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JP2024517985A - 抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体及びその癌の予防または治療用バイオマーカー - Google Patents

抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体及びその癌の予防または治療用バイオマーカー Download PDF

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cancer
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monoclonal antibody
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イ、スイン
キム、ハヌル
ギ イム、チャン
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Centricsbio Inc
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Abstract

本発明は、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体及びその癌の予防または治療用用途に関する。本発明による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体は、ＣＤ３００ｃ抗原に高い特異性を有して結合するだけでなく、抗癌免疫作用を促進させることにより多様な癌の成長、発達、転移などに効果的に使用できることが期待される。【選択図】図１７

Description

本発明は、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片、及びそれを含む癌の予防または治療用バイオマーカー、組成物、方法及びキットに関する。
癌は、現代人の死亡原因において最大の比重を占めている疾患の一つで、様々な原因によって発生した遺伝子の突然変異により正常細胞が変化して発生した疾病であり、正常な細胞の分化、増殖、成長形態などに従わない腫瘍中、悪性であることを指す。癌とは、「制御されない細胞成長」を特徴とし、このような異常な細胞成長により腫瘍（ｔｕｍｏｒ）と呼ばれる細胞塊が形成され、周囲の組織に浸透し、ひどい場合には、身体の他の器官に転移することもある。癌は、手術、放射線及び薬物療法などで治療しても多くの場合に根本的な治癒にならず、患者に苦痛を与え、究極的には死に至る難治性慢性疾患である。特に、最近では老年人口の増加、環境悪化などにより世界の癌発生率は毎年５％以上増加している傾向であり、ＷＨＯ報告書によると、今後２５年内の癌発生人口は３千万人に増加し、そのうち、２千万人の人口は癌で死亡すると推定されている。
癌の薬物治療、即ち、抗癌剤は、一般に細胞毒性を有している化合物として癌細胞を攻撃して死滅させる方式で癌を治療するが、癌細胞だけでなく正常細胞にも損傷を与えるため、高い副作用を示す。したがって、副作用を減少させるために標的抗癌剤が開発された。しかし、このような標的抗癌剤の場合には副作用は低下させたが、高い確率で耐性が生じるという限界点を示した。したがって、近年、体内の免疫体系を利用して毒性及び耐性による問題点を減少させる免疫抗癌剤に関する関心が急増している傾向である。このような免疫抗癌剤の一例として癌細胞表面のＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、Ｔ細胞のＰＤ－１との結合を抑制してＴ細胞を活性化させ、癌細胞を攻撃させる免疫関門抑制剤が開発されている。しかし、このような免疫関門抑制剤の場合にも効果を奏する癌の種類が多様でないため、多様な癌で同様に治療効果を奏する新たな抗炎免疫治療剤の開発が切実に必要な実情である。
韓国公開特許１０－２０１８－００９９５５７
本発明は、上述の問題点を全て解決することをその目的とする。
本発明は、癌の予防または治療のための抗－ＣＤ３００ｃ抗体を提供することを一つの目的とする。
本発明は、抗－ＣＤ３００ｃ抗体を利用した抗癌療法を提供することを他の目的とする。
本発明は、癌の予防または治療のための抗－ＣＤ３００ｃ抗体を利用した療法のための薬学組成物を提供することをもう一つの目的とする。
本発明は、抗－ＣＤ３００ｃ抗体を利用した癌の予防または治療方法を提供することをもう一つの目的とする。
本発明は、癌の予防または治療のための抗－ＣＤ３００ｃ抗体を利用した療法のためのキットを提供することをもう一つの目的とする。
本発明の目的は、以上に言及した目的に制限されない。本発明の目的は、以下の説明でより明らかになり、特許請求の範囲に記載された手段及びその組み合わせで実現されるものである。
前記目的を達成するための本発明の代表的な構成は、次の通りである。
本発明の一様態によると、ＣＤ３００ｃに特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）またはその抗原結合断片が提供される。
本発明の他の様態によると、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片及びその癌の予防または治療用用途が提供される。
本発明のもう一つの様態によると、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の癌の予防または治療用薬剤製造のための用途が提供される。
本発明のもう一つの様態によると、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む抗癌療法が提供される。
本発明のもう一つの様態によると、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防または治療のための薬学組成物が提供される。
本発明のもう一つの様態によると、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を癌の予防または治療が必要な対象体に投与する段階を含む癌の予防または治療方法が提供される。
本発明のもう一つの様態によると、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を有効量で含む組成物、及び前記抗体またはその抗原結合断片の使用を指示する指示書を含む、癌の予防または治療用キットが提供される。
本発明による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体は、多様な癌の表面で発現するＣＤ３００ｃに特異的に高い結合力で結合することにより、Ｔ細胞を活性化させると同時にＭ１マクロファージへの分化を促進させるため、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができ、多様な癌の免疫治療剤として効果的に使用することができる。また、本発明による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体は、既存の免疫抗癌剤との併用投与を通じてその治療効果をさらに増加させるだけでなく、種間交差反応性（ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を有しているため、多様な哺乳類に幅広く適用することができる。また、アポトーシスに抵抗する能力を示す抵抗性癌細胞に本発明の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理する場合、癌細胞の抵抗性を顕著に弱化させて癌再発の防止にも優れた効能を示すと期待される。また、一般に、癌細胞は、前炎症性サイトカインであるＩＬ－２の生成を阻害することにより免疫系を回避するが、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体は、このような癌細胞により遮断されたＩＬ－２の生産量を回復させることにより、活性化した免疫系を通じて癌細胞死滅を誘導させることが確認され、より根本的な免疫抗癌剤として活用できると期待される。
本発明による２５種の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体それぞれの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列（核酸及びアミノ酸配列）を示す。それぞれの図面において、ＣＤＲ部位（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は順に表示した。 本発明の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体及び／又はＣＤ３００ｃ ｓｉＲＮＡが抗癌効果を奏する機序を簡略に示した概略図である。 本発明の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がそれぞれ単球、Ｔ細胞、癌細胞に作用する機序を簡略に示した概略図である。 実施例１．４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の非還元条件におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。 実施例１．４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の還元条件におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。 実験例１．１による正常細胞、免疫細胞、及び癌細胞株でＣＤ３００ｃの発現を比較した結果を示す。 実験例１．２による癌組織でＣＤ３００ｃが発現することを確認した結果を示す。 実験例１．２による免疫細胞でＣＤ３００ｃが発現することを確認した結果を示す。 実験例１．３による扁桃組織でＣＤ３００ｃが発現することを確認した結果を示す。 実験例１．３による癌組織でＣＤ３００ｃが発現することを確認した結果を示す。 実験例２．１による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体のＣＤ３００ｃ抗原に対する結合力を確認した結果を示す。 実験例２．２のＦＡＣＳ結合の結果によるＳ字状曲線を示す。 実験例２．３による結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。 実験例２．４による表面プラズモン共鳴の結果を示す。 実験例２．５による結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。 実験例２．６による結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。 実験例２．７に関連してＣＤ３００ｃ発現量による多様な癌患者における全生存期間の比較結果を示す。 実験例３．１による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体のＴ細胞活性化を通じた抗癌効果を確認した結果を示す。 実験例３．２による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＭ１マクロファージへの分化に及ぼす影響を確認した結果を示す。 実験例３．３によるＭ１マクロファージへの分化に対する抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の濃度依存的効果を確認した結果を示す。 実験例３．４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＭ１マクロファージへの分化に及ぼす影響を確認した結果を示す。 実験例３．５による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がヒト単球細胞のＭ１マクロファージへの分化を促進させるかを再確認した結果を示す。 実験例３．６による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＭ２マクロファージをＭ１マクロファージに再分化させるかを確認した結果を示す。 実験例３．７による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体のＭ１マクロファージへの分化能及び再分化能を確認した結果を示す。 実験例４．１によるＣＤ３００ｃを標的とするモノクローナル抗体が癌細胞の成長に及ぼす影響を確認した結果を示す。 実験例４．１によるＣＤ３００ｃを標的とするモノクローナル抗体が癌細胞の成長に及ぼす影響を確認した結果を示す。 実験例４．２による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の濃度による癌細胞の成長抑制効果を確認した結果を示す。 実験例４．３による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がマウスマクロファージからＭ１マクロファージへの分化能を促進させるかを確認した結果を示す。 実験例４．４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が抗癌効果を奏するかを確認した結果を示す。 実験例５．１による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤のＭ１マクロファージ分化能を比較した結果を示す。 実験例５．１による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤のＭ１マクロファージ分化能を比較した結果を示す。 実験例５．１による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤のＭ１マクロファージ分化能を比較した結果を示す。 実験例５．１による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤のＭ１マクロファージ分化能を比較した結果を示す。 実験例５．２による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤との間のＭ０マクロファージのＭ１マクロファージへの分化能を比較した結果を示す。 実験例５．３による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤との間のＭ１マクロファージへの分化能を比較した結果を示す。 実験例５．４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤との間の癌細胞の成長抑制効果を比較した結果を示す。 実験例５．４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤との間の癌細胞の成長抑制効果を比較した結果を示す。 実験例６．１による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が腫瘍関連のマクロファージに及ぼす影響をインビボ条件で確認した結果を示す。 実験例６．２による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＣＤ８＋ Ｔ細胞に及ぼす影響をインビボ条件で確認した結果を示す。 実験例６．３による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が腫瘍特異的な方式でＣＤ８＋ Ｔ細胞数を増加させるかを確認した結果を示す。 実験例６．４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性増加に及ぼす影響をインビボ条件で確認した結果を示す。 実験例６．５による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が調節Ｔ細胞に比べて細胞毒性Ｔ細胞の増加に及ぼす影響をインビボ条件で確認した結果を示す。 実験例６．６による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が細胞毒性Ｔ細胞、調節Ｔ細胞及び腫瘍関連のマクロファージに対して及ぼす影響を確認した結果を示す。 実験例６．７による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の抗癌効果をインビボ条件で確認した結果を示す。 実施例２．１により固形癌モデルにＣＬ７を処理した場合に得られたナノストリング免疫プロファイリング（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）の結果を示す。 実施例２．１により固形癌モデルにＣＬ７を処理した場合に得られた多様な免疫細胞及び腫瘍微細環境関連マーカーの発現変化を示す。＊表示はＣＬ７を処理する前と比較して発現水準が統計的に有意に変化したマーカーを意味する。 実施例２．２による実施例２．１で得られたナノストリング免疫プロファイリング結果に基づいて確認された免疫関門マーカーの発現変化を示す。＊表示はＣＬ７を処理する前と比較して発現水準が統計的に有意に変化したマーカーを意味する。 実験例７．１による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の単独及び併用処理による単球細胞のＭ１マクロファージへの分化結果（Ｍ１マクロファージの増加の有無）を示す。 実験例７．２による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の処理による単球細胞のＭ１マクロファージへの分化結果（Ｍ１マクロファージマーカーの増加の有無を示す）を示す。 実験例７．２による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用処理による単球細胞のＭ１マクロファージへの分化結果（Ｍ１マクロファージマーカーの増加の有無を示す）を示す。 実験例７．４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用処理時、Ｍ１マクロファージ分化の信号であるＭＡＰＫのシグナル伝達を確認した結果を示す。 実験例７．４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用処理時、Ｍ１マクロファージ分化の信号であるＮＦ－ｋＢのシグナル伝達を確認した結果を示す。 実験例７．４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用処理時、Ｍ１マクロファージ分化の信号であるＩｋＢのシグナル伝達を確認した結果を示す。 実験例８．１による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用処理時、細胞自滅信号の変化を確認した結果を示す。 実験例８．２による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用処理時、癌細胞の成長抑制効果を確認した結果を示す。 実験例８．２による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用処理時、癌細胞の成長抑制効果を確認した結果を示す。 実験例９．１で用いられた実験方法を概略的に示す。 実験例９．１による抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独または併用で大腸癌細胞株移植マウスに投与した場合に観察されるインビボ癌成長抑制効果を示す。 実験例９．３による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がマウスモデルで癌組織内のＭ１マクロファージを増加させるかを確認した結果を示す。 実験例９．４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がマウス腫瘍モデルでＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫を促進するかを確認した結果を示す。 実験例１０．１で用いられた実験方法を概略的に示す。 実験例１０．１による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＣＴ２６大腸癌マウスモデル以外にさらに他の癌腫でも効果があるかを確認した結果を示す。 実験例１０．２による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の単独または併用投与（二重及び三重併用投与を含む）がＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルでＣＤ８＋ Ｔ細胞に及ぼす影響をインビボ条件で確認した結果を示す。 実験例１０．３による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の単独または併用投与（二重及び三重併用投与を含む）がＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルで調節Ｔ細胞に及ぼす影響をインビボ条件で確認した結果を示す。 実験例１０．４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の単独または併用投与（二重及び三重併用投与を含む）がＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルでマクロファージに及ぼす影響をインビボ条件で確認した結果を示す。 実験例１１による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用投与による抗癌効果をインビボ条件で確認した結果を示す。腫瘍体積減少率を示す。 実験例１１による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用投与による抗癌効果をインビボ条件で確認した結果を示す。完全寛解率を示す。 実験例１２による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用投与による長期生存率向上効果を確認した結果を示す。 実験例１３による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用投与による癌の再発防止効果をインビボ条件で確認した結果を示す。 実験例１４による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用投与による免疫記憶効果を確認した結果を示す。 実験例１５による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の単独または併用投与（二重及び三重併用投与を含む）が単球でＭ１マクロファージへの分化を促進させるかを確認した結果を示す。 実験例１６による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が免疫抗癌剤との併用投与により癌細胞の成長を抑制できるかを確認した結果を示す。 実験例１６による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が免疫抗癌剤との併用投与により癌細胞の成長を抑制できるかを確認した結果を示す。
後述する本発明に関する詳細な説明は、本発明が実施できる特定の具現例について特定の図面を参照して記述されるが、本発明は、これに限定されず、適切に説明されれば、その請求項が主張することと均等な全ての範囲とともに添付された請求項によってのみ限定される。本発明の多様な実施例は、それぞれ異なるが、相互に排他的である必要はないことが理解されなければならない。例えば、本明細書に記載されている特定形状、構造及び特性は、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、一具現例から他の具現例に変更されたり具現例が組み合わせて具現することができる。本明細書で使用される技術用語及び学術用語は、特に定義されない限り、本発明が属する分野において一般に使用されるものと同様な意味を有する。本明細書を解釈する目的で、下記定義が適用され、単数で使用される用語は、適切な場合には複数形を含み、その反対も同様である。
定義
本明細書で使用される用語「約」は、当該技術分野において通常の技術者に知られたそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。
用語「抗体」は広義に用いられ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのような任意のアイソタイプのモノクローナル抗体（全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、抗体融合体（例えば、抗体と（ポリ）ペプチドの融合体または抗体と化合物の融合体）及び抗体断片（抗原結合断片を含む）を含む。本明細書において、接頭辞「抗－」は、抗原に関連した場合、当該抗体が当該抗原と反応性であることを意味する。特定抗原と反応性である抗体は、ファージまたは類似のベクターで組換え抗体ライブラリーの選別のような合成及び／又は組換え方法により、または抗原または抗原コード核酸を用いた動物の免疫化により生成され得るが、これに制限されない。代表的なＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合により結合される２個の同一の重鎖及び２個の同一の軽鎖で構成される。それぞれの重鎖及び軽鎖は、定常領域及び可変領域を含む。重鎖可変領域（ＨＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＶＲ）は、それぞれ「相補性決定領域「（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」と称される３個の切片を含み、これは、主に、抗原エピトープとの結合に関与する。これらは、Ｎ－末端から順次数字が付けられ、通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と称される。ＣＤＲ外部の可変領域中、よりよく保存された領域は「骨格領域「（「ＦＲ」）と称される。本明細書において抗体は、例えば、動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。
用語「ヒト化」（リーシェイピング（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）またはＣＤＲグラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）とも称される）は、異種供給源（通常、げっ歯類）由来のモノクローナル抗体の免疫原性を低下させ、親和度またはエフェクター機能（ＡＤＣＣ、補体活性化、Ｃｌｑ結合）を改善させるための確立された技法を含む。
用語「モノクローナル抗体」は、「モノクローナル抗体」と互換的に用いられ、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体を指し、即ち、集団を成す個別抗体は、少量で存在可能な天然の突然変異及び／又は翻訳後の変形（例えば異性化、アミド化）を除いては同一である。モノクローナル抗体は高度で特異的であり、一つの抗原性部位に対して誘導される。モノクローナル抗体は、実質的に均一な集団から得られたもので抗体の特性を示し、任意の特定の方法により抗体の生産を要求するものと解釈されない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル性抗体は、ハイブリドーマ方法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ技術、ヒト免疫グロブリンローカスの全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法などの多様な技術により製造することができる。
用語「抗原結合断片」は、抗原に対する特異的結合能を有する抗体の一部またはそれを含むポリペプチドを意味する。文脈上、「抗体」が特に「抗原結合断片」を除くことと理解される場合を除いては「抗体」と「抗原結合断片」は互換的に用いられ、「抗体」は「抗原結合断片」を含むことと解釈され得る。抗原結合断片の例にはＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロス－Ｆａｂ断片、線形抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、抗体断片と単一ドメイン抗体で形成された多重特異性抗体が含まれるが、これに限定されない。
用語「抗癌剤」は、細胞の各種代謝経路に作用して癌細胞に対し、細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）または細胞増殖抑制（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ）の効果を奏する既存の癌治療に使用される公知の薬剤を総称することであり、化学抗癌剤、標的抗癌剤、及び免疫抗癌剤を含む。
用語「免疫抗癌剤」は、免疫細胞を活性化させて癌細胞を死滅させる薬剤を指す。
用語「対象体」は、「患者」と互換的に用いられ、癌の予防または治療を必要とする哺乳動物、例えば、霊長類（例：ヒト）、ペット動物（例：イヌ、ネコなど）、家畜動物（例：ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギなど）及び実験室動物（例：ラット、マウス、モルモットなど）であってもよい。本発明の一具現例において、対象体はヒトである。
用語「治療」は、一般に、目的とする薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。このような効果は、疾病及び／又はこのような疾病による有害効果を部分的にまたは完全に治癒する点で治療的効果を有する。好ましい治療的効果は、疾患の発生または再発防止、症状の好転、疾患の任意の直接または間接的な病理学的結果の縮小、転移の防止、疾患進行速度の減少、疾患状態の好転または緩和、及び快方または改善された予後を含むが、これに制限されない。好ましくは、「治療」は、すでに現れた疾患または障害の医療的介入を意味し得る。
用語「予防」は、予防的治療、即ち、疾病を治療するよりは予防するための目的の措置または手続きに関する。「予防」とは、疾病またはその症状を部分的にまたは完全に予防するという観点で目的とする予防的な薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。
用語「投与」とは、対象体に予防的または治療的目的（例えば、癌の予防または治療）を達成するための物質（例えば、抗－ＣＤ３００ｃ抗体及びその抗原結合断片または他の抗癌剤）を提供することを意味する。
用語「生物学的試料」は、対象体から得られる多様なサンプル類型を包括し、診断またはモニタリング分析法に利用され得る。生物学的試料は、血液及びその他生物学的起源の液体試料、生体検査試料、組織培養物、またはこれに由来した細胞及びその子孫のような固体組織試料を含むが、これらに限定されるものではない。したがって、生物学的試料は、臨床的試料、培養物中の細胞、細胞上層液、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的流体及び組織試料、特に腫瘍試料を包括する。用語「生物学的資料」とは、前記生物学的試料を利用して得た任意の分析資料を意味する。
