JP2024516323A - プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用に関する。雑草の防除方法は、有効量のPPO阻害剤を含有する除草剤を、少なくとも1つの遺伝子導入植物が存在する圃場に施用することを含み、遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多い。本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1~PPO14は、PPO阻害除草剤に対して高い耐性を有する。また、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む植物は、PPO阻害除草剤に対して強い耐性を有し、圃場濃度4倍のオキシフルオルフェン、サフルフェナシルおよびフルミオキサジン、ならびに圃場濃度2倍のスルフェントラゾンの、ほとんど全てに対して高い抵抗性を示す。したがって、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼには、植物における広域施用の見込みがある。
Description
本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用に関し、特に原核生物に由来するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを用いて、PPO阻害除草剤に対する耐性を植物に付与する方法、およびその使用に関する。
ポルフィリンの生合成経路は、植物代謝で重要な役割を果たすクロロフィルおよびヘムの合成に用いられ、この経路は葉緑体で生じる。この経路では、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protoporphyrinogen oxidase:PPO)が、プロトポルフィリノーゲンIXのプロトポルフィリンIXへの酸化を触媒する。プロトポルフィリンIXが生成された後、マグネシウムケラターゼによってプロトポルフィリンIXがマグネシウムと結合してクロロフィルが合成されるか、あるいは、フェロケラターゼによってプロトポルフィリンIXが鉄と結合してヘムが合成される。
PPOを阻害することによって作用する除草剤としては、主にジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類、トリアジノン類などの種類のPPO阻害除草剤が挙げられる。植物において、PPO阻害剤はPPOの酵素活性を阻害し、その結果、クロロフィルとヘムの合成が阻害され、基質であるプロトポルフィリノーゲンIXが蓄積する。蓄積したプロトポルフィリノーゲンIXは、葉緑体から細胞質へ速やかに輸送され、そこでプロトポルフィリノーゲンIXは非酵素的反応でプロトポルフィリンIXに変換される。プロトポルフィリンIXは、光と酸素分子の存在下で、さらに反応性の高い一重項酸素(1O2)を形成し、それにより細胞膜に損傷を与え、植物細胞を速やかに死に至らしめる。
PPO阻害除草剤に対して耐性のある植物を提供する方法としては、主に以下のものが挙げられる。1)除草剤またはその活性代謝物を無毒性産物に変換する酵素で除草剤を無毒化する。2)感受性PPOを過剰発現させることによって、除草剤に対して十分な量の標的酵素を植物体内で生成し、この酵素の動力学定数を考慮したうえで、阻害剤が存在しても機能的酵素を十分に利用できるようにする。3)除草剤またはその活性代謝物に対する感受性が低く、プロトポルフィリノーゲンIXのプロトポルフィリンIXへの酸化を触媒する能力を保持している機能性PPOを提供する。機能性PPOに関しては、一定の機能性PPO酵素が、いくつかのPPO阻害除草剤に対して有用なレベルの耐性を提供する可能性があるものの、その同じ機能性PPOは、より望ましい異なるPPO阻害除草剤に対して、商業レベルの耐性を提供するには全く不十分である可能性がある。例えば、各PPO阻害除草剤については、防除する雑草のスペクトル、それぞれの製造コスト、および環境面でのそれぞれの利点が異なる可能性がある。したがって、様々な作物および作物品種群にPPO阻害除草剤耐性を付与する新規な方法が必要とされている。
本発明の目的は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用を提供することである。当該プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは原核生物に由来し、本発明によるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列で形質転換した植物は、PPO阻害除草剤に対する耐性が良好である。
上記の目的を達成するために、本発明は、少なくとも1つの遺伝子導入植物が存在する圃場に、有効量のPPO阻害剤を含有する除草剤を施用することを含む雑草の防除方法を提供する。当該方法において、遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多く、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する。
より好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有する。
さらに好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群のアミノ酸配列から選択される。
