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JP2024518369A - 増殖性疾患で使用されるｃｄ２０及びｃｄ２２標的化抗原結合分子 - Google Patents

増殖性疾患で使用されるｃｄ２０及びｃｄ２２標的化抗原結合分子 Download PDF

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JP2024518369A JP2023567186A JP2023567186A JP2024518369A JP 2024518369 A JP2024518369 A JP 2024518369A JP 2023567186 A JP2023567186 A JP 2023567186A JP 2023567186 A JP2023567186 A JP 2023567186A JP 2024518369 A JP2024518369 A JP 2024518369A
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Abstract

本発明は、それぞれＣＤ２０及びＣＤ２２に結合する第１及び第２のドメイン、ヒト及びマカク（Ｍａｃａｃａ）ＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合する第３のドメイン、並びに任意選択的な、Ｆｃ様式である第４のドメインを含むことを特徴とするＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子を提供する。さらに、本発明は、この抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、この抗原結合分子を発現する宿主細胞、及びこれを含む医薬組成物を提供する。

Description

本発明は、生物工学の生成物及び方法に関し、特に、ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子、その調製、及びその使用に関する。
免疫腫瘍学で有用な二重特異性分子は、抗体等の抗原結合ポリペプチドであり得、例えば、ＩｇＧ様二重特異性抗体（即ち、完全長二重特異性抗体）、又は完全長抗原結合分子ではない非ＩｇＧ様二重特異性抗体であり得る。完全長二重特異性抗体は、通常、２つのＦａｂ部位が異なる抗原に結合することを除いて、２つのＦａｂアーム及び１つのＦｃ領域の通常のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）構造を保持する。非完全長二重特異性抗体は、Ｆｃ領域を完全に欠く可能性がある。これらとして、Ｆａｂ領域のみからなる化学的に連結されたＦａｂ、並びに様々な型の二価及び三価の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。２つの抗体の可変ドメインを模倣する融合タンパク質もある。そのような形式の例は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））である（Ｙａｎｇ，Ｆａ；Ｗｅｎ，Ｗｅｉｈｏｎｇ；Ｑｉｎ，Ｗｅｉｊｕｎ（２０１６）．“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ａ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｎｅｗ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ”．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１８（１）：４８）。
ＢｉＴＥ（登録商標）分子等の例示的な二重特異性抗体に由来する分子は、２つの柔軟に連結された抗体に由来する結合ドメインから構成される組換えタンパク質コンストラクトである。ＢｉＴＥ（登録商標）分子の１つの結合ドメインは、標的細胞上の選択された腫瘍関連表面抗原に特異的であり；第２の結合ドメインは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体のサブユニットであるＣＤ３に特異的である。それらの特別な設計により、ＢｉＴＥ（登録商標）抗原結合分子は、Ｔ細胞を標的細胞と一過的に結び付け、同時に標的細胞に対するＴ細胞の固有の細胞溶解能を強力に活性化するのに独特に適している。ＡＭＧ １０３及びＡＭＧ １１０としてクリニックに展開された第一世代のＢｉＴＥ（登録商標）分子の重要なさらなる開発（国際公開第９９／５４４４０号パンフレット及び同第２００５／０４０２２０号パンフレットを参照されたい）は、ＣＤ３ε鎖のＮ末端のコンテクスト非依存的なエピトープに結合する二重特異性抗原結合分子を提供した（国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット）。この選出されたエピトープに結合するＢｉＴＥ（登録商標）分子は、ヒト及びマカク（Ｍａｃａｃａ）、又はマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）若しくはリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）ＣＤ３ε鎖に対する種間特異性を示さないだけでなく、（二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子において既に説明されているＣＤ３結合体のエピトープの代わりに）この特異的エピトープを認識するため、前世代のＴ細胞エンゲージ抗体で観察されたのと同程度のＴ細胞の非特異的な活性化も示さない。Ｔ細胞活性化のこの減少は、患者におけるＴ細胞再分布の減少又は低減と関連しており、後者は、例えば、パスツキシマブにおいて、副作用のリスクがあると特定された。
国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットで説明されている抗体に基づく分子は、体内からの迅速なクリアランスによって特徴付けられ；したがって、それらは、体内のほとんどの部分に迅速に到達し得るが、それらのインビボ適用は、それらのインビボにおける短い持続性によって制限され得る。一方、体内のそれらの濃度を、すぐに適合させ、微調整することができる。この小さい一本鎖分子は、インビボ半減期が短いため、治療効果を達成するために持続点滴静注による継続投与が使用される。しかしながら、国際公開第２０１７／１３４１４０号パンフレットで説明されているより長い半減期を含むより好ましい薬物動態特性を有する二重特異性抗原結合分子が利用可能である。長い半減期は通常、例えば患者コンプライアンスのために、免疫グロブリンのインビボ適用において有用であり、特に小サイズの抗体断片又はコンストラクトに関するインビボ適用において特に有用である。
抗体に基づく免疫腫瘍学において進行中の困難な問題の１つは、腫瘍回避である。そのような腫瘍回避は、免疫系がいくつかの抗体に基づく免疫療法により誘発されるか又は誘導される場合でさえ、遺伝的改変及び後成的改変が蓄積されており、且つ免疫編集プロセスの勝利となるためにいくつかの機構を使用する腫瘍を十分に根絶し得ない場合に起こる（Ｋｅｓｈａｖａｒｚ－Ｆａｔｈｉ，Ｍａｈｓａ；Ｒｅｚａｅｉ，Ｎｉｍａ（２０１９）“Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”）。一般的に、効果的な抗腫瘍免疫応答を妨害する下記の４つの機構が知られる：（１）欠陥のある腫瘍抗原プロセシング又は提示、（２）活性化機構の欠如、（３）阻害機構及び免疫抑制状態、並びに（４）抵抗性腫瘍細胞。特に、最初の機構に関して、腫瘍抗原は、遺伝的不安定性、腫瘍の変異、及び免疫系からの回避に起因して、新しい形態で存在する可能性がある。エピトープ陰性腫瘍細胞は、隠れたままであり、その結果、免疫拒絶に抵抗性を示す。これらは、ダーウィンの自然淘汰の理論と同様に、エピトープ陽性腫瘍細胞の除去に続いて発現されている。その結果、腫瘍細胞上の抗原に対する抗体に基づく免疫療法は、そのような腫瘍細胞が腫瘍回避に起因してそれぞれの抗原をもはや発現しない場合に無効となる。前記抗原消失は、本明細書では腫瘍回避の原動力と理解され、そのため、互換的に使用される。したがって、腫瘍回避を効果的に防ぐために、抗原消失の問題に対処する改善された抗体に基づく癌免疫療法を提供する必要がある。
さらに、抗体ベースの免疫療法のこれまで達成された前臨床及び臨床の成功にもかかわらず、個人間及び癌の種類間での反応の差違等の顕著な限界が残っている。全ての患者が、利用可能である安全な用量で療法に反応するわけではなく、なぜならば、用量制限毒性は、抗体に基づく免疫治療薬の有効性を制限する要因となり得るからである。したがって、抗体に基づく免疫治療薬における用量制限毒性を低減して、そのような療法を、多様な増殖性疾患に罹患しているより多くの患者に利用可能にすることも必要である。
Ｔ細胞エンゲージ二重特異性分子に関する癌免疫療法の幅広い利用に対する別の課題は、適切な標的の利用可能性である（Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；２２（１３）Ｊｕｌｙ １，２０１６）。例えば、固形腫瘍標的は、腫瘍細胞上で過剰発現され得るが、重要な組織での非悪性一次細胞上では、より低いが有意なレベルで発現され得る。自然界では、Ｂａｃａｃらによると、Ｔ細胞は、比較的親和性が低いが、それでも十分に高レベルの標的抗原を発現する標的細胞への高結合活性の結合を達成し得るＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により、抗原発現が高い細胞と、抗原発現が低い細胞とを区別し得る。そのため、同じことを促進することができ、したがって、標的発現が高い細胞の死滅と標的発現が低い細胞の死滅の間の期間を最大化し得るＴ細胞エンゲージ二重特異性分子が、非常に望ましい。当技術分野で考察されているアプローチの１つは、同一の細胞上の２種の抗原の二重標的化の使用により、両方の標的抗原の一方のみ又低レベルのみを発現する正常組織よりも標的選択性が改善されることである。この効果は、同一の細胞上の両方の抗原へのｂｓＡｂの同時結合により媒介される結合活性成分に依存すると考えられる。そのような二重標的化に関して、当技術分野では、いくつかの多重特異性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又は他の免疫コンストラクトが知られている。国際公開第２０１４／１１６８４６号パンフレットは、標的細胞抗原に特異的に結合する第１の結合部位、免疫細胞上の細胞表面受容体に特異的に結合する第２の結合部位、及び免疫細胞上の細胞表面調節因子に特異的に結合する第３の結合部位を含む多重特異性結合タンパク質を教示している。米国特許出願公開第２０１７／００２２２７４号明細書は、二重特異性抗体を含む三価Ｔ細胞リダイレクティング複合体を開示しており、この二重特異性抗体は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する２つの結合部位、及びＴ細胞に対する１つの結合部位を有する。当技術分野では、様々な多重特異性抗体又は抗体フラグメントが既知であり、そのいくつかは、Ｔ細胞に対処するが、抗原欠損／腫瘍回避を克服する必要性、及び抗体ベースの免疫療法における用量制限毒性を低減する必要性に対処し、同時に１つの安定した使用準備済みの治療システムにより、Ｔ細胞を効果的にリダイレクトする必要性に対処する、（好ましくは一本鎖）二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子のメカニズムを採用するＣＤ２０及びＣＤ２２標的化二重特異性分子は、これまで提案されていない。
国際公開第９９／５４４４０号パンフレット 国際公開第２００５／０４０２２０号パンフレット 国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット 国際公開第２０１７／１３４１４０号パンフレット 国際公開第２０１４／１１６８４６号パンフレット 米国特許出願公開第２０１７／００２２２７４号明細書
Ｙａｎｇ，Ｆａ；Ｗｅｎ，Ｗｅｉｈｏｎｇ；Ｑｉｎ，Ｗｅｉｊｕｎ（２０１６）．"Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ａ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｎｅｗ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ"．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１８（１）：４８ Ｋｅｓｈａｖａｒｚ－Ｆａｔｈｉ，Ｍａｈｓａ；Ｒｅｚａｅｉ，Ｎｉｍａ（２０１９）"Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ" Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；２２（１３）Ｊｕｌｙ １，２０１６
上記で説明されている必要性を考慮して、本発明の目的は、好ましくは、特定の状態の処置での使用のための、前記特定の状態に関連する標的細胞上の２種の抗原に結合し、同時にエフェクター細胞上の１種の抗原に結合するのに特に適しているＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子（典型的にはポリペプチド、例えばＴ細胞エンゲージ二重特異性分子）を提供することである。この分子は、高い生産性、安定性、及び活性をさらに示すべきである。したがって、本発明は、ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化二重特異性抗原結合分子であって、第１の標的細胞表面抗原（ＴＡＡ）としてのＣＤ２０に結合する第１のドメイン、ＣＤ２２（第２のＴＡＡ）に結合する第２のドメイン、ヒト及び非ヒト（例えば、マカク（Ｍａｃａｃａ）のＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合する第３のドメイン、並びに好ましくは、この分子の半減期を調節する特定のＦｃ様式である第４のドメインを含むことを特徴とするＣＤ２０及びＣＤ２２標的化二重特異性抗原結合分子を提供する。好ましくは、これらのドメインは、それぞれアミノからカルボキシルの方向にＶＨドメイン及びＶＬドメインで構成される結合ドメインであって、可動性であるが短いペプチドリンカーは、第１の結合ドメインのＶＬを第２の結合ドメインのＶＨを連結する、結合ドメインである。驚くべきことに、特定の疾患に関連する標的細胞に対する本発明の分子の活性は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の立体障害なしに、且つ即時に提供されるより短いリンカーと比べて不利に分解、切断、又は同類のものを受けやすいであろう長いリンカーを提供する必要なしに保存され得る。同時に、この分子は、十分に生産可能であり、且つ良好な製品同一性を示す。さらに、本発明は、抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、及びこのコンストラクトを発現する宿主細胞、並びにこれを含む医薬組成物を提供する。
第１の態様では、本発明に関連して、
少なくとも３つの結合ドメインを含むＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子であって、
（ｉ．）第１の結合ドメインは、ＣＤ２０に免疫特異的に結合するパラトープを含み、第１の結合ドメインは、
ａ）配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、
ｂ）配列番号７１～７３のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号７４～７６のＣＤＲ Ｌ１～３、
ｃ）配列番号８４～８６のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号８７～８９のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに
ｄ）配列番号９７～９９のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１００～１０２のＣＤＲ Ｌ１～３
から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含み、
（ｉｉ．）第２の結合ドメインは、ＣＤ２２に免疫特異的に結合するパラトープを含み、第２の結合ドメインは、
ａ）配列番号１３８～１４０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１４１～１４３のＣＤＲ Ｌ１～３、
ｂ）配列番号１５１～１５３のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１５４～１５６のＣＤＲ Ｌ１～３、
ｃ）配列番号１６４～１６６のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１６７～１６９のＣＤＲ Ｌ１～３、
ｄ）配列番号１７７～１７９のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１８０～１８２のＣＤＲ Ｌ１～３、
ｅ）配列番号１９０～１９２のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１９３～１９５のＣＤＲ Ｌ１～３、
ｆ）配列番号２０３～２０５のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号２０６～２０８のＣＤＲ Ｌ１～３、
ｇ）配列番号１２５～１２７のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１２８～１３０のＣＤＲ Ｌ１～３、
ｈ）配列番号２１６～２１８のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号２１９～２２１のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに
ｉ）配列番号３７９～３８１のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号３８２～３８４のＣＤＲ Ｌ１～３
から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含み、
（ｉｉｉ．）第３の結合ドメインは、ヒト及び／又はマカク（Ｍａｃａｃａ）ＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに免疫特異的に結合するパラトープを含み、
第１、第２、及び第３の結合ドメインは、アミノからカルボキシルの順に配置されており、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、５～２４個、好ましくは１８個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより連結されている、
ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子を提供することが想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、この抗原結合分子は、第４のドメインを含み、第４のドメインは、２つのポリペプチド単量体であって、それぞれ、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド単量体を含み、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合している、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、前記第４のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、
ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
を含む、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、第４のドメイン中の前記ポリペプチド単量体のそれぞれは、配列番号１７～２４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有しており、好ましくは、前記ポリペプチド単量体のそれぞれは、配列番号１７～２４から選択されるアミノ酸を有している、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、ＣＨ２ドメインは、ドメイン内システインジスルフィド架橋を含む、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、第１、第２、第３、及び任意選択的な第４の結合ドメインは、アミノからカルボキシルの順に配置されている、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、抗原結合分子は、一本鎖抗原結合分子であり、好ましくは多重特異性ｓｃＦｖ抗原結合分子である、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、第１、第２、及び第３の結合ドメインは、それぞれ、アミノからカルボキシルの順に、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、第１の結合ドメインのＶＨと第２の結合ドメインのＶＨとの間のペプチドリンカーは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４個のアミノ酸、好ましくは、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のアミノ酸、より好ましくは、６個のアミノ酸の長さを有するものから選択される、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、第１の結合ドメインのＶＬと第２の結合ドメインのＶＨとの間のペプチドリンカーは、可動性リンカーであり、アミノ酸構成要素としてセリン及びグリシンを含み、好ましくはセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）及びグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）のみを含む可動性リンカーである、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間のペプチドリンカーは、好ましくは、小さい及び／又は親水性のアミン酸に富み、好ましくは、Ｓ（Ｇ４Ｓ）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（Ｇ４）ｎ、及び（Ｇ５）ｎ（ここで、ｎは、１、２、３又は４に等しく、より好ましくは、ｎは、１又は２に等しい）からなる群から選択され、より好ましくはＳＧ４Ｓから選択される、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子であって、
第１の結合ドメイン及び前記第２の結合ドメインは、それぞれ、
ａ）第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号１３８～１４０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１４１～１４３のＣＤＲ Ｌ１～３；
ｂ）第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号１５１～１５３のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１５４～１５６のＣＤＲ Ｌ１～３；
ｃ）第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号１６４～１６６のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１６７～１６９のＣＤＲ Ｌ１～３；
ｄ）第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号１７７～１７９のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１８０～１８２のＣＤＲ Ｌ１～３；
ｅ）第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号１９０～１９２のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１９３～１９５のＣＤＲ Ｌ１～３；
ｆ）第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号２０３～２０５のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号２０６～２０８のＣＤＲ Ｌ１～３；
ｇ）第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号１２５～１２７のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１２８～１３０のＣＤＲ Ｌ１～３；
ｈ）第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号２１６～２１８のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号２１９～２２１のＣＤＲ Ｌ１～３；
ｉ）第１の結合ドメインの配列番号７１～７３のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号７４～７６のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号３７９～３８１のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号３８２～３８４のＣＤＲ Ｌ１～３；
ｊ）第１の結合ドメインの配列番号７１～７３のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号７４～７６のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号２０３～２０５のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号２０６～２０８のＣＤＲ Ｌ１～３；
ｋ）第１の結合ドメインの配列番号８４～８６のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号８７～８９のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号１６４～１６６のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１６７～１６９のＣＤＲ Ｌ１～３；
ｌ）第１の結合ドメインの配列番号９７～９９のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１００～１０２のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号１７７～１７９のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１８０～１８２のＣＤＲ Ｌ１～３；
ｍ）第１の結合ドメインの配列番号９７～９９のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１００～１０２のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに第２の結合ドメインの配列番号１９０～１９２のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１９３～１９５のＣＤＲ Ｌ１～３
から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、第１の結合ドメインは、第１の標的細胞表面抗原ＣＤ２０に結合可能であり、第２の結合ドメインは、同時に第２の標的細胞表面抗原ＣＤ２２に結合可能であり、好ましくは、第１の標的細胞表面抗原及び第２の標的細胞表面抗原は、同一の標的細胞上に存在している、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、請求項１に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子であって、第３の結合ドメインは、
ａ）配列番号３９２～３９４のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号３９５～３９７のＣＤＲ Ｌ１～３；並びに
ｂ）配列番号４０１～４０３のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号４０４～４０６のＣＤＲ Ｌ１～３
から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、それぞれのペプチドリンカーにより融合している第１、第２、及び第３のドメインは、ペプチドリンカーを介して第４のドメインに融合している、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、抗原結合分子は、アミノからカルボキシルの順に、
（ａ）第１のドメイン；
（ｂ）好ましくは、配列番号１～４及び９～１２からなる群から選択され、好ましくは配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）第２のドメイン、
（ｄ）好ましくは、配列番号１～３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；並びに
（ｅ）第３のドメイン
を含む、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、抗原結合分子は、アミノからカルボキシルの順に、
（ｆ）配列番号１、２、３、９、１０、１１、及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｇ）第４のドメインの第１のポリペプチド単量体；
（ｈ）配列番号５、６、７、及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；並びに
（ｉ）第４のドメインの第２のポリペプチド単量体
をさらに含む、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗原結合分子であって、第１の結合ドメインは、それぞれＶＨとしての配列番号６４及びＶＬとしての配列番号６５、ＶＨとしての配列番号７７及びＶＬとしての配列番号７８、ＶＨとしての配列番号９０及びＶＬとしての配列番号９１、ＶＨとしての配列番号１０３及びＶＬとしての１０４から選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、第２の結合ドメインは、それぞれＶＨとしての配列番号１４４及びＶＬとしての配列番号１４５、配列番号１５７及び１５８、配列番号１７２及び１７３、配列番号１８３及び１８４、配列番号１９６及び１９７、配列番号２０９及び２１０、配列番号１３１及び１３２、並びに配列番号３８５及び３８６から選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗原結合分子であって、第１の結合ドメインは、配列番号６６、７９、９２、及び１０５からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列を含み、第２の結合ドメインは、配列番号１４６、１５９、１７２、１８５、１９８、２１１、１３３、２２４、及び３８７からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列を含む、抗原結合分子を提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、多重特異性抗原結合分子であって、抗原結合分子は、第１（ＣＤ２０）及び第２（ＣＤ２２）の標的結合ドメインを、第３のエフェクター（ＣＤ３）結合ドメイン、及び半減期の延長を付与する第４のドメインと一緒に含み、互いに連結された３つの結合ドメイン及び第４のドメインは、配列番号２３８、２４８、２５８、２６８、２７８、２８８、３０８、３１８、３２８、３３８、３４８、３６８、及び３７８からなる群から選択される配列を有する、多重特異性抗原結合分子を提供することも想定される。
第２の態様では、本発明に関連して、本発明の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを提供することがさらに想定される。
第３の態様では、本発明に関連して、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することも想定される。
第４の態様では、本発明に関連して、本発明のポリヌクレオチド又はベクターで形質転換されたか又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供することがさらに想定される。
第５の態様では、本発明に関連して、本発明の抗原結合分子の生成のためのプロセスであって、本発明の宿主細胞を、抗原結合分子の発現を可能にする条件下で培養すること、及び生成された抗原結合分子を培養物から回収することを含むプロセスを提供することも想定される。
第６の態様では、本発明に関連して、本発明の抗原結合分子又は本発明のプロセスに従って生成された抗原結合分子を含む医薬組成物を提供することがさらに想定される。
前記態様では、本発明に関連して、医薬組成物が、約－２０℃で少なくとも４週間にわたり安定であることも想定される。
本発明に関連して、増殖性疾患、腫瘍性疾患、癌又は免疫障害から選択される疾患の予防、処置、又は寛解における使用のための、本発明の抗原結合分子、又は本発明のプロセスに従って生成された抗原結合分子を提供することがさらに想定される。
前記態様では、本発明に関連して、ＣＤ２０×ＣＤ２２標的化抗原結合分子は、非ホジキンリンパ腫の処置で使用されることも想定される。
標的細胞としてのヒトＣＤ２０及びＣＤ２２二重陽性ヒト細胞株Ｏｃｉ－Ｌｙ １（Ａ）、ヒトＣＤ２０単一陽性ヒト細胞株Ｏｃｉ－Ｌｙ １（ＣＤ２２ノックアウトクローン＃Ａ１）（Ｂ）、並びにＣＤ２２単一陽性ヒト細胞株Ｏｃｉ－Ｌｙ １（ＣＤ２０ノックアウトクローン＃Ａ５）（Ｃ）、並びにエフェクター細胞としてのｐａｎＴ（Ｅ：Ｔ比１０：１）による、ＣＤ２０及びＣＤ２２二重標的化抗原結合分子の４８時間のＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイ。ＥＣ５０値を、固定ヒルスロープを有するシグモイド用量反応曲線の評価用の４パラメトリックロジスティック回帰モデルにより決定する。 標的細胞としてのヒトＣＤ２０及びＣＤ２２二重陽性ヒト細胞株Ｏｃｉ－Ｌｙ １（Ａ）、ヒトＣＤ２０単一陽性ヒト細胞株Ｏｃｉ－Ｌｙ １（ＣＤ２２ノックアウトクローン＃Ａ１）（Ｂ）、並びにＣＤ２２単一陽性ヒト細胞株Ｏｃｉ－Ｌｙ １（ＣＤ２０ノックアウトクローン＃Ａ５）（Ｃ）、並びにエフェクター細胞としてのｐａｎＴ（Ｅ：Ｔ比１０：１）による、ＣＤ２０及びＣＤ２２二重標的化抗原結合分子の４８時間のＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイ。ＥＣ５０値を、固定ヒルスロープを有するシグモイド用量反応曲線の評価用の４パラメトリックロジスティック回帰モデルにより決定する。
本発明に関連して、少なくとも３つの結合ドメインを含むＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子であって、アミノからカルボキシルの方向の第１及び第２の結合ドメインは、好ましくは、ＣＤ２０及びＣＤ２２を同時に標的とし得、第３の結合ドメインは、Ｔ細胞であるエフェクター細胞上のヒト及び／又はマカク（Ｍａｃａｃａ）ＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合する、ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子が提供される。
本発明に関連して、ＣＤ２０及びＣＤ２２標的結合体の選択された組み合わせを有する、本発明に係るＴ細胞エンゲージＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子は、優れた収量、安定性、及び２種の標的結合体間の均衡した活性を示すという驚くべき発見がある。これにより、生産能及び貯蔵能といった実用的な側面と、好ましくは信頼性のある薬効との両方が改善される。これに関して、本発明に係る分子は、本明細書で実証されているように、典型的には１５超であり、好ましくは２０超であり、さらには２５超であるＨＩＣ溶出勾配を示すことが見出される。しかしながら、本発明に係る一般的な構造に従う分子は、本明細書で説明されている特定の結合剤選択を含まず、典型的には、生成物のより低い均一性を示す、より低い値を示す。さらにより顕著なのは、全体的な生産性の指標としての収量であり、この収量は、典型的には１０ｍｇ／Ｌ超の、好ましくは１５ｍｇ／Ｌ超の、さらには２０ｍｇ／Ｌ超の単量体（即ち、所望の生成物）である。対照的に、本明細書で説明されている分子を基礎となる一般的な形式の他の分子は、典型的には、１０ｍｇ／Ｌ超の収量には達しない。製品品質のさらなる指標として、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）での単量体ピークの対称性は、典型的には、本発明に係る特定の結合剤選択を含む分子では改善されている。そのようなピークの対称性は、好ましくは、１．４の値未満であり、より好ましくは、１．３５以下の値未満である。当業者には分かるように、１付近の値が典型的には好ましい。しかしながら、本発明の分子の基礎となる一般的な形式に従う他の分子は、典型的には、１．４未満の値に達しない。さらに、本発明の分子は、典型的には、標的ＣＤ２０及びＣＤ２２の両方を発現する細胞に対して良好な活性を示す。したがって、本明細書で特許請求されている抗ＣＤ２０結合剤及び抗ＣＤ２２結合剤の特異的選択を含む分子では、観察されるＥＣ５０値は、典型的には、驚くほど低い。したがって、本発明の分子は、典型的には、ＣＤ２０－ＣＤ２２二重陽性標的細胞（例えば、Ｏｃｉ－Ｌｙ １細胞）に対して、２０ｐＭ未満の、好ましくは１５ｐＭ未満の、さらにより好ましくは１０ｐＭ未満のＥＣ５０値を示す。本発明の分子の基礎となる一般的な形式に従う他の分子は、典型的には、対応する条件下で２０ｐＭ超（ａｂｏｉｅ）のＥＣ５０値を示す。したがって、より高い有効性は、本発明に係る分子に起因し得る。
加えて、本発明の分子は、好ましくは、癌細胞等の１つの標的細胞上の２つの（異なる）抗原を標的とするのに適しており、対照的に非癌細胞をあまり標的としない、基礎となる一般的な形式の分子の驚くべき特徴を満たす。２種の標的抗原に同時に対処し得ることにより、（ａ）癌細胞等の標的細胞を標的とする可能性は、そのような標的細胞が抗原欠損を受けると大きく増加し、そのため、抗原回避を受けている細胞上に標的として１つの有効な抗原が残っていることから、有効な抗腫瘍療法を腫瘍が回避する傾向があり、且つ（ｂ）生理学的細胞の代わりに疾患に関連する標的細胞を標的とする可能性は、生理学的細胞の代わりに疾患に関連する標的細胞と典型的には関連する２種のＴＡＡが選択される場合に大きく増加する。これに関して、本明細書では、例えば腫瘍環境における抗原回避を防止するだけでなく、例えば特定の疾患に典型的には関連する２種の抗原のパターンを有する細胞に対処することにより治療の幅をさらに広げるＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子が想定される。そのため、細胞が２種の標的の１種のみを発現する生体組織は、即時二重標的化抗原結合分子により対処されない。特に、選択的ギャップは、例えば、標的結合ドメイン（又は結合体、本開示を通して同義に使用される）及びＣＤ３結合体、さらなる標的結合体、並びに任意選択的な半減期延長ドメイン（例えば、ｓｃＦｃドメイン）を含む二重特異性実体を有する、例えば本明細書で説明されているような形式の二重標的化分子により達成され得る。本明細書で説明されている二重標的化抗原結合分子は、典型的には、両方の標的に関して陽性な細胞に対して１００ｐＭ未満のＥＣ５０値を特徴とし、好ましくは５０ｐＭ未満、より好ましくは３０ｐＭ未満、さらにより好ましくは約１０ｐＭ以下のＥＣ５０値を特徴とするが、そのような二重標的化分子は、典型的には、単一標的化細胞で用いられる場合に有意に高いＥＣ５０値（例えば、少なくとも５０ｐＭ、１００ｐＭ、２５０ｐＭ、さらには５００ｐＭ以上）を示す。この知見は、本発明のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化分子が、有利には、両標的を発現する病原性標的細胞に特異的に対処するように使用可能であり、且つ前記分子が同時に結合することによりＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘起し得る、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、又はさらに３０倍という活性の観点で、選択性ギャップを確かに有することを示唆する。それにより、オフターゲット毒性及び関連する副作用は低減する可能性があり、ここで説明された概念に基づき、より安全な治療を提供し得る。したがって、典型的には一本鎖である本発明に係るＴ細胞エンゲージＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子は、既存の二重特異性抗体又はＴ細胞に結合する抗原結合分子に関する有効性及び安全性の改善を提供する。前記有利な特性は、好ましくは、このＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子の第１及び第２の結合ドメインが互いに独立してその生物活性を維持し得る（即ち、それぞれの他の結合ドメイン及び／又はそれぞれの他の標的結合体が結合している標的により立体的に妨げられることなく、それぞれの標的に結合し得る）という事実により達成される。生物活性の保存は、好ましくは、（ａ）両方の結合ドメインのアミノからカルボキシルの方向へのＶＨ－ＶＬ配置、並びに／又は（ｂ）第１及び第２の結合ドメインを連結するリンカーの慎重な選択により達成される。前記リンカーは、両方の結合ドメインの生物活性と、このコンストラクトの十分な（化学的）安定性との両方を確保する長さを有する必要がある。約５～２４個、好ましくは５～１８個、より好ましくは６又は１２個のアミノ酸の長さという驚くほど比較的短いペプチドリンカーは、両方の要件を満たす。好ましくは、そのようなリンカーは、Ｇｌｙ及びＳｅｒ等の小さい又は親水性のアミノ酸に富んでおり、なぜなら、そのような組成は、好ましくは、可動性を提供するからである。その結果、そのような可動性は、好ましくは、本発明に係るＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子の他の結合ドメインから独立して、それぞれの結合ドメインの相互作用を可能にする。同時に、そのような短く好ましくは可動性のペプチドリンカーでさえ、典型的には、両方のドメインが、本発明に関連して治療上有用な分子を有するために必要とされるそれらの生物活性を保持するように、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の十分な空間的分離を提供することは、驚くべきことである。本発明に関連して開示されるそのような短いリンカーのさらなる利点は、より長いリンカーと比較して鎖間誤対合が好ましくは防止されていることである。
