴＣ ＰＡＭモチーフ、又はＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＣＴＣのうちのいずれか１つが、標的配列に対して相補的な非標的鎖配列に対して１ヌクレオチド５’に位置するとき、ＲＮＰの成分として真核細胞（例えば、真核染色体、染色体配列、真核ＲＮＡなど）の核酸中の遺伝子の一部分に対して配列相補性を有し、したがって、それにハイブリダイズすることができる。ｇＲＮＡの標的化配列は、ＰＡＭ配列の位置が考慮される限り、ｇＲＮＡが任意の所望の標的核酸配列の所望の配列を標的とすることができるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭモチーフ配列は、ＴＣである。他の実施形態では、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭ配列は、ＮＴＣである。他の実施形態では、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭ配列は、ＴＴＣである。他の実施形態では、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭ配列は、ＡＴＣである。他の実施形態では、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭ配列は、ＣＴＣである。他の実施形態では、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭ配列は、ＧＴＣである。
本開示の遺伝子リプレッサー系は、転写の抑制が求められている遺伝子又は遺伝子の領域の任意の領域若しくはその近位の任意の領域を標的とするように設計され得る。遺伝子の全体が抑制される場合、転写開始部位（ＴＳＳ）を包含するか、又はその近位の配列に対して相補的な標的化配列を有するガイドを設計することが、本開示によって企図される。ＴＳＳ選択は、プロモーター配列及び開始基質濃度に応じて、プロモーター領域内の異なる位置で生じる。コアプロモーターは、Ｐｏｌ ＩＩ及びその関連する一般転写因子（ＧＴＦ）を含む転写機構のための結合プラットフォームとして機能する（Ｈａｂｅｒｌｅ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｏｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９（１０）：６２１（２０１８））。ＴＳＳ選択における変動性は、ＤＮＡ「スクランチング」及び「抗スクランチング」を伴うことが提案されており、その特徴は、（ｉ）ＤＮＡに対するＲＮＡポリメラーゼのトレーリングエッジではなくリーディングエッジの順方向及び逆方向の移動、並びに（ｉｉ）転写バブルの拡張及び収縮である。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系のＲＮＰによって結合された標的核酸配列は、遺伝子中の転写開始部位（ＴＳＳ）の１ｋｂ以内である。いくつかの実施形態では、系のＲＮＰによって結合された標的核酸配列は、遺伝子のＴＳＳの上流２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、又は１ｋｂ以内にある。いくつかの実施形態では、系のＲＮＰによって結合された標的核酸配列は、遺伝子のＴＳＳの下流２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、又は１ｋｂ以内にある。いくつかの実施形態では、系のＲＮＰによって結合された標的核酸配列は、遺伝子のＴＳＳの上流５００ｂｐ～下流５００ｂｐ、又は上流３００ｂｐ～下流３００ｂｐ以内にある。いくつかの実施形態では、系のＲＮＰによって結合された標的核酸配列は、遺伝子のエンハンサーの２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、又は１ｋｂ以内にある。いくつかの実施形態では、本開示の系のＲＮＰによって結合された標的核酸配列は、遺伝子の５’非翻訳領域に対して１ｋｂ ３’以内にある。他の実施形態では、系のＲＮＰによって結合された標的核酸配列は、イントロン（存在する場合）を含む遺伝子のオープンリーディングフレーム内にある。いくつかの実施形態では、本開示の系のｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子のエクソンに特異的であるように設計されている。特定の実施形態では、本開示の系のｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子のエクソン１に特異的であるように設計されている。他の実施形態では、本開示の系のｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子のイントロンに特異的であるように設計されている。他の実施形態では、本開示の系のｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子のイントロン－エクソン接合部に特異的であるように設計されている。他の実施形態では、本開示の系のｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子の調節要素に特異的であるように設計されている。他の実施形態では、本開示の系のｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子の遺伝子間領域の配列に対して相補的であるように設計されている。他の実施形態では、本開示の系のｇＲＮＡの標的化配列は、遺伝子のエクソン、イントロン、及び／又は調節要素の接合部に特異的である。標的化配列が調節要素に特異的である場合、そのような調節要素としては、プロモーター領域、エンハンサー領域、遺伝子間領域、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、保存要素、及びシス調節要素を含む領域が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーター領域は、コード配列の開始点から５ｋｂ以内のヌクレオチドを包含することが意図されるか、又は遺伝子エンハンサー要素若しくは保存要素の場合、標的核酸の遺伝子のコード配列から数千ｂｐ、数十万ｂｐ、又は更には数百万ｂｐ離れていてもよい。前述では、標的は、標的のコード遺伝子が、遺伝子産物が細胞中で発現されないか、又はより低いレベルで発現されるように抑制されることが意図されるものである。いくつかの実施形態では、本開示の系のＲＮＰが標的核酸の結合位置に結合すると、系は、ＲＮＰの結合位置に対して５’の遺伝子の転写を抑制することができる。他の実施形態では、系のＲＮＰが標的核酸の結合位置に結合すると、系は、ＲＮＰの結合位置に対して３’の遺伝子の転写を抑制することができる。いくつかの実施形態では、系のＲＮＰが標的核酸の結合位置に結合すると、系は、インビトロアッセイで評価された場合、未処置遺伝子と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％大きく遺伝子の転写を抑制することができる。いくつかの実施形態では、系のＲＮＰが標的核酸の結合位置に結合すると、系は、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約７日、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、少なくとも約２か月、又は少なくとも約６か月、又は少なくとも約１年間、遺伝子の転写を抑制することができる。
いくつかの実施形態では、系のｇＲＮＡの標的化配列は、１４～２０個の連続するヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の連続するヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、系のｇＲＮＡの標的化配列は、２０個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１７個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１６個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１５個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の連続するヌクレオチドを有し、標的化配列は、標的核酸配列に対して０～５個、０～４個、０～３個、又は０～２個のミスマッチを含み、標的化配列を含むｇＲＮＡを含むＲＮＰが、標的核酸に対して相補的結合を形成することができるように、十分な結合特異性を保持することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のリプレッサー系であるｄＸＲ：ｇＲＮＡは、第１のｇＲＮＡを含み、第２（及び任意選択的に第３、第４、第５、又はそれ以上）のｇＲＮＡを更に含み、第２のｇＲＮＡ又は追加のｇＲＮＡは、標的核酸中の複数の点が標的化されるように、第１のｇＲＮＡの標的化配列と比較して、標的核酸配列の異なる部分又は重複部分に対して相補的な標的化配列を有し、転写を効果的に抑制する系の能力を高める。そのような場合、第２又は追加のｇＲＮＡは、ｄＸＲの追加のコピーと複合体化されることが理解されるであろう。ｇＲＮＡの標的化配列の選択によって、標的核酸配列の定義された領域が、本明細書に記載される系を使用して抑制され得る。
ｃ．ｇＲＮＡ足場
標的化配列領域を除いて、ｇＲＮＡの残りの領域は、本明細書では足場と称される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、変異、挿入、欠失、又はドメイン置換が、ｇＲＮＡに望ましい特性を付与するために導入される、参照ｇＲＮＡのバリアントである。
いくつかの実施形態では、参照ｇＲＮＡは、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａから単離されたか、又はそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａから単離されたか、又はそれに由来する例示的なＣａｓＸ参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列としては、ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号６）及びＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号７）が挙げられ得る。Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａから単離されたか、又はそれに由来する例示的なｃｒＲＮＡ配列は、ＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号３３２７１）の配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、参照ガイドＲＮＡは、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されたか、又はそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されたか、又はそれに由来する例示的な参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列としては、ＵＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号８）及び
ＵＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号９）が挙げられ得る。Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されたか、又はそれに由来する例示的なｃｒＲＮＡ配列は、ＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号３３２７２）の配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、参照ｇＲＮＡは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されたか、又はそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されたか、又はそれに由来する例示的なＣａｓＸ参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列としては、ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＡＧＧＧＵ（配列番号１０）、ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＡＧＧＵ（配列番号１１）、ＵＵＵＵＡＣＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵ（配列番号１２）、及びＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＧＧ（配列番号１３）の配列を含み得る。表１は、いくつかの実施形態では、系のｇＲＮＡを生成するように修飾されている、参照ｇＲＮＡ ｔｒａｃｒ、ｃｒ、及び足場配列の配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡバリアント配列を提供し、ｇＲＮＡは、表１の配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を有する参照ｇＲＮＡ配列に対して、１つ以上のヌクレオチド修飾を有する配列を含む足場を有する。ベクターがｇＲＮＡのＤＮＡコード配列を含む、実施形態では、チミン（Ｔ）塩基は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ配列実施形態のいずれかのウラシル（Ｕ）塩基に対して置換され得ることが理解されるであろう。
ｄ．ｇＲＮＡバリアント
別の態様では、本開示は、参照ｇＲＮＡ足場に対して１つ以上の修飾を含むガイドリボ核酸バリアント（本明細書では「ｇＲＮＡバリアント」と称される）に関する。本明細書で使用される場合、「足場」は、スペーサー配列を除いて、ｇＲＮＡ機能に必要なｇＲＮＡに対する全ての部分を指す。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、本開示の参照ｇＲＮＡ配列に対して、１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、欠失、又は交換された領域若しくは置き換えられた領域を含む。いくつかの実施形態では、変異が、参照ｇＲＮＡ足場の任意の領域に生じて、ｇＲＮＡバリアントを産生し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント配列の足場は、配列番号４又は配列番号５の配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの特徴を改善する、参照ｇＲＮＡ足場の１つ以上の領域内の１つ以上のヌクレオチド変化を含む。例示的な領域としては、ＲＮＡ三重鎖、シュードノット、足場ステムループ、及び伸長ステムループが挙げられる。いくつかの場合では、バリアント足場ステムは、バブルを更に含む。他の場合では、バリアント足場は、三重鎖ループ領域を更に含む。更に他の場合では、バリアント足場は、５’非構造化領域を更に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号１４に対して少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する足場ステムループを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号１４に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する足場ステムループを含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧ（配列番号３３２７３）の配列を有する足場ステムループを含む。他の実施形態では、本開示は、配列番号５に対して、Ｃ１８Ｇ置換、Ｇ５５挿入、Ｕ１欠失、並びに元の６ｎｔループ及び１３個の最ループ近位塩基対（合計３２個のヌクレオチド）がＵｖｓｘヘアピン（４ｎｔループ及び５個のループ近位塩基対、合計１４個のヌクレオチド）によって置き換えられ、伸長ステムのループ遠位塩基が、Ａ９９の欠失及びＧ６５Ｕの置換によって、新しいＵｖｓｘヘアピンと連続する完全塩基対ステムに変換された、修飾伸長ステムループを含む。前述の実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、配列ＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＵＣＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号３３２７４）を含む。
１つ以上の改善された特徴を有するか、又は１つ以上の新しい機能を追加する全てのｇＲＮＡバリアントは、バリアントｇＲＮＡが本明細書に記載される参照ｇＲＮＡと比較されると、本開示の範囲内として想定される。遺伝子リプレッサー系に適したそのようなｇＲＮＡバリアントの代表的な例は、ｇＲＮＡバリアント１７４（配列番号２２３８）である。遺伝子リプレッサー系に適したそのようなｇＲＮＡバリアントの別の代表的な例は、ｇＲＮＡバリアント２３５（配列番号２２９２）である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡバリアントを含むＲＮＰに新しい機能を追加する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、安定性の改善、溶解性の改善、ｇＲＮＡの転写の改善、ヌクレアーゼ活性に対する耐性の改善、ｇＲＮＡのフォールディング速度の増加、フォールディング中の副産物形成の減少、生産性の高いフォールディングの増加、ｄＸＲ融合タンパク質及び連結されたリプレッサードメインに対する結合親和性の改善、ｄＸＲ融合タンパク質及び連結されたリプレッサードメインと複合体化されたときの標的核酸に対する結合親和性の改善、並びにｄＸＲ融合タンパク質と複合体化されたときの標的核酸の結合における、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＴＣＣを含む１つ以上のＰＡＭ配列のより大きなスペクトルを利用する能力の改善、並びにそれらの任意の組み合わせから選択される、改善された特徴を有する。いくつかの場合では、ｇＲＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡに対して少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善される。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡに対して少なくとも約１．１、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１００，０００倍、又はそれ以上改善される。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡに対して約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、又は約５０～１００倍改善される。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡに対して約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、又は５００倍改善される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、本開示のｇＲＮＡバリアントを生成するために、Ｄｅｅｐ Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＭＥ）、ディープ変異スキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異導入、ランダム変異導入、互い違い伸長ＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、又はドメインスワッピングを含み得る、本明細書で以下に記載される変異導入方法などの１つ以上の変異導入方法に供することによって生成され得る。参照ｇＲＮＡの活性は、ｇＲＮＡバリアントの活性が比較され、それによって、ｇＲＮＡバリアントの機能の改善を測定する、ベンチマークとして使用され得る。他の実施形態では、参照ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡバリアント、例えば、合理的に設計されたバリアントを産生するために、１つ以上の意図的な標的化変異、置換、又はドメインスワッピングに供されてもよい。そのような方法によって産生される例示的なｇＲＮＡバリアントを表２に示す。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ガイドリボ核酸足場配列と比較して１つ以上の修飾を含み、１つ以上の修飾は、参照ｇＲＮＡの領域内の少なくとも１つのヌクレオチド置換、参照ｇＲＮＡの領域内の少なくとも１つのヌクレオチド欠失、参照ｇＲＮＡの領域内の少なくとも１つのヌクレオチド挿入、参照ｇＲＮＡの領域の全て若しくは一部分の置換、参照ｇＲＮＡの領域の全て若しくは一部分の欠失、又は前述の任意の組み合わせから選択される。いくつかの場合では、修飾は、１つ以上の領域内の参照ｇＲＮＡ中の１～１５個の連続する又は非連続のヌクレオチドの置換である。他の場合では、修飾は、１つ以上の領域内の参照ｇＲＮＡ中の１～１０個の連続する又は非連続のヌクレオチドの欠失である。他の場合では、修飾は、１つ以上の領域内の参照ｇＲＮＡ中の１～１０個の連続する又は非連続のヌクレオチドの挿入である。他の場合では、修飾は、足場ステムループ又は伸長ステムループの、近位５’末端及び３’末端を有する異種ＲＮＡ源からのＲＮＡステムループ配列での置換である。いくつかの場合では、本開示のｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡに対して、１つの領域内に２つ以上の修飾を含む。他の場合では、本開示のｇＲＮＡバリアントは、２つ以上の領域内に修飾を含む。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントは、本段落に記載される前述の修飾の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、Ｕ６プロモーターからの転写が＋１ヌクレオチドがＧである場合、開始部位に関してより効率的かつより一貫しているため、５’Ｇは、参照ｇＲＮＡに対して、インビボでの発現のためにｇＲＮＡバリアント配列に付加される。他の実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼが＋１位におけるＧ及び＋２位におけるプリンを強く好むため、インビトロ転写のためのｇＲＮＡバリアント配列を生成して、生成効率を高めるために、２つの５’Ｇが付加される。いくつかの場合では、５’Ｇ塩基は、表１の参照足場に付加される。他の場合では、５’Ｇ塩基は、表２のバリアント足場に付加される。
表２は、例示的なｇＲＮＡバリアント足場配列を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、表２に列挙される配列のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。ベクターがｇＲＮＡのＤＮＡコード配列を含む、実施形態では、チミン（Ｔ）塩基は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ配列実施形態のいずれかのウラシル（Ｕ）塩基に対して置換され得ることが理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、遺伝子リプレッサー系のｇＲＮＡバリアントは、表２に記載される配列番号２２３８～２３３１、５７５４４～５７５８９、及び５９３５２のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２３８、２２４１、２２４４、２２４８、２２４９、又は２２５９～２２８０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２３８、２２４１、２２４４、２２４８、２２４９、又は２２５９～２２８０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２８１～２３３１のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、配列番号５７５４４～５７５８９及び５９３５２のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、配列に対して１つ以上の化学修飾を含む。
本開示の遺伝子リプレッサー系とともに使用するための追加の代表的なｇＲＮＡバリアント足場配列は、配列番号２１０１～２２３７として含まれる。
ｅ．ｇＲＮＡ３１６
ガイド足場は、組換え又は固相ＲＮＡ合成を含む、いくつかの方法によって作製され得る。しかしながら、足場の長さは、固相ＲＮＡ合成を使用する場合に製造可能性に影響を与える可能性があり、より長い長さは、製造コストの増加、純度及び収率の減少、並びにより高い合成失敗率をもたらす。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤での使用については、商業的開発に必要な量を生成するために、足場の固相ＲＮＡ合成が好ましい。以前の実験では、ｇＲＮＡ足場２３５（配列番号２２９２）が、ｇＲＮＡ足場１７４（配列番号２２３８）に対して強化された特性を有すると識別されたが、その長さの増加により、ＬＮＰ製剤のためのその使用が問題のあるものになった。したがって、代替の配列が求められた。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ及び連結された標的化配列が、約１２０個未満のヌクレオチド、約１１０個未満のヌクレオチド、又は約１００個未満のヌクレオチドの配列を有する、ｇＲＮＡを提供する。
一実施形態では、足場１７４の伸長ステムループが２３５足場の伸長ステムループを置き換えたドメインスワップによって、足場２３５配列が修飾され、ｇＲＮＡ足場２３５の９９個のヌクレオチドと比較して、８９個のヌクレオチドを有する配列ＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＣＵＡＵＣＵＧＡＵＵＡＣＵＣＵＧＡＧＣＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＵＣＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＡＵＣＡＧＡＧ（配列番号５９３５２）を有するキメラＲＮＡ足場３１６を得た、足場を設計した。製造可能性の改善に加えて、実施例に記載されるように、３１６足場は、編集アッセイにおいてｇＲＮＡ足場１７４と同等に又はより好ましく機能すると決定された。結果として生じる３１６個の足場は、伸長ステムループがＣｐＧモチーフを含有しなかったという点で更なる利点を有し、特性の強化は、以下により十分に記載される。
ｆ．化学修飾された足場
別の態様では、本開示は、化学修飾を有するｇＲＮＡに関する。いくつかの実施形態では、化学修飾は、配列の１つ以上のヌクレオチドへの２’Ｏ－メチル基の付加である。いくつかの実施形態では、化学修飾は、配列の２つ以上のヌクレオチド間のホスホロチオエート結合の置換である。
ｇ．ステムループ修飾
いくつかの実施形態では、遺伝子リプレッサー系のｇＲＮＡバリアントは、外因性伸長ステムループを含み、参照ｇＲＮＡとのそのような差異は、以下に記載される。いくつかの実施形態では、外因性伸長ステムループは、本明細書に開示される参照ステムループ領域（例えば、配列番号１５）と同一性をほとんど又は全く有していない。いくつかの実施形態では、外因性ステムループは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、又は少なくとも１，０００ｂｐである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、少なくとも１０個、少なくとも１００個、少なくとも５００個、又は少なくとも１０００個のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、異種ステムループは、ｇＲＮＡの安定性を高める。いくつかの実施形態では、異種ＲＮＡステムループは、タンパク質、ＲＮＡ構造、ＤＮＡ配列、又は小分子に結合することが可能である。いくつかの実施形態では、外因性ステムループ領域は、１つ以上のＲＮＡステムループ又はヘアピン、例えば、熱安定性ＲＮＡ、例えば、ＭＳ２結合（又はタグ付け）配列（ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵ（配列番号３３２７６）、Ｑβヘアピン（ＡＵＧＣＡＵＧＵＣＵＡＡＧＡＣＡＧＣＡＵ（配列番号３３２７７））、Ｕ１ヘアピンＩＩ（ＧＧＡＡＵＣＣＡＵＵＧＣＡＣＵＣＣＧＧＡＵＵＵＣＡＣＵＡＧ（配列番号３３２７８））、Ｕｖｓｘ（ＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧ（配列番号３３２７９））、ＰＰ７（ＡＡＧＧＡＧＵＵＵＡＵＡＵＧＧＡＡＡＣＣＣＵＵ（配列番号３３２８０））、ファージ複製ループ（ＡＧＧＵＧＧＧＡＣＧＡＣＣＵＣＵＣＧＧＵＣＧＵＣＣＵＡＵＣＵ（配列番号３３２８１））、キッシングループ．ａ（ＵＧＣＵＣＧＣＵＣＣＧＵＵＣＧＡＧＣＡ（配列番号３３２８２））、キッシングループ＿ｂ１（ＵＧＣＵＣＧＡＣＧＣＧＵＣＣＵＣＧＡＧＣＡ（配列番号３３２８３））、キッシングループ＿ｂ２（ＵＧＣＵＣＧＵＵＵＧＣＧＧＣＵＡＣＧＡＧＣＡ（配列番号３３２８４））、Ｇ四本鎖（ｑｕａｄｒｉｐｌｅｘ）（Ｍ３ｑ（ＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧ（配列番号３３２８５））、Ｇ四本鎖（ｑｕａｄｒｉｐｌｅｘ）テロメアバスケット（ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧ（配列番号３３２８６））、サルシン－リシンループ（ＣＵＧＣＵＣＡＧＵＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＡＧ（配列番号３３２８７））、シュードノット（ＵＡＣＡＣＵＧＧＧＡＵＣＧＣＵＧＡＡＵＵＡＧＡＧＡＵＣＧＧＣＧＵＣＣＵＵＵＣＡＵＵＣＵＡＵＡＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＵＵＵＵＡＡＡＡＵＧＵＣＵＣＵＡＡＧＵＡＣＡ（配列番号３３２８８））、トランス活性化応答要素（ＴＡＲ）（ＧＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＣ（配列番号５７７４１））、鉄応答要素（ＩＲＥ）ＣＣＧＵＧＵＧＣＡＵＣＣＧＣＡＧＵＧＵＣＧＧＡＵＣＣＡＣＧＧ（配列番号５７７４２））、トランス活性化応答要素（ＴＡＲ）ＧＧＣＵＣＧＵＧＵＡＧＣＵＣＡＵＵＡＧＣＵＣＣＧＡＧＣＣ（配列番号５７７４３））、ファージＧＡヘアピン（ＡＡＡＡＣＡＵＡＡＧＧＡＡＡＡＣＣＵＡＵＧＵＵ（配列番号５７７４４））、ファージΛＮヘアピン（ＧＣＣＣＵＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣ（配列番号５７７４５））、又はそれらの配列バリアントを含む。いくつかの実施形態では、前述のヘアピン配列のうちの１つは、ステムループに組み込まれて、ｇＲＮＡ（及びＲＮＰ複合体中の関連するＣａｓＸ）の、出芽ＸＤＰ（以下により十分に記載される）への組み込みを輸送するのを助ける。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子リプレッサー系のｓｇＲＮＡバリアントは、以前に生成されたバリアントへの１つ以上の追加の変化を含み、以前に生成されたバリアント自体が参照配列として機能する。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２３８、配列番号２２３９、配列番号２２４０、配列番号２２４１、配列番号２２４１、配列番号２２７４、配列番号２２７５、配列番号２２７９、又は配列番号５９３５２の配列への１つ以上の追加の変化を含む。
いくつかの例示的な実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２３８（バリアント足場１７４、表２を参照）の配列への１つ以上の追加の変化を含む。
いくつかの例示的な実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２３９（バリアント足場１７５、表２を参照）の配列への１つ以上の追加の変化を含む。
いくつかの例示的な実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２７５（バリアント足場２１５、表２を参照）の配列への１つ以上の追加の変化を含む。
いくつかの例示的な実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２９２（バリアント足場２３５、表２を参照）の配列への１つ以上の追加の変化を含む。
いくつかの例示的な実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号５９３５２（バリアント足場３１６、表２を参照）の配列への１つ以上の追加の変化を含む。
ｈ．ｄＣａｓＸタンパク質との複合体形成
いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、ｄＣａｓＸ及び連結されたリプレッサードメインに対する改善された親和性を有し、それによって、ｄＣａｓＸタンパク質及び連結されたリプレッサードメインとともにリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するその能力を改善する。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体形成の改善は、機能性ＲＮＰが組み立てられる効率を改善し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント及びスペーサーを含むＲＮＰの９０％超、９３％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、又は９９％超は、標的核酸に結合する能力がある。
ｇＲＮＡバリアントがｄＸＲとともに複合体を形成する能力を改善することができる例示的なヌクレオチド変化は、いくつかの実施形態では、足場ステムを熱安定性ステムループで置き換えることを含み得る。いかなる理論によっても束縛されることを望むものではないが、足場ステムを熱安定性ステムループで置き換えることは、ｄＸＲとのｇＲＮＡバリアントの全体的な結合安定性を高め得る。代替的又は追加的に、ステムループの大きなセクションを除去することは、例えば、ｇＲＮＡバリアントそれ自体が「絡み合う」可能性がある程度を低下させることによって、ｇＲＮＡバリアントのフォールディング動態を変化させ、機能的にフォールディングされたｇＲＮＡを構造的に組み立てることをより容易かつより迅速にすることができる。いくつかの実施形態では、足場ステムループ配列の選択は、ｇＲＮＡに利用される異なるスペーサーとともに変化し得る。いくつかの実施形態では、足場配列は、スペーサー、したがって標的配列に合わせられ得る。実施例のアッセイを含む生化学的アッセイを使用して、ＲＮＰを形成するためのｇＲＮＡバリアントに対するｄＸＲの結合親和性を評価することができる。例えば、当業者は、追加の標識されていない「コールド競合体」ｇＲＮＡの濃度の増加に応答して、固定化ｄＸＲに結合された蛍光標識されたｇＲＮＡの量の変化を測定することができる。代替的又は追加的に、蛍光シグナルは、異なる量の蛍光標識されたｇＲＮＡが固定化ｄＸＲ上に流れるにつれてどのように変化するかを監視され得るか、又は見ることができる。代替的に、ＲＮＰを形成する能力は、定義された標的核酸配列に対するインビトロアッセイを使用して評価され得る。
ｉ．ｇＲＮＡ機能の追加又は変化
いくつかの実施形態では、系のｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡに対してｇＲＮＡバリアントのトポロジーを変化させ、それによって、異なるｇＲＮＡ機能性を可能にする、より大きな構造的変化を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡ足場の内在性ステムループを、以前に特定された安定したＲＮＡ構造、あるいはタンパク質若しくはＲＮＡ結合パートナーと相互作用してｄＣａｓＸバリアントに追加の部分を動員するか、又はｄＣａｓＸバリアントを当該ＲＮＡ構造への結合パートナーを有するＸＤＰキャプシドの内側などの特定の位置に動員することができるステムループとスワッピングした。ＲＮＡ結合ドメインは、ｇＲＮＡに挿入されたレトロウイルスＰｓｉパッケージング要素であり得るか、又はＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、Ｑβコートタンパク質、Ｕ１Ａタンパク質、若しくはファージＲループからなる群から選択されるタンパク質に対する親和性を有するステムループ若しくはヘアピン（例えば、ＭＳ２ヘアピン、Ｑβヘアピン、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、若しくはＰＰ７ヘアピン）であり得、これらは、ｄＣａｓＸバリアントへのｇＲＮＡの結合を促進し得る。ｄＣａｓＸバリアントに組み込まれたタンパク質構造に対する親和性を有する類似のＲＮＡ成分としては、キッシングループ、ａ、キッシングループ＿ｂ１、キッシングループ＿ｂ２、Ｇ四本鎖（ｑｕａｄｒｉｐｌｅｘ）Ｍ３ｑ、Ｇ四本鎖（ｑｕａｄｒｉｐｌｅｘ）テロメアバスケット、サルシン－リシンループ、及びシュードノットが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡバリアントは、前述の複数の成分、又は同じ成分の複数のコピーを含む。
Ｖ．遺伝子リプレッサー系のＣＲＩＳＰＲタンパク質
触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む融合タンパク質を含む遺伝子リプレッサー系が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質は、触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質である。クラス２系は、単一のマルチドメインエフェクタータンパク質を有し、参照により本明細書に組み込まれるＭａｋａｒｏｖａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ：ａ ｂｕｒｓｔ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ａｎｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：６７（２０２０）に記載されるＩＩ型、Ｖ型、又はＶＩ型系に更に分けられる。いくつかの実施形態では、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃａｓ９などのクラス２、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。他の場合では、触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲは、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃａｓ１２ｌ、Ｃａｓ１４、及び／又はＣａｓΦなどのクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。
Ｖ型系のヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの１つの鎖の切断に各々関与する２つの核ドメインを含有するＩＩ型エフェクター（例えば、Ｃａｓ９）とは異なり、ＨＮＨヌクレアーゼが、Ｒｕｖ－Ｃ様ヌクレアーゼドメイン配列内に挿入される。Ｖ型ヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインではなく、単一ＲＮＡガイドＲｕｖＣドメイン含有エフェクターを保有し、それらは、標的配列の３’側でＧ豊富ＰＡＭに依存するＣａｓ９系とは異なる、非標的鎖上の標的領域の上流の５’にあるＴ豊富プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する。Ｖ型ヌクレアーゼは、ＰＡＭに近い近位部位に平滑末端を生成するＣａｓ９とは異なり、ＰＡＭ配列の遠位に互い違いの二本鎖切断を生成する。加えて、Ｖ型ヌクレアーゼは、シスにおける標的ｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡ結合によって活性化されると、トランスにおけるｓｓＤＮＡを分解する。いくつかの実施形態では、ＸＤＰ実施形態で利用されるＶ型ヌクレアーゼは、５’ＴＣ ＰＡＭモチーフを認識し、ＲｕｖＣドメインによって切断された互い違いの末端を産生する。Ｖ型系（例えば、Ｃａｓ１２）は、両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのみを含有する。ＶＩ型（Ｃａｓ１３）は、ＩＩ型及びＶ型の系のエフェクターとは無関係であり、２つのＨＥＰＮドメインを含有し、ＲＮＡを標的とする。
本明細書で使用される場合、「ＣａｓＸタンパク質」という用語は、タンパク質のファミリーを指し、全ての自然に存在するＣａｓＸタンパク質（「参照ＣａｓＸ」）、並びに自然に存在する参照ＣａｓＸタンパク質に対して、１つ以上の改善された特徴を有するＣａｓＸバリアントを包含する。本開示の文脈では、触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸ及びＣａｓＸバリアントタンパク質から調製され、例示的なｄＣａｓＸバリアント配列は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８に示される。本開示のＣａｓＸ及びｄＣａｓＸタンパク質は、以下により十分に記載される非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖ローディング（ＴＳＬ）ドメイン、らせん状Ｉドメイン、らせん状ＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、及びＲｕｖＣドメインのうちの少なくとも１つを含む（そのうちの最後のドメインは、触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアントを生成するために修飾又は欠失され得る）。
ａ．参照ＣａｓＸタンパク質
本開示は、自然に存在し、かつｄＣａｓＸバリアントの生成のための配列修飾を導入するための前述のプロトコルのための出発材料であった、参照ＣａｓＸタンパク質を提供する。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、又はＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａ種などの自然に存在する原核生物から単離され得る。参照ＣａｓＸタンパク質（本明細書では参照ＣａｓＸポリペプチドと時に称される）は、ガイドＲＮＡと相互作用してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができるタンパク質のＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅと時に称される）ファミリーに属するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。
いくつかの場合では、参照ＣａｓＸタンパク質は、以下の配列を有するＤｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ単離されるか、又はそれに由来する：
Figure 2024534523000012
いくつかの場合では、参照ＣａｓＸタンパク質は、以下の配列を有するＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されるか、又はそれに由来する：
Figure 2024534523000013
いくつかの場合では、参照ＣａｓＸタンパク質は、以下の配列を有するＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されるか、又はそれに由来する：
Figure 2024534523000014
ｂ．触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアントタンパク質（ｄＣａｓＸバリアント）
遺伝子リプレッサー系では、ＣａｓＸタンパク質は、触媒活性を伴わない（ｄＣａｓＸ）が、標的核酸に結合する能力を保持する。本開示は、触媒活性を伴わないバリアント（本明細書では「ｄＣａｓＸバリアント」又は「ｄＣａｓＸバリアントタンパク質」と互換的に称される）を提供し、触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアントは、配列番号１～３（上記）の配列の触媒活性を伴わないバージョンに対して、少なくとも１つのドメイン中に少なくとも１つの修飾を含む。例示的な触媒活性を伴わないＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの活性部位中に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、触媒活性を伴わない参照ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１を参照して残基６７２、７６９、及び／又は９３５に置換を含む。一実施形態では、触媒活性を伴わない参照ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１を参照してＤ６７２Ａ、Ｅ７６９Ａ、及び／又はＤ９３５Ａの置換を含む。他の実施形態では、触媒活性を伴わない参照ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２を参照してアミノ酸６５９、７５６、及び／又は９２２に置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒活性を伴わない参照ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２を参照してＤ６５９Ａ、Ｅ７５６Ａ、及び／又はＤ９２２Ａ置換を含む。本開示のｄＣａｓＸの例示的なＲｕｖＣドメインは、配列番号１のアミノ酸６６１～８２４及び９３５～９８６、又は配列番号２のアミノ酸６４８～８１２及び９２２～９７８を含み、当該ＲｕｖＣ切断ドメイン配列に対して１つ以上のアミノ酸修飾を有し、ｄＣａｓＸバリアントは、参照ｄＣａｓＸと比較して１つ以上の改善された特徴を示す。更なる実施形態では、触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの全て又は一部の欠失を含む。同じ前述の置換又は欠失が、開始バリアントの対応する位置（任意の挿入又は欠失を可能にする）に対して、本開示の配列番号３３３５２～３３６２４又は５７６４７～５７７３５のＣａｓＸバリアントのうちのいずれかに同様に導入され、ｄＣａｓＸバリアントをもたらすことができることが理解されるであろう（例えば、例示的な配列については表４を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、連結されたリプレッサードメインを有するｄＣａｓＸバリアントは、例えば、配列番号３３３５２～３３６２４又は５７６４７～５７７３５のうちのいずれか１つのＣａｓＸバリアントの触媒活性を伴わないバージョンなど、同等の様式で構成された連結されたリプレッサードメインを有する参照ｄＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つの改善された特徴を示す。本明細書に記載される連結されたリプレッサードメインを有する参照ｄＣａｓＸタンパク質と比較して、連結されたリプレッサードメインを有する場合のｄＣａｓＸバリアントタンパク質の１つ以上の機能又は特徴を改善する全てのバリアントは、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態では、修飾は、参照ｄＣａｓＸの１つ以上のアミノ酸の変異である。いくつかの実施形態では、修飾は、配列の追加の変異又は改変に供されたｄＣａｓＸバリアントの１つ以上のアミノ酸の変異である。他の実施形態では、修飾は、参照ｄＣａｓＸの１つ以上のドメインの、異なるＣａｓＸ由来の１つ以上のドメインでの置換である。いくつかの実施形態では、挿入は、異なるＣａｓＸタンパク質からのドメインの一部又は全ての挿入を含む。変異は、参照ｄＣａｓＸタンパク質又はｄＣａｓＸバリアントの任意の１つ以上のドメインで生じ得、例えば、１つ以上のドメインの一部若しくは全ての欠失、又は任意のドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換、欠失、若しくは挿入を含み得る。ＣａｓＸタンパク質のドメインは、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖ローディング（ＴＳＬ）ドメイン、らせん状Ｉドメイン、らせん状ＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、及びＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含み、それらは、以下に記載されるサブドメインを更に含み得る。タンパク質の特徴の改善につながる参照ｄＣａｓＸタンパク質のアミノ酸配列の任意の変化は、本開示のｄＣａｓＸバリアントタンパク質とみなされる。例えば、ｄＣａｓＸバリアントは、参照ｄＣａｓＸタンパク質配列に対して１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、若しくはスワッピングされたドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
本開示のｄＣａｓＸバリアントタンパク質を生成するための好適な変異導入方法としては、例えば、Ｄｅｅｐ Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＭＥ）、ディープ変異スキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異導入、ランダム変異導入、互い違い伸長ＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、又はドメインスワッピングが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントは、例えば、参照ｄＣａｓＸにおいて１つ以上の所望の変異を選択することによって設計される。ある特定の実施形態では、参照ｄＣａｓＸタンパク質の活性は、１つ以上のｄＣａｓＸバリアントの活性が比較され、それによって、ｄＣａｓＸバリアントの機能の改善を測定する、ベンチマークとして使用される。
本明細書に記載されるｄＣａｓＸバリアントのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾は、（ａ）ｄＣａｓＸバリアント中の１～１００個の連続する若しくは非連続のアミノ酸の置換、（ｂ）ｄＣａｓＸバリアント中の１～１００個の連続する若しくは非連続のアミノ酸の欠失、（ｃ）ｄＣａｓＸ中の１～１００個の連続する若しくは非連続なアミノ酸の挿入、又は（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾は、（ａ）ｄＣａｓＸバリアント中の５～１０個の連続する若しくは非連続のアミノ酸の置換、（ｂ）ｄＣａｓＸバリアント中の１～５個の連続する若しくは非連続のアミノ酸の欠失、（ｃ）ｄＣａｓＸ中の１～５個の連続する若しくは非連続のアミノ酸の挿入、又は（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせを含む。
任意のアミノ酸は、本明細書に記載される置換において任意の他のアミノ酸に対して置換され得る。置換は、保存的置換であり得る（例えば、塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸に対して置換される）。置換は、非保存的置換であり得る（例えば、塩基性アミノ酸が酸性アミノ酸に対して置換されるか、又はその逆）。例えば、参照ｄＣａｓＸタンパク質中のプロリンは、本開示のｄＣａｓＸバリアントタンパク質を生成するために、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンのうちのいずれかに対して置換され得る。
本明細書に記載される置換、挿入、及び欠失実施形態の任意の順列を組み合わせて、本開示のｄＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。例えば、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ｄＣａｓＸタンパク質配列に対する少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの欠失、参照ｄＣａｓＸタンパク質配列に対する少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの挿入、参照ｄＣａｓＸタンパク質配列に対する少なくとも１つの挿入及び少なくとも１つの欠失、又は参照ｄＣａｓＸタンパク質配列に対する少なくとも１つの置換、１つの挿入、及び１つの欠失を含み得る。
いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、７００～１２００個のアミノ酸、８００～１１００個のアミノ酸、又は９００～１０００個のアミノ酸を含む。
本開示のｄＣａｓＸ及び連結されたリプレッサードメインは、参照ｄＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣから選択されるＰＡＭ配列を含むＰＡＭ ＴＣモチーフを利用して、ＲＮＰとしてｇＲＮＡとともに複合体化されたとき、標的核酸に効率的に結合する能力が強化されている。前述では、ＰＡＭ配列は、同等のアッセイ系における参照ｄＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰの結合と比較して、アッセイ系におけるｇＲＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して少なくとも１ヌクレオチド５’に位置する。
いくつかの実施形態では、本開示の連結されたリプレッサードメインを有するｄＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡを含むＲＮＰは、２０ｐＭ以下の濃度で、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の効率で二本鎖ＤＮＡ標的に結合することができる。一実施形態では、連結されたリプレッサードメインを有するｄＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、同等のアッセイ系において、連結されたリプレッサードメインを有する参照ｄＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰと比較して、標的核酸中の標的配列のより大きな結合を示し、標的核酸のＰＡＭ配列は、ＴＴＣである。別の実施形態では、連結されたリプレッサードメインを有するｄＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、同等のアッセイ系において、連結されたリプレッサードメインを有する参照ｄＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰと比較して、標的核酸中の標的配列のより大きな結合親和性を示し、標的核酸のＰＡＭ配列は、ＡＴＣである。別の実施形態では、連結されたリプレッサードメインを有するｄＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、同等のアッセイ系において、連結されたリプレッサードメインを有する参照ｄＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰと比較して、標的核酸中の標的配列のより大きな結合親和性を示し、標的核酸のＰＡＭ配列は、ＣＴＣである。別の実施形態では、連結されたリプレッサードメインを有するｄＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、同等のアッセイ系において、連結されたリプレッサードメインを有する参照ｄＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰと比較して、標的核酸中の標的配列のより大きな結合親和性を示し、標的核酸のＰＡＭ配列は、ＧＴＣである。前述の実施形態では、１つ以上のＰＡＭ配列に対する結合親和性の増加は、ＰＡＭ配列について、表１の連結されたリプレッサードメイン及びｇＲＮＡを有する参照ｄＣａｓＸタンパク質（配列番号１～３から修飾）のうちのいずれか１つのＲＮＰの結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍以上である。
ｃ．複数のソースタンパク質由来のドメインを有するｄＣａｓＸバリアントタンパク質
ある特定の実施形態では、本開示は、２つ以上の自然に存在するＣａｓＸタンパク質、又は本明細書に記載される２つ以上のＣａｓＸバリアントタンパク質配列などの２つ以上の異なるＣａｓＸタンパク質由来のタンパク質ドメインを含む、ｄＸＲ系で使用するためのキメラｄＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「キメラｄＣａｓＸタンパク質」は、いくつかの実施形態では、異なる種から単離され得る、２つの天然に存在するタンパク質などの異なる供給源から単離されるか、又はそれらに由来する少なくとも２つのドメインを含む触媒活性を伴わないＣａｓＸを指す。例えば、いくつかの実施形態では、キメラｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第２の異なるＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、らせん状Ｉ－Ｉ、らせん状Ｉ－ＩＩ、らせん状ＩＩ、ＯＢＤ－Ｉ、ＯＢＤ－ＩＩ、ＲｕｖＣ－Ｉ、及びＲｕｖＣ－ＩＩドメインからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、らせん状Ｉ－Ｉ、らせん状Ｉ－ＩＩ、らせん状ＩＩ、ＯＢＤ－Ｉ、ＯＢＤ－ＩＩ、ＲｕｖＣ－Ｉ、及びＲｕｖＣ－ＩＩドメインからなる群から選択され、第２のドメインは、前述の第１のドメインとは異なる。キメラｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、らせん状Ｉ－Ｉ、らせん状Ｉ－ＩＩ、らせん状ＩＩ、ＯＢＤ－Ｉ、及びＯＢＤ－ＩＩドメイン、並びに配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のＲｕｖＣ－Ｉ及び／又はＲｕｖＣ－ＩＩドメイン、又はその逆を含んでもよく、変異又は他の配列改変が導入されて、参照ｄＣａｓＸタンパク質に対して改善されたバリアントの特性を有する触媒活性を伴わないバリアントを生成する。前述の一例として、キメラＲｕｖＣドメインは、配列番号１のアミノ酸６６１～８２４及び配列番号２のアミノ酸９２２～９７８を含む。前述の代替例として、キメラＲｕｖＣドメインは、配列番号２のアミノ酸６４８～８１２及び配列番号１のアミノ酸９３５～９８６を含む。特定の実施形態では、ｄＸＲで使用するためのｄＣａｓＸは、配列番号１からのＮＴＳＢドメイン及びらせん状Ｉ－ＩＩドメイン、並びに配列番号２からのらせん状Ｉ－Ｉドメインを含み、後者は、キメラドメインである。配列番号１及び配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質中のＣａｓＸドメインの座標を以下の表３に提供する。
いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントの改善された特徴は、参照ｄＣａｓＸタンパク質に対して少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントの改善された特徴は、参照ＣａｓＸタンパク質よりも少なくとも約１．１～約１０，０００倍改善される、少なくとも約１．１～約１，０００倍改善される、少なくとも約１．１～約５００倍改善される、少なくとも約１．１～約４００倍改善される、少なくとも約１．１～約３００倍改善される、少なくとも約１．１～約２００倍改善される、少なくとも約１．１～約１００倍改善される、少なくとも約１．１～約５０倍改善される、少なくとも約１．１～約４０倍改善される、少なくとも約１．１～約３０倍改善される、少なくとも約１．１～約２０倍改善される、少なくとも約１．１～約１０倍改善される、少なくとも約１．１～約９倍改善される、少なくとも約１．１～約８倍改善される、少なくとも約１．１～約７倍改善される、少なくとも約１．１～約６倍改善される、少なくとも約１．１～約５倍改善される、少なくとも約１．１～約４倍改善される、少なくとも約１．１～約３倍改善される、少なくとも約１．１～約２倍改善される、少なくとも約１．１～約１．５倍改善される、少なくとも約１．５～約３倍改善される、少なくとも約１．５～約４倍改善される、少なくとも約１．５～約５倍改善される、少なくとも約１．５～約１０倍改善される、少なくとも約５～約１０倍改善される、少なくとも約１０～約２０倍改善される、少なくとも１０～約３０倍改善される、少なくとも１０～約５０倍改善される、又は少なくとも１０～約１００倍改善される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントの改善された特徴は、参照ｄＣａｓＸタンパク質に対して少なくとも約１０～約１０００倍改善される。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子リプレッサー系で利用されるｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号３３３５２～３３６２４又は５７６４７～５７７３５の配列、及びＣａｓＸバリアントの触媒ドメインを不活生化してｄＣａｓＸバリアントを産生する上記の１つ以上の挿入、置換、又は欠失を含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子リプレッサー系で利用されるｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列からなる。他の実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列に対して少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含む。
ｄ．ｇＲＮＡに対する親和性
いくつかの実施形態では、連結されたリプレッサードメインを有するｄＣａｓＸは、参照ｄＣａｓＸタンパク質に対してｇＲＮＡに対する親和性が改善され、リボ核タンパク質複合体の形成をもたらす。ｇＲＮＡに対するｄＸＲの親和性の増加は、例えば、ＲＮＰ複合体の生成についてより低いＫｄをもたらし得、これは場合によっては、より安定したリボ核タンパク質複合体形成をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対するｄＸＲのＫｄは、参照ｄＣａｓＸタンパク質に対して少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、又は少なくとも約１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントは、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質の触媒活性を伴わないバリアントと比較して、ｇＲＮＡに対して約１．１～約１０倍増加した結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対する連結されたリプレッサードメインを有するｄＣａｓＸの親和性の増加は、対象へのインビボ送達を含む哺乳動物細胞に送達されたとき、リボ核タンパク質複合体の安定性の増加をもたらす。この安定性の増加は、対象の細胞中の複合体の機能及び有用性に影響を与え、かつ対象に送達されたとき、血液中の薬物動態特性の改善をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ｄＸＲの親和性の増加、及び結果として生じるリボ核タンパク質複合体の安定性の増加は、対象又は細胞に送達されるｄＸＲのより低い用量を可能にする一方で、所望の活性、例えばインビボ又はインビトロでの遺伝子抑制を依然として有する。ＲＮＰを形成し、それらを安定した形態に保つ能力の増加は、当該技術分野で既知のインビトロアッセイを使用して評価され得る。
いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質及び連結されたリプレッサードメインのｇＲＮＡに対するより高い親和性（より緊密な結合）は、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡの両方がＲＮＰ複合体中に残る場合、より大きな量の抑制事象を可能にする。抑制事象の増加は、本明細書に記載される抑制アッセイを使用して評価され得る。
ｇＲＮＡに対するｄＸＲ融合タンパク質結合親和性を測定する方法は、精製されたｄＸＲ融合タンパク質及びｇＲＮＡを使用するインビトロ方法を含む。ｇＲＮＡ又はｄＸＲ融合タンパク質がフルオロフォアでタグ付けされる場合、参照ｄＸＲに対する結合親和性は、蛍光偏光によって測定され得る。代替的又は追加的に、結合親和性は、バイオレイヤー干渉法、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、又はフィルター結合によって測定され得る。参照ｇＲＮＡ及びそのバリアントなどの特定のｇＲＮＡに対する、本開示の参照ｄＣａｓＸ及びバリアントタンパク質などのＲＮＡ結合タンパク質の絶対親和性を定量化するための追加の標準的な技術としては、等温熱量測定（ＩＴＣ）、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、並びに実施例の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
ｅ．標的部位への特異性の改善