好ましくは、遺伝子導入植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、遺伝子導入植物は、カラスムギ(Avena sativa)、コムギ(Triticum aestivum)、オオムギ(Hordeum vulgare)、キビ(Setaria italica)、トウモロコシ(Zea mays)、モロコシ(Sorghum bicolor)、ミナトカモジグサ(Brachypodium distachyo)、イネ(Oryza sativa)、タバコ(Nicotiana tabacum)、ヒマワリ(Helianthus annuus)、アルファルファ(Medicago sativa)、ダイズ(Glycine max)、ヒヨコマメ(cicer arietinum)、ピーナッツ(Arachis hypogaea)、テンサイ(Beta vulgaris)、キュウリ(Cucumis sativus)、ワタ(Gossypium hirsutum)、アブラナ(Brassica napus)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、トマト(Solanum lycopersicum)、またはシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)であり、さらに好ましくは、遺伝子導入植物はグリホサート耐性植物であり、雑草はグリホサート抵抗性雑草である。
好ましくは、PPO阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および/またはトリアジノン類の種類のPPO阻害除草剤を含む。
さらに好ましくは、PPO阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および/またはフルミオキサジンを含む。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのポリヌクレオチド配列は、以下を含む。
(a)配列番号1~14から選択される配列と少なくとも88%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、配列番号15~28を含まないポリヌクレオチド配列、または
(b)配列番号29~42または配列番号62~64のいずれか1つに示されるポリヌクレオチド配列。
(b)配列番号29~42または配列番号62~64のいずれか1つに示されるポリヌクレオチド配列。
さらに、遺伝子導入植物は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列とは異なる、第2の除草剤耐性タンパク質をコードする少なくとも1つの第2のポリヌクレオチドをさらに含む。
第2のポリヌクレオチドは、選択性マーカータンパク質、合成活性を有するタンパク質、分解活性を有するタンパク質、生物的ストレス抵抗性タンパク質、非生物的ストレス抵抗性タンパク質、雄性不稔性タンパク質、植物収量に影響を及ぼすタンパク質、および/または植物品質に影響を及ぼすタンパク質をコードする。
特に、第2のポリヌクレオチドは、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素、グリホサート酸化還元酵素、グリホサート-N-アセチル基転移酵素、グリホサート脱炭酸酵素、グルホシネートアセチル基転移酵素、アルファ-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ、ジカンバモノオキシゲナーゼ、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、および/またはチトクロム様タンパク質をコードする。
あるいは、有効量のPPO阻害剤を含有する除草剤には、さらに、グリホサート除草剤、グルホシネート除草剤、オーキシン様除草剤、雑草防除剤、出芽前選択的除草剤および/または出芽後選択的除草剤が含まれてもよい。
上記の目的を達成するために、本発明はさらに、PPO阻害除草剤および少なくとも1つの遺伝子導入植物を含む、雑草の成長を抑制するための植栽組合せを提供する。ここで、有効量のPPO阻害剤を含有する前記除草剤は、少なくとも1つの遺伝子導入植物が存在する圃場に施用され、遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多い。また、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する。
より好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有する。
さらに好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群のアミノ酸配列から選択される。
好ましくは、遺伝子導入植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、遺伝子導入植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、さらに好ましくは、遺伝子導入植物はグリホサート耐性植物であり、雑草はグリホサート抵抗性雑草である。
好ましくは、PPO阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および/またはトリアジノン類の種類のPPO阻害除草剤を含む。
さらに好ましくは、PPO阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および/またはフルミオキサジンを含む。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのポリヌクレオチド配列は、以下を含む。
(a)配列番号1~14から選択される配列と少なくとも88%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、配列番号15~28を含まないポリヌクレオチド配列、または
(b)配列番号29~42または配列番号62~64のいずれか1つに示されるポリヌクレオチド配列。
(b)配列番号29~42または配列番号62~64のいずれか1つに示されるポリヌクレオチド配列。
さらに、遺伝子導入植物は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列とは異なる、第2の除草剤耐性タンパク質をコードする少なくとも1つの第2のポリヌクレオチドをさらに含む。