本発明の基礎となる上記の特定の発見は、先行技術の教示を考慮すると驚くべきことである。例えば、Ｌｉｕらは、ペプチド間のリンカーが長いほど、２つの分子の独立したフォールディング及び生物学的活性が良好に維持されることを示した（Ｌｉｕ ＺＧ，Ｌｉｎ ＪＢ，Ｄｕ Ｗ，ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩＩｎ－ＵＫ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２００５；３２：５４４－５０）。過剰に短い、結合ドメイン（好ましくはｓｃＦｖ結合ドメイン）間のリンカーは、空間占有によりタンパク質フォールディングに悪影響を及ぼし、過剰に長いリンカーは、ｓｃＦｖ抗体の抗原性を増強し、ｓｃＦｖ抗体の機能性及び活性にも影響を及ぼす。Ｘｕらは、十分な長さ及びある特定の配列の特性が、２つの半分子がそれらの機能を発揮するための十分な自由空間を有するのに重要な因子であり、ａ－ヘリックス及びｂ－シートの形成を回避することが安定性に重要であることを教示する（Ｘｕｅ Ｆ，Ｇｕ Ｚ，Ｆｅｎｇ ＪＡ．ＬＩＮＫＥＲ：ａ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００４；３２：Ｗ５６２－５）。したがって、結合ドメイン間の距離を維持することを目的とする当業者は、典型的にはらせん構造を特徴とするか又はプロリンに富む剛性リンカーを採用することを企図しているであろう。しかしながら、剛性リンカーの長さもタンパク質の生物活性に大きい影響を及ぼす。ＭｃＣｏｒｍｉｃｋらは、インターフェロン－γ－ｇｐ１２０融合タンパク質で適用された剛性ペプチドリンカー（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ（１０～３４個のａａ）を調べた（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｍ，Ｈｅａｔｈ Ａ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ－ｇｐ１２０ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｇｐ１２０． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． ２００１；１８４：１４２３－１４３０）。１０個のａａの短いリンカーにより、この融合タンパク質は、インターフェロン－γの生物活性が比較的低かった。このリンカーを長くすることにより、この融合タンパク質の生物活性は徐々に改善され、最長の３４個の残基のリンカーによる遊離インターフェロン－γの８８％の活性がピークであった。さらに、場合によっては、柔軟な又は剛性のリンカーを挿入しても、ドメイン間の立体障害に起因して、生物活性の低下を依然として克服し得ない（Ｂａｉ Ｙ，Ａｎｎ ＤＫ，Ｓｈｅｎ ＷＣ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａｎ ｏｒａｌ ｍｙｅｌｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｇｅｎｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００５；１０２：７２９２－７２９６）。
当技術分野で既知の障害を考慮して、当業者は、短い可動性の又はさらには剛性のリンカーを回避するように促されており、より長い剛性リンカーに目を向けており、ここで、「長い」は、当技術分野から、好ましくはプロリンを含む約３０個のアミノ酸と理解され得るであろう。この情報に基づいて、当業者は、好ましくは、最先端のモデル化技術を使用して、ペプチドリンカーによって連結される第１及び第２の結合ドメインをモデル化し、いずれのリンカー長を取るべきか及びいずれのリンカー長を避けるべきであるかを確認するであろう。リンカーが、Ｇｅｒ及びＳｅｒに富む可動性リンカーである場合、３０個のアミノ酸のリンカー長は、典型的には、第１及び第２の結合ドメイン間にかなり大きい空間（典型的には少なくとも７０Å、より典型的には少なくとも８０Å）をもたらし、当業者は、ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子の第２の結合ドメインによる結合を促進するために第２の標的細胞表面抗原（ＴＡＡ２ ＣＤ２２）を収容するのに安全なサイズと見なすであろう。本発明に関連して、第１の結合ドメイン（即ち、Ｎ末端結合ドメイン）は、標的への結合時に立体障害を引き起こす可能性がある、隣接する結合ドメインが１つのみあることから、比較的容易にアクセスされるが、第２の結合ドメインは、Ｎ方向で第１の結合ドメインに接続されていることに留意することが重要である。
典型的には、ＳＧＧＧＧＳリンカーが、ｓｃＦｖである２つの標的結合ドメイン間でモデル化されている場合（結合ドメイン内のＶＨ及びＶＬ間で（ＧＧＧＧＳ）３リンカーがそれぞれモデル化されている場合、第１の結合ドメイン（例えば抗ＭＳＬＮ結合ドメイン）が固定されている場合、及び３種の可能性のある予想される立体構造（リンカーが異なる直交で揺れる）が適用されている場合（それぞれリンカー立体構造１、２及び３）、リンカー位置３の場合に完全な衝突が観察され、位置１及び２では衝突が観察されない。しかしながら、この空間は、典型的には、ＣＤＲが本発明に係るＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子の第２の結合ドメイン内に好ましくは位置する場所に基づいて、ＴＡＡ２を収容するには依然として十分ではない。それ故、この結果は、２つの標的結合ドメイン間でのより長いリンカーの必要性を強く示す。当業者が、ガイドとして標的ＥｐＣＡＭのサイズを使用した場合、より良好なリンカーは、好ましくは少なくとも約３０個の残基、あまり好ましくはないが少なくとも２０個の残基（即ち、１個のａａ当たり３．８で除算された７０Ａの好ましい距離）を有するものであると予測されるであろう。したがって、空間の欠如により、ＳＧＧＧＳリンカー等の短いリンカーソリューション（ｌｉｎｋｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及びその短い多重性（例えば、本発明に係る２つの標的結合ドメイン間のＳ（Ｇ４Ｓ）２及びＳ（Ｇ４Ｓ）２）は好ましくなく、したがって、ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子（特に、二重標的化ＢｉＴＥ（登録商標）分子）における標的結合体のこの構造のための非自明の選択である。同じことが１２個のａａのリンカーにも当てはまり、このリンカーは、典型的には、状況に応じて最大約５０Åであり得る約３５Åの小さい最大利用可能空間を付与し、そのため、少なくとも約４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０又は８５Åのサイズである、結合される典型的な標的は、安全に収容されないであろう。同様に、本明細書で開示される構造での結合ドメイン間の最大利用可能空間が６０Å以下であり、典型的には５５Å以下であり、例えば５４～６０Åである１８個のａａの長さのリンカー（例えばＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ）は、４５～７０Åの例示的なサイズの第２のＴＡＡ２への結合を不可能にする可能性があるであろう。対照的に、３０個のａａの長さのリンカーは、典型的には８４～９４Åの最大空間を付与し、そのため、標的結合体が約４５～７０Åの例示的な標的に安全に結合することが可能になる。そのため、当業者は、本発明に係るＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子の例としてのＨＬＥ ｄｕａｌ ＢｉＴＥ（登録商標）等での第２のＴＡＡ２の結合を確実にするために、少なくとも１８個超のａａの長さのリンカーを選択しているであろう。上記の考察は、Ｓｅｒ及び／又はＧｌｙの含有量が高い可動性リンカーに基づいていることに留意しなければならない。当業者は、前記標的結合ドメインの生物学的機能を維持するために、本発明に係る２つの隣接する標的結合ドメイン間の距離を維持するのに十分な長さを確保するべく、可動性が低いリンカーがさらに多くのアミノ酸を必要とする場合があることを企図しているであろう。
２つの異なる標的細胞表面抗原に対処するＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子は、それにより、その標的細胞に非常に特異的であり、したがって、その治療的使用において好ましくは安全であることが、本発明との関連において特に想定される。このことは、カニクイザル毒性試験で実証されている。
Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０又はＣＤ２０は、前Ｂ期（ＣＤ４５Ｒ＋、ＣＤ１１７＋）で始まり、成熟まで濃度が徐々に増加する全てのＢ細胞の表面上で発現される。ＣＤ２２又は表面抗原分類２２は、レクチンのＳＩＧＬＥＣファミリに属する分子である。この分子は、成熟Ｂ細胞の表面上で見出され、一部の未熟Ｂ細胞上では比較的低い程度で見出される。
さらに、本発明に関連して任意選択的ではあるが有利には、ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子は、第４のドメイン（典型的にはｓｃＦｃドメイン、即ち、ＨＬＥ）を備えており、抗原結合分子は、わずか毎週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、さらには４週間毎に１回、又はより少ない頻度で投与される静脈内投与を可能にすることが想定される。
例えばＣＤ２０エピトープに向けられた本発明に係る好ましいＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子のエピトープを決定するために、本明細書で説明されているようにマッピングを行なった。ヒトＣＤ２０タンパク質の細胞外領域を、下記の５つの部分に分けた：（１）Ｅ１と呼ばれる細胞外ループ１（ＥＣＬ１、アミノ酸７２～８４、実施例１７の参考文献を参照されたい）、及びＥ２と呼ばれる細胞外ループ２（ＥＣＬ２）。細胞外ループ１（Ｅ１）を、Ｅ１Ａ（ａａ７２～７９）及びＥ１Ｂ（ａａ８０～８４）と呼ばれる２つの副部分にさらに分けた。細胞外ループ２（Ｅ２、ａａ１４２～１８８）を、Ｅ２Ａ（ａａ１４２～１６１）、Ｅ２Ｂ（ａａ１６２～１６６）、Ｅ２Ｃ（ａａ１６７～１７５）、及びＥ２Ｄ（ａａ１７６～１８８）と呼ばれる４つの副部分にさらに分けた。驚くべきことに、ＣＤ２０抗原結合分子は、単一標的化及び二重標的化の両方で、（ｉ）Ｅ１Ａ及びＥ２Ｂ及びＥ２Ｃエピトープ、又は（ｉｉ）Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂエピトープへの結合時に好ましくはより高い細胞傷害活性を示すことを発見した。これに応じて、エピトープの特徴付けのために、ヒトＣＤ２２タンパク質の細胞外領域を、下記の７つの部分に分けた：Ｖ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０２７３＋ＲＰＦＰで規定されるａａ２０～１４２）、Ｃ２－１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０２７３＋ＬＮＶＫＨＴで規定されるａａ１４３～２４１）、Ｃ２－２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０２７３＋ＶＱＹＡで規定されるａａ２４２～３３０）、Ｃ２－３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０２７３＋ＹＰで規定されるａａ３３１～４１８）、Ｃ２－４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０２７３＋ＶＱＹＡで規定されるａａ４１９～５０４）、Ｃ２－５（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０２７３＋ＫＡＷＴＬＥＶＬＹＡで規定されるａａ５０５～５９２）、及びＣ２－６（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０２７３＋ＶＹＹＳＰＥＴＩＧＲＲで規定されるａａ５９３～６８７）。驚くべきことに、ＣＤ２２抗原結合分子は、単一標的化及び二重標的化の両方で、Ｃ２－１エピトープへの結合時に好ましくはより高い細胞傷害活性を示すことを発見した。
本発明に係る多重特異性抗原結合分子が、標的結合ドメイン間の短いリンカーにもかかわらず、２種の異なる標的に好ましくは同時に結合し得ることは、特に驚くべきことである。同時結合は、本明細書において、いくつかの標的に関して実証されている。しかしながら、このことは、標的間の典型的な距離を考慮すると驚くべきことである。例えば、ＣＤ２０は、わずか１３個のａａ（Ｅ１）及び４７個のａａ（Ｅ２）という２個の小さい細胞外ドメインを含む。対照的に、ＣＤ２２は、６７６個のａａを有する７Ｉｇドメイン長の細胞外ドメインを含む。しかしながら、細胞外のサイズ及び構成の著しい差違にもかかわらず、本意図に係る多重特異性抗原結合分子は、高い有効性及び低い毒性という利点のために、同時にＴＡＡ ＣＤ２０及びＣＤ２２の両方に成功裏に対処し得る。これは、好ましくは、達成される。
好ましい多重特異性抗原結合分子は、細胞傷害性と親和性の好ましい比率を示すだけではなく、さらに前記コンストラクトを製剤化し、保管し、且つ投与する際の実用的な取扱いを容易にするために十分な安定性特性を示すことが、本発明との関連において想定される。十分な安定性は、例えば、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定される場合に少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％等の、標準的な調製後の高い単量体含有量（即ち、非凝集及び／又は非会合の天然分子）によって特徴付けられる。また、例えば、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度において光吸収として３４０ｎｍで測定された混濁度は、例えば、望ましくない凝集物の本質的な欠如と結論するために、好ましくは０．０２５以下、より好ましくは０．０２０以下であるべきである。有利には、高い単量体含量は、凍結／解凍又は３７℃若しくは４０℃でのインキュベーション等の負荷条件におけるインキュベーションの後に維持される。さらに、本発明に係る多重特異性抗原結合分子は、典型的には、１つの標的結合ドメインのみを有するがそうでなければＣＤ３結合ドメイン及び任意選択的な半減期延長ｓｃＦｃドメインを含む（即ち、構造的にあまり複雑でない）二重特異性抗原結合分子のものより、少なくとも同等であるか又はさらに高い熱安定性を有する。当業者は、より構造的に複雑なタンパク質に基づく分子は、熱分解及び他の分解を受けにくかった（即ち、熱安定性が低い）ことを期待するであろう。
そのため、本発明は、ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子であって、
（ｉ．）第１の標的細胞表面抗原に特異的に結合する第１の結合ドメイン（選択された抗ＣＤ２０結合体）、
（ｉｉ．）第２の標的細胞表面抗原に特異的に結合する第２の結合ドメイン（選択された抗ＣＤ２２結合体）、
（ｉｉｉ．）ヒト及び／又はマカク（Ｍａｃａｃａ）ＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合する第３の結合ドメインであり、第１、第２、及び第３の結合ドメインは、アミノからカルボキシルの順に配置されており、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、５～２５個（好ましくは、５～１８個又は６～１６個）のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより連結されている、第３の結合ドメイン、並びに任意選択的な
（ｉｖ．）ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインをそれぞれ含む２つのポリペプチド単量体を含む第４のドメインであり、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合している、第４のドメイン
を含むＣＤ２０及びＣＤ２２標的化結合ドメイン分子を提供する。
本発明のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化二重特異性抗原結合分子の一般的な要件として、二重特異性実体として作用し、それにより（好ましくは二重陽性）標的細胞とエフェクターＴ細胞との間の細胞溶解性シナプスを形成するために、１つの標的結合ドメインは、エフェクターＣＤ３結合ドメインのＮ末端に隣接して配置されていなければならない。
用語「ポリペプチド」は、本明細書では、少なくとも１本の連続した非分枝アミノ酸鎖を含む有機ポリマーと理解される。本発明との関連では、複数のアミノ酸鎖を含むポリペプチドも、同様に想定される。ポリペプチドのアミノ酸鎖は、典型的には、少なくとも５０個のアミノ酸を含み、好ましくは、少なくとも１００、２００、３００、４００、又は５００個のアミノ酸を含む。本発明との関連では、ポリマーのアミノ酸鎖が、アミノ酸で構成されていない実体に連結していることもまた想定される。
本発明に係る用語「抗原結合ポリペプチド」は、好ましくは、その標的又は抗原に免疫特異的に結合するポリペプチドである。それは、典型的には、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、又はこれらに由来するドメインを含む。本発明に係るポリペプチドは、免疫特異的標的結合を可能にする抗体の最小限の構造要件を含む。この最小限の要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（即ち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（即ち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在により定義され得、好ましくは６つ全てのＣＤＲの存在により定義され得る。したがって、Ｔ細胞エンゲージポリペプチドは、いずれか一方又は両方の結合ドメイン内の３つ又は６つのＣＤＲの存在を特徴とし得、これらのＣＤＲが結合ドメイン内のどこに（いずれの順序で）配置されているかは、当業者に既知である。典型的には、「抗原結合分子」は、本発明に関連する「抗原結合ポリペプチド」と理解される。
或いは、本発明に関連して、抗原結合ポリペプチドは「抗体コンストラクト」に相当し、この抗体コンストラクトは、典型的には、構造及び／又は機能が抗体（例えば、完全長免疫グロブリン分子又は全免疫グロブリン分子）の構造及び／又は機能に基づいている分子を指す。したがって、抗原結合分子は、その特異的な標的若しくは抗原に結合し得、及び／又は抗体若しくはその断片の可変重鎖（ＶＨ）及び／若しくは可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから導き出される。さらに、本明細書では、本発明に係る結合パートナーに結合するドメインは、本発明に係る抗原結合分子の結合ドメインとして理解される。典型的には、本発明に係る結合ドメインは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（即ち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（即ち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在により定義され得、好ましくは６つ全てのＣＤＲの存在により定義され得る。抗体の最小構造要件を定義する代替の手法は、それぞれエピトープ領域を構成する標的タンパク質のタンパク質ドメインである特異的な標的の構造内での抗体のエピトープの定義であるか（エピトープクラスター）、又は定義された抗体のエピトープと競合する特異的な抗体を参照することによる。本発明に係るコンストラクトが基づく抗体として、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が挙げられる。
本発明に係る抗原結合分子の結合ドメインは、例えば、上で参照される群のＣＤＲを含んでもよい。好ましくは、これらのＣＤＲは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワーク内に含まれるが；それは両方を含む必要はない。Ｆｄ断片は、例えば、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合、インタクトな抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持している。抗体断片、抗体バリアント、又は結合ドメインの形式のさらなる例として、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインを有する一価の断片であるＦａｂ断片；（２）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を有する二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（４）抗体の単一のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメインを有するＦｖ断片、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（７）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、後者が好ましい（例えば、ｓｃＦＶライブラリ由来のもの）。本発明に係る抗原結合分子の実施形態の例は、例えば、国際公開第００／００６６０５号パンフレット、同第２００５／０４０２２０号パンフレット、同第２００８／１１９５６７号パンフレット、同第２０１０／０３７８３８号パンフレット、同第２０１３／０２６８３７号パンフレット、同第２０１３／０２６８３３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４／０３０８２８５号明細書、同第２０１４／０３０２０３７号明細書、国際公開第２０１４／１４４７２２号パンフレット、同第２０１４／１５１９１０号パンフレット、及び同第２０１５／０４８２７２号パンフレットで説明されている。
また、「結合ドメイン」又は「～に結合するドメイン」の定義には、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は「ｒ ＩｇＧ」（「半抗体」）等の完全長抗体の断片も含まれる。本発明に係る抗原結合分子はまた、抗体バリアントとも呼ばれる、抗体の改変された断片、例えば、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ又はｂｉ（ｓ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖ、「マルチボディ」、例えばトリアボディ又はテトラボディ、及び単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディ、又は他のＶ領域若しくはドメインに非依存的に抗原若しくはエピトープに特異的に結合する、ＶＨＨ、ＶＨ若しくはＶＬであり得るただ１つの可変ドメインを含む単一可変ドメイン抗体も含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「一本鎖Ｆｖ」、「一本鎖抗体」、又は「ｓｃＦｖ」は、重鎖及び軽鎖の両方からの可変領域を含むが定常領域を欠く単一のポリペプチド鎖抗体断片を指す。通常、一本鎖抗体は、ＶＨ及びＶＬドメイン間において、抗原への結合を可能にする所望の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをさらに含む。一本鎖抗体は、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）においてＰｌｕｃｋｔｈｕｎによって詳細に議論されている。一本鎖抗体を作製する様々な方法が知られており、米国特許第４，６９４，７７８号明細書及び同第５，２６０，２０３号明細書；国際特許出願公開の国際公開第８８／０１６４９号パンフレット；Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４４２；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４５４；Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８－１０４１で説明されているものが挙げられる。特定の実施形態では、一本鎖抗体は、二重特異性、多重特異性、ヒト、及び／若しくはヒト化、並びに／又は合成性でもあり得る。
さらに、用語「抗原結合分子」の定義は、好ましくは多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）／多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）コンストラクトを含み、そのため、二重特異性分子（二重特異性は、異なる抗原構造を含む２種の細胞タイプ（即ち、標的細胞及びエフェクター細胞）に特異的に結合することを意味する）を含む。本発明の抗原結合分子は、好ましくはＣＤ２０及びＣＤ２２標的化であることから、典型的には、２つの標的結合ドメイン及び１つのＣＤ３結合ドメインである本発明に関連する異なる結合ドメインを介して、３種以上（好ましくは３種）の抗原性構造に特異的に結合する多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）／多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）分子である。さらに、用語「抗原結合分子」の定義は、１本のペプチド鎖のみからなる分子、及び複数のポリペプチド鎖（これらの鎖は、同一であり得る（ホモ二量体、ホモ三量体、若しくはホモオリゴマー）か又は異なり得る（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、若しくはヘテロオリゴマー））からなる分子を含む。複数のポリペプチド鎖（即ち、典型的には２本の鎖）を含むそのような分子は、例えば、本明細書で説明されているＣＤ３結合体のＣ末端位置で、例えば半減期延長部分として機能するヘテロＦｃ実体内で、荷電対結合によりヘテロ二量体として典型的には互いに結合しているこれらの鎖を有する。上で特定された抗原結合分子、例えば、抗体に基づく分子に関する例は、とりわけ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）及びＵｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ ｅｄ．２０１０及びＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２００９で説明されている。
用語「二重特異性」は、本明細書で使用される場合、「少なくとも二重特異性」である抗原結合分子を指し、即ち、この抗原結合分子は、２種の異なる細胞タイプに対処し、即ち、エフェクター細胞を標的とし、且つ少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、ここで、少なくとも一方の結合ドメインは、好ましくはＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦＬＴ３、ＣＤ１２３、ＭＳＬＮ、ＣＬＬ１、及びＥｐＣＡＭから選択される抗原又は標的に結合し、同一分子の別の結合ドメインは、別の抗原又は標的（本明細書ではＣＤ３）に結合する。したがって、本発明に係る抗原結合分子は、少なくとも２種の異なる抗原又は標的に対する特異性を含む。例えば、１つのドメインは、好ましくは、本明細書で説明されている種の１つ又は複数のＣＤ３ｅの細胞外エピトープに結合しない。
用語「標的細胞表面抗原」は、細胞により発現されており且つ本明細書で説明されている抗原結合分子がアクセス可能であるように細胞表面に存在する抗原性構造を指す。本発明に関連する好ましい標的細胞表面抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。これは、タンパク質（好ましくは、タンパク質の細胞外部分）、又は炭水化物構造（好ましくは、糖タンパク質等のタンパク質の炭水化物構造）であり得る。これは、好ましくは腫瘍抗原である。本発明の用語「二重特異性抗原結合分子」はまた、３つの結合ドメインを含む三重特異性抗原結合分子、又は３つ超（例えば、４つ、５つ．．．）の特異性を有するコンストラクト等の多重特異性抗原結合分子も包含する。
本発明に関連して好ましいのは、「少なくとも二重特異性」であると本明細書で理解されている「多重特異性」である分子である。これに関して、抗原結合分子等の多重特異性分子は、ＣＤ３（より好ましくはＣＤ３ｅ）等のエフェクターと、少なくとも２種の標的細胞表面抗原とに特異的である。前記特異性は、本明細書で定義されているそれぞれの結合ドメインにより付与される。典型的には、「多重特異性」は、２つの異なる標的細胞の表面エフェクターに特異的である分子を指し、したがって、多重特異性は、本発明に係る多重特異性抗原結合分子の好ましい特性（即ち、抗原欠損の軽減及び治療の幅の増加又はよい高い忍容性）を付与する。
本発明に係る抗原結合分子が（少なくとも）二重特異性である場合、これは、天然には存在せず、且つこれは、天然に存在する生成物と顕著に異なる。したがって、「二重特異性」抗原結合分子又は免疫グロブリンは、特異性が異なる少なくとも２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体又は免疫グロブリンである。二重特異性抗原結合分子は、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法により生成され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１（１９９０）を参照されたい。
本発明の抗原結合分子の少なくとも３つの結合ドメイン及び可変ドメイン（ＶＨ／ＶＬ）は、典型的には、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含む。用語「ペプチドリンカー」は、本発明によれば、本発明の抗原結合分子の一方の（可変及び／又は結合）ドメイン並びにもう一方の（可変及び／又は結合）ドメインのアミノ酸配列を互いに連結するアミノ酸配列を含む。好ましくは異なる標的（例えば、ＴＡＡ１及びＴＡＡ２）である２つの標的に同時に結合し得る第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間のペプチドリンカーは、好ましくは、可動性であり且つ長さが制限されている（例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８個のアミノ酸である）。このペプチドリンカーを、第３のドメインを本発明の抗原結合分子の他のドメインにも融合させためにも使用し得る。そのようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、重合活性を含まないことである。好適なペプチドリンカーは、米国特許第４，７５１，１８０号明細書及び同第４，９３５，２３３号明細書、又は国際公開第８８／０９３４４号パンフレットで説明されているものである。ペプチドリンカーをまた、他のドメイン又はモジュール又は領域（半減期延長ドメイン等）を本発明の抗原結合分子に結合させるためにも使用し得る。しかしながら、典型的には、第１の標的結合ドメインと第２の標的結合ドメインとの間のリンカーは、標的結合ドメイン内のＶＨ及びＶＬを連結する結合体内リンカーとは異なる。前記差異は、結合体内リンカーと比べて１つのアミノ酸が多い（例えば、ＳＧＧＧＧＳ対ＧＧＧＧＳ等のそれぞれ６つ及び５つのアミノ酸）、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間のリンカーである。これにより、驚くべきことに、本明細書で説明されている特定の抗原結合分子形式において、可動性及び安定性が同時に付与される。
本発明の抗原結合分子は、好ましくは「インビトロで生成された抗原結合分子」である。この用語は、可変領域の全て又は一部（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）が非免疫細胞の選択、例えばインビトロファージディスプレイ、タンパク質チップ、又は抗原結合能に関して候補配列を試験し得る任意の他の方法において生成される、上記定義による抗原結合分子を指す。したがって、この用語は、好ましくは、動物の免疫細胞におけるゲノム再編成によってのみ生成される配列を除外する。「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術又は遺伝子工学の使用により作製された抗体である。
用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）又はモノクローナル抗原結合分子は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち、少量存在する可能性がある、考えられる天然に存在する変異及び／又は翻訳後改変（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、異なる決定基（又はエピトープ）に対して誘導された異なる抗体を通常含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、抗原上の単一の抗原部位又は決定基に対して誘導される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成されるため、他の免疫グロブリンが混入しない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。
モノクローナル抗体の調製には、継続的な細胞株培養により産生される抗体をもたらす任意の技術を使用し得る。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に説明されたハイブリドーマ方法によって作製され得るか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体を産生するさらなる技術の例として、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４（１９８３），７２）、及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７－９６）が挙げられる。
次に、ハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴分析、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）等の標準的な方法を使用してスクリーニングして、指定の抗原に特異的に結合する抗体を産生する１つ又は複数のハイブリドーマを同定し得る。例えば、組換え抗原、天然に存在する形態、そのあらゆるバリアント又は断片、及びその抗原性ペプチドといった、あらゆる形態の関連抗原を、免疫原として使用し得る。Ｂｉａｃｏｒｅシステムで採用されている表面プラズモン共鳴を使用して、標的細胞の表面抗原のエピトープにファージ抗体が結合する効率を高め得る（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７－１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７－１３）。
モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法として、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージディスプレイ又はリボソームディスプレイライブラリのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイについては、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２２３，４０９号明細書、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５－１３１７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）、及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）で説明されている。
ディスプレイライブラリの使用に加えて、関連抗原を使用して、非ヒト動物、例えばげっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ウサギ、又はラット）を免疫化し得る。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生が欠損したマウス系統を、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きいフラグメントを用いて改変することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を製造して選択し得る。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１、米国特許出願公開第２００３－００７０１８５号明細書、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット及び同第９６／３３７３５号パンフレットを参照されたい。
モノクローナル抗体をまた、非ヒト動物から得た後、当技術分野で知られる組換えＤＮＡ技術を使用して、例えば、ヒト化、脱免疫、キメラ化等の改変を行い得る。改変された抗原結合分子の例として、非ヒト抗体のヒト化バリアント、「親和性成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９－８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１０８３２－１０８３７（１９９１）を参照されたい）、及びエフェクター機能が改変された抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号明細書、前掲のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０）、及び前掲のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照されたい）が挙げられる。
免疫学において、親和性成熟とは、免疫反応の過程で抗原に対する親和性が増大した抗体をＢ細胞が産生するプロセスのことである。同じ抗原への反復曝露により、宿主は、連続的により高い親和性の抗体を産生する。天然のプロトタイプと同様に、インビトロ親和性成熟は、変異及び選択の原理に基づいている。インビトロ親和性成熟を問題なく使用して、抗体、抗原結合分子、及び抗体断片を最適化している。ＣＤＲ内部のランダム変異は、放射線、化学的変異原、又はエラープローンＰＣＲを使用して導入される。加えて、チェインシャッフリングにより、遺伝的多様性を増加させ得る。ファージディスプレイのようなディスプレイ方法を用いた２又は３ラウンドの変異及び選択により、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体断片が得られる。
抗原結合分子のアミノ酸置換変種の好ましいタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基の置換を含む。一般に、さらなる開発のために選択されて得られるバリアントは、それらが生成された親抗体と比べて向上した生物学的特性を有することになる。そのような置換バリアントを生成するための簡便な方法には、ファージディスプレイを用いる親和性成熟が含まれる。簡潔に説明すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７部位）は、それぞれの部位で可能な全てのアミノ酸置換が生じるように変異される。そのようにして生成された抗体バリアントは、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として、繊維状ファージ粒子から一価形態で提示される。次に、ファージディスプレイされたバリアントを、本明細書に開示されるとおりにそれらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための超可変領域部位候補を同定するために、アラニンスキャニング変異導入法を実施して、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定し得る。或いは又は加えて、結合ドメインと、例えばヒトＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦＬＴ３、ＣＤ１２３、ＣＤＨ３、ＭＳＬＮ、ＣＬＬ１、又はＥｐＣＡＭの間の接触点を同定するために、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析することが有益な場合がある。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書中で詳述される技術に従う置換の候補である。そのようなバリアントを生成してから、バリアントのパネルに対して、本明細書で説明されているスクリーニングを施し、１つ又は複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択してもよい。
本発明のモノクローナル抗体及び抗原結合分子は、特に、重鎖及び／若しくは軽鎖の一部が、特定の種に由来するか又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか若しくは相同である一方、鎖の残部は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来するか又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体並びにそのような抗体の断片中の対応する配列と同一であるか若しくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む「霊長類化」抗体が含まれる。キメラ抗体を作製するための様々な方法が説明されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，同第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０１７１４９６号明細書；同第０１７３４９４号明細書；及び英国特許第２１７７０９６号明細書を参照されたい。
抗体、抗原結合分子、抗体断片、又は抗体バリアントはまた、例えば国際公開第９８／５２９７６号パンフレット又は同第００／３４３１７号パンフレットで開示されている方法によるヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫化」と呼ばれる方法）によっても改変され得る。簡潔に説明すると、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを分析し得る。これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープ（国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び同第００／３４３１７号パンフレットで定義されている）に相当する。潜在的なＴ細胞エピトープの検出には、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び同第００／３４３１７号パンフレットに記載される通り、「ペプチドスレッディング法」と呼ばれるコンピューターモデリング手法を適用し得、加えて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースで、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフを検索し得る。これらのモチーフは、１８種の主要なＭＨＣクラスＩｌ ＤＲアロタイプのいずれかに結合し、したがって潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープを、可変ドメイン内の少数のアミノ酸残基を置換することにより、又は好ましくは単一のアミノ酸置換により、除去し得る。典型的には、保存的置換が行われる。限定されないが、多くの場合、ヒト生殖系列抗体配列中の位置に共通のアミノ酸が使用され得る。ヒト生殖細胞系配列については、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ．１６（５）：２３７－２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１４：４６２８－４６３８において開示されている。Ｖ ＢＡＳＥ総覧は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的な総覧を提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ ａｌ．ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより編集）。この配列は、ヒト配列の供給源として、例えばフレームワーク領域及びＣＤＲに使用され得る。例えば、米国特許第６，３００，０６４号明細書で説明されているコンセンサスヒトフレームワーク領域も使用し得る。