いくつかの実施形態では、連結されたリプレッサードメインを有するｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、連結されたリプレッサードメインを有する参照ｄＣａｓＸタンパク質に対して、標的核酸配列への特異性が改善されている。本明細書で使用される場合、「標的特異性」とも時に称される「特異性」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系リボ核タンパク質複合体が、標的核酸配列と類似しているが同一ではないオフターゲット配列に結合する程度を指し、例えば、より高い特異度を有するｄＸＲ ＲＮＰは、参照ｄＸＲタンパク質に対して配列のオフターゲットメチル化の低減を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の特異性、及び潜在的に有害なオフターゲット効果の低減は、哺乳動物対象における使用のための許容可能な治療指数を達成するために極めて重要であり得る。
いくつかの実施形態では、連結されたリプレッサードメインを有するｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、ｇＲＮＡの標的化配列に対して相補的である標的配列内の標的部位への特異性が改善されている。理論によって束縛されることを望むものではないが、標的核酸鎖に対するｄＸＲの特異性を高めるらせん状Ｉ及びＩＩドメイン中のアミノ酸変化は、標的核酸全体に対するｄＸＲの特異性を高めることができる可能性がある。いくつかの実施形態では、標的核酸に対するｄＸＲの特異性を高めるアミノ酸変化はまた、ＤＮＡに対するｄＸＲの親和性の減少をもたらし得る。
ｆ．プロトスペーサー及びＰＡＭ配列
本明細書では、プロトスペーサーは、ガイドＲＮＡの標的化配列に対して相補的なＤＮＡ配列、及びその配列に対して相補的なＤＮＡとして定義され、それぞれ標的鎖及び非標的鎖と称される。本明細書で使用される場合、ＰＡＭは、ｇＲＮＡの標的化配列と併せて、ＤＮＡ鎖上のＣａｓＸの配向及び位置付けを助ける、プロトスペーサーの近位のヌクレオチド配列である。
ＰＡＭ配列は、縮重し得、特定のＲＮＰ構築物は、結合の異なる効率、及び触媒活性型ヌクレアーゼの場合、切断を支持する、異なる好ましくかつ許容されるＰＡＭ配列を有し得る。慣例に従うと、別段の記載がない限り、本開示は、ＰＡＭ配列及びプロトスペーサー配列の両方、並びに非標的鎖の配向に従ったそれらの方向性に言及する。これは、標的鎖ではなく非標的鎖のＰＡＭ配列が、切断を決定するようなものであるか、又は標的認識に機械的に関与することを暗示するものではない。例えば、言及がＴＴＣ ＰＡＭに対するものである場合、それは実際には、標的結合に必要である相補的ＧＡＡ配列であり得るか、又は両方の鎖からのヌクレオチドの何らかの組み合わせであり得る。本明細書に開示されるＣａｓＸタンパク質の場合、ＰＡＭは、ＰＡＭをプロトスペーサーの第１のヌクレオチドから分離する単一ヌクレオチドを有するプロトスペーサーの５’に位置する。したがって、参照ＣａｓＸの場合、ＴＴＣ ＰＡＭは、式５’－．．．ＮＮＴＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’に従う配列を意味すると理解されるべきであり、式中、「Ｎ」は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、「（プロトスペーサー）」は、ガイドＲＮＡの標的化配列と同一性を有するＤＮＡ配列である。拡張されたＰＡＭ認識を有するＣａｓＸバリアントの場合、ＴＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＡＴＣ ＰＡＭは、以下の式に従う配列を意味すると理解されるべきである：５’－．．．ＮＮＴＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’、５’－．．．ＮＮＣＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’、５’－．．．ＮＮＧＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’、又は５’－．．．ＮＮＡＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’。あるいは、ＴＣ ＰＡＭは、式５’－．．．ＮＮＮＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’に従う配列を意味すると理解されるべきである。
いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントは、ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣのうちのいずれか１つが、同等のアッセイ系における参照ｄＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰの抑制効率及び／又は結合と比較して、細胞アッセイ系におけるｇＲＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して１ヌクレオチド５’に位置するとき、標的核酸中の標的配列のより大きな抑制効率及び／又は結合を示す。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＴＣである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＴＣである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＣＴＣである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＧＴＣである。
ｇ．ｄＣａｓＸ融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、異種タンパク質を含むｄＸＲ融合タンパク質を提供する。
いくつかの場合では、ｄＸＲとともに使用するための異種ポリペプチド（融合パートナー）は、細胞内局在化を提供し、すなわち、異種ポリペプチドは、細胞内局在化配列（例えば、核への標的化のための核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核の外に融合タンパク質を保つための配列、例えば、核輸出配列（ＮＥＳ）、細胞質内に保持された融合タンパク質を保つための配列、ミトコンドリアへの標的化のためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体への標的化のための葉緑体局在化シグナル、ＥＲ保持信号など）を含む。
いくつかの場合では、ｄＸＲ融合タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む（それに融合されている）。いくつかの場合では、ｄＸＲ融合タンパク質は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上のＮＬＳに融合されている。いくつかの場合では、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のＮＬＳ）は、ｄＸＲ融合タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に又はその近く（例えば、その５０アミノ酸以内）に位置付けられている。いくつかの場合では、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のＮＬＳ）は、ｄＸＲ融合タンパク質のＮ末端に又はその近く（例えば、その５０アミノ酸以内）に位置付けられている。いくつかの場合では、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のＮＬＳ）は、ｄＸＲ融合タンパク質のＣ末端に又はその近く（例えば、その５０アミノ酸以内）に位置付けられている。いくつかの場合では、１つ以上のＮＬＳ（３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のＮＬＳ）は、ｄＸＲ融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方に又はそれらの近く（例えば、その５０アミノ酸以内）に位置付けられている。いくつかの場合では、１つのＮＬＳが、Ｎ末端に位置付けられており、１つのＮＬＳが、ｄＸＲ融合タンパク質のＣ末端に位置付けられている。ＮＬＳを有するｄＸＲの代表的な構成を図７、３８、及び４５に示す。
いくつかの場合では、ｄＸＲとともに使用するのに適したＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３２８９）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ－抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３３２９０）を有するヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３３２９１）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号３３２９２）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号３３２９３）を有するｈＲＮＰＡｌ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３３２９４）、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３３２９５）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３３２９６）、ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号３３２９７）、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３３２９８）、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号３３２９９）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３３３００）、肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３３３０１）、マウスＭｘｌタンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３３３０２）、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３３３０３）、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３３３０４）、ボルナ病ウイルスＰタンパク質（ＢＤＶ－Ｐ１）の配列ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号３３３０５）、Ｃ型肝炎ウイルス非構造タンパク質（ＨＣＶ－ＮＳ５Ａ）の配列ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号３３３０６）、ＬＥＦ１の配列ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号３３３０７）、ＯＲＦ５７ ｓｉｍｉｒａｅの配列ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号３３３０８）、ＥＢＶ ＬＡＮＡの配列ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号３３３０９）、インフルエンザＡタンパク質の配列ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号３３３１０）、ヒトＲＮＡヘリカーゼＡ（ＲＨＡ）の配列ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号３３３１１）、核小体ＲＮＡヘリカーゼＩＩの配列ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号３３３１２）、ＴＵＳ－タンパク質の配列ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号３３３１３）、インポーチン－アルファに関連する配列ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３３３１４）、ＨＴＬＶ－１におけるＲｅｘタンパク質由来の配列ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３３３１５）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓのＥＧＬ－１３タンパク質由来の配列ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号３３３１６）、並びに配列ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３３３１７）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号３３３１８）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号３３３１９）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号３３３２０）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号３３３２１）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号３３３２２）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号３３３２３）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号３３３２４）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３３３２５）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３２６）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号３３３２７）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号３３３２８）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号３３３２９）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号３３３３０）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号３３３３１）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号３３３３２）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３３３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号３３３３４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３３３５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号３３３３６）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号３３３３７）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３３８）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３３９）に由来する配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％の同一性を有するか、又はそれらと同一である配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、リンカーペプチドでｄＸＲに又は隣接するＮＬＳに連結されており、リンカーペプチドは、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号３３２４０）、（ＧＳ）ｎ（配列番号３３２４１）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４３）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４４）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４５）、ＧＧＳＧ（配列番号３３２４６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３３２４７）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３３２４８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３３２４９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３３２５０）、ＧＳＳＳＧ（配列番号３３２５１）、（ＧＰ）ｎ（配列番号３３２５２）、ＧＰＧＰ（配列番号３３２５３）、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３２５４）、ＧＳＧＳＧＧＧ（配列番号５７６２８）、ＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣ（配列番号５７６２４）、ＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号５７６２５）、ＧＧＡＴＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡ（配列番号５７６２７）、ＧＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＡＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＧＣＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＧＴＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＧ（配列番号５７６２０）、ＳＳＧＮＳＮＡＮＳＲＧＰＳＦＳＳＧＬＶＰＬＳＬＲＧＳＨ（配列番号５７６２３）、ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥ（配列番号５７６２１）、ＴＣＴＡＧＣＧＧＣＡＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＴＡＡＣＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴ（配列番号５７６２２）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号３３２５５）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号３３２５６）、ＰＰＰＧ（配列番号３３２５７）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２５８）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号３３２５９）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６０）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６１）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３３２６２）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号３３２６３）からなる群から選択され、ｎは、１～５の整数である。
概して、ＮＬＳ（又は複数のＮＬＳ）は、真核細胞の核内の参照又はｄＣａｓＸバリアント融合タンパク質の蓄積を促進するのに十分な強度を有する。核内の蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施され得る。例えば、細胞内の位置が可視化され得るように、検出可能なマーカーが、参照又はｄＣａｓＸバリアント融合タンパク質に融合され得る。細胞核もまた、細胞から単離され得、次いで、その含有物は、免疫組織化学、ウェスタンブロット、又は酵素活性アッセイなどのタンパク質を検出するための任意の好適なプロセスによって分析され得る。核内の蓄積はまた、間接的に決定され得る。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ＮＬＳを含むｄＸＲは、表５及び６に記載される配列番号３７～１１２、並びに表７に記載される配列番号５９３５９～５９４３２のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの場合では、ｄＸＲ融合タンパク質は、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、又は小胞膜の横断を促進するタンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、又は有機若しくは無機化合物を指す、「タンパク質形質導入ドメイン」又はＰＴＤ（ＣＰＰ－細胞透過性ペプチドとしても知られる）を含む。小さな極性分子から大きな巨大分子及び／又はナノ粒子にまで及び得る、別の分子に付着したＰＴＤは、膜を横断する、例えば、細胞外空間から細胞内空間へ、又はサイトゾルからオルガネラ内へ進む分子を促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ｄＸＲ融合タンパク質のアミノ末端に共有結合している。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ｄＸＲ融合タンパク質のカルボキシル末端に共有結合している。ＰＴＤの例としては、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３３３４０）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号３３３４１）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号３３３４２）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号３３３４３）、ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号３３３４４）を含むＨＩＶ ＴＡＴのペプチド形質導入ドメイン、細胞への直接的な侵入に十分な数のアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０～５０個のアルギニン（配列番号３３３４５）を含むポリアルギニン配列、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９－９６）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）、短縮ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）、ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３－１３００８）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号３３３４６）、トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３３３４７）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号３３３４８）、及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３３３４９）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ｄＸＲの個々の成分は、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介して連結され得る。リンカーポリペプチドは、様々なアミノ酸配列のうちのいずれかを有し得る。タンパク質を、概して柔軟性質のスペーサーペプチドによって結合することができるが、他の化学結合は除外されない。好適なリンカーとしては、長さが４個のアミノ酸～４０個のアミノ酸、又は長さが４個のアミノ酸～２５個のアミノ酸のポリペプチドが挙げられる。これらのリンカーは、概して、合成のリンカーをコードするオリゴヌクレオチドを使用してタンパク質を結合することによって産生される。ある程度の柔軟性を有するペプチドリンカーを使用することができる。連結ペプチドは、好ましいリンカーが概して柔軟性のペプチドをもたらす配列を有することを念頭に置いて、事実上あらゆるアミノ酸配列を有し得る。グリシン、セリン、プロリン、及びアラニンなどの小さなアミノ酸の使用は、柔軟なペプチドの生成に有用である。そのような配列の生成は、当業者にとっては日常的である。様々な異なるリンカーが市販されており、使用に好適とみなされる。例示的なリンカーポリペプチドは、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号３３２４０）、（ＧＳ）ｎ（配列番号３３２４１）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４３）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４４）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４５）、ＧＧＳＧ（配列番号３３２４６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３３２４７）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３３２４８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３３２４９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３３２５０）、ＧＳＳＳＧ（配列番号３３２５１）、（ＧＰ）ｎ（配列番号３３２５２）、ＧＰＧＰ（配列番号３３２５３）、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３２５４）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号３３２５５）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号３３２５６）、ＰＰＰＧ（配列番号３３２５７）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２５８）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号３３２５９）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６０）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６１）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３３２６２）、ＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号３３２６３）、ＧＳＧＳＧＧＧ（配列番号５７６２８）、ＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣ（配列番号５７６２４）、ＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号５７６２５）、ＧＧＡＴＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡ（配列番号５７６２７）、ＧＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＡＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＧＣＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＧＴＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＧ（配列番号５７６２０）、ＳＳＧＮＳＮＡＮＳＲＧＰＳＦＳＳＧＬＶＰＬＳＬＲＧＳＨ（配列番号５７６２３）、ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥ（配列番号５７６２１）、及びＴＣＴＡＧＣＧＧＣＡＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＴＡＡＣＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴ（配列番号５７６２２）からなる群から選択される１つ以上のリンカーを含み、ｎは、１～５の整数である。当業者は、リンカーが柔軟性リンカー並びに低柔軟性構造を付与する１つ以上の部分を含むことができるように、上記の任意の要素にコンジュゲートされたペプチドの設計が、全て又は部分的に柔軟性であるリンカーを含み得ることを認識するであろう。
ＶＩ．ｇＲＮＡ及びｄＣＲＩＳＰＲタンパク質－リプレッサードメイン遺伝子抑制対
別の態様では、遺伝子抑制対を含む組成物が本明細書に提供され、遺伝子抑制対は、１つ以上の連結されたリプレッサードメイン及びガイドＲＮＡを有する触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子リプレッサー対は、１つ以上の連結されたリプレッサードメインを有する触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子リプレッサー対は、触媒活性を伴わないクラス２、ＩＩ型、Ｖ型、又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子抑制対は、触媒活性を伴わないＣａｓ９などのクラス２、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含む。他の場合では、遺伝子抑制対は、触媒活性を伴わないＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃａｓ１２ｌ、Ｃａｓ１４、及び／又はＣａｓΦタンパク質などのクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。
ある特定の実施形態では、遺伝子抑制対が、１つ以上のリプレッサードメイン（例えば、配列番号８８９～２１００、２３３２～３３２３９、３３６２５～５７５４３、及び５９４５０の配列のうちのいずれか１つ）に連結された、本明細書に記載されるｄＣａｓＸバリアントタンパク質（例えば、表４に記載される配列のうちのいずれか１つ）を含む一方で、ガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるｇＲＮＡバリアント（例えば、配列番号２２３８～２３３１、５７５４４～５７５８９、及び５９３５２、若しくは表２に記載される配列）、又はそれらに対して少なくとも６０％、若しくは少なくとも７０％、少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列バリアントであり、ｇＲＮＡは、標的核酸に対して相補的な標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子抑制対は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８のうちのいずれか１つから選択されるｄＣａｓＸ、配列番号８８９～２１００、２３３２～３３２３９、３３６２５～５７５４３、及び５９４５０の配列のうちのいずれか１つから選択されるｄＣａｓＸに連結された１つ以上のリプレッサードメイン、並びに配列番号２２３８、２２３９、及び２２９２のうちのいずれか１つから選択されるｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子抑制対は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８のうちのいずれか１つから選択されるｄＣａｓＸ、配列番号３５５～８８８、３３６２５～５７５４３、及び５９４５０の配列のうちのいずれか１つから選択されるｄＣａｓＸに連結された１つ以上のリプレッサードメイン、並びに配列番号２２３８、２２３９、及び２２９２のうちのいずれか１つから選択されるｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、標的核酸に対して相補的な標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子抑制対は、配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８のうちのいずれか１つから選択されるｄＣａｓＸ、配列番号３５５～８８８、３３６２５～５７５４３、及び５９４５０の配列のうちのいずれか１つから選択されるｄＣａｓＸに連結された１つ以上のリプレッサードメイン、並びに配列番号２２３８～２３３１、５７５４４～５７５８９、及び５９３５２のうちのいずれか１つから選択されるｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、標的核酸に対して相補的な標的化配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子抑制対は、配列番号１８のｄＣａｓＸ、配列番号５７７４６～５７７５５のＫＲＡＢドメイン配列、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０のＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン、配列番号５９６２５のＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメイン、及び配列番号５９４５２のＡＤＤドメインを含むｄＸＲ（ｄＸＲは、図４５の構成１、４、又は５の構成を有する）、並びに配列番号２２９２又は５９３５２のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡは、標的核酸に対して相補的な標的化配列を含む）を含む。
他の実施形態では、遺伝子抑制対は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８のうちのいずれか１つから選択されるｄＣａｓＸタンパク質、及びｄＣａｓＸに連結された１つ以上のリプレッサードメイン、標的化配列を有する第１のｇＲＮＡ（本明細書に記載されるｇＲＮＡバリアント（例えば、配列番号２２３８～２３３１、５７５４４～５７５８９、及び５９３５２、又は表２に記載される配列）、並びに第２のｇＲＮＡバリアント及びｄＸＲを含み、第２のｇＲＮＡバリアントは、第１のｇＲＮＡの標的化配列と比較して、標的核酸の異なる部分又は重複部分に対して相補的な標的化配列を有する。
いくつかの実施形態では、遺伝子抑制対が、本明細書に記載されるｄＣａｓＸバリアントタンパク質及び連結されたリプレッサードメイン並びにｇＲＮＡバリアントの両方を含む場合、遺伝子抑制対の１つ以上の特徴は、ｄＣａｓＸタンパク質又はｇＲＮＡのみを変化させることによって達成され得る特徴を超えて改善される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアントは、相加的に作用して、遺伝子抑制対の１つ以上の特徴を改善する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアントは、相乗的に作用して、遺伝子抑制対の１つ以上の特徴を改善する。前述の実施形態では、改善は、参照ｄＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡ対の特徴と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約１０，０００倍、又は少なくとも約１００，０００倍である。
ＶＩＩ．ベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質、及び連結されたリプレッサードメイン、及びｇＲＮＡバリアントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが、本明細書に提供される。いくつかの場合では、ベクターは、遺伝子抑制対又はＲＮＰの触媒活性を伴わないＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｄＸＲ）及びｇＲＮＡ成分の発現及び回復に利用される。他の場合では、ベクターは、以下により十分に記載されるように、標的核酸の抑制のための標的細胞へのコードポリヌクレオチドの送達に利用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡバリアントをコードするポリヌクレオチドが、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。他の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。他の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターが、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを含むベクターは、細菌プラスミド、ウイルスベクターなどを含む。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ及びｇＲＮＡバリアントは、同じベクター上でコードされる。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ及びｇＲＮＡバリアントは、異なるベクター上でコードされる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系の成分をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。例えば、いくつかの実施形態では、ａ）ｄＸＲ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ｂ）本明細書に記載されるｇＲＮＡバリアントをコードするヌクレオチド配列と、を含む、組換え発現ベクターが、本明細書に提供される。いくつかの場合では、ｄＸＲ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はｇＲＮＡバリアントをコードするヌクレオチド配列は、最適な細胞型（例えば、原核細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、齧歯類細胞、ヒト細胞）中で作動可能であるプロモーターに作動可能に連結されている。ベクターに含むのに適したプロモーターを本明細書で以下に記載する。
いくつかの実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。このタイプの最適化は、同じタンパク質をコードしながら、意図された宿主生物又は細胞のコドン選好を模倣するためのｄＣａｓＸコードヌクレオチド配列の変異を伴うことができる。したがって、コドンを変化させることができるが、コードされたタンパク質は、不変のままである。例えば、意図された標的細胞がヒト細胞であった場合、ヒトコドン最適化ｄＣａｓＸバリアントコードヌクレオチド配列を使用することができる。別の非限定的な例として、意図された宿主細胞がマウス細胞であった場合、マウスコドン最適化ｄＣａｓＸバリアントコードヌクレオチド配列を生成することができる。別の非限定的な例として、意図された宿主細胞が細菌細胞であった場合、細菌コドン最適化ｄＸＲ融合タンパク質コードヌクレオチド配列を生成することができる。
いくつかの実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＬＮＰへの組み込みのために設計されたｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本開示のｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、化学修飾されており、化学修飾は、配列の１つ以上のウリジンヌクレオチドのＮ１－メチル－シュードウリジンに対する置換である。いくつかの実施形態では、本開示のｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、本開示のｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号５９５８４、５９５８５、５９６１０、５９６１１、５９６２２、及び５９６２３からなる群から選択される１つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、５９４４４～５９４４９、５９４５５～５９４５６、５９４８８～５９４９７、５９５６８～５９５８３、５９５９５～５９６０９、及び５９６１２～５９６２１からなる群から選択される配列によってコードされる１つ以上の配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ｉ）本明細書に記載されるｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、真核細胞などの標的細胞中で作動可能であるプロモーターに作動可能に連結されている）、及び（ｉｉ）ｄＸＲ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、真核細胞などの標的細胞中で作動可能であるプロモーターに作動可能に連結されている）などの１つ以上の組換え発現ベクターが、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びｄＸＲ融合タンパク質をコードする配列は、異なる組換え発現ベクター中にあり、他の実施形態では、ｇＲＮＡ及びｄＸＲ融合タンパク質は、同じ組換え発現ベクター中にある。いくつかの実施形態では、組換え発現ベクター中のｇＲＮＡ、組換え発現ベクターによってコードされるｄＸＲ融合タンパク質のいずれか、又はその両方は、本明細書に記載される参照ｄＣａｓＸタンパク質又はｇＲＮＡのバリアントである。ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の場合、組換え発現ベクターは、例えば、ｇＲＮＡを産生するためにＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用してインビトロで転写され得、次いで、従来の方法、例えば、ゲル電気泳動を介した精製によって回収され得る。合成されると、ｇＲＮＡは、遺伝子抑制対で利用されて、標的核酸に直接接触し得るか、又は核酸を細胞に導入するための周知の技術（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスフェクションなど）のうちのいずれかによって細胞に導入され得る。
利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの好適な転写及び翻訳制御要素のうちのいずれかが、発現ベクターで使用され得る。
いくつかの実施形態では、ｄＸＲ及び／又はｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素に作動可能に連結されている。いくつかの場合では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。いくつかの場合では、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。いくつかの場合では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの場合では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの場合では、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。いくつかの場合では、転写制御要素（例えば、プロモーター）は、標的化細胞型又は標的化細胞集団中で機能的である。例えば、いくつかの場合では、転写制御要素は、真核細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４（＋）細胞、骨髄（ＢＭ）ＣＤ３４（＋）細胞など）中で機能的であり得る。転写活性化によって、転写は、約１０倍、約１００倍、より通常は約１０００倍、標的細胞中の基礎レベルを上回って増加することが意図される。
Ｐｏｌ ＩＩプロモーターの非限定的な例としては、ＥＦ－１アルファ、ＥＦ－１アルファコアプロモーター、Ｊｅｎｓ Ｔｏｒｎｏｅ（ＪｅＴ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、ＣＭＶ最初期（ＣＭＶＩＥ）、ＣＭＶエンハンサー、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ＳＶ４０エンハンサー、レトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、マウスメタロチオネイン－Ｉ、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ＣＭＶプロモーター完全長プロモーター、最小ＣＭＶプロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢＡ）、ＣＢＡハイブリッド（ＣＢｈ）、サイトメガロウイルスエンハンサー（ＣＢ７）を有するニワトリβ－アクチンプロモーター、ニワトリベータ－アクチンプロモーター及びウサギベータ－グロビンスプライス受容体部位融合（ＣＡＧ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＨＩＶ－Ｌｔｒプロモーター、ｈＰＧＫプロモーター、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、７ＳＫプロモーター、Ｍｉｎｉ－ＴＫプロモーター、ニューロン特異的発現を付与するヒトシナプシンＩ（ＳＹＮ）プロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、スーパーコアプロモーター１（ＳＣＰ１）、ニューロンにおける選択的発現のためのＭｅｃｐ２プロモーター、最小ＩＬ－２プロモーター、ラウス肉腫ウイルスエンハンサー／プロモーター（単一）、脾臓巣形成ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＴＢＧプロモーター、ヒトチロキシン結合グロブリン遺伝子（肝臓特異的）からのプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ＵＣＯＥプロモーター（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３のプロモーター）、合成ＣＡＧプロモーター、ヒストンＨ２プロモーター、ヒストンＨ３プロモーター、Ｕ１ａ１小核ＲＮＡプロモーター（２２６ｎｔ）、Ｕ１ａ１小核ＲＮＡプロモーター（２２６ｎｔ）、Ｕ１ｂ２小核ＲＮＡプロモーター（２４６ｎｔ）２６、ＧＵＳＢプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ロドプシン（Ｒｈｏ）プロモーター、サイレンシングを受けやすい脾臓巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）、ＰＯＬ１プロモーター、ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、ｂ－キネシンプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ヒト真核細胞開始因子４Ａ（ＥＩＦ４Ａ１）プロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、並びに前述の短縮バージョン及び配列バリアントが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、ＥＦ－１アルファであり、プロモーターは、トランスフェクション効率、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの導入遺伝子転写又は発現、発現陽性クローンの割合、及び長期培養におけるエピソームベクターのコピー数を強化する。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、Ｕ６、ミニＵ６、Ｕ６短縮プロモーター、ＢｉＨ１（双方向Ｈ１プロモーター）、ＢｉＵ６、Ｂｉ７ＳＫ、ＢｉＨ１（双方向Ｕ６、７ＳＫ、及びＨ１プロモーター）、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ＳＫ、ヒトＨ１プロモーター、並びにそれらの短縮バージョン及び配列バリアントが挙げられるが、これらに限定されない。前述の実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ｇＲＮＡの転写を強化する。
適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当該分野の通常の技術レベルの範囲内である。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含有し得る。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。発現ベクターはまた、ｄＸＲ融合タンパク質に融合され得るタンパク質タグ（例えば、６ｘＨｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含み、したがって、キメラＣａｓＸバリアントポリペプチドをもたらし得る。
本開示の組換え発現ベクターはまた、本開示のｄＸＲ及び／又はバリアントｇＲＮＡの堅牢な発現を促進する要素を含むことができる。例えば、組換え発現ベクターは、ポリアデニル化シグナル（ポリ（Ａ）、イントロン配列、又はウッドチャック肝炎転写後調節要素（ＷＰＲＥ）などの転写後調節要素のうちの１つ以上を含み得る。例示的なポリ（Ａ）配列としては、ｈＧＨポリ（Ａ）シグナル（短い）、ＨＳＶ ＴＫポリ（Ａ）シグナル、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル、β－グロビンポリ（Ａ）シグナルなどが挙げられる。加えて、ｇＲＮＡ及び／又はｄＸＲタンパク質をコードする核酸を細胞に提供するために使用されるベクターは、ｇＲＮＡ及び／又はｄＸＲタンパク質を取り込んだ細胞を特定するように、標的細胞中の選択可能なマーカーをコードする核酸配列を含み得る。当業者は、本明細書に記載される組換え発現ベクターに含むために好適な要素を選択することができるであろう。
組換え発現ベクター配列は、細胞、エクスビボ、インビトロ、又はインビボのその後の感染及び形質転換のために、ウイルス又はウイルス様粒子（本明細書では「粒子」又は「ビリオン」とも称される）にパッケージングされ得る。そのような粒子又はビリオンは、典型的には、ベクターゲノムをキャプシドで包むか、又はパッケージングするタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレトロウイルスベクターである。
ａ．ｄＸＲ：ｒＲＮＡの送達のための組換えＡＡＶ
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、対象に投与するために調製される、細胞についてインビボ又はエクスビボのいずれかでの、真核細胞などの細胞への送達のためのウイルスベクターを用いる状況において、ヒト疾患の治療に有用である小さい（２０ｎｍ）非病原性ウイルスである。構築物、例えば、本明細書に記載される融合タンパク質及びｇＲＮＡ実施形態をコードする構築物が生成され、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接し、それによって、以下に記載されるＡＡＶキャップコード領域配列を用いて、ＡＡＶベクターのＡＡＶウイルス粒子へのパッケージングを可能にする。
「ＡＡＶ」ベクターは、自然に存在する野生型ウイルス自体又はその誘導体を指し得る。この用語は、別段の要求がない限り、全てのサブタイプ、血清型、及びシュードタイプ、並びに自然に存在する型及び組換え型の両方を網羅する。本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、定義された抗血清とのキャプシドタンパク質反応性に基づいて、他のＡＡＶによって特定され、かつそれらと区別されるＡＡＶを指し、例えば、霊長類ＡＡＶの多くの既知の血清型がある。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ－Ｒｈ７４（アカゲザル由来ＡＡＶ）、及びＡＡＶＲｈ１０、並びにこれらの血清型の修飾キャプシドから選択される。例えば、血清型ＡＡＶ－２は、ＡＡＶ－２のｃａｐ遺伝子からコードされたキャプシドタンパク質、並びに同じＡＡＶ－２血清型由来の５’及び３’ＩＴＲ配列を含有するゲノムを含有するＡＡＶを指すために使用される。シュードタイプＡＡＶは、１つの血清型由来のキャプシドタンパク質、及び第２の血清型の５’－３’ＩＴＲを含むウイルスゲノムを含有するＡＡＶを指す。シュードタイプｒＡＡＶは、キャプシド血清型の細胞表面結合特性及びＩＴＲ血清型と一致する遺伝子特性を有すると予想される。シュードタイプ組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、当該技術分野で記載される標準的な技術を使用して産生される。本明細書で使用される場合、例えば、ｒＡＡＶ１は、同じ血清型由来のキャプシドタンパク質及び５’－３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを指すために使用され得るか、又はそれは、血清型１由来のキャプシドタンパク質、及び異なるＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２由来の及び５’－３’ＩＴＲを有するＡＡＶを指し得る。本明細書に例示される各実施例について、ベクター設計及び産生の記載は、キャプシド及び５’－３’ＩＴＲ配列の血清型を説明する。
「ＡＡＶウイルス」又は「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質の全てによる）、及びキャプシドで包まれたポリヌクレオチドで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、「導入遺伝子」と呼ばれる、哺乳動物細胞に送達される野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を更に含む場合、それは典型的には、「ｒＡＡＶ」と称される。例示的な異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される実施形態のいずれかのｄＸＲタンパク質及び／又はｓｇＲＮＡを含むポリヌクレオチドである。天然で複製欠陥性であり、人体におけるほぼ全ての細胞型を形質導入することができるため、ＡＡＶは、遺伝子療法又はワクチン送達における治療用途に適したベクターを表す。典型的には、組換えＡＡＶベクターを産生するとき、２つのＩＴＲ間の配列は、１つ以上の目的の配列（例えば、導入遺伝子）と置き換えられ、Ｒｅｐ配列及びＣａｐ配列は、トランスで提供され、ＩＴＲをベクターに残留する唯一のウイルスＤＮＡにする。結果として生じる組換えＡＡＶベクターゲノム構築物は、目的の導入遺伝子配列をコードする発現カセットに隣接する２つのシス作用性１３０～１４５ヌクレオチドＩＴＲを含み、ベクターの総サイズが、ＡＡＶキャプシド内のパッケージと適合性がある、５～５．２ｋｂ（構築物のサイズがこの閾値を超えると、ベクターのパッケージング効率が減少することが理解される）を下回るように、導入遺伝子、１つ以上のプロモーター、及び随伴要素を含むことができる、外来ＤＮＡのパッケージングのために少なくとも４．７ｋｂ以上を提供する。導入遺伝子は、本開示の文脈において、対象の細胞中の欠損遺伝子の転写を抑制するために使用され得る。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子抑制との関連で、発現カセットのサイズ制限は、ヌクレアーゼの大きなサイズを考えると、ほとんどのＣＲＩＳＰＲ系（例えば、Ｃａｓ９）にとって課題である。しかしながら、ｄＣａｓＸ及びｇＲＮＡの小さなサイズが、細胞中で遺伝子抑制が可能なｄＸＲ：ｇＲＮＡを送達することができる、「一体型」構築物の生成を可能にすることが発見されている。
「アデノ随伴ウイルス逆位末端反復」又は「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＤＮＡ複製の起源として、及びウイルスのパッケージングシグナルとして、シスで一緒に機能する、ＡＡＶゲノムの各末端に見られる当該技術分野で認識されている領域を意味する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と一緒に、２つの隣接するＩＴＲの間に介在するヌクレオチド配列の、効率的な除去及びレスキュー、並びに哺乳動物細胞ゲノムへの組み込みを提供する。ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は、既知である。例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１、Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照されたい。本明細書で使用される場合、ＡＡＶ ＩＴＲは、示される野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換によって改変され得る。更に、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、及びＡＡＶＲｈ１０、並びにこれらの血清型の修飾キャプシドを含むがこれらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。更に、ＡＡＶベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、それらが意図されるとおりに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノム若しくはベクターからの目的の配列の除去及びレスキューを可能にするように、かつＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在する場合、異種配列のレシピエント細胞ゲノムへの組み込みを可能にするように機能する限り、必ずしも同一である必要も、同じＡＡＶ血清型若しくは分離株に由来する必要もない。異種配列の宿主細胞への組み込みのためのＡＡＶ血清型の使用は、当該技術分野で既知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／１９５５５５Ａ１及びＵＳ２０１８／０２５８４２４Ａ１を参照されたい）。１つの特定の実施形態では、ＩＴＲは、血清型ＡＡＶ１に由来する。本開示のＡＡＶの別の特定の実施形態では、ＩＴＲは、血清型ＡＡＶ２、配列ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３３３５０）を有する５’ＩＴＲ、及び配列ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧ（配列番号３３３５１）を有する３’ＩＴＲに由来する。
「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起源の認識、結合、及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するために集合的に必要とされる。
「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」とは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、又はそれらの機能的相同体をコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするために集合的に必要とされるパッケージング機能を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示のｄＸＲ及びｇＲＮＡのコード配列を含む導入遺伝子の宿主細胞への送達に利用されるＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４（アカゲザル由来ＡＡＶ）、及びＡＡＶＲｈ１０を含むがこれらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のうちのいずれかに由来し得、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型１又は血清型２に由来する。
ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶ発現ベクターは、トランスフェクションによってなど、既知の技術を使用して好適な宿主細胞に導入される。パッケージング細胞は、典型的にはウイルス粒子を形成するために使用され、そのような細胞は、アデノウイルスをパッケージングするＨＥＫ２９３細胞（及び当該技術分野で既知の他の細胞）を含む。いくつかのトランスフェクション技術が、当該技術分野で一般に既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。特に好適なトランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞内への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介遺伝子導入、脂質媒介形質導入、及び高速マイクロプロジェクタイルを使用する核酸送達が含まれる。
いくつかの実施形態では、上記のＡＡＶ発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接するヌクレオチド配列を複製し、かつキャプシドで包んで、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶヘルパー機能を提供することを可能な状態にされる。ＡＡＶヘルパー機能は、概して、ＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得るＡＡＶ由来コード配列であり、順に、ＡＡＶ遺伝子産物は、生産性のあるＡＡＶ複製のためにトランスで機能する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターから欠落している必要なＡＡＶ機能を補完するために本明細書で使用される。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、ｒｅｐ及びｃａｐコード領域、又はその機能的相同体をコードする、主要なＡＡＶ ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の一方又は両方を含む。補助機能が、当業者に既知の方法を使用して、宿主細胞に導入され、次いで、宿主細胞において発現され得る。一般的に、補助機能は、無関係なヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染によって提供される。いくつかの実施形態では、補助機能は、補助機能ベクターを使用して提供される。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの好適な転写及び翻訳制御要素のうちのいずれかが、発現ベクターで使用され得る。
本開示は、ｄＸＲ及びｇＲＮＡをコードする導入遺伝子を含むＡＡＶを提供し、ｄＸＲは、導入遺伝子のサイズ制限を考えると、単一リプレッサーとしてｄＣａｓＸ及びＫＲＡＢドメインを含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列の群から選択されるｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含む系のｄＸＲ融合タンパク質をコードし、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５９３４２、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列の群から選択されるｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含む系のｄＸＲ融合タンパク質をコードし、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７８４０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列の群から選択されるｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含む系のｄＸＲ融合タンパク質をコードし、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。特定の実施形態では、導入遺伝子は、表４に記載される配列番号１８のｄＣａｓＸに作動可能に連結された単一のＫＲＡＢドメインを含む系のｄＸＲ融合タンパク質をコードし、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される。前述の実施形態の導入遺伝子は、配列番号２２９２若しくは５９３５２の配列、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場を有するｇＲＮＡを更にコードし、ｇＲＮＡは、抑制のために標的化された遺伝子の標的核酸配列に対して相補的な標的化配列を含む。前述の実施形態では、ｄＸＲ及びｇＲＮＡは各々、プロモーターに作動可能に連結されており、その実施形態は、本明細書に記載されている。
ｂ．ｄＸＲ：ｇＲＮＡの送達のためのＶＬＰ及びＸＤＰ
