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JP2024525665A - 効率的なゲノム編集のための組成物及び方法 - Google Patents

効率的なゲノム編集のための組成物及び方法 Download PDF

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JP2024525665A JP2024501179A JP2024501179A JP2024525665A JP 2024525665 A JP2024525665 A JP 2024525665A JP 2024501179 A JP2024501179 A JP 2024501179A JP 2024501179 A JP2024501179 A JP 2024501179A JP 2024525665 A JP2024525665 A JP 2024525665A
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Abstract

本明細書では、標的遺伝子の効率的で正確な編集を可能とする改善されたプライム編集方法及び組成物が提供される。【選択図】図１

Description

相互参照
本出願は、２０２１年７月０６日に出願された米国仮出願番号６３／２１８，７４４、及び２０２１年７月０８日に出願された米国仮出願番号６３／２１９，６２３の利益を主張し、これらの出願の各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
プライム編集技術は、標的ゲノムにおいて標的とされる挿入、欠失、ならびにすべてのトランスバージョン及びトランジション点変異を為すことができる遺伝子編集技術である。本開示は、標的遺伝子の効率的で正確な編集を可能とする改善されたプライム編集方法及び組成物を提供する。
本明細書では、いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における標的配列における改変の効率的なプライム編集のための方法及び組成物が提供される。
いかなる特定の理論にも縛られることなく、プライム編集プロセスは、標的ポリヌクレオチドにおける内因性配列を探し、置き換え得る。図３に例示されるように、プライム編集ガイドＲＮＡ（ＰＥｇＲＮＡ）のスペーサー配列は、二本鎖標的ポリヌクレオチド、例えば、二本鎖標的ＤＮＡの標的鎖におけるサーチ標的配列を認識し、それにアニールする。プライム編集複合体は、標的鎖の相補鎖である編集鎖上の標的ＤＮＡにおいてニックを生成し得る。次いでプライム編集複合体は、編集鎖のニック部位で形成された遊離３’末端を使用してＤＮＡ合成を開始させ得、その場合、ＰＥｇＲＮＡのプライマー結合部位配列（ＰＢＳ）は、遊離３’末端と複合体化し、ＰＥｇＲＮＡの編集鋳型を鋳型として使用して一本鎖ＤＮＡが合成される。編集鋳型は、内因性二本鎖標的ＤＮＡ配列と比較して１つ以上の意図されるヌクレオチド編集を含み得る。したがって、新しく合成された一本鎖ＤＮＡもまた、編集鋳型によってコードされるヌクレオチド編集（複数可）を含む。二本鎖標的ＤＮＡの編集鎖上の編集標的配列の除去及びＤＮＡ修復メカニズムを介して、新しく合成された一本鎖ＤＮＡは、編集標的配列に置き換わり、所望のヌクレオチド編集（複数可）が二本鎖標的ＤＮＡに組み込まれる。
本明細書では、いくつかの実施形態では、修飾されたプライムエディター（ＰＥ）ポリペプチド、互いに会合し、かつ二本鎖標的ＤＮＡにおいて意図されるヌクレオチド編集を効率的に組み込み得る修飾されたＰＥｇＲＮＡ、及び特定の細胞タイプ、例えば、造血幹細胞において標的ＤＮＡを編集するためにそれを使用する方法が提供される。
一態様では、本明細書では、融合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して接続されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、ペプチドリンカーは、配列番号２８９、２９１、２９３、２９４、２９５、３０１、３０２、３０３、３０６、３０９、３１０、及び３１１からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、プライム編集組成物が提供される。
一態様では、本明細書では、融合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して接続されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、ペプチドリンカーは、配列番号２８６～４１１からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、プライム編集組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、選択される配列と少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号３０２である。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号３０９である。
一態様では、本明細書では、融合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して接続されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、ペプチドリンカーは、少なくとも４個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む、プライム編集組成物が提供される。
一態様では、本明細書では、融合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して接続されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、ペプチドリンカーは、４～１０個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む、プライム編集組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、４、５、６、８、または１０個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む。
一態様では、本明細書では、融合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して接続されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、ペプチドリンカーは、少なくとも２個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む、プライム編集組成物が提供される。
一態様では、本明細書では、融合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して接続されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、ペプチドリンカーは、２～８個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む、プライム編集組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２、３、４、６、または８個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインは、逆転写酵素（ＲＴ）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）ＲＴドメインである。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸５０４及び５０５に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号３６と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸４７８及び４７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号５４と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一態様では、本開示は、ａ）ＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、及びｂ）モロニーマウス白血病逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）ドメインまたはＭ－ＭＬＶ ＲＴドメインをコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸５０４及び５０５に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む、プライム編集組成物を提供する。
一態様では、本明細書では、ａ）ＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、及びｂ）モロニーマウス白血病逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）ドメインまたはＭ－ＭＬＶ ＲＴドメインをコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸４７８及び４７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されている、プライム編集組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してアミノ酸置換Ｄ２００Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、融合タンパク質においてＭ－ＭＬＶ ＲＴドメインに接続されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン及びＭ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、ペプチドリンカーによって接続されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８６～４１１からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＨＮＨドメインにおける変異を含むニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２と比較してＨ８４０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型Ｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、またはＣａｓ１２ｅである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼドメイン及びＤＮＡ結合ドメインをＮ末端からＣ末端へ含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼドメイン及びＤＮＡ結合ドメインをＣ末端からＮ末端へ含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７８、１０５、１１７、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、及び２２７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号７８である。
いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号１０５である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８６、１１１、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００、２０６、２１２、２１８、２２４、及び２３０からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号８６である。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号１１１である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、選択される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、配列番号８～１５または６２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７７、９３、１０４、１１６、及び６２０からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号７７または配列番号６２０である。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号９３である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８５、９６、１１０、及び６２２からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号８５または配列番号６２２である。
いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号１１０である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、選択される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記の態様のいずれか１つのプライム編集組成物は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、配列番号８１、８２、１０８、１０９、１２０、１２１、１２６、１２７、１３２、１３３、１３８、１３９、１４４、１４５、１５０、１５１、１５６、１５７、１６２、１６３、１６８、１６９、１７４、１７５、１８０、１８１、１８６、１８７、１９２、１９３、１９８、１９９、２０４、２０５、２１０、２１１、２１６、２１７、２２２、２２３、２２８、及び２２９からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号８１または８２である。いくつかの実施形態では、上記の態様のいずれか１つのプライム編集組成物は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、配列番号８９、９０、１０２、１０３、１１４、１１５、１２３、１２４、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１、１４２、１４７、１４８、１５３、１５４、１５９、１６０、１６５、１６６、１７１、１７２、１７７、１７８、１８３、１８４、１８９、１９０、１９５、１９６、２０１、２０２、２０７、２０８、２１３、２１４、２１９、２２０、２２５、２２６、２３１、及び２３２からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号８９または９０である。
いくつかの実施形態では、上記態様のいずれか１つのプライム編集組成物は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、配列番号７９、８０、９４、９５、１０６、１０７、１１８、及び１１９からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、上記態様のいずれか１つのプライム編集組成物は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、配列番号８７、８８、９７、９８、１００、１０１、１１２、及び１１３からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号７９または８０である。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号８７または８８である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、３’末端で終止コドンをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２７６～２７９の配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２８２～２８５の配列を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２７４、２７５、５９２、または５９３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２８０、２８１、５９４、または５９５の配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、制御性要素配列をさらに含み、任意に制御性要素配列は、プロモーターである。
一態様では、本明細書では、ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、第２のポリヌクレオチドは、配列番号４１２～５５５からなる群から選択される配列のヌクレオチド１００～２１３０に対応する配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、プライム編集組成物が提供される。
一態様では、本明細書では、ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、第２のポリヌクレオチドは、配列番号８３または８４と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、プライム編集組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、配列番号８３または８４と少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
一態様では、本明細書では、ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、第２のポリヌクレオチドは、配列番号８３または８４の配列を含む、プライム編集組成物が提供される。
一態様では、本明細書では、ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、第２のポリヌクレオチドは、配列番号９１または９２と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、プライム編集組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、配列番号９１または９２と少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
一態様では、本明細書では、ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、第２のポリヌクレオチドは、配列番号９１または９２の配列を含む、プライム編集組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＨＮＨドメインにおける変異を含むニッカーゼであり、任意にＣａｓ９タンパク質は、配列番号２と比較してＨ８４０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型Ｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、またはＣａｓ１２ｅである。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、融合ポリヌクレオチドにおいて接続されている。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、ペプチドリンカーをコードする配列によって接続されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３５、２３６または６３３～６３６の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの５’末端に接続されている。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの３’末端に接続されている。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８１、８２、１０８、１０９、１２０、１２１、１２６、１２７、１３２、１３３、１３８、１３９、１４４、１４５、１５０、１５１、１５６、１５７、１６２、１６３、１６８、１６９、１７４、１７５、１８０、１８１、１８６、１８７、１９２、１９３、１９８、１９９、２０４、２０５、２１０、２１１、２１６、２１７、２２２、２２３、２２８、２２９、２４１、及び２４２からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号８１または８２である。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号２４１または２４２である。
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８９、９０、１０２、１０３、１１４、１１５、１２３、１２４、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１、１４２、１４７、１４８、１５３、１５４、１５９、１６０、１６５、１６６、１７１、１７２、１７７、１７８、１８３、１８４、１８９、１９０、１９５、１９６、２０１、２０２、２０７、２０８、２１３、２１４、２１９、２２０、２２５、２２６、２３１、及び２３２からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号８９または９０である。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号１０２または１０３である。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号１１４または１１５である。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、またはその両方は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号２３９または２４０の配列を含み、第２のポリヌクレオチドの３’末端に接続されている。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号７９、８０、９４、９５、１０６、１０７、１１８、１１９、２３３、及び２３４からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号７９または８０である。
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８７、８８、９７、９８、１００、１０１、１１２、及び１１３からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、選択される配列は、配列番号８７または８８である。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、３’末端で終止コドンをさらに含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号２７６～２７９からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号２８２～２８５からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２７４、２７５、５９２、または５９３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２８０、２８１、５９４、または５９５の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、及び／または融合ポリヌクレオチドは、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、及び／または融合ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、制御性要素配列をさらに含み、任意に制御性要素配列は、プロモーターである。
いくつかの実施形態では、配列同一性は、存在（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）：１１、伸長（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）１に設定されたギャップコストを用いて２つの配列のニードルマン・ウンシュアライメントによって決定され、同一率は、同一の数をアライメントの長さで除算することによって計算される。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、プライム編集ガイドＲＮＡ（ＰＥｇＲＮＡ）またはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）またはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
一態様では、本明細書では、上記態様のいずれか１つのプライム編集組成物のポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含むベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
一態様では、本明細書では、上記態様のいずれか１つのプライム編集組成物または上記態様のいずれか１つのベクター、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。
一態様では、本明細書では、標的遺伝子を編集する方法であって、方法は、標的遺伝子を上記態様のいずれか１つのプライム編集組成物と接触させることを含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、細胞におけるものである。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、（ＣＤ３４＋）造血幹細胞または造血幹前駆細胞である。いくつかの実施形態では、接触させることは、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるものである。いくつかの実施形態では、細胞は、対象にある。
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれることが示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲において示される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
Ｃａｓ９ニッカーゼ、逆転写酵素、及びリンカーを含む例示的なプライムエディター融合タンパク質の概略図である。 プライムエディターのために設計されたＰＥｇＲＮＡの例示的な概略図におけるプライム編集ガイドＲＮＡ（ＰＥｇＲＮＡ）構成を示している。 二本鎖標的ＤＮＡ配列に結合しているプライム編集ガイドＲＮＡ（ＰＥｇＲＮＡ）の概略図を示している。 ２つの別々の分子における例示的なガイドＲＮＡのスペーサー及びｇＲＮＡコア部分を示す概略図である。ＰＥｇＲＮＡ構造の残部は示されていない。 操作されたＲＴドメインを有するプライムエディターのプライム編集効率を示している。「ｐｅｇＲＮＡのみ」（各プライムエディターについての上部のバー）は、ｎｇＲＮＡと対合されていないｐｅｇＲＮＡで達成された編集効率を指す；「ｐｅｇＲＮＡ＋ｎｇＲＮＡ」（各プライムエディターについての下部のバー）は、ｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡで達成された編集効率を指す。
本明細書では、いくつかの実施形態では、標的細胞における標的ＤＮＡポリヌクレオチドの高度なプライム編集のための組成物及び編集方法が提供される。本明細書で提供される組成物は、標的ＤＮＡポリヌクレオチドにおける特定のＤＮＡ遺伝子座にＰＥを標的化するプライム編集ガイドＲＮＡ（ＰＥｇＲＮＡ）と称される操作されたガイドポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡを使用し得、かつ疾患を引き起こす変異の直接的修正を含む多様な機能を果たし得るＤＮＡ編集をコードし得るプライムエディター（ＰＥ）を含み得る。
以下の記載及び例は、本開示の実施形態を詳細に説明する。本開示は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして様々であり得ることを理解されたい。当業者は、本開示の多数のバリエーション及び修飾が存在し、これらはその範囲に包含されることを認識するであろう。本開示の様々な特徴は、単一の実施形態の文脈で記載され得るが、特徴はまた、別々にまたは任意の好適な組み合わせで提供され得る。逆に、本開示は、明確性のために別々の実施形態の文脈で記載され得るが、本開示はまた、単一の実施形態で実践され得る。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈が別途明らかに示さない限り、複数形も同様に含まれることが意図されている。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「伴う」、またはその変化形は、本明細書で使用される場合、「含む」を意味する程度まで。
別途特定されない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」は、包括的またはオープンエンドであり、追加の記述していない要素または方法工程を排除しない。
「いくつかの実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」に対する言及は、実施形態と組み合わせて記載される特定の特徴または特性が、少なくとも１つ以上の実施形態に含まれるが、かならずしも、本開示のすべての実施形態に含まれるわけではないことを意味する。
用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に依存することになる。例えば、「約」は、当該技術分野における実践に従って、１標準偏差以内を意味し得る。代替的には、「約」は、所与の値の最大で２０％、最大で１０％、最大で５％、または最大で１％の範囲を意味し得る。代替的には、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、その用語は、値の１桁分以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願及び特許請求の範囲に記載される場合、別途記述されない限り、特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味する用語「約」が想定されるべきである。
本明細書で使用される場合、「細胞」は通常、生物学的細胞を指し得る。細胞は、生物の基礎構造的、機能的及び／または生物学的単位であり得る。細胞は、１つ以上の細胞を有する任意の生物に由来し得る。いくつかの非限定的な例には、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞性真核生物の細胞、原生動物細胞、植物からの細胞、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫等）からの細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）からの細胞、哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒト等）からの細胞等が含まれる。時に細胞は、天然生物に由来しない場合がある（例えば、細胞は、合成的に製造される（時に人工細胞と称される））。
いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。細胞は、異なる組織、器官、及び／または細胞タイプのものであり、またはそれに由来し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞である。本明細書で使用される場合、用語「初代細胞」は、生物、例えば、哺乳動物から単離された細胞であって、細分割及び二次培養への移行前に初めて組織培養（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増殖させられたものを意味する。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの非限定的な例では、初代細胞及び幹細胞を含む哺乳動物細胞は、１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び／またはプライム編集組成物の導入を介して（例えば、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション等を介して）修飾され、さらに継代され得る。そのような修飾される細胞には、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞、（ＨＳＰＣ）、肝細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、乳房上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、形成された血液の要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞、造血幹前駆細胞）、筋肉細胞及びこれらの体細胞タイプの前駆体が含まれ得る。いくつかの実施形態では、細胞は、初代肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代ヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、多能性細胞（例えば、多能性幹細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、幹細胞）は、胚性幹細胞、組織特異的幹細胞、間葉幹細胞、または人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、人工ヒト多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する初代ヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ニューロンである。いくつかの実施形態では、細胞は、大脳基底核からのニューロンである。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象の大脳基底核からのニューロンである。いくつかの実施形態では、細胞は、肺、肝臓、胃、または腸からの上皮細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象の肺、肝臓、胃、または腸からの上皮細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、網膜細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象からの網膜細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、人工ヒト多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト胚性幹細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血前駆細胞（ＨＰＣ）である。いくつかの実施形態では、造血幹細胞及び造血前駆細胞は、造血幹または前駆細胞（ＨＳＰＣ）と称される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトＨＳＣである。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトＨＰＣである。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトＨＳＰＣである。いくつかの実施形態では、細胞は、長期（ＬＴ）－ＨＳＣである。いくつかの実施形態では、細胞は、短期（ＳＴ）－ＨＳＣである。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、顆粒球単球前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、巨核球赤血球前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）である。
いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血幹及び前駆細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、骨髄または動員末梢血からのものであり得る。いくつかの実施形態ではヒト幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトＨＳＣである。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血前駆細胞、多能性前駆細胞、リンパ前駆細胞、骨髄前駆細胞、巨核球－赤血球前駆細胞、顆粒球－巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、血小板、巨核芽球、血小板産生巨核球、単球、マクロファージ、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、リンパ球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、またはＴ細胞である。いくつかの実施形態では、プライム編集によって編集された細胞は、細胞、例えば、共通リンパ前駆細胞、共通骨髄前駆細胞、巨核球－赤血球前駆細胞、顆粒球－巨核球前駆細胞、顆粒球、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、網状赤血球、血小板、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、リンパ球、例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはＴ細胞の集団に分化され、またはその回復を生じさせ得る。いくつかの実施形態では、プライム編集によって編集された細胞は、細胞、例えば、好中球、血小板、赤血球、単球、マクロファージ、抗原提示細胞、ミクログリア、破骨細胞、樹状細胞、内耳細胞、内耳支持細胞、蝸牛細胞及び／またはリンパ球の集団に分化され、またはその回復を生じさせ得る。いくつかの実施形態では、細胞は、対象、例えば、ヒト対象におけるものである。
いくつかの実施形態では、細胞は、生物から単離されないが、生物、例えば、哺乳動物の組織または器官の一部を形成する。いくつかの非限定的な例では、哺乳動物細胞には、形成された血液の要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、これらの体細胞タイプのいずれかの前駆体、及び幹細胞が含まれる。
いくつかの実施形態では、細胞は、生物から単離される。いくつかの実施形態では、細胞は、生物に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、分化した細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞から分化される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＳＣまたはＨＰＳＣから分化される。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化される。いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）から分化される。
いくつかの実施形態では、細胞は、分化したヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、人工ヒト多能性幹細胞から分化される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトｉＰＳＣまたはヒトＥＳＣから分化される。
いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に開示されるプライムエディター、ＰＥｇＲＮＡ、またはプライム編集組成物を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象からのものである。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、プライム編集によって修正される変異に関連する疾患または病態を有する、またはその疾患または病態を発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象からのものであり、変異の修正のためのプライムエディターまたはプライム編集組成物を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、二本鎖標的ＤＮＡにおける変異を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、標的遺伝子における変異を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、疾患、障害、または病態に関連する変異を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象におけるものである。いくつかの実施形態では、細胞は、変異の修正のためのプライムエディターまたはプライム編集組成物を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象におけるものであり、変異の修正のための本明細書に開示されるプライムエディター、ＰＥｇＲＮＡ、またはプライム編集組成物を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象からのものである。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象からのものであり、変異は、プライム編集によって編集または修正されている。
用語「実質的に」は、本明細書で使用される場合、所与の値の１００％に近い値を指し得る。いくつかの実施形態では、その用語は、全量の少なくとも約７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％であり得る量を指し得る。いくつかの実施形態では、その用語は、全量の約１００％であり得る量を指し得る。
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、三次元コンフォメーションを採用し得る共有結合（例えば、アミド結合）によって接続された２つ以上のアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、共有結合（例えば、アミド結合）によって接続された少なくとも１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸または５０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、少なくとも２つのアミド結合を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、複数のアミド結合を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、少なくとも１０個のアミド結合、１５個のアミド結合、２０個のアミド結合、３０個のアミド結合、または５０個のアミド結合を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、酵素、酵素前駆体タンパク質、制御性タンパク質、構造タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、受容体、核酸結合タンパク質、バイオマーカー、特異的結合対のメンバー（例えば、リガンドまたはアプタマー）、または抗体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、全長タンパク質（例えば、所定の生物学的機能を有する十分に処理されたタンパク質）であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、全長タンパク質のバリアントまたは断片であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質ドメインは、天然に存在するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質と比較してＨ８４０Ａアミノ酸置換を含む。タンパク質または酵素のバリアント、例えば、バリアント逆転写酵素は、参照タンパク質のアミノ酸配列と約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一、約９９．５％同一、または約９９．９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、１つ以上のタンパク質ドメインまたはサブドメインを含む。本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチドドメイン」、「タンパク質ドメイン」、または「ドメイン」は、タンパク質またはポリペプチドとの関連で使用される場合、１つ以上の生物学的機能、例えば、触媒的機能、タンパク質－タンパク質結合機能、またはタンパク質－ＤＮＡ機能を有するポリペプチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、複数のタンパク質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然に存在する複数のタンパク質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然に存在するタンパク質とは異なる複数のタンパク質ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質ドメインまたはその断片、変異体、もしくはバリアント及びレトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）の逆転写酵素タンパク質ドメインまたはそのレトロウイルスの変異体、断片、もしくはバリアントを含む融合タンパク質であり得る。異なる起源または天然に存在するタンパク質からのアミノ酸配列を含むタンパク質は、融合体、またはキメラタンパク質と称され得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、全長野生型タンパク質の機能的バリアントまたは機能的断片を含む。「機能的断片」または「機能的部分」は、本明細書で使用される場合、機能、例えば、触媒的または結合機能の１つ以上を保持しながら、参照タンパク質の全体に満たないアミノ酸配列を包含する参照タンパク質（例えば、野生型タンパク質）の任意の部分を指す。例えば、逆転写酵素の機能的断片は、野生型逆転写酵素の全体に満たないアミノ酸配列を包含し得るが、ポリヌクレオチドの重合を触媒するための少なくとも１つの条件のセット下で能力を保持する。参照タンパク質が複数の機能的ドメインの融合体である場合、その機能的断片は、機能的ドメインの少なくとも１つの機能の１つ以上を保持し得る。例えば、Ｃａｓ９の機能的断片は、野生型Ｃａｓ９の全体に満たないアミノ酸配列を包含し得るが、そのＤＮＡ結合能力を保持し、そのヌクレアーゼ活性を部分的または完全に欠き得る。
「機能的バリアント」または「機能的変異体」は、本明細書で使用される場合、機能、例えば、触媒的または結合機能の１つ以上を保持しながら、参照タンパク質のアミノ酸配列に対する１つ以上の改変を包含する参照タンパク質（例えば、野生型タンパク質）の任意のバリアントまたは変異体を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列に対する１つ以上の改変は、アミノ酸置換、挿入または欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列に対する１つ以上の改変は、アミノ酸置換を含む。例えば、逆転写酵素の機能的断片は、野生型逆転写酵素のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸置換を含み得るが、ポリヌクレオチドの重合を触媒するための少なくとも１つの条件のセット下で能力を保持する。参照タンパク質が複数の機能的ドメインの融合体である場合、その機能的バリアントは、機能的ドメインの少なくとも１つの機能の１つ以上を保持し得る。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９の機能的断片は、野生型Ｃａｓ９のアミノ酸配列と比較して、ヌクレアーゼドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｈ８４０Ａアミノ酸置換を含み得るが、ＤＮＡ結合能力を保持し、ヌクレアーゼ活性を部分的または完全に欠く。
用語「機能」及びその文法的同等物は、本明細書で使用される場合、意図される目的を遂行する、有する、または発揮する能力を指し得る。機能的は、意図される目的のベースラインから１００％までの任意のパーセントを含み得る。例えば、機能的は、意図される目的の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または最大で約１００％を含み得、または含む。いくつかの実施形態では、機能的という用語は、正常な機能の１００％超または約１００％超、例えば、意図される目的の１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％または最大で約１０００％を意味し得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質またはポリペプチドには、天然に存在するアミノ酸（例えば、天然で合成されたペプチドに一般的に見られ、１文字の略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶによって知られている２０種のアミノ酸のうちの１つ）が含まれる。いくつかの実施形態では、タンパク質またはポリペプチドには、天然に存在しないアミノ酸（例えば、天然で合成されたペプチドに一般的に見られる２０種のアミノ酸のうちの１つではないアミノ酸（合成アミノ酸、アミノ酸アナログ、及びアミノ酸模倣体を含む））が含まれる。いくつかの実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、修飾される。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、単離されたポリペプチドを含む。用語「単離された」は、天然状態または環境に見られるように通常付随する成分から遊離しているか、または様々な程度まで取り出されていることを意味する。例えば、生存動物に天然に存在するポリペプチドは、単離されておらず、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じポリペプチドは、単離されている。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞、組織、器官、またはウイルス粒子内に存在する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞または細胞の一部（例えば、細菌細胞、植物細胞、または動物細胞）内に存在する。いくつかの実施形態では、細胞は、組織、対象、または細胞培養におけるものである。いくつかの実施形態では、細胞は、微生物（例えば、細菌、真菌、原生動物、またはウイルス）である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、分析物の混合物（例えば、ライセート）に存在する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、複数の細胞からのライセートまたは単一の細胞からのライセートに存在する。
用語「相同」、「相同性」、または「相同率」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸と対応する参照アミノ酸配列との間、またはポリヌクレオチド配列と対応する参照ポリヌクレオチド配列との間の配列同一性の程度を指す。「相同性」は、同様のポリマー配列、例えば、ポリペプチドまたはＤＮＡ配列を指し得る。相同性は、例えば、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を意味し得る。他の実施形態では、核酸配列の「相同配列」は、参照核酸配列と少なくとも９３％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を示し得る。例えば、「ゲノム領域に対して相同性の領域」は、ゲノムにおける所与のゲノム領域と同様の配列を有するＤＮＡの領域であり得る。相同性の領域は、例えば、スペーサーまたはプライマー結合部位配列のゲノム領域への結合を促進するために十分な任意の長さのものであり得る。例えば、相同性の領域は、相同性の領域が、対応するゲノム領域との結合を受けるために十分な相同性を有するように、長さが少なくとも５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００個またはそれを超える塩基を含み得る。
配列相同性または同一性のパーセンテージが特定される場合、２つの核酸配列または２つのポリペプチド配列との関連で、相同性または同一性のパーセンテージは通常、最大一致のために比較及びアライメントされた場合、それらの長さの一部分にわたる２つ以上の配列のアライメントを指す。比較された配列における位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有され得る場合、そのときはその分子は、その位置で相同であり得る。別途記述されない限り、配列相同性または同一性は、核酸、ポリペプチドまたはその一部分の特定された長さにわたって評価される。いくつかの実施形態では、相同性または同一性は、その長さの機能的部分または特定された部分にわたって評価される。
配列相同性の評価のための配列のアライメントは、当該技術分野で知られているアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－ ４１０，１９９０に記載されているＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムによって実行され得る。ＢＬＡＳＴ分析を実施するための公共に利用可能なインターネットインターフェースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｒｉｏｎを介してアクセス可能である。追加の既知のアルゴリズムには、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８で公開されているもの；またはこれらのまたは同様のアルゴリズムの自動化実行によるものが含まれる。グローバルアライメントプログラムもまた、およそ同等のサイズの同様の配列をアライメントするために使用され得る。グローバルアライメントプログラムの例には、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（Ｒｉｃｅ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，２０００；１６：２７６－２７７）の一部であるＮＥＥＤＬＥ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で利用可能）、及びＦＡＳＴＡパッケージ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｄ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４－２４４８）の一部であるＧＧＳＥＡＲＣＨプログラムｈｔｔｐｓ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／が含まれる。これらのプログラムの両方は、それらの長さ全体に沿って２つの配列の最適なアライメント（ギャップを含む）を発見するために使用されるニードルマン・ウンシュアルゴリズムに基づく。配列分析の詳細な論述はまた、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ（“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４－１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，１９９８）のユニット１９．３で見られ得る。いくつかの実施形態では、クエリー配列及び参照配列の間のアライメントは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，（“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ ａｄｊｕｓｔｅｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ”，ＦＥＢＳ Ｊ．２７２：５１０１－５１０９，２００５）にさらに記載されるように、存在：１１、伸長１に設定されたギャップコストを用いてニードルマン・ウンシュアライメントで実施され、同一率は、同一の数をアライメントの長さで除算することによって計算される。
アミノ酸（またはヌクレオチド）位置は、アライメントに基づいて相同配列において決定され得ること、例えば、参照Ｃａｓ９配列における「Ｈ８４０」は、Ｃａｓ９ホモログが参照Ｃａｓ９配列に対してアライメントされた場合、Ｃａｓ９ホモログにおけるＨ８３９、または別の対応する位置に対応し得ることを当業者は理解する。用語「ホモログ」は、本明細書で使用される場合、共通の先祖のＤＮＡ配列によって別の遺伝子またはタンパク質と関連する遺伝子またはタンパク質を指す。ホモログは、オルソログまたはパラログであり得る。オルソログは、種形成事象によって別の遺伝子またはタンパク質に関連する遺伝子またはタンパク質を指す。パラログは、ゲノム内の重複事象によって別の遺伝子またはタンパク質に関連する遺伝子またはタンパク質を指す。パラログは、それが関連する遺伝子またはタンパク質の同じ種内にあり得る。パラログはまた、それが関連する遺伝子またはタンパク質の異なる種におけるものであり得る。いくつかの実施形態では、オルソログは、同じ機能を保持し得る。いくつかの実施形態では、パラログは、新たな機能を伴い得る。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、そのハイブリダイゼーション、またはＲＮＡ－ＤＮＡキメラ分子を含む、ヌクレオチドの任意のポリマー形態であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖、例えば、遺伝子における二本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖または実質的に一本鎖、例えば、一本鎖ＤＮＡまたはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、無細胞核酸分子である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、血液中を循環する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞性核酸分子である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、血液中を循環する細胞における細胞性核酸分子である。
ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（限定されないが、ヘテロクロマチンＤＮＡを含む）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離されたＤＮＡ、単離されたＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、核酸プローブ、プライマー、ｓｎＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ由来小ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または小分子ｒＤＮＡ由来ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらのアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログを含む。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドの構築の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって、重合後にさらに修飾され得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；及びポリヌクレオチドがＲＮＡである場合はチミンに代えてウラシル（Ｕ）の特定の配列から構成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の他のヌクレオチド塩基、例えば、グアニン（Ｇ）として翻訳機構によって読み取られるイノシン（Ｉ）を含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾され得る。本明細書で使用される場合、用語「修飾された」または「修飾」は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵヌクレオチドに関する化学的修飾を指す。いくつかの実施形態では、修飾は、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオシドのヌクレオシド塩基及び／または糖部分上にあり得る。いくつかの実施形態では、修飾は、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸骨格）上にあり得る。いくつかの実施形態では、複数の修飾が、修飾された核酸分子に含まれる。いくつかの実施形態では、単一の修飾が、修飾された核酸分子に含まれる。
用語「相補体」、「相補的」、または「相補性」は、本明細書で使用される場合、２つのポリヌクレオチド分子が互いに塩基対合する能力を指す。相補的ポリヌクレオチドは、ワトソンクリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合を介して塩基対合され得る。例えば、１つのポリヌクレオチド分子上のアデニンは、第２のポリヌクレオチド分子上のチミンまたはウラシルと塩基対合し、１つのポリヌクレオチド分子上のシトシンは、第２のポリヌクレオチド分子上のグアニンと塩基対合する。２つのポリヌクレオチド分子は、第１のヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド分子が、第２のヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド分子と塩基対合し得る場合、互いに相補的である。例えば、２つのＤＮＡ分子５’－ＡＴＧＣ－３’及び５’－ＧＣＡＴ－３’は、相補的であり、ＤＮＡ分子５’－ＡＴＧＣ－３’の相補体は、５’－ＧＣＡＴ－３’である。相補性のパーセンテージは、第２のポリヌクレオチド分子と塩基対合し得るポリヌクレオチド分子におけるヌクレオチドのパーセンテージを示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）。「完全に相補的」は、ポリヌクレオチド分子の連続ヌクレオチドのすべてが、第２のポリヌクレオチド分子における同じ数の連続ヌクレオチドと塩基対合することを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書で使用される場合、２つのポリヌクレオチド分子のすべてまたは一部分にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％であり得る相補性の程度を指す。いくつかの実施形態では、相補性の一部分は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、またはそれを超えるヌクレオチドの領域であり得る。「実質的に相補的」はまた、２つのポリヌクレオチド分子の一部分または領域にわたって１００％の相補性を指し得る。いくつかの実施形態では、２つのポリヌクレオチド分子間の相補性の一部分または領域は、２つのポリヌクレオチド分子またはその機能的もしくは定義される部分のうちの少なくとも１つの長さの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％である。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡがｍＲＮＡ及び／またはプロセスに転写されるプロセス、及び／またはポリヌクレオチド、例えば、転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、タンパク質をコードする遺伝子またはＤＮＡの発現は、遺伝子の転写及び翻訳の後の遺伝子によってコードされるタンパク質の量によって決定される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、タンパク質をコードする遺伝子またはＤＮＡの発現は、遺伝子の転写及び翻訳の後の遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的形態の量によって決定される。いくつかの実施形態では、遺伝子の発現は、遺伝子の転写の後の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ、または転写産物の量によって決定される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡの発現は、ｍＲＮＡの翻訳の後のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の量によって決定される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡまたはコードＲＮＡの発現は、ポリヌクレオチドの翻訳の後のポリペプチドによってコードされるタンパク質の機能的形態の量によって決定される。
用語「シーケンシング」は、本明細書で使用される場合、キャピラリーシーケンシング、バイサルファイトフリーシーケンシング、バイサルファイトシーケンシング、ＴＥＴアシストバイサルファイト（ＴＡＢ）シーケンシング、ＡＣＥ－シーケンシング、ハイスループットシーケンシング、マキサム・ギルバートシーケンシング、超並列シグネチャシーケンシング、ポロニーシーケンシング、４５４パイロシーケンシング、サンガーシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ単分子シーケンシング、単分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、ナノポアシーケンシング、ショットガンシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
用語「同等」または「生物学的同等」は、特定の分子、または生物学的または細胞物質に言及する場合に互換的に使用され、所望の構造または機能性を依然として維持しながら、別の分子に対する最小の相同性を有する分子を意味する。
用語「コードする」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、そのネイティブ状態でまたは当業者によく知られている方法によって操作される際に、ポリヌクレオチド合成鋳型として使用され得る場合、例えば、ＲＮＡに転写され、ＤＮＡまたはｃＤＮＡに逆転写され、及び／またはアミノ酸、またはポリペプチドもしくはその断片を生成するように翻訳され得る場合、別のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアミノ酸を「コードする」と称されるポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、３つの連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、特定のアミノ酸をコードするコドンを形成する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする１つ以上のコドンを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のコドンを含むポリヌクレオチドは、野生型参照ポリヌクレオチドと比較してコドンにおける変異を含む。いくつかの実施形態では、コドンにおける変異は、野生型参照ポリペプチドと比較してポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換をコードする。
用語「変異」は、本明細書で使用される場合、タンパク質のアミノ酸配列またはポリヌクレオチドの核酸配列における変化及び／または改変を指す。そのような変化及び／または改変は、参照アミノ酸または参照核酸配列と比較して、アミノ酸配列の場合は１つ以上のアミノ酸、及び／または核酸配列の場合はヌクレオチドの置換、挿入、欠失及び／または切断を含み得る。いくつかの実施形態では、参照配列は、野生型配列である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの核酸配列における変異は、ポリペプチドのアミノ酸配列における変異をコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸配列における変異またはポリヌクレオチドの核酸配列における変異は、疾患状態に関連する変異である。「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、指定される配列のサブセットまたは全体；例えば、全長ｃＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、遺伝子配列もしくはポリペプチド配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、遺伝子配列もしくはポリペプチド配列であり得る。いくつかの実施形態では、参照配列は、対象となるタンパク質の野生型配列またはそのバリアントである。他の実施形態では、参照配列は、野生型タンパク質またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。
用語「対象」及びその文法的同等物は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは非ヒトを指し得る。対象は、哺乳動物であり得る。ヒト対象は、男性または女性であり得る。ヒト対象は、任意の年齢のものであり得る。対象は、ヒト胚であり得る。ヒト対象は、新生児、幼児、小児、青年期、または成人であり得る。ヒト対象は、最大で約１００歳であり得る。ヒト対象は、遺伝子疾患または障害のための処置を必要とし得る。
用語「処置」または「処置すること」及びそれらの文法的同等物は、疾患、病態、または障害の症状を治癒、改善、または改善することを目的とした対象の医学的管理を指し得る。処置には、能動的処置、すなわち、疾患、病態、または障害の改善に対して具体的に仕向けられた処置が含まれ得る。処置には、原因処置、すなわち、関連する疾患、病態、または障害の原因の除去に対して仕向けられた処置が含まれ得る。また、この処置には、姑息的処置、すなわち、疾患、病態、または障害の治癒ではなく、症状の軽減のために設計された処置が含まれ得る。処置には、補助的処置、すなわち、疾患、病態、または障害の改善に対して仕向けられた別の特定の療法を補うために用いられる処置が含まれ得る。いくつかの実施形態では、病態は、病理学的であり得る。いくつかの実施形態では、処置は、疾患、病態、または障害を完全に治癒または予防することができない。いくつかの実施形態では、処置は、疾患、病態、または障害を改善するが、完全に治癒または予防しない。いくつかの実施形態では、対象は、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週、３週、４週、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、無限に、または対象の人生の間、処置され得る。
用語「改善する」及びその文法的同等物は、疾患の発症または進行を低減、抑制、減弱、軽減、停止、好転、または安定化することを意味する。
用語「予防する」または「予防すること」は、所定の期間、疾患、病態、または障害の開始または発症を遅延、防止、または回避することを意味する。予防するはまた、疾患、障害、または病態を発症するリスクを低減することを意味する。予防には、疾患、病態、または障害の発症を最小化すること、または部分的もしくは完全に阻害することが含まれる。いくつかの実施形態では、組成物、例えば、薬学的組成物は、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週、３週、４週、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、無限に、または対象の人生の間、障害の開始を遅延させることによって障害を予防する。
用語「有効量」または「治療的有効量」は、本明細書に開示される対象への導入後に所望の活性をもたらすために十分であり得る組成物、例えば、コンストラクトを含むプライム編集組成物の量を指す。プライム編集組成物の有効量は、細胞がｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであるかどうかにかかわらず、遺伝子または細胞を標的とするために提供され得る。有効量は、陰性対照と比べて観察される標的核酸調節の量が、例えば、少なくとも約２倍以上の変化（増加または低下）を誘導するための量であり得る。有効量または用量は、例えば、標的遺伝子調節（例えば、機能的タンパク質を生成するための標的遺伝子の発現）の約２倍の増加、約３倍の増加、約４倍の増加、約５倍の増加、約６倍の増加、約７倍の増加、約８倍の増加、約９倍の増加、約１０倍の増加、約２５倍の増加、約５０倍の増加、約１００倍の増加、約２００倍の増加、約５００倍の増加、約７００倍の増加、約１０００倍の増加、約５０００倍の増加、または約１０，０００倍の増加を誘導し得る。標的遺伝子調節の量は、当該技術分野で知られている任意の好適な方法によって測定され得る。いくつかの実施形態では、「有効量」または「治療的有効量」は、未処置患者と比べて疾患の症状を改善するために必要とされる組成物の量である。いくつかの実施形態では、有効量は、細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの細胞）における対象となる遺伝子における改変を導入するために十分な組成物の量である。
有効量は、細胞の集団に投与された場合、細胞の集団の所定の割合が変異の修正を有するように誘導するための量であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、有効量は、細胞の集団に投与または導入された場合、細胞の集団の少なくとも約１％、２％、５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％において、標的遺伝子における変異を修正する１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の導入を誘導するための量であり得る。
用語「逆転写酵素」または「ＲＴ」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡ分子を合成する酵素のクラスを指す。ＲＴは、露出した３’ヒドロキシル基を有するプライマー分子を必要とし得る。いくつかの実施形態では、ＲＴのプライマー分子は、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ＲＴのプライマー分子は、ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ＲＴは、ＤＮＡポリメラーゼ活性及びＲＮａｓｅ Ｈ活性の両方を含む。２つの活性は、ＲＴにおける２つの別個のドメインに所在し得る。
用語「リンカー」は、本明細書で使用される場合、２つの分子または部位を連結する結合、化学基、または分子、例えば、融合タンパク質を形成するための２つのタンパク質ドメインを指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドリンカーである。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質動員配列、例えば、ＭＳ２ポリヌクレオチド配列は、プライムエディターのＣａｓ９ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを接続するために使用され得、Ｃａｓ９ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインの一方は、ＭＳ２コートタンパク質に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、リンカーまたはリンカーによって連結される配列または分子の用途に応じて、様々な長さを有し得る。
用語「融合タンパク質」は、複数の天然に存在するまたは組換え的に生成されたタンパク質からのドメインを含むタンパク質であって、通常、各ドメインが異なる機能を果たすものを指す。ドメインは、アミノ酸の特定の構成を含み得る。ドメインはまた、本明細書に記載されるタンパク質の構造を含み得る。
本明細書には、いくつかの実施形態では、上述したＰＥｇＲＮＡ、上述したニックガイド配列、プライマー編集体、プライム編集組成物またはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸を含むポリヌクレオチド及びコンストラクトを含む組成物が開示される。所定の実施形態では、本明細書では、標的ポリヌクレオチド、例えば、標的遺伝子のプログラム可能なプライム編集のためのプライムエディターが提供される。
プライム編集
用語「プライム編集」は、標的プライミング化ＤＮＡ合成を介して意図されるヌクレオチド編集（本明細書でヌクレオチド変化とも称される）を標的ＤＮＡに組み込むためにＰＥｇＲＮＡと複合体化されたプライムエディターを使用した標的ＤＮＡのプログラム可能な編集を指す。プライム編集の標的ＤＮＡポリヌクレオチド、例えば、標的遺伝子は、２つの相補鎖を有する二本鎖ＤＮＡ分子を含み得る：第１の鎖は、「標的鎖」または「非編集鎖」と称され得、第２の鎖は、「非標的鎖」、または「編集鎖」と称され得る。いくつかの実施形態では、プライム編集ガイドＲＮＡ（ＰＥｇＲＮＡ）において、スペーサー配列は、「サーチ標的配列」と称され得る、標的鎖上の特定の配列に相補的または実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、サーチ標的配列で標的鎖とアニーリングする。標的鎖はまた、「非プロトスペーサー隣接モチーフ（非ＰＡＭ鎖）」と称され得る。いくつかの実施形態では、非標的鎖はまた、「ＰＡＭ鎖」と称され得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ鎖は、プロトスペーサー配列及び任意にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。Ｃａｓ－タンパク質ベースのプライムエディターを使用するプライム編集において、ＰＡＭ配列は、標的遺伝子のＰＡＭ鎖上のプロトスペーサー配列にすぐ隣接する短いＤＮＡ配列を指す。ＰＡＭ配列は、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質、例えば、ＣａｓニッカーゼまたはＣａｓヌクレアーゼによって特異的に認識され得る。いくつかの実施形態では、特定のＰＡＭは、特定のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質、例えば、ＣａｓニッカーゼまたはＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼに特徴的である。プロトスペーサー配列は、サーチ標的配列に相補的な二本鎖標的ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子）のＰＡＭ鎖における特定の配列を指す。ＰＥｇＲＮＡにおいて、スペーサー配列は、スペーサー配列がウラシル（Ｕ）を含み得、プロトスペーサー配列がチミン（Ｔ）含み得ることを除き、二本鎖標的ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子）の編集鎖上のプロトスペーサー配列と実質的に同一の配列を有し得る。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡは、ＰＡＭ鎖（または非標的鎖）上でニック部位を含む。本明細書で使用される場合、「ニック部位」は、二本鎖標的ＤＮＡの２つのヌクレオチドまたは２つの塩基対における特定の位置を指す。いくつかの実施形態では、ニック部位の位置は、特定のＰＡＭ配列の位置に対して決定される。いくつかの実施形態では、ニック部位は、二本鎖標的ＤＮＡが、ニッカーゼ、例えば、特定のＰＡＭ配列を認識するＣａｓニッカーゼと接触させられた場合、ニックが生じることになる特定の位置である。いくつかの実施形態では、ニック部位は、二本鎖標的ＤＮＡのＰＡＭ鎖上の特定のＰＡＭ配列の上流にある。いくつかの実施形態では、ニック部位は、二本鎖標的ＤＮＡのＰＡＭ鎖上の特定のＰＡＭ配列の下流にある。いくつかの実施形態では、ニック部位は、Ｃａｓ９ニッカーゼによって認識されるＰＡＭ配列の上流にあり、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ヌクレアーゼ活性ＲｕｖＣドメイン及びヌクレアーゼ不活性ＮＨＮドメインを含む。いくつかの実施形態では、ニック部位は、ＰＡＭ配列の３ヌクレオチド上流にあり、ＰＡＭ配列は、ヌクレアーゼ活性ＲｕｖＣドメイン及びヌクレアーゼ不活性ＮＨＮドメインを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｐ．ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｎ．ｃｉｎｅｒｅａ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、またはＮ．ｌａｒｉ Ｃａｓ９ニッカーゼによって認識される。いくつかの実施形態では、ニック部位は、ＰＡＭ配列の２ヌクレオチド上流にあり、ＰＡＭ配列は、ヌクレアーゼ活性ＲｕｖＣドメイン及びヌクレアーゼ不活性ＮＨＮドメインを含むＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９ニッカーゼによって認識される。
「プライマー結合部位」（ＰＢＳまたはプライマー結合部位配列とも称される）は、ＰＡＭ鎖（すなわち、非標的鎖または編集鎖）に相補的な領域を含むＰＥｇＲＮＡの一本鎖部分である。ＰＢＳは、ニック部位のすぐ上流にある二本鎖標的ＤＮＡのＰＡＭ鎖上の配列に相補的または実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、プライム編集のプロセスにおいて、ＰＥｇＲＮＡ複合体は、プライムエディターと複合体化し、それを二本鎖標的ＤＮＡの標的鎖上のサーチ標的配列に結合するように誘導し、二本鎖標的ＤＮＡの非標的鎖上のニック部位でニックを生成する。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、ニック部位における二本鎖標的ＤＮＡの非標的鎖上の遊離３’末端に相補的または実質的に相補的であり、それにアニーリングし得る。いくつかの実施形態では、非標的鎖上の遊離３’にアニーリングされたＰＢＳは、標的プライミング化ＤＮＡ合成を開始させ得る。
ＰＥｇＲＮＡの「編集鋳型」は、ＰＢＳの５’にあり、かつＰＡＭ鎖（すなわち、非標的鎖または編集鎖）に対して相補性の領域を含むＰＥｇＲＮＡの一本鎖部分であり、二本鎖標的ＤＮＡの内因性配列と比較して１つ以上の意図されるヌクレオチド編集を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型及びＰＢＳは、互いにすぐ隣接する。したがって、いくつかの実施形態では、プライム編集におけるＰＥｇＲＮＡは、互いにすぐ隣接するＰＢＳ及び編集鋳型を含む一本鎖部分を含む。いくつかの実施形態では、ＰＢＳ及び編集鋳型の両方を含むＰＥｇＲＮＡの一本鎖部分は、意図されるヌクレオチド編集位置における１つ以上の非相補的ヌクレオチドを除き、二本鎖標的ＤＮＡのＰＡＭ鎖（すなわち、非標的鎖または編集鎖）上の内因性配列に相補的または実質的に相補的である。本明細書で使用される場合、他の文脈における相対的５’－３’配置にかかわらず、ＰＢＳと編集鋳型との間の相対的位置、及びＰＥｇＲＮＡの要素間の相対的位置は、ＰＥｇＲＮＡの要素と相補性または同一性を有し得る二本鎖標的ＤＮＡにおける配列の位置にかかわらず、単分子としてのＰＥｇＲＮＡ５’から３’への順序によって決定される。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、意図されるヌクレオチド編集位置における１つ以上の非相補的ヌクレオチドを除き、ニック部位のすぐ下流にあるＰＡＭ鎖上の配列と相補的または実質的に相補的である。意図されるヌクレオチド編集に対応する位置における１つ以上の非相補的ヌクレオチドを除き、編集鋳型に相補的または実質的に相補的である内因性、例えば、ゲノム配列は、「編集標的配列」と称され得る。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、意図されるヌクレオチド編集位置における１つ以上の挿入、欠失、または置換を除き、編集標的配列と相補的である、または編集標的配列とゲノムにおいて同じ位置を有する標的鎖上の配列と同一性または実質的同一性を有する。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、一本鎖ＤＮＡをコードし、一本鎖ＤＮＡは、１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の位置における１つ以上の挿入、欠失、または置換を除き、編集標的配列と同一性または実質的同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターと複合体化し、それを標的遺伝子のサーチ標的配列と結合させるように誘導する。いくつかの実施形態では、結合したプライムエディターは、標的遺伝子の編集鎖（ＰＡＭ鎖）上でニックを生成する。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡのプライマー結合部位（ＰＢＳ）は、ニック部位で形成された遊離３’末端とアニーリングし、プライムエディターは、遊離３’末端をプライマーとして使用して、ニック部位からＤＮＡ合成を開始させる。その後、ＰＥｇＲＮＡの編集鋳型によってコードされる一本鎖ＤＮＡが合成される。いくつかの実施形態では、新しく合成された一本鎖ＤＮＡは、内因性標的遺伝子配列と比較して１つ以上の意図されるヌクレオチド編集を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡの編集鋳型は、編集鋳型における意図されるヌクレオチド編集位置における１つ以上のミスマッチを除き、編集鎖における配列と相補的である。いくつかの実施形態では、新しく合成された一本鎖ＤＮＡは、意図されるヌクレオチド編集位置における１つ以上の挿入、欠失、または置換を除き、編集標的配列における配列と同一性または実質的同一性を有する。編集鋳型と部分的に相補的である内因性、例えば、ゲノム配列は、「編集標的配列」と称され得る。
いくつかの実施形態では、新しく合成された一本鎖ＤＮＡは、標的遺伝子の標的鎖と対合するために二本鎖標的ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子）の編集鎖上の編集標的と平衡化する。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子）の編集標的配列は、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）、例えば、ＦＥＮ１によって切除される。いくつかの実施形態では、ＦＥＮは、例えば、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を含む細胞における、内因性ＦＥＮである。いくつかの実施形態では、ＦＥＮは、プライムエディターの他の成分と連結されたまたはトランスで提供される、プライムエディターの一部として提供される。いくつかの実施形態では、意図されるヌクレオチド編集を含む新しく合成された一本鎖ＤＮＡは、二本鎖標的ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子）の編集鎖上の内因性一本鎖編集標的配列に置き換わる。いくつかの実施形態では、新しく合成された一本鎖ＤＮＡ及び標的鎖上の内因性ＤＮＡは、二本鎖標的ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子）の編集標的配列に対応する領域でヘテロ二本鎖ＤＮＡ構造を形成する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集を含む新しく合成された一本鎖ＤＮＡは、ヌクレオチド編集を含まない標的ＤＮＡの標的鎖とヘテロ二本鎖で対合され、それにより２つの他の相補鎖間でミスマッチを生成する。いくつかの実施形態では、ミスマッチは、ＤＮＡ修復機構、例えば、内因性ＤＮＡ修復機構によって認識される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復を介して、意図されるヌクレオチド編集は、二本鎖標的ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子）に組み込まれる。
プライムエディター
用語「プライムエディター（ＰＥ）」は、プライム編集に関与するポリペプチドまたはポリペプチド成分を指す。様々な実施形態では、プライムエディターには、ＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドドメイン（例えば、ＤＮＡポリメラーゼドメイン）が含まれる。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドドメイン（例えば、ＤＮＡポリメラーゼドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡポリメラーゼドメインを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、リンカー、例えば、ペプチドリンカー、例えば、ＧＳリッチペプチドリンカーによって連結されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、リンカー、例えば、ペプチドリンカー、例えば、ＧＳリッチペプチドリンカーによって連結されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含む融合ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドドメインは、ヌクレアーゼドメインまたはヌクレアーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼドメインまたはヌクレアーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドドメインは、ニッカーゼ、または十分に活性なヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ニッカーゼ、または十分に活性なヌクレアーゼを含む。本明細書で使用される場合、用語「ニッカーゼ」は、二本鎖ＤＮＡ標的の一方の鎖のみを切断することが可能なヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、不活性ヌクレアーゼであるポリペプチドドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、不活性ヌクレアーゼ；例えば、ｄＣａｓ９であるヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、核酸でガイドされるＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、または別のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、核酸でガイドされるＤＮＡ結合ドメイン）は、Ｃａｓタンパク質ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９；例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ；例えば、ｄＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、ニッカーゼまたはニッカーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９またはそのバリアント（例えば、ニッカーゼバリアント）である。いくつかの実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドドメインは、核酸でガイドされるＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、または別のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドドメインは、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインは、逆転写酵素ドメイン（ＲＴドメイン）または逆転写酵素（ＲＴ）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインは、ＲＴドメインまたはＲＴである。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、逆転写酵素（ＲＴ）活性を含む。例えば、プライムエディターの第１のポリペプチドは、標的プライミング化逆転写のための活性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドドメインは、逆転写酵素活性（例えば、標的プライミング化逆転写のための活性）を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、プライム編集に関与する追加のポリペプチド、例えば、プライム編集プロセスを編集された生成物形成に向けて誘導することを補助するための５’エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドドメイン、例えば、５’内因性ＤＮＡフラップエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮ１）を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＲＮＡ－タンパク質動員ポリペプチド、例えば、ＭＳ２コートタンパク質をさらに含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、異なる種に由来するＣａｓポリペプチド（すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン）及び逆転写酵素ポリペプチド（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼドメイン）を含む。例えば、プライムエディターは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチド及びモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）逆転写酵素ポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、異なる種に由来するＣａｓポリペプチド（すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン）及び逆転写酵素ポリペプチド（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼドメイン）を含む融合ポリペプチドを含む。例えば、プライムエディターは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチド及びモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）逆転写酵素（ＲＴ）ポリペプチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのポリペプチドドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメイン）は、融合タンパク質を形成するためにペプチドリンカーによって融合または連結されている。他の実施形態では、プライムエディターは、非ペプチド結合を介してまたはアプタマーまたは動員配列を介して互いに会合することが可能である、別々のタンパク質としてトランスで提供される１つ以上のポリペプチドドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ペプチドリンカー（例えば、配列番号２８６～４１１に示される開示されたリンカー）によって互いに融合または連結されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメイン（例えば、逆転写酵素ドメインまたはＲＴ）を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡに連結され得るＲＮＡ－タンパク質動員アプタマー、例えば、ＭＳ２アプタマーによって互いに融合または連結されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメイン（例えば、逆転写酵素ドメインまたはＲＴ）を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターの１つ以上のポリペプチドは、（例えば、ペプチドリンカーを介して）１つ以上のＮＬＳに融合または連結されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、トランスで提供されるＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、ＤＮＡ結合ドメイン及び／またはＤＮＡポリメラーゼドメインは、１つ以上のＮＬＳに融合または連結されている。
プライムエディターポリペプチド成分は、１つ以上のポリヌクレオチドによって全体的または部分的にコードされ得る。本開示は、プライムエディター成分をコードするポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを企図する。本開示はまた、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含む単一のポリヌクレオチドを企図する。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドは、ペプチドリンカーによって連結されたＤＮＡポリメラーゼドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質（例えば、プライムエディター）をもたらすためにリンカーポリヌクレオチド（例えば、ペプチドリンカーをコードする）によって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、リンカーポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドは、リンカーポリヌクレオチド（例えば、ペプチドリンカーをコードする）によって連結され、１つ以上のＮＬＳをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列をさらに含むことで、ペプチドリンカーによって連結され、かつ１つ以上のＮＬＳにさらに融合または連結されたＤＮＡポリメラーゼドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質（例えば、プライムエディター）をもたらす。
いくつかの実施形態では、単一のポリヌクレオチド（例えば、単一のｍＲＮＡ）コンストラクト、またはベクターが、プライムエディター融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチド、コンストラクト、またはベクターがそれぞれ、プライムエディターのドメインのポリペプチドドメインもしくは一部分、またはプライムエディター融合タンパク質の一部分をコードする。例えば、プライムエディター融合タンパク質は、インテイン－Ｎに融合されたＮ末端部分及びインテイン－Ｃに融合されたＣ末端部分を含み得、これらの各々は、ＡＡＶベクターによって個々にコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライムエディターの成分（例えば、ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド及び／またはＤＮＡポリメラーゼドメインを含むポリペプチド）は、スプリットインテインを介して翻訳後に一緒にもたらされ得る。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、アミノ酸配列を含み得、最初のメチオニン（位置１）は、任意に存在しない。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチド配列は、Ｎ末端メチオニン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチド配列は、Ｎ末端メチオニンを欠き得る。いくつかの実施形態では、翻訳開始コドン、例えば、ＡＴＧによってコードされるＮ末端メチオニンは、翻訳後にプライムエディターポリペプチドから除去され得る。いくつかの実施形態では、翻訳開始コドン、例えば、ＡＴＧによってコードされるＮ末端メチオニンは、プライムエディターポリペプチド配列に存在したままであり得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドのアミノ酸配列は、１つ以上の処理酵素によって、例えば、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）によってＮ末端修飾され得る。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡポリメラーゼドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含み、ＤＮＡポリメラーゼドメイン及び／またはＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、Ｎ末端メチオニンを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、参照ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列と比べてＮ末端メチオニンを欠くアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、参照ＤＮＡ結合ドメインアミノ酸配列と比べてＮ末端メチオニンを欠くアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター及び／またはその成分（例えば、ＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメイン及び／またはＤＮＡポリメラーゼドメインを含むポリペプチドまたはＤＮＡポリメラーゼドメインを含むポリペプチド）は、操作され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターのポリペプチド成分は、同じ生物または細胞環境において自然に発生しない。いくつかの実施形態では、プライムエディターのポリペプチド成分は、異なる起源のものまたは異なる生物からのものであり得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、異なる種に由来するＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、合理的に操作されたＲＴまたはＲＴドメイン（例えば、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）を含む。そのような操作されたＲＴまたはＲＴドメインは、例えば、天然に存在するＲＴまたはＲＴドメインとは異なる配列またはアミノ酸変化を含み得る。いくつかの実施形態では、操作されたＲＴまたはＲＴドメインは、対応する天然に存在するＲＴまたはＲＴドメインと比べて改善されたＲＴ活性を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＲＴまたはＲＴドメインは、プライムエディターにおいて使用される場合、対応する天然に存在するＲＴまたはＲＴドメインと比べて改善されたプライム編集効率を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、表１４に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２、６、７、または５９６～６１３に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含む。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ａ）ＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、及びｂ）モロニーマウス白血病逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）ドメインまたはＭ－ＭＬＶ ＲＴドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１、５、または６２３に示されるアミノ酸Ｌ４７８の後の位置でＣ末端で切断されている。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ａ）ＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、及びｂ）モロニーマウス白血病逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）ドメインまたはＭ－ＭＬＶ ＲＴドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１、５、または６２３に示されるＬ４７８とＧ５０４との間の位置で切断された位置でＣ末端で切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、ＭＭＬＶ－ＲＴまたはその変異体、断片もしくはバリアントを含むＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、野生型ＭＭＬＶ－ＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失を含むＭＭＬＶ－ＲＴバリアント、例えば、配列番号１に示される参照ＭＭＬＶ－ＲＴ配列と比較して１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失を含むＭＭＬＶ－ＲＴバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶＲＴバリアントは、参照ＭＭＬＶＲＴ配列配列番号１と比較して１つ以上のＤ２００Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ６０３Ｗアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶＲＴバリアントは、参照ＭＭＬＶＲＴ配列配列番号１と比較してＤ２００Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、及びＬ６０３Ｗアミノ酸置換を含む（そのバリアントは、ＭＭＬＶＲＴ５Ｍバリアントとも称される）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、参照ＭＭＬＶＲＴ配列配列番号１と比較してＤ５２４Ｎ、Ｌ４３５Ｋ、Ｙ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、参照ＭＭＬＶＲＴ配列配列番号１と比較して１つ以上のアミノ酸欠失を有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸５０４及び５０５に対応する位置の間でＣ末端で切断されている。Ｃ末端で切断されるとは、切断位置に対してＣ末端のアミノ酸が、参照配列と比較してＭＭＬＶ ＲＴ配列から欠失させられることを意味し、すなわち、配列番号１に示されるアミノ酸５０４及び５０５に対応する位置の間でＣ末端で切断されたＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示される位置１～５０４におけるアミノ酸のみを含有する（そのような切断は、本明細書で５０４Ｘ、またはＧ５０４Ｘ切断と称され得る）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸４７８及び４７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（Ｌ４７８Ｘ末端）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示される位置４７８と５０５との間の任意のアミノ酸位置でＣ末端で切断されている。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸３６５及び３６６に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（Ｐ３６５Ｘ）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸２７８及び２７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（Ｒ２７８Ｘ末端）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸３２８及び３２９に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（Ｔ３２８Ｘ末端）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸３７８及び３７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（Ｋ４７８Ｘ末端）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸４２８及び４２９に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（Ｍ４２８Ｘ末端）。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、表６７に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号１、４、５、３６、４５、５４、６３、または６２３に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼドメイン（例えば、ＭＭＬＶ－ＲＴ）を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号５を含むＭＭＬＶ－ＲＴドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣ末端切断ＭＭＬＶ－ＲＴドメインを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを接続する１つ以上のペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＤＮＡ結合ドメイン、ペプチドリンカー、及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｃ末端からＮ末端へ、ＤＮＡ結合ドメイン、ペプチドリンカー、及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表３に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２８６～４１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表３に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２８６～４１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２８６～４１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表３に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２８９～３１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表３に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２８９～３１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２８９～３１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号３０２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号３０２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号３０２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、１つ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡポリメラーゼドメインは、１つ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインは、２つ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡポリメラーゼドメインは、２つ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡポリメラーゼドメインとの間に１つ以上または２つ以上のＮＬＳを含む融合タンパク質を含む。ＮＬＳ配列は、当該技術分野で知られている任意のＮＬＳであり得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表２に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号８～２４、または６２１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｎ末端からＣ末端へＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列番号８、９、または１０の配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列番号１１～２４からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列番号１１、１２、１３、または１４の配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、（ａ）ＤＮＡ結合ドメイン及び（ｂ）ＭＭＬＶ－ＲＴまたはその変異体、断片もしくはバリアントを含むＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインは、融合タンパク質を形成するためにペプチドリンカーによって接続されている。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインをＮ末端からＣ末端へ含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインをＣ末端からＮ末端へ含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、表１４に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２、６、７、または５９６～６１３に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、
少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインは、ＭＭＬＶＲＴ５Ｍバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、参照ＭＭＬＶＲＴ配列配列番号１と比較してＤ５２４Ｎ、Ｌ４３５Ｋ、Ｙ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒアミノ酸置換のうちの１つ以上を有するＭＭＬＶ ＲＴバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、参照ＭＭＬＶＲＴ配列配列番号１と比較してＤ２００Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、及びＬ６０３Ｗアミノ酸置換のうちの１つ以上を有するＭＭＬＶ ＲＴバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＭＭＬＶ ＲＴ Ｇ５０４Ｘ切断バリアント、ＭＭＬＶ ＲＴ Ｌ４７８切断バリアント、ＭＭＬＶ ＲＴ Ｋ４７８Ｘ切断バリアント、ＭＭＬＶ ＲＴ Ｍ４２８Ｘ切断バリアント、ＭＭＬＶ ＲＴ Ｔ３２８Ｘ切断バリアント、ＭＭＬＶ ＲＴ Ｒ２７８Ｘ切断バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインは、表６７に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号１、４、５、３６、４５、５４、６３、または６２３に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを接続するペプチドリンカーは、表３に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２８６～４１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、表３に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２８６～４１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表３に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２８９～３１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表３に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２８９～３１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、
プライムエディターは、配列番号２８９～３１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号３０２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号３０２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号３０２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表２に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号８～２４、または６２１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む１つ以上のＮＬＳをさらに含み、ＮＬＳは、（例えば、表３に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２８６～４１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むリンカーを介して）ＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡポリメラーゼドメインのＣ末端またはＮ末端に融合または連結されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、表１４に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２、６、７、または５９６～６１３に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含み、表６７に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号１、４、５、３６、４５、５４、６３、または６２３に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼドメインをさらに含み、任意にＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインは、表３に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２８６～４１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって融合または連結されており、任意に表２に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号８～２３、または６２１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む１つ以上のＮＬＳをさらに含み、ＮＬＳは、（例えば、表３に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２８６～４１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むリンカーを介して）ＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡポリメラーゼドメインのＣ末端またはＮ末端に融合または連結されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、２、６、７、または５９６～６１３から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合ドメイン、配列番号１、４、５、３６、４５、５４、６３、または６２３から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼドメイン、及び任意に配列番号２８６～４１１から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するリンカーを含み得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、本明細書に記載される配列番号８～２３、または６２１から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、本明細書に記載のＤＮＡポリメラーゼドメインのＮ末端に融合されている。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＣ末端に融合されている。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端またはＣ末端に融合されている。いくつかの実施形態では、リンカー配列、例えば、配列番号２８６～４１１から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むリンカーが、ＮＬＳとプライムエディターのドメインとの間に配置される。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含み、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼドメインをさらに含み、任意にＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインは、配列番号２８９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって融合または連結されており、任意に表２に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号９、１０、または１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む１つ以上のＮＬＳをさらに含み、ＮＬＳは、（例えば、配列番号２８８に示される記述されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むリンカーを介して）ＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡポリメラーゼドメインのＣ末端またはＮ末端に融合または連結されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含み、配列番号３６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼドメインをさらに含み、任意にＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインは、配列番号２８９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって融合または連結されており、任意に表２に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号９、１０、または１１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む１つ以上のＮＬＳをさらに含み、ＮＬＳは、（例えば、配列番号２８８に示される記述されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むリンカーを介して）ＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡポリメラーゼドメインのＣ末端またはＮ末端に融合または連結されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合ドメイン、配列番号５または３６から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼドメイン及び任意に配列番号３０２または３０９から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するリンカーを含み得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、本明細書に記載される配列番号９、１０または１１から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合ドメイン、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼドメイン、任意に配列番号２８８、２８９、または３０２から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するリンカーを含み得、任意に、本明細書に記載される配列番号９、１０または１１から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合ドメイン、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼドメイン、任意に配列番号２８８、２８９、または３０２から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するリンカーを含み得、任意に、本明細書に記載される配列番号９、１０または１１から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表１４～６５のいずれかに記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号２５、３４、３５、４３、４４、５２、５３、６１、６２、６３、７０－７８、８５、８６、９３、９６、９９、１０４、１０５、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１７０、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、６２０、６２２、６２４、６２５、６４７に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表１５～６５のいずれかに記述されるアミノ酸配列のいずれか１つまたは配列番号２５、３４、３５、４３、４４、５２、５３、６１、６２、６３、７０－７８、８５、８６、９３、９６、９９、１０４、１０５、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１７０、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、６２０、６２２、６２４、６２５、６４７に示されるアミノ酸配列のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２５、３４、３５、４３、４４、５２、５３、６１、６２、６３、７０－７８、８５、８６、９３、９６、９９、１０４、１０５、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１７０、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、６２０、６２２、６２４、６２５、または６４７に示されるアミノ酸配列のいずれかと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個以下の相違、例えば、変異、例えば、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、及び／またはアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表１５～６５のいずれか１つに列挙されるアミノ酸配列のいずれかと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個以下の相違、例えば、変異、例えば、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、及び／またはアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２５、３４、３５、４３、４４、５２、５３、６１、６２、６３、７０－７８、８５、８６、９３、９６、９９、１０４、１０５、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１７０、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、６２０、６２２、６２４、６２５、または６４７（表１５～６５）に示される配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２５、３４、３５、７７、７８、８５、８６、６２０、６２２、６２４、６２５、または６４７に示される配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２５、６２４、または６２５に示される配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号３４、３５、６４７に示される配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７７、７８、または６２０に示される配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８５、８６、または６２２に示される配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表１５～６５のいずれかに列挙される配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表１５～１７のいずれかに列挙される配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表１５に列挙される配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表１６に列挙される配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、表１７に列挙される配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２５、３４、３５、４３、４４、５２、５３、６１、６２、６３、７０－７８、８５、８６、９３、９６、９９、１０４、１０５、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１７０、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、６２０、６２２、６２４、または６２５（表１５～６５）に示される配列のいずれか１つから選択される対応するプライムエディター配列と比較してＮ末端メチオニンを欠くアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、構造：Ｎ－Ｃａｓ９ニッカーゼ－ペプチドリンカー－ＲＴ－Ｃを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、構造：Ｎ－Ｃａｓ９ニッカーゼ－ペプチドリンカー－ＭＭＬＶ ＲＴバリアント－Ｃを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＨＮＨドメインにおける変異を含み、活性ＲｕｖＣドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＨＨＮドメインにおけるＨ８４０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、ＭＭＬＶＲＴ５Ｍである。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、ＭＭＬＶＲＴ５Ｍと比較して位置５０４及び５０５に対応する位置の間で切断されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８６～４１１からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８９～３１１からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８９～３１１からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３０２と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３０９と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３０２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３０９の配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７８、１０５、１１７、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、及び２２７からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７８、１０５、１１７、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、及び２２７からなる群から選択される配列を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８６、１１１、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００、２０６、２１２、２１８、２２４、及び２３０からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８６、１１１、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００、２０６、２１２、２１８、２２４、及び２３０からなる群から選択される配列を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７８と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７８の配列を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８６と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８６の配列を含む融合タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、構造：Ｎ末端ＮＬＳ－Ｃａｓ９ニッカーゼ－ペプチドリンカー－ＲＴ－Ｃ末端ＮＬＳを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、構造：Ｃａｓ９ニッカーゼ－ペプチドリンカー－ＭＭＬＶ ＲＴバリアントを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＨＮＨドメインにおける変異を含み、活性ＲｕｖＣドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＨＨＮドメインにおけるＨ８４０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、ＭＭＬＶＲＴ５Ｍである。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、ＭＭＬＶＲＴ５Ｍと比較して位置５０４及び５０５に対応する位置の間で切断されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８６～４１１からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８９～３１１からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８９～３１１からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３０２と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３０９と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３０２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３０９の配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ＮＬＳまたはＣ末端は、配列番号１１～２４及び６２１から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ＮＬＳは、配列番号８～１０及び６２１から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ＮＬＳは、配列番号８～１０及び６２１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＮＬＳは、配列番号８の配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＮＬＳは、配列番号９の配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＮＬＳは、配列番号１１～２４から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＮＬＳは、配列番号１１～２４から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＮＬＳは、配列番号１１の配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＮＬＳは、配列番号２４の配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７７、９３、１０４、６２０、及び１１６からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７７、９３、１０４、６２０、及び１１６からなる群から選択される配列を含む融合タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８５、９６、６２２、及び１１０からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８５、９６、６２２、及び１１０からなる群から選択される配列を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７７と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７７または６２０の配列を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８５または６２２と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８５または６２２の配列を含む融合タンパク質を含む。