用語「発現水準」は、当該マーカーのｍＲＮＡ及びタンパク質中の一つ以上の発現水準を測定することにより決定することができ、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定する方法は、当業界に公知となっている任意の方法を使用することができる。例えば、ｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤は、当該マーカー遺伝子に特異的に結合するプライマー対またはプローブであってもよく、タンパク質の発現水準を測定する製剤は、当該マーカーに特異的に結合する抗体、基質、リガンドまたは補助因子であってもよい。ｍＲＮＡ発現水準を測定するための分析方法としては、逆転写酵素重合酵素反応、競争的逆転写酵素重合酵素反応、リアルタイム逆転写酵素重合酵素反応、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、ノーザンブロッティング、ＤＮＡチップなどがあるが、これに制限されるものではない。タンパク質水準を測定するための分析方法としては、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、タンパク質チップなどがあるが、これに制限されるものではない。
用語「治療反応性」とは、癌にかかっているか、かかったと疑われる個体が治療有効成分（例えば、ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片）を利用した治療に対して有利に、または不利に反応するかどうかを指すことであり、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の投与後に現れる腫瘍治療と関連した免疫体系の変化により評価することができる。
抗－ＣＤ３００ｃ抗体
本発明の一様態によると、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が提供される。本発明による抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ３００ｃタンパク質に特異的に結合する抗原結合分子である。好ましくは、前記抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ３００ｃタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
用語「ＣＤ３００ｃタンパク質」は、「ＣＤ３００ｃ」または「ＣＤ３００ｃ抗原」と互換的に用いられ、ＣＤ３００ｃ遺伝子によりコードされるタンパク質としてＢ７ファミリータンパク質と相当な配列同一性を示し、抗原提示細胞の膜に発現することが知られている。ＣＤ３００ｃタンパク質の発現または活性抑制は、Ｔ細胞の活性化及び／又はＭ１マクロファージへの分化促進を誘導することができる。
また、用語「抗－ＣＤ３００ｃ抗体」は、ＣＤ３００ｃタンパク質に結合するポリペプチドと互換的で使用され得る。用語「ポリペプチド」は、長さと無関係にペプチド結合を通じて互いに連結されたアミノ酸で構成された任意のポリマーを意味することと意図される。即ち、本明細書においてポリペプチドは、ペプチド及びタンパク質を含む。
一具現例において、抗－ＣＤ００ｃ抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ３００ｃタンパク質の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ；ＥＣＤ）に特異的に結合することができる。前記ＣＤ３００ｃの細胞外ドメインは、ヒトＣＤ３００ｃタンパク質の細胞外ドメインであってもよい。また、ＣＤ３００ｃの細胞外ドメインは、配列番号４０２で表示されるアミノ酸配列を含むことができる。
一実施例において、ＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準は、多様な癌患者の生存期間と非常に高い関連性を示すことを確認した。具体的には、癌患者の平均ＣＤ３００ｃ発現水準に比べて、ＣＤ３００ｃ発現水準が高い癌患者は、ＣＤ３００ｃ発現水準が低い癌患者に比べて生存期間が短いことを確認した。これは、本発明による抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を利用したＣＤ３００ｃの発現または活性の抑制が癌治療効果または癌患者の生存期間増加効果をもたらすことを意味する。
本発明による抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片は、多様な癌細胞の表面で発現するＣＤ３００ｃに特異的に結合して抗癌効果を奏することができる。抗－ＣＤ３００ｃ抗体のＣＤ３００ｃへの結合は、Ｔ細胞を活性化させると同時にＭ１マクロファージへの分化を促進させて癌細胞の増殖を効果的に抑制することができ、これは、抗－ＣＤ３００ｃ抗体が多様な癌の免疫治療剤として効果的に使用されるようにする。また、このような抗－ＣＤ３００ｃ抗体は、既存の抗癌剤との併用投与を通じてその治療効果がさらに増加するだけでなく、種間交差反応性（例えば、ヒト抗原とマウス抗原）を有しているため、多様な哺乳類に幅広く適用することができる。また、このような抗－ＣＤ３００ｃ抗体をアポトーシスに抵抗する能力を示す抵抗性癌細胞に処理した場合、癌細胞の抵抗性を顕著に弱化させるため、癌の再発防止にも優れた効能を示すと期待される。また、一般に癌細胞は、前炎症性サイトカインであるＩＬ－２の生成を阻害することにより免疫系を回避するが、抗－ＣＤ３００ｃ抗体は、このような癌細胞により遮断されたＩＬ－２の生産量を回復させることにより活性化した免疫系を通じて癌細胞死滅を誘導することが確認された。したがって、より根本的な免疫抗癌剤として活用できるものと期待される。ＣＤ３００ｃタンパク質または抗－ＣＤ３００ｃ抗体に関する内容は、また、韓国特許公開公報第１０－２０１９－０１３６９４９号を参照することができ、その内容は、全部本明細書に含まれる。
一具現例において、前記抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、
（ｉ）配列番号７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４３、配列番号５５、配列番号６７、配列番号７９、配列番号９１、配列番号１０３、配列番号１１５、配列番号１２７、配列番号１３９、配列番号１５１、配列番号１６３、配列番号１７５、配列番号１８７、配列番号１９９、配列番号２１１、配列番号２２３、配列番号２３５、配列番号２４７、配列番号２５９、配列番号２７１、配列番号２８３及び配列番号２９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１；
配列番号８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号４４、配列番号５６、配列番号６８、配列番号８０、配列番号９２、配列番号１０４、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１４０、配列番号１５２、配列番号１６４、配列番号１７６、配列番号１８８、配列番号２００、配列番号２１２、配列番号２２４、配列番号２３６、配列番号２４８、配列番号２６０、配列番号２７２、配列番号２８４及び配列番号２９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２；及び
配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、配列番号８１、配列番号９３、配列番号１０５、配列番号１１７、配列番号１２９、配列番号１４１、配列番号１５３、配列番号１６５、配列番号１７７、配列番号１８９、配列番号２０１、配列番号２１３、配列番号２２５、配列番号２３７、配列番号２４９、配列番号２６１、配列番号２７３、配列番号２８５及び配列番号２９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び
（ｉｉ）配列番号１０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号４６、配列番号５８、配列番号７０、配列番号８２、配列番号９４、配列番号１０６、配列番号１１８、配列番号１３０、配列番号１４２、配列番号１５４、配列番号１６６、配列番号１７８、配列番号１９０、配列番号２０２、配列番号２１４、配列番号２２６、配列番号２３８、配列番号２５０、配列番号２６２、配列番号２７４、配列番号２８６及び配列番号２９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１；
配列番号１１、配列番号２３、配列番号３５、配列番号４７、配列番号５９、配列番号７１、配列番号８３、配列番号９５、配列番号１０７、配列番号１１９、配列番号１３１、配列番号１４３、配列番号１５５、配列番号１６７、配列番号１７９、配列番号１９１、配列番号２０３、配列番号２１５、配列番号２２７、配列番号２３９、配列番号２５１、配列番号２６３、配列番号２７５、配列番号２８７及び配列番号２９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２；及び
配列番号１２、配列番号２４、配列番号３６、配列番号４８、配列番号６０、配列番号７２、配列番号８４、配列番号９６、配列番号１０８、配列番号１２０、配列番号１３２、配列番号１４４、配列番号１５６、配列番号１６８、配列番号１８０、配列番号１９２、配列番号２０４、配列番号２１６、配列番号２２８、配列番号２４０、配列番号２５２、配列番号２６４、配列番号２７６、配列番号２８８及び配列番号３００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
他の具現例において、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号７、配列番号１９、配列番号４３、配列番号５５、配列番号６７、配列番号７９、配列番号１０３、配列番号１１５、配列番号１２７、配列番号１３９、配列番号１５１、配列番号１６３、配列番号１９９及び配列番号２１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１；
配列番号８、配列番号２０、配列番号４４、配列番号５６、配列番号６８、配列番号８０、配列番号１０４、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１４０、配列番号１５２、配列番号１６４、配列番号２００及び配列番号２１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２；及び
配列番号９、配列番号２１、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、配列番号８１、配列番号１０５、配列番号１１７、配列番号１２９、配列番号１４１、配列番号１５３、配列番号１６５、配列番号２０１及び配列番号２１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ｉｉ）配列番号１０、配列番号２２、配列番号４６、配列番号５８、配列番号７０、配列番号８２、配列番号１０６、配列番号１１８、配列番号１３０、配列番号１４２、配列番号１５４、配列番号１６６、配列番号２０２及び配列番号２１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１；
配列番号１１、配列番号２３、配列番号４７、配列番号５９、配列番号７１、配列番号８３、配列番号１０７、配列番号１１９、配列番号１３１、配列番号１４３、配列番号１５５、配列番号１６７、配列番号２０３及び配列番号２１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２；及び
配列番号１２、配列番号２４、配列番号４８、配列番号６０、配列番号７２、配列番号８４、配列番号１０８、配列番号１２０、配列番号１３２、配列番号１４４、配列番号１５６、配列番号１６８、配列番号２０４及び配列番号２１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含むことができる。
もう一つの具現例において、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号４３、配列番号７９、配列番号１１５、及び配列番号２１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１；
配列番号４４、配列番号８０、配列番号１１６、及び配列番号２１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２；及び
配列番号４５、配列番号８１、配列番号１１７、及び配列番号２１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ｉｉ）配列番号４６、配列番号８２、配列番号１１８、及び配列番号２１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１；
配列番号４７、配列番号８３、配列番号１１９、及び配列番号２１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２；及び
配列番号４８、配列番号８４、配列番号１２０、及び配列番号２１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含むことができる。
もう一つの具現例において、前記重鎖可変領域は、配列番号４３で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１、配列番号４４で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２、及び配列番号４５で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号４６で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１、配列番号４７で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２、及び配列番号４８で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含むことができる。
もう一つの具現例において、前記重鎖可変領域は、配列番号７９で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１、配列番号８０で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２、及び配列番号８１で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号８２で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１、配列番号８３で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２、及び配列番号８４で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含むことができる。
もう一つの具現例において、前記重鎖可変領域は、配列番号１１５で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１、配列番号１１６で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２、及び配列番号１１７で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１１８で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１、配列番号１１９で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２、及び配列番号１２０で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含むことができる。
もう一つの具現例において、前記重鎖可変領域は、配列番号２１１で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１、配列番号２１２で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２、及び配列番号２１３で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号２１４で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１、配列番号２１５で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ２、及び配列番号２１６で表示されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ３を含むことができる。
もう一つの具現例において、前記重鎖可変領域は、配列番号３０３、３０７、３１１、３１５、３１９、３２３、３２７、３３１、３３５、３３９、３４３、３４７、３５１、３５５、３５９、３６３、３６７、３７１、３７５、３７９、３８３、３８７、３９１、３９５、及び３９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号３０４、３０８、３１２、３１６、３２０、３２４、３２８、３３２、３３６、３４０、３４４、３４８、３５２、３５６、３６０、３６４、３６８、３７２、３７６、３８０、３８４、３８８、３９２、３９６、及び４００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
もう一つの具現例において、前記重鎖可変領域は、配列番号３１５、３２７、３３９、及び３７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号３１６、３２８、３４０、及び３７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、前記重鎖可変領域は、配列番号３１５で表示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号３１６で表示されるアミノ酸配列を含むか；前記重鎖可変領域は、配列番号３２７で表示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号３２８で表示されるアミノ酸配列を含むか；前記重鎖可変領域は、配列番号３３９で表示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号３４０で表示されるアミノ酸配列を含むか；前記重鎖可変領域は、配列番号３７１で表示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号３７２で表示されるアミノ酸配列を含むことができる。
もう一つの様態において、の下記式（１）～（３）でそれぞれ表されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び下記式（４）～（６）でそれぞれ表されるアミノ酸配列を含むか、これにより構成されるＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される（各アミノ酸配列は、Ｎ→Ｃ方向である）：
ＦＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＭＸ５ＷＶＲ （１） （配列番号４０３）
前記式において、
Ｘ１＝ ＧまたはＳ
Ｘ２＝ Ｓ、ＲまたはＤ
Ｘ３＝ ＮまたはＹ
Ｘ４＝ Ｙ、Ａ、ＧまたはＨ
Ｘ５＝ ＳまたはＨ
Ｘ１ＩＳＸ２ＳＧＸ３Ｘ４ＴＹＹＡＸ５ （２） （配列番号４０４）
前記式において、
Ｘ１＝ ＴまたはＡ
Ｘ２＝ ＧまたはＳ
Ｘ３＝ ＴまたはＧ
Ｘ４＝ ＳまたはＹ
Ｘ５＝ ＤまたはＥ
ＹＣＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｗ （３） （配列番号４０５）
前記式において、
Ｘ１＝ ＲまたはＳ
Ｘ２＝ ＧまたはＳ
Ｘ３＝ Ｍ、Ｓ、ＹまたはＩ
Ｘ４＝ Ｗ、Ｑ、ＧまたはＲ
Ｘ５＝ ＧまたはＬ
Ｘ６＝ Ｍ、ＩまたはＰ
Ｘ７＝ Ｄ、ＦまたはＬ
Ｘ８＝ ＶまたはＤ
Ｘ９＝ Ｉ、Ｙまたは存在せず
ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＶＸ１２Ｗ （４） （配列番号４０６）
前記式において、
Ｘ１＝ ＴまたはＳ
Ｘ２＝ ＧまたはＲ
Ｘ３＝ Ｋ、ＮまたはＳ
Ｘ４＝ Ｈ、ＮまたはＳ
Ｘ５＝ Ｒ、ＩまたはＧ
Ｘ６＝ Ｈ、ＧまたはＩ
Ｘ７＝ Ｔ、ＩまたはＳ
Ｘ８＝ Ｒ、Ａ、Ｋ、または存在せず
Ｘ９＝ Ｒ、Ｓ、Ｇ、または存在せず
Ｘ１０＝ Ｎまたは存在せず
Ｘ１１＝ Ｙまたは存在せず
Ｘ１２＝ Ｎ、ＨまたはＱ
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＰＳＧＶＸ５ （５） （配列番号４０７）
前記式において、
Ｘ１＝ Ｌ、Ｓ、ＲまたはＥ
Ｘ２＝ Ｄ、ＫまたはＮ
Ｘ３＝ ＳまたはＮ
Ｘ４＝ Ｅ、Ｎ、ＱまたはＫ
Ｘ５＝ ＰまたはＲ
ＹＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＶＦ （６） （配列番号４０８）
前記式において、
Ｘ１＝ Ｑ、Ａ、またはＳ
Ｘ２＝ ＳまたはＡ
Ｘ３＝ ＹまたはＷ
Ｘ４＝ ＤまたはＡ
Ｘ５＝ Ｓ、ＤまたはＧ
Ｘ６＝ Ｓ、ＮまたはＴ
Ｘ７＝ Ｓ、Ｌ、ＮまたはＫ
Ｘ８＝ Ｖ、Ｓ、ＮまたはＧ
Ｘ９＝ Ｇ、Ｌ、Ｖまたは存在せず
Ｘ１０ ＝ Ｐまたは存在しない。
特定の具現例において、前記抗－ＣＤ３００ｃ抗体または抗原結合断片は、前記ＣＤＲ配列または下記表３と表４及び表５で提示された配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列同一性を有する配列を含むことができる。
特定の具現例において、本発明の抗体のアミノ酸配列変異体が考慮される。例えば、抗体の結合親和度及び／又は他の生物学的特性を改善することが好ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、分子をエンコードするヌクレオチド配列内に適切な変形を導入することにより、またはペプチド合成により製造することができる。そのような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、及び／又はそのようなアミノ酸配列内への残基の挿入及び／又はそのようなアミノ酸配列内での残基の置換を含む。最終構成物に到達するように欠失、挿入及び置換を含む多様な変更の任意の組み合わせが行われ得るが、最終構成物は、所望の特性、例えば、抗原結合特性を保有しなければならない。置換突然変異の誘発のための関心のある部位は、重鎖可変領域（ＨＶＲ）及び骨格領域（ＦＲ）を含む。保存的置換は、表１に「好ましい置換」という項目の下に提供されており、以下にアミノ酸側鎖部類（１）～（６）と関連してさらに記述されている。アミノ酸の置換は関心がある分子及び望む活性、例えば、維持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣあるいはＣＤＣに対してスクリーニングされた生成物に導入することができる。
アミノ酸は、通常の側鎖性質により次の通りグループ化され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、このような部類中の一つの構成員を他の部類で交換することを伴う。
本明細書において用語「アミノ酸配列変異体」は、母抗体結合分子（例えば、ヒト化あるいはヒト抗体）の一つ以上の超可変領域残基にアミノ酸の置換が存在する実質的な変異体を含む。一般に、追加の研究のために選択された、生成された変異体は、母抗体結合分子に比べて特定の生物学的特性の変形、例えば、改善（例えば、増加した親和度、減少した免疫原性）を有し／有したり母抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に維持するものである。例示的な置換変異体は親和度成熟抗体であり、これは、例えば、当業界に公知となったファージディスプレイ基盤の親和度成熟技法を利用して便利に生成され得る。簡単に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が突然変異され、変異体抗原結合分子がファージ上にディスプレーされ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和度）がスクリーニングされる。特定の具現例において、置換、挿入または欠失は、そのような変更が抗原に結合する抗原結合分子の能力を実質的に減少させない限り、一つ以上のＨＶＲ内で起きる。例えば、結合親和度を実質的に減少させない保存的変更（例えば、本明細書に提供されたような保存的置換）がＨＶＲで行われ得る。
アミノ酸配列の挿入は、単一または多数のアミノ酸残基の配列内挿入だけでなく、長さが一つの残基で百個以上の残基を含むポリペプチドに至る範囲であるアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合を含むことができる。末端挿入の例には、Ｎ－末端メチオニル残基を有する抗体を含む。分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドのＮ－末端またはＣ－末端への融合を含むことができる。また、分子の他の挿入変異体は、脳血管障壁（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ，ＢＢＢ）の通過を容易にするためのポリペプチドのＮ－末端またはＣ－末端への融合を含むことができる。
また、ＣＤ３００ｃ抗原に対して改善された親和度を有する本発明の抗体またはその抗原結合断片の変異体が提供される。そのような変異体は、ＣＤＲ突然変異（文献［Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２５４，３９２－４０３，１９９５］）、チェーンシャフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（文献［Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０，７７９－７８３，１９９２］）、Ｅ．ｃｏｌｉの突然変異誘発（ｍｕｔａｔｏｒ）菌株の使用（文献［Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２５０，３５９－３６８，１９９６］）、ＤＮＡシャフリング（文献［Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ８，７２４－７３３，１９９７］）、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）（文献［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２５６，７７－８８，１９９６］）及び有性（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲ（文献［Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、３９１，２８８－２９１，１９９８］）をはじめとする多数の親和度成熟プロトコルにより得られる。文献［Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９，１５３４－１５３６，１９８８］には、このような親和度成熟方法が議論されている。
一具現例において、前記抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、種間交差反応性を有することができる。具体的には、前記抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ヒト及びマウスＣＤ３００ｃ抗原の両方に対する交差反応性であってもよい。このような交差反応性は、実験例４．１～実験例４．４で確認される。
他の具現例において、前記抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、他の薬物と結合された抗体薬物結合体の形態を含んでもよく、このような形態で提供してもよい。
本明細書において用語「抗体薬物結合体」とは、抗体と薬物の生物学的活性を低下させないながら、抗体と薬物を化学的に連結した形態を指す。本明細書において、前記抗体薬物結合体は、抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＮ－末端のアミノ酸残基に薬物が結合された形態、具体的には、抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＮ－末端、α－アミン基に薬物が結合された形態を指す。
前記「薬物」とは、細胞（例えば、癌細胞）に対して特定の生物学的活性を有する任意の物質を意味することができ、これは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドを含む概念である。前記薬物は、α－アミン基と反応して架橋できる反応基を含む形態であってもよく、α－アミン基と反応して架橋できる反応基を含むリンカーが連結されている形態も含む。
前記α－アミン基と反応して架橋できる反応基は、抗体の重鎖または軽鎖のＮ－末端のα－アミン基と反応して架橋できれば、その種類は特に制限されず、当業界に公知となったアミン基と反応する種類を全て含む。その例には、イソチオシアネート（Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、イソシアネート（Ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ）、アシルアジド（Ａｃｙｌ ａｚｉｄｅ）、ＮＨＳエステル（ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）、スルホニルクロリド（Ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、アルデヒド（Ａｌｄｅｈｙｄｅ）、グリオキサール（Ｇｌｙｏｘａｌ）、エポキシド（Ｅｐｏｘｉｄｅ）、オキシラン（Ｏｘｉｒａｎｅ）、カーボネート（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、アリールハライド（Ａｒｙｌ ｈａｌｉｄｅ）、イミドエステル（Ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ）、カルボイミド（Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、アンヒドリド（Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）及びフルオロフェニルエステル（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）のいずれか一つが含まれてもよいが、これに制限されるものではない。
前記薬物は、本発明による抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が標的とする疾患を治療できる薬物であれば、その種類に関係なく含まれるが、好ましくは、抗癌剤であってもよい。
核酸、ベクター、宿主細胞及び製造方法
本発明の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、当業界に知られている任意の抗体生成技術により製造することができる。