他の実施形態では、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、本開示の遺伝子リプレッサー系のコード核酸の送達のためのベクターとしての使用に好適であり得る。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは、「欠陥性」であり、例えば、増殖感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができず、利用される成分に応じて、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）又は送達粒子（ＸＤＰ）と称され得る。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株中の成長を必要とする。目的の核酸を含むウイルス粒子を生成するために、核酸を含むレトロウイルス核酸は、パッケージング細胞株によってＶＬＰ又はＸＤＰキャプシドにパッケージングされる。異なるパッケージング細胞株は、キャプシドに組み込まれる異なるエンベロープタンパク質（同種指向性、両指向性、又は異種指向性）を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞に対するウイルス粒子の特異性を決定する（マウス及びラットについては同種指向性、ヒト、イヌ、及びマウスを含むほとんどの哺乳動物細胞型については両指向性、並びにマウス細胞を除くほとんどの哺乳動物細胞型については異種指向性）。適切なパッケージング細胞株を使用して、細胞がパッケージングされたウイルス粒子によって標的化されることを確実にし得る。対象ベクターである発現ベクターをパッケージング細胞株に導入し、パッケージング株によって生成されるウイルス粒子を収集する方法は、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｄＸＲ融合タンパク質を含む遺伝子リプレッサー系をコードするか、又はそれを含むベクターを提供し、ｄＸＲ融合タンパク質は、第１の転写リプレッサードメインを含み、ｄＸＲは、第１のリプレッサードメインとして本明細書に記載される実施形態のいずれかのＫＲＡＢドメインに連結された、本明細書に記載される実施形態のいずれかの触媒活性を伴わないＣａｓＸを含む。
他の実施形態では、本開示は、融合タンパク質を含む遺伝子リプレッサー系をコードするか、又はそれを含むベクターを提供し、融合タンパク質は、第１、第２、及び第３の転写リプレッサードメインに連結された、本明細書に記載される実施形態のいずれかの触媒活性を伴わないＣａｓＸを含み、第１の転写リプレッサードメインは、本明細書に記載される実施形態のいずれかのＫＲＡＢドメインであり、第２のドメインは、本明細書に記載される実施形態のいずれかのＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３の転写リプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、融合タンパク質は、１つ以上のＮＬＳペプチド及びリンカーペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＮＬＳ－リンカー４－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー１－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ、ＮＬＳ－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ－リンカー１－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ、ＮＬＳ－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー１－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ、ＮＬＳ－ＫＲＡＢ－リンカー３－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー１－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＮＬＳ、又はＮＬＳ－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー３－ＫＲＡＢ－リンカー１－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＮＬＳで構成されている。
他の実施形態では、本開示は、融合タンパク質を含む遺伝子リプレッサー系をコードするか、又はそれを含むベクターを提供し、融合タンパク質は、第１、第２、第３、及び第４の転写リプレッサードメインに連結された、本明細書に記載される実施形態のいずれかの触媒活性を伴わないＣａｓＸを含み、第１の転写リプレッサードメインは、本明細書に記載される実施形態のいずれかのＫＲＡＢドメインであり、第２のドメインは、本明細書に記載される実施形態のいずれかのＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３の転写リプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、第４の転写リプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインにＮ末端で連結されたＡＴＲＸ－ＤＮＭＴ３－ＤＮＭＴ３Ｌ（ＡＤＤ）ドメインであり、融合タンパク質は、１つ以上のＮＬＳペプチド及びリンカーペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＮＬＳ－リンカー４－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー１－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ、ＮＬＳ－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ－リンカー１－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ、ＮＬＳ－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー１－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ、ＮＬＳ－ＫＲＡＢ－リンカー３－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー１－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＮＬＳ、又はＮＬＳ－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー３－ＫＲＡＢ－リンカー１－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＮＬＳで構成されている。
いくつかの実施形態では、本開示は、標的細胞へのＸＤＰの侵入を促進するために、レトロウイルスｇａｇポリタンパク質、ｇａｇ－ｐｏｌｙポリタンパク質、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ ＲＮＰ、ＲＮＡ輸送成分、及び標的細胞の細胞表面マーカーに対する結合親和性を有する１つ以上の指向性因子のうちの全て又は一部分から選択される成分を含むＸＤＰを提供する。
いくつかの実施形態では、ＸＤＰ系のレトロウイルス成分は、Ｏｒｔｈｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅウイルス又はＳｐｕｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅウイルスに由来し、Ｏｒｔｈｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅウイルスは、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガマレトロウイルス、及びレンチウイルスからなる群から選択され、Ｓｐｕｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅウイルスは、ボビスプマウイルス、エクイスプマウイルス、フェリスプマウイルス、プロシミスプマウイルス、シミイスプマウイルス、及びスプマウイルスからなる群から選択される。
ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系とともに使用するためのＸＤＰは、利用される成分に基づいて異なる構成で構築され得る。いくつかの実施形態では、ＸＤＰは、Ｇａｇポリタンパク質、Ｇａｇ－トランスフレーム領域－ｐｏｌプロテアーゼポリタンパク質（Ｇａｇ－ＴＦＲ－ＰＲ）、マトリクスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＣ）、キャプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１ペプチド、ｐ６ペプチド、ｐ２Ａペプチド、ｐ２Ｂペプチド、ｐ１０ペプチド、ｐ１２ペプチド、ｐ２１／２４ペプチド、ｐ１２／ｐ３／ｐ８ペプチド、ｐ２０ペプチド、プロテアーゼ切断部位、及びプロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼから選択される１つ以上のレトロウイルス成分を含み、これらは、パッケージング細胞中のＸＤＰの産生のために１つ以上の核酸上にコードされ得る。ｄＸＲ及びｇＲＮＡのキャプシドで包まれたペイロード（ＲＮＰとして複合体化）、ＸＤＰへのＲＮＰの組み込みを増加させるために使用されるＲＮＡ輸送成分（以下に記載）、及び指向性因子などの残りの成分は、レトロウイルス成分をコードする核酸に組み込まれ得るか、又は別個の核酸上にコードされ得る。いくつかの実施形態では、ＸＤＰ系の成分は、単一核酸上、２つの核酸上、３つの核酸上、４つの核酸上、又は５つの核酸上にコードされ、次いで、トランスフェクションで使用されるプラスミドに組み込まれて、パッケージング細胞中でＸＤＰを生成する。パッケージング細胞中でＸＤＰを作製するために使用されるプラスミドの代表的な非限定的な構成を図４及び５に示す。図４の構成の特定の実施形態では、プラスミド１のＧａｇポリタンパク質及びプラスミド２のＧａｇ－ＴＦＲ－ＰＲポリタンパク質は、レンチウイルス（ＨＩＶ－１プロテアーゼを有する）に由来し、プラスミド１のコードされたＭＳ２は、配列番号３３２７６の配列を含み、プラスミド３のコードされたｄＸＲ融合タンパク質は、本明細書に記載されるｄＸＲ実施形態のいずれかを含み、ＶＳＶ－Ｇプラスミドは、配列番号１１３のＶＳＶ－Ｇ配列をコードし、ｇＲＮＡプラスミドは、配列番号２２９２又は５９３５２の足場をコードする。いくつかの実施形態では、ＸＤＰ系の成分は、１つ以上の核酸が真核宿主細胞に導入され、発現されるとき、ｄＸＲ：ｇＲＮＡの組み込まれたＲＮＰを有するＸＤＰに自己集合することができる。前述の実施形態では、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ ＲＮＰは、ＸＤＰの自己集合時に、ＸＤＰ内にキャプシドで包まれる。特定の実施形態では、指向性因子は、ＸＤＰの自己集合時に、ＸＤＰ表面上に組み込まれる。ＸＤＰ組成物及びＸＤＰを作製する方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／１１３７７２Ａ１及びＰＣＴ／ＵＳ２２／３２５７９に記載されている。
本明細書に記載される実施形態のいずれかのＧａｇ、ｄＸＲ、及びｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞の核からの成分の輸送を補助し、複合体化されたＣａｓＸ：ｇＲＮＡの出芽ＸＤＰへの動員を促進するように設計された対の成分を更に含み得る。そのような非共有結合の輸送成分の非限定的な例としては、Ｇａｇポリタンパク質に融合されているＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、Ｑβコートタンパク質、タンパク質Ｎ、タンパク質Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ファージＧＡコートタンパク質、及びＵ１Ａシグナル認識粒子に対してそれぞれ結合親和性を有する、ヘアピンＲＮＡ又はループ、例えば、ＭＳ２ヘアピン、ＰＰ７ヘアピン、Ｑβヘアピン、ボックスＢ、トランス活性化応答要素（ＴＡＲ）、Ｒｅｖ応答要素、ファージＧＡヘアピン、及びＵ１ヘアピンＩＩが挙げられる。ガイドＲＮＡに挿入された結合パートナー及びパッケージングリクルーターを、Ｇａｇポリペプチドを含む核酸に組み込むことが、部分的にはＲＮＰをもたらすｇＲＮＡに対するＣａｓＸの親和性により、ＸＤＰ粒子のパッケージングを促進し、その結果、ｇＲＮＡ及びＣａｓＸの両方が、ＸＤＰのキャプシドで包むプロセス中にＧａｇに関連付けられ、結合パートナー及びパッケージングリクルーターを欠く構築物と比較して、ＲＮＰを含むＸＤＰの割合を増加させることが発見されている。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｇａｇポリタンパク質に連結され得る、Ｒｅｖに対する結合親和性を有するＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）又はその一部分を含み得る。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上のＲＲＥ配列及び１つ以上のＭＳ２ヘアピン配列を含み得る。ＲＲＥは、Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）のステムＩＩＢ、ＲＲＥのステムＩＩ－Ｖ、ＲＲＥのステムＩＩ、ステムＩＩＢのＲｅｖ結合要素（ＲＢＥ）、及び完全長ＲＲＥからなる群から選択され得る。前述の実施形態では、成分は、ＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡ（ステムＩＩＢ、配列番号５７７３６）、ＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣ（ステムＩＩ、配列番号５７７３７）、ＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡＵＵＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＵＣＣＵＧ（ステムＩＩ－Ｖ、配列番号５７７３８）、ＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣ（ＲＢＥ、配列番号５７７３９）、及びＡＧＧＡＧＣＵＵＵＧＵＵＣＣＵＵＧＧＧＵＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡＵＵＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＵＣＣＵＧＧＣＵＧＵＧＧＡＡＡＧＡＵＡＣＣＵＡＡＡＧＧＡＵＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＵ（完全長ＲＲＥ、配列番号５７７４０）の配列を含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上のＲＲＥ配列及び１つ以上のＭＳ２ヘアピン配列を含み得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＭＳ２コートタンパク質に対する結合親和性を高めるように最適化され、それによって、ｇＲＮＡ及び関連するＣａｓＸの出芽ＸＤＰへの組み込みを強化する、ＭＳ２ヘアピンバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、ＸＤＰ表面上に組み込まれる指向性因子は、標的細胞マーカーに対する糖タンパク質、抗体断片、受容体、及びリガンドからなる群から選択される。前述の一実施形態では、指向性因子は、表８に記載される配列、又はそれらに対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される配列を有する糖タンパク質である。特定の実施形態では、糖タンパク質は、ＶＳＶ－Ｇである。
いくつかの実施形態では、ＸＤＰ系で利用される核酸にコードされるプロテアーゼは、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１プロテアーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ）、ｂウイルスＮＩａプロテアーゼ、ＢウイルスＲＮＡ－２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、パースニップ黄斑ウイルスプロテアーゼ、３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、カテプシン、トロンビン、第Ｘａ因子、メタロプロテイナーゼ、及びエンテロキナーゼからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、前述の実施形態のいずれか１つのＸＤＰ系をコードするプラスミドでトランスフェクトされた真核細胞を提供し、細胞は、コードされたｄＸＲ：ｇＲＮＡ及びＸＤＰ成分の発現、並びにｄＸＲ及びｇＲＮＡのＲＮＰをキャプシドで包むＸＤＰ粒子の組み立てを促進することができるパッケージング細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ａ５４９細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＶＥＲＯ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、及びＨＴ１０８０細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、パッケージング宿主細胞は、そうでなければＸＤＰに組み込まれるであろう細胞表面マーカー又は受容体を低減又は除去するように修飾され、それによって、ＸＤＰの投与を受けている対象による細胞表面マーカー又は受容体に対する免疫応答を低減することができる。そのようなマーカーは、ＭＨＣ受容体によって結合され得るか、又はそうでなければ対象において免疫応答を誘発するであろう受容体又はタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、パッケージング宿主細胞は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＰＤ１、及びＨＬＡ－Ｅ ＫＩからなる群から選択される細胞表面マーカーの発現を低減又は除去するように修飾されており、マーカーの組み込みは、ＸＤＰの表面上で低減される。いくつかの実施形態では、パッケージング宿主細胞は、（「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）」シグナルとして機能する）ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２４、ＣＤ５８、ＳＬＡＭＦ４、及びＳＬＡＭＦ３からなる群から選択される１つ以上の細胞表面マーカーを発現するように修飾され、細胞表面マーカーは、ＸＤＰの表面上に組み込まれ、当該組み込みは、マクロファージ及び単球などの宿主監視細胞によるＸＤＰの貪食及び食作用を不能にする。
非ウイルス送達については、ベクターも送達され得、ｄＸＲ及びｇＲＮＡをコードする及び／又は含むベクターは、ナノ粒子中で製剤化され、企図されるナノ粒子としては、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが挙げられるが、これらに限定されない。以下により十分に記載されるように、脂質ナノ粒子は、一般的に、イオン化可能なカチオン性脂質、並びにコレステロール、ＤＯＰＥ、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有脂質などの３つ以上の追加の成分で構成されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される実施形態のｄＸＲバリアントをコードするｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中で製剤化される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、本明細書に開示される実施形態のｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ｄＸＲをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系の成分は、細胞への送達のために、又は投与を必要とする対象への投与のために、別個のナノ粒子中で製剤化される。
ｃ．脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される系の実施形態のいずれかのｇＲＮＡ及び融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの送達のための、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、標的遺伝子の転写を抑制する本開示の遺伝子リプレッサー系（すなわち、融合タンパク質（例えば、ｄＸＲ）をコードするｍＲＮＡ及び標的核酸に対する標的化配列を有するｇＲＮＡ）をキャプシドで包むＬＮＰを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、組織又は臓器特異的であり、優れた生体適合性を有し、ｄＸＲをコードするｍＲＮＡ及び標的化配列を有するｇＲＮＡを含む系を、高効率で標的核酸に送達することができ、したがって、疾患又は障害を有する対象の細胞中の遺伝子の標的核酸の抑制又はサイレンシングに有効に使用され得る。
核酸ポリマーは、それらの天然形態では、生体液中で不安定であり、細胞質に送達される標的細胞の膜を貫通することができず、したがって、細胞に侵入することができる送達系を必要とする。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、核酸の保護並びに組織及び細胞への送達の両方に有用であることが証明されている。更に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするためのＬＮＰにおけるｍＲＮＡの使用は、ＤＮＡベクターと比較して望ましくないゲノムの組み込みの可能性を排除する。更に、ｍＲＮＡは、細胞質区画にその機能を及ぼすため、核への侵入を必要としないため、有糸分裂細胞及び非有糸分裂細胞の両方を効率的にトランスフェクトする。送達プラットフォームとしてのＬＮＰは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及びｇＲＮＡの両方を単一のＬＮＰ粒子に共製剤化することができるという追加の利点を提供する。
したがって、様々な実施形態では、本開示は、インビトロ及びインビボの両方で、細胞への封入されたｄＸＲ：ｇＲＮＡ系の送達を含む、様々な目的のために使用され得るＬＮＰ及び組成物を包含する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰで使用するためのｇＲＮＡは、配列番号５９３５２である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰで使用するためのｇＲＮＡは、その配列に対する１つ以上の化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰへの組み込みのためのｍＲＮＡは、本明細書に記載されるｄＸＲの実施形態のいずれかをコードする。いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰへの組み込みのためのｍＲＮＡは、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、本開示のｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、化学修飾されており、化学修飾は、配列の１つ以上のウリジンヌクレオチドのＮ１－メチル－シュードウリジンに対する置換である。いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰへの組み込みのためのｍＲＮＡは、配列番号５９５８４～５９５８５、５９６１０、５９６１１、５９６２２、及び５９６２３からなる群から選択される１つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰへの組み込みのためのｍＲＮＡは、５９４４４～５９４４９、５９４５５～５９４５６、５９４８８～５９４９７、５９５６８～５９５８３、５９５９５～５９６０９、及び５９６１２～５９６２１からなる群から選択される配列によってコードされる１つ以上の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ、及び第１のリプレッサードメインに連結されたｄＣａｓＸの融合タンパク質をコードするｍＲＮＡをキャプシドで包むＬＮＰを包含し、リプレッサードメインは、本明細書に記載される実施形態のいずれかのＫＲＡＢドメインである。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ、並びに第１及び第２のリプレッサードメインに連結されたｄＣａｓＸの融合タンパク質をコードするｍＲＮＡをキャプシドで包むＬＮＰを包含し、第１のリプレッサードメインは、ＫＲＡＢドメインであり、第２のリプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインである。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ、並びに第１、第２、及び第３のリプレッサードメインに連結されたｄＣａｓＸの融合タンパク質をコードするｍＲＮＡをキャプシドで包むＬＮＰを包含し、第１のリプレッサードメインは、ＫＲＡＢドメインであり、第２のリプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のドメインは、ＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインである。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ、並びに第１、第２、第３、及び第４のリプレッサードメインに連結されたｄＣａｓＸの融合タンパク質をコードするｍＲＮＡをキャプシドで包むＬＮＰを包含し、第１のリプレッサードメインは、ＫＲＡＢドメインであり、第２のリプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインであり、第３のドメインは、ＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインであり、第４のドメインは、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインである。前述の実施形態では、融合タンパク質の成分は、図７及び図４５に示されるように、代替の構成で配列され得る。ある特定の実施形態では、本開示は、疾患又は障害の治療又は予防を必要とする対象において、対象を、本明細書に記載される実施形態のｄＸＲ：ｇＲＮＡ系を封入するＬＮＰと接触させることによって、治療又は予防する方法を包含し、ｄＸＲは、コードｍＲＮＡであり、ｇＲＮＡは、対象の細胞中の標的核酸に対して相補的な標的化配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ及びｄＸＲをコードするｍＲＮＡが単一のＬＮＰ粒子に組み込まれるＬＮＰを提供する。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、重量で測定された場合、約２５：１～約１：２５の本明細書に記載される実施形態のｇＲＮＡ対ｄＸＲ ｍＲＮＡの比を含む。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約１０：１～約１：１０のｄＸＲ ｍＲＮＡなどの、ｇＲＮＡ対ｄＸＲ ｍＲＮＡの比を含む。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約８：１～約１：８のｇＲＮＡ対ｄＸＲ ｍＲＮＡの比を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約５：１～約１：５のｇＲＮＡ対ｄＸＲ ｍＲＮＡの比を含む。いくつかの実施形態では、比の範囲は、約３：１～１：３、約２：１～１：２、約５：１～１：２、約５：１～１：１、約３：１～１：２、約３：１～１：１、約３：１、約２：１～１：１である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの比は、約３：１又は約２：１である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ対ｄＸＲ ｍＲＮＡの比は、約１：１である。比は、約２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、又は１：２５であり得る。
他の実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ及びｄＸＲをコードするｍＲＮＡが別個のＬＮＰ粒子に組み込まれ、これが、投与のために様々な比で一緒に製剤化され得る、ＬＮＰを提供する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質をコードする本開示の最適化されたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡがＬＮＰに封入され得るように、脂質溶液と混合される溶液中に提供され得る。好適なｍＲＮＡ溶液は、様々な濃度で封入されるｍＲＮＡを含有する任意の水溶液であり得る。例えば、好適なｍＲＮＡ溶液は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．７５ｍｇ／ｍｌ、又は２．０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のｍＲＮＡを含有し得る。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、約０．０１～２．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１～１．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１～１．２５ｍｇ／ｍｌ、０．０１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．２～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．３～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．４～０．７ｍｇ／ｍｌ、又は０．５～０．６ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のｍＲＮＡを含有し得る。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、最大約５．０ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌ、０．０３ｍｇ／ｍｌ、０．０２ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌ、又は０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度のｍＲＮＡを含有し得る。
いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡは、ｇＲＮＡがＬＮＰに封入され得るように、脂質溶液と混合される溶液中に提供され得る。好適なｇＲＮＡ溶液は、様々な濃度で封入されるｇＲＮＡを含有する任意の水溶液であり得る。例えば、好適なｇＲＮＡ溶液は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．７５ｍｇ／ｍｌ、又は２．０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のｇＲＮＡを含有し得る。いくつかの実施形態では、好適なｇＲＮＡ溶液は、約０．０１～２．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１～１．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１～１．２５ｍｇ／ｍｌ、０．０１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．２～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．３～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．４～０．７ｍｇ／ｍｌ、又は０．５～０．６ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のｇＲＮＡを含有し得る。いくつかの実施形態では、好適なｇＲＮＡ溶液は、最大約５．０ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌ、０．０３ｍｇ／ｍｌ、０．０２ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌ、又は０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度のｇＲＮＡを含有し得る。
永久カチオン性脂質を利用したＬＮＰの初期製剤は、インビボで毒性が証明された正の表面電荷を有するＬＮＰをもたらし、更に食細胞によって急速に除去された。三級又は四級アミンを有するイオン化可能なカチオン性脂質、特に７未満のｐＫａを有するものに変化させることによって、結果として生じるＬＮＰは、ｍＲＮＡ又はｇＲＮＡのリン酸骨格の負電荷と静電的に相互作用することによって、低ｐＨで核酸ポリマーの効率的な封入を達成し、これはまた、生理学的ｐＨ値で主に中性系をもたらし、したがって、永久的に荷電したカチオン性脂質に関連する問題を軽減する。本明細書では、「イオン化可能な脂質」とは、容易にプロトン化され得るアミン含有脂質を意味し、例えば、それは、周囲のｐＨに応じてその電荷状態が変化する脂質であり得る。イオン化可能な脂質は、カチオン性脂質のｐＫａを下回るｐＨでプロトン化（正に荷電）されてもよく、それは、ｐＫａを超えるｐＨで実質的に中性であり得る。一例では、ＬＮＰは、中和を示すプロトン化されたイオン化可能な脂質及び／又はイオン化可能な脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５～８、５．５～７．５、６～７、又は６．５～７のｐＫａを有する。ＬＮＰのｐＫａは、ＬＮＰの核酸ペイロードのインビボ安定性及び放出に重要である。いくつかの実施形態では、前述のｐＫａ範囲を有するＬＮＰは、インビボで標的臓器（例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、並びに腫瘍）及び／又は標的細胞（肝細胞、ＬＳＥＣ、心臓細胞、がん細胞など）に安全に送達され得、エンドサイトーシス後、エンドソーム膜のアニオン性タンパク質との静電相互作用を介して封入されたペイロードを放出するための正電荷を示す。
イオン化可能な脂質は、一般的に脂質と類似した特徴を有するイオン化可能な化合物であり、核酸（例えば、本開示のｍＲＮＡ又はｇＲＮＡ）との静電相互作用を通して、ＬＮＰ内に核酸を高効率で封入する役割を果たし得る。
イオン化可能な脂質に含まれるアミンのタイプによると、（ｉ）核酸封入効率、（ｉｉ）ＰＤＩ（多分散指数）、並びに又は（ｉｉｉ）臓器（例えば、肝臓中の肝細胞又は肝類洞内皮細胞）を構成する組織及び／若しくは細胞へのＬＮＰの核酸送達効率は、異なり得る。ある特定の実施形態では、イオン化可能なカチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約４６ｍｏｌ％～約６６ｍｏｌ％を構成する。
アミンを含むイオン化可能な脂質を含むＬＮＰは、１つ以上の種類の以下の特徴を有し得る：（１）高効率で薬物若しくは生物製剤を封入すること、（２）調製された粒子の均一なサイズ（若しくは低いＰＤＩ値を有すること）、及び／又は（３）肝臓、肺、心臓、脾臓などの臓器、並びに腫瘍、及び／又はそのような臓器を構成する細胞（例えば、肝細胞、ＬＳＥＣ、心臓細胞、がん細胞など）への優れた核酸送達効率。
脂質ナノ粒子の脂質組成物は、通常、イオン化可能なアミノ脂質、ヘルパー脂質（通常、リン脂質）、コレステロール、及びポリエチレングリコール－脂質コンジュゲート（ＰＥＧ脂質）からなって、血漿タンパク質の特異的吸収を低減し、ナノ粒子上に水和層を形成することによって、生物学的環境におけるコロイド安定性を改善し、５０：１０：３７～３９：１．５～２．５の典型的なモル比で製剤化され、個々の特性を調節するために変動が加えられる。ＰＥＧ－脂質が表面脂質を形成するため、ＬＮＰのサイズは、表面（ＰＥＧ）脂質対コア（イオン化可能なカチオン性）脂質の比率を変化させることによって、容易に変化し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、サイズ、安定性、及び循環時間などの粒子特性を改変するために、約１～５ｍｏｌ％変化し得る。具体的には、カチオン性脂質形態は、静電相互作用を通した核酸封入、及びエンドソーム膜を破壊することによる細胞内放出の両方において重要な役割を果たす。ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ（標的化配列を有する）は、それらが正に荷電したカチオン性（又はイオン化可能な）脂質とともに形成するイオン相互作用によってＬＮＰ内に封入される。本開示のＬＮＰで利用されるイオン化可能なカチオン性脂質成分の非限定的な例は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン）、並びにＴＮＴ（１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン）及びＴＴ（Ｎ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（２－アミノエチル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキサミド）から選択される。本開示のＬＮＰで利用されるヘルパー脂質の非限定的な例は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＰＯＰＣ（２－オレオイル－１－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、及びＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）から選択される。コレステロール及びＰＥＧ－ＤＭＧ（（Ｒ）－２，３－ビス（オクタデシルオキシ）プロピル－１－（メトキシポリエチレングリコール２０００）カルバメート）又はＰＥＧ－ＤＳＧ（１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレングリコール２０００）は、ＬＮＰの安定性、循環、及びサイズのために利用される成分である。
他の実施形態では、本開示の核酸－脂質粒子中のイオン化可能なカチオン性脂質は、例えば、１つ以上のイオン化可能なカチオン性脂質を含み得、イオン化可能なカチオン性脂質は、ジアルキル脂質である。別の実施形態では、イオン化可能なカチオン性脂質は、トリアルキル脂質である。１つの特定の実施形態では、イオン化可能なカチオン性脂質は、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジ－．ガンマ．－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ガンマ．－ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル－３－ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ）、又はそれらの塩及びそれらの混合物からなる群から選択される。特定の実施形態では、イオン化可能なカチオン性脂質は、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－．ガンマ．－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（．ガンマ．－ＤＬｅｎＤＭＡ、それらの塩、又はそれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比（カチオン性／イオン化可能な脂質からの窒素及び核酸からのリン酸）は、約３：１～７：１、若しくは約４：１～６：１、又は３：１、又は４：１、又は５：１、又は６：１、又は７：１の範囲内である。
一例に従ったＬＮＰの要素のリン脂質は、ＬＮＰ中のイオン化可能な脂質及び核酸の相互作用によって形成されるコアを覆い、かつ保護する役割を果たし、標的細胞のリン脂質二重層に結合することによって、核酸の細胞内送達中の細胞膜透過及びエンドソーム脱出を促進し得る。
リン脂質については、一例に従ってＬＮＰの融合を促進することができるリン脂質が、限定されることなく使用され得、例えば、それは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－Ｌ－セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－Ｌ－セリン］などからなる群から選択される１つ以上の種類であり得る。一例では、ＤＯＰＥを含むＬＮＰは、ｍＲＮＡ送達において有効であり得る（優れた送達有効性）。
一例に従ったＬＮＰの要素のコレステロールは、ＬＮＰ中の脂質充填に形態学的剛性を提供し、ナノ粒子の安定性を改善するためにナノ粒子のコア及び表面に分散され得る。
本明細書では、「脂質－ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）コンジュゲート」、「脂質－ＰＥＧ」、「ＰＥＧ－脂質」、「ＰＥＧ－脂質」、又は「脂質－ＰＥＧ」は、脂質及びＰＥＧがコンジュゲートされている形態を指し、親水性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーが一端に結合されている脂質を意味する。脂質－ＰＥＧコンジュゲートは、ＬＮＰ内のナノ粒子の血清中の粒子安定性に寄与し、ナノ粒子間の凝集を防止する役割を果たす。更に、脂質－ＰＥＧコンジュゲートは、核酸のインビボ送達中に核酸を分解酵素から保護し、インビボでの核酸の安定性を強化し、ナノ粒子に封入された薬物又は生物製剤の半減期を増加させ得る。ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの例としては、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）コンジュゲート、ＰＥＧ－リン脂質コンジュゲート、ＰＥＧ－セラミド（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）コンジュゲート、及びそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートである。ある特定の実施形態では、脂質粒子中のＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）コンジュゲート、又はそれらの混合物を含み得る。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジミリストイルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲートである。他の実施形態では、脂質－ＰＥＧコンジュゲートは、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、セラミドにコンジュゲートされたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＣＥＲ、セラミド－ＰＥＧコンジュゲート、セラミド－ＰＥＧ、コレステロール、又はその誘導体にコンジュゲートされたＰＥＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、及びそれらの混合物などの、リン脂質に結合されたＰＥＧであり得、例えば、Ｃ１６－ＰＥＧ２０００セラミド（Ｎ－パルミトイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝）、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、１４：０ ＰＥＧ２０００ ＰＥであり得る。
ある特定の実施形態では、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％を構成する。
一例では、脂質－ＰＥＧコンジュゲートの平均分子量は、１００ダルトン～１０，０００ダルトン、２００ダルトン～８，０００ダルトン、５００ダルトン～５，０００ダルトン、１，０００ダルトン～３，０００ダルトン、１，０００ダルトン～２，６００ダルトン、１，５００ダルトン～２，６００ダルトン、１，５００ダルトン～２，５００ダルトン、２，０００ダルトン～２，６００ダルトン、２，０００ダルトン～２，５００ダルトン、又は２，０００ダルトンであり得る。
脂質－ＰＥＧコンジュゲート中の脂質については、ポリエチレングリコールに結合することができる任意の脂質が、限定されることなく使用され得、ＬＮＰの他の要素であるリン脂質及び／又はコレステロールも使用され得る。具体的には、脂質－ＰＥＧコンジュゲート中の脂質は、セラミド、ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）、スクシノイル－ジアシルグリセロール（ｓ－ＤＡＧ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、又はコレステロールであり得るが、これらに限定されない。
脂質－ＰＥＧコンジュゲートでは、ＰＥＧは、脂質に直接コンジュゲートされ得るか、又はリンカー部分を介して脂質に連結され得る。ＰＥＧを脂質に結合するために好適な任意のリンカー部分が使用され得、例えば、エステルを含まないリンカー部分及びエステル含有リンカー部分を含む。エステルを含まないリンカー部分は、アミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、アミノ（－ＮＲ－）、カルボニル（－Ｃ（Ｏ）－）、カルバメート（－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－）、尿素（－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－）、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）、エーテル（－Ｏ－）、スクシニル（－（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－）、スクシンアミジル（－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、エーテル、ジスルフィドだけでなく、それらの組み合わせ（例えば、カルバメートリンカー部分及びアミドリンカー部分の両方を含有するリンカー）も含むが、これらに限定されない。エステル含有リンカー部分は、例えば、炭酸塩（－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－）、スクシノイル、リン酸エステル（－Ｏ－（Ｏ）ＰＯＨ－Ｏ－）、スルホン酸エステル、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、約５：１～約１５：１の総脂質：ｇＲＮＡ質量比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰに含まれるイオン化可能な脂質及び核酸の重量比は、１～２０：１、１～１５：１、１～１０：１、５～２０：１、５～１５：１、５～１０：１、７．５～２０：１、７．５～１５：１、又は７．５～１０：１であり得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、２０～５０重量部のイオン化可能な脂質、１０～３０重量部のリン脂質、２０～６０重量部（又は２０～６０重量部）のコレステロール、及び０．１～１０重量部（又は０．２５～１０重量部、０．５～５重量部）の脂質－ＰＥＧコンジュゲートを含み得る。ＬＮＰは、総ナノ粒子重量に基づいて、２０～５０重量％のイオン化可能な脂質、１０～３０重量％のリン脂質、２０～６０重量％（又は３０～６０重量％）のコレステロール、及び０．１～１０重量％（又は０．２５～１０重量％、０．５～５重量％）の脂質－ＰＥＧコンジュゲートを含み得る。他の例では、ＬＮＰは、総ナノ粒子重量に基づいて、２５～５０重量％のイオン化可能な脂質、１０～２０重量％のリン脂質、３５～５５重量％のコレステロール、及び０．１～１０重量％（又は０．２５～１０重量％、０．５～５重量％）の脂質－ＰＥＧコンジュゲートを含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰを製剤化するためのアプローチ（実施例で十分に記載される）は、エタノールなどの有機溶媒中に脂質を溶解することであり、これは次いで、酸性緩衝液（通常、ｐＨ４）中に溶解された核酸とマイクロミキサーを通して混合される。このｐＨで、イオン化可能なカチオン性脂質は、正に荷電され、負に荷電した核酸ポリマーと相互作用する。次いで、核酸を含有する結果として生じるナノ構造は、エタノール除去工程中に中性緩衝液に対して透析されたときに中性ＬＮＰに変換される。これによって形成されるＬＮＰは、イオン化可能なカチオン性脂質が、従来の二重層リポソーム構造とは対照的に、封入されたｍＲＮＡ分子の周囲の逆ミセルに組織化される、別個の電子密度の高いナノ構造コアを有する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、２０ｎｍ～２００ｎｍ、２０ｎｍ～１８０ｎｍ、２０ｎｍ～１７０ｎｍ、２０ｎｍ～１５０ｎｍ、２０ｎｍ～１２０ｎｍ、２０ｎｍ～１００ｎｍ、２０ｎｍ～９０ｎｍ、３０ｎｍ～２００ｎｍ、３０～１８０ｎｍ、３０ｎｍ～１７０ｎｍ、３０ｎｍ～１５０ｎｍ、３０ｎｍ～１２０ｎｍ、３０ｎｍ～１００ｎｍ、３０ｎｍ～９０ｎｍ、４０ｎｍ～２００ｎｍ、４０～１８０ｎｍ、４０ｎｍ～１７０ｎｍ、４０ｎｍ～１５０ｎｍ、４０ｎｍ～１２０ｎｍ、４０ｎｍ～１００ｎｍ、４０ｎｍ～９０ｎｍ、４０ｎｍ～８０ｎｍ、４０ｎｍ～７０ｎｍ、５０ｎｍ～２００ｎｍ、５０～１８０ｎｍ、５０ｎｍ～１７０ｎｍ、５０ｎｍ～１５０ｎｍ、５０ｎｍ～１２０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍ、５０ｎｍ～９０ｎｍ、６０ｎｍ～２００ｎｍ、６０～１８０ｎｍ、６０ｎｍ～１７０ｎｍ、６０ｎｍ～１５０ｎｍ、６０ｎｍ～１２０ｎｍ、６０ｎｍ～１００ｎｍ、６０ｎｍ～９０ｎｍ、７０ｎｍ～２００ｎｍ、７０～１８０ｎｍ、７０ｎｍ～１７０ｎｍ、７０ｎｍ～１５０ｎｍ、７０ｎｍ～１２０ｎｍ、７０ｎｍ～１００ｎｍ、７０ｎｍ～９０ｎｍ、８０ｎｍ～２００ｎｍ、８０～１８０ｎｍ、８０ｎｍ～１７０ｎｍ、８０ｎｍ～１５０ｎｍ、８０ｎｍ～１２０ｎｍ、８０ｎｍ～１００ｎｍ、８０ｎｍ～９０ｎｍ、９０ｎｍ～２００ｎｍ、９０～１８０ｎｍ、９０ｎｍ～１７０ｎｍ、９０ｎｍ～１５０ｎｍ、９０ｎｍ～１２０ｎｍ、又は９０ｎｍ～１００ｎｍの平均直径を有し得る。ＬＮＰは、肝臓、肺、心臓、脾臓、並びに腫瘍を含むがこれらに限定されない、臓器又は組織への容易な導入のためにサイズ設定され得る。ＬＮＰのサイズが上記の範囲よりも小さい場合、ＬＮＰの表面積が過度に増加するにつれて、安定性を維持することが困難であり、したがって、標的組織への送達及び／又は治療効果が低減される可能性がある。ＬＮＰは、肝臓組織を特異的に標的とし得る。ＬＮＰは、天然リポタンパク質の代謝挙動を非常に類似して模倣し得、肝臓による脂質代謝プロセス及びこれを通した治療機構に有効に適用され得る。肝細胞又はＬＳＥＣ（肝類洞内皮細胞）への薬物又は生物製剤の送達中、類洞内腔から肝細胞及びＬＳＥＣにつながる窓の直径は、哺乳動物では約１４０ｎｍ、ヒトでは約１００ｎｍであるため、上記の範囲の直径を有するＬＮＰは、上記の範囲外の直径を有するＬＮＰと比較して、肝細胞及びＬＳＥＣに対して優れた送達効率を有し得る。
いくつかの実施形態によると、標的細胞への核酸送達のための組成物中に含まれるＬＮＰは、イオン化可能な脂質：リン脂質：コレステロール：脂質－ＰＥＧコンジュゲートを、上記の範囲で、又は２０～５０：１０～３０：３０～６０：０．５～５のモル比で、２５～４５：１０～２５：４０～５０：０．５～３のモル比で、２５～４５：１０～２０：４０～５５：０．５～３のモル比で、若しくは２５～４５：１０～２０：４０～５５：１．０～１．５のモル比で含み得る。上記の範囲のモル比の成分を含むＬＮＰは、標的臓器の細胞に特異的な優れた送達効率を有し得る。
いくつかの実施形態に従ったＬＮＰは、５～８、５．５～７．５、６～７、又は６．５～７のｐＫａを示すことによって、酸性ｐＨ条件下で正電荷を示し、負電荷を示す核酸などの治療剤との静電相互作用によって核酸とともに複合体を用意に形成することによって、高効率で核酸を封入し得、それは、薬物又は生物製剤（例えば、核酸又はタンパク質）の細胞内又はインビボ送達のための組成物として有効に使用され得る。本明細書では、「封入」は、送達物質を封入し、それをインビボで効率的に包囲及び包埋することを指し、封入効率（封入効率）は、調製に使用される薬物又は生物製剤の総含有量に対する、ＬＮＰに封入された薬物又は生物製剤の含有量を意味する。
ＬＮＰ中の組成物の核酸の封入効率は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９４％以上、又は９５％以上であり得る。他の実施形態では、ＬＮＰ中の組成物の核酸の封入効率は、８０％超～９９％以下、８０％超～９７％以下、８０％超～９５％以下、８５％以上～９５％以下、８７％以上～９５％以下、９０％以上～９５％以下、９１％以上～９５％以下、９１％以上～９４％以下、９１％以上～９５％以下、９２％以上～９９％以下、９２％以上～９７％以下、又は９２％以上～９５％以下である。本明細書で使用される場合、「封入効率」とは、ＬＮＰ内に組み込まれる核酸を含有するＬＮＰ粒子の割合を意味する。いくつかの実施形態では、本開示のｄＸＲをコードするｍＲＮＡ及び標的核酸に対する標的化配列を有するｇＲＮＡは、核酸－脂質粒子に完全に封入されている。
ＬＮＰによって核酸が送達される標的臓器としては、肝臓、肺、心臓、脾臓、並びに腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態に従ったＬＮＰは、肝臓組織特異的であり、優れた生体適合性を有し、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系組成物の核酸を高効率で送達することができ、したがって、それは、脂質ナノ粒子媒介遺伝子療法などの関連技術分野で有効に使用され得る。特定の実施形態では、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ系の核酸が一例に従ったＬＮＰによって送達される標的細胞は、インビボでの肝細胞及び／又はＬＳＥＣであり得る。他の実施形態では、本開示は、実施形態の核酸をエクスビボで細胞に送達するために製剤化されたＬＮＰを提供する。
したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、１つ以上の標的核酸の発現を標的とするｇＲＮＡ分子、本開示のｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ及び１つ以上の標的核酸の発現を標的とするｇＲＮＡのうちの１つ以上を含む核酸－脂質粒子、ｇＲＮＡのうちの１つ以上（例えば、カクテル）を含む核酸－脂質粒子、並びに核酸－脂質粒子を送達及び／又は投与する方法を包含する。ｇＲＮＡ分子は、ｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と同時又は逐次的に送達され、それによって、成分を送達して、疾患の治療を必要とするヒト、例えば、障害の治療又は予防を必要とするヒトにおいてそのような治療をするために系を利用し得る。ある特定の実施形態では、ｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡは、同じ核酸－脂質粒子中に存在し得るか、又は異なる核酸－脂質粒子中に存在し得る。
本開示はまた、異なる配列を標的とするｇＲＮＡのうちの１つ以上（例えば、カクテル）と、本明細書に記載されるｄＸＲのうちの１つ以上と、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物を提供する。ｄＸＲ：ｇＲＮＡカクテルを含む製剤に関して、カクテル中に存在する異なるタイプのｇＲＮＡ種（例えば、異なる標的化配列を有するｇＲＮＡ）は、同じ粒子に共封入され得るか、又はカクテル中に存在する各タイプのｇＲＮＡ種は、別個の粒子に封入され得る。ＬＮＰカクテルは、同一の、類似の、又は異なる濃度又はモル比で、２つ、３つ、又はそれ以上の個々のｇＲＮＡ（各々が固有の標的化配列を有する）の混合物を使用して、本明細書に記載される粒子中に製剤化され得る。
一実施形態では、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ及び標的核酸に対して異なる標的化配列を有する２つ以上のｇＲＮＡのカクテルは、各ｇＲＮＡ種の同一の、類似の、又は異なる濃度又はモル比を使用して製剤化され、異なるタイプのｇＲＮＡは、同じ粒子に共封入される。別の実施形態では、カクテル中に存在する各タイプのｇＲＮＡ種は、同一の、類似の、又は異なるｇＲＮＡ濃度又はモル比で異なる粒子に封入され、このように形成された粒子（各々が異なるｇＲＮＡペイロードを含有する）は、別々に（例えば、治療レジメンに従って異なる時点で）投与されるか、又は組み合わされ、単一の単位用量として一緒に（例えば、薬学的に許容可能な担体とともに）投与される。本明細書に記載される粒子は、血清安定性であり、ヌクレアーゼ分解に対して耐性があり、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。
ある特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、電子密度の高いコアを有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書に記載されるｄＸＲをコードするｍＲＮＡ及び標的核酸に対する標的化配列を有するｇＲＮＡのうちの１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％を構成する１つ以上のイオン化可能なカチオン性脂質又はその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％を構成する１つ以上の非カチオン性脂質と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を含む粒子の凝集を阻害する１つ以上のコンジュゲートされた脂質と、を含む核酸－脂質粒子を提供する。
一実施形態では、核酸－脂質粒子は、（ａ）本明細書に記載されるｄＸＲをコードするｍＲＮＡ及び標的核酸に対する標的化配列を有するｇＲＮＡの１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５２ｍｏｌ％～約６２ｍｏｌ％を構成するイオン化可能なカチオン性脂質又はその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３６ｍｏｌ％～約４７ｍｏｌ％を構成するリン脂質及びコレステロール又はその誘導体の混合物と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、を含む。１つの特定の実施形態では、製剤は、約１．４ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ）と、約５７．１ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）又はその塩と、約７．１ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（又はＤＳＰＣ）と、約３４．３ｍｏｌ％のコレステロール（又はその誘導体）と、を含む四成分系である。
別の実施形態では、核酸－脂質粒子は、（ａ）本明細書に記載されるｄＸＲをコードするｍＲＮＡ及び標的核酸に対する標的化配列を有するｇＲＮＡの１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約４６．５ｍｏｌ％～約６６．５ｍｏｌ％を構成するイオン化可能なカチオン性脂質又はその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３１．５ｍｏｌ％～約４２．５ｍｏｌ％を構成するコレステロール又はその誘導体と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、を含む。１つの特定の実施形態では、製剤は、リン脂質を含まず、かつ約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ）と、約６１．５ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）又はその塩と、約３６．９ｍｏｌ％のコレステロール（又はその誘導体）と、を含む三成分系である。
追加の製剤は、ＰＣＴ公開ＷＯ０９／１２７０６０、並びに公開された米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／００７１２０８Ａ１号及び同第ＵＳ２０１１／００７６３３５Ａ１号に記載されており、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
他の実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する１つ以上のイオン化可能な脂質又はその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％を構成する１つ以上の非カチオン性脂質と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を含む粒子の凝集を阻害する１つ以上のコンジュゲートされた脂質と、を含む核酸－脂質粒子を提供する。
この実施形態の一態様では、核酸－脂質粒子は、（ａ）本明細書に記載されるｄＸＲをコードするｍＲＮＡ及び標的核酸に対する標的化配列を有するｇＲＮＡの１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成するイオン化可能なカチオン性脂質又はその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約４７ｍｏｌ％～約６９ｍｏｌ％を構成するリン脂質及びコレステロール又はその誘導体の混合物と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、を含む。１つの特定の実施形態では、製剤は、約２ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ）と、約４０ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）又はその塩と、約１０ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（又はＤＳＰＣ）と、約４８ｍｏｌ％のコレステロール（又はその誘導体）と、を含む四成分系である。
更なる実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書に記載されるｄＸＲをコードするｍＲＮＡ及び標的核酸に対する標的化配列を有するｇＲＮＡの１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％を構成する１つ以上のイオン化可能なカチオン性脂質又はその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％を構成する１つ以上の非カチオン性脂質と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％を含む粒子の凝集を阻害する１つ以上のコンジュゲートされた脂質と、を含む核酸－脂質粒子を提供する。
別の実施形態では、核酸－脂質粒子は、（ａ）本明細書に記載されるｄＸＲをコードするｍＲＮＡ及び標的核酸に対する標的化配列を有するｇＲＮＡの１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成するイオン化可能なカチオン性脂質又はその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％を構成するリン脂質及びコレステロール又はその誘導体の混合物と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、を含む。
ある特定の実施形態では、製剤中の非カチオン性脂質混合物は、（ｉ）粒子中に存在する総脂質の約５モル％～約１０モル％のリン脂質と、（ｉｉ）粒子中に存在する総脂質の約２５モル％～約３５モル％のコレステロール又はその誘導体と、を含む。１つの特定の実施形態では、製剤は、約７ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ７５０－Ｃ－ＤＭＡ）と、約５４ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）又はその塩と、約７ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（又はＤＳＰＣ）と、約３２ｍｏｌ％のコレステロール（又はその誘導体）と、を含む四成分系である。
別の実施形態では、核酸－脂質粒子は、（ａ）本明細書に記載されるｄＸＲをコードするｍＲＮＡ及び標的核酸に対する標的化配列を有するｇＲＮＡの１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５５ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％を構成するイオン化可能なカチオン性脂質又はその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を構成するコレステロール又はその誘導体と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、を含む。１つの特定の実施形態では、製剤は、リン脂質を含まず、かつ約７ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ７５０－Ｃ－ＤＭＡ）と、約５８ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）又はその塩と、約３５ｍｏｌ％のコレステロール（又はその誘導体）と、を含む三成分系である。