プライムエディターヌクレオチドポリメラーゼドメイン
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を含むポリペプチドドメイン（例えば、ＤＮＡポリメラーゼドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡポリメラーゼドメインを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ポリメラーゼドメイン、例えば、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ヌクレオチドポリメラーゼドメイン、例えば、ＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインは、野生型ＤＮＡポリメラーゼドメイン、全長ＤＮＡポリメラーゼタンパク質ドメインであり得、または機能的変異体、機能的バリアント、またはそれらの機能的断片であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインは、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼドメインである。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、新たな鎖ＤＮＡ合成のための鋳型ポリヌクレオチド鎖、例えば、編集鋳型配列に依存し得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有するプライムエディターは、鋳型としてＤＮＡ配列を含むＰＥｇＲＮＡ編集鋳型を使用して新たな一本鎖ＤＮＡを合成し得る。そのような場合では、ＰＥｇＲＮＡは、キメラまたはハイブリッドＰＥｇＲＮＡであり、ＤＮＡ鎖を含む伸長アームを含む。いくつかの実施形態では、キメラまたはハイブリッドＰＥｇＲＮＡは、ＲＮＡ部分（スペーサー及びｇＲＮＡコアを含む）及びＤＮＡ部分（ＤＮＡの鎖を含む編集鋳型を含む伸長アーム）を含み得る。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインは、例えば、真核、原核生物、古細菌、またはウイルス生物からの野生型ポリメラーゼであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインは、修飾されたＤＮＡポリメラーゼ、例えば、遺伝子操作、変異誘発、または指向性進化ベースのプロセスによって修飾された野生型ＤＮＡポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージポリメラーゼ、例えば、Ｔ４、Ｔ７、またはｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、古細菌ポリメラーゼ、例えば、ｐｏｌ Ｉ型古細菌ポリメラーゼまたはｐｏｌ ＩＩ型古細菌ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、真正細菌ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、またはＰｏｌ ＩＩＩポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ ＩファミリーＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ ＩＩファミリーＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）Ｐｏｌ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ ＩＶファミリーＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＶ ＤＮＡポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、真核ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ－ベータＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ－ラムダＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ－シグマＤＮＡポリメラーゼ、またはＰｏｌ－ミューＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ－アルファＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＯＬＡ１ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＯＬＡ２ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ－デルタＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＯＬＤ１ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＯＬＤ２ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ヒトＰＯＬＤ１ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ヒトＰＯＬＤ２ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＯＬＤ３ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＯＬＤ４ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ－イプシロンＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＯＬＥ１ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＯＬＥ２ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＯＬＥ３ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ－イータ（ＰＯＬＨ）ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ－イオタ（ＰＯＬＩ）ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ－カッパ（ＰＯＬＫ）ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｒｅｖ１ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ヒトＲｅｖ１ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ウイルスＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＵＬ３０ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ５４ ＤＮＡポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、古細菌ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢ／ｐｏｌ Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼである。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓからのＰｆｕのホモログである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ｐｏｌ ＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼである。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＰ１／ＤＰ２ ２－サブユニットポリメラーゼのホモログである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を欠く。好適なＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ Ｉまたはｐｏｌ ＩＩ）は、所望のアッセイ温度と同様の最適な成長温度を有する古細菌に由来し得る。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性古細菌ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ｆｕｒｉｏｓｕｓ、種ＧＢ－Ｄ、ｗｏｅｓｉｉ、ａｂｙｓｉｉ、ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１、ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、種９度Ｎｏｒｔｈ－７、種ＪＤＦ－３、ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ、及びＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓから単離され、またはそれに由来する。
ポリメラーゼはまた、真正細菌種からのものであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ ＩファミリーＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ ＩＩファミリーＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）Ｐｏｌ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ ＩＩＩファミリーＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ ＩＶファミリーＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＶ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ Ｉ ＤＮＡポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠き、またはそれが低減しているＤＮＡポリメラーゼ機能的バリアントである。好適な熱安定性ｐｏｌ Ｉ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ種及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ ＵｌＴｍａ）を含む、多様な好熱性真正細菌から単離され得る。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼドメイン、例えば、逆転写酵素（ＲＴ）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼドメイン、例えば、逆転写酵素（ＲＴ）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインは、逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、例えば、逆転写酵素（ＲＴ）である。いくつかの実施形態では、逆転写酵素（ＲＴ）、またはＲＴドメインは、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、機能的変異体、機能的バリアント、またはそれらの機能的断片）である。ＲＴまたはＲＴドメインは、野生型ＲＴドメイン、全長ＲＴドメインであり得、または機能的変異体、機能的バリアント、またはそれらの機能的断片であり得る。プライムエディターのＲＴまたはＲＴドメインは、野生型ＲＴ、全長ＲＴ、機能的変異体、機能的バリアント、またはそれらの機能的断片を含み得、または特定のアミノ酸置換、切断、またはバリアントを含有するように操作または発達させられ得る。操作されたＲＴは、天然に存在するＲＴまたは対応する参照ＲＴとは異なる配列またはアミノ酸変化を含み得る。いくつかの実施形態では、操作されたＲＴは、天然に存在するＲＴまたはＲＴドメインよりも改善された逆転写活性を有し得る。いくつかの実施形態では、操作されたＲＴは、天然に存在するＲＴよりも改善された特徴、例えば、改善された耐熱性、逆転写効率、または標的忠実性を有し得る。いくつかの実施形態では、操作されたＲＴを含むプライムエディターは、参照天然に存在するＲＴを有するプライムエディターよりも改善されたプライム編集効率を有する。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素ドメインまたはＲＴは、長さが２００～８００アミノ酸、長さが３００～７００アミノ酸、または長さが少なくとも４００～６００アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、逆転写酵素ドメインまたはＲＴは、長さが少なくとも２００アミノ酸、長さが少なくとも３００アミノ酸、長さが少なくとも４００アミノ酸、長さが少なくとも５００アミノ酸、または長さが少なくとも６００アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、逆転写酵素ドメインまたはＲＴは、長さが２５０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、逆転写酵素ドメインまたはＲＴは、長さが３５０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、逆転写酵素ドメインまたはＲＴは、長さが４５０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、逆転写酵素ドメインまたはＲＴは、長さが５５０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、逆転写酵素ドメインまたはＲＴは、長さが６５０アミノ酸である。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、真核性ＲＴ、例えば、酵母、ショウジョウバエ、げっ歯類、または霊長類ＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、グループＩＩイントロンＲＴ、例えば、ａ．Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓグループＩＩイントロン（ＧｓＩ－ＩＩＣ）ＲＴまたはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅグループＩＩイントロン（Ｅｕ．ｒｅ．Ｉ２）ＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、レトロンＲＴを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ウイルスＲＴ、例えば、レトロウイルスＲＴを含む。ウイルスＲＴの非限定的な例には、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶまたはＭＬＶＲＴ）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）ＲＴ；ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）ＲＴ；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、Ｍ－ＭＦＶ ＲＴ、トリ肉腫－白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ－Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ－Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルス（ＵＲ２ＡＶ）ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、及び骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴが含まれ、これらのすべては、本明細書に記載の方法及び組成物において好適に使用され得る。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、機能的変異体、機能的バリアント、またはそれらの機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインまたはＲＴは、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、機能的変異体、機能的バリアント、またはそれらの機能的断片）である。いくつかの実施形態では、参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴである。野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴの例示的な配列が配列番号６２３に提供される。参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴの例示的な配列が配列番号１に提供される。例示的なＭＭＬＶ－ＲＴアミノ酸及びヌクレオチド配列が表６７に開示されている。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶＲＴバリアントは、参照ＭＭＬＶＲＴ配列配列番号１と比較してＤ２００Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、及びＬ６０３Ｗアミノ酸置換を含む。配列番号５の配列を有するバリアントは、本明細書で「ＭＭＬＶＲＴ５Ｍ」または「ＭＭＬＶＲＴ５Ｍ」と称される。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、対応する参照ＲＴ（例えば、参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）と比較して操作されたＲＮａｓｅドメインを含むＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、参照ＲＴと比較して１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、対応する参照ＲＴ（例えば、参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）と比較して切断されている。参照ポリペプチド配列と比較した場合、ポリペプチドが、末端部分、例えば、Ｎ末端部分またはＣ末端部分を欠いている場合、ポリペプチドは「切断されている」。ポリペプチドが、アミノ酸位置ｎの後に切断されているとは、ポリペプチドが、参照ポリペプチド配列と比較して、アミノ酸ｎまたはその対応するアミノ酸に対してＣ末端であるアミノ酸を欠くが、アミノ酸ｎを保持することを意味する。すなわち、「位置ｎにおけるアミノ酸の後に切断された」または「位置ｎとｎ＋１との間でＣ末端で切断された」は、位置ｎとｎ＋１との間でのポリペプチドの切断であって、アミノ酸ｎに対してＣ末端であるアミノ酸が、参照ポリペプチド配列と比較して欠失したものを指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸ｎの後で切断されたポリペプチドは、参照ポリペプチド配列と比較した場合、アミノ酸ｎ及びアミノ酸ｎに対してＮ末端のすべてのアミノ酸を含み、アミノ酸ｎに対してＣ末端のアミノ酸、またはその対応するアミノ酸を欠く。
いくつかの実施形態では、アミノ酸ｎの前で切断されたポリペプチド、または位置ｎ－１及びｎの間でＮ末端で切断されたポリペプチドは、参照ポリペプチド配列と比較した場合、アミノ酸ｎ及びアミノ酸ｎに対してＣ末端のすべてのアミノ酸を含み、アミノ酸ｎに対してＮ末端のアミノ酸、またはその対応するアミノ酸を欠く。いくつかの実施形態では、切断されたポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で切断されている。Ｃ末端切断ポリペプチドはまた、そのＮ末端で切断され得る。Ｎ末端切断ポリペプチドはまた、そのＣ末端で切断され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、対応する参照ＲＴのアミノ酸の９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％からなる。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、対応する参照ＲＴと比較して切断されたＲＴを含み、切断は、ＲＴのＮ末端におけるものである。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、対応する参照ＲＴと比較して切断されたＲＴを含み、切断は、ＲＴのＣ末端におけるものである。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、対応する参照ＲＴと比較して切断されたＲＴを含み、切断は、対応する参照ＲＴの中央部内におけるものである。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、対応する参照ＲＴと比較して切断されたＲＴを含み、ＲＴドメインは、Ｎ末端及びＣ末端の両方で切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、対応する参照ＲＴと比較して切断されたＲＴを含み、ＲＴは、対応するＲＴによって参照されるＲＴのＮ末端、Ｃ末端、及び／または中央部で切断されている。いくつかの実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０個またはそれを超えるアミノ酸は、対応する参照ＲＴと比較してプライムエディターにおけるＲＴのＮ末端で切断されている。いくつかの実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０個またはそれを超えるアミノ酸は、対応する参照ＲＴと比較してプライムエディターにおけるＲＴのＣ末端で切断されている。いくつかの実施形態では、参照ＲＴ配列は、配列番号１の配列を有する。いくつかの実施形態では、参照ＲＴ配列は、配列番号５の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）であるＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、またはＭＭＬＶＲＴ５Ｍと比較して１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたはＭＭＬＶＲＴ５Ｍと比較して切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたはＭＭＬＶＲＴ５Ｍのアミノ酸の９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％からなる。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、またはＭＭＬＶＲＴ５Ｍと比較してＮ末端で切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、またはＭＭＬＶＲＴ５Ｍと比較してＣ末端で切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、切断は、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、またはＭＭＬＶＲＴ５Ｍによって参照されるＲＴの中央部内におけるものである。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、またはＭＭＬＶＲＴ５Ｍと比較して切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、ＲＴは、Ｎ末端及びＣ末端の両方で切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、またはＭＭＬＶＲＴ５Ｍと比較して切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、ＲＴは、野生型Ｍ－ＭＬＶＲＴまたは参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、またはＭＭＬＶＲＴ５Ｍによって参照されるＲＴのＮ末端、Ｃ末端、及び／または中央部で切断されている。
いくつかの実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００個、またはそれを超えるアミノ酸が、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたはＭＭＬＶＲＴ５Ｍと比較してプライムエディターにおいてＭ－ＭＬＶ ＲＴのＮ末端で切断されている。いくつかの実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０個、またはそれを超えるアミノ酸が、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたはＭＭＬＶＲＴ５Ｍと比較してプライムエディターにおいてＭ－ＭＬＶ ＲＴのＣ末端で切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＲＮａｓｅドメインを含む逆転写酵素（ＲＴ）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、ＲＮａｓｅドメインを含むウイルスＲＴドメインである。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、ＲＮａｓｅ Ｈドメインを含むウイルスＲＴドメインである。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、５’及び／または３’リボヌクレアーゼ活性を有するＲＮａｓｅ Ｈドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド二本鎖と接触した場合、ＲＮＡ鎖に対する３’及び／または５’ヌクレアーゼ活性を有するＲＮａｓｅ Ｈドメインを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、対応する参照ＲＴと比較して操作されたＲＮａｓｅドメインを含むＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、対応する参照ＲＴと比較して操作されたＲＮａｓｅ Ｈドメインを含むＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、対応と比較してＲＮａｓｅ Ｈドメインにおいて１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｈドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失は、ＲＮａｓｅ ＨドメインのＲＮａｓｅ活性を低減または無効化する。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、低下または無効化したＲＮａｓｅ活性を有するＲＮａｓｅ Ｈドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、不活性化ＲＮａｓｅ Ｈドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、対応する参照ＲＴと比較してＲＮａｓｅ Ｈドメインの活性を低下または無効化するＲＮａｓｅ Ｈドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、対応する参照ＲＴと比較して切断されたＲＮａｓｅ Ｈドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｈドメインにおける切断は、ＲＮａｓｅ ＨドメインのＲＮａｓｅ活性を低下または無効化する。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、対応する野生型ＲＮａｓｅ Ｈドメイン（例えば、参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたはＭＭＬＶＲＴ５Ｍからの野生型ＲＮａｓｅ Ｈドメイン）のアミノ酸の９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％からなるＲＮａｓｅ Ｈドメインを含む。いくつかの実施形態では、参照ＲＴ配列は、配列番号１の配列を有する。いくつかの実施形態では、参照ＲＴ配列は、配列番号５の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、対応する参照ＲＴと比較して切断されたＲＮａｓｅ Ｈドメインを含み、切断は、ＲＮａｓｅ ＨドメインのＮ末端におけるものである。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、対応する参照ＲＴと比較して切断されたＲＮａｓｅ Ｈドメインを含み、切断は、ＲＮａｓｅ ＨドメインのＣ末端におけるものである。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、対応する参照ＲＴと比較して切断されたＲＮａｓｅ Ｈドメインを含み、切断は、対応する参照ＲＴのＲＮａｓｅ Ｈドメインによって参照されるＲＮａｓｅ Ｈドメインの中央部内におけるものである。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、対応する参照ＲＴと比較して切断されたＲＮａｓｅ Ｈドメインを含み、切断されたＲＮａｓｅ Ｈドメインは、ＲＮａｓｅ ＨドメインのＮ末端及びＣ末端の両方で切断されているものである。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、対応する参照ＲＴと比較して切断されたＲＮａｓｅ Ｈドメインを含み、切断されたＲＮａｓｅ Ｈドメインは、対応する参照ＲＴのＲＮａｓｅ Ｈドメインによって参照されるＲＮａｓｅ ＨドメインのＮ末端、Ｃ末端、及び／または中央部で切断されている。いくつかの実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０個またはそれを超えるアミノ酸は、対応する参照ＲＴのＲＮａｓｅ Ｈドメインと比較してプライムエディターにおけるＲＴのＲＮａｓｅ ＨドメインのＮ末端で切断されている。いくつかの実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０個またはそれを超えるアミノ酸は、対応する参照ＲＴのＲＮａｓｅ Ｈドメインと比較してプライムエディターにおけるＲＴのＲＮａｓｅ ＨドメインのＣ末端で切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＲＴは、ＲＮａｓｅ Ｈドメインを欠く。いくつかの実施形態では、参照ＲＴ配列は、配列番号１の配列を有する。いくつかの実施形態では、参照ＲＴ配列は、配列番号５の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＲＮａｓｅ Ｈドメインを含むモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）であるＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴのＲＮａｓｅ Ｈドメインと比較してＲＮａｓｅ Ｈドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｈドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失は、ＲＮａｓｅ ＨドメインのＲＮａｓｅ活性を低減または無効化する。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴにおけるＲＮａｓｅ Ｈドメインと比較して低減または無効化されたＲＮａｓｅ活性を有するＲＮａｓｅ Ｈドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、不活性化ＲＮａｓｅ Ｈドメインを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号１に示される参照Ｍ－ＭＭＬＶ ＲＴと比較してアミノ酸置換Ｐ５１＄、Ｓ６７、Ｅ６９＄、Ｌ１３９＄、Ｔ１９７＄、Ｄ２００＄、Ｈ２０４＄、Ｆ２０９＄、Ｅ３０２＄、Ｔ３０６＄、Ｆ３０９＄、Ｗ３１３＄、Ｔ３３０＄、Ｌ３４５＄、Ｌ４３５＄、Ｎ４５４＄、Ｄ５２４＄、Ｅ５６２＄、Ｄ５８３＄、Ｈ５９４＄、Ｌ６０３＄、Ｅ６０７＄、またはＤ６５３＄のうちの１つ以上を含むＭ－ＭＭＬＶ ＲＴを含み、＄は、野生型アミノ酸以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号１に示される参照Ｍ－ＭＭＬＶ ＲＴと比較してアミノ酸置換Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｋ、Ｅ６９Ｋ、Ｌ１３９Ｐ、Ｔ１９７Ａ、Ｄ２００Ｎ、Ｈ２０４Ｒ、Ｆ２０９Ｎ、Ｅ３０２Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、Ｔ３０６Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ３４５Ｇ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｌ６０３Ｗ、Ｅ６０７Ｋ、及びＤ６５３Ｎのうちの１つ以上を含むＭ－ＭＭＬＶ ＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号１に示される参照Ｍ－ＭＭＬＶと比較して１つ以上のアミノ酸置換Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆを含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号１に示される参照Ｍ－ＭＭＬＶ ＲＴと比較してアミノ酸置換Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆを含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号１に示される参照Ｍ－ＭＭＬＶ ＲＴと比較してＤ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆを保有する逆転写酵素を含むプライムエディターは、「ＰＥ２」プライムエディター、及び対応するプライム編集システムＰＥ２プライム編集システムと称され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号１、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＭＬＶ ＲＴと比較してアミノ酸置換Ｄ２００Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ６０３Ｗ、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含むＭ－ＭＭＬＶ ＲＴを含み、Ｘは、野生型アミノ酸以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号１、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＭＬＶ ＲＴと比較してアミノ酸置換Ｙ１３４Ｘ、Ｙ２７２Ｘ、Ｌ４３５Ｘ、Ｄ５２４Ｘ、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含むＭ－ＭＭＬＶ ＲＴを含み、Ｘは、野生型アミノ酸以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号１、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＭＬＶ ＲＴと比較してアミノ酸置換Ｙ１３４Ｒ、Ｙ２７２Ｒ、Ｌ４３５Ｋ、Ｄ５２４Ｎ、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含むＭ－ＭＭＬＶ ＲＴを含み、Ｘは、野生型アミノ酸以外の任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶＲＴバリアントは、参照ＭＭＬＶＲＴ配列配列番号１と比較してＤ２００Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、及びＬ６０３Ｗアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶＲＴバリアントは、参照ＭＭＬＶＲＴ配列配列番号１と比較してＤ２００Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、及びＬ６０３Ｗアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、参照ＭＭＬＶＲＴ配列配列番号１と比較してＤ５２４Ｎ、Ｌ４３５Ｋ、Ｙ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、参照ＭＭＬＶＲＴ配列配列番号１と比較して１つ以上のアミノ酸欠失を有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸５０４及び５０５に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（そのような切断は、本明細書で５０４Ｘ、またはＧ５０４Ｘ切断と称され得る）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸４７８及び４７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（Ｌ４７８Ｘ末端）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示される位置４７８と５０５との間の任意のアミノ酸位置でＣ末端で切断されている。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸３６５及び３６６に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（Ｐ３６５Ｘ）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸２７８及び２７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（Ｒ２７８Ｘ末端）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸３２８及び３２９に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（Ｔ３２８Ｘ末端）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸３７８及び３７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（Ｋ４７８Ｘ末端）。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示されるアミノ酸４２８及び４２９に対応する位置の間でＣ末端で切断されている（Ｍ４２８Ｘ末端）。いくつかの実施形態では、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示される対応する参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＤ２００＄、Ｔ３０６＄、Ｗ３１３＄、及び／またはＴ３３０＄アミノ酸置換をさらに含み、＄は、元のアミノ酸以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴバリアントは、配列番号１に示される対応する参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＤ２００Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、及び／またはＴ３３０Ｐアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、表６７に記述されるアミノ酸配列のいずれか１つとまたは配列番号１、４、５、３６、４５、５４、６３、または６２３に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼドメイン（例えば、ＭＭＬＶ－ＲＴ）を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号５を含むＭＭＬＶ－ＲＴドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣ末端切断ＭＭＬＶ－ＲＴドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、４、５、３６、４５、５４、６３、または６２３に示される配列のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号６２３に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号６２３に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、配列番号１、４、５、３６、４５、５４、６３、または６２３に示される配列のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＴバリアントは、対応するＲＴ（例えば、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、または最大で１００個、または最大で２００個、または最大で３００個、または最大で４００個、または最大で５００個またはそれを超えるアミノ酸変化を有する対応するＲＴ（例えば、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）の機能的断片であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＴバリアントは、断片が、対応するＲＴの対応する断片と約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一、約９９．５％同一、または約９９．９％同一となるように、対応するＲＴ、例えば、（例えば、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）の断片を含む。いくつかの実施形態では、断片は、対応するＲＴ（例えば、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）のアミノ酸長の３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％である。
いくつかの実施形態では、ＲＴ機能的断片は、長さが少なくとも１００アミノ酸である。いくつかの実施形態では、断片は、長さが少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または最大で６００またはそれを超えるアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、真核性ＲＴ、例えば、酵母、ショウジョウバエ、げっ歯類、または霊長類ＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、グループＩＩイントロンＲＴ、例えば、ａ．Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓグループＩＩイントロン（ＧｓＩ－ＩＩＣ）ＲＴまたはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅグループＩＩイントロン（Ｅｕ．ｒｅ．Ｉ２）ＲＴを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、レトロンＲＴを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＹ１３３＄アミノ酸置換を含み、＄は、Ｙを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＹ１３３Ｒアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＹ２７１＄アミノ酸置換を含み、＄は、Ｙを除く任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＹ２７１Ｒアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＤ５２４＄アミノ酸置換を含み、＄は、Ｄを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＤ５２４Ｎアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＬ４３５＄アミノ酸置換を含み、＄は、Ｌを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＬ４３５Ｋアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＹ１３３＄、Ｙ２７１＄、Ｌ４３５＄、及び／またはＤ５２４＄アミノ酸置換を含み、＄は、元のアミノ酸を除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＹ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒ、Ｌ４３５Ｋ、及び／またはＤ５２４Ｎアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＹ１３３＄アミノ酸置換を含み、＄は、Ｙを除く任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＹ１３３Ｒアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＹ２７１＄アミノ酸置換を含み、＄は、Ｙを除く任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してＹ２７１Ｒアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶＲＴは、配列番号１に示されるアミノ酸４７８及び４７９、４７８及び４７９、４７９及び４８０、４８０及び４８１、４８１及び４８２、４８２及び４８３、４８３及び４８４、４８４及び４８５、４８５及び４８６、４８６及び４８７、４８７及び４８８、４８８及び４８９、４８９及び４９０、４９０及び４９１、４９１及び４９２、４９２及び４９３、４９３及び４９４、４９４及び４９５、４９５及び４９６、４９６及び４９７、４９７及び４９８、４９８及び４９９、４９９及び５００、５００及び５０１、５０１及び５０２、５０２及び５０３、５０３及び５０４、または５０４及び５０５に対応する位置の間でＣ末端で切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶＲＴは、配列番号１に示されるアミノ酸５０４に対してＣ末端である任意のアミノ酸の後に切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶＲＴは、配列番号１に示されるアミノ酸４７８に対してＣ末端である任意のアミノ酸の後に切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴの位置５０５～６７９におけるアミノ酸が、配列番号１配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴの位置５０４に対してＣ末端のアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている（Ｇ５０４切断）。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べてアミノ酸５０５～６７９の欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べて位置５０４に対してＣ末端のアミノ酸の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴのアミノ酸３６５に対してＣ末端の位置におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して欠失している。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴの位置３６５に対してＣ末端のアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている（Ｐ３６５切断）。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べてアミノ酸３６５に対してＣ末端のアミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べて位置３６５に対してＣ末端のアミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１、５、または６２３に示されるアミノ酸５０４及び５０５に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１、５、または６２３に示されるアミノ酸３６５及び３６６に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１、５、または６２３に示されるアミノ酸４７８及び４７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１、５、または６２３と比較してＬ４７８とＧ５０４との間のアミノ酸の後のＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１、５、または６２３と比較してアミノ酸Ｌ４７８の後のＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１、５、または６２３に示されるアミノ酸４２８及び４２９に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１、５、または６２３に示されるアミノ酸３７８及び３７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１、５、または６２３に示されるアミノ酸３６６及び３６７に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１、５、または６２３に示されるアミノ酸３２８及び３２９に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１、５、または６２３に示されるアミノ酸２７８及び２７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴの位置４７９～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＭ－ＭＬＶ ＲＴは、切断されたＲＮａｓｅ Ｈドメインを含み、位置４７８に対してＣ末端のアミノ酸は、配列番号１、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている（Ｌ４７８切断）。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べてアミノ酸４７９～６７９の欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べて位置４７８に対してＣ末端のアミノ酸の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴの位置４２９～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置４２８に対してＣ末端のアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている（Ｍ４２８切断）。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べてアミノ酸４２９～６７９の欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べて位置４２８に対してＣ末端のアミノ酸の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴの位置３７９～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３７８に対してＣ末端のアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている（Ｋ３７８切断）。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べてアミノ酸３７９～６７９の欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べて位置３７８に対してＣ末端のアミノ酸の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴの位置３６７～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３６５に対してＣ末端のアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている（Ｐ３６５切断）。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べてアミノ酸３６７～６７９の欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べて位置３６５に対してＣ末端のアミノ酸の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴの位置３２８～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３２８に対してＣ末端のアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている（Ｔ３２８切断）。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べてアミノ酸３２８～６７９の欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べて位置３２８に対してＣ末端のアミノ酸の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴの位置２７９～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置２７８に対してＣ末端のアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている（Ｒ２７８切断）。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べてアミノ酸２７９～６７９の欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べて位置２７８に対してＣ末端のアミノ酸の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴの位置１～２２におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置２４に対してＮ末端のアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べてアミノ酸１～２２の欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、切断されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ）は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べて位置２４に対してＮ末端のアミノ酸の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、対応する参照ＲＴまたは野生型ＲＴと比較して１つ以上のアミノ酸置換及び／または１つ以上のアミノ酸欠失を有するＲＴドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴまたは参照ＲＴ（例えば、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３）と比較して１つ以上のアミノ酸置換及び１つ以上のアミノ酸欠失を有するＭ－ＭＬＶ ＲＴを含む。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して１つ以上のアミノ酸置換及び／または１つ以上のアミノ酸欠失を含むアミノ酸配列を含む。本明細書に記載されているまたは当該技術分野で知られているアミノ酸切断、欠失、及び置換のいずれか１つは、プライムエディターＲＴ、例えば、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴにおいて組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３＄、Ｙ２７１＄、Ｌ４３５＄、及び／またはＤ５２４＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置５０５～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、元のアミノ酸を除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒ、Ｌ４３５Ｋ、及び／またはＤ５２４Ｎアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置５０５～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３＄、Ｙ２７１＄、Ｌ４３５＄、及び／またはＤ５２４＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置４７９～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、元のアミノ酸を除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒ、Ｌ４３５Ｋ、及び／またはＤ５２４Ｎアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置４７９～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３＄、Ｙ２７１＄、Ｌ４３５＄、及び／またはＤ５２４＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置４２９～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、元のアミノ酸を除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒ、Ｌ４３５Ｋ、及び／またはＤ５２４Ｎアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置４２９～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３＄、Ｙ２７１＄、Ｌ４３５＄、及び／またはＤ５２４＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３７９～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、元のアミノ酸を除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒ、Ｌ４３５Ｋ、及び／またはＤ５２４Ｎアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３７９～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３＄、Ｙ２７１＄、Ｌ４３５＄、及び／またはＤ５２４＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３６７～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、元のアミノ酸を除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒ、Ｌ４３５Ｋ、及び／またはＤ５２４Ｎアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３６７～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３＄、Ｙ２７１＄、Ｌ４３５＄、及び／またはＤ５２４＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３２８～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、元のアミノ酸を除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒ、Ｌ４３５Ｋ、及び／またはＤ５２４Ｎアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３２８～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３＄、Ｙ２７１＄、Ｌ４３５＄、及び／またはＤ５２４＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置２７９～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、元のアミノ酸を除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒ、Ｌ４３５Ｋ、及び／またはＤ５２４Ｎアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置２７９～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３＄、Ｙ２７１＄、Ｌ４３５＄、及び／またはＤ５２４＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置１～２２におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、元のアミノ酸を除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒ、Ｌ４３５Ｋ、及び／またはＤ５２４Ｎアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置１～２２におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｌ４３５＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置５０５～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、Ｌを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｌ４３５Ｋアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置５０５～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｌ４３５＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置１～２２におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、Ｌを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｌ４３５Ｋアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置１～２２におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、Ｌ４３５＄アミノ酸置換を含み、位置１～２２におけるアミノ酸及び位置５０５～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、Ｌを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴを含み、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、Ｌ４３５Ｋアミノ酸置換を含み、位置１～２２におけるアミノ酸及び位置５０５～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３６７～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、Ｙを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３Ｒアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３６７～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ２７１＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３６７～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、Ｙを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ２７１Ｒアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３６７～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３＄及びＹ２７１＄アミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３６７～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、Ｙを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３Ｒ及びＹ２７１Ｒアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置３６７～６７９におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されている。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｙ１３３Ｒ、Ｙ２７１Ｒ、Ｌ４３５Ｋ、及び／またはＤ５２４Ｎアミノ酸置換を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含み、位置１～２２におけるアミノ酸は、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して切断されており、＄は、元のアミノ酸を除く任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して位置Ｐ３６５に対してＣ末端のアミノ酸の欠失、Ｙ１３３＄アミノ酸置換、及び／またはＹ２７１＄アミノ酸置換を含み、＄は、元のもの以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してアミノ酸３６６～６７９の欠失、Ｙ１３３＄アミノ酸置換、及び／またはＹ２７１＄アミノ酸置換を含み、＄は、元のもの以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して位置Ｐ３６５に対してＣ末端のアミノ酸の欠失、Ｙ１３３Ｒアミノ酸置換、及び／またはＹ２７１Ｒアミノ酸置換を含み、＄は、元のもの以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して位置Ｇ５０４に対してＣ末端のアミノ酸の欠失、及び／またはＬ４３５＄アミノ酸置換を含み、＄は、元のもの以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してアミノ酸残基５０５～６７９の欠失、及び／またはＬ４３５＄アミノ酸置換を含み、＄は、元のもの以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較して位置Ｇ５０４に対してＣ末端のアミノ酸の欠失、アミノ酸残基１～２２の欠失、及び／またはＬ４３５＄アミノ酸置換を含み、＄は、元のもの以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してアミノ酸残基５０５～６７９の欠失、Ｎ末端アミノ酸残基１～２２の欠失、及び／またはＬ４３５＄アミノ酸置換を含み、＄は、元のもの以外の任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメイン、例えば、逆転写酵素ドメイン、例えばＭ－ＭＬＶ ＲＴは、１つ以上の変異（例えば、１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／またはアミノ酸挿入）を含み得る。変異体逆転写酵素は、例えば、部位特異的またはランダム変異誘発によって対象となる逆転写酵素をコードする遺伝子（複数可）を変異させることによって得られ得る。いくつかの実施形態では、変異は、例えば、編集効率を増加させることによって、逆転写酵素活性を増加させることによって、及び／または安定性（例えば、耐熱性）を増加させることによってＤＮＡポリメラーゼドメイン、例えば、逆転写酵素ドメインの効率を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される１つ以上の変異を含むＤＮＡポリメラーゼドメインを含むプライムエディターは、対応する非変異ＤＮＡポリメラーゼを含むプライムエディターと比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、または少なくとも１０００％の編集効率の増加を示し得る。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴであるＤＮＡポリメラーゼドメインは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べてＰ５１＄、Ｓ６７＄、Ｅ６９＄、Ｌ１３９＄、Ｔ１９７＄、Ｄ２００＄、Ｈ２０４＄、Ｆ２０９＄、Ｅ３０２＄、Ｔ３０６＄、Ｆ３０９＄、Ｗ３１３＄、Ｔ３３０＄、Ｌ４３５＄、Ｐ４４８＄、Ｄ４４９＄、Ｎ４５４＄、Ｄ５２４＄、Ｅ５６２＄、Ｄ５８３＄、Ｈ５９４＄、Ｌ６０３＄、Ｅ６０７＄、Ｇ６１５＄、Ｈ６３４＄、Ｇ６３７＄、Ｈ６３８＄、Ｄ６５３＄、またはＬ６７１＄変異からなる群から選択される１つ以上の変異を含み、＄は、野生型アミノ酸以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメイン、例えば、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、配列番号１、配列番号５、または配列番号６２３に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比べてＰ５１Ｌ、Ｓ６７Ｋ、Ｅ６９Ｋ、Ｌ１３９Ｐ、Ｔ１９７Ａ、Ｄ２００Ｎ、Ｈ２０４Ｒ、Ｆ２０９Ｎ、Ｅ３０２Ｋ、Ｔ３０６Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｐ４４８Ａ、Ｄ４４９Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｌ６０３Ｗ、Ｅ６０７Ｋ、Ｇ６１５、Ｈ６３４Ｙ、Ｇ６３７Ｒ、Ｈ６３８Ｇ、Ｄ６５３Ｎ、またはＬ６７１Ｐからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。
いくつかの実施形態では、操作されたＲＴは、天然に存在するＲＴまたはＲＴドメインよりも改善された安定性、逆転写活性を有し得る。いくつかの実施形態では、操作されたＲＴは、天然に存在するＲＴよりも改善された特徴、例えば、改善された耐熱性、逆転写効率、または標的忠実性を有し得る。いくつかの実施形態では、操作されたＲＴを含むプライムエディターは、参照天然に存在するＲＴを有するプライムエディターよりも改善されたプライム編集効率を有する。
本明細書に記載の操作されたＲＴのいずれかを含むプライムエディターは、対応する参照ＲＴ（例えば、配列番号１に示される参照ＲＴ）を有する参照プライムエディターと比較して改変された機能的特徴を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＲＴを含むプライムエディターは、対応する参照ＲＴ（例えば、配列番号１に示されるような参照ＲＴ）を有する参照プライムエディターと比較して改善された安定性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＲＴを含むプライムエディターは、対応する参照ＲＴ（例えば、配列番号１に示されるような参照ＲＴ）を有する参照プライムエディターと比較して改善された耐熱性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＲＴを含むプライムエディターは、対応する参照ＲＴ（例えば、配列番号１に示されるような参照ＲＴ）を有する参照プライムエディターと比較して改善された溶解性または低減した凝集を有する。いくつかの実施形態では、操作されたＲＴを含むプライムエディターは、対応する参照ＲＴ（例えば、配列番号１に示されるような参照ＲＴ）を有する参照プライムエディターと比較して改善されたプライム編集効率を有する。いくつかの実施形態では、操作されたＲＴを含むプライムエディターは、対応する参照ＲＴ（例えば、または配列番号１に示される参照ＲＴ）を有する参照プライムエディターと比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％またはそれを超えて増加したプライム編集効率を有する。いくつかの実施形態では、操作されたＲＴを含むプライムエディターは、対応する参照ＲＴ（例えば、配列番号１に示されるような参照ＲＴ）を有する参照プライムエディターと比較して少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍またはそれを超えて増加したプライム編集効率を有する。
プログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡ結合活性（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）を有するポリペプチドドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡ結合活性（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）を有するポリペプチドドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２、６、７、５９６～６１３（表１４）に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２、６、７、５９６～６１３に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以下の相違、例えば、変異、例えば、欠失または置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、対応するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、配列番号２、６、７、５９６～６１３のいずれか１つに示されるＤＮＡ結合ドメイン）と比較してＮ末端メチオニンを欠くアミノ酸配列を含む。（表１４）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、１つ以上の処理酵素によって、例えば、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）によってＮ末端修飾され得る。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性、例えば、ＣａｓポリペプチドのＲＮＡでガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼドメインまたはヌクレアーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ニッカーゼ、または十分に活性なヌクレアーゼを含む。本明細書で使用される場合、用語「ニッカーゼ」は、二本鎖ＤＮＡ標的の一方の鎖のみを切断することが可能なヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、不活性ヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインは、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインである。プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、特定の核酸配列、例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを結合させるように設計されたタンパク質ドメインを指す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインを二本鎖標的ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子）における特定のＤＮＡ配列、例えば、サーチ標的配列にガイドするガイドポリヌクレオチド（例えば、ＰＥｇＲＮＡ）と会合し得るプログラム可能なポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメインである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、クラスター化規則的インタースペース短パリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質を含む。Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載の任意のＣａｓタンパク質またはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインはまた、ジンクフィンガータンパク質ドメインを含み得る。他の場合では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化因子様エフェクタードメイン（ＴＡＬＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡヌクレアーゼを含む。例えば、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインは、ＲＮＡでガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含み、１つ以上のジンクフィンガーモチーフまたはＴＡＬＥモチーフは、１つ以上のヌクレアーゼ、例えば、Ｆｏｋ Ｉヌクレアーゼドメインと会合する。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインは、一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するエンドヌクレアーゼドメインを含む。例えば、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインは、十分なヌクレアーゼ活性を有するヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインは、野生型エンドヌクレアーゼドメインと比較して修飾されたまたは低減されたヌクレアーゼ活性を有するヌクレアーゼを含む。例えば、エンドヌクレアーゼドメインは、野生型エンドヌクレアーゼドメインと比較して１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインは、ニッカーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインは、ニッカーゼであるＣａｓタンパク質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、Ｃａｓニッカーゼは、その二本鎖ヌクレアーゼ活性を低減または無効化するが、ＤＮＡ結合活性を保持するヌクレアーゼドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、ＨＮＨドメインにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインにおけるアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質）ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質は、クラス１またはクラス２Ｃａｓタンパク質であり得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型Ｃａｓタンパク質、またはＶＩ型Ｃａｓタンパク質であり得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｂ１（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｂ２、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、Ｃ２ｃ９、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、Ｃａｓ１４ｃ、Ｃａｓ１４ｄ、Ｃａｓ１４ｅ、Ｃａｓ１４ｆ、Ｃａｓ１４ｇ、Ｃａｓ１４ｈ、Ｃａｓ１４ｕ、Ｃｎｓ２、ＣａｓΦ、及びそれらのホモログ、機能的断片、または修飾されたバージョンが含まれる。Ｃａｓタンパク質は、他のタンパク質またはポリペプチドに融合されたキメラＣａｓタンパク質であり得る。Ｃａｓタンパク質は、例えば、異なる生物からのＣａｓタンパク質のドメインを含む様々なＣａｓタンパク質のキメラであり得る。
Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、任意の好適な生物からのものであり得る。いくつかの態様では、生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である。いくつかの態様では、生物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）である。いくつかの態様では、生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。いくつかの実施形態では、生物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓである。
Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、野生型または修飾された形態のＣａｓタンパク質であり得る。Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性バリアント、ヌクレアーゼ不活性バリアント、ニッカーゼ、または機能的バリアントもしくは機能的断片であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、Ｃａｓタンパク質の野生型バージョンと比べてアミノ酸変化、例えば、欠失、挿入、置換、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型の例示的なＣａｓタンパク質と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または配列類似性を有するポリペプチドであり得る。
Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、１つ以上のドメインを含み得る。Ｃａｓドメインの非限定的な例には、ガイド核酸認識及び／または結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、及び二量体化ドメインが含まれる。様々な実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ガイド核酸認識及び／またはガイド核酸と相互作用し得る結合ドメイン、及び核酸切断のための触媒活性を含む１つ以上のヌクレアーゼドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、１つ以上のヌクレアーゼドメインを含む。Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン）と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、単一のヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃｐｆ１は、ＲｕｖＣドメインを含み得るが、ＨＮＨドメインを欠く。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのヌクレアーゼドメインを含み、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み得る。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９であって、Ｃａｓタンパク質のすべてのヌクレアーゼドメインが活性であるものを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、１つ以上の不活性ヌクレアーゼドメインを有するＣａｓタンパク質を含む。Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ）は、もはや機能的でなくなるようにまたは低減したヌクレアーゼ活性を含むように、欠失または変異させられ得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインにおける変異を含むＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、ガイド核酸、例えば、ＰＥｇＲＮＡと複合体化した場合にサーチ標的配列で核酸遺伝子座を標的とするその能力を維持しながら、低減（例えば、ニッカーゼ）または無効化されたヌクレアーゼ活性を有する。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列特異的様式で二本鎖標的ＤＮＡに結合し、かつ二本鎖標的ＤＮＡにおける二本鎖ＤＮＡ内のプロトスペーサーで一本鎖破断を生成することができるが、二本鎖破断を生成することができないＣａｓニッカーゼを含む。例えば、Ｃａｓニッカーゼは、二本鎖標的ＤＮＡの編集鎖または非編集鎖を切断し得るが、両方を切断しない場合がある。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、２つのヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含むＣａｓニッカーゼを含み、２つのヌクレアーゼドメインのうちの１つは、触媒活性を欠くように修飾されており、または欠失している。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＣａｓニッカーゼは、ヌクレアーゼ不活性ＲｕｖＣドメイン及びヌクレアーゼ活性ＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＣａｓニッカーゼは、ヌクレアーゼ不活性ＨＮＨドメイン及びヌクレアーゼ活性ＲｕｖＣドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＲｕｖＣドメインにおけるアミノ酸置換を有するＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と比較してＤ１０＄アミノ酸置換を含み、＄は、Ｄ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＨＮＨドメインにおけるアミノ酸置換を有するＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と比較してＨ８４０＄アミノ酸置換を含み、＄は、Ｈ以外の任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列特異的様式で二本鎖標的ＤＮＡに結合し得るＣａｓタンパク質を含むが、ヌクレアーゼ活性を欠き、または無効化されたヌクレアーゼ活性を有し、二本鎖標的ＤＮＡにおける二本鎖ＤＮＡのいずれの鎖も切断しない場合がある。無効化された活性または欠いた活性は、野生型の例示的な活性（例えば、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性）と比較して１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、または１０％未満の活性の酵素活性を指し得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＣａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を完全に欠く。ヌクレアーゼ活性を欠くヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ不活性または「ヌクレアーゼ死」（「ｄ」と略される）と称され得る。ヌクレアーゼｄｅａｄ Ｃａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ、ｄＣａｓ９）は、標的ポリヌクレオチドに結合し得るが、標的ポリヌクレオチドを切断しない場合がある。いくつかの態様では、ｄｅａｄ Ｃａｓタンパク質は、ｄｅａｄ Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ヌクレアーゼｄｅａｄ Ｃａｓタンパク質を含み、ヌクレアーゼドメインのすべて（例えば、Ｃａｓ９タンパク質におけるＲｕｖＣ及びＨＮＨヌクレアーゼドメインの両方；Ｃｐｆ１タンパク質におけるＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン）は、触媒活性を欠くように変異させられ、または欠失している。
Ｃａｓタンパク質は、修飾され得る。Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、及び／または酵素活性を増加または低下させるように修飾され得る。Ｃａｓタンパク質はまた、タンパク質の任意の他の活性または特性、例えば、安定性を変化させるように修飾され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインは、修飾、欠失、または不活性化され得、またはＣａｓタンパク質は、タンパク質の機能のために必須ではないドメインを除去するようにまたはＣａｓタンパク質の活性を最適化（例えば、向上または低減する）ように切断され得る。
Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写制御ドメイン、またはポリメラーゼドメインに融合され得る。Ｃａｓタンパク質はまた、増加または低下した安定性を提供する異種ポリペプチドに融合され得る。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質内のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の形態、例えば、単独のまたはガイド核酸と複合体化されたＣａｓタンパク質で提供され得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、例えば、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡの形態で提供され得る。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化され得る。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれ得る。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞において活性なプロモーターに機能可能に連結され得る。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現コンストラクトにおけるプロモーターに機能可能に連結され得る。発現コンストラクトには、対象となる遺伝子または他の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を誘導することが可能であり、かつそのような対象となる核酸配列を標的細胞に移行させ得る任意の核酸コンストラクトが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質の修飾された形態を含み得る。いくつかの実施形態では、野生型Ｃａｓタンパク質の修飾された形態は、Ｃａｓタンパク質の核酸切断活性を低減する１つ以上の変異（例えば、アミノ酸欠失、挿入、及び／または置換）を含み得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の修飾された形態は、対応するタンパク質（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）と比較して９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、未満３０％、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満の核酸切断活性を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質の修飾された形態は、実質的な核酸切断活性を有しない場合がある。Ｃａｓタンパク質が、実質的な核酸切断活性を有しない修飾された形態である場合、それは、酵素的に不活性及び／または「ｄｅａｄ」（「ｄ」によって略される）と称され得る。ｄｅａｄ Ｃａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ、ｄＣａｓ９）は、標的ポリヌクレオチドに結合し得るが、標的ポリヌクレオチドを切断しない場合がある。いくつかの実施形態では、ｄｅａｄ Ｃａｓタンパク質は、ｄｅａｄ Ｃａｓ９タンパク質である。
酵素的に不活性とは、配列特異的様式でポリヌクレオチドにおける核酸配列に結合し得るが、標的ポリヌクレオチドを切断しない場合があるポリペプチドを指し得る。酵素的に不活性な部位誘導ポリペプチドは、酵素的に不活性なドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）を含み得る。酵素的に不活性は、活性がないことを指し得る。酵素的に不活性は、実質的に活性がないことを指し得る。酵素的に不活性は、本質的に活性がないことを指し得る。酵素的に不活性は、対応する野生型の例示的な活性（例えば、核酸切断活性、野生型Ｃａｓ９活性）と比較して１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、または１０％未満の活性を指し得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ）は、もはや機能的でなくなるようにまたは低減したヌクレアーゼ活性を含むように、欠失または変異させられ得る。例えば、少なくとも２つのヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含むＣａｓタンパク質において、ヌクレアーゼドメインのうちの１つが欠失または変異した場合、ニッカーゼとして知られている得られるＣａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）認識配列で一本鎖破断を生成し得るが、二本鎖破断を生成しない場合がある。そのようなニッカーゼは、相補鎖または非相補鎖を切断し得るが、両方を切断しない場合がある。Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインのすべて（例えば、Ｃａｓ９タンパク質におけるＲｕｖＣ及びＨＮＨヌクレアーゼドメインの両方；Ｃｐｆ１タンパク質におけるＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン）が欠失または変異した場合、得られるＣａｓタンパク質は、二本鎖標的ＤＮＡの両方の鎖を切断する低減した能力を有し得、またはその能力を有しない場合がある。Ｃａｓ９タンパク質をニッカーゼに変換し得る変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａアミノ酸置換（配列番号２に示されるＣａｓ９の位置１０におけるアスパラギン酸からアラニンへの）変異である。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ８４０Ａアミノ酸置換（配列番号２に示されるアミノ酸位置８４０におけるヒスチジンからアラニン）に対応する変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。Ｃａｓ９タンパク質をｄｅａｄ Ｃａｓ９に変換し得る変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の位置１０におけるアスパラギン酸からアラニンへの）変異及びＨＮＨドメインにおけるＨ８４０Ａ（アミノ酸位置８４０におけるヒスチジンからアラニン）である。
いくつかの実施形態では、ｄｅａｄ Ｃａｓタンパク質は、そのタンパク質の野生型バージョンと比べて１つ以上の変異を含み得る。変異は、野生型Ｃａｓタンパク質の複数の核酸切断ドメインの１つ以上における核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満をもたらし得る。変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断するその能力を低減する複数の核酸切断ドメインの１つ以上をもたらし得る。変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の相補鎖を切断するその能力を低減する複数の核酸切断ドメインの１つ以上をもたらし得る。変異は、標的核酸の相補鎖及び非相補鎖を切断する能力を欠く複数の核酸切断ドメインの１つ以上をもたらし得る。ヌクレアーゼドメインにおいて変異させられる残基は、ヌクレアーゼの１つ以上の触媒的残基に対応し得る。例えば、野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドにおける残基、例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４及びＡｓｎ８５６は、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）の１つ以上を不活性化するように変異させられ得る。Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインにおいて変異させられる残基は、例えば、配列及び／または構造アライメントによって決定される場合、野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドにおける残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４及びＡｓｎ８５６に対応し得る。
非限定的な例として、配列番号２に示されるＳｐＣａｓ９におけるアミノ酸残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７、または別のＣａｓ９タンパク質における対応するアミノ酸残基のうちの１つ以上が変異させられ得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質バリアントは、配列番号２に示されるＤ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、及び／またはＤ９８６Ａアミノ酸置換または対応する変異のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、アラニン置換以外の変異が好適であり得る。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ニッカーゼであるＣａｓタンパク質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、対応するＣａｓタンパク質と比較してヌクレアーゼドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換は、その二本鎖ヌクレアーゼ活性を低減または無効化するが、ＤＮＡ結合活性を保持する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、対応するＣａｓタンパク質と比較してＨＮＨドメインにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、対応するＣａｓタンパク質と比較してＲｕｖＣドメインにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、対応するＣａｓ９タンパク質と比較してＨＮＨドメインにおける１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、ＨＮＨドメインにおける１つ以上の変異は、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を低減または無効化する。例示的なＣａｓ９ニッカーゼバリアントの配列は、配列番号７、５９７、５９８、６００、６０１、６０３、６０６、６０７、６０９、６１０、６１２、または６１３で提供される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、野生型Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性バリアント、ヌクレアーゼ不活性バリアント、ニッカーゼ、または機能的バリアントもしくは機能的断片である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、長さが８００～１５００アミノ酸、長さが１４００～９００アミノ酸、または長さが少なくとも１０００～１３００アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質ドメインは、長さが少なくとも８００アミノ酸、長さが少なくとも９００アミノ酸、長さが少なくとも１０００アミノ酸、長さが少なくとも１１００アミノ酸、または長さが少なくとも１２００アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質ドメインは、長さが１０５７アミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、長さが１０６９アミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、長さが１３６９アミノ酸である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、ＰＡＭ配列「ＮＧＡ」（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドである）を認識する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、ＰＡＭ配列「ＮＧＮ」（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドである）を認識する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、ＰＡＭ配列「ＮＲＮ」（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドである）を認識する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、ＰＡＭ配列「ＮＮＧＲＲＴ」（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドである）を認識する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、ＰＡＭ配列「ＮＮＧＧ」（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドである）を認識する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるプライムエディターは、改変されたＰＡＭ認識を可能とする修飾を含有するＣａｓタンパク質ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質ベースのプライムエディターを使用するプライム編集において、「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）」、ＰＡＭ配列、またはＰＡＭ様モチーフは、標的遺伝子のＰＡＭ鎖上のプロトスペーサー配列にすぐ隣接する短いＤＮＡ配列を指すために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、プライム編集中にプライムエディターにおけるＣａｓヌクレアーゼによって認識される。所定の実施形態では、ＰＡＭは、Ｃａｓタンパク質ドメインの標的結合のために必要とされる。Ｃａｓタンパク質ドメイン認識のために必要とされる特定のＰＡＭ配列は、特定のタイプのＣａｓタンパク質に依存し得る。ＰＡＭは、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、長さが２～６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、５’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）であり得る。他の実施形態では、ＰＡＭは、３’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）であり得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＣａｓタンパク質は、標準的なＰＡＭを認識し、例えば、ＳｐＣａｓ９は、５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭを認識する。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、１つ以上のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、野生型Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、参照Ｃａｓタンパク質（例えば、配列番号２、６、７、５９６～６１３のいずれか１つから選択されるＣａｓタンパク質）のヌクレアーゼドメインと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ドメインは、単一のヌクレアーゼドメインを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列特異的様式で標的遺伝子に結合し得るＣａｓタンパク質ドメインを含むが、ヌクレアーゼ活性を欠き、または無効化されたヌクレアーゼ活性を有し、標的遺伝子における二本鎖ＤＮＡのいずれの鎖も切断しない場合がある。無効化された活性または欠いた活性は、野生型の例示的な活性（例えば、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性）と比較して１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、または１０％未満の活性の酵素活性を指し得る。
例示的なＣａｓタンパク質ドメインが表１４に示されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質ドメインまたはＣａｓタンパク質）は、配列番号２、６、７、５９６～６１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質ドメインまたはＣａｓタンパク質）は、配列番号２、６、７、５９６～６１３（例えば、表１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメインは、配列番号２、６、７、５９６～６１３（例えば、表１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメインは、配列番号２、６、７、５９６～６１３（例えば、表１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメインは、対応するＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメイン（例えば、配列番号２、６、７、５９６～６１３に示されるＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメインのいずれか１つ）と比較してＮ末端メチオニンを欠くアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、配列番号２、６、７、５９６～６１３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメイン）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、配列番号２、６、７、５９６～６１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメイン）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメイン）をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメイン）をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）は、配列番号６２７、または配列番号６２９の核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）は、配列番号６２７、及び配列番号６２９からなる群から選択される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）は、配列番号６２８、または配列番号６３０の核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）は、配列番号６２８、または配列番号６３０からなる群から選択される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターのＣａｓタンパク質は、クラス２Ｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質の修飾されたバージョン、Ｃａｓ９タンパク質ホモログ、変異体、バリアント、またはそれらの機能的断片である。本明細書で使用される場合、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ヌクレアーゼは、１つ以上のＣａｓ９ヌクレアーゼドメイン及びガイドポリヌクレオチド、例えば、ＰＥｇＲＮＡを結合させる能力を有するＣａｓ９ ｇＲＮＡ結合ドメインを含むＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９タンパク質は、任意の生物からの野生型Ｃａｓ９タンパク質または任意の生物からのホモログ、オルソログ、もしくはパラログ；その任意の機能的変異体もしくは機能的バリアント；またはその任意の機能的断片もしくはドメインを指し得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、全長Ｃａｓ９タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は通常、野生型参照Ｃａｓ９タンパク質（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、野生型参照Ｃａｓ９タンパク質と比較してアミノ酸変化、例えば、欠失、挿入、置換、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的なＣａｓ９配列が表１４に提供される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｎｉｓ（Ｓｃ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓｔ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ（Ｓｌｕ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｎｍ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（Ｃｊ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｆｎ）、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｔｄ）からのＣａｓ９タンパク質、または当該技術分野で知られている生物からの任意のＣａｓ９ホモログまたはオルソログを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿０３８４３１３１４に示されるアミノ酸配列を含むＳｐＣａｓ９ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５に示されるアミノ酸配列を含むＳａＣａｓ９ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ３Ｐ５ＹＡ７８に示されるアミノ酸配列を含むＳｃＣａｓ９ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿００７８９６５０１．１に示されるアミノ酸配列を含むＳｔＣａｓ９ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿２３０５８０２３６．１またはＷＰ＿２５０６３８３１５．１またはＷＰ＿２４２２３４１５０．１、ＷＰ＿２４１４３５３８４．１、ＷＰ＿００２４６０８４８．１、ＫＡＫ５８３７１．１に示されるアミノ酸配列を含むＳｌｕＣａｓ９ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿００２２３８３２６．１またはＷＰ＿０６１７０４９４９．１のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むＮｍＣａｓ９ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿１００６１２０３６．１、ＷＰ＿１１６８８２１５４．１、ＷＰ＿１１６５６０５０９．１、ＷＰ＿１１６４８４１９４．１、ＷＰ＿１１６４７９３０３．１、ＷＰ＿１１５７９４６５２．１、ＷＰ＿１００６２４８７２．１のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むＣｊＣａｓ９ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントである。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ｑ５Ｙ３に示されるアミノ酸配列を含むＦｎＣａｓ９ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿１４７６２５０６５．１に示されるアミノ酸配列を含むＴｄＣａｓ９ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、本明細書に記載される生物または当該技術分野で知られているものの２つ以上からのドメインを含むキメラである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿００３０７９７０１．１に示されるアミノ酸配列を含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅからのＣａｓ９ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ相互作用ドメインをＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ Ｃａｓ９（Ｓｐｙ－ｍａｃ Ｃａｓ９）のものと置き換えることによって生成されるＣａｓ９ポリペプチドである。
例示的なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）アミノ酸配列が配列番号２に提供される。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ（Ｓｌｕ Ｃａｓ９）からのＣａｓ９タンパク質を含む。Ｓｌｕ Ｃａｓ９の例示的なアミノ酸配列が配列番号６０６に提供される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換を含有するバリアントＣａｓ９タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、二本鎖標的ＤＮＡ配列の両方の鎖を切断し得るヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９タンパク質は、機能的ＲｕｖＣドメイン及び機能的ＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ガイドポリヌクレオチドに結合し、標的ＤＮＡを認識し得るが、二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖のみを切断し得るＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、１つの機能的ＲｕｖＣドメインまたは１つの機能的ＨＮＨドメインのみを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、非機能的ＨＮＨドメイン及び機能的ＲｕｖＣドメインを有するＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、編集鎖（すなわち、ＰＡＭ鎖）を切断することができるが、二本鎖標的ＤＮＡ配列の非編集鎖を切断することができない。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、標的鎖（すなわち、非ＰＡＭ鎖）を切断することができるが、二本鎖標的ＤＮＡ配列の編集鎖を切断することができない非機能的ＲｕｖＣドメインを有するＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、機能的ＲｕｖＣドメインも機能的ＨＮＨドメインも有しないＣａｓ９を有し、これは、二本鎖標的ＤＮＡ配列のいずれの鎖も切断しない場合がある。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を低減または無効化するＲｕｖＣドメインにおける変異を有するＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号２に示される野生型ＳｐＣａｓ９と比較してアミノ酸Ｄ１０における変異、またはその対応する変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号２に示される野生型ＳｐＣａｓ９と比較してＤ１０Ａ変異、またはその対応する変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、配列番号２に示される野生型ＳｐＣａｓ９と比較してアミノ酸Ｄ１０、Ｇ１２、及び／またはＧ１７における変異、またはその対応する変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、配列番号２に示される野生型ＳｐＣａｓ９と比較してＤ１０Ａ変異、Ｇ１２Ａ変異、及び／またはＧ１７Ａ変異、またはその対応する変異を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を低減または無効化するＨＮＨドメインにおける変異を有するＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、配列番号２に示される野生型ＳｐＣａｓ９と比較してアミノ酸Ｈ８４０における変異、またはその対応する変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、配列番号２に示される野生型ＳｐＣａｓ９と比較してＨ８４０Ａ変異、またはその対応する変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、配列番号２に示される野生型ＳｐＣａｓ９と比較してアミノ酸Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８５６、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７における変異、またはその対応する変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、配列番号２に示される野生型ＳｐＣａｓ９と比較してＥ７６２Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、及び／またはＤ９８６Ａ変異、またはその対応する変異を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメインの両方のヌクレアーゼ活性を低減または無効化するＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメインの両方における１つ以上のアミノ酸置換を有するＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９、またはヌクレアーゼｄｅａｄ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、配列番号２に示される野生型ＳｐＣａｓ９と比較してＨ８４０＄置換及びＤ１０Ｘ変異またはその対応する変異を含み、＄は、Ｈ８４０＄置換のためのＨ以外の任意のアミノ酸及びＤ１０＄置換のためのＤ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ｄｅａｄ Ｃａｓ９は、配列番号２に示される野生型ＳｐＣａｓ９と比較してＨ８４０Ａ及びＤ１０Ａ変異、またはその対応する変異を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端メチオニンは、Ｃａｓ９ニッカーゼから、または本明細書で開示または企図される任意のＣａｓ９バリアント、オルソログ、または同等物から除去される。例えば、メチオニンを欠くＣａｓ９ニッカーゼには、以下の配列番号７、５９８、６０１、６０４、６０７、６１０、６１３、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するそのバリアントが含まれる。
ｄｅａｄ Ｃａｓ９及びＣａｓ９ニッカーゼバリアントに加えて、本明細書で使用されるＣａｓ９タンパク質にはまた、任意の野生型Ｃａｓ９、または変異体Ｃａｓ９（例えば、ｄｅａｄ Ｃａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼ）、または断片Ｃａｓ９、または循環置換Ｃａｓ９、または本明細書に開示されるまたは当該技術分野で知られているＣａｓ９の他のバリアントを含む、任意の参照Ｃａｓ９タンパク質と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一を有する他のＣａｓ９バリアントが含まれ得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、参照Ｃａｓ９、例えば、野生型Ｃａｓ９と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれを超えるアミノ酸変化を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、参照Ｃａｓ９、例えば、野生型Ｃａｓ９に対応する断片と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一となるように、参照Ｃａｓ９の断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、断片は、対応する野生型Ｃａｓ９のアミノ酸長さの少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％である。いくつかの実施形態では、参照Ｃａｓ９は、配列番号２、６、７、５９６～６１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、改変されたＰＡＭ認識を可能とする修飾を含有するＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９を含む。Ｃａｓタンパク質ベースのプライムエディターを使用するプライム編集において、「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）」、ＰＡＭ配列、またはＰＡＭ様モチーフは、二本鎖標的ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子）のＰＡＭ鎖上のプロトスペーサー配列の直後の短いＤＮＡ配列を指すために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、プライム編集中にプライムエディターにおけるＣａｓヌクレアーゼによって認識される。所定の実施形態では、ＰＡＭは、Ｃａｓタンパク質の標的結合のために必要とされる。Ｃａｓタンパク質認識のために必要とされる特定のＰＡＭ配列は、特定のタイプのＣａｓタンパク質に依存し得る。ＰＡＭは、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、長さが２～６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、５’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）であり得る。他の実施形態では、ＰＡＭは、３’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）であり得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＣａｓタンパク質は、標準的なＰＡＭを認識し、例えば、ＳｐＣａｓ９は、５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭを認識する。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＣａｓタンパク質は、改変されたまたは非標準的ＰＡＭ特異性を有する。例示的なＰＡＭ配列及び対応するＣａｓバリアントが以下の表１ａに記載されている。提供されるバリアントの各々について、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質配列、例えば、配列番号２に示されるＣａｓ９と比較して示されるアミノ酸置換の１つ以上を含むことが理解されるべきである。以下の表１ａに示されるＰＡＭモチーフは、５’から３’への順序である。