本発明の他の様態によると、前記抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）が提供される。このような核酸分子は、前記抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の重鎖可変領域または重鎖ＣＤＲ領域が含まれたアミノ酸配列及び／又は軽鎖可変領域または軽鎖ＣＤＲ領域が含まれたアミノ酸配列をコードすることができる。本発明による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の重鎖／軽鎖可変領域及びＣＤＲ領域をコードする核酸分子の配列は、表３～表５及び図１を参照することができる。
前記「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは天然ヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形されたアナログ（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、及びＣＤＲ領域をコードする核酸分子の配列は変形することができる。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、または非保存的置換または保存的置換を含む。本発明の核酸分子は、前記のヌクレオチド配列に対し実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むことと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記の本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限対応するように整列（ａｌｉｇｎ）し、当業界において通常用いられるアルゴリズムを利用して整列した配列を分析した場合に、８０％以上の相同性、一特定例では９０％以上の相同性、他の特定例では９５％以上の相同性、また他の特定例では、９８％以上の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。
本発明のもう一つの様態によると、前記核酸が含まれた一つまたはそれ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。
前記「ベクター」は、それに連結された他の核酸を運搬できる核酸分子を指す。ベクターの一類型は「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントが挿入され得る円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの他の類型はウイルスベクターであり、ここで、ウイルスに由来したＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルス内へのパッケージングのためにベクターに存在する。特定ベクターは、これが導入される宿主細胞で自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）が宿主細胞内への導入時、宿主細胞のゲノム内に統合することができ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定ベクターは、これが作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ－ｌｉｎｋｅｄ）遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技法で有用な通常の発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態で存在する。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが最も通常に使用されるベクターの形態であるため、互換的に使用され得る。しかし、本発明は、同等な機能をする他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）を含む。
本発明のもう一つの様態によると、本発明のモノクローナル抗体をコードする一つ以上の核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）を含む宿主細胞が提供される。
前記宿主細胞は、本発明の組換えベクターで形質変換された細胞であってもよい。前記組換えベクターの安定で連続的なクローニング及び発現を可能にする当業界に知られている任意の宿主細胞が使用され得る。適した原核宿主細胞には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ）のようなバチルス種菌株、腸内細菌及び菌株、例えば、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｙｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、及び多様なシュードモナス種が含まれる。形質変換される適した真核宿主細胞には、酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエに、昆虫細胞、植物細胞、及び動物細胞、例えば、Ｓｐ２／０、中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ） Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、及びＭＤＣＫ細胞株が含まれる。また、前記「宿主細胞」は、形質変換された細胞または核酸配列で形質変換された後、選択された関心遺伝子を発現できる細胞を指すために使用される。前記用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が本来母体（ｐａｒｅｎｔ）と形態または遺伝的構成の面で同一かどうかに関係なく母細胞の子孫を含む。
本発明のもう一つの様態によると、前記宿主細胞を培養する段階を含む、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を製造する方法が提供される。
前記抗体またはその抗原結合断片の製造のための宿主細胞の培養は、当業界に知られている適当な培地と培養条件により行われる。このような培養過程は、選択される宿主細胞に応じて当業者により容易に調整されて使用される。培養過程は、細胞成長の類型によって懸濁培養と付着培養に区分され、培養類型によって回分式、流加式及び連続式培養に区分される。多様な培養過程が、例えば、文献［“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ” ｂｙ Ｊａｍｅｓ Ｍ．Ｌｅｅ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ－Ｈａｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，ｐｐ １３８－１７６］に開示されている。
前記抗体を回収するために、免疫グロブリンの精製のために当業界に公知となった任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（イオン交換、親和性（例：ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）、サイズ排除など）、遠心分離、差等溶解度またはタンパク質の精製のための他の標準技術が使用され得る。
免疫抗癌剤との併用
本発明者らは、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が一つ以上の他の免疫抗癌剤と併用されて増強された抗癌効果を奏することを確認した。したがって、本発明の抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片は、一つ以上の他の免疫抗癌剤と併用されて癌の予防または治療に使用される。
免疫抗癌剤は、人体の免疫細胞を活性化させて癌細胞を死滅させる新たな機序を有するため、特定の遺伝子変異がなくても多くの癌に幅広く使用されるという長所を有する。また、免疫抗癌剤は、患者自身の免疫体系の強化を通じて癌を治療するという点で副作用が少なく、患者の生活の質を向上させ、生存期間も大幅に延長する効果を奏する。このような免疫抗癌剤は、免疫関門抑制剤を含み、公知の方法により製造されたものであるか、市販の製品であってもよい。免疫抗癌剤の例には、抗－ＰＤ－１、抗－ＰＤ－Ｌ１、抗－ＣＴＬＡ－４、抗－ＣＤ４７、抗－ＫＩＲ、抗－ＬＡＧ３、抗－ＣＤ１３７、抗－ＯＸ４０、抗－ＣＤ２７６、抗－ＣＤ２７、抗－ＧＩＴＲ、抗－ＴＩＭ３、抗－４１ＢＢ、抗－ＣＤ２２６、抗－ＣＤ４０、抗－ＣＤ７０、抗－ＩＣＯＳ、抗－ＣＤ４０Ｌ、抗－ＢＴＬＡ、抗－ＴＣＲ及び抗－ＴＩＧＩＴ抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、免疫抗癌剤の例には、デュルバルマブ（イミフィンジ（Ｉｍｆｉｎｚｉ））、アテゾリズマブ（テセントリク（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ））、アベルマブ（バベンチオ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ））、ペムブロリズマブ（キイトルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ））、ニボルマブ（オプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ））、αＣＤ４７、セミプリマブ（リブタヨ（Ｌｉｂｔａｙｏ））、マグロリマブ（Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４）、及びイピリムマブ（ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ））が含まれるが、これらに限定されるものではない。
一具現例において、免疫抗癌剤は、抗－ＰＤ－１、抗－ＰＤ－Ｌ１、抗－ＣＴＬＡ－４、抗－ＣＤ４７、抗－ＫＩＲ、抗－ＬＡＧ３、抗－ＣＤ１３７、抗－ＯＸ４０、抗－ＣＤ２７６、抗－ＣＤ２７、抗－ＧＩＴＲ、抗－ＴＩＭ３、抗－４１ＢＢ、抗－ＣＤ２２６、抗－ＣＤ４０、抗－ＣＤ７０、抗－ＩＣＯＳ、抗－ＣＤ４０Ｌ、抗－ＢＴＬＡ、抗－ＴＣＲ及び抗－ＴＩＧＩＴ抗体からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含むことができる。一例として、免疫抗癌剤は、抗－ＰＤ－１、抗－ＰＤ－Ｌ１、抗－ＣＴＬＡ－４、及び抗－ＣＤ４７抗体からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含むことができる。
他の具現例において、免疫抗癌剤は、デュルバルマブ（イミフィンジ（Ｉｍｆｉｎｚｉ））、アテゾリズマブ（テセントリク（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ））、ペムブロリズマブ（キイトルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ））、ニボルマブ（オプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ））、αＣＤ４７、及びイピリムマブ（ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ））からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含むことができる。
癌の予防または治療方法
本発明のもう一つの様態によると、本発明による抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を利用して対象体で癌を予防または治療したり、癌の少なくとも一つの症状または兆候の重症度を改善または減少させたり、転移を抑制したり、癌の成長を抑制する方法が提供される。本明細書において「癌を予防または治療」するとは、癌の増殖、生存、転移、再発または抗癌剤の耐性を抑制することを含むことができる。このような方法は、本発明による抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を癌の予防または治療が必要な対象体に投与する段階を含むことができる。
本明細書において用語「癌」は、哺乳類で典型的に調節されない細胞成長を特徴とする生理的状態を指す。本発明において予防または治療の対象となる癌には、その発生部位によって大腸癌、小腸癌、直膓癌、結腸癌、甲状腺癌、内分泌腺癌、口腔癌、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、子宮頸部癌、子宮癌、卵管癌、卵巣癌、脳癌、頭頸部癌、肺癌、リンパ腺癌、胆嚢癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌（または黒色腫）、乳癌、胃癌、骨癌、血液癌などが含まれ得るが、癌細胞の表面にＣＤ３００ｃタンパク質を発現する限り、全ての癌が含まれ得る。一具現例において、前記癌は、大腸癌、直膓癌、結腸癌、甲状腺癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、子宮頸部癌、脳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、舌癌、乳癌、子宮癌、胃癌、骨癌及び血液癌からなる群から選択されたいずれか一つ以上を含むことができる。他の具現例において前記癌は固形癌であってもよい。
一具現例において、前記方法は、前記抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の投与前に、対象体の生物学的試料または資料に基づいてＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準を決定する段階をさらに含むことができる。
また、前記方法は、前記対象体の生物学的試料または資料を利用して決定されたＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準が一定レベル以上の場合に、前記対象体は、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を利用した治療に適した対象体であると判断する段階を含むことができる。具体的には、前記方法は、前記対象体の生物学的試料または資料を利用して決定されたＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準が対照群（例えば、癌にかかっていない正常な人における発現水準または癌患者における平均発現水準）と比較して統計的に有意に高い場合（例えば、１０％以上高い場合）に、前記対象体は、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を利用した治療に適した対象体であると判断する段階を含むことができる。しかし、前記提示されたＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準の差は、単に例示的なものであり、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上であってもよく、これらに限定されるものではない。好ましくは、対照群は、同種の癌患者における平均発現水準であってもよい。
本発明の一実施例において、米国ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）データベースから得た腎臓癌（５３０人）、膵臓癌（１７７人）及び肝臓癌（３７０人）患者のデータを利用してＣＤ３００ｃの発現水準による全生存期間（Ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）を比較した結果、癌腫別の平均ＣＤ３００ｃ発現水準に比べて、高いＣＤ３００ｃ発現水準を示す癌患者は、そうではない患者に比べて短い全生存期間を示した。したがって、対象体に対する抗－ＣＤ３００ｃ抗体の治療反応率を高めるために、対象体のＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準を参照することが好ましい場合がある。
他の具現例において、前記方法は、一つ以上の免疫抗癌剤を投与する段階をさらに含むことができる。（ｉ）抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が、（ｉｉ）一つ以上の免疫抗癌剤と併用される場合、（ｉ）及び（ｉｉ）は、同時に投与されても順次投与されてもよい。
「順次投与」されるとは、一つの成分が投与され、投与直後または投与後に一定間隔を置いて他の成分が投与されることを意味し、この時、成分は、どのような順序でも投与できる。即ち、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が投与された直後または投与後に一定間隔を置いて一つ以上の免疫抗癌剤が投与されてもよく、またはその反対も同様に適用される。また、一つ以上の免疫抗癌剤のいずれか一つが先に投与され、次いで抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が投与され、次いで一つ以上の免疫抗癌剤の他の一つが投与することができる。
もう一つの具現例において、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片は、二つ以上の免疫抗癌剤とともに投与することができる。一例として、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が二つの免疫抗癌剤（例えば、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗－ＰＤ－１抗体、または抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＣＴＬＡ－４抗体）と併用された場合に、最高の癌細胞増殖抑制効果などを奏すると確認された。
本発明による抗体またはその抗原結合断片及び選択的に一つ以上の追加の抗癌剤のそれぞれは、局所または全身治療が要望されるかどうか及び治療される領域に応じて種々の方式で投与することができる。このような成分を対象体に投与する方法は、投与目的、発病部位、対象体の状態などによって変わり得る。投与経路は、経口、非経口、吸入、局所または局部投与（例えば、病変内投与）であってもよい。例えば、非経口投与は、静脈内、皮下、腹腔内、肺内、動脈内、筋肉内、直腸、膣内、関節内、前立腺内、鼻内、眼球内、膀胱内、脊椎腔内投与または心室内投与（例えば、脳室内投与）を含むことができるが、これに制限されない。また、併用される場合、抗－ＣＤ３００ｃ抗体と追加の免疫抗癌剤は、同一の経路で投与され得るか、または互いに異なる経路で投与され得る。
前記方法において、本発明による抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片及び選択的に一つ以上の追加抗癌剤のそれぞれの有効量は、個体（患者）の年齢、性別、体重によって変わり、一般には、体重１ｋｇ当り約０．０１ｍｇ～１００ｍｇ、または５ｍｇ～約５０ｍｇが１日１回～数回に分けて投与され得る。しかし、投与経路及び期間、疾病の重症度、性別、体重、年齢などによって増減し得るため、本発明の範囲は、これらに限定されるものではない。
本発明による方法は、対象体から予めＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準を確認する段階を含むことができる。その発現水準により抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を投与するかどうかを決定することができる。
他の具現例において、本発明による方法は、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を対象体に投与した後、特定マーカーの発現水準の変化を測定することにより、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片と併用するのに適した追加（一つ以上の）の免疫抗癌剤を選別する段階を含むことができる。
具体的には、前記方法は、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が投与された対象体の生物学的試料または資料を利用して下記マーカーから選択された一つ以上のマーカーの発現水準を決定する段階をさらに含むことができる：
Ｂｓｔ２、Ｃｄ４０、Ｃｄ７０、Ｃｄ８６、Ｃｃｌ８、Ｘｃｌ１、Ｃｃｒ７、Ｃｄ８０、Ｃｄ２０６、Ｍｓｒ１、Ａｒｇ１、Ｖｅｇｆａ、Ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ４ａ１、Ｈｉｆ１ａ、Ｖｃａｍ１、Ｉｃａｍ１、Ｇｚｍａ、Ｇｚｍｂ、Ｉｃｏｓ、Ｃｄ６９、Ｉｆｎｇ、Ｔｎｆ、Ｃｄ１ｄ１、Ｃｄ１ｄ２、Ｃｄ３８、Ｃｘｃｒ６、Ｘｃｒ１、Ｔｂｘ２１、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ４、Ｃｘｃｒ３、ＩＬ－１２ｂ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、Ｌａｇ３、Ｔｉｍ３、Ｏｘ４０、Ｇｉｔｒ、Ｈｖｅｍ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｃｍａ１、Ｔｉｍｄ４、Ｂｃｌ６、Ｃｘｃｌ５及びＣｃｌ２１ａ。
前記マーカーに対する説明は、下記表２を参照する。
もう一つの具現例において、前記方法は、確認されたマーカーの発現水準に基づいて追加の免疫抗癌剤を選別する段階をさらに含み得る。この時、前記マーカーにはＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、Ｌａｇ３、Ｔｉｍ３、Ｉｃｏｓ、Ｏｘ４０、Ｇｉｔｒ、Ｈｖｅｍ、ＣＤ２７及びＣＤ２８が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。もう一つの具現例において、前記マーカーは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、Ｌａｇ３、Ｔｉｍ３、Ｉｃｏｓ、Ｏｘ４０、Ｇｉｔｒ、Ｈｖｅｍ、ＣＤ２７及びＣＤ２８からなる群から選択された一つ以上を含むことができる。好ましくは、前記マーカーは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、Ｌａｇ３及びＴｉｍ３からなる群から選択された一つ以上を含むことができる。また、前記マーカーはＩｃｏｓ、Ｏｘ４０、Ｇｉｔｒ、Ｈｖｅｍ、ＣＤ２７及びＣＤ２８からなる群から選択された一つ以上を含むことができる。
このようなマーカーの発現水準の変化は、本発明の抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を個体に投与した時に現れる腫瘍抑制効果に影響を及ぼす腫瘍／免疫関連マーカーの変化を意味する。例えば、前記マーカーの発現水準の変化は、免疫細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞）の活性と関連したタンパク質マーカーまたは免疫関門タンパク質マーカー、腫瘍増殖に影響を及ぼす腫瘍微細環境（ＴＭＥ）タンパク質マーカー、Ｔｈ１反応及びＴｈ２反応に関連したマーカーの発現様相の変化を含むことができる。マーカーの具体的な例については、前記説明を参照する。このような発現様相の変化を通じて患者が薬物に反応する確率を予測したり抗癌効果を最大化できる他の免疫関門抑制剤を含む抗癌剤を選択することができる。また、前記マーカーを活用すれば、患者が前記抗体で治療可能かどうかを判断することができる。また、薬物治療効果をモニタリングすることができる。また、薬物用量、用法、併用療法などを含む治療方法のための情報を提供することができる。
本発明の実施例によると、本発明の抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の投与後、個体で観察された前記マーカーの発現水準の変化により選別された他の免疫関門抑制剤（抗－ＰＤ－Ｌ１抗体であるデュルバルマブ（イミフィンジ（Ｉｍｆｉｎｚｉ））、抗－ＰＤ－１抗体であるニボルマブ（オプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ））、抗－ＰＤ－１抗体であるペムブロリズマブ（キイトルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ））、抗－ＣＴＬＡ－４抗体及び抗－ＣＤ４７抗体（αＣＤ４７）中の一つ以上）と併用した結果、増強された抗腫瘍効果を奏することが確認された。
もう一つの具現例において、前記確認されたマーカーの発現水準に基づいて抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の治療反応性を確認する段階をさらに含んでもよい。前記マーカーにはｖｅｇｆａ、ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ４ａ１、Ｈｉｆ１ａ、Ｂｓｔ２、ＣＣＬ８、Ｘｃｌ１、ＣＣＲ７、ＣＤ８０、Ｔｂｘ２１、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ４、Ｉｆｎｇ、Ｃｘｃｒ３、ＩＬ－６、Ｇｚｍａ、Ｉｃｏｓ、Ｃｄ６９、Ｃｄ１ｄ１、Ｃｄ３８、Ｃｘｃｒ６、Ｏｘ４０、Ｇｉｔｒ、ＣＤ２７及びＣＤ２８が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。好ましくは、前記マーカーは、ｖｅｇｆａ、ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ４ａ１、Ｈｉｆ１ａ、Ｂｓｔ２、ＣＣＬ８、Ｘｃｌ１、ＣＣＲ７、ＣＤ８０、Ｔｂｘ２１、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ４、Ｉｆｎｇ、Ｃｘｃｒ３、ＩＬ－６、Ｇｚｍａ、Ｉｃｏｓ、Ｃｄ６９、Ｃｄ１ｄ１、Ｃｄ３８及びＣｘｃｒ６からなる群から選択された一つ以上を含むことができる。また、前記マーカーは、ｖｅｇｆａ、ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ４ａ１及びＨｉｆ１ａからなる群から選択された一つ以上を含むことができる。また、前記マーカーはＢｓｔ２、ＣＣＬ８及びＸｃｌ１からなる群から選択された一つ以上を含むことができる。もう一つの具現例において、前記マーカーはＣＣＲ７、ＣＤ８０またはこれらの組み合わせを含むことができる。また、前記マーカーはＴｂｘ２１、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ４、Ｉｆｎｇ、Ｃｘｃｒ３及びＩＬ－６からなる群から選択された一つ以上を含むことができる。
もう一つの具現例において、前記方法は、前記マーカー中の一つ以上のマーカーの発現水準が抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が投与されていない対象体に比べて減少した場合、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の治療反応性が良好または優れることで決定する段階をさらに含んでもよい。例えば、前記方法はｖｅｇｆａ、ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ４ａ１、Ｈｉｆ１ａ及びＩＬ－６からなる群から選択された一つ以上のマーカーの発現水準が抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が投与されていない対象体に比べて減少した場合に、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の治療反応性が良好または優れることで決定することができる。この時、発現水準の減少は統計的に有意な減少を意味し、発現水準の減少率は約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約１００％以上を含み得るが、これらに限定されるものではない。
また、前記方法は、前記マーカー中の一つ以上のマーカーの発現水準が抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が投与されていない対象体に比べて増加した場合、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の治療反応性が良好または優れることで決定する段階をさらに含んでもよい。例えば、前記方法はＢｓｔ２、ＣＣＬ８、Ｘｃｌ１、ＣＣＲ７、ＣＤ８０、Ｔｂｘ２１、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ４、Ｉｆｎｇ、Ｃｘｃｒ３、Ｇｚｍａ、Ｉｃｏｓ、Ｃｄ６９、Ｃｄ１ｄ１、Ｃｄ３８、Ｃｘｃｒ６、Ｏｘ４０、Ｇｉｔｒ、Ｃｄ２７及びＣｄ２８からなる群から選択された一つ以上のマーカーの発現水準が抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が投与されていない対象体に比べて増加した場合に、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の治療反応性が良好または優れることで決定することができる。この時、発現水準の増加は統計的に有意な増加を意味し、発現水準の増加率は約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約１００％以上を含み得るが、これらに限定されるものではない。
薬学組成物
本発明のもう一つの様態によると、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物が提供される。
前記抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片は、組成物に予防的または治療的有効量で含まれ得る。前記薬学組成物は、癌の増殖、生存、転移、再発または抗癌剤の耐性を抑制するために対象体に投与することができる。
一具現例において、前記薬学組成物は、一つ以上の免疫抗癌剤をさらに含んでもよい。具体的には、前記抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片及び選択的に前記追加の免疫抗癌剤は同一の組成物に含まれるか、またはそれぞれ別個の組成物に含まれ得る。別個の組成物に含まれる場合、前記抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片及び前記追加の免疫抗癌剤は、それぞれ製剤化されることができ、それぞれ同時または順次投与することができる。
本発明の薬学組成物を製造するために、前記抗体またはその抗原結合断片及び選択的に追加の免疫抗癌剤は、製薬上許容される担体及び／又は賦形剤と混合することができる。薬学組成物は、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で製造することができる。例えば、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ （１９８４）］を参照する。
許容される担体及び／又は賦形剤（安定化剤を含む）は、使用される用量及び濃度で対象体に無毒性であり、バッファー（例えば、ホスフェート、シトレートまたは他の有機酸）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはメチオニン）；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０以下の残基）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性重合体（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン）；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩形成の対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び（または）非イオン系界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含むことができ、これに制限されない。