本開示のある特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、（ａ）本明細書に記載されるｄＸＲをコードするｍＲＮＡ及び標的核酸に対する標的化配列を有するｇＲＮＡの１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約４８ｍｏｌ％～約６２ｍｏｌ％を構成するイオン化可能なカチオン性脂質又はその塩と、（ｃ）リン脂質及びコレステロール又はその誘導体の混合物（リン脂質は、粒子中に存在する総脂質の約７ｍｏｌ％～約１７ｍｏｌ％を構成し、コレステロール又はその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を構成する）と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約３．０ｍｏｌ％を構成するＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、を含む。
ＶＩＩＩ．用途
本明細書に提供される融合タンパク質、ｇＲＮＡ、融合タンパク質をコードする核酸、及びそれらのバリアント、並びにそのような成分をコードするベクター、遺伝子リプレッサー系の送達のための粒子系、又は核酸を含むＬＮＰは、治療法、診断、及び研究を含む様々な用途に有用である。
標的核酸を、ｄＸＲ及び標的核酸に対して相補的である標的化配列を有するｇＲＮＡと接触させることを含む、細胞中の標的核酸によってコードされる標的遺伝子の転写を抑制する方法が、本明細書に提供される。方法のいくつかの実施形態では、リプレッサー系は、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体として細胞に提供され、その実施形態は、上に記載されており、接触は、転写の抑制又はサイレンシングをもたらす。方法の他の実施形態では、リプレッサー系は、ｄＸＲ及びｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸又はベクターとして、又はｄＸＲをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ成分を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として細胞に提供され、接触は、ｄＸＲ及びｇＲＮＡの発現及び結果として生じるＲＮＰ複合体の標的核酸への結合時に、標的核酸の転写の抑制又はサイレンシングをもたらす。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｄＸＲ及びｇＲＮＡ成分をコードするＡＡＶである。方法の他の実施形態では、ベクターは、ウイルス様粒子であり、ＸＤＰは、複数のｄＸＲ：ｇＲＮＡ ＲＮＰを含み、標的核酸の接触は、標的核酸のＲＮＰの結合位置の近位にある遺伝子の転写の抑制又はサイレンシングをもたらす。
細胞中の標的核酸の発現を抑制する方法のいくつかの実施形態では、リプレッサー系は、上により十分に記載された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の集団にキャプシドで包まれた細胞に提供される。ＬＮＰは、脂質から作製された粒子を表し、系の核酸は、脂質内に完全にキャプシドで包まれる。ある特定の場合では、ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に延長された循環寿命を示し得るため、全身用途に非常に有用であり、それらは、対象内の遠位部位に蓄積することができ、実施形態のｄＸＲ：ｇＲＮＡ系をキャプシドで包むために使用される場合、これらの遠位部位における標的遺伝子発現の抑制又はサイレンシングを媒介することができる。好ましくは、これらのＬＮＰ組成物は、系の核酸を高効率で封入し、高い薬物：脂質比を有し、封入された核酸を血清中の分解及びクリアランスから保護し、全身送達に適しており、封入された核酸の細胞内送達を提供する。方法のいくつかの実施形態では、リプレッサー系は、第１及び第２の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として細胞に提供され、第１のＬＮＰは、本明細書に記載される実施形態のいずれかのｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡをキャプシドで包み、第２のＬＮＰは、本明細書に記載される実施形態のいずれかのｇＲＮＡをキャプシドで包み、細胞の接触及びＬＮＰの取り込みは、ｄＸＲ融合タンパク質の発現、並びにＲＮＰとしてのｄＸＲ及びｇＲＮＡの複合体化をもたらし、標的核酸への結果として生じるＲＮＰ複合体の結合時に、標的核酸の転写の抑制又はサイレンシングが生じる。他の実施形態では、リプレッサー系は、ＬＮＰの集団として細胞に提供され、ＬＮＰは、本明細書に記載される実施形態のいずれかのｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ及び本明細書に記載される実施形態のいずれかのｇＲＮＡの両方をキャプシドで包み、細胞の接触及びＬＮＰの取り込みは、ｄＸＲ融合タンパク質の発現及びＲＮＰ抑制の複合体化をもたらし、標的核酸への結果として生じるＲＮＰ複合体の結合時に、標的核酸の転写の抑制又はサイレンシングが生じる。
方法のいくつかの実施形態では、標的核酸へのｄＸＲ：ｇＲＮＡ ＲＮＰの結合時に、細胞集団中の遺伝子の転写は、インビトロアッセイで評価された場合、リプレッサードメインを含まず同等のガイドＲＮＡ及び触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアントを含むＲＮＰによってもたらされる抑制と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％大きく抑制される。他の実施形態では、細胞集団中の遺伝子の転写は、インビトロアッセイで評価された場合、リプレッサードメインを含まず同等のガイドＲＮＡ及び触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアントを含むＲＮＰによってもたらされる抑制と比較して、少なくとも約１０％～約９０％、又は少なくとも約２０％～約８０％、又は少なくとも約３０％～約６０％抑制される。方法のいくつかの実施形態では、細胞集団中の転写の抑制は、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、少なくとも約２か月、又は少なくとも約６か月以上維持される。抑制を測定するための例示的なアッセイは、以下の実施例を含む本明細書に記載されている。
いくつかの場合では、ｄＸＲ：ｇＲＮＡ ＲＮＰによるオフターゲットメチル化又はオフターゲット転写抑制は、ゲノムワイドな細胞中で約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。
細胞中の標的核酸を抑制する方法のいくつかの実施形態では、本開示のｄＸＲ：ｇＲＮＡ系で利用されるｇＲＮＡ足場は、表２に記載される配列番号２２３８～２３３１、５７５４４～５７５８９、及び５９３５２、又はそれらに対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる配列の群から選択され、ｇＲＮＡは、抑制される標的核酸に対して相補的である標的化配列を更に含む。方法のいくつかの実施形態では、本開示のｄＸＲ：ｇＲＮＡ系で利用されるｇＲＮＡ足場は、１つ以上の化学修飾を含む。方法のいくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントは、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列、又はそれらに対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列であり、第１のリプレッサードメイン、第１及び第２のリプレッサードメイン、第１、第２、及び第３のリプレッサードメイン、又は第１、第２、第３、及び第４のリプレッサードメインに連結されている。方法のいくつかの実施形態では、融合タンパク質としてｄＣａｓＸに連結された（又は融合タンパク質として発現されるようにコードされた）第１のドメインは、本明細書に記載される実施形態のいずれかのＫＲＡＢドメインである。方法のいくつかの実施形態では、融合タンパク質としてｄＣａｓＸに連結された第１のドメインは、ＫＲＡＢドメイン配列であり、第２のリプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン配列である。方法のいくつかの実施形態では、融合タンパク質としてｄＣａｓＸに連結された第１のドメインは、ＫＲＡＢドメイン配列であり、第２のリプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン配列であり、第３のリプレッサーは、ＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメイン配列である。方法のいくつかの実施形態では、融合タンパク質としてｄＣａｓＸに連結された第１のドメインは、ＫＲＡＢドメイン配列であり、第２のリプレッサードメインは、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン配列であり、第３のリプレッサーは、ＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメイン配列であり、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメイン内の第４のドメインである。前述のいくつかの実施形態では、ＫＲＡＢドメインは、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９、又はそれらに対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される。細胞中の標的核酸を抑制する方法のいくつかの実施形態では、ＫＲＡＢドメインは、ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又はｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上のモチーフを含み、ＫＲＡＢドメインは、配列番号５７７４６～５９３４２、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む。方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインは、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む。方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインは、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインは、配列番号５９４５２の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。
細胞中の標的核酸を抑制する方法のいくつかの実施形態では、方法は、第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＮＡをコードする核酸の包含を更に含み、第２のｇＮＡは、標的核酸配列の異なる部分に対して相補的な標的化配列を有し、ｄＸＲ融合タンパク質とともにリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる。
細胞中の標的核酸を抑制する方法のいくつかの実施形態では、抑制は、インビトロ、細胞外、無細胞系で生じる。いくつかの実施形態では、抑制は、インビトロで、細胞内、例えば、細胞培養系で生じる。いくつかの実施形態では、抑制は、細胞内のインビボで、例えば生物の細胞中で生じる。いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。真核細胞の例としては、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ブタ細胞、イヌ細胞、霊長類細胞、及び非ヒト霊長類細胞が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血幹細胞、ニューロン前駆細胞、ニューロン、星状細胞、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、網膜細胞、がん細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自家移植拡張心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、造血幹細胞、骨髄由来前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多分化能前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、又は出生後幹細胞である。細胞は、対象内にあり得る。いくつかの実施形態では、抑制は、遺伝子の対立遺伝子に変異を有する対象で生じ、変異は、対象において疾患又は障害を引き起こす。いくつかの実施形態では、抑制は、対象において疾患又は障害を引き起こす遺伝子の対立遺伝子の転写を低減又はサイレントし、対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、及びヒトからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抑制は、細胞を対象に導入する前に、細胞内のインビトロで生じる。いくつかの実施形態では、細胞は、対象に対して自己又は同種である。
インビトロで細胞に核酸（例えば、本明細書に記載されるｄＸＲ：ｇＲＮＡ系又はそのバリアントをコードする核酸）を導入する方法は、当該技術分野で既知であり、任意の便利な方法を使用して、細胞に核酸を導入することができる。好適な方法としては、ウイルス感染、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、ＬＮＰトランスフェクション、ドナーＤＮＡに融合されるか又はそれを動員する細胞透過性ｄＸＲタンパク質による直接付加、細胞圧搾、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などが挙げられる。核酸は、十分に開発されたトランスフェクション技術、及び市販されているＱｉａｇｅｎ製のＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ製のＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、及びＭｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ製のＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション、Ｍａｘａｇｅｎエレクトロポレーションなどを使用して細胞に提供され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ベクターが細胞によって取り込まれるように、標的宿主細胞に直接提供され得る。組換え発現ベクターを細胞に導入することは、任意の好適な培養培地中で、及び細胞の生存を促進する任意の好適な培養条件下で生じ得る。
本開示のｄＸＲタンパク質又はｄＸＲをコードするｍＲＮＡは、当該技術分野で既知の従来の方法を使用して、インビトロ合成によって調製され得る。様々な市販の合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎなどによる自動合成装置が利用可能である。合成装置を使用することによって、自然に存在するアミノ酸又はヌクレオチド（該当する場合）は、非天然のアミノ酸又はヌクレオチドで置換され得る。特定の配列及び調製方法は、利便性、経済状態、必要とされる純度などによって決定される。
ｄＸＲ融合タンパク質はまた、本明細書に記載される実施形態のいずれかのｄＸＲをコードするポリヌクレオチド配列を組換えで産生し、宿主細胞に適した発現ベクターにコード遺伝子を組み込むことによって調製され得る。本明細書に記載される実施形態のいずれかのコードされたｄＸＲの産生について、方法は、コードポリヌクレオチドを含む発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換することと、本明細書に記載される実施形態のいずれかの結果として生じるｄＸＲに、形質転換された宿主細胞中で発現若しくは転写させるか、又はそれを可能にする条件下で、宿主細胞を培養することと、を含み、それによってｄＸＲを産生し、これは、本明細書に記載される方法によって、又は当該技術分野で既知の標準的な精製方法によって、又は実施例に記載されるように回収される。分子生物学における標準的な組換え技術を使用して、本開示のポリヌクレオチド及び発現ベクターを作製する。
本開示のｄＸＲタンパク質はまた、組換え合成の従来の方法に従って単離及び精製され得る。溶解物は、発現宿主から調製され得、溶解物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、又は他の精製技術を使用して精製され得る。ほとんどの場合、使用される組成物は、生成物の調製方法及びその精製に関連する汚染物質に関して、５０重量％以上の所望の生成物、より一般的には７５重量％以上、好ましくは９５重量％以上、及び治療目的では通常、９９．５重量％以上を含む。通常、割合は、総タンパク質に基づく。したがって、いくつかの場合では、本開示のｄＸＲポリペプチド、又はｄＸＲ融合ポリペプチドは、少なくとも８０％純粋、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、又は少なくとも９９％純粋である（例えば、汚染物質、非ｄＸＲタンパク質、又は他の巨大分子などを含まない）。
いくつかの実施形態では、インビトロ細胞中で、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）の転写の抑制を誘導するため目に、本開示のｄＸＲ及びｇＲＮＡは、それらが核酸（ＬＮＰ内若しくはＡＡＶ内にキャプシドで包まれたものを含む）又はＲＮＰとして導入されるかどうかにかかわらず、約３０分～約２４時間、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、又は約３０分から約２４時間までの任意の他の期間細胞に提供され、これは、ほぼ毎日～約７日毎、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎の頻度、又はほぼ毎日から約７日毎までの任意の他の頻度で繰り返され得る。いくつかの実施形態では、対象において標的核酸の転写の抑制を誘導するために、本開示のｄＸＲ及びｇＲＮＡは、対象細胞に１回以上、例えば、１回、２回、３回、又は４回以上提供され得、細胞は、各接触事象の後に、ある時間、例えば、１６～２４時間薬剤とインキュベートされ、その後、培地は、新鮮な培地と交換され、細胞は、更に培養される。
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子変異によって引き起こされる障害を有する対象を治療する方法を提供し、方法は、治療有効用量の（ｉ）本明細書に記載される実施形態のいずれかのｄＸＲ：ｇＲＮＡ系をコードするＡＡＶベクター、（ｉｉ）本明細書に記載される実施形態のいずれかのｄＸＲ：ｇＲＮＡ系のＲＮＰを含むＸＤＰ、（ｉｉｉ）ｇＲＮＡ及びｄＸＲをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ（これは、単一ＬＮＰであり得るか、若しくはｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡをそれぞれキャプシドで包む第１及び第２のＬＮＰとして製剤化され得る）、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の組み合わせを投与することを含み、対象の細胞中の遺伝子の標的核酸への遺伝子リプレッサー系のＲＮＰの結合時に、ＲＮＰの結合位置の近位の遺伝子の転写を抑制する。いくつかの実施形態では、標的化配列に対して相補的なｇＲＮＡ標的核酸配列は、遺伝子中の転写開始部位（ＴＳＳ）の１ｋｂ以内であり、ＲＮＰの結合時に、転写は抑制される。いくつかの実施形態では、標的化配列に対して相補的なｇＲＮＡ標的核酸配列は、遺伝子のＴＳＳの上流５００ｂｐ～下流５００ｂｐ以内にあり、ＲＮＰの結合時に、転写は抑制される。いくつかの実施形態では、標的化配列に対して相補的なｇＲＮＡ標的核酸配列は、遺伝子のＴＳＳの上流３００ｂｐ～下流３００ｂｐ以内にあり、ＲＮＰの結合時に、転写は抑制される。いくつかの実施形態では、標的化配列に対して相補的なｇＲＮＡ標的核酸配列は、遺伝子のエンハンサーの１ｋｂ以内にあり、ＲＮＰの結合時に、転写は抑制される。いくつかの実施形態では、標的化配列に対して相補的なｇＲＮＡ標的核酸配列は、遺伝子の３’非翻訳領域内にあり、ＲＮＰの結合時に、転写は抑制される。いくつかの実施形態では、標的化配列に対して相補的なｇＲＮＡ標的核酸配列は、遺伝子のエクソン内にあり、ＲＮＰの結合時に、転写は抑制される。いくつかの実施形態では、標的化配列に対して相補的なｇＲＮＡ標的核酸配列は、遺伝子のエクソン１内にあり、ＲＮＰの結合時に、転写は抑制される。
治療有効用量のｄＸＲ：ｇＲＮＡ系で対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、対象の細胞中の標的遺伝子の転写は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％抑制される。治療有効用量の前述のｄＸＲ系を有するｄＸＲ：ｇＲＮＡ系で対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、対象の標的細胞中の遺伝子の転写の抑制は、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約７日、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、少なくとも約２か月、又は少なくとも約６か月以上維持される。
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子変異によって引き起こされる障害を有する対象を治療する方法を提供し、方法は、治療有効量の本明細書に記載される実施形態のいずれかのＡＡＶベクターを投与することを含み、標的細胞の接触時に、ｄＸＲ：ｇＲＮＡが発現され、ＲＮＰとして複合体化し、対象の細胞中の標的核酸へのＲＮＰの結合時に、ＲＮＰの結合位置の近位の遺伝子の転写は、抑制され、治療は、障害に関連する少なくとも１つの臨床的に関連する評価項目の改善をもたらす。方法のいくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、少なくとも約１×１０５ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、ＡＡＶベクターは、少なくとも約１×１０５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。上述の一実施形態では、標的化細胞中の遺伝子の転写は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％抑制される。前述の別の実施形態では、細胞中の遺伝子の転写は、少なくとも約１０％～約９９％、又は少なくとも２０％～約９０％、少なくとも約３０％～約８０％、又は少なくとも約４０％～約６０％抑制される。
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子変異によって引き起こされる障害を有する対象を治療する方法を提供し、方法は、治療有効量の本明細書に記載される実施形態のいずれかのＸＤＰを投与することを含み、標的細胞の接触及び対象の細胞中の標的核酸へのＸＤＰのＲＮＰの結合時に、ＲＮＰの結合位置の近位の遺伝子の転写は、抑制され、治療は、障害に関連する少なくとも１つの臨床的に関連する評価項目の改善をもたらす。方法のいくつかの実施形態では、ＸＤＰは、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、ＸＤＰは、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ～約１×１０１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ～約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ～約１×１０１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される。上述の一実施形態では、標的化細胞中の遺伝子の転写は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％抑制される。前述の別の実施形態では、細胞中の遺伝子の転写は、少なくとも約１０％～約９９％、又は少なくとも２０％～約９０％、少なくとも約３０％～約８０％、又は少なくとも約４０％～約６０％抑制される。
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子変異によって引き起こされる障害を有する対象を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載される実施形態のいずれかのｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む治療有効量のＬＮＰ（これは、単一ＬＮＰであり得るか、若しくはｄＸＲ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡをそれぞれキャプシドで包む第１及び第２のＬＮＰとして製剤化され得る）を投与することを含み、標的化細胞の接触時に、ｄＸＲ融合タンパク質が発現され、ｇＲＮＡと複合体化されてＲＮＰを形成し、対象の細胞中の標的核酸へのＲＮＰの結合時に、ＲＮＰの結合位置の近位の遺伝子の転写は、抑制され、治療は、障害に関連する少なくとも１つの臨床的に関連する評価項目の改善をもたらす。方法のいくつかの実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ～約１×１０１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ～約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ～約１×１０１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される。上述の一実施形態では、標的化細胞中の遺伝子の転写は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％抑制される。前述の別の実施形態では、細胞中の遺伝子の転写は、少なくとも約１０％～約９９％、又は少なくとも２０％～約９０％、少なくとも約３０％～約８０％、又は少なくとも約４０％～約６０％抑制される。
治療方法の実施形態では、ＡＡＶベクター、ＸＤＰ、又はＬＮＰは、皮下、皮内、神経内、節内、髄内、筋肉内、腰椎内、髄腔内、くも膜下、脳室内、嚢内、静脈内、リンパ管内、又は腹腔内経路から選択される投与経路によって対象に投与され、投与方法は、注射、注入、若しくは移植、又はその組み合わせである。いくつかの実施形態では、対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、及びヒトからなる群から選択される。
多くの治療方略が、疾患を有する対象の治療方法で使用するための組成物を設計するために使用されている。いくつかの実施形態では、本発明は、疾患を有する対象の治療方法を提供し、方法は、治療有効用量を使用した１つ以上の連続用量を含む治療レジメンに従って、本明細書に開示される実施形態のいずれかのＬＮＰのｄＸＲ：ｇＲＮＡ組成物、ＡＡＶベクター、ＸＤＰを対象に投与することを含む。治療レジメンのいくつかの実施形態では、組成物又はベクターの治療有効用量は、単回用量として投与される。治療レジメンの他の実施形態では、治療有効用量は、少なくとも２週間、又は少なくとも１か月、又は少なくとも２か月、又は少なくとも３か月、又は少なくとも４か月、又は少なくとも５か月、又は少なくとも６か月の期間にわたって、２回以上の用量として対象に投与される。治療レジメンのいくつかの実施形態では、有効用量は、皮下、皮内、神経内、結節内、髄内、筋肉内、腰椎内、髄腔内、くも膜下、脳室内、嚢内、静脈内、動脈内、リンパ管内、硝子体内、網膜下、又は腹腔内経路からなる群から選択される経路によって投与され、投与方法は、注射、輸血、又は移植である。治療レジメンのいくつかの実施形態では、対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、及びヒトからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、遺伝子産物の発現を抑制するための、本明細書に開示されるｄＸＲタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びガイドリボ核酸組成物を含むベクター又はＬＮＰを含む、治療有効量のｄＸＲ：ｇＲＮＡモダリティの、疾患を有する対象への投与は、対象が依然として基礎疾患に罹患している可能性があるにもかかわらず、疾患に関連する少なくとも１つの臨床的に関連のある評価項目の改善が観察されるような、基礎疾患の予防又は改善につながる。いくつかの実施形態では、治療有効量のｄＸＲ：ｇＲＮＡモダリティの投与は、疾患に関連する少なくとも２つの臨床的に関連のあるパラメータの改善をもたらす。
２つ以上の異なる標的化複合体が細胞に提供される実施形態では（例えば、同一の又は異なる標的核酸内の異なる配列に対して相補的である２つ以上の異なる標的化配列を含む２つのｄＸＲ：ｇＲＮＡ）、複合体は、同時に提供され得るか、又は連続的に提供され得、例えば、第１のｄＸＲ：ｇＲＮＡ標的化複合体が最初に提供され、その後に第２の標的化複合体が提供される。
標的細胞へのＤＮＡベクターの送達を改善するために、ＤＮＡは損傷から保護され、例えば、リポプレックス及びポリプレックスを使用することによって、細胞へのその侵入が促進され得る。したがって、いくつかの場合では、本開示の核酸（例えば、本開示の組換え発現ベクター）は、ミセル、リポソーム、又は脂質ナノ粒子などの組織化された構造中の脂質で覆われ得、その実施形態は、上により十分に記載されている。ＬＮＰで採用されるアニオン性（負に荷電）、中性、カチオン性（正に荷電）、又はイオン化可能なカチオン性の４つのタイプの脂質がある。ＬＮＰのカチオン性脂質（又は適切なｐＨでのイオン化可能な脂質）は、その正電荷により、負に荷電したＤＮＡと自然に複合体化する。また、それらの電荷の結果として、それらは、細胞膜と相互作用する。次いで、ＬＮＰのエンドサイトーシスが生じ、ＤＮＡが細胞質に放出される。カチオン性脂質はまた、細胞によるＤＮＡの分解から保護する。
別の態様では、本開示は、対象における疾患の治療における薬剤として使用するための、本明細書に記載される実施形態のいずれかの遺伝子リプレッサー系の組成物を提供する。いくつかの実施形態では、対象対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、及びヒトからなる群から選択される。
ＩＸ．キット及び製造品
別の態様では、薬学的に許容可能な賦形剤中に製剤化され、好適な容器（例えば、管、バイアル、又はプレート）中に含有される、本開示の実施形態のいずれかの融合タンパク質と１つ又は複数のｇＲＮＡと、を含むキットが、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本開示のｇＲＮＡバリアントを含む。含まれ得る例示的なｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２３８～２３３１、５７５４４～５７５８９、及び５９３５２のうちのいずれか１つの配列、又は表２の配列を、足場の３’末端に連結された抑制される遺伝子に適した標的化配列と一緒に含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される実施形態の１つ以上のリプレッサードメイン、例えば、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン、ＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメイン、及びＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインに連結された、本開示のｄＣａｓＸバリアントタンパク質（例えば、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列）を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容可能な賦形剤中に製剤化され、好適な容器中に含有される、本明細書に記載される実施形態のいずれかのｄＸＲ：ｇＲＮＡをコードするベクターを含む。
ある特定の実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤中に製剤化され、好適な容器中に含有される、本明細書に記載されるｄＸＲをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを含むキットが、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、使用説明書、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを更に含む。
本説明は、多数の例示的な構成、方法、パラメータ、などを記載する。しかしながら、そのような説明は、本開示の範囲への制限として意図されないが、代わりに例示的な実施形態の説明として提供されることが認識されるべきである。上記の本主題の実施形態は、単独で、又は１つ以上の他の態様又は実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の説明を限定することなく、本開示のある特定の非限定的な実施形態を以下に提供する。本開示を読んだ当業者には明らかになるように、個別に番号付けされた実施形態の各々は、先行する又は後に続く個別に番号付けされた実施形態のいずれかとともに使用され得るか、又は組み合わされ得る。これは、実施形態の全てのそのような組み合わせに対する支持を提供することを意図しており、以下に明示的に提供される実施形態の組み合わせに限定されない。
以下の実施例は、例示的なものにすぎず、本開示の任意の態様をいかなる方法でも限定することを意図するものではない。
列挙される実施形態
本開示は、以下の例示され、列挙された実施形態に関して理解され得る。
セット１．
１．遺伝子リプレッサー系であって、
（ａ）触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、
（ｂ）１つ以上の転写リプレッサードメインと、
（ｃ）ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、
を含み、
ｉ）１つ以上の転写リプレッサードメインが、融合タンパク質として触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結されており、
ｉｉ）ｇＲＮＡが、遺伝子の標的核酸配列に対して相補的な標的化配列を含み、
ｉｉｉ）融合タンパク質が、ｇＲＮＡとともにリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、遺伝子リプレッサー系。
２．遺伝子が、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、構造ＲＮＡ、又はタンパク質をコードする、実施形態１に記載の遺伝子リプレッサー系。
３．１つ以上の転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）、メチル－ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）結合ドメイン２（ＭｅＣＰ２）、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＦＯＧ、ＥＺＨ２、ＳＩＤ４Ｘ、ＳＩＤ、ＮｃｏＲ、ＮｕＥ、メチル－ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）結合ドメイン２（ｍｅＣＰ２）、スイッチ独立３転写調節因子ファミリーメンバーＡ（ＳＩＮ３Ａ）、ヒストンデアセチラーゼＨＤＴ１（ＨＤＴ１）、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン含有タンパク質２のｎ末端短縮（ＭＢＤ２Ｂ）、タンパク質ホスファターゼ－１の核阻害剤（ＮＩＰＰ１）、及びヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１Ａ）からなる群から選択される、実施形態１に記載の遺伝子リプレッサー系。
４．ＫＲＡＢ転写リプレッサードメインが、ＺＮＦ３４３、ＺＮＦ３３７、ＺＮＦ３３４、ＺＮＦ２１５、ＺＮＦ５１９、ＺＮＦ４８５、ＺＮＦ２１４、ＺＮＦ３３Ｂ、ＺＮＦ２８７、ＺＮＦ７０５Ａ、ＺＮＦ３７Ａ、ＫＲＢＯＸ４、ＺＫＳＣＡＮ３、ＺＫＳＣＡＮ４、ＺＮＦ５７、ＺＮＦ５５７、ＺＮＦ７０５Ｂ、ＺＮＦ６６２、ＺＮＦ７７、ＺＮＦ５００、ＺＮＦ５５８、ＺＮＦ６２０、ＺＮＦ７１３、ＺＮＦ８２３、ＺＮＦ４４０、ＺＮＦ４４１、ＺＮＦ１３６、ＳＮＲＰＢ、ＺＮＦ７３５、ＺＫＳＣＡＮ２、ＺＮＦ６１９、ＺＮＦ６２７、ＺＮＦ３３３、ＡＢＣＡ１１Ｐ、ＰＬＤ５Ｐ１、ＺＮＦ２５、ＺＮＦ７２７、ＺＮＦ５９５、ＺＮＦ１４、ＺＮＦ３３Ａ、ＺＮＦ１０１、ＺＮＦ２５３、ＺＮＦ５６、ＺＮＦ７２０、ＺＮＦ８５、ＺＮＦ６６、ＺＮＦ７２２Ｐ、ＺＮＦ４８６、ＺＮＦ６８２、ＺＮＦ６２６、ＺＮＦ１００、ＺＮＦ９３、ＺＫＳＣＡＮ１、ＺＮＦ２５７、ＺＮＦ７２９、ＺＮＦ２０８、ＺＮＦ９０、ＺＮＦ４３０、ＺＮＦ６７６、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４２９、ＺＮＦ６７５、ＺＮＦ６８１、ＺＮＦ９９、ＺＮＦ４３１、ＺＮＦ９８、ＺＮＦ７０８、ＺＮＦ７３２、ＳＳＸ２、ＺＮＦ７２１、ＺＮＦ７２６、ＺＮＦ７３０、ＺＮＦ５０６、ＺＮＦ７２８、ＺＮＦ１４１、ＺＮＦ７２３、ＺＮＦ３０２、ＺＮＦ４８４、ＬＩＮＣ００９６０、ＳＳＸ２Ｂ、ＺＮＦ７１８、ＺＮＦ７４、ＺＮＦ１５７、ＺＮＦ７９０、ＺＮＦ５６５、ＺＮＦ７０５Ｇ、ＶＮ１Ｒ１０７Ｐ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＺＮＦ７３７、ＳＳＸ４、ＺＮＦ８５０、ＺＮＦ７１７、ＺＮＦ１５５、ＺＮＦ２８３、ＺＮＦ４０４、ＺＮＦ１１４、ＺＮＦ７１６、ＺＮＦ２３０、ＺＮＦ４５、ＺＮＦ２２２、ＺＮＦ２８６Ａ、ＺＮＦ６２４、ＺＮＦ２２３、ＺＮＦ２８４、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ７４９、ＺＮＦ６１５、ＺＦＰ９０、ＺＮＦ２２５、ＺＮＦ２３４、ＺＮＦ５６８、ＺＮＦ６１４、ＺＮＦ５８４、ＺＮＦ４３２、ＺＮＦ４６１、ＺＮＦ１８２、ＺＮＦ６３０、ＺＮＦ６３０－ＡＳ１、ＺＮＦ１３２、ＺＮＦ４２０、ＺＮＦ３２４Ｂ、ＺＮＦ６１６、ＺＮＦ４７１、ＺＮＦ２２７、ＺＮＦ３２４、ＺＮＦ８６０、ＺＦＰ２８、ＺＮＦ４７０、ＺＮＦ５８６、ＺＮＦ２３５、ＺＮＦ２７４、ＺＮＦ４４６、ＺＦＰ１、ＺＩＭ３、ＺＮＦ２１２、ＺＮＦ７６６、ＺＮＦ２６４、ＺＮＦ４８０、ＺＮＦ６６７、ＺＮＦ８０５、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ７８３、ＺＮＦ６２１、ＺＮＦ８－ＤＴ、ＺＮＦ８８０、ＺＮＦ２１３－ＡＳ１、ＺＮＦ２１３、ＺＮＦ２６３、ＺＳＣＡＮ３２、ＺＩＭ２、ＺＮＦ５９７、ＺＮＦ７８６、ＫＲＢＡ１、ＺＮＦ４６０、ＺＮＦ８、ＺＮＦ８７５、ＺＮＦ５４３、ＺＮＦ１３３、ＺＮＦ２２９、ＺＮＦ５２８、ＳＳＸ１、ＺＮＦ８１、ＺＮＦ５７８、ＺＮＦ８６２、ＺＮＦ７７７、ＺＮＦ４２５、ＺＮＦ５４８、ＺＮＦ７４６、ＺＮＦ２８２、ＺＮＦ３９８、ＺＮＦ５９９、ＺＮＦ２５１、ＺＮＦ１９５、ＺＮＦ１８１、ＲＢＡＫ－ＲＢＡＫＤＮ、ＺＦＰ３７、ＲＮ７ＳＬ５２６Ｐ、ＺＮＦ８７９、ＺＮＦ２６、ＺＳＣＡＮ２１、ＺＮＦ３、ＺＮＦ３５４Ｃ、ＺＮＦ１０、ＺＮＦ７５Ｄ、ＺＮＦ４２６、ＺＮＦ５６１、ＺＮＦ５６２、ＺＮＦ８４６、ＺＮＦ７８２、ＺＮＦ５５２、ＺＮＦ５８７Ｂ、ＺＮＦ８１４、ＺＮＦ５８７、ＺＮＦ９２、ＺＮＦ４１７、ＺＮＦ２５６、ＺＮＦ４７３、ＺＦＰ１４、ＺＦＰ８２、ＺＮＦ５２９、ＺＮＦ６０５、ＺＦＰ５７、ＺＮＦ７２４、ＺＮＦ４３、ＺＮＦ３５４Ａ、ＺＮＦ５４７、ＳＳＸ４Ｂ、ＺＮＦ５８５Ａ、ＺＮＦ５８５Ｂ、ＺＮＦ７９２、ＺＮＦ７８９、ＺＮＦ３９４、ＺＮＦ６５５、ＺＦＰ９２、ＺＮＦ４１、ＺＮＦ６７４、ＺＮＦ５４６、ＺＮＦ７８０Ｂ、ＺＮＦ６９９、ＺＮＦ１７７、ＺＮＦ５６０、ＺＮＦ５８３、ＺＮＦ７０７、ＺＮＦ８０８、ＺＫＳＣＡＮ５、ＺＮＦ１３７Ｐ、ＺＮＦ６１１、ＺＮＦ６００、ＺＮＦ２８、ＺＮＦ７７３、ＺＮＦ５４９、ＺＮＦ５５０、ＺＮＦ４１６、ＺＩＫ１、ＺＮＦ２１１、ＺＮＦ５２７、ＺＮＦ５６９、ＺＮＦ７９３、ＺＮＦ５７１－ＡＳ１、ＺＮＦ５４０、ＺＮＦ５７１、ＺＮＦ６０７、ＺＮＦ７５Ａ、ＺＮＦ２０５、ＺＮＦ１７５、ＺＮＦ２６８、ＺＮＦ３５４Ｂ、ＺＮＦ１３５、ＺＮＦ２２１、ＺＮＦ２８５、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ３０、ＺＮＦ３０４、ＺＮＦ２５４、ＺＮＦ７０１、ＺＮＦ４１８、ＺＮＦ７１、ＺＮＦ５７０、ＺＮＦ７０５Ｅ、ＫＲＢＯＸ１、ＺＮＦ５１０、ＺＮＦ７７８、ＰＲＤＭ９、ＺＮＦ２４８、ＺＮＦ８４５、ＺＮＦ５２５、ＺＮＦ７６５、ＺＮＦ８１３、ＺＮＦ７４７、ＺＮＦ７６４、ＺＮＦ７８５、ＺＮＦ６８９、ＺＮＦ３１１、ＺＮＦ１６９、ＺＮＦ４８３、ＺＮＦ４９３、ＺＮＦ１８９、ＺＮＦ６５８、ＺＮＦ５６４、ＺＮＦ４９０、ＺＮＦ７９１、ＺＮＦ６７８、ＺＮＦ４５４、ＺＮＦ３４、ＺＮＦ７、ＺＮＦ２５０、ＺＮＦ７０５Ｄ、ＺＮＦ６４１、ＺＮＦ２、ＺＮＦ５５４、ＺＮＦ５５５、ＺＮＦ５５６、ＺＮＦ５９６、ＺＮＦ５１７、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ１８、ＺＮＦ８２９、ＺＮＦ７７２、ＺＮＦ１７、ＺＮＦ１１２、ＺＮＦ５１４、ＺＮＦ６８８、ＰＲＤＭ７、ＺＮＦ６９５、ＺＮＦ６７０－ＺＮＦ６９５、ＺＮＦ１３８、ＺＮＦ６７０、ＺＮＦ１９、ＺＮＦ３１６、ＺＮＦ１２、ＺＮＦ２０２、ＲＢＡＫ、ＺＮＦ８３、ＺＮＦ４６８、ＺＮＦ４７９、ＺＮＦ６７９、ＺＮＦ７３６、ＺＮＦ６８０、ＺＮＦ２７３、ＺＮＦ１０７、ＺＮＦ２６７、ＺＫＳＣＡＮ８、ＺＮＦ８４、ＺＮＦ５７３、ＺＮＦ２３、ＺＮＦ５５９、ＺＮＦ４４、ＺＮＦ５６３、ＺＮＦ４４２、ＺＮＦ７９９、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ７０９、ＺＮＦ５６６、ＺＮＦ６９、ＺＮＦ７００、ＺＮＦ７６３、ＺＮＦ４３３－ＡＳ１、ＺＮＦ４３３、ＺＮＦ８７８、ＺＮＦ８４４、ＺＮＦ７８８Ｐ、ＺＮＦ２０、ＺＮＦ６２５－ＺＮＦ２０、ＺＮＦ６２５、ＺＮＦ６０６、ＺＮＦ５３０、ＺＮＦ５７７、ＺＮＦ６４９、ＺＮＦ６１３、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ３１７、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ１８０、ＺＮＦ４１５、ＶＮ１Ｒ１、ＺＮＦ２６６、ＺＮＦ７３８、ＺＮＦ４４５、ＺＮＦ８５２、ＺＫＳＣＡＮ７、ＺＮＦ６６０、ＭＰＲＩＰＰ１、ＺＮＦ１９７、ＺＮＦ５６７、ＺＮＦ５８２、ＺＮＦ４３９、ＺＦＰ３０、ＺＮＦ５５９－ＺＮＦ１７７、ＺＮＦ２２６、ＺＮＦ８４１、ＺＮＦ５４４、ＺＮＦ２３３、ＺＮＦ５３４、ＺＮＦ８３６、ＺＮＦ３２０、ＫＲＢＡ２、ＺＮＦ７６１、ＺＮＦ３８３、ＺＮＦ２２４、ＺＮＦ５５１、ＺＮＦ１５４、ＺＮＦ６７１、ＺＮＦ７７６、ＺＮＦ７８０Ａ、ＺＮＦ８８８、ＺＮＦ８１６－ＺＮＦ３２１Ｐ、ＺＮＦ３２１Ｐ、ＺＮＦ８１６、ＺＮＦ３４７、ＺＮＦ６６５、ＺＮＦ６７７、ＺＮＦ１６０、ＺＮＦ１８４、ＺＮＦ１４０、ＺＮＦ５８９、ＺＮＦ８９１、ＺＦＰ６９Ｂ、ＺＮＦ４３６、ＰＯＧＫ、ＺＮＦ６６９、ＺＦＰ６９、ＺＮＦ６８４、ＺＮＦ１２４、及びＺＮＦ４９６からなる群から選択される、実施形態３に記載の遺伝子リプレッサー系。
５．１つ以上の転写リプレッサードメインが、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９、又はそれらに対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される、実施形態１に記載の遺伝子リプレッサー系。
６．１つ以上の転写リプレッサードメインが、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９からなる配列の群から選択される、実施形態１に記載の遺伝子リプレッサー系。
７．融合タンパク質が、２つの転写リプレッサードメインを含み、第１の転写リプレッサードメインが、第２の転写リプレッサードメインとは異なる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー複合体。
８．第１の転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢであり、第２の転写リプレッサードメインが、メチル－ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）結合ドメイン２（ＭｅＣＰ２）、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＦＯＧ、ＥＺＨ２、ＳＩＤ４Ｘ、ＳＩＤ、ＮｃｏＲ、ＮｕＥ、メチル－ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）結合ドメイン２（ｍｅＣＰ２）、スイッチ独立３転写調節因子ファミリーメンバーＡ（ＳＩＮ３Ａ）、ヒストンデアセチラーゼＨＤＴ１（ＨＤＴ１）、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン含有タンパク質２のｎ末端短縮（ＭＢＤ２Ｂ）、タンパク質ホスファターゼ－１の核阻害剤（ＮＩＰＰ１）、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１Ａ）、混合系統白血病タンパク質－１（ＭＬＬ１）、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＭＬＬ４、ＭＬＬ５、ＳＥＴドメイン含有１Ａ（ＳＥＴＤ１Ａ）、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ２、斑入り３－９相同体１のサプレッサー（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ＳＵＶ３９Ｈ２、真正染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ１（ＥＨＭＴ１）、ヒストン－リジンＮ－メチルトランスフェラーゼＥＺＨ１（ＥＺＨ１）、核受容体結合ＳＥＴドメインタンパク質１（ＮＳＤ１）、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＡＳＨ１様ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（ＡＳＨ１Ｌ）、三要素モチーフ含有２８（ＴＲＩＭ２８）、メチルトランスフェラーゼ様３（ＭＥＴＴＬ３）、ＭＥＴＴＬ４、配列類似性を有するファミリー２０８メンバーＡ（ＦＡＭ２０８Ａ）、Ｍ相リンタンパク質８（ＭＰＨＯＳＰＨ８）、及びペリフィリン１（ＰＰＨＬＮ１）からなる群から選択される、実施形態７に記載の遺伝子リプレッサー複合体。
９．融合タンパク質が、第３の転写リプレッサードメインを含み、第３の転写リプレッサードメインが、第１の転写リプレッサードメイン及び第２の転写リプレッサードメインとは異なる、実施形態７又は実施形態８に記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１０．第１の転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢであり、第２の転写リプレッサードメイン及び第３の転写リプレッサードメインが、メチル－ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）結合ドメイン２（ＭｅＣＰ２）、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＦＯＧ、ＥＺＨ２、ＳＩＤ４Ｘ、ＳＩＤ、ＮｃｏＲ、ＮｕＥ、メチル－ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）結合ドメイン２（ｍｅＣＰ２）、スイッチ独立３転写調節因子ファミリーメンバーＡ（ＳＩＮ３Ａ）、ヒストンデアセチラーゼＨＤＴ１（ＨＤＴ１）、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン含有タンパク質２のｎ末端短縮（ＭＢＤ２Ｂ）、タンパク質ホスファターゼ－１の核阻害剤（ＮＩＰＰ１）、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１Ａ）、混合系統白血病タンパク質－１（ＭＬＬ１）、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＭＬＬ４、ＭＬＬ５、ＳＥＴドメイン含有１Ａ（ＳＥＴＤ１Ａ）、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ２、斑入り３－９相同体１のサプレッサー（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ＳＵＶ３９Ｈ２、真正染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ１（ＥＨＭＴ１）、ヒストン－リジンＮ－メチルトランスフェラーゼＥＺＨ１（ＥＺＨ１）、核受容体結合ＳＥＴドメインタンパク質１（ＮＳＤ１）、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＡＳＨ１様ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（ＡＳＨ１Ｌ）、三要素モチーフ含有２８（ＴＲＩＭ２８）、メチルトランスフェラーゼ様３（ＭＥＴＴＬ３）、ＭＥＴＴＬ４、配列類似性を有するファミリー２０８メンバーＡ（ＦＡＭ２０８Ａ）、Ｍ相リンタンパク質８（ＭＰＨＯＳＰＨ８）、及びペリフィリン１（ＰＰＨＬＮ１）からなる群から選択される、実施形態９に記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１１．転写リプレッサードメインが、リンカーペプチド配列によって連結されている、実施形態７～１０のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１２．１つ以上の転写リプレッサードメインが、リンカーペプチド配列によって触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＣ末端で又はその近くで連結されている、先行する実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１３．１つ以上の転写リプレッサードメインが、リンカーペプチド配列によって触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端で又はその近くで連結されている、実施形態１～１１に記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１４．リンカーペプチドが、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号３３２４０）、（ＧＳ）ｎ（配列番号３３２４１）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４３）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４４）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４５）、ＧＧＳＧ（配列番号３３２４６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３３２４７）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３３２４８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３３２４９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３３２５０）、ＧＳＳＳＧ（配列番号３３２５１）、（ＧＰ）ｎ（配列番号３３２５２）、ＧＰＧＰ（配列番号３３２５３）、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３２５４）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号３３２５５）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号３３２５６）、ＰＰＰＧ（配列番号３３２５７）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２５８）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号３３２５９）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６０）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６１）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３３２６２）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号３３２６３）からなる群から選択され、ｎは、１～５の整数である、実施形態１１～１３のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１５．触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、表４に記載される配列番号１７～３６、又はそれらに対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む、触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアントタンパク質（ｄＣａｓＸ）を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
１６．触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、表４に記載される配列番号１７～３６の配列からなる群から選択される配列を含む、触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアントタンパク質（ｄＣａｓＸ）を含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
１７．配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９に記載される配列、又はそれらに対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１５又は実施形態１６に記載の遺伝子リプレッサー系。
１８．配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９に記載される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１５又は実施形態１６に記載の遺伝子リプレッサー系。
１９．融合タンパク質が、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態１５～１８のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
２０．１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３２８９）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３３２９０）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３３２９１）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号３３２９２）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号３３２９３）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３３２９４）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３３２９５）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３３２９６）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１６６）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３３２９８）、ＤＲＬＲＲ（配列番号３３２９９）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３３３００）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３３３０１）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３３３０２）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３３３０３）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３３３０４）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号３３３０５）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号３３３０６）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号３３３０７）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号３３３０８）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号３３３０９）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号３３３１０）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号３３３１１）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号３３３１２）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号３３３１３）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３３３１４）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３３３１５）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号３３３１６）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３３３１７）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号３３３１８）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号３３３１９）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号３３３２０）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号３３３２１）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号３３３２２）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号３３３２３）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号３３３２４）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３３３２５）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３２６）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号３３３２７）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号３３３２８）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号３３３２９）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号３３３３０）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号３３３３１）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号３３３３２）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３３３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号３３３３４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３３３５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号３３３３６）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号３３３３７）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３３８）．からなる配列の群から選択される、実施形態１９に記載の遺伝子リプレッサー系。
２１．１つ以上のＮＬＳが、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＣ末端で又はその近くで連結されている、実施形態１９又は実施形態２０に記載の遺伝子リプレッサー系。
２２．１つ以上のＮＬＳが、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＮ末端で又はその近くで連結されている、実施形態１９又は実施形態２０に記載の遺伝子リプレッサー系。
２３．１つ以上のＮＬＳが、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＮ末端及びＣ末端の両方で又はそれらの近くで連結されている、実施形態１９又は実施形態２０に記載の遺伝子リプレッサー系。
２４．１つ以上のＮＬＳが、表５に記載される配列の群から選択され、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＮ末端で又はその近くで連結されている、実施形態１９に記載の遺伝子リプレッサー系。
２５．１つ以上のＮＬＳが、表６に記載される配列番号７２～１１２の群から選択され、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＣ末端で又はその近くで連結されている、実施形態１９に記載の遺伝子リプレッサー系。
２６．１つ以上のＮＬＳが、表５に記載される配列番号３７～７１の群から選択され、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＮ末端で又はその近くで連結されており、１つ以上のＮＬＳが、表６に記載される配列の群から選択され、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＣ末端で又はその近くで連結されている、実施形態１９に記載の遺伝子リプレッサー系。
２７．１つ以上のＮＬＳが、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質、リプレッサードメイン、又は１つ以上のリンカーペプチドを有する隣接するＮＬＳに連結されており、リンカーペプチドが、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号３３２４０）、（ＧＳ）ｎ（配列番号３３２４１）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４３）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４４）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４５）、ＧＧＳＧ（配列番号３３２４６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３３２４７）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３３２４８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３３２４９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３３２５０）、ＧＳＳＳＧ（配列番号３３２５１）、（ＧＰ）ｎ（配列番号３３２５２）、ＧＰＧＰ（配列番号３３２５３）、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３２５４）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号３３２５５）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号３３２５６）、ＰＰＰＧ（配列番号３３２５７）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２５８）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号３３２５９）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６０）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６１）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３３２６２）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号３３２６３）からなる群から選択され、ｎは、１～５の整数である、実施形態１９～２６のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