Figure 2024525665000002
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２に示される野生型ＳｐＣａｓ９ポリペプチドと比較してＡ６１Ｒ、Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ２２１Ｋ、Ａ２６２Ｔ、Ｒ３２４Ｌ、Ｎ３９４Ｋ、Ｓ４０９Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４２７Ｇ、Ｅ４８０Ｋ、Ｍ４９５Ｖ、Ｎ４９７Ａ、Ｙ５１５Ｎ、Ｋ５２６Ｅ、Ｆ５３９Ｓ、Ｅ５４３Ｄ、Ｒ６５４Ｌ、Ｒ６６１Ａ、Ｒ６６１Ｌ、Ｒ６９１Ａ、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｍ６９４Ｉ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａ、Ｒ７５３Ｇ、Ｍ７６３Ｉ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ８９０Ｎ、Ｑ９２６Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ、Ｌ１１１１Ｒ、Ｒ１１１４Ｇ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｄ１１３５Ｌ、Ｄ１１３５Ｎ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｖ１１３９Ａ、Ｄ１１８０Ｇ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｑ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｑ１２２１Ｈ、Ｐ１２４９Ｓ、Ｅ１２５３Ｋ、Ｎ１３１７Ｒ、Ａ１３２０Ｖ、Ｐ１３２１Ｓ、Ａ１３２２Ｒ、Ｉ１３２２Ｖ、Ｄ１３３２Ｇ、Ｒ１３３２Ｎ、Ａ１３３２Ｒ、Ｒ１３３３Ｋ、Ｒ１３３３Ｐ、Ｒ１３３５Ｌ、Ｒ１３３５Ｑ、Ｒ１３３５Ｖ、Ｔ１３３７Ｎ、Ｔ１３３７Ｒ、Ｓ１３３８Ｔ、Ｈ１３４９Ｒ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の変異を含むＣａｓ９ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＳａＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＳａＣａｓ９ポリペプチドは、野生型ＳａＣａｓ９（例えば、配列番号５９６）と比較して変異Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、及びＲ１０１５Ｈのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＦｎＣａｓ９ポリペプチド、例えば、野生型ＦｎＣａｓ９ポリペプチドまたは野生型ＦｎＣａｓ９と比較して変異Ｅ１３６９Ｒ、Ｅ１４４９Ｈ、またはＲ１５５６Ａのうちの１つ以上を含むＦｎＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＳｃＣａｓ９、例えば、野生型ＳｃＣａｓ９を含み、またはＳｃＣａｓ９ポリペプチドは、野生型ＳｃＣａｓ９と比較して変異Ｉ３６７Ｋ、Ｇ３６８Ｄ、Ｉ３６９Ｋ、Ｈ３７１Ｌ、Ｔ３７５Ｓ、Ｔ３７６Ｇ、及びＴ１２２７Ｋのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｓｔ１ Ｃａｓ９ポリペプチド、Ｓｔ３ Ｃａｓ９ポリペプチド、またはＳｌｕ Ｃａｓ９ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、循環置換Ｃａｓバリアントを含むＣａｓポリペプチドを含む。例えば、プライムエディターのＣａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９ニッカーゼ）のＮ末端及びＣ末端が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化した場合にＤＮＡを結合させる能力を保持するように局所的に再配置されるように操作され得る。例示的な循環置換構成は、Ｎ末端－［元のＣ末端］－［元のＮ末端］－Ｃ末端であり得る。任意のバリアント、オルソログ、または天然に存在するＣａｓ９またはその同等物を含むＣａｓ９タンパク質のいずれかは、循環置換バリアントとして再構成され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライムエディターはまた、Ｃａｓ９以外のＣａｓタンパク質を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるプライムエディターは、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）ポリペプチドまたはその機能的バリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａポリペプチドは、Ｃａｓ１２ａポリペプチドのエンドヌクレアーゼドメインを低減または無効化する変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａポリペプチドは、Ｃａｓ１２ａニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓ１２ａポリペプチドと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）またはＣａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）ポリペプチドであるＣａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）またはＣａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）タンパク質と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ｂニッカーゼまたはＣａｓ１２ｃニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、Ｃａｓ１４ｃ、Ｃａｓ１４ｄ、Ｃａｓ１４ｅ、Ｃａｓ１４ｆ、Ｃａｓ１４ｇ、Ｃａｓ１４ｈ、Ｃａｓ１４ｕ、またはＣａｓΦポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、Ｃａｓ１４ｃ、Ｃａｓ１４ｄ、Ｃａｓ１４ｅ、Ｃａｓ１４ｆ、Ｃａｓ１４ｇ、Ｃａｓ１４ｈ、Ｃａｓ１４ｕ、またはＣａｓΦタンパク質と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１３、またはＣａｓΦニッカーゼである。
フラップエンドヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、追加のポリペプチド成分、例えば、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ、例えば、ＦＥＮ１）をさらに含む。いくつかの実施形態では、フラップエンドヌクレアーゼは、二本鎖標的ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子）の編集鎖の５’一本鎖ＤＮＡを切除し、二本鎖標的ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子）への意図されるヌクレオチド編集の組み込みを補助する。いくつかの実施形態では、ＦＥＮは、別の成分に連結または融合される。いくつかの実施形態では、ＦＥＮは、トランスで、例えば、ＦＥＮをコードする別々のポリペプチドまたはポリヌクレオチドとして提供される。
いくつかの実施形態では、プライムエディターまたはプライム編集組成物は、フラップヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、フラップヌクレアーゼは、ＦＥＮ１、またはその任意のＦＥＮ１機能的バリアント、機能的変異体、もしくは機能的断片である。いくつかの実施形態では、フラップヌクレアーゼは、本明細書に記載されているまたは当該技術分野で知られているフラップヌクレアーゼのいずれかと少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一であるアミノ酸配列を有する。
核局在化配列
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、細胞核へのタンパク質の転座の促進を補助する。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、１つ以上のＮＬＳを含む融合タンパク質、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターの１つ以上のポリペプチドは、１つ以上のＮＬＳに融合または連結される。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、トランスで提供されるＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、ＤＮＡ結合ドメイン及び／またはＤＮＡポリメラーゼドメインは、１つ以上のＮＬＳに融合または連結されている。
所定の実施形態では、プライムエディターまたはプライム編集複合体は、少なくとも１つのＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターまたはプライム編集複合体は、少なくとも２つのＮＬＳを含む。少なくとも２つのＮＬＳを有する実施形態では、ＮＬＳは、同じＮＬＳであり得、またはそれらは、異なるＮＬＳであり得る。
いくつかの例では、プライムエディターは、少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含み得る。いくつかの場合では、プライムエディターは、１つのＮＬＳをさらに含み得る。いくつかの場合では、プライムエディターは、２つのＮＬＳをさらに含み得る。
また、ＮＬＳは、プライムエディター複合体の一部として発現し得る。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、タンパク質のアミノ酸配列におけるほぼ任意の場所に位置し得、通常、３つ以上または４つ以上のアミノ酸の短い配列を含む。ＮＬＳ融合体の位置は、Ｎ末端、Ｃ末端であるか、またはプライムエディターまたはその成分の配列内の任意の場所に位置し得る（例えば、Ｎ末端からＣ末端またはＣ末端からＮ末端のいずれかの順序で、プライムエディター融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡポリメラーゼドメインとの間、ＤＮＡ結合ドメインとリンカー配列との間、ＤＮＡポリメラーゼとリンカー配列との間、プライムエディター融合タンパク質またはその成分の２つのリンカー配列の間で挿入される）。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｎ末端でＮＬＳを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｃ末端でＮＬＳを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｎ末端及びＣ末端の両方で少なくとも１つのＮＬＳを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｎ末端及び／またはＣ末端で２つのＮＬＳを含む融合タンパク質である。
当該技術分野で知られている任意のＮＬＳも本明細書で企図される。ＮＬＳは、任意の天然に存在するＮＬＳ、または任意の天然に存在しないＮＬＳ（例えば、野生型ＮＬＳと比べて１つ以上の変異を有するＮＬＳ）であり得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターの１つ以上のＮＬＳは、双節型ＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、主に塩基性である。いくつかの実施形態では、プライムエディターの１つ以上のＮＬＳは、リジン及びアルギニン残基に富む。いくつかの実施形態では、プライムエディターの１つ以上のＮＬＳは、プロリン残基を含む。いくつかの実施形態では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、配列ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号１６）、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１）を含む。
いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、単節型ＮＬＳである。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ；ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１２）である。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、双節型ＮＬＳである。いくつかの実施形態では、双節型ＮＬＳは、可変数のアミノ酸を含むスペーサー配列によって隔てられた２つの塩基性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、双節型ＮＬＳである。いくつかの実施形態では、双節型ＮＬＳは、可変数のアミノ酸を含むスペーサー配列によって隔てられた２つの塩基性ドメインからなる。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号８～２４及び６２１のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、８～２４及び６２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、配列番号８～２４及び６２１のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＮＬＳをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、８～２４及び６２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＮＬＳをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチド）は、配列番号６３７、６３８、６３１または６３２のいずれか１つの核酸配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）は、配列番号６３７、または６３１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）は、配列番号６３８、または６３２のいずれか１つの核酸配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
当該技術分野で知られている任意のＮＬＳも本明細書で企図される。ＮＬＳは、任意の天然に存在するＮＬＳ、または任意の天然に存在しないＮＬＳ（例えば、野生型ＮＬＳと比べて１つ以上の変異を有するＮＬＳ）であり得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターの１つ以上のＮＬＳは、双節型ＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターの１つ以上のＮＬＳは、リジン及びアルギニン残基に富む。いくつかの実施形態では、プライムエディターの１つ以上のＮＬＳは、プロリン残基を含む。ＮＬＳ配列の非限定的な例が以下の表２に提供される。
Figure 2024525665000003
リンカー
プライムエディターの成分、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含むポリペプチドは、リンカー、例えば、ペプチドまたは非ペプチドリンカーを介して融合され得、または互いに対してトランスで提供され得る。例えば、逆転写酵素は、ＤＮＡ結合ドメインを有する融合タンパク質の一部ではなく個々の成分として発現され、送達され、またはそうでなければ提供され得る。そのような場合では、プライムエディターの成分は、非ペプチド結合または共局在化機能を介して会合され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、プライムエディターまたはプライム編集システムの他の成分と相互作用し、会合することが可能である、またはそれを動員することが可能である追加の成分をさらに含む。例えば、プライムエディターは、ＲＮＡ－タンパク質動員ＲＮＡアプタマーと会合し得るＲＮＡ－タンパク質動員ポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－タンパク質動員ポリペプチドは、特定のＲＮＡ配列を動員し、またはそれによって動員され得る。
ＲＮＡ－タンパク質動員ポリペプチド及びＲＮＡアプタマー対の非限定的な例には、ＭＳ２コートタンパク質及びＭＳ２ ＲＮＡヘアピン、ＰＣＰポリペプチド及びＰＰ７ ＲＮＡヘアピン、Ｃｏｍポリペプチド及びＣｏｍ ＲＮＡヘアピン、Ｋｕタンパク質及びテロメラーゼＫｕ結合ＲＮＡモチーフ、ならびにＳｍ７タンパク質及びテロメラーゼＳｍ７結合ＲＮＡモチーフが含まれる。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＲＮＡ－タンパク質動員ポリペプチドに融合または連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＲＮＡ－タンパク質動員ポリペプチドに融合または連結されたＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－タンパク質動員ポリペプチドに融合されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメイン、またはＲＮＡ－タンパク質動員ポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインに融合されたＤＮＡ結合ドメインは、ＲＮＡ－タンパク質動員ポリペプチドの対応するＲＮＡ－タンパク質動員ＲＮＡアプタマーによって共局在化される。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡの一部分に融合または連結された対応するＲＮＡ－タンパク質動員ＲＮＡアプタマー。例えば、ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡでガイドされるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）の共局在化のためのＤＮＡポリメラーゼに融合または連結されたＭＳ２コートタンパク質及びＰＥｇＲＮＡ上に導入されたＭＳ２ヘアピン。
所定の実施形態では、プライムエディターの成分は、互いに直接的に融合される。所定の実施形態では、プライムエディターの成分は、リンカーを介して互いに会合される。
本明細書で使用される場合、リンカーは、２つの分子または部位、例えば、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを連結させる任意の化学基または分子であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部位である。いくつかの実施形態では、リンカーは、非ペプチド部位を含む。リンカーは、共有結合のように単純であり得、またはそれは、長さがポリマー性リンカーの多くの原子、例えば、ポリヌクレオチド配列であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、共有結合（例えば、炭素－炭素結合、ジスルフィド結合、炭素－ヘテロ原子結合等）である。所定の実施形態では、リンカーは、アミド結合の炭素－窒素結合である。いくつかの実施形態では、リンカーは、長さがポリマー性リンカーの多くの原子、例えば、ポリペプチド配列である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、プライムエディターの２つのドメイン、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを接続させる。いくつかの実施形態では、リンカーは、プライムエディターの２つ以上のドメイン、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、ＤＮＡポリメラーゼドメイン、ＲＮＡ結合タンパク質ドメイン（例えば、ＭＳ２動員アプタマーＲＮＡ配列に結合するＭＳ２コートタンパク質）、及び／またはフラップヌクレアーゼドメインの各々、または少なくとも２つを接続させる。いくつかの実施形態では、リンカーは、プライムエディターの２つ以上のドメイン、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、ＤＮＡポリメラーゼドメイン、ＲＮＡ結合タンパク質ドメイン（例えば、ＭＳ２動員アプタマーＲＮＡ配列に結合するＭＳ２コートタンパク質）、フラップヌクレアーゼドメイン、及び／または１つ以上の核局在化配列の各々、または少なくとも２つを接続させる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸であり、または複数のアミノ酸を含むペプチドである。所定の実施形態では、プライムエディターの２つ以上の成分は、ペプチドリンカーによって互いに連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが５～１００アミノ酸、例えば、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、または１５０～２００アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３５、４５、５０、５５、６０、６０、６５、７０、７０、７５、８０、８５、９０、９０、９５、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７５、１８０、１９０、または２００アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが５～１００アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが１０～８０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが１５～７０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが１６アミノ酸、長さが２４アミノ酸、長さが６４アミノ酸、または長さが９６アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが少なくとも５０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが少なくとも４０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが少なくとも３０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが４６アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが９２アミノ酸である。
例えば、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインは、ペプチドまたはタンパク質リンカーによって接続され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼドメイン、及びＤＮＡポリメラーゼドメイン、例えば、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素ドメインを接続させる１つ以上のペプチドリンカーを含む融合タンパク質を含む。
いくつかの他の実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸モチーフＧＧＧＳ、ＧＧＳＳ、ＧＧＳ（配列番号２８７）、ＧＧＧＧＳ、ＳＧＧＳ（配列番号２８８）、ＥＡＡＡＫ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７６）、（Ｇ）ｎ（配列番号３７７）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号３７８）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号３７９）、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３８０）、（ＧＧＳＳ）ｎ（配列番号３８１）、（ＸＰ）ｎ（配列番号３８２）、またはそれらの任意の組み合わせ（式中、ｎは、独立して、１～３０の整数であり、Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＳ）ｎ（配列番号３７９）（式中、ｎは、１、３、または７である）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＸＴＥＮモチーフと称され得るアミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号２９５）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、または６個の連続するＸＴＥＮモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２９６）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３８３）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳ（配列番号２８８）を含む。他の実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＡＧＳＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＳＡＡＰＡＡＫＫＫＫＬＤＧＳＧＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号３８４）を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２個のＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも３個のＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも４個のＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも５個のＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも６個のＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも７個のＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも８個のＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも９個のＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２個の連続ＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも３個の連続ＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも４個の連続ＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも５個の連続ＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも６個の連続ＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも７個の連続ＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも８個の連続ＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも９個の連続ＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１個のＧＧＳモチーフをさらに含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１個のＧＧＳモチーフ及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１個のＧＧＳモチーフ及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＧＧＳモチーフ及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＧＧＳＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＧＧＳモチーフ及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ＧＧＳＳモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２個のＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも３個のＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも４個のＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも５個のＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも６個のＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも７個のＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも８個のＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも９個のＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも３個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも４個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも５個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも６個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも７個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも８個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも９個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１個のＧＧＳモチーフをさらに含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１個のＧＧＳモチーフ及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１個のＧＧＳモチーフ及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＧＧＳモチーフ及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＳＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＧＧＳモチーフ及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも３個のＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも４個のＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも５個のＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも６個のＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも７個のＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも８個のＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも９個のＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも３個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも４個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも５個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも６個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも７個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも８個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも９個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１個のＧＧＳモチーフをさらに含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１個のＧＧＳモチーフ及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１個のＧＧＳモチーフ及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＧＧＳモチーフ及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＥＡＡＡＫモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＧＧＳモチーフ及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＧＳＳ）ｍ－（ＧＧＳ）ｎ（式中、ｍ及びｎはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍ及びｎは、同じである。いくつかの実施形態では、ｍ及びｎは、異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３８５）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３８６）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３８７）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３８８）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３８９）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３９０）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３９１）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３９２）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３９３）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３９４）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３９５）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３９６）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３９７）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３９８）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号３９９）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号４００）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号４０１）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号４０２）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号４０３）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号４０４）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号４０５）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号４０６）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号４０７）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号４０８）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号４０９）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号４１０）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（配列番号４１１）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８６～４１１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
例示的なペプチドリンカー配列は、以下の表３に提供される：