「ヒト化」抗体、抗原結合分子、バリアント、又はその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合部分配列）は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、大部分がヒト配列である抗体又は免疫グロブリンである。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲともいう）由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ハムスター、又はウサギ等の非ヒト（例えば齧歯類）種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられている。さらに、「ヒト化抗体」はまた、本明細書で使用される場合、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含む場合もある。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させ、最適化するためになされる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部を含む場合もある。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。
ヒト化抗体又はその断片を、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列をヒトＦｖ可変ドメイン由来の等価な配列に置き換えることにより生成し得る。ヒト化抗体又はその断片を生成するための例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４並びに米国特許第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、同第５，８５９，２０５号明細書、及び同第６，４０７，２１３号明細書により提供される。これらの方法は、重鎖又は軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全て又は一部分をコードする核酸配列の単離、操作、及び発現を含む。そのような核酸を、上記のとおりの所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマ、及び他の供給源から得てもよい。次に、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡを、適切な発現ベクターにクローニングし得る。
ヒト化抗体はまた、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内在性のマウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現し得ないマウス等のトランスジェニック動物を用いて作製してもよい。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書で説明されているヒト化抗体の調製に使用され得る例示的なＣＤＲ移植法を説明している（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全てが、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部に置き換えられてもよいし、ＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲに置き換えられてもよい。所定の抗原へのヒト化抗体の結合に必要とされる数のＣＤＲを置き換えることのみが必要である。
ヒト化抗体を、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系列置換、及び／又は復帰変異の導入によって最適化し得る。そのような改変された免疫グロブリン分子を、当技術分野で既知のいくつかの技術のいずれかによって作製し得る（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８－７３１２，１９８３；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３；Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３－１６，１９８２、及び欧州特許第２３９４００号明細書）。
用語「ヒト抗体」、「ヒト抗原結合分子」、及び「ヒト結合ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（前掲）で説明されたものを含む、当技術分野で既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変及び定常領域又はドメイン等の抗体領域を有する抗体、抗体結合分子、及び結合ドメインを含む。本発明のヒト抗体、抗原結合分子、又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発若しくは部位特異的変異誘発によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含み得る。ヒト抗体、抗原結合分子、又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基に置き換えられた、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の位置を有し得る。ヒト抗体、抗原結合分子、及び結合ドメインの定義はまた、本明細書で使用される場合、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ等の技術又はシステムを使用することによって得ることができる、非人為的且つ／又は遺伝的に改変された抗体のヒト配列のみを含む完全ヒト抗体も意図している。好ましくは、「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合分子は、「単離された」又は「実質的に純粋な」抗原結合分子である。「単離された」又は「実質的に純粋な」は、本明細書で開示されている抗原結合分子の説明に使用される場合に、その産生環境の成分から同定されており、分離されており、及び／又は回収されている抗原結合分子を意味する。好ましくは、抗原結合分子は、その産生環境由来の他の全ての成分との会合を有しないか、又は実質的に有しない。組換えトランスフェクト細胞から生じる成分等の、その産生環境の混入成分は、通常はポリペプチドについての診断又は治療用途を妨げる材料であり、これは、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含み得る。抗原結合分子は、例えば、所与の試料中の全タンパク質の少なくとも約５重量％、又は少なくとも約５０重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、状況に応じて、総タンパク質含量の５重量％～９９．９重量％を構成し得ることが理解される。ポリペプチドは、誘導性プロモーター又は高発現プロモーターを使用することによって著しく高い濃度で作製される場合があり、その結果、増大した濃度レベルで作製される。この定義には、当技術分野で知られる多種多様な生物体及び／又は宿主細胞での抗原結合分子の生成が含まれる。好ましい実施形態では、抗原結合分子は、（１）スピニングカップシークエネーターを用いることによりＮ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、又は（２）クマシーブルー若しくは好ましくは銀染色法を用いた非還元若しくは還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一になるまで精製されることになる。ただし、通常、単離された抗原結合分子は、少なくとも１つの精製工程によって調製されることになる。
用語「結合ドメイン」は、本発明との関係では、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープ又は所与の標的部位、例えばそれぞれＣＤ２０及びＣＤ２２並びにＣＤ３と（特異的に）結合する／それらと相互作用する／それらを認識するドメインを特徴とする。第１及び／又は第２の結合ドメイン（ＣＤ２０及びＣＤ２２を認識する）の構造及び機能、並びに好ましくはエフェクター結合ドメイン（典型的には、ＣＤ３を認識する第３の結合ドメイン）の構造及び／又は機能も、抗体（例えば、完全長又は完全免疫グロブリン分子）の構造及び／又は機能に基づいており、且つ／又は抗体若しくはその断片の可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから導き出される。好ましくは、標的細胞表面抗原結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（即ち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（即ち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）の存在を特徴とする。エフェクター（典型的にはＣＤ３）結合ドメインはまた、好ましくは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（即ち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（即ち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。第１の結合ドメイン及び／又は第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のＣＤＲ配列を足場に移植する以外のファージディスプレイ又はライブラリスクリーニング法によって作製されるか又は得られることが想定される。
本発明によれば、結合ドメインは、１つ又は複数のポリペプチドの形態である。そのようなポリペプチドは、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、化学的リンカー又はグルタルアルデヒド等の化学的架橋剤）を含み得る。タンパク質（その断片、好ましくは生物学的に活性な断片、及び通常３０個未満のアミノ酸を有するペプチドが挙げられる）は、（アミノ酸の鎖をもたらす）共有ペプチド結合を介して互いに共役した２つ以上のアミノ酸を含む。
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、通常３０個を超えるアミノ酸からなる分子群を表す。ポリペプチドはさらに、二量体、三量体、及びより高次のオリゴマー等の多量体を形成する場合があり、即ち、複数のポリペプチド分子からなる場合もある。そのような二量体、三量体等を形成するポリペプチド分子は、同一であっても、同一でなくてもよい。そのような多量体の対応する高次構造は、したがってホモ又はヘテロ二量体、ホモ又はヘテロ三量体等と称される。ヘテロ多量体の例は、その天然形態において、２つの同一のポリペプチド軽鎖及び２つの同一のポリペプチド重鎖からなる抗体分子である。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」はまた、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等のような翻訳後改変によって改変がなされた天然の改変ペプチド／ポリペプチド／タンパク質も指す。「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」はまた、本明細書で言及される場合、ペグ化等の化学改変されたものでもあり得る。そのような改変は、当技術分野で公知であり、本明細書では下記で説明される。
好ましくは、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦＬＴ３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ１、ＣＤＨ３、ＭＳＬＮ、及びＥｐＣＡＭのいずれかに結合する結合ドメイン、並びに／又はＣＤ３εに結合する結合ドメインは、ヒト結合ドメインである。少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体及び抗原結合分子は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はウサギ）等の非ヒト可変及び／又は定常領域を有する抗体又は抗原結合分子に伴う問題の一部を回避する。そのような齧歯類由来タンパク質が存在すると、抗体又は抗原結合分子の迅速なクリアランスをもたらす可能性があるか、又は患者による抗体又は抗原結合分子に対する免疫反応を発生させる可能性がある。齧歯類由来の抗体又は抗原結合分子の使用を避けるために、齧歯類が完全ヒト抗体を産生するようにヒト抗体機能を齧歯類に導入することにより、ヒト又は完全ヒト抗体／抗原結合分子を生成し得る。
酵母人工染色体ＹＡＣにおいてメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローニングし、且つ再構築する能力、及びそれらをマウス生殖細胞系列に導入する能力は、非常に大きいか又は粗くマッピングされた遺伝子座の機能的要素の解明並びにヒト疾患の有用なモデルの生成にとって強力な手法を提供する。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト均等物で置換するそのような技術を使用すれば、発生期のヒト遺伝子産物の発現及び調節、それらと他の系との伝達、並びに疾患の誘発及び進行へのそれらの関与について独特の見解を得ることができるであろう。
そのような戦略の重要な実用化が、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内在性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子が不活性化されたマウスへのヒトＩｇ遺伝子座の導入により、抗体のプログラムされた発現及び構築並びにＢ細胞の発生におけるそれらの役割の基礎となる機構を研究する機会が得られる。さらに、そのような戦略であれば、ヒト疾患における抗体療法の可能性を実現する上で重要なマイルストーンとなる完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製にとって理想的な供給源を得ることができるであろう。完全ヒト抗体又は抗原結合分子は、マウスｍＡｂ又はマウス由来ｍＡｂに固有の免疫原性及びアレルギー反応を最小化し、それによって投与される抗体／抗原結合分子の有効性及び安全性を増大させることが期待される。完全ヒト抗体又は抗原結合分子の使用により、化合物の反復投与を必要とする慢性及び再発性のヒト疾患、例えば炎症、自己免疫、及び癌の処置で大幅な利点が得られるものと期待され得る。
この目標に向けた手法の１つが、マウス抗体の産生に欠損があるマウス系統をヒトＩｇ遺伝子座の大きい断片を用いて操作することであり、これは、そのようなマウスが、マウス抗体を生じずに広範なレパートリーのヒト抗体を産生するであろうとの予測に立つものであった。大きいヒトＩｇ断片は、可変遺伝子の広範な多様性、並びに抗体の産生及び発現の適切な調節を保持すると考えられる。抗体の多様化及び選択、並びにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如のためにマウス機構を利用することによって、これらのマウス系統において再現されるヒト抗体レパートリーが、ヒト抗原を含む目的の任意の抗原に対して高親和性の抗体を産生するはずである。ハイブリドーマ技術を使用すれば、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを容易に作製して選択することができるであろう。この一般的な戦略は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス株の生成と関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１（１９９４）参照）。このＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統は、可変領域及び定常領域のコア配列を含有したヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれ２４５ｋｂ及び１９０ｋｂサイズの生殖細胞系列配置断片を含有するＹＡＣを用いて操作された。このヒトＩｇを含有するＹＡＣは、抗体の再編成及び発現の両方に関してマウス系への適合性があることが証明されており、不活性化されたマウスＩｇ遺伝子を置換することが可能であった。このことは、それらがＢ細胞の発生を誘導して、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトｍＡｂを産生する能力によって実証された。これらの結果はまた、多数のＶ遺伝子、追加の調節エレメント、及びヒトＩｇ定常領域を含有するヒトＩｇ遺伝子座の大部分の導入が、感染及び免疫化に対するヒト液性応答を特徴とする実質的に完全なレパートリーを再現し得ることも示唆した。最近、Ｇｒｅｅｎらの研究を発展させ、ヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれのメガベースサイズの生殖細胞系列配置ＹＡＣ断片の導入により、ヒト抗体レパートリーのおよそ８０％超が導入された。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（１９９７）及び米国特許出願第０８／７５９，６２０号明細書を参照されたい。
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物の作製は、米国特許出願第０７／４６６，００８号明細書、同第０７／６１０，５１５号明細書、同第０７／９１９，２９７号明細書、同第０７／９２２，６４９号明細書、同第０８／０３１，８０１号明細書、同第０８／１１２，８４８号明細書、同第０８／２３４，１４５号明細書、同第０８／３７６，２７９号明細書、同第０８／４３０，９３８号明細書、同第０８／４６４，５８４号明細書、同第０８／４６４，５８２号明細書、同第０８／４６３，１９１号明細書、同第０８／４６２，８３７号明細書、同第０８／４８６，８５３号明細書、同第０８／４８６，８５７号明細書、同第０８／４８６，８５９号明細書、同第０８／４６２，５１３号明細書、同第０８／７２４，７５２号明細書、及び同第０８／７５９，６２０号明細書；並びに米国特許第６，１６２，９６３号明細書；同第６，１５０，５８４号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書、及び同第５，９３９，５９８号明細書；並びに日本特許第３０６８１８０Ｂ２号公報、同第３０６８５０６Ｂ２号公報、及び同第３０６８５０７Ｂ２号公報でさらに議論され詳述されている。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（１９９７）及びＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３－４９５（１９９８）、欧州特許第０４６３１５１Ｂ１号明細書、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、同第９６／３４０９６号パンフレット、同第９８／２４８９３号パンフレット、同第００／７６３１０号パンフレット、及び同第０３／４７３３６号パンフレットも参照されたい。
別のアプローチでは、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む他社が「小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチを利用している。小遺伝子座法では、外来性Ｉｇ遺伝子座は、Ｉｇ遺伝子座からの小片（個々の遺伝子）を含めることを通して模倣される。そのため、１つ又は複数のＶＨ遺伝子、１つ又は複数のＤＨ遺伝子、１つ又は複数のＪＨ遺伝子、μ定常領域、及び第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）が、動物への挿入用コンストラクトとして形成される。この手法は、Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号明細書、並びにそれぞれＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙに対する米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，６２５，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、同第５，７７０，４２９号明細書、同第５，７８９，６５０号明細書、同第５，８１４，３１８号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，８７４，２９９号明細書、及び同第６，２５５，４５８号明細書、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号明細書及び同第６，０２３．０１０号明細書、Ｂｅｒｎｓらに対する米国特許第５，６１２，２０５号明細書、同第５，７２１，３６７号明細書、及び同第５，７８９，２１５号明細書、並びにＣｈｏｉ及びＤｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号明細書、並びにＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願第０７／５７４，７４８号明細書、同第０７／５７５，９６２号明細書、同第０７／８１０，２７９号明細書、同第０７／８５３，４０８号明細書、同第０７／９０４，０６８号明細書、同第０７／９９０，８６０号明細書、同第０８／０５３，１３１号明細書、同第０８／０９６，７６２号明細書、同第０８／１５５，３０１号明細書、同第０８／１６１，７３９号明細書、同第０８／１６５，６９９号明細書、同第０８／２０９，７４１号明細書で説明されている。欧州特許第０５４６０７３Ｂ１号明細書、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、同第９２／２２６４５号パンフレット、同第９２／２２６４７号パンフレット、同第９２／２２６７０号パンフレット、同第９３／１２２２７号パンフレット、同第９４／００５６９号パンフレット、同第９４／２５５８５号パンフレット、同第９６／１４４３６号パンフレット、同第９７／１３８５２号パンフレット、及び同第９８／２４８８４号パンフレット、並びに米国特許第５，９８１，１７５号明細書も参照されたい。さらに、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、及びＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照されたい。
Ｋｉｒｉｎも、マイクロセル融合によって大きい染色体片又は染色体全体が導入された、マウスからのヒト抗体の産生を実証した。欧州特許出願公開第７７３２８８号明細書及び同第８４３９６１号明細書を参照されたい。Ｘｅｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、有望なヒト抗体産生技術を開発している。この技術では、ＳＣＩＤマウスを、ヒトリンパ細胞、例えばＢ細胞及び／又はＴ細胞で再構成する。次いで、マウスを抗原で免疫化し、抗原に対する免疫応答を生じさせ得る。米国特許第５，４７６，９９６号明細書、同第５，６９８，７６７号明細書、及び同第５，９５８，７６５号明細書を参照されたい。
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応は、産業界がキメラ抗体又は別の方法でヒト化された抗体を作製する要因となった。しかしながら、ある種のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応が、特に慢性又は複数回用量での当該抗体の利用において観察されることになると予想される。そのため、ＨＡＭＡ若しくはＨＡＣＡ反応の懸念及び／又は影響をなくすために、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦＬＴ３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ１、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ３、又はＥｐＣＡＭに対するヒト結合ドメインと、ＣＤ３εに対するヒト結合ドメインとを含む抗原結合分子を提供することが望ましいであろう。
用語「（特異的に）又は（免疫特異的に）結合する」、「（特異的に）認識する」、「（特異的に）誘導される」、及び「（特異的に）反応する」は、本発明によれば、結合ドメインが、好ましくはそのパラトープにより、標的分子（抗原、本明細書では、好ましくは、それぞれＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦＬＴ３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ１、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ３、又はＥｐＣＡＭ、及びＣＤ３ε）上の所与のエピトープ又は所与の標的部位と相互作用するか又は特異的に相互作用することを意味する。
本発明との関連において、パラトープは、本明細書で説明されているポリペプチドの一部であり且つ抗原を認識して結合する抗原結合部位と理解される。パラトープは、典型的は、少なくとも約５つのアミノ酸の小さい領域である。本明細書で理解されるパラトープは、典型的には、抗体由来の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の配列の一部を含む。本発明に係るポリペプチドの各結合ドメインは、それぞれ３つが抗体由来のＶＨ配列及びＶＬ配列内に含まれる６つの相補性決定領域（ＣＤＲループ）のセットを含むパラトープを備えている。
本発明に関連して、本発明の抗原結合分子（即ち、好ましくはポリペプチド）は、特定の方法で、それぞれの標的構造に結合する。好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、それぞれの標的構造に「特異的に若しくは免疫特異的に結合する」か、それを「（特異的に若しくは免疫特異的に）認識する」か又はそれと「（特異的に若しくは免疫特異的に）反応する」１つの結合ドメイン当たり１つのパラトープを含む。このことは、本発明に従って、ポリペプチド又はその結合ドメインが、標的分子（抗原）及びＣＤ３上の所与のエピトープとそれぞれ相互作用するか又は（免疫）特異的に相互作用することを意味する。この相互作用又は会合は、代替物質（非標的分子）と比べて、特定の標的上のエピトープに対してより頻繁に、より迅速に、より持続的に、より親和的に、又はこれらのパラメーターのいくつかの組み合わせで起こる。しかしながら、様々な種における相同タンパク質間の配列類似性のために、標的（例えばヒト標的）に免疫特異的に結合する抗体コンストラクト又は結合ドメインは、異なる種（例えば非ヒト霊長類）由来の相同標的分子と交差反応する場合がある。したがって、用語「特異的な／免疫特異的な結合」は、複数の種中のエピトープ及び／又は構造的に関連するエピトープに対する抗体コンストラクト又は結合ドメインの結合を含み得る。用語「（免疫）選択的に結合する」は、構造的に関連するエピトープへの結合を除外する。
用語「エピトープ」は、抗体若しくは免疫グロブリン、又は抗体若しくは免疫グロブリンの誘導体、断片、若しくはバリアント等の結合ドメインが特異的に結合する抗原上の部位を指す。「エピトープ」は抗原性であり、そのためエピトープという用語は、本明細書において「抗原性構造」又は「抗原決定基」と称される場合もある。そのため、結合ドメインは「抗原相互作用部位」である。前記結合／相互作用はまた、「特異的認識」を定義すると理解される。
「エピトープ」は、連続したアミノ酸又はタンパク質の三次元フォールディングによって並列される非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸一次配列が認識されるエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは、典型的には、特有の配列内に、少なくとも３個又は少なくとも４個、及びより一般的に少なくとも５個、又は少なくとも６個、又は少なくとも７個（例えば約８個～約１０個）のアミノ酸を含む。
「立体構造エピトープ」は、線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを定義する唯一の要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ）である。典型的には、立体構造エピトープは、線状エピトープと比較して多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原（好ましくは、ペプチド若しくはタンパク質又はそれらの断片）の三次元構造を認識する（本発明の文脈では、結合ドメインのうちの１つに対する抗原性構造が、標的細胞の表面抗原タンパク質内に含まれる）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造が形成される場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸及び／又はポリペプチド骨格が並列した状態になり、それによって抗体がそのエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法として、ｘ線結晶構造解析、二次元核磁気共鳴（２Ｄ－ＮＭＲ）分光分析、及び部位特異的スピンラベル法、及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法が挙げられるが、これらに限定されない。
エピトープマッピングのための方法を、下記で説明する：ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２タンパク質のある領域（隣接するひと続きのアミノ酸）が、非ヒト及び非霊長類のＣＤ２０及びＣＤ２２（例えば、マウスＣＤ２０及びＣＤ２２であるが、他にニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギ等のものも考えられ得る）の対応する領域で交換されるか又は置き換えられる場合、使用されている非ヒト、非霊長類のＣＤ２０及びＣＤ２２に対して結合ドメインが交差反応性でない限り、結合ドメインの結合性の低減が起こると予想される。前述の低減は、ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２タンパク質の対応する領域への結合を１００％とした場合、ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２ＣＤ２０及びＣＤ２２タンパク質内のそれぞれへの領域への結合と比較して、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％；より好ましくは少なくとも６０％、７０％、又は８０％、及び最も好ましくは９０％、９５％、又はさらに１００％である。上記のヒトＣＤ２０及びＣＤ２２／非ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２のキメラは、ＣＨＯ細胞において発現されることが想定される。また、ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２／非ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２のキメラは、ＥｐＣＡＭ等の異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインと融合していることも想定される。
エピトープマッピングの代替的又は追加の方法では、結合ドメインによって認識される特定の領域を決定するために、ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２細胞外ドメインのいくつかの短縮型が作製され得る。これらの短縮型では、細胞外の異なるＣＤ２０及びＣＤ２２ドメイン／サブドメイン又は領域は、Ｎ末端から開始して段階的に欠失される。短縮型のＣＤ２０及びＣＤ２２は、ＣＨＯ細胞で発現され得ることが想定される。また、短縮型のＣＤ２０及びＣＤ２２は、ＥｐＣＡＭ等の異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインと融合する場合があることも想定される。また、短縮型のＣＤ２０及びＣＤ２２は、それらのＮ末端にシグナルペプチドドメイン（例えば、マウスＩｇＧ重鎖シグナルペプチドに由来するシグナルペプチド）を包含する場合があることも想定される。さらに、短縮型のＣＤ２０及びＣＤ２２は、細胞表面上でのそれらの正確な発現を確認できる（シグナルペプチドに続く）Ｎ末端におけるｖ５ドメインを包含する場合があることも想定される。結合ドメインによって認識されるＣＤ２０及びＣＤ２２領域をもはや包含しない短縮型のＣＤ２０及びＣＤ２２では、結合の低減又は喪失が起こると予想される。結合の低減は、ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２タンパク質全体（又はその細胞外領域若しくはドメイン）への結合を１００％とした場合、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％；より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、及び最も好ましくは９０％、９５％、又はさらに１００％である。
抗体結合分子又は結合ドメインによる認識に対するＣＤ２０及びＣＤ２２の特定の残基の寄与を決定するためのさらなる方法は、分析される各残基を例えば部位特異的変異誘発によってアラニンに置き換えるアラニンスキャニング（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＫＬ＆Ｗｅｉｓｓ ＧＡ．Ｃｕｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｎ；５（３）：３０２－７を参照されたい）である。アラニンが使用される理由は、嵩高くなく、化学的に不活性であり、それでも多くの他のアミノ酸が有している二次構造基準を模倣するメチル官能基を有しているためである。変異される残基のサイズを保存することが望ましい場合には、時としてバリン又はロイシン等の嵩高いアミノ酸を使用し得る。アラニンスキャニングは、長期にわたり使用されてきた成熟した技術である。
結合ドメインと、エピトープ又はエピトープを含む領域との間の相互作用は、結合ドメインが特定のタンパク質又は抗原（本明細書中では、それぞれ、ＣＤ２０及びＣＤ２２、並びにＣＤ３）上のエピトープ／エピトープを含む領域に対して相当の親和性を示し、且つ一般にＣＤ２０及びＣＤ２２又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原との著しい反応性を示さないことを意味する。「測定可能な親和性」は、約１０－６Ｍ（ＫＤ）又はそれより強い親和性を有する結合を含む。好ましくは、結合親和性が約１０－１２～１０－８Ｍ、１０－１２～１０－９Ｍ、１０－１２～１０－１０Ｍ、１０－１１～１０－８Ｍ、好ましくは約１０－１１～１０－９Ｍである場合、結合を特異的と見なす。結合ドメインが標的と特異的に反応するか又は標的に結合するかどうかを、とりわけ、標的タンパク質又は抗原に対する前記結合ドメインの反応を、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対する前記結合ドメインの反応と比較することにより、容易に試験し得る。好ましくは、本発明の結合ドメインは、ＣＤ２０及びＣＤ２２又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に本質的に又は実質的に結合しない（即ち、第１の結合ドメインは、ＣＤ２０以外のタンパク質に結合し得ず、第２の結合ドメインは、ＣＤ２２以外のタンパク質に結合し得ない）。他のＨＬＥ形式と比較して優れた親和性特性を有することは、本発明に係る抗原結合分子の想定される特徴である。そのような優れた親和性は、結果として、インビボでの半減期の延長を示唆する。本発明に係る抗原結合分子のより長い半減期は、投与期間及び投与頻度を減少させる場合があり、このことは、典型的には、患者のコンプライアンスの改善に寄与する。これは、特に重要なことであり、なぜなら、本発明の抗原結合分子は、非常に衰弱した又はさらに多疾患である癌患者に特に有益であるためである。
用語「本質的／実質的に結合しない」又は「結合し得ない」は、本発明の結合ドメインがＣＤ２０及びＣＤ２２又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に結合せず、即ち、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＣＤ３のそれぞれに対する結合を１００％とした場合、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対して３０％超、好ましくは２０％超、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％、又は５％超の反応性を示さないことを意味する。
特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列内の特異的モチーフによってもたらされると考えられる。そのため、結合は、それらの一次、二次、及び／又は三次構造の結果として、並びに前記構造の二次的改変の結果として生じる。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用により、抗原に対する関部位の単純な結合が生じ得る。さらに、抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用により、例えば抗原の立体構造変化の誘導、抗原のオリゴマー化等によって、代替的に又は追加的に、シグナルの開始がもたらされ得る。
用語「可変」は、配列内で可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体又は免疫グロブリンドメインの一部（即ち、「可変ドメイン」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）との対が、共に単一の抗原結合部位を形成する。
可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく、重鎖及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存的な（即ち、非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭ又はＦＲ）と呼ばれ、抗原結合表面を形成する三次元空間内における６つのＣＤＲのための足場を提供する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がβシート配置をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含み、これらが、ループ接続を形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって接続されている。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭによって近接して共同で保持されており、他の鎖の超可変領域と共に、抗原結合部位の形成に寄与する（前掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。
用語「ＣＤＲ」、及びその複数形である「ＣＤＲｓ」は、相補性決定領域を指し、そのうちの３つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）、３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与しており：ＣＤＲは、抗原特異性の主要な決定基である。
ＣＤＲの境界及び長さの厳密な定義は、各種の分類及び付番方式に従う。したがって、ＣＤＲは、本明細書で説明されている付番方式を含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ｃｏｎｔａｃｔ、又は任意の他の境界定義によって表わされ得る。境界が異なっていても、これらの方式の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分において、ある程度の重複を有する。したがって、これらの方式によるＣＤＲの定義は、長さ、及び隣接するフレームワーク領域に関する境界領域が相違する場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間の配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）、及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前掲；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１－９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）を参照されたい。抗原結合部位を特徴付けるさらに別の標準は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。２つの残基同定技術が、重複するが同一領域ではない領域を定義する限り、それらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義し得る。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔシステムに従う付番が好ましい。
典型的には、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類され得るループ構造を形成する。用語「カノニカル構造」は、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主鎖の立体構造を指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループの内の５つは、利用可能な立体構造の内の限られたレパートリーしか有さないことが見出された。各カノニカル構造を、ポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴付け得る。したがって、抗体間の対応するループは、ループの大部分に、高いアミノ酸配列可変性が見られるにもかかわらず、非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、採用されたループ構造とそれを取り囲むアミノ酸配列との間には関係がある。特定のカノニカルクラスの立体配座は、ループの長さ及びループ内、並びに保存されたフレームワーク内の重要な位置に存在するアミノ酸残基によって決定される（即ち、ループの外側）。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当てを、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行い得る。