第2のポリヌクレオチドは、選択性マーカータンパク質、合成活性を有するタンパク質、分解活性を有するタンパク質、生物的ストレス抵抗性タンパク質、非生物的ストレス抵抗性タンパク質、雄性不稔性タンパク質、植物収量に影響を及ぼすタンパク質、および/または植物品質に影響を及ぼすタンパク質をコードする。
特に、第2のポリヌクレオチドは、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素、グリホサート酸化還元酵素、グリホサート-N-アセチル基転移酵素、グリホサート脱炭酸酵素、グルホシネートアセチル基転移酵素、アルファ-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ、ジカンバモノオキシゲナーゼ、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、および/またはチトクロム様タンパク質をコードする。
あるいは、有効量のPPO阻害剤を含有する除草剤には、さらに、グリホサート除草剤、グルホシネート除草剤、オーキシン様除草剤、雑草防除剤、出芽前選択的除草剤および/または出芽後選択的除草剤が含まれてもよい。
上記の目的を達成するために、本発明はさらに、PPO阻害除草剤に対して耐性のある植物の産生方法を提供する。当該方法は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を植物のゲノムに導入することを含み、有効量のPPO阻害剤を含む除草剤が、少なくとも前記植物が存在する圃場に施用された場合に、前記植物は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多い。ここで、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する。
より好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有する。
さらに好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群のアミノ酸配列から選択される。
好ましくは、前記導入の方法は、遺伝子形質転換、ゲノム編集、または遺伝子変異法を含む。
好ましくは、植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
好ましくは、PPO阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および/またはトリアジノン類の種類のPPO阻害除草剤を含む。
さらに好ましくは、PPO阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および/またはフルミオキサジンを含む。
上記の目的を達成するために、本発明はさらに、PPO阻害除草剤に対して耐性のある植物の栽培方法を提供し、その栽培方法は、
植物繁殖体であって、前記植物繁殖体は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有する、植物繁殖体を、少なくとも1つ植栽することと、
前記植物繁殖体を植物に成長させることと、
有効量のPPO阻害剤を含む除草剤を、少なくとも前記植物を含む圃場に施用し、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多い前記植物を収穫することと
を含む。
植物繁殖体であって、前記植物繁殖体は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有する、植物繁殖体を、少なくとも1つ植栽することと、
前記植物繁殖体を植物に成長させることと、
有効量のPPO阻害剤を含む除草剤を、少なくとも前記植物を含む圃場に施用し、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多い前記植物を収穫することと
を含む。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する。
より好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有する。
さらに好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群のアミノ酸配列から選択される。
好ましくは、植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
好ましくは、PPO阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および/またはトリアジノン類の種類のPPO阻害除草剤を含む。
さらに好ましくは、PPO阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および/またはフルミオキサジンを含む。
上記の目的を達成するために、本発明はさらに、PPO阻害除草剤によって生じる損傷から植物を保護するか、または、PPO阻害除草剤に対する耐性を植物に付与するための方法を提供する。当該方法は、少なくとも1つの遺伝子導入植物が存在する圃場に、有効量のPPO阻害剤を含む除草剤を施用することを含み、遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多い。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する。
より好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有する。
さらに好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群のアミノ酸配列から選択される。
好ましくは、遺伝子導入植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、遺伝子導入植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