２８．ｇＲＮＡが、表２に記載される配列番号２１０１～２３３１、又はそれらに対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む足場を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
２９．ｇＲＮＡが、表２に記載される配列番号２１０１～２３３１からなる群から選択される配列を含む足場を有する、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
３０．ｇＲＮＡが、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１個のヌクレオチドを有する標的化配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
３１．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子中の転写開始部位（ＴＳＳ）の１ｋｂ以内にある、実施形態３０に記載の遺伝子リプレッサー系。
３２．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子のＴＳＳの５００ｂｐ上流～５００ｂｐ下流内にある、実施形態３０に記載の遺伝子リプレッサー系。
３３．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子の非翻訳領域に対して３’又は５’の１ｋｂ内にある、実施形態３０に記載の遺伝子リプレッサー系。
３４．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子のオープンリーディングフレーム内にある、実施形態３０に記載の遺伝子リプレッサー系。
３５．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子のエクソン内にある、実施形態３０に記載の遺伝子リプレッサー系。
３６．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子のエクソン１内にある、実施形態３５に記載の遺伝子リプレッサー系。
３７．ＲＮＰが、標的核酸に結合することができるが、標的核酸を切断することができない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
３８．先行する実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系の融合タンパク質をコードする核酸。
３９．先行する実施形態のいずれか１つに記載のｇＲＮＡをコードする核酸。
４０．核酸配列が、真核細胞中の発現に最適化されたコドンである、実施形態３８又は実施形態３９に記載の核酸。
４１．実施形態３８～４０に記載の核酸を含むベクター。
４２．ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ベクター、送達粒子系（ＸＤＰ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、及びＲＮＡベクターからなる群から選択される、実施形態４１に記載のベクター。
４３．ベクターが、ＡＡＶベクターである、実施形態４２に記載のベクター。
４４．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０から選択される、実施形態４３に記載のベクター。
４５．融合タンパク質及びｇＲＮＡをコードする核酸が、ＡＡＶ内の５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列と３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列との間の導入遺伝子として組み込まれる、実施形態４３又は実施形態４４に記載のベクター。
４６．ベクターが、レトロウイルスｇａｇポリタンパク質又はｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質の１つ以上の成分をコードする核酸を含むＸＤＰベクターである、実施形態４２に記載のベクター。
４７．核酸が、１つ以上の成分をコードし、ｇａｇ－トランスフレーム領域－ｐｏｌプロテアーゼポリタンパク質（ｇａｇ－ＴＦＲ－ＰＲ）、マトリクスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＣ）、キャプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１ペプチド、ｐ６ペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｐ２Ｂペプチド、Ｐ１０ペプチド、ｐ１２ペプチド、ＰＰ２１／２４ペプチド、Ｐ１２／Ｐ３／Ｐ８ペプチド、Ｐ２０ペプチド、ＭＳ２コートタンパク質、プロテアーゼ、及びプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される、実施形態４６に記載のベクター。
４８．核酸が、実施形態３８に記載の融合タンパク質を更にコードする、実施形態４６又は実施形態４７に記載のベクター。
４９．ベクターが、融合タンパク質をコードする第１の核酸と、ｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分をコードする第２の核酸とを含む、実施形態４６又は実施形態４７に記載のベクター。
５０．標的細胞へのＸＤＰの結合及び融合を提供するシュードタイピングウイルスエンベロープ糖タンパク質又は抗体断片をコードする核酸を更に含む、実施形態４８又は実施形態４９に記載のベクター。
５１．コードされたｇＲＮＡが、ＭＳ２ヘアピン配列を更に含む、実施形態４７～５０のいずれか１つに記載のベクター。
５２．Ｇａｇ－トランスフレーム領域－Ｐｏｌプロテアーゼポリタンパク質（Ｇａｇ－ＴＦＲ－ＰＲ）をコードする核酸と、Ｇａｇ－ＴＦＲ－ＰＲの各成分間の介在するプロテアーゼ切断部位とを更に含む、実施形態４７～５１のいずれか１つに記載のベクター。
５３．核酸が、図４又は図５に示されるように構成されている、実施形態５２に記載のベクター。
５４．実施形態４１～５３のいずれか１つに記載のベクターを含む宿主細胞。
５５．宿主細胞が、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、及び酵母細胞からなる群から選択される、実施形態５４に記載の宿主細胞。
５６．ＸＤＰであって、
（ａ）マトリクスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＣ）、キャプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１ペプチド、ｐ６ペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｐ２Ｂペプチド、Ｐ１０ペプチド、ｐ１２ペプチド、ＰＰ２１／２４ペプチド、Ｐ１２／Ｐ３／Ｐ８ペプチド、Ｐ２０ペプチド、ＭＳ２コートタンパク質、プロテアーゼ、及びプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される１つ以上の成分と、
（ｂ）実施形態１～３７のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系を含むＲＮＰであって、ＲＮＰが、ＸＤＰの自己集合時にＸＤＰ内にキャプシドで包まれる、ＲＮＰと、
（ｃ）標的細胞へのＸＤＰの結合及び融合を提供する、ＸＤＰキャプシド表面上に組み込まれたシュードタイピングウイルスエンベロープ糖タンパク質又は抗体断片と、を含む、ＸＤＰ。
５７．細胞集団中の標的核酸配列の転写を抑制する方法であって、方法が、細胞に、
（ａ）実施形態１～３７のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系を含むＲＮＰ、
（ｂ）実施形態３８～４０のいずれか１つに記載の核酸、
（ｃ）実施形態４１～５２のいずれか１つに記載のベクター、
（ｅ）実施形態５６に記載のＸＤＰ、又は
（ｆ）それらの組み合わせ、を導入することを含み、
標的核酸へのＲＮＰの結合時に、ＲＮＰの結合位置の近位の遺伝子の転写が、細胞中で抑制される、方法。
５８．細胞集団中の遺伝子の転写が、インビトロアッセイで評価された場合、同等のガイドＲＮＡとリプレッサードメインを含まない触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアントとを含むＲＮＰによってもたらされる抑制と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％大きく抑制される、実施形態５７に記載の方法。
５９．オフターゲット結合又はオフターゲット転写抑制が、細胞中で約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である、実施形態５７又は実施形態５８に記載の方法。
６０．細胞中の転写の抑制が、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約１週間、又は少なくとも約１か月維持される、実施形態５７～５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＮＡをコードする核酸を更に含み、第２のｇＮＡが、標的核酸配列の異なる部分に対して相補的な標的化配列を有し、触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質とともにリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、実施形態５７～６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．遺伝子変異によって引き起こされる障害を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の
（ａ）実施形態４３若しくは実施形態４４に記載のＡＡＶベクター、又は
（ｂ）実施形態５６に記載のＸＤＰ、を投与することを含み、
ＡＡＶベクター又はＸＤＰと接触した対象の細胞中の標的核酸へのＲＮＰの結合時に、ＲＮＰの結合位置の近位の遺伝子の転写が抑制される、方法。
６３．標的化細胞中の遺伝子の転写が、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％抑制される、実施形態６２に記載の方法。
６４．治療が、疾患又は障害に関連する少なくとも１つの臨床的に関連のある評価項目の改善をもたらす、実施形態６２又は実施形態６３に記載の方法。
６５．ＡＡＶベクター又はＸＤＰが、皮下、皮内、神経内、節内、髄内、筋肉内、腰椎内、髄腔内、くも膜下、脳室内、嚢内、静脈内、リンパ管内、又は腹腔内経路から選択される投与経路によって対象に投与され、投与方法が、注射、注入、若しくは移植、又はその組み合わせである、実施形態６２～６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．ＸＤＰが、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６粒子／ｋｇの用量で投与される、実施形態６５に記載の方法。
６７．ＸＤＰが、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ～約１×１０１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ～約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ～約１×１０１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態６５に記載の方法。
６８．ＡＡＶベクターが、少なくとも約１×１０８ベクターゲノム（ｖｇ）、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態６５に記載の方法。
６９．ＡＡＶベクターが、少なくとも約１×１０５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態６５に記載の方法。
７０．ＸＤＰ又はＡＡＶベクターが、ＸＤＰ又はＡＡＶの１つ以上の連続用量を含む治療レジメンに従って対象に投与される、実施形態６２～６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．治療有効用量が、少なくとも２週間、若しくは少なくとも１か月、若しくは少なくとも２か月、若しくは少なくとも３か月、若しくは少なくとも４か月、若しくは少なくとも５か月、若しくは少なくとも６か月の期間にわたって２回以上の用量として、又は年１回、対象に投与される、実施形態７０に記載の方法。
７２．対象が、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態６２～７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．対象が、ヒトである、実施形態６２～７１のいずれか１つに記載の方法。
７４．実施形態１～３７のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系と、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む医薬組成物。
７５．遺伝子変異によって引き起こされる障害の対象の治療における薬剤として使用するための、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
７６．ｇＲＮＡの標的化配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の１ヌクレオチド３’に位置する非標的鎖配列に対して相補的である、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
７７．ＰＡＭ配列が、ＴＣモチーフを含む、実施形態７６に記載の組成物。
７８．ＰＡＭ配列が、ＡＴＣ、ＧＴＣ、ＣＴＣ、又はＴＴＣを含む、実施形態７７に記載の組成物。
セット２．
１．遺伝子リプレッサー系であって、
（ａ）触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、
（ｂ）１つ以上の転写リプレッサードメインと、
（ｃ）ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、
を含み、
ｉ）１つ以上の転写リプレッサードメインが、融合タンパク質として触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結されており、
ｉｉ）ｇＲＮＡが、抑制、サイレンシング、又は下方調節のために標的化される遺伝子の標的核酸配列に対して相補的な標的化配列を含み、
ｉｉｉ）融合タンパク質が、ｇＲＮＡとともにリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができ、
ｉｖ）ＲＮＰが、標的核酸に結合することができる、遺伝子リプレッサー系。
２．遺伝子が、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又は構造ＲＮＡをコードする、実施形態１に記載の遺伝子リプレッサー系。
３．１つ以上の転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３アルファ（ＤＮＭＴ３Ａ）、ＤＮＭＴ３Ａ様タンパク質（ＤＮＭＴ３Ｌ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ベータ（ＤＮＭＴ３Ｂ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、フレンドオブＧＡＴＡ－１（Ｆｒｉｅｎｄ ｏｆ ＧＡＴＡ－１）（ＦＯＧ）、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、強化型ＳＩＤ（ＳＩＤ４Ｘ）、核受容体コリプレッサー（ＮｃｏＲ）、核エフェクタータンパク質（ＮｕＥ）、ＫＯＸ１抑制ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ＳＲＤＸ抑制ドメイン、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ、例えば、ＰＲ／ＳＥＴドメイン含有タンパク質（Ｐｒ－ＳＥＴ）７／８、リジンメチルトランスフェラーゼ５Ｂ（ＳＵＶ４－２０Ｈ１）、ＰＲ／ＳＥＴドメイン２（ＲＩＺ１）、ヒストンリジンデメチラーゼ、例えば、リジンデメチラーゼ４Ａ（ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ）、リジンデメチラーゼ４Ｂ（ＪＭＪＤ２Ｂ）、リジンデメチラーゼ４Ｃ（ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１）、リジンデメチラーゼ４Ｄ（ＪＭＪＤ２Ｄ）、リジンデメチラーゼ５Ａ（ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２）、リジンデメチラーゼ５Ｂ（ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１）、リジンデメチラーゼ５Ｃ（ＪＡＲＩＤ １Ｃ／ＳＭＣＸ）、リジンデメチラーゼ５Ｄ（ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ）、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）、ＳＩＲＴ２、ＤＮＡメチラーゼ、例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、メチルトランスフェラーゼ１（ＭＥＴ１）、ヒストンＨ３リジン９メチルトランスフェラーゼＧ９ａ（Ｇ９ａ）、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼスーパーファミリータンパク質（ＤＲＭ３）、ＤＮＡシトシンメチルトランスフェラーゼＭＥＴ２ａ（ＺＭＥＴ２）、メチル－ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）結合ドメイン２（ｍｅＣＰ２）、スイッチ独立３転写調節因子ファミリーメンバーＡ（ＳＩＮ３Ａ）、ヒストンデアセチラーゼＨＤＴ１（ＨＤＴ１）、メチル－ＣｐＧ結合ドメインタンパク質２のｎ末端短縮（ＭＢＤ２Ｂ）、タンパク質ホスファターゼ－１の核阻害剤（ＮＩＰＰ１）、ＧＬＰ、クロモメチラーゼ１（ＣＭＴ１）、クロモメチラーゼ２（ＣＭＴ２）、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１Ａ）、混合系統白血病タンパク質－５（ＭＬＬ５）、ヒストン－リジンＮ－メチルトランスフェラーゼＳＥＴＤＢ１（ＳＥＴＢ１）、斑入り３－９相同体１のサプレッサー（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ＳＵＶ３９Ｈ２、真正染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ１（ＥＨＭＴ１）、ヒストン－リジンＮ－メチルトランスフェラーゼＥＺＨ１（ＥＺＨ１）、ＥＺＨ２、核受容体結合ＳＥＴドメインタンパク質１（ＮＳＤ１）、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＡＳＨ１様ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（ＡＳＨ１Ｌ）、三要素モチーフ含有２８（ＴＲＩＭ２８）、メチルトランスフェラーゼ様３（ＭＥＴＴＬ３）、ＭＥＴＴＬ４、配列類似性を有するファミリー２０８メンバーＡ（ＦＡＭ２０８Ａ）、Ｍ相リンタンパク質８（ＭＰＨＯＳＰＨ８）、ＳＥＴドメイン含有２（ＳＥＴＤ２）、ヒストンデアセチラーゼ１（ＨＤＡＣ１）、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、及びペリフィリン１（ＰＰＨＬＮ１）ドメインからなる群から選択される、実施形態１に記載の遺伝子リプレッサー系。
４．転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢドメインである、実施形態３に記載の遺伝子リプレッサー系。
５．ＫＲＡＢ転写リプレッサードメインが、ＺＮＦ３４３、ＺＮＦ３３７、ＺＮＦ３３４、ＺＮＦ２１５、ＺＮＦ５１９、ＺＮＦ４８５、ＺＮＦ２１４、ＺＮＦ３３Ｂ、ＺＮＦ２８７、ＺＮＦ７０５Ａ、ＺＮＦ３７Ａ、ＫＲＢＯＸ４、ＺＫＳＣＡＮ３、ＺＫＳＣＡＮ４、ＺＮＦ５７、ＺＮＦ５５７、ＺＮＦ７０５Ｂ、ＺＮＦ６６２、ＺＮＦ７７、ＺＮＦ５００、ＺＮＦ５５８、ＺＮＦ６２０、ＺＮＦ７１３、ＺＮＦ８２３、ＺＮＦ４４０、ＺＮＦ４４１、ＺＮＦ１３６、ＳＮＲＰＢ、ＺＮＦ７３５、ＺＫＳＣＡＮ２、ＺＮＦ６１９、ＺＮＦ６２７、ＺＮＦ３３３、ＡＢＣＡ１１Ｐ、ＰＬＤ５Ｐ１、ＺＮＦ２５、ＺＮＦ７２７、ＺＮＦ５９５、ＺＮＦ１４、ＺＮＦ３３Ａ、ＺＮＦ１０１、ＺＮＦ２５３、ＺＮＦ５６、ＺＮＦ７２０、ＺＮＦ８５、ＺＮＦ６６、ＺＮＦ７２２Ｐ、ＺＮＦ４８６、ＺＮＦ６８２、ＺＮＦ６２６、ＺＮＦ１００、ＺＮＦ９３、ＺＫＳＣＡＮ１、ＺＮＦ２５７、ＺＮＦ７２９、ＺＮＦ２０８、ＺＮＦ９０、ＺＮＦ４３０、ＺＮＦ６７６、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４２９、ＺＮＦ６７５、ＺＮＦ６８１、ＺＮＦ９９、ＺＮＦ４３１、ＺＮＦ９８、ＺＮＦ７０８、ＺＮＦ７３２、ＳＳＸ２、ＺＮＦ７２１、ＺＮＦ７２６、ＺＮＦ７３０、ＺＮＦ５０６、ＺＮＦ７２８、ＺＮＦ１４１、ＺＮＦ７２３、ＺＮＦ３０２、ＺＮＦ４８４、ＬＩＮＣ００９６０、ＳＳＸ２Ｂ、ＺＮＦ７１８、ＺＮＦ７４、ＺＮＦ１５７、ＺＮＦ７９０、ＺＮＦ５６５、ＺＮＦ７０５Ｇ、ＶＮ１Ｒ１０７Ｐ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＺＮＦ７３７、ＳＳＸ４、ＺＮＦ８５０、ＺＮＦ７１７、ＺＮＦ１５５、ＺＮＦ２８３、ＺＮＦ４０４、ＺＮＦ１１４、ＺＮＦ７１６、ＺＮＦ２３０、ＺＮＦ４５、ＺＮＦ２２２、ＺＮＦ２８６Ａ、ＺＮＦ６２４、ＺＮＦ２２３、ＺＮＦ２８４、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ７４９、ＺＮＦ６１５、ＺＦＰ９０、ＺＮＦ２２５、ＺＮＦ２３４、ＺＮＦ５６８、ＺＮＦ６１４、ＺＮＦ５８４、ＺＮＦ４３２、ＺＮＦ４６１、ＺＮＦ１８２、ＺＮＦ６３０、ＺＮＦ６３０－ＡＳ１、ＺＮＦ１３２、ＺＮＦ４２０、ＺＮＦ３２４Ｂ、ＺＮＦ６１６、ＺＮＦ４７１、ＺＮＦ２２７、ＺＮＦ３２４、ＺＮＦ８６０、ＺＦＰ２８、ＺＮＦ４７０、ＺＮＦ５８６、ＺＮＦ２３５、ＺＮＦ２７４、ＺＮＦ４４６、ＺＦＰ１、ＺＩＭ３、ＺＮＦ２１２、ＺＮＦ７６６、ＺＮＦ２６４、ＺＮＦ４８０、ＺＮＦ６６７、ＺＮＦ８０５、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ７８３、ＺＮＦ６２１、ＺＮＦ８－ＤＴ、ＺＮＦ８８０、ＺＮＦ２１３－ＡＳ１、ＺＮＦ２１３、ＺＮＦ２６３、ＺＳＣＡＮ３２、ＺＩＭ２、ＺＮＦ５９７、ＺＮＦ７８６、ＫＲＢＡ１、ＺＮＦ４６０、ＺＮＦ８、ＺＮＦ８７５、ＺＮＦ５４３、ＺＮＦ１３３、ＺＮＦ２２９、ＺＮＦ５２８、ＳＳＸ１、ＺＮＦ８１、ＺＮＦ５７８、ＺＮＦ８６２、ＺＮＦ７７７、ＺＮＦ４２５、ＺＮＦ５４８、ＺＮＦ７４６、ＺＮＦ２８２、ＺＮＦ３９８、ＺＮＦ５９９、ＺＮＦ２５１、ＺＮＦ１９５、ＺＮＦ１８１、ＲＢＡＫ－ＲＢＡＫＤＮ、ＺＦＰ３７、ＲＮ７ＳＬ５２６Ｐ、ＺＮＦ８７９、ＺＮＦ２６、ＺＳＣＡＮ２１、ＺＮＦ３、ＺＮＦ３５４Ｃ、ＺＮＦ１０、ＺＮＦ７５Ｄ、ＺＮＦ４２６、ＺＮＦ５６１、ＺＮＦ５６２、ＺＮＦ８４６、ＺＮＦ７８２、ＺＮＦ５５２、ＺＮＦ５８７Ｂ、ＺＮＦ８１４、ＺＮＦ５８７、ＺＮＦ９２、ＺＮＦ４１７、ＺＮＦ２５６、ＺＮＦ４７３、ＺＦＰ１４、ＺＦＰ８２、ＺＮＦ５２９、ＺＮＦ６０５、ＺＦＰ５７、ＺＮＦ７２４、ＺＮＦ４３、ＺＮＦ３５４Ａ、ＺＮＦ５４７、ＳＳＸ４Ｂ、ＺＮＦ５８５Ａ、ＺＮＦ５８５Ｂ、ＺＮＦ７９２、ＺＮＦ７８９、ＺＮＦ３９４、ＺＮＦ６５５、ＺＦＰ９２、ＺＮＦ４１、ＺＮＦ６７４、ＺＮＦ５４６、ＺＮＦ７８０Ｂ、ＺＮＦ６９９、ＺＮＦ１７７、ＺＮＦ５６０、ＺＮＦ５８３、ＺＮＦ７０７、ＺＮＦ８０８、ＺＫＳＣＡＮ５、ＺＮＦ１３７Ｐ、ＺＮＦ６１１、ＺＮＦ６００、ＺＮＦ２８、ＺＮＦ７７３、ＺＮＦ５４９、ＺＮＦ５５０、ＺＮＦ４１６、ＺＩＫ１、ＺＮＦ２１１、ＺＮＦ５２７、ＺＮＦ５６９、ＺＮＦ７９３、ＺＮＦ５７１－ＡＳ１、ＺＮＦ５４０、ＺＮＦ５７１、ＺＮＦ６０７、ＺＮＦ７５Ａ、ＺＮＦ２０５、ＺＮＦ１７５、ＺＮＦ２６８、ＺＮＦ３５４Ｂ、ＺＮＦ１３５、ＺＮＦ２２１、ＺＮＦ２８５、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ３０、ＺＮＦ３０４、ＺＮＦ２５４、ＺＮＦ７０１、ＺＮＦ４１８、ＺＮＦ７１、ＺＮＦ５７０、ＺＮＦ７０５Ｅ、ＫＲＢＯＸ１、ＺＮＦ５１０、ＺＮＦ７７８、ＰＲＤＭ９、ＺＮＦ２４８、ＺＮＦ８４５、ＺＮＦ５２５、ＺＮＦ７６５、ＺＮＦ８１３、ＺＮＦ７４７、ＺＮＦ７６４、ＺＮＦ７８５、ＺＮＦ６８９、ＺＮＦ３１１、ＺＮＦ１６９、ＺＮＦ４８３、ＺＮＦ４９３、ＺＮＦ１８９、ＺＮＦ６５８、ＺＮＦ５６４、ＺＮＦ４９０、ＺＮＦ７９１、ＺＮＦ６７８、ＺＮＦ４５４、ＺＮＦ３４、ＺＮＦ７、ＺＮＦ２５０、ＺＮＦ７０５Ｄ、ＺＮＦ６４１、ＺＮＦ２、ＺＮＦ５５４、ＺＮＦ５５５、ＺＮＦ５５６、ＺＮＦ５９６、ＺＮＦ５１７、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ１８、ＺＮＦ８２９、ＺＮＦ７７２、ＺＮＦ１７、ＺＮＦ１１２、ＺＮＦ５１４、ＺＮＦ６８８、ＰＲＤＭ７、ＺＮＦ６９５、ＺＮＦ６７０－ＺＮＦ６９５、ＺＮＦ１３８、ＺＮＦ６７０、ＺＮＦ１９、ＺＮＦ３１６、ＺＮＦ１２、ＺＮＦ２０２、ＲＢＡＫ、ＺＮＦ８３、ＺＮＦ４６８、ＺＮＦ４７９、ＺＮＦ６７９、ＺＮＦ７３６、ＺＮＦ６８０、ＺＮＦ２７３、ＺＮＦ１０７、ＺＮＦ２６７、ＺＫＳＣＡＮ８、ＺＮＦ８４、ＺＮＦ５７３、ＺＮＦ２３、ＺＮＦ５５９、ＺＮＦ４４、ＺＮＦ５６３、ＺＮＦ４４２、ＺＮＦ７９９、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ７０９、ＺＮＦ５６６、ＺＮＦ６９、ＺＮＦ７００、ＺＮＦ７６３、ＺＮＦ４３３－ＡＳ１、ＺＮＦ４３３、ＺＮＦ８７８、ＺＮＦ８４４、ＺＮＦ７８８Ｐ、ＺＮＦ２０、ＺＮＦ６２５－ＺＮＦ２０、ＺＮＦ６２５、ＺＮＦ６０６、ＺＮＦ５３０、ＺＮＦ５７７、ＺＮＦ６４９、ＺＮＦ６１３、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ３１７、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ１８０、ＺＮＦ４１５、ＶＮ１Ｒ１、ＺＮＦ２６６、ＺＮＦ７３８、ＺＮＦ４４５、ＺＮＦ８５２、ＺＫＳＣＡＮ７、ＺＮＦ６６０、ＭＰＲＩＰＰ１、ＺＮＦ１９７、ＺＮＦ５６７、ＺＮＦ５８２、ＺＮＦ４３９、ＺＦＰ３０、ＺＮＦ５５９－ＺＮＦ１７７、ＺＮＦ２２６、ＺＮＦ８４１、ＺＮＦ５４４、ＺＮＦ２３３、ＺＮＦ５３４、ＺＮＦ８３６、ＺＮＦ３２０、ＫＲＢＡ２、ＺＮＦ７６１、ＺＮＦ３８３、ＺＮＦ２２４、ＺＮＦ５５１、ＺＮＦ１５４、ＺＮＦ６７１、ＺＮＦ７７６、ＺＮＦ７８０Ａ、ＺＮＦ８８８、ＺＮＦ８１６－ＺＮＦ３２１Ｐ、ＺＮＦ３２１Ｐ、ＺＮＦ８１６、ＺＮＦ３４７、ＺＮＦ６６５、ＺＮＦ６７７、ＺＮＦ１６０、ＺＮＦ１８４、ＺＮＦ１４０、ＺＮＦ５８９、ＺＮＦ８９１、ＺＦＰ６９Ｂ、ＺＮＦ４３６、ＰＯＧＫ、ＺＮＦ６６９、ＺＦＰ６９、ＺＮＦ６８４、ＺＮＦ１２４、ＺＮＦ４９６、及びそれらの配列バリアントからなる群から選択される、実施形態４に記載の遺伝子リプレッサー系。
６．ＫＲＡＢドメインが、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９、又はそれらに対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列からなる配列の群から選択される、実施形態４又は実施形態５に記載の遺伝子リプレッサー系。
７．ＫＲＡＢドメインが、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９からなる配列の群から選択される、実施形態４又は実施形態５に記載の遺伝子リプレッサー系。
８．１つ以上の転写リプレッサードメインが、リンカーペプチド配列によって触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＣ末端で又はその近くで連結されている、実施形態１～７のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー複合体。
９．１つ以上の転写リプレッサードメインが、リンカーペプチド配列によって触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端で又はその近くで連結されている、実施形態１～７に記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１０．融合タンパク質が、２つの転写リプレッサードメインを含み、第１の転写リプレッサードメインが、第２の転写リプレッサードメインとは異なる、実施形態１～９のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１１．第１の転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢであり、第２の転写リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ１、ＦＯＧ、ＳＩＤ、ＳＩＤ４Ｘ、ＮｃｏＲ、ＮｕＥ、ＫＯＸ１、ＥＲＤ、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＲＩＺ１、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、Ｍ．ＨｈａＩ、ＭＥＴ１、Ｇ９ａ、ＤＲＭ３、ＺＭＥＴ２、ｍｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、ＧＬＰ、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２、ＨＰ１Ａ、ＭＬＬ５、ＳＥＴＢ１、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＥＨＭＴ１、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＮＳＤ１、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＡＳＨ１Ｌ、ＴＲＩＭ２８、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ４、ＦＡＭ２０８Ａ、ＭＰＨＯＳＰＨ８、ＳＥＴＤ２、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、及びＰＰＨＬＮ１からなる群から選択される、実施形態１０に記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１２．第２の転写リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３Ａドメイン、又はその配列バリアントである、実施形態１１に記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１３．ＤＮＭＴ３Ａドメインが、配列番号３３６２５～５７５４３からなる群から選択される、実施形態１２に記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１４．融合タンパク質が、第３の転写リプレッサードメインを含み、第３の転写リプレッサードメインが、第１の転写リプレッサードメイン及び第２の転写リプレッサードメインとは異なる、実施形態１０～１３のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１５．第３の転写リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ１、ＦＯＧ、ＳＩＤ、ＳＩＤ４Ｘ、ＮｃｏＲ、ＮｕＥ、ＫＯＸ１、ＥＲＤ、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＲＩＺ１、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、Ｍ．ＨｈａＩ、ＭＥＴ１、Ｇ９ａ、ＤＲＭ３、ＺＭＥＴ２、ｍｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、ＧＬＰ、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２、ＨＰ１Ａ、ＭＬＬ５、ＳＥＴＢ１、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＥＨＭＴ１、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＮＳＤ１、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＡＳＨ１Ｌ、ＴＲＩＭ２８、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ４、ＦＡＭ２０８Ａ、ＭＰＨＯＳＰＨ８、ＳＥＴＤ２、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、及びＰＰＨＬＮ１からなる群から選択される、実施形態１４に記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１６．第３の転写リプレッサードメインが、ＤＭＮＴ３Ｌ、又はその配列バリアントである、実施形態１４又は実施形態１５に記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１７．第２の転写リプレッサードメイン及び／又は第３の転写リプレッサードメインが、リンカーペプチド配列によって、触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に、又は転写リプレッサードメインに連結されている、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１８．リンカーペプチドが、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号３３２４０）、（ＧＳ）ｎ（配列番号３３２４１）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４３）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４４）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４５）、ＧＧＳＧ（配列番号３３２４６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３３２４７）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３３２４８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３３２４９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３３２５０）、ＧＳＳＳＧ（配列番号３３２５１）、（ＧＰ）ｎ（配列番号３３２５２）、ＧＰＧＰ（配列番号３３２５３）、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３２５４）、ＧＳＧＳＧＧＧ（配列番号５７６２８）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号３３２５５）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号３３２５６）、ＰＰＰＧ（配列番号３３２５７）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２５８）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号３３２５９）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６０）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６１）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３３２６２）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号３３２６３）からなる群から選択され、ｎは、１～５の整数である、実施形態８～１７のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー複合体。
１９．触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、表４に記載される配列番号１７～３６、又はそれらに対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む、触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアントタンパク質（ｄＣａｓＸ）を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
２０．触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、表４に記載される配列番号１７～３６の配列からなる群から選択される配列を含む、触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアントタンパク質（ｄＣａｓＸ）を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
２１．融合タンパク質が、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
２２．１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３２８９）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３３２９０）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３３２９１）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号３３２９２）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号３３２９３）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３３２９４）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３３２９５）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３３２９６）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１６６）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３３２９８）、ＤＲＬＲＲ（配列番号３３２９９）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３３３００）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３３３０１）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３３３０２）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３３３０３）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３３３０４）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号３３３０５）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号３３３０６）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号３３３０７）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号３３３０８）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号３３３０９）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号３３３１０）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号３３３１１）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号３３３１２）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号３３３１３）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３３３１４）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３３３１５）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号３３３１６）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３３３１７）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号３３３１８）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号３３３１９）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号３３３２０）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号３３３２１）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号３３３２２）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号３３３２３）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号３３３２４）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３３３２５）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３２６）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号３３３２７）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号３３３２８）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号３３３２９）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号３３３３０）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号３３３３１）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号３３３３２）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３３３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号３３３３４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３３３５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号３３３３６）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号３３３３７）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３３８）、及び配列番号３７～１１２からなる配列の群から選択される、実施形態２１に記載の遺伝子リプレッサー系。
２３．１つ以上のＮＬＳが、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＣ末端で又はその近くで連結されている、実施形態２１又は実施形態２２に記載の遺伝子リプレッサー系。
２４．１つ以上のＮＬＳが、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＮ末端で又はその近くで連結されている、実施形態２１又は実施形態２２に記載の遺伝子リプレッサー系。
２５．１つ以上のＮＬＳが、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＮ末端及びＣ末端の両方で又はそれらの近くで連結されている、実施形態２１又は実施形態２２に記載の遺伝子リプレッサー系。
２６．１つ以上のＮＬＳが、表５に記載される配列番号３７～７１の群から選択され、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＮ末端で又はその近くで連結されている、実施形態２１に記載の遺伝子リプレッサー系。
２７．１つ以上のＮＬＳが、表６に記載される配列番号７２～１１２の群から選択され、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＣ末端で又はその近くで連結されている、実施形態２１に記載の遺伝子リプレッサー系。
２８．１つ以上のＮＬＳが、表５に記載される配列番号３７～７１からなる群から選択されるＮＬＳを含み、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＮ末端で又はその近くで連結されており、表６に記載される配列番号７２～１１２からなる群から選択されるＮＬＳを含み、ｄＣａｓＸ又はリプレッサードメインのＣ末端で又はその近くで連結されている、実施形態２１に記載の遺伝子リプレッサー系。
２９．１つ以上のＮＬＳが、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質、リプレッサードメイン、又は１つ以上のリンカーペプチドを有する隣接するＮＬＳに連結されており、リンカーペプチドが、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号３３２４０）、（ＧＳ）ｎ（配列番号３３２４１）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４３）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４４）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４５）、ＧＧＳＧ（配列番号３３２４６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３３２４７）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３３２４８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３３２４９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３３２５０）、ＧＳＳＳＧ（配列番号３３２５１）、（ＧＰ）ｎ（配列番号３３２５２）、ＧＰＧＰ（配列番号３３２５３）、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３２５４）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号３３２５５）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号３３２５６）、ＰＰＰＧ（配列番号３３２５７）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２５８）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号３３２５９）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６０）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６１）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３３２６２）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号３３２６３）からなる群から選択され、ｎは、１～５の整数である、実施形態２１～２８のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
３０．融合タンパク質が、図７に描写される構成に従って構成されている、実施形態２１～２９のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー複合体。
３１．ｇＲＮＡが、表２に記載される配列番号２２３８～２３３１及び５７５４４～５７５８９、又はそれらに対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む足場を有する、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
３２．ｇＲＮＡが、表２に記載される配列番号２２３８～２３３１及び５７５４４～５７５８９からなる群から選択される配列を含む足場を有する、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
３３．ｇＲＮＡが、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１個のヌクレオチドを有する標的化配列を含む、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
３４．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子中の転写開始部位（ＴＳＳ）の１ｋｂ以内にある、実施形態３３に記載の遺伝子リプレッサー系。
３５．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子のＴＳＳの５００ｂｐ上流～５００ｂｐ下流内にある、実施形態３３に記載の遺伝子リプレッサー系。
３６．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子のＴＳＳの３００ｂｐ上流～３００ｂｐ下流内にある、実施形態３３に記載の遺伝子リプレッサー系。
３７．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子のエンハンサーの１ｋｂ以内にある、実施形態３３に記載の遺伝子リプレッサー系。
３８．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子の３’非翻訳領域内にある、実施形態３３に記載の遺伝子リプレッサー系。
３９．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子のエクソン内にある、実施形態３３に記載の遺伝子リプレッサー系。
４０．標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子のエクソン１内にある、実施形態３９に記載の遺伝子リプレッサー系。
４１．ＲＮＰが、標的核酸に結合することができるが、標的核酸を切断することができない、実施形態１～４０のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
４２．実施形態１～４１のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系の融合タンパク質をコードする核酸。
４３．実施形態１～４１のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系のｇＲＮＡをコードする核酸。
４４．核酸配列が、真核細胞中の発現に最適化されたコドンである、実施形態４２に記載の核酸。
４５．実施形態４２の核酸を含む脂質ナノ粒子。
４６．実施形態４３の核酸を含む脂質ナノ粒子。
４７．実施形態１～４１のいずれか１つに記載のリプレッサー系の融合タンパク質をコードする第１の核酸と、ｇＲＮＡを含む第２の核酸と、を含む脂質ナノ粒子。
４８．脂質ナノ粒子の第１の集団及び脂質ナノ粒子の第２の集団と、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系をコードする核酸と、を含む脂質ナノ粒子組成物であって、第１の集団が、融合タンパク質をコードする第１の核酸をキャプシドで包む脂質ナノ粒子を含み、脂質ナノ粒子の第２の集団が、ｇＲＮＡをコードする第２の核酸をキャプシドで包むか、又はｇＲＮＡを含む、ナノ粒子を含む、脂質ナノ粒子組成物。
４９．実施形態４２～４４のいずれか１つに記載の核酸を含むベクター。
５０．ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、及びＲＮＡベクターからなる群から選択される、実施形態４９に記載のベクター。
５１．ベクターが、ＡＡＶベクターである、実施形態５０に記載のベクター。
５２．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０から選択される、実施形態５１に記載のベクター。
５３．融合タンパク質及びｇＲＮＡをコードする核酸が、ＡＡＶ内の５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列と３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列との間の導入遺伝子として組み込まれる、実施形態５１又は実施形態５２に記載のベクター。
５４．送達粒子系（ＸＤＰ）であって、
（ａ）マトリクスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＣ）、キャプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１ペプチド、ｐ６ペプチド、ｐ２Ａペプチド、ｐ２Ｂペプチド、ｐ１０ペプチド、ｐ１２ペプチド、ｐｐ２１／２４ペプチド、ｐ１２／ｐ３／ｐ８ペプチド、ｐ２０ペプチド、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、Ｑコートタンパク質、Ｕ１Ａシグナル認識粒子、ファージＲ－ループ、Ｒｅｖタンパク質、及びＰｓｉパッケージング要素からなる群から選択される１つ以上の成分と、
（ｂ）実施形態１～４１のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系を含むＲＮＰであって、ＸＤＰ内にキャプシドで包まれる、ＲＮＰと、
（ｃ）標的細胞へのＸＤＰの結合及び融合を提供する、ＸＤＰ表面上に組み込まれた指向性因子と、を含む、送達粒子系（ＸＤＰ）。
５５．指向性因子が、シュードタイピングウイルスエンベロープ糖タンパク質、抗体断片、又は細胞受容体断片からなる群から選択される、実施形態５４に記載のＸＤＰ。
５６．細胞集団中の遺伝子の標的核酸配列の転写を抑制する方法であって、方法が、細胞に、
（ａ）実施形態１～４１のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系を含むＲＮＰ、
（ｂ）実施形態４２～４４のいずれか１つに記載の核酸、
（ｃ）実施形態４９～５３のいずれか１つに記載のベクター、
（ｄ）実施形態５４若しくは５５に記載のＸＤＰ、
（ｅ）実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子、又は
（ｆ）実施形態４８に記載の脂質ナノ粒子組成物、を導入することを含み、
標的核酸への遺伝子リプレッサー系のＲＮＰの結合時に、ＲＮＰの結合位置の近位の遺伝子の転写が、細胞中で抑制される、方法。
５７．ＲＮＰの結合位置が、
（ａ）遺伝子中の転写開始部位（ＴＳＳ）に対して５’の３００～１，０００塩基対以内の配列、
（ｂ）遺伝子中のＴＳＳに対して３’の３００～１，０００塩基対以内の配列、
（ｃ）遺伝子のエンハンサーに対して３００～１，０００塩基対以内の配列、
（ｄ）遺伝子のオープンリーディングフレーム内の配列、
（ｅ）遺伝子のエクソン内の配列、又は
（ｆ）遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の配列からなる群から選択される、実施形態５６に記載の方法。
５８．遺伝子の転写が、ＲＮＰの結合位置に対して５’で抑制される、実施形態５６又は実施形態５７に記載の方法。
５９．遺伝子の転写が、ＲＮＰの結合位置に対して３’で抑制される、実施形態５６又は実施形態５７に記載の方法。
６０．細胞集団中の遺伝子の転写が、インビトロアッセイで評価された場合、未処置細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％大きく抑制される、実施形態５６～５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．オフターゲットメチル化又はオフターゲット転写抑制が、インビトロアッセイで評価された場合、細胞中で約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である、実施形態５６～６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．細胞中の転写の抑制が、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約７日、少なくとも約１か月、又は少なくとも約２か月維持される、実施形態５６～６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＮＡをコードする核酸を更に含み、第２のｇＮＡが、標的核酸配列の異なる部分に対して相補的な標的化配列を有し、触媒活性を伴わないクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び１つ以上の転写リプレッサードメインを含む融合タンパク質とともに、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、実施形態５６～６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．方法が、細胞の遺伝子中の遺伝的エピジェネティック変化を媒介する、実施形態５６～６３のいずれか１つに記載の方法。
６５．遺伝子変異によって引き起こされる障害を有する対象を治療する方法であって、治療有効用量の
（ａ）実施形態５１～５３のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター、
（ｂ）実施形態５４若しくは実施形態５５に記載のＸＤＰ、
（ｃ）実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子、又は
（ｄ）実施形態４８に記載の脂質ナノ粒子組成物、を投与することを含み、
対象の細胞中の遺伝子の標的核酸への遺伝子リプレッサー系のＲＮＰの結合時に、ＲＮＰの結合位置の近位の遺伝子の転写が抑制される、方法。
６６．遺伝子の転写が、ＲＮＰの結合位置に対して５’で抑制される、実施形態６５に記載の方法。
６７．遺伝子の転写が、ＲＮＰの結合位置に対して３’で抑制される、実施形態６５に記載の方法。
６８．細胞中の遺伝子の転写が、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％抑制される、実施形態６５のいずれか１つに記載の方法。
６９．細胞中の遺伝子の転写の抑制が、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約７日、少なくとも約１か月、又は少なくとも約２か月維持される、実施形態６５のいずれか１つに記載の方法。
７０．方法が、対象の細胞の遺伝子中の遺伝的エピジェネティック変化を媒介する、実施形態６５～６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．ＡＡＶベクター、ＸＤＰ、又は脂質ナノ粒子が、皮下、皮内、神経内、節内、髄内、筋肉内、腰椎内、髄腔内、くも膜下、脳室内、嚢内、静脈内、リンパ管内、又は腹腔内経路から選択される投与経路によって対象に投与され、投与方法が、注射、注入、若しくは移植、又はその組み合わせである、実施形態６５～７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．ＸＤＰ又は脂質ナノ粒子が、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６粒子／ｋｇの用量で投与される、実施形態７１に記載の方法。
７３．ＸＤＰ又は脂質ナノ粒子が、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ～約１×１０１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ～約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ～約１×１０１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態７１に記載の方法。
７４．ＡＡＶベクターが、少なくとも約１×１０８ベクターゲノム（ｖｇ）、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態７１に記載の方法。
７５．ＡＡＶベクターが、少なくとも約１×１０５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態７１に記載の方法。
７６．第１の脂質ナノ粒子及び第２の脂質ナノ粒子が各々、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６粒子／ｋｇの用量で投与される、実施形態７１に記載の方法。
７７．第１の脂質ナノ粒子及び第２の脂質ナノ粒子が各々、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ～約１×１０１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ～約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ～約１×１０１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態７１に記載の方法。
７８．ＸＤＰ、ＡＡＶベクター、又は第１の脂質ナノ粒子及び第２の脂質ナノ粒子が、１つ以上の連続用量を含む治療レジメンに従って対象に投与される、実施形態６５～７７のいずれか１つに記載の方法。
７９．治療有効用量が、少なくとも２週間、若しくは少なくとも１か月、若しくは少なくとも２か月、若しくは少なくとも３か月、若しくは少なくとも４か月、若しくは少なくとも５か月、若しくは少なくとも６か月の期間にわたって２回以上の用量として、又は年１回、対象に投与される、実施形態６５～７８のいずれか１つに記載の方法。
８０．治療が、対象における障害に関連する少なくとも１つの臨床的に関連する評価項目の改善をもたらす、実施形態６５～７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．対象が、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態６５～７９のいずれか１つに記載の方法。
８２．対象が、ヒトである、実施形態６５～７９のいずれか１つに記載の方法。
８３．実施形態１～４１のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系と、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む医薬組成物。
８４．遺伝子変異によって引き起こされる障害の対象の治療における薬剤として使用するための、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
８５．ｇＲＮＡの標的化配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の１ヌクレオチド３’に位置する非標的鎖配列に対して相補的である、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の遺伝子リプレッサー系。
８６．ＰＡＭ配列が、ＴＣモチーフを含む、実施形態８５に記載の組成物。
８７．ＰＡＭ配列が、ＡＴＣ、ＧＴＣ、ＣＴＣ、又はＴＴＣを含む、実施形態８５又は実施形態８６に記載の組成物。
実施例１：ＲＮＡレベル及びタンパク質レベルでのＢ２Ｍの抑制に関する触媒活性を伴わないＣａｓＸリプレッサー（ｄＸＲ）軽の実証
様々な触媒活性を伴わないＣａｓＸリプレッサー（ｄＸＲ）構築物が哺乳動物細胞中で転写リプレッサーとして作用することができるかを判断するための実験を実施した。
材料及び方法：