「カノニカル構造」という用語はまた、例えばＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲）によってカタログ化されているように、抗体の線状配列に関する考慮事項も含み得る。Ｋａｂａｔの付番スキーム（方式）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した様式で付番するために広く採用されている基準であり、本明細書の他の箇所でも言及されるように本発明で適用される好ましいスキームである。さらなる構造的な考慮も、抗体のカノニカル構造を決定するために使用され得る。例えば、Ｋａｂａｔの付番法では十分に反映されない相違を、Ｃｈｏｔｈｉａらの付番方式によって説明し得、且つ／又は他の技術（例えば、結晶学及び二次元若しくは三次元コンピューターモデリング）によって明らかにし得る。したがって、所与の抗体配列を、とりわけ、（例えば、種々のカノニカル構造をライブラリに含めるという要求に基づいて）適切なシャーシ配列の同定が可能であるカノニカルクラスに分類し得る。抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔ付番法、及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（前掲）で説明されている構造的な考慮、並びに抗体構造のカノニカルな側面の解釈に対するそれらの意義については、文献で説明されている。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は、当技術分野で公知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照されたい。
軽鎖のＣＤＲ３、及び特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖の可変領域内での抗原結合において最も重要な決定因子を構成する場合がある。いくつかの抗原結合分子では、重鎖ＣＤＲ３は、抗原と抗体の間の主要な接触領域を構成すると思われる。ＣＤＲ３のみを変化させるインビトロ選択スキームを使用して、抗体の結合特性を変化させ得るか、又はどの残基が抗原の結合に寄与するかを決定し得る。したがって、ＣＤＲ３は通常、抗体結合部位内での分子的多様性の最大の源である。例えば、Ｈ３は、２個のアミノ酸残基程度の短いもの、又は２６個超のアミノ酸であり得る。
古典的な完全長抗体又は免疫グロブリンでは、各軽（Ｌ）鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重（Ｈ）鎖に連結される一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ又は複数のジスルフィド結合によって互いに連結される。ＶＨに最も近接するＣＨドメインは通常、ＣＨ１と称される。定常（「Ｃ」）ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、抗体依存性、細胞介在性の細胞傷害性、及び補体活性化等の種々のエフェクター機能を示す。抗体のＦｃ領域は、重鎖定常ドメイン内に含まれ、例えば細胞表面に位置するＦｃ受容体と相互作用可能である。
構築及び体細胞変異後の抗体遺伝子の配列は、極めて多様であり、これらの多様化した遺伝子は、１０１０種の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。したがって、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。「レパートリー」という用語は、少なくとも１種の免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列から全体的又は部分的に誘導される少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。配列は、重鎖のＶ、Ｄ、及びＪセグメント、並びに軽鎖のＶ及びＪセグメントのインビボでの再配列によって生成され得る。これ以外にも、この配列は、再配置を生じさせる、例えばインビトロ刺激に応答して細胞から生成され得る。或いは、この配列の一部又は全ては、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発、及び他の方法によって得られる場合がある（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい）。レパートリーは、１つの配列のみを含んでもよいし、遺伝的に多様なコレクション内のものを含む、複数の配列を含んでもよい。
用語「Ｆｃ部分」又は「Ｆｃ単量体」は、本発明との関係では、免疫グロブリン分子のＣＨ２ドメインの機能を有する少なくとも１つのドメインと、ＣＨ３ドメインの機能を有する少なくとも１つのドメインとを含むポリペプチドを意味する。「Ｆｃ単量体」という用語から明らかなとおり、それらのＣＨドメインを含むポリペプチドは、「ポリペプチド単量体」である。Ｆｃ単量体は、少なくとも重鎖の第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１）を除く免疫グロブリンの定常領域の断片を含むが、少なくとも１つのＣＨ２ドメインの機能的部分及び１つのＣＨ３ドメインの機能的部分を維持しており、ＣＨ２ドメインがＣＨ３ドメインのアミノ末端側にあるポリペプチドであり得る。本定義の好ましい態様において、Ｆｃ単量体は、Ｉｇ－Ｆｃヒンジ領域の一部、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域を含み、ヒンジ領域がＣＨ２ドメインのアミノ末端側にあるポリペプチド定常領域であり得る。本発明のヒンジ領域は二量体化を促進することが想定される。そのようなＦｃポリペプチド分子は、例えば、免疫グロブリン領域のパパイン消化（当然、２つのＦｃポリペプチドの二量体を生じる）によって入手され得るが、これに限定されない。本定義の別の態様において、Ｆｃ単量体は、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の一部を含むポリペプチド領域であり得る。そのようなＦｃポリペプチド分子は、例えば、免疫グロブリン分子のペプシン消化によって入手され得るが、これに限定されない。一実施形態では、Ｆｃ単量体のポリペプチド配列は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ＩｇＧ３ Ｆｃ領域、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ＩｇＭ Ｆｃ領域、ＩｇＡ Ｆｃ領域、ＩｇＤ Ｆｃ領域、及びＩｇＥ Ｆｃ領域のＦｃポリペプチド配列と実質的に同様である。（例えば、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３１（３），１６９－２１７（１９９３）を参照されたい）。免疫グロブリン間には一定の変種が存在するため、及び単に明確性のために、Ｆｃ単量体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの末尾の２つの重鎖定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの末尾の３つの重鎖定常領域免疫グロブリンドメインを指す。言及されるとおり、Ｆｃ単量体はまた、これらのドメインのＮ末端側に可動性のヒンジも含み得る。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、Ｆｃ単量体は、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃ部分は、免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３並びに最初の２つのドメインとＣＨ２の間のヒンジを含む。Ｆｃ部分の境界は、異なる場合があるが、機能的ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分の例は、例えば、Ｋａｂａｔに従う付番でＣＨ３ドメインのカルボキシル末端の残基Ｄ２３１（ヒンジドメインの－下記の表１のＤ２３４に相当する）～Ｐ４７６、Ｌ４７６（ＩｇＧ４の場合）をそれぞれ含むように定義され得る。ペプチドリンカーを介して互いに融合している２つのＦｃ部分又はＦｃ単量体は、本発明の抗原結合分子の第３のドメインを定義し、これはまた、ｓｃＦｃドメインとしても定義され得る。
本発明の一実施形態では、本明細書で開示されているｓｃＦｃドメイン（それぞれ、互いに融合したＦｃ単量体）は、抗原結合ポリペプチドの第３のドメインにのみ含まれることが想定される。
本発明に一致して、ＩｇＧヒンジ領域は、表１に記述されるＫａｂａｔ付番を用いた類似性によって同定され得る。上記に一致して、本発明のヒンジドメイン／領域に関して、最小要件は、Ｋａｂａｔ付番によるＤ２３１ Ｄ２３４～Ｐ２４３の一続きのＩｇＧ１配列に対応するアミノ酸残基を含むことが想定される。同様に、本発明のヒンジドメイン／領域は、ＩｇＧ１ヒンジ配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号）（下記の表１に示されるとおりのＤ２３４～Ｐ２４３区間に対応する－前記配列の変種もまた、ヒンジ領域が依然として二量体化を促進するという条件で想定される）を含むか又はからなることが想定される。本発明の好ましい実施形態では、抗原結合分子の第３のドメイン内のＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位は、Ｎ３１４Ｘ置換によって除去される（ここで、Ｘは、Ｑ以外の任意のアミノ酸である）。前記置換は、好ましくは、Ｎ３１４Ｇ置換である。より好ましい実施形態では、前記ＣＨ２ドメインは、下記の置換をさらに含む（位置は、Ｋａｂａｔに従う）：Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃ（これらの置換は、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１でドメイン内システインジスルフィド架橋を導入する）。
本発明の抗原結合分子の第３のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号）（即ち、ヒンジ）－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号）（即ち、ヒンジ）－ＣＨ２－ＣＨ３を含むか又はからなることも想定される。前述の抗原結合分子のペプチドリンカーは、好ましい実施形態では、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（即ち、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１））、又はそのポリマー（即ち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘ（式中、ｘは５以上の整数（例えば５、６、７、８等、又はそれを超える）であり、６が好ましい（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６）））によって特徴付けられる。前記コンストラクトは、前述の置換：Ｎ３１４Ｘ、好ましくはＮ３１４Ｇ、並びに／又はさらなる置換Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃをさらに含み得る。本明細書において前で定義される本発明の抗原結合分子の好ましい実施形態では、第２のドメインは、ヒト及び／又はマカク（Ｍａｃａｃａ）ＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合することが想定される。
Figure 2024518369000001
本発明の更なる実施形態では、ヒンジドメイン／領域は、ＩｇＧ２サブタイプヒンジ配列ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号）、ＩｇＧ３サブタイプヒンジ配列ＥＬＫＴＰＬＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号）若しくはＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号）、及び／又はＩｇＧ４サブタイプヒンジ配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号）を含むか又はからなる。ＩｇＧ１サブタイプヒンジ配列は、次の配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（表１及び配列番号で示される）であり得る。そのため、これらのコアヒンジ領域も、本発明に関連して想定される。
ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＤ３ドメインの位置並びに配列は、表２に記載されるＫａｂａｔ付番を用いた類似性によって同定され得る。
Figure 2024518369000002
本発明の一実施形態では、第１のＦｃ単量体又は両方のＦｃ単量体のＣＨ３ドメイン内の太字で強調表示されたアミノ酸残基は、欠失している。
第３のドメインのポリペプチド単量体（「Ｆｃ部分」又は「Ｆｃ単量体」）を互いに融合するペプチドリンカーは、好ましくは、少なくとも２５個のアミノ酸残基（２５、２６、２７、２８、２９、３０個等）を含む。より好ましくは、このペプチドリンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸残基（３０、３１、３２、３３、３４、３５個等）を含む。リンカーが最大４０個のアミノ酸残基を含むことも好ましく、より好ましくは最大３５個のアミノ酸残基、最も好ましくはちょうど３０個のアミノ酸残基である。そのようなペプチドリンカーの好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、即ち、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）又はそのポリマー、即ち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、ここで、ｘは、５以上の整数（例えば、６、７、又は８）である。好ましくは、整数は、６又は７であり、より好ましくは、整数は、６である。
第１のドメインを第２のドメインと融合するために、又は第１のドメイン若しくは第２のドメインを第３のドメインと融合するためにリンカーが使用される場合、このリンカーは、好ましくは、第１のドメイン及び第２のドメインの各々が互いに独立してそれらの異なる結合特異性を確実に保持し得る十分な長さ及び配列のリンカーである。本発明の抗原結合分子内の少なくとも２つの結合ドメイン（又は２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーに関して、それらのペプチドリンカーは、数個のアミノ酸残基のみを含むもの（例えば、１２個のアミノ酸残基以下を含むもの）が好ましい。そのため、１２、１１、１０、９、８、７、６、又は５個のアミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５個未満のアミノ酸を有する想定されるペプチドリンカーは、４、３、２、又は１個のアミノ酸を含み、Ｇｌｙリッチなリンカーが好ましい。第１及び第２のドメインの融合のためのペプチドリンカーの好ましい実施形態は、配列番号１に示される。第２及び第３のドメインを融合するためのペプチドリンカーの好ましいリンカー実施形態は、（Ｇｌｙ）４－リンカーであり、Ｇ４－リンカーとも呼ばれる。
上記の「ペプチドリンカー」の１つに関連して特に好ましい「単一」のアミノ酸は、Ｇｌｙである。したがって、前記ペプチドリンカーは、単一のアミノ酸Ｇｌｙからなり得る。本発明の好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（即ち、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１））、又はそのポリマー（即ち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘ）を特徴とし、ここで、ｘは、１以上の整数（例えば、２又は３）である。好ましいリンカーは、配列番号１～１２に示される。二次構造を促進しないことを含む前記ペプチドリンカーの特徴は、当技術分野で知られており、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６－９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１－３０）、及びＲａａｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３－８０）で説明されている。さらにいかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。前記ドメインの相互の連結を、例えば、実施例に記載されるとおりの遺伝子操作によって提供し得る。融合され作動可能に連結された二重特異性一本鎖コンストラクトを調製し、それらを哺乳動物細胞又は細菌において発現させる方法は、当技術分野で公知である（例えば、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）。
本発明の抗原結合分子の好ましい実施形態では、第１のドメイン及び第２のドメインは、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ、及びこれらの形式のいずれかのオリゴマーからなる群から選択される形式の抗原結合分子を形成する。
特に好ましい実施形態によれば、そして付属の実施例に記述されるとおり、本発明の抗原結合分子の第１のドメイン及び第２のドメインは、「二重特異性一本鎖抗原結合分子」であり、より好ましくは二重特異性「一本鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が一価分子を形成するように対をなす単一のタンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能にする、本明細書の上記のとおりの合成リンカーによって結合することができる；例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来技術を用いて得られ、且つこのフラグメントは、完全抗体又は完全長抗体と同じ様式で機能について評価される。したがって、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質であり、通常、本明細書で説明されている短いリンカーペプチドで連結されている。リンカーは通常、可動性のためにグリシン、及び溶解性のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域を除去し、リンカーを導入したにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
二重特異性一本鎖抗原結合分子は、当技術分野で知られており、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５－３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１－７０２５、Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３－１９７、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８－２１０３、Ｂｒｕｅｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０－２４２６、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１－５６で説明されている。一本鎖抗体の作製に関して記載された技術（とりわけ米国特許第４，９４６，７７８号明細書、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０）、前掲及びＬｉｔｔｌｅ（２００９）、前掲を参照されたい）を、選出された標的を特異的に認識する一本鎖抗原結合分子を生成するために適合させ得る。
二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）又は二重特異性一本鎖可変断片（形式（ｓｃＦｖ）２を有するｂｉ－ｓｃＦｖ又はｄｉ－ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖ分子を（例えば、本明細書で前に記載されるとおりのリンカーを用いて）連結することにより作り出すことができる。これら２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二価と呼ぶことが好ましい（即ち、それは、同じ標的エピトープに対して２の価数を有する）。これら２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二重特異性と呼ぶことが好ましい。連結は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を作製して、タンデムｓｃＦｖを生成することによってなされ得る（例えば、Ｋｕｆｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８－２４４を参照されたい）。別の可能性は、２つの可変領域を一体に折り畳むには短すぎる（例えば、約５アミノ酸の）リンカーペプチドを用いてｓｃＦｖ分子を作製し、ｓｃＦｖを二量体化させることである。この型は、ダイアボディとして知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０（１４）：６４４４－８を参照されたい）。
本発明に一致して、第１のドメイン、第２のドメイン、又は第１のドメイン及び第２のドメインのいずれかは、それぞれ単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体の可変ドメイン又は単一ドメイン抗体の少なくともＣＤＲを含み得る。単一ドメイン抗体は、他のＶ領域又はドメインに非依存的に特異的抗原に選択的に結合し得る１つのみの（単量体の）抗体可変ドメインを含む。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体から作り出され、これらは、ＶＨＨ断片と呼ばれる。軟骨魚類もまた、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有し、そこからＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体が得られ得る。代替的な手法は、例えば、ヒト又は齧歯類由来の一般的な免疫グロブリン由来の二量体可変ドメインを単量体に分割し、それによって単一ドメインＡｂとしてＶＨ又はＶＬを得ることである。単一ドメイン抗体に関する大部分の研究は、現時点で重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディ、又は単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。
したがって、（単一ドメインｍＡｂ）２は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲを含む群から個別に選択される（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体から構成されるモノクローナル抗原結合分子である。リンカーは、好ましくはペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖ－単一ドメインｍＡｂ」は、少なくとも１つの上記のとおりの単一ドメイン抗体及び１つの上記のとおりのｓｃＦｖ分子から構成されるモノクローナル抗原結合分子である。再び、リンカーは、好ましくはペプチドリンカーの形態である。
抗原結合分子が別の所与の抗原結合分子と競合して結合するかどうかを、競合ＥＬＩＳＡ又は細胞に基づく競合アッセイ等の競合アッセイで測定し得る。アビジンが共役したマイクロ粒子（ビーズ）も使用し得る。アビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートと同様に、ビオチン化タンパク質と反応させる際、これらのビーズのそれぞれを基材として使用し得、その上でアッセイを実施し得る。抗原をビーズにコーティングし、次に第１の抗体でプレコーティングする。二次抗体を添加して、任意のさらなる結合を確認する。読み取りのために可能な手段として、フローサイトメトリーが挙げられる。
Ｔ細胞又はＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球（それ自体白血球の一種）の一種である。Ｔ細胞には、それぞれ異なる機能を有するいくつかのサブセットが存在する。Ｔ細胞は、その細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在する点で他のリンパ球、例えばＢ細胞及びＮＫ細胞と区別し得る。ＴＣＲは、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与し、２つの異なるタンパク質鎖から構成される。Ｔ細胞の９５％において、ＴＣＲは、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖からなる。ＴＣＲが抗原ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と結合するとき、Ｔリンパ球が、関連酵素、共受容体、特化したアダプター分子、及び活性化されたか又は放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象を通じて活性化される。
ＣＤ３受容体複合体は、タンパク質複合体であり、４本の鎖から構成される。哺乳動物において、この複合体は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２本のＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び所謂ζ（ゼータ）鎖と会合してＴ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生じさせる。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）、及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する、非常に近縁の免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、ＴＣＲのシグナル伝達能に必須である免疫受容活性化チロシンモチーフ又は略称ＩＴＡＭとして知られる単一の保存的モチーフを含有する。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトにおいて第１１染色体上に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。最も好ましいＣＤ３イプシロンのエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１～２７の範囲に含まれる。本発明に係る抗原結合分子は、典型的且つ有利には、特定の免疫療法において望ましくない非特異的Ｔ細胞活性化をそれほど示さないことが想定される。これは、副作用のリスクが低いことになる。
多重特異性（少なくとも二重特異性）の抗原結合分子によるＴ細胞の動員を介するリダイレクトされた標的細胞の溶解は、細胞溶解性シナプスの形成、並びにパーフォリン及びグランザイムの送達を伴う。結合したＴ細胞は、連続的な標的細胞の溶解が可能であり、ペプチド抗原のプロセシング及び提示又はクローナルなＴ細胞分化を妨げる免疫回避機構による影響を受けない（例えば、国際公開第２００７／０４２２６１号パンフレットを参照されたい）。
本発明の抗原結合分子により媒介される細胞傷害性を、様々な方法で測定し得る。エフェクター細胞は、例えば、刺激された濃縮（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞又は未刺激の（ヒト）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。標的細胞がマカク起源である場合には、又は第１のドメインが結合するマカクＣＤ２０又はＣＤ２２を発現するか若しくはそれでトランスフェクトされる場合には、エフェクター細胞も、マカクＴ細胞株（例えば、４１１９ＬｎＰｘ）等のマカク起源のものであるべきである。標的細胞は、ＣＤ２０又はＣＤ２２（例えば、ヒト又はマカクＣＤ２０又はＣＤ２２）（の少なくとも細胞外ドメイン）を発現するはずである。標的細胞は、ＣＤ２０又はＣＤ２２（例えば、ヒト又はマカクＣＤ２０又はＣＤ２２）で安定して又は一過性にトランスフェクトされている細胞株（例えば、ＣＨＯ）であり得る。通常、ＥＣ５０値は、細胞表面に高レベルのＣＤ２０又はＣＤ２２を発現する標的細胞株で低くなると予想される。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は通常、約１０：１であるが、変動することもある。二重特異性抗原結合分子であるＣＤ２０又はＣＤ２２の細胞傷害活性を５１Ｃｒ放出アッセイ（約１８時間のインキュベーション時間）又はＦＡＣＳを用いた細胞傷害性アッセイ（約４８時間のインキュベーション時間）で測定し得る。アッセイインキュベーション時間（細胞傷害性反応）の変更も可能である。細胞傷害性を測定する他の方法は、当業者に公知であり、ＭＴＴ又はＭＴＳアッセイ、生物発光アッセイを含むＡＴＰ系アッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン原性アッセイ、及びＥＣＩＳ技術を含む。
本発明のＣＤ２０及びＣＤ２２×ＣＤ３二重特異性抗原結合分子によって媒介される細胞傷害活性を、好ましくは、細胞を用いた細胞傷害性アッセイで測定する。これを、５１Ｃｒ放出アッセイでも測定し得る。これは、ＥＣ５０値によって表され、半数効果濃度（ベースラインと最大値との中間の細胞傷害性反応を誘導する抗原結合分子の濃度）に対応する。好ましくは、ＣＤ２０及びＣＤ２２×ＣＤ３二重特異性抗原結合分子のＥＣ５０値は、≦５０００ｐＭ又は≦４０００ｐＭであり、より好ましくは≦３０００ｐＭ又は≦２０００ｐＭであり、さらにより好ましくは≦１０００ｐＭ又は≦５００ｐＭであり、さらにより好ましくは≦４００ｐＭ又は≦３００ｐＭであり、さらにより好ましくは≦２００ｐＭであり、さらにより好ましくは≦１００ｐＭであり、さらにより好ましくは≦５０ｐＭであり、さらにより好ましくは≦２０ｐＭ又は≦１０ｐＭであり、最も好ましくは≦５ｐＭである。
様々なアッセイにおいて、上記の所与のＥＣ５０値を測定し得る。刺激された／濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、エフェクター細胞として使用する場合、未刺激のＰＢＭＣと比較してＥＣ５０値が低くなると予想され得ることを当業者は認識している。さらに、ＥＣ５０値は、標的細胞が多数のＣＤ２０及びＣＤ２２を発現する場合、標的発現の少ないラットと比較して低くなると予想され得る。例えば、刺激された／濃縮されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、エフェクター細胞として使用する場合（及びＣＨＯ細胞等のＣＤ２０及びＣＤ２２でトランスフェクトされた細胞、又はＣＤ２０及びＣＤ２２陽性ヒト細胞株のいずれかを標的細胞として使用する場合）、ＣＤ２０又はＣＤ２２二重特異性抗原結合分子のＥＣ５０値は、好ましくは、≦１０００ｐＭであり、より好ましくは≦５００ｐＭであり、さらにより好ましくは≦２５０ｐＭであり、さらにより好ましくは≦１００ｐＭであり、さらにより好ましくは≦５０ｐＭであり、さらにより好ましくは≦１０ｐＭであり、最も好ましくは≦５ｐＭである。ヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用する場合、ＣＤ２０及びＣＤ２２×ＣＤ３二重特異性抗原結合分子のＥＣ５０値は、好ましくは、≦５０００ｐＭ又は≦４０００ｐＭ（特に、標的細胞がＣＤ２０又はＣＤ２２陽性ヒト細胞株である場合）であり、より好ましくは≦２０００ｐＭであり、より好ましくは≦１０００ｐＭ又は≦５００ｐＭであり、さらにより好ましくは≦２００ｐＭであり、さらにより好ましくは≦１５０ｐＭであり、さらにより好ましくは≦１００ｐＭであり、最も好ましくは≦５０ｐＭである。ＬｎＰｘ４１１９等のマカクＴ細胞株を、エフェクター細胞として使用し、ＣＨＯ細胞等のマカクＣＤ２０又はＣＤ２２でトランスフェクトされた細胞株を、標的細胞株として使用する場合、ＣＤ２０及びＣＤ２２×ＣＤ３二重特異性抗原結合分子のＥＣ５０値は、好ましくは、≦２０００ｐＭ又は≦１５００ｐＭであり、より好ましくは≦１０００ｐＭ又は≦５００ｐＭであり、さらにより好ましくは≦３００ｐＭ又は≦２５０ｐＭであり、さらにより好ましくは≦１００ｐＭであり、最も好ましくは≦５０ｐＭである。
好ましくは、本発明のＣＤ２０及びＣＤ２２×ＣＤ３二重特異性抗原結合分子は、ＣＨＯ細胞等のＣＤ２０及びＣＤ２２陰性細胞の溶解を誘導／媒介しないか、又は本質的に誘導／媒介しない。用語「溶解を誘導しない」、「溶解を本質的に誘導しない」、「溶解を媒介しない」、又は「溶解を本質的に媒介しない」は、ＣＤ０２０又はＣＤ２２陽性ヒト細胞株の溶解を１００％とした場合、本発明の抗原結合分子がＣＤ２０又はＣＤ２２陰性細胞の３０％超、好ましくは２０％超、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％又は５％超の溶解を誘導しないか又は媒介しないことを意味する。これは、通常、最大５００ｎＭの抗原結合分子の濃度に適用される。当業者には、さらなる労力を伴わずに細胞溶解を測定する方法が知られている。さらに、本明細書では、細胞溶解の測定方法の具体的な指示を教示する。
個々のＣＤ２０及びＣＤ２２×ＣＤ３二重特異性抗原結合分子の単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの細胞傷害活性の差は、「効力ギャップ」と称される。この効力ギャップを、例えば、その分子の単量体形態のＥＣ５０値と二量体形態のＥＣ５０値との間の比率として算出し得る。本発明のＣＤ２０及びＣＤ２２×ＣＤ３二重特異性抗原結合分子の効力ギャップは、好ましくは、≦５であり、より好ましくは≦４であり、さらにより好ましくは≦３であり、さらにより好ましくは≦２であり、最も好ましくは≦１である。
本発明の抗原結合分子の第１及び／第２の（又は任意のさらなる）結合ドメインは、好ましくは、霊長類の哺乳動物目のメンバーに異種間特異的である。異種間特異的ＣＤ３結合ドメインは、例えば国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットで説明されている。一実施形態によれば、第１及び／又は第２の結合ドメインは、ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２並びにヒトＣＤ３への結合に加えて、新世界霊長類（例えば、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）、又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ））、旧世界霊長類（例えば、ヒヒ及びマカク）、テナガザル、並びに非ヒトのヒト亜科動物を含む（ただし、これらに限定されない）霊長類のＣＤ２０及びＣＤ２２／ＣＤ３にもそれぞれ結合することになる。
本発明の抗原結合分子の一実施形態では、第１のドメインは、ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２に結合し、且つさらにカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＣＤ２０及びＣＤ２２等のマカクＣＤ２０及びＣＤ２２に結合し、より好ましくは、例えば、ＣＨＯ又は２９３細胞等の細胞の表面上で発現されるマカクＣＤ２０及びＣＤ２２に結合する。ＣＤ２０及びＣＤ２２（好ましくは、ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２）に対する第１のドメインの親和性は、好ましくは、≦１００ｎＭ又は≦５０ｎＭであり、より好ましくは≦２５ｎＭ又は≦２０ｎＭであり、より好ましくは≦１５ｎＭ又は≦１０ｎＭであり、さらにより好ましくは≦５ｎＭであり、さらにより好ましくは≦２．５Ｍ又は≦２Ｍであり、さらにより好ましくは≦１ｎＭであり、さらにより好ましくは≦０．６ｎＭであり、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭであり、最も好ましくは≦０．４ｎＭである。親和性を、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ又はスキャッチャードアッセイで測定し得る。親和性を決定する他の方法も、当業者に公知である。マカクＣＤ２０及びＣＤ２２に対する第１のドメインの親和性は、好ましくは、≦１５ｎＭであり、より好ましくは≦１０ｎＭであり、さらにより好ましくは≦５ｎＭであり、さらにより好ましくは≦１ｎＭであり、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭであり、さらにより好ましくは≦０．１ｎＭであり、最も好ましくは≦０．０５ｎＭ又はさらに≦０．０１ｎＭである。
好ましくは、本発明に係る抗原結合分子の（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ又はスキャッチャード分析により決定される）マカクＣＤ２０及びＣＤ２２対ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２［ｍａ ＣＤ２０及びＣＤ２２：ｈｕ ＣＤ２０及びＣＤ２２］の結合に関する親和性ギャップは、＜１００であり、好ましくは＜２０であり、より好ましくは＜１５であり、さらに好ましくは＜１０であり、さらにより好ましくは＜８であり、より好ましくは＜６であり、最も好ましくは＜２である。本発明に係る抗原結合分子のマカクＣＤ２０及びＣＤ２２対ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２の結合に関する親和性ギャップの好ましい範囲は、０．１～２０であり、より好ましくは０．２～１０であり、さらにより好ましくは０．３～６であり、さらにより好ましくは０．５～３又は０．５～２．５であり、最も好ましくは０．５～２又は０．６～２である。
本発明の抗原結合分子の第３の結合ドメインは、ヒトＣＤ３イプシロン及び／又はマカク（Ｍａｃａｃａ）ＣＤ３イプシロンに結合する。好ましい実施形態では、第２のドメインは、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）、又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ３イプシロンにさらに結合する。マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）及びワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）は、両方ともマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｉｄａｅ）科に属する新世界霊長類であるが、リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）は、オマキザル（Ｃｅｂｉｄａｅ）科に属する新世界霊長類である。前記結合ドメインは、好ましくは、表５中で「Ｉ２Ｃ」又は「Ｉ２Ｃ０」と称され得る。
本発明の抗原結合分子に関して、ヒト及び／又はマカク（Ｍａｃａｃａ）ＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する第３の結合ドメインは、下記から選択されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが好ましい：
（ａ）配列番号３９２～３９４；及び
（ｂ）配列番号３９５～３９７。
本発明の抗原結合分子のさらに好ましい実施形態では、ヒト及び／又はマカク（Ｍａｃａｃａ）ＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する第３のドメインは、下記から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域を含む：
（ａ）配列番号４００～４０２；及び
（ｂ）配列番号４０３～４０５。
本発明の抗原結合分子の好ましい実施形態では、ＶＬ ＣＤＲの上記の３群を、第３の結合ドメイン内の上記のＶＨ ＣＤＲの１０群と組み合わせて、それぞれＣＤＲ－Ｌ１～３及びＣＤＲ－Ｈ１～３を含む群を形成する。
本発明の抗原結合分子では、ＣＤ３に結合する第３のドメインは、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７、２１、３５、３９、５３、５７、７１、７５、８９、９３、１０７、１１１、１２５、１２９、１４３、１４７、１６１、１６５、１７９、若しくは１８３に示されるか又は本発明に係る配列番号１３に示されるものからなる群から選択されるＶＬ領域を含むことが好ましい。
ＣＤ３に結合する第３のドメインは、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７、若しくは１８１に示されるか又は配列番号１４に示されるものからなる群から選択されるＶＨ領域を含む。
より好ましくは、本発明の抗原結合分子は、下記からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含むＣＤ３に結合する第３のドメインを特徴とする：
（ａ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７又は２１に示されるＶＬ領域、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５又は１９に示されるＶＨ領域；
（ｂ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３５又は３９に示されるＶＬ領域、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３３又は３７に示されるＶＨ領域；
（ｃ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号５３又は５７に示されるＶＬ領域、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号５１又は５５に示されるＶＨ領域；
（ｄ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号７１又は７５に示されるＶＬ領域、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６９又は７３に示されるＶＨ領域；
（ｅ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８９又は９３に示されるＶＬ領域、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８７又は９１に示されるＶＨ領域；
（ｆ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０７又は１１１に示されるＶＬ領域、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０５又は１０９に示されるＶＨ領域；
（ｇ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２５又は１２９に示されるＶＬ領域、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２３又は１２７に示されるＶＨ領域；
（ｈ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４３又は１４７に示されるＶＬ領域、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４１又は１４５に示されるＶＨ領域；
