JP2024527471A - グランザイムｂ検出 - Google Patents

Abstract

本開示は、グランザイムＢの検出に使用するための新規な切断可能ペプチドプローブの開発、ならびに医療および生物学的環境におけるプローブの使用方法に関する。プローブは、ペプチドに連結または結合した蛍光部分、およびペプチドに連結または結合した消光部分を含むことができ、ペプチドの切断時に、蛍光部分は発光する。

Description

本開示は、グランザイムＢの検出に使用する新規プローブの開発、ならびに医療および生物学的設定におけるプローブの使用方法に関する。

ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答は、癌から人体を保護する主要な免疫機構の一つである。腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の存在は、癌患者における良好な予後を示す。しかしながら、患者が免疫療法にどのように反応するかには大きなばらつきがある。臨床画像は腫瘍の大きさや、ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤をある程度は測定できるが、免疫系が癌細胞（ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ）に対してどの程度効率的に反応しているかを読み取ることはできない。この限界によって、新薬の評価や、標的外毒性を最小化するための免疫療法の個別最適化が妨げられる。腫瘍浸潤Ｔ細胞の活性を直接測定する化学的アプローチは、治療に対する反応の信頼できる指標を提供し、抗癌剤のスクリーニングを加速する。

ＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏモニタリングのための標準的方法として、細胞毒性ＬＤＨ、ＭＴＳまたは^５１Ｃｒ放出アッセイが用いられる。これらのアッセイは、Ｔ細胞特異的抗癌反応よりもむしろバルクの細胞毒性を報告する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性は、抗体を用いて細胞外サイトカインと膜蛋白質（例えば、ＣＤ１０７ａ）の濃度を測定することにより間接的にモニターできる。これらの方法はＴ細胞機能を評価するが、癌細胞死を直接報告しないので、腫瘍における免疫殺傷能力のバイオマーカーではない。グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）の活性感知レポーターの化学的なデザインは、癌におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性活性をモニターするための効果的な戦略である。ＧｚｍＢは、抗原による認識によって癌細胞内での放出と活性化が促されるまで、Ｔ細胞内で不活性に貯蔵されるセリンプロテアーゼである。ＧｚｍＢを検出するためのプローブには、この酵素の活性化型と不活性化型を区別しない抗体^１と融合蛋白質、およびＴｈｏｒｎｂｅｒｒｙらによって最初に記述されたＩｌｅ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ（ＩＥＰＤ）配列に基づく活性化可能な構築物が含まれる^２。後者のいくつかの例には、尿分析のためのナノプローブが含まれる^３，４。これらの構築物はすべて、限られた触媒効率（例えば、ｐｍｏｌ ｍｉｎ^－１の範囲のＶ_ｍａｘおよびｍＭ^－１ ｓ^－１付近のｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ比は表１参照）の化学足場に依存する。
本開示の目的の一つは、上述の欠点の一つ以上を回避および／または軽減することである。

本開示は、グランザイムＢによって切断可能であり、切断時に、例えば、シグナルの増加、１つ以上の物理化学的特性の変化またはシグナルノイズ比の増加によって検出可能な切断ペプチドを生成するプローブの開発に部分的に基づいている。

第１の態様において、グランザイムＢの検出に使用するためのプローブが提供され、該プローブは、検出可能な部分に連結または結合されたグランザイムＢ切断可能ペプチドを含み、該グランザイムＢ切断可能ペプチドは、下記の配列を有するヘキサペプチド配列を含む、または本質的にそれから成る、またはそれから成る。
Ｐ４－Ｐ３－Ｐ２－Ｐ１－Ｘ１－Ｘ２
ここで、Ｐ４はＩまたはＶである；Ｐ３はＥ、ＱまたはＭである；Ｐ２は任意のアミノ酸である；Ｐ１はＤ、Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｗ、またはＲである；Ｘ２はＧ、Ｌ、またはＲである。

ペプチドはＰ１アミノ酸残基とＸ１アミノ酸残基の間で切断される。本開示を通して、慣習的な１文字アミノ酸コードを用いてアミノ酸を定義する。

必要に応じて、ヘキサペプチド配列は、下記の配列を含む、または本質的にそれから成る、またはそれから成る。
Ｉ－Ｅ－Ｐ／Ｆ－Ｄ－Ｘ１－Ｘ２
ここで、Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｗ、またはＲ；であり、Ｘ２はＧ、Ｌ、またはＲである。

誤解を避けるために、Ｐ／ＦはＰまたはＦを意味すると理解されている。

本明細書に記載された方法は、定性的または定量的な意味で使用することができる。したがって、特定の態様において、それらの方法は、グランザイムＢ活性の測定に使用することができる。

ペプチドの切断後、検出可能な部分を含む切断されたペプチドが生成され、これを検出することができる。放射線測定、常磁性造影剤、常磁性または超常磁性粒子および光学的に検出可能な部分を含む、種々の検出可能な部分を想定することができる。１つの共示では、検出可能な部分は、ペプチドと連結または結合したときに最初は消光されている。しかし、グランザイムＢによるペプチドの切断に続いて、最初は消光されているシグナルの脱消光が起こり、検出可能なシグナルの増加と物理化学的性質の変化が観察される。

本開示によれば、切断されたペプチドを非切断ペプチドから識別することが可能である。想定される１つの方法は、無傷のペプチド中ではシグナルを消光するように設計されているが、ペプチド切断後には消光されない、消光部分の使用を採用する。消光または脱消光されない検出可能なシグナルを使用することも可能である。一実施形態では、非切断ペプチドは細胞によって取り込まれ、切断が内部的に行われるので、グランザイムＢを有する標的細胞は、シグナルの増加（例えば蛍光）および／または物理化学的特性の変化を示す。別の実施形態では、切断ペプチドは細胞によって取り込まれ得るが、非切断ペプチドは内部化されないことが想定される。このようにして、切断ペプチドは細胞の取り込みに続いて検出され得る。非切断ペプチドは、細胞による内部化を防止または低減する、部分または全体的な負電荷を有することができる。しかしながら、ペプチドが切断された後は、切断ペプチドは、その部分または負電荷を含まないため、それが内部化され、切断ペプチドが検出されるようになり得る。

本開示のプローブは、グランザイムＢに対して高度に特異的であり得る。この点に関して、高度に特異的とは、プローブが、カスパーゼ－３およびグランザイムＡを含む他のカスパーゼなどの他の酵素よりもグランザイムＢに対してより特異的であることを意味する。典型的には、本開示のプローブは、グランザイムＢに対して３０μＭ、２５μＭ、２０μＭ、１５μＭ、または１０μＭ未満のＫ_Ｍおよび／または１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、または１×１０^７より大きいｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ値を示す。

１つの教示において、検出される信号は、光信号であり得る。光信号は、視覚的および分光高度法的、並びにＣＣＤ、ＣＭＯＳセンサ、およびフォトダイオード等を含む光センサの使用を含む、当該技術分野で公知の様々な方法によって検出され得る。任意の適切な光検出方法を採用することができ、また、これに制限されない。

本開示の１つの教示に従って、信号部分は蛍光部分であってもよく、これはクエンチャー（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）や蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の方法の使用によって最初に消光される。蛍光信号の検出は、例えば、蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の増加または蛍光寿命の変化であってもよい。蛍光は、例えば、蛍光分光法、蛍光顕微鏡法、共焦点蛍光顕微鏡法、蛍光画像分析、フローサイトメトリー、レーザースキャンサイトメトリー、プレートマルチウェル蛍光リーダー、またはシンチレーションカウンターによって検出されてもよい。

Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）、および電子エネルギー移動（ＥＥＴ）としても知られるＦＲＥＴの原理は、励起されたドナー色素から空間的に近接して位置するアクセプタ色素またはクエンチャーへのエネルギー移動に基づく。ダークアクセプタまたはダーククエンチャーは、蛍光体（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）からの励起エネルギーを吸収し、そのエネルギーを熱として放散する物質である；一方、蛍光アクセプタまたは蛍光クエンチャーは、このエネルギーの多くを光として再放出する。アクセプタ種の蛍光量子効率に応じて、ドナー種からアクセプタ種に転送されたエネルギーは、内部変換によって非放射緩和を受けてドナーエネルギーのクエンチングにつながるか、アクセプタ種の蛍光によって放出されるかのいずれかになる。

ＦＲＥＴは、ドナー種とアクセプタ種が十分に近接している場合に、ドナー種とアクセプタ種の電子励起状態の間で発生し、ドナー種の励起状態エネルギーがアクセプタ種に転送される。その結果、ドナー種の蛍光期間が短くなり、ドナー種の蛍光が消光する。この原理の１つの応用では、本明細書で適用可能なように、蛍光部分は消光部分に近接するように配置される。この配置では、励起されたドナー蛍光部分からのエネルギーはアクセプタ消光部分に伝達され、蛍光ではなく熱として放散される。しかしながら、グランザイムＢによるペプチドの切断後のように、蛍光部分が消光部分に近接していない場合、蛍光部分の蛍光は消光部分によってもはや消光されず、例えば、蛍光強度の増加によって検出することができる。

したがって、本開示の１つの教示に従って、グランザイムＢの検出に使用するための高度に特異的なプローブが供給される。該プローブは、該ペプチドと連結または結合した蛍光部分、および該ペプチドと連結または結合した消光部分を含み、該ペプチドは、下記の配列を有するグランザイムＢ切断可能ヘキサペプチド配列を含む、該配列から本質的に成る、または該配列から成る。
Ｐ４－Ｐ３－Ｐ２－Ｐ１－Ｘ１－Ｘ２
ここで、Ｐ４はＩまたはＶである；Ｐ３はＥ、ＱまたはＭである；Ｐ２は任意のアミノ酸である；Ｐ１はＤ、または任意である
Ｉ Ｅ Ｐ／Ｆ Ｄ Ｘ１ Ｘ２
ここで、Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｗ、またはＲ；であり、Ｘ２はＧ、Ｌ、またはＲ；であり、
ここで、グランザイムＢによるペプチドの切断後、蛍光部分の脱消光が起こり、蛍光シグナルの検出可能な変化が観察され得る。

本開示がグランザイムＢによるペプチドの切断を対象としているため、本明細書に記載されるプローブおよび方法は、酵素的に活性なグランザイムＢの検出に関与している。したがって、本開示は、グランザイムＢが活性でない可能性のある他の教示を区別することができる。例えば、酵素による切断を伴わない基質結合は、その結合分子が酵素的に活性であるかどうかを示さない。さらに、グランザイムＢに結合する抗体を使用する方法は、グランザイムＢの活性化型と非活性化型を必ずしも区別しない。したがって、有利なことに、本発明は、不活性化型を含む可能性のあるグランザイムＢの単なる存在ではなく、活性化型グランザイムＢを同定することができる。さらに、本方法は、総グランザイムＢレベルを検出するための他の方法と組み合わせて使用することができる。このようにして、総グランザイムＢに対する活性化型グランザイムＢの比率を計算することが可能であり、不活性酵素の量の同定も可能である。

蛍光部分のような検出可能な部分は、任意の適切な方法によってペプチドに連結され得る。典型的には、検出可能な部分は、共有結合によってペプチドに連結される。例えば、検出可能な部分は、アミド結合を介してペプチドに連結され得る。検出可能な部分は、ペプチド配列に沿った任意の場所に連結され得るが、一実施形態では、検出可能な部分は、アミド結合を介して、ペプチドのＮまたはＣ末端のアミノ酸に共有結合され得る。一実施形態では、シグナル生成部分は、Ｎ末端のアミノ酸に共有結合され得る。アミノ酸側鎖を介した連結または共有結合も想定される。シグナル生成部分は、ペプチドに直接連結または共有結合してもよいし、検出可能部分とペプチドとの間のリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）分子を介して結合してもよい。

使用される場合、クエンチャー部分は、上述のように、検出可能部分と同様の方法でペプチドに連結または結合してもよい。しかしながら、クエンチャー部分は、一般に、ペプチド上の検出可能部分と同じ位置に連結または結合されない。一実施形態では、検出可能部分は、ＮまたはＣ末端のアミノ酸に、クエンチャー部分は、ＣまたはＮ末端のアミノ酸を介してそれぞれ連結または共有結合する。

検出可能部分、蛍光部分および／またはクエンチャー部分は、ペプチドに間接的に連結してもよい。例えば、１つの教示において、蛍光部分および／またはクエンチャー部分は、ラテックスナノ粒子などのナノ粒子内に連結、結合および／または埋め込まれてもよく、そのナノ粒子はペプチドに結合されてもよい。

使用される場合、適切なリンカー分子は、アルキル、アルケニル、またはポリエーテル鎖のような脂肪族化合物を含み、必要に応じてＣ_２～Ｃ_２４反復単位を有する。脂肪族分子は、例えば、１つ以上のカルボン酸および／またはアミノ基を含み得る。適切な脂肪族リンカーは、脂肪族ジアミン、例えば、１，２－ジアミノエタン～１，１０－ジアミノデカン、およびペグ化ジアミン、例えば、２，２’－オキシジエタナミン～１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタンを含む。

あるいは、１つ以上の天然または非天然に存在するアミノ酸および／またはイミノ酸を、連結基として使用することができる。

本発明での使用に適した蛍光部分は、単一の分子または分子色素を含むことができる。本発明に有用な色素は、４００から１０００ｎｍの範囲で蛍光を発する蛍光性の疎水性色素を含む。色素類には、オキソノール、ピリリウム、スクエア、クロコニック、ロジゾン、ポリアザインダセンまたはクマリン、シンチレーション色素（通常オキサゾール、ベンゾチアジアゾール、オキサジアゾール）、アリール置換およびヘテロアリール置換ポリオレフィン（Ｃ２－Ｃ８オレフィン部分）、メロシアニン類、ローダミン類、スルホシアニン類、カルボシアニン類、フタロシアニン類、オキサジン類、カルボスチリル類、ポルフィリン色素、ジピロメテナボロンジフルオリド色素、アザ－ジピロメテナボロンジフルオリド色素、およびオキサジン色素が含まれるが、これらに限定されるわけではない。市販の蛍光色素（Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｄｙｅ）は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから得ることができる。