Ｕ６－ｇＲＮＡ＋Ｅｆ１α－ＮＬＳ－ＧＧＳ－ｄＣａｓＸ４９１－ＧＧＳ－ＫＲＡＢバリアント－ＮＬＳ（ｄＣａｓＸ４９１は、触媒活性を伴わないＣａｓＸ４９１を指す）の構成を有する構築物をコードするｄＸＲバリアントプラスミドを、配列された９６ウェル形式でＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。これらの構築物はまた、２×ＦＬＡＧ配列、並びに内在性Ｂ２Ｍ（ベータ－２－ミクログロブリン）遺伝子を標的とするスペーサー（スペーサー７．３７）又は非標的化対照（スペーサー０．０）を有するｇＲＮＡ足場１７４（配列番号２２３８）のいずれかをコードする配列も含有し、これらは全て、プラスミド上のＰ２Ａ－ピューロマイシン要素の上流でクローニングされた。４つの異なるエフェクタードメインを、「裸の」ｄＣａｓＸ４９１に加えて試験した（表９に列挙するＫＲＡＢバリアントドメイン、表１０に列挙するスペーサー配列、表１１に列挙する追加の要素の配列）。完全なｄＸＲ分子をコードする配列を表１２に列挙する。ｄＸＲ分子の対応するタンパク質配列を表１３に列挙し、ｄＸＲ分子の一般的な構成を図３８に示す。Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ（スペーサー７．１４）又は非標的化ｇＲＮＡ対照（スペーサー０．０）を有する触媒活性を伴わないＣａｓ９ヌクレアーゼ（ＺＮＦ１０リプレッサーあり又はなし）に基づく陽性及び陰性の対照を、同じ７．３７及び０．０スペーサーを有する触媒活性型ＣａｓＸ４９１及びｇＲＮＡとともに含んだ。トランスフェクションの２日後、総ＲＮＡを採取し、逆転写してｃＤＮＡライブラリーを生成した。遺伝子発現の変化を、標的化遺伝子及び参照としてのハウスキーピング遺伝子に対してｑＰＣＲを実施することによって計算した。相対遺伝子発現は、２つの生物学的複製の非標的化ガイド条件に対して正規化された参照遺伝子に対する標的特異的ＲＮＡの量を表す。ＲＮＡ測定に使用されるウェルに加えて、別個のウェルのセットをトランスフェクションの７日後に採取し、Ｂ２Ｍタンパク質発現について分析した。Ｂ２Ｍタンパク質の発現を、細胞表面上のＢ２Ｍ依存性ＨＬＡタンパク質複合体を検出する抗体を使用することによって決定した。Ｂ２Ｍを発現した細胞（Ｂ２Ｍ＋）を、フローサイトメトリーを使用して測定し、関連データを表１４に示す。
結果：
遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを有する全ての条件が、抑制をもたらしたが、抑制の強度は、ドメインの選択によって異なった（図１）。エフェクタードメインを有する触媒活性を伴わないＣａｓＸ分子は、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（約８２％のＲＮＡが枯渇した）に匹敵して、４８時間で標的化ＲＮＡの大部分を枯渇させた（平均で約８１％のＲＮＡが枯渇した）。タンパク質レベルでは、ｄＣａｓＸは、それ自体でわずかな抑制をもたらすが（細胞の約１０％がタンパク質レベルで陰性）、任意のＫＲＡＢドメインの付加は、更なる抑制に大きく寄与した（細胞の８０～８９％の範囲がＢ２Ｍタンパク質に対して陰性であった（表１４）。更に、ほとんどのＣａｓＸ構築物は、タンパク質の枯渇においてｄＣａｓ９対照に引けを取らなかった（細胞の２２％がｄＣａｓ９に対して陰性、及び細胞の８１％がｄＣａｓ９－ＫＲＡＢに対して陰性）（表１４）。
表１４中、ｄＣａｓＸは、触媒活性を伴わないＣａｓＸ４９１を指し、ｄＸＲ１～４は、以下の配向：Ｕ６－ｇＲＮＡ＋Ｅｆ１α－ＮＬＳ－ＧＧＳ－ｄＣａｓＸ－ＧＧＳ－ＫＲＡＢバリアント－ＮＬＳで、表９に示すＫＲＡＢドメインに融合されたｄＣａｓＸ４９１を指し、ＣａｓＸは、触媒活性型ＣａｓＸ４９１を指す。ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢは、ＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメインに融合されたｄＣａｓ９を指す。
結果は、ｄＸＲが内在性遺伝子座（Ｂ２Ｍ）を転写的に抑制し、標的タンパク質の喪失をもたらすことができることを実証する。更に、転写エフェクタードメインの付加及び選択は、分子の全体的な効力に影響を与える。
実施例２：ハイスループットスクリーニングのためのＨＢＥＧＦに対するｄＸＲ有効性の実証
哺乳動物細胞中の分子のハイスループットスクリーニングのためにｄＸＲ構築物を使用する実行可能性を決定するための実験を実施した。
材料及び方法：
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３００，０００細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種し、ＣａｓＸ分子（４９１）、ＺＮＦ１０－ＫＲＡＢリプレッサードメイン（ｄＸＲ）を有する触媒活性を伴わないＣａｓＸ４９１、及びＨＢＥＧＦ遺伝子を標的とするスペーサー又は非標的化スペーサーを有するガイド足場１７４（配列番号２２３８）のいずれかをコードする１μｇのプラスミドでリポフェクトした。示されるスペーサー（表１５）とのＣａｓＸ系分子及びｇＲＮＡの５つの組み合わせを、５つの別個のウェルにトランスフェクトした。ＨＢＥＧＦは、細胞に付加されたときに翻訳を阻害し、細胞死をもたらすジフテリア毒素の侵入を媒介する受容体である。ＣａｓＸ又はｄＸＲ分子及び標的化ｇＲＮＡを用いたＨＢＥＧＦ遺伝子の標的化が、毒素の侵入を防止し、細胞の生存を可能にするはずである一方で、ＣａｓＸ及びｄＸＲ分子並びに非標的化ｇＲＮＡで処置された細胞は、生存しないはずである。トランスフェクションの１日後、トランスフェクトされた各ウェル内の細胞を、９６ウェルプレート中の１２個の異なるウェルに分割し、ピューロマイシンで選択した。３日間にわたって、細胞を６つの異なる濃度のジフテリア毒素（０、０．２、２、２０、２００、及び２０００ｎｇ／ｍＬ）で処置し、生物学的複製を実施した。更に２日後、細胞を新鮮な培地に分割し、総細胞数をＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｐｉｃｏ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ上で測定した。
結果：
ジフテリア毒素アッセイの結果を図２のプロットに示す。ＨＢＥＧＦ遺伝子のｄＸＲ媒介抑制は、細胞の生存をもたらしたが、低用量の毒素（０．２～２０ｎｇ／ｍＬ）でのみもたらした。しかしながら、それらの同じ用量は、非標的化構築物で処置された対照細胞において完全な細胞死をもたらした。高用量（２０ｎｇ／ｍＬ超）の毒素は、ｄＸＲ及び対照試料の両方で細胞死をもたらし、ｄＸＲによって可能になる転写の基礎レベルが、十分な毒素が細胞に侵入し、細胞死を引き起こすことを可能にすることを示唆している。結果は、遺伝子座の編集が機能性タンパク質の完全な喪失につながるため、ＣａｓＸ編集細胞が保護されたままであったことを示す。非標的化対照は、全ての用量で死滅し、ＨＢＥＧＦが抑制又は編集されていないときの毒素の有効性を実証している。
結果は、ｄＸＲが低用量の毒素で保護することを示し、この分子が０．２～２０ｎｇ／ｍＬのジフテリア毒素の範囲内でスクリーニングされ得、ｄＸＲと対照との間の最も高い倍率濃縮が０．２ｎｇ／ｍＬで観察されたことを実証している。ＣａｓＸは、全ての用量で保護するが、ｄＸＲによる抑制は依然として、高用量の毒素での細胞の毒性につながる、標的の低い基礎発現を誘導することに留意されたい。
実施例３：触媒活性を伴わないＣａｓＸ系リプレッサー（ｄＸＲ）がＣ９ｏｒｆ７２を抑制する能力の実証
ｄＣａｓＸ系リプレッサーが、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の５’ＵＴＲで構築されたレポーターの転写サイレンシングを誘導することができるかを判断するための実験を実施した。この系は、Ｃ９ｏｒｆ７２が内在的に発現されない細胞型におけるｄＸＲ－ｇＲＮＡの組み合わせの有効性を研究することを可能にし、更に、編集系で活性であることが知られているスペーサーを有するｇＲＮＡを使用した追加のｄＸＲ分子のハイスループットスクリーニングを可能にする。
材料及び方法：
ＣＭＶプロモーター、Ｃ９ｏｒｆ７２完全５’ＵＴＲ（全ての潜在的なＡＴＧ開始コドンが変異し、２つの人工ＰＡＭが５’末端及び３’末端に付加されたエクソン１ａ－エクソン１ｂ－エクソン２）、並びにＴｕｒｂｏＧＦＰ－ＰＥＳＴ－ｐ２Ａ－ＨＳＶ＿ＴＫのコード配列を含有するプラスミドレポーターで、Ｋ５６２（ヒト骨髄性白血病細胞株）細胞をヌクレオフェクトすることによって、クローンレポーター細胞株を構築した。ＣＭＶプロモーターは、レポーターの構成的発現を可能にし、Ｃ９ｏｒｆ７２ ５’ＵＴＲは、ｄＣａｓＸ構築物で標的化する配列を提供し、ＧＦＰ及びＴＫ（単純ヘルペスウイルス－１チミジンキナーゼ）タンパク質は、選択及び対抗選択のためのマーカーを提供する。具体的には、ＴＫは、典型的には不活性なプロ－ドラッグガンシクロビルを、細胞死につながる毒性チミジン類似体に代謝する。ヌクレオフェクト細胞をハイグロマイシン中で１か月選択し、単一細胞にソーティングし、ガンシクロビル感受性について特性評価した。５μｇ／ｍＬのガンシクロビル濃度で５日以内に完全な細胞死を示した単一クローン（ＧＦＰ－ＴＫ－ｃ１０）を選択した。
ＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメインを含有するｄＸＲ分子、及び足場１７４を有するｇＲＮＡ（配列番号２２３８）、及びＧＦＰ－ＴＫレポーター中に存在するＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の５’ＵＴＲ配列を標的とするスペーサー（表１６）をコードするレンチウイルスで、ＧＦＰ－ＴＫ－ｃ１０細胞を形質導入した（２５０，０００細胞、６ウェル形式）。１つのレンチウイルスを細胞の１つのウェルに適用する配列された様式で形質導入を行った。形質導入の４８時間後、細胞を５μｇ／ｍＬのガンシクロビルで５日間処置し、次いで、トリパンブルーで染色し、自動細胞カウンターでカウントした。
別個に、定義された比で複数のウイルスの組み合わせで、細胞を形質導入した（２５０，０００細胞、６ウェル形式）（表１７）。形質導入の４８時間後、各ウェル内の細胞の半分を採取し、細胞ペレットとして凍結させ、残りの半分を同じ様式（５日、５μｇ／ｍＬのガンシクロビル）で選択した。ガンシクロビル選択後、残りの細胞を採取し、ガンシクロビル処置の前及び後の両方の試料からｇＤＮＡを抽出した。レンチウイルス構築物にスペーサー配列を含有する領域に隣接するプライマーを使用して、各ウェル内のスペーサーの比を選択の前及び後で比較した次世代シーケンシング分析用のアンプリコンを生成した。これらの比を使用して、選択前から選択後までのスペーサー頻度の倍率変化のｌｏｇ２を取ることによって、各競合に対するスペーサー適合性スコアを計算した。適合性を以下の方程式によって決定した：
適合性＝ｌｏｇ２（選択後のスペーサー頻度／選択前のスペーサー頻度）
結果：
ＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメイン並びにスペーサー１（２９．２０００）及び２（２９．１６８）を有するガイド１７４を含有するｄＸＲでの処置は、細胞生存を可能にし（図３）、一方で、モック、ＮＴ（０．０）、及びスペーサー３（２９．１６３）の条件は全て、細胞死をもたらした。スペーサー１及び２を利用する構築物の結果は、ｄＸＲ分子及びＣ９ｏｒｆ７２標的化スペーサーの組み合わせが強力な転写抑制を誘導し、治療的に関連する遺伝子座におけるｄＸＲ及びスペーサー効力を測定するプラットフォームとして、この系を確立することができることを実証する。
更に、表１８のスペーサー適合性の測定は、スペーサー１及び２の両方を利用する構築物が、細胞生存を可能にし、スペーサー２が、全ての競合においてスペーサー１よりも明らかに強力であったため、このアッセイの定量的かつ再現可能な性質を実証する。更に、スペーサー３を有する構築物は、ほぼ全ての競争において効果がなく、有効なスペーサーのスクリーニングにおけるこの系の有用性を実証している。
結果は、ｄＸＲ分子が治療的に関連する配列を転写的に抑制し、機能的スペーサーと非機能的スペーサーとを区別することができることを実証する。
実施例４：ｄＸＲ組成物に含むために改善されたリプレッサーを特定するための選択の開発
より良好なｄＸＲ分子を開発するために、多くの種由来の転写エフェクタードメインのライブラリーを選択アッセイで試験した。ＫＲＡＢドメインは、脊椎動物において最大かつ最も急速に進化したドメインの１つであるため、以前に評価されていない種由来のドメインは、抑制の強度及び持続性の改善をもたらすと予測された。
材料及び方法：
候補ＫＲＡＢドメインの特定：
Ｐｒｏｓｉｔｅアクセッションｐｓ５０８０５（ＫＲＡＢドメインのアクセッション番号）で注釈が付けられた全ての配列をダウンロードすることによって、ＫＲＡＢドメインを特定した。全てのドメインを１００個のアミノ酸だけ拡張して（注釈は中央を中心とする）、潜在的な注釈なしの機能配列を含んだ。更に、ドメインを特定するためのツールであるＨＭＭＥＲを、記載される（Ｗａｒｒｅｎ，ＷＣ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｈａｎｃｅ ｉｔｓ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７０，Ｉｓｓｕｅ ６５２３，ｅａｂｃ６６１７ｉｎ（２０２０）、Ｆｉｄｄｅｓ，ＩＴ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＣＡＴ）－ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｃｌａｄｅ ａｎｄ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２８（７）：１０２９（２０１８）、Ｍａｏ，Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｂｏｎｏｂｏ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｆｉｎｅｓ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｏｍｉｎｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５９４：７７（２０２１））ロングリード霊長類ゲノムアセンブリの最近完成したアラインメントからの高品質の霊長類注釈のセット上で実行して、これらのアセンブリでＫＲＡＢドメインを特定し、それらのほとんどは、ＵｎｉＰｒｏｔにおいて存在していなかった。検索は、１５９個の異なる生物由来の３２，１２０個の固有の配列をもたらし、それらは、抑制におけるそれらの効力について試験される。配列の完全なリストは、配列番号３５５～２１００及び２３３２～３３２３９として列挙される。更に、長さ８０残基の５８０個のランダムアミノ酸配列を陰性対照としてライブラリーに含み、３０４個のヒトＫＲＡＢドメインを、Ｔｙｃｋｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ．２０２０ Ｄｅｃ ２３；１８３（７）：２０２０－２０３５）による研究に基づいて含んだ。
スクリーニング方法：
上記のＫＲＡＢドメインをＤＮＡオリゴとして合成し、増幅し、スペーサー３４．２８又はスペーサー２９．１６８のいずれかを有するガイド足場１７４（配列番号２２３８）とともに、ｄＣａｓＸ４９１ Ｃ末端ＧＳリンカーレンチウイルス構築物にクローニングし、それらの両方は、それらのそれぞれの標的（すなわち、ＨＢＥＧＦ及びＧＦＰ－ＴＫ）を抑制し、上記の実施例に記載されるアッセイにおいて生存をもたらした。各ＫＲＡＢドメインについて、Ｃ末端ＧＳリンカーを同義的に置換して、ＮＧＳによって区別され得る固有のＤＮＡバーコードを生成し、内部の技術的複製がプールされた各実験で評価することを可能にした。これらのプラスミドを使用して、ライブラリーのレンチウイルス構築物を生成した。２９，１６８個のプラスミドを有するレンチウイルスライブラリーを使用して、ＧＦＰ－ＴＫ細胞を形質導入し、これを１μｇ／ｍＬのピューロマイシン、次いで、５μｇ／ｍＬのガンシクロビルで５日間処置して、形質導入されていない細胞を除去した。選択後、ｇＤＮＡを抽出し、生存細胞中にＫＲＡＢドメインを含有するｇＤＮＡを増幅し、配列決定した。
ＨＢＥＧＦを標的とするスペーサー３４．２８を有するレンチウイルスライブラリーで、類似のアッセイを実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入し、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで処置して、形質導入されていない細胞を除去し、２ｎｇ／ｍＬのジフテリア毒素で４８時間選択を行った。上記のようにｇＤＮＡを抽出し、増幅し、配列決定した。対照としてガンシクロビル又はジフテリア毒素で選択する前の細胞からのｇＤＮＡ試料も抽出し、増幅し、配列決定した。ジフテリア毒素及びＧＦＰ－ＴＫ選択の両方に対して、２つの独立した複製を実施した。
Ｂ２Ｍ抑制の評価：
代表的なＫＲＡＢドメインを、スペーサー７．１５（ＧＧＡＡＵＧＣＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＧＡＣ、配列番号５９６３４）を有するガイド足場３１６（配列番号５９３５２）とともに、ｄＣａｓＸ４９１ Ｃ末端ＧＳリンカーレンチウイルス構築物にクローニングし、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とした。別個に、代表的なＫＲＡＢドメインを、スペーサー７．３７（配列番号５７６４４）を有するガイド足場１７４（配列番号２２３８）とともに、ｄＣａｓＸ４９１ Ｃ末端ＧＳリンカーレンチウイルス構築物にクローニングし、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的化した。様々なＫＲＡＢドメインを有する、ｄＸＲをコードするレンチウイルスプラスミド構築物を、標準的な分子クローニング技術を使用して生成した。これらの構築物は、ｄＣａｓＸ４９１をコードする配列、及びＺＮＦ１０、ＺＩＭ３からのＫＲＡＢドメイン、又はライブラリーで試験したＫＲＡＢドメインのうちの１つを含んだ。クローニング及び配列検証された構築物をミディプレップし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のトランスフェクションの前に品質評価に供した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに３０，０００個の細胞の密度で播種した。翌日、各ウェルを、各々が異なるＫＲＡＢドメインを有するｄＸＲ構築物と、Ｂ２Ｍ遺伝子座に対する標的化スペーサーを有するｇＲＮＡと、を含有する１００ｎｇのｄＸＲプラスミドを有するリポフェクタミンを使用して一過性にトランスフェクトした。実験対照は、ＺＮＦ１０若しくはＺＩＭ３由来のＫＲＡＢドメイン、ライブラリー内にあったが、上位９５個若しくは１５９７個のＫＲＡＢドメインにはなかったＫＲＡＢドメイン、又はｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０を有するｄＸＲ構築物を含み、各々は、対応するＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを有する。各構築物を３連で試験した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで２日間選択した。トランスフェクションの７日後又は１０日後、ＨＬＡ免疫染色、続いてフローサイトメトリーを介してＢ２Ｍタンパク質発現を分析することによる編集抑制分析のために、細胞を採取した。Ｂ２Ｍ発現を、細胞表面上に発現されたＢ２Ｍ依存性ＨＬＡタンパク質を検出する抗体を使用することによって決定した。Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターを使用して、ＨＬＡ＋細胞を測定した。
データ分析：
試験されたＫＲＡＢライブラリーにおけるタンパク質配列の多様性を理解するために、３２，１２０個のＫＲＡＢドメインアミノ酸配列の初期ライブラリーに進化スケールモデリング（ＥＳＭ）形質転換体（ＥＳＭ－１ｂ）を適用して、配列の高次元表現を生成した（Ｒｉｖｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０２１ Ａｐｒ １３；１１８（１５））。次に、一様マニホールド近似と投影（ＵＭＡＰ）を適用して、データセットを配列多様性の二次元表現に削減した（ＭｃＩｎｎｅｓ，Ｌ．，Ｈｅａｌｙ，Ｊ．，ＡｒＸｉｖ ｅ－ｐｒｉｎｔｓ １８０２．０３４２６，２０１８）。この技術を使用して、ＫＲＡＢドメイン配列の７５個のクラスターを特定した。
ＳＴＲＥＭＥアルゴリズム（Ｂａｉｌｅｙ，Ｔ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０２１ Ｍａｒ ２４；３７（１８）：２８３４－２８４０）を使用して、タンパク質配列モチーフを生成して、強いリプレッサーが濃縮されたモチーフを特定した。
結果：
選択を実施して、最も強力な転写リプレッサーであった３２，１２０個の固有の配列のライブラリーからＫＲＡＢドメインを特定した。ジフテリア毒素選択は、より高い品質のＮＧＳライブラリーを生成し、したがって、更なる分析のために選択された。選択の前及び後のライブラリー内の各ＫＲＡＢドメインの存在量の倍率変化を、各バーコード－ＫＲＡＢ対について計算し、その結果、実験の２つの独立した複製は一緒に、各ＫＲＡＢドメインの適合性の１２回の測定値を表す。
図１６は、Ｔｙｃｋｏ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ．２０２０ Ｄｅｃ ２３；１８３（７）：２０２０－２０３５）によって実施されたＨＴ－動員実験の５日目の、ライブラリー全体、陰性対照としての役割を果たした無作為化配列、１超のｌｏｇ２（倍率変化）を有することが示されたＫＲＡＢドメインの陽性対照セットのｌｏｇ２（倍率変化）値の範囲を示す。図１６に示すように、ジフテリア毒素選択は、より強力なリプレッサーであったＫＲＡＢドメインに対して濃縮されることに成功した。陰性対照配列を、選択後にライブラリーから脱濃縮した。
選択後ライブラリーに再現可能に濃縮されたＫＲＡＢドメインを特定するために、０．０１未満のｐ値閾値及び２超のｌｏｇ２（倍率変化）閾値を設定した。１５９７個のＫＲＡＢドメインがこれらの基準を満たした。並べ替え検定及び多重検定の偽発見率調整を使用するＭＡＧｅＣＫアルゴリズムを介して、Ｐ値を計算した（Ｗｅｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１４；１５（１２）：５５４）。これらの上位１５９７個のＫＲＡＢドメインのｌｏｇ２（倍率変化）値を図１６に示し、アミノ酸配列、ｐ値、及びｌｏｇ２（倍率変化）値を以下の表１９に提供する。対照的に、Ｚｉｍ３は、１．７７８７のｌｏｇ２（倍率変化）を有し、標準Ｚｎｆ１０は、１．３６３７のｌｏｇ２（倍率変化）を有し、Ｔｙｃｋｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ．２０２０ Ｄｅｃ ２３；１８３（７）：２０２０－２０３５）で使用されたＺｎｆ１０ ＫＲＡＢドメインに対応する代替のＺｎｆ１０は、１．６１８２のｌｏｇ２（倍率変化）を有した。したがって、１５９７個の上位のＫＲＡＢドメインは、Ｚｎｆ１０及びＺｉｍ３よりも実質的に優れたリプレッサーであった。これらの上位のＫＲＡＢリプレッサーの多くは、Ｚｉｍ３及びＺｎｆ１０と比較して、Ｔｒｉｍ２８タンパク質との相互作用を安定化すると予測される残基を有するアミノ酸を含有した（Ｓｔｏｌｌ，Ｇ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２２．０３．１７．４８４７４６）
アミノ酸配列の多様性の幅を維持しながらＫＲＡＢドメインのリストを更に絞り込むために、各クラスターから最良のドメイン、並びに１５９７個のうちの上位２５個の最良のリプレッサーを選択することによって、９５個のリードドメインのセットを１５９７個のうちから選択した。これらの上位９５個のＫＲＡＢドメインを、以下に記載されるように、独立した抑制アッセイにおいてｌｏｇ２（倍率変化）、ｐ値、及び性能によって上位のドメインを選択することに基づいて、上位１０個に更に絞り込んだ。特定した上位１０個のＫＲＡＢドメインは、ドメイン＿７３７、ドメイン＿１０３３１、ドメイン＿１０９４８、ドメイン＿１１０２９、ドメイン＿１７３５８、ドメイン＿１７７５９、ドメイン＿１８２５８、ドメイン＿１９８０４、ドメイン＿２０５０５、及びドメイン＿２６７４９であった。
ｌｏｇ２（倍率変化）が最も高いＫＲＡＢドメインは、キングコブラ、Ｏｐｈｉｏｐｈａｇｕｓ ｈａｎｎａｈ（ドメイン＿２６７４９、配列番号５７７５５）由来であった。驚くべきことに、この配列は、ヒトＫＲＡＢドメインとは非常に異なり（わずか４１％の配列同一性を有する）、不十分なリプレッサードメインの配列クラスターにグループ化された。
選択で特定されたＫＲＡＢドメインが独立アッセイにおいて転写抑制を支持したことを検証するために、上位９５個及び１５９７個のＫＲＡＢドメインの代表的なメンバーを使用してｄＸＲ構築物を生成し、それらがＢ２Ｍ遺伝子座の転写を抑制する能力を試験した。図１７に示すように、形質導入の７日後、代表的な上位９５個又は１５９７個のＫＲＡＢドメインのうちの１つを除く全てを有するｄＸＲは、ＺＮＦ１０を有するｄＸＲよりも大きな程度までＢ２Ｍを抑制した。図１８に示すように、形質導入の１０日後、試験した代表的な上位９５個又は１５９７個のＫＲＡＢドメインを有するｄＸＲの大部分は、ＺＮＦ１０又はＺＩＭ３よりも大きな程度までＢ２Ｍを抑制した。標的遺伝子座のｄＸＲ抑制は、経時的に悪化する傾向があり、形質導入の１０日後は、ｄＸＲ抑制を測定する比較的遅い時点であると考えられる。したがって、上位９５個及び１５９７個のＫＲＡＢドメインを有するｄＸＲ構築物の多くが、形質導入後１０日ほど遅くに、ＺＮＦ１０又はＺＩＭ３に由来するＫＲＡＢドメインを有するｄＸＲよりも大きな程度までＢ２Ｍを抑制することができたことが、特に注目すべきである。
特定されたＫＲＡＢドメインが転写を抑制する優れた能力の基礎を更に理解するために、ＳＴＲＥＭＥアルゴリズムを使用して、上位１５９７個のＫＲＡＢドメインについてタンパク質配列モチーフを生成した。具体的には、上位１５９７個のＫＲＡＢドメインのアミノ酸配列を、０．０１未満のｐ値及び０未満のｌｏｇ２（倍率変化）値を有する１５０６個のＫＲＡＢドメインの負の訓練セットと比較することによって、５個のモチーフ（モチーフ１～５）を生成した。モチーフ１～５のロゴを図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、及び１９Ｅに提供する。更に、上位１５９７個のＫＲＡＢドメインを、１５９７個の配列に由来するシャッフルされた配列と比較することによって、４つのモチーフ（モチーフ６～９）を生成した。モチーフ６～９のロゴを図１９Ｆ、１９Ｇ、１９Ｈ、及び１９Ｉに提供する。
以下の表２０は、ＳＴＲＥＭＥによって計算された場合の、９個のモチーフの各々についての上位１５９７個のＫＲＡＢドメインにおけるモチーフと一致する配列のｐ値、Ｅ値（統計的有意性の尺度）、並びに数及び割合を提供する。表２１は、各モチーフの配列を提供し、モチーフ内の各位置に存在するアミノ酸残基を示す（Ｎ末端からＣ末端）。
特に、モチーフ６及び７は、上位１５９７個のＫＲＡＢドメインの１００％に存在した。モチーフ６における高度に保存された位置の多く（例えば、アミノ酸残基Ｌ１、Ｙ２、Ｖ５、Ｍ６、及びＥ８）は、Ｔｒｉｍ２８（Ｋａｐ１としても知られる）との界面を形成することが知られており、これは、転写抑制機構を遺伝子座に動員するのに関与する。同様に、モチーフ７の残基（Ｄ３、Ｖ４、Ｅ１１、Ｅ１２）は全て、Ｔｒｉｍ２８動員に寄与する。上位のＫＲＡＢドメインが濃縮されたと特定されたアミノ酸残基の多くは、Ｔｒｉｍ２８動員を強化すると考えられる。特に、これらの残基の一部は、一般的に使用されるＫＲＡＢドメインが欠けている。具体的には、モチーフ６と一致するＺＮＦ１０の部位では、第１の位置の残基は、ロイシンの代わりにバリンである。モチーフ７と一致するＺＩＭ３の部位では、１１位の残基は、グルタミン酸の代わりにグリシンである。全てのＫＲＡＢドメインに存在しない上記の他のモチーフの多くは、ＫＲＡＢの配列クラスターに特異的である追加かつ新規の抑制機構を表し得る。
まとめると、本明細書に記載される実験は、ｄＸＲ分子との関連で転写抑制を促進するのに有効である一連のＫＲＡＢドメインを特定した。これらのＫＲＡＢドメインは、ＺＮＦ１０及びＺＩＭ３よりも大きい程度まで転写を抑制した。最後に、最も強い転写リプレッサーであるＫＲＡＢドメインに関連するタンパク質配列モチーフが特定された。
実施例５：タンパク質レベルでのＰＴＢＰ１の抑制に関する触媒活性を伴わないＣａｓＸリプレッサー（ｄＸＲ）系の実証
様々なｄＸＲ構築物が、初代中脳星状細胞培養物中のＰＴＢＰ１（ポリピリミジントラクト結合タンパク質１）タンパク質の発現を抑制するように作用し得ることを実証するための実験を実施した。
材料及び方法：
レンチウイルスプラスミドクローニング：
ｄＸＲ分子をコードするレンチウイルスプラスミド構築物を、標準的な分子クローニング技術を使用して構築した。これらの構築物は、ガイドＲＮＡ足場バリアント１７４（配列番号２２３８）及びＰＴＢＰ１遺伝子座を標的とするスペーサー（表２３）又は非標的化（ＮＴ、スペーサー０．０）スペーサーとともに、ＺＮＦ１０ ＫＲＡＢドメインに連結された触媒活性を伴わないＣａｓＸタンパク質４９１（ｄＣａｓＸ４９１、配列番号１８）をコードする配列で構成された。これらのスペーサーは、マウスＰＴＢＰ１遺伝子のエクソン１、２、又は３のいずれかを標的とした。クローニング及び配列検証された構築物をミディプレップし、標準的な方法を使用して実施したレンチウイルス粒子の産生のためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のトランスフェクションの前に、品質評価に供した。
ＸＤＰ（ＣａｓＸ送達粒子）構築物のクローニング及び産生：
ＣａｓＸタンパク質バリアント４９１、ガイド足場１７４、及びＰＴＢＰ１を標的とするスペーサーをコードする配列を含むＸＤＰプラスミド構築物を、標準的な方法に従ってクローニングし、サンガーシーケンシングを通して検証した。
足場１７４及びＰＴＢＰ１標的化スペーサーを使用して、ＣａｓＸタンパク質バリアント４９１及びｇＲＮＡのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含有するＸＤＰを、懸濁液適合ＨＥＫ２９３Ｔ Ｌｅｎｔｉ－Ｘ細胞又は接着ＨＥＫ２９３Ｔ Ｌｅｎｔｉ－Ｘ細胞のいずれかを使用して産生した。ＸＤＰを産生するための方法は、ＷＯ２０２１／１１３７７２Ａ１に記載されており、参照によりその全体が組み込まれる。これらの粒子を生成するために使用される例示的なプラスミド（及びそれらの構成）を図４及び５に示す。
初代中脳マウス星状細胞の形質導入及びウェスタンブロッティング：
初代中脳マウス星状細胞を、ＮｂＡｓｔｒｏグリア培養培地中、６ウェルプレート形式で１ウェル当たり１５０，０００個の細胞で播種した。プレーティングの２日後、ＺＮＦ１０ ＫＲＡＢドメインに連結されたｄＣａｓＸ４９１、並びにＰＴＢＰ１を標的とするスペーサー（表２２）又は非標的化スペーサーを有するガイド足場１７４（配列番号２２３８）をコードするレンチウイルスパッケージングｄＸＲ２構築物で、細胞を形質導入した。陽性対照として、別個のウェルにおいて、触媒活性型ＣａｓＸ４９１及びＰＴＢＰ１標的化スペーサー２８．１０）を有するガイド１７４のＲＮＰを含有するＸＤＰ－２８．１０で、細胞を形質導入した。形質導入の１１日後に細胞を採取し、ペレット化し、標準的な方法に従って実施したウェスタンブロッティングのために、プロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。簡潔に述べると、変性タンパク質試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分解し、ゲルからＰＶＤＦ膜上に移し、ＰＴＢＰ１タンパク質について免疫ブロットした。ウェスタンブロットに基づくタンパク質定量化を、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用した密度測定によって定量化した。各実験条件についてのＰＴＢＰ１タンパク質／総タンパク質の比は、ＮＴスペーサーを有するｄＸＲを使用する条件について決定された比に対してｄＸＲが正規化され、結果を図６及び表２３に示す。
結果：
レンチウイルス粒子を介して送達された、異なるＰＴＢＰ１標的化スペーサーを有する様々なｄＸＲ構築物のうち、スペーサー２８．１６構築物を有するｄＸＲ及びｇＲＮＡを用いた処置が、ＰＴＢＰ１タンパク質レベルの低減を示した一方で、スペーサー２８．５、２８．９、２８．１０、又は２８．１１を有するガイドを有するｄＸＲ構築物は、ＮＴスペーサー（ｄＸＲ０．０）条件で決定されたタンパク質レベルに対して、タンパク質レベルにいかなる変化も示さなかった（図６、表２３）。具体的には、スペーサー２８．１６の使用は、ＮＴ対照に対してＰＴＢＰ１レベルのほぼ５０％の減少をもたらした（図６、表２３）。予想どおり、触媒活性型ＣａｓＸ ＲＮＰを含有するＸＤＰを用いた処置は、ＮＴ対照に対してＰＴＢＰ１タンパク質レベルの最も強い減少（７０％超）を示した（図６、表２３）。これらのデータは、ｄＸＲ分子及びＰＴＢＰ１標的化スペーサーを有するガイドが転写抑制を誘導することができ、それが、ＰＴＢＰ１タンパク質レベルの減少をもたらしたことを示す。
これらの実験からの結果は、ＰＴＢＰ１遺伝子座を標的とするｇＲＮＡを有するｄＸＲ分子が、インビトロで効率的に、治療的に関連するＰＴＢＰ１標的を転写的に抑制することができ、アッセイが、ＣａｓＸリプレッサー系における機能的スペーサーと非機能的スペーサーとを区別することができたことを実証する。
実施例６：Ｂ２Ｍ遺伝子座の持続的なサイレンシングを誘導するための、ＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｌ由来の追加のドメインと融合された触媒活性を伴わないＣａｓＸリプレッサー（ｄＸＲ）系の使用
ＫＲＡＢドメインで構成された３つのリプレッサードメイン、ＤＮＭＴ３Ａ由来の触媒ドメイン、及び触媒活性を伴わないＣａｓＸ４９１に融合されたＤＮＭＴ３Ｌ由来の相互作用ドメインを有する、合理的に設計されたエピジェネティックな長期ＣａｓＸリプレッサー（ＥＬＸＲ）分子が、インビトロで内在性Ｂ２Ｍ遺伝子座の持続的な長期抑制を誘導するかどうかを判断するための実験を実施した。更に、ｄＣａｓＸに対するエピジェネティックドメインの様々な配置を含有するＥＬＸＲ分子の複数の配置を設計して、それらの配置がＢ２Ｍ遺伝子座のサイレンシングの持続、並びにそれらのオンターゲットメチル化活性の特異性にどのように影響するかを評価した。
材料及び方法：
ＥＬＸＲ構築物の生成及びレンチウイルスプラスミドクローニング：
ＥＬＸＲ分子をコードするレンチウイルスプラスミド構築物を、標準的な分子クローニング技術を使用して構築した。これらの構築物は、触媒活性を伴わないＣａｓＸタンパク質４９１（ｄＣａｓＸ４９１）、ＺＮＦ１０又はＺＩＭ３由来のＫＲＡＢドメイン、並びにそれぞれＤＮＭＴ３Ａ（Ｄ３Ａ）及びＤＮＭＴ３Ｌ（Ｄ３Ｌ）由来の触媒ドメイン及び相互作用ドメインをコードする配列で構成された。簡潔に述べると、構築物をオリゴヌクレオチドとして順序付けし、重複伸長ＰＣＲ、続いて等温アセンブリによって組み立てた。結果として生じるプラスミド（表２４に列挙される主要なＥＬＸＲ要素の配列、及び表２５の選択プラスミド構築物）は、ＥＬＸＲ分子を生成するために様々な構成で位置付けられた構築物を含有した。ＥＬＸＲ分子のタンパク質配列を表２６に列挙し、ＥＬＸＲ構成を図７に示す。ＥＬＸＲ分子をコードする配列はまた、２×ＦＬＡＧタグを含有した。プラスミドはまた、内在性Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とするスペーサー又は非標的化対照（表２７に列挙されるスペーサー配列）のいずれかを有するｇＲＮＡ足場バリアント１７４をコードする配列を有した。これらの構築物を全て、レンチウイルスプラスミド上のＰ２Ａ－ピューロマイシン要素の上流でクローニングした。クローニング及び配列検証された構築物をミディプレップし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のトランスフェクションの前に品質評価に供した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション：
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに３０，０００個の細胞の密度で播種した。翌日、各々が、Ｂ２Ｍ遺伝子座に対して非標的化スペーサー０．０又は標的化スペーサー７．３７のいずれかを有するｇＲＮＡを有する、異なる構成のＥＬＸＲタンパク質（図７）をコードするｄＣａｓＸ：ｇＲＮＡ構築物を含有する１００ｎｇのＥＬＸＲバリアントプラスミドを有するリポフェクタミンを使用して、各ウェルを一過性にトランスフェクトした。具体的には、１つの実験について、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＥＬＸＲタンパク質番号１～３をコードするプラスミドでトランスフェクトし、第２の実験では、細胞を、ＥＬＸＲタンパク質番号１、４、及び５をコードするプラスミドでリポフェクトした（配列については、表２５を参照されたい）。両方の実験において、ＥＬＸＲ分子は、ＺＮＦ１０又はＺＩＭ３のいずれかのＫＲＡＢドメインを有した。実験対照は、ｄＣａｓＸ４９１（ＺＮＦ１０リプレッサードメインあり又はなし）、触媒活性型ＣａｓＸ４９１、並びに各々が同じＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ又は非標的化ｇＲＮＡを有するＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメイン及びＤＮＭＴ３Ａ／Ｌドメインの両方に融合された触媒活性を伴わないＣａｓ９を含んだ。各構築物を３連で試験した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで２日間選択した。トランスフェクションの６日後、ＨＬＡ免疫染色、続いてフローサイトメトリーを介してＢ２Ｍタンパク質発現を分析することによる２～３日毎の抑制分析のために、細胞を採取した。Ｂ２Ｍ発現を、細胞表面上に発現されたＢ２Ｍ依存性ＨＬＡタンパク質を検出する抗体を使用することによって決定した。Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターを使用して、ＨＬＡ＋細胞を測定した。更に、別の実験では、ＥＬＸＲバリアントプラスミド及びＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ又は非標的化ｇＲＮＡで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、バイサルファイトシーケンシングのためのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）抽出のために、リポフェクションの５日後に採取した。
標的遺伝子座でのオフターゲットメチル化レベルによって測定されたＥＬＸＲ特異性を評価するためのバイサルファイトシーケンシング：
Ｂ２Ｍ遺伝子座でのオフターゲットメチル化レベルを決定するために、採取された細胞由来のｇＤＮＡを、Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓキットを製造業者の指示に従って使用して抽出した。次いで、抽出されたｇＤＮＡを、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を製造業者のプロトコルに従って使用したバイサルファイト変換に供し、任意の非メチル化シトシンをウラシルに変換した。結果として生じるバイサルファイト処置ＤＮＡを、その後、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して配列決定し、Ｂ２Ｍ及びＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットメチル化のレベルを決定した。
ＮＧＳ処理及び分析：
標的アンプリコンを、目的のバイサルファイト変換標的位置（ヒトＢ２Ｍ及びＶＥＧＦＡ遺伝子座）に特異的なプライマーのセットを用いたＰＣＲを介して、１００ｎｇのバイサルファイト処置ＤＮＡから増幅した。これらの遺伝子特異的プライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）アダプターを導入するために、５’末端に追加の配列を含有した。増幅されたＤＮＡ生成物を、Ｃｙｔｉｖａ Ｓｅｒａ－Ｍａｇ Ｓｅｌｅｃｔ ＤＮＡクリーンアップキットで精製した。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）Ｍｉｓｅｑ（商標）上で、製造業者の指示に従ってアンプリコンを配列決定した。配列決定からの未加工のｆａｓｔｑファイルを、Ｂｉｓｍａｒｋ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅａｄ Ｍａｐｐｅｒ及びＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎコーラーを使用して処理した。バイサルファイト処置ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、全てのウラシルヌクレオチドをチミンに変換し、ＰＣＲ産物の配列決定は、各ＥＬＸＲ分子によって媒介されるＢ２Ｍ及びＶＥＧＦＡ遺伝子座での潜在的なオフターゲットメチル化のレベルを読み出しとして、シトシンからチミンへの変換速度を決定する。
結果：
異なる構成のＥＬＸＲタンパク質（図７）をコードするＥＬＸＲバリアントプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトして、合理的に設計されたＥＬＸＲ分子がインビトロで標的Ｂ２Ｍ遺伝子座の遺伝子発現を遺伝的にサイレンシングすることができたかどうかを判断した。図８Ａ及び８Ｂは、ＥＬＸＲタンパク質番号１～３によって媒介されるＢ２Ｍタンパク質抑制を評価する経時的実験の結果を示し、それらの各々は、ＺＮＦ１０（図８Ａ）又はＺＩＭ３（図８Ｂ）由来のＫＲＡＢドメインを保有した。表２８は、トランスフェクションの５０日後の各状態についてＨＬＡ陰性（Ｂ２Ｍ発現の枯渇を示す）として特性評価された細胞の平均割合を示す。結果は、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡを有する全てのＥＬＸＲ分子が、インビトロで５０日間、維持されたＢ２Ｍ抑制を実証することができたが、抑制の効力が、ＫＲＡＢドメイン及びＥＬＸＲ配置の選択によって変化したことを示す。例えば、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを有すると、ＥＬＸＲタンパク質はＺＮＦ１０－ＫＲＡＢを有するよりも有効なリプレッサーとなり、この効果は、ＥＬＸＲ番号２に対して最も顕著に観察された（図８Ａを図８Ｂと比較する）。更に、ＤＮＭＴ３Ａ／ＬドメインをｄＣａｓＸ４９１のＮ末端に位置付けること（ＥＬＸＲ番号１）は、ｄＣａｓＸ４９１のＣ末端にＤＮＭＴ３Ａ／Ｌドメインを有するＥＬＸＲ（ＥＬＸＲ番号２及び番号３、図８Ａ及び８Ｂ）によって媒介される効果と比較して、Ｂ２Ｍ発現のより安定したサイレンシングをもたらした。これらの結果はまた、２つのタイプのリプレッサードメイン（すなわち、ＥＬＸＲ番号２のｄＣａｓＸ４９１－ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌ対ＥＬＸＲ番号３のｄＣａｓＸ４９１－ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌ－ＫＲＡＢ）の相対的な位置付けが、両方の構成がｄＣａｓＸ４９１のＣ末端融合であるにもかかわらず、ＥＬＸＲ分子の全体的な効力にも影響を及ぼし得たことを明らかにした（ＥＬＸＲ番号２及び番号３、図８Ａ及び８Ｂ）。
第２の経時的実験では、持続的なＢ２Ｍ抑制をＥＬＸＲタンパク質番号１、番号４、及び番号５について評価し、ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌ及びＫＲＡＢドメインの両方を、ＥＬＸＲ番号４及び番号５（図７）についてｄＣａｓＸ４９１のＮ末端に位置付けた。表２９は、リポフェクションの７３日後の各状態についてのＨＬＡ陰性細胞の平均割合を示す。第１の時間経過で同様に見られるように、Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを有する全てのＥＬＸＲ条件は、Ｂ２Ｍ遺伝子座の持続的なサイレンシングを維持した（図９Ａ及び９Ｂ、表２９）。実際に、この実験の結果は、ＥＬＸＲ番号５が、インビトロで７３日間、ＥＬＸＲ番号１又はＥＬＸＲ番号４によって達成されたものと比較して、最高レベルのＢ２Ｍ抑制を達成及び維持することができたことを示す（図９Ａ及び９Ｂ）。更に、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢを含有するＥＬＸＲ番号４も、そのＥＬＸＲ番号１対応物よりも優れているように見えた（図９Ｂ）。上述の両方の経時的実験について、ＣａｓＸ４９１媒介編集が、Ｂ２Ｍ発現の持続的なサイレンシングをもたらした一方で、ＫＲＡＢドメインのみをｄＣａｓｘ４９１（ｄＣａｓＸ４９１－ＺＮＦ１０）に融合するＸＲ構築物は、一過性Ｂ２Ｍノックダウンをもたらしただけであった。
ＥＬＸＲ分子内のＤＮＭＴ３Ａ／Ｌドメインによって媒介されるＢ２Ｍ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の程度を評価するために、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを含有するＥＬＸＲタンパク質番号１～３で処置され、リポフェクションの５日後に採取されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを使用して、バイサルファイトシーケンシングを実施した。図１０は、バイサルファイトシーケンシングからの結果を示し、具体的には、各実験条件についての、ある特定のレベルのＣｐＧメチル化を有したＢ２Ｍ遺伝子座の転写開始部位の周囲のＣｐＧ部位の数の分布を示す。結果は、ＥＬＸＲ番号１が、最も強いオンターゲットＣｐＧメチル化活性（ＥＬＸＲ１－ＺＩＭ３ ７．３７）を実証した一方で、それが、最も高いレベルのオフターゲットＣｐＧメチル化（ＥＬＸＲ１－ＺＩＭ３ ＮＴ）を誘導したことを明らかにした。ＥＬＸＲ番号２及びＥＬＸＲ番号３は、より弱いオンターゲットＣｐＧメチル化活性を示したが、比較的より低いオフターゲットメチル化を示した（図１０）。図１１は、ＣａｓＸ４９１及びｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌに対してベンチマークされたＥＬＸＲタンパク質番号１～３の活性－特異性プロファイルをマッピングした散布図であり、活性を２１日目にＨＬＡ陰性細胞の平均割合として測定し、特異性を、５日目に定量化されたＢ２Ｍ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合によって表した。
ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌドメインによって媒介されるオフターゲットＣｐＧメチル化の程度を、図１０についてすでに使用されたのと同じ抽出されたｇＤＮＡを使用したバイサルファイトシーケンシングを実施することによって、異なる遺伝子座、すなわち、ＶＥＧＦＡでのＣｐＧメチル化のレベルを評価することによって更に評価した。図１２のバイオリンプロットは、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメイン及びＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを含有するＥＬＸＲタンパク質番号１～３で処置された細胞中のＶＥＧＦＡ遺伝子座でのＣｐＧメチル化を有するＣｐＧ部位の分布を示す、バイサルファイトシーケンシング結果を示す。結果は更に、ＥＬＸＲ番号１の使用が、最高レベルのオフターゲットＣｐＧメチル化をもたらしたことを実証し、図１０で先に示されたデータを裏付けている。比較すると、ＥＬＸＲ番号２又はＥＬＸＲ番号３のいずれかの使用は、－３遺伝子座での実質的により低いオフターゲットメチル化をもたらした（図１２）。
ＥＬＸＲ分子番号１、番号４、及び番号５についてのＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の程度も分析した。図１３Ａ～１３Ｂは、ＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメイン又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメイン及び非標的化ｇＲＮＡ（図１３Ｂ）又はＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ（図１３Ａ）のいずれかを含有するＥＬＸＲ番号１、４、及び５で処置された細胞中のＶＥＧＦＡ遺伝子座でのＣｐＧメチル化部位の分布を示す、バイサルファイトシーケンシング結果を示す。図１３Ｂは、ＥＬＸＲ４－ＺＮＦ１０、ＥＬＸＲ５－ＺＦＮ１０、又はＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３の使用が、ＥＬＸＲ１－ＺＮＦ１０又はＥＬＸＲ１－ＺＩＭ３の使用と比較して、ＶＥＧＦＡ遺伝子座での著しくより低いオフターゲットＣｐＧメチル化をもたらしたことを示す。同様に、図１３Ａは、ＫＲＡＢドメインのいずれかを有するＥＬＸＲ番号４又はＥＬＸＲ番号５の使用が、ＥＬＸＲ１－ＺＮＦ１０との使用と比較して、実質的により低いレベルのオフターゲットＣｐＧメチル化部位をもたらしたことを示す。図１３Ａ及び１３Ｂの両方に示されるように、ＥＬＸＲ番号１によって実証された非特異的ＣｐＧメチル化のレベルは、ｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌベンチマークによって達成されたものと同等である。
図１４は、ＣａｓＸ４９１及びｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌに対してベンチマークされたＺＮＦ１０－ＫＲＡＢドメイン又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインのいずれかを含有するＥＬＸＲ分子番号１～５の活性－特異性プロファイルをマッピングした散布図であり、活性を２１日目のＨＬＡ陰性細胞の平均割合として測定し、特異性を５日目の検出されたＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合中央値によって表した。データは、評価した５つのＥＬＸＲ分子のうち、ＥＬＸＲ番号５の使用が最高レベルの抑制活性をもたらした一方で、ＥＬＸＲ番号４の使用が最高レベルの特異性をもたらしたことを示す。
実験は、合理的に操作されたＥＬＸＲ分子が、内在性Ｂ２Ｍ遺伝子座を転写的かつ遺伝的に抑制することができ、標的タンパク質の維持された枯渇をもたらすことを実証する。結果はまた、ＫＲＡＢドメインの選択、並びにＤＮＭＴ３Ａ／Ｌドメインの位置及び相対配置が、標的遺伝子座を持続的にサイレンシングする際のＥＬＸＲ分子の全体的な効力及び特異性に影響を与え得たことも示す。
実施例７：合理的に操作された、改善されたＥＬＸＲバリアントの活性及び特異性を評価するための機能的スクリーニングの開発
改善された抑制活性及び標的メチル化特異性を有するＥＬＸＲバリアントを操作するために、プールされたスクリーニングアッセイを開発する。簡潔に述べると、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインの系統的変異導入を実施して、様々な機能アッセイを使用して改善されたＥＬＸＲバリアントについてスクリーニングするために、ＥＬＸＲ分子で試験されるＤＮＭＴ３Ａバリアントのライブラリー（配列番号３３６２５～５７５４３）を生成する。
材料及び方法：
ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインバリアントのライブラリーの生成：
以下の方法を使用して、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインバリアントのＤＭＥライブラリーを構築する。スクリーニングに使用されるデスティネーションベクターと互換性のある制限部位が隣接したＤＮＭＴ３Ａ配列を有するように、ステージングベクターを生成する。ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン配列を５つの約２００ｂｐの断片に分割し、各断片をオリゴヌクレオチドプールとして合成する。各オリゴヌクレオチドプールを、３つの異なるタイプの修飾ライブラリーを含有するように構築する。第１に、１９個の考えられるアミノ酸変異をコードする１９個の考えられる代替のコドンのうちの１つで置き換えられるＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン断片の各コドンをもたらす、置換オリゴヌクレオチドライブラリー。第２に、系統的に除去されてそのアミノ酸を欠失させる断片の各コドンをもたらす、欠失オリゴヌクレオチドライブラリーが調製される。第３に、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン断片の全ての位置に２０個の考えられるコドンのうちの１つを挿入する、挿入オリゴヌクレオチドライブラリーが調製される。これらのオリゴヌクレオチドプールを増幅し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応及びＰＣＲ生成骨格を使用してステージングベクターにクローニングする。次いで、プールされたＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインＤＭＥライブラリーを、ライブラリー増幅前に制限酵素消化及びライゲーションを介して、実施例６に記載されるＥＬＸＲ分子をコードするレンチウイルスＥＬＸＲ構築物に移す。適切なライブラリー範囲を決定するために、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインＤＭＥの各断片を、遺伝子特異的プライマーで別々にＰＣＲ増幅し、その後に、重複するペアエンドシーケンシングを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）Ｍｉｓｅｑ（商標）上のＮＧＳが続いた。
ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインＤＭＥライブラリーを使用して生成されたＥＬＸＲバリアントのハイスループットスクリーニング：
レンチウイルスの産生及び力価の標準プロトコルに従った後、結果として生じるＥＬＸＲバリアントのレンチウイルスライブラリーを、異なるハイスループット機能的スクリーニングに供する。これらの機能的スクリーニングを以下に簡潔に記載する。
特異性に焦点を合わせたスクリーニングは、オフターゲットメチル化が減少したＥＬＸＲ分子をもたらすＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインバリアントを特定することを目的とする。例えば、インビトロドロップアウトアッセイを使用して、有害な非特異的メチル化を誘導しないＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインバリアントを特定することができる。ＤＮＭＴ３Ａの過剰発現は、細胞の生存及び増殖に重要な遺伝子の抑制の増加に起因する可能性がある、細胞成長に悪影響を与える外来性メチル化をもたらす。このアッセイでは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、低い感染多重度（ＭＯＩ）においてレンチウイルスＥＬＸＲライブラリーで形質導入し、形質導入細胞の初期集団を、ピューロマイシンで５日間選択する前に採取する。選択後、複数の時点の集団を５、７、１０、及び１４日目に採取し、ｇＤＮＡを全ての集団から抽出し、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインバリアントを含有する標的アンプリコンのＰＣＲ増幅及びＮＧＳシーケンシングに供する。初期集団と最終集団との間のライブラリー組成物の読み出しを比較すると、細胞の生存性及び成長をもたらす非有害なＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインバリアントが得られる。並行して、非標的化ＥＬＸＲ分子の過剰発現が、オフターゲットの全体的なメチル化によるＧＦＰ抑制をもたらす、ＧＦＰに結合されたメチル化感受性プロモーターが開発されている。したがって、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインＤＭＥライブラリーが、これらのメチル化感受性レポーターを有する細胞株に形質導入され、ＧＦＰレベルの定量化により、経時的にオフターゲットメチル化を引き起こすＥＬＸＲバリアントの評価及び特定が可能になる、直交スクリーニングを実施する。
活性に焦点を合わせたスクリーニングは、オンターゲットメチル化活性が高まったＥＬＸＲ分子を明らかにするＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインバリアントを特定することを目的とする。ここで、このアプローチは、ＤＮＡメチル化の広がりを利用して、近くのプロモーターの活性を潜在的に抑制して、ＥＬＸＲ特異的スペーサーを特定し、より早い時点でＥＬＸＲ分子活性を評価することができる。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ懸濁細胞を、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とするスペーサーを有するレンチウイルスＥＬＸＲライブラリーで形質導入し、ピューロマイシンで５日間選択する。選択後、Ｂ２Ｍタンパク質発現を免疫染色によって測定し、Ｂ２Ｍ抑制を示す細胞（ＨＬＡ陰性細胞によって示される）をＦＡＣＳによって選別する。ゲノムＤＮＡを、ＮＧＳ分析のためにソーティングされたＨＬＡ陰性細胞から抽出する。各バリアントの濃縮スコアは、選別された集団における変異の頻度をナイーブ細胞と比較して、Ｂ２Ｍ発現をより強力に抑制するＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインバリアントを特定することによって計算され得る。
ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインバリアントのライブラリーをスクリーニングすることに加えて、上の実施例４に記載されるＫＲＡＢリプレッサードメインのライブラリーを並行してスクリーニングすることは、改善された活性及び特異性プロファイルを有するＥＬＸＲバリアントを特定するのに役立つ。
本実施例に記載される実験は、改善された持続的な抑制活性及び特異性を有する追加のＥＬＸＲリードを特定することが予想される。これらの改善されたＥＬＸＲ分子は、開発のためのリード候補を更に特性評価及び特定するために、目的の治療標的に対して様々な細胞型で試験される。
実施例８：触媒活性を伴わないＣａｓＸがインビトロで内在性Ｂ２Ｍ遺伝子座において編集しないことの実証
触媒活性を伴わないＣａｓＸがインビトロアッセイにおいて内在性Ｂ２Ｍ遺伝子を編集することができないことを実証するための実験を実施した。
材料及び方法：
触媒活性を伴わないＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）構築物の生成及びクローニング：
これらの実験では、ｇＲＮＡ足場バリアント１７４を有するＣａｓＸバリアント４９１、５２７、６６８、及び６７６を使用した。触媒活性を伴わないＣａｓＸ４９１（ｄＣａｓＸ４９１、配列番号１８）及び触媒活性を伴わないＣａｓＸ５２７（ｄＣａｓＸ５２７、配列番号２４）を生成するために、ＣａｓＸバリアント４９１のＲｕｖＣドメインのＤ６５９、Ｅ７５６、Ｄ９２１触媒残基、並びにＣａｓＸバリアント５２７のＲｕｖＣドメインのＤ６６０、Ｅ７５７、及びＤ９２２触媒残基をアラニンに変異させて、エンドヌクレアーゼ活性を消滅させた。同様に、ＣａｓＸバリアント６６８及び６７６のＲｕｖＣドメイン内の触媒残基におけるＤ６６０、Ｅ７５７、Ｄ９２３からアラニンへの変異を、触媒活性を伴わないＣａｓＸ６６８（ｄＣａｓＸ６６８、配列番号５９３５５）及び触媒活性を伴わないＣａｓＸ６７６（ｄＣａｓＸ６７６、配列番号５９３５７）を生成するように設計した。結果として生じるプラスミドは、以下の構成を有する構築物を含有した：Ｅｆ１α－ＳＶ４０ＮＬＳ－ｄＣａｓＸバリアント－ＳＶ４０ＮＬＳ。プラスミドはまた、Ｂ２Ｍ標的化スペーサー（スペーサー７．３７、ＧＧＣＣＧＡＧＡＵＧＵＣＵＣＧＣＵＣＣＧ、配列番号５９６２８）又は非標的化スペーサー対照（スペーサー０．０、ＣＧＡＧＡＣＧＵＡＡＵＵＡＣＧＵＣＵＣＧ、配列番号５９６３０）を有するｇＲＮＡ足場バリアント１７４をコードする配列を含有した。
触媒活性を伴わないＣａｓＸバリアント（ｄＣａｓＸ４９１、ｄＣａｓＸ５２７、ｄＣａｓＸ６６８、及びｄＣａｓＸ６７６）をコードするプラスミドを、標準的な分子クローニング方法を使用して生成し、サンガーシーケンシングを使用して検証した。配列検証された構築物を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのその後のトランスフェクションのためにミディプレップした。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのプラスミドトランスフェクション：
約３０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、翌日、Ｂ２Ｍ遺伝子座に対して非標的化スペーサー０．０又は標的化スペーサー７．３７のいずれかを有するｇＲＮＡを有する、ｄＣａｓＸ４９１、ｄＣａｓＸ５２７、ｄＣａｓＸ６６８、又はｄＣａｓＸ６７６（表４の配列）をコードするｄＣａｓＸ：ｇＲＮＡ構築物を含有するプラスミドで、細胞を一過性にトランスフェクトした。各構築物を３連で試験した。トランスフェクションの２４時間後、細胞をピューロマイシンで選択し、トランスフェクションの６日後、細胞をＮＧＳによるＢ２Ｍ遺伝子座での編集分析のために採取した。以下の実験対照もこの実験に含んだ：１）Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ又は非標的化ｇＲＮＡを有する触媒活性型ＣａｓＸ４９１、２）適切なｇＲＮＡを伴うＣａｓ９の触媒活性を伴わないバリアント（ｄＣａｓ９）、及び３）モック（プラスミドなし）トランスフェクション。
ＮＧＳ処理及び分析：
Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓキットを製造業者の指示に従って使用して、ｇＤＮＡを採取された細胞から抽出した。標的アンプリコンを、ヒトＢ２Ｍ遺伝子座に特異的なプライマーのセットを用いて抽出ｇＤＮＡから増幅した。これらの遺伝子特異的プライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）アダプター及び１６ヌクレオチド一意分子識別子を導入するために、５’末端に追加の配列を含有した。Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ ＤＮＡクリーンアップキットを用いて、増幅ＤＮＡ産物を精製した。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）Ｍｉｓｅｑ（商標）上で、製造業者の指示に従ってアンプリコンを配列決定した。配列決定からの未加工ｆａｓｔｑファイルを、品質管理し、ｃｕｔａｄａｐｔ ｖ２．１、ｆｌａｓｈ２ ｖ２．２．００、及びＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ ｖ２．０．２９を使用して処理した。各配列を、スペーサーの３’末端の周囲のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とした３０ｂｐウィンドウ）に、参照配列に対する挿入又は欠失（インデル）を含有するために定量化した。ＣａｓＸ活性を、各試料について、このウィンドウ内の任意の場所に挿入、置換、及び／又は欠失を含むリードの総割合として定量化した。
結果：
図１５のプロットは、編集分析の結果、具体的には、示された治療条件の各々についてＮＧＳによって検出されたインデル速度として測定された、Ｂ２Ｍ遺伝子座における編集パーセントを示す。データは、８０％超の編集が、触媒活性型ＣａｓＸ４９１によって媒介されるＢ２Ｍ遺伝子座で達成されたことを実証する。一方で、ｄＣａｓＸ４９１、ｄＣａｓＸ５２７、ｄＣａｓＸ６６８、及びｄＣａｓＸ６７６は、Ｂ２Ｍ標的化スペーサーを有するＢ２Ｍ遺伝子座での編集を示さなかった。
この実験の結果は、触媒活性を伴わないＣａｓＸが、インビトロで内在性標的遺伝子座において編集しないことを実証する。
実施例９：ＥＬＸＲ分子の使用が内在性ＣＤ１５１遺伝子の持続的なサイレンシングを誘導することができることの実証
ＥＬＸＲ分子が、細胞ベースのアッセイにおいて、代替の内在性遺伝子座、すなわち、ＣＤ１５１遺伝子の長期抑制を誘導することができることを実証するための実験を実施した。
材料及び方法：
ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを含有するＥＬＸＲ分子番号１、番号４、及び番号５（具体的な構成については図７、及びコード配列については表２５を参照されたい）をこの実験で評価した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション：
各々が、内在性細胞表面受容体をコードするＣＤ１５１遺伝子を標的とする４つの異なるｇＲＮＡ（表３０に列挙されるスペーサー配列）を有する、ＥＬＸＲ分子番号１、番号４、又は番号５をコードするＥＬＸＲ：ｇＲＮＡ構築物を含有する１００ｎｇのＥＬＸＲバリアントプラスミドで、播種されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトした。翌日、細胞をピューロマイシンで４日間選択した。細胞を、トランスフェクション後６日目、１５日目、及び２２日目に抑制分析のために採取した。ＣＤ１５１免疫標識を介してＣＤ１５１タンパク質発現のレベルを定量化することによって、続いて、Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーによって、抑制分析を実施した。実験対照として、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞も、（表３０に列挙される標的化スペーサー１～３を有する）適切なＣＤ１５１標的化ｇＲＮＡを有するｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌでトランスフェクトした。図２０Ａは、表３０に列挙される標的化スペーサーの相対位置を示す概略図である。
結果：
ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ番号１、番号４、及び番号５をコードするＥＬＸＲバリアントプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトして、これらのＥＬＸＲ分子が、細胞ベースのアッセイにおいて標的ＣＤ１５１遺伝子の発現を持続的にサイレンシングすることができたかどうかを判断した。ＥＬＸＲによる結果として生じるＣＤ１５１ノックダウンの定量化を図２０Ｂに示す。データは、４つの試験された標的化スペーサーのうち３つの使用が、様々なレベルのノックダウンにもかかわらず、トランスフェクション後２２日間のＣＤ１５１遺伝子座の持続的なサイレンシングをもたらしたことを実証する。具体的には、標的化スペーサー３９．１を有するＥＬＸＲ番号１、番号４、又は番号５の使用は、他の標的化スペーサーを使用した場合に達成されるものと比較して、最も強い持続性のＣＤ１５１ノックダウンをもたらした（図２０Ｂ）。結果はまた、ＥＬＸＲ番号５の使用が、試験されたスペーサーにわたってトランスフェクション後１５日目及び２２日目に観察可能な最も強い抑制活性をもたらしたことを示す（図２０Ｂ）。ＥＬＸＲ番号５及びスペーサープール又はｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌ及び適切なｇＲＮＡを用いたトランスフェクションは同様に、ＣＤ１５１遺伝子座の持続的なサイレンシングをもたらした。