（ｉ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１６１又は１６５に示されるＶＬ領域、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５９又は１６３に示されるＶＨ領域；並びに
（ｊ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７９又は１８３に示されるＶＬ領域、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７７又は１８１に示されるＶＨ領域。
配列番号１３に示されるＶＬ領域及び配列番号１４に示されるＶＨ領域を含むＣＤ３に結合する第３のドメインもまた、本発明の抗原結合分子との関係で好ましい。
本発明の抗原結合分子の好ましい実施形態によれば、第１のドメイン及び／又は第３のドメインは、下記の形式を有する：ＶＨ領域とＶＬ領域との対は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形式である。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨの順に配置される。ＶＨ領域がリンカー配列のＮ末端に配置され、且つＶＬ領域がリンカー配列のＣ末端に配置されることが好ましい。
本発明の上述の抗原結合分子の好ましい実施形態は、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５、若しくは１８７からなる群から選択されるか又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ３に結合する第３のドメインを特徴とする。
本発明は、配列番号６７３、６７６、６７９、６８２、６８５、６８８、６９１、６９４、６９７、７００、７０３、７０６、７０９、７１２、７１５、７１８、７２１、７２４、７２７、７３０、７３３、７３６、７３９、７４２、７４５、７４８、７５１、７５４、７５７、７６０、７６３、７６６、７６９、７７２、７７５、７７８、７８１、７８４、７８７、７９０、７９３、７９６、７９９、８０２、８０５、８０８、８１１、８１４、８１７、８２０、８２３、８２６、８２９、８３２、８３５、８３８、８４１、８４４、８４７、８５０、８５３、８５６、８５９、８６２、８６５、８６８、８７１、１４３７、１４４０、１４４３、１４４６、１４４９、１４５２、１４５５、１４５８、１４６１、１４６４、１４６７、１４７０、１４７３、１４７６、１４７９、１４８２、１４８５、１４８８、１４９９、１６６７、１６７０、１６７３、１６７６、１６７９、１６８２、１６８５、１６８８、１６９１、１６９４、１６９７、１７００、１７０３、１７０６、１７０９、１７１２、１７１５、１７１８、１７２１、１７２４、１７２７、１７３０、１７３３、１７３６、１７３９、１７４２、１７４５、１７４８、１７５１、１７５４、１７５７、１７６０、１７６３、１７６６、１７６９、１７７２、１７７５、１７７８、１７８１、１７８４、１７８７、１７９０、１７９３、１７９６、１７９９、１８０２、１８０５、１８０８、１８１１、１８１４、１８１７、１８２０、１８２３、１８２６、１８２９、１８３８、１８５１、１８６４、１８７７、１８９０、１９０３、１９１６、１９３３、１９４６、１９５９、１９７２、１９８５、１９９８、２０１１、２０２４、２０３７、２０５０、２０６３、２０７６、２０８９、２１０２、２１１５、２１２８、２１４１、２１５４、２１６７、２１８０、２１９４、２２０６、２２１９、２２３２、２２４５、２２５８、２２６２、２２７０、２２７１、２２８０、２２８１、２２９０、２２９１、２３００、２３０１、２３１０、２３１１、２３２０、２３２１、２３３０、２３３１、２３４０、２３４１、２３５０、２３５１、２３６０、２３６１、２３７０、２３７１、２３８０、２３８１、２３９０、２３９１、２４００、２４０１、２４１０、２４１１、２４２０、２４２１、２４３０、２４３１、２４４０、２４４１、２４５０、２４５１、２４６０、２４６１、２４７０、２４７１、２４８０、２４８１、２４９０、２４９１、２５００、２５０１、２５１０、２５１１、２５２０、２５２１、２５３０、２５３１、２５４０、２５４１、２５５０、２５５１、２５６０、２５６１、２５７０、２５７１、２５８０、２５８１、２５９０、２５９１、２６００、２６０１、２６１０、２６１１、２６２０、２６２１、２６３０、２６３１、２６４０、２６４１、２６５０、２６５１、２６６０、２６６１、２６７０、２６７１、２６８０、２６８１、２６９０、２６９１、２７００、２７０１、２７１０、２７１１、２７２０、２７２１、２７３０、２７３１、２７４０、２７４１、２７５０、２７５１、２７６０、２７６１、２７７０、２７７１、２７８０、２７８１、２７９０、２７９１、２８００、２８０１、２８１０、２８１１、２８２０、２８２１、２８３０、２８３１、２８４０、２８４１、２８５０、２８５１、２８６０、２８６１、２８７０、２８７１、２８８０、２８８１、２８９０、２８９１、２９００、２９０１、２９１０、２９１１、２９２０、２９２１、２９３０、２９３１、２９４０、２９４１、２９５０、２９５１、２９６０、２９６１、２９７０、２９７１、２９８０、２９８１、２９９０、２９９１、３０００、３００１、３０１０、３０１１、３０２０、３０２１、３０３０、３０３１、３０４０、３０４１、３０５０、３０５１、３０６０、３０６１、３０７０、３０７１、３０８０、３０８１、３０９０、３０９１、３１００、３１０１、３１１０、３１１１、３１２０、３１２１、３１３０、３１３１、３１４０、３１４１、３１５０、３１５１、３１６０、３１６１、３１７０、３１７１、３１８０、３１８１、３１９０、３１９１、３２００、３２０１、３２１０、３２１１、３２２０、３２２１、３２３１、３２４０、３２４１、３２５０、３２５１、３２６０、３２６１、３２７０、３２７１、３２８０、３２８１、３２９０、３２９１、３３００、３３０１、３３１０、３３１１、３３２０、３３２１、３３３０、３３３１、３３４０、３３４１、３３４４、３３４５、３３５６、３３６７、３３７８、３３８９、３４００、３４１１、３４２２、３４３３、３４４４、３４５５、３４６６、３４７７、３４８８、３４９９、３５１０、３５２１、３５３２、３５４３、３５５４、３５６５、３５７６、３５７９、３５８２、３５８５、３５８８、３５９１、３５９４、３５９７、３６００、３６０３、３６０６、３６０９、３６１２、３６１５、３６１８、３６２１、３６２４、３６２７、３６３０、３６３３、３６３６、３６３９、３６４２、３６４５、３６４８、３６５１、３６５４、３６５７、３６６０、３６６３、３６６６、３６６９、３６７２、３６７５、３６７８、３６８９、３７００、３７０４、３７０５、３７０８、３７０９、３７１０、３７１１、３７２２、３７３３、３７３６、３７３９、３７４４、３７４７、３７４８、３７５６、３７５７、３７６１、及び３７６２、好ましくは１４３７のいずれかからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか若しくは有する抗原結合分子（完全二重特異性抗原結合分子）をさらに提供するか、又は前記配列に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗原結合分子をさらに提供する。
抗原結合分子の共有結合性改変も本発明の範囲内に含まれ、これは、必ずしもというわけではないが、概して翻訳後に行われる。例えば、抗原結合分子のいくつかの種類の共有結合性改変は、抗原結合分子の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮ末端若しくはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることによって、分子内に導入される。
システイニル残基は、最も一般的には、α－ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えばクロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α－ブロモ－β－（５－イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ－アルキルマレイミド、３－ニトロ－２－ピリジルジスルフィド、メチル２－ピリジルジスルフィド、ｐ－クロロメルクリ安息香酸、２－クロロメルクリ－４－ニトロフェノール、又はクロロ－７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾールとの反応により誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５～７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化され、なぜなら、この薬剤は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的だからである。パラ－ブロモフェナシルブロミドも有用であり、この反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ－アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬として、ピコリンイミド酸メチル等のイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ－メチルイソ尿素；２，４－ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
アルギニル残基は、１つ又はいくつかの従来型の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３－ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応により改変される。グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルギニン残基の誘導体化は、反応をアルカリ条件下で実施する必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基及びアルギニンイプシロン－アミノ基と反応し得る。
チロシル残基の特異的改変は、特に芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入を目的として行われる場合がある。最も一般的には、Ｎ－アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ－アセチルチロシル種及び３－ニトロ誘導体を形成する。１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化して、ラジオイムノアッセイに使用される標識タンパク質を調製する上記のクロラミンＴ法が好適である。
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－Ｒ’）との反応によって選択的に改変され、ここで、Ｒ及びＲ’は、任意選択的に異なるアルキル基、例えば、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミド又は１－エチル－３－（４－アゾニア－４，４－ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。
二官能性物質による誘導体化は、本発明の抗原結合分子を、様々な方法に使用するための非水溶性の支持マトリックス又は支持表面に架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤として、例えば下記が挙げられる：１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４－アジドサリチル酸とのエステル、ジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、例えば、３，３－ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、及び二官能性マレイミド、例えば、ビス－Ｎ－マレイミド－１，８－オクタン。メチル－３－［（ｐ－アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート等の誘導体化剤により、光の存在下で架橋を形成可能な光活性化され得る中間体が得られる。或いは、臭化シアン活性化炭水化物等の反応性非水溶性マトリックス、並びに米国特許第３，９６９，２８７号明細書；同第３，６９１，０１６号明細書；同第４，１９５，１２８号明細書；同第４，２４７，６４２号明細書；同第４，２２９，５３７号明細書；及び同第４，３３０，４４０号明細書で説明されている反応性基質が、タンパク質固定化に利用される。
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、多くの場合、脱アミド化されて、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基になる。或いは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。
他の改変として、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９－８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
本発明の範囲内に含まれる抗原結合分子の別の種類の共有結合性改変は、タンパク質のグリコシル化パターンを変化させることを含む。当技術分野で知られるとおり、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、下記で論じる特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在若しくは非存在）又はそのタンパク質を産生する宿主細胞若しくは生物体の両方に依存し得る。特定の発現系について、下記で論じる。
ポリペプチドのグリコシル化は通常、Ｎ結合又はＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、糖鎖のアスパラギン残基側鎖への結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生成する。Ｏ結合型グリコシル化は、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの１つの糖のヒドロキシアミノ酸への付加を指し、最も一般的にはセリン又はスレオニンであるが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンが使用される場合もある。
抗原結合分子へのグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列の内の１つ又は複数を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって都合よく達成され得る（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）。改変は、１つ又は複数のセリン若しくはトレオニン残基の開始配列への付加又はそれによる置換によってもなされ得る（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。簡潔には、抗原結合分子のアミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変更、特に所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生じるようにポリペプチドをコードするＤＮＡを、事前に選択した塩基で変異させることによって改変することが好ましい。
抗原結合分子上の糖鎖の数を増加させる別の手段は、そのタンパク質へのグリコシドの化学的又は酵素的結合によるものである。これらの手順は、それらがＮ結合型及びＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖が、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのもの等の遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、若しくはヒドロキシプロリンのもの等の遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、若しくはトリプトファンのもの等の芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。これらの方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレット及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９－３０６で説明されている。
出発抗原結合分子上に存在する糖鎖の除去は、化学的又は酵素的に行われ得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は均等な化合物へのタンパク質の曝露が必要となる。この処理により、ポリペプチドは無傷な状態のままで、結合している糖（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖が切断される。化学的脱グリコシル化については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１で説明されている。ポリペプチド上の糖鎖の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０で説明されているように、種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５で説明されている化合物ツニカマイシンの使用によって妨げられ得る。ツニカマイシンは、タンパク質－Ｎ－グリコシド結合の形成を遮断する。
本明細書では、抗原結合分子の他の改変も企図される。例えば、抗原結合分子の別の種類の共有結合性改変は、様々な非タンパク質性ポリマーへの抗原結合分子の連結を含み、このポリマーとして、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書、又は同第４，１７９，３３７号明細書で説明されている様式の様々なポリオール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、当技術分野で知られるとおり、例えば、ＰＥＧ等のポリマーの付加を容易にするために、抗原結合分子内の様々な位置でアミノ酸置換がなされ得る。
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合分子の共有結合性改変は、１つ又は複数の標識の付加を含む。標識基は、潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合分子に共役され得る。タンパク質を標識するための様々な方法が当技術分野で知られており、本発明を実施する際に使用され得る。用語「標識」又は「標識基」は、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識は、これが検出されることとなるアッセイに応じて種々のクラスに分けられ、下記の例が挙げられるが、これらに限定されない。
ａ）放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）等の放射性又は重同位体であり得る同位体標識
ｂ）磁気標識（例えば、磁性粒子）
ｃ）酸化還元活性部分
ｄ）光学色素（例えば、限定されないが、発色団、蛍光体、及びフルオロフォア）、例えば蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、化学発光基、及び「低分子」蛍光体又はタンパク質性蛍光体のいずれかであり得るフルオロフォア
ｅ）酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチン化基
ｇ）二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）。
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性によって検出され得る任意の分子を意味する。好適な蛍光標識として下記が挙げられるが、これらに限定されない：フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン類、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ ５、Ｃｙ ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ及びＲ－フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）。蛍光体を含む適切な光学染料は、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋで説明されている。
好適なタンパク質性蛍光標識として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ウミシイタケ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）、ヒロバネウミエラ属（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ）、又はオワンクラゲ属（Ａｅｑｕｏｒｅａ）種のＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２－８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）を含む緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１ ｄｅ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ Ｈ３Ｈ １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：４６２－４７１；Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８－１８２）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８－５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３－２６０７）、及びＲｅｎｉｌｌａ（国際公開第９２／１５６７３号パンフレット、同第９５／０７４６３号パンフレット、同第９８／１４６０５号パンフレット、同第９８／２６２７７号パンフレット、同第９９／４９０１９号パンフレット、米国特許第５，２９２，６５８号明細書；同第５，４１８，１５５号明細書；同第５，６８３，８８８号明細書；同第５，７４１，６６８号明細書；同第５，７７７，０７９号明細書；同第５，８０４，３８７号明細書；同第５，８７４，３０４号明細書；同第５，８７６，９９５号明細書；同第５，９２５，５５８号明細書）。
本発明の抗原結合分子はまた、例えば、分子の単離に有用であるか又は分子の適合された薬物動態プロファイルに関する追加のドメインも含み得る。抗原結合分子の単離に有用なドメインは、単離方法（例えば、単離カラム）で捕捉し得るペプチドモチーフ又は二次的に導入される部分から選択され得る。そのような追加ドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、及びその変種（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩタグ）、並びにＨｉｓタグとして知られるペプチドモチーフを含む。本明細書で開示される抗原結合分子は全て、分子のアミノ酸配列中の連続するＨｉｓ残基（好ましくは５つ、より好ましくは６つのＨｉｓ残基（ヘキサヒスチジン））のリピートとして一般に知られるＨｉｓタグドメインを含み得る。Ｈｉｓタグは、例えば、抗原結合分子のＮ末端又はＣ末端に位置してもよく、好ましくはＣ末端に位置する。最も好ましくは、ヘキサ－ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１６）は、ペプチド結合を介して本発明に係る抗原結合分子のＣ末端に連結される。加えて、持続放出用途及び薬物動態プロファイルの向上のために、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡのコンジュゲート系をポリヒスチジンタグと組み合わせてもよい。
本明細書で説明されている抗原結合分子のアミノ酸配列改変も企図される。例えば、抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を向上させることが望ましい場合もある。抗原結合分子のアミノ酸配列バリアントは、抗原結合分子の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成によって作製される。下記で説明されてるアミノ酸配列改変の全ては、未改変の親分子の所望の生物活性（ＣＤ２０及びＣＤ２２並びにＣＤ３への結合）を引き続き保持する抗体結合分子をもたらすはずである。
用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、典型的には、アラニン（Ａｌａ又はＡ）；アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）；アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）；システイン（Ｃｙｓ又はＣ）；グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）；グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）；イソロイシン（Ｈｅ又はＩ）；ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）；リジン（Ｌｙｓ又はＫ）；メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）；プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）；セリン（Ｓｅｒ又はＳ）；スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）；トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）；チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）；及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）からなる群から選択されるアミノ酸等の当技術分野で認められる定義を有するアミノ酸を指すが、改変アミノ酸、合成アミノ酸、又は希少アミノ酸が、必要に応じて使用され得る。一般に、アミノ酸を、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負電荷側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正電荷側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；又は無電荷極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）の存在によって分類し得る。
アミノ酸改変は、例えば、抗原結合分子のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基への挿入、及び／又は残基の置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行って、最終コンストラクトに至るが、ただし、最終コンストラクトは、所望の特性を有するものとする。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等の抗原結合分子の翻訳後プロセスも改変し得る。
例えば、１、２、３、４、５、又は６個のアミノ酸が、ＣＤＲの各々において（当然のことながら、それらの長さに依存する）挿入され得るか、置換され得るか、又は欠失され得る一方、ＦＲの各々において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２５個のアミノ酸が、挿入され得るか、置換され得るか、又は欠失され得る。好ましくは、抗原結合分子へのアミノ酸配列の挿入は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の残基から、１００個の以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。対応する改変をまた、本発明の抗原結合分子の第３のドメイン内でも実施し得る。本発明の抗原結合分子の挿入バリアントは、抗原結合分子のＮ末端若しくはＣ末端への酵素の融合、又はポリペプチドへの融合を含む。
置換変異誘発にとって最も重要な部位として、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域が挙げられるが（これらに限定されるものではない）、重鎖及び／又は軽鎖におけるＦＲの改変も企図される。置換は、本明細書で説明されている保存的置換であることが好ましい。好ましくは、ＣＤＲ又はＦＲの長さに応じて、ＣＤＲでは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸を置換してもよく、一方でフレームワーク領域（ＦＲ）では１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２５個のアミノ酸を置換してもよい。例えば、ＣＤＲ配列が６個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸の１、２、又は３個が置換されることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸の１、２、３、４、５、又は６個が置換されることが想定される。
変異誘発について好ましい位置である抗原結合分子のある特定の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５（１９８９）により説明されている「アラニンスキャニング変異導入法」と呼ばれる。この方法では、抗原結合分子内の残基又は標的残基群を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ等の荷電残基）、アミノ酸とエピトープとの相互作用に影響を与える中性又は負電荷アミノ酸（最も好ましくは、アラニン又はポリアラニン）で置き換える。
次に、さらなるバリアント又は他のバリアントを置換部位に、即ち、置換部位の代わりに導入することにより、置換に対して機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置を厳選する。このように、アミノ酸配列変種を導入する部位又は領域は、予め決定されるが、変異の性質自体を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析するか又は最適化するために、アラニンスキャニング又はランダム変異誘発が標的コドン又は標的領域で実施される場合があり、発現される抗原結合分子バリアントは、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされる。既知の配列を有するＤＮＡ内の所定部位に置換変異を行う技術は、公知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発がある。変異体のスクリーニングは、ＣＤ２０及びＣＤ２２又はＣＤ３結合等の抗原結合活性のアッセイを使用して行われる。
一般に、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲの１つ若しくは複数又は全てにおいてアミノ酸が置換される場合、それによって得られる「置換された」配列は、「当初の」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％又は６５％、より好ましくは７０％又は７５％、さらにより好ましくは８０％又は８５％、特に好ましくは９０％又は９５％同一であることが好ましい。これは、それが「置換された」配列とどの程度同一であるかがＣＤＲの長さに依存することを意味する。例えば、５個のアミノ酸を有するＣＤＲが、少なくとも１個の置換されたアミノ酸を有するには、その置換された配列と８０％同一であることが好ましい。したがって、抗原結合分子のＣＤＲは、それらの置換配列に対して様々な程度の同一性を有する場合があり、例えば、ＣＤＲＬ１が８０％を有する場合がある一方、ＣＤＲＬ３が９０％を有する場合がある。
好ましい置換（又は置き換え）は、保存的置換である。しかしながら、抗原結合分子が、第１の結合ドメインを介してＣＤ２０及びＣＤ２２に結合し、第２の結合ドメインを介してＣＤ３イプシロンに結合する能力を保持する限り、且つ／又はそのＣＤＲが置換後の配列に対して同一性を有している（「当初の」ＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％又は６５％、より好ましくは７０％又は７５％、さらにより好ましくは８０％又は８５％、特に好ましくは９０％又は９５％同一である）限り、（非保存的置換又は下記の表３に列挙される「例示的な置換」の１つ又は複数を含む）任意の置換が想定される。
保存的置換は、表３の「好ましい置換」の見出し下に示される。そのような置換が生物活性を変化させる場合、表３において「例示的な置換」と称されるか、又はアミノ酸クラスに関連して下記でさらに説明されているより実質的な変更が導入され、所望の特徴について産物がスクリーニングされ得る。
Figure 2024518369000003
本発明の抗原結合分子の生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）例えばシート状若しくはらせん状の立体構造としての置換領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に対する影響が著しく異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて下記の群に分類される：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性疎水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；ａｓｎ、ｇｌｎ（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。抗原結合分子の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般的にはセリンで置換することで分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を回避し得る。逆に、抗体にシステイン結合を付加することで、（特に抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合）その安定性を向上させ得る。
アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／又は類似性は、当技術分野で既知の標準的な技術、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７－３９５により説明されている、好ましくはデフォルト設定を用いたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを使用することにより又は目視等により決定される。好ましくは、同一性パーセントは、下記のパラメーターに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算される：ミスマッチペナルティが１；ギャップペナルティが１；ギャップサイズペナルティが０．３３；及び結合ペナルティが３０、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７－１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ法によるペアワイズアラインメントを使用して関連配列群から多重配列アラインメントを生成する。これにより、アラインメントの生成に使用されたクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１－３６０のプログレッシブアラインメント法の簡易版を使用し；この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３で説明されたものと同様である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、３．００のデフォルトのギャップ加重、０．１０のデフォルトのギャップ長加重、及び加重エンドギャップを含む。
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５７８７で説明されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０－４８０から入手したＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメーターを使用しており、その大部分がデフォルト値に設定される。調整可能なパラメーターは、下記の値に設定されている：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰ Ｓパラメーター及びＨＳＰ Ｓ２パラメーターは、ダイナミック値であり、特定の配列の組成、及び目的の配列が検索されることとなる特定のデータベースの組成に依存して、プログラムそれ自体により確立され；しかしながら、値は、感度を増大させるように調整され得る。
追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２によって報告されているギャップ付きＢＬＡＳＴである。ギャップ付きＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ－６２置換スコアを使用し、閾値Ｔパラメーターは、９に設定され、ギャップなし伸長をもたらす２ヒット（ｔｗｏ－ｈｉｔ）法は、ギャップ長ｋのコストを１０＋ｋとし、Ｘｕは、１６に設定され、Ｘｇは、データベース検索段階では４０に、アルゴリズムの出力段階では６７に設定される。ギャップ付きアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアにより開始される。
一般に、個々のバリアントＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列間のアミノ酸相同性、類似性、又は同一性は、本明細書に示される配列に対して少なくとも６０％であり、より典型的には相同性又は同一性が少なくとも６５％又は７０％、より好ましくは少なくとも７５％又は８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及びほぼ１００％に増加することが好ましい。同様に、本明細書で特定される結合タンパク質の核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、抗原結合分子のコード配列内のヌクレオチド残基と同一である候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。具体的な方法では、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションがそれぞれ１及び０．１２５に設定されているデフォルトパラメーターに設定されたＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
一般に、個々のバリアントＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列をコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されるヌクレオチド配列との間の核酸配列相同性、類似性、又は同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には相同性又は同一性が少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％及びほぼ１００％に増加することが好ましい。したがって、「バリアントＣＤＲ」又は「バリアントＶＨ／ＶＬ領域」は、本発明の親ＣＤＲ／ＶＨ／ＶＬに対して特定の相同性、類似性、又は同一性を有するものであり、且つ親ＣＤＲ若しくはＶＨ／ＶＬの特異性及び／又は活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を含むがこれらに限定されない生物学的機能を共有している。
一実施形態では、本発明に係る抗原結合分子のヒト生殖細胞系列に対する同一性のパーセンテージは、≧７０％又は≧７５％であり、より好ましくは≧８０％又は≧８５％であり、さらにより好ましくは≧９０％であり、最も好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％又はさらに≧９６％である。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子産物に対する同一性は、治療用タンパク質が処置中の患者の薬物に対する免疫反応を誘発するリスクを低減するための重要な特徴であると考えられる。Ｈｗａｎｇ ＆ Ｆｏｏｔｅ（“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”；Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）３－１０）は、薬物抗原結合分子の非ヒト部分の減少が処置中の患者における抗薬物抗体の誘発リスクの低減をもたらすことを実証している。膨大な数の臨床評価済み抗体薬物及びそれぞれの免疫原性データを比較することにより、抗体のＶ領域のヒト化は、未改変の非ヒトＶ領域を保有する抗体（患者の平均２３．５９％）よりもタンパク質の免疫原性が少ない（患者の平均５．１％）という傾向を示している。したがって、Ｖ領域をベースにした抗原結合分子の形態でのタンパク質治療薬に関して、ヒト配列に対する同一性が高いことが望ましい。この生殖細胞系列同一性の決定のために、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアを用いて、ＶＬのＶ領域を、ヒト生殖細胞系列Ｖセグメント及びＪセグメントのアミノ酸配列（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）とアラインさせ、同一アミノ酸残基数をＶＬの総アミノ酸残基数で割ることにより、アミノ酸配列をパーセントで算出し得る。ＶＨセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）についても同様の方法が可能であるが、例外として、ＶＨ ＣＤＲ３は多様性が高く、既存のヒト生殖細胞系列ＶＨ ＣＤＲ３のアラインメントパートナーを欠くため除外され得る。続いて、組換え技術を使用して、ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子に対する配列同一性を増大させ得る。
さらなる実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、標準的な研究規模の条件下（例えば、標準的な二段階精製プロセス）において、高い単量体収量を示す。好ましくは、本発明に係る抗原結合分子の単量体収量は、≧０．２５ｍｇ／Ｌ上清であり、より好ましくは≧０．５ｍｇ／Ｌであり、さらにより好ましくは≧１ｍｇ／Ｌであり、最も好ましくは≧３ｍｇ／Ｌ上清である。
同様に、二量体抗原結合分子アイソフォームの収量、及びしたがって抗原結合分子の単量体のパーセンテージ（即ち、単量体：（単量体＋二量体））が決定され得る。単量体及び二量体抗原結合分子の生産性、並びに算出される単量体のパーセンテージを、例えば、ローラーボトル中における標準化された研究規模の製造に由来する培養上清のＳＥＣ精製工程で取得し得る。一実施形態では、抗原結合分子の単量体のパーセンテージは、≧８０％であり、より好ましくは≧８５％であり、さらにより好ましくは≧９０％であり、最も好ましくは≧９５％である。