好ましくは、PPO阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および/またはトリアジノン類の種類のPPO阻害除草剤を含む。
さらに好ましくは、PPO阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および/またはフルミオキサジンを含む。
上記の目的を達成するために、本発明はさらに、PPO阻害除草剤に対する耐性を植物に付与するためのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用を提供し、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する。
より好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有する。
さらに好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群のアミノ酸配列から選択される。
好ましくは、植物にPPO阻害除草剤に対する耐性を付与するためのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用は、少なくとも1つの遺伝子導入植物が存在する圃場に、有効量のPPO阻害剤を含有する除草剤を施用することを含み、遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多い。
好ましくは、植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
好ましくは、PPO阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および/またはトリアジノン類の種類のPPO阻害除草剤を含む。
さらに好ましくは、PPO阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および/またはフルミオキサジンを含む。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのポリヌクレオチド配列は、以下を含む。
(a)配列番号1~14から選択される配列と少なくとも88%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、配列番号15~28を含まないポリヌクレオチド配列、または
(b)配列番号29~42または配列番号62~64のいずれか1つに示されるポリヌクレオチド配列。
(b)配列番号29~42または配列番号62~64のいずれか1つに示されるポリヌクレオチド配列。
具体的な実施形態として、PPO阻害除草剤(PPO阻害剤類の除草剤としても既知である)は、以下に限定されないが、ジフェニルエーテル類(クロルニトロフェン、クロメトキシフェン、ビフェノックス、オキシフルオルフェン、アシフルオルフェン、その塩およびエステル、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェンエチル、エトキシフェンエチル、アクロニフェン、ビフェノックス、エトキシフェン、クロリントロフェン(chlorintrofen)、およびハロサフェン)、オキサジアゾロン類(オキサジアゾンおよびオキサジアルギル)、N-フェニルフタルイミド類(フルミオキサジン、フルミクロラックペンチル、およびシニドンエチル)、オキサゾリノン類(ペントキサゾン)、フェニルピラゾール類(フルアゾレートおよびピラフルフェンエチル)、ウラシル類(ベンズフェンジゾン、ブタフェナシル、およびサフルフェナシル)、チアジアゾール類(チジアジミンおよびフルチアセット)、トリアゾリノン類(アザフェニジン、スルフェントラゾン、およびカルフェントラゾン)、トリアジノン類(トリフルジモキサジン)、ならびにその他(フルフェンピルエチルおよびピラクロニル)からなる群から選択される1つまたは複数であってもよい。
本明細書において、冠詞「a」および「an」は、1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)を指す。例えば、「要素(an element)」とは、1つまたは複数の要素(elements)(構成要素(components))を意味する。さらに、「comprise」、または「comprises」もしくは「comprising」などの変形語は、記載された要素、整数もしくは工程、または、要素、整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、他のいかなる要素、整数もしくは工程、または、要素、整数もしくは工程の群も除外することを意味しないと理解すべきである。
本明細書において、「除草剤非感受性」という用語は、1つまたは複数のPPO除草剤の存在下でも、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼがその酵素活性の少なくとも一部を維持する能力を意味する。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素活性は、当技術分野で既知の任意の手段によって測定することができ、例えば、1つまたは複数のPPO除草剤の存在下でのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの産物の生成、またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの基質の消費を、蛍光、高速液体クロマトグラフィー(high performance liquid chromatography:HPLC)、または質量分析(mass spectrometry:MS)により測定するアッセイによって、測定することができる。「除草剤非感受性」とは、特定の除草剤に対する完全または部分的な非感受性であってもよく、特定のPPO除草剤に対する耐性または非感受性の割合(%)で表されてもよい。