本開示での使用に適した例示的なクエンチャー色素化合物は、単一分子または分子色素を含むことができる。適切なクエンチャー色素には、例えば、モレキュラープローブからのＤＡＢＣＹＬおよびＱＳＹシリーズ（ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＤａｒｋ Ｃｙ－ｄｙｅｓ（ｗｗｗ．ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）、Ｅｐｏｃｈ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＥｃｌｉｐｓｅ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ｄｙｅｓ（ｗｗｗ．ｅｐｏｃｈｂｉｏ．ｃｏｍ）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ｄｙｅｓ（ｗｗｗ．ｂｉｏｓｅａｒｃｈｔｅｃｈ．ｃｏｍ）、ＤＹＱ－ｄｙｅｓ（ｗｗｗ．ｄｙｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）、Ｂｅｒｒｙ＆ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓからのＢｌａｃｋ Ｂｅｒｒｙ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ｗｗｗ．ｂｅｒｒｙａｓｓｏｃ．ｃｏｍ）、ＡｎａＳｐｅｃ， Ｉｎｃ．からのＱＸＬクエンチャーおよびＯｓｗｅｌ（ｗｗｗ．ｏｓｗｅｌ．ｃｏｍ）からのＥｌｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ）））が含まれる。その他のクエンチャーには、メチルレッド、アイオワ・ブラックＦＱ、アイオワ・ブラックＲＱ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１（Ｌｉｃｏｒ）およびＳｉ－ローダミン系ＮＩＲ暗クエンチャー（Ｍｙｃｏｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１５， １３７， １４， ４７５９－４７６５）がある。

蛍光部分および消光色素は、ペプチド切断前に、任意の蛍光シグナルの適切な消光を確保するために、ペプチドに結合したときに十分に近接している必要がある。ここに示すように、ヘキサペプチドを使用し、蛍光部分および消光部分をペプチドの両端に結合すると、十分な消光が観察される。当業者は、より長いペプチドの消光能力、並びに蛍光部分および／または消光部分がペプチド末端に結合できるかどうか、または蛍光部分および／または消光部分がペプチドの内部基を介して連結または結合しなければならないかどうか、を容易に試験することができる。

一実施形態では、ペプチド配列は、以下の配列を含むかまたは配列からなる：
Ｉ Ｅ Ｐ Ｄ Ｘ１ Ｘ２、上記に定義されたようにＸ１およびＸ２は定義される。

一実施形態では、Ｘ１はＡ、Ｓ、またはＷであり、および／またはＸ２はＧ、またはＬである。

一実施形態では、ペプチドは、以下からなる群から選択される。
Ｉ Ｅ Ｐ Ｄ Ａ Ｇ； Ｉ Ｅ Ｐ Ｄ Ｓ Ｇ； Ｉ Ｅ Ｐ Ｄ Ｓ Ｌ； Ｉ Ｅ Ｐ Ｄ Ｗ Ｌ； Ｉ Ｅ Ｐ Ｄ Ｗ Ｇ； Ｉ Ｅ Ｐ Ｄ Ａ Ｌ； Ｉ Ｅ Ｆ Ｄ Ａ Ｌ．

本開示のプローブが検出できるグランザイムＢの量は１０ｎＭ未満が好ましく、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、または５０ｐＭ未満が好ましい。

本開示のプローブは、迅速な反応性を示すことが望ましい。この文脈において、迅速な反応性は、グランザイムＢを用いてペプチドを短時間で切断する能力を意味してもよい。一実施形態において、これは、２時間以内などの数時間でペプチドを何パーセント切断できるかの能力である。本明細書に記載された１つの試験において、採用された試験は、２時間でペプチドの何パーセントが切断されたかを確認することであった。いくつかの実施形態では、この試験に従って、７０％以上の切断を示すペプチドが望ましく、少なくとも７５％または８０％の切断を示すペプチドが望ましい。

本明細書に記載されるようなプローブは、溶液中に提供されてもよく、または、マイクロタイタープレートのウェル、マイクロ流体チャネルの表面、横流システム内の表面、または既知の分析物検出アッセイで使用される他の適切な表面のような基板に結合されてもよい。プローブはまた、体液または排泄物、細胞サンプル、または生検内で遊離しているグランザイムＢ、並びに本明細書に記載されるようなグランザイムＢ特異的結合剤の使用によって最初に捕捉されたグランザイムＢと接触されてもよい。

グランザイムＢ介在性細胞毒性は、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、病原体感染細胞（ＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス病原体を含む）、形質転換癌細胞、ＩＢＤに関連する上皮細胞などの上皮細胞、および腎臓、肝臓または肺移植などの移植拒絶事象における非自己細胞を排除する主要なメカニズムである。

したがって、本開示のプローブは、Ｔおよび／またはＮＫ細胞の細胞毒性活性のような免疫介在性細胞死を、異常または望ましくない細胞で検出する際に応用できる。異常または望ましくない細胞は、異常に増殖している細胞、例えば、悪性（すなわち、がん）または非悪性腫瘍細胞であってもよく、グランザイムＢは、ＣＤ４＋Ｔ細胞、肥満細胞、活性化マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、制御性Ｔ細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、ケラチノサイト、ＩＩ型肺細胞、セルトリ細胞、一次精母細胞、顆粒膜細胞、合胞体栄養芽細胞と同様に、腸上皮細胞、ウイルスまたは細菌感染細胞にも見出される。

グランザイムＢの活性は細胞外でも検出できる。ＧｚｍＢは健常者（約２０～４０ｐｇ／ｍＬ）の血清中に存在し、例えばＨＩＶ、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス、関節炎および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者の血清中で増加している。ＧｚｍＢは関節リウマチ患者の滑液、多発性硬化症患者の脳脊髄液およびラスムッセン脳炎患者にも見出される。例えば、ＣＯＰＤ患者、および肺炎症または肺サルコイドーシスに罹患している患者の気管支肺胞洗浄にも見出される。ＧｚｍＢは急性移植拒絶にも関連する。

したがって、１つの教示では、上述のように、サンプルおよび／または体液中の細胞中のグランザイムＢのレベル、例えば異常なレベル、を検出する際に、本明細書に記載されているようなプローブの使用が提供される。適切なサンプルは、組織または生検サンプルを含むことができる。体液は、任意の適切な体液脳脊髄液（ＣＳＦ）、全血、血清、血漿、細胞質液、尿、糞便、胃液、消化液、唾液、鼻または他の気道液、膣液または精液を含むことができ、最も典型的には、生物学的体液は、血液、血漿または血清である。典型的には、サンプルは、任意の適切な動物、最も典型的にはヒトのような哺乳類から得られる。一実施形態では、検出される疾患／病態はＩＢＤであり、サンプルは便、または血液（例えば血清または血漿）サンプルである。一実施形態では、病態は急性移植拒絶であり、試料は尿（腎臓用）、血液（血清または血漿）、または洗浄（肺用）試料である。異常レベルは、グランザイムＢのレベルが正常またはベースラインレベルに対して実質的に増加または減少（または同じ）しているかどうかを決定するために、非疾患細胞または前述の同定された疾患または病態に罹患していない被験者からの体液から得られる、正常またはベースラインレベルのグランザイムＢと比較して、識別されうると理解される。増加または減少レベルは、正常またはベースラインレベルに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、１００％、２００％またはそれ以上の差であることを理解されたい。

したがって、一実施形態では、便サンプルの一部を含む上清を提供するために、便サンプルが処理される。上清は、例えば、便サンプルの一部に存在する任意のグランザイムＢを結合させるために、表面に付着または接着され得る抗グランザイムＢ捕捉抗体のような適切なグランザイムＢ結合剤と接触される。その後、本明細書で定義されるように、ペプチドは、抗グランザイムＢ抗体に結合した、便サンプルの一部に存在する任意のグランザイムＢを検出し、必要に応じて定量するために接触される。

他の結合剤は、グランザイムＢに特異的に結合することができる抗体断片、ナノボディ、アプタマー、およびグランザイムＢに特異的に結合することができる受容体その他のタンパク質を含む。

表面は、スライド、マイクロプレート、流体デバイスの壁などの表面のような任意の適切な表面であってもよいが、結合剤が接着、付着、または他の方法で固定されている、例えばビーズまたはマイクロまたはナノ粒子の表面であってもよい。

細胞は、例えば組織生検または検体から得られるような単一の細胞集団または多様な細胞集団であってもよい。

さらなる教示において、細胞または体液中のグランザイムＢを検出する方法が提供され、その方法は、本明細書に記載のプローブを、被験体から単離された細胞または体液試料と、ｉｎ ｓｉｔｕまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させ、ペプチドの切断および検出可能なシグナル部分の放出によりグランザイムＢのレベルを検出することを含む。

本発明のプローブは、さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、細胞集団に対する薬剤の任意の効果（治療効果または細胞毒性効果など）を検出する方法において使用することができる。

［詳細な説明］
本開示は、以下に示す図を参照して、例によってさらに説明される。

図１．ヘキサペプチドＨ５は、特異な結合ポケットにアクセスすることにより、ＧｚｍＢに対して高い反応性と選択性を達成している。ａ）蛍光性ヘキサペプチドＨ５並びに無傷および開裂プローブの蛍光量子収率。ｂ）ｈＧｚｍＢとインキュベーションした際のテトラおよびヘキサペプチド配列、蛍光増加（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ）およびｔ_５０値。平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）としてのデータ。ｃ）３７℃でｈＧｚｍＢ（２０ｎＭ）とインキュベートした後のＨ５（２５μＭ、ダークグレー、５１０ｍｍ）およびＡｃ－ＩＥＰＤ－ＡＭＣ（２５μＭ、ライトグレー、４５０ｎｍ）の経時蛍光（２５μＭ、黒、５１０ｎｍ）。平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）としてのデータ。ｄ）プロテアーゼ（２０ｎＭ）と３７℃で６０分間インキュベートした後のペプチドＨ５（２５μＭ）の蛍光変化。平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）としてのデータ。ｅ）基質濃度の機能としてのｈＧｚｍＢ（２０ｎＭ）によるペプチドＨ５の切断速度（ｎ＝３）。ｆ）ＭＤシミュレーションに基づく、Ｔ１におけるＩＥＰＤ－Ｄａｂｃｙｌ（左）とＨ５におけるＩＥＰＤ－Ｄａｂｃｙｌ（右）の代表的結合様式。ｇ）ペプチドＨ５のＰ１’とＰ２’部位における詳細な相互作用と３つの独立な実験に基づくオーバーレイ構造。

図２．プローブＨ５はＣＤ８＋Ｔ細胞のＧｚｍＢ介在性抗癌活性を検出する。ａ）共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）アッセイの概略手順。ｂ）再活性化前後のＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的顕微鏡画像および抗ＧｚｍＢ（白色矢印は蛍光シグナルを示す）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（灰色で描かれた核の輪郭）による染色（ｎ＝３）。スケールバー：１０μｍ。ｃ）活性化（ＩＬ－２、２４時間）または不活性（ＩＬ－２、２時間）ＣＤ８＋Ｔ細胞との共培養、またはスタウロスポリン（１μｍ、１時間）存在下での単独培養におけるＥ０７７１細胞のフローサイトメトリー（）：生存（白色）、Ｈ５で染色（灰色）、アポトーシス（黒色）。（ｎ＝３）。ｄ）活性化Ｔ細胞（左）、非活性化Ｔ細胞（中央）または活性化Ｔ細胞＋Ａｃ－ＩＥＰＤ－ＣＨＯ（右）との共培養下でＨ５（）で染色されたｍＫａｔｅ発現Ｅ０７７１癌細胞（核は大きな円形のシグナルを示す）の共焦点顕微鏡画像。黒い矢印はＴ細胞を、白い矢印はＨ５で染色された細胞内ＧｚｍＢ班点を強調する。スケールバー：１０μｍ。ｅ）Ｈ５（ｔ＝２時間後に見えるようになる）の存在下でＯＶＡ－ＥＬ４癌細胞を殺すＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞（文字Ｔで強調）の経時的蛍光顕微鏡画像。スケールバー：７μｍ。ｆ）ｅ（ｎ＝３）の実験からのＯＶＡ－ＥＬ４癌細胞のフローサイトメトリー分析。両側ｔ検定によるＰ値。