一実施形態では、抗原結合分子は、好ましくは、≦５又は≦４、より好ましくは≦３．５又は≦３、さらにより好ましくは≦２．５又は≦２、及び最も好ましくは≦１．５又は≦１の血漿安定性（血漿非存在下でのＥＣ５０に対する血漿存在下でのＥＣ５０の比率）を有する。抗原結合分子の血漿安定性を、コンストラクトを、ヒト血漿中、３７℃で２４時間インキュベートし、続いて５１クロム放出細胞傷害性アッセイにおいてＥＣ５０を決定することにより試験し得る。細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞は、刺激された濃縮ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞であり得る。標的細胞は、例えば、ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞であり得る。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、１０：１又は５：１として選択され得る。この目的で使用されるヒト血漿プールは、ＥＤＴＡコーティングされたシリンジによって回収された健常ドナーの血液に由来する。細胞成分を遠心分離により除去して、上部血漿相を回収し、その後にプールする。対照として、抗原結合分子を細胞傷害性アッセイの直前にＲＰＭＩ－１６４０培地で希釈する。血漿安定性を、ＥＣ５０（対照）に対するＥＣ５０（血漿インキュベーション後）の比率として算出する。
本発明の抗原結合分子の単量体から二量体への変換率は、低いことがさらに好ましい。変換率を、異なる条件下で測定し、高速サイズ排除クロマトグラフィーによって分析し得る。例えば、抗原結合分子の単量体アイソフォームのインキュベーションを、インキュベーター内で、例えば１００μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度及び３７℃で７日間行い得る。これらの条件下において、本発明の抗原結合分子は、≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％、最も好ましくは≦１％又は≦０．５％又はさらに０％の二量体のパーセンテージを示すことが好ましい。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、数回の凍結／解凍サイクル後、非常に低い二量体変換率を示すことも好ましい。例えば、抗原結合分子の単量体を、例えば汎用の製剤緩衝液中、２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、３回の凍結／解凍サイクル（－８０℃で３０分間の凍結後、室温で３０分間の解凍）にかけた後、高速ＳＥＣを行い、二量体抗原結合分子に変換された初期単量体抗原結合分子のパーセンテージを決定する。好ましくは、二重特異性抗原結合分子の二量体のパーセンテージは、例えば、３回の凍結／解凍サイクル後に≦５％であり、より好ましくは≦４％であり、さらにより好ましくは≦３％であり、さらにより好ましくは≦２．５％であり、さらにより好ましくは≦２％であり、さらにより好ましくは≦１．５％であり、最も好ましくは≦１％又はさらに≦０．５％である。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、好ましくは、≧４５℃又は≧５０℃、より好ましくは≧５２℃又は≧５４℃、さらにより好ましくは≧５６℃又は≧５７℃、最も好ましくは≧５８℃又は≧５９℃の凝集温度で良好な熱安定性を示す。抗体の凝集温度の観点から、熱安定性パラメーターを、下記のとおりに決定し得る：濃度２５０μｇ／ｍｌの抗体溶液を単回使用のキュベットに移し、動的光散乱（ＤＬＳ）装置内に置く。測定半径を常時取得しながら、０．５℃／分の加熱速度で４０℃から７０℃まで試料を加熱する。タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増大を使用して、抗体の凝集温度を算出する。
或いは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって融解温度曲線を決定して、抗原結合分子の固有の生物物理学的なタンパク質の安定性を決定し得る。これらの実験を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ）ＶＰ－ＤＳＣ装置を使用して実施する。抗原結合分子を含有する試料のエネルギー取り込みを２０℃から９０℃まで記録して、製剤緩衝液のみを含有する試料と比較する。抗原結合分子を、例えば、ＳＥＣランニング緩衝液中において２５０μｇ／ｍｌの最終濃度に調整する。それぞれの融解曲線を記録するために、試料全体の温度を段階的に上昇させる。各温度Ｔでの試料及び製剤緩衝液標準物質のエネルギー取り込みを記録する。試料から標準物質を差し引いたエネルギー取り込みＣｐ（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ／℃）の差を、それぞれの温度に対してプロットする。融解温度は、エネルギー取り込みが最初に最大となる温度と定義される。
本発明の標的細胞のＣＤ２０及びＣＤ２２×ＣＤ３二重特異性抗原結合分子はまた、≦０．２、好ましくは≦０．１５、より好ましくは≦０．１２、さらにより好ましくは≦０．１、最も好ましくは≦０．０８の混濁度（精製された単量体抗原結合分子を２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、一晩インキュベートした後、ＯＤ３４０により測定される）を有すると想定される。
さらなる実施形態では、本発明に係る抗原結合分子は、生理的なｐＨ又はそれよりわずかに低いｐＨ（即ち、約ｐＨ７．４～６．０）で安定である。非生理的ｐＨ（例えば、約ｐＨ６．０）で抗原結合分子が示す耐性が高いほど、負荷されたタンパク質の総量に対するイオン交換カラムから溶出される抗原結合分子の回収率が高くなる。約ｐＨ６．０でのイオン（例えば、カチオン）交換カラムからの抗原結合分子の回収率は、好ましくは≧３０％であり、より好ましくは≧４０％であり、より好ましくは≧５０％であり、さらにより好ましくは≧６０％であり、さらにより好ましくは≧７０％であり、さらにより好ましくは≧８０％であり、さらにより好ましくは≧９０％であり、さらにより好ましくは≧９５％であり、最も好ましくは≧９９％である。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、治療有効性又は抗腫瘍活性を示すことがさらに想定される。このことを、例えば、下記の進行期のヒト腫瘍異種移植モデルの一般化された実施例に開示される試験において評価し得る。
試験の１日目に、ヒト標的細胞抗原（ＣＤ２０及びＣＤ２２）陽性癌細胞株の５×１０６個の細胞を、雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右背側側腹部に皮下注射する。平均腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達するとき、インビトロで増殖させたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を、動物の腹膜腔への約２×１０７個の細胞の注射によってマウスに移植する。溶媒対照群１のマウスを、エフェクター細胞を受容せず、且つ溶媒対照群２（エフェクター細胞を受容する）との比較のための非移植対照として使用して、腫瘍増殖に対するＴ細胞単独の影響をモニタリングする。平均腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達するときに、抗体処置を開始する。処置開始日の各処置群の平均腫瘍サイズは、いずれの他の群とも統計的に異なるべきではない（分散分析）。マウスを、静脈内ボーラス注射によって約１５～２０日間、０．５ｍｇ／ｋｇ／日のＣＤ２０及びＣＤ２２×ＣＤ３二重特異性抗原結合分子で処置する。腫瘍を、試験中にキャリパーによって測定し、進行を、腫瘍体積（ＴＶ）の群間比較によって評価する。腫瘍増殖阻害Ｔ／Ｃ［％］を、Ｔ／Ｃ％＝１００×（分析群の中央値ＴＶ）／（対照群２の中央値ＴＶ）としてＴＶを計算することによって決定する。
当業者は、この試験の特定のパラメーター、例えば、注射される腫瘍細胞の数、注射部位、移植されるヒトＴ細胞の数、投与されることになる二重特異性抗原結合分子の量、及び予定表を変更させるか又は適合させながらも、有意義で再現性のある結果を得る方法を知っている。好ましくは、腫瘍増殖抑制Ｔ／Ｃ［％］は、≦７０若しくは≦６０であり、より好ましくは≦５０若しくは≦４０であり、さらにより好ましくは≦３０若しくは≦２０であり、最も好ましくは≦１０若しくは≦５又はさらに≦２．５である。腫瘍増殖阻害は、１００％に近いことが好ましい。
本発明の抗原結合分子の好ましい実施形態では、抗原結合ポリペプチドは、一本鎖抗原結合分子である。
また、本発明の抗原結合分子の好ましい実施形態では、前記第３のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、
ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。
本発明の一実施形態では、第３のドメインの前記ポリペプチド単量体の各々は、配列番号１７～２４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態又は本発明では、前記ポリペプチド単量体の各々は、配列番号１７～２４から選択されるアミノ酸配列を有する。
また、本発明の一実施形態では、第３のドメインの１つ又は好ましくは各々（両方）のポリペプチド単量体のＣＨ２ドメインは、ドメイン内システインジスルフィド架橋を含む。当技術分野で知られるとおり、用語「システインジスルフィド架橋」は、一般構造Ｒ－Ｓ－Ｓ－Ｒを有する官能基を指す。この連結はまた、ＳＳ結合又はジスルフィド架橋とも呼ばれ、システイン残基の２つのチオール基のカップリングによって得られる。本発明の抗原結合分子に関して、成熟抗原結合分子内でシステインジスルフィド架橋を形成するシステインは、３０９及び３２１（Ｋａｂａｔ付番）に対応するＣＨ２ドメインのアミノ酸配列に導入されることが特に好ましい。
本発明の一実施形態では、ＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位が除去される。このグリコシル化部位の除去は、Ｎ３１４Ｘ置換によって達成されることが好ましく、ここで、Ｘは、Ｑではない任意のアミノ酸である。前記置換は、好ましくは、Ｎ３１４Ｇである。より好ましい実施形態では、前記ＣＨ２ドメインは、下記の置換をさらに含む（位置は、Ｋａｂａｔに従う）：Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃ（これらの置換は、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１でドメイン内システインジスルフィド架橋を導入する）。
例えば、当技術分野で既知の二重特異性ヘテロＦｃ抗原結合分子（図Ｆ １ｂ）と比較した本発明の抗原結合分子の好ましい特徴は、とりわけ、ＣＨ２ドメインにおける上記の改変の導入に関連し得ると考えられる。したがって、本発明のコンストラクトに関して、本発明の抗原結合分子の第３のドメイン内のＣＨ２ドメインがＫａｂａｔ位置３０９及び３２１にドメイン内システインジスルフィド架橋を含み、且つ／又はＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位が、好ましくはＮ３１４Ｇ置換により除去されることが好ましい。
本発明のさらに好ましい実施形態では、本発明の抗原結合分子の第３のドメイン内のＣＨ２ドメインは、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１にドメイン内システインジスルフィド架橋を含み、且つＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位がＮ３１４Ｇ置換によって除去されている。最も好ましくは、本発明の抗原結合分子の第３のドメインのポリペプチド単量体は、配列番号１７及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明は、抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のドメインが、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインが、２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉ）第１のドメインが、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインが、２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉｉ）第１のドメインが、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインが、１つの抗体可変ドメインを含むか；又は
（ｉｖ）第１のドメインが、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインが、１つの抗体可変ドメインを含む
抗原結合分子を提供する。
したがって、第１のドメイン及び第２のドメインは、ＶＨ及びＶＬドメイン等の各々２つの抗体可変ドメインを含む結合ドメインであり得る。本明細書の上記の２つの抗体可変ドメインを含むそのような結合ドメインの例は、例えば、本明細書の上記のＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、又はＦａｂ断片を含む。代わりに、それらの結合ドメインのいずれか一方又は両方は、単一の可変ドメインのみを含み得る。本明細書の上記のそのような単一ドメイン結合ドメインの例は、例えば、他のＶ領域又はドメインに非依存的に抗原又はエピトープに特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨ、又はＶＬであり得る１つのみの可変ドメインを含むナノボディ又は単一可変ドメイン抗体を含む。
本発明の抗原結合分子の好ましい実施形態では、第１及び第２のドメインは、ペプチドリンカーを介して第３のドメインに融合している。好ましいペプチドリンカーは、本明細書で上述されており、且つアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（即ち、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１））、又はそのポリマー（即ち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘ）によって特徴付けられ、ここで、ｘは、１以上の整数（例えば、２又は３）である。第３のドメインに対する第１のドメイン及び第２のドメインの融合において特に好ましいリンカーは、配列番号１で示される。
好ましい実施形態では、本発明の抗原結合分子は、アミノからカルボキシルの順に、
（ａ）第１のドメイン；
（ｂ）配列番号１～３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）第２のドメイン；
（ｄ）配列番号１、２、３、９、１０、１１、及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｅ）第３のドメインの第１のポリペプチド単量体；
（ｆ）配列番号５、６、７、及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；並びに
（ｇ）第３のドメインの第２のポリペプチド単量体
を含むことを特徴とする。
本発明の抗原結合分子は、ＣＤ２０及びＣＤ２２に結合し、好ましくはＣＤ２０及びＣＤ２２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する第１のドメインを含む。本発明に関連して、用語「ＣＤ２０及びＣＤ２２の細胞外ドメインに結合する」は、結合ドメインが、標的細胞の表面で発現されるＣＤ２０及びＣＤ２２に結合することを意味することが理解される。したがって、本発明に係る第１のドメインは、ＣＤ２０及びＣＤ２２が、自然に発現する細胞若しくは細胞株により発現され、且つ／又はＣＤ２０及びＣＤ２２で形質転換若しくは（安定的に／一過的に）トランスフェクトされた細胞若しくは細胞株によって発現される場合に、ＣＤ２０及びＣＤ２２に結合することが好ましい。好ましい実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ２０及びＣＤ２２がＢＩＡｃｏｒｅ又はスキャッチャード等のインビトロ結合アッセイにおける「標的」又は「リガンド」分子として使用される場合に、ＣＤ２０及びＣＤ２２にも結合する。「標的細胞」は、その表面でＣＤ２０及びＣＤ２２を発現する任意の原核細胞又は真核細胞であり得；好ましくは、標的細胞は、特定のＣＤ２０及びＣＤ２２発現癌又は腫瘍細胞等のヒト又は動物の体の一部である細胞である。
好ましくは、第１の結合ドメインは、ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２／ＣＤ２０及びＣＤ２２ ＥＣＤに結合する。さらに好ましい実施形態では、これは、マカクＣＤ２０及びＣＤ２２／ＣＤ２０及びＣＤ２２ ＥＣＤに結合する。最も好ましい実施形態によれば、これは、ヒト及びマカクＣＤ２０及びＣＤ２２／ＣＤ２０及びＣＤ２２ ＥＣＤの両方に結合する。「ＣＤ２０及びＣＤ２２細胞外ドメイン」又は「ＣＤ２０及びＣＤ２２ ＥＣＤ」は、ＣＤ２０及びＣＤ２２の膜貫通ドメイン及び細胞質内ドメインを本質的に含まないＣＤ２０及びＣＤ２２領域又は配列を指す。本発明のＣＤ２０及びＣＤ２２ポリペプチドに関して同定される膜貫通ドメインは、その型の疎水性ドメインを同定するための当技術分野で慣用的に用いられる基準に従って同定されることが当業者に理解されるであろう。膜貫通ドメインの正確な境界が異なる場合があるが、本明細書で具体的に言及されるドメインのいずれかの末端の約５個のアミノ酸以下である可能性が非常に高い。
ＣＤ３に結合する好ましい結合ドメインは、国際公開第２０１０／０３７８３６号パンフレット及び同第２０１１／１２１１１０号パンフレットで開示されている。これらの出願で説明されているＣＤ３の任意の結合ドメインが、本発明に関連して使用される場合があるが、しかしながら、好ましいのは、本明細書で開示されている配列番号４００又は４０９を有する第３の結合ドメインである。配列番号４０９が、非常に好ましい。
本発明は、本発明の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド／核酸分子をさらに提供する。ポリヌクレオチドは、鎖内で共有結合された１３個以上のヌクレオチド単量体で構成される生体高分子である。ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）及びＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸分子の単量体又はサブユニットとして機能する有機分子である。核酸分子又はポリヌクレオチドは、二本鎖及び一本鎖、線状及び環状であり得る。これは、好ましくは宿主細胞内に含まれるベクター内に含まれることが好ましい。前記宿主細胞は、例えば、本発明のベクター又はポリヌクレオチドで形質転換されたか又はトランスフェクトされた後、抗原結合分子を発現し得る。それを目的として、ポリヌクレオチド又は核酸分子は、制御配列に作動可能に連結される。
遺伝暗号は、遺伝子材料（核酸）内にコードされた情報をタンパク質に翻訳するルールのセットである。生細胞中での生物学的解読は、アミノ酸を運搬し、ｍＲＮＡ中の３つのヌクレオチドを一度に読み取るｔＲＮＡ分子を使用して、ｍＲＮＡによって指定された順にアミノ酸を結合するリボソームによって行われる。この暗号は、コドンと呼ばれる三つ組のヌクレオチド配列が、タンパク質の合成時に次に付加されることになるアミノ酸をどのように指定するかを定義する。いくつかの例外があるが、核酸配列中の３ヌクレオチドのコドンは、１つのアミノ酸を指定する。大部分の遺伝子は、厳密に同じ暗号で暗号化されているため、この特定の暗号を基準遺伝暗号又は標準遺伝暗号と称する場合が多い。遺伝暗号は所与のコード領域のタンパク質配列を決定するが、他のゲノム領域がこれらのタンパク質が産生される時期及び場所に影響を及ぼし得る。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、（外来）遺伝子材料を細胞内に移すための媒体として使用される核酸分子である。用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体を包含するが、これらに限定されない。一般に、遺伝子操作されたベクターは、複製起点、マルチクローニング部位、及び選択マーカーを含む。ベクター自体は、一般に、インサート（導入遺伝子）、及びベクターの「骨格」の役割をするより大きな配列を含むヌクレオチド配列（一般にＤＮＡ配列）である。現代のベクターは、導入遺伝子インサート及び骨格に加えて、追加の特徴を包含し得る：プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的化配列、タンパク質精製タグ。発現ベクター（発現コンストラクト）と呼ばれるベクターは特に、標的細胞における導入遺伝子の発現のためのものであり、一般に制御配列を有する。
用語「制御配列」は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列として、例えば、プロモーター、任意選択的なオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係にある場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列若しくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されているか；プロモーター若しくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結されているか；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していること、及び分泌リーダーの場合には連続し且つ読み取り枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、都合のよい制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、従来の慣例に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。
「トランスフェクション」は、標的細胞に核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を意図的に導入するプロセスである。この用語は、真核細胞における非ウイルス性の方法に主に用いられる。形質導入を使用して、核酸分子又はポリヌクレオチドのウイルス媒介移入を説明することが多い。動物細胞のトランスフェクションは、典型的には、細胞膜に一過性の細孔又は「穴」を開けて材料の取り込みを可能にすることを伴う。トランスフェクションを、リン酸カルシウムを用いて行ない得るか、エレクトロポレーションによって行ない得るか、細胞の圧迫によって行ない得るか、又は陽イオン性脂質とリポソームを生成する物質とを混合し、細胞膜と融合させ、内部のカーゴを蓄積することによって行ない得る。
用語「形質転換」は、細菌への及び植物細胞を含む非動物真核細胞への核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）の非ウイルス的移入を説明するために使用される。したがって、形質転換は、細胞膜を通じたその周辺からの直接的取り込み及びそれに続く外来性遺伝子材料（核酸分子）の組み込みから生じる、細菌又は非動物真核細胞の遺伝的改変である。形質転換を、人為的手段によって生じさせ得る。形質転換を生じさせるには、細胞又は細菌は、飢餓及び細胞密度等の環境条件に対する時限応答として形質転換が起こり得るコンピテントな状態でなければならない。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子又はベクターで形質転換されたか又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」又は「レシピエント細胞」は、本発明の抗原結合分子をコードするベクター、外来性核酸分子、及びポリヌクレオチドのレシピエント；並びに／又はその抗原結合分子自体のレシピエントであり得るか又はそうであった任意の個々の細胞又は細胞培養物を含むことが意図される。細胞へのそれぞれの物質の導入は、形質転換、トランスフェクション等によって実施される。用語「宿主細胞」はまた、単一細胞の子孫又は潜在的子孫を含むことも意図する。後継世代において、自然発生的、偶発的、若しくは意図的な変異のいずれかに起因して、又は環境的影響に起因して、一定の改変が生じる場合があるため、そのような子孫は、実際には、（形態学的に、又はゲノム若しくは全ＤＮＡの組に関して）親細胞と完全に同一ではない場合もあるが、なおも本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。好適な宿主細胞として、原核細胞又は真核細胞が挙げられ、また細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、及び動物細胞、例えば昆虫細胞及び哺乳動物細胞、例えばマウス、ラット、マカク、又はヒトが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の抗原結合分子は、細菌内で産生され得る。発現後、本発明の抗原結合分子を、可溶性画分中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ペーストから単離し、例えばアフィニティクロマトグラフィー及び／又はサイズ排除によって精製し得る。最終精製を、例えばＣＨＯ細胞において発現された抗体の精製方法と同様に実施し得る。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の真核微生物が、本発明の抗原結合分子に好適なクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、いくつかの他の属、種、及び系統が一般に利用可能であり、且つ本明細書において有用であり、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えば、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６０４５）、Ｋ．ウィッカラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２２２６号明細書）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３０７０号明細書）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４２３４号明細書）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；並びに糸状菌、例えば、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が挙げられる。
本発明のグリコシル化抗原結合分子の発現のための好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例として、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルスの株及びバリアント並びに宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞（例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ））が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばオートグラファカリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１バリアント、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ－５株が公的に入手可能であり、そのようなウイルスを、本発明に係る本明細書のウイルスとして、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用してもよい。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ及びタバコの植物細胞培養物も、宿主として使用し得る。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生に有用なクローニングベクター及び発現ベクターは、当業者に知られている。例えば、Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：７６－７８、Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９０－７９４、Ａｒｔｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ ８：７４５－７５０、及びＦｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２：９７９－９８６を参照されたい。
しかしながら、脊椎動物細胞に対する関心が最も高く、培養（組織培養）下での脊椎動物細胞の増殖は、通例の手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、下記である：ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞、又は懸濁培養物中で増殖用にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、１４１３ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５ １）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）３８３：４４－６８）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫系統（Ｈｅｐ Ｇ２）。
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗原結合分子の作製のためのプロセスであって、本発明の抗原結合分子の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、及び産生された抗原結合分子を培養物から回収することを含むプロセスを提供する。
本明細書で使用される場合、用語「培養」は、培地中の好適な条件下におけるインビトロでの細胞の維持、分化、成長、増殖、及び／又は伝播を指す。用語「発現」には、本発明の抗原結合分子の生成に関与する任意の工程、例えば、下記に限定されないが、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、及び分泌が含まれる。
組換え技術を使用する場合、抗原結合分子は、細胞内の細胞膜周辺腔において産生され得るか、又は培地中に直接的に分泌され得る。抗原結合分子が細胞内で産生される場合、第１の工程として、粒状の細片である宿主細胞又は溶解した断片は、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が説明されている。簡潔には、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍する。細胞片を、遠心分離により除去し得る。抗体が培地に分泌される場合、一般にそのような発現系からの上清を、最初に市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して濃縮する。タンパク質分解を阻害するために、前述の工程のいずれかにおいてＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤が含まれてもよく、また外来性の汚染菌の増殖を防止するために、抗生物質が含まれてもよい。
宿主細胞から調製された本発明の抗原結合分子を、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィーを使用して回収し得るか、又は精製し得る。回収される抗体に応じて、他のタンパク質精製技術、例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法もまた、利用可能である。本発明の抗原結合分子がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が、精製に有用である。
親和性クロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス（例えば、コントロールドポアガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼン）は、アガロースを用いて達成できるものよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。
さらに、本発明は、本発明の抗原結合分子又は本発明の方法に従って生成された抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物において、抗原結合分子の均一性は、≧８０％であることが好ましく、より好ましくは≧８１％、≧８２％、≧８３％、≧８４％、又は≧８５％であり、さらに好ましくは≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、又は≧９０％であり、なおさらに好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、又は≧９５％であり、最も好ましくは≧９６％、≧９７％、≧９８％、又は≧９９％である。
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、患者（好ましくは、ヒト患者）への投与に好適な組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、１種又は複数種の本発明の抗原結合分子を、好ましくは治療有効量で含む。好ましくは、医薬組成物は、１種又は複数種（薬学的に有効な）担体、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、保存剤、及び／又はアジュバントの好適な製剤をさらに含む。許容される組成物の成分は、採用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。本発明の医薬組成物として、液体組成物、凍結組成物、及び凍結乾燥組成物が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。一般に、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与、特に非経口投与に適合するあらゆる水性及び非水性の溶液、滅菌溶液、溶媒、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、懸濁液、油／水エマルジョン等のエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、リポソーム、分散媒体、及びコーティングを意味する。医薬組成物におけるそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知であり、そのような担体を含む組成物を、公知の従来法によって製剤化し得る。
ある特定の実施形態は、本発明の抗原結合分子、及びさらに１種又は複数種の賦形剤、例えば、本節及び本明細書の他の箇所で例示的に説明されているものを含む医薬組成物を提供する。賦形剤を、粘度の調整等の製剤の物理的、化学的、又は生物学的特性の調整、及び／又は有効性を向上させ、且つ／若しくはそのような製剤を安定化するための本発明の方法、並びに、例えば製造、輸送、保管、使用前の調製、投与の間及びこれらの後に生じるストレスに起因する劣化及び損傷に対する方法等の広範囲の目的を考慮して、本発明で使用し得る。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、吸着、又は浸透を変更するか、持続するか又は保護することを目的とする製剤材料を含有してもよい（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。そのような実施形態では、好適な製剤化材料として下記が挙げられ得るが、これらに限定されない：
・ アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、スレオニン、プロリン、２－フェニルアラニン、例えば、荷電アミノ酸、好ましくはリジン、酢酸リジン、アルギニン、グルタミン酸塩、及び／又はヒスチジン
・ 抗菌薬及び抗真菌薬等の抗微生物薬
・ アスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウム、又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；
・ 生理的なｐＨ又はそれよりわずかに低いｐＨ、好ましくはより低い４．０～６．５のｐＨで組成物を維持するのに使用される緩衝液、緩衝液系、及び緩衝化剤；緩衝液の例は、ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、又は他の有機酸、コハク酸塩、リン酸塩、及びヒスチジンである；例えば、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝液；
・ 非水性溶媒、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステル；
・ 水等の水性担体、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液、例えば、生理塩類溶液及び緩衝媒体；
・ ポリエステル等の生分解性ポリマー；
・ マンニトール又はグリシン等の充填剤；
・ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤；
・ 等張剤及び吸収遅延剤；
・ 錯化剤、例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β－シクロデキストリン、又はヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン
・ 注入剤；
・ 単糖類；二糖類；及び他の糖質（例えば、グルコース、マンノース、又はデキストリン）；糖質は、非還元糖であり得、好ましくは、トレハロース、スクロース、オクタスルファート、ソルビトール、又はキシリトールであり得る；
・ （低分子量）タンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質性担体、例えば、ヒト若しくはウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は好ましくはヒト起源の免疫グロブリン；
・ 着色剤及び着香剤；
・ 硫黄含有還元剤、例えば、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］－モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム
・ 希釈剤；
・ 乳化剤；
・ ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；
・ ナトリウム等の塩形成対イオン；
・ 保存剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等；例は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、又は過酸化水素である；
・ Ｚｎ－タンパク質錯体等の金属錯体；
・ 溶媒及び共溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコール）；
・ 糖及び糖アルコール、例えば、トレハロース、スクロース、オクタスルファート、マンニトール、ソルビトール又はキシリトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；及び多価糖アルコール；
・ 懸濁化剤；
・ 界面活性剤又は湿潤剤、例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）；界面活性剤は、好ましくは＞１．２ＫＤの分子量を有する洗剤、及び／又は好ましくは＞３ＫＤの分子量を有するポリエーテルであり得；好ましい洗剤の非限定的な例は、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、及びＴｗｅｅｎ ８５であり；好ましいポリエーテルの非限定的な例は、ＰＥＧ ３０００、ＰＥＧ ３３５０、ＰＥＧ ４０００、及びＰＥＧ ５０００である；
・ スクロース又はソルビトール等の安定性増強剤；
・ 等張性増強剤、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール；
・ 非経口送達ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は固定油；
・ 静脈内送達ビヒクル、例えば、体液、及び栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンゲルデキストロースをベースにしたもの）。
本発明との関連において、好ましくは液体組成物であるか、又は凍結乾燥によって得られる固体組成物であり得るか、又は再構成された液体組成物であり得る医薬組成物は、
（ａ）少なくとも３つのドメインを含む抗原結合分子であって、
・ 第１のドメインは、標的細胞の表面抗原に結合し、且つ４～９．５の範囲の等電点（ｐＩ）を有し；
・ 第２のドメインは、第２の抗原に結合し、且つ８～１０、好ましくは８．５～９．０の範囲のｐＩを有し；並びに
・ 任意選択的な第３のドメインは、２つのポリペプチド単量体であって、それぞれヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド単量体を含み、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合しており；
（ｂ）少なくとも１種の緩衝剤；
（ｃ）少なくとも１種の糖；並びに
（ｄ）少なくとも１種の界面活性剤
を含み、
医薬組成物のｐＨは、３．５～６の範囲である。
さらに、少なくとも１種の緩衝剤は、５～２００ｍＭの濃度範囲で存在し、より好ましくは１０～５０ｍＭの濃度範囲で存在することが、本発明との関連において想定される。少なくとも１種の糖類が、単糖類、二糖類、環状多糖類、糖アルコール、直鎖状分岐状デキストラン又は直鎖状非分岐状デキストランからなる群から選択されることが、本発明との関連において想定される。本発明との関連において、二糖類は、スクロース、トレハロース、及びマンニトール、ソルビトール、並びにこれらの組合せからなる群から選択されることも想定される。さらに、糖アルコールはソルビトールであることが、本発明との関連において想定される。少なくとも１種の糖類は、１～１５％（ｍ／Ｖ）の範囲の濃度で存在し、好ましくは９～１２％（ｍ／Ｖ）の濃度範囲で存在することが、本発明との関連において想定される。
少なくとも１種の界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニックＦ６８、トリトンＸ－１００、ポリオキシエチレン、ＰＥＧ ３３５０、ＰＥＧ ４０００、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることも、本発明との関連において想定される。さらに、少なくとも１種の界面活性剤は、０．００４～０．５％（ｍ／Ｖ）の範囲、好ましくは０．００１～０．０１％（ｍ／Ｖ）の範囲の濃度で存在することが、本発明との関連において想定される。組成物のｐＨは、４．０～５．０の範囲、好ましくは４．２であることが、本発明との関連において想定される。医薬組成物は、１５０～５００ｍＯｓｍの範囲のモル浸透圧濃度を有することも、本発明との関連において想定される。医薬組成物は、１種又は複数種のポリオール及び１種又は複数種のアミノ酸からなる群から選択される賦形剤をさらに含むことが、本発明との関連においてさらに想定される。前記１種又は複数種の賦形剤は、０．１～１５％（ｗ／Ｖ）の濃度範囲で存在することが、本発明との関連において想定される。