本明細書において、「植物、種子、植物組織もしくは細胞の除草剤耐性」または「除草剤耐性の植物、種子、植物組織もしくは細胞」という用語は、施用された除草剤の効果に抵抗する植物、種子、植物組織または細胞の能力を指す。例えば、除草剤耐性植物は、除草剤の存在下でも生き延び、または成長し続けることができる。植物、種子、植物組織または細胞の除草剤耐性は、植物、種子、植物組織、または細胞を、適切な対照と比較することによって評価することができる。例えば、除草剤耐性を付与することができるタンパク質をコードするDNA分子を含む植物(試験植物)と、除草剤耐性を付与することができるタンパク質をコードするDNA分子を含まない植物(対照植物)とに除草剤を施用し、次いでそれら2つの植物の損傷を比較することによって、除草剤耐性を評価および判定することができ、試験植物の除草剤耐性は、対照植物と比較した損傷率の低減度によって表される。除草剤耐性の植物、種子、植物組織または細胞は、対照の植物、種子、植物組織または細胞と比較して、除草剤の毒性効果に対する反応が低減する。「除草剤耐性形質」という用語は、野生型植物と比較して改善された除草剤耐性を、植物に付与する遺伝子導入形質である。本発明の除草剤耐性形質を用いて生成し得る植物としては、例えば、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、およびシロイヌナズナなどの作物植物を含む任意の植物を挙げることができる。
本発明のDNA分子は、特に、DNA操作に有用な配列(制限酵素認識部位、または、組換えに基づいたクローニング部位など)、植物に好ましい配列(植物コドン使用またはコザックコンセンサス配列など)、またはDNA構築物設計に有用な配列(スペーサー配列またはリンカー配列など)を提供することが望ましい場合、当技術分野で既知の方法によって、完全あるいは部分的に合成および改変されてもよい。本発明には、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、および少なくとも99%の配列同一性を有するタンパク質をコードするDNA分子、好ましくはタンパク質が含まれる。「配列同一性割合」または「配列同一性%」という用語は、参照配列もしくはクエリー配列(またはその相補鎖)と、試験配列(またはその相補鎖)とを整列させた場合に、試験配列(またはその相補鎖)と比較した参照配列もしくはクエリー配列(またはその相補鎖)のタンパク質配列における同一アミノ酸の割合を指す。配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知であり、MyersおよびMiller(1988)によるCABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smithら(1981)によるAdv.Appl.Math.2:482のローカルアラインメントアルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch(1970)によるJ.Mol.Biol.48:443-453のグローバルアライメントアルゴリズム、ならびに、KarlinおよびAltschul(1993)によるProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877において修正された、KarlinおよびAltschul(1990)によるProc.Natl.Acad.Sci.USA 872264のアルゴリズムなどの数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。これらの数学的アルゴリズムのコンピュータ実装を配列の比較に利用して、配列同一性を決定することができる。このような実装としては、以下に限定されないが、PC/Geneプログラム(Intelligenetics,Mountain View,Californiaから入手可能)のCLUSTAL;GCG Wisconsin Genetics Software Package、Version 10(Accelrys Inc,9685 Scranton Road,San Diego,California,USAから入手可能)のALIGNプログラム(Version 2.0)ならびにGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTAが挙げられる。配列同一性割合は、同一性比率に100を掛けたものとして表される。
本明細書において、オキシフルオルフェンは、無色結晶固体である2-クロロ-1-(3-エトキシ-4-ニトロフェノキシ)-4-トリフルオロメチルベンゼンを指す。オキシフルオルフェンは、ジフェニルエーテル類の超低用量の選択的、出芽前および出芽後の接触性PPO阻害除草剤であり、乳化可能な濃縮物として施用することができる。雑草は、主に、子葉鞘および中胚軸を通して除草剤を吸収することにより、枯死する。オキシフルオルフェンは、イネ、ダイズ、トウモロコシ、ワタ、野菜、ブドウ、果樹などの作物の圃場の雑草を、効果的に防除することができる。防除することができる雑草には、以下に限定されないが、単子葉植物および広葉雑草のイヌビエ(Barnyard grass)、キバナツノクサネム(Sesbania cannabina)、ウマノチャヒキ(Bromus tectorum)、エノコログサ(Setaria viridis)、ヨウシュチョウセンアサガオ(Datura stramonium)、シバムギ(Agropyron repens)、ブタクサ(Ambrosia artemisiifolia)、アメリカキンゴジカ(Sida spinosa)、イチビ(Abutilonophrasti)およびノハラガラシ(Brassica kaber)が含まれる。
本明細書において、オキシフルオルフェンの有効量とは、180から720g ai/haまでの範囲の量、例えば、190から700g ai/haまで、250から650g ai/haまで、300から600g ai/haまで、または400から500g ai/haまでで用いられることを意味する。