図３．プローブＨ５は扁平上皮癌マウスモデルにおいてＴ細胞介在性腫瘍退縮を検出する。ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞介在性腫瘍退縮モデルの実験的タイムライン。ｂ）野生型ＳＣＣおよびＳＣＣ ＦＡＫ（－／－）腫瘍で見出された細胞集団。ｃ－ｆ）ＳＣＣおよびＳＣＣ ＦＡＫ（－／－）細胞をＦＶＢ免疫応答マウス（１×１０^６細胞／マウス）に注射し、腫瘍を１４日目に採取した。生／死染色による細胞生存率（Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ）のための野生型ＳＣＣおよびＳＣＣ ＦＡＫ（－／－）腫瘍のフローサイトメトリー（ｃ）；抗ＣＤ８－ＰＥによるＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤（ｄ）；Ｈ５染色によるＧｚｍＢ陽性ＳＣＣ癌細胞の割合（ｅ）；ＳＣＣ癌細胞内のＨ５の蛍光強度（５２５ ｎｍ）（ｆ）。（ｎ＝４）。ＳＣＣ ＦＡＫ（－／－）腫瘍（ｇ）および野生型ＳＣＣ腫瘍（ｈ）（ｅｘ ｖｉｖｏで５μＭ化合物Ｈ５で染色された）をフローサイトメトリーで分析し、異なる細胞集団におけるプローブの分布（左）およびＨ５染色の蛍光強度（右）を決定するための疑似着色二次元ｔＳＮＥ（ｔ分布確率的近傍埋込み）プロットとして提示した（ｎ＝４）。ｉ）癌細胞注入後１４日目に採取したＳＣＣ７．１およびＳＣＣ７．１ ＦＡＫ －／－腫瘍の代表的な画像。ｊ）組織分散と蛋白質抽出後の両腫瘍の、ＥＬＩＳＡによるＧｚｍＢレベルの定量。ＧｚｍＢレベルはＢＣＡ法で測定した総蛋白質量で標準化した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝４）で示した。Ｐ値は両側ｔ検定から得た。ｊ）複数の細胞サブセットにおける蛍光発光。データは平均値±ＳＥＭ（２つの独立した実験）で示した。

図４．プローブＨ５は、表現型スクリーニングにおける免疫調節作用およびヒト肺癌生検におけるＴ細胞による細胞傷害活性を検出する。ａ）表現型スクリーニングの実験プロトコル。ｂ）低分子（Ｃ１－Ｃ４４）存在下でＥ０７７１細胞とＩＬ－２活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を共培養させた後のプローブＨ５の蛍光強度。活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の陽性対照として高濃度のＩＬ－２を用い、陰性対照としてラパマイシンを用いた。プローブＨ５を１時間インキュベートし、蛍光画像を得た（ｎ≧８）。陽性対照以上のＨ５蛍光シグナルを示す薬物の化学構造。ｃ）肺腺癌患者から採取した生検における健常（左）と癌（右）領域の代表的なＨ＆Ｅ顕微鏡画像。ｄ）プローブＨ５によるインキュベーション後の癌患者からのペア（健常対癌）生検におけるＥｐＣＡＭ＋Ｈ５＋細胞のサイトメトリー分析。（ｎ＝３）。

図５．ｈＧｚｍＢとの反応前後のプローブＨ５のＨＰＬＣトレース。段階的に濃度を増加させたｈＧｚｍＢとの反応前後のプローブＨ５のＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析。Ｍｃａｌｃ。（無傷プローブ）：１２４６．６［Ｍ＋Ｎａ^＋］；Ｍｃａｌｃ。（切断プローブ）：７４７．２［Ｍ＋Ｈ^＋］。

図６．ヘキサペプチドＨ５の、酵素選択性および検出限界の比較。ａ）ｈＧｚｍＢ（薄い灰色のバー）、ヒトカスパーゼ－３（濃い灰色のバー）およびｈＧｚｍＡ（白いバー）（ｎ＝３）とのインキュベーション後の蛍光性ペプチドＨ５、Ｔ１およびＡｃ－ＩＥＰＤ－ＡＭＣの蛍光応答。ｂ）３７℃での、段階的に増加させたｈＧｚｍＢ（０、９．６、３２、９６，３２０，９６０、３，２００、９，６００、３２，０００および９６，０００ｐｇ ｍＬ^－１）との反応後のヘキサペプチドＨ５の蛍光発光（５３０ｎｍ）によるｈＧｚｍＢの検出限界。データは平均値±ＳＤで示された（それぞれ少なくとも３回の反復を伴う２つの独立した実験）。

図７．組換えマウスＧｚｍＢに対するヘキサペプチドＨ５およびＨ５ｍの反応性。マウスカテプシンＣで４時間前活性化した後、組換えマウスｐｒｏ－ＧｚｍＢ（１００ｎＭ）と３７℃で９０分間インキュベートした後の蛍光性ペプチドＨ５およびＨ５ｍ（いずれも２５μＭ）の蛍光の増加倍率。励起／発光波長：４５０ｎｍ／５１０ｎｍ。データは平均値±ＳＥＭ（それぞれ３つの別々の反復を含む３つの独立した実験）で示した。

図８．ｍＫａｔｅ－Ｅ０７７１癌細胞における細胞生存性アッセイ。ｍＫａｔｅ－Ｅ０７７１細胞を９６ウェルプレート（５０，０００細胞ウェル^－１）にまき、表示された濃度のプローブＨ５と３７℃で１時間インキュベートした。細胞生存性は、未処理細胞に対して標準化した値で市販のＭＴＴキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した。データは平均値±ＳＥＭ（それぞれ３回の反復による２つの独立した実験）で示した。

図９．ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞とＯＶＡ－ＥＬ４癌細胞の共培養。ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞と癌細胞の間の免疫学的シナプスの模式図。細胞がアポトーシスする前のペプチドＨ５（緑色）と、グランザイムＢがアポトーシスを開始した後の死細胞マーカーＳｙｔｏｘ Ｂｌｕｅ（青色）の蛍光染色を強調している。ｂ）時間０と、矢印で強調した異なる時点（ｈＧｚｍＢ １ｎＭ増加）でｈＧｚｍＢを急激に増加させた際のプローブＨ５（１ｎＭ）の縦方向蛍光放出（ｎ＝３）。

図１０．プローブＨ５は、ＩＬ－２およびＡＺＤ５３６３により誘導された癌細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞介在性細胞死を検出する。ａ）Ｅ０７７１細胞単独（５０，０００細胞ウェル^－１）またはＣＤ８＋Ｔ細胞との共培養（２００，０００細胞ウェル^－１）およびＡＺＤ５３６３（１μＭ）処理におけるプローブＨ５染色の代表的ヒストグラム。励起／発光波長：４８８ｎｍ／５２５ｎｍ。ｂ）マウスＣＤ８＋Ｔ細胞（２００，０００細胞ウェル^－１）との共培養およびＩＬ－２（２００Ｕ ｍＬ^－１）およびＡＺＤ５３６３（１μＭ）との二重処理後のＥ０７７１細胞（５０，０００細胞ウェル^－１）の代表的なフローサイトメトリー等高線プロット（）。共培養した細胞はプローブＨ５（５μＭ）およびＡＦ６４７－アネキシンＶ（１０ｎＭ）で染色した。励起／発光波長：４８８ｎｍ／５２５ｎｍ（プローブＨ５）、６３３／６７０ｎｍ（ＡＦ６４７－アネキシンＶ）。ｃ）ａ）に記載した実験条件下でプローブＨ５とＡＦ６４７－アネキシンＶで二重染色したＥ０７７１細胞の割合。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）で示した。

図１１．Ａ）尿中で組換えヒトグランザイムＢ（１５ｎＭ）存在下、３７℃で１．５時間インキュベートした後のプローブＨ５またはＲ７（２５μＭ、黒丸、黒丸四角）、あるいは尿中でグランザイムＢなしでインキュベートしたプローブＨ５またはＲ７（Ｈ５：三角形、Ｒ７：逆三角形）の蛍光応答（ｎ＝３）。ヒト尿中で、グランザイムＢ存在下（下）または非存在下（上）で３７℃で３時間インキュベートした後のＲ７（パネルＢ）およびＨ５（パネルＣ）を示すＨＰＬＣクロマトグラム。Ｄ）プローブＨ５と３７℃で３時間インキュベートした後のヒト尿中にスパイクされたヒト組換えグランザイムＢの検出限界。Ｅ）プローブＲ７と３７℃で３時間インキュベートした後のヒト尿中にスパイクされたヒト組換えグランザイムＢの検出限界。

図１２．自社開発したグランザイムＢ抗体捕捉アッセイの概略図。励起／発光Ｈ５：４５０／５１０ｎｍ，Ｒ７：６２０／６６０ｎｍ。

図１３．プローブＨ５（Ａ）またはＲ７（Ｂ）（いずれも２５μＭ）と、健常者の便（Ｓｔｏｏｌ）（ｎ＝４６）検体およびＩＢＤ患者の便（ｎ＝４８）検体を、図１２に概説した方法を用いて３７℃で１８時間インキュベートした後の、グランザイムＢ検量線の補間により測定した群当たりのグランザイムＢの平均濃度。Ｈ５λ_{ｅｘｃ／ｅｍｉ}：４５０／５１０ｎｍ。Ｒ７λ_{ｅｘｃ／ｅｍｉ}：６２０／６６０ｎｍ。非対ｔ検定で算出した有意差、ｐ値をグラフに示す。カルプロテクチン（Ｃａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｎ）レベルが５００ｕｇ／ｍｇ試料より高いと高カルプロテクチンとして分類される。カルプロテクチンレベルが１００ｕｇ／ｍｇ未満だと低カルプロテクチンとして分類される。

図１４．Ａ）ヒト組換えグランザイムＢ（２０ｎＭ）と３７℃で２時間インキュベートしたプローブＲ１－１０（２５μＭ）の蛍光倍率変化（ｎ＝６）、エラーバーはＳＥＭ。Ｂ）グランザイムＢと３７℃で２時間インキュベートする前（上）と後（下）のプローブＲ７の代表的なＨＰＬＣスペクトル。Ｃ）あらかじめ市販の阻害剤（Ａｃ－ＩＥＰＤ－ＣＨＯ、Ｅｎｚｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で阻害しておいたグランザイムＢを含む、選択された酵素（Ｃａｓｐ－３：カスパーゼ－３、ＧｚｍＡ：グランザイムＡ、ＧｚｍＢ＝グランザイムＢ）とのインキュベーション後のプローブＲ７の蛍光倍率変化（ｎ＝３）。エラーバーはＳＥＭ。Ｄ）グランザイムＢ存在下（灰色）あるいは非存在下（黒）でのインキュベーション後のＲ７（２５μＭ）の蛍光動態および関連するｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値。（ｎ＝３）。プローブ励起：６２０ｎｍ，プローブ発光：６６０ｎｍ。

［方法］
［化学合成］
Ｃ末端官能化の手順
ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＤＭＦ（１：１，１ｍＬ）中のペプチドフルオロフォア複合体（１ｅｑ）の溶液にベンジル（２－アミノエチル）カルバメート（２ｅｑ）、Ｏｘｙｍａ（２．５ｅｑ）およびＰｙＯｘｉｍ（２．５ｅｑ）を加えた。反応混合物を－２０℃で５分間撹拌した。次にＤＩＰＥＡ（５ｅｑ）を添加し、撹拌を－２０℃で３時間維持した。反応物を室温まで加温した。溶媒を減圧下で除去した。残渣を半分取ＨＰＬＣで精製し、精製ペプチドを得た。

水素化の一般的手順
蛍光ペプチド（１ｅｑ）およびＰｄ／Ｃ（１０％）（０．５ｅｑ）またはＰｄ（ＯＨ）_２／Ｃ（２０％）（０．５ｅｑ）を、あらかじめＮ_２でパージしたＭｅＯＨ（５ｍＬ）中の２％ギ酸に溶解した。反応容器をＮ_２で洗浄し、排気して、Ｈ_２ガスで満たした。反応混合物をＨ_２ガス下で室温で攪拌した。大気圧下で２時間攪拌した。その後、反応混合物をセライトで濾過して触媒を除去し、濾液を減圧下で蒸発させて脱保護ペプチドを単離した。

ダブシルカップリングの一般的手順
ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＤＭＦ（１：１，１ｍＬ）中のダブシル－ＯＳｕ（１．２ｅｑ）の溶液にペプチド（１ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（２ｅｑ）を添加した。撹拌は室温で２４時間維持した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＭｅＯＨに溶解し、セミ分取ＨＰＬＣで精製して最終ペプチドを得た。

（２－アミノエチル）カルバミン酸ベンジル

ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）中のクロロギ酸ベンジル（４２８μＬ、３ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（４０ｍＬ）中の１，２－ジアミノエタン（２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）溶液に０℃で１時間かけて滴加した。反応物を０℃で１．５時間攪拌した後、室温で一晩攪拌した。ＴＬＣ分析（ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ，７：３）は反応が完了したことを示した。反応で生成した沈殿物を濾過により除去し、次いで濾液を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、溶媒を減圧下で除去して非晶質黄色固体（５７０ｍｇ，収率９８％）として化合物を得た。粗生成物を更なる精製なしで次の工程で使用した。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）δ７．４４－７．２５（ｍ，５Ｈ）、５．０９（ｓ，２Ｈ）、３．２２（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．７５（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）。
^１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）δ１５７．７，１３６．９，１２８．０，１２７．５，１２７．４，６６．０，４２．６，４０．８。
ＭＳ（ＥＳＩ＋、Ｈ_２Ｏ／ＭｅＣＮ）：［Ｍ＋Ｈ^＋］ｃａｌｃｄ。Ｃ_１０Ｈ_１５Ｎ_２Ｏ_２の場合：１９５．１；ｆｏｕｎｄ：１９５．３。
すべてのスペクトル特性は文献による。

２，５－ジオキソピロリジン－１－イル４－（（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ジアゼニル）安息香酸（ダブシル－ＯＳＵ）

Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（８５ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）、４－（（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ジアゼニル）－安息香酸（１００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ ＨＣｌ（１４２ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２：ＤＭＦ（１：１，１０ｍＬ）の混合物に溶解し、室温で１６時間撹拌した。次いで溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を得た。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ，９９：１）により精製し、化合物をオレンジ色固体（１００ｍｇ，収率８８％）として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ８．２５－８．２０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．９８－７．９３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．８９－７．８４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），６．９０－６．８５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ２Ｈ），３．１１（ｓ，６Ｈ），２．９１（ｓ，４Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ１７０．８，１６１．９，１５７．０，１５３．９，１４３．２，１３１．９，１２６．２，１２４．４，１２２．９，１１２．１，２６．０．
ＭＳ（ＥＳＩ＋，Ｈ_２Ｏ／ＭｅＣＮ）：［Ｍ＋Ｈ^＋］ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１９Ｈ_１９Ｎ_４Ｏ_４：３６６．１；ｆｏｕｎｄ：３６６．０．