Figure 2024525665000004
Figure 2024525665000005
Figure 2024525665000006
Figure 2024525665000007
いくつかの実施形態では、プライムエディターの２つ以上のポリペプチド成分は、非ペプチドリンカーによって互いに連結されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、非ペプチド部位を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミド結合の炭素－窒素結合である。所定の実施形態では、リンカーは、環状または非環状、置換または非置換、分岐状または非分岐状脂肪族またはヘテロ脂肪族リンカーである。所定の実施形態では、リンカーは、ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステル等）である。所定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカノール酸のモノマー、ダイマー、またはポリマーを含む。所定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカノール酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ－アラニン、３－アミノプロパン酸、４－アミノブタン酸、５－ペンタン酸等）を含む。所定の実施形態では、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）のモノマー、ダイマー、またはポリマーを含む。所定の実施形態では、リンカーは、炭素環式部位（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。他の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール部位（ＰＥＧ）を含む。所定の実施形態では、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部位を含む。所定の実施形態では、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーには、ペプチドからリンカーへの求核試薬（例えば、チオール、アミノ）の結合を容易化するための官能化部位が含まれ得る。任意の求電子剤が、リンカーの一部として使用され得る。例示的な求電子剤には、活性化エステル、活性化アミド、マイケル受容体、アルキルハライド、アリールハライド、アシルハライド、及びイソチオシアネートが含まれるがこれらに限定されない。
プライムエディターの成分は、互いに任意の順序で接続され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインは、Ｎ末端からＣ末端への任意の順序で、融合タンパク質を形成するために融合され得、またはペプチドまたはタンパク質リンカーによって接続され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＣ末端に融合または連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＮ末端に融合または連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、構造ＮＨ２－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＤＮＡポリメラーゼ］－ＣＯＯＨ；またはＮＨ２－［ポリメラーゼ］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－ＣＯＯＨを含む融合タンパク質であって、「］－［」の各場合は、任意のリンカー配列の存在を示す、融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、トランスで提供される融合タンパク質及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、融合タンパク質は、構造ＮＨ２－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＲＮＡ－タンパク質動員ポリペプチド］－ＣＯＯＨを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、トランスで提供される融合タンパク質及びＤＮＡ結合ドメインを含み、融合タンパク質は、構造ＮＨ２－［ＤＮＡポリメラーゼドメイン］－［ＲＮＡ－タンパク質動員ポリペプチド］－ＣＯＯＨを含む。
また、ＮＬＳは、プライムエディター組成物、融合タンパク質、または複合体の一部として表され得る。ＮＬＳ融合体の位置は、Ｎ末端、Ｃ末端であるか、またはプライムエディターまたはその成分の配列内の任意の場所に位置し得る（例えば、Ｎ末端からＣ末端またはＣ末端からＮ末端のいずれかの順序で、プライムエディター融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡポリメラーゼドメインとの間、ＤＮＡ結合ドメインとリンカー配列との間、ＤＮＡポリメラーゼとリンカー配列との間、プライムエディター融合タンパク質またはその成分の２つのリンカー配列の間で挿入される）。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｎ末端でＮＬＳを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｃ末端でＮＬＳを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｎ末端及びＣ末端の両方で少なくとも１つのＮＬＳを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｎ末端及び／またはＣ末端で２つのＮＬＳを含む融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、プライム編集は、１つ以上のペプチドリンカー及び１つ以上のＮＬＳを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、１つ以上の双節型ＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、１つ以上の双節型ＮＬＳ及び１つ以上のペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、２つの双節型ＮＬＳ及び１つ以上のペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の双節型ＮＬＳは、ｃｍｙｃ双節型ＮＬＳである。いくつかの実施形態では、２つの双節型ＮＬＳは、それぞれ、プライムエディター融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端にある。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、双節型ＮＬＳ及びＸＴＥＮリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、２つの双節型ＮＬＳ及びＸＴＥＮリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、双節型ＮＬＳ及び（ＧＧＳＳ）モチーフを含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、２つの双節型ＮＬＳ及び（ＧＧＳＳ）モチーフを含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、双節型ＮＬＳ及び１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれを超える（ＧＧＳＳ）モチーフを含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、２つの双節型ＮＬＳ及び１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれを超える（ＧＧＳＳ）モチーフを含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、双節型ＮＬＳ及び１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれを超える（ＥＡＡＡＫ）モチーフを含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、２つの双節型ＮＬＳ及び１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれを超える（ＥＡＡＡＫ）モチーフを含むペプチドリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｎ末端からＣ末端へ以下の構造：［ＮＬＳ］－［Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）］－［ペプチドリンカー］－［ＭＭＬＶ＿ＲＴ（Ｄ２００Ｎ）（Ｔ３３０Ｐ）（Ｌ６０３Ｗ）（Ｔ３０６Ｋ）（Ｗ３１３Ｆ）］（アミノ酸置換は、括弧内に示されている）を有するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ））及び逆転写酵素（例えば、バリアントＭＭＬＶ ＲＴ）を含む融合タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、Ｎ末端からＣ末端へ構造：
［ＮＬＳ１］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ペプチドリンカー］－［逆転写酵素］；
［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ペプチドリンカー］－［逆転写酵素］－［ＮＬＳ１］；
［ＮＬＳ１］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ペプチドリンカー］－［逆転写酵素］－［ＮＬＳ２］；
［ＮＬＳ１］－［ＮＬＳ２］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ペプチドリンカー］－［逆転写酵素］－［ＮＬＳ］；
［ＮＬＳ１］－［ＮＬＳ２］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ペプチドリンカー］－［逆転写酵素］－［ＮＬＳ３］－［ＮＬＳ４］；
［ＮＬＳ１］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ペプチドリンカー］－［逆転写酵素］－［ＮＬＳ２］－［ＮＬＳ３］；
［ＮＬＳ１］－［ＮＬＳ２］－［ＮＬＳ３］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ペプチドリンカー］－［逆転写酵素］－［ＮＬＳ４］；
［ＮＬＳ１］－［ＮＬＳ２］－［ＮＬＳ３］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ペプチドリンカー］－［逆転写酵素］－［ＮＬＳ４］－［ＮＬＳ５］；
［ＮＬＳ１］－［ＮＬＳ２］－［ＮＬＳ３］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ペプチドリンカー］－［逆転写酵素］－［ＮＬＳ４］－［ＮＬＳ５］－［ＮＬＳ６］；
［ＮＬＳ１］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ペプチドリンカー］－［逆転写酵素］－［ＮＬＳ２］－［ＮＬＳ３］－［ＮＬＳ４］；
［ＮＬＳ１］－［ＮＬＳ２］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ペプチドリンカー］－［逆転写酵素］－［ＮＬＳ３］－［ＮＬＳ４］－［ＮＬＳ５］；
［ＮＬＳ１］－［逆転写酵素］－［ペプチドリンカー］－［ＤＮＡ結合ドメイン］；
［逆転写酵素］－［ペプチドリンカー］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＮＬＳ１］；
［ＮＬＳ１］－［逆転写酵素］－［ペプチドリンカー］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＮＬＳ２］；
［ＮＬＳ１］－［ＮＬＳ２］－［逆転写酵素］－［ペプチドリンカー］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＮＬＳ］；
［ＮＬＳ１］－［ＮＬＳ２］－［逆転写酵素］－［ペプチドリンカー］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＮＬＳ３］－［ＮＬＳ４］；
［ＮＬＳ１］－［逆転写酵素］－［ペプチドリンカー］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＮＬＳ２］－［ＮＬＳ３］；
［ＮＬＳ１］－［ＮＬＳ２］－［ＮＬＳ３］－［逆転写酵素］－［ペプチドリンカー］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＮＬＳ４］；
［ＮＬＳ１］－［ＮＬＳ２］－［ＮＬＳ３］－［逆転写酵素］－［ペプチドリンカー］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＮＬＳ４］－［ＮＬＳ５］；
［ＮＬＳ１］－［ＮＬＳ２］－［ＮＬＳ３］－［逆転写酵素］－［ペプチドリンカー］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＮＬＳ４］－［ＮＬＳ５］－［ＮＬＳ６］；
［ＮＬＳ１］－［逆転写酵素］－［ペプチドリンカー］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＮＬＳ２］－［ＮＬＳ３］－［ＮＬＳ４］；または
［ＮＬＳ１］－［ＮＬＳ２］－［逆転写酵素］－［ペプチドリンカー］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＮＬＳ３］－［ＮＬＳ４］－［ＮＬＳ５］
を含む融合タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：
［ＮＬＳ］ｎ－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ペプチドリンカー］－［逆転写酵素］－［ＮＬＳ］ｍ、または［ＮＬＳ］ｎ－［逆転写酵素］－［ペプチドリンカー］－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［ＮＬＳ］ｍ（式中、ｎ及びｍは、０～５０の任意の整数であり、［ＮＬＳ］ｎは、ｎ個のＮＬＳモチーフ配列であり、［ＮＬＳ］ｍは、ｍ個のＮＬＳモチーフ配列を指す）を含む。ｎ個のＮＬＳモチーフ配列は、同じである場合があり、同じではない場合がある。いくつかの実施形態では、ｍ及びｎは、同じである。いくつかの実施形態では、ｎ及びｍは、異なる。
ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載されているまたは当該技術分野で知られているＤＮＡポリメラーゼのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＨＮＨドメインにおけるヌクレアーゼ不活性化アミノ酸置換を含むｎＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＳｐＣａｓ９と比較してＨ８４０Ａアミノ酸置換を含むｎＣａｓ９である。
逆転写酵素は、本明細書に記載されているまたは当該技術分野で知られている逆転写酵素のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴである。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、本明細書に記載されるアミノ酸置換または切断のいずれか１つを有するＭ－ＭＬＶ ＲＴ機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、。
いくつかの実施形態では、ＮＬＳ１、ＮＬＳ２、ＮＬＳ３、ＮＬＳ４、ＮＬＳ５、ＮＬＳ６のいずれか１つは、独立して、当該技術分野で知られているまたは本明細書に記載されるＮＬＳである。いくつかの実施形態では、ＮＬＳ１、ＮＬＳ２、ＮＬＳ３、ＮＬＳ４、ＮＬＳ５、ＮＬＳ６のいずれか１つは、双節型ＮＬＳである。いくつかの実施形態では、ＮＬＳ１、ＮＬＳ２、ＮＬＳ３、ＮＬＳ４、ＮＬＳ５、ＮＬＳ６のいずれか１つは、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１９）を含むｃ－Ｍｙｃ ＮＬＳである。いくつかの実施形態では、ＮＬＳ１、ＮＬＳ２、ＮＬＳ３、ＮＬＳ４、ＮＬＳ５、ＮＬＳ６のいずれか１つは、単節型ＮＬＳである。いくつかの実施形態では、ＮＬＳ１、ＮＬＳ２、ＮＬＳ３、ＮＬＳ４、ＮＬＳ５、ＮＬＳ６のいずれか１つは、ＳＶ４０ＮＬＳである。
いくつかの実施形態では、ＮＬＳ１～６の２つ以上は、同じである。いくつかの実施形態では、ＮＬＳ１～６は、互いに異なる。
プライムエディター構造のいずれかでは、ペプチドリンカーは、本明細書に記載されているまたは当該技術分野で知られている任意のペプチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）ｍ－（ＧＧＳ）ｎ（式中、ｍ及びｎはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳ）ｎ－（ＧＧＳＳ）ｍ（式中、ｍ及びｎはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）を含む。いくつかの実施形態では、ｍ及びｎは、同じである。いくつかの実施形態では、ｍ及びｎは、異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）６－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）７－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）８－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）９－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）１０－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）１１－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）１２－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）１３－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）１４－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）１５－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）１１を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）１２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）１３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）１４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）１５を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＧＧＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＧＧＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＧＧＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）６－（ＧＧＳ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）７－（ＧＧＳ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）８－（ＧＧＳ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）９－（ＧＧＳ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）１０－（ＧＧＳ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）１１－（ＧＧＳ）１１を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）１２－（ＧＧＳ）１２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）１３－（ＧＧＳ）１３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）１４－（ＧＧＳ）１４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へアミノ酸配列：（ＧＧＳＳ）１５－（ＧＧＳ）１５を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＧＳＳ）モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号２９５）を含むＸＴＥＮモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２つ以上の（ＧＧＳＳ）モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＸＴＥＮモチーフ及び（ＧＧＳＳ）モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１つ以上のＸＴＥＮモチーフ及び２つ以上の（ＧＧＳＳ）モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２つ以上のＸＴＥＮモチーフ及び２つ以上の（ＧＧＳＳ）モチーフを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上または２つ以上のＸＴＥＮモチーフは、ペプチドリンカーのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、１つ以上または２つ以上のＸＴＥＮモチーフは、ペプチドリンカーのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、１つ以上または２つ以上の（ＧＧＳＳ）は、ペプチドリンカーのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、１つ以上または２つ以上の（ＧＧＳＳ）は、ペプチドリンカーのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、各末端で（ＧＧＳＳ）モチーフと隣接する１つ以上のＸＴＥＮモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、各末端で（ＧＧＳＳ）モチーフと隣接する２つ以上のＸＴＥＮモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）ｎ－（ＸＴＥＮ）ｍ－（ＧＧＳＳ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、及びｗは、同じであり、またはｍ、ｎ、及びｗのうちの２つは、同じである。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、及びｗはそれぞれ、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）１－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）６－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）６－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）６－（ＸＴＥＮ）６－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）６－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）６－（ＧＧＳＳ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）６－（ＸＴＥＮ）６－（ＧＧＳＳ）６を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）７－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）７－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）７－（ＸＴＥＮ）７－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）７－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）７－（ＧＧＳＳ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）７－（ＸＴＥＮ）７－（ＧＧＳＳ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）８－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）８－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）８－（ＸＴＥＮ）８－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）８－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）８－（ＧＧＳＳ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）８－（ＸＴＥＮ）８－（ＧＧＳＳ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）９－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）９－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）９－（ＸＴＥＮ）９－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）９－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）９－（ＧＧＳＳ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）９－（ＸＴＥＮ）９－（ＧＧＳＳ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）１０－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）１０－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）１０－（ＸＴＥＮ）１０－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）１０－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）１０－（ＧＧＳＳ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）１０－（ＸＴＥＮ）１０－（ＧＧＳＳ）１０を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）６－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）６－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）６－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）６－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）６－（ＸＴＥＮ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）７－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）７－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）７－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）７－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）７－（ＸＴＥＮ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）８－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）８－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）８－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）８－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）８－（ＸＴＥＮ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）９－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）９－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）９－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）９－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）９－（ＸＴＥＮ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）１０－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）１０－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）１０－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）１０－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）１０－（ＸＴＥＮ）５を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）１０－を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）１０を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）ｎ（式中、ｎは、０～５０の任意の整数である）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）１１を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）１２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）１３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）１４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）１５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）１６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）１７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）１８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）１９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳＳ）２０を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＳＳモチーフ、ＸＴＥＮモチーフ、及びＧＧＳモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）ｎ－（ＸＴＥＮ）ｍ－（ＧＧＳ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｎ、ｍ、及びｗは、同じ整数である。いくつかの実施形態では、ｎ、ｍ、及びｗはそれぞれ、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）ｎ－（ＸＴＥＮ）ｍ－（ＧＧＳＳ）ｘ－（ＧＧＳ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｎ、ｍ、ｘ、及びｗは、同じ整数である。いくつかの実施形態では、ｎ、ｍ、ｘ、及びｗはそれぞれ、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳ）３を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳ）５を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）２－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）２－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）２－（ＸＴＥＮ）２－（ＧＧＳＳ）２－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）３－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）３－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）３－（ＸＴＥＮ）３－（ＧＧＳＳ）３－（ＧＧＳ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）４－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）４－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）４－（ＸＴＥＮ）４－（ＧＧＳＳ）４－（ＧＧＳ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、
Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）５－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）－（ＸＴＥＮ）－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）５－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）５－（ＸＴＥＮ）５－（ＧＧＳＳ）５－（ＧＧＳ）５を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＥＡＡＡＫ）モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２つ以上の（ＥＡＡＡＫ）モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＸＴＥＮモチーフ及び（ＥＡＡＡＫ）モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１つ以上のＸＴＥＮモチーフ及び２つ以上の（ＥＡＡＡＫ）モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２つ以上のＸＴＥＮモチーフ及び２つ以上の（ＥＡＡＡＫ）モチーフを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上または２つ以上のＸＴＥＮモチーフは、ペプチドリンカーのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、１つ以上または２つ以上のＸＴＥＮモチーフは、ペプチドリンカーのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、１つ以上または２つ以上の（ＥＡＡＡＫ）モチーフは、ペプチドリンカーのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、１つ以上または２つ以上の（ＥＡＡＡＫ）モチーフは、ペプチドリンカーのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、各末端で（ＥＡＡＡＫ）モチーフと隣接する１つ以上のＸＴＥＮモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、各末端で（ＥＡＡＡＫ）モチーフと隣接する２つ以上のＸＴＥＮモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）ｎ－（ＸＴＥＮ）ｍ－（ＥＡＡＡＫ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、及びｗは、同じであり、またはｍ、ｎ、及びｗのうちの２つは、同じである。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、及びｗはそれぞれ、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）２－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）２－（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）２－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）２－（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）３－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）３－（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）３－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）１－（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）２－（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）２－（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）３－（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）３－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）３－（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）４－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）４－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）４－（ＸＴＥＮ）４－（ＥＡＡＡＫ）を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）４－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）４－（ＥＡＡＡＫ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）４－（ＸＴＥＮ）４－（ＥＡＡＡＫ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）５－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）５－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）５－（ＸＴＥＮ）５－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）５－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）５－（ＥＡＡＡＫ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）５－（ＸＴＥＮ）５－（ＥＡＡＡＫ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）６－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）６－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）６－（ＸＴＥＮ）６－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）６－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）６－（ＥＡＡＡＫ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）６－（ＸＴＥＮ）６－（ＥＡＡＡＫ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）７－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）７－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）７－（ＸＴＥＮ）７－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）７－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）７－（ＥＡＡＡＫ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）７－（ＸＴＥＮ）７－（ＥＡＡＡＫ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）８－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）８－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）８－（ＸＴＥＮ）８－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）８－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）８－（ＥＡＡＡＫ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）８－（ＸＴＥＮ）８－（ＥＡＡＡＫ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）９－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）９－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）９－（ＸＴＥＮ）９－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）９－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）９－（ＥＡＡＡＫ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）９－（ＸＴＥＮ）９－（ＥＡＡＡＫ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）１０－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）１０－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）１０－（ＸＴＥＮ）１０－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）１０－（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）１０－（ＥＡＡＡＫ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）１０－（ＸＴＥＮ）１０－（ＥＡＡＡＫ）１０を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）２－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）２－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）３－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）３－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）３－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）４－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）４－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）４－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）４－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）５－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）５－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）５－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）５－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）５－（ＸＴＥＮ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）６－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）６－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）６－（ＸＴＥＮ）３を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）６－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）６－（ＸＴＥＮ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）７－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）７－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）７－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）７－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）７－（ＸＴＥＮ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）８－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）８－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）８－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）８－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）８－（ＸＴＥＮ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）９－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）９－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）９－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）９－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）９－（ＸＴＥＮ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）１０－（ＸＴＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）１０－（ＸＴＥＮ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）１０－（ＸＴＥＮ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）１０－（ＸＴＥＮ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）１０－（ＸＴＥＮ）５を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＥＡＡＡＫ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＥＡＡＡＫ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）５－（ＥＡＡＡＫ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）６を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＥＡＡＡＫ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）５－（ＥＡＡＡＫ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＥＡＡＡＫ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）５－（ＥＡＡＡＫ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＥＡＡＡＫ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）５－（ＥＡＡＡＫ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＥＡＡＡＫ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）５－（ＥＡＡＡＫ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）－（ＥＡＡＡＫ）１０－を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）２－（ＥＡＡＡＫ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）３－（ＥＡＡＡＫ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）４－（ＥＡＡＡＫ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）５－（ＥＡＡＡＫ）１０を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）ｎ（式中、ｎは、０～５０の任意の整数である）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）１１を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）１２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）１３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）１４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）１５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）１６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）１７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）１８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）１９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）２０を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）ｎ－Ａ（式中、ｎは、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）２－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）３－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）４－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）５－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）６－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）７－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）８－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）９－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）１０－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）１１－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）１２－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）１３－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）１４－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）１５－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）１６－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）１７－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）１８－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）１９－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：Ａ－（ＥＡＡＡＫ）２０－Ａを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）ｎ－ＳＧＧＳ（式中、ｎは、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）２－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）３－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）４－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）５－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）６－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）７－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）８－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）９－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）１０－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）１１－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）１２－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）１３－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）１４－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）１５－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）１６－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）１７－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）１８－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）１９－ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）２０－ＳＧＧＳを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）ｎ－（ＥＡＡＡＫ）ｍ－（ＧＧＳ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、及びｗは、同じであり、またはｍ、ｎ、及びｗのうちの２つは、同じである。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、及びｗはそれぞれ、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）２－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）３－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）４－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）５－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）６－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）７－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）８－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）９－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）１０－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）１１－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）１２－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）１３－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）１４－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＥＡＡＡＫ）１５－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）２－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）３－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）４－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）５－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）６－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）７－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）８－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）９－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）１０－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）１１－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）１２－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）１３－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）１４－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＥＡＡＡＫ）１５－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）ｎ－（ＸＴＥＮ）ｍ－（ＥＡＡＡＫ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳＳ）ｎ－（ＥＡＡＡＫ）ｍ－（ＸＴＥＮ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）ｎ－（ＸＴＥＮ）ｍ－（ＧＧＳＳ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＥＡＡＡＫ）ｎ－（ＧＧＳＳ）ｍ－（ＸＴＥＮ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）ｎ－（ＧＧＳＳ）ｍ－（ＥＡＡＡＫ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＸＴＥＮ）ｎ－（ＥＡＡＡＫ）ｍ－（ＧＧＳＳ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、及びｗは、同じであり、またはｍ、ｎ、及びｗのうち２つが同じである。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、及びｗはそれぞれ、互いに異なる。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）ｎ（式中、ｎは、０～５０の任意の整数である）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）１０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）１１を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）１２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）１３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）１４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）１５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）１６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）１７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）１８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）１９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列（ＰＡＰＡ）２０を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）ｎ－（ＰＡＰＡ）ｍ－（ＧＧＳ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、及びｗは、同じであり、またはｍ、ｎ、及びｗのうちの２つは、同じである。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、及びｗはそれぞれ、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）２－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）３－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）４－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）５－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）６－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）７－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）８－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）９－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）１０－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）１１－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）１２－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）１３－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）１４－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）１５－（ＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）２－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）３－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）４－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）５－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）６－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）７－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）８－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）９－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）１０－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）１１－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）１２－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）１３－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）１４－（ＧＧＳ）２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）２－（ＰＡＰＡ）１５－（ＧＧＳ）２を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）ｎ－（ＰＡＰＡ）ｍ－（ＰＳＧＧＳ）ｗ（式中、ｎ、ｍ、ｗはそれぞれ、０～５０の任意の整数である）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、及びｗは、同じであり、またはｍ、ｎ、及びｗのうちの２つは、同じである。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、及びｗはそれぞれ、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）２－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）３－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）４－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）５－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）６－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）７－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）８－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）９－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）１０－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）１１－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）１２－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）１３－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）１４－（ＰＳＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端からＣ末端へ配列：（ＧＧＳ）－（ＰＡＰＡ）１５－（ＰＳＧＧＳ）を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８６～４１１からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８９～３１１からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８９～３１１からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３０２と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３０９と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３０２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３０９の配列を含む。
核局在化シグナル
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｃ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端で第１のＮＬＳ及びＣ末端で第２のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では第１及び第２のＮＬＳは、同一である。いくつかの実施形態では第１及び第２のＮＬＳは、同一ではない。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＮ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＮ末端で第１のＮＬＳ及びＤＮＡ結合ドメインのＣ末端で第２のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＮ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＣ末端で第１のＮＬＳ及びＤＮＡ結合ドメインＮ末端で第２のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では第１及び第２のＮＬＳは、同一である。いくつかの実施形態では第１及び第２のＮＬＳは、同一ではない。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＣ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、２つ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端及び／またはＣ末端で２つ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡポリメラーゼドメインとの間でＮＬＳを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列ＭＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９）を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列（ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ）ｎ（式中、ｎは、０～５０、１～５０、２～４０、２～２５、２～１０、または２～５の任意の整数である）を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列ＭＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１５）を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列（ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ）ｎ（式中、ｎは、０～５０、１～５０、２～４０、２～２５、２～１０、または２～５の任意の整数である）を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｃ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｃ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列（ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ）ｎ（式中、ｎは、０～５０、１～５０、２～４０、２～２５、２～１０、または２～５の任意の整数である）を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｃ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｃ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列（ＰＫＫＫＲＫＶ）ｎ（式中、ｎは、０～５０、１～５０、２～４０、２～２５、２～１０、または２～５の任意の整数である）を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｃ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶ－ＥＦＥＳ－ＰＫＫＫＲＫＶを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｃ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列（ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶ－ＥＦＥＳ－ＰＫＫＫＲＫＶ）ｎ（式中、ｎは、０～５０、１～５０、２～４０、２～２５、２～１０、または２～５の任意の整数である）を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｃ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶ－ＥＦＥ－ＰＫＫＫＲＫＶを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｃ末端でＮＬＳを含み、ＮＬＳは、配列（ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶ－ＥＦＥ－ＰＫＫＫＲＫＶ）ｎ（式中、ｎは、０～５０、１～５０、２～４０、２～２５、２～１０、または２～５の任意の整数である）を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端で１つ以上のＮＬＳ及びＣ末端で１つ以上のＮＬＳを含み、Ｎ末端におけるＮＬＳは、配列ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶを含み、Ｃ末端におけるＮＬＳは、配列ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端で１つ以上のＮＬＳ及びＣ末端で１つ以上のＮＬＳを含み、Ｎ末端におけるＮＬＳは、配列ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶを含み、Ｃ末端におけるＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端で１つ以上のＮＬＳ及びＣ末端で１つ以上のＮＬＳを含み、Ｎ末端におけるＮＬＳは、配列ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶを含み、Ｃ末端におけるＮＬＳは、配列ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶ－ＥＦＥＳ－ＰＫＫＫＲＫＶを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端で１つ以上のＮＬＳ及びＣ末端で１つ以上のＮＬＳを含み、Ｎ末端におけるＮＬＳは、配列ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶを含み、Ｃ末端におけるＮＬＳは、配列ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶ－ＥＦＥ－ＰＫＫＫＲＫＶを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端で１つ以上のＮＬＳ及びＣ末端で１つ以上のＮＬＳを含み、Ｎ末端におけるＮＬＳは、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶを含み、Ｃ末端におけるＮＬＳは、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端で１つ以上のＮＬＳ及びＣ末端で１つ以上のＮＬＳを含み、Ｎ末端におけるＮＬＳは、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶを含み、Ｃ末端におけるＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端で１つ以上のＮＬＳ及びＣ末端で１つ以上のＮＬＳを含み、Ｎ末端におけるＮＬＳは、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶを含み、Ｃ末端におけるＮＬＳは、配列ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶ－ＥＦＥＳ－ＰＫＫＫＲＫＶを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端で１つ以上のＮＬＳ及びＣ末端で１つ以上のＮＬＳを含み、Ｎ末端におけるＮＬＳは、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶを含み、Ｃ末端におけるＮＬＳは、配列ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶ－ＥＦＥ－ＰＫＫＫＲＫＶを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－（ＧＧＳＳ）２－ＸＴＥＮ－（ＧＧＳＳ２）－逆転写酵素－ＢＰＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－（ＳＧＧＳ）８－逆転写酵素－ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ１を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－（ＳＧＧＳ）８－逆転写酵素（Ｇ５０４Ｘ）－ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ１を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－（ＧＧＳＳ）２－ＸＴＥＮ－（ＧＧＳＳ２）－逆転写酵素－ＢＰＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）４－ＳＧＧＳ－逆転写酵素－ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ１を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－ＳＧＧＳ－（ＥＡＡＡＫ）４－ＳＧＧＳ－逆転写酵素（Ｇ５０４Ｘ）－ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ１を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：ｃ－ＭｙｃＮＬＳ－ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－（ＳＧＧＳ）８－逆転写酵素－ＢＰＮＬＳ－ＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：Ｃ－ｍｙｃＮＬＳ－ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－（ＳＧＧＳ）８－逆転写酵素－ＢＰＮＬＳ－ＳＶ４０ＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－（ＥＡＡＡＫ）８－逆転写酵素－ＢＰＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－（ＧＧＳＳ）２－ＸＴＥＮ－（ＧＧＳＳ）２－逆転写酵素－ＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－（ＧＧＳＳ）２－ＸＴＥＮ－（ＧＧＳＳ）２－逆転写酵素－ＳＶ４０ＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：Ｃ－ｍｙｃＮＬＳ－ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－（ＳＧＧＳ）８－逆転写酵素（Ｇ５０４Ｘ）－ＢＰＮＬＳ－ＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：Ｃ－ｍｙｃＮＬＳ－ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－（ＳＧＧＳ）８－逆転写酵素－ＢＰＮＬＳ－ＳＶ４０ＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ構造：Ｃ－ｍｙｃＮＬＳ－ＢＰＮＬＳ－ＤＮＡ結合ドメイン－（ＳＧＧＳ）８－逆転写酵素（Ｇ５０４Ｘ）－ＢＰＮＬＳ－ＮＬＳを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｃ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端で第１のＮＬＳ及びＣ末端で第２のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では第１及び第２のＮＬＳは、同一である。いくつかの実施形態では第１及び第２のＮＬＳは、同一ではない。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＮ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＮ末端で第１のＮＬＳ及びＤＮＡ結合ドメインのＣ末端で第２のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＮ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＣ末端で第１のＮＬＳ及びＤＮＡ結合ドメインＮ末端で第２のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では第１及び第２のＮＬＳは、同一である。いくつかの実施形態では第１及び第２のＮＬＳは、同一ではない。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼドメインのＣ末端でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、２つ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、Ｎ末端及び／またはＣ末端で２つ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡポリメラーゼドメインとの間でＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳまたは２つ以上のＮＬＳは、双節型ＮＬＳ（ＢＰＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＢＰＮＬＳは、双節型ＳＶ４０ ＮＬＳまたは双節型ＸｅｎｏｐｕｓヌクレオプラスミンＮＬＳである。いくつかの実施形態では、ＢＰＮＬＳは、配列番号８～２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質、プライムエディターのポリペプチド成分、またはプライムエディター融合タンパク質もしくはポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドは、Ｎ末端半分及びＣ末端半分またはＮ末端半分及びＣ末端半分をコードするポリペプチドに分割し、細胞において別々に標的ＤＮＡに提供され得る。例えば、所定の実施形態では、プライムエディター融合タンパク質は、ＡＡＶベクターにおいて別々の送達のためにＮ末端及びＣ末端半分に分割し、その後、標的細胞において翻訳及び共局在化されて、完全なポリペプチドまたはプライムエディタータンパク質を再形成し得る。そのような場合では、タンパク質または融合タンパク質の別々の半分はそれぞれ、インテイン容易化トランススプライシングのメカニズムによって完全なタンパク質または融合タンパク質の共局在化及び再形成を容易化するためにスプリットインテインを含み得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、インテイン－Ｎに融合されたＮ末端半分、及びインテイン－Ｃに融合されたＣ末端半分、またはその各々をコードするポリヌクレオチドもしくはベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む。標的細胞において送達及び／または発現させられる場合、インテイン－Ｎ及びインテイン－Ｃは、タンパク質トランス－スプライシングを介して切除され得、標的細胞における完全なプライムエディター融合タンパク質をもたらす。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７７、７８、８５、８６、９３、９６、９９、１０４、１０５、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、及び２３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号３４、３５、７７、７８、８５、８６、６２０、６２２、６２４、６２５、または６４７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２、６、７、または５９６～６１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号１、４、５、３６、４５、５４、６３、または６２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む逆転写酵素を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７９～８２、８７～９０、９４～９５、９７～９８、１００～１０３、１０６～１０９、１１２～１１５、１１８～１２１、１２３、１２４、１２６、１２７、１２９、１３０、１３２、１３３、１３５、１３６、１３８、１３９、１４４、１４５、１４７、１４８、１５０、１５１、１５３、１５４、１５６、１５７、１５９、１６０、１６２、１６３、１６５、１６６、１６８、１６９、１７１、１７２、１７４、１７５、１７７、１７８、１８０、１８１、１８３、１８４、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９５、１９６、１９８、１９９、２０１、２０２、２０４、２０５、２０７、２０８、２１０、２１１、２１３、２１４、２１６、２１７、２１９、２２０、２２２、２２３、２２５、２２６、２２８、２２９、２３１、２３２、２３３、２３４、２４１、２４２、２７４～２８５、及び５９２～５９５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号７９～８２、８７～９０、２７４～２８５、または５９２～５９５に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質である。
プライム編集ガイドＲＮＡ（ＰＥｇＲＮＡ）
用語「プライム編集ガイドＲＮＡ」、または「ＰＥｇＲＮＡ」は、二本鎖標的ポリヌクレオチド、例えば、二本鎖標的ＤＮＡへの組み込みのための１つ以上の意図されるヌクレオチド編集を含むガイドポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターと会合し、それをプライム編集を介して二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子に１つ以上の意図されるヌクレオチド編集を組み込むように誘導する。「ヌクレオチド編集」または「意図されるヌクレオチド編集」は、１つの特定の位置における１つ以上のヌクレオチドの特定の欠失、１つの特定の位置における１つ以上のヌクレオチドの挿入、単一のヌクレオチドの置換、または二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の配列に組み込まれる１つの特定の位置における他の改変を指す。意図されるヌクレオチド編集は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の標的鎖上の配列と比較した編集鋳型上の編集を指し得、または編集標的配列と比較して、編集標的配列を置き換える新しく合成された一本鎖ＤＮＡ上の編集鋳型によってコードされる編集を指し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の標的鎖上のサーチ標的配列に相補的または実質的に相補的であるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質ドメインと会合するｇＲＮＡコアを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の内因性配列と比較して１つ以上の意図されるヌクレオチド編集を含む伸長したヌクレオチド配列をさらに含み、伸長したヌクレオチド配列は、伸長アームと称され得る。
所定の実施形態では、伸長アームは、標的プライミング化ＤＮＡ合成を開始させ得るプライマー結合部位配列（ＰＢＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、プライムエディターによって生成されるニック部位で二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖上の遊離３’末端に相補的または実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、伸長アームは、プライム編集によって二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子に組み込まれる１つ以上の意図されるヌクレオチド編集を含む編集鋳型をさらに含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、プライムエディターのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼドメインまたはポリペプチド、例えば、逆転写酵素ドメインのための鋳型である。逆転写酵素編集鋳型はまた、本明細書でＲＴ鋳型、またはＲＴＴと称され得る。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における編集標的配列と部分的な相補性を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子に組み込まれる意図されるヌクレオチド編集の位置を除き、編集標的配列と実質的または部分的相補性を含む。ＰＥｇＲＮＡ（その成分を含む）の例示的な構成が図２に図示されている。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、ＲＮＡヌクレオチドのみを含み、ＲＮＡポリヌクレオチドを形成する。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、ＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドの両方を含むキメラポリヌクレオチドである。例えば、ＰＥｇＲＮＡには、スペーサー配列、ｇＲＮＡコア、または伸長アームにおいてＤＮＡが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、スペーサー配列においてＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡのスペーサー配列の全体が、ＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、ｇＲＮＡコアにおいて、例えば、ｇＲＮＡコアのステム領域においてＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、伸長アームにおいて、例えば、編集鋳型においてＤＮＡを含む。ＤＮＡ配列を含む編集鋳型は、プライムエディターにおけるＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのためのＤＮＡ合成鋳型として機能し得る。したがって、ＰＥｇＲＮＡは、スペーサー、ｇＲＮＡコア、及び／またはＰＢＳ配列におけるＲＮＡ及び編集鋳型におけるＤＮＡを含むキメラポリヌクレオチドであり得る。
ＰＥｇＲＮＡの成分は、モジュール様式で配置され得る。いくつかの実施形態では、スペーサーならびにプライマー結合部位配列（ＰＢＳ）及び編集鋳型、例えば、逆転写酵素鋳型（ＲＴＴ）を含む伸長アームは、ＰＥｇＲＮＡの５’部分、ＰＥｇＲＮＡの３’部分、またはｇＲＮＡコアの中央部において交換可能に位置し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、ＰＢＳ及び編集鋳型配列を５’から３’の順序で含む。いくつかの実施形態では、本開示のＰＥｇＲＮＡのｇＲＮＡコアは、ＰＥｇＲＮＡのスペーサーと伸長アームとの間に位置し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡのｇＲＮＡコアは、スペーサーの３’末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡのｇＲＮＡコアは、スペーサーの５’末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡのｇＲＮＡコアは、伸長アームの３’末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡのｇＲＮＡコアは、伸長アームの５’末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’から３’へ：スペーサー、ｇＲＮＡコア、及び伸長アームを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’から３’へ：スペーサー、ｇＲＮＡコア、編集鋳型、及びＰＢＳを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’から３’へ：伸長アーム、スペーサー、及びｇＲＮＡコアを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’から３’へ：編集標的、ＰＢＳ、スペーサー、及びｇＲＮＡコアを含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、スペーサー配列、ｇＲＮＡコア、及び伸長アームを含む単一のポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、複数のポリヌクレオチド分子、例えば、２つのポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、スペーサー及びｇＲＮＡコアの一部分を含む第１のポリヌクレオチド分子、ならびにｇＲＮＡコアの残部及び伸長アームを含む第２のポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド分子におけるｇＲＮＡコア部分及び第２のポリヌクレオチド分子におけるｇＲＮＡコア部分は、少なくとも部分的に互いに相補的である。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、スペーサー及びｇＲＮＡコアの第１の部分（ｃｒＲＮＡとも称され得る）を含む第１のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、ｇＲＮＡコアの第２の部分及び伸長アームを含む第２のポリヌクレオチドを含み、ｇＲＮＡコアの第２の部分は、トランス活性化ｃｒＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡとも称され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡコアのｃｒＲＮＡ部分及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、少なくとも部分的に互いに相補的である。いくつかの実施形態ではｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの部分的に相補的な部分は、図４に例示されるように、下部ステム、バルジ、及び上部ステムを形成する。
いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、ＡＴ７Ｂ遺伝子の標的鎖上のサーチ標的配列と実質的相補性を有する領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡのスペーサー配列は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖上のプロトスペーサー配列と同一または実質的に同一である（プロトスペーサー配列がチミンを含み、スペーサー配列がウラシルを含み得る場合を除く）。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子におけるサーチ標的配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相補的である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、サーチ標的配列と実質的に相補的である。
いくつかの実施形態では、スペーサーの長さは、少なくとも１０ヌクレオチド～１００ヌクレオチドまで可変である。例えば、スペーサーは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１１ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１３ヌクレオチド、少なくとも１４ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも９０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、長さが１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、または２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、長さが１５ヌクレオチド～３０ヌクレオチド、長さが１５～２５ヌクレオチド、長さが１８～２２ヌクレオチド、長さが１０～２０ヌクレオチド、長さが２０～３０ヌクレオチド、長さが３０～４０ヌクレオチド、長さが４０～５０ヌクレオチド、長さが５０～６０ヌクレオチド、長さが６０～７０ヌクレオチド、長さが７０～８０ヌクレオチド、または長さが９０ヌクレオチド～１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、長さが２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、長さが１７～１８ヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、ＰＥｇＲＮＡまたはニックガイドＲＮＡ配列、またはその断片、例えば、スペーサー、ＰＢＳ、またはＲＴＴ配列において、別途示されない限り、文字「Ｔ」または「チミン」は、ＰＥｇＲＮＡまたはガイドＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列における核酸塩基を示し、ＰＥｇＲＮＡまたはガイドＲＮＡのウラシル（Ｕ）核酸塩基または当該技術分野で知られている任意の化学的に修飾されたウラシル核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを指すことが意図されることが理解されるべきである。
ＰＥｇＲＮＡの伸長アームは、プライマー結合部位（ＰＢＳ）及び編集鋳型（例えば、ＲＴＴ）を含み得る。伸長アームは、スペーサーと部分的に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、編集鋳型（例えば、ＲＴＴ）は、スペーサーと部分的に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、編集鋳型（例えば、ＲＴＴ）及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）はそれぞれ、スペーサーと部分的に相補的である。
ＰＥｇＲＮＡの伸長アームは、プライムエディターでのニッキングによって生成される二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における一本鎖ＤＮＡの遊離３’末端とハイブリダイズするプライマー結合部位配列（ＰＢＳ、またはＰＢＳ配列）を含み得る。ＰＢＳ配列の長さは、例えば、プライムエディター成分、サーチ標的配列、及びＰＥｇＲＮＡの他の成分に応じて様々であり得る。いくつかの実施形態では、プライマー結合部位（ＰＢＳ）の長さは、少なくとも２ヌクレオチド～５０ヌクレオチドまで可変である。例えば、プライマー結合部位（ＰＢＳ）は、長さが少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも７ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも９ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１１ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１３ヌクレオチド、少なくとも１４ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、長さが少なくとも６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、長さが約４～１６ヌクレオチド、約６～１６ヌクレオチド、約６～１８ヌクレオチド、約６～２０ヌクレオチド、約８～２０ヌクレオチド、約１０～２０ヌクレオチド、約１２～２０ヌクレオチド、約１４～２０ヌクレオチド、約１６～２０ヌクレオチド、または約１８～２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、長さが約７～１５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、長さが６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、または１４ヌクレオチドである。
ＰＢＳは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖におけるＤＮＡ配列に相補的または実質的に相補的であり得る。プライムエディターニッキングによって生成された遊離ヒドロキシ基、例えば、遊離３’末端での編集鎖とのアニーリングによって、ＰＢＳは、ニック部位で編集鋳型によってコードされる新たな一本鎖ＤＮＡの合成を開始させ得る。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖の領域と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相補的である。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖の領域と完全に相補的、または１００％相補的である。
ＰＥｇＲＮＡの伸長アームは、プライム編集中にプライムエディターにおけるＤＮＡポリメラーゼのためのＤＮＡ合成鋳型として機能する編集鋳型を含み得る。
編集鋳型の長さは、例えば、プライムエディター成分、サーチ標的配列、及びＰＥｇＲＮＡの他の成分に応じて様々であり得る。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、逆転写酵素のためのＤＮＡ合成鋳型として機能し、編集鋳型は、逆転写編集鋳型（ＲＴＴ）と称される。
編集鋳型（例えば、ＲＴＴ）は、いくつかの実施形態では、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＲＴＴは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＲＴＴは、長さが１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、編集鋳型（例えば、ＲＴＴ）配列は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖上の編集標的配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％相補的である。いくつかの実施形態では、編集鋳型配列（例えば、ＲＴＴ）は、編集標的配列に対して実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、編集鋳型配列（例えば、ＲＴＴ）は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子に組み込まれる意図されるヌクレオチド編集の位置を除き、編集標的配列と相補的である。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における編集鎖における編集標的配列と約８５％～約９５％の相補性を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖における編集標的配列と約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の相補性を含む。
ＰＥｇＲＮＡの編集鋳型における意図されるヌクレオチド編集は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列と比較して様々なタイプの改変を含み得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列と比較して単一のヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列と比較して欠失である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列と比較して挿入である。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列と比較して１～１０個の意図されるヌクレオチド編集を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列と比較して１つ以上の意図されるヌクレオチド編集を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列と比較して２つ以上の意図されるヌクレオチド編集を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列と比較して３つ以上の意図されるヌクレオチド編集を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列と比較して４つ以上、５つ以上、または６つ以上の意図されるヌクレオチド編集を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列と比較して、２つの単一ヌクレオチド置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列と比較して、３つの単一ヌクレオチド置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列と比較して、４、５、または６つの単一ヌクレオチド置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、アデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）への置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、Ａからグアニン（Ｇ）への置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、Ａからシトシン（Ｃ）への置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、Ｔ－Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、Ｔ－Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、Ｔ－Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、ＧからＡへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、ＧからＴへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、ＧからＣへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、ＣからＡへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、ＣからＴへの置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、ＣからＧへの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド挿入は、長さが少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも７ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも９ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１１ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１３ヌクレオチド、少なくとも１４ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド挿入は、長さが１～２ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、１～４ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、２～５ヌクレオチド、３～５ヌクレオチド、３～６ヌクレオチド、３～８ヌクレオチド、４～９ヌクレオチド、５～１０ヌクレオチド、６～１１ヌクレオチド、７～１２ヌクレオチド、８～１３ヌクレオチド、９～１４ヌクレオチド、１０～１５ヌクレオチド、１１～１６ヌクレオチド、１２～１７ヌクレオチド、１３～１８ヌクレオチド、１４～１９ヌクレオチド、１５～２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド挿入は、単一ヌクレオチド挿入である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド挿入は、２つのヌクレオチドの挿入を含む。
ＰＥｇＲＮＡの編集鋳型は、編集される二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子と比較して、１つ以上の意図されるヌクレオチド編集を含み得る。ＰＥｇＲＮＡの他の成分に対する、または二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における特定のヌクレオチド（例えば、変異）に対する意図されるヌクレオチド編集（複数可）の位置は、様々であり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、プロトスペーサー配列に対応するまたはそれと相同なＰＥｇＲＮＡの領域におけるものである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、プロトスペーサー配列の外の二本鎖標的ＤＮＡの領域に対応するＰＥｇＲＮＡの領域におけるものである。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子におけるヌクレオチド編集組み込みの位置は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の位置に基づいて決定され得る。例えば、意図されるヌクレオチド編集は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対応する配列において導入され得る。いくつかの実施形態では、編集鋳型におけるヌクレオチド編集は、ＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドに対応する位置におけるものである。いくつかの実施形態では、編集鋳型におけるヌクレオチド編集は、ＰＡＭ配列の最も３’のヌクレオチドに対応する位置におけるものである。いくつかの実施形態では、編集鋳型における意図されるヌクレオチド編集の位置は、編集鋳型を、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の部分的に相補的な編集鎖とアライメントすること、及び意図されるヌクレオチド編集が組み込まれた編集鎖上のヌクレオチド位置を言及することによって言及され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖におけるＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドの約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド上流に対応する位置で組み込まれる。参照位置の０ヌクレオチド上流または下流とは、意図されるヌクレオチドが、参照位置のすぐ上流または下流にあることを意味する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、ＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドの約０～２ヌクレオチド、０～４ヌクレオチド、０～６ヌクレオチド、０～８ヌクレオチド、０～１０ヌクレオチド、２～４ヌクレオチド、２～６ヌクレオチド、２～８ヌクレオチド、２～１０ヌクレオチド、２～１２ヌクレオチド、４～６ヌクレオチド、４～８ヌクレオチド、４～１０ヌクレオチド、４～１２ヌクレオチド、４～１４ヌクレオチド、６～８ヌクレオチド、６～１０ヌクレオチド、６～１２ヌクレオチド、６～１４ヌクレオチド、６～１６ヌクレオチド、８～１０ヌクレオチド、８～１２ヌクレオチド、８～１４ヌクレオチド、８～１６ヌクレオチド、８～１８ヌクレオチド、１０～１２ヌクレオチド、１０～１４ヌクレオチド、１０～１６ヌクレオチド、１０～１８ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、１２～１４ヌクレオチド、１２～１６ヌクレオチド、１２～１８ヌクレオチド、１２～２０ヌクレオチド、１２～２２ヌクレオチド、１４～１６ヌクレオチド、１４～１８ヌクレオチド、１４～２０ヌクレオチド、１４～２２ヌクレオチド、１４～２４ヌクレオチド、１６～１８ヌクレオチド、１６～２０ヌクレオチド、１６～２２ヌクレオチド、１６～２４ヌクレオチド、１６～２６ヌクレオチド、１８～２０ヌクレオチド、１８～２２ヌクレオチド、１８～２４ヌクレオチド、１８～２６ヌクレオチド、１８～２８ヌクレオチド、２０～２２ヌクレオチド、２０～２４ヌクレオチド、２０～２６ヌクレオチド、２０～２８ヌクレオチド、または２０～３０ヌクレオチド上流に対応する位置で組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、ＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドの３ヌクレオチド上流に対応する位置で組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、ＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドの４ヌクレオチド上流に対応する位置で組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、ＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドの５ヌクレオチド上流に対応する位置で組み込まれる。いくつかの実施形態では、編集鋳型におけるヌクレオチド編集は、ＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドの６ヌクレオチド上流に対応する位置におけるものである。
いくつかの実施形態では、意図されるヌクレオチド編集は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖におけるＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドの約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド下流に対応する位置で組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、ＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドの約０～２ヌクレオチド、０～４ヌクレオチド、０～６ヌクレオチド、０～８ヌクレオチド、０～１０ヌクレオチド、２～４ヌクレオチド、２～６ヌクレオチド、２～８ヌクレオチド、２～１０ヌクレオチド、２～１２ヌクレオチド、４～６ヌクレオチド、４～８ヌクレオチド、４～１０ヌクレオチド、４～１２ヌクレオチド、４～１４ヌクレオチド、６～８ヌクレオチド、６～１０ヌクレオチド、６～１２ヌクレオチド、６～１４ヌクレオチド、６～１６ヌクレオチド、８～１０ヌクレオチド、８～１２ヌクレオチド、８～１４ヌクレオチド、８～１６ヌクレオチド、８～１８ヌクレオチド、１０～１２ヌクレオチド、１０～１４ヌクレオチド、１０～１６ヌクレオチド、１０～１８ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、１２～１４ヌクレオチド、１２～１６ヌクレオチド、１２～１８ヌクレオチド、１２～２０ヌクレオチド、１２～２２ヌクレオチド、１４～１６ヌクレオチド、１４～１８ヌクレオチド、１４～２０ヌクレオチド、１４～２２ヌクレオチド、１４～２４ヌクレオチド、１６～１８ヌクレオチド、１６～２０ヌクレオチド、１６～２２ヌクレオチド、１６～２４ヌクレオチド、１６～２６ヌクレオチド、１８～２０ヌクレオチド、１８～２２ヌクレオチド、１８～２４ヌクレオチド、１８～２６ヌクレオチド、１８～２８ヌクレオチド、２０～２２ヌクレオチド、２０～２４ヌクレオチド、２０～２６ヌクレオチド、２０～２８ヌクレオチド、または２０～３０ヌクレオチド下流に対応する位置で組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、ＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドの３ヌクレオチド下流に対応する位置で組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、ＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドの４ヌクレオチド下流に対応する位置で組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、ＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドの５ヌクレオチド下流に対応する位置で組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集は、ＰＡＭ配列の最も５’のヌクレオチドの６ヌクレオチド下流に対応する位置で組み込まれる。「上流」及び「下流」は、５’から３’方向で配向した核酸分子における少なくとも２つの領域または配列における相対的位置を定義することが意図される。例えば、第１の配列は、第１の配列が第２の配列に対して５’に位置する場合、ＤＮＡ分子において第２の配列の上流である。したがって、第２の配列は、第１の配列の下流である。
ＰＥｇＲＮＡで言及される場合、１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の位置は、ＰＥｇＲＮＡの成分に対して言及され得る。例えば、意図されるヌクレオチド編集は、ＰＢＳに対して５’または３’であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’から３’へ構造：スペーサー、ｇＲＮＡコア、編集鋳型、及びＰＢＳを含む。いくつかの実施形態では、意図されるヌクレオチド編集は、ＰＢＳの最も５’のヌクレオチドの０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０塩基対上流にある。いくつかの実施形態では、意図されるヌクレオチド編集は、ＰＢＳの最も５’のヌクレオチドの０～２塩基対、０～４塩基対、０～６塩基対、０～８塩基対、０～１０塩基対、２～４塩基対、２～６塩基対、２～８塩基対、２～１０塩基対、２～１２塩基対、４～６塩基対、４～８塩基対、４～１０塩基対、４～１２塩基対、４～１４塩基対、６～８塩基対、６～１０塩基対、６～１２塩基対、６～１４塩基対、６～１６塩基対、８～１０塩基対、８～１２塩基対、８～１４塩基対、８～１６塩基対、８～１８塩基対、１０～１２塩基対、１０～１４塩基対、１０～１６塩基対、１０～１８塩基対、１０～２０塩基対、１２～１４塩基対、１２～１６塩基対、１２～１８塩基対、１２～２０塩基対、１２～２２塩基対、１４～１６塩基対、１４～１８塩基対、１４～２０塩基対、１４～２２塩基対、１４～２４塩基対、１６～１８塩基対、１６～２０塩基対、１６～２２塩基対、１６～２４塩基対、１６～２６塩基対、１８～２０塩基対、１８～２２塩基対、１８～２４塩基対、１８～２６塩基対、１８～２８塩基対、２０～２２塩基対、２０～２４塩基対、２０～２６塩基対、２０～２８塩基対、または２０～３０塩基対上流にある。
二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子に組み込まれた意図されるヌクレオチド編集の対応する位置はまた、配列相同性及び相補性に基づいてプライムエディターによって生成されたニッキング位置に基づいて称され得る。例えば、実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子に組み込まれるヌクレオチド編集と、プライムエディターによって生成されるニックとの間の距離は、スペーサーがサーチ標的配列とハイブリダイズし、伸長アームが編集標的配列とハイブリダイズする場合に決定され得る。所定の実施形態では、ヌクレオチド編集の位置は、ニック部位と意図されるヌクレオチド編集との間の距離が、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さとなるように、プライムエディターによって生成される編集鎖（またはＰＡＭ鎖）上のニック部位の下流の任意の位置におけるものであり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集の位置は、編集鎖上のニック部位の０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド上流にある。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集の位置は、編集鎖上のニック部位の０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド下流にある。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド編集の位置は、編集鎖上のニック部位から０塩基対にあり、すなわち、編集位置は、ニック部位と同じ位置にある。本明細書で使用される場合、ニック部位とヌクレオチド編集との間の距離は、例えば、ヌクレオチド編集が挿入または欠失を含む場合、編集鎖上の３’遊離末端を生成するニックのためのヌクレオチド編集の最も５’の位置（すなわち、ニック部位に対するヌクレオチド編集の「近傍位置」）を指す。同様に、本明細書で使用される場合、ニック部位とＰＡＭ位置編集との間の距離は、例えば、ヌクレオチド編集が２つ以上の連続ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む場合、ヌクレオチド編集の最も５’の位置及びＰＡＭ配列の最も５’の位置を指す。
いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列に組み込まれるヌクレオチド編集を超えて伸長する。例えば、いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列に組み込まれるヌクレオチド編集に対して３’の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列に組み込まれるヌクレオチド編集に対して３’の少なくとも４～３０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列に組み込まれるヌクレオチド編集に対して３’の少なくとも４～２５塩基対を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列に組み込まれるヌクレオチド編集に対して３’の少なくとも４～２０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列に組み込まれるヌクレオチド編集に対して５’の少なくとも４～３０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列に組み込まれるヌクレオチド編集に対して５’の少なくとも４～２５塩基対を含む。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列に組み込まれるヌクレオチド編集に対して５’の少なくとも４～２０塩基対を含む。
いくつかの実施形態では、編集鋳型は、第１の核酸塩基位置でアデニンを含む（例えば、５’－スペーサー－ｇＲＮＡコア－ＲＴＴ－ＰＢＳ－３’配向に従うＰＥｇＲＮＡの場合、最も５’の核酸塩基が「第１の塩基」である）。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、第１の核酸塩基位置でグアニンを含む（例えば、５’－スペーサー－ｇＲＮＡコア－ＲＴＴ－ＰＢＳ－３’配向に従うＰＥｇＲＮＡの場合、最も５’の核酸塩基が「第１の塩基」である）。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、第１の核酸塩基位置でウラシルを含む（例えば、５’－スペーサー－ｇＲＮＡコア－ＲＴＴ－ＰＢＳ－３’配向に従うＰＥｇＲＮＡの場合、最も５’の核酸塩基が「第１の塩基」である）。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、第１の核酸塩基位置でシトシンを含む（例えば、５’－スペーサー－ｇＲＮＡコア－ＲＴＴ－ＰＢＳ－３’配向に従うＰＥｇＲＮＡの場合、最も５’の核酸塩基が「第１の塩基」である）。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、第１の核酸塩基位置でシトシンを含まない（例えば、５’－スペーサー－ｇＲＮＡコア－ＲＴＴ－ＰＢＳ－３’配向に従うＰＥｇＲＮＡの場合、最も５’の核酸塩基が「第１の塩基」である）。
ＰＥｇＲＮＡの編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における標的配列を置き換えるための（例えば、逆転写による）新たな一本鎖ＤＮＡをコードし得る。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖における編集標的配列は、新しく合成された鎖によって置き換えられ、ヌクレオチド編集（複数可）は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の領域に組み込まれる。いくつかの実施形態では、新しく合成されたＤＮＡ鎖は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における編集標的配列に置き換わり、編集標的配列（または標的遺伝子の標的鎖上の編集標的配列に相補的な内因性配列）は、同じ遺伝子の野生型配列と比較して変異を含み、１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みは、変異を修正する。
ＰＥｇＲＮＡのガイドＲＮＡコア（本明細書でｇＲＮＡコア、ｇＲＮＡ骨格、またはｇＲＮＡ骨格配列とも称される）は、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）に結合するポリヌクレオチド配列を含有し得る。ｇＲＮＡコアは、例えば、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＤＮＡニッカーゼとの会合によって、本明細書に記載されるプライムエディターと相互作用し得る。
当業者は、異なるＤＮＡ結合タンパク質とは異なるＤＮＡ結合ドメインを有する異なるプライムエディターが、ＤＮＡ結合タンパク質に特異的な異なるｇＲＮＡコア配列を必要とし得ることを認識する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡコアは、Ｃａｓ９ベースのプライムエディターに結合することが可能である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡコアは、Ｃｐｆ１ベースのプライムエディターに結合することが可能である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡコアは、Ｃａｓ１２ｂベースのプライムエディターに結合することが可能である。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡコアは、特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質との結合に関与する領域及び二次構造を含む。例えば、Ｃａｓ９ベースのプライム編集システムにおいて、ＰＥｇＲＮＡのｇＲＮＡコアは、スペーサー配列に隣接する塩基対合した「下部ステム」及び下部ステムの後の塩基対合した「上部ステム」の１つ以上の領域を含み得、下部ステム及び上部ステムは、対合していないＲＮＡを含む「バルジ」によって接続され得る。ｇＲＮＡコアは、図４に例示されるように、スペーサー配列から遠位の「ネクサス」と、それに続く、例えば、３’末端におけるヘアピン構造をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡコアは、下部ステム、上部ステム、及び／またはヘアピンにおいて野生型ｇＲＮＡコアと比較して修飾されたヌクレオチドを含む。例えば、下部ステム、上部ステム、及び／またはヘアピン領域におけるヌクレオチドは、修飾、欠失、または置換され得る。いくつかの実施形態では、下部ステム、上部ステム、及び／またはヘアピン領域におけるＲＮＡヌクレオチドは、１つ以上のＤＮＡ配列と置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡコアは、ネクサス及び／またはバルジ領域における未修飾または野生型ＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡコアは、Ａ－Ｔ対の長い伸長部、例えば、ＧＵＵＵＵ－ＡＡＡＡＣ対合要素を含まない。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡコアは、配列：ＧＵＵＵＧＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＣＣ（配列番号５５６）、または
ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５５７）を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡコアは、配列
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５５８）を含む。当該技術分野で知られている任意のｇＲＮＡコア配列もまた、本明細書に記載のプライム編集組成物において企図される。
ＰＥｇＲＮＡはまた、任意の修飾因子、例えば、３’末端修飾因子領域及び／または５’末端修飾因子領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、スペーサー、ｇＲＮＡコア、または伸長アームの一部ではない少なくとも１つのヌクレオチドを含む。任意の配列修飾因子は、示される他の領域のいずれかの中または間に位置し得、３’及び５’末端に位置することに限定されない。所定の実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、二次ＲＮＡ構造、例えば、限定されないが、アプタマー、ヘアピン、ステム／ループ、トーループ、及び／またはＲＮＡ結合タンパク質動員ドメイン（例えば、ＭＳ２ｃｐタンパク質を動員し、それに結合するＭＳ２アプタマー）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’末端または３’末端でウラシルの短い伸長部を含む。例えば、いくつかの実施形態では、３’伸長アームを含むＰＥｇＲＮＡは、伸長アームの３’末端で「ＵＵＵ」配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、３’末端でトーループ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、３’伸長アーム及び伸長アームの３’末端におけるトーループ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’伸長アーム及び伸長アームの５’末端におけるトーループ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、配列５’－ＧＡＡＡＮＮＮＮＮ－３’（Ｎは、任意の核酸塩基である）を有するトーループ要素を含む。いくつかの実施形態では、二次ＲＮＡ構造は、スペーサー内に位置する。いくつかの実施形態では、二次構造は、伸長アーム内に位置する。いくつかの実施形態では、二次構造は、ｇＲＮＡコア内に位置する。いくつかの実施形態では、二次構造は、スペーサーとｇＲＮＡコアとの間、ｇＲＮＡコアと伸長アームとの間、またはスペーサーと伸長アームとの間に位置する。いくつかの実施形態では、二次構造は、ＰＢＳと編集鋳型との間に位置する。いくつかの実施形態では二次構造は、ＰＥｇＲＮＡの３’末端または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、ＰＥｇＲＮＡの３’末端で転写終結シグナルを含む。二次ＲＮＡ構造に加えて、ＰＥｇＲＮＡは、化学的リンカーまたはポリ（Ｎ）リンカーまたはテール（「Ｎ」は、任意の核酸塩基であり得る）を含み得る。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、ｇＲＮＡコアの逆転写を予防するように機能し得る。
ＰＥｇＲＮＡの３’末端配列及び５’末端配列は、ＰＥｇＲＮＡの機能的成分のいずれか１つであり得、当該技術分野で知られている任意の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、３’末端で伸長アームを含む。例えば、ＰＥｇＲＮＡは、５’から３’へ構造：スペーサー、ｇＲＮＡコア、編集鋳型（例えば、ＲＴＴ）、及びＰＢＳを含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、３’末端でｇＲＮＡコアを含む。例えば、ＰＥｇＲＮＡは、５’から３’へ構造：編集鋳型（例えば、ＲＴＴ）、ＰＢＳ、スペーサー、及びｇＲＮＡコアを含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、３’末端で特定のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡの最も３’の３ヌクレオチドは、５’－ＵＵＵ－３’である。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡの最も３’の４ヌクレオチドは、５’－ＵＵＵＵ－３’である。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡの最も３’の３ヌクレオチドは、５’－ＵＵＵ－３’ではない。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡの最も３’の４ヌクレオチドは、５’－ＵＵＵＵ－３’ではない。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、最も３’の３ヌクレオチドにおいて２つの連続するウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、最も３’の４ヌクレオチドにおいて２つの連続するウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、最も３’の４ヌクレオチドにおいてウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、最も３’の３ヌクレオチドにおいてウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、化学的に合成される。
いくつかの実施形態では、プライム編集システムまたは組成物は、ニックガイドポリヌクレオチド、例えば、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）をさらに含む。いかなる特定の理論にも縛られることなく、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における二本鎖標的ＤＮＡの非編集鎖は、ｎｇＲＮＡによって仕向けられるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓニッカーゼによってニッキングされ得る。いくつかの実施形態では、非編集鎖上のニックは、内因性ＤＮＡ修復機構を、非編集鎖の修復のための鋳型として編集鎖を使用するように誘導し、これはプライム編集の効率を増加させ得る。いくつかの実施形態では、非編集鎖は、ｎｇＲＮＡによって非編集鎖に局在化されたプライムエディターによってニッキングされる。したがって、また、本明細書では、少なくとも１つのＰＥｇＲＮＡ及び少なくとも１つのｎｇＲＮＡを含むＰＥｇＲＮＡシステムが提供される。
いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、可変スペーサー配列及び例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、プライムエディターのＣａｓ９と相互作用するガイドＲＮＡ骨格またはコア領域を含有するガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、編集鎖、または非標的鎖上に位置する第２のサーチ標的配列（またはｎｇサーチ標的配列）に実質的に相補的であるスペーサー配列（本明細書でｎｇスペーサー、または第２のスペーサーと称される）を含む。よって、いくつかの実施形態では、ｎｇスペーサーによって認識されるｎｇサーチ標的配列及びＰＥｇＲＮＡのスペーサー配列によって認識されるサーチ標的配列は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の二本鎖標的ＤＮＡの反対鎖にある。ｎｇＲＮＡを含むプライム編集システムまたは複合体は、「ＰＥ３」プライム編集システム、ＰＥ３プライム編集組成物またはＰＥ３プライム編集複合体と称され得る。
いくつかの実施形態では、ｎｇサーチ標的配列は、編集鎖上でＰＥｇＲＮＡによって組み込まれる意図されるヌクレオチド編集の１０ヌクレオチド～１００ヌクレオチド内で非標的鎖上に位置する。いくつかの実施形態では、ｎｇ標的サーチ標的配列は、編集鎖上のＰＥｇＲＮＡによって組み込まれる意図されるヌクレオチド編集の１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、９１ｂｐ、９２ｂｐ、９３ｂｐ、９４ｂｐ、９５ｂｐ、９６ｂｐ、９７ｂｐ、９８ｂｐ、９９ｂｐ、または１００ｂｐ内にある。いくつかの実施形態では、ｎｇサーチ標的配列及びＰＥｇＲＮＡサーチ標的配列の５’末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｂｐ以内で互いに離れている。いくつかの実施形態では、ｎｇサーチ標的配列及びＰＥｇＲＮＡサーチ標的配列の５’末端は、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、９１ｂｐ、９２ｂｐ、９３ｂｐ、９４ｂｐ、９５ｂｐ、９６ｂｐ、９７ｂｐ、９８ｂｐ、９９ｂｐ、または１００ｂｐ以内で互いに離れている。
いくつかの実施形態では、意図されるヌクレオチド編集がＰＥｇＲＮＡの編集鋳型によって編集鎖上に組み込まれた後にのみ、ｎｇスペーサー配列は、第２のサーチ標的配列と相補的であり、それにハイブリダイズし得る。そのようなプライム編集システムは、「ＰＥ３ｂ」プライム編集システムまたは組成物と称され得る。いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、ヌクレオチド編集の組み込み後に編集鎖のみにマッチするが、編集鎖上の内因性二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子配列にマッチしないスペーサー配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、意図されるヌクレオチド編集は、ｎｇサーチ標的配列内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、意図されるヌクレオチド編集は、ｎｇサーチ標的配列のＰＡＭに対応する位置の約１～１０ヌクレオチド内に組み込まれる。
本開示のＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡには、いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオチド、例えば、化学的に修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡ核酸塩基が含まれ得、また、１つ以上の核酸塩基アナログ（例えば、機能性、例えば、温度耐性を付与する可能性がある修飾）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡは、化学的に修飾され得る。語句「化学的修飾」には、本明細書で使用される場合、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡにおいて見られるものとは異なる化学種を導入する修飾、例えば、共有結合修飾、例えば、修飾されたヌクレオチドの導入（例えば、ヌクレオチドアナログ、またはＤＮＡまたはＲＮＡ分子において天然に見られないペンダント基の包含）が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、本開示に提供されるＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡは、化学的または生物学的修飾を受けた場合がある。修飾は、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡ内の任意の位置で行われ得、それには、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡの核酸塩基またはリン酸骨格に対する修飾が含まれ得る。いくつかの実施形態では、化学的修飾は、構造ガイド修飾であり得る。いくつかの実施形態では、化学的修飾は、ＰＥｇＲＮＡの５’末端及び／または３’末端におけるものである。いくつかの実施形態では、化学的修飾は、ｎｇＲＮＡの５’末端及び／または３’末端におけるものである。いくつかの実施形態では、化学的修飾は、ＰＥｇＲＮＡのスペーサー配列、伸長アーム、編集鋳型配列、またはプライマー結合部位内におけるものであり得る。いくつかの実施形態では、化学的修飾は、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡのスペーサー配列またはｇＲＮＡコア内におけるものであり得る。いくつかの実施形態では、化学的修飾は、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡの最も３’のヌクレオチド内におけるものであり得る。いくつかの実施形態では、化学的修飾は、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡの最も３’の末端内におけるものであり得る。いくつかの実施形態では、化学的修飾は、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡの最も５’の末端内におけるものであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超える化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、３個の連続する化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超える化学的に修飾されたヌクレオチドを５’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、もしくは５個またはそれを超える化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、または５個以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを５’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、もしくは３個またはそれを超える化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、または３個以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを５’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超える連続する化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超える連続する化学的に修飾されたヌクレオチドを５’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、または５個の連続する化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、または５個の連続する化学的に修飾されたヌクレオチドを５’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、または３個の連続する化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、または３個の連続する化学的に修飾されたヌクレオチドを５’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、３個の連続する化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、５個、またはそれを超える化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端の近くで含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、３個の連続する化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、３個の連続する化学的に修飾されたヌクレオチドを５’末端で含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、５個、またはそれを超える化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端の近くで含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、５個、またはそれを超える連続する化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端の近くで含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、５個、またはそれを超える化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端の近くで含み、最も３’のヌクレオチドは、修飾されておらず、１、２、３、４、５個、またはそれを超える化学的に修飾されたヌクレオチドは、５’から３’の順序で最も３’のヌクレオチドに先行する。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５個またはそれを超える化学的に修飾されたヌクレオチドを３’末端の近くで含み、最も３’のヌクレオチドは、修飾されておらず、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５個またはそれを超える化学的に修飾されたヌクレオチドは、５’から３’の順序で最も３’のヌクレオチドに先行する。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、ｇＲＮＡコアにおいて１つ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。図４に例示されるように、ＰＥｇＲＮＡのｇＲＮＡコアは、塩基対合した下部ステムの１つ以上の領域、塩基対合した上部ステムを含み得、下部ステム及び上部ステムは、対合していないＲＮＡを含むバルジによって接続され得る。ｇＲＮＡコアは、スペーサー配列から遠位のネクサスをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡコアは、下部ステム、上部ステム、及び／またはヘアピン領域において１つ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、下部ステム、上部ステム、及び／またはヘアピン領域におけるヌクレオチドのすべては、化学的に修飾されている。
ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡに対する化学的修飾は、２’－Ｏ－チオノカルバメートで保護されたヌクレオシドホスホロアミダイト、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡに対する化学的修飾は、ヌクレオチド糖修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学的修飾は、２’Ｏ－Ｃ１－４アルキル修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学的修飾は、２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学的修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－デオキシ（２’－Ｈ）、例えば、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－アミノ（「２’－ＮＨ２」）、または２’－アラビノシル（「２’－アラビノ」）、２’－Ｆ－アラビノシル（「２’－Ｆ－アラビノ」）修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡに対する化学的修飾は、ヌクレオチド間結合修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート（「ＰＳ」）、ホスホノカルボキシレート（Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、ホスホロアセテート（ＰＡＣＥ）、（Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））チオホスホノカルボキシレート（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））、アルキルホスホネート（Ｐ（Ｃ１－３アルキル）、例えば、メチルホスホネート－Ｐ（ＣＨ３）、ボラノホスホネート（Ｐ（ＢＨ３））、またはホスホロジチオエート（Ｐ（Ｓ）２）修飾である。いくつかの実施形態では、化学的に修飾されたＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）ＲＮＡ、３’チオＰＡＣＥ ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）ＲＮＡ、２’－Ｆ ＲＮＡ、もしくは当該技術分野で知られている任意の他の化学的修飾を有するＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせである。化学的修飾にはまた、例えば、ＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡのへの非ヌクレオチド結合または修飾されたヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ分子の３’及び５’末端の一方または両方に対する修飾）の組み込みが含まれ得る。そのような修飾には、ＲＮＡを薬剤（例えば、タンパク質または相補的核酸分子）と複合体化するＲＮＡ配列への塩基の付加、及び（例えば、二次構造を形成する）ＲＮＡ分子の構造を変化させる要素の包含が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＸｍＸｍＸｍＸｍＸ－［スペーサー配列の残部－ｇＲＮＡコア－伸長アーム配列の残部］－ｍＸｍＸｍＸｍＸｍＸ－３’（式中、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、「スペーサー配列の残部」は、スペーサー配列の未修飾ヌクレオチドを表し、「伸長アーム配列の残部」は、伸長アーム配列の未修飾ヌクレオチドを表す）の配列を含む。本明細書で使用される場合、ＰＥｇＲＮＡ配列またはガイドＲＮＡ配列化学的修飾との関連で、「ｍ」は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＸ＊ｍＸ＊ｍＸ＊ｍＸ＊ｍＸ＊－［スペーサー配列の残部－ｇＲＮＡコア－伸長アーム配列の残部］－ｍＸ＊ｍＸ＊ｍＸ＊ｍＸ＊ｍＸ＊－３’（式中、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、「スペーサー配列の残部」は、スペーサー配列の未修飾ヌクレオチドを表し、「伸長アーム配列の残部」は、伸長アーム配列の未修飾ヌクレオチドを表す）の配列を含む。本明細書で使用される場合、ＰＥｇＲＮＡ配列またはガイドＲＮＡ配列化学的修飾との関連で、「＊」は、ホスホロチオエート結合を表す。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＸｍＸｍＸｍＸ－［スペーサー配列の残部－ｇＲＮＡコア－伸長アーム配列の残部］－ｍＸｍＸｍＸｍＸ－３’（式中、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、「スペーサー配列の残部」は、スペーサー配列の未修飾ヌクレオチドを表し、「伸長アーム配列の残部」は、伸長アーム配列の未修飾ヌクレオチドを表す）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＸ＊ｍＸ＊ｍＸ＊ｍＸ＊－［スペーサー配列の残部－ｇＲＮＡコア－伸長アーム配列の残部］－ｍＸ＊ｍＸ＊ｍＸ＊ｍＸ＊－３’（式中、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、「スペーサー配列の残部」は、スペーサー配列の未修飾ヌクレオチドを表し、「伸長アーム配列の残部」は、伸長アーム配列の未修飾ヌクレオチドを表す）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＸｍＸｍＸｍＸｍＸ－［スペーサー配列の残部－ｇＲＮＡコア－伸長アーム配列の残部］－ｍＸｍＸｍＸｍＸｍＸ－３’（式中、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、「スペーサー配列の残部」は、スペーサー配列の未修飾ヌクレオチドを表し、「伸長アーム配列の残部」は、伸長アーム配列の未修飾ヌクレオチドを表す）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＸ＊ｍＸ＊ｍＸ＊－スペーサー配列の残部－ｇＲＮＡコア－伸長アーム配列の残部］－ｍＸ＊ｍＸ＊ｍＸ＊－３’（式中、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、「スペーサー配列の残部」は、スペーサー配列の未修飾ヌクレオチドを表し、「伸長アーム配列の残部」は、伸長アーム配列の未修飾ヌクレオチドを表す）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＸｍＸ－［スペーサー配列の残部－ｇＲＮＡコア－伸長アーム配列の残部］－ｍＸｍＸ－３’（式中、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、「スペーサー配列の残部」は、スペーサー配列の未修飾ヌクレオチドを表し、「伸長アーム配列の残部」は、伸長アーム配列の未修飾ヌクレオチドを表す）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＸ＊ｍＸ＊－［スペーサー配列の残部－ｇＲＮＡコア－伸長アーム配列の残部］－ｍＸ＊ｍＸ＊－３’（式中、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、「スペーサー配列の残部」は、スペーサー配列の未修飾ヌクレオチドを表し、「伸長アーム配列の残部」は、伸長アーム配列の未修飾ヌクレオチドを表す）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＸ－［スペーサー配列の残部－ｇＲＮＡコア－伸長アーム配列の残部］－ｍＸ－３’（式中、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、「スペーサー配列の残部」は、スペーサー配列の未修飾ヌクレオチドを表し、「伸長アーム配列の残部」は、伸長アーム配列の未修飾ヌクレオチドを表す）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＸ＊－［スペーサー配列の残部－ｇＲＮＡコア－伸長アーム配列の残部］－ｍＸ＊－３’（式中、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、「スペーサー配列の残部」は、スペーサー配列の未修飾ヌクレオチドを表し、「伸長アーム配列の残部」は、伸長アーム配列の未修飾ヌクレオチドを表す）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＣＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ－３’（配列番号５５９）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＣＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣＵＵＵＵ－３’（配列番号５６０）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＣＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣ－３’（配列番号５６１）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＣＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧｍＣ＊ｍＡ＊ｍＣ＊－３’（配列番号５６２）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＣＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣ－３’（配列番号５６３）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ－３’（配列番号５６４）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、５’－ＣＣＵＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ－３’（配列番号５６５）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３’（配列番号５６６）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧｍＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊－３’（配列番号５６７）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、５’－ＣＣＵＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３’（配列番号５６８）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＵＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ－３’（配列番号５６９）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＵＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣＵＵＵＵ－３’（配列番号５７０）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＵＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣ－３’（配列番号５７１）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＵＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧｍＣ＊ｍＡ＊ｍＣ＊－３’（配列番号５７２）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＵＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣ－３’（配列番号５７３）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ－３’（配列番号５７４）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、５’－ＣＣＵＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ－３’（配列番号５７５）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３’（配列番号５７６）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧｍＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊－３’（配列番号５７７）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、５’－ＣＣＵＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３’（配列番号５７８）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ－３’（配列番号５７９）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣＵＵＵＵ－３’（配列番号５８０）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣ－３’（配列番号５８１）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧｍＣ＊ｍＡ＊ｍＣ＊－３’（配列番号５８２）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣ－３’（配列番号５８３）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ－３’（配列番号５７４）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ＣＣＵＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ－３’（配列番号５７５）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３’（配列番号５７６）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧｍＵ＊ｍＧ＊ｍＣ－３’（配列番号５７７）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ＣＣＵＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３’（配列番号５７８）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ－３’（配列番号５７９）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣＵＵＵＵ－３’（配列番号５８０）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣ－３’（配列番号５８１）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧｍＣ＊ｍＡ＊ｍＣ＊－３’（配列番号５８２）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣ－３’（配列番号５８３）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ－３’（配列番号５７４）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ＣＣＵＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ－３’（配列番号５７５）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３’（配列番号５７６）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧｍＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊－３’（配列番号５７７）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ＣＣＵＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３’（配列番号５７８）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ－３’（配列番号５７９）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣＵＵＵＵ－３’（配列番号５８０）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣ－３’（配列番号５８１）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧｍＣ＊ｍＡ＊ｍＣ＊－３’（配列番号５８２）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、５’－ＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣ－３’（配列番号５８３）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ－３’（配列番号５７４）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ＣＣＵＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ－３’（配列番号５７５）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３’（配列番号５７６）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧｍＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊－３’（配列番号５７７）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）は、５’－ＣＣＵＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３’（配列番号５７８）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、５’－ＧＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＣＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号５８４）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、５’－ＧＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＣＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号５８５）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡは、５’－ＧＣＣＴＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号５８６）の配列を含む。