本明細書において、サフルフェナシルは、淡褐色の押出し粒状固体であるN’-[2-クロロ-4-フルオロ-5-(3-メチル-2,6-ジオキソ-4-(トリフルオロメチル)-3,6-ジヒドロ-1(2H)-ピリミジン)ベンゾイル]-N-イソプロピル-N-メチルスルファミドを指す。サフルフェナシルは、ウラシル類の滅菌PPO阻害除草剤に属し、70%水分散性粒剤とすることができる。サフルフェナシルは、グリホサート、アセト乳酸合成酵素(acetolactate synthase:ALS)、およびトリアジンに対して抵抗性のあるものなど、様々な広葉雑草に対して有効であり、枯死効果が早く、土壌において残留物の分解が早いという特徴がある。
本明細書において、サフルフェナシルの有効量とは、25から100g ai/haまでの範囲の量、例えば、30から95g ai/haまで、40から90g ai/haまで、50から85g ai/haまで、または60から80g ai/haまでで用いられることを意味する。
本明細書において、フルミオキサジンとは、2-[7-フルオロ-3,4-ジヒドロ-3-オキソ-4-(2-プロピニル)-2H-1,4-ベンゾオキサジン-6-イル]-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イソインドール-1,3(2H)-ジオンを指す。フルミオキサジンは、N-フェニルフタルイミド類のPPO阻害除草剤であり、実生や葉によって吸収され、通常、水和剤50%およびSC剤(suspension concentrate)48%の剤形で施用される。フルミオキサジンは、一年生広葉雑草、および一部のイネ科雑草を効果的に防除することができる。フルミオキサジンは環境中で分解されやすく、後作物に安全である。
本明細書において、フルミオキサジンの有効量とは、60から240g ai/haまでの範囲の量、例えば、70から220g ai/haまで、85から200g ai/haまで、90から185g ai/haまで、または100から150g ai/haまでで用いられることを意味する。
本明細書において、スルフェントラゾンとは、褐色固体であるN-(2,4-ジクロロ-5-(4-ジフルオロメチル-4,5-ジヒドロ-3-メチル-5-オキソ-1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)フェニル)メタンスルホンアミドを指す。スルフェントラゾンは、通常、38.9%および44.5%のSC剤の剤形であるトリアゾリノン類のPPO阻害除草剤である。スルフェントラゾンは、トウモロコシ、モロコシ、ダイズ、ピーナッツなどの圃場において、とりわけ一年生広葉雑草、イネ科雑草、および、アサガオ(Ipomoea nil)、アオゲイトウ(Amaranthus retroflexus)、シロザ(Chenopodium album)、ヨウシュチョウセンアサガオ(Datura stramonium)、オニメヒシバ(Digitaria sanguinalis)、エノコログサ(Setaria viridis)、オナモミ(Xanthium strumarium)、オヒシバ(Eleusine indica Gaertn)、ハマスゲ(Cyperus rotundus)などのカヤツリグサ科の防除に用いることができる。
本明細書において、スルフェントラゾンの有効量とは、450から900g ai/haまでの範囲の量、例えば、500から850g ai/haまで、550から700g ai/haまで、500から685g ai/haまで、または500から650g ai/haまでで用いられることを意味する。
本明細書において、「抵抗性」という用語は、遺伝性であり、通常の除草剤での効果的な処理が所与の植物に行われる状況下でも、植物が成長し繁殖することを可能にする。当業者によって認識されるように、除草剤で処理された所与の植物に、ある程度の損傷(小さな壊死、溶解または白化などの損傷)があっても、少なくとも収量が著しく損なわれていなければ、植物は依然として「抵抗性である」とみなすことができる。言い換えれば、所与の植物は、除草剤によって誘発される様々な程度の損傷に抵抗する能力を高めており、一般に、同じ遺伝子型を持つ野生型植物に対しては、同じ用量の除草剤で損傷を生じさせることができる。本発明における「耐性の」または「耐性」という用語は、「抵抗性」という用語よりも広義であり、「抵抗性」を含む。
本明細書において、生物的ストレス抵抗性タンパク質とは、他の生物から強いられるストレスに抵抗するタンパク質、例えば、昆虫抵抗性タンパク質ならびに(ウイルス、細菌、真菌および線虫の)病害抵抗性タンパク質を指す。
本明細書において、非生物的ストレス抵抗性タンパク質とは、外部環境から強いられるストレスに抵抗するタンパク質、例えば、除草剤、乾燥、熱、寒冷、霜、塩ストレス、酸化ストレスなどに対して耐性のあるタンパク質を指す。
本明細書において、植物品質に影響を及ぼすタンパク質とは、例えば、デンプン、油、ビタミンなどの品質および含量を向上させるタンパク質、繊維品質を向上させるタンパク質など、植物産物形質に影響を及ぼすタンパク質を指す。
また、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、植物において除草剤耐性遺伝子をコードする少なくとも1つのタンパク質とともに発現させることもできる。除草剤耐性タンパク質には、以下に限定されないが、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase:EPSPS)、グリホサート酸化還元酵素(glyphosate oxidoreductase:GOX)、グリホサート-N-アセチル基転移酵素(glyphosate-N-acetyltransferase:GAT)、グリホサート脱炭酸酵素、グルホシネートアセチル基転移酵素(glufosinate acetyltransferase:PAT)、アルファ-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ(alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase:AAD)、ジカンバモノオキシゲナーゼ(dicamba monooxygenase:DMO)、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(4-hydroxy phenyl pyruvate dioxygenase:HPPD)、アセト乳酸合成酵素(acetolactate synthase:ALS)、および/またはチトクロム様タンパク質(P450)が含まれる。