プローブＨ５

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．９８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．８６（ｄｄ，Ｊ＝１０．２，８．８Ｈｚ，４Ｈ），７．４２（ｓ，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），６．３３（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２２（ｓ，１Ｈ），４．６８（ｄｄ，Ｊ＝８．７，５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．５５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３９－４．２９（ｍ，２Ｈ），４．２５－４．１３（ｍ，２Ｈ），３．９３－３．８３（ｍ，１Ｈ），３．８１－３．７４（ｍ，１Ｈ），３．６５－３．５３（ｍ，３Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．０１（ｓ，１Ｈ），２．８８（ｓ，１Ｈ），２．８３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７７－２．６５（ｍ，３Ｈ），２．５２（ｓ，３Ｈ），２．４６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ），２．２２－２．１５（ｍ，２Ｈ），２．１１－１．９９（ｍ，２Ｈ），１．９８－１．９０（ｍ，３Ｈ），１．８５－１．６２（ｍ，５Ｈ），１．５２－１．４７（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ），１．３８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），１．３５－１．３０（ｍ，３Ｈ），１．１５（ｍ，２Ｈ），１．００－０．７４（ｍ，１２Ｈ）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１７４．１，１７３．９，１７３．２，１７２．５，１６８．４，１５７．０，１５５．０，１５３．２，１４３．４，１３４．３，１３３．５，１２８．２，１２８．１，１２５．０，１２４．３，１２１．５，１１９．９，１１６．４，１１１．２，６１．２，５７．８，５７．６，５２．３，５０．９，５０．７，３９．７，３９．２，３９．０，３８．７，３８．６３６．５，３４．２，２９．３，２９．０，２８．９，２４．８，２４．７，２４．６，２４．１，２３．９，２２．１，２０．１，１５．９，１４．５，１３．５，９．９，９．７．
ＨＲＭＳ：［Ｍ＋Ｎａ^＋］ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ_６０Ｈ_８０ＢＦ_２Ｎ_１３ＮａＯ_１２：１２４６．５９８９；ｆｏｕｎｄ：１２４６．６０１３．

計算方法
ＰＤＢ ｉｄ １ＩＡＵを持つＧｚｍＢの結晶構造からシミュレーションシステムを構築した。プローブＴ１とＨ５はＭａｅｓｔｒｏを用いて構築され、ＩＥＰＤ部分のペプチド骨格を、立体衝突を避けるために手動で調整された側鎖とＤａｂｃｙｌを共結晶化阻害剤（Ａｃ－ＩＥＰＤ－ＣＨＯ）のそれに重畳した。蛋白質とプローブのペプチドフラグメントの原子型は、ＦＦ１４ＳＢ力場を用いて割り当てられた。リンカーとＤａｂｃｙｌクエンチャーは、ＧＡＦＦ２原子型によってパラメータ化された。Ｃｙｓ対４９－６５，１４２－２０９および１７３－２０８の間に３つのジスルフィド結合を構築した。蛋白質およびプローブからなる各系を、１２Åの緩衝領域を有する切断八面体ＴＩＰ３Ｐ水ボックス中で溶媒和した。系を中和するために必要な対イオンが添加され、共役勾配アルゴリズムの６，５００回反復を伴う最急降下の３，５００回反復を用いて最小化段階が行われた。生産の前に、各系（すなわち、Ｇｍｚｂ－Ｔ１およびＧｚｍＢ－Ｈ５）に対して３つの独立した複製を準備し、各複製を１ｆｓのタイムステップを用いて標準アンサンブルで１５０ｐｓ（５０Ｋ～１５０Ｋ、１５０Ｋ～２５０Ｋ、２５０Ｋ～２９８Ｋ）の３段階で加熱した。続いて、密度を２ｆｓのタイムステップを用いてＮＰＴアンサンブルで５００ｐｓに平衡化した。Ｌａｎｇｅｖｉｎサーモスタット（衝突周波数３ｐｓ^－１）とＭｏｎｔｅｃａｒｌｏバロスタットは温度と圧力を維持するために用いた。加熱と平衡段階を通して、Ｓｅｒ２８３とプローブ中のＡｓｐ残基のカルボニルとの間の距離は平坦底拘束（ｋ＝５ｋｃａｌｍｏｌ^－１Å^－２）を用いて４．０Å以下に維持された。個々の複製のための生産実行は、２ｆｓ時間ステップを用いたＮＰＴアンサンブルにおける２００ｎｓの長さのシミュレーションから成った。

組換え酵素を用いた蛍光アッセイ。ＧｚｍＢ、ｐｒｏ－ＧｚｍＢ、ＧｚｍＡおよびＨＮＥに対しては緩衝液－１（５０ｍＭトリス、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中、カスパーゼおよび他の酵素に対しては緩衝液－２（２５ｍＭＨＥＰＥＳ、０．１％ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．５）中において、酵素を用いた蛍光アッセイを行った。プローブ（２５μＭ）を３８４ウェルプレート中の酵素（２０ｎＭまたは指示濃度）に添加し、それらの蛍光発光をＳｙｎｅｒｇｙＨ１ハイブリッドリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて３７℃で４５０ｎｍ（ＡＭＣに対して）または５１０ｎｍ（ＢＯＤＩＰＹに対して）で記録した。Ａｃ－ＩＥＰＤ－ＣＨＯ（５０μＭ）を用いた実験では、阻害剤をプローブ添加する前にＧｚｍＢと１時間プレインキュベートした。

一次細胞分離と細胞培養。核に局在化した赤色蛍光蛋白質ｍＫａｔｅを発現するＥ０７７１癌細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、抗生物質（１００Ｕ ｍＬ^－１ペニシリンと１００ｍｇｍＬ^－１ストレプトマイシン）および２ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を用いて、５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気中で培養した。細胞は９０％のコンフルエンシーに達した時点でＴ－２５細胞培養フラスコに定期的に継代した。初代ＣＤ８＋Ｔ細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌ）を、組織均質化、赤血球溶血および磁気ビーズ（ＣＤ８マイクロビーズキット）による精製によりマウス脾臓から単離した。

計算研究および分子動力学シミュレーション。モデルは、ＰＤＢ ｉｄ １ｌＡＵを用いてＭａｅｓｔｒｏおよびＡＭＢＥＲ１６で構築した。力場ｆｆ１４ＳＢ，ＧＡＦＦ２およびＴＩＰ３Ｐを用いて溶媒和系をパラメータ化した。Ｄａｂｃｙｌ中のアゾベンゼン部分に対するねじりパラメータはＬｕｑｕｅ研究グループによって提供された^５。各系に対して、Ｌａｎｇｅｖｉｎサーモスタット（衝突周波数３ｐｓ^－１）を用いて２９８Ｋおよび１ａｔｍで２００ｎｓの条件で、３つの反復を実行し、モンテカルロバロスタットをＰＭＥＭＤに実装した^６。

フローサイトメトリー。Ｅ０７７１（５×１０^４細胞／ウェル）をＩＬ－２（１，０００Ｕ ｍＬ^－１）と共にＧｅｌｔｒｅｘ被覆６ウェルプレート上にまいて、あらかじめ抗マウスＣＤ３ｅ（２μｇ ｍＬ^－１）、抗マウスＣＤ２８（５μＬ ｍＬ^－１）およびＩＬ－２（８０Ｕ ｍＬ^－１）を添加したＥ－ＤＭＥＭ中で２日間培養したマウスＣＤ８＋Ｔ細胞（２．５×１０^５細胞／ウェル）のいずれかと共培養した。スタウロスポリン（１μＭ）による処理を１時間行った。フローサイトメトリー調製には、トリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）処理、洗浄、ＰＢＳ中での再懸濁およびプローブＨ５（５μＭ）による３７℃での１時間のインキュベーションを含んだ。その後、ＦｌｏｗＪｏで分析したデータを用いた５Ｌ ＬＳＲでのフローサイトメトリー分析の前に、細胞を２回洗浄し、アネキシンＶ－ＡＦ６４７（１０ｎＭ）でインキュベートした。励起／発光波長：Ｈ５（４８８ｎｍ、５２５±５０ｎｍ）、ｍＫａｔｅ（５６１ｎｍ、６３５±１５ｎｍ）、アネキシンＶ－ＡＦ６４７（６４０ｎｍ、６７０±１４ｎｍ）。

生細胞蛍光共焦点顕微鏡法。ＩＬ－２（８０Ｕ ｍＬ^－１）、抗マウスＣＤ３ｅ（２μｇ ｍＬ^－１）および抗マウスＣＤ２８（５μＬ ｍＬ^－１）を含む濃縮Ｅ－ＤＭＥＭフェノールレッド非含有培地において、Ｅ０７７１（１．５×１０^３細胞／ウェル）を、新たに単離したマウスＣＤ８＋Ｔ細胞（１．２×１０^４細胞／ウェル）と共にＧｅｌｔｒｅｘ被覆８チャンバーガラススライド上にまいた。４８時間後、ＩＬ－２（１，０００Ｕ ｍＬ^－１）の添加および３時間のインキュベーションによりＴ細胞の再活性化を行った。プローブＨ５を２５μＭで、Ａｃ－ＩＥＰＤ－ＣＨＯを５０μＭで使用し、１時間のプレインキュベーションを行った。Ｈ５を３７℃で１時間処理した後、細胞を培地で洗浄し、ライカＴＣＳ ＳＰ８蛍光共焦点顕微鏡下で４０倍油浸対物レンズで画像を取得した。励起波長：４８８ｎｍ（Ｈ５）、５６１ｎｍ（ｍＫａｔｅ）。画像はＩｍａｇｅＪで解析した。

前臨床癌モデル。ＳＣＣ腫瘍を確立し、先述のようにフローサイトメトリーで染色した^７。簡単に言うと、１×１０^６ＳＣＣ癌細胞をＦＶＢ／Ｎマウスに皮下注射し、移植後１４日で屠殺し、シングルセル懸濁液を生成するために腫瘍を分離した。細胞を抗体およびプローブＨ５で室温で３０分間染色した。フローサイトメトリー（ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）により分析した。データ分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて行った。

薬物スクリーニング。Ｅ０７７１（７５０細胞／ウェル）および新たに単離したマウスＣＤ８＋Ｔ細胞（６，０００細胞／ウェル）を上記のように３８４ウェルプレートにプレートした。３７℃で２日間共培養した後、ＩＬ－２単独（１００または２５０Ｕ ｍＬ^－１）またはＩＬ－２（１００Ｕ ｍＬ^－１）と薬物（表３）を併用してさらに３時間インキュベートした。Ｈ５（２０μＭ）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１μＭ）を３７℃で１時間添加し、ＰＢＳで洗浄した後、培地としてＫＲＢ（１０％ＦＢＳ）緩衝液を用いてＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ^ＴＭ ＸＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）下で画像を取得した。蛍光画像（４サイト／ウェル）を４０５ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）および４８８ｎｍ（Ｈ５）励起波長を用いて４０×対物レンズ下で取得し、データをカスタムモジュールエディタを用いてＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアで分析した。簡単に言えば、擬似細胞領域を作成するために核をシードとして用い、グランザイムＢ陽性点をトップハットフィルタ（ピクセルサイズ：１０、円シェイプ）とそれに続く平均フィルタ（３×３ピクセル）を用いて検出した。

ヒト生検。組織サンプルは外科的切除を受けている未治療患者から採取した。参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供し、研究はＮＨＳ Ｌｏｔｈｉａｎ ＲＥＣによって承認され、ＮＨＳ Ｌｏｔｈｉａｎ ＳＡＨＳＣバイオリソース（記録番号：１５／ＥＳ／００９４）によって進められた。新鮮なサンプルをミンチにし、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ，１ｍｇ ｍＬ^－１のＤＮａｓｅ１，５０Ｕ ｍＬ^－１のヒアルロニダーゼが入ったＤＭＥＭ中で３７℃で１時間撹拌し、１００および７０μｍのフィルターを通過させた後、赤血球溶解を行った。顕微鏡検査のために、非小細胞肺癌および対になった非癌性肺のホルマリン固定パラフィン包埋スライドを、脱パラフィン化し、再水和し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、続いて脱水し、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＳｃａｎ顕微鏡で画像を取得した。

尿試料中の蛍光分析
グランザイムＢ緩衝液（５０ｍＭトリス、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中のプローブ（Ｈ５またはＲ７）（２５μＭ、５０μＭ）を、一定範囲のグランザイムＢ濃度（２０，０００ｐｇ ｍＬ^－１～７８ｐｇ ｍＬ^－１）を含む、またはグランザイムＢを含まない（対照）健常ドナーからの尿試料（５０μＬ）に直接添加した。溶液を３７℃でインキュベートし、蛍光応答を経時的にモニターした（λ_ｅｘｃ／_ｅｍ：４５０／５１０ｎｍまたは６２０／６６０ｎｍ）。蛍光は、シナジーバイオテックＨ１分光光度計で読み取った。

尿中のグランザイムＢによるプローブ切断のＨＰＬＣ／ＭＳ分析
プローブ（Ｈ５またはＲ７）（２５μＭ）をグランザイムＢ緩衝液中のヒト組換えグランザイムＢ（１５ｎＭ）と３７℃で１．５時間インキュベートした後、試料をＭｅＯＨで希釈し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣ／ＭＳに注入した。試料はＨ_２Ｏ（Ａ）中の０．１％ＨＣＯＯＨ、およびＭｅＣＮ（Ｂ）中の０．１％ＨＣＯＯＨで溶出され、溶出は５分間かけて０から１００％Ｂの勾配をとり、さらに３分間のアイソクラティック時間をかけ、流速１．５ｍＬ ｍｉｎ^－１で行われた。反応は２２０－７００ｎｍでモニターされ、切断されたプローブのピーク面積をＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア上の無傷プローブと比較することにより、切断されたパーセンテージが決定された。