本発明の薬学組成物は、その投与経路により当業界に公知となった適した形態で製剤化することができる。
本明細書において用語「予防的または治療的有効量」または「有効量」は、対象体の癌を予防または治療するのに有効な組成物の有効成分の量であり、医学的処置に適用可能な合理的な受恵／リスクの比率で癌を予防または治療するのに充分であり、副作用を起こさない程度の量を意味する。前記有効量の水準は、患者の健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、配合または同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られている要素により決定することができる。この時、前記の要素を全て考慮し、最小限の副作用または副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは、通常の技術者が容易に決定することができる。
具体的には、本発明の薬学組成物において有効成分のそれぞれの有効量は、個体（患者）の年齢、性別、体重によって変わり、一般には、体重１ｋｇ当り約０．０１ｍｇ～１００ｍｇ、または５ｍｇ～約５０ｍｇが１日１回～数回に分けて投与することができる。しかし、投与経路及び期間、疾病の重症度、性別、体重、年齢などによって増減し得るため、本発明の範囲は、これらに限定されるものではない。
癌の予防または治療用キット
本発明のもう一つの様態によると、本発明による抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を含む組成物、及び前記抗体またはその抗原結合断片の使用を指示する指示書を含む、癌の予防または治療用キットが提供される。この時、前記組成物は、前記抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の予防的または治療的有効量を含有することができる。
一具現例において、前記指示書は、前記抗体またはその抗原結合断片及び一つ以上の追加抗癌剤の組み合わせの使用を指示する指示書を含むことができる。
一具現例において、前記指示書は、有効成分の服薬または投与指針を含む指示書を含むことができる。例えば、前記指示書は、抗体またはその抗原結合断片の投与前に対象体から得られた生物学的試料または資料を利用してＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準の測定を指示することを含むことができる。選択的に、有効成分（ら）を投与するのに必要な機器または装置がキットに含まれ得る。
投与用量
本発明による抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片、及び選択的に追加の免疫抗癌剤のそれぞれの有効量または効果的な無毒性の量は、通常の実験により決定することができる。例えば、抗体または免疫抗癌剤の治療活性量は、疾患段階、疾患の重症度、対象体の年齢、性別、医学的合併症、及び体重、そして対象体で望まれる反応を誘発する成分の能力のような要因及び共に使用される抗癌剤の投与量により変わる。抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片または追加の免疫抗癌剤それぞれの投与量及び投与療法は、最適の治療反応を提供するために調整することができる。例えば、いくつかの分割用量が毎日、毎週、２週ごとに、３週ごとに、４週ごとになどで投与されることができ／できたり、用量を治療状況の緊迫により比例的に減少または増加することができる。
癌の予防または治療のための情報の提供方法及びキット
本発明のもう一つの様態によると、癌の予防または治療が必要な対象体から得られた生物学的試料または資料を利用してＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準を決定する段階を含む癌の予防または治療のための情報を提供する方法が提供される。前記方法は、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の投与のための事前検診にも活用することができる。
一具現例において、前記ＣＤ３００ｃタンパク質（マーカー）の発現水準を決定する段階は、前記ＣＤ３００ｃタンパク質に特異的に結合する分子、例えば、抗体、基質、リガンドまたは補因子、または前記ＣＤ３００ｃのｍＲＮＡに特異的に結合する分子、例えば、プライマー対またはプローブを利用することを含むことができる。これら試薬を利用して発現水準を決定する方法は、前述のことを含めて当業界によく知られている。
一具現例において、前記方法は、前記対象体の生物学的試料または資料を利用して決定されたＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準が一定レベル以上の場合に、前記対象体は、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を利用した治療に適した対象体であると判断する段階を含むことができる。具体的には、前記方法は、前記対象体の生物学的試料または資料を利用して決定されたＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準が対照群（例えば、癌にかかっていない正常な人における発現水準または癌患者における平均発現水準）と比較して統計的に有意に高い場合（例えば、１０％以上高い場合）に、前記対象体は、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を利用した治療に適した対象体であると判断する段階を含むことができる。しかし、前記提示されたＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準の差は、単に例示的なものであり、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上であってもよく、これらに限定されるものではない。好ましくは、対照群は、同種の癌患者における平均の発現水準であってもよい。
本発明の一実施例において、米国ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）データベースから得た腎臓癌（５３０人）、膵臓癌（１７７人）及び肝臓癌（３７０人）患者のデータを利用してＣＤ３００ｃの発現水準による全生存期間（Ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）を比較した結果、癌腫別の平均ＣＤ３００ｃ発現水準に比べて、高いＣＤ３００ｃ発現水準を示す癌患者は、そうではない患者に比べて短い全生存期間を示した。したがって、対象体に対する抗－ＣＤ３００ｃ抗体の治療反応率を高めるために、対象体のＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準を参照することが好ましい場合がある。
他の具現例において、前記癌の予防または治療のための情報は、ＣＤ３００ｃタンパク質に関連した治療剤（例えば、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片）の治療反応性、治療剤の選択、治療対象体の選択、対象体の予後、及び対象体の生存期間のいずれか一つ以上に関する情報を含み得るが、これらに限定されるものではない。好ましくは、前記癌の予防または治療のための情報は、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の癌治療反応性、対象体の生存期間、または両方を含むことができる。
本発明のもう一つの様態によると、癌の予防または治療が必要な対象体から得られた生物学的試料または資料を利用してＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準を測定するための物質を含む癌の予防または治療のための情報を提供するためのキットが提供される。前記キットは、分析方法に適した一種類またはそれ以上の他の構成成分の組成物、溶液または装置を含むことができる。前記キットは、タンパク質マーカーの発現水準を測定するためのキットであってもよく、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キットであってもよい。前記キットは、抗体の免疫学的検出のために必要なものであり、当業界に知られている他の試薬を含むことができる。前記キットは、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む薬学組成物をさらに含んでもよい。
以下、本発明を下記の実施例により、さらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらだけに限定されるものではない。
実施例
Ｉ．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の製造
実施例１．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の製造
実施例１．１．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体ライブラリーの製作
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を選別するために、ラムダファージライブラリー、カッパファージライブラリー、ＶＨ３ＶＬ１ファージライブラリー、及びＯＰＡＬＴＬファージライブラリーを利用してバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）を行った。具体的には、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）に５μｇ／ｍＬ濃度のＣＤ３００ｃ抗原を添加し、１時間反応させて試験管の表面に抗原を吸着させた。その後、３％の脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を添加して非特異的反応を抑制させた後、再び３％の脱脂乳に分散している１０１２ ＰＦＵの抗体ファージライブラリーをそれぞれの免疫試験管に添加して抗原と結合させた。次いで、ＴＢＳＴ（ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ２０）溶液を利用して３回洗浄し、非特異的に結合されているファージを除去した後、ＣＤ３００ｃ抗原特異的に結合されている単鎖可変フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）ファージ抗体を１００ｍＭのトリエチルアミン溶液を利用して溶出させた。溶出されたファージは、１．０ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ ７．８）を利用して中和させた後に、大腸菌ＥＲ２５３７に処理して３７℃で１時間感染させ、感染させた大腸菌は、カルベニシリンが含まれているＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で１６時間培養した。次いで、形成された大腸菌コロニーを３ｍＬのＳＢ（ｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ）－カルベニシリン培養液を利用して懸濁させ、一部は１５％グリセロールを添加して－８０℃で使用するまで保管し、残りはＳＢ－カルベニシリン－２％ブドウ糖溶液に再接種して３７℃で培養した。得られた培養液を遠心分離してファージ粒子が含まれている上層液を利用して再びバイオパニングを３回繰り返すことにより、抗原特異的な抗体を確保及び濃縮した。
バイオパニングを３回繰り返した後に抗体遺伝子を含んでいる大腸菌をカルベニシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で１６時間培養し、形成された大腸菌コロニーを再びＳＢ－カルベニシリン－２％ブドウ糖溶液に再接種して３７℃で吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．５になるまで培養した後に、ＩＰＴＧを添加して３０℃で１６時間追加培養した。その後、原形質膜抽出（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を行い、前記結果を通じてＣＤ３００ｃ抗原に特異的に結合する抗体のライブラリープール（ｌｉｂｒａｒｙ ｐｏｏｌ）を一次的に確保した。
実施例１．２．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の選別
ＣＤ３００ｃ抗原に高い結合力を有し、特異的に結合する抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を選別するために、実施例１．１と同様の方法で確保されたライブラリープールを利用してＥＬＩＳＡを行った。より詳しくは、コーティング緩衝溶液（ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；０．１ Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０）にＣＤ３００ｃ抗原とＣＤ３００ａ抗原をそれぞれ１ウェル当たり５μｇ／ｍＬの濃度になるようにＥＬＩＳＡプレートに分注した後、室温で３時間反応させて抗原をプレートに結合させた。その後、ＰＢＳＴ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ２０）を利用して３回洗浄して結合されていない抗原を完全に除去した後に、それぞれのウェルに２％ ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が添加されているＰＢＳＴを３５０μＬ添加し、室温で１時間反応させ、ＰＢＳＴを利用して再洗浄した。次いで、実施例１．１と同様の方法で確保されたｓｃＦｖを含んでいる原形質膜抽出物を２５μｇずつ添加し、１時間室温で反応させて抗原と結合させた。１時間後にＰＢＳＴを利用して３回洗浄して結合されていないｓｃＦｖを除去した後に、４μｇ／ｍＬの検出用抗体を添加し、再び室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴを利用して結合されていない検出用抗体を除去した後にＨＲＰが結合されている抗－ウサギＩｇＧを添加し、室温で１時間反応させ、再びＰＢＳＴを利用して結合されていない抗体を除去した。次いで、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＴＭＢ）溶液を添加し、１０分間反応させて発色させた後に、２Ｎの硫酸溶液を添加して発色反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を測定し、ＣＤ３００ｃ抗原に特異的に結合する抗体を確認した。
１．３．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体配列の確認
実施例１．２と同様の方法を利用して選別された抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の塩基配列を確認した。より詳しくは、選別された抗体クローンをプラスミドミニプレップキット（ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）を利用してプラスミドＤＮＡを抽出した後に、ＤＮＡシーケンシングを行ってＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）の配列を分析した。その結果、それぞれ互いに異なるアミノ酸配列を有している２５種の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を確保した。このような２５種の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を下記表３及び表４に示した。
前記の表３及び表４に言及したそれぞれの図面において、ＣＤＲ部位（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は、下線を引いて順に表示した（即ち、ＣＤＲ１が先に表示され、次いでＣＤＲ２が表示され、次いでＣＤＲ３が表示される）。また、それぞれの図面に含まれたＣＤＲ部位を下記表５に示したように、配列番号で表示した：
前記のように、ＣＤ３００ｃ抗原に高い結合力を有し、特異的に結合する癌の予防または治療に使用できる２５種の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が確認された。
実施例１．４．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の製作及び精製
実施例１．３を通じて確認した抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の塩基配列を利用して抗体を発現できる重鎖と軽鎖を分離した発現用ベクターを製作した。より詳しくは、分析したＣＤＲ配列を利用してｐＣＩＷ３．３ベクターにそれぞれ重鎖と軽鎖を発現できるように遺伝子を挿入して製作した。製作した重鎖と軽鎖発現用ベクターをＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）と１：１の質量比で混ぜて２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして抗体の発現を誘導した後、８日目に培養液を遠心分離して細胞を除去し、培養液を得た。得られた培養液は、濾過過程を経た後、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４及び０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）が混合されている溶液を利用して再懸濁させた。再懸濁させた溶液は、タンパク質Ａビード（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用した親和性クロマトグラフィーにより精製し、最終的に溶離緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を利用して溶出させた。
製作された抗体を確認するために、精製された抗体５μｇにそれぞれ還元性サンプル緩衝液と非還元性サンプル緩衝液に添加し、ｐｒｅ－ｍａｄｅ ＳＤＳ ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して電気泳動を行い、その後、クマシーブルーを利用してタンパク質を染色した。非還元条件の結果を図４に、還元条件の結果を図５に示した。
図４及び図５に示したように、純度の高い抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が製作及び精製されたことが確認された。
ＩＩ．癌細胞におけるＣＤ３００ｃの発現及び抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体のＣＤ３００ｃ抗原の結合
実験例１．癌細胞及び免疫細胞におけるＣＤ３００ｃの発現
実験例１．１．癌細胞株におけるＣＤ３００ｃの発現の確認
ＣＤ３００ｃが多様な癌細胞で発現しているかを評価するために、癌細胞株ＭＫＮ４５（ヒト胃癌細胞株）、ＩＭ９５（ヒト胃癌細胞株）、ＨＴ－２９（ヒト大腸癌細胞株）、Ａ５４９（ヒト肺癌細胞株）、ＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌細胞株）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓癌細胞株）などの多様な細胞株を培養してｍＲＮＡ及びタンパク質の水準でＣＤ３００ｃの発現を評価した。また、免疫細胞であるＴＨＰ－１（ヒト単球細胞株）についても評価を行った。この時、ＨＥＫ２９３Ｔ（一般の細胞株）を対照群として用いた。
一方、タンパク質の発現は、ウェスタンブロットと蛍光標識された細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を利用して確認した。具体的には、培養した各細胞株を４％ホルムアルデヒドで固定させた後に、５％ノーマル（ｎｏｒｍａｌ）ウシ血清アルブミンを利用して遮断した。次いで、０．５μｇのｅＦｌｕｏｒ６６０標識された抗－ＣＤ３００ｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して染色した。その後、蛍光標識された細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を利用して確認した。
その結果、大腸癌、肺癌、乳癌など多様な癌細胞でＣＤ３００ｃ抗原がｍＲＮＡ及びタンパク質の水準で発現することを確認した。また、図６に示されたように、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を利用した分析結果、一般の細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ）と比較してヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）及びヒト単球細胞株（ＴＨＰ－１）で遥かに多くのＣＤ３００ｃが発現することを確認した。
実験例１．２．癌組織及び免疫細胞におけるＣＤ３００ｃの発現の確認（Ｉ）
患者の癌組織においてＣＤ３００ｃの発現を確認するために、組織マイクロアレイを次のように行った。大腸癌患者の組織をホルマリン固定し、パラフィンでブロックを製作した後、微細組織アレイで直径２．０ｍＭ、厚さ３～５ｕｍの厚さで薄切りした。次いで、スライドに一定方向に付着させて乾燥させた。Ｈ＆Ｅ染色を通じて癌組織を染色した後、抗－ＣＤ３００ｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：５００で処理してＣＤ３００ｃを染色した。その結果、図７ａに示されたように、患者の大腸癌組織でＣＤ３００ｃが発現していることを確認した。
ＣＤ３００ｃが大腸癌患者の組織だけでなく、癌組織内の免疫細胞でも発現するかどうかを確認するために、２Х１０５個のＣＴ２６細胞を８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で移植した。腫瘍移植後、２５日目（Ｄ２５）に犠牲にさせて抗－ＣＤ３００ｃ抗体を投与していない対照群マウス６匹から腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を取り出した後、コラゲナーゼＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）とＤＮａｓｅ Ｉ（２ｍｇ／ｍｌ）の混合溶液中で３７℃で１時間インキュベートした。その後、７０μｍのセルストレーナー（ｓｔｒａｉｎｅｒ）で濾過し、赤血球を溶解させた後、ナイロンメッシュで再濾過した。その後、単一細胞浮遊液をＣＤ１６／３２抗体（入手先：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で遮断し、細胞生存度確認用染色液（入手先：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び総マクロファージのマーカーであるＦ４／８０（Ａｂｃａｍ）、ＣＤ１１ｂ（入手先：Ａｂｃａｍ）、ＣＤ１１ｃ（入手先：Ａｂｃａｍ）、ＣＤ３（入手先：Ａｂｃａｍ）、ＣＤ４（入手先：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＣＤ８（入手先：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に対する抗体とＣＤ３００ｃ抗体（入手先：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で細胞を染色した。その後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメトリーでデータを読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
その結果、図７ｂに示されたように、マウスの腫瘍組織内にＣＤ３００ｃを発現する免疫細胞が存在することを確認した。これは、ＣＤ１１ｂとＣＤ１１ｃマーカーを同時に発現している免疫細胞であり、その例としては、樹状細胞、マクロファージなどがある。このような結果から、癌組織と免疫細胞のいずれにおいてもＣＤ３００ｃが発現することを確認した。
実験例１．３．癌組織及び免疫細胞におけるＣＤ３００ｃの発現の確認（ＩＩ）
ヒトの免疫組織と癌細胞でＣＤ３００ｃが発現するかどうかを確認するために、次のように組織マイクロアレイを施行した。正常の扁桃組織と大腸癌患者の組織をホルマリン固定し、パラフィンでブロックを製作した。その後、正常の扁桃組織と大腸癌患者の組織中、組織マイクロアレイを施行する位置を探した後、微細組織アレイで直径２．０ｍＭ、厚さ３～５ｕｍの厚さで薄切りした。次いで、スライドに一定方向に付着させて乾燥させた。Ｈ＆Ｅ染色を通じて癌組織を染色した後、抗－ＣＤ３００ｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：５００で処理してＣＤ３００ｃを染色した。
その結果、図８ａ及び図８ｂに示されたように、免疫組織である正常の扁桃組織（図８ａ）と患者の大腸癌組織（図８ｂ）の両方でＣＤ３００ｃが発現していることを確認した。扁桃にはＴ細胞、単球など多数の免疫細胞が分布しているため、扁桃組織でＣＤ３００ｃが発現するということは免疫細胞でＣＤ３００ｃが発現することを意味する。本実験例は、実験例１．２と同様に大腸癌患者の組織でＣＤ３００ｃが発現することを確認したものであるが、４人の大腸癌患者の組織全てでＣＤ３００ｃの発現を観察したことで、多数の大腸癌組織でＣＤ３００ｃが発現することを確認したという意味を有する。
実験例２．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体のＣＤ３００ｃ抗原認識及びそれに対する結合の確認
実験例２．１．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の抗原結合能（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）の確認
実施例１で製作された抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の抗原結合能を確認するために、結合ＥＬＩＳＡを行った。具体的には、コーティング緩衝溶液（０．１Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０）にＣＤ３００ｃ抗原（１１８３２－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）またはＣＤ３００ａ抗原（１２４４９－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をそれぞれ１ウェル当たり８ｕｇ／ｍＬの濃度になるようにＥＬＩＳＡプレートに分注した後、室温で３時間反応させて抗原をプレートに結合させた。次いで、ＰＢＳＴを利用して３回洗浄して結合されていない抗原を完全に除去した後に、それぞれのウェルに５％ ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が添加されているＰＢＳＴを３００μＬ添加し、室温で１時間反応させ、ＰＢＳＴを利用して再洗浄した。その後、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を４倍希釈して加え、１時間室温で反応させて抗原と結合させた。１時間後にＰＢＳＴを利用して３回洗浄して結合されていない抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を除去した後に、４μｇ／ｍＬの検出用抗体（ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－Ｆｃ ＩｇＧ）を添加し、再び室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴを利用して結合されていない検出用抗体を除去した後にＴＭＢ溶液を添加し、１０分間反応させて発色させた後に、２Ｎの硫酸溶液を添加して発色反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を測定し、ＣＤ３００ｃ抗原に特異的に結合する抗体を確認した。その結果は、表６及び図９に示した。
表６に示されるように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体のＥＣ５０（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｔｈａｔ ｃａｕｓｅｓ ５０％ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を測定した結果、４個のクローン（ＣＫ３，ＣＬ８，ＳＫ１５，ＳＫ１６）を除き、残りの１４個のクローンが全て０．２μｇ／ｍＬ以下として結合親和力（Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）が高いことを確認した。また、図９に示されたように、結合ＥＬＩＳＡの結果によるＳ字状曲線（ｓｉｇｍｏｉｄ ｃｕｒｖｅ）でも本発明の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が強い結合力でＣＤ３００ｃ抗原に結合することを確認することができた。
実験例２．２．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の細胞抗原認識の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体（ＣＬ７）が細胞抗原を認識することを確認するために、ＦＡＣＳ結合を行った。
２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）とＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ）でＣＤ３００ｃを過剰発現させた後、この細胞を各微細遠心分離チューブ当たり２ｘ１０５個の細胞に分注した。その後、１０ｕｇ／ｍｌから３倍に連続希釈した抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を３０分間ＣＯ２インキュベーターで反応させ、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。その後、１：１００でＦＡＣＳ緩衝液に希釈したＦＩＴＣ－接合抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を３０分間ＣＯ２インキュベーターで反応させ、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ社のＣｙｔｏＦＬＥＸ機器でＦＩＴＣ信号を測定した後、ＣｙｔＥｘｐｅｒｔプログラムを用いてＭＦＩ値を求めた。このようにして得たＭＦＩ値を用いてｓｉｇｍａｐｌｏｔプログラムによりＳ字状曲線を描いてＥＣ５０（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｔｈａｔ ｃａｕｓｅｓ ５０％ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を計算した。その結果、２９３Ｔ細胞の場合、２．７ｎＭ、ＴＨＰ－１細胞の場合、２．６ｎＭのＥＣ５０を得た。