この実験の結果は、ＥＬＸＲ分子がインビトロで代替の内在性遺伝子座の遺伝的サイレンシングを誘導することができることを実証する。更に、結果は、ＥＬＸＲ番号５分子の使用が、試験された様々なＥＬＸＲ構成の中で最高の抑制活性をもたらしたことを示し、ＤＮＭＴ３Ａ／Ｌドメインの位置及び相対配置が、標的遺伝子座でのＥＬＸＲ分子の全体的な活性に影響を及ぼすことを示している。
実施例１０：ＥＬＸＲがｄＸＲと比較してより広い標的化ウィンドウを有することの実証
遺伝子プロモーターでのＥＬＸＲ分子の標的化ウィンドウを決定するための、及びＥＬＸＲがｄＸＲ分子と比較してより幅広い標的化ウィンドウを有することを実証するための実験を実施した。先の実施例に記載されるように、ｄＸＲが、ＫＲＡＢリプレッサードメインと融合されたｄＣａｓＸである一方で、ＥＬＸＲは、ＫＲＡＢドメイン、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメイン、及びＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメインと融合されたｄＣａｓＸである。
材料及び方法：
実施例６に記載されるＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを含有するＥＬＸＲ番号１、及び実施例１に記載されるｄＸＲ１を、この実験で評価した。この実験では、Ｂ２Ｍ標的化スペーサーを含有する足場１７４を有する様々なｇＲＮＡを使用した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション：
Ｂ２Ｍプロモーターの約１ＫＢ領域にわたってタイル表示された９つの異なる標的化ｇＲＮＡ（表３１に列挙されるスペーサー配列）とともに、ＸＲ１又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを含有するＥＬＸＲ番号１のいずれかをコードするＣａｓＸ：ｇＲＮＡ構築物を含有する１００ｎｇのプラスミドで、播種されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をリポフェクトした。翌日、細胞をピューロマイシンで更に４日間選択した。実施例６に記載されるように、細胞をリポフェクションの６日後に採取し、フローサイトメトリーによってＢ２Ｍタンパク質発現を決定した。非標的化ｇＲＮＡを有するＥＬＸＲ番号１又はｄＸＲ１のいずれかでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、実験対照として含んだ。図２１Ａは、Ｂ２Ｍプロモーターの約１ＫＢウィンドウ内の様々なＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ（表３１に列挙されるスペーサー）のタイル表示を示す概略図である。
結果：
ＥＬＸＲ分子の標的化ウィンドウを決定し、かつｄＸＲ分子と比較するために、Ｂ２Ｍプロモーターの約１ＫＢ領域にわたってタイル表示された様々なＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを有する、ＥＬＸＲ番号１又はｄＸＲ１のいずれかをコードするプラスミドで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした（表３１）。図２１Ｂは、様々なＢ２Ｍ標的化スペーサーについて、ｄＸＲ１によって媒介されるものと比較して、ＥＬＸＲ番号１によって媒介されるＢ２Ｍタンパク質抑制（ＨＬＡ陰性として特性評価された細胞の平均割合によって示される）を評価する実験の結果を示すプロットである。データは、ＥＬＸＲ番号１が、ｄＸＲ１で観察されたものと比較して、より多くの標的化スペーサーで実質的なＢ２Ｍ抑制を誘導することができたことを実証する（図２１Ｂ）。具体的には、ｄＸＲ１で見られる効果とは異なり、ＥＬＸＲ番号１は、スペーサー７．１６０、７．１６３、７．１６４、及び７．１６５で大きなＢ２Ｍ抑制を達成することができ、これら４つのスペーサーがＢ２Ｍ遺伝子座におけるＥＬＸＲ特異的スペーサーであることを示唆している。予想どおり、ＥＬＸＲ番号１及びｄＸＲ１の両方は、スペーサー７．３７でＢ２Ｍタンパク質発現の著しい減少、及び非標的化スペーサーでごくわずかな減少を誘導することができた（図２１Ｂ）。
この実験の結果は、ＥＬＸＲ分子が、ｄＸＲ分子と比較して、標的遺伝子座においてより幅広い標的化ウィンドウを有すること、及びＥＬＸＲが、標的遺伝子の抑制を誘導するために遺伝子プロモーターからより長い距離で機能することができることを実証する。
実施例１１：ＤＮＭＴ３Ａ由来のＡＤＤドメインの包含がＥＬＸＲ分子の活性及び特異性を強化することの実証
ＤＮＭＴ３Ａは、そのＣ末端メチルトランスフェラーゼドメインに加えて、その機能及びクロマチンへの動員を調節する２つのＮ末端ドメイン、すなわち、ＡＤＤドメイン及びＰＷＷＰドメインを含有する。ＰＷＷＰドメインは、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３を含むメチル化ヒストンテールと相互作用することが報告されている。ＡＤＤドメインは、２つの主要な機能を有することが知られている：１）メチルトランスフェラーゼ自己阻害ドメインとして機能することによってＤＮＭＴ３Ａの触媒活性をアロステリックに調節する、及び２）非メチル化Ｈ３Ｋ４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ０）を認識する。Ｈ３Ｋ４ｍｅ０マークとＡＤＤドメインの相互作用は、ＤＮＭＴ３Ａの触媒部位を明らかにし、それによって、活性ＤＮＭＴ３Ａをクロマチンに動員して、これらの部位でデノボメチル化を行う。
ＡＤＤドメインのこれらの機能を考えると、ＡＤＤドメインを含むことがＥＬＸＲ分子の活性及び特異性を強化し得た可能性がある。ここで、実施例６で前述されたＥＬＸＲ番号５分子へのＡＤＤドメインの組み込みが、標的遺伝子座の長期抑制の改善及びオフターゲットメチル化の低減をもたらすかどうかを評価するための実験を実施した。ＥＬＸＲ活性及び特異性に対する、ＡＤＤドメインとともにＰＷＷＰドメインを組み込む効果も評価した。
材料及び方法：
ＥＬＸＲ構築物の生成及びプラスミドクローニング：
ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ番号５構築物のバリアント（ＥＬＸＲ番号５．Ａ、ＥＬＸＲ番号５の構成については図７を参照されたい）をコードするプラスミド構築物を、標準的な分子クローニング技術を使用して構築した。得られた構築物は、ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３の以下の４つの代替の変形のうちの１つをコードする配列で構成され、追加のＤＮＭＴ３Ａドメインが組み込まれた：１）ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３＋ＡＤＤ、２）ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３＋ＡＤＤ＋ＰＷＷＰ、３）ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインなしのＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３＋ＡＤＤ、及び４）ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインなしのＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３＋ＡＤＤ＋ＰＷＷＰ。ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３分子及びそのバリアント内の主要な要素の配列を表３２に列挙し、各ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３及びそのバリアントの完全なコード配列を表３３に列挙する。図３６は、本実施例でアッセイされた様々なＥＬＸＲ番号５アーキテクチャを示す概略図である。ＥＬＸＲ分子をコードする配列はまた、２×ＦＬＡＧタグを含有した。プラスミドはまた、内在性Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とするスペーサー又は非標的化対照（表３４に列挙されるスペーサー配列）のいずれかを有するｇＲＮＡ足場バリアント１７４をコードする構築物を有した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション：
各々が、非標的化スペーサー０．０又はＢ２Ｍ標的化スペーサー（スペーサー配列については表３４）のいずれかを有するｇＲＮＡを有する、ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３又はその代替の変形（図３６、配列については表３３）のうちの１つをコードするＥＬＸＲ：ｇＲＮＡ構築物を含有する１００ｎｇのＥＬＸＲ５バリアントプラスミドで、播種されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトした。実施例１０の結果は、スペーサー７．１６０及び７．１６５をＥＬＸＲ特異的スペーサーであると特定した。各構築物を３連で試験した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで３日間選択した。細胞を、トランスフェクション後５日目、１２日目、２１日目、及び５１日目に抑制分析のために採取した。簡潔に述べると、実施例６に記載されるように、ＨＬＡ免疫染色、続いてフローサイトメトリーを介してＢ２Ｍタンパク質発現を分析することによって、抑制分析を行った。更に、ＥＬＸＲ５バリアントプラスミド及びＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ又は非標的化ｇＲＮＡで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、バイサルファイトシーケンシングのためのｇＤＮＡ抽出のためにトランスフェクションの７日後に採取して、ＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットメチル化を評価し、これを、実施例６に記載されるように実施した。
結果：
標的Ｂ２Ｍ遺伝子座の長期抑制の増加及びオフターゲットメチル化の低減に対する、ＥＬＸＲ５分子へのＰＷＷＰドメインあり又はなしのＡＤＤドメインの組み込みの効果を評価した。ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３分子の変形を、Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ（スペーサー７．３７及びＥＬＸＲ特異的スペーサー７．１６０及び７．１６５を有する）又は非標的化ｇＲＮＡのいずれかで評価し、結果を図２２～２５のプロットに示す。図２２は、スペーサー７．３７の使用が、ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３、ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３＋ＡＤＤ、及びＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３＋ＡＤＤ＋ＰＷＷＰと対になったときに飽和レベルの抑制活性をもたらし、ＥＬＸＲ５バリアント間の活性差を評価することをより困難にすることを示す。しかしながら、ＥＬＸＲ５バリアント間の抑制活性の差は、スペーサー７．１６０及び７．１６５を使用するときにより顕著であった（図２３及び２４）。データは、ＡＤＤドメインの組み込みが、他のＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３分子で達成された抑制レベルと比較して、２つのＥＬＸＲ特異的スペーサーと対になったときに長期抑制の有意な増加をもたらしたことを実証する。一方、ＡＤＤドメイン及びＰＷＷＰドメインの両方の組み込みは、特にベースラインＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３分子と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子座の抑制の改善をもたらさなかった。予想どおり、ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインなしの２つのＥＬＸＲ５バリアントは、不十分な長期抑制を示した。更に、図２５は、ベースラインＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３分子に対して、観察されたＨＬＡ陰性細胞の割合がより低いことを考えると、ＡＤＤドメインの付加が特異性の上昇をもたらすように見えたことを示す。
ＥＬＸＲ５バリアントによって潜在的に媒介されるＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化を、バイサルファイトシーケンシングを使用して評価した。図２６は、バイサルファイトシーケンシングからの結果を示し、具体的には、ＶＥＧＦＡ遺伝子座の周囲のＣｐＧメチル化の割合を示す。結果は、全てのＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ、並びに非標的化ｇＲＮＡについて、ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３分子へのＡＤＤドメインの組み込みが、ＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットメチル化のレベルを劇的に低減したことを実証する（図２６）。図２７は、本実施例で調査されたＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３バリアントの活性－特異性プロファイルをマッピングした散布図であり、活性を、スペーサー７．１６０と対になったときの２１日目のＨＬＡ陰性細胞の平均割合として測定し、特異性を、スペーサー７．１６０と対になったときの７日目の定量化されたＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合によって表した。散布図は、ＡＤＤドメインの付加が、ＡＤＤドメインなしのベースラインＥＬＸ５分子に対して、ＥＬＸＲ５分子の活性を有意に高めることを明確に示す（図２７）。
実験は、ＡＤＤドメイン及びＰＷＷＰドメインの両方の包含ではなく、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインの包含が、ＥＬＸＲ分子の抑制活性及び特異性を改善することを実証する。活性及び特異性のこの強化は、複数のｇＲＮＡで観察され、ＥＬＸＲへのＡＤＤドメインの組み込みの有意性を実証している。
実施例１２：ＥＬＸＲ分子によって媒介される標的遺伝子座のサイレンシングがＤＮＭＴ１阻害剤を使用して可逆的であることの実証
ＥＬＸＲ分子によって媒介される標的遺伝子座の持続的な抑制が、ＤＮＭＴ１阻害剤を用いた処置が標的遺伝子の発現を再活性化するためにメチルマークを除去するように可逆的であることを実証するための実験を実施した。
材料及び方法：
実施例６に記載されるように生成されたＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメイン及びＣａｓＸバリアント４９１を含有するＥＬＸＲ番号５を、本実験で使用した。スペーサー７．３７（配列番号５７６４４）又は非標的化ｇＲＮＡ含有スペーサー０．０（配列番号５７６４６）を含有する足場１７４を有するＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを、本実験で使用した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション：
Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを有するＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを含有するＣａｓＸ４９１又はＥＬＸＲ番号５のいずれかをコードする構築物を含有する１００ｎｇのプラスミドで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、５８日間培養した。これらのトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、その後、９６ウェルプレートの約３０，０００細胞ウェルで再播種し、０μＭ～２０μＭの範囲の濃度の、ＤＮＭＴ１阻害剤である５－アザ－２’－デオキシシチジン（５－ａｚａｄＣ）で処置した。５－ａｚａｄＣを用いた処置の６日後、トランスフェクション後５日目、１２日目、及び２１日目にＢ２Ｍサイレンシング分析のために細胞を採取した。簡潔に述べると、実施例６に記載されるように、ＨＬＡ免疫染色、続いてフローサイトメトリーを介してＢ２Ｍタンパク質発現を分析することによって、抑制分析を行った。各実験条件についての５－ａｚａｄＣの各用量に対する処置を３連で実施した。
結果：
図３４のプロットは、Ｂ２Ｍタンパク質を発現した、示された濃度の５－ａｚａｄＣで処置されたトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の割合を示す。データは、Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを有するＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞の５－ａｚａｄＣ処置が、Ｂ２Ｍ遺伝子の再活性化をもたらしたことを実証する（図３４）。具体的には、処置細胞の約７５％が、０μＭの濃度でＢ２Ｍ発現を有する細胞の２５％と比較して、２０μＭの５－ａｚａｄＣでＢ２Ｍ発現を示した（図３４）。更に、Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを有するＣａｓＸ４９１をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞の５－ａｚａｄＣ処置は、Ｂ２Ｍ遺伝子の再活性化を示さなかった。図３５は、５－ａｚａｄＣ処置時の遺伝子再活性化とＢ２Ｍ抑制活性を並置するプロットである。データは、Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを有するＣａｓＸ４９１又はＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３のいずれかでのトランスフェクション後のＢ２Ｍ抑制を示し、５８日目までにＢ２Ｍ発現の約７５％の抑制をもたらすが、Ｂ２Ｍ発現は、５－ａｚａｄＣ処置時に増加する（図３５）。予想どおり、非標的化ｇＲＮＡを有するＣａｓＸ４９１又はＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３のいずれかでトランスフェクトされた細胞の５－ａｚａｄＣ処置は、抑制又は再活性化を実証しなかった（図３４～３５）。
実験は、標的遺伝子座のＥＬＸＲ媒介抑制の可逆性を実証する。ＤＮＭＴ１阻害剤を使用して、ＥＬＸＲ分子によって実行されたメチルマークを除去することによって、サイレンシングされた標的遺伝子を再活性化して、標的タンパク質の発現を誘導した。
実施例１３：ＥＬＸＲへのＤＮＭＴ３Ａ由来のＡＤＤドメインの包含が、オンターゲット活性を強化し、オフターゲットメチル化を減少させることの実証
標的遺伝子座の長期抑制及びオフターゲットメチル化に対する、実施例６で前述された構成番号１、番号４、及び番号５を有するＥＬＸＲ分子にＡＤＤドメインを組み込む効果を評価するための実験を実施した。
材料及び方法：
ＥＬＸＲ構築物の生成及びプラスミドクローニング：
ＺＮＦ１０－ＫＲＡＢ又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメイン及びＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインを有する構成番号１、番号４、及び番号５を有するＥＬＸＲ分子をコードするプラスミド構築物を、標準的な分子クローニング技術を使用して構築した。結果として生じるＥＬＸＲ分子の配列を表３５に列挙し、これはまた、特定のＥＬＸＲ分子の略された構築物名（例えば、ＥＬＸＲ番号１．Ａ、番号１．Ｂ）を示す。図３７は、ＥＬＸＲ構成番号１、番号４、及び番号５に組み込まれたＡＤＤドメインを有するＥＬＸＲ分子の一般的なアーキテクチャを示す概略図である。ＥＬＸＲ分子をコードする配列はまた、２×ＦＬＡＧタグを含有した。プラスミドはまた、内在性Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とするスペーサー又は非標的化対照（表３４に列挙されるスペーサー配列）のいずれかを有するｇＲＮＡ足場１７４をコードする配列を有した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション：
各々が、非標的化スペーサー０．０又はＢ２Ｍ標的化スペーサー（表３４）のいずれかを有するｇＲＮＡを有する、ＥＬＸＲ分子（表３５、図３７）をコードするＥＬＸＲ：ｇＲＮＡ構築物を含有する１００ｎｇのＥＬＸＲバリアントプラスミドで、播種されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトした。各構築物を３連で試験した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで３日間選択した。細胞を、トランスフェクション後８日目、１３日目、２０日目、及び２７日目に抑制分析のために採取した。簡潔に述べると、実施例６に記載されるように、ＨＬＡ免疫染色、続いてフローサイトメトリーを介してＢ２Ｍタンパク質発現を分析することによって、抑制分析を行った。更に、バイサルファイトシーケンシングのためのｇＤＮＡ抽出のためにトランスフェクション後５日目にも細胞を採取して、非標的化ＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットメチル化を評価し、これを、実施例６に記載されるのと類似した方法を使用して実施した。
結果：
Ｂ２Ｍ遺伝子座の長期抑制及びオフターゲットメチル化に対する、ＺＮＦ１０又はＺＩＭ－ＫＲＡＢのいずれかを有する構成番号１、番号４、又は番号５を有するＥＬＸＲ分子にＡＤＤドメインを組み込む効果を評価した。ＥＬＸＲ分子を、Ｂ２Ｍ標的化ｇＲＮＡ又は非標的化ｇＲＮＡのいずれかで試験し、結果を図３９Ａ～４２Ｂのプロットに示す。データは、ＥＬＸＲ分子へのＡＤＤドメインの組み込みが、スペーサー７．１６０（図３９Ａ）を使用したときのＺＩＭ３－ＫＲＡＢを含有する全てのＥＬＸＲ配向について、全ての時点でＢ２Ｍ抑制の実質的な増加を明確にもたらしたことを実証し、スペーサー７．１６５及び７．３７（データは示さず）を使用したときに類似した結果が観察された。図３９Ｂは、スペーサー７．１６０を有するｇＲＮＡと対になったときのＺＮＦ１０－ＫＲＡＢ又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢのいずれかを含有するＥＬＸＲ番号５の使用時に結果として生じるＢ２Ｍ抑制を示し、データは、ＡＤＤドメインを含むことが、全体的に持続的なＢ２Ｍ抑制を増加させ、ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３＋ＡＤＤは、ＥＬＸＲ５－ＺＮＦ１０＋ＡＤＤと比較してより高い活性を有したことを実証する。ＥＬＸＲ番号１及びＥＬＸＲ番号４並びに他の２つのスペーサーについて、類似した経時的結果が観察された（データは示さず）。図３９Ｃは、３つのＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡのいずれかと対になったときの、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢを含有するＥＬＸＲ番号５の使用時に結果として生じるＢ２Ｍ抑制を示し、データは、ＡＤＤドメインの包含が全体的により高いＢ２Ｍ抑制をもたらしたことを実証する。ＥＬＸＲ番号１及びＥＬＸＲ番号４についても類似した経時的結果が観察された（データは示さず）。
図４０Ａ～４０Ｃは、試験された全てのＥＬＸＲ構成及びｇＲＮＡについて、２７日目の時点で結果として生じるＢ２Ｍ抑制を示す。結果は、Ｂ２Ｍ抑制活性の上昇が、スペーサー７．３７の使用と比較して、準最適スペーサー７．１６０及び７．１６５の使用でより顕著であることを示す。更に、分子のＮ末端上にＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｌドメインを含有したＥＬＸＲ番号１及びＥＬＸＲ番号５の使用は、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインの付加時にＢ２Ｍ抑制の最も高い増加をもたらした（図４０Ａ～４０Ｃ）。ＫＲＡＢドメインに対して３’及びｄＣａｓＸに対して５’にＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌドメインを有したＥＬＸＲ番号４の使用は、活性上昇の低下をもたらし、これは、ＡＤＤドメインがクロマチンと適切に相互作用する能力の減少に起因する可能性がある。
ＥＬＸＲ分子の特異性を、バイサルファイトシーケンシングを使用して、オフターゲット遺伝子座であるＶＥＧＦＡ遺伝子でのＣｐＧメチル化のレベルをプロファイリングすることによって決定し、データを図４１Ａ～４４Ｂに示す。データは、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインの包含が、試験された全ての条件にわたってＶＥＧＦＡ遺伝子座のオフターゲットメチル化の実質的な減少をもたらしたことを実証する（図４１Ａ～４１Ｃ）。特に、ＡＤＤドメインの包含によって媒介される特異性の上昇は、ＥＬＸＲ番号１及びＥＬＸＲ番号５の構成で最も顕著であり、それらの両方は、分子のＮ末端上にＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌドメインを有した。興味深いことに、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを含有するＥＬＸＲ分子は、ＶＥＧＦＡ遺伝子座のより強いオフターゲットメチル化をもたらした。更に、ＥＬＸＲ番号４及び番号５の構成の使用は、ＡＤＤドメインの非存在下であっても、ＥＬＸＲ番号１の構成の使用と比較してより高い特異性をもたらした。ＥＬＸＲ１－ＺＩＭ３及びＥＬＸＲ４－ＺＩＭ３の構成と比較して、ＥＬＸＲ５－ＺＩＭ３へのＡＤＤドメインの包含は、最も低いオフターゲットメチル化をもたらした。
図４２Ａ～４４Ｂは、様々なＥＬＸＲ分子の活性－特異性プロファイルをマッピングする一連の散布図であり、活性を２７日目のＨＬＡ陰性細胞の平均割合としてを測定し、特異性を５日目のＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットＣｐＧメチル化の割合によって決定した。データは、試験された３つ全てのＢ２Ｍ標的化スペーサーにわたって、ＡＤＤドメインの包含が、オンターゲットＢ２Ｍ抑制の増加及びＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットメチル化の減少をもたらしたことを実証する。番号１及び番号５の構成を有するＥＬＸＲ分子は、試験された各スペーサーで活性及び特異性の最大の上昇を示した。
本実施例で考察された実験の結果は、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインの包含が、早期時点での抑制強度及び細胞分裂にわたるサイレンシングの遺伝性の両方を強化し、かつＥＬＸＲ分子中のＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインによって生じるオフターゲットメチル化を減少させることをデータが実証するという点で、実施例１１の結果を裏付ける。データはまた、異なるＥＬＸＲ配向が特異性において固有の差を有し、これは、より強力なＫＲＡＢドメインの使用によって悪化され得ることも確認する。この特異性の減少は、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインの包含によって軽減され得、これはまた、全体的により大きなオンターゲット抑制をもたらし得る。抑制活性の上昇は、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインがＨ３Ｋ４ｍｅ０を認識する機能、及びその後のクロマチンへの動員によって媒介されると考えられる。特異性の上昇は、ＤＮＭＴ３Ａ ＡＤＤドメインがＨ３Ｋ４ｍｅ０への結合の非存在下でＤＮＭＴ３Ａの触媒ドメインのアロステリック阻害を誘導する機能を介して媒介されると考えられる。結果はまた、試験された異なる構成におけるＡＤＤドメインの位置付けが、ＥＬＸＲ分子の特異性及び活性の両方で最も強い上昇を達成するために重要であることも強調する。
実施例１４：ＥＬＸＲの使用がマウスＨｅｐａ１－６細胞中の内在性遺伝子座のサイレンシングを誘導することができることの実証
ＥＬＸＲが、標的化ｇＲＮＡとコトランスフェクトされたｍＲＮＡとして送達されたときに、マウスＨｅｐａ１－６肝細胞中の代替の内在性遺伝子座の持続的な抑制を誘導する能力を実証するための実験を実施した。
材料及び方法：
実験番号１：ｍＲＮＡとして送達されたときのＨｅｐａ１－６細胞中のｄＸＲ１対ＥＬＸＲ番号１
ｄＸＲ１ ｍＲＮＡ及びＥＬＸＲ番号１ ｍＲＮＡの生成：
ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを含有するｄＸＲ１又はＥＬＸＲ番号１をコードするｍＲＮＡを、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって生成した。簡潔に述べると、５’ＵＴＲ領域、隣接したＳＶ４０ ＮＬＳを有するＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを有するｄＸＲ１又はＥＬＸＲ番号１、及び３’ＵＴＲ領域をコードする構築物を生成し、Ｔ７プロモーター及び８０ヌクレオチドポリ（Ａ）テールを含有するプラスミドにクローニングした。これらの構築物はまた、２×ＦＬＡＧ配列を含有した。ｄＸＲ１分子及びＥＬＸＲ番号１分子をコードする配列を、様々な公的に入手可能なコドン最適化ツールの使用、及び必要に応じてＧＣ含有量などのパラメータの調整に加えて、リボソームタンパク質コドン使用法に基づくコドン利用表を使用してコドン最適化した。結果として生じるプラスミドを、ＩＶＴ反応に使用する前に線形化し、これを、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＡＧ及びＮ１－メチル－シュードウリジンを用いて行った。次いで、ＩＶＴ反応をＤＮａｓｅ消化及びカラム上のオリゴｄＴ精製に供した。実験番号１については、ｄＸＲ１分子及びＥＬＸＲ番号１分子をコードするＤＮＡ配列を表３６に列挙する。ｄＸＲ１ ｍＲＮＡ及びＥＬＸＲ番号１ ｍＲＮＡをコードする対応するｍＲＮＡ配列を表３７に列挙する。ｄＸＲ１及びＥＬＸＲ番号１のタンパク質配列を表３８に示す。
ｇＲＮＡの合成：
この実験番号１では、ＰＣＳＫ９遺伝子座を標的とするｇＲＮＡを、ｇＲＮＡ足場１７４を使用して設計し、化学的に合成した。ＰＣＳＫ９標的化スペーサーの配列を表３９に列挙する。
Ｈｅｐａ１－６細胞へのｍＲＮＡ及びｇＲＮＡのトランスフェクション、並びに細胞内ＰＣＳＫ９染色：
ＮＡＴＥ（商標）阻害剤で処置された、播種されたＨｅｐａ１－６細胞を、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを有するｄＸＲ１又はＥＬＸＲ番号１をコードする３００ｎｇのｍＲＮＡ（表３７）及び１５０ｎｇのＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡ（表３９）でリポフェクトした。マウスＰＣＳＫ９遺伝子座のプロモーター領域に及ぶ７つの異なるｇＲＮＡを、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子に対して相補的な非標的化配列に加えて試験した（表３９）。トランスフェクションの６、１３、及び２５日後に細胞を採取し、細胞内フローサイトメトリー染色プロトコルを使用してＰＣＳＫ９タンパク質の細胞内レベルを測定した。簡潔に述べると、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定し、透過処理し、マウス抗ＰＣＳＫ９一次抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、続いて蛍光ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して染色した。Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターを使用して蛍光レベルを測定し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを使用してデータを分析した。非標的化ｇＲＮＡを陰性対照として使用して、細胞集団をゲーティングした。
実験番号２：ｍＲＮＡとして送達されたときのＨｅｐａ１－６細胞中のＥＬＸＲ番号１対ＥＬＸＲ番号５
ｍＲＮＡの生成：
ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを含有するＥＬＸＲ番号１又はＥＬＸＲ番号５をコードするｍＲＮＡを、ＰＣＲテンプレートを使用して社内ＩＶＴによって生成した。簡潔に述べると、Ｔ７プロモーターを含有する順方向プライマー及び１２０ヌクレオチドポリ（Ａ）テールをコードする逆方向プライマーを有する隣接したＮＬＳを有するＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ番号１又はＥＬＸＲ番号５をコードするプラスミドに対して、ＰＣＲを実施した。これらの構築物はまた、２×ＦＬＡＧ配列を含有した。これらの分子をコードするＤＮＡ配列を表４０に列挙する。結果として生じるＰＣＲテンプレートをＩＶＴ反応に使用し、これを、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＡＧ及びＮ１－メチル－シュードウリジンを用いて行った。次いで、ＩＶＴ反応をＤＮａｓｅ消化及びカラム上のオリゴｄＴ精製に供した。ＥＬＸＲ ｍＲＮＡをコードする完全長ＲＮＡ配列を表４１に列挙する。
実験対照として、触媒活性型ＣａｓＸ４９１をコードするｍＲＮＡも、記載されるＰＣＲテンプレートを使用してＩＶＴによって同様に生成された。ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメイン及びｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ（実施例６に記載される）を含有するＥＬＸＲ番号１をコードするｍＲＮＡの第３者によるＩＶＴによる生成を、実験番号１についての上記のように実施した。
実験番号２については、ＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡの合成を、実験番号１についての上記のように実施し、標的化スペーサーの配列を表３９に列挙する。ｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌとの対合については、標的化スペーサーは以下のとおりであった：１）７．１４８（Ｂ２Ｍ、非標的化対照として、配列番号５７６４５）、２７．１２６（ＰＣＳＫ９、ＣＡＣＧＣＣＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＣＡＵ、配列番号６００１３）、及び２７．１２８（ＰＣＳＫ９、ＣＡＧＣＣＵＧＣＧＣＧＵＣＣＡＣＧＵＧＡ、配列番号６００１４）。
Ｈｅｐａ１－６細胞へのｍＲＮＡ及びｇＲＮＡのトランスフェクション、並びに細胞内ＰＣＳＫ９染色：
ＮＡＴＥ（商標）阻害剤で処置された、播種されたＨｅｐａ１－６細胞を、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢを有するＥＬＸＲ番号１、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢを有するＥＬＸＲ番号５、触媒活性型ＣａｓＸ４９１、又はｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌをコードする３００ｎｇのｍＲＮＡ、及び１５０ｎｇのＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡ（表３９）でリポフェクトした。ＰＣＳＫ９タンパク質の細胞内レベルを、実験番号１について先に記載された細胞内染色プロトコルを使用して、トランスフェクション後７日目及び１４日目に測定した。
結果：
実験番号１では、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメインを含有するｄＸＲ１又はＥＬＸＲ番号１をコードするｍＲＮＡを、ＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡとマウスＨｅｐａ１－６細胞にコトランスフェクトして、マウスＰＣＳＫ９遺伝子座をサイレンシングすることによってＰＣＳＫ９ノックダウンを誘導するその能力を評価した。結果として生じるＰＣＳＫ９ノックダウンの定量化を図２８～３０に示す。データは、６日目に、ＥＬＸＲ番号１ ｍＲＮＡを伴う、マウスＰＣＳＫ９遺伝子座を標的とする７つのｇＲＮＡのうちの６つの使用が、細胞内ＰＣＳＫ９の５０％超のノックダウンをもたらし、上位のスペーサー２７．９４は、８０％超の抑制レベルを達成したことを実証する（図２８）。６日目にｄＸＲ１ ｍＲＮＡを使用して類似した傾向が観察されたが、抑制の程度は、スペーサー２７．９２及び２７．１００などのある特定のスペーサーと対になったときにあまり有意ではなかった（図２８）。結果はまた、ＥＬＸＲ番号１ ｍＲＮＡの使用が、少なくとも２５日間のＰＣＳＫ９遺伝子座の維持された抑制をもたらし、上位のスペーサー２７．９４及び２７．８８の使用は、ＰＣＳＫ９のサイレンシングにおいて最も強い持久性を示すことも実証する（図３０）。しかしながら、６日目に観察されたｄＸＲ１によって媒介されるＰＣＳＫ９抑制は、１３日目までに非標的化対照（スペーサー６．７）で検出されたのと類似したレベルのＰＣＳＫ９に戻り、そのような一過性の抑制は、マウスＰＣＳＫ９遺伝子を標的とした、アッセイされた全てのｇＲＮＡについて顕著であった（図２９）。
実験番号２では、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢドメイン、ｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ、又は触媒活性型ＣａｓＸ４９１を含有するＥＬＸＲ番号１又はＥＬＸＲ番号５をコードするｍＲＮＡを、ＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡとマウスＨｅｐａ１－６細胞にコトランスフェクトして、マウスＰＣＳＫ９遺伝子座をサイレンシングすることによってＰＣＳＫ９ノックダウンを誘導するその能力を評価した。結果として生じるＰＣＳＫ９抑制の定量化を図３１～３３に示す。データは、ＩＶＴ産生ＥＬＸＲ番号１又はＥＬＸＲ番号５ ｍＲＮＡの送達が、上位のスペーサー２７．９４（７０％超）を有する標的化ｇＲＮＡと対になったときに同等のレベルの維持されたＰＣＳＫ９ノックダウンをもたらした一方で、スペーサー２７．８８を有するｇＲＮＡの使用は、ＥＬＸＲ番号５よりもＥＬＸＲ番号１でわずかに高い抑制をもたらしたことを実証する（図３１～３３）。更に、ＥＬＸＲ番号１及びｄＣａｓ９－ＺＮＦ１０－ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌをコードする、第３者によって産生されたｍＲＮＡは、上位のスペーサーを含有するｇＲＮＡと対になったときに類似したレベルの持続的なＰＣＳＫ９ノックダウン（７０％超）をもたらした（図３１～３３）。
これらの実験は、異なる構成を有するＥＬＸＲ分子が、マウス肝臓細胞株中の内在性遺伝子座の遺伝的サイレンシングを誘導することができることを実証する。一方、予想どおり、ｄＸＲ構築物の使用は、早期時点で標的遺伝子座の効率的な抑制をもたらすが、その使用は、持続的なサイレンシングをもたらさない。これらの結果はまた、（異なる構成の）ｄＸＲ分子及びＥＬＸＲ分子がｍＲＮＡとして送達され、標的化ｇＲＮＡと細胞にコトランスフェクトされ得ることを示し、この送達モダリティの一過性の性質が依然としてサイレンシングを誘導するのに十分であることを示している。
実施例１５：ＥＬＸＲ ｍＲＮＡ及び標的化ｇＲＮＡは、ＬＮＰを介して送達されて、インビトロでの標的遺伝子座の抑制を達成することができる
ＥＬＸＲ ｍＲＮＡを封入し、ｇＲＮＡを標的とする脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の送達が、細胞ベースのアッセイにおいて標的内在性遺伝子座の持続的な抑制を誘導することを実証するための実験を実施する。
材料及び方法：
ＥＬＸＲ ｍＲＮＡの生成：
ＥＬＸＲ分子をコードするｍＲＮＡを、実施例１４で先に記載されたようにＩＶＴによって生成する。ＥＬＸＲ分子をコードする配列を、実施例１４に簡潔に記載されるようにコドン最適化する。ＥＬＸＲ ｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の例を表３６及び表４０に列挙し、対応するｍＲＮＡ配列を表３７及び表４１に列挙する。ＥＬＸＲ ｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の追加の例を以下の表４２に示し、それらの対応するｍＲＮＡ配列を表４３に示す。
（例えば、内在性Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とする）標的化ｇＲＮＡの合成を、実施例１４の上記のように実施する。
ＬＮＰ製剤化を実施例１６に記載されるように実施する。
ＥＬＸＲ ｍＲＮＡを封入し、ｇＲＮＡを標的とするＬＮＰのマウス肝臓Ｈｅｐａ１－６細胞への送達：
Ｈｅｐａ１－６細胞を９６ウェルプレートに播種する。翌日、播種された細胞を異なる濃度のＬＮＰで処置し、これを２５０ｎｇで開始する６回の２倍連続希釈で調製する。これらのＬＮＰを、ＥＬＸＲ ｍＲＮＡ及びＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを封入するように製剤化する。培地をＬＮＰ処置の２４時間後に交換し、ＮＧＳによるＢ２Ｍ遺伝子座の編集評価のためのｇＤＮＡ抽出、及び実施例６に記載されるＶＥＧＦＡ遺伝子座でのオフターゲットメチル化を評価するためのバイサルファイトシーケンシングのために、細胞を複数の時点（例えば、処置の７、１４、２１、２８、及び５６日後）で採取する前に培養する。
この実験からの結果は、ＥＬＸＲ ｍＲＮＡ及び標的化ｇＲＮＡがＬＮＰ内に共封入されて、標的細胞に送達されて、標的内在性遺伝子座の遺伝的サイレンシングを誘導することができることを示すことが予想される。
実施例１６：ＸＲ ｍＲＮＡ又はＥＬＸＲ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡペイロードを標的細胞及び組織に送達するための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製剤化
標的細胞及び組織への送達のために、ＸＲ ｍＲＮＡ又はＥＬＸＲ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡをＬＮＰに封入するための実験を実施する。ここで、ＸＲ ｍＲＮＡ又はＥＬＸＲ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（ＰＮＩ）Ｉｇｎｉｔｅ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｓｙｓｔｅｍを製造業者のガイドラインに従って使用して、ＧｅｎＶｏｙ－ＩＬＭ（商標）脂質を使用してＬＮＰに封入する。ＧｅｎＶｏｙ－ＩＬＭ（商標）脂質は、５０：１０：３７．５：２．５ｍｏｌ％のイオン化可能な脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：安定剤の組成物である。簡潔に述べると、ＬＮＰを製剤化するために、等しい質量比のＸＲ ｍＲＮＡ又はＥＬＸＲ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを、ＰＮＩ製剤緩衝液、ｐＨ４．０で希釈する。ＧｅｎＶｏｙ－ＩＬＭ（商標）脂質を無水エタノール中で１：１に希釈する。ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ共製剤を、所定のＮ／Ｐ比を使用して実施する。ＲＮＡ及び脂質を、ＰＮＩ Ｉｇｎｉｔｅ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｓｙｓｔｅｍ上で所定の流量比においてＰＮＩ層流カートリッジを通過させる。製剤化後、ＬＮＰをＰＢＳ、ｐＨ７．４で希釈して、エタノール濃度を減少させ、ｐＨを増加させ、これは粒子の安定性を高める。ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰの緩衝液交換は、１０ｋ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を使用して、４℃のＰＢＳ、ｐＨ７．４中での一晩の透析によって達成される。透析後、ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ－ＬＮＰを、１００ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ（登録商標）－Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して０．５ｍｇ／ｍＬ超に濃縮し、次いでフィルター滅菌する。製剤化されたＬＮＰをＳｔｕｎｎｅｒ（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）上で分析して、その直径及び多分散指数（ＰＤＩ）を決定する。封入効率及びＲＮＡ濃度を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＱｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）ＲＮＡアッセイキットを使用したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイによって決定する。ＸＲ ｍＲＮＡ又はＥＬＸＲ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを標的細胞及び組織に送達するために、ＬＮＰを様々な実験で使用する。
実施例１７：上位９５個のＫＲＡＢドメインのメンバーは、ＥＬＸＲ５活性を高める
実施例４に記載されるように、ｄＸＲ構築物との関連で優れたリプレッサーであったＫＲＡＢドメインを特定した。本明細書に記載されるように、実施例４で特定されたＫＲＡＢドメインが、ＥＬＸＲ５との関連で実施例４でも優れた転写リプレッサーであったかどうかを試験するための実験を実施した。
材料及び方法：
実施例４で特定され、上位９５個のリプレッサーのメンバーであると決定された代表的なＫＲＡＢドメインを、ＥＬＸＲ５構築物にクローニングした（ＥＬＸＲ番号５の構成については、図７を参照されたい）。ＥＬＸＲ５構築物を、ＳＶ４０ ＮＬＳがＫＲＡＢドメインの下流に存在したことを除いて、実施例６（表２５及び表２６）に記載されるように構築した。ＺＩＭ３に由来するＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ５分子を対照として使用した。別個のプラスミドを使用して、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とするスペーサー７．１６５（ＵＣＣＣＵＡＵＧＵＣＣＵＵＧＣＵＧＵＵＵ、配列番号５９６６７）を有するガイド足場３１６（配列番号５９３５２）をコードした。追加の対照は、同じガイド及びスペーサーを有するＺＩＭ３に由来するＫＲＡＢドメインを有するｄＸＲ分子、並びにＺＩＭ３に由来するＫＲＡＢドメイン及び非標的化０．０スペーサー（配列番号５７６４６）を有するＥＬＸＲ５分子及びｄＸＲ分子を含んだ。特に、スペーサー７．１６５は、比較的非効率なスペーサーであり、これはしたがって、試験された様々なＥＬＸＲ分子間の差を識別するためのアッセイのダイナミックレンジを増加させることが知られているため、それを選択した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、細胞がＥＬＸＲ構築物をコードするプラスミド及びｓｇＲＮＡをコードするプラスミドの各々５０ｎｇでトランスフェクトされたことを除いて、実施例１１に記載されるようにトランスフェクトした。実施例６に記載されるように、トランスフェクションの７日後にＨＬＡ免疫染色、続いてフローサイトメトリーを介してＢ２Ｍタンパク質発現を分析することによって、抑制分析を行った。
結果：
Ｂ２Ｍアッセイの結果を以下の表４４に提供する。
表４４に示されるように、上位９５個のＫＲＡＢドメインにＫＲＡＢドメインの多くを有する構築物は、ＺＩＭ３に由来するＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ５構築物と比較して、スペーサー７．１６５を有するＥＬＸＲ５分子との関連で、より高いレベルのＢ２Ｍ抑制をもたらした。最高レベルの抑制は、ＫＲＡＢドメインＩＤ３０１７３を有するＥＬＸＲ５分子によって達成され、これは、ＺＩＭ３に由来するＫＲＡＢドメインを有するＥＬＸＲ５よりも３５％強い抑制をもたらした。その後の時点を評価して、抑制の持続性を測定する。
したがって、本明細書に記載される実験は、実施例４で特定されたＫＲＡＢドメインが、ｄＸＲ構築物及びＥＬＸＲ構築物の両方との関連で、改善されたレベルの転写抑制を裏付けることを実証する。
実施例１８：ｄＸＲ構築物及びＥＬＸＲ構築物の例示的な配列
表４５は、ｄＸＲ構築物及びＥＬＸＲ構築物の成分の例示的なアミノ酸配列を提供する。表４５中、開始メチオニンなしのタンパク質ドメインが示される。
表４６は、ＡＤＤドメインあり又はなしの構成１、４、又は５の例示的な完全長ＥＬＸＲ構築物（ｄＣａＸ、ＮＬＳ、リンカー、及びリプレッサードメインを含む）を提供し、上位１０個のＫＲＡＢドメインの各々は以下である：ドメイン＿７３７、ドメイン＿１０３３１、ドメイン＿１０９４８、ドメイン＿１１０２９、ドメイン＿１７３５８、ドメイン＿１７７５９、ドメイン＿１８２５８、ドメイン＿１９８０４、ドメイン＿２０５０５、及びドメイン＿２６７４９。更なる例示的な完全長ＥＬＸＲ配列を配列番号５９６７３～６００１２に提供される。

Claims (124)

  1. 遺伝子リプレッサー系であって、
    ａ）触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、
    ｂ）転写リプレッサードメインと、
    ｃ）ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、
    を含み、
    ｉ）前記転写リプレッサードメインが、融合タンパク質として前記触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結されており、
    ｉｉ）前記ｇＲＮＡが、抑制、サイレンシング、又は下方調節のために標的化される遺伝子の標的核酸配列に対して相補的な標的化配列を含み、
    ｉｉｉ）前記融合タンパク質が、前記ｇＲＮＡとともにリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成することができ、
    ｉｖ）前記ＲＮＰが、前記標的核酸に結合することができる、遺伝子リプレッサー系。
  2. 前記遺伝子が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、又は構造ＲＮＡをコードする、請求項１に記載の遺伝子リプレッサー系。
  3. 前記転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインである、請求項１又は２に記載の遺伝子リプレッサー系。
  4. 前記ＫＲＡＢドメインが、ＺＮＦ３４３、ＺＮＦ３３７、ＺＮＦ３３４、ＺＮＦ２１５、ＺＮＦ５１９、ＺＮＦ４８５、ＺＮＦ２１４、ＺＮＦ３３Ｂ、ＺＮＦ２８７、ＺＮＦ７０５Ａ、ＺＮＦ３７Ａ、ＫＲＢＯＸ４、ＺＫＳＣＡＮ３、ＺＫＳＣＡＮ４、ＺＮＦ５７、ＺＮＦ５５７、ＺＮＦ７０５Ｂ、ＺＮＦ６６２、ＺＮＦ７７、ＺＮＦ５００、ＺＮＦ５５８、ＺＮＦ６２０、ＺＮＦ７１３、ＺＮＦ８２３、ＺＮＦ４４０、ＺＮＦ４４１、ＺＮＦ１３６、ＳＮＲＰＢ、ＺＮＦ７３５、ＺＫＳＣＡＮ２、ＺＮＦ６１９、ＺＮＦ６２７、ＺＮＦ３３３、ＡＢＣＡ１１Ｐ、ＰＬＤ５Ｐ１、ＺＮＦ２５、ＺＮＦ７２７、ＺＮＦ５９５、ＺＮＦ１４、ＺＮＦ３３Ａ、ＺＮＦ１０１、ＺＮＦ２５３、ＺＮＦ５６、ＺＮＦ７２０、ＺＮＦ８５、ＺＮＦ６６、ＺＮＦ７２２Ｐ、ＺＮＦ４８６、ＺＮＦ６８２、ＺＮＦ６２６、ＺＮＦ１００、ＺＮＦ９３、ＺＫＳＣＡＮ１、ＺＮＦ２５７、ＺＮＦ７２９、ＺＮＦ２０８、ＺＮＦ９０、ＺＮＦ４３０、ＺＮＦ６７６、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４２９、ＺＮＦ６７５、ＺＮＦ６８１、ＺＮＦ９９、ＺＮＦ４３１、ＺＮＦ９８、ＺＮＦ７０８、ＺＮＦ７３２、ＳＳＸ２、ＺＮＦ７２１、ＺＮＦ７２６、ＺＮＦ７３０、ＺＮＦ５０６、ＺＮＦ７２８、ＺＮＦ１４１、ＺＮＦ７２３、ＺＮＦ３０２、ＺＮＦ４８４、ＬＩＮＣ００９６０、ＳＳＸ２Ｂ、ＺＮＦ７１８、ＺＮＦ７４、ＺＮＦ１５７、ＺＮＦ７９０、ＺＮＦ５６５、ＺＮＦ７０５Ｇ、ＶＮ１Ｒ１０７Ｐ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＺＮＦ７３７、ＳＳＸ４、ＺＮＦ８５０、ＺＮＦ７１７、ＺＮＦ１５５、ＺＮＦ２８３、ＺＮＦ４０４、ＺＮＦ１１４、ＺＮＦ７１６、ＺＮＦ２３０、ＺＮＦ４５、ＺＮＦ２２２、ＺＮＦ２８６Ａ、ＺＮＦ６２４、ＺＮＦ２２３、ＺＮＦ２８４、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ７４９、ＺＮＦ６１５、ＺＦＰ９０、ＺＮＦ２２５、ＺＮＦ２３４、ＺＮＦ５６８、ＺＮＦ６１４、ＺＮＦ５８４、ＺＮＦ４３２、ＺＮＦ４６１、ＺＮＦ１８２、ＺＮＦ６３０、ＺＮＦ６３０－ＡＳ１、ＺＮＦ１３２、ＺＮＦ４２０、ＺＮＦ３２４Ｂ、ＺＮＦ６１６、ＺＮＦ４７１、ＺＮＦ２２７、ＺＮＦ３２４、ＺＮＦ８６０、ＺＦＰ２８、ＺＮＦ４７０、ＺＮＦ５８６、ＺＮＦ２３５、ＺＮＦ２７４、ＺＮＦ４４６、ＺＦＰ１、ＺＩＭ３、ＺＮＦ２１２、ＺＮＦ７６６、ＺＮＦ２６４、ＺＮＦ４８０、ＺＮＦ６６７、ＺＮＦ８０５、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ７８３、ＺＮＦ６２１、ＺＮＦ８－ＤＴ、ＺＮＦ８８０、ＺＮＦ２１３－ＡＳ１、ＺＮＦ２１３、ＺＮＦ２６３、ＺＳＣＡＮ３２、ＺＩＭ２、ＺＮＦ５９７、ＺＮＦ７８６、ＫＲＢＡ１、ＺＮＦ４６０、ＺＮＦ８、ＺＮＦ８７５、ＺＮＦ５４３、ＺＮＦ１３３、ＺＮＦ２２９、ＺＮＦ５２８、ＳＳＸ１、ＺＮＦ８１、ＺＮＦ５７８、ＺＮＦ８６２、ＺＮＦ７７７、ＺＮＦ４２５、ＺＮＦ５４８、ＺＮＦ７４６、ＺＮＦ２８２、ＺＮＦ３９８、ＺＮＦ５９９、ＺＮＦ２５１、ＺＮＦ１９５、ＺＮＦ１８１、ＲＢＡＫ－ＲＢＡＫＤＮ、ＺＦＰ３７、ＲＮ７ＳＬ５２６Ｐ、ＺＮＦ８７９、ＺＮＦ２６、ＺＳＣＡＮ２１、ＺＮＦ３、ＺＮＦ３５４Ｃ、ＺＮＦ１０、ＺＮＦ７５Ｄ、ＺＮＦ４２６、ＺＮＦ５６１、ＺＮＦ５６２、ＺＮＦ８４６、ＺＮＦ７８２、ＺＮＦ５５２、ＺＮＦ５８７Ｂ、ＺＮＦ８１４、ＺＮＦ５８７、ＺＮＦ９２、ＺＮＦ４１７、ＺＮＦ２５６、ＺＮＦ４７３、ＺＦＰ１４、ＺＦＰ８２、ＺＮＦ５２９、ＺＮＦ６０５、ＺＦＰ５７、ＺＮＦ７２４、ＺＮＦ４３、ＺＮＦ３５４Ａ、ＺＮＦ５４７、ＳＳＸ４Ｂ、ＺＮＦ５８５Ａ、ＺＮＦ５８５Ｂ、ＺＮＦ７９２、ＺＮＦ７８９、ＺＮＦ３９４、ＺＮＦ６５５、ＺＦＰ９２、ＺＮＦ４１、ＺＮＦ６７４、ＺＮＦ５４６、ＺＮＦ７８０Ｂ、ＺＮＦ６９９、ＺＮＦ１７７、ＺＮＦ５６０、ＺＮＦ５８３、ＺＮＦ７０７、ＺＮＦ８０８、ＺＫＳＣＡＮ５、ＺＮＦ１３７Ｐ、ＺＮＦ６１１、ＺＮＦ６００、ＺＮＦ２８、ＺＮＦ７７３、ＺＮＦ５４９、ＺＮＦ５５０、ＺＮＦ４１６、ＺＩＫ１、ＺＮＦ２１１、ＺＮＦ５２７、ＺＮＦ５６９、ＺＮＦ７９３、ＺＮＦ５７１－ＡＳ１、ＺＮＦ５４０、ＺＮＦ５７１、ＺＮＦ６０７、ＺＮＦ７５Ａ、ＺＮＦ２０５、ＺＮＦ１７５、ＺＮＦ２６８、ＺＮＦ３５４Ｂ、ＺＮＦ１３５、ＺＮＦ２２１、ＺＮＦ２８５、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ３０、ＺＮＦ３０４、ＺＮＦ２５４、ＺＮＦ７０１、ＺＮＦ４１８、ＺＮＦ７１、ＺＮＦ５７０、ＺＮＦ７０５Ｅ、ＫＲＢＯＸ１、ＺＮＦ５１０、ＺＮＦ７７８、ＰＲＤＭ９、ＺＮＦ２４８、ＺＮＦ８４５、ＺＮＦ５２５、ＺＮＦ７６５、ＺＮＦ８１３、ＺＮＦ７４７、ＺＮＦ７６４、ＺＮＦ７８５、ＺＮＦ６８９、ＺＮＦ３１１、ＺＮＦ１６９、ＺＮＦ４８３、ＺＮＦ４９３、ＺＮＦ１８９、ＺＮＦ６５８、ＺＮＦ５６４、ＺＮＦ４９０、ＺＮＦ７９１、ＺＮＦ６７８、ＺＮＦ４５４、ＺＮＦ３４、ＺＮＦ７、ＺＮＦ２５０、ＺＮＦ７０５Ｄ、ＺＮＦ６４１、ＺＮＦ２、ＺＮＦ５５４、ＺＮＦ５５５、ＺＮＦ５５６、ＺＮＦ５９６、ＺＮＦ５１７、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ１８、ＺＮＦ８２９、ＺＮＦ７７２、ＺＮＦ１７、ＺＮＦ１１２、ＺＮＦ５１４、ＺＮＦ６８８、ＰＲＤＭ７、ＺＮＦ６９５、ＺＮＦ６７０－ＺＮＦ６９５、ＺＮＦ１３８、ＺＮＦ６７０、ＺＮＦ１９、ＺＮＦ３１６、ＺＮＦ１２、ＺＮＦ２０２、ＲＢＡＫ、ＺＮＦ８３、ＺＮＦ４６８、ＺＮＦ４７９、ＺＮＦ６７９、ＺＮＦ７３６、ＺＮＦ６８０、ＺＮＦ２７３、ＺＮＦ１０７、ＺＮＦ２６７、ＺＫＳＣＡＮ８、ＺＮＦ８４、ＺＮＦ５７３、ＺＮＦ２３、ＺＮＦ５５９、ＺＮＦ４４、ＺＮＦ５６３、ＺＮＦ４４２、ＺＮＦ７９９、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ７０９、ＺＮＦ５６６、ＺＮＦ６９、ＺＮＦ７００、ＺＮＦ７６３、ＺＮＦ４３３－ＡＳ１、ＺＮＦ４３３、ＺＮＦ８７８、ＺＮＦ８４４、ＺＮＦ７８８Ｐ、ＺＮＦ２０、ＺＮＦ６２５－ＺＮＦ２０、ＺＮＦ６２５、ＺＮＦ６０６、ＺＮＦ５３０、ＺＮＦ５７７、ＺＮＦ６４９、ＺＮＦ６１３、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ３１７、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ１８０、ＺＮＦ４１５、ＶＮ１Ｒ１、ＺＮＦ２６６、ＺＮＦ７３８、ＺＮＦ４４５、ＺＮＦ８５２、ＺＫＳＣＡＮ７、ＺＮＦ６６０、ＭＰＲＩＰＰ１、ＺＮＦ１９７、ＺＮＦ５６７、ＺＮＦ５８２、ＺＮＦ４３９、ＺＦＰ３０、ＺＮＦ５５９－ＺＮＦ１７７、ＺＮＦ２２６、ＺＮＦ８４１、ＺＮＦ５４４、ＺＮＦ２３３、ＺＮＦ５３４、ＺＮＦ８３６、ＺＮＦ３２０、ＫＲＢＡ２、ＺＮＦ７６１、ＺＮＦ３８３、ＺＮＦ２２４、ＺＮＦ５５１、ＺＮＦ１５４、ＺＮＦ６７１、ＺＮＦ７７６、ＺＮＦ７８０Ａ、ＺＮＦ８８８、ＺＮＦ８１６－ＺＮＦ３２１Ｐ、ＺＮＦ３２１Ｐ、ＺＮＦ８１６、ＺＮＦ３４７、ＺＮＦ６６５、ＺＮＦ６７７、ＺＮＦ１６０、ＺＮＦ１８４、ＺＮＦ１４０、ＺＮＦ５８９、ＺＮＦ８９１、ＺＦＰ６９Ｂ、ＺＮＦ４３６、ＰＯＧＫ、ＺＮＦ６６９、ＺＦＰ６９、ＺＮＦ６８４、ＺＮＦ１２４、ＺＮＦ４９６、及びそれらの配列バリアントからなる群から選択される、請求項３に記載の遺伝子リプレッサー系。
  5. 前記ＫＲＡＢドメインが、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる配列の群から選択される、請求項３に記載の遺伝子リプレッサー系。
  6. 前記ＫＲＡＢドメインが、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９からなる配列の群から選択される、請求項３に記載の遺伝子リプレッサー系。
  7. 前記ＫＲＡＢドメインが、
    ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（
    ｉ）Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、
    ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（
    ｉ）Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、
    ｉｘ）Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、
    ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（
    ｉ）Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、
    ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（
    ｉ）Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、
    ｉｘ）Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、
    ｘ）Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、
    ｘｉ）Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、
    ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（
    ｉ）Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、
    ｉｘ）Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、
    ｘ）Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、
    ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（
    ｉ）Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、
    ｉｘ）Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、
    ｘ）Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、
    ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（
    ｉ）Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、
    ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（
    ｉ）Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、
    ｉｘ）Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、
    ｘ）Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、
    ｘｉ）Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、
    ｘｉｉ）Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又は
    ｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（
    ｉ）Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含む、請求項５又は６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  8. 前記ＫＲＡＢドメインが、第１及び第２の配列モチーフを含み、
    ａ）前記第１の配列モチーフが、配列ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（
    ｉ）Ｘ１は、Ｋ又はＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ｄ又はＥであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、又はＲであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｎ又はＴであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｆ又はＹであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、又はＳであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、又はＮであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ｌ又はＶであり、
    ｉｘ）Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、又はＶであり、
    ｘ）Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、又はＳである）を含み、
    ｂ）前記第２の配列モチーフが、配列ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（
    ｉ）Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、又はＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ａ、Ｓ、又はＴであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｉ又はＶであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、又はＹであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｓ又はＴであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、又はＷであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｄ又はＥであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、又はＲである）を含む、請求項７に記載の遺伝子リプレッサー系。