便サンプル中の蛍光分析
高結合マイクロプレート（Ｍｅｒｃｋ）をコーティング緩衝液（ＮａＯＡｃ緩衝液、ｐＨ５．５）中で５０μＬ（２μｇ／ｍｌ）の抗ＧｚｍＢ抗体（ヒト、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅバイオサイエンス）で被覆し、加湿チャンバー中で４℃で一晩インキュベートした。プレートは洗浄緩衝液（０．０１ＭＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）で４回洗浄され、抗体は９６ウェルプレートに１００μＬのＣｈｏｎｂｌｏｃｋが室温で１時間添加されることでブロックされた。次にプレートを洗浄緩衝液（×４）で洗浄し、Ｃｈｏｎｂｌｏｃｋ（１：１）で希釈した臨床試料を同じくＣｈｏｎｂｌｏｃｋ（１：１）で希釈したグランザイムＢ標準と共にプレート（５０μＬ）に添加した。プレートを洗浄緩衝液（×４）で洗浄する前に、試料を室温で２時間インキュベートした。最後に、プローブＨ５またはＲ７（２５μＭ）を各ウェル（全体積５０μＬ）に添加し、蛍光強度をＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ Ｂｉｏｔｅｋマイクロプレートリーダーを用いて０時間、２時間、４時間、１８および２４時間でモニターした。ゲイン６０の設定のモノクロメータを用いてＨ５：λ_ｅｘ＝４７０ｎｍおよびλ_ｅｘ＝５１０ｎｍとし、ゲイン９０設定のモノクロメータを用いてＲ７：λ_ｅｘ＝６２０ｎｍおよびλ_ｅｘ＝６６０ｎｍとした。

本研究では、ＧｚｍＢ基質を合理的に設計し、酵素の活性部位に最適に適合する新しいヘキサペプチド配列を同定し、高特異性ＧｚｍＢプローブとしての代替の結合態様を示唆した。ＦＲＥＴ構築物へのヘキサペプチドの最適化は、ＩＥＰＤテトラペプチドのｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ比よりも数桁優れたプローブＨ５をもたらした。Ｈ５の高速性と選択性は、免疫介在性腫瘍退縮のマウスモデルにおけるＴ細胞の抗癌活性のリアルタイム測定を可能にした。我々はまた、Ｈ５が癌細胞に対してＣＤ８＋Ｔ細胞を再活性化することができる新薬を同定するために画像ベースのスクリーニングで使用できることを示した。最後に、我々はヒト腫瘍におけるｉｎ ｓｉｔｕ Ｔ細胞毒性活性を検出するために、癌患者からの生検においてプローブＨ５を最適化した。

グランザイムＢのための高反応性蛍光プローブの設計
テトラペプチドＩＥＰＤは、ヒトＧｚｍＢ（ｈＧｚｍＢ）を標的とする蛍光基質と同様に、共有結合性阻害剤の調合剤として報告されている主要な足場材料である^８－１０。最初に、臨床アッセイに適用可能な酵素濃度に対する市販のＡｃ－ＩＥＰＤ－ＡＭＣ（すなわち、ｈＧｚｍＢとの反応により７－アミノ－４－メチルクマリンを放出する基質）の反応性を評価した。Ａｃ－ＩＥＰＤ－ＡＭＣの遅い酵素切断速度（すなわち、２０ｎＭ酵素２時間の反応で、１％未満の開裂、１００ｎＭで２４時間の反応で、１０％の開裂）と２５ｎＭの検出限界（ＬｏＤ）を観察したが、これは臨床試料で見出されたＧｚｍＢのｐＭ濃度とはかけ離れていた^１１。これらの結果を考慮して、ＩＥＰＤベースのＦｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プローブがｈＧｚｍＢに対する反応性の増加を示すかどうかを検討した。ドナー－アクセプタ対としてのフルオロフォアとクエンチャーを、ＩＥＰＤ配列の側面に配置することによりＦＲＥＴ基質を合成した。Ａｃ－ＩＥＰＤ－ＡＭＣとは異なり、フルオロフォアをＮ末端に置き、クエンチャーを開裂部位の隣に置いたので、その電子吸引特性は酵素開裂に有利であった。フルオロフォア、スペーサーおよびクエンチャーの異なる組合せを合成し、テトラペプチドＴ１（フルオロフォアとしてＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、クエンチャーとしてエチレンジアミン－ダブシルを備える）を最も反応性の高い基質として同定した。それでも、ｈＧｚｍＢに対するＴ１の反応性は低く（すなわち、２０ｎＭ酵素で２時間の反応で＜５％開裂、１００ｎＭ２４時間の反応で１５％開裂）、ＬｏＤは１７ｎＭであった。

したがって、ｈＧｚｍＢとより速く、より特異的に反応できる配列を同定することにより、ＦＲＥＴ基質を最適化することにした。そこで、ＩＥＰＤ配列がＰ１’とＰ２’の位置に小さなアミノ酸で拡張されたＦＲＥＴヘキサペプチドを調製した（図１ａ）。ヘキサペプチドＨ１（ＩＥＰＤＡＧ）とＨ２（ＩＥＰＤＳＧ）はテトラペプチドＴ１より著しく速い変換（例えば、それぞれ７５％および８０％の変換、表２）を示したが、２０ｎＭ ｈＧｚｍＢの２時間の処理では変換は不完全であった。ペプチドＨ２はわずかに高い反応性を示したので、Ｐ１’位置にセリンを保持し、Ｐ２’位置により疎水性ロイシンを有するペプチドＨ３（ＩＥＰＤＳＬ）を調製した。この変化は反応性を改善しなかったので（例えば、８０％変換、表２）、Ｐ１’およびＰ２’位置における代替を探索した。ヘキサペプチドＨ４は８３％の変換を達成したが、ペプチドＨ５は最も高い反応性を示し、３０分未満で速く完全な開裂を示した（表２および図５）。興味深いことに、この結果は、より小さいアミノ酸（すなわち、トリプトファンの代わりにアラニン）が酵素により良好に許容されることを示唆した。この観察を確認するために、Ｈ４とＨ５配列のネガティブコントロールペプチドを合成し、結合を阻害するためにＰ１’またはＰ２’にアルギニンを含めた。得られたヘキサペプチドＨ６（ＩＥＰＤＷＲ）とＨ７（ＩＥＰＤＲＬ）は著しく低い反応性（すなわち、それぞれ４０％および６０％の変換、表２）を示したが、テトラペプチドＴ１よりもはるかに高い反応性を示した。これらの結果は、ＦＲＥＴヘキサペプチド構築物が短いテトラペプチドよりもはるかに速くｈＧｚｍＢと反応することを示唆する。溶液と固相合成を用いてすべてのペプチドを調整し（以下に記述するように）、９５％以上の純度で調製ＨＰＬＣによりそれらを単離し、高分解能質量分析によりそれらの同一性を確認した。

全てのペプチド複合体は、２－クロロトリチルクロリドポリスチレン樹脂上でＦｍｏｃ／^ｔＢｕ戦略を用い固相ペプチド合成を用いて合成した。適切なＦｍｏｃ保護アミノ酸（１．４ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（１０ｅｑ）を用いて、ＤＣＭ中に室温で１時間、樹脂装填を行った。その後、残りの２－クロロトリチル基をＭｅＯＨ（０．８μＬ／ｍｇ樹脂）でキャップした。Ｆｍｏｃ除去は、３×５分サイクル下でアスパルチミド形成を最小化するために、ピペリジン（ＤＭＦ中２０％）とＯｘｙｍａ（１．０Ｍ）で行った。アミノ酸は、過剰のＦｍｏｃ保護アミノ酸（４ｅｑ）、ＣＯＭＵ（４ｅｑ）、Ｏｘｙｍａ（４ｅｑ）、およびＤＩＰＥＡ（８ｅｑ）を用いて、ＤＭＦ中で室温で１．５時間結合された。結合の完了は、Ｋａｉｓｅｒ試験（およびプロリン結合後のクロラニル試験）によってモニターした。アスパラギン酸とグルタミン酸の側鎖はＯＢｚｌ基で保護され、アルギニン側鎖はＮＯ_２基で保護されたが、これは、これらが酸に不安定なＢＯＤＩＰＹ－ＦＬフルオロフォアによって許容される軽度Ｐｄ触媒水素化下で除去され得るからである。フルオロフォア結合は、ＤＭＦ中のＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ（１．１ｅｑ）、ＣＯＭＵ（１．１５ｅｑ）、Ｏｘｙｍａ（１．１５ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（３ｅｑ）を用いて固相で室温で１．５時間行った。樹脂開裂は、樹脂をＴＦＡ（１％ ｉｎ ＤＣＭ）で５×１分サイクルで処理することにより行った。次に、組合せ溶液をＤＣＭ上に注ぎ、減圧下で蒸発させた。精製は半調製ＨＰＬＣによって行い、純粋な蛍光ペプチドをＣｂｚ保護１，２－ジアミノエタンに結合させた。次いで、ＮＨＳ媒介カップリングを介してリンカーの末端アミンにクエンチャーであるダブシルを導入することを可能にするため、すべての保護基を除去するための触媒水素化を行った。純度＞９５％の最終ペプチドを半調製ＨＰＬＣによって単離した。

プローブＨ５はユニークな結合ポケットにアクセスすることによりヒトＧｚｍＢの高度に特異的な基質である。

組換えｈＧｚｍＢの存在下でそれらの蛍光発光を測定することにより、すべてのヘキサペプチドＨ１～Ｈ７の蛍光発生応答を分析した（図１ａ）。予想通り、すべてのヘキサペプチドはテトラペプチドＴ１を上回り、シグナル対バックグラウンド比は１２倍（ペプチドＨ６）から１５３倍（ペプチドＨ５）の範囲であった（図１ｂ）。また、最も反応性の高い化合物が５０倍の蛍光増加（ｔ_５０）に達するのに要する時間を測定した。プローブＨ５は、すべてのペプチドの中で最も速い応答を示し、ｔ_５０は７分（図１ｂ、１ｃ）であった。また、ヘキサペプチドＨ５の動力学特性を、以前に報告されたテトラペプチド構築物と比較した。ペプチドＨ５は、高いμＭ ｍｉｎ^－１範囲のＶ_ｍａｘ値と１．２×１０^７Ｍ^－１ ｓ^－１のｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ比（図１ｅ）で著しく高い触媒効率を示し、蛍光テトラペプチドよりも１０００倍以上の改善を示した（表１）。これらの結果は、プローブＨ５の並外れた反応性を確認し、ｈＧｚｍＢに対して６ｐＭという前例のないＬｏＤを示した（図６ｂ）。

また、不活性なプロ－ｈＧｚｍＢおよび他のセリンプロテアーゼ（例、グランザイムＡ，好中球エラスターゼ）およびアポトーシス中に活性なシステインプロテアーゼ（例えば、カスパーゼ）を含む他の酵素に対する、ｈＧｚｍＢへのペプチドＨ５の特異性を評価した。プローブＨ５は、いくつかのＩＥＰＤベースのプローブを切断できるカスパーゼ－３（図６）を含む他の酵素（図１ｄ）に対して最小の応答を示した。カスパーゼ－３との交差反応性は、全体的な細胞死とＴ細胞介在性癌細胞死を区別することを妨げるため、これは免疫療法に対する応答を評価する際の１つの重要な利点を示す。最後に、プローブＨ５から発生する蛍光がｈＧｚｍＢとの特異的反応によることをさらに確認するために、不可逆的なＧｚｍＢ阻害剤Ａｃ－ＩＥＰＤ－ＣＨＯの存在下で実験を行ったところ、Ｈ５の蛍光応答が劇的に減少した（図１ｄ）。

モデルテトラペプチドＴ１と新規ヘキサペプチド間の反応性の違いを理解するために、分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを用いて、ｈＧｚｍＢモデルとの複合体におけるＴ１とＨ５の好ましい結合様式を比較した。全てのヘキサペプチドはＢＯＤＩＰＹ－ＦＬとＰ１－Ｐ４アミノ酸を共有したので、Ｐ１’－Ｐ２’残基とＤａｂｃｙｌクエンチャーの解析に焦点をあてた。ＭＤシミュレーションによってＴ１とＨ５が２つの異なるポケットにクエンチャーを収容することが明らかになった。ｈＧｍｚＢ－Ｔ１シミュレーションでは、Ｄａｂｃｙｌ部分はループ７４－８４とループ１４６－１６１の間の溝に優先的に結合したが（図１ｆ）、ｈＧｍｚＢ－Ｈ５シミュレーションでは、クエンチャーはループ７４－８４とβ－バレル３５－１１４によって描かれた触媒溝の延長線上に優先的に結合した（図１ｆ）。軌跡の目視検査は、残基２００－２０１のバックボーンが、短いテトラペプチドＴ１が触媒溝に沿ってクエンチャーを収容するのを妨げる、図１ｆのオレンジで強調された鞍点を形成することを明らかにした。どちらの場合も、Ｄａｂｃｙｌ部分は柔軟性を維持し、特定の蛋白質残基との長寿命相互作用を形成しない。ＭＤシミュレーションでは、Ｈ５の反応性が他のヘキサペプチドよりも高いのは、触媒溝の小さな疎水性ポケットを満たすＰ１’のアラニン残基と、２００～２０１の鞍点を縛るＰ２’のロイシン残基の複合効果によることも示唆されている（図１ｇ）。この結合様式は、Ｈ５ペプチドの、以下に対する強化された反応性を説明している：１）Ｈ４とＨ６のペプチドは、Ｐ１’のトリプトファンが大きすぎてポケットに収まりきらない、２）ペプチドＨ７は、Ｐ１’のアルギニンがこのサブポケットを画定する塩基性残基によって静電的に不利である、３）ペプチドＨ３は、Ｐ１’のセリンが隣接する有効な水素結合ドナーを欠いている、４）Ｈ１とＨ２のペプチドは、Ｐ２’のグリシンが小さすぎて２００～２０１の鞍点に対して効果的に充填できない。