図１０に示されたように、ＦＡＣＳ結合の結果によるＳ字状曲線において実施例１で製造した抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体は、強い結合力でＴＨＰ－１及び２９３Ｔ細胞の表面で過剰発現されたＣＤ３００ｃに結合した。したがって、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体は、ＣＤ３００ｃに抗原特異的に結合することが確認された。
実験例２．３．ＣＤ３００ｃ抗原に対する抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の結合力の確認（Ｉ）：結合ＥＬＩＳＡ
ＣＤ３００ｃ抗原（２５０ｕｇ／ｍＬ）をコーティング緩衝溶液（０．１ Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０）に８００ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈して９６－ウェルマイクロプレートに１００ｕＬずつ入れて、４℃で一晩中インキュベートした。翌日、ＰＢＳＴ ２００ｕＬで３回洗浄した。その後、遮断緩衝溶液（５％スキムミルク）を２００ｕＬずつ入れて、室温で１時間遮断した。抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７をＰＢＳに２００ｕｇ／ｍＬで希釈してナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ；製品名：ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ／Ｏｎｅｃ、メーカー：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定して濃度を確認した。その後、ＣＬ７をＰＢＳで１０ｕｇ／ｍＬから４倍希釈してそれぞれ１００ｕＬずつ添加した後、室温で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴ ２００ｕＬで３回洗浄した。２次抗体（接合抗－Ｆｃ ＩｇＧ）を遮断緩衝溶液に１：１０，０００に希釈して１００ｕＬを添加した後、室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴ ２００ｕＬを添加して３回洗浄した。次いで、ＴＭＢと過酸化水素を１：１で混ぜて各ウェルに１００ｕＬずつ入れた後、室温で７分～９分間反応させた。その後、１Ｎ硫酸５０ｕｌを添加して発色を止めた後、マイクロプレートリーダー（製品名：Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ）を利用して４５０ｎｍで測定して結合親和度結果を得た。
その結果、図１１に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が濃度依存的な方式でＣＤ３００ｃに結合することを確認し、これは、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が抗原であるＣＤ３００ｃに対して優れた結合力と特異性を有することを示す。
実験例２．４．ＣＤ３００ｃ抗原に対する抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の結合力の確認（ＩＩ）：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
抗原であるＣＤ３００ｃと抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７間の結合親和度を確認するために、表面プラズモン共鳴実験を進めた。
ＣＤ３００ｃをＣＭ５チップに固定するために、５ｕｇ／ｍｌのＣＤ３００ｃを１０ｍＭアセテート緩衝溶液（ｐＨ ５．５）に希釈した。その後、流量を全て同一に１０ｍｌ／分にし、それぞれの目標ＲＵを３００ＲＵと設定した。０．２Ｍ ＥＤＣと０．０５Ｍ ＮＨＳの混合物で活性化を進めて１Ｍエタノールアミンで遮断し、ＣＤ３００ｃの最終ＲＵが３９９．２ ＲＵになるように固定化した。その後、ＣＬ７をＰＢＳＰにそれぞれ０、０．１９５、０．３９、０．７８、１．５６、３．１２５、６．２５ｕｇ／ｍｌの濃度に希釈し、結合時間を２４０秒とし、解離時間を９００秒とし、流量を３０ｕｌ／分と設定してカイネティクス／親和度（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ／Ａｆｆｉｎｉｔｙ）試験を進めた。その後、５０ｍＭ ＮａＯＨを３０ｕｌ／分の速度で３０秒間流して表面を再生させた。
その結果、図１２に示されたように、ＫＤ値は５．１９９Ｅ－１０Ｍと分析され、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の結合親和度は、ナノモル以下（ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌ）の水準である０．５２ｎＭと確認された。これは、抗原に対する抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の結合力が高いことを意味する。
実験例２．５．ＣＤ３００ｃ抗原に対する抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の結合特異性の確認（Ｉ）
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７が他のＢ７ファミリータンパク質には結合せず、ＣＤ３００ｃのみに特異的に結合することを確認するために、結合ＥＬＩＳＡを行った。より詳しくは、コーティング緩衝溶液（０．１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０）にＣＤ３００ｃ抗原、ＣＤ３００ａ抗原またはＢ７ファミリータンパク質抗原７種（ＰＤ－Ｌ１［Ｂ７－Ｈ１］（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＣＯＳ Ｌｉｇａｎｄ［Ｂ７－Ｈ２］（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＣＤ２７６［Ｂ７－Ｈ３］（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｂ７－Ｈ４（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＣＤ８０［Ｂ７－１］（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＣＤ８６［Ｂ７－２］（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＣＤ２７３［ＰＤ－Ｌ２］（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ））をそれぞれ１ウェル当たり８μｇ／ｍＬの濃度になるようにＥＬＩＳＡプレートにコーティングした後、２℃～８℃で一晩中インキュベーションして抗原をプレートに結合させた。ＰＢＳＴを利用して３回洗浄して結合されていない抗原を完全に除去した後、それぞれのウェルに遮断緩衝溶液（ＰＢＳＴ中の５％脱脂乳）３００ｍｌを添加した。次いで、室温で１時間遮断した後、ＰＢＳＴを利用して再洗浄した。その後、ＣＬ７をＰＢＳに４倍希釈し、１時間室温で反応させて抗原と結合させた。１時間後、ＰＢＳＴを利用して３回洗浄した。次いで、遮断緩衝溶液に４μｇ／ｍＬで希釈した２次抗体（ＨＲＰ－接合抗－Ｆｃ ＩｇＧ）を添加し、再び室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴを利用して結合されていない検出用抗体を除去した後、ＴＭＢ溶液を添加し、１０分間反応させて発色させた。次いで、２Ｎ硫酸溶液を添加して発色反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を測定し、ＣＤ３００ｃ抗原に特異的に結合する抗体を確認した。
その結果、図１３に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体は、他の類似タンパク質には結合せず、ＣＤ３００ｃのみを特異的に認識することを確認した。
実験例２．６．ＣＤ３００ｃ抗原に対する抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の結合特異性の確認（ＩＩ）
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７のＣＤ３００ｃ抗原に対する特異性を確認するために、ＣＬ７が既にＣＤ３００ｃ抗原と拮抗作用をすることが知られているだけでなく、それとタンパク質配列が類似のＣＤ３００ａ抗原に対して交差反応性を示すかどうかをさらに確認した。より詳しくは、ＣＤ３００ａ抗原（入手先：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を０．０３９、０．６３、及び１０μｇ／ｍＬの濃度で処理した後、実験例２．１と同様の方法で結合ＥＬＩＳＡを行った。
その結果、図１４に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体は、ＣＤ３００ｃ以外の抗原には結合しないため、ＣＤ３００ｃ抗原のみに高い結合特異性を示すことを確認することができた。
実験例２．７．ＣＤ３００ｃ発現量による多様な癌患者の全生存期間の比較
米国ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）データベースから得た腎臓癌（５３０人）、膵臓癌（１７７人）及び肝臓癌（３７０人）患者のデータを利用してＣＤ３００ｃの発現水準による全生存期間（Ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）を比較した。まず、各癌患者をＣＤ３００ｃ発現量の高低により分類した。このような高低は、癌腫別ＣＤ３００ｃ発現量の平均と比較して区分したものである。腎臓癌患者の場合、３９４人は低いＣＤ３００ｃの発現水準を示し、１３６人は高いＣＤ３００ｃの発現水準を示した。膵臓癌患者の場合、５７人は低いＣＤ３００ｃの発現水準を示し、１２０人は高いＣＤ３００ｃの発現水準を示した。一方、肝臓癌患者の場合、１９２人は低いＣＤ３００ｃの発現水準を示し、１７８人は高いＣＤ３００ｃの発現水準を示した。各癌患者のＣＤ３００ｃ発現量による全生存期間をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ方法で分析した。次いで、ｌｏｇ－順位検定によりＣＤ３００ｃ発現水準が高い患者群と低い患者群の生存期間を比較した。
その結果、図１５に示されたように、ＣＤ３００ｃ発現水準が低い患者に比べてＣＤ３００ｃ発現水準が高い患者が生存期間が短いことを確認し、これは、Ｐ値を考慮して見ると、有意な結果であることを示す。このような結果は、ＣＤ３００ｃの発現が癌患者の生存期間と非常に関連性があることを意味するだけでなく、ＣＤ３００ｃの発現または活性を抑制した時、癌治療効果または生存期間増加効果を期待できることを意味する。
ＩＩＩ．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の抗癌効果
実験例３．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の投与による抗癌効果の確認
実験例３．１．Ｔ細胞活性化効果の確認
実施例１で製造された抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＴ細胞活性化を通じて抗癌効果を奏するかを確認するために、ヒトＴ細胞で抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の処理によるＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）の生産量を確認した。ＩＬ－２はＴ細胞の成長、増殖及び分化を助ける免疫因子であり、ＩＬ－２の生成量が増加することは、Ｔ細胞の分化、増殖、及び成長が増加するように誘導する刺激が増加することにより、Ｔ細胞を活性化させることを意味する。具体的には、それぞれ２μｇ／ウェルの濃度になるように、抗－ＣＤ３モノクローナル抗体と抗－ＣＤ２８モノクローナル抗体を９６－ウェルプレートに添加して２４時間固定させた後に、１ｘ１０５細胞／ウェルのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ヒトＴリンパ球細胞株）と１０μｇ／ウェルの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を共に処理した。次いで、ＩＬ－２の生成量をＥＬＩＳＡキット（ＩＬ－２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した後に、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理していない対照群と比較した。その結果を図１６に示した。
図１６に示されたように、抗－ＣＤ３モノクローナル抗体と抗－ＣＤ２８モノクローナル抗体を処理して活性化させたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理した場合にＩＬ－２の生成量が増加したことを確認し、前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＴ細胞を活性化させることと、これを通じて、抗癌免疫作用を誘発して癌組織の成長を抑制できることを確認することができた。
実験例３．２．Ｍ１マクロファージへの分化促進の確認（Ｉ）：マクロファージ分化マーカー（ＴＮＦ－α）生成量の測定
実施例１で選別された抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が単球細胞のＭ１マクロファージへの分化を促進させることができるかを確認するために、９６－ウェルプレートに１．５ｘ１０４細胞／ウェルでＴＨＰ－１（ヒト単球細胞株）を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体及び／又は１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを処理した。４８時間反応させた後に、Ｍ１マクロファージの分化マーカーであるＴＮＦ－α（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）の生成量をＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－αＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した。その結果を図１７及び図１８に示した。
図１７に示されたように、ＬＰＳを単独で処理した対照群（Ｃｏｎ）と比較してＣＬ４、ＣＬ７、ＣＬ１０、及びＳＬ１８抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が約２倍以上ＴＮＦ－αの生成量が増加したことを確認した。
また、図１８に示されたように、ＬＰＳを単独で処理した対照群（Ｃｏｎ）と比較してＬＰＳの処理なしに抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した実験群で全て対照群と比較してＴＮＦ－αの生成量が増加したことを確認した。
実験例３．３．Ｍ１マクロファージへの分化能の抗体濃度依存的増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＭ１マクロファージへの分化を誘導することが濃度に応じて増加することを確認するために、実験例３．２と同様の方法でＴＮＦ－αの生成量を確認した。抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を１０、１、及び０．１μｇ／ｍＬの濃度で処理した。その結果を図１９に示した。図１９に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体（ＣＬ７、ＣＬ１０またはＳＬ１８）の処理濃度が増加するほどＴＮＦ－αの生成量も増加することを確認した。
より詳細な濃度を確認するために、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体（ＣＬ７）を１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５７、及び０．０７９μｇ／ｍＬの濃度で処理し、ＴＮＦ－αの生成量を確認した。その結果を図２０に示した。図２０に示されたように、ＴＮＦ－αの生成量は、処理された抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の濃度が増加するにつれて増加することを確認した。
実験例３．４．Ｍ１マクロファージへの分化能促進の確認（ＩＩ）：細胞形態観察
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単球細胞に処理した時、Ｍ１マクロファージへの分化様相を細胞形態で確認するために、ＴＨＰ－１に１０μｇ／ｍｌの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理し、４８時間培養した後に細胞の形態を顕微鏡下で観察した。その結果を図２１に示した。
図２１に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理した実験群（ＣＬ７）の場合に、ＴＨＰ－１細胞の形態が浮遊細胞（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌ）でＭ１マクロファージの形態である円形の付着細胞に変わることを確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の処理により単球細胞のＭ１マクロファージへの分化が促進されることを確認した。
実験例３．５．Ｍ１マクロファージへの分化能促進の再確認
ＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がヒト単球細胞のＭ１マクロファージへの分化を促進させるかを再確認するために、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β）、及びＩＬ－８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－８）の分泌量をＥＬＩＳＡキットを利用して測定した。より詳しくは、９６－ウェルプレートに１．５ｘ１０４細胞／ウェルでＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理した。４８時間反応させた後に、Ｍ１マクロファージの分化マーカーであるＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－８の生成量をＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－αＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した。その結果を図２２に示した。
図２２に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理していない対照群（Ｃｏｎ）と比較し、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理した実験群（ＣＬ７）で三種類のＭ１マクロファージ分化マーカーが全部増加したことを確認した。
実験例３．６．Ｍ２マクロファージのＭ１マクロファージでの再分化能の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＭ２マクロファージをＭ１マクロファージに再分化させることができるかを確認するために、９６－ウェルプレートに１．５ｘ１０４細胞／ウェルでＴＨＰ－１を分注し、３２０ｎＭのＰＭＡを処理して６時間前処理した後に、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４）及びＩＬ－１３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３）、そして１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理し、１８時間反応させた。ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－８の生成量をＥＬＩＳＡキットで確認した。その結果を図２３～２５に示した。
図２３～図２５に示されたように、ＰＭＡを前処理していない場合にはＩＬ－４及びＩＬ－１３と抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を共に処理した実験群でＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－８の生成量が増加し、ＰＭＡを前処理した場合にも同様にＩＬ－４及びＩＬ－１３と抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を共に処理した実験群でＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－８の生成量が増加したことを確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＭ２マクロファージを再びＭ１マクロファージで効果的に再分化させることを確認することができた。
実験例３．７．Ｍ１マクロファージへの分化能及び再分化能の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体のＭ１マクロファージへの分化能及び再分化能を確認するために、９６－ウェルプレートに１．５ｘ１０４細胞／ウェルでＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を４８時間前処理し、１００ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ、そして２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４及びＩＬ－１３を処理して２４時間反応させた。ＴＮＦ－αの生成量をＥＬＩＳＡキットで確認した。その結果を図２６に示した。
図２６に示されたように、ＰＭＡを単独で処理したＭ０マクロファージ対照群、ＬＰＳを単独で処理したＭ１マクロファージ対照群、そしてＩＬ－４及びＩＬ－１３を単独で処理したＭ２マクロファージ対照群と比較し、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を前処理した実験群で全てＴＮＦ－αの生成量が有意に増加したことを確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体は、Ｍ０マクロファージのＭ１マクロファージへの分化能、ＴＨＰ－１のＭ１マクロファージへの分化能及びＭ２マクロファージのＭ１マクロファージへの再分化能に優れることを確認することができた。
実験例４．抗癌効果観察による抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の種間交差反応性の確認
実験例４．１．ヒト癌細胞の成長抑制効果の確認
ＣＤ３００ｃを標的とするモノクローナル抗体が癌細胞の成長に及ぼす影響を確認するために、Ａ５４９（ヒト肺癌細胞株）を利用して細胞増殖分析を行った。より詳しくは、９６－ウェルプレートに０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）の条件では２ｘ１０４細胞を分注し、０．１％ウシ胎児血清の条件では６ｘ１０３細胞を分注した。次いで、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理し、５日間培養した。ＣＣＫ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を処理し、ＯＤ４５０ｎｍで吸光度を測定して抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の癌細胞の成長抑制効果を確認した。その結果を図２７及び図２８に示した。
図２７に示されたように、０％ ＦＢＳの条件でＳＫ１１及びＳＫ１７を除いては、全部癌細胞の増殖を抑制する効果を奏することを確認した。
図２８に示されたように、０．１％ ＦＢＳの条件では、実験に用いた全ての抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が癌細胞の増殖を抑制する効果を奏することを確認した。
実験例４．２．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の濃度別癌細胞の成長抑制効果の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の濃度による癌細胞の成長抑制効果を確認するために、９６－ウェルプレートに０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）の条件では２ｘ１０４ Ａ５４９細胞を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理し、５日間培養した。次いで、ＣＣＫ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を処理して３時間反応させた後に、ＯＤ４５０ｎｍで吸光度を測定して抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の癌細胞の成長抑制効果を確認した。その結果を図２９に示した。
図２９に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の濃度が増加するにつれて癌細胞の成長が抑制されることを確認した。
実験例４．３．マウスにおいてＭ１マクロファージへの分化能の増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がマウスマクロファージからＭ１マクロファージへの分化能を促進させることができるかを確認するために、９６－ウェルプレートにマウスマクロファージ（Ｒａｗ２６４．７）を１ｘ１０４細胞／ウェルの濃度で分注した後に、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を共に処理して培養した。ＴＮＦ－αの生成量をＥＬＩＳＡキットで確認した。その結果を図３０に示した。
図３０に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理した実験群ではＴＮＦ－αの生成量が増加したことを確認し、前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がヒトだけでなく、マウスでも同様に作用してＭ１マクロファージへの分化を促進する交差反応性を有することが分かる。
実験例４．４．マウス癌細胞の成長抑制効果の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７、ＣＬ１０及びＳＬ１８が抗癌効果を奏するかを確認するために、ＣＴ２６（マウス大腸癌細胞株）を９６－ウェルプレートに１ｘ１０４細胞／ウェルの濃度で分注し、１０ｕｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を処理し、５日間培養した後、ＣＣＫ－８検出を通じて細胞増殖分析を行った。
図３１に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体は、それぞれ対照群に比べて６６％（ＣＬ７）、１５％（ＣＬ１０）、及び３８％（ＳＬ１８）の癌細胞増殖抑制効果を発揮するため、マウスで癌治療効果を奏することを確認した。これにより、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体はヒトだけでなく、マウスでも同様に作用して抗癌効果を奏する交差反応性を有することが分かる。
実験例５．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤との間のインビトロ抗癌効果の比較
下記実験例で用いられた免疫抗癌剤それぞれの入手先は、次の通りである：イミフィンジ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）及びキイトルーダ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ）。
実験例５．１．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤との間のＭ１マクロファージへの分化能の比較：三つの分化マーカー（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－８）生成量の測定
比較するために、実験例３．２と同様の方法でＴＮＦ－αの生成量をＥＬＩＳＡキットで確認した。既存の免疫抗癌剤ではイミフィンジ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で処理した。その結果を図３２に示した。
図３２に示されたように、イミフィンジ（Ｉｍｆ）を単独で処理した比較群より抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＴＮＦ－αの生成量を顕著に増加させることを確認した。前記結果を通じて、既に知られている免疫抗癌剤より抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＭ１マクロファージへの分化能を顕著に増加させることを確認することができた。
他の免疫抗癌剤との比較のために、抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗癌剤であるイミフィンジ、抗－ＰＤ－１免疫抗癌剤であるキイトルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、そしてアイソタイプ対照群（免疫グロブリンＧ）抗体をそれぞれ１０μｇ／ｍＬの濃度で処理し、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－８の生成量をＥＬＩＳＡキットで確認した。その結果を図３３～図３５に示した。
図３３～図３５に示されたように、イミフィンジ、キイトルーダ、ＩｇＧ抗体に比べて抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－８の生成量を顕著に増加させることを確認し、前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が既存の免疫抗癌剤に比べてＭ１マクロファージへの分化促進を顕著に増加させることができることを確認することができた。
実験例５．２．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤との間のＭ０マクロファージのＭ１マクロファージへの分化能の比較