プライム編集組成物
本明細書には、いくつかの実施形態では、プライム編集組成物を使用する組成物、システム、及び方法が開示される。用語「プライム編集組成物」または「プライム編集システム」は、本明細書に記載されるプライム編集方法に関与する組成物を指す。プライム編集組成物には、プライムエディター、例えば、プライムエディター融合タンパク質、及びＰＥｇＲＮＡが含まれ得る。プライム編集組成物は、追加の要素、例えば、第２の鎖ニッキングｎｇＲＮＡをさらに含み得る。プライム編集組成物の成分は、プライム編集のための複合体を形成するために組み合わされ得、または別々に、例えば、投与目的のために維持され得る。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＰＥｇＲＮＡと複合体化された、及び任意にｎｇＲＮＡと複合体化されたプライムエディター融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＰＥｇＲＮＡを介して互いに会合するＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含むプライムエディターを含む。例えば、プライム編集組成物は、ＰＥｇＲＮＡに連結された、ＲＮＡ－タンパク質動員アプタマーＲＮＡ配列によって互いに連結されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含むプライムエディターを含み得る。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドコンストラクト、またはベクターを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＰＥｇＲＮＡ、ｎｇＲＮＡ、及びプライムエディター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドコンストラクト、またはベクターを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、複数のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドコンストラクト、またはベクターを含み、これらの各々は、１つ以上のプライム編集組成物成分をコードする。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物のＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメイン、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼに会合されている。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物のＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインと複合体し、プライムエディターを標的ＤＮＡに誘導する。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、プライムエディター成分及び／またはＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）ｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、（ｉ）プライムエディターのＤＮＡ結合ドメイン、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）プライムエディターのＤＮＡポリメラーゼドメイン、例えば、逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、（ｉ）プライムエディターのＤＮＡ結合ドメイン、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）プライムエディターのＤＮＡポリメラーゼドメイン、例えば、逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド及び（ｉｖ）ｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドまたはＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドはさらに、追加のポリペプチドドメイン、例えば、ＲＮＡ－タンパク質動員ドメイン、例えば、ＭＳ２コートタンパク質ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、（ｉ）プライムエディター融合タンパク質のＮ末端半分及びインテイン－Ｎをコードするポリヌクレオチド及び（ｉｉ）プライムエディター融合タンパク質のＣ末端半分及びインテイン－Ｃをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、（ｉ）プライムエディター融合タンパク質のＮ末端半分及びインテイン－Ｎをコードするポリヌクレオチド（ｉｉ）プライムエディター融合タンパク質のＣ末端半分及びインテイン－Ｃをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及び／または（ｉｖ）ｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分及びインテイン－Ｎをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分、インテイン－Ｃ、及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓタンパク質ドメイン、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分及びインテイン－Ｎをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分、インテイン－Ｃ、及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及び／または（ｉｖ）ｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、プライム編集システムは、１つ以上のプライムエディターポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含み、プライム編集システムの活性は、ベクターが送達されるタイミングをコントロールすることによって時間的に制御され得る。例えば、いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチド及びＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが同時に送達され得る。例えば、いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチド及びＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが順次に送達され得る。
プライムエディター成分をコードするポリヌクレオチド
プライム編集組成物成分をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物成分をコードするポリヌクレオチドは、発現コンストラクトである。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物成分をコードするポリヌクレオチドは、ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドは、改善された発現のためにコドン最適化される。コドン最適化は、ネイティブアミノ酸配列を維持しながら、ネイティブポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個以上、またはそれより多いコドン）を、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって対象となる宿主細胞における向上した発現のためにポリヌクレオチド配列を操作することを指し得る。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、宿主細胞におけるｍＲＮＡ安定性を増加させるためにポリヌクレオチド配列のＧＣ含有量を改変することによって向上した発現のためにポリヌクレオチド配列を操作する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化は、遺伝子構築または発現を損ない得るタンデムリピートコドンまたはタンデムリピート核酸塩基ランを最小化する。コドン最適化にはまた、転写及び翻訳コントロール領域をカスタマイズすること、タンパク質トラフィッキング配列を挿入することまたは除去すること、コードされるタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去することまたは付加すること、タンパク質ドメインを付加すること、除去することまたはシャッフル化すること、制限部位を挿入することまたは欠失させること、及び／またはリボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾して宿主細胞におけるプライムエディターポリペプチドの発現及び適切なフォールディングを向上させることが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ配列またはｍＲＮＡ配列は、例えば、特定の種の細胞における発現のためにコドン最適化される。様々な種は、特定のアミノ酸の所定のコドンについて特定のバイアスを示す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン使用頻度表を使用して、特定の種の細胞における増加した発現のために最適化され得る。コドン使用頻度表は、当業者に容易に利用可能である。例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００” Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列を最適化するコドンのためのコンピュータアルゴリズム、例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）もまた利用可能である。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ配列またはｍＲＮＡ配列は、特定の種からの所望の細胞、例えば、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、真核細胞における発現のためのものである。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、哺乳動物細胞における発現のためのものである。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、ヒト細胞における発現のためのものである。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、所望の細胞タイプにおける発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、造血幹細胞（ＨＳＣ）における発現のためのものである。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、ＣＤ３４＋ＨＳＣにおける発現のためのものである。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）における発現のためのものである。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣにおける発現のためのものである。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、ヒトＣＤ３４＋造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）における発現のためのものである。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、肝細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、乳房上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、形成された血液の要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞、造血幹前駆細胞）、筋肉細胞及びこれらの体細胞タイプの前駆体における発現のためのものである。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、初代肝細胞における発現のためのものである。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）における発現のためのものである。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、ニューロンにおける発現のためのものである。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、大脳基底核における発現のためのものである。コドン最適化は、肺、肝臓、胃、または腸からの上皮細胞における発現のためのものである。コドン最適化は、網膜細胞における発現のためのものである。
いくつかの実施形態では、コドン最適化は、宿主細胞における発現を向上させるために二次構造を改変することによって向上した発現のためにポリヌクレオチド配列を操作する。「二次構造」は、ポリヌクレオチド等の生体高分子のローカルセグメントの三次元形態を指す。いくつかの実施形態では、二次構造は、ポリヌクレオチド分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形成され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドにおける二次構造は、単一のポリヌクレオチド分子内の相補的ヌクレオチド配列の塩基対合によって形成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドにおける二次構造は、単一のポリヌクレオチド分子内の相補的ヌクレオチド配列の塩基対合を介して１つ以上の二本鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡの二次構造は、ヘアピン、ステム、ループ、テトラループ、シュードノット、ステムループ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドと比較して改変された二次構造を含有する場合、ポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドと比較して低減または増加した程度の二次構造を有する。二次構造の程度は、同じポリヌクレオチド内の相補的塩基対を形成するポリヌクレオチドのヌクレオチドのパーセンテージによって測定され得る。
いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列、例えば、ｍＲＮＡは、参照ポリヌクレオチド配列、例えば、ＰＥタンパク質をコードする未改変参照ｍＲＮＡと比較して増加した程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、参照配列は、プライムエディタータンパク質のすべてまたは一部分をコードする野生型ポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、参照配列は、プライムエディタータンパク質のすべてまたは一部分の機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列であり、参照配列は、機能的バリアントにおける１つ以上のアミノ酸置換をコードするためだけに野生型ポリヌクレオチド配列から改変される。ＰＥタンパク質をコードする例示的な参照ポリヌクレオチド配列が配列番号２６、２７、３２、３３に提供される。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列と比較して低減された程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と比較して低減された数の逆位反復モチーフを含む。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列と比較して増加した程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と比較して増加した数の逆位反復モチーフを含む。
いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と比較して特定の部分において改変された程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と比較して特定の部分において低減された程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と比較してオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において改変された程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と比較してＯＲＦの５’領域でリボソーム結合部位において低減された程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と比較してＯＲＦのＮ末端で低減した程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と比較してＯＲＦのＣ末端で低減した程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列と比較して特定の部分において増加した程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と比較してオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において増加した程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と比較してＯＲＦのＮ末端で増加した程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と比較してＯＲＦのＣ末端で増加した程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、ＳｐＣａｓ９またはＭ－ＭＬＶ ＲＴの参照コード配列と比較して増加した程度の二次構造を示す。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、ＳｐＣａｓ９またはＭ－ＭＬＶ ＲＴの参照コード配列と比較してオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において増加した二次構造を示す。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリヌクレオチドの安定性を増加させる二次構造（複数可）を示す。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、開始コドンでのまたは開始コドンからのポリペプチド合成の開始を増加させる二次構造（複数可）を示す。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、完全なＯＲＦ以外のポリヌクレオチド内の任意のＯＲＦから翻訳されるポリペプチドの量を阻害または低減する二次構造（複数可）を示し、それによりプライムエディターポリペプチドの翻訳忠実性を増加させる。いくつかの実施形態では、二次構造は、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ、またはポリヌクレオチドによってコードされるｍＲＮＡの安定性を改善する。いくつかの実施形態では、二次構造は、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ、またはポリヌクレオチドによってコードされるｍＲＮＡの耐熱性を改善する。
プライムエディターポリペプチドまたは成分をコードする最適化されたポリヌクレオチドが提供される。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号６２７または配列番号６２９（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）の核酸配列とまたは配列番号６２８、または配列番号６３０（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）の核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号６２７、または配列番号６２９からなる群からまたは配列番号６２８、または配列番号６３０からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２８、４１、５０、５９、６８、８３、９１、２４５、または２５７（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれかから選択される核酸配列とまたは配列番号２９、４２、５１、６０、６９、８４、９２、２４６、または２５８（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）の核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２８、４１、５０、５９、６８、８３、９１、２４５、または２５７（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれかからなる群からまたは配列番号２９、４２、５１、６０、６９、８４、９２、２４６、または２５８（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）のいずれかからなる群からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、コドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８３または９１（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれかから選択される核酸配列とまたは配列番号８４または９２（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）の核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号８３または９１（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれかからなる群からまたは配列番号８４または９２（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）のいずれかからなる群からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２３５、２４７、２５９、６３３、または６３５（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれかから選択される核酸配列とまたは配列番号２３６、２４８、２６０、６３４、または６３６（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）のいずれかから選択される核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２３５、２４７、２５９、６３３、または６３５からなる群からまたは配列番号２３６、２４８、２６０、６３４、または６３６からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされるリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、コドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされるリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２３９、２５１、２６３、６３１、または６３７（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれかから選択される核酸配列とまたは配列番号２４０、２５２、２６４、６３２、または６３８（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）の核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号２３９、２５１、２６３、６３１、または６３７からなる群からまたは配列番号２４０、２５２、２６４、６３２、または６３８からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターは、コドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされるＮＬＳを含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号６２７または配列番号６２９（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）の核酸配列とまたは配列番号６２８、または配列番号６３０（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）の核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含み、配列番号２８、４１、５０、５９、６８、８３、９１、２４５、または２５７（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれかから選択される核酸配列とまたは配列番号２９、４２、５１、６０、６９、８４、９２、２４６、または２５８（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）の核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼドメインをさらに含み、任意にプライムエディターは、配列番号２３５、２４７、２５９、６３３、または６３５（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれかから選択される核酸配列とまたは配列番号２３６、２４８、２６０、６３４、または６３６（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）のいずれかから選択される核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるリンカーをさらに含み、任意にプライムエディターは、配列番号２３９、２５１、２６３、６３１、または６３７（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれかから選択される核酸配列とまたは配列番号２４０、２５２、２６４、６３２、または６３８（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）の核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＮＬＳをさらに含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号６２７、または配列番号６２９からなる群からまたは配列番号６２８、または配列番号６３０からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含み、配列番号２８、４１、５０、５９、６８、８３、９１、２４５、または２５７（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれかからなる群からまたは配列番号２９、４２、５１、６０、６９、８４、９２、２４６、または２５８（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）のいずれかからなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼドメインをさらに含み、任意にプライムエディターは、配列番号２３５、２４７、２５９、６３３、または６３５からなる群からまたは配列番号２３６、２４８、２６０、６３４、または６３６からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされるリンカーをさらに含み、任意にプライムエディターは、配列番号２３９、２５１、２６３、６３１、または６３７からなる群からまたは配列番号２４０、２５２、２６４、６３２、または６３８からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のＮＬＳをさらに含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号６２７、または配列番号６２９（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）からなる群からまたは配列番号６２８、または配列番号６３０（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含み、配列番号８３、９１、２４５、または２５７（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれかからなる群からまたは配列番号８４、９２、２４６、または２５８（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼドメインをさらに含み、任意にプライムエディターは、配列番号２３５、２４７、２５９、６３３、または６３５からなる群からまたは配列番号２３６、２４８、２６０、６３４、または６３６からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされるリンカーをさらに含み、任意にプライムエディターは、配列番号２３９、２５１、２６３、６３１、または６３７からなる群からまたは配列番号２４０、２５２、２６４、６３２、または６３８からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のＮＬＳをさらに含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号６２７（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）に示されるまたは配列番号６２９（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含み、配列番号８３（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）に示されるまたは配列番号８４（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼドメインをさらに含み、任意にプライムエディターは、配列番号６３３、または６３５からなる群からまたは配列番号６３４、または６３６からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされるリンカーをさらに含み、任意にプライムエディターは、配列番号６３１、または６３７からなる群からまたは配列番号６３２、または６３８からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のＮＬＳをさらに含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号６２９（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）に示されるまたは配列番号６３０（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含み、配列番号９１（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）に示されるまたは配列番号９２（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼドメインをさらに含み、任意にプライムエディターは、配列番号６３３、または６３５からなる群からまたは配列番号６３４、または６３６からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされるリンカーをさらに含み、任意にプライムエディターは、配列番号６３１、または６３７からなる群からまたは配列番号６３２、または６３８からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のＮＬＳをさらに含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターは、配列番号６２７または６２９（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）に示されるまたは配列番号６２８または６３０（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含み、配列番号８３または９１（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）に示されるまたは配列番号８４または９２（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼドメインをさらに含み、任意にプライムエディターは、配列番号２３３に示される、または配列番号２３６に示される配列から選択されるポリヌクレオチドによってコードされるリンカーをさらに含み、任意にプライムエディターは、配列番号２３９、６３１、または６３７に示されるまたは配列番号２４０に示されるポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のＮＬＳをさらに含む。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、配列番号２５、３４、３５、４３、４４、５２、５３、６１、６２、６３、７０－７８、８５、８６、９３、９６、９９、１０４、１０５、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１７０、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、６２０、６２２、６２４、または６２５に示される配列のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むプライムエディターをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、配列番号２５、３４、３５、４３、４４、５２、５３、６１、６２、６３、７０－７８、８５、８６、９３、９６、９９、１０４、１０５、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１７０、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、６２０、６２２、６２４、または６２５（表１５～６６）のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むプライムエディターをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）は、２６、３０、３２、３４、３７、３９、４６、４８、５５、５７、６４、６６、７９、８１、８７、８９、９４、９７、１００、１０２、１０６、１０８、１１２、１１４、１１８、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３３、２４１、２４３、２５３、２５５、２６３、または２６５（表１５～６６）に示される配列のいずれか１つとまたは配列番号２７、３１、３３、３５、３８、４０、４７、４９、５６、５８、６５、６７、７９、８２、８８、９０、９５、９８、１０１、１０３、１０７、１０９、１１３、１１５、１１９、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３４、２４２、２４４、２５４、２５６、２６４、または２６６（表１５～６６）に示される配列のうちの１つと少なくとも約８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）は、配列番号２６、３０、３２、３４、３７、３９、４６、４８、５５、５７、６４、６６、７９、８１、８７、８９、９４、９７、１００、１０２、１０６、１０８、１１２、１１４、１１８、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３３、２４１、２４３、２５３、２５５、２６３、または２６５（表１５～６６）（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれか１つから選択されるまたは配列番号２７、３１、３３、３５、３８、４０、４７、４９、５６、５８、６５、６７、７９、８２、８８、９０、９５、９８、１０１、１０３、１０７、１０９、１１３、１１５、１１９、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３４、２４２、２４４、２５４、２５６、２６４、または２６６（表１５～６６）（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）のいずれか１つから選択される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７９、８１、８７、８９、または２３３（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）に示される配列のいずれか１つとまたは配列番号８０、８２、８８、９０、または２３４（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）に示される配列のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）は、配列番号７９、８１、８７、８９、または２３３（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれか１つから選択されるまたは配列番号８０、８２、８８、９０、または２３４（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）のいずれか１つから選択される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７９または８１（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）に示される配列のいずれかまたは配列番号８０または８２に示される配列のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）は、配列番号７９または８１（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれか１つから選択されるまたは配列番号８０または８２（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）のいずれか１つから選択される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８８または９０（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）に示される配列のいずれかまたは配列番号８８または９０に示される配列のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）は、配列番号８７または８９（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）のいずれか１つから選択されるまたは配列番号８８または９０（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）のいずれか１つから選択される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７９、８０、９４、９５、１０６、１０７、１１８、及び１１９からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７９、８０、９４、９５、１０６、１０７、１１８、及び１１９からなる群から選択される配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７９、８０、９４、９５、１０６、１０７、１１８、及び１１９からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号８７、８８、９７、９８、１００、１０１、１１２、及び１１３からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号８７、８８、９７、９８、１００、１０１、１１２、及び１１３からなる群から選択される配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号８７、８８、９７、９８、１００、１０１、１１２、及び１１３からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２７４～２８５または５９２～５９５からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２７４～２８５または５９２～５９５からなる群から選択される配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２７４～２８５または５９２～５９５からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書では、１つ以上のプライムエディター成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物が提供される。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡポリメラーゼドメイン、例えば、ＲＴドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼドメイン、例えば、ＲＴドメインをコードするポリヌクレオチドを含む融合ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号４１２～５５５からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号４１２～５５５からなる群から選択される配列のヌクレオチド１００～２１３０に対応する配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号４１２～５５５からなる群から選択される配列のヌクレオチド１００～２１３０に対応する配列と少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号８３または８４と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号８３または８４と少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号８３または８４の配列を含む。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、配列番号９１または９２と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号９１または９２と少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号９１または９２の配列を含む。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６２７～６３０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６２７、６２８、６２９、または６３０の配列を含む。
いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチド、例えば、融合ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含み、任意にリンカーをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含み、任意にＮＬＳをコードする第４のポリヌクレオチドをさらに含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするポリヌクレオチド、例えば、融合ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含み、任意にリンカーをコードする第３のポリヌクレオチドドメインをさらに含み、任意にＮＬＳをコードする第４のポリヌクレオチドドメインをさらに含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のポリヌクレオチド配列は、第１と第２のポリヌクレオチド配列の間に位置する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列の５’末端でＮＬＳをコードする配列（例えば、第４のポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする配列の５’末端でＮＬＳをコードする配列（例えば、第４のポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列の３’末端でＮＬＳをコードする配列（例えば、第４のポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする配列の３’末端でＮＬＳをコードする配列（例えば、第４のポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列を含むプライムエディターをコードするポリヌクレオチド、例えば、融合ポリヌクレオチドは、２つ以上のＮＬＳをコードする２つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列を含むプライムエディターをコードするポリヌクレオチド、例えば、融合ポリヌクレオチドは、３’末端で２つ以上のＮＬＳをコードする２つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列を含むプライムエディターをコードするポリヌクレオチド、例えば、融合ポリヌクレオチドは、５’末端で２つ以上のＮＬＳをコードする２つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列を含むプライムエディターをコードするポリヌクレオチド、例えば、融合ポリヌクレオチドは、３’末端で少なくとも１つのＮＬＳ及び５’末端で少なくとも１つのＮＬＳをコードする少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号２３９、２４０、２５１、２５２、２６３、及び２６４に示される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含み、第１の及び第２のポリヌクレオチドは、融合ポリヌクレオチドを形成するために接続されている。いくつかの実施形態では、第１の及び第２のポリヌクレオチドは、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド配列によって接続されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２３５または２３６と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２３５または２３６の配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、５’から３’へ第１の及び第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、３’から５’へ第１の及び第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８１、８２、１０８、１０９、１２０、１２１、１２６、１２７、１３２、１３３、１３８、１３９、１４４、１４５、１５０、１５１、１５６、１５７、１６２、１６３、１６８、１６９、１７４、１７５、１８０、１８１、１８６、１８７、１９２、１９３、１９８、１９９、２０４、２０５、２１０、２１１、２１６、２１７、２２２、２２３、２２８、２２９、２４１、及び２４２からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８１、８２、１０８、１０９、１２０、１２１、１２６、１２７、１３２、１３３、１３８、１３９、１４４、１４５、１５０、１５１、１５６、１５７、１６２、１６３、１６８、１６９、１７４、１７５、１８０、１８１、１８６、１８７、１９２、１９３、１９８、１９９、２０４、２０５、２１０、２１１、２１６、２１７、２２２、２２３、２２８、２２９、２４１、及び２４２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８１または８２と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８１または８２の配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号２４１または２４２と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号２４１または２４２の配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８９、９０、１０２、１０３、１１４、１１５、１２３、１２４、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１、１４２、１４７、１４８、１５３、１５４、１５９、１６０、１６５、１６６、１７１、１７２、１７７、１７８、１８３、１８４、１８９、１９０、１９５、１９６、２０１、２０２、２０７、２０８、２１３、２１４、２１９、２２０、２２５、２２６、２３１、及び２３２からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８９、９０、１０２、１０３、１１４、１１５、１２３、１２４、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１、１４２、１４７、１４８、１５３、１５４、１５９、１６０、１６５、１６６、１７１、１７２、１７７、１７８、１８３、１８４、１８９、１９０、１９５、１９６、２０１、２０２、２０７、２０８、２１３、２１４、２１９、２２０、２２５、２２６、２３１、及び２３２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８９または９０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８９または９０の配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号１０２または１０３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号１０２または１０３の配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号１１４または１１５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号１１４または１１５の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、または融合ポリヌクレオチドは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳをコードする配列は、第１のポリヌクレオチドの５’末端にある。いくつかの実施形態では、ＮＬＳをコードする配列は、第１のポリヌクレオチドの３’末端にある。いくつかの実施形態では、ＮＬＳをコードする配列は、第２のポリヌクレオチドの５’末端にある。いくつかの実施形態では、ＮＬＳをコードする配列は、第２のポリヌクレオチドの３’末端にある。いくつかの実施形態では、ＮＬＳをコードする配列は、第１と第２のポリヌクレオチドの間にある。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、その両方は、２つ以上のＮＬＳをコードする２つ以上の配列を含む。第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは接続されており、第１のポリヌクレオチドは、５’末端でＮＬＳをコードする配列を含み、第２のポリヌクレオチドは、３’末端でＮＬＳをコードする配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは接続されており、第１のポリヌクレオチドは、５’末端で２つ以上のＮＬＳをコードする配列を含み、及び／または第２のポリヌクレオチドは、３’末端で２つ以上のＮＬＳをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳまたは２つ以上のＮＬＳは、双節型ＮＬＳ（ＢＰＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＢＰＮＬＳは、双節型ＳＶ４０ ＮＬＳまたは双節型ＸｅｎｏｐｕｓヌクレオプラスミンＮＬＳである。いくつかの実施形態では、ＢＰＮＬＳは、配列番号４～２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号２３９、２４０、２５１、２５２、２６３、及び２６４に示される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＮＬＳをコードする配列は、配列番号２３９または２４０の配列を含み、第２のポリヌクレオチドの３’末端に接続されている。
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号７９、８０、９４、９５、１０６、１０７、１１８、１１９、２３３、及び２３４からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号７９、８０、９４、９５、１０６、１０７、１１８、１１９、２３３、または２３４の配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号７９または８０の配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号７９または８０の配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８７、８８、９７、９８、１００、１０１、１１２、及び１１３からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８７、８８、９７、９８、１００、１０１、１１２、または１１３の配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８７または８８の配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号８７または８８の配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、３’末端で終止コドンをさらに含む。いくつかの実施形態では、終止コドンは、配列番号２６９～２７２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、終止コドンは、配列ＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ、及びＵＡＡＵＡＧＵＧＡからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、終止コドンは、当該技術分野で知られている任意の終止コドンのＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号２７６～２７９からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号２７６～２７９からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号２８２～２８５からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号２８２～２８５からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、５’非翻訳領域配列（５’ＵＴＲ）または３’非翻訳領域配列（３’ＵＴＲ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号２７４、２７５、５９２、及び５９３からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号２７４、２７５、５９２、及び５９３からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号２８０、２８１、５９４、または５９５からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、配列番号２８０、２８１、５９４、または５９５からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、または融合ポリヌクレオチドは、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、または融合ポリヌクレオチドは、制御性要素を含む。いくつかの実施形態では、制御性要素は、プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、または融合ポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、または融合ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。
本明細書に記載のタンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡは、ＤＮＡを化学的に合成することによって、またはＰＣＲ法及びギブソンアセンブリ法を利用することによって合成された部分的に重複するオリゴＤＮＡ短鎖を接続してその全長をコードするＤＮＡを構築することによって得られ得る。化学的合成またはＰＣＲ法またはギブソンアセンブリ法の組み合わせによって全長ＤＮＡを構築する利点は、使用されるコドンが、ＤＮＡが導入される宿主に応じてＣＤＳ全長において設計され得ることである。異種ＤＮＡの発現において、タンパク質発現レベルは、そのＤＮＡ配列を、宿主生物において非常に頻繁に使用されるコドンに変換することによって増加することが予期される。使用される宿主におけるコード使用頻度のデータとして、例えば、Ｋａｚｕｓａ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのホームページで開示されている遺伝子コード使用頻度データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）が使用され得、または各宿主におけるコドン使用頻度を示す文献が参照され得る。得られるデータ及び導入されるＤＮＡ配列に対する参照によって、ＤＮＡ配列のために使用されるものの中で宿主における低い使用頻度を示すコドンは、同じアミノ酸をコードし、かつ高い使用頻度を示すコドンに変換され得る。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の発現制御性要素、例えば、プロモーター、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、またはそれらの任意の組み合わせに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物成分をコードするポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’末端でＣａｐ及び／または３’末端でポリＡテールを含む。
薬学的組成物
本明細書には、本明細書に記載のプライム編集組成物成分、例えば、プライムエディター、融合タンパク質、プライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＥｇＲＮＡ、ｎｇＲＮＡ、及び／またはプライム編集複合体のいずれかを含む薬学的組成物が開示される。
用語「薬学的組成物」は、本明細書で使用される場合、薬学的使用のために製剤化された組成物を指す。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、例えば、半減期を増加させる、特異的送達のための、追加の薬剤、または他の治療的化合物を含む。
いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、任意のビヒクル、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたは亜鉛、またはステアリン酸）、または化合物を身体のある部位（例えば、送達部位）から別の部位（例えば、身体の器官、組織または一部分）への運搬または輸送に関与する溶媒包含物質を含む。薬学的に許容可能な担体は、製剤の他の成分と適合性があり、対象の組織に対して有害ではない（例えば、生理学的適合性、無菌、生理学的ｐＨ等）という意味で「許容可能」である。本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野で知られているまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。通常、そのような調製方法には、活性成分（複数可）を賦形剤及び／または１つ以上の他の付随成分と会合させ、次いで、必要に応じて及び／または所望により、生成物を所望の単一または複数の用量単位に成形及び／または包装する工程が含まれる。薬学的製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤を追加的に含み得、これには、本明細書で使用される場合、所望の特定の投薬形態と適合するように、あらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤等が含まれる。
編集方法
本明細書に開示される方法及び組成物は、プライム編集によって二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、対象となる標的遺伝子を編集するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、プライム編集方法は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をＰＥｇＲＮＡ及び本明細書に記載のプライムエディター（ＰＥ）ポリペプチドと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子は、二本鎖であり、互いに相補的なＤＮＡの２つの鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡと接触させること及びプライムエディターと接触させることは、順次に実施される。いくつかの実施形態では、プライムエディターと接触させることは、ＰＥｇＲＮＡと接触させた後に実施される。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡと接触させることは、プライムエディターと接触させた後に実施される。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡと接触させること、及びプライムエディターと接触させることは、同時に実施される。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を接触させる前に複合体において会合される。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライム編集組成物と接触させることは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の標的鎖へのＰＥｇＲＮＡの結合をもたらす。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライム編集組成物と接触させることは、ＰＥｇＲＮＡとの接触により、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の標的鎖上のサーチ標的配列へのＰＥｇＲＮＡの結合をもたらす。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライム編集組成物と接触させることは、ＰＥｇＲＮＡの前記接触により、サーチ標的配列に対するＰＥｇＲＮＡのスペーサー配列と、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の標的鎖上のサーチ標的配列との結合をもたらす。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライム編集組成物と接触させることは、ＰＥ組成物と二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子との接触により、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子、例えば、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子へのプライムエディターの結合をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＥのＤＮＡ結合ドメインは、ＰＥｇＲＮＡと会合する。いくつかの実施形態では、ＰＥは、ＰＥｇＲＮＡによって仕向けられる二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を結合させる。したがって、いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の接触は、ＰＥｇＲＮＡによって仕向けられる二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子のプライムエディターのＤＮＡ結合ドメインの結合をもたらす。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライム編集組成物と接触させることは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子と接触し、それにより二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖上でニックを生成することによりプライムエディターによって、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖におけるニックをもたらす。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライム編集組成物と接触させることは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖のニック部位で遊離３’末端を含む一本鎖ＤＮＡをもたらす。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライム編集組成物と接触させることは、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインによって二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖におけるニックをもたらし、それによりニック部位で遊離３’末端を含む一本鎖ＤＮＡを生成する。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓドメインである。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライム編集組成物と接触させることは、ＰＥｇＲＮＡと、ニッキングされた一本鎖ＤＮＡの３’末端とのハイブリダイゼーションをもたらし、それによりプライムエディターのＤＮＡポリメラーゼドメインによってＤＮＡ重合をプライミングする。いくつかの実施形態では、ニック部位で生成された一本鎖ＤＮＡの遊離３’末端は、接触したＰＥｇＲＮＡのプライマー結合部位配列（ＰＢＳ）にハイブリダイズし、それによりＤＮＡ重合をプライミングする。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ重合は、プライムエディターの逆転写酵素ドメインによって触媒される逆転写である。いくつかの実施形態では、方法は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を、プライムエディター融合タンパク質またはプライム編集複合体の一部として（シスで）、または別々のタンパク質として（トランスで）、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライム編集組成物と接触させることは、ニック部位で一本鎖ＤＮＡの３’遊離末端からのＤＮＡポリメラーゼ媒介重合によってＰＥｇＲＮＡの編集鋳型によってコードされる編集された一本鎖ＤＮＡを生成する。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡの編集鋳型は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の内因性配列と比較して１つ以上の意図されるヌクレオチド編集を含む。いくつかの実施形態では、意図されるヌクレオチド編集は、ニック部位で生成された二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖の５’一本鎖ＤＮＡの切除及びＤＮＡ修復によって二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子に組み込まれる。いくつかの実施形態では、意図されるヌクレオチド編集は、編集標的配列の切除及びＤＮＡ修復によって二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ニック部位で生成された編集鎖の５’一本鎖ＤＮＡの切除は、フラップエンドヌクレアーゼによる。いくつかの実施形態では、フラップヌクレアーゼは、ＦＥＮ１である。いくつかの実施形態では、方法は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をフラップエンドヌクレアーゼと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、フラップエンドヌクレアーゼは、プライムエディター融合タンパク質の一部として提供される。いくつかの実施形態では、フラップエンドヌクレアーゼは、トランスで提供される。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライム編集組成物と接触させることは、編集された一本鎖ＤＮＡを含む二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖、及び二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の非編集標的鎖を含むミスマッチヘテロ二本鎖を生成する。理論に縛られることなく、内因性ＤＮＡ修復及び複製は、所望の編集された二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を形成するためにヌクレオチド変化（複数可）を組み込むためにミスマッチの編集されたＤＮＡを解消し得る。
いくつかの実施形態では、方法は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を本明細書に開示されるニックガイド（ｎｇＲＮＡ）と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖上の第２のサーチ標的配列を結合させるスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、接触したｎｇＲＮＡは、ＰＥを、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の標的鎖においてニックを導入するように誘導する。いくつかの実施形態では、標的鎖（非編集鎖）上のニックは、内因性ＤＮＡ修復機構が編集鎖を使用して非編集鎖を修復することをもたらし、それにより二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の両方鎖において意図されるヌクレオチド編集を組み込み、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を修飾する。いくつかの実施形態では、意図されるヌクレオチド編集（複数可）が二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の編集鎖に組み込まれた後にのみ、ｎｇＲＮＡは、編集鎖上の第２のサーチ標的配列と相補的であり、それにハイブリダイズし得るスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子は、ｎｇＲＮＡ、ＰＥｇＲＮＡ、及びＰＥによって同時に接触させられる。いくつかの実施形態では、ｎｇＲＮＡ、ＰＥｇＲＮＡ、及びＰＥは、それらが二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を接触させた場合、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子は、ｎｇＲＮＡ、ＰＥｇＲＮＡ、及びプライムエディターと順次に接触させられる。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をＰＥと接触させた後に、ｎｇＲＮＡ及び／またはＰＥｇＲＮＡと接触させられる。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライムエディターと接触させる前に、ｎｇＲＮＡ及び／またはＰＥｇＲＮＡと接触させられる。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子は、細胞におけるものである。したがって、また、本明細書では、細胞を修飾する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、プライム編集方法は、ＰＥｇＲＮＡ、プライムエディター、及び／またはｎｇＲＮＡを二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を有する細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、プライム編集方法は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を有する細胞に、ＰＥｇＲＮＡ、プライムエディターポリペプチド、及び／またはｎｇＲＮＡを含むプライム編集組成物に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡ、プライムエディターポリペプチド、及び／またはｎｇＲＮＡは、細胞への導入の前に複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡ、プライムエディターポリペプチド、及び／またはｎｇＲＮＡは、細胞への導入の後に複合体を形成する。プライムエディター、ＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡ、及びプライム編集複合体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、ｍＲＮＡ送達、及び物理的技術、例えば、マイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜破壊を含む、本明細書に記載の任意の送達アプローチまたは当該技術分野で知られている任意の送達アプローチによって細胞に導入され得る。プライムエディター、ＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡ、及びプライム編集複合体は、同時にまたは順次に細胞に導入され得る。
いくつかの実施形態では、プライム編集方法は、ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、プライムエディターポリペプチドをコードするプライムエディターポリヌクレオチド、及び任意にｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、プライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／またはｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを同時に細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、プライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／またはｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを細胞に順次に導入することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド及び／またはｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの導入の前に、プライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド及び／またはｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の前に細胞に導入され、発現させられる。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド及び／またはｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが細胞に導入された後に細胞に導入される。プライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及び／またはｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意の送達アプローチまたは当該技術分野で知られている任意の送達アプローチ、例えば、ＲＮＰ、ＬＮＰ、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、ｍＲＮＡ送達、及び物理的送達によって細胞に導入され得る。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及び／またはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、細胞に導入された後に細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及び／またはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、一過性発現のために細胞に導入される。したがって、また、本明細書では、プライム編集によって修飾された細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒト霊長類細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、げっ歯類またはマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、人工ヒト多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する初代ヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトＨＳＣである。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣである。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、ヒトＣＤ３４＋造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）における発現のためのものである。
いくつかの実施形態では、プライム編集によって編集される二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子は、細胞の染色体におけるものである。いくつかの実施形態では、意図されるヌクレオチド編集は、細胞の染色体に組み込まれ、子孫細胞によって継承可能である。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物及び方法によって細胞に導入された意図されるヌクレオチド編集は、細胞及び細胞の子孫もまた、意図されるヌクレオチド編集を含むようなものである。いくつかの実施形態では、細胞は、対象に対して自己、同種、または異種である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象からのものであり、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象からのものであり、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、プライム編集による意図されるヌクレオチド編集の組み込み後に、対象、例えば、ヒト対象に導入して戻される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、プライムエディターポリペプチドまたはプライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及び／またはｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を含む複数の細胞または細胞の集団に導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、同じ細胞タイプのものである。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、同じ組織または器官のものである。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、異種である。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、同種である。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、単一の組織または器官からのものであり、細胞は、異種である。いくつかの実施形態では、細胞の集団への導入は、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるものである。いくつかの実施形態では、細胞の集団への導入は、ｉｎ ｖｉｖｏ、例えば、ヒト対象内へのものである。
いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子は、集団の各細胞のゲノムにおけるものである。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドまたはプライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及び／またはｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの導入は、細胞の集団における細胞の少なくとも１つにおける二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みをもたらす。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドまたはプライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及び／またはｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの導入は、複数の細胞の集団における二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みをもたらす。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドまたはプライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及び／またはｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの導入は、細胞の集団の各細胞における二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みをもたらす。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドまたはプライムエディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＥｇＲＮＡまたはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及び／またはｎｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの導入は、疾患または障害が処置、予防または改善されるように十分な数の細胞における二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みをもたらす。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物及び本明細書に記載の方法の編集効率は、プライム編集組成物が導入された細胞の集団における編集された二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子のパーセンテージを計算することによって測定され得る。いくつかの実施形態では、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、７日、１０日、または１４日の二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子のプライム編集組成物への曝露の後に編集効率が決定される。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物が導入された細胞の集団は、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるものである。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物が導入された細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるものである。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物が導入された細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、好適な対照と比べて少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の編集効率を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、好適な対照と比べて少なくとも２５％の編集効率を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、好適な対照と比べて少なくとも３５％の編集効率を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、好適な対照と比べて少なくとも３０％の編集効率を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、好適な対照と比べて少なくとも４５％の編集効率を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、好適な対照と比べて少なくとも５０％の編集効率を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、好適な対照初代細胞と比べて初代細胞において少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約７．５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の編集の編集効率を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、対応する対照肝細胞と比べて肝細胞において少なくとも約５％、少なくとも約７．５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の編集の編集効率を有する。いくつかの実施形態では、肝細胞は、ヒト肝細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、対応する対照ＨＳＣと比べて造血幹細胞（ＨＳＣ）において少なくとも約５％、少なくとも約７．５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の編集の編集効率を有する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、ヒトＨＳＣである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、配列番号２５の及び／または配列番号２６によってコードされる配列を有するプライムエディターでのプライム編集と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％またはそれを超える増加した編集効率を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、配列番号２５の及び／または配列番号２６によってコードされる配列を有するプライムエディターでのプライム編集と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％またはそれを超える増加した編集効率を有する。いくつかの実施形態では、増加した編集効率は、ヒト細胞におけるものである。いくつかの実施形態では、増加した編集効率は、初代細胞におけるものである。いくつかの実施形態では、増加した編集効率は、ヒト初代細胞におけるものである。いくつかの実施形態では、増加した編集効率は、前駆細胞におけるものである。いくつかの実施形態では、増加した編集効率は、ヒト前駆細胞におけるものである。いくつかの実施形態では、増加した編集効率は、肝細胞におけるものである。いくつかの実施形態では、増加した編集効率は、ヒト肝細胞におけるものである。いくつかの実施形態では、増加した編集効率は、人工ヒト多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する初代ヒト肝細胞におけるものである。いくつかの実施形態では、増加した編集効率は、造血幹細胞（ＨＳＣ）におけるものである。いくつかの実施形態では、増加した編集効率は、初代細胞におけるものである。いくつかの実施形態では、増加した編集効率は、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣにおけるものである。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるプライム編集組成物は、有意な割合のインデルを生成せずに１つ以上の意図されるヌクレオチド編集を組み込むことが可能である。用語「インデル（複数可）」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド、例えば、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子内のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を指す。そのような挿入または欠失は、遺伝子のコード領域内のフレームシフト変異をもたらし得る。編集のインデル頻度は、当該技術分野で知られている方法によって計算され得る。いくつかの実施形態では、インデル頻度は、配列アライメント、例えば、Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７（３）：２２４－２２６（２０１９）（その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ ２アルゴリズムに基づいて計算され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、２０％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、未満１．５％、または１％未満のインデル頻度を有し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、または少なくとも１４日の二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の曝露の後に任意の数のインデルが決定される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるプライム編集組成物は、有意な割合のインデルを生成せずに１つ以上の意図されるヌクレオチド編集を効率的に組み込むことが可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約１％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約１％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約１％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約５％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約５％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約５％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約７．５％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約７．５％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約７．５％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約１０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約１０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約１０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約１５％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約１５％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約１５％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約２０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約２０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約２０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約３０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約３０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約３０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約４０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約４０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約４０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約５０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約５０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約５０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約６０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約６０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約６０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約７０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約７０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約７０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約８０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約８０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約８０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約９０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約９０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒトＨＳＣにおいて少なくとも約９０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒト細胞において少なくとも約９５％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒト細胞において少なくとも約９５％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞、例えば、ヒト細胞において少なくとも約９５％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団、例えば、ヒト細胞、例えば、ヒト幹細胞の集団において少なくとも約１％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７．５％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７．５％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７．５％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７．５％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７．５％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７．５％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７．５％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１０％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１０％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１０％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１０％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１５％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１５％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１５％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１５％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１５％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１５％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約１５％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約２０％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約２０％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約２０％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約２０％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団、例えば、ヒト幹細胞の集団において少なくとも約２０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約２０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約２０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約３０％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約３０％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約３０％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約３０％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約３０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約３０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約３０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約４０％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約４０％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約４０％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約４０％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約４０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約４０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約４０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５０％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５０％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５０％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５０％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約５０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約６０％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約６０％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約６０％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約６０％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約６０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約６０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約６０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７０％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７０％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７０％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７０％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約７０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約８０％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約８０％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約８０％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約８０％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約８０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約８０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約８０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９０％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９０％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９０％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９０％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９０％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９０％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９０％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９５％の編集効率及び１０％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９５％の編集効率及び７．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９５％の編集効率及び５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９５％の編集効率及び２．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９５％の編集効率及び１％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９５％の編集効率及び０．５％未満のインデル頻度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライム編集方法は、標的細胞の集団において少なくとも約９５％の編集効率及び０．１％未満のインデル頻度を有する。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、標的細胞におけるものである。したがって、一態様では本明細書では、ポリペプチドをコードした二本鎖標的ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子）を含む標的細胞を編集する方法であって、二本鎖標的ＤＮＡは、野生型二本鎖ＤＮＡ（例えば、野生型遺伝子）と比べて１つ以上の変異を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、ＰＥｇＲＮＡ、プライムエディターポリペプチド、ｎｇＲＮＡ、及び／またはＰＥｇＲＮＡ、プライムエディターポリペプチド、またはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物を標的遺伝子を有する標的細胞に導入して、標的遺伝子を編集し、それにより編集された細胞を生成することを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、本明細書に開示される細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ヒト細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライム編集組成物の成分は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで標的細胞に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライム編集組成物の成分は、ｅｘ ｖｉｖｏで標的細胞に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライム編集組成物の成分は、ｉｎ ｖｉｖｏで標的細胞に提供される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、または少なくとも１４日の二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子のプライム編集組成物への曝露の後に任意の数のインデルが決定される。いくつかの実施形態では、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、７日、１０日、または１４日の二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子のプライム編集組成物への曝露の後に編集効率が決定される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライム編集組成物は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を含む染色体において５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、未満０．０５％、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、または０．０１％未満のオフターゲット編集をもたらす。いくつかの実施形態では、オフターゲット編集は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、または少なくとも１４日の二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子（例えば、細胞のゲノム内の核酸）のプライム編集組成物への曝露の後に決定される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライム編集組成物の成分は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで標的細胞に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライム編集組成物の成分は、ｅｘ ｖｉｖｏで標的細胞に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライム編集組成物の成分は、ｉｎ ｖｉｖｏで標的細胞に提供される。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物（例えば、本明細書に記載されるＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディター）及び本明細書に開示されるプライム編集方法は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を編集するために使用され得る。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子は、同じ遺伝子の野生型配列と比較して変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、遺伝子疾患または障害に関連する。いくつかの実施形態では、変異は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子のコード領域にある。いくつかの実施形態では、変異は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子のエクソンにある。いくつかの実施形態では、プライム編集方法は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を、プライムエディター、ＰＥｇＲＮＡ、及び／またはｎｇＲＮＡを含むプライム編集組成物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライム編集組成物と接触させることは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みをもたらす。いくつかの実施形態では、組み込みは、標的遺伝子における編集標的配列に対応する二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の領域におけるものである。いくつかの実施形態では、１つ以上の意図されるヌクレオチド編集は、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子の内因性配列と比較して、単一のヌクレオチド置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みは、１つ以上の変異と、対応する野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列との置き換えをもたらす。いくつかの実施形態では、１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みは、１つ以上の変異と、対応する野生型遺伝子配列との置き換えをもたらす。いくつかの実施形態では、１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における変異の修正をもたらす。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子は、変異を含有する編集鋳型配列を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子をプライム編集組成物と接触させることは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における編集標的配列（または編集標的配列及び標的鎖上の編集標的配列に対する相補的配列を含む二本鎖領域）における変異を修正する二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みをもたらす。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異を含む二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みは、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の野生型発現及び機能を回復させる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現及び／または機能は、標的細胞において発現した場合に測定され得る。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みは、標的遺伝子発現のレベルの倍率変化及び／または標的遺伝子によってコードされる機能的タンパク質のレベル倍率変化をもたらす。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現レベルにおけるレベルの変化は、本明細書に記載のプライム編集組成物が導入されていない好適な対照細胞における発現と比較して、例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれを超える倍率変化を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異を含む二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みは、野生型標的遺伝子を含む好適な対照細胞における対応するタンパク質の野生型発現と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超えて標的遺伝子によってコードされる機能的タンパク質の野生型発現を回復させる。
いくつかの実施形態では、発現増加は、機能性アッセイによって測定され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質発現は、タンパク質アッセイを使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質発現は、抗体試験を使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質発現は、ＥＬＩＳＡ、質量分析、ウエスタンブロット、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動、またはそれらの任意の組み合わせを使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質アッセイは、クマシーブルー染色ゲルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びデンシトメトリー分析を含み得る。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、遺伝子疾患または障害に関連する１つ以上の変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書では、プライム編集によって修正され得る１つ以上の病原性変異に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患を有すると診断された対象の処置のための方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書では、遺伝子疾患を処置するための方法であって、治療的有効量のプライム編集組成物、または本明細書に記載されるプライム編集組成物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物の投与は、対象における二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みをもたらす。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物の投与は、対象における疾患に関連する１つ以上の病原性変異、例えば、点変異、挿入、または欠失の修正をもたらす。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子は、病原性変異を含有する編集標的配列を含む。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物の投与は、対象における二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における編集標的配列（または編集標的配列及び標的鎖上の編集標的配列に対する相補的配列を含む二本鎖領域）における病原性変異を修正する二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子における１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みをもたらす。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、有効量のプライム編集組成物、例えば、ＰＥｇＲＮＡ、プライムエディター、及び／またはｎｇＲＮＡを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、有効量の本明細書に記載のプライム編集組成物、例えば、プライム編集組成物成分をコードするポリヌクレオチド、ベクター、またはコンストラクト、またはプライム編集組成物成分を含むＲＮＰ、ＬＮＰ、及び／またはポリペプチドを対象に投与することを含む。プライム編集組成物は、疾患に罹患している、疾患を有する、疾患に罹患しやすい、または疾患のリスクがある対象、例えば、ヒト対象における病原性変異（複数可）を有する標的遺伝子を標的とするように投与され得る。そのような処置を必要とする対象を同定することは、対象またはヘルスケア専門家の判断であり得、主観的（例えば、意見）または客観的（例えば、検査または診断方法によって測定可能）であり得る。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書で提供されるプライム編集組成物を対象に直接的に投与することを含む。本明細書に記載のプライム編集組成物は、本明細書に記載される任意の形態、例えば、ＬＮＰ、ＲＮＰ、ポリヌクレオチドベクター、例えば、ウイルスベクター、またはｍＲＮＡで送達され得る。プライム編集組成物は、対象に直接的に投与するために本明細書に記載されているまたは当該技術分野で知られている任意の薬学的に許容可能な担体で製剤化され得る。プライム編集組成物またはその薬学的組成物の成分は、同時にまたは順次に対象に投与され得る。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、プライムエディター融合タンパク質及びＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡを含む複合体を含むプライム編集組成物、またはその薬学的組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡと同時にプライムエディターをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡの投与の前にプライムエディターをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを対象に投与することを含む。
プライム編集組成物を対象に投与する好適な経路には、限定されないが、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、経鼓膜、器官内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、及び脳室内投与が含まれる。いくつかの実施形態では、記載される組成物は、腹腔内に、静脈内に、または直接的注射もしくは直接的注入によって投与される。いくつかの実施形態では、記載される組成物は、直接的注射または注入または輸液、移植（例えば、本明細書に記載されるプライム編集複合体と接触させられた細胞を使用する同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ））によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、注射によって、カテーテルを用いて、座剤を用いて、または埋込物を用いて対象に投与される。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載のプライム編集組成物で編集された細胞を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、同種である。いくつかの実施形態では、同種細胞は、プライム編集組成物またはその薬学的組成物とｅｘ ｖｉｖｏで接触させられ、または接触させられており、それを必要とするヒト対象に導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、対象に対して自己である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から除去され、プライム編集組成物またはその薬学的組成物とｅｘ ｖｉｖｏで接触させられ、対象に再導入される。
いくつかの実施形態では、細胞は、プライム編集組成物の１つ以上の成分とｅｘ ｖｉｖｏで接触させられる。細胞は、本明細書に記載されているまたは当該技術分野で知られている任意のアプローチでｅｘ ｖｉｖｏで接触させられ得る。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞は、エレクトロポレーションによってプライム編集組成物の１つ以上の成分とｅｘ ｖｉｖｏで接触させられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞は、プライム編集組成物またはその成分を含むＬＮＰによってｅｘ ｖｉｖｏでプライム編集組成物の１つ以上の成分と接触させられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞は、プライム編集組成物の１つ以上の成分とｅｘ ｖｉｖｏで接触させられ、プライム編集組成物の１つ以上の成分は、細胞浸透性ペプチドに関連する。いくつかの実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏで接触させられた細胞は、対象に導入され、対象は、プライム編集組成物の１つ以上の成分とｉｎ ｖｉｖｏで投与される。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、プライムエディターとｅｘ ｖｉｖｏで接触させられ、対象に導入される。いくつかの実施形態では、対象は、次いでＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡ、またはＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが投与される。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物と接触させられた細胞は、対象への再導入前にゲノムにおける１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みについて決定される。いくつかの実施形態では、細胞は、対象への再導入前にゲノムにおいて１つ以上の意図されるヌクレオチド編集の組み込みが濃縮される。いくつかの実施形態では、編集される細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、編集される細胞は、前駆細胞である。いくつかの実施形態では、編集される細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、編集される細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態では、編集される細胞は、初代ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、編集される細胞は、ヒト前駆細胞である。いくつかの実施形態では、編集される細胞は、ヒト幹細胞である。いくつかの実施形態では、編集される細胞は、ヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ニューロンである。いくつかの実施形態では、細胞は、大脳基底核からのニューロンである。いくつかの実施形態では、細胞は、対象の大脳基底核からのニューロンである。いくつかの実施形態では、細胞は、対象の大脳基底核におけるニューロンである。
プライム編集組成物またはその成分は、ＬＮＰ投与、ＲＮＰ投与、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、トランスフェクション、ウイルス形質導入、マイクロインジェクション、細胞膜破壊及び拡散を含む本明細書に記載される任意の送達アプローチ、または当該技術分野で知られている任意の他のアプローチによって細胞に導入され得る。
プライム編集で編集された細胞は、当該技術分野で知られている任意の経路によって対象に導入され得る。いくつかの実施形態では、編集された細胞は、直接的注入によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、編集された細胞は、静脈内注入によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、編集された細胞は、埋込物として対象に投与される。
いくつかの実施形態では、対象における編集される標的遺伝子は、ＨＢＢ遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＨＢＢ遺伝子は、鎌状赤血球病に関連する変異を含む。いくつかの実施形態では、ＨＢＢ遺伝子は、野生型ベータグロビンタンパク質と比較してＨＢＢ遺伝子によってコードされるベータグロビンタンパク質におけるＥ６Ｖアミノ酸置換をコードする変異を含む。いくつかの実施形態では、本明細書では、プライムエディター及びＰＥｇＲＮＡを含むプライム編集組成物であって、ＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターを、ＨＢＢ遺伝子における鎌状赤血球病に関連する変異を修正するように誘導することが可能である、プライム編集組成物が提供される。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、意図されるヌクレオチド編集を含む編集鋳型を含み、ＨＢＢ遺伝子における意図されるヌクレオチド編集の組み込みは、鎌状赤血球病に関連するＨＢＢ遺伝子における変異を修正する。いくつかの実施形態では、編集鋳型は、野生型ＨＢＢ遺伝子の野生型配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書では、ＨＢＢ遺伝子における鎌状赤血球病に関連する変異を修正する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＨＢＢ遺伝子をＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターと接触させることを含み、ＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターが、ＨＢＢ遺伝子において意図されるヌクレオチド編集を組み込むように誘導し、それによりＨＢＢ遺伝子における鎌状赤血球病に関連する変異を修正する。いくつかの実施形態では、ＨＢＢ遺伝子は、細胞におけるものである。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、ＨＢＢ遺伝子を含む細胞にＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターを導入することを含み、ＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターが、ＨＢＢ遺伝子において意図されるヌクレオチド編集を組み込むように誘導し、それによりＨＢＢ遺伝子における鎌状赤血球病に関連する変異を修正する。いくつかの実施形態では、方法は、ＨＢＢ遺伝子を含む細胞にＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、プライムエディターの発現により、ＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターが、ＨＢＢ遺伝子において意図されるヌクレオチド編集を組み込むように誘導し、それによりＨＢＢ遺伝子における鎌状赤血球病に関連する変異を修正する。いくつかの実施形態では、細胞は、血液細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＢＢ遺伝子は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるものである。いくつかの実施形態では、細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるものである。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターは、同時に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターをコードするポリヌクレオチドは、同時に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターは、順次に細胞に導入され、例えば、ＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターの導入の前または後に導入され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターをコードするポリヌクレオチドは、順次に細胞に導入され、例えば、ＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターをコードするポリヌクレオチドの導入の前または後に導入され得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書では、鎌状赤血球病を処置する方法であって、方法は、ＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターまたはプライムエディターをコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することを含み、ＰＥｇＲＮＡは、対象におけるＨＢＢ遺伝子において意図されるヌクレオチド編集を組み込むように誘導し、それによりＨＢＢ遺伝子における変異を修正し、鎌状赤血球病を処置する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、鎌状赤血球病を処置する方法は、ＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターまたはプライムエディターをコードするポリヌクレオチドを細胞または細胞の集団に導入してＨＢＢにおける鎌状赤血球病に関連する変異を修正すること、及びその後、編集された細胞または編集された細胞の集団をそれを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞の集団は、編集の前にそれを必要とする対象から得られる。いくつかの実施形態では、細胞または細胞の集団は、編集前にドナーから得られる。いくつかの実施形態では、細胞または細胞の集団は、造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターは、同時に投与される。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターをコードするポリヌクレオチドは、同時に投与される。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターは、順次に投与され、例えば、ＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターの投与の前または後に投与され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡ及びプライムエディターをコードするポリヌクレオチドは、順次に投与され、例えば、ＰＥｇＲＮＡは、プライムエディターをコードするポリヌクレオチドの投与の前または後に投与され得る。
本明細書に記載される薬学的組成物、プライム編集組成物、及び細胞は、有効量で投与され得る。いくつかの実施形態では、有効量は、投与様式に依存する。いくつかの実施形態では、有効量は、病態の段階、対象の年齢及び身体的状態、もし存在する場合は、併用療法の特質、ならびに医療実践者によく知られている同様の因子に依存する。
投与される特定の用量は、各対象について均一な用量であり得る。代替的には、対象の用量は、対象のおおよその体重に対して調整され得る。適切な投薬量を決定する際の他の要因には、処置または予防される疾患または病態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別及び医学的状態が含まれ得る。
プライム編集組成物の成分が順次に投与される実施形態では、逐次投与間の時間は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、または少なくとも１４日であり得る。
送達
本明細書に記載のプライム編集組成物は、当該技術分野で知られている任意のアプローチで細胞環境に送達され得る。プライム編集組成物の成分は、同じ様式または異なる様式によって細胞に送達され得る。例えば、いくつかの実施形態では、プライムエディターまたはその成分（例えば、ＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡポリメラーゼドメイン）は、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）としてまたはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として送達され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥｇＲＮＡは、ＲＮＡとしてまたはＰＥｇＲＮＡをコードするＤＮＡとしてまたはＲＮＰ複合体としてＰＥタンパク質に複合体化されたＲＮＡとして直接的に送達され得る。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物の成分は、ＤＮＡ及びＲＮＡの組み合わせとして送達され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディター組成物の成分は、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、及びタンパク質の組み合わせとして送達され得る。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物の成分は、ポリヌクレオチド、ベクター、またはコンストラクトによってコードされる。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチド、ＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡは、ポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含むプライムエディター融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、プライムエディターのＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、プライムエディターのＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、プライムエディタータンパク質の一部分、例えば、インテイン－Ｎに接続されたプライムエディター融合タンパク質のＮ末端部分をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、プライムエディタータンパク質の一部分、例えば、インテイン－Ｃに接続されたプライムエディター融合タンパク質のＣ末端部分をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、プライム編集組成物の２つ以上の成分、例えば、プライムエディター融合タンパク質及びＰＥｇＲＮＡをコードする。
いくつかの実施形態では、１つ以上のプライム編集組成物成分をコードするポリヌクレオチドは、例えば、レトロウイルスベクターによって、標的細胞に送達され、長期発現のために細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、標的細胞に送達されたポリヌクレオチドは、一過性に発現する。例えば、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、またはエピソーム発現のための非組み込みベクター（非組み込みウイルス、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ）の形態で送達され得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上のプライム編集システム成分をコードするポリヌクレオチドは、制御性要素、例えば、転写コントロール要素、例えば、プロモーターに機能可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のコントロール要素に機能可能に連結される。利用される発現システムに応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含む多数の好適な転写及び翻訳コントロール要素のいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る（例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）。
いくつかの実施形態では、１つ以上のプライム編集組成物成分をコードするポリヌクレオチドは、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）の一部であり、またはそのベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、送達は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕにおけるものである。
非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写産物）、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクル、例えば、リポソームに複合体化された核酸が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡまたは転写産物として提供される。プライム編集システムの任意のＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡまたはプライムエディターをコードするｍＲＮＡは、ＲＮＡの形態で送達され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡであるプライム編集システムの１つ以上の成分は、直接的化学合成によって生成され、またはＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用して生成される。ガイドポリヌクレオチド（例えば、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡ）はまた、Ｔ７プロモーターと、それに続く配列「ＧＧ」、及びガイドポリヌクレオチド配列を含有するカセットからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用して転写され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードするｍＲＮＡ、ＰＥｇＲＮＡ、及び／またはｎｇＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ等）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで合成される。合成されると、ＲＮＡは、二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子を直接的に接触させ得、または核酸を細胞に導入するための任意の好適な技術（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスフェクション）を使用して細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターをコードする配列、ＰＥｇＲＮＡ、及び／またはｎｇＲＮＡは、例えば、シュード－Ｕまたは５－メチル－Ｃを使用して、１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含むように修飾される。
核酸の非ウイルスの送達の方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポゾーム、細胞浸透性ペプチド、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、マイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜破壊、及びＤＮＡの薬剤向上取り込みが含まれ得る。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質が使用され得る。送達は、細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ投与）へのものであり得る。標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体、例えば、免疫脂質複合体の調製物が使用され得る。
ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有し得るＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ得る。ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムは、特定の細胞を標的とし、ウイルスペイロードを細胞の小器官にトラフィッキングするために使用され得る。ウイルスベクターは、直接的に（ｉｎ ｖｉｖｏで）投与され得、またはそれらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を処置するために使用され得、修飾された細胞は、（ｅｘ ｖｉｖｏで）任意に投与され得る。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたは単純ヘルペスウイルスベクターである。レトロウイルスベクターには、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせに基づくものが含まれ得る。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、ガンマレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。
いくつかの実施形態では、１つ以上のプライム編集組成物成分をコードするポリヌクレオチドは、ウイルス粒子にパッケージングされる。パッケージング細胞が、標的細胞を感染させ得るウイルス粒子を形成するために使用され得る。そのような細胞には、２９３細胞（例えば、アデノウイルスをパッケージングする場合）、及びψ２細胞またはＰＡ３１７細胞（例えば、レトロウイルスをパッケージングする場合）が含まれ得る。ウイルスベクターは、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする細胞株を生成することによって生成され得る。ベクターは、パッケージング及びその後の宿主への組み込みのために必要とされる最小ウイルス配列を含有し得る。ベクターは、発現されるポリヌクレオチド（複数可）のための発現カセットによって置き換えられる他のウイルス配列を含有し得る。欠いているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給され得る。例えば、ＡＡＶベクターは、パッケージング及び宿主ゲノムへの組み込みのために必要とされるＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、二重ＡＡＶベクターは、大きな導入遺伝子発現カセットを２つの別個の半分（例えば、プライムエディターポリペプチドのＮ末端部分及びＣ末端部分をコードする５’及び３’末端）に分割することによって生成され、カセットの各半分は、長さが５ｋｂ以下、任意に長さが４．７ｋｂ以下であり、単一のＡＡＶベクターにパッケージングされる。いくつかの実施形態では、全長導入遺伝子発現カセットは、両方の二重ＡＡＶベクターによる同じ細胞の共感染により再構築され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼの一部分または断片は、インテインに融合される。ポリペプチドの一部分または断片は、インテインのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＮ末端部分は、インテイン－Ｎに融合され、ポリペプチドのＣ末端部分は、インテイン－Ｃに別々に融合される。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質の一部分または断片は、インテインに融合され、ＡＡＶカプシドタンパク質に融合される。インテイン、ヌクレアーゼ及びカプシドタンパク質は、任意の配置（例えば、ヌクレアーゼ－インテイン－カプシド、インテイン－ヌクレアーゼ－カプシド、カプシド－インテイン－ヌクレアーゼ等）で一緒に融合され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、２つの別々の半分（それぞれがプライムエディター融合タンパク質の一部分をコードする）に分割され、インテインに別々に融合される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの２つの半分の各々は、二重ＡＡＶベクターシステムの個々のＡＡＶベクターにおいてパッケージングされる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの２つの半分の各々は、長さが５ｋｂ以下、任意に長さが４．７ｋｂ以下である。いくつかの実施形態では、全長プライムエディター融合タンパク質は、両方の二重ＡＡＶベクターによる同じ細胞の共感染、プライムエディター融合タンパク質の両方の半分の発現、及びインテインの自己切除により再構築される。いくつかの実施形態では、二重ＡＡＶベクターのｉｎ ｖｉｖｏ使用は、全長プライムエディター融合タンパク質の発現をもたらす。いくつかの実施形態では、二重ＡＡＶベクタープラットフォームの使用は、サイズが約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０ｋｂを超える導入遺伝子の実行可能な送達を可能とする。標的細胞は、本明細書に記載の１つ以上のベクターで一過性または非一過性でトランスフェクションされ得る。細胞は、対象において自然に生じるようにトランスフェクションされ得る。細胞は、対象から取得され、またはそれに由来し、トランスフェクションされ得る。細胞は、対象から取得された細胞、例えば、細胞株に由来し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のベクターでトランスフェクションされた細胞は、１つ以上のベクターに由来する配列を含む新たな細胞株を樹立するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物で一過性にトランスフェクション（例えば、１つ以上のベクターの一過性トランスフェクション、またはＲＮＡでのトランスフェクションによる）され、かつプライムエディターの活性を介して修飾された細胞は、修飾を含有するが、任意の他の外因性配列を欠く新たな細胞株を樹立するために使用され得る。宿主細胞と適合性がある任意の好適なベクターは、本開示の方法と共に使用され得る。ベクターの非限定的な例には、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０が含まれる。
いくつかの実施形態では、プライムエディタータンパク質は、ポリペプチドとして細胞に提供され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディタータンパク質は、タンパク質の溶解性を増加させるポリペプチドドメインに融合される。いくつかの実施形態では、プライムエディタータンパク質は、タンパク質の溶解性を改善するように製剤化される。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、細胞による取り込みを促進するためにポリペプチド浸透ドメインに融合される。いくつかの実施形態では、浸透ドメインは、包含ペプチド、ペプチド模倣体、または非ペプチド担体である。例えば、浸透ペプチドは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを含む、ペネトラチンと称される、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ転写因子アンテナペディアの第３のアルファヘリックスに由来し得る。別の例として、浸透ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｔａｔ塩基性領域アミノ酸配列を含み得、これには、例えば、天然に存在するｔａｔタンパク質のアミノ酸４９～５７が含まれ得る。他の浸透ドメインには、ポリ－アルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ－１ ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４～５６の領域、ノナ－アルギニン、及びオクタ－アルギニンが含まれ得る。ノナ－アルギニン（Ｒ９）配列が使用され得る。融合が行われ得る部位は、ポリペプチドの生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するために選択され得る。
いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは宿主細胞によって生成され、それは、アンフォールディング、例えば、熱変性、ＤＴＴ還元等によってさらに処理され、さらに再フォールディングされ得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成によって調製される。様々な市販の合成装置が使用され得る。合成機を使用することによって、天然に存在するアミノ酸は、非天然アミノ酸で置換され得る。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチドは、組換え合成方法に従って、例えば、宿主細胞における発現によって単離及び精製され、ライセートは、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製技術を使用して精製される。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物、例えば、プライムエディターポリペプチド成分及びＰＥｇＲＮＡ／ｎｇＲＮＡは、ナノ粒子によって標的細胞に導入される。いくつかの実施形態では、プライムエディターポリペプチド成分及びＰＥｇＲＮＡ及び／またはｎｇＲＮＡは、ナノ粒子において複合体を形成する。任意の好適なナノ粒子設計が、ゲノム編集システム成分またはそのような成分をコードする核酸を送達するため使用され得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、無機である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、有機である。いくつかの実施形態では、プライム編集組成物は、有機ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）またはポリマーナノ粒子中で標的細胞、例えば、肝細胞に送達される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性、中性脂質、またはそれらの組み合わせから製剤化される。いくつかの実施形態では、中性脂質、例えば、フソゲン性リン脂質ＤＯＰＥまたは膜成分コレステロールは、トランスフェクション活性及びナノ粒子安定性を向上させるために含まれる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、疎水性脂質、親水性脂質、またはそれらの組み合わせを用いて製剤化される。脂質は、ＬＮＰを生成するために広範囲のモル比で製剤化され得る。当該技術分野で知られている任意の脂質または脂質の組み合わせが、ＬＮＰを生成するために使用され得る。ＬＮＰを生成するために使用される例示的な脂質が以下の表４に提供される。
いくつかの実施形態では、プライム編集組成物の成分は、標的細胞への送達前に複合体を形成する。例えば、プライムエディター融合タンパク質、ＰＥｇＲＮＡ、及び／またはｎｇＲＮＡは、標的細胞への送達前に複合体を形成し得る。いくつかの実施形態では、プライム編集ポリペプチド（例えば、プライムエディター融合タンパク質）及びガイドポリヌクレオチド（例えば、ＰＥｇＲＮＡまたはｎｇＲＮＡ）は、標的細胞への送達のためのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成する。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、ＰＥｇＲＮＡと複合したプライムエディター融合タンパク質を含む。ＲＮＰは、既知の方法、例えば、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、またはカチオン性脂質媒介法、または当該技術分野で知られている任意の他のアプローチを使用して細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、標的細胞へのプライム編集組成物または複合体の送達は、細胞への外来ＤＮＡの送達を必要としない。いくつかの実施形態では、プライム編集複合体を含むＲＮＰは、標的細胞において経時的に分解する。ナノ粒子製剤及び／または遺伝子移行において使用するための例示的な脂質が以下の表４に示されている。
Figure 2024525665000008
Figure 2024525665000009
ナノ粒子製剤及び／または遺伝子移行において使用するための例示的なポリマーが以下の表５に示されている。