医薬組成物は、
（ａ）上記で論じられた抗原結合分子、
（ｂ）１０ｍＭのグルタミン酸塩又は酢酸塩、
（ｃ）９％（ｍ／Ｖ）スクロース又は６％（ｍ／Ｖ）スクロース、及び６％（ｍ／Ｖ）ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン；
（ｄ）０．０１％（ｍ／Ｖ）ポリソルベート８０
を含み、
液体医薬組成物のｐＨは、４．２である
ことも、本発明との関連において想定される。
抗原結合分子は、０．１～８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２～２．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５～１．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在することが、本発明との関連においてさらに想定される。
医薬組成物の異なる成分（例えば、上記に列挙したもの）が異なる効果を有し得ることは、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸は、緩衝液、安定化剤、及び／又は抗酸化剤として作用し得；マンニトールは、充填剤及び／又は等張性増強剤として作用し得；塩化ナトリウムは、送達ビヒクル及び／又は等張性増強剤として作用し得る等である。
本発明の組成物は、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに加えて、この組成物の使用目的に応じてさらなる生物学的に活性な薬剤を含む場合があることが想定される。そのような薬剤は、当技術分野で知られる胃腸系に対して作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症を防ぐ薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症反応を調節する薬物、循環系に対して作用する薬物、及び／又はサイトカイン等の薬剤であり得る。本発明の抗原結合分子は、併用療法で、即ち、別の抗癌薬と組み合わせて適用されることも想定される。
ある特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、及び所望の投与量に応じて、当業者により決定されることになる。例えば、前掲のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照されたい。ある特定の実施形態では、そのような組成物は、本発明の抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響し得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物中の主なビヒクル又は担体は、実際は、水性又は非水性のいずれかであり得る。例えば、好適なビヒクル又は担体は、注射用水、生理食塩水溶液、又は人工脳脊髄液であり得、場合により非経口投与用組成物で一般的な他の材料が補充される。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合された生理食塩水も、さらなる例示的なビヒクルである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物の抗原結合分子は、凍結乾燥ケーク又は水性溶液の形態において、所望の度合いの純度を有する選択された組成物と、任意選択的な配合剤（前掲のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することによって、保管のために調製され得る。さらに、ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、スクロース等の適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化され得る。
非経口投与が企図される場合、本発明における使用のための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に本発明の所望の抗原結合分子を含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態で提供され得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、本発明の抗原結合分子は、その中で適切に保存された滅菌等張溶液として製剤化される。ある特定の実施形態では、製剤は、デポ注射を介して送達され得る産物の制御性放出又は持続放出を提供し得る薬剤、例えば注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（例えば、ポリ乳酸若しくはポリグリコール酸）、ビーズ、又はリポソームと、所望の分子との製剤を含み得る。ある特定の実施形態では、循環中の持続期間を増進する効果を有するヒアルロン酸も使用し得る。ある特定の実施形態では、所望の抗原結合分子を導入するために、埋め込み可能な薬物送達デバイスを使用してもよい。
さらなる医薬組成物が当業者に明らかであり、これには、持続性又は制御性の送達／放出製剤中に本発明の抗原結合分子を含む製剤が含まれる。様々な他の持続性又は制御性の送達手段、例えば、リポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子、又は多孔ビーズ、及びデポ注射を製剤化する技術もまた、当業者に知られている。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出を説明する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号明細書を参照されたい。持続放出性製剤は、成形物品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許出願公開第０５８４８１号明細書で開示されている）、Ｌ－グルタミン酸とガンマエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：５４７－５５６）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７－２７７、及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１、前掲）、又はポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）を含み得る。持続放出性組成物は、当技術分野で既知のいくつかの方法のいずれかによって作製可能なリポソームも含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８－３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号明細書；同第０８８，０４６号明細書、及び同第１４３，９４９号明細書を参照されたい。
抗原結合分子は、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル、及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）、又はマクロエマルジョンにも封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
インビボ投与に使用される医薬組成物は、典型的には、滅菌製剤として提供される。無菌化を、無菌濾過膜を介する濾過によって達成し得る。この組成物を凍結乾燥する場合、この方法を使用した無菌化を、凍結乾燥及び再構成の前後いずれに実施してもよい。非経口投与用の組成物を、凍結乾燥形態又は溶液で保存し得る。非経口組成物は一般に、滅菌したアクセスポートを有するコンテナ、例えば、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静注液バッグ又はバイアル中に入れられる。
本発明の別の態様は、国際特許出願国際公開第０６１３８１８１Ａ２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９号明細書）で説明されているとおりの医薬組成物として使用され得る本発明の製剤の自己緩衝性抗原結合分子を含む。タンパク質の安定化、並びにこれに関して有用な製剤材料及び方法に対して様々な説明が利用可能であり、例えばＡｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．８（３）：２８５－９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ” ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＳＴＡＢＬＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１－８４（２００２）、及びＲａｎｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９－７５（２００２）が利用可能であり、特に獣医学的及び／又はヒト医療用途のタンパク質医薬品及びプロセスに関しては、特に本発明による自己緩衝性タンパク質製剤と同じ賦形剤及びプロセスに関する部分を参照されたい。
塩を、本発明のある特定の実施形態に従って、例えば製剤のイオン強度及び／若しくは等張性を調整するために、並びに／又は本発明による組成物のタンパク質若しくは他の成分の溶解度及び／若しくは物理的安定性を向上させるために、使用し得る。よく知られているとおり、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することによって、並びにタンパク質中の荷電基及び極性基を遮蔽し、その静電気相互作用、引力、及び反発相互作用の強度を低減することによって、天然状態のタンパク質を安定化させ得る。イオンはまた、特にタンパク質の変性ペプチド結合（－－ＣＯＮＨ）に結合することによって、変性状態のタンパク質を安定化させ得る。さらに、タンパク質中の荷電基及び極性基とのイオン相互作用は、分子間静電相互作用を低減し、それによりタンパク質の凝集及び不溶化を防止し得るか、又は低減させ得る。
イオン種は、タンパク質に対するその効果が著しく異なる。イオン及びタンパク質に対するその効果の分類上の順位付けがいくつか立案されており、これを、本発明による医薬組成物の製剤化に使用し得る。一例は、イオン性溶質及び極性非イオン性溶質を溶液中のタンパク質の立体構造安定性に対する効果によって順位付けするホフマイスター系列である。安定化溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは、一般に、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞１モル硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは、一般に、タンパク質を変性させるために及び／又は可溶化（「塩溶」）させるために使用される。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な効果によって、ホフマイスター系列でのイオンの位置が定義される。
遊離アミノ酸を、充填剤、安定化剤、及び抗酸化剤として、且つ他の標準的用途として、本発明の様々な実施形態による本発明の製剤の抗原結合分子で使用し得る。リジン、プロリン、セリン、及びアラニンを、製剤中のタンパク質を安定化するために使用し得る。グリシンは、凍結乾燥において適切なケークの構造及び特性を確保するのに有用である。アルギニンは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でも、タンパク質の凝集を阻害するのに有用であり得る。メチオニンは、抗酸化剤として有用である。
ポリオールは、糖、例えば、マンニトール、スクロース、及びソルビトール、並びに多価アルコール、例えば、グリセロール及びプロピレングリコール、並びに本明細書での議論を目的として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。ポリオールは、コスモトロピックである。これは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でも、タンパク質を物理的及び化学的分解プロセスから保護するのに有用な安定化剤である。ポリオールは、製剤の等張性を調整するのにも有用である。ポリオールの中で本発明の選択された実施形態において有用なのは、マンニトールであり、これは、凍結乾燥製剤においてケークの構造安定性を確保するために一般に使用される。マンニトールは、ケークの構造安定性を確保する。一般に、これは、凍結乾燥保護剤、例えばスクロースと共に使用される。ソルビトール及びスクロースは、等張性を調整するため及び輸送中又は製造工程でのバルク調製時の凍結解凍ストレスから保護するための安定化剤として好ましい薬剤の中に含まれる。還元糖（遊離アルデヒド基又はケトン基を含有する）、例えばグルコース及びラクトースは、表面のリジン及びアルギニン残基を糖化し得る。したがって、これらは、一般に、本発明による使用のための好ましいポリオールの中に含まれない。加えて、そのような反応種を形成する糖、例えばスクロースも、酸性条件下でフルクトース及びグルコースに加水分解され、その結果糖化を生じさせる点で、本発明の好ましいポリオールの中に含まれない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化するのに及び凍結保護物質として有用であり、この点に関して本発明に使用し得る。
本発明の製剤の抗原結合分子の実施形態は、界面活性剤をさらに含む。タンパク質分子は、表面への吸着、並びに気体－液体界面、固体－液体界面、及び液体－液体界面での変性及びその結果としての凝集を引き起こしやすいことがある。これらの効果は、一般にタンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は一般に、タンパク質濃度と反比例し、典型的には、例えば製品の輸送及び取り扱い時に生じる物理的撹拌によって悪化する。界面活性剤は、慣例的に、表面吸着を防止するか、最小化するか、又は低減するために使用される。この点に関して本発明において有用な界面活性剤として、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８が挙げられる。界面活性剤は、タンパク質の立体構造安定性を制御するためにも一般に使用される。任意の所与の界面活性剤は通常、一部のタンパク質を安定化し、他を不安定化するので、この点で界面活性剤の使用はタンパク質特異的である。
ポリソルベートは、酸化的分解を起こしやすく、多くの場合、供給される場合に、タンパク質残基の側鎖（特に、メチオニン）の酸化を引き起こすほど十分な過酸化物量を含有している。したがって、ポリソルベートは、慎重に使用すべきであり、使用時には最小影響濃度で用いなければならない。この点で、ポリソルベートは、賦形剤を最小影響濃度で用いるべきとする一般通則を例示している。
本発明の製剤の抗原結合分子の実施形態は、１種又は複数種の抗酸化剤をさらに含む。適切なレベルの周囲酸素及び周囲温度を維持することによって、並びに光への暴露を回避することによって、医薬製剤中でのタンパク質の有害な酸化をある程度まで防止し得る。抗酸化賦形剤を、タンパク質の酸化的分解を防止するためにも同様に使用し得る。この点で特に有用な抗酸化剤には、還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤、及びキレート剤が含まれる。本発明による治療用タンパク質製剤に使用するための抗酸化剤は、好ましくは、水溶性であり、製品の有効期間にわたって活性を維持する。この点で、ＥＤＴＡが本発明による好ましい抗酸化剤である。抗酸化剤は、タンパク質を損傷する可能性がある。例えば、還元剤（例えば、グルタチオン）は、特に、分子内ジスルフィド結合を破壊し得る。したがって、本発明に使用するための抗酸化剤は、とりわけ、それ自体が製剤中のタンパク質に損傷を与える可能性を排除するか又はその可能性を十分に低減するように選択される。
本発明による製剤は、タンパク質の補因子であり、タンパク質配位化合物を形成するのに必要とされる金属イオンを含み得、例えば、ある特定のインスリン懸濁液を形成するのに必要とされる亜鉛を含み得る。金属イオンはまた、タンパク質を分解するいくつかのプロセスを阻害し得る。しかしながら、金属イオンはまた、タンパク質を分解する物理的及び化学的プロセスも触媒する。マグネシウムイオン（１０～１２０ｍＭ）を、アスパラギン酸のイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用し得る。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増大させ得る。しかしながら、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化させ得る。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化させ得、これは、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２によって不安定化させ得、その凝集が、Ａｌ＋３イオンによって増大する可能性がある。
本発明の製剤の抗原結合分子の実施形態は、１種又は複数種の保存剤をさらに含む。保存剤は、同じコンテナからの２回以上の取り出しを伴う複数回用量の非経口製剤を開発する際に必要となる。その主な機能は、製剤の貯蔵寿命又は使用期間にわたって微生物の増殖を阻害し、製品の無菌性を確保することである。一般に使用される保存剤としては、ベンジルアルコール、フェノール、及びｍ－クレゾールが挙げられる。保存剤は、低分子の非経口薬との使用において長い歴史を有するが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は、困難であり得る。保存剤は、ほぼ常にタンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有しており、これが複数回用量のタンパク質製剤における使用を制限する主要な要因となっている。現在に至るまで、ほとんどのタンパク質薬は、単回使用用としてのみ製剤化されている。しかしながら、複数回用量製剤が可能である場合、患者の利便性及び高い市場性を実現するという利点が加わる。保存処理された製剤の開発により、より便利な複数回使用の注射ペンの提案が製品化に至ったヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、その良い例である。ｈＧＨの保存処理された製剤を含有するそのようなペンデバイスは、少なくとも４つが現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥－デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）は、フェノールを含有する一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ－クレゾールにより製剤化されている。保存処理された剤形の製剤化及び開発中、いくつかの態様を考慮する必要がある。薬物製品中における有効保存剤濃度が最適化されていなければならない。これには、タンパク質安定性を損なうことなく抗微生物有効性を付与する濃度範囲に関して、剤形における所与の保存剤を試験する必要がある。
予想されるとおり、保存剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。凍結乾燥製品は、保存剤なしで凍結乾燥され、使用時に保存剤を含有する希釈剤で再構成され得る。これにより、保存剤がタンパク質と接触する時間が短縮され、付随する安定性のリスクが大幅に最小化される。液体製剤の場合、保存剤の有効性及び安定性は、製品有効期間全体（約１８～２４か月）にわたって維持されるべきである。注意すべき重要な点として、保存剤の有効性は、活性薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終製剤において実証されるべきである。
本明細書で開示されている抗原結合分子は、免疫リポソームとしても製剤化され得る。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物送達に有用である様々な種類の脂質、リン脂質、及び／又は界面活性剤から構成される小さい小胞である。リポソームの成分は一般に、生体膜の脂質の配置と同様に、二層構造で配置される。抗原結合分子を含有するリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び同第４，５４４，５４５号明細書；並びに国際公開第９７／３８７３１号パンフレットで説明されている、当技術分野で知られる方法によって調製される。循環時間が長くなったリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号明細書で開示されている。特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法によって作製し得る。所望の直径を有するリポソームを得るために、リポソームを、所定の孔径のフィルターを通して押し出す。本発明の抗原結合分子のＦａｂ’断片を、ジスルフィド交換反応により、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６－２８８（１９８２）で説明されているリポソームにコンジュゲートさせ得る。任意選択的に、化学療法剤がリポソーム内に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。
医薬組成物を製剤化した後、これを、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として、又は脱水粉末若しくは凍結乾燥粉末として、無菌バイアル中に保存してもよい。そのような製剤は、即時使用が可能な形態、又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥品）で保存され得る。
本明細書で定義される医薬組成物の生物活性を、例えば、下記の実施例、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット、又はＳｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１－１２）で説明されている細胞傷害アッセイによって決定し得る。本明細書で使用される場合、「有効性」又は「インビボ有効性」は、例えば、標準化されたＮＣＩの反応基準を用いた、本発明の医薬組成物による療法に対する反応を指す。本発明の医薬組成物を用いる療法の成功又はインビボ有効性は、その意図された目的、即ち、組成物がその所望の効果、即ち、病的細胞（例えば腫瘍細胞）の枯渇を引き起こす能力に関する組成物の有効性を指す。インビボ有効性を、白血球の計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺を含むが、これらに限定されない、それぞれの疾患実体についての確立された標準的方法によってモニタリングし得る。加えて、様々な疾患特異的臨床化学パラメーター及び他の確立された標準的方法を使用し得る。さらに、コンピューター断層撮影法、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影法（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの基準に基づく反応評価［Ｃｈｅｓｏｎ ＢＤ，Ｈｏｒｎｉｎｇ ＳＪ，Ｃｏｉｆｆｉｅｒ Ｂ，Ｓｈｉｐｐ ＭＡ，Ｆｉｓｈｅｒ ＲＩ，Ｃｏｎｎｏｒｓ ＪＭ，Ｌｉｓｔｅｒ ＴＡ，Ｖｏｓｅ Ｊ，Ｇｒｉｌｌｏ－Ｌｏｐｅｚ Ａ，Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ Ａ，Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ Ｆ，Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ Ｄ，Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ Ｗ，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ ＮＬ，Ａｒｍｉｔａｇｅ ＪＯ，Ｃａｒｔｅｒ Ｗ，Ｈｏｐｐｅ Ｒ，Ｃａｎｅｌｌｏｓ ＧＰ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｔｏ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＮＣＩ Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９９ Ａｐｒ；１７（４）：１２４４］）、ポジトロン放出断層走査、白血球の計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺、リンパ節生検／組織学、及び様々なリンパ腫に特異的な臨床化学パラメーター（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）、並びに他の確立された標準的方法が使用され得る。
本発明の医薬組成物等の薬物の開発におけるもう１つの主な課題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的のために、候補薬物の薬物動態プロファイル、即ち、特定の薬物が所与の病態を処置する能力に影響する薬物動態パラメーターのプロファイルが、確立され得る。ある種の疾病を処置するための薬物の能力に影響する薬物の薬物動態パラメーターは、半減期、分布容積、肝臓の初回通過代謝、及び血清結合の程度が挙げられるが、これらに限定されない。所与の薬剤の有効性は、上述の各パラメーターによって影響され得る。特定のＦＣ様式により提供される本発明の抗原結合分子の想定される特徴は、それらが例えば薬物動態挙動において相違を含むことである。本発明に係る半減期が延長した標的化抗原結合分子は、好ましくは、前記抗原結合分子の「カノニカル」な非ＨＬＥバージョンと比較して、インビボで驚くほど増加した滞留時間を示す。
「半減期」は、投与された薬物の５０％が生物学的過程、例えば、代謝、排泄等を通じて排出される時間を意味する。「肝臓の初回通過代謝」は、肝臓との初回接触時、即ち、肝臓を最初に通過する間に代謝される薬物の傾向を意味する。「分布容積」は、例えば、細胞内及び細胞外空間、組織及び臓器等のような、身体の様々な区画にわたる薬物の保持度、並びにこれらの区画内での薬物の分布を意味する。「血清結合の程度」は、薬物がアルブミン等の血清タンパク質と相互作用して結合し、薬物の生物活性の低減又は消失をもたらす傾向を意味する。
薬物動態パラメーターはまた、投与される所与量の薬物についてのバイオアベイラビリティ、ラグタイム（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、より多くの作用発現、及び／又はＣｍａｘも含む。「バイオアベイラビリティ」は、血液コンパートメント中の薬物の量を意味する。「ラグタイム」は、薬物の投与から、血液又は血漿中での薬物の検出及び測定が可能になるまでの遅延時間を意味する。「Ｔｍａｘ」は、その後に薬物の最高血中濃度に到達する時間であり、「Ｃｍａｘ」は、所与の薬物によって得られる最高血中濃度である。薬物が生物学的効果に必要とされる血中濃度又は組織濃度に達するまでの時間は、全てのパラメーターに影響される。先に概説されるとおりのチンパンジーではない霊長類における前臨床動物試験において決定され得る種間特異性を示す二重特異性抗原結合分子の薬物動態パラメーターは、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１－１２）にも記載されている。
本発明の好ましい態様では、医薬組成物は、約－２０℃で少なくとも４週間安定である。付属の実施例から明らかなとおり、対応する最先端の抗原結合分子の品質に対する本発明の抗原結合分子の品質を、異なる系を使用して試験し得る。これらの試験は、「ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｑ５Ｃ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｑ６Ｂ」に準拠するものであることが理解され、それにより、その産物の同一性、純度、及び能力の変化の確実な検出をもたらす安定性指標プロファイルを提供するように選択される。純度という用語は、相対的な用語であることが十分に受け入れられている。グリコシル化、脱アミド、又は他の異種性の影響に起因して、生物工学的／生物学的産物の絶対的な純度は、典型的には、複数の方法によって評価されるべきであり、得られる純度の値は、方法依存的である。安定性試験の目的のために、純度の試験は、分解産物の決定方法に合わせるべきである。
本発明の抗原結合分子を含む医薬組成物の品質の評価のために、例えば溶液中の可溶性凝集物の含有量（サイズ排除によるＨＭＷＳ）を分析することによって分析され得る。約－２０℃での少なくとも４週間の安定性は、１．５％ＨＭＷＳ未満、好ましくは１％ＨＭＷＳ未満の含有量によって特徴付けられることが好ましい。
医薬組成物としての抗原結合分子のための好ましい製剤は、例えば、下記のとおりの製剤の成分を含み得る：
・ 製剤：
ｐＨ６．０のリン酸カリウム、Ｌ－アルギニン塩酸塩、トレハロース二水和物、ポリソルベート８０。
医薬組成物の形態の本発明の抗原結合分子の安定性の評価の他の例は、付属の実施例４～１２で提供される。これらの実施例において、本発明の抗原結合分子の実施形態は、異なる医薬製剤において異なるストレス条件に関して試験され、その結果が、当技術分野で知られる他の半減期延長（ＨＬＥ）形式の二重特異性Ｔ細胞エンゲージ抗原結合分子と比較される。一般に、本発明に係る特定のＦＣ様式で提供される抗原結合分子は、典型的には、異なるＨＬＥ形式で提供される抗原結合分子及びいかなるＨＬＥ形式も有しない抗原結合分子（例えば、「カノニカル」な抗原結合分子）の両方と比較して、温度及び光ストレス等の広範囲のストレス条件に対してより安定であることが想定される。前述の温度安定性は、低温（凍結温度を含む室温未満）及び高温（体温までの又は体温を超える温度を含む室温超）の両方に関連し得る。当業者が認めるとおり、診療において避けるのが困難なストレスに対するそのような安定性の向上により、診療において生じる分解産物がより少なくなるため、抗原結合分子がより安全になる。結果として、前述の安定性の向上は、安全性の向上を意味する。
一実施形態は、前立腺癌等のＣＤ２０及びＣＤ２２発現又はＣＤ２０及びＣＤ２２過剰発現と関連する癌の予防、処置、又は改善における使用のための本発明の抗原結合分子又は本発明のプロセスに従って生成される抗原結合分子を提供する。
本明細書で説明されている製剤は、それを必要とする患者において、本明細書で説明されている病的な医学的状態を治療する、改善する及び／又は予防する医薬組成物として有用である。用語「処置」は、治療的処置及び予防的又は抑止的手段の両方を指す。処置は、疾患、疾患の症状、又は疾患素因を治癒する、治す、軽減する、緩和する、変化させる、矯正する、改善する、好転させる又は影響を与えることを目的とした、疾患／障害、疾患／障害の症状、又は疾患／障害の素因を有する患者の身体、単離された組織又は細胞に対する製剤の適用又は投与を含む。
本明細書で使用される場合、用語「改善」は、本発明に係る抗原結合分子のそれを必要とする対象への投与による、本明細書の下記に示す疾患を有する患者の疾患状態のあらゆる好転を指す。そのような好転は、患者の疾患の進行の緩徐化又は停止として見られる場合もある。本明細書で使用される場合、用語「予防」は、本発明に係る抗原結合分子を、それを必要とする対象に投与することによる、本明細書の下記に示す腫瘍若しくは癌又は転移性癌を有する患者の発症又は再発の回避を意味する。
用語「疾患」は、本明細書で説明されている抗原結合分子又は医薬組成物による処置から恩恵を受けることになる任意の状態を指す。これには、哺乳類において問題の疾患の素因になる病理学的状態を含む慢性及び急性の障害又は疾患が含まれる。
「新生物」は、組織の異常な増殖であり、必ずしもそうとは限らないが通常は腫瘤を形成する。また、腫瘤を形成する場合、これは、一般に「腫瘍」と呼ばれる。新生物又は腫瘍は、良性、潜在性悪性（前癌性）、又は悪性であり得る。悪性新生物は、一般に癌と呼ばれる。これは通常、周囲の組織に侵入してそれを破壊し、転移を形成し得、即ち、これは、身体の他の部分、組織、又は臓器に広がる。したがって、用語「転移性癌」は、原発腫瘍のもの以外の他の組織又は臓器への転移を包含する。リンパ腫及び白血病は、リンパ系新生物である。本発明の目的において、これらはまた、用語「腫瘍」又は「癌」にも包含される。
用語「ウイルス性疾患」は、対象のウイルス感染の結果である疾患を表す。
本明細書で使用される場合、用語「免疫障害」は、この用語の一般的な定義に沿って自己免疫疾患、過敏症、免疫不全等の免疫障害を表す。
一実施形態では、本発明は、ＣＤ２０及びＣＤ２２の発現又はＣＤ２０及びＣＤ２２の過剰発現と関連する癌の処置又は改善のための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の抗原結合分子、又は本発明の方法に従って作製される抗原結合分子を投与する工程を含む方法を提供する。ＣＤ２０及びＣＤ２２×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体は、癌、好ましくは固形腫瘍、より好ましくは癌腫及び前立腺癌の治療に関して特に有利である。
用語「必要とする対象」又は「処置を必要とする」対象は、既にその障害を有する対象、及びその障害を予防しようとする対象を含む。必要とする対象又は「患者」は、予防的処置又は治療的処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。
本発明の抗原結合分子は一般に、とりわけバイオアベイラビリティ及び持続性の範囲において、特定の投与経路及び投与方法、特定の投与量及び投与頻度、特定の疾患の特定の処置のために設計されることになる。組成物の材料は、好ましくは、投与部位に許容される濃度で製剤化される。
したがって、製剤及び組成物は、本発明に従って任意の好適な投与経路による送達のために設計され得る。本発明との関連において、投与経路として下記が挙げられるが、これらに限定されない：
・ 局所経路（例えば、皮膚上、吸入、鼻、眼、耳介／耳、膣、粘膜）；
・ 腸経路（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、頬側、直腸）；及び
・ 非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）。
本発明の医薬組成物及び抗原結合分子は、例えば、ボーラス注射等の注射による、又は持続注入等の注入による、非経口投与、例えば、皮下又は静脈内送達に特に有用である。医薬組成物は、医療デバイスを使用して投与され得る。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例が、米国特許第４，４７５，１９６号明細書；同第４，４３９，１９６号明細書；同第４，４４７，２２４号明細書；同第４，４４７，２３３号明細書；同第４，４８６，１９４号明細書；同第４，４８７，６０３号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；及び同第５，３９９，１６３号明細書で説明されている。
特に、本発明は、好適な組成物の中断のない投与を実現する。非限定的な例として、中断のない又は実質的に中断のない、即ち連続投与は、患者体内への治療薬の流入を調整するための、患者が装着した小型ポンプシステムによって実現され得る。本発明の抗原結合分子を含む医薬組成物を、前記ポンプシステムを使用することによって投与し得る。そのようなポンプシステムは一般に当技術分野で知られており、通常は注入する治療薬を含有するカートリッジの定期交換に依拠する。そのようなポンプシステムでカートリッジを交換する際、交換時以外には中断しない患者体内への治療薬の流入に一時的な中断が結果として生じる場合がある。そのような場合であっても、カートリッジ交換前の投与段階とカートリッジ交換後の投与段階はなお、共にそのような治療薬の「中断のない投与」を構成する本発明の医薬的手段及び方法の意味の範囲内とみなされるであろう。
本発明の抗原結合分子の連続投与又は中断のない投与は、流体をリザーバから送り出すための流体送出機構及びこの送出機構を駆動するための駆動機構を含む流体送達デバイス又は小型ポンプシステムによる静脈内又は皮下投与であり得る。皮下投与用のポンプシステムは、患者の皮膚に穿通し、好適な組成物を患者体内に送達するための針又はカニューレを含み得る。前記ポンプシステムを、静脈、動脈、又は血管を問わず、患者の皮膚に直接固定するか又は装着することで、ポンプシステムと患者の皮膚とを直接接触させることが可能になる。このポンプシステムを、患者の皮膚に２４時間から数日間装着させ得る。リザーバの容積が小さい小型のポンプシステムの場合もある。非限定的な例として、投与される好適な医薬組成物のためのリザーバの容積は、０．１～５０ｍｌであり得る。
連続投与はまた、皮膚に装着されて時折交換されるパッチによって経皮的でもあり得る。当業者は、この目的に好適な薬物送達のためのパッチシステムを認識している。経皮投与は、例えば第１の使用済みパッチのすぐ隣の皮膚表面に、第１の使用済みパッチを除去する直前に、新しい第２のパッチを装着すると同時に第１の使用済みパッチの交換を完了できる有利さがあることから、中断のない投与に特に適していることに注目されたい。流入の中断又は電池故障の問題は、生じない。
医薬組成物が凍結乾燥されている場合、まず凍結乾燥材料を投与前に適切な液体で再構成する。この凍結乾燥材料を、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、又は凍結乾燥前にタンパク質が存在した同じ製剤中で再構成し得る。
本発明の組成物を、例えば、本明細書で説明されている種間特異性を示す本発明の抗原結合分子をチンパンジーではない霊長類、例えばマカクに用量を増加させながら投与することによる用量漸増試験によって決定し得る好適な用量で、対象に投与し得る。上述のとおり、本明細書で説明されている種間特異性を示す本発明の抗原結合分子には、チンパンジーではない霊長類の前臨床試験において同一の形態で使用し得、且つヒトにおける薬物として使用し得る利点がある。投与計画は、主治医が臨床的要因によって決定することになる。医学分野で公知のように、ある１人の患者に対する投与量は、その患者の体格、体表面積、年齢、投与される個々の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身健康状態、並びに同時に投与されている他の薬物を含む多くの要因に依存する。
用語「有効用量」又は「有効投与量」は、所望の効果を達成するか又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。用語「治療的に有効な用量」は、疾患に既に罹患している患者の疾患及びその合併症を治癒するか又は少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この用途に効果的な量又は用量は、処置される状態（適応症）、送達される抗原結合分子、治療の内容及び目的、疾患の重症度、前治療、患者の病歴及び治療剤に対する応答、投与経路、体格（体重、体表面積、若しくは臓器サイズ）、及び／又は患者の状態（年齢及び全身健康状態）、並びに患者自身の免疫系の全身状態に依存することになる。適当な用量を、１回の投与又は複数回にわたる投与で患者に投与し得るように、又は最適な治療効果を得るために、主治医の判断に従って調整し得る。
典型的な投与量は、上記の要因に応じて約０．１μｇ／ｋｇ～最大約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。特定の実施形態では、投与量は、１．０μｇ／ｋｇ～最大約２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に１０μｇ／ｋｇ～最大約１０ｍｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇ～最大約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
治療有効量の本発明の抗原結合分子は、好ましくは、疾患症状の重症度を低下させるか、疾患症状がない期間の頻度若しくは期間を増加させるか、又は疾患の苦痛に起因する機能障害若しくは能力障害を予防する。本明細書の上記で説明されているＣＤ２０及びＣＤ２２発現と相関する疾患を処置するために、本発明の抗原結合分子、ここでは、抗ＣＤ２０及びＣＤ２２／抗ＣＤ３抗原結合分子の治療的に有効な量は、好ましくは、非処置の患者と比較して、細胞成長又は腫瘍成長を少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力を、有効性を予測する動物モデルで評価し得る。
医薬組成物を、単一の治療として投与し得るか、又は必要に応じて抗癌療法等の追加の療法、例えば他のタンパク質性及び非タンパク質性薬物と組み合わせて投与し得る。これらの薬物を、本明細書で定義されている本発明の抗原結合分子を含む組成物と同時に投与し得るか、又は前記抗原結合分子の投与前若しくは投与後に既定の時間間隔及び用量で別々に投与し得る。
本明細書で使用される場合、用語「有効且つ非毒性用量」は、重大な毒性作用を生じさせずに又は本質的に生じさせずに、病的細胞の激減、腫瘍消失、腫瘍の縮退、又は疾患の安定化をもたらすのに十分に高い、本発明の抗原結合分子の耐容量を指す。そのような有効且つ非毒性用量を、例えば、当技術分野で説明されている用量漸増試験によって決定してもよく、この用量は、重篤な有害副事象を誘発する用量未満であるべきである（用量制限毒性、ＤＬＴ）。
本明細書で使用される場合、用語「毒性」は、有害事象又は重篤な有害事象として現れる薬物の毒性作用を指す。この副事象は、全身的な薬物耐容性の欠如、及び／又は投与後の局所的な耐容性の欠如を指す場合がある。毒性はまた、この薬物によって引き起こされる催奇性作用又は発癌性作用も含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「安全性」、「インビボ安全性」、又は「耐容性」は、投与直後に（局所耐容性）及びより長期の薬物適用期間の間に、重篤な有害事象を誘発しない薬物の投与を定義する。「安全性」、「インビボ安全性」、又は「耐容性」を、例えば、処置中、そして経過観察期間中に定期的に評価し得る。測定値は、臨床評価、例えば、臓器の所見、及び臨床検査値異常のスクリーニングを含む。臨床評価が実施され、ＮＣＩ－ＣＴＣ及び／又はＭｅｄＤＲＡ標準に従って、正常所見からの逸脱が記録され／コード化され得る。臓器の所見は、例えばＣｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に示される、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心不整脈、凝固等の基準を含み得る。試験され得る検査パラメーターは、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロファイル及び尿検査、並びに他の体液（例えば、血清、血漿、リンパ液又は脊髄液、髄液等）の検査を含む。したがって、安全性を、例えば、身体検査、画像化技術（即ち、超音波、ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、技術的デバイスを用いた他の計測（即ち、心電図）、バイタルサインにより、検査パラメーターを測定し、有害事象を記録することにより評価し得る。例えば、本発明に係る使用及び方法において、チンパンジーではない霊長類における有害事象を、組織病理学的方法及び／又は組織化学的方法により試験し得る。