プローブＨ５は、癌細胞との共培養においてＴ細胞のリアルタイム再活性化を検出する
ＧｚｍＢに対するプローブＨ５の反応性と選択性を考慮して、癌細胞へ攻撃中のＴ細胞の細胞傷害活性を測定するためのその有用性を検討した。これを検討するために、マウスＣＤ８＋Ｔ細胞とＥ０７７１乳癌細胞を共培養した（図２ａ）。マウスＧｚｍＢの基質は、ヒト基質のプロリンの代わりにＰ２のフェニルアラニンを特徴とするが、マウスＧｚｍＢに対するプローブＨ５の良好な応答が観察され、フェニルアラニンを含むヘキサペプチド類似体（プローブＨ５_ｍ：ＩＥＦＤＡＬ、図７）よりもわずかに良好な反応性であった。したがって、マウスとヒトの両方のアッセイにプローブＨ５を使用することにした。最初に、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＧｚｍＢのレベルを効果的に増加させるために共培養を最適化した。インターロイキンＩＬ－２とのインキュベーションは最大の再活性化をもたらし、８０％以上のＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＬ－２処理後に不活性なＧｚｍＢを発現していることを、抗ＧｚｍＢを用いた蛍光顕微鏡で確認した（図２ｂ）。次に、これらの条件を、検出を容易にするために赤色蛍光タンパク質ｍＫａｔｅを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞と遺伝子改変Ｅ０７７１－Ｌａ２－ＮＬＲ細胞の共培養に適用し、プローブＨ５およびアポトーシスのマーカーであるアネキシンＶ－ＡＦ６４７とインキュベートした。フローサイトメトリー分析により、活性化Ｔ細胞と共培養された癌細胞の８０％以上がＨ５とアネキシンＶ－ＡＦ６４７で二重染色されていることが明らかになり、プローブＨ５の放出が免疫介在性の癌細胞死を示すことが確認された（図２ｃ）。非再活性化Ｔ細胞と共培養された癌細胞またはアポトーシスを誘導するキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンで処理された癌細胞は弱い蛍光を示し、プローブＨ５が活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞によって殺された死んだ癌細胞を検出することが確認された（図２ｃ）。蛍光顕微鏡実験でも、プローブＨ５はｍＫａｔｅ＋癌細胞の細胞質のみを染色し、Ｔ細胞は染色しなかった（図２ｄ）。追加対照として、プローブＨ５は細胞毒性がなく（図８）、不活性であるＴ細胞との共培養または不可逆性ＧｚｍＢ阻害剤Ａｃ－ＩＥＰＤ－ＣＨＯで前処理された共培養では癌細胞を染色しなかった（図２ｄ）。全体として、これらの結果は、プローブＨ５が活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の攻撃に起因する癌細胞死を検出できることを確認し、プローブＨ５の蛍光発光が生存状態での培養における免疫調節効果のバイオマーカーとして使用できることを示唆している。
次に、ＣＤ８＋Ｔ細胞が癌細胞を攻撃する方法をリアルタイムで画像化するためにＨ５を使用できるかどうかを検討した。Ｈ－２ｋｂのコンテキストでＯＶＡ由来ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原を提示する細胞を特異的に標的とするＯＴ－Ｉトランスジェニック受容体を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を利用し、ＳＩＩＮＦＥＫＬを付加したＥＬ４癌細胞と共培養した（図９）。細胞は、識別を容易にするためにＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで対比染色し、プローブＨ５および細胞死マーカーＳｙｔｏｘ Ｂｌｕｅとインキュベートした後、タイムラプス顕微鏡観察を行った。当初、プローブＨ５は変化がなかったが、ＣＤ８＋Ｔ細胞が癌細胞と免疫シナプスを形成し始めると、標的細胞内での放出は徐々に増加した（図２ｅおよび）。ＣＤ８＋Ｔ細胞と癌細胞の間の数回の接触後、Ｈ５の緑色蛍光シグナルはＳｙｔｏｘ Ｂｌｕｅの青色シグナルと共局在し、標的癌細胞がＧｚｍＢ介在性アポトーシスを受けたことを示した。定量的フローサイトメトリー分析はまた、癌細胞におけるペプチドＨ５の蛍光シグナルがシトックスブルーのそれに先行することを確認した。これは免疫介在性癌細胞死の初期バイオマーカーとしての活性化型ＧｚｍＢ（ａｃｔｉｖｅ ＧｚｍＢ）を裏付けている（図２ｆ）。並行して、ＣＤ８＋Ｔ細胞から複数の接触を受ける癌細胞に見られる細胞内環境を模倣したｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を行い、ＧｚｍＢのスパイク１ｎＭ増加に対するプローブＨ５の累積蛍光シグナルを観察した（図９）。

プローブＨ５は癌マウスモデルにおいてＴ細胞介在性腫瘍退縮を検出する。
我々はさらに、腫瘍退縮マウスモデルにおいてＧｚｍＢ活性を検出するペプチドＨ５の能力を検討した。Ｓｅｒｒｅｌｓらは、Ｆｏｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｋｉｎａｓｅ（ＦＡＫ）の阻害が免疫抑制微小環境（図３ａ、図３ｂ）の調節を介して扁平上皮癌（ＳＣＣ）腫瘍のＴ細胞介在性退縮を促進することを報告し、ＦＡＫ阻害剤は現在、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた臨床試験中である^１２。ＳＣＣ ＦＡＫ（－／－）マウスにおける腫瘍退縮はＣＤ８Ｔ＋細胞に依存するため、この前臨床モデルは、プローブＨ５が腫瘍におけるＴ細胞介在性癌細胞死を検出できるかどうかを検討するための優れたプラットフォームである。

最初に、ＦＶＢ免疫応答マウスにＳＣＣ ＦＡＫ（－／－）癌細胞または野生型ＳＣＣ癌細胞（陰性対照として）を投与し、腫瘍を２週間増殖させた。予想通り、ＳＣＣ ＦＡＫ（－／－）腫瘍は野生型ＳＣＣ腫瘍よりも有意に小さく、生細胞の含有量が少なかった（図３ｃ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の数はＳＣＣ ＦＡＫ（－／－）腫瘍で約１０倍高く、これは活性化されたＴ細胞応答（図３ｄ）を意味し、ＥＬＩＳＡで測定したＧｚｍＢも高い発現レベルを示した（図３ｊ）。ＳＣＣ ＦＡＫ（－／－）腫瘍の癌細胞が細胞内活性化型ＧｚｍＢを含むかどうかを評価するために、腫瘍を採取し、フローサイトメトリーで分析する前にプローブＨ５で３０分間処理した。特に、ＳＣＣ ＦＡＫ（－／－）腫瘍の４０％以上の癌細胞はプローブＨ５で染色されたが、野生型ＳＣＣ腫瘍はほとんど染色されなかった（図３ｅ、３ｆ）。さらに、プローブＨ５の蛍光シグナルは癌細胞のサブセットでのみ見出されるが、腫瘍（図３ｇ、３ｈ、３ｋ）で見出された他の細胞（例、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞）では見出されないことを観察した。全体として、これらの結果は、マウス腫瘍におけるＴ細胞介在性細胞死を迅速に検出するためのプローブＨ５の有用性を裏付けている。

プローブＨ５は、薬物スクリーニングおよびヒト腫瘍生検における免疫調節活性を同定する
次に、免疫調節薬のスクリーニングおよびヒト腫瘍生検における臨床アッセイにおけるプローブＨ５の有用性を評価した（図４ａ）。まず、マウスＣＤ８＋Ｔ細胞およびＥ０７７１癌細胞の共培養系を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の殺傷能力を活性化するための小分子をスクリーニングできる画像ベースの表現型アッセイのための３８４ウェルプレートフォーマットに適合させた。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ高含量分析システムを用いて、種々の薬理学的標的を有する抗癌剤のコレクションを試験した（表３）。Ｅ０７７１とＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＬ－２（１００Ｕ ｍＬ^－１）およびそれぞれの作用濃度の個々の薬剤とインキュベーションする前に２日間共培養した（表３）。イメージングの１時間前に、プローブＨ５をウェルに添加し、核対比染色としてＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を含む蛍光顕微鏡画像を得た。癌細胞内のプローブＨ５の蛍光強度を用いて、全４４薬剤の免疫調節能を比較した。高ＧｚｍＢの陽性対照として高濃度のＩＬ－２（２５０Ｕ ｍＬ^－１）を有するウェルを、低ＧｚｍＢ活性の陰性対照として、１００Ｕ ｍＬ^－１のＩＬ－２に加え、Ｔ細胞のＩＬ－２誘導活性化を阻害する既知のｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシンを有するウェルを含めた。注目すべきことに、異なる薬理学的機能（例えば、プロテインキナーゼ阻害剤、微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ）機能阻害剤、ＤＮＡアルキル化（ＤＮＡ ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ）剤、プロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）阻害剤）を有する化合物の小セットは、ＩＬ－２による単独処理よりも優れた染色性を示し、抗癌Ｔ細胞活性を活性化する能力を示した。

（ＩＬ－２のみの対照と比較して）増加した蛍光シグナルが、ＩＬ－２と異なる小分子と組み合わせで観察された。これらの中で、異なる作用機序を有する化合物を同定した。ＡＺＤ５３６３（Ｃ５）は蛋白質キナーゼＡＫＴ阻害剤である；ドセタキセル（Ｃ１１）、ＡＲＱ－６２１（Ｃ１２）およびエポチロンＢ（Ｃ１３）は微小管機能の直接阻害剤である；マイトマイシンＣ（Ｃ１８）およびテモゾロミド（Ｃ２０）はＤＮＡアルキル化剤であり、ラクタシスチン（Ｃ３０）は不可逆的プロテアソーム阻害剤である。これらの化合物のいくつかはすでに抗癌薬として医療用に承認されている。ドセタキセル（タキソテール登録商標）、マイトマイシンＣ（ムタマイシン登録商標）およびテモゾロミド（テモダール登録商標）は、乳癌（ドセタキセル）、肺癌（マイトマイシン）および脳腫瘍（テモゾロミド）を含むいくつかのタイプの癌の治療のために確立された化学療法薬である。他の化合物は現在臨床試験で試験されている。例えば、ＡＺＤ５３６３は、単独または他の薬剤（例えばパクリタキセル）との併用で、転移性乳癌または婦人科系の癌患者を対象とした第ＩＩ相試験中である。ＡＲＱ６２１は、末期固形癌または血液悪性腫瘍患者を対象とした第Ｉ相試験で評価されている。同様に、エポチロンＢは、特に進行性の結腸直腸癌、腎臓癌および前立腺癌の患者を対象とした第ＩＩ相試験中である。

これらの中で、ＡＫＴキナーゼ阻害剤ＡＺＤ５３６３は最も明るいＨ５蛍光染色を示し、さらなる研究のために選択された。ＡＺＤ５３６３とインキュベートしたＥ０７７１癌細胞、およびＩＬ－２のみまたはＩＬ－２＋ＡＺＤ５３６３とインキュベートしたＣＤ８＋Ｔ細胞とＥ０７７１細胞の共培養において、細胞生存性およびＨ５蛍光染色の程度を解析した。ＡＺＤ５３６３単独処理は有意な癌細胞死を誘導せず、Ｈ５染色を引き起こさなかったが、１００Ｕ ｍＬ^－１ＩＬ－２と組み合わせた同濃度のＡＺＤ５３６３は、ＣＤ８＋Ｔ細胞－Ｅ０７７１細胞共培養において有意な癌細胞死およびＨ５蛍光発光を引き起こした（図１０）。これらの観察は、ＡＫＴ阻害がＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊を防止し、標的細胞に対する細胞溶解活性を増強することを示唆する最近の報告と一致する。これらの結果は、ＩＬ－２と併用した場合にＣＤ８＋Ｔ細胞の抗癌活性を活性化するＡＺＤ５３６３の可能性を強調し、新しい免疫調節薬の同定のためのＨ５ベースのイメージングスクリーンプラットフォームの有効性を示す。

最後に、抗癌治療に対する潜在的素因をスクリーニングする方法として、プローブＨ５が肺癌患者からの生検で細胞傷害性Ｔ細胞機能もモニターできるかどうかを調べた。これらの実験のために、外科的切除を受ける未治療肺癌患者から対（すなわち、正常組織と癌組織、図４ｃ）組織切除片を得た。プローブＨ５が健常領域と癌領域の間のＣＤ８＋Ｔ細胞再活性化の違いを検出できるかどうかを分析するために、プローブＨ５ですべての試料を処理し、上皮および免疫細胞マーカーの抗体ベースのパネルと共にフローサイトメトリーにより迅速に分析した。図４ｄに示すように、すべての患者の健康組織と癌組織の間のＥｐＣＡＭ＋Ｈ５＋細胞の割合に有意差を認め、腫瘍微小環境における肺上皮細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態と細胞傷害活性を示した。癌患者における免疫療法の評価にプローブＨ５を適応させるためには、さらなる最適化研究が必要である。全体として、我々の結果は、プローブＨ５が、ヒト腫瘍生検の臨床的特徴づけと同様に、新しい免疫療法の組み合わせの発見を促進するための、ハイスループットスクリーニングアッセイにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで使用できることを示し、個別化抗癌免疫療法の開発を加速するための新しい道を開く。