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤のＭ０マクロファージからＭ１マクロファージへの分化能を比較するために、９６－ウェルプレートに１．５ｘ１０４細胞／ウェルでＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体、１０μｇ／ｍＬのイミフィンジ、及び／又は２００ｎＭのＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ－１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ－１３－ａｃｅｔａｔｅ）を処理した。４８時間反応させた後に、ＴＮＦ－αの生成量をＥＬＩＳＡキットを利用して測定した。その結果を図３６に示した。
図３６に示されたように、免疫抗癌剤であるイミフィンジを単独で処理した比較群の場合にはＴＮＦ－αが生成されていないが、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した実験群ではＴＮＦ－αの生成量が増加したことを確認した。また、ＴＨＰ－１細胞にＰＭＡを処理してＭ０マクロファージで分化させた時にも、イミフィンジを処理した実験群と比較し、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理した実験群で顕著に高いＴＮＦ－α生成量を確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が既存の免疫抗癌剤に比べてＭ０マクロファージのＭ１マクロファージへの分化を促進させることを確認することができた。
実験例５．３．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤との間のＭ１マクロファージへの分化能の比較
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤のＭ１マクロファージへの分化能を比較するために、実験例３．２と同様の方法でＴＮＦ－αの生成量を確認した。その結果を図３７に示した。
図３７に示されたように、ＬＰＳを処理して単球細胞をＭ１マクロファージに分化させた時、イミフィンジとＬＰＳを共に処理した実験群ではＴＮＦ－αの生成量が有意な差を示さなかったが、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体とＬＰＳを共に処理した実験群では抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した実験群と比較してＴＮＦ－αの生成量が有意に増加したことを確認した。
実験例５．４．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤との間の癌細胞の成長抑制効果の比較
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と既存の免疫抗癌剤との癌細胞の成長抑制効果を比較するために、Ａ５４９（ヒト肺癌細胞株）とＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳癌細胞株）を利用して細胞成長抑制効果を確認した。より詳しくは、９６－ウェルプレートに０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）の条件では２ｘ１０４細胞を分注し、０．１％ウシ胎児血清の条件では６ｘ１０３細胞を分注した。次いで、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理し、５日間培養した後に、光学顕微鏡で観察した。その結果を図３８及び図３９に示した。
図３８に示されたように、Ａ５４９細胞株では免疫抗癌剤であるイミフィンジより抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が癌細胞の増殖をさらに効果的に抑制することを確認した。
図３９に示されたように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株では免疫抗癌剤であるイミフィンジより抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が癌細胞の増殖をさらに効果的に抑制することを確認した。
実験例６．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体のインビボ抗癌効果の確認
実験例６．１．腫瘍関連のマクロファージ（ＴＡＭ）の増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７が腫瘍関連のマクロファージに及ぼす影響をインビボ条件で確認するために、大腸癌細胞株（ＣＴ２６） ２ｘ１０５個を８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射で移植して同種移植（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）マウス腫瘍モデルを製作した。動物の飼育及び実験は、全てＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）施設で進めた。大腸癌細胞株を移植し、１２日後に、腫瘍の大きさが５０～１００ｍｍ３であるマウスに抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体をそれぞれ投与して、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、リン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を同量注射した。１週間に２回ずつ２週間合計４回にかけてマウスに腹腔内注射（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で２５ｍｇ／ｋｇの用量で注射した。注射後２５日目にマウスを犠牲にさせて対照群と比較して抗腫瘍効果が最も高かったＣＬ７ ２５ｍｇ／ｋｇ投与群のそれぞれ６匹のマウスから腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を取り出した後、コラゲナーゼＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）とＤＮａｓｅ Ｉ（２ｍｇ／ｍｌ）の混合溶液中で３７℃で１時間インキュベートした。その後、７０μｍのセルストレーナーで濾過し、赤血球を溶解させた後、ナイロンメッシュで再濾過した。その後、単一細胞浮遊液をＣＤ１６／３２（入手先：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体で遮断し、細胞生存度確認用染色液、及び総マクロファージのマーカーであるＦ４／８０及びＭ１マクロファージマーカーであるｉＮＯＳに対する抗体（入手先：Ａｂｃａｍ）で細胞を染色した。その後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメトリーでデータを読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
その結果、図４０に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時、マウス癌組織でＭ１形態の腫瘍関連のマクロファージの発現量が増加することを確認した。これは、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の投与を通じて癌組織内の腫瘍関連のマクロファージが増加して癌の成長を抑制することを意味する。
実験例６．２．細胞毒性Ｔ細胞の増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７がＣＤ８＋ Ｔ細胞に及ぼす影響をインビボ条件で確認するために、実験例６．１と同様に同種移植マウス腫瘍モデルを製作して同濃度で投与した。注射後２５日目にマウスを犠牲にさせて対照群と比較して抗腫瘍効果が最も高かったＣＬ７ ２５ｍｇ／ｋｇ投与群のそれぞれ６匹のマウスから腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を取り出した後、コラゲナーゼＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）とＤＮａｓｅ Ｉ（２ｍｇ／ｍｌ）の混合溶液中で３７℃で１時間インキュベートした。その後、７０μｍのセルストレーナーで濾過し、赤血球を溶解させた後、ナイロンメッシュで再濾過した。その後、単一細胞浮遊液をＣＤ１６／３２（入手先：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体で遮断し、細胞生存度確認用染色液及びＣＤ８＋抗体（入手先：Ａｂｃａｍ）及びＣＤ４＋抗体（入手先：Ａｂｃａｍ）で細胞を染色した。その後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメトリーでデータを読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
その結果、図４１に示されたように、抗－ＣＤ３００Ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時、腫瘍内ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数が増加することを確認した。これは、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の投与が腫瘍内細胞毒性Ｔ細胞を増加させて癌治療効果を奏することを意味する。
実験例６．３．細胞毒性Ｔ細胞の腫瘍特異的増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７が腫瘍特異的な方式でＣＤ８＋ Ｔ細胞数を増加させるかを確認するために、実験例６．１と同様に同種移植マウス腫瘍モデルを製作して同濃度で投与した。注射後２５日目にマウスを犠牲にさせて対照群と比較して抗腫瘍効果が最も高かったＣＬ７ ２５ｍｇ／ｋｇ投与群のそれぞれ６匹のマウスから腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を取り出した後、コラゲナーゼＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）とＤＮａｓｅ Ｉ（２ｍｇ／ｍｌ）の混合溶液中で３７℃で１時間インキュベートした。その後、７０μｍのセルストレーナーで濾過し、赤血球を溶解させた後、ナイロンメッシュで再濾過した。その後、単一細胞浮遊液をＣＤ１６／３２（入手先：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体で遮断し、細胞生存度確認用染色液及びＡＨ１テトラマー抗体（入手先：Ａｂｃａｍ）で細胞を染色した。その後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメトリーでデータを読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
その結果、図４２に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で投与した時、ＣＤ８＋ Ｔ細胞でＣＴ２６腫瘍マーカー因子であるＡＨ１－テトラマーの発現が増加するにつれてＣＤ８＋ Ｔ細胞は腫瘍（ＣＴ２６）特異的な方式でその数が増加したことを確認した。これは、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の投与がＣＴ２６癌細胞を標的にしてこれを抑制するためにＣＤ８＋ Ｔ細胞を増加させたことを意味する。
実験例６．４．細胞毒性Ｔ細胞の活性増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７がＣＤ８＋ Ｔ細胞に及ぼす影響をインビボ条件で確認するために、実験例６．１と同様に同種移植マウス腫瘍モデルを製作して同濃度で投与した。注射後２５日目にマウスを犠牲にさせて対照群と比較して抗腫瘍効果が最も高かったＣＬ７ ２５ｍｇ／ｋｇ投与群のそれぞれ６匹のマウスで脾臓を採取した。次いで、ＥＬＩＳＰＯＴ分析法を通じてＩＦＮ－ｇを測定して結果を確認した。具体的には、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（＃ＥＬ４８５）のＭｏｕｓｅ ＩＦＮ－ｇ ＥＬＩＳｐｏｔキットを購入し、キットのプロトコルによりＩＦＮ－ｇを測定した。
その結果、図４３に示されたように、抗－ＣＤ３００Ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時、ＩＦＮ－ｇの発現が増加することを確認した。これは、抗－ＣＤ３００Ｃモノクローナル抗体の単独投与がＣＤ８＋ Ｔ細胞数増加をもたらす（図４１を参照）ことに加えてＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性増加ももたらすことにより、多方面で癌成長を抑制して癌治療効果を奏することを意味する。
実験例６．５．調節Ｔ細胞に比べて細胞毒性Ｔ細胞の増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７が調節Ｔ細胞に比べて細胞毒性Ｔ細胞の増加に及ぼす影響をインビボ条件で確認するために、実験例６．１と同様に同種移植マウス腫瘍モデルを製作して同濃度で投与した。注射後２５日目にマウスを犠牲にさせて対照群と比較して抗腫瘍効果が最も高かったＣＬ７ ２５ｍｇ／ｋｇ投与群のそれぞれ６匹のマウスから腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を取り出した後、コラゲナーゼＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）とＤＮａｓｅ Ｉ（２ｍｇ／ｍｌ）の混合溶液中で３７℃で１時間インキュベートした。その後、７０μｍのセルストレーナーで濾過し、赤血球を溶解させた後、ナイロンメッシュで再濾過した。その後、単一細胞浮遊液をＣＤ１６／３２（入手先：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体で遮断し、細胞生存度確認用染色液、Ｔｒｅｇマーカータンパク質であるＣＤ２５（入手先：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）とＦｏｘｐ３（入手先：Ａｂｃａｍ）に対する抗体（入手先：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＣＤ３＋抗体及びＣＤ８＋抗体で細胞を染色した。その後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメトリーでデータを読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
その結果、図４４に示されたように、抗－ＣＤ３００Ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時、ＣＤ８＋ Ｔ細胞がＴｒｅｇ Ｔ細胞に比べて増加することを確認した。これは、抗－ＣＤ３００Ｃモノクローナル抗体の投与でその数が増加したＣＤ８＋ Ｔ細胞が癌の成長をさらに抑制することを意味する。
実験例６．６．細胞毒性Ｔ細胞、調節Ｔ細胞及び腫瘍関連のマクロファージに対する影響の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７が細胞毒性Ｔ細胞、調節Ｔ細胞及び腫瘍関連のマクロファージに対して及ぼす影響を確認するために、次のような実験を行った。実験例６．１と同様に同種移植マウス腫瘍モデルを製作した。大腸癌細胞株を移植し、１２日後に、腫瘍の大きさが５０～１００ｍｍ３であるマウスに抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体をそれぞれ投与し、対照群としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を同量注射した。１週間に２回ずつ２週間合計４回にかけてマウスに腹腔内注射で２５ｍｇ／ｋｇの用量で注射した。注射後２５日目にマウスを犠牲にさせて対照群と比較して抗腫瘍効果が最も高かったＣＬ７ ２５ｍｇ／ｋｇ投与群のそれぞれ６匹のマウスから腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を取り出した後、コラゲナーゼＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）とＤＮａｓｅ Ｉ（２ｍｇ／ｍｌ）の混合溶液中で３７℃で１時間インキュベートした。その後、７０μｍのセルストレーナーで濾過し、赤血球を溶解させた後、ナイロンメッシュで再濾過した。その後、単一細胞浮遊液をＣＤ１６／３２（入手先：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体で遮断し、細胞生存度確認用染色液、及びＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌマーカーであるＣＤ８＋抗体及びＣＤ４＋抗体で細胞を染色、またはＴｒｅｇ ｃｅｌｌマーカーであるＦｏｘｐ３抗体及びＣＤ４＋抗体で細胞を染色、または総マクロファージのマーカーであるＦ４／８０及びＭ１マクロファージマーカーであるｉＮＯＳに対する抗体（入手先：Ａｂｃａｍ）で細胞を染色した。その後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメトリーでデータを読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。その結果を図４５に示した。
図４５に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体（ＣＬ７）は、活性化したＣＤ８＋ Ｔ細胞を有意に増加させ、調節Ｔ細胞を抑制し、腫瘍関連のマクロファージをＭ１表現型側に再分極させることが確認された。
実験例６．７．インビボ癌成長抑制効果の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７の抗癌効果をインビボ条件で確認するために、大腸癌細胞株（ＣＴ２６）２ｘ１０５個を８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射で移植して同種移植マウス腫瘍モデルを製作した。動物の飼育及び実験は、全てＳＰＦ施設で進めた。大腸癌細胞株を移植した後１１日目（Ｄ１１）に、腫瘍の大きさが５０～１００ｍｍ３であるマウスに抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体をそれぞれ１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇで投与し、対照群としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を同量注射した。具体的には、マウスに腹腔内注射でそれぞれの用量を１週間２回、２週間合計４回（Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８及びＤ２１）注射した。２５日間腫瘍体積を測定した。その結果を図４６に示した。
図４６に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７は、ＣＴ２６大腸癌成長を用量依存的な方式で遅延させることが確認された。
ＩＶ．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の投与によるバイオマーカーの発現変化
実施例２．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の投与による免疫細胞関連マーカー及び腫瘍微細環境関連マーカーの発現変化
実施例２．１．ナノストリング免疫プロファイリング
実施例１で製造した抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体（ＣＬ７）を固形癌モデルに投与した時、免疫細胞及び腫瘍微細環境関連マーカーの発現変化を確認するために、大腸癌細胞株（ＣＴ２６）２ｘ１０５個を８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射で移植して同種移植マウス腫瘍モデルを製作した。動物の飼育及び実験は、全てＳＰＦ施設で進めた。大腸癌細胞株を移植し、１２日後に、腫瘍の大きさが５０～１００ｍｍ３であるマウスに抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体をそれぞれ投与し、対照群としては、リン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を同量注射した。１週間に２回ずつ２週間合計４回にかけてマウスに腹腔内注射（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で２５ｍｇ／ｋｇの用量で注射した。注射後２５日目にマウスを安楽死させて腫瘍組織を準備した。これからＲＮＡを抽出して精製した後、ナノストリング免疫プロファイリングを通じて樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）マーカー、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）マーカー、腫瘍微細環境（ＴＭＥ）マーカー、Ｔｈ１反応マーカー、またはＴｈ２反応マーカーの変化を確認した。
前記ナノストリング免疫プロファイリング結果を図４７に示した。これから抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の投与は、腫瘍免疫微細環境を広範囲にリプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）したことを確認した。
また、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の投与による樹状細胞マーカー、マクロファージマーカー、腫瘍微細環境マーカー、Ｔｈ１反応マーカー、またはＴｈ２反応マーカーの変化を対照群に比べて観察した結果を図４８に示した。図４８に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の投与時、樹状細胞マーカーであるＢｓｔ２、ＣＣＬ８、Ｘｃｌ１の発現が有意に増加し；Ｍ１マクロファージマーカーであるＣＣＲ７、ＣＤ８０の発現が有意に増加し；腫瘍微細環境で癌の生長を助けるｖｅｇｆａ、ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ４ａ１、Ｈｉｆ１ａの発現が減少し；Ｔｈ１反応を確認できるマーカーであるＴｂｘ２１、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ４、Ｉｆｎ－ｇ、Ｃｘｃｒ３の発現が増加したことが確認された。
実施例２．２．免疫関門マーカーの発現変化
実施例２．１で得られたナノストリング免疫プロファイリング結果に基づいて、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を同種移植マウス腫瘍モデルに投与した時にどの免疫関門マーカーの発現が対照群に比べて有意な差を示すかを確認した。
その結果を図４９に示した。抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が投与された場合、抑制性免疫関門（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＩＣ）のＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ｌａｇ３の発現が増加し、作用性免疫関門（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＩＣ）のＩＣＯＳ、ＯＸ４０、Ｇｉｔｒ、Ｃｄ２７及びＣｄ２８の発現も増加したことが確認された。
このような結果は、さらに向上した抗癌効能を得るために抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と追加の免疫抗癌剤を併用投与する場合、どの免疫関門の免疫抗癌剤を選択すべきかに関する有用な情報を提供できるという点で相当な意義を有する。
Ｖ．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用
実施例３．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体（ＣＬ７）と免疫抗癌剤の併用投与
実施例１で製造された抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体（ＣＬ７）を他の免疫抗癌剤、例えば、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体であるイミフィンジ（Ｉｍｆｉｎｚｉ(R)）とオプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ(R)）、抗－ＰＤ－１抗体であるキイトルーダ、抗－ＣＤ４７抗体（αＣＤ４７）、抗－ＣＴＬＡ－４抗体と併用し、その結果を観察した。
前記免疫抗癌剤それぞれの入手先は、次の通りである：イミフィンジ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；オプジーボ、抗－ＣＴＬＡ－４抗体（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ）、キイトルーダ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ）、及び抗－ＣＤ４７抗体（Ａｂｃａｍ）。
実験例７．併用によるマクロファージ活性の（相乗的）増加の確認
実験例７．１．Ｍ１マクロファージの増加の確認
実施例１で製造した抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７を抗－ＰＤ－Ｌ１抗体であるイミフィンジ、抗－ＰＤ－１抗体であるキイトルーダ、抗－ＣＤ４７抗体（αＣＤ４７）などの免疫抗癌剤と併用で単球細胞に処理した時、Ｍ１マクロファージへの分化様相を細胞形態で確認するために、ＴＨＰ－１（ヒト単球細胞株）にそれぞれ１０μｇ／ｍｌの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤を単独または併用で処理し、４８時間培養した後に細胞の形態を顕微鏡下で観察した。
その結果、図５０に示されたように、免疫抗癌剤を単独処理した場合に比べて抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体とともに併用で処理した場合に、ＴＨＰ－１細胞の形態が浮遊細胞（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌ）でＭ１マクロファージの形態である円形の付着細胞に変わることを確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用処理により単球細胞のＭ１マクロファージへの分化がさらに促進されることが確認された。
実験例７．２．Ｍ１マクロファージマーカーの増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７を抗－ＰＤ－Ｌ１抗体であるイミフィンジ、抗－ＰＤ－１抗体であるオプジーボ、抗－ＰＤ－１抗体であるキイトルーダ、抗－ＣＤ４７抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体の免疫抗癌剤と併用で処理した時、単球細胞のＭ１マクロファージへの分化誘導が増加するかを確認するために、９６－ウェルプレートに１．５ｘ１０４細胞／ウェルのＴＨＰ－１を分注し、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤をそれぞれ１０μｇ／ｍＬで単独または併用で処理した。４８時間反応させた後に、Ｍ１マクロファージの分化マーカーであるＴＮＦ－α（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－８の生成量をＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－αＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した。
その結果、図５１に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が単独で処理された場合、三つの分化マーカー全ての生成量が増加し、特にＩＬ－８の生成量が顕著に増加したことが確認された。また、図５２に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時に比べて、イミフィンジ、オプジーボ、キイトルーダ、αＣＤ４７と併用で処理した時にＭ１マクロファージのマーカーであるＴＮＦ－αの生成量がさらに増加することが確認された。これから、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時より抗－ＰＤ－１抗体及び／又は抗－ＣＤ４７抗体と併用で処理した時に単球細胞がＭ１マクロファージにさらに多く分化することが確認された。
実験例７．３．Ｍ２マクロファージマーカーの減少の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体をイミフィンジ、オプジーボ、キイトルーダ、抗－ＣＴＬＡ－４またはαＣＤ４７などの免疫抗癌剤と併用で投与した時、単球細胞のＭ２マクロファージへの分化誘導が減少するかを確認するために、９６－ウェルプレートに１．５ｘ１０４細胞／ウェルのＴＨＰ－１を分注し、３２０ｎＭのＰＭＡを６時間前処理した後に、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４）及びＩＬ－１３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３）とともにそれぞれ１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤を単独または併用で処理して４８時間反応させた。その後、Ｍ２マクロファージの分化マーカーであるＩＬ－１０、ＩＬ－１２の生成量をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した。
その結果、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時より、イミフィンジ、オプジーボ、キイトルーダ、αＣＤ４７と併用で処理した時にＩＬ－１０、ＩＬ－１２の生成量が３０％以上さらに減少することが確認された。
実験例７．４．Ｍ１マクロファージ分化能の増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７を抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体、抗－ＣＤ４７抗体などの免疫抗癌剤と併用で処理した時に単球細胞のＭ１マクロファージへの分化能が増加することを確認するために、Ｍ１マクロファージ分化の代表的な信号であるＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）、ＩｋＢ及びＮＦ－ｋＢのシグナル伝達を確認した。具体的には、６－ウェルプレートに８．８ｘ１０５細胞／ウェルのＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体、１０μｇ／ｍＬのイミフィンジ、及び／又は１０μｇ／ｍＬのキイトルーダを処理した。対照群としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を同量処理した。４８時間培養した後に、ＭＡＰＫ信号の場合、リン酸化されたＳＡＰＫ／ＪＮＫ、リン酸化されたＥＲＫ、リン酸化されたｐ３８を、ＮＦ－ｋＢ信号の場合、リン酸化されたＮＦ－ｋＢを、ＩｋＢ信号の場合、リン酸化されたＩｋＢをウェスタンブロッティングを通じて確認した。その結果を図５３～図５５に示した。