上記の用語は、例えば、１９９７年７月１６日のＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓ６；ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；ＩＣＨ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｍｅｅｔｉｎｇでも参照されている。
最後に、本発明は、本発明の又は本発明のプロセスに従って生成される抗原結合分子、本発明の医薬組成物、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、及び／又は本発明の宿主細胞を含むキットを提供する。
本発明との関連において、用語「キット」は、２つ以上の構成要素がコンテナ、容器、又は他にまとめて梱包されており、構成要素の１つが本発明の抗原結合分子、医薬組成物、ベクター、又は宿主細胞に対応するものを意味する。したがって、キットを、単品として販売し得えるある特定の目的を達成するのに十分な製品及び／又は用具の一式であると説明し得る。
キットは、投与に適した投与量（上記を参照されたい）の本発明の抗原結合分子又は医薬組成物を含有する任意の適切な形状、サイズ、及び材質（好ましくは防水性、例えばプラスチック又はガラス）の１つ又は複数の容器（例えば、バイアル、アンプル、コンテナ、シリンジ、ボトル、バッグ）を含み得る。キットはさらに、（例えば、リーフレット又は取扱説明書の形態の）使用のための指示書、本発明の抗原結合分子を投与するための手段、例えばシリンジ、ポンプ、インフューザー等、本発明の抗原結合分子を再構成するための手段、及び／又は本発明の抗原結合分子を希釈するための手段を含み得る。
本発明はまた、単回用量投与単位のためのキットも提供する。本発明のキットはまた、乾燥／凍結乾燥された抗原結合分子を含む第１の容器、及び水性製剤を含む第２の容器を含み得る。本発明のある特定の実施形態では、単一チャンバー及び多チャンバー式充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジ及び溶解シリンジ）を含むキットが提供される。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「試薬」に対する参照は、１種又は複数種のそのような種々の試薬を含み、「方法」に対する参照は、本明細書で説明されている方法のために改変され得るか又は本明細書で説明されている方法と置換され得る、当業者に既知の均等な工程及び方法に対する参照を含む。
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のあらゆる要素を指すと理解すべきである。当業者であれば、単なる通例的な実験により、本明細書で説明されている本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか又は確認し得るであろう。そのような均等物は、本発明に包含されることが意図されている。
用語「及び／又は」は、本明細書のいずれの箇所で使用される場合でも、「及び」、「又は」、及び「前記用語によって接続される要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書で使用される場合、用語「約」又は「およそ」は、所与の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。ただし、この用語は、具体的な数字も含み、例えば、約２０は、２０を含む。
用語「～未満」又は「～より大きい」は、具体的な数字を含む。例えば、２０未満は、それ未満又はそれに等しいことを意味する。同様に、～を超える又は～より大きいは、それぞれ～を超える若しくはそれに等しい、又は～より大きい若しくはそれに等しいことを意味する。
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体において、文脈上他の意味が要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる」等のバリエーションは、述べられる整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を含むことを意味するが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を除外することを意味するものではないことを理解されたい。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を、用語「含有する」若しくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、又は本明細書で使用される場合は時として用語「有する」とも置き換え得る。
本明細書で使用される場合、「～からなる」は、請求項の要素で特定されていないあらゆる要素、工程、又は成分を除外する。本明細書で使用される場合、「～から本質的になる」は、請求項の基本的及び新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外しない。
本明細書では、各場合において、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれかに置き換えられてもよい。
本発明は、本明細書で説明されている特定の方法論、プロトコル、材料、試薬、及び物質等に限定されず、そのようなものとして変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するように意図されておらず、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。
本明細書の本文全体において引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書等を含む）は、上記であっても又は下記であっても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先発明によってそのような開示に先行する権利を有しないことを承認するものとして解釈すべきではない。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するか又は一致しない限り、本明細書は、いかなるそのような資料よりも優先される。
本発明及びその利点のより適切な理解が下記の実施例から得られ、本実施例は、例示目的でのみ提供される。本実施例は、決して本発明の範囲を限定するように意図されていない。
実施例１：生産性及び生成物均一性の評価
２段階高速タンパク質液体クロマトグラフィーによるタンパク質精製
Ｕｎｉｃｏｒｎ（登録商標）７．３ソフトウェアで制御されたＡｅｋｔａ純精製システム（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、製造業者の仕様書に従って、アフィニティ捕捉及びサイズ排除クロマトグラフィーに使用した。
アフィニティ捕捉（ＡＣ）クロマトグラフィーによるタンパク質単離
Ｃ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子の捕捉を、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（登録商標）（５ｍｌカラム容量（ＣＶ）；Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）プロテインＡアフィニティ媒体を使用して実施した。このカラムを、２ＣＶ リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まない；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で平衡化し、タンパク質含有細胞培養上清を、６ｍｌ／分の流速で、このカラムにアプライした。タンパク質溶出の前に、このカラムを、ＰＢＳと、０．５Ｍ Ｌ－アルギニン、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５（それぞれ１０ＣＶ）で順次洗浄して、未結合の宿主細胞タンパク質、又は結合が弱い宿主細胞タンパク質を除去した。結合したタンパク質を、２ｍｌ／分の流速での３ＣＶのプロテインＡ ＩｇＧ溶出緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ クエン酸、ｐＨ３．０）のアプライにより溶出させ、溶出液 ６ｍｌを、付属の試料ループに集めた。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるタンパク質単量体の単離
ＡＣに続いて、タンパク質を、試料ループから、１．５ＣＶの製剤緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭ クエン酸、７５ｍｌ リジンＨＣｌ、ｐＨ７．０）で予め平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓ２００ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ＳＥＣカラム（３２０ｍｌ ＣＶ；Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。次いで、２．５ｍｌ／分の流速で１．５ＣＶの製剤緩衝液をアプライすることにより、ＨＭＷタンパク質種及びＬＭＷタンパク質種から単量体タンパク質を分離し、最後に画分コレクタに集めた。
単量体を含むそれぞれ集めた画分へのタンパク質安定化のために、トレハロースを添加して最終濃度を４％ トレハロースにした。さらに、Ａ２８０ｎｍ光吸収を使用してタンパク質濃度を決定し、単量体タンパク質が十分に濃縮されている画分をプールした。０．２５ｍｇ／ｍｌまで濃縮してろ過した後に、総タンパク質量に基づいて、純粋な単量体タンパク質の収量を算出した。単量体メインピークのＳＥＣピーク対称性は、半値最大ピーク高でソフトウェアＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）７．３ソフトウェアにより得られる。
Figure 2024518369000004
ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子の最終のタンパク質単量体収量及びＳＥＣ単量体ピーク対称性。収量を、精製、ろ過、及び０．２５ｍｇ／ｍｌまでの濃縮の後に、総タンパク質量に基づいて算出した。ＳＥＣピーク対称性を、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアで算出した。
結果
本発明に係る、選択されたＣＤ２０及びＣＤ２２二重標的化抗原結合分子は全て、ＣＤ２０ ９９－Ｅ５ ＣＣ×ＣＤ２２ ２８－Ｂ７ Ｎ６５Ｓ ＣＣ×Ｉ２Ｃ０×ｓｃＦｃと比べて、比較分子とは対照的に、最終収量に関して１０ｍｇ／Ｌを超える生産性を示す。また、本発明に係る分子は、好ましい閾値１．４よりも低い動的半径により、比較分子ＣＤ２０ ９９－Ｅ５ ＣＣ×ＣＤ２２ ２８－Ｂ７ Ｎ６５Ｓ ＣＣ×Ｉ２Ｃ０×ｓｃＦｃと比べて均一な構造も示す。これらの新規分子の対称性ピークは、低分子量生成物が少ないか又は折り畳み形態が少ないことを示唆しており、そのため、生成物均一性が改善されている。
実施例２ ＣＤ２０－ＣＤ２２標的化抗原結合分子表面の疎水性の評価
単離して製剤化されたＣＤ２０－ＣＤ２２結合Ｔ細胞エンゲージャー分子と、定義されたタンパク質濃度まで調整された単量体とを、オートサンプラーフィッティング試料バイアルに移し、Ａｅｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。疎水性相互作用クロマトグラフィーＨＩＣカラムを、製剤緩衝液で平衡化し、既定の体積のタンパク質溶液を、一定の製剤緩衝液流速でアプライした。検出を、ＯＤ２８０ｎｍの光吸収によって行なった。溶出挙動を、ピーク形状によって決定し、減衰するシグナルのピークの勾配をそれぞれ数学的に計算した。急勾配／高勾配値は、より平坦な溶出挙動及び低勾配値を有するコンストラクトと比較して、タンパク質表面の疎水性相互作用が小さいことを示す。
Figure 2024518369000005
表５から分かるように、本発明に係る分子に関して、１５超（典型的には２５超）のＨＥＣ溶出勾配を観察し得る。勾配が大きいほど疎水性が低くなり、そのため生産性及び安定性が良好となる。
ＣＤ２０ ＣＤ２２二重標的化抗原結合分子のインビトロでの親和性の評価
ＣＤ２０ ＣＤ２２二重標的化抗原結合分子の細胞に基づく親和性を、非線形回帰（一部位特異的結合）分析により決定した。ヒトＣＤ２０、カニクイザルＣＤ２０、ヒトＣＤ２２、又はカニクイザルＣＤ２２を発現するＣＨＯ細胞を、４℃で１６時間にわたり、ＣＤ２０ Ｃｄ２２二重標的化抗原結合分子の濃度を減少させつつ（最大８００ｎＭ、段階１：２又は１：３、１１段階）インキュベートした。結合したＣＤ２０ ＣＤ２２二重標的化抗原結合分子を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆａｂ断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で検出した。固定された細胞を、ＤＲＡＱ５、Ｆａｒ－Ｒｅｄ蛍光生細胞浸透性ＤＮＡ色素で染色し、シグナルを蛍光サイトメトリーによって検出した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアの一部位特異的結合評価ツールを用いて、それぞれの平衡解離定数（Ｋｄ）値を算出した。平均Ｋｄ値及び親和性ギャップを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで算出した。
Figure 2024518369000006
標的がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対するＣＤ２０ ＣＤ２２二重標的化抗原結合分子の細胞に基づく親和性を、非線形回帰（一部位特異的結合）分析によって決定した。平均Ｋｄ値を、３つの独立した測定値から算出した。親和性ギャップを、カニクイザルＫｄをヒトＫｄで除算することにより決定した。
結果
細胞に基づく親和性の測定から、ＣＤ２０ ＣＤ２２二重標的化抗原結合分子２～１６は、ＣＤ２０ ＣＤ２２二重標的化抗原結合分子１と比較して、ヒト又はカニクイザルＣＤ２０陽性ＣＨＯ細胞に対する細胞に基づく親和性が高く、且つＣＤ２２陽性ＣＨＯ細胞でのカニクイザル／ヒトギャップが小さいことが明らかになった。
未刺激のヒトＰＢＭＣによるＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ
エフェクター細胞の単離
輸血用血液を収集する血液バンクの副産物である濃縮リンパ球製剤（バフィーコート）からフィコール密度勾配遠心分離により、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製した。バフィーコートは末梢血バンクにより供給され、血液収集の同日にＰＢＭＣを調製した。フィコール密度遠心分離、及びダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）での徹底洗浄の後、残存赤血球を、ＰＢＭＣから赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、１００μＭ ＥＤＴＡ）とのインキュベーションを介して除去した。１００×ｇでＰＢＭＣを遠心すると、上清を介して血小板が除去された。残ったリンパ球は、主にＢ及びＴリンパ球、ＮＫ細胞、並びに単球を含む。１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）含有のＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中３７℃／５％ＣＯ２での培養下で、ＰＢＭＣを維持した。
ＣＤ１４＋、ＣＤ１５＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ３６＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ１２３＋、及びＣＤ２３５ａ＋の枯渇。
ＣＤ１４＋、ＣＤ１５＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ３６＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ１２３＋、及びＣＤ２３５ａ＋細胞の枯渇の場合には、ヒトＰａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，＃１３０－０９６－５３５）を使用した。ＰＢＭＣを計数し、３００×ｇで室温にて１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットをＭＡＣＳ単離緩衝液［８０μＬ／１０７個の細胞；ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２００１２－０４３）、０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、番号１０２７０－１０６）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｅ－６５１１）］に再懸濁した。ヒトＰａｎ Ｔ細胞単離キット（２０μＬ／１０７個の細胞）を添加し、４～８℃で１５分にわたりインキュベートした。細胞を、ＭＡＣＳ単離緩衝液（１～２ｍｌ／１０７個の細胞）で洗浄した。遠心分離（上記参照）後、上清を廃棄し、細胞をＭＡＣＳ単離緩衝液（５００μＬ／１０８細胞）に再懸濁した。次いで、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、及びＣＤ２３５ａ陰性細胞を、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，＃１３０－０４２－４０１）を使用して単離した。Ｐａｎ Ｔ細胞を、必要とされるまでインキュベーター内にて３７℃で、ＲＰＭＩ完全培地、即ち、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏ Ｗｅｓｔ、＃Ｓ０１１５）、１×非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、＃Ｋ０２９３）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、＃Ｌ１６１３）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、＃Ｌ０４７３）、及び１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、＃Ａ２２１３）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、＃ＦＧ１２１５）中で培養した。
標的細胞標識
フローサイトメトリーアッセイでの細胞溶解の分析のために、蛍光膜色素ＤｉＯＣ１８（ＤｉＯ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ｖ２２８８６）を使用して、ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２二重陽性ヒト細胞株Ｏｃｉ－Ｌｙ １、ヒトＣＤ２０単一陽性ヒト細胞株Ｏｃｉ－Ｌｙ １（ＣＤ２２ノックアウトクローン＃Ａ１）、及びＣＤ２２単一陽性ヒト細胞株Ｏｃｉ－Ｌｙ １（ＣＤ２０ノックアウトクローン＃Ａ５）を標的細胞として標識し、これらの細胞株をエフェクター細胞と区別させた。簡潔に説明すると、細胞を収集し、ＰＢＳで１回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び膜色素ＤｉＯ（５μＬ／１０６個の細胞）を含有するＰＢＳで１０６個の細胞／ｍＬに調整した。３７℃で３分間のインキュベーション後、細胞を完全ＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、細胞数を１．２５×１０５個の細胞／ｍＬに調整した。細胞の活力を、ＮＣ－２５０細胞カウンター（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して決定した。
フローサイトメトリーに基づく分析
このアッセイを、Ｏｃｉ－Ｌｙ １細胞の溶解をＣＤ２０及びＣＤ２２二重標的化抗原結合分子の段階希釈物の存在下で定量するように設計した。等容積のＤｉＯ標識標的細胞及びエフェクター細胞（即ちｐａｎＴ細胞）を混合し、１０：１のＥ：Ｔ細胞比を得た。この懸濁液 ８０μｌを、９６ウェルプレートの各ウェルに移した。ＣＤ２０及びＣＤ２２二重標的化抗原結合分子の段階希釈物 ２０μＬ、及び陰性対照（無関係の標的抗原を認識するＣＤ３に基づくＴ細胞エンゲージャー分子）又はさらなる陰性対照としてのＲＰＭＩ完全培地を添加した。７％ ＣＯ２の加湿インキュベーター内で、二重標的化抗原結合分子の細胞傷害性反応を４８時間進行させた。次に、細胞を新しい９６ウェルプレートに移し、標的細胞膜完全性の喪失を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を１μｇ／ｍＬの最終濃度で添加することによりモニタリングした。ＰＩは、通常は生細胞から排除される膜不透過性色素であるのに対し、死細胞は、それを取込み、蛍光発光により同定可能になる。
試料を、ｉＱｕｅ Ｐｌｕｓ機器でのフローサイトメトリーにより測定し、Ｆｏｒｅｃｙｔソフトウェア（共にＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）により解析した。標的細胞を、ＤｉＯ陽性細胞として同定した。ＰＩ陰性標的細胞を、生存標的細胞に分類した。細胞傷害性の百分率を、下記の式によって算出した。
Figure 2024518369000007
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を使用して、細胞傷害性の百分率を、対応するＣＤ２０及びＣＤ２２二重標的化抗原結合分子濃度に対してプロットした。固定ヒルスロープを有するシグモイド用量反応曲線の評価のための４パラメトリックロジスティック回帰モデルを用いて用量反応曲線を解析し、ＥＣ５０値を算出した。
Figure 2024518369000008
表７は、標的細胞としてのヒトＣＤ２０及びＣＤ２２二重陽性ヒト細胞株Ｏｃｉ－Ｌｙ １、ヒトＣＤ２０単一陽性ヒト細胞株Ｏｃｉ－Ｌｙ １（ＣＤ２２ノックアウトクローン＃Ａ１）、及びＣＤ２２単一陽性ヒト細胞株Ｏｃｉ－Ｌｙ １（ＣＤ２０ノックアウトクローン＃Ａ５）、並びにエフェクター細胞としてのｐａｎＴ（Ｅ：Ｔ比１０：１）によるＣＤ２０及びＣＤ２２二重標的化抗原結合分子の４８時間ＦＡＣＳベースの細胞傷害アッセイを示す。ＥＣ５０値を、固定ヒルスロープを有するシグモイド用量反応曲線の評価用の４パラメトリックロジスティック回帰モデルにより決定する。
ヒトＣＤ２０及びＣＤ２２二重陽性ヒトＯｃｉ－Ｌｙ １細胞による細胞傷害アッセイから、全ての結合体が、結合体ＣＤ２０ ９９－Ｅ５ ＣＣ×ＣＤ２２ ２８－Ｂ７ Ｎ６５Ｓ ＣＣ×Ｉ２Ｃ０×ｓｃＦｃ（Ｇ３Ｐ）と比べて１～２桁のｐＭ範囲で良好な生物活性を示すことが明らかとなった。
表８：配列表
下記の表は、抗原結合分子全体、並びにその断片及び／又は構成ブロックの配列を示す。それそれの配列の説明において、Ｉ２Ｃは、ＣＤ３エフェクター結合ドメインを表す。Ｉ２Ｅは、安定性が増加したＣＤ３エフェクター結合ドメインを表す。ＨＬＥは、半減期延長ドメインを表し、典型的にはｓｃＦｃドメインを表す。ｓｃＦｖは、機能的標的又はエフェクター結合ドメインを一緒に形成するＶＨ及びＶＬの組み合わせを表す。二重特異性分子は、機能的二重特異性抗原結合分子を一緒に形成する少なくとも１つの標的結合ドメイン及び１つのエフェクター結合ドメインの組み合わせを表す。標的は、典型的には２文字で省略される。
Figure 2024518369000009
Figure 2024518369000010
Figure 2024518369000011
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Figure 2024518369000052
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Figure 2024518369000056
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Figure 2024518369000059
Figure 2024518369000060
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Figure 2024518369000062
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Figure 2024518369000070
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Figure 2024518369000073
Figure 2024518369000074
Figure 2024518369000075

Claims (21)

  1. 少なくとも３つの結合ドメインを含むＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子であって、
    （ｉ．）第１の結合ドメインは、ＣＤ２０に免疫特異的に結合するパラトープを含み、前記第１の結合ドメインは、
    ａ）配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、
    ｂ）配列番号７１～７３のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号７４～７６のＣＤＲ Ｌ１～３、
    ｃ）配列番号８４～８６のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号８７～８９のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに
    ｄ）配列番号９７～９９のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１００～１０２のＣＤＲ Ｌ１～３
    から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含み、
    （ｉｉ．）第２の結合ドメインは、ＣＤ２２に免疫特異的に結合するパラトープを含み、前記第２の結合ドメインは、
    ａ）配列番号１３８～１４０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１４１～１４３のＣＤＲ Ｌ１～３、
    ｂ）配列番号１５１～１５３のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１５４～１５６のＣＤＲ Ｌ１～３、
    ｃ）配列番号１６４～１６６のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１６７～１６９のＣＤＲ Ｌ１～３、
    ｄ）配列番号１７７～１７９のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１８０～１８２のＣＤＲ Ｌ１～３、
    ｅ）配列番号１９０～１９２のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１９３～１９５のＣＤＲ Ｌ１～３、
    ｆ）配列番号２０３～２０５のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号２０６～２０８のＣＤＲ Ｌ１～３、
    ｇ）配列番号１２５～１２７のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１２８～１３０のＣＤＲ Ｌ１～３、
    ｈ）配列番号２１６～２１８のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号２１９～２２１のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに
    ｉ）配列番号３７９～３８１のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号３８２～３８４のＣＤＲ Ｌ１～３
    から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含み、
    （ｉｉｉ．）第３の結合ドメインは、ヒト及び／又はマカク（Ｍａｃａｃａ）ＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに免疫特異的に結合するパラトープを含み、
    前記第１、第２、及び第３の結合ドメインは、アミノからカルボキシルの順に配置されており、前記第１の結合ドメイン及び前記第２の結合ドメインは、５～２４個、好ましくは１８個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより連結されている、
    ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  2. 前記抗原結合分子は、第４のドメインを含み、前記第４のドメインは、２つのポリペプチド単量体であって、それぞれ、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド単量体を含み、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合しており、
    前記第４のドメインは、好ましくは、アミノからカルボキシルの順に、
    ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
    を含み、及び／又は、
    好ましくは、前記第４のドメイン中の前記ポリペプチド単量体のそれぞれは、配列番号１７～２４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有しており、好ましくは、前記ポリペプチド単量体のそれぞれは、配列番号１７～２４から選択されるアミノ酸配列を有しており、及び／又は、
    好ましくは、前記ＣＨ２ドメインは、ドメイン内システインジスルフィド架橋を含み、及び／又は、
    前記第１の、第２、第３、及び第４の結合ドメインは、アミノからカルボキシルの順に配置されている、
    請求項１に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  3. 前記抗原結合分子は、一本鎖抗原結合分子であり、好ましくは、ＣＤ２０及びＣＤ２２標的化ｓｃＦｖ抗原結合分子である、請求項１又は２に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  4. 前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとの間の前記ペプチドリンカーは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４個のアミノ酸、好ましくは、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のアミノ酸、より好ましくは、６個のアミノ酸の長さを有するものから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  5. 前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとの間の前記ペプチドリンカーは、Ｓ（Ｇ４Ｓ）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、Ｇ４ｎ、及びＧ５ｎ（ここで、ｎは、１、２、３、又は４に等しく、好ましくは、ｎは、１又は２に等しい）からなる群から選択され、より好ましくはＳＧ４Ｓから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  6. 前記第１の結合ドメイン及び前記第２の結合ドメインは、それぞれ、
    ａ）前記第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号１３８～１４０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１４１～１４３のＣＤＲ Ｌ１～３；
    ｂ）前記第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号１５１～１５３のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１５４～１５６のＣＤＲ Ｌ１～３；
    ｃ）前記第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号１６４～１６６のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１６７～１６９のＣＤＲ Ｌ１～３；
    ｄ）前記第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号１７７～１７９のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１８０～１８２のＣＤＲ Ｌ１～３；
    ｅ）前記第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号１９０～１９２のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１９３～１９５のＣＤＲ Ｌ１～３；
    ｆ）前記第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号２０３～２０５のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号２０６～２０８のＣＤＲ Ｌ１～３；
    ｇ）前記第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号１２５～１２７のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１２８～１３０のＣＤＲ Ｌ１～３；
    ｈ）前記第１の結合ドメインの配列番号５８～６０のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号６１～６３のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号２１６～２１８のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号２１９～２２１のＣＤＲ Ｌ１～３；
    ｉ）前記第１の結合ドメインの配列番号７１～７３のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号７４～７６のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号３７９～３８１のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号３８２～３８４のＣＤＲ Ｌ１～３；
    ｊ）前記第１の結合ドメインの配列番号７１～７３のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号７４～７６のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号２０３～２０５のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号２０６～２０８のＣＤＲ Ｌ１～３；
    ｋ）前記第１の結合ドメインの配列番号８４～８６のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号８７～８９のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号１６４～１６６のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１６７～１６９のＣＤＲ Ｌ１～３；
    ｌ）前記第１の結合ドメインの配列番号９７～９９のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１００～１０２のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号１７７～１７９のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１８０～１８２のＣＤＲ Ｌ１～３；
    ｍ）前記第１の結合ドメインの配列番号９７～９９のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１００～１０２のＣＤＲ Ｌ１～３、並びに前記第２の結合ドメインの配列番号１９０～１９２のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号１９３～１９５のＣＤＲ Ｌ１～３
    から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  7. 前記第１の結合ドメインは、ＣＤ２０に結合可能であり、前記第２の結合ドメインは、同時にＣＤ２２に結合可能であり、好ましくは、ＣＤ２０及びＣＤ２２は、同一の標的細胞上に存在している、
    請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  8. 前記第３の結合ドメインは、
    ａ）配列番号３９２～３９４のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号３９５～３９７のＣＤＲ Ｌ１～３；並びに
    ｂ）配列番号４０１～４０３のＣＤＲ Ｈ１～３、及び配列番号４０４～４０６のＣＤＲ Ｌ１～３
    から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、請求項１に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  9. 前記抗原結合分子は、アミノからカルボキシルの順に、
    （ａ）前記第１のドメイン；
    （ｂ）好ましくは、配列番号１～４及び９～１２からなる群から選択され、好ましくは配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    （ｃ）前記第２のドメイン、
    （ｄ）好ましくは、配列番号１～３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；並びに
    （ｅ）前記第３のドメイン
    を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  10. 前記抗原結合分子は、アミノからカルボキシルの順に、
    （ｆ）配列番号１、２、３、９、１０、１１、及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    （ｇ）前記第４のドメインの第１のポリペプチド単量体；
    （ｈ）配列番号５、６、７、及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；並びに
    （ｉ）前記第４のドメインの第２のポリペプチド単量体
    をさらに含む、請求項９に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  11. 前記第１の結合ドメインは、それぞれＶＨとしての配列番号６４及びＶＬとしての配列番号６５、ＶＨとしての配列番号７７及びＶＬとしての配列番号７８、ＶＨとしての配列番号９０及びＶＬとしての配列番号９１、ＶＨとしての配列番号１０３及びＶＬとしての配列番号１０４から選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、前記第２の結合ドメインは、それぞれＶＨとしての配列番号１４４及びＶＬとしての配列番号１４５、配列番号１５７及び１５８、配列番号１７２及び１７３、配列番号１８３及び１８４、配列番号１９６及び１９７、配列番号２０９及び２１０、配列番号１３１及び１３２、並びに配列番号３８５及び３８６から選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  12. 前記第１の結合ドメインは、配列番号６６、７９、９２、及び１０５からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列を含み、前記第２の結合ドメインは、配列番号１４６、１５９、１７２、１８５、１９８、２１１、１３３、２２４、及び３８７からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  13. 前記抗原結合分子は、第１（ＣＤ２０）及び第２（ＣＤ２２）の標的結合ドメインを、第３のエフェクター（ＣＤ３）結合ドメイン、及び半減期の延長を付与する第４のドメインと一緒に含み、互いに連結された前記３つの結合ドメイン及び前記第４のドメインは、配列番号２３８、２４８、２５８、２６８、２７８、２８８、３０８、３１８、３２８、３３８、３４８、３６８、及び３７８からなる群から選択される配列を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
  15. 請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  16. 請求項１４に記載のポリヌクレオチド又は請求項１５に記載のベクターで形質転換されたか又はトランスフェクトされた宿主細胞。
  17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子の生成のためのプロセスであって、請求項１６に記載の宿主細胞を、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗原結合分子の発現を可能にする条件下で培養すること、及び前記生成された抗原結合分子を培養物から回収することを含むプロセス。
  18. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子、又は請求項１７に記載のプロセスに従って生成されたＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子を含む医薬組成物であって、
    好ましくは、約－２０℃で少なくとも４週間にわたり安定である、
    医薬組成物。
  19. 増殖性疾患、腫瘍性疾患、癌、又は免疫障害から選択される疾患、好ましくは癌、より好ましくは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、及び結腸直腸癌（ＣＲＣ）の予防、処置、又は寛解における使用のための、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子、又は請求項１７に記載のプロセスに従って生成されたＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子。
  20. 増殖性疾患、腫瘍性疾患、癌、又は免疫障害の処置又は寛解の方法であって、それを必要とする対象に、請求項１に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子、又は請求項１７に記載のプロセスに従って生成されたＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子を投与するステップを含み、前記疾患は、好ましくは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、及び結腸直腸癌（ＣＲＣ）である、方法。
  21. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子、又は請求項１７に記載のプロセスに従って生成されたＣＤ２０及びＣＤ２２標的化抗原結合分子、請求項１４に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載のベクター、並びに／又は請求項１６に記載の宿主細胞を含むキット。
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