結論
我々は、活性化型のマウスおよびヒトＧｚｍＢの迅速検出およびイメージングのための蛍光プローブの合理的設計について述べた。一般的なＩＥＰＤ配列から出発して、我々は、前例のないｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ比１．２×１０^７Ｍ^－１ ｓ^－１および検出限界６ｐＭを有するヘキサペプチドＨ５を最適化するためのＦＲＥＴプローブのコレクションを構築した。ペプチドの結合モードを調べるために分子動力学シミュレーションを使用し、Ｈ５が、テトラペプチド配列によってアクセスできないｈＧｚｍＢのループ７４－８４およびβ－バレル３５－１１４によって画定された触媒溝の延長に結合することを観察した。活性化型ｈＧｚｍＢに対するこの代替結合態様の発見は、イメージングプローブおよび酵素阻害剤の設計と最適化を促進し得る。Ｈ５の蛍光発光は、蛍光顕微鏡による定性的解析およびフローサイトメトリーによる定量的解析の両方で、ＣＤ８＋Ｔ細胞および癌細胞の生きた状態での培養において、免疫介在性腫瘍殺傷能力を直接見るレポーターとして使用できることを示した。重要なことに、プローブＨ５は、ＧｚｍＢが不活性であるＴ細胞内、または免疫介在性癌細胞死に関連しない他の薬剤（すなわち、スタウロスポリン）によって殺された癌細胞内では蛍光を発しない。我々はまた、プローブＨ５が扁平上皮癌のモデルにおいて免疫介在性退行を受けるマウス腫瘍を識別し、画像に基づく表現型スクリーンにおいて免疫調節応答を活性化する小分子薬剤を同定できることを示した。最後に、我々はヒト腫瘍生検の臨床的特徴づけのためにＨ５を使用し、抗癌免疫療法に対する初期反応の個別化検出のための潜在的応用を強調した。

近赤外グランザイムＢプローブ合成
グランザイムＢ技術をさらに発展させるために、活性化型グランザイムＢを検出するための近赤外（ＮＩＲ）発光スマートプローブを開発しようとした。ＮＩＲ光の使用は、皮膚を貫通するより深い浸透や、自己蛍光の減少および最小の光散乱といった、短波長の発光に対するいくつかの利点を示し、生物学的試料中のノイズに対する信号を増強する。

ＧｚｍＢ特異的配列の開発における上述の研究に基づき、プローブＨ５で見られるように、ＧｚｍＢ（Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｌｅｕ）との迅速な反応性と選択性を与える、特に有効なヘキサペプチド配列を保持することを意図した。ＮＩＲ ＧｚｍＢスマートプローブを製造するには、ＧｚｍＢの非存在下でプローブを非蛍光化するＦＲＥＴプロセスを保持するために、蛍光体だけでなく消光基も交換する必要がある。スマートプローブ成分の変化は、所望の標的との反応性を低下させる可能性があるので、２つの異なるＮＩＲ蛍光体（ケイ素ローダミンとＳｕｌｆｏ－Ｃｙ５）、２つのリンカータイプ（疎水性と親水性）および３つの異なるＮＩＲ消光基（ＱＳＹ２１、ＢＸＬ－６７０およびＢＨＱ－３）の組み合わせを用いて、１２のＮＩＲ発光スマートプローブを開発することにより、このリスクを最小化することを試みた。化学構造を以下に示す（ＱＸＬ－６７０の化学構造は開示されておらず、入手できないことに注意）。

グランザイムＢ活性を検出するためのＮＩＲプローブの開発に使用されるフルオロフォア、リンカーおよびクエンチャー（ＱＸＬ－６７０を除く）の化学構造。

ＮＩＲスマートプローブに対する合成戦略は、２－クロロトリチル結合ポリスチレン樹脂上の固相ペプチド合成から始まり、ここでは、側鎖保護を必要とする唯一の残基としてＡｓｐ（Ｏ^ｔＢｕ）およびＧｌｕ（Ｏ^ｔＢｕ）を用いたＦｍｏｃ／^ｔＢｕｔｙｌ戦略を採用した。Ｏ^ｔＢｕ側鎖保護基は、Ｆｍｏｃ脱保護と樹脂からのペプチド切断との直交性のために利用した。各カップリングは、カップリング試薬としてＣＯＭＵとＯｘｙｍａを使用し、Ｆｍｏｃ除去のためにＤＭＦ溶液中の２０％ピペリジン、１Ｍ Ｏｘｙｍａを利用した（ＯｘｙｍａはＦｍｏｃ除去中のアスパルチミド副生成物形成を最小化するために添加した）。２つのフルオロフォア（上記参照）の各々は、ＴＦＡ（ＤＣＭ中１％）で樹脂からペプチドを除去する前に最後にカップリングし、ＳｉＲｈｏとＳｕｌｆｏＣｙ５をレンダリングした。

グランザイムＢヘキサペプチドを含むシリコンローダミンとＳｕｌｆｏＣｙ５の固相ペプチド合成。

次に、リンカーをペプチドの遊離Ｃ末端に組み込んだ。利用するための２つのリンカー、すなわち、Ｎ－Ｂｏｃ－１，６－ヘキサンジアミンおよびｔｅｒｔ－ブチル（１４アミノ－３、６、９、１２テトラオキサテトラデシル）カルバメートを選択した。これらのリンカーの各々は対照的な極性を示し、ＧｚｍＢによる基質切断に対するそれらの効果をモニターするために選択された。それらは共に、側鎖^ｔｂｕｔｙｌ除去後に末端アミンを遊離するためにｍｏｎｏ－ｂｏｃで保護されており、ｂｏｃ除去もまた高い割合のＴＦＡを必要とする。ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）混合物中、ＰｙＯｘｉｍ，ＯｘｙｍａおよびＤＩＰＥＡの存在下、－２０℃で１．５時間ペプチドの遊離Ｃ末端をそれぞれのリンカーと反応させることにより、リンカー結合を達成した。粗混合物は逆相半調製ＨＰＬＣにより精製した。

カップリング試薬としてＰｙＯｘｉｍおよびＯｘｙｍａを用いたフルオロフォレペプチド試薬へのリンカー結合。

シーケンスの次のステップは、上記プローブのすべてについて、ｂｏｃ保護アミンとともにグルタミン酸およびアスパラギン酸の側鎖からｔ－ブチル保護基を除去することを含んだ。これは、プローブをＤＣＭ中に溶解し、室温で１時間ＴＦＡ（５０％）で処理することによって行った。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残った非晶質固体をジエチルエーテルで洗浄することによって精製した。

すべてのフルオロフォア－ペプチドリンカー複合体に対するＤＣＭ中のＴＦＡ（４０％）による保護基除去

完全ＮＩＲプローブの合成の最終段階はクエンチャー部分の添加であった。各クエンチャーは脱保護後のリンカーの末端アミンへの抱合を可能にするスクシンイミドエステルとして購入された。スクシンイミドエステルは、末端アミンとアミド結合を形成するためのカップリング試薬を必要としないように十分に活性化され、したがって、ペプチド配列の側鎖カルボン酸基との潜在的な副反応を回避される。フルオロフォア－ペプチドリンカー複合体の各々に、３つのクエンチャー（ＱＸＬ－６７０、ＱＳＹ２１またはＢＨＱ－３）の各々を別々の反応で添加した。次いで、アミド結合形成を促進するためにＤＩＰＥＡを添加し、反応を室温で２日間撹拌した。反応の完了後（ＨＰＬＣによる測定による）、粗物を逆相半調製ＨＰＬＣで精製し、最終プローブを青色非晶質固体として得た（表４）。

フルオロフォア－ペプチド－リンカー複合体へのクエンチャー添加。

グランザイムＢとのＮＩＲプローブの反応性
これらのプローブを用いて（表４）、ヒト組換えグランザイムＢとの反応性を試験し、リード候補を同定した。各プローブを２０ｎＭグランザイムＢに対して２５μＭの濃度で試験し、蛍光を３７℃で２時間にわたって記録した（λ_ｅｘ：６２０ｎｍ、λ_ｅｍ：６６０ｎｍ）。その結果、プローブＲ７は最高の性能を示し、その６６０ｎｍでの蛍光強度は、グランザイムＢの添加後に約８０倍となった（図１４Ａ）。ＨＰＬＣ－ＭＳを用いてＲ７とグランザイムＢとの反応性を確認し、２時間以内に無傷から開裂への変換が１００％完了し、アスパラギン酸残基の後ろでプローブが開裂することを示した（図１４Ｂ）。次に、Ｒ７を密接に関連するプロテアーゼ、すなわち－カスパーゼ－３およびグランザイムＡとインキュベートすることにより、グランザイムＢに対するＲ７の選択性を調べた。６６０ｎｍでの蛍光の増加は観察されなかった一方で、グランザイムＢを既知の市販阻害剤（Ａｃ－ＩＥＰＤ－ＣＨＯ）とプレインキュベートすると倍率変化が減少するので、グランザイムＢに対するＲ７の特異性がさらに確認された（図１４Ｃ）。最後に、基質濃度を変化させ、酵素（２０ｎＭ）の固定濃度で初期速度を計算することにより、ヒト組換えグランザイムＢによるＲ７消費の動力学を調べた（図１４Ｄに示す２５μＭ基質での動力学）。これらの結果から、Ｒ７は約１．９８×１０^６Ｍ^－１ ｓ^－１のＫ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍを有することと定めた。

アッセイ条件の最適化（プローブＨ５による）
プローブの最適設定を確立するために、種々の濃度（０、８．４、２８、８４，２８０，８４０、２８００、８４００、２８０００および８４０００ｐｇ／ｍｌ）のｈＧｚｍＢを用いて、異なる緩衝液組成および光学設定におけるプローブＨ５の性能を比較した。表５に別段の記載がない限り、２５μＭのＨ５を３８４ウェルブラックマイクロプレート中でｈＧｚｍＢと混合し、蛍光強度を定量する前に３７℃でインキュベートした。プローブ濃度、緩衝液のイオン強度およびｐＨ，ならびにＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ Ｂｉｏｔｅｋマイクロプレートリーダー上の光学設定を、可能な限り低いＬｏＤを得るために変更した（表５）。

抗体捕捉活性アッセイ（プローブＨ５による）
抗体はそれらの基質に高度に特異的であり、イムノアッセイ技術において試料（特に複雑なマトリックスを有する試料）から材料を捕捉するために一般的に使用されるので、緩衝液および生物学的試料（例えば血清）中のＧｚｍＢを検出するために追加の抗体捕捉ステップが追加された。高結合マイクロプレート（メルク）をコーティング緩衝液中で抗ＧｚｍＢ抗体で被覆し、加湿チャンバー中で４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（０．０１ＭＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）で４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌストックからＧｚｍＢ緩衝液（ＮａＣｌ１００ｍＭ、トリス５０Ｍｍ、ｐＨ７）で様々な濃度に希釈した１００ｕｌの活性化型ＧｚｍＢ標準液を添加し、５０ｒｐｍで振とうしながら１時間インキュベートした。サンプルを再び洗浄緩衝液で４回洗浄し、最適化ＧｚｍＢ緩衝液中の１０ｍＭストック溶液から希釈した１００ｕｌ ２５ｕＭプローブＨ５を添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ Ｂｉｏｔｅｋマイクロプレートリーダーを用いて０時間、２時間、４時間および２４時間後のλ_ｅｘ＝４７０ｎｍおよびλ_ｅｍ＝５１０ｎｍの蛍光強度をモノクロメータを用いて読み取った。蛍光強度をＧｚｍＢ濃度に対してプロットし、検出限界（ＬｏＤ）を０濃度サンプルの平均＋３標準偏差に基づいて計算した。他の配位子（例えば、タンパク質、ナノボディ）を使用して、上記のようなマイクロウェルプレートの表面に酵素を捕捉することができる。

血清中で得られたＬｏＤは４０．９ｐｇ／ｍｌであり、これは血液中のＧｚｍＢの病理学的レベルに匹敵するため、臨床試料で使用できる優れた可能性がある。

急性移植拒絶のための尿試料の検査
背景
急性移植拒絶反応を検出するためのゴールドスタンダードな検査は、コア生検と呼ばれる移植臓器から材料のサンプルを採取することである。しかし、これは患者に害を及ぼす可能性のある侵襲的な検査であり、１０例に一例は診断のための十分な組織を提供しない。グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）は急性移植拒絶に関連するタンパク質であり、その活性の測定は高い精度で拒絶の初期段階を同定することができる。

腎移植は依然として末期腎不全に対する唯一の最も効果的な治療法である。患者の約５人に１人は、腎移植を受けてから１年以内に急性拒絶反応を経験し、移植片喪失および死亡のリスク増大と関連している。したがって、急性移植拒絶反応の早期発見と効果的な治療は、患者の移植片機能と生活の質を最大化するために重要である。

ＧｚｍＢは尿中に存在する可能性があるが、これを測定する現在の方法は高価な装置とサンプル処理を必要とする。ここでは、酵素活性を検出するために、組換えグランザイムＢでスパイクした尿サンプルにプローブＨ５とＲ７を適用することによって、この問題に取り組んでいる。