図５３、図５４及び図５５は、それぞれＭＡＰＫ、ＮＦ－Ｋｂ及びＩｋＢのシグナル伝達を確認した結果を示す。抗－ＣＤ３００ｃを単独で処理した時と比較し、抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体、抗－ＣＤ４７抗体などの免疫抗癌剤と併用で処理した時にリン酸化されたＭＡＰＫ、ＩｋＢ、ＮＦ－ｋＢの量が増加することが確認された。これから、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時より抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体、抗－ＣＤ４７抗体などの免疫抗癌剤と併用で処理した時にＭ１マクロファージに分化する細胞信号伝達が増加することを確認した。
実験例８．併用による癌細胞の成長抑制効果の（相乗的）増加の確認（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
実験例８．１．細胞自滅信号の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７を抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体、抗－ＣＤ４７抗体などの免疫抗癌剤と併用で処理した時に細胞自滅信号が増加するかを確認した。具体的には、６－ウェルプレートに８ｘ１０５細胞／ウェルのＡ５４９を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体、１０μｇ／ｍＬのイミフィンジ、キイトルーダ、オプジーボ、抗－ＣＤ４７抗体を単独または併用で処理した。４８時間培養した後に、細胞自滅信号または細胞周期信号をウェスタンブロッティングを通じて確認した。確認した細胞自滅信号のマーカーとしては、切断された（ｃｌｅａｖｅｄ） ｃａｓｐａｓｅ－９、ｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－２、ｃａｓｐａｓｅ－８を確認し、細胞周期信号のマーカーとしては、サイクリンＤ１、ＣＤＫ２、ｐ２７ｋｉｐ１、ＣＤＫ６、サイクリンＤ３、Ｐ２１ Ｗａｆ１、Ｃｉｐ１などを確認した。
図５６に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時より抗－ＰＤ－１であるイミフィンジと併用処理した時、細胞自滅信号が増加し、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を抗－ＰＤ１、抗－ＰＤ－Ｌ１、抗－ＣＴＬＡ－４、抗－ＣＤ４７などの免疫抗癌剤とともに併用で処理した時にｃｌｅａｖｅｄ－ｃａｓｐａｓｅ９、ｐ２１の量が増加し、サイクリンＤ１は減少した。これから、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時より抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体、抗－ＣＤ４７抗体などの免疫抗癌剤と併用で処理した時に癌細胞の細胞自滅がさらによく誘導されることが確認された。
実験例８．２．癌細胞株の成長抑制効果の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７と免疫抗癌剤の併用投与による癌細胞の成長抑制効果を確認するために、Ａ５４９（ヒト肺癌細胞株）とＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳癌細胞株）を利用して癌細胞の成長抑制効果を比較した。具体的には、９６－ウェルプレートにウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）がない条件では２ｘ１０４細胞（Ａ５４９）または３ｘ１０４細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を分注し、０．１％ウシ胎児血清の条件では６ｘ１０３細胞（Ａ５４９）または１ｘ１０４細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を分注した。次いで、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体とイミフィンジを単独で処理したり併用で処理し、５日間培養した。対照群としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を同量処理した。次いで、ＣＣＫ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を処理し、ＯＤ ４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図５７（Ａ５４９）と図５８（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）に示した。
Ａ５４９細胞株に処理した場合、図５７に示されたように、ＦＢＳがない条件では抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時、対照群と比較して細胞成長抑制効果は１７％高く、イミフィンジと併用で処理した時には３４％高いことが確認された。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に処理した場合、図５８に示されたように、０．１％ ＦＢＳの条件では対照群と比較し、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の単独処理時、１９％高い癌細胞の成長抑制効果が観察され、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と抗－ＣＤ４７抗体を併用で処理した時には４５％高い抑制効果が観察され、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と抗－ＣＤ４７抗体、イミフィンジを共に処理した時には５１％高い抑制効果が観察された。０．１％ ＦＢＳの条件では抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の処理時、１９％高い癌細胞の成長抑制効果を奏し、抗－ＣＤ４７抗体と併用で処理した時には２２％高い抑制効果が観察され、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と抗－ＣＤ４７抗体、イミフィンジを全部併用で処理した時には３２％高い抑制効果が観察された。
前記結果から、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時より抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体、抗－ＣＤ４７抗体などの免疫抗癌剤と併用で処理した時に癌細胞の成長がさらに抑制されたことが確認された。
実験例９．併用によるインビボ抗癌効果の（相乗的）増加の確認（大腸癌マウスモデル）
実験例９．１．インビボ癌成長抑制効果の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７の抗癌効果をインビボ条件で確認するために、大腸癌細胞株（ＣＴ２６）２ｘ１０５個を８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射で移植して同種移植マウス腫瘍モデルを製作した。動物の飼育及び実験は、全てＳＰＦ施設で進めた。大腸癌細胞株を移植した後１２日目（Ｄ１２）に、腫瘍の大きさが５０～１００ｍｍ３であるマウスに抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体とそれぞれＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した抗－ＰＤ－１抗体を単独または併用して投与し、対照群としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を同量注射した。概略的な実験方法を図５９に示した。具体的には、マウスに腹腔内注射でそれぞれの抗体を単独または併用して１週間２回、２週間合計４回（Ｄ１２、Ｄ１５、Ｄ１９及びＤ２２）注射した（ＣＬ７：１０ｍｇ／ｋｇ；抗－ＰＤ－１抗体：１０ｍｇ／ｋｇ）。２５日間腫瘍体積を測定した。その結果を図６０に示した。
図６０から分かるように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独投与した実験群でも対照群と比較して癌の成長が抑制されるが、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時より抗－ＰＤ－１抗体などの免疫抗癌剤と併用で処理した時に、癌の成長がさらに効果的に抑制されたことが確認された。
実験例９．２．インビボ腫瘍微細環境における腫瘍浸潤リンパ球増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が腫瘍微細環境（ＴＭＥ）で腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＴＩＬ）に及ぼす影響を確認するために、実験例９．１と同様の方法で実験した２５日目マウスを安楽死させ、１％ ＰＦＡ（ｐａｒａ－ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）をマウスに血管内注入して灌流させた後、癌組織を得た。得られた癌組織を１％ ＰＦＡを利用して固定させ、順に１０％、２０％、３０％のスクロース溶液を利用して脱水した。脱水された癌組織をＯＣＴコンパウンド（Ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で冷凍させた後、冷凍組織切片機（Ｃｒｙｏｔｏｍｅ）を利用して癌組織を５０μｍ厚の切片にした。２０ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤと２ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ混合溶液で３７℃で１時間組織をインキュベートした後、７０ｕｍのセルストレーナーで濾過し、赤血球を溶解させた後、細胞を単一細胞にさせるために、ナイロンメッシュで再濾過した。単一細胞浮遊液で非特異的反応を抑制するためにＣＤ１６／３２（入手先：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体で１時間反応させ、細胞生存度を確認し、腫瘍浸潤リンパ球マーカーであるＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＤ３１＋癌血管細胞を染色した。
その結果、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独投与した実験群と比較し、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を抗－ＰＤ－１抗体または抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体、抗－ＣＤ４７抗体と併用投与した実験群でＣＤ８＋ Ｔ細胞が増加したことが確認され、これを通じて、抗－ＣＤ３００ｃを単独で処理した時より抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体、抗－ＣＤ４７抗体などの免疫抗癌剤と併用で処理した時に腫瘍微細環境で腫瘍浸潤リンパ球を増加させて抗癌効果を奏することを確認することができた。
実験例９．３．インビボにおけるＭ１マクロファージ増加効果の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体がマウスモデルで癌組織内のＭ１マクロファージを増加させるかを確認するために、実験例９．２と同様の方法で準備した癌組織切片をＭ１マクロファージマーカーであるｉＮＯＳとＭ２マクロファージマーカーであるＣＤ２０６に対する抗体で染色してＦＡＣＳで確認した。
その結果、図６１に示されたように、抗－ＰＤ－１抗体を処理した実験群ではＭ１マクロファージが対照群と比較して一部増加したが、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理した実験群ではＭ１マクロファージが顕著に増加し、Ｍ２マクロファージはほぼ観察されないことを確認した。また、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と抗－ＰＤ－１抗体を併用投与した実験群で、よりＭ１マクロファージが増加したことが確認された。前記結果から、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時より抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体、抗－ＣＤ４７抗体などの免疫抗癌剤と併用で処理した時にＭ１マクロファージへの分化を効果的に促進させることを確認した。
実験例９．４．インビボにおけるＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫促進効果の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７がマウス腫瘍モデルでＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫を促進するかを確認するために、実験例９．１と同様の方法で実験した２５日目マウスを安楽死させた後、１％ ＰＦＡをマウスに血管内注入して灌流させた後、癌組織を得た。得られた癌組織を１％ ＰＦＡを利用して固定させ、順に１０％、２０％、３０％スクロース溶液で脱水した。脱水された癌組織をＯＣＴコンパウンドで冷凍させた後、冷凍組織切片機を利用して癌組織を５０μｍ厚の切片にした。次いで、ＣＤ８＋及びｉＮＯＳで染色した。
図６２に示されたように、抗－ＰＤ－１抗体を処理した実験群ではＣＤ８＋ Ｔ細胞が対照群と比較して一部増加したが、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を処理した実験群ではＣＤ８＋ Ｔ細胞が顕著に増加することを確認した。また、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と抗－ＰＤ－１抗体を併用投与した実験群の場合、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が抗－ＰＤ－１単独処理群よりさらに増加したことを確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体が既存の免疫抗癌剤と併用された場合、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数をさらに効果的に増加させることを確認することができた。
実験例９．５．インビボ免疫細胞活性の増加効果の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を免疫抗癌剤と併用投与した時、免疫細胞の活性が増加するかを確認するために、実験例９．１と同様の方法で抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と抗－ＰＤ－１、抗－ＣＴＬＡ－４、抗－ＫＩＲ、抗－ＬＡＧ３、抗－ＣＤ１３７、抗－ＯＸ４０、抗－ＣＤ２７６、抗－ＣＤ２７、抗－ＧＩＴＲ、抗－ＴＩＭ３、抗－４１ＢＢ、抗－ＣＤ２２６、抗－ＣＤ４０、抗－ＣＤ７０、抗－ＩＣＯＳ、抗－ＣＤ４０Ｌ、抗－ＢＴＬＡ、抗－ＴＣＲ、抗－ＴＩＧＩＴ、抗－ＣＤ４７抗体を併用投与したマウスの脾臓を得た。得られた脾臓を実験例９．２に説明されたように、Ｔ細胞の活性度及びＮＫＴ細胞の活性度が分かる多様なマーカーでＦＡＣＳ染色し、ＭＦＩを通じて確認した。
その結果、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を前記免疫抗癌剤と併用投与した時、Ｔ細胞の活性化マーカーであるＧｚｍａ、Ｉｃｏｓ、ＣＤ６９、Ｉｆｎｇが増加し、またＮＫＴ細胞の活性化マーカーであるＣｄ１１、ＣＤ３８、ｃｘｃｒ６が有意に増加することを確認した。これから、抗－ＣＤ３００ｃを単独で処理した時より免疫抗癌剤と併用で処理した時にＴ細胞及びＮＫＴ細胞がさらに活性化したことが確認された。
実験例９．６．インビボＴｒｅｇ抑制効果の確認
固形癌モデルで抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と抗－ＰＤ－１、抗－ＰＤ－Ｌ１、抗－ＣＴＬＡ－４、抗－ＫＩＲ、抗－ＬＡＧ３、抗－ＣＤ１３７、抗－ＯＸ４０、抗－ＣＤ２７６、抗－ＣＤ２７、抗－ＧＩＴＲ、抗－ＴＩＭ３、抗－４１ＢＢ、抗－ＣＤ２２６、抗－ＣＤ４０、抗－ＣＤ７０、抗－ＩＣＯＳ、抗－ＣＤ４０Ｌ、抗－ＢＴＬＡ、抗－ＴＣＲ、抗－ＴＩＧＩＴ、抗－ＣＤ４７抗体などの免疫抗癌剤を併用で投与した時、免疫を抑制する反応を起こすＴｒｅｇ細胞の様相変化を確認するために、実験例９．２と同様の方法で準備した脾臓組織からＴ細胞を抽出してＣＤ３＋ Ｔ細胞中、ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇの数をＦＡＣＳ染色を通じて確認してみた。
ＣＤ３＋細胞でＴｒｅｇの比率を見た時、各免疫抗癌剤を単独で投与した時より抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と併用で投与した時、Ｔｒｅｇの比率が顕著に減少したことが確認され、これから癌細胞を攻撃するＴ細胞の活性化が誘導されることが分かった。
実験例１０．併用によるインビボ抗癌効果の（相乗的）増加の確認（黒色腫マウスモデル）
実験例１０．１．インビボ癌成長抑制効果の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７がＣＴ２６大腸癌マウスモデル以外にさらに他の癌腫でも効果があるかを確認するために、黒色腫マウスモデルに追加の実験を進めた。８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞７ｘ１０５個を皮下注射で移植して同種移植マウス腫瘍モデルを製作した。動物の飼育及び実験は、全てＳＰＦ施設で進めた。黒色腫細胞株を移植した後８日目に、腫瘍の大きさが５０～１００ｍｍ３であるマウスにＣＬ７ ２５ｍｇ／ｋｇ、α－ＰＤ－１ １０ｍｇ／ｋｇ、α－ＣＴＬＡ４ ４ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した。概略的な実験方法を図６３に示した。より詳しくは、１週間に２回ずつ２週間合計４回にかけて抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体、抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体＋抗－ＰＤ－１抗体（Ｃｏｍｂｏ）、及び抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体＋抗－ＰＤ－１抗体＋抗－ＣＴＬＡ－４抗体（Ｔｒｉｐｌｅ）をそれぞれマウスに注射し、対照群としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と同量で注射した。２０日間癌の大きさを測定した。
その結果、図６４に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体の単独投与によっても癌成長が抑制されるが、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＣＴＬＡ－４抗体と併用投与した群で癌成長がさらに効果的に抑制されることを確認した。
実験例１０．２．細胞毒性Ｔ細胞の増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７と抗－ＰＤ－１抗体及び／又は抗－ＣＴＬＡ－４抗体の併用がＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルでＣＤ８＋ Ｔ細胞に及ぼす影響をインビボ条件で確認するために、実験例１０．１と同様にマウス腫瘍モデルを製作して同一の濃度で各試験物質を注射した。
１群当たりそれぞれマウス６匹から腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を取り出した後、コラゲナーゼＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）とＤＮａｓｅ Ｉ（２ｍｇ／ｍｌ）の混合溶液中で３７℃で１時間インキュベートした。その後、７０μｍのセルストレーナーで濾過し、赤血球を溶解させた後、ナイロンメッシュで再濾過した。その後、単一細胞浮遊液をＣＤ１６／３２（入手先：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体で遮断し、細胞生存度確認用染色液及びＣＤ８＋抗体及びＣＤ４＋抗体で細胞を染色した。その後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメトリーでデータを読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
その結果、図６５に示されたように、ＣＴ２６癌腫モデルと同様に（実験例６．２）、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用投与（Ｄ群及びＴ群）によりＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルでもＣＤ８＋ Ｔ細胞の数が増加することを確認した。ここで、Ｄ群はＣＬ７と抗－ＰＤ－１抗体の併用を示し、Ｔ群はＣＬ７、抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＣＴＬＡ－４抗体の併用を示す。
実験例１０．３．調節Ｔ細胞に比べて細胞毒性Ｔ細胞の増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７と抗－ＰＤ－１抗体及び／又は抗－ＣＴＬＡ－４抗体の併用がＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルで調節Ｔ細胞に及ぼす影響をインビボ条件で確認するために、実験例１０．１と同様にマウス腫瘍モデルを製作して同一の濃度で各試験物質を注射した。実験群は、（ｉ）ＣＬ７投与群、（ｉｉ）抗－ＰＤ－１投与群、（ｉｉｉ）ＣＬ７及び抗－ＰＤ－１投与群（Ｄ群）、及び（ｉｖ）ＣＬ７、抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＣＴＬＡ４抗体投与群（Ｔ群）である。
１群当たりそれぞれマウス６匹から腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を取り出した後、コラゲナーゼＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）とＤＮａｓｅ Ｉ（２ｍｇ／ｍｌ）の混合溶液中で３７℃で１時間インキュベートした。その後、７０μｍのセルストレーナーで濾過し、赤血球を溶解させた後、ナイロンメッシュで再濾過した。その後、単一細胞浮遊液をＣＤ１６／３２（入手先：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体で遮断し、細胞生存度確認用染色液、Ｔｒｅｇマーカータンパク質であるＣＤ２５とＦｏｘｐ３に対する抗体、ＣＤ３＋抗体及びＣＤ８＋抗体で細胞を染色した。その後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメトリーでデータを読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
その結果、図６６に示されたように、ＣＴ２６癌腫モデルと同様に（実験例６．５）、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用投与（Ｄ群及びＴ群）によりＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルでもＣＤ８＋ Ｔ細胞が調節Ｔ細胞に比べて増加することを確認した。ここで、Ｄ群はＣＬ７と抗－ＰＤ－１抗体の併用を示し、Ｔ群はＣＬ７、抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＣＴＬＡ－４抗体の併用を示す。
実験例１０．４．腫瘍関連のマクロファージ（ＴＡＭ）の増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７と抗－ＰＤ－１抗体及び／又は抗－ＣＴＬＡ－４抗体の併用がＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルでマクロファージに及ぼす影響をインビボ条件で確認するために、実験例１０．１と同様にマウス腫瘍モデルを製作して同一の濃度で各試験物質を注射した。
１群当たりそれぞれマウス６匹から腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を取り出した後、コラゲナーゼＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）とＤＮａｓｅ Ｉ（２ｍｇ／ｍｌ）の混合溶液中で３７℃で１時間インキュベートした。その後、７０μｍのセルストレーナーで濾過し、赤血球を溶解させた後、ナイロンメッシュで再濾過した。その後、単一細胞浮遊液をＣＤ１６／３２（入手先：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体で遮断し、細胞生存度確認用染色液及びＦ４／８０とｉＮＯＳに対する抗体で細胞を染色した。その後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメトリーでデータを読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
その結果、図６７に示されたように、ＣＴ２６癌腫モデルと同様に（実験例６．１）、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用投与（Ｄ群及びＴ群）によりＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルでもＭ１形態の腫瘍関連のマクロファージの発現量が増加することを確認した。ここで、Ｄ群はＣＬ７と抗－ＰＤ－１抗体の併用を示し、Ｔ群はＣＬ７、抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＣＴＬＡ－４抗体の併用を示す。
まとめると、図６５、図６６及び図６７に提示された結果は、次のような意味を有する。抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７は、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫マウスモデルでもＣＴ２６大腸癌マウスモデル（図４０、図４１及び図４２）と同一の機序で癌を治療するため、ＣＬ７と免疫抗癌剤の併用投与が種々の癌腫で同様な効果を発揮することを予測することができる。
実験例１１．併用投与による大腸癌マウスモデルにおける完全寛解現象の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７と抗－ＰＤ－１抗体及び／又は抗－ＣＴＬＡ－４抗体の併用投与による抗癌効果をインビボ条件で確認するために、大腸癌細胞株（ＣＴ２６）２ｘ１０５個を８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射で移植して同種移植マウス腫瘍モデルを製作した。動物の飼育及び実験は、全てＳＰＦ施設で進めた。大腸癌細胞株を移植した後１１日目（Ｄ１１）に、腫瘍の大きさが５０～１００ｍｍ３であるマウスに抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と各ＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＣＴＬＡ－４抗体を単独または併用して投与し、対照群としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）をＣＬ７と同量で注射した。具体的には、Ｄ１１、Ｄ１４及びＤ１８にマウスに腹腔内注射でそれぞれの抗体を単独でまたは併用して注射し（ＣＬ７：２５ｍｇ／ｋｇ；抗－ＰＤ－１抗体：１０ｍｇ／ｋｇ；抗－ＣＴＬＡ－４抗体：４ｍｇ／ｋｇ）、腫瘍体積を測定した。
その結果、図６８ａに示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独投与した実験群でも対照群と比較して癌の成長が抑制されたが、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時より抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体などの免疫抗癌剤と併用で処理した時に、癌の成長がさらに効果的に抑制されることを確認した。特に、ＣＬ７ ＋αＰＤ－１ ＋αＣＴＬＡ－４の三重併用投与の場合、腫瘍の大きさが９０％まで減少した。
また、図６８ｂに示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を抗－ＰＤ－１抗体と併用投与した時、５０％の完全寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ，ＣＲ）が達成され、抗－ＣＴＬＡ－４抗体まで三重で併用投与した時、７０％の完全寛解（ＣＲ）が達成され、これは、併用投与が優れた抗癌効果をもたらすことを確認する。
実験例１２．併用投与による長期生存率向上効果の確認
実験例１１で実験されたマウスの長期生存率を確認した。その結果、図６９に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を単独で処理した時より抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体などの免疫抗癌剤と併用で処理した時に長期生存率も向上することを確認した。
実験例１３．併用投与による癌の再発防止効果の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ７と免疫抗癌剤の併用投与による癌の再発防止効果をインビボ条件で確認するために、大腸癌細胞株（ＣＴ２６）２ｘ１０５個を８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射で移植して同種移植マウス腫瘍モデルを製作した後、実験例１１に説明された通り実験を進めて完全寛解となったマウスを得た。このように得たマウスに大腸癌細胞株（ＣＴ２６）２ｘ１０５個を再び移植し（Ｒｅ－ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）、３０日間観察した。