  9. ＫＲＡＢドメイン配列が、配列番号５７７４６～５９３４２、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項７又は８に記載の遺伝子リプレッサー系。
  10. 前記ＫＲＡＢドメイン配列が、配列番号５７７４６～５７８４０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項９に記載の遺伝子リプレッサー系。
  11. 前記ＫＲＡＢドメイン配列が、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項９に記載の遺伝子リプレッサー系。
  12. 前記融合タンパク質が、インビトロ細胞アッセイでアッセイされた場合、ＺＮＦ１０ ＫＲＡＢドメイン（配列番号５９６２６）を含む同等の融合タンパク質よりも大きい程度まで、レポーター遺伝子の発現を抑制することができる、請求項７～１１のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  13. 前記レポーター遺伝子が、ＨＥＫ２９３細胞中のＢ２Ｍ遺伝子座であり、Ｂ２Ｍの発現が、前記細胞アッセイの７日目に少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％抑制される、請求項１２に記載の遺伝子リプレッサー系。
  14. 前記ＫＲＡＢドメインが、リンカーペプチド配列によって、前記触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＣ末端で又はその近くで連結されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  15. 前記ＫＲＡＢドメインが、リンカーペプチド配列によって、前記触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端で又はその近くで連結されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  16. 遺伝子リプレッサー系であって、
    ａ）触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、
    ｂ）第１の転写リプレッサードメインと、
    ｃ）第２の転写リプレッサードメインと、
    ｄ）第３の転写リプレッサードメインと、
    ｅ）ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、
    を含み、
    ｉ）前記触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質、前記第１の転写リプレッサードメイン、前記第２の転写リプレッサードメイン、及び前記第３の転写リプレッサードメインが、融合タンパク質として連結されており、
    ｉｉ）前記ｇＲＮＡが、抑制、サイレンシング、又は下方調節のために標的化される遺伝子の標的核酸配列に対して相補的な標的化配列を含み、
    ｉｉｉ）前記融合タンパク質が、前記ｇＲＮＡとともにリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成することができ、
    ｉｖ）前記ＲＮＰが、前記遺伝子の前記標的核酸に結合することができる、遺伝子リプレッサー系。
  17. 前記遺伝子が、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又は構造ＲＮＡをコードする、請求項１６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  18. 前記第１の転写リプレッサーが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインである、請求項１６又は１７に記載の遺伝子リプレッサー系。
  19. 前記ＫＲＡＢドメインが、ＺＮＦ３４３、ＺＮＦ３３７、ＺＮＦ３３４、ＺＮＦ２１５、ＺＮＦ５１９、ＺＮＦ４８５、ＺＮＦ２１４、ＺＮＦ３３Ｂ、ＺＮＦ２８７、ＺＮＦ７０５Ａ、ＺＮＦ３７Ａ、ＫＲＢＯＸ４、ＺＫＳＣＡＮ３、ＺＫＳＣＡＮ４、ＺＮＦ５７、ＺＮＦ５５７、ＺＮＦ７０５Ｂ、ＺＮＦ６６２、ＺＮＦ７７、ＺＮＦ５００、ＺＮＦ５５８、ＺＮＦ６２０、ＺＮＦ７１３、ＺＮＦ８２３、ＺＮＦ４４０、ＺＮＦ４４１、ＺＮＦ１３６、ＳＮＲＰＢ、ＺＮＦ７３５、ＺＫＳＣＡＮ２、ＺＮＦ６１９、ＺＮＦ６２７、ＺＮＦ３３３、ＡＢＣＡ１１Ｐ、ＰＬＤ５Ｐ１、ＺＮＦ２５、ＺＮＦ７２７、ＺＮＦ５９５、ＺＮＦ１４、ＺＮＦ３３Ａ、ＺＮＦ１０１、ＺＮＦ２５３、ＺＮＦ５６、ＺＮＦ７２０、ＺＮＦ８５、ＺＮＦ６６、ＺＮＦ７２２Ｐ、ＺＮＦ４８６、ＺＮＦ６８２、ＺＮＦ６２６、ＺＮＦ１００、ＺＮＦ９３、ＺＫＳＣＡＮ１、ＺＮＦ２５７、ＺＮＦ７２９、ＺＮＦ２０８、ＺＮＦ９０、ＺＮＦ４３０、ＺＮＦ６７６、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４２９、ＺＮＦ６７５、ＺＮＦ６８１、ＺＮＦ９９、ＺＮＦ４３１、ＺＮＦ９８、ＺＮＦ７０８、ＺＮＦ７３２、ＳＳＸ２、ＺＮＦ７２１、ＺＮＦ７２６、ＺＮＦ７３０、ＺＮＦ５０６、ＺＮＦ７２８、ＺＮＦ１４１、ＺＮＦ７２３、ＺＮＦ３０２、ＺＮＦ４８４、ＬＩＮＣ００９６０、ＳＳＸ２Ｂ、ＺＮＦ７１８、ＺＮＦ７４、ＺＮＦ１５７、ＺＮＦ７９０、ＺＮＦ５６５、ＺＮＦ７０５Ｇ、ＶＮ１Ｒ１０７Ｐ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＺＮＦ７３７、ＳＳＸ４、ＺＮＦ８５０、ＺＮＦ７１７、ＺＮＦ１５５、ＺＮＦ２８３、ＺＮＦ４０４、ＺＮＦ１１４、ＺＮＦ７１６、ＺＮＦ２３０、ＺＮＦ４５、ＺＮＦ２２２、ＺＮＦ２８６Ａ、ＺＮＦ６２４、ＺＮＦ２２３、ＺＮＦ２８４、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ７４９、ＺＮＦ６１５、ＺＦＰ９０、ＺＮＦ２２５、ＺＮＦ２３４、ＺＮＦ５６８、ＺＮＦ６１４、ＺＮＦ５８４、ＺＮＦ４３２、ＺＮＦ４６１、ＺＮＦ１８２、ＺＮＦ６３０、ＺＮＦ６３０－ＡＳ１、ＺＮＦ１３２、ＺＮＦ４２０、ＺＮＦ３２４Ｂ、ＺＮＦ６１６、ＺＮＦ４７１、ＺＮＦ２２７、ＺＮＦ３２４、ＺＮＦ８６０、ＺＦＰ２８、ＺＮＦ４７０、ＺＮＦ５８６、ＺＮＦ２３５、ＺＮＦ２７４、ＺＮＦ４４６、ＺＦＰ１、ＺＩＭ３、ＺＮＦ２１２、ＺＮＦ７６６、ＺＮＦ２６４、ＺＮＦ４８０、ＺＮＦ６６７、ＺＮＦ８０５、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ７８３、ＺＮＦ６２１、ＺＮＦ８－ＤＴ、ＺＮＦ８８０、ＺＮＦ２１３－ＡＳ１、ＺＮＦ２１３、ＺＮＦ２６３、ＺＳＣＡＮ３２、ＺＩＭ２、ＺＮＦ５９７、ＺＮＦ７８６、ＫＲＢＡ１、ＺＮＦ４６０、ＺＮＦ８、ＺＮＦ８７５、ＺＮＦ５４３、ＺＮＦ１３３、ＺＮＦ２２９、ＺＮＦ５２８、ＳＳＸ１、ＺＮＦ８１、ＺＮＦ５７８、ＺＮＦ８６２、ＺＮＦ７７７、ＺＮＦ４２５、ＺＮＦ５４８、ＺＮＦ７４６、ＺＮＦ２８２、ＺＮＦ３９８、ＺＮＦ５９９、ＺＮＦ２５１、ＺＮＦ１９５、ＺＮＦ１８１、ＲＢＡＫ－ＲＢＡＫＤＮ、ＺＦＰ３７、ＲＮ７ＳＬ５２６Ｐ、ＺＮＦ８７９、ＺＮＦ２６、ＺＳＣＡＮ２１、ＺＮＦ３、ＺＮＦ３５４Ｃ、ＺＮＦ１０、ＺＮＦ７５Ｄ、ＺＮＦ４２６、ＺＮＦ５６１、ＺＮＦ５６２、ＺＮＦ８４６、ＺＮＦ７８２、ＺＮＦ５５２、ＺＮＦ５８７Ｂ、ＺＮＦ８１４、ＺＮＦ５８７、ＺＮＦ９２、ＺＮＦ４１７、ＺＮＦ２５６、ＺＮＦ４７３、ＺＦＰ１４、ＺＦＰ８２、ＺＮＦ５２９、ＺＮＦ６０５、ＺＦＰ５７、ＺＮＦ７２４、ＺＮＦ４３、ＺＮＦ３５４Ａ、ＺＮＦ５４７、ＳＳＸ４Ｂ、ＺＮＦ５８５Ａ、ＺＮＦ５８５Ｂ、ＺＮＦ７９２、ＺＮＦ７８９、ＺＮＦ３９４、ＺＮＦ６５５、ＺＦＰ９２、ＺＮＦ４１、ＺＮＦ６７４、ＺＮＦ５４６、ＺＮＦ７８０Ｂ、ＺＮＦ６９９、ＺＮＦ１７７、ＺＮＦ５６０、ＺＮＦ５８３、ＺＮＦ７０７、ＺＮＦ８０８、ＺＫＳＣＡＮ５、ＺＮＦ１３７Ｐ、ＺＮＦ６１１、ＺＮＦ６００、ＺＮＦ２８、ＺＮＦ７７３、ＺＮＦ５４９、ＺＮＦ５５０、ＺＮＦ４１６、ＺＩＫ１、ＺＮＦ２１１、ＺＮＦ５２７、ＺＮＦ５６９、ＺＮＦ７９３、ＺＮＦ５７１－ＡＳ１、ＺＮＦ５４０、ＺＮＦ５７１、ＺＮＦ６０７、ＺＮＦ７５Ａ、ＺＮＦ２０５、ＺＮＦ１７５、ＺＮＦ２６８、ＺＮＦ３５４Ｂ、ＺＮＦ１３５、ＺＮＦ２２１、ＺＮＦ２８５、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ３０、ＺＮＦ３０４、ＺＮＦ２５４、ＺＮＦ７０１、ＺＮＦ４１８、ＺＮＦ７１、ＺＮＦ５７０、ＺＮＦ７０５Ｅ、ＫＲＢＯＸ１、ＺＮＦ５１０、ＺＮＦ７７８、ＰＲＤＭ９、ＺＮＦ２４８、ＺＮＦ８４５、ＺＮＦ５２５、ＺＮＦ７６５、ＺＮＦ８１３、ＺＮＦ７４７、ＺＮＦ７６４、ＺＮＦ７８５、ＺＮＦ６８９、ＺＮＦ３１１、ＺＮＦ１６９、ＺＮＦ４８３、ＺＮＦ４９３、ＺＮＦ１８９、ＺＮＦ６５８、ＺＮＦ５６４、ＺＮＦ４９０、ＺＮＦ７９１、ＺＮＦ６７８、ＺＮＦ４５４、ＺＮＦ３４、ＺＮＦ７、ＺＮＦ２５０、ＺＮＦ７０５Ｄ、ＺＮＦ６４１、ＺＮＦ２、ＺＮＦ５５４、ＺＮＦ５５５、ＺＮＦ５５６、ＺＮＦ５９６、ＺＮＦ５１７、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ１８、ＺＮＦ８２９、ＺＮＦ７７２、ＺＮＦ１７、ＺＮＦ１１２、ＺＮＦ５１４、ＺＮＦ６８８、ＰＲＤＭ７、ＺＮＦ６９５、ＺＮＦ６７０－ＺＮＦ６９５、ＺＮＦ１３８、ＺＮＦ６７０、ＺＮＦ１９、ＺＮＦ３１６、ＺＮＦ１２、ＺＮＦ２０２、ＲＢＡＫ、ＺＮＦ８３、ＺＮＦ４６８、ＺＮＦ４７９、ＺＮＦ６７９、ＺＮＦ７３６、ＺＮＦ６８０、ＺＮＦ２７３、ＺＮＦ１０７、ＺＮＦ２６７、ＺＫＳＣＡＮ８、ＺＮＦ８４、ＺＮＦ５７３、ＺＮＦ２３、ＺＮＦ５５９、ＺＮＦ４４、ＺＮＦ５６３、ＺＮＦ４４２、ＺＮＦ７９９、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ７０９、ＺＮＦ５６６、ＺＮＦ６９、ＺＮＦ７００、ＺＮＦ７６３、ＺＮＦ４３３－ＡＳ１、ＺＮＦ４３３、ＺＮＦ８７８、ＺＮＦ８４４、ＺＮＦ７８８Ｐ、ＺＮＦ２０、ＺＮＦ６２５－ＺＮＦ２０、ＺＮＦ６２５、ＺＮＦ６０６、ＺＮＦ５３０、ＺＮＦ５７７、ＺＮＦ６４９、ＺＮＦ６１３、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ３１７、ＺＮＦ３００、ＺＮＦ１８０、ＺＮＦ４１５、ＶＮ１Ｒ１、ＺＮＦ２６６、ＺＮＦ７３８、ＺＮＦ４４５、ＺＮＦ８５２、ＺＫＳＣＡＮ７、ＺＮＦ６６０、ＭＰＲＩＰＰ１、ＺＮＦ１９７、ＺＮＦ５６７、ＺＮＦ５８２、ＺＮＦ４３９、ＺＦＰ３０、ＺＮＦ５５９－ＺＮＦ１７７、ＺＮＦ２２６、ＺＮＦ８４１、ＺＮＦ５４４、ＺＮＦ２３３、ＺＮＦ５３４、ＺＮＦ８３６、ＺＮＦ３２０、ＫＲＢＡ２、ＺＮＦ７６１、ＺＮＦ３８３、ＺＮＦ２２４、ＺＮＦ５５１、ＺＮＦ１５４、ＺＮＦ６７１、ＺＮＦ７７６、ＺＮＦ７８０Ａ、ＺＮＦ８８８、ＺＮＦ８１６－ＺＮＦ３２１Ｐ、ＺＮＦ３２１Ｐ、ＺＮＦ８１６、ＺＮＦ３４７、ＺＮＦ６６５、ＺＮＦ６７７、ＺＮＦ１６０、ＺＮＦ１８４、ＺＮＦ１４０、ＺＮＦ５８９、ＺＮＦ８９１、ＺＦＰ６９Ｂ、ＺＮＦ４３６、ＰＯＧＫ、ＺＮＦ６６９、ＺＦＰ６９、ＺＮＦ６８４、ＺＮＦ１２４、ＺＮＦ４９６、及びそれらの配列バリアントからなる群から選択される、請求項１８に記載の遺伝子リプレッサー系。
  20. 前記ＫＲＡＢドメインが、ＺＮＦ１０又はＺＩＭ３から選択される、請求項１９に記載の遺伝子リプレッサー系。
  21. 前記ＫＲＡＢドメインが、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる配列の群から選択される、請求項１８に記載の遺伝子リプレッサー系。
  22. 前記ＫＲＡＢドメインが、配列番号８８９～２１００及び２３３２～３３２３９からなる配列の群から選択される、請求項１８に記載の遺伝子リプレッサー系。
  23. 前記ＫＲＡＢドメインが、
    ａ）ＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＥＸ７（
    ｉ）Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、若しくはＦであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ｌ若しくはＭであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＲである）、
    ｂ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（
    ｉ）Ｘ１は、Ｌ若しくはＶであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、若しくはＶであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ａ、Ｆ、若しくはＳであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｌ若しくはＶであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、若しくはＹであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ａ、Ｃ、Ｐ、Ｑ、若しくはＳであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、若しくはＶであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ａ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、
    ｉｘ）Ｘ９は、Ｋ若しくはＲである）、
    ｃ）ＱＸ１Ｘ２ＬＹＲＸ３ＶＭＸ４（配列番号５９３４５）（
    ｉ）Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｄ、Ｅ、若しくはＳであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｌ若しくはＲである）、
    ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ４ＤＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号５９３４６）（
    ｉ）Ｘ１は、Ａ、Ｌ、Ｐ、若しくはＳであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ｌ若しくはＶであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｓ若しくはＴであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、若しくはＲであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ａ若しくはＴであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ｉ若しくはＶであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ｓ若しくはＴであり、
    ｉｘ）Ｘ９は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、
    ｘ）Ｘ１０は、Ｅ若しくはＮであり、
    ｘｉ）Ｘ１１は、Ｅ若しくはＱである）、
    ｅ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（
    ｉ）Ｘ１は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ｅ若しくはＫであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｃ若しくはＷであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、若しくはＶであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、若しくはＶであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、若しくはＶであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、若しくはＲであり、
    ｉｘ）Ｘ９は、Ａ、Ｄ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、若しくはＶであり、
    ｘ）Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、若しくはＶである）、
    ｆ）ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（
    ｉ）Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ｄ若しくはＥであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、若しくはＲであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｎ若しくはＴであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｆ若しくはＹであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、若しくはＳであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、若しくはＮであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ｌ若しくはＶであり、
    ｉｘ）Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、又はＶであり、
    ｘ）Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、若しくはＳである）、
    ｇ）ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（
    ｉ）Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、又はＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｉ若しくはＶであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、若しくはＹであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｓ若しくはＴであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｄ若しくはＥであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、若しくはＲである）、
    ｈ）Ｘ１ＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＥＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（
    ｉ）Ｘ１は、Ｋ若しくはＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、若しくはＮであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、若しくはＶであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｉ若しくはＶであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｆ、Ｓ、若しくはＴであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、若しくはＷであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ｅ、Ｇ、若しくはＲであり、
    ｉｘ）Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、若しくはＫであり、
    ｘ）Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、若しくはＥであり、
    ｘｉ）Ｘ１１は、Ｌ若しくはＰであり、
    ｘｉｉ）Ｘ１２は、Ｃ若しくはＷである）、又は
    ｉ）Ｘ１ＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５Ｘ６（
    ｉ）Ｘ１は、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、若しくはＷであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、若しくはＳであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｌ、Ｐ、Ｓ、若しくはＴであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ａ、Ｓ、若しくはＴであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｋ若しくはＲであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、若しくはＴである）からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含む、請求項２１又は２２に記載の遺伝子リプレッサー系。
  24. 前記ＫＲＡＢドメインが、第１及び第２の配列モチーフを含み、
    ａ）前記第１の配列モチーフが、配列ＬＹＸ１Ｘ２ＶＭＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号５９３４８）（
    ｉ）Ｘ１は、Ｋ又はＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ｄ又はＥであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｌ、Ｑ、又はＲであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｎ又はＴであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｆ又はＹであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、又はＳであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｈ、Ｌ、又はＮであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ｌ又はＶであり、
    ｉｘ）Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、又はＶであり、
    ｘ）Ｘ１０は、Ａ、Ｆ、又はＳである）を含み、
    ｂ）前記第２の配列モチーフが、配列ＦＸ１ＤＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＷＸ８（配列番号５９３４９）（
    ｉ）Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、又はＲであり、
    ｉｉ）Ｘ２は、Ａ、Ｓ、又はＴであり、
    ｉｉｉ）Ｘ３は、Ｉ又はＶであり、
    ｉｖ）Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、又はＹであり、
    ｖ）Ｘ５は、Ｓ又はＴであり、
    ｖｉ）Ｘ６は、Ｅ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、又はＷであり、
    ｖｉｉ）Ｘ７は、Ｄ又はＥであり、
    ｖｉｉｉ）Ｘ８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、又はＲである）を含む、請求項２２又は２３に記載の遺伝子リプレッサー系。
  25. 前記ＫＲＡＢドメイン配列が、配列番号５７７４６～５９３４２、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項２４に記載の遺伝子リプレッサー系。
  26. 前記ＫＲＡＢドメイン配列が、配列番号５７７４６～５７８４０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項２５に記載の遺伝子リプレッサー系。
  27. 前記ＫＲＡＢドメイン配列が、配列番号５７７４６～５７７５５、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項２５に記載の遺伝子リプレッサー系。
  28. 前記第２の転写リプレッサードメイン及び前記第３の転写リプレッサードメインが各々、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）ドメインである、請求項１６～２７のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  29. 前記第２の転写リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３Ａ又はそのサブドメインである、請求項２８に記載の遺伝子リプレッサー系。
  30. 前記第２の転写リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３Ａの触媒ドメイン（ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ）である、請求項２９に記載の遺伝子リプレッサー系。
  31. 前記ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤが、配列番号３３６２５～５７５４３及び５９４５０、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む、請求項３０に記載の遺伝子リプレッサー系。
  32. 前記第３の転写リプレッサードメインが、ＤＮＭＴ３Ｌ相互作用ドメイン（ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ）である、請求項２６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  33. 前記ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤが、配列番号５９６２５の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３２に記載の遺伝子リプレッサー系。
  34. 前記融合タンパク質が、前記ＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインにＮ末端で連結されたＡＴＲＸ－ＤＮＭＴ３－ＤＮＭＴ３Ｌ（ＡＤＤ）ドメインを含む、請求項３０又は３１に記載の遺伝子リプレッサー系。
  35. 前記ＡＤＤドメインが、配列番号５９４５２の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３４に記載の遺伝子リプレッサー系。
  36. 前記融合タンパク質が、１つ以上のリンカーペプチド配列を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  37. 前記リンカーペプチド配列が、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号３３２４０）、（ＧＳ）ｎ（配列番号３３２４１）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４３）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４４）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２４５）、ＧＧＳＧ（配列番号３３２４６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３３２４７）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３３２４８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３３２４９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３３２５０）、ＧＳＳＳＧ（配列番号３３２５１）、（ＧＰ）ｎ（配列番号３３２５２）、ＧＰＧＰ（配列番号３３２５３）、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３２５４）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号３３２５５）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号３３２５６）、ＰＰＰＧ（配列番号３３２５７）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２５８）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号３３２５９）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６０）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３２６１）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３３２６２）、ＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号３３２６３）、ＧＳＧＳＧＧＧ（配列番号５７６２８）、ＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣ（配列番号５７６２４）、ＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号５７６２５）、ＧＧＡＴＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡ（配列番号５７６２７）、ＧＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＡＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＧＣＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＧＴＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＧ（配列番号５７６２０）、ＳＳＧＮＳＮＡＮＳＲＧＰＳＦＳＳＧＬＶＰＬＳＬＲＧＳＨ（配列番号５７６２３）、ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥ（配列番号５７６２１）、及びＴＣＴＡＧＣＧＧＣＡＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＴＡＡＣＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴ（配列番号５７６２２）からなる群から選択され、ｎは、１～５の整数である、請求項３６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  38. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、触媒活性を伴わないＩＩ型、触媒活性を伴わないＶ型、又は触媒活性を伴わないＶＩ型タンパク質からなる群から選択される触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、請求項１～３７のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  39. 前記触媒活性を伴わないＩＩ型タンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項３８に記載の遺伝子リプレッサー系。
  40. 触媒活性を伴わないＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃａｓ１４、及びＣａｓΦタンパク質からなる群から選択される前記触媒活性を伴わないＶ型タンパク質、請求項３８に記載の遺伝子リプレッサー系。
  41. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、触媒活性を伴わないＣａｓＸタンパク質（ｄＣａｓＸ）である、請求項４０に記載の遺伝子リプレッサー系。
  42. 前記ｄＣａｓＸが、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８、又はそれらに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む、請求項４１に記載の遺伝子リプレッサー系。
  43. 前記ｄＣａｓＸが、表４に記載される配列番号１７～３６及び５９３５３～５９３５８の配列からなる群から選択される配列を含む、請求項４１に記載の遺伝子リプレッサー系。
  44. 前記ｄＣａｓＸが、配列番号１８の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４３に記載の遺伝子リプレッサー系。
  45. 前記融合タンパク質が、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  46. 前記１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３２８９）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３３２９０）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３３２９１）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号３３２９２）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号３３２９３）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３３２９４）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３３２９５）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３３２９６）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１６６）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３３２９８）、ＤＲＬＲＲ（配列番号３３２９９）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３３３００）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３３３０１）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３３３０２）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３３３０３）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３３３０４）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号３３３０５）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号３３３０６）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号３３３０７）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号３３３０８）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号３３３０９）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号３３３１０）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号３３３１１）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号３３３１２）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号３３３１３）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３３３１４）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３３３１５）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号３３３１６）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３３３１７）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号３３３１８）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号３３３１９）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号３３３２０）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号３３３２１）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号３３３２２）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号３３３２３）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号３３３２４）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３３３２５）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３２６）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号３３３２７）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号３３３２８）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号３３３２９）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号３３３３０）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号３３３３１）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号３３３３２）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３３３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号３３３３４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号３３３３５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号３３３３６）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号３３３３７）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３３３８）、及び配列番号３７～１１２からなる配列の群から選択される、請求項４５に記載の遺伝子リプレッサー系。
  47. 前記１つ以上のＮＬＳが、前記融合タンパク質のＣ末端で又はその近くで連結されている、請求項４５又は４６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  48. 前記１つ以上のＮＬＳが、前記融合タンパク質のＮ末端で又はその近くで連結されている、請求項４５又は４６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  49. 前記１つ以上のＮＬＳが、前記融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方で又はそれらの近くで連結されている、請求項４５又は４６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  50. 前記１つ以上のＮＬＳが、表５に記載される配列番号３７～７１の群から選択され、前記融合タンパク質のＮ末端で又はその近くで連結されている、請求項４５に記載の遺伝子リプレッサー系。
  51. 前記１つ以上のＮＬＳが、表６に記載される配列番号７２～１１２の群から選択され、前記融合タンパク質のＣ末端で又はその近くで連結されている、請求項４５に記載の遺伝子リプレッサー系。
  52. １つ以上のＮＬＳが、表５に記載される配列番号３７～７１からなる群から選択されるＮＬＳを含み、前記融合タンパク質のＮ末端で又はその近くで連結されており、表６に記載される配列番号７２～１１２からなる群から選択されるＮＬＳを含み、前記融合タンパク質のＣ末端で又はその近くで連結されている、請求項４５に記載の遺伝子リプレッサー系。
  53. 前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、
    ａ）ＮＬＳ－リンカー４－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー１－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ、
    ｂ）ＮＬＳ－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ－リンカー１－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ、
    ｃ）ＮＬＳ－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー１－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ、
    ｄ）ＮＬＳ－ＫＲＡＢ－リンカー３－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー１－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＮＬＳ、又は
    ｅ）ＮＬＳ－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー３－ＫＲＡＢ－リンカー１－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＮＬＳで構成されている、請求項４５～５２のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  54. 前記融合タンパク質が、図７に描写される構成に従って構成されている、請求項４５～５２のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  55. 前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、
    ａ）ＮＬＳ－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー１－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ、
    ｂ）ＮＬＳ－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ－リンカー１－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ、
    ｃ）ＮＬＳ－リンカー３－ｄＣａｓＸ－リンカー１－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー３－ＫＲＡＢ－ＮＬＳ、
    ｄ）ＮＬＳ－ＫＲＡＢ－リンカー３－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー１－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＮＬＳ、又は
    ｅ）ＮＬＳ－ＡＤＤ－ＤＮＭＴ３Ａ ＣＤ－リンカー２－ＤＮＭＴ３Ｌ ＩＤ－リンカー３－ＫＲＡＢ－リンカー１－ｄＣａｓＸ－リンカー３－ＮＬＳで構成されている、請求項４５～５２のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  56. 前記融合タンパク質が、図４５に描写される構成に従って構成されている、請求項４５～５２のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  57. 前記融合タンパク質が、配列番号５９５０８～５９５６７及び５９６７３～６００１２、又はそれらに対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む、請求項５５又は５６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  58. 前記融合タンパク質が、配列番号５９５０８～５９５６７及び５９６７３～６００１２からなる群から選択される配列を含む、請求項５５又は５６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  59. 前記ｇＲＮＡが、表２に記載される配列番号２２３８～２３３１、５７５４４～５７５８９及び５９３５２、又はそれらに対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む足場を有する、請求項１～５８のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  60. 前記ｇＲＮＡが、表２に記載される配列番号２２３８～２３３１、５７５４４～５７５８９及び５９３５２からなる群から選択される配列を含む足場を有する、請求項１～５８のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  61. 前記ｇＲＮＡが、配列番号２２９２の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場を有する、請求項１～６０のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  62. 前記ｇＲＮＡが、配列番号５９３５２の配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場を有する、請求項１～６０のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  63. 前記ｇＲＮＡ足場が、前記配列に対する１つ以上の化学修飾を含む、請求項６１又は６２に記載の遺伝子リプレッサー系。
  64. 前記化学修飾が、前記配列の１つ以上のヌクレオチドへの２’Ｏ－メチル基の付加である、請求項６３に記載の遺伝子リプレッサー系。
  65. 前記化学修飾が、前記配列の２つ以上のヌクレオチド間のホスホロチオエート結合の置換である、請求項６３又は６４に記載の遺伝子リプレッサー系。
  66. 前記ｇＲＮＡが、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヌクレオチドを有する標的化配列を含む、請求項１～６５のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  67. 前記標的化配列に対して相補的な標的核酸配列が、遺伝子中の転写開始部位（ＴＳＳ）の１ｋｂ以内にある、請求項６６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  68. 前記標的化配列に対して相補的な前記標的核酸配列が、前記遺伝子のＴＳＳの５００ｂｐ上流～５００ｂｐ下流内にある、請求項６６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  69. 前記標的化配列に対して相補的な前記標的核酸配列が、前記遺伝子のＴＳＳの３００ｂｐ上流～３００ｂｐ下流内にある、請求項６６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  70. 前記標的化配列に対して相補的な前記標的核酸配列が、前記遺伝子のエンハンサーの１ｋｂ以内にある、請求項６６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  71. 前記標的化配列に対して相補的な前記標的核酸配列が、前記遺伝子の３’非翻訳領域内にある、請求項６６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  72. 前記標的化配列に対して相補的な前記標的核酸配列が、前記遺伝子のエクソン内にある、請求項６６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  73. 前記標的化配列に対して相補的な前記標的核酸配列が、前記遺伝子のエクソン１内にある、請求項７２に記載の遺伝子リプレッサー系。
  74. 前記ＲＮＰが、前記標的核酸に結合することができるが、前記標的核酸を切断することができない、請求項１～７３のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  75. 前記標的核酸に結合すると、前記遺伝子が、エピジェネティックに修飾される、請求項７４に記載の遺伝子リプレッサー系。
  76. エピジェネティックな修飾後、前記遺伝子の転写が、抑制される、請求項７５に記載の遺伝子リプレッサー系。
  77. 前記遺伝子の転写が、インビトロアッセイで評価された場合、未処置遺伝子と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％抑制される、請求項７６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  78. 前記遺伝子の転写の前記抑制が、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約７日、少なくとも約１か月、又は少なくとも約２か月維持される、請求項７６に記載の遺伝子リプレッサー系。
  79. 請求項１～７８のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系の前記融合タンパク質をコードする核酸。
  80. 前記核酸配列が、ｍＲＮＡである、請求項７９に記載の核酸。
  81. 前記ｍＲＮＡが、化学修飾されている、請求項８０に記載の核酸。
  82. 請求項１～７８のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系の前記ｇＲＮＡをコードする核酸。
  83. 前記核酸配列が、真核細胞中の発現に最適化されたコドンである、請求項７９～８１のいずれか一項に記載の核酸。
  84. 請求項７９～８１のいずれか一項に記載の核酸を含む脂質ナノ粒子。
  85. 請求項８２に記載の核酸を含む脂質ナノ粒子。
  86. 請求項１～７８のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系の前記融合タンパク質をコードする第１の核酸と、前記ｇＲＮＡを含む第２の核酸と、を含む脂質ナノ粒子。
  87. 請求項１～７８のいずれか一項に記載のリプレッサー系をキャプシドで包む脂質ナノ粒子の第１の集団及び脂質ナノ粒子の第２の集団を含む、脂質ナノ粒子組成物であって、前記第１の集団が、前記融合タンパク質をコードする第１の核酸をキャプシドで包む脂質ナノ粒子を含み、脂質ナノ粒子の第２の集団が、前記ｇＲＮＡをコードする第２の核酸をキャプシドで包むか、又は前記ｇＲＮＡを含む、ナノ粒子を含む、脂質ナノ粒子組成物。
  88. 請求項７９～８３のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  89. 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、及びＲＮＡベクターからなる群から選択される、請求項８８に記載のベクター。
  90. 前記ベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項８９に記載のベクター。
  91. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、及びＡＡＶＲｈ１０から選択される血清型を有する、請求項９０に記載のベクター。
  92. 前記ＡＡＶ内の５’と３’逆位末端反復（ＩＴＲ）との間の導入遺伝子として組み込まれた、前記融合タンパク質及び前記ｇＲＮＡをコードする核酸を含む、請求項９０又は９１に記載のベクター。
  93. 送達粒子系（ＸＤＰ）であって、
    ａ）マトリクスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＣ）、キャプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１ペプチド、ｐ６ペプチド、ｐ２Ａペプチド、ｐ２Ｂペプチド、ｐ１０ペプチド、ｐ１２ペプチド、ｐｐ２１／２４ペプチド、ｐ１２／ｐ３／ｐ８ペプチド、ｐ２０ペプチド、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、Ｑコートタンパク質、Ｕ１Ａシグナル認識粒子、ファージＲ－ループ、Ｒｅｖタンパク質、及びＰｓｉパッケージング要素からなる群から選択される１つ以上の成分と、
    ｂ）請求項１～７４のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系を含むＲＮＰであって、前記ＸＤＰ内にキャプシドで包まれる、ＲＮＰと、
    ｃ）標的細胞への前記ＸＤＰの結合及び融合を提供する、前記ＸＤＰ表面上に組み込まれた指向性因子と、を含む、送達粒子系（ＸＤＰ）。
  94. 前記指向性因子が、シュードタイピングウイルスエンベロープ糖タンパク質、抗体断片、又は細胞受容体断片からなる群から選択される、請求項９３に記載のＸＤＰ。
  95. 細胞集団中の遺伝子の標的核酸配列の転写を抑制する方法であって、前記方法が、前記細胞に、
    ａ）請求項１～７８のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系を含むＲＮＰ、
    ｂ）請求項７９～８３のいずれか一項に記載の核酸、
    ｃ）請求項８８～９２のいずれか一項に記載のベクター、
    ｄ）請求項９３若しくは９４に記載のＸＤＰ、
    ｅ）請求項８３～８６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は
    ｆ）請求項８７に記載の脂質ナノ粒子組成物、を導入することを含み、
    前記標的核酸への前記遺伝子リプレッサー系の前記導入又は発現されたＲＮＰの結合後、前記遺伝子の転写が、前記細胞中で抑制される、方法。
  96. 前記細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血幹細胞、ニューロン前駆細胞、ニューロン、星状細胞、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、網膜細胞、がん細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自家移植拡張心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、造血幹細胞、骨髄由来前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多分化能前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、及び出生後幹細胞からなる群から選択される、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記ＲＮＰの結合位置が、
    ａ）前記遺伝子中の転写開始部位（ＴＳＳ）に対して５’の３００～１，０００塩基対以内の配列、
    ｂ）前記遺伝子中のＴＳＳに対して３’の３００～１，０００塩基対以内の配列、
    ｃ）前記遺伝子のエンハンサーに対して３００～１，０００塩基対以内の配列、
    ｄ）前記遺伝子のオープンリーディングフレーム内の配列、
    ｅ）前記遺伝子のエクソン内の配列、又は
    ｆ）前記遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の配列からなる群から選択される、請求項９５又は９６に記載の方法。
  98. 前記細胞集団中の前記遺伝子の転写が、インビトロアッセイで評価された場合、未処置細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％大きく抑制される、請求項９５～９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. オフターゲットメチル化又はオフターゲット転写抑制が、インビトロアッセイで評価された場合、前記細胞中で約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である、請求項９５～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記細胞中の転写の前記抑制が、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約７日、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、少なくとも約２か月、又は少なくとも約６か月維持される、請求項９５～９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 第２のｇＲＮＡ又は前記第２のｇＮＡをコードする核酸を更に含み、前記第２のｇＮＡが、前記標的核酸配列の異なる部分に対して相補的な標的化配列を有し、触媒活性を伴わないクラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び１つ以上の転写リプレッサードメインを含む前記融合タンパク質とともに、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成することができる、請求項９５～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記方法が、前記細胞中の遺伝的エピジェネティック変化を媒介する、請求項９５～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 遺伝子変異によって引き起こされる障害を有する対象を治療する方法であって、治療有効用量の
    ａ）請求項１～７８のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系を含むＲＮＰ、
    ｂ）請求項７９～８３のいずれか一項に記載の核酸、
    ｃ）請求項８８～９２のいずれか一項に記載のベクター、
    ｄ）請求項９３若しくは９４に記載のＸＤＰ、
    ｅ）請求項８３～８６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は
    ｆ）請求項８７に記載の脂質ナノ粒子組成物、を投与することを含み、
    前記対象の細胞中の遺伝子の前記標的核酸への前記遺伝子リプレッサー系の前記投入又は発現されたＲＮＰの結合後、前記遺伝子の転写が、抑制される、方法。
  104. 前記細胞中の前記遺伝子の転写が、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも９９％抑制される、請求項１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記細胞中の前記遺伝子の転写の前記抑制が、少なくとも約８時間、少なくとも約１日、少なくとも約７日、少なくとも約１か月、又は少なくとも約２か月維持される、請求項１０３に記載の方法。
  106. 前記方法が、前記対象の前記細胞中の遺伝的エピジェネティック変化を媒介する、請求項１０３～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記ＲＮＰ、核酸、ＡＡＶベクター、ＸＤＰ、又は前記脂質ナノ粒子が、皮下、皮内、神経内、節内、髄内、筋肉内、腰椎内、髄腔内、くも膜下、脳室内、嚢内、静脈内、リンパ管内、又は腹腔内経路から選択される投与経路によって前記対象に投与され、前記投与方法が、注射、注入、若しくは移植、又はその組み合わせである、請求項１０３～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記ＸＤＰ又は前記脂質ナノ粒子が、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６粒子／ｋｇの用量で投与される、請求項１０７に記載の方法。
  109. 前記ＸＤＰ又は前記脂質ナノ粒子が、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ～約１×１０１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ～約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ～約１×１０１４粒子／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１０７に記載の方法。
  110. 前記ＡＡＶベクターが、少なくとも約１×１０８ベクターゲノム（ｖｇ）、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１０７に記載の方法。
  111. 前記ＡＡＶベクターが、少なくとも約１×１０５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１０７に記載の方法。
  112. 第１の脂質ナノ粒子及び第２の脂質ナノ粒子が各々、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６粒子／ｋｇの用量で投与される、請求項１０７に記載の方法。
  113. 前記第１の脂質ナノ粒子及び前記第２の脂質ナノ粒子が各々、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ～約１×１０１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ～約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ～約１×１０１４粒子／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１０７に記載の方法。
  114. 前記ＸＤＰ、前記ＡＡＶベクター、前記脂質ナノ粒子、又は前記第１の脂質ナノ粒子及び第２の脂質ナノ粒子が、１つ以上の連続用量を含む治療レジメンに従って前記対象に投与される、請求項１０３～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記治療有効用量が、少なくとも２週間、若しくは少なくとも１か月、若しくは少なくとも２か月、若しくは少なくとも３か月、若しくは少なくとも４か月、若しくは少なくとも５か月、若しくは少なくとも６か月の期間にわたって２回以上の用量として、又は年１回、前記対象に投与される、請求項１０３～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. 前記治療が、前記対象における前記障害に関連する少なくとも１つの臨床的に関連する評価項目の改善をもたらす、請求項１０３～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記対象が、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項１０３～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記対象が、ヒトである、請求項１０３～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  119. 請求項１～９２のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系、核酸、ベクター、ＸＤＰ、又はＬＮＰと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む医薬組成物。
  120. 遺伝子変異によって引き起こされる障害を有する対象の治療における薬剤として使用するための、請求項１～７８のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  121. 前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の１ヌクレオチド３’に位置する非標的鎖配列に対して相補的である、請求項１～７８のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
  122. 前記ＰＡＭ配列が、ＴＣモチーフを含む、請求項１２１に記載の組成物。
  123. 前記ＰＡＭ配列が、ＡＴＣ、ＧＴＣ、ＣＴＣ、又はＴＴＣを含む、請求項１２１又は１２２に記載の組成物。
  124. 遺伝子変異によって引き起こされる障害を有する対象の治療における薬剤の製造に使用するための、請求項１～７８のいずれか一項に記載の遺伝子リプレッサー系。
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