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プライム編集組成物成分をコードするポリヌクレオチドのための例示的な送達方法が以下の表６に示されている。

Figure 2024525665000011
本開示のプライム編集組成物は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとして導入されるかどうかにかかわらず、約３０分～約２４時間、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間 ４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、または約３０分～約２４時間の任意の他の時間の間、細胞に提供され、これは、約１日毎～約４日毎の頻度、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎、または約１日毎～約４日毎の任意の他の頻度で繰り返され得る。組成物は、１回以上、例えば、１回、２回、３回、または３回を超えて対象細胞に提供され得、細胞は、各接触事象の後のいくらかの時間、例えば、１６～２４時間、薬剤（複数可）とインキュベートさせられる。２つ以上の異なるプライム編集システム成分、例えば、２つの異なるポリヌクレオチドコンストラクトが細胞に提供される場合（例えば、同じプライム編集システムの異なる成分、または同じまたは異なる二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子内の異なる配列と相補的である２つの異なるガイド核酸）、組成物は、（例えば、２つのポリペプチド及び／または核酸として）同時に送達され得る。代替的には、それらは、順次に提供され得、例えば、１つの組成物が最初に提供され、それに続いて第２の組成物が提供される。
本開示のプライム編集組成物及び薬学的組成物は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとして導入されるかどうかにかかわらず、約３０分～約２４時間、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間 ４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、または約３０分～約２４時間の任意の他の時間の間、必要とする対象に投与され、これは、約１日毎～約４日毎の頻度、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎、または約１日毎～約４日毎の任意の他の頻度で繰り返され得る。組成物は、１回以上、例えば、１回、２回、３回、または３回を超えて対象に提供され得る。２つ以上の異なるプライム編集システム成分、例えば、２つの異なるポリヌクレオチドコンストラクトが対象に投与される場合（例えば、同じプライム編集システムの異なる成分、または同じまたは異なる二本鎖標的ＤＮＡ、例えば、標的遺伝子内の異なる配列に相補的である２つの異なるガイド核酸）、組成物は、（例えば、２つのポリペプチド及び／または核酸として）同時に投与され得る。代替的には、それらは、順次に提供され得、例えば、１つの組成物が最初に提供され、それに続いて第２の組成物が提供される。