その結果、図７０に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用投与により完全寛解となった群では癌の再発や転移が起こらないことを確認した。これは、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と抗－ＰＤ－１抗体の併用投与（ＣＬ７ ＋αＰＤ－１；Ｃｏｍｂｉ）またはこれに、抗－ＣＴＬＡ－４抗体まで加えられた三重併用投与（ＣＬ７ ＋αＰＤ－１ ＋αＣＴＬＡ－４；Ｔｒｉｐｌｅ）を通じて完全寛解となった個体は、持続的な免疫記憶を通じて全身防御免疫反応を示すことにより癌の再発や転移を抑制することを予想させた。
実験例１４．併用投与による免疫記憶効果の確認
実験例１３で完全寛解となったマウスでエフェクターメモリーＴ細胞を分析するために、マウスを犠牲にさせて脾臓を採取した。次いで、脾臓細胞を得て、これをＴ細胞活性に関連したマーカーであるＣＤ４４とＣＤ６２Ｌに対する抗体（入手先：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。その後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメトリーでデータを読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
その結果、図７１に示されたように、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体と免疫抗癌剤の併用処理時、エフェクターメモリーＴ細胞が有意に増加することを確認した。これは、実験例１３で予測した通り、完全寛解となったマウスは、ＣＬ７と抗－ＰＤ－１抗体の併用投与（Ｃｏｍｂｉ）またはこれに、抗－ＣＴＬＡ－４抗体まで加えられた三重併用投与（Ｔｒｉｐｌｅ）時に増加したエフェクターメモリーＴ細胞を通じて免疫記憶を有するようになって追加的に癌細胞ができてもその成長を抑制することを示す。
実施例４．抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体（ＣＬ１０、ＳＬ１８）と免疫抗癌剤の併用投与
実施例１で製造された抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体（ＣＬ１０、ＳＬ１８）を他の免疫抗癌剤、例えば、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体であるイミフィンジ、抗－ＰＤ－１抗体であるキイトルーダと併用し、その結果を観察した。
前記免疫抗癌剤それぞれの入手先は、次の通りである：イミフィンジ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）及びキイトルーダ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ）。
実験例１５．Ｍ１マクロファージ分化能の増加の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ１０またはＳＬ１８がマクロファージからＭ１マクロファージへの分化能を促進させることができるかを確認するために、９６－ウェルプレートに１ｘ１０４細胞／ウェルのＴＨＰ－１細胞を分注した後に、１０μｇ／ｍＬのＣＬ１０またはＳＬ１８を処理した。また、ＣＬ１０またはＳＬ１８と免疫抗癌剤の併用処理による効果を確認するために、前記抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍＬのイミフィンジ及び／又はキイトルーダとともに処理した。その後、ＣＯ２インキュベーターで４８時間インキュベートした後に、Ｍ１マクロファージの分化マーカーであるＴＮＦ－αの生成量をＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－αＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で確認した。その結果を図７２ａ（ＣＬ１０併用）及び図７２ｂ（ＳＬ１８併用）に示した。
図７２ａ及び図７２ｂに示されたように、ＴＨＰ－１細胞にＣＬ１０またはＳＬ１８を単独で処理した時よりイミフィンジまたはキイトルーダと併用で処理した時、ＴＮＦ－αの発現量が増加したことが確認された。特に、ＣＬ１０またはＳＬ１８をイミフィンジ及びキイトルーダの二つの抗体と同時に併用投与した時、ＴＮＦ－αの発現量が最も高いことが確認された。
実験例１６．癌細胞の成長抑制効果の確認
抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体であるＣＬ１０またはＳＬ１８と免疫抗癌剤の併用投与による癌細胞の成長抑制効果を確認するために、Ａ５４９（ヒト肺癌細胞株）細胞を利用して細胞成長抑制効果を比較した。具体的には、９６－ウェルプレートにＦＢＳがない条件では２ｘ１０４細胞を分注し、０．１％ ＦＢＳの条件では６ｘ１０３細胞を分注した。次いで、ＣＬ１０またはＳＬ１８を単独でまたはイミフィンジ及び／又はキイトルーダと併用でそれぞれ１０μｇ／ｍＬの濃度で処理し、５日間培養した。次いで、ＣＣＫ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）をウェル当たり３０ｕｌずつ処理し、ＣＯ２インキュベーターで４時間インキュベーションしながら１時間ごとにＯ．Ｄ ４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図７３ａ（ＣＬ１０併用）及び図７３ｂ（ＳＬ１８併用）に示した。
図７３ａ及び図７３ｂに示されたように、０．１％ ＦＢＳの条件でＡ５４９細胞にＣＬ１０またはＳＬ１８を単独で処理した時よりイミフィンジまたはキイトルーダと併用で処理した時、癌細胞増殖抑制効果がさらに増加し、ＣＬ１０またはＳＬ１８をイミフィンジ及びキイトルーダの二つの抗体と同時に併用投与した時、癌細胞増殖抑制効果が最も優れたことが確認された。
前記実験例１５と本実験例を通じて分かるように、ＣＬ１０及びＳＬ１８をはじめとする実施例１で製造された残りの抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体もＣＬ７と同一の作用機序を通じて効能を示し、ＣＬ７と同様に、その効能が免疫抗癌剤との併用投与により増加した。
統計処理
実験を通じて得られた結果は、一元分散分析に続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を利用して実験グループ間比較分析を行い、ｐ値が０．０５以下である時、グループ間の差が有意であった。

Claims (42)

  1. （ｉ）配列番号７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４３、配列番号５５、配列番号６７、配列番号７９、配列番号９１、配列番号１０３、配列番号１１５、配列番号１２７、配列番号１３９、配列番号１５１、配列番号１６３、配列番号１７５、配列番号１８７、配列番号１９９、配列番号２１１、配列番号２２３、配列番号２３５、配列番号２４７、配列番号２５９、配列番号２７１、配列番号２８３及び配列番号２９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
    配列番号８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号４４、配列番号５６、配列番号６８、配列番号８０、配列番号９２、配列番号１０４、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１４０、配列番号１５２、配列番号１６４、配列番号１７６、配列番号１８８、配列番号２００、配列番号２１２、配列番号２２４、配列番号２３６、配列番号２４８、配列番号２６０、配列番号２７２、配列番号２８４及び配列番号２９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
    配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、配列番号８１、配列番号９３、配列番号１０５、配列番号１１７、配列番号１２９、配列番号１４１、配列番号１５３、配列番号１６５、配列番号１７７、配列番号１８９、配列番号２０１、配列番号２１３、配列番号２２５、配列番号２３７、配列番号２４９、配列番号２６１、配列番号２７３、配列番号２８５及び配列番号２９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び
    （ｉｉ）配列番号１０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号４６、配列番号５８、配列番号７０、配列番号８２、配列番号９４、配列番号１０６、配列番号１１８、配列番号１３０、配列番号１４２、配列番号１５４、配列番号１６６、配列番号１７８、配列番号１９０、配列番号２０２、配列番号２１４、配列番号２２６、配列番号２３８、配列番号２５０、配列番号２６２、配列番号２７４、配列番号２８６及び配列番号２９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
    配列番号１１、配列番号２３、配列番号３５、配列番号４７、配列番号５９、配列番号７１、配列番号８３、配列番号９５、配列番号１０７、配列番号１１９、配列番号１３１、配列番号１４３、配列番号１５５、配列番号１６７、配列番号１７９、配列番号１９１、配列番号２０３、配列番号２１５、配列番号２２７、配列番号２３９、配列番号２５１、配列番号２６３、配列番号２７５、配列番号２８７及び配列番号２９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
    配列番号１２、配列番号２４、配列番号３６、配列番号４８、配列番号６０、配列番号７２、配列番号８４、配列番号９６、配列番号１０８、配列番号１２０、配列番号１３２、配列番号１４４、配列番号１５６、配列番号１６８、配列番号１８０、配列番号１９２、配列番号２０４、配列番号２１６、配列番号２２８、配列番号２４０、配列番号２５２、配列番号２６４、配列番号２７６、配列番号２８８及び配列番号３００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  2. 前記重鎖可変領域は、
    （ｉ）配列番号７、配列番号１９、配列番号４３、配列番号５５、配列番号６７、配列番号７９、配列番号１０３、配列番号１１５、配列番号１２７、配列番号１３９、配列番号１５１、配列番号１６３、配列番号１９９及び配列番号２１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
    配列番号８、配列番号２０、配列番号４４、配列番号５６、配列番号６８、配列番号８０、配列番号１０４、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１４０、配列番号１５２、配列番号１６４、配列番号２００及び配列番号２１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
    配列番号９、配列番号２１、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、配列番号８１、配列番号１０５、配列番号１１７、配列番号１２９、配列番号１４１、配列番号１５３、配列番号１６５、配列番号２０１及び配列番号２１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、
    前記軽鎖可変領域は、
    （ｉｉ）配列番号１０、配列番号２２、配列番号４６、配列番号５８、配列番号７０、配列番号８２、配列番号１０６、配列番号１１８、配列番号１３０、配列番号１４２、配列番号１５４、配列番号１６６、配列番号２０２及び配列番号２１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
    配列番号１１、配列番号２３、配列番号４７、配列番号５９、配列番号７１、配列番号８３、配列番号１０７、配列番号１１９、配列番号１３１、配列番号１４３、配列番号１５５、配列番号１６７、配列番号２０３及び配列番号２１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
    配列番号１２、配列番号２４、配列番号４８、配列番号６０、配列番号７２、配列番号８４、配列番号１０８、配列番号１２０、配列番号１３２、配列番号１４４、配列番号１５６、配列番号１６８、配列番号２０４及び配列番号２１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  3. 前記重鎖可変領域は
    （ｉ）配列番号４３、配列番号７９、配列番号１１５、及び配列番号２１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
    配列番号４４、配列番号８０、配列番号１１６、及び配列番号２１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
    配列番号４５、配列番号８１、配列番号１１７、及び配列番号２１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、
    前記軽鎖可変領域は
    （ｉｉ）配列番号４６、配列番号８２、配列番号１１８、及び配列番号２１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
    配列番号４７、配列番号８３、配列番号１１９、及び配列番号２１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
    配列番号４８、配列番号８４、配列番号１２０、及び配列番号２１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  4. 前記重鎖可変領域は、配列番号４３で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４４で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４５で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、
    前記軽鎖可変領域は、配列番号４６で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４７で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４８で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  5. 前記重鎖可変領域は、配列番号７９で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８０で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８１で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、
    前記軽鎖可変領域は、配列番号８２で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８３で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８４で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  6. 前記重鎖可変領域は、配列番号１１５で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１６で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１７で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、
    前記軽鎖可変領域は、配列番号１１８で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１９で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２０で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  7. 前記重鎖可変領域は、配列番号２１１で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１２で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２１３で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、
    前記軽鎖可変領域は、配列番号２１４で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１５で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２１６で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  8. 前記重鎖可変領域は、配列番号３０３、３０７、３１１、３１５、３１９、３２３、３２７、３３１、３３５、３３９、３４３、３４７、３５１、３５５、３５９、３６３、３６７、３７１、３７５、３７９、３８３、３８７、３９１、３９５、及び３９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記軽鎖可変領域は、配列番号３０４、３０８、３１２、３１６、３２０、３２４、３２８、３３２、３３６、３４０、３４４、３４８、３５２、３５６、３６０、３６４、３６８、３７２、３７６、３８０、３８４、３８８、３９２、３９６、及び４００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  9. 前記重鎖可変領域は、配列番号３１５、３２７、３３９、及び３７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記軽鎖可変領域は、配列番号３１６、３２８、３４０、及び３７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  10. 前記抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は種間交差反応性を有する、請求項１に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  11. 前記抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ヒト及びマウスＣＤ３００ｃ抗原の両方に対する交差反応性である、請求項１０に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  12. 下記式（１）～（３）でそれぞれ表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
    下記式（４）～（６）でそれぞれ表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む
    抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片：
    ＦＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＭＸ５ＷＶＲ （１）
    前記式において、
    Ｘ１＝ ＧまたはＳ
    Ｘ２＝ Ｓ、ＲまたはＤ
    Ｘ３＝ ＮまたはＹ
    Ｘ４＝ Ｙ、Ａ、ＧまたはＨ
    Ｘ５＝ ＳまたはＨ
    Ｘ１ＩＳＸ２ＳＧＸ３Ｘ４ＴＹＹＡＸ５ （２）
    前記式において、
    Ｘ１＝ ＴまたはＡ
    Ｘ２＝ ＧまたはＳ
    Ｘ３＝ ＴまたはＧ
    Ｘ４＝ ＳまたはＹ
    Ｘ５＝ ＤまたはＥ
    ＹＣＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｗ （３）
    前記式において、
    Ｘ１＝ ＲまたはＳ
    Ｘ２＝ ＧまたはＳ
    Ｘ３＝ Ｍ、Ｓ、ＹまたはＩ
    Ｘ４＝ Ｗ、Ｑ、ＧまたはＲ
    Ｘ５＝ ＧまたはＬ
    Ｘ６＝ Ｍ、ＩまたはＰ
    Ｘ７＝ Ｄ、ＦまたはＬ
    Ｘ８＝ ＶまたはＤ
    Ｘ９＝ Ｉ、Ｙまたは存在せず
    ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＶＸ１２Ｗ （４）
    前記式において、
    Ｘ１＝ ＴまたはＳ
    Ｘ２＝ ＧまたはＲ
    Ｘ３＝ Ｋ、ＮまたはＳ
    Ｘ４＝ Ｈ、ＮまたはＳ
    Ｘ５＝ Ｒ、ＩまたはＧ
    Ｘ６＝ Ｈ、ＧまたはＩ
    Ｘ７＝ Ｔ、ＩまたはＳ
    Ｘ８＝ Ｒ、Ａ、Ｋ、または存在せず
    Ｘ９＝ Ｒ、Ｓ、Ｇ、または存在せず
    Ｘ１０＝ Ｎまたは存在せず
    Ｘ１１＝ Ｙまたは存在せず
    Ｘ１２＝ Ｎ、ＨまたはＱ
    Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＰＳＧＶＸ５ （５）
    前記式において、
    Ｘ１＝ Ｌ、Ｓ、ＲまたはＥ
    Ｘ２＝ Ｄ、ＫまたはＮ
    Ｘ３＝ ＳまたはＮ
    Ｘ４＝ Ｅ、Ｎ、ＱまたはＫ
    Ｘ５＝ ＰまたはＲ
    ＹＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＶＦ （６）
    前記式において、
    Ｘ１＝ Ｑ、Ａ、またはＳ
    Ｘ２＝ ＳまたはＡ
    Ｘ３＝ ＹまたはＷ
    Ｘ４＝ ＤまたはＡ
    Ｘ５＝ Ｓ、ＤまたはＧ
    Ｘ６＝ Ｓ、ＮまたはＴ
    Ｘ７＝ Ｓ、Ｌ、ＮまたはＫ
    Ｘ８＝ Ｖ、Ｓ、ＮまたはＧ
    Ｘ９＝ Ｇ、Ｌ、Ｖまたは存在せず
    Ｘ１０ ＝ Ｐまたは存在しない。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物。
  14. 前記癌は、大腸癌、直膓癌、結腸癌、甲状腺癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、子宮頸部癌、脳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、舌癌、乳癌、子宮癌、胃癌、骨癌及び血液癌からなる群から選択されたいずれか一つ以上を含む、請求項１３に記載の薬学組成物。
  15. 前記癌は固形癌である、請求項１３に記載の薬学組成物。
  16. 前記癌は、大腸癌、肺癌、黒色腫、及び乳癌からなる群から選択された一つ以上を含む、請求項１３に記載の薬学組成物。
  17. 前記薬学組成物は、癌の増殖、生存、転移、再発または抗癌剤の耐性を抑制するものである、請求項１３に記載の薬学組成物。
  18. 前記薬学組成物は、一つ以上の免疫抗癌剤をさらに含む、請求項１３に記載の薬学組成物。
  19. 前記免疫抗癌剤は、抗－ＰＤ－１、抗－ＰＤ－Ｌ１、抗－ＣＴＬＡ－４、抗－ＫＩＲ、抗－ＬＡＧ３、抗－ＣＤ１３７、抗－ＯＸ４０、抗－ＣＤ２７６、抗－ＣＤ２７、抗－ＧＩＴＲ、抗－ＴＩＭ３、抗－４１ＢＢ、抗－ＣＤ２２６、抗－ＣＤ４０、抗－ＣＤ７０、抗－ＩＣＯＳ、抗－ＣＤ４０Ｌ、抗－ＢＴＬＡ、抗－ＴＣＲ、及び抗－ＴＩＧＩＴからなる群から選択されたいずれか一つ以上を含む、請求項１８に記載の薬学組成物。
  20. 前記免疫抗癌剤は、抗－ＰＤ－１、抗－ＰＤ－Ｌ１、抗－ＣＴＬＡ－４及び抗－ＣＤ４７抗体からなる群から選択される一つ以上を含む、請求項１８に記載の薬学組成物。
  21. 前記免疫抗癌剤は、デュルバルマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、αＣＤ４７、及びイピリムマブからなる群から選択される一つ以上を含む、請求項１８に記載の薬学組成物。
  22. 前記抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片と前記免疫抗癌剤は、それぞれ製剤化されて同時または順次別個で投与される形態である、請求項１８に記載の薬学組成物。
  23. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を癌の予防または治療が必要な対象体に投与する段階を含む癌の予防または治療方法。
  24. 一つ以上の免疫抗癌剤を投与する段階をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の投与前に、対象体の生物学的試料または資料に基づいてＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準を確認する段階をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記確認されたマーカーの発現水準に基づいて抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の治療反応性を確認する段階をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が投与された対象体の生物学的試料または資料を利用して下記マーカーから選択された一つ以上のマーカーの発現水準を確認する段階をさらに含む、請求項２３に記載の方法：
    Ｂｓｔ２、Ｃｄ４０、Ｃｄ７０、Ｃｄ８６、Ｃｃｌ８、Ｘｃｌ１、Ｃｃｒ７、Ｃｄ８０、Ｃｄ２０６、Ｍｓｒ１、Ａｒｇ１、Ｖｅｇｆａ、Ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ４ａ１、Ｈｉｆ１ａ、Ｖｃａｍ１、Ｉｃａｍ１、Ｇｚｍａ、Ｇｚｍｂ、Ｉｃｏｓ、Ｃｄ６９、Ｉｆｎｇ、Ｔｎｆ、Ｃｄ１ｄ１、Ｃｄ１ｄ２、Ｃｄ３８、Ｃｘｃｒ６、Ｘｃｒ１、Ｔｂｘ２１、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ４、Ｃｘｃｒ３、ＩＬ－１２ｂ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、Ｌａｇ３、Ｔｉｍ３、Ｉｃｏｓ、Ｏｘ４０、Ｇｉｔｒ、Ｈｖｅｍ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｃｍａ１、Ｔｉｍｄ４、Ｂｃｌ６、Ｃｘｃｌ５及びＣｃｌ２１ａ。
  28. 前記確認されたマーカーの発現水準に基づいて前記抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と併用されるもう一つ以上の免疫抗癌剤を選別する段階をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記マーカーは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、Ｌａｇ３、Ｔｉｍ３、Ｉｃｏｓ、Ｏｘ４０、Ｇｉｔｒ、Ｈｖｅｍ、ＣＤ２７及びＣＤ２８からなる群から選択された一つ以上を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記マーカーは、ｖｅｇｆａ、ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ４ａ１、Ｈｉｆ１ａ、Ｂｓｔ２、ＣＣＬ８、Ｘｃｌ１、ＣＣＲ７、ＣＤ８０、Ｔｂｘ２１、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ４、Ｉｆｎｇ、Ｃｘｃｒ３、ＩＬ－６、Ｇｚｍａ、Ｉｃｏｓ、Ｃｄ６９、Ｃｄ１ｄ１、Ｃｄ３８、Ｃｘｃｒ６、Ｏｘ４０、Ｇｉｔｒ、ＣＤ２７及びＣＤ２８からなる群から選択された一つ以上を含む、請求項２７に記載の方法。
  31. 前記マーカー中、ｖｅｇｆａ、ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ４ａ１、Ｈｉｆ１ａ及びＩＬ－６からなる群から選択された一つ以上のマーカーの発現水準が抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が投与されていない対象体に比べて統計的に有意に減少した場合に、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の治療反応性が良好または優れることで決定する段階をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記マーカー中、Ｂｓｔ２、ＣＣＬ８、Ｘｃｌ１、ＣＣＲ７、ＣＤ８０、Ｔｂｘ２１、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ４、Ｉｆｎｇ、Ｃｘｃｒ３、Ｇｚｍａ、Ｉｃｏｓ、Ｃｄ６９、Ｃｄ１ｄ１、Ｃｄ３８、Ｃｘｃｒ６、Ｏｘ４０、Ｇｉｔｒ、ＣＤ２７及びＣＤ２８からなる群から選択された一つ以上のマーカーの発現水準が抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片が投与されていない対象体に比べて統計的に有意に増加した場合に、抗－ＣＤ３００ｃ抗体またはその抗原結合断片の治療反応性が良好または優れることで決定する段階をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  33. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む組成物、及び
    前記抗体またはその抗原結合断片の使用を指示する指示書を含む
    癌の予防または治療用キット。
  34. 前記指示書は、前記抗体またはその抗原結合断片及び一つ以上の追加抗癌剤の組み合わせの使用を指示することを含む、請求項３３に記載のキット。
  35. 前記指示書は、前記抗体またはその抗原結合断片の投与前に対象体から得られた生物学的試料または資料を利用してＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準の測定を指示することを含む、請求項３３に記載のキット。
  36. 癌の予防または治療が必要な対象体から得られた生物学的試料または資料に基づいてＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準を測定する段階を含む癌の予防または治療のための情報を提供する方法。
  37. 前記癌の予防または治療のための情報は、ＣＤ３００ｃタンパク質に関連した治療剤（例えば、抗－ＣＤ３００ｃまたはその抗原結合断片）の治療反応性、治療剤の選択、治療対象体の選択、対象体の予後、及び対象体の生存期間のいずれか一つ以上に関する情報を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 癌の予防または治療が必要な対象体から得られた生物学的試料または資料を利用してＣＤ３００ｃタンパク質の発現水準を測定するための物質を含む癌の予防または治療のための情報を提供するためのキット。
  39. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
  40. 請求項３９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  41. 請求項３９に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
  42. 請求項４１に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を製造する方法。
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