本明細書において、「グリホサート」とは、N-ホスホノメチルグリシンおよびその塩を指し、「グリホサート除草剤」での処理とは、グリホサートを含有する任意の除草剤製剤による処理を指す。グリホサートの市販製剤としては、以下に限定されないが、ラウンドアップ(ROUNDUP)(登録商標)(イソプロピルアンモニウム塩であるグリホサート)、ラウンドアップ(登録商標)ウェザーマックス(WEATHERMAX)(カリウム塩であるグリホサート);ラウンドアップ(登録商標)ドライ(DRY)およびライバル(RIVAL)(登録商標)(アンモニウム塩であるグリホサート);ラウンドアップ(登録商標)ジオフォース(GEOFORCE)(ナトリウム塩であるグリホサート);およびタッチダウン(TOUCHDOWN)(登録商標))(トリメチルスルホニウム塩であるグリホサート)が挙げられる。
本明細書において、グリホサートの有効量とは、200から1600g ae/haまでの範囲の量、例えば、250から1600g ae/haまで、300から1600g ae/haまで、500から1600g ae/haまで、800から1500g ae/haまで、1000から1500g ae/haまで、800から1500g ae/haまでで用いられることを意味する。
本明細書において、「グルホシネート」はホスフィノトリシンとしても既知であり、2-アミノ-4-[ヒドロキシ(メチル)ホスホリル]ブタン酸アンモニウムを指し、「グルホシネート除草剤」による処理とは、グルホシネートを含有する任意の除草剤製剤による処理を指す。
本明細書において、グルホシネートの有効量とは、200から800g ae/haまでの範囲の量、例えば、200から750g ae/haまで、250から700g ae/haまで、300から700g ae/haまで、350から650g ae/haまで、または400から600g ae/haまでで用いられることを意味する。
本発明において、オーキシン様除草剤は、オーキシンと呼ばれる天然の植物成長調節因子を模倣するか、そのように作用する。オーキシン様除草剤は、細胞壁の可塑性や核酸代謝に影響を及ぼし、それにより、細胞分裂や成長を抑制不能にすることができる。オーキシン様除草剤によって生じる傷害症状としては、茎および葉柄の上偏生長屈曲およびねじれ、葉の陥凹および湾曲、ならびに、葉形および葉脈の異常が挙げられる。オーキシン様除草剤としては、以下に限定されないが、フェノキシカルボン酸化合物、安息香酸化合物、ピリジンカルボン酸化合物、キノリンカルボン酸化合物、およびベナゾリンエチル化合物が挙げられる。通常、オーキシン様除草剤は、ジカンバ、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid:2,4-D)、(4-クロロ-2-メチルフェノキシ)酢酸(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid:MCPA)、および/または4-(2,4-ジクロロフェノキシ)酪酸(4-(2,4-dichlorophenoxy)butyric acid:2,4-DB)である。
本明細書において「ジカンバ」とは、3,6-ジクロロ-o-アニス酸または3,6-ジクロロ-2-メトキシ安息香酸、ならびにその酸および塩を指す。その塩としては、イソプロピルアミン、ジグリコールアミン、ジメチルアミン、カリウムおよびナトリウムの塩が挙げられる。ジカンバの市販製剤としては、以下に限定されないが、Banvel(登録商標)、(DMA塩)、Clarity(登録商標)(DGA塩、BASF)、VEL-58--CS-11(商標)、およびVanquish(登録商標)(DGA塩、BASF)が挙げられる。
本発明における2,4-Dは、広域スペクトルの比較的安価で強力な広葉除草剤であり、農業および非作物の条件下で65年超にわたって、広域スペクトル広葉樹雑草防除に用いられてきた。2,4-Dは、植物によって選択性のレベルが異なる(例えば、双子葉植物はイネ科植物よりも感受性が高い)。普通、植物は2,4-Dをゆっくりと代謝するので、標的部位の活性の違いによって2,4-Dに対する植物の反応の違いが説明できる可能性が高い。2,4-Dの植物代謝は、一般に、2段階の代謝、すなわち、普通はヒドロキシル化の後に、アミノ酸またはグルコースに結合するという2段階の代謝によってなされる。
本発明における発芽前の選択的除草剤としては、以下に限定されないが、アセトアニリド、アセトクロル、アセト乳酸合成酵素阻害剤、およびジニトロアニリンが挙げられる。
本発明における発芽後の選択的除草剤としては、以下に限定されないが、ニコスルフロン、リムスルフロン、およびキザロホップ-p-エチルが挙げられる。
本発明における除草剤の施用量は、土壌構造、pH値、有機物含量、営農体系、および雑草のサイズによって異なり、除草剤のラベルに記載の除草剤の適正施用量を確認して決定する。
本明細書において、「付与する」という用語は、特性または形質、例えば除草剤耐性および/またはその他の望ましい形質を、植物に提供することを指す。
本明細書において、「異種」という用語は、別の供給源からのものを意味する。DNAの文脈では、「異種」とは、同じ種の別の植物からのものを含め、外来の任意の「非自己」DNAを指す。例えば、本発明では、遺伝子導入法によりダイズ植物で発現させることができるダイズHPPD遺伝子は、やはり「異種」DNAとみなされる。