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以下の例は、例示の目的のためにのみ提供され、本明細書で提供される特許請求の範囲の範囲を限定することは意図されていない。
実施例１．コドン最適化された逆転写酵素ドメインを含むプライムエディター。
ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａ－［（ＳＧＧＳ）２－ＸＴＥＮ－（ＳＧＧＳ）２－Ｓ］－ＭＭＬＶＲＴ５Ｍ－ＳＧＧＳ－ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ１（アミノ酸配列番号２５）の構造を有するプライムエディター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を操作した。融合タンパク質のＣ末端部分である［（ＳＧＧＳ）２－ＸＴＥＮ－（ＳＧＧＳ）２－Ｓ］－ＭＭＬＶＲＴ５Ｍ－ＳＧＧＳ－ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ１］をコードするポリヌクレオチド配列についてコドン最適化を実施した。融合タンパク質の示されるＣ末端部分をコードするコドンを、ヒトゲノムにおける頻繁なコドンを使用するために及びｍＲＮＡ安定性を改善するために最適化した。融合タンパク質の残りのＮ末端部分（ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａ）のため、Ａｎｚａｌｏｎｅ Ｎａｔｕｒｅ ５７６（７７８５）：１４９－１５７（２０１９）で公開されているものと同じ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を使用した。
上述したプライムエディター融合タンパク質をコードする１４４種のコドン最適化ＲＮＡ配列を設計し、コード配列が配列番号４１２～５５５に提供される。ＰＥ－Ｃ２（配列番号２４４）、ＰＥ－Ｃ３（配列番号２３４）、及びＰＥ－Ｃ４（配列番号２５６）という名称の３種のコドン最適化されたｍＲＮＡを、配列番号２７の配列を含み、かつ以後ＰＥ－ＡＡ２０１９ ｍＲＮＡと称される同じ融合タンパク質をコードする上方最適化された対照ｍＲＮＡ配列と比較した。ＰＥ－Ｃ２、ＰＥ－Ｃ３、及びＰＥ－Ｃ４の各々のＲＴ部分をコードするコドン最適化された配列がそれぞれ配列番号２４５、８３、及び２５７に提供される。ＰＥ－Ｃ２、ＰＥ－Ｃ３、ＰＥ－Ｃ４、及びＰＥ－ＡＡ２０１９ ｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡもまた、陰性対照として機能するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。ＰＥ－Ｃ２、ＰＥ－Ｃ３、ＰＥ－Ｃ４、及びＰＥ－ＡＡ２０１９の各々のＲＮＡ配列及び対応するＤＮＡ配列、ならびに各成分をコードする配列が表１５に提供される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に起因するｍＲＮＡのため、５’末端に５’ＵＴＲを付加し、ｍＲＮＡの各々の３’末端に「ＴＡＡ」終止コドンと、それに続く３’ＵＴＲを付加した。ＵＴＲ配列をコードする配列が配列番号６４０及び６４５、表６８に提供される。
各ｍＲＮＡを、Ｔ＞Ａヌクレオチド置換（鎌状赤血球疾患に関連する「Ｅ６Ｖ」として知られているアミノ酸置換をもたらす鎌状赤血球変異）を野生型ＨＢＢ遺伝子に導入するように設計されたプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）及びニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）と共に健康なヒトドナーＣＤ３４＋細胞にエレクトロポレーション（ＡＴｘ，Ｍａｘｃｙｔｅ）した。ｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡの配列が以下に提供される：
ｐｅｇＲＮＡ配列：（５’－３’）
ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＣＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ（配列番号５５９）
ｎｇＲＮＡ配列：（５’－３’）
ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ（配列番号５６４）
ガイドＲＮＡ配列が列挙される任意の場合において、＊は、ホスホロチオエート結合を示し、「ｍ」は、２’ＯＭｅ修飾を示す。
２００ｎＭのプライムエディターをコードするｍＲＮＡ、２０μＭのｐｅｇＲＮＡ及び１１μＭのニックガイドＲＮＡを各エレクトロポレーションのために使用した。プライム編集効率を３つの時点：エレクトロポレーションから２４時間、７２時間、及び１２０時間後にそれぞれ試験した。各時点について、２つの生物学的反復物がプライムエディターをコードするｍＲＮＡの各々について含まれ、１つの反復物をＳｐＣａｓ９対照のために使用した。ゲノムＤＮＡを抽出し、３つの時点の各々でＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ次世代シーケンシング（ＮＧＳ）でシーケンシングした。
ｍＲＮＡをコードするプライムエディターの各々のプライム編集効率が表７にまとめられている。コドン最適化されたコンストラクトで、特にＰＥ－Ｃ３において改善されたプライム編集効率が観察された。
Figure 2024525665000234
Figure 2024525665000235
ＣＤ３４＋細胞におけるプライムエディタータンパク質（またはＳｐＣａｓ９対照）のレベルも評価した。エレクトロポレーションの２４時間後、タンパク質をＣＤ３４＋細胞から収集し、抗Ｃａｓ９一次抗体を使用してキャピラリーウエスタンブロットアッセイ（Ｊｅｓｓ，ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）によって定量した。ＰＥ－Ｃ３について、２つの生物学的反復物の一方のみをプライムエディタータンパク質レベルについて測定した。キャピラリーウエスタンブロットを実行する前にビシンコニン酸（ＢＣＡ）定量（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して総タンパク質濃度によってサンプルを正規化した。Ｃａｓ９定量についての１６０ｋＤａ（±１０％）またはプライムエディターピークについての２３０ｋＤａ（±１０％）における検出されたピークについて曲線下面積を測定することによってタンパク質を定量した。結果が表８にまとめられている：
Figure 2024525665000236
実施例２．最適化されたリンカーを有するプライムエディター。
この実験では、プライムエディター融合タンパク質のＣａｓ９ドメイン及びＲＴドメインを接続するペプチドリンカーを最適化した。以下の構造をそれぞれ有する２２種のプライムエディター融合タンパク質を設計した：
ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａ－［リンカー］－ＭＭＬＶＲＴ５Ｍ－ＳＧＧＳ－ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ１
［リンカー］は、２２種の融合タンパク質の各々における異なるペプチドリンカーを示す。ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａ－［（ＳＧＧＳ）２－ＸＴＥＮ－（ＳＧＧＳ）２－Ｓ］－ＭＭＬＶＲＴ５Ｍ－ＳＧＧＳ－ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ１の構造を有する、実施例１に記載されるプライムエディター融合タンパク質を、代替リンカーを有する２２種のプライムエディター融合タンパク質との比較のための対照として使用した。２２種の融合タンパク質及び対照融合タンパク質の各々をコードするｍＲＮＡ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。リンカーバリアント融合タンパク質をコードする２２種のｍＲＮＡ配列の各々において、ＭＭＬＶＲＴをコードする部分をコドン最適化し、それは、実施例１に記載されるＰＥ－Ｃ３におけるＭＭＬＶＲＴをコードする配列（配列番号２３４）と同じ配列を有する。ＭＭＬＶＲＴ－Ｃ３と称される、ＭＭＬＶＲＴ５Ｍをコードするコドン最適化されたＲＮＡ配列が配列番号８４に提供され、対応するＤＮＡ配列が配列番号８３に提供される。対照プライムエディター融合タンパク質は、ＰＥ－Ｃ３最適化ｍＲＮＡによってコードされ、そのコード配列は配列番号２３４にある。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に起因するｍＲＮＡのため、５’末端に５’ＵＴＲを付加し、ｍＲＮＡの各々の３’末端に「ＴＡＡ」終止コドンと、それに続く３’ＵＴＲ（表６８に提供される配列）を付加した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を、ホモ接合性様式でＨＢＢ遺伝子における鎌状赤血球変異を含有するように生成した。ｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡ対を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における鎌状赤血球変異遺伝子座を編集するために設計し、化学的に合成した：
ｐｅｇＲＮＡ配列：（５’－３’）
ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＵＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ（配列番号５６９）
ｎｇＲＮＡ配列：（５’－３’）
ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ（配列番号５７４）
２２種の融合タンパク質及び対照融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（商標）脂質試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、リポフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。４０００ｎｇのｍＲＮＡ、２５０ｎｇのｐｅｇＲＮＡ及び７５ｎｇのｎｇ ＲＮＡを各ウェルのために使用した。プライムエディターをコードするｍＲＮＡの各々について、２つの技術的反復物を試験した。リポフェクションの３日後に、ゲノムＤＮＡを収集し、上述したようにＩｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳを使用してシーケンシングしてプライム編集効率及びインデル頻度を測定した。結果が表９にまとめられている。対照リンカー（ＳＧＧＳ）２－ＸＴＥＮ（ＳＧＧＳ）２－Ｓと比較して、代替リンカーを有するプライムエディターは、改善された編集効率を示す。