結果
まず、プローブＨ５およびＲ７の安定性、および３人の健康なドナーからの尿中の安定性を検討し、すべての尿サンプルに存在する可能性のある他の生体分子と交差反応性が生じないことを確認した。これを行うために、スパイクグランザイムＢ（１５ｎＭ）の有無での尿中のプローブＨ５およびＲ７の蛍光応答をモニターし、ＨＰＬＣ分析による安定性も評価した。結果は、プローブＨ５の５１０ｎｍでの蛍光増加が７倍、プローブＲ７の６６０ｎｍでの蛍光増加が９０倍であることを示したが、ＨＰＬＣ分析は、両プローブの１％未満が尿試料中のみで切断され、グランザイムＢの存在下では１時間後にＨ５およびＲ７（それぞれ）が切断プローブへの８４％および９９％までの変換が生じたことを明らかにした。（図１１）。なお、ＨＰＬＣ－ＭＳにより、アスパラギン酸残基（天然グランザイムＢ開裂部位）の後ろでプローブＨ５およびＲ７が開裂されることを確認した。

次に、検出限界を決定するために、３つの健常者の尿試料中のスパイク組換えグランザイムＢの検出を検討した。活性化型組換えグランザイムＢの濃度のダイナミックレンジ（２０，０００－７８ｐｇ／ｍＬ）を健常者の尿試料に加え、プローブＨ５およびＲ７（２５μＭ）と試料を３７℃で３時間インキュベートした。プローブＨ５のＬｏＤは６．１８ｐＭ（１９８ｐｇ／ｍＬ）、プローブＲ７のＬｏＤは３．１ｐＭ（９９ｐｇ／ｍＬ）であった。

ＩＢＤ患者便サンプルのグランザイムＢ活性の検査
背景
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、消化管の炎症を引き起こす慢性免疫介在性疾患である。過去十年間に、ＩＢＤは公衆衛生上の課題として浮上し、ＥＵでは３００万人がこの疾患に罹患し、世界的な有病率は０．３％を超えている。最も一般的な症例はクローン病と潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である。

ＩＢＤの診断と治療の進歩にもかかわらず、ＩＢＤの新しいバイオマーカーは、腸の炎症、治療に対する反応および治療法の選択をモニターする方法を改良するために必要である。ＩＢＤの現在のモニタリングは、大腸内視鏡検査（数か月の待ち時間を伴う侵襲的手技）、生検の組織学的分析、または２～３週間で結果が得られるクリニックでの血液または便サンプル中の限られたタンパク質の量を測定することにより実施されている。大腸内視鏡検査は侵襲的で高価である；一方、イメージングスキャン（例、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ））は腸粘膜の直接的な評価を提供しない。粘膜治癒はＩＢＤ患者における治療の有効性を評価するために使用されているが、長期にわたる侵襲的生検の組織像に大きく依存している。

Ｃ反応性蛋白質やカルプロテクチンなど、ＩＢＤのバイオマーカーのいくつかはすでに存在しており、これらは血液／便サンプルで検出できる。しかし、これらのバイオマーカーは炎症の一般的な指標であり、ＩＢＤ活性を特異的に報告することはできない。したがって、臨床医が自由に使える追加のマーカーまたはより特異的なマーカーを持つことが望ましい。

グランザイムＢは炎症性疾患に直接関与しており、ＩＢＤ患者の血清を用いた研究（Ｒ． Ｋａｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｒｏｈｎ’ｓ． Ｃｏｌｉｔｉｓ． ２０２０， １５， ６９９－７０８）や腸組織生検で示されているように、慢性腸炎の間に非常に活性である。非常に高レベルの活性化型グランザイムＢは腸を損傷し、炎症が消失しない理由の１つとなる。ＩＢＤ患者の腸は、グランザイムＢ依存的に腸損傷を誘発することができる免疫細胞（Ｔ細胞）の高い浸潤を有する。我々の蛍光化学プローブを用いたグランザイムＢのための最初のＩＶＤの開発は、大腸内視鏡を介したＩＢＤ診断およびモニタリングの現在のプロセスを激変させる可能性がある。ここでは、グランザイムＢ活性もまた健康と疾患を区別できるかどうかを確立するために、カルプロテクチンレベルに基づく臨床便サンプルにおいてプローブＨ５およびＲ７を利用する。

結果
本研究では、独自に開発した抗体捕捉アッセイを用いて、各便検体中のグランザイムＢ活性を評価した（図１２）。まず、高結合９６ウェルプレートを３７℃で２時間グランザイムＢ抗体で被覆し、結合した抗体をＣｈｏｎｂｌｏｃｋを用いてブロック（室温で２時間）し、洗浄し、臨床便検体を添加して室温で２時間インキュベートした。次にプレートを洗浄し、プローブＨ５とＲ７を添加し、蛍光を３７℃で１８時間モニターした。検出したグランザイムＢシグナルを定量化するために、各９６ウェルプレート上に検量線を設け、既知濃度のヒト組換えグランザイムＢを各ウェルに添加した。

４８検体の‘高カルプロテクチン’と４６検体の‘低カルプロテクチン’の便上清を分析し、プローブＨ５とＲ７の蛍光倍率変化を比較した。この倍率変化を定量化し、検量線に沿った濃度値を得た（図１３ＡとＢ）。これを定量化すると、プローブＨ５を用いた低カルプロテクチン試料と高カルプロテクチン試料の平均濃度は、それぞれ４８０２ｐｇ／ｍＬと１１６３６ｐｇ／ｍＬであった（図１３Ａ）。一方、プローブＲ７を用いた低カルプロテクチン試料と高カルプロテクチン試料の平均濃度は、それぞれ３３１８ｐｇ／ｍＬと５６８７ｐｇ／ｍＬであった（図１３Ｂ）。

ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ

１．Ｍｏｕｃｈａｃｃａ， Ｐ．， Ｓｃｈｍｉｔｔ－Ｖｅｒｈｕｌｓｔ， Ａ． Ｍ． ＆ Ｂｏｙｅｒ， Ｃ． Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｅ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｃｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６７２３９（２０１３）．
２．Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ， Ｎ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｄｅｆｉｎｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｓｐａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ： ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｋｅｙ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， １７９０７－１７９１１（１９９７）．
３．Ｍａｃ， Ｑ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒｓ ｏｆ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． ３， ２８１－２９１（２０１９）．
４．Ｈｅ， Ｓ．， Ｌｉ， Ｊ．， Ｌｙｕ， Ｙ．， Ｈｕａｎｇ， Ｊ． ＆ Ｐｕ， Ｋ． Ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ ｆｏｒ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｕｒｉｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １４２， ７０７５－７０８２（２０２０）．
５．Ｅｓｐａｒｇａｒｏ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ ｔｏ ａｍｙｌｏｉｄ ｆｉｂｒｉｌｓ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ５９， ８１０４－８１０７（２０２０）．
６．Ｇｏｔｚ， Ａ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｒｏｕｔｉｎｅ ｍｉｃｒｏｓｅｃｏｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＡＭＢＥＲ ｏｎ ＧＰＵｓ． １． ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｒｎ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｔｈｅｏｒｙ． Ｃｏｍｐｕｔ． ８， １５４２－１５５５（２０１２）．
７．Ｓｅｒｒｅｌｓ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅａｒ ＦＡＫ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ， Ｔｒｅｇｓ， ａｎｄ ｅｖａｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｃｅｌｌ １６３， １６０－１７３（２０１５）．
８．Ｊａｎｉｓｚｅｗｓｋｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｅｎｚｙｍｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｂｅｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２９５， ９５６７－９５８２（２０２０）．
９．Ｍａｈｒｕｓ， Ｓ． ＆ Ｃｒａｉｋ， Ｃ． Ｓ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｂｅｓ ｏｆ ｇｒａｎｚｙｍｅｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｒｅｖｅａｌ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｉｓ ａ ｍａｊｏｒ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １２， ５６７－５７７（２００５）．
１０．Ｈａｒｒｉｓ， Ｊ． Ｌ．， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｅ． Ｐ．， Ｈｕｄｉｇ， Ｄ．， Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ， Ｎ． Ａ． ＆ Ｃｒａｉｋ， Ｃ． Ｓ． Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ２７３６４－２７３７３（１９９８）．
１１．Ｋｏｋ， Ｈ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｄ ｌｏｃａｌ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｌｅｖｅｌｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｋｉｄｎｅｙ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ５６， ２１２９－２１３４（２０１７）．
１２．Ｃａｎｅｌ， Ｍ．， Ｔａｇｇａｒｔ， Ｄ．， Ｓｉｍｓ， Ａ． Ｈ．， Ｌｏｎｅｒｇａｎ， Ｄ． Ｗ．， Ｗａｉｚｅｎｅｇｇｅｒ， Ｉ． Ｃ． ＆ Ｓｅｒｒｅｌｓ， Ａ． Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＦＡＫ ｄｒｉｖｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ｅＬｉｆｅ ９， ｅ４８０９２（２０２０）．

Claims (22)

1. グランザイムＢの検出に使用するためのプローブであって、検出可能な部分に連結または結合したグランザイムＢ切断可能ペプチドを含み、前記グランザイムＢ切断可能ペプチドが下記の配列を有するヘキサペプチド配列を含む、あるいは前記ヘキサペプチド配列から本質的に成る、あるいは前記ヘキサペプチド配列からなるものであり、
   Ｐ４－Ｐ３－Ｐ２－Ｐ１－Ｘ１－Ｘ２
   ここで、Ｐ４はＩまたはＶであり；Ｐ３はＥ、ＱまたはＭであり；Ｐ２は任意のアミノ酸であり；Ｐ１はＤであり、Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｗ、またはＲであり；Ｘ２はＧ、Ｌ、またはＲである、
   プローブ。
2. 下記の配列：
   Ｉ－Ｅ－Ｐ／Ｆ－Ｄ－Ｘ１－Ｘ２
   を有し、ここで、Ｘ１はＡ、Ｓ、ＷまたはＲであり、Ｘ２はＧ、ＬまたはＲである、
   請求項１に記載のプローブ。
3. 前記検出可能な部分が、同位体標識もしくは放射線標識、常磁性造影剤、常磁性もしくは超常磁性粒子、または光学的に検出可能な部分である、請求項１または２のいずれかに記載のプローブ。
4. 前記光学的に検出可能な部分が、蛍光部分である、請求項３に記載のプローブ。
5. クエンチャー部分をさらに含む、請求項４に記載のプローブ。
6. 検出可能部分および／またはクエンチャー部分が、共有結合を介して前記ペプチドに連結される、請求項３～５のいずれか一項に記載のプローブ。
7. 前記検出可能部分が、前記ペプチドのＮまたはＣ末端アミノ酸に連結され、クエンチャー部分が存在する場合には前記クエンチャー部分が、蛍光部分が連結されるそれぞれのＣまたはＮ末端に連結される、前記のいずれかの請求項に記載のプローブ。
8. 前記検出可能部分、蛍光部分および／またはクエンチャー部分が、ナノ粒子内に連結、結合および／または埋め込まれ、前記ナノ粒子がペプチドに連結される、請求項３～５のいずれか一項に記載のプローブ。
9. 前記検出可能部分、蛍光部分、クエンチャー部分および／またはナノ粒子が、リンカー分子を介して前記ペプチドに連結される、前記のいずれかの請求項に記載のプローブ。
10. リンカー分子が、アルキル、アルケニル、またはポリエーテル鎖であり、場合によってはＣ２～Ｃ２４反復単位を有し、または、１つ以上の天然もしくは非天然のアミノ酸もしくはイミノ酸である、請求項９に記載のプローブ。
11. １ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐｍ、１００ｐｍ、または５０ｐｍ未満など、１０ｎＭ未満の量のサンプル中のグランザイムＢを検出することができる、前記のいずれかの請求項に記載のプローブ。
12. グランザイムＢのＫｍが３０μＭ、２５μＭ、２０μＭ、１５μＭまたは１０μＭ未満である前記のいずれかの請求項に記載のプローブ
13. ｋｃａｔ／ＫＭ値が１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６または１×１０^７より大きい前記のいずれかの請求項に記載のプローブ。
14. 前記プローブが、装置の表面に結合され、接着され、またはその他の方法で捕捉されている、前記のいずれかの請求項に記載のプローブを含む検出装置。
15. 前記表面は、スライド、マイクロタイタープレート、横流デバイス、または流体デバイスの壁の表面である、請求項１４に記載の検出装置。
16. 前記表面は、ビーズ、マイクロ粒子またはナノ粒子の表面である、請求項１４に記載の検出装置。
17. 細胞および／または体液試料中のグランザイムＢのレベルのｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ検出における、前記いずれかの請求項に記載のプローブの使用。
18. 細胞含有試料または体液若しくは排泄物中のグランザイムＢを検出する方法であって、請求項１～１３のいずれかに記載のプローブまたは請求項１４～１６のいずれかに記載の検出装置を、細胞含有試料または体液／排泄物試料若しくはその処理された一部とｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させることと、前記ペプチドの開裂および前記検出可能部分を含む開裂ペプチドの放出によりグランザイムＢのレベルを検出することとを含む方法。
19. 前記体液が血液、血清または血漿試料である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記体液が尿または肺洗浄液である、請求項１８に記載の方法。
21. 前記体液／排泄物が、サンプル中の他の成分からグランザイムＢを濃縮および／または分離するために処理された、便または尿サンプルのようなサンプルである、請求項１８または１９に記載の方法。
22. 前記処理されたサンプルは、抗グランザイムＢ抗体またはグランザイムＢに特異的に結合することができるその結合断片のような、結合剤に接触され、任意で前記結合剤は、プローブを接触させ希釈便サンプル中に存在するグランザイムＢのレベルを検出する前に、表面に結合、接着、またはその他の方法で付着されている、請求項２１に記載の方法。
    

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