Figure 2024525665000237
最適化されたリンカーを有するプライムエディターのサブセットを、ＨＢＢ遺伝子座を編集するために健康なヒトドナーＣＤ３４＋細胞においてさらに試験した。ｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡをＨＢＢ遺伝子座を標的とするように設計した：
ｐｅｇＲＮＡ配列：（５’－３’）
ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ（配列番号５７９）
ニックＲＮＡ配列：（５’－３’）
ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ（配列番号５７４）
１５０ｎＭのプライムエディターをコードするｍＲＮＡ、２０μＭのｐｅｇＲＮＡ、及び１０μＭのｎｇＲＮＡを各ＣＤ３４＋細胞エレクトロポレーションのために使用した。プライム編集効率及びインデル頻度をエレクトロポレーションから２４時間、４８時間、及び９６時間後にそれぞれ試験した。ゲノムＤＮＡを３つの時点の各々で抽出し、記載したようにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ次世代シーケンシングで分析した。プライム編集効率及びインデル頻度が表１０にまとめられている。ＣＤ３４＋細胞における最大で４１％のプライム編集がエレクトロポレーションから９６時間後に観察された。
Figure 2024525665000238
実施例３．最適化されたｐｅｇＲＮＡを有するプライム編集
３’末端ウラシルを欠く化学的に合成されたｐｅｇＲＮＡをＣＤ３４＋細胞における編集効率について試験し、３’末端で４つの追加のウラシルヌクレオチド（５’－「ＵＵＵＵ」－３’）を有する化学的に合成されたｐｅｇＲＮＡと比較した。ｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡをＨＢＢ遺伝子座を標的とするように設計した。実施例２において使用された同じｐｅｇＲＮＡを、ｐｅｇＲＮＡの３’末端で４ウラシルヌクレオチドを除去することによって生成されたｐｅｇＲＮＡと比較した。上の実施例２において使用されたｎｇＲＮＡを、４つの３’ウラシルを有する及び有しないｐｅｇＲＮＡとそれぞれ対合させて、プライム編集効率を試験した。ｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡを合成し、以下に示されるように５’及び３’末端を保護するように化学的に修飾した：
末端Ｕを有するｐｅｇＲＮＡ配列：
５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ－３’（配列番号５７９）
末端Ｕを有しないｐｅｇＲＮＡ配列：
５’－ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵｍＧ＊ｍＣ＊ｍＡ＊Ｃ－３’（配列番号５８７）
ニックガイドＲＮＡ配列：
５’－ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ－３’（配列番号５７４）
２つの異なるプライムエディターをコードする２つのｍＲＮＡを使用した：１）実施例１に記載されるＰＥ－Ｃ３コドン最適化ｍＲＮＡ（配列番号２３３）、及び２）実施例２に記載されるＰＥ－Ｃ３と同じコドン最適化されたＭＭＬＶＲＴ５Ｍ部分を有する、構造（ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａ－（ＳＧＧＳ）８－ ＭＭＬＶＲＴ５ＭＣ３－ＳＧＧＳ－ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ１）を有する（ＳＧＧＳ）８リンカーを有するプライムエディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０）。異なる量のｍＲＮＡも試験した。ＰＥタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｐｅｇＲＮＡ、及びｎｇＲＮＡをヒト健康ドナーＣＤ３４＋細胞においてエレクトロポレーションした。各エレクトロポレーションについて、２０μＭのｐｅｇＲＮＡ及び１１μＭのｎｇＲＮＡを使用した。プライム編集効率及びインデル頻度をエレクトロポレーションから４８時間及び９６時間後にそれぞれ試験した。ゲノムＤＮＡを各時点で抽出し、プライム編集効率及びインデル頻度をＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ次世代シーケンシングで分析した。使用された編集条件、プライム編集効率及びインデル頻度が表１１にまとめられている。

Figure 2024525665000239
実施例４．操作された逆転写酵素ドメインを有するプライムエディター
ＭＭＬＶＲＴ ＲＮａｓｅＨドメインにおける切断及び変異を含む、操作された逆転写酵素ドメインを有するプライムエディター融合タンパク質をプライム編集効率について試験した。１１種のプライムエディター融合タンパク質を設計し、ＲＴドメインタンパク質構造配列に対する修飾が以下の表１２に示されている。
ｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡを、ＨＢＢ遺伝子遺伝子座における鎌状赤血球変異を標的とするように設計した。２つの異なるプライム編集標的化ストラテジーを使用した：ｉ）鎌状赤血球変異の組み込み；及びｉｉ）鎌状赤血球変異に加えてサイレントＰＡＭ変異の組み込み。ｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列は、以下に示されるとおりである（転写に関連し、ＨＢＢ標的化に関与しないｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列における５’グアニン及び３’配列ＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号６４６））：
ｐｅｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列：
ＧＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号５８８）
ｐｅｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列（サイレントＰＡＭ変異を有する）
ＧＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号５８９）
ニックＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列（サイレントＰＡＭ変異及びｎｇＲＮＡ結合を有する）：
ＧＣＣＴＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号５９０）
プライムエディターをコードする配列を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのコントロール下で発現プラスミドにおいてそれぞれ構築した。表６８に提供される５’ＵＴＲ、及び「ＴＡＡ」終止コドンと、それに続く３’ＵＴＲも、プラスミドにおいてプライムエディターをコードする配列に付加した。ＰＥｇＲＮＡ配列及びｎｇＲＮＡ配列を、ｈＵ６プロモーターのコントロール下でプラスミドにおいてそれぞれ構築した。プライムエディターをコードするプラスミドをそれぞれ個々に、２つの追加のプラスミド（各々がＰＥｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡをコードする）と共に野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にリポフェクションした。１ウェル当たり７５０ｎｇのプライムエディターをコードするプラスミド、２５ｎｇのＰＥｇＲＮＡをコードするプラスミド、及び８３ｎｇのｎｇＲＮＡをコードするプラスミドをリポフェクション（リポフェクタミン２０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のために使用した。ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするプラスミド、及び配列番号２５の配列を有する全長ＭＭＬＶＲＴ５Ｍを有するプライムエディターをコードするプラスミドを２つの対照として使用した。ゲノムＤＮＡをリポフェクションから３日後に収集し、ＰＣＲ増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉｓｅｑＮｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎシーケンシングを使用してシーケンシングした。各処置について、２つの技術的反復物を試験した。結果が以下の表１２にまとめられている。ＭＭＬＶ－ＲＴ五変異体（配列番号５）を、表１２に列挙されるコンストラクトを生成するためにさらに修飾した。アミノ酸置換は、「元のアミノ酸「位置」置換されたアミノ酸」として示されている。例えば、Ｄ５２４Ｎは、配列番号１、５または６２３と比較して位置５２４におけるＡｓｐからＡｓｎへの置換を指す。文字Ｘ及びＸに先行する数字は、切断の位置を示す。例えば、Ｇ５０４Ｘは、配列番号５と比較してアミノ酸Ｇｌｙ５０４の後の切断を指す；Ｇｌｙ５０４は、切断されたアミノ酸配列において保持されている。２２ａａ＿ｄｅｌ＿Ｎ末端は、配列番号５のＮ末端で２２アミノ酸の欠失を指す。対応するＣａｓ９－ＲＴ融合タンパク質配列及びＲＴバリアント配列、ならびにバリアントＧ５０４Ｘ、Ｄ５２４Ｎ、及びＬ４７８Ｘのための実験において使用されたものと同じものをコードするポリペプチド配列も表１８～２０にそれぞれ提供される。この実施例及び本明細書に記載の以下の実施例４において、ＭＭＬＶＲＴに対する修飾は、ＭＭＬＶＲＴ５Ｍに対するものであること、及びＭＭＬＶＲＴ５Ｍにおける変異は、切断されない限り、ＭＭＬＶＲＴバリアントにおいて保持されることが留意されるべきである。
結果が以下の表１２にまとめられている。位置Ｇ５０４またはＬ４７８の後にＲＮＡｓｅＨドメインを除去するためプライムエディターの切断は、元の全長コンストラクトと比較して活性の増加をもたらし、Ｌ４３５Ｋ変異の包含もよく耐容される。
Figure 2024525665000240
標準的なＳｐＣａｓ９ガイドＲＮＡ骨格と一致するように配列番号５８９及び５９０における８４番目のヌクレオチドグアニンを置き換えることによって作製されたｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡの異なる対を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞において実験を繰り返した。各プライムエディターバリアントについて３つの技術的反復物を試験した。結果が図５に示されている。
複数のリンカー及びＮＬＳ配列と組み合わせた位置Ｇ５０４の後の切断を有するＭ－ＭＬＶ ＲＴを含むプライムエディターを、配列番号５の全長Ｍ－ＭＬＶ ＲＴを有するプライムエディターと比較したＣＤ３４＋細胞における編集効率についてさらに試験した。融合タンパク質の各々の成分及び構造が表１３の第１のカラムに示されている。融合タンパク質をコードするアミノ酸配列及び対応するＤＮＡ／ＲＮＡ配列が表１５、１６、１７、２３、２４、２８、及び５３に提供される。表５３について、ＮＬＳ配列が表２に提供される。プライムエディター融合タンパク質の各々をコードするポリヌクレオチド配列において、逆転写酵素をコードする部分を、ＰＥ－Ｃ３におけるＭＭＬＶＲＴ５Ｍをコードする対応する配列（またはその部分）としてコドン最適化した（配列番号８３及び８４に示される全長のコドン最適化されたＭＭＬＶＲＴ５ＭのＤＮＡ及びＲＮＡ配列）。プライムエディター融合タンパク質の各々をコードするｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のため、５’末端に５’ＵＴＲを付加し、ｍＲＮＡの各々の３’末端に「ＴＡＡ」終止コドンと、それに続く３’ＵＴＲ（表６８に提供される配列）を付加した。ｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡを合成し、以下のとおりの末端保護されたＰＥｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡを使用して鎌状赤血球変異をＨＢＢ遺伝子に導入した
ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＧＧＵＧＣＡＣＣＵＧＡＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＡＧＡＣＵＵＣＵＣＵＡＣＡＧＧＡＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ（配列番号５９１）
ニックＲＮＡ配列：
ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ＵＧＡＵＡＣＣＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ（配列番号５７４）
１５０ｎＭ ｍＲＮＡ、２０μＭ ＰＥｇＲＮＡ、及び１０μＭ ｎｇＲＮＡをヒト健康ドナーＣＤ３４＋細胞におけるエレクトロポレーションのために使用した。ゲノムＤＮＡをエレクトロポレーションから２４時間、４８時間、７２時間、及び９６時間後にそれぞれ収集し、Ｍｉｓｅｑベースのシーケンシング方法で分析した。編集効率及びインデル頻度が以下の表１３にまとめられている。

Figure 2024525665000241
ＰＥ－Ｃ３ ｍＲＮＡ及び上の表１３におけるプライムエディター融合タンパク質（ＳＶ４０ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａ－（ＳＧＧＳ）２－ＸＴＥＮ－（ＳＧＧＳ）２－ＭＭＬＶＲＴ（Ｇ５０４Ｘ）－ＮＬＳ）をコードするｍＲＮＡ（配列番号９２の配列を有するコドン最適化された切断されたＭＭＬＶＲＴ（Ｇ５０４Ｘ）を含有する）を使用してｍＲＮＡ用量反応をさらに実施した。２００ｎＭのｍＲＮＡで、全長及び切断された編集体は、同様に挙動した（エレクトロポレーションから７２時間後に、３５．７％及び３６．６％のプライム編集の平均）が、切断されたプライムエディターは、１５０ｎＭのｍＲＮＡで全長編集体よりもわずかに効率的であった（全長について２８．７％及び切断されたプライムエディターについて３４．３％の平均）。

Claims (120)

  1. 融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して接続されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、前記ペプチドリンカーは、配列番号２８９、２９１、２９３、２９４、２９５、３０１、３０２、３０３、３０６、３０９、３１０、及び３１１からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記プライム編集組成物。
  2. 融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して接続されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、前記ペプチドリンカーは、配列番号２８６～４１１からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記プライム編集組成物。
  3. 前記ペプチドリンカーの前記アミノ酸配列は、前記選択される配列と少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載のプライム編集組成物。
  4. 選択される配列は、配列番号３０２である、請求項１～３のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  5. 選択される配列は、配列番号３０９である、請求項１～３のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  6. 融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して接続されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、前記ペプチドリンカーは、少なくとも４個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む、前記プライム編集組成物。
  7. 融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して接続されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、前記ペプチドリンカーは、少なくとも４～１０個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む、前記プライム編集組成物。
  8. 前記ペプチドリンカーは、４、５、６、８、または１０個の連続ＳＧＧＳモチーフを含む、請求項７に記載のプライム編集組成物。
  9. 融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して接続されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、前記ペプチドリンカーは、少なくとも２個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む、前記プライム編集組成物。
  10. 融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して接続されたＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡポリメラーゼドメインを含み、前記ペプチドリンカーは、２～８個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む、前記プライム編集組成物。
  11. 前記ペプチドリンカーは、２、３、４、６、または８個の連続ＥＡＡＡＫモチーフを含む、請求項１０に記載のプライム編集組成物。
  12. 前記ＤＮＡポリメラーゼドメインは、逆転写酵素（ＲＴ）ドメインを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  13. 前記ＲＴドメインは、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）ＲＴドメインである、請求項１２に記載のプライム編集組成物。
  14. 前記Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸を含む、請求項１３に記載のプライム編集組成物。
  15. 前記Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸５０４及び５０５に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のプライム編集組成物。
  16. 前記Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号３６と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のプライム編集組成物。
  17. 前記Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸４７８及び４７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のプライム編集組成物。
  18. 前記Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号５４と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のプライム編集組成物。
  19. ａ）ＤＮＡ結合ドメインまたは前記ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、及びｂ）モロニーマウス白血病逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）ドメインまたは前記Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインをコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸５０４及び５０５に対応する位置の間でＣ末端で切断されたアミノ酸配列を含む、前記プライム編集組成物。
  20. ａ）ＤＮＡ結合ドメインまたは前記ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、及びｂ）モロニーマウス白血病逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）ドメインまたは前記Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインをコードするポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸４７８及び４７９に対応する位置の間でＣ末端で切断されている、前記プライム編集組成物。
  21. 前記Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、配列番号１に示される参照Ｍ－ＭＬＶ ＲＴと比較してアミノ酸置換Ｄ２００Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１９または２０に記載のプライム編集組成物。
  22. 前記ＤＮＡ結合ドメインは、融合タンパク質において前記Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインに接続されている、請求項１９～２１のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  23. 前記ＤＮＡ結合ドメイン及び前記Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、ペプチドリンカーによって接続されている、請求項２２に記載のプライム編集組成物。
  24. 前記ペプチドリンカーは、配列番号２８６～４１１からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２３に記載のプライム編集組成物。
  25. 前記ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  26. 前記Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である、請求項２５に記載のプライム編集組成物。
  27. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である、請求項２６に記載のプライム編集組成物。
  28. 前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＨＮＨドメインにおける変異を含むニッカーゼである、請求項２７に記載のプライム編集組成物。
  29. 前記Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２と比較してＨ８４０Ａ変異を含む、請求項２８に記載のプライム編集組成物。
  30. 前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のプライム編集組成物。
  31. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型Ｃａｓタンパク質である、請求項２５に記載のプライム編集組成物。
  32. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、またはＣａｓ１２ｅである、請求項３１に記載のプライム編集組成物。
  33. 前記融合タンパク質は、前記ＤＮＡポリメラーゼドメイン及び前記ＤＮＡ結合ドメインをＮ末端からＣ末端へ含む、請求項１～１８及び２２～３２のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  34. 前記融合タンパク質は、前記ＤＮＡポリメラーゼドメイン及び前記ＤＮＡ結合ドメインをＣ末端からＮ末端へ含む、請求項１～１８及び２２～３２のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  35. 前記融合タンパク質は、配列番号７８、１０５、１１７、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、及び２２７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のプライム編集組成物。
  36. 前記選択される配列は、配列番号７８である、請求項３５に記載のプライム編集組成物。
  37. 前記選択される配列は、配列番号１０５である、請求項３５に記載のプライム編集組成物。
  38. 前記融合タンパク質は、配列番号８６、１１１、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００、２０６、２１２、２１８、２２４、及び２３０からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のプライム編集組成物。
  39. 前記選択される配列は、配列番号８６である、請求項３８に記載のプライム編集組成物。
  40. 前記選択される配列は、配列番号１１１である、請求項３８に記載のプライム編集組成物。
  41. 前記融合タンパク質は、前記選択される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３５～４０のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  42. 前記融合タンパク質は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項３４～４１のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  43. 前記１つ以上のＮＬＳは、配列番号８～１５または６２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のプライム編集組成物。
  44. 前記融合タンパク質は、配列番号７７、９３、１０４、１１６、及び６２０からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のプライム編集組成物。
  45. 前記選択される配列は、配列番号７７または配列番号６２０である、請求項４４に記載のプライム編集組成物。
  46. 前記選択される配列は、配列番号９３である、請求項４４に記載のプライム編集組成物。
  47. 前記融合タンパク質は、配列番号８５、９６、１１０、及び６２２からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のプライム編集組成物。
  48. 前記選択される配列は、配列番号８５または配列番号６２２である、請求項４７に記載のプライム編集組成物。
  49. 前記選択される配列は、配列番号１１０である、請求項４８に記載のプライム編集組成物。
  50. 前記融合タンパク質は、前記選択される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４４～４９のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  51. 前記融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８１、８２、１０８、１０９、１２０、１２１、１２６、１２７、１３２、１３３、１３８、１３９、１４４、１４５、１５０、１５１、１５６、１５７、１６２、１６３、１６８、１６９、１７４、１７５、１８０、１８１、１８６、１８７、１９２、１９３、１９８、１９９、２０４、２０５、２１０、２１１、２１６、２１７、２２２、２２３、２２８、及び２２９からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１８及び２２～５０のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  52. 前記選択される配列は、配列番号８１または８２である、請求項５１に記載のプライム編集組成物。
  53. 前記融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８９、９０、１０２、１０３、１１４、１１５、１２３、１２４、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１、１４２、１４７、１４８、１５３、１５４、１５９、１６０、１６５、１６６、１７１、１７２、１７７、１７８、１８３、１８４、１８９、１９０、１９５、１９６、２０１、２０２、２０７、２０８、２１３、２１４、２１９、２２０、２２５、２２６、２３１、及び２３２からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１８及び２２～５０のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  54. 前記選択される配列は、配列番号８９または９０である、請求項５３に記載のプライム編集組成物。
  55. 前記融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、配列番号７９、８０、９４、９５、１０６、１０７、１１８、及び１１９からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１８及び２２～５０のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  56. 前記融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８７、８８、９７、９８、１００、１０１、１１２、及び１１３からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１８及び２２～５０のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  57. 前記選択される配列は、配列番号７９または８０である、請求項５５に記載のプライム編集組成物。
  58. 前記選択される配列は、配列番号８７または８８である、請求項５６に記載のプライム編集組成物。
  59. 前記融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは、３’末端で終止コドンをさらに含む、請求項５１～５８のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  60. 前記ポリヌクレオチドは、配列番号２７６～２７９の配列を含む、請求項５９に記載のプライム編集組成物。
  61. 前記ポリヌクレオチドは、配列番号２８２～２８５の配列を含む、請求項５９に記載のプライム編集組成物。
  62. ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲをさらに含む、請求項５１～６１のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  63. 前記ポリヌクレオチドは、配列番号２７４、２７５、５９２、または５９３の配列を含む、請求項６２に記載のプライム編集組成物。
  64. 前記ポリヌクレオチドは、配列番号２８０、２８１、５９４、または５９５の配列を含む、請求項６２に記載のプライム編集組成物。
  65. 前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡを含む、請求項５１～６４のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  66. 前記ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む、請求項５１～６４のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  67. 制御性要素配列をさらに含み、任意に前記制御性要素配列は、プロモーターである、請求項６５に記載のプライム編集組成物。
  68. ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４１２～５５５からなる群から選択される配列のヌクレオチド１００～２１３０に対応する配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、前記プライム編集組成物。
  69. ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号８３または８４と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、前記プライム編集組成物。
  70. 前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号８３または８４と少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６９に記載のプライム編集組成物。
  71. ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号８３または８４の配列を含む、前記プライム編集組成物。
  72. ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号９１または９２と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、前記プライム編集組成物。
  73. 前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号９１または９２と少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項７２に記載のプライム編集組成物。
  74. ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを含むプライム編集組成物であって、前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号９１または９２の配列を含む、前記プライム編集組成物。
  75. 前記第１のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする、請求項６８～７４のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  76. 前記Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である、請求項７５に記載のプライム編集組成物。
  77. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である、請求項７６に記載のプライム編集組成物。
  78. 前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＨＮＨドメインにおける変異を含むニッカーゼであり、任意に前記Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２と比較してＨ８４０Ａ変異を含む、請求項７７に記載のプライム編集組成物。
  79. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型Ｃａｓタンパク質である、請求項７５に記載のプライム編集組成物。
  80. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、またはＣａｓ１２ｅである、請求項７９に記載のプライム編集組成物。
  81. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは、融合ポリヌクレオチドにおいて接続されている、請求項６８～８０のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  82. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは、ペプチドリンカーをコードする配列によって接続されている、請求項８１に記載のプライム編集組成物。
  83. 前記ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３５、２３６または６３３～６３６の配列を含む、請求項８２に記載のプライム編集組成物。
  84. 前記第１のポリヌクレオチドは、前記第２のポリヌクレオチドの５’末端に接続されている、請求項８１～８３のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  85. 前記第１のポリヌクレオチドは、前記第２のポリヌクレオチドの３’末端に接続されている、請求項８１～８３のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  86. 前記融合ポリヌクレオチドは、配列番号８１、８２、１０８、１０９、１２０、１２１、１２６、１２７、１３２、１３３、１３８、１３９、１４４、１４５、１５０、１５１、１５６、１５７、１６２、１６３、１６８、１６９、１７４、１７５、１８０、１８１、１８６、１８７、１９２、１９３、１９８、１９９、２０４、２０５、２１０、２１１、２１６、２１７、２２２、２２３、２２８、２２９、２４１、及び２４２からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項８１～８５のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  87. 前記選択される配列は、配列番号８１または８２である、請求項８６に記載のプライム編集組成物。
  88. 前記選択される配列は、配列番号２４１または２４２である、請求項８６に記載のプライム編集組成物。
  89. 前記融合ポリヌクレオチドは、配列番号８９、９０、１０２、１０３、１１４、１１５、１２３、１２４、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１、１４２、１４７、１４８、１５３、１５４、１５９、１６０、１６５、１６６、１７１、１７２、１７７、１７８、１８３、１８４、１８９、１９０、１９５、１９６、２０１、２０２、２０７、２０８、２１３、２１４、２１９、２２０、２２５、２２６、２３１、及び２３２からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項８１～８５のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  90. 前記選択される配列は、配列番号８９または９０である、請求項８９に記載のプライム編集組成物。
  91. 前記選択される配列は、配列番号１０２または１０３である、請求項８９に記載のプライム編集組成物。
  92. 前記選択される配列は、配列番号１１４または１１５である、請求項８９に記載のプライム編集組成物。
  93. 前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、またはその両方は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列をさらに含む、請求項６８～９２のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  94. 前記ＮＬＳをコードする配列は、配列番号２３９または２４０の配列を含み、前記第２のポリヌクレオチドの３’末端に接続されている、請求項６８～９３のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  95. 前記融合ポリヌクレオチドは、配列番号７９、８０、９４、９５、１０６、１０７、１１８、１１９、２３３、及び２３４からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項８１～９４のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  96. 前記選択される配列は、配列番号７９または８０である、請求項９５に記載のプライム編集組成物。
  97. 前記融合ポリヌクレオチドは、配列番号８７、８８、９７、９８、１００、１０１、１１２、及び１１３からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項８１～９４のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  98. 前記選択される配列は、配列番号８７または８８である、請求項９７に記載のプライム編集組成物。
  99. 前記融合ポリヌクレオチドは、３’末端で終止コドンをさらに含む、請求項８１～９８のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  100. 前記融合ポリヌクレオチドは、配列番号２７６～２７９からなる群から選択される配列を含む、請求項９９に記載のプライム編集組成物。
  101. 前記融合ポリヌクレオチドは、配列番号２８２～２８５からなる群から選択される配列を含む、請求項９９に記載のプライム編集組成物。
  102. 前記融合ポリヌクレオチドは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲを含む、請求項８１～１０１のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  103. 前記ポリヌクレオチドは、配列番号２７４、２７５、５９２、または５９３の配列を含む、請求項１０２に記載のプライム編集組成物。
  104. 前記ポリヌクレオチドは、配列番号２８０、２８１、５９４、または５９５の配列を含む、請求項１０２に記載のプライム編集組成物。
  105. 前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、及び／または前記融合ポリヌクレオチドは、ＤＮＡを含む、請求項６８～１０４のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  106. 前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、及び／または前記融合ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む、請求項６８～１０４のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  107. 前記融合ポリヌクレオチドは、制御性要素配列をさらに含み、任意に前記制御性要素配列は、プロモーターである、請求項１０５に記載のプライム編集組成物。
  108. 配列同一性は、存在：１１、伸長１に設定されたギャップコストを用いて２つの配列のニードルマン・ウンシュアライメントによって決定され、同一率は、同一の数を前記アライメントの長さで除算することによって計算される、請求項１～１０７のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  109. 前記プライム編集組成物は、プライム編集ガイドＲＮＡ（ＰＥｇＲＮＡ）またはＰＥｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～１０８のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  110. 前記プライム編集組成物は、ニックガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）またはｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～１０９のいずれか１項に記載のプライム編集組成物。
  111. 請求項１～１１０のいずれか１項に記載のプライム編集組成物のポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含むベクター。
  112. 前記ベクターは、ＡＡＶベクターである、請求項１１１に記載のベクター。
  113. 前記ベクターは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項１１２に記載のベクター。
  114. 請求項１～１１０のいずれか１項に記載のプライム編集組成物または請求項１１１～１１３に記載のベクター、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
  115. 標的遺伝子を編集する方法であって、前記方法は、前記標的遺伝子を請求項１～１１０のいずれか１項に記載のプライム編集組成物と接触させることを含む、前記方法。
  116. 前記標的遺伝子は、細胞におけるものである、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記細胞は、ヒト細胞である、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記細胞は、（ＣＤ３４＋）造血幹細胞または造血幹前駆細胞である、請求項１１６に記載の方法。
  119. 前記接触させることは、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるものである、請求項１１５～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. 前記細胞は、対象におけるものである、請求項１１５～１１８のいずれか１項に記載の方法。
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