本明細書において、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを含み、特に明記しない限り、天然ヌクレオチドの本質的特性を有し、天然起源のヌクレオチドと同様の様式で一本鎖の核酸にハイブリダイズする既知の類似体(例えばペプチド核酸)を包含する。
本明細書において、「コードする」または「コードされた」という用語は、特定の核酸の文脈で用いられる場合、ヌクレオチド配列の特定のタンパク質への翻訳を指示するために、核酸が必要な情報を含むことを意味する。タンパク質がコードされる情報は、コドンの使用によって特定される。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列(例えばイントロン)を含んでいてもよいし、(例えばcDNAでのように)そのような介在非翻訳配列がなくてもよい。
本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするDNA配列は、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするDNA配列を含まない同種の植物(対照植物)と比較して、複数のPPO阻害除草剤に対してより良好な耐性を提示する本発明の植物、植物細胞および種子の提供に用いられる。
本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子は、PPO阻害除草剤に対して耐性のある植物の産生に有用である。本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子は、植物に除草剤耐性を付与するための植物における発現に特に適している。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然起源のアミノ酸ポリマーに適用される。本発明のポリペプチドは、本明細書に開示の核酸から、または標準的な分子生物学的技術によって、生成することができる。例えば、本発明の切断タンパク質は、適切な宿主細胞における本発明の組換え核酸の発現によって、あるいは、プロテアーゼ消化および精製などの、ex vivo手順の組合せによって生成することができる。
本発明はまた、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを含む核酸分子を提供する。一般に、本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼに対して1つまたは複数の保存的アミノ酸置換体を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする任意のポリヌクレオチド配列を含む。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換体は、当技術分野で周知である。次の5つの群はそれぞれ、互いに保存的置換体であるアミノ酸を含んでいる。脂肪族:グリシン(G)、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)、イソロイシン(I);芳香族:フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);硫黄含有:メチオニン(M)、システイン(C);塩基性:アルギニン(I)、リシン(K)、ヒスチジン(H);酸性:アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)。
したがって、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害除草剤に対する耐性活性を有し、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子と厳密な条件下でハイブリダイズする配列は、本発明に含まれる。例示的な配列は、本発明の配列番号29~42および配列番号62~64と少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を含む。本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子は、配列番号15~28を含まない。
任意の従来の核酸ハイブリダイゼーション法または核酸増幅法を用いて、本発明のPPO遺伝子の存在を特定することができる。核酸分子またはその断片は、ある状況下で、他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることが可能である。本発明において、2つの核酸分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成することができれば、これら2つの核酸分子は、互いに特異的にハイブリダイズし得るとみなすことができる。2つの核酸分子が完全な相補性を示せば、2つのうち一方の核酸分子は、他方の核酸分子の「相補体」であると言う。本発明では、核酸分子の各ヌクレオチドが別の核酸分子の対応するヌクレオチドと相補的である場合、これら2つの核酸分子は「完全相補性」を示すと言う。2つの核酸分子が、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールし結合するのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができれば、これら2つの核酸分子は「最小相補的」であると言う。同様に、2つの核酸分子が、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールし結合するのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができれば、これら2つの核酸分子は「相補的」であると言う。完全相補性からのずれは、このずれによって2分子が二本鎖構造を形成することを完全に妨げられない限り、許容される。核酸分子をプライマーやプローブとして作用可能にするためには、特定の溶媒と塩濃度の条件下で安定した二本鎖構造が形成されるように、分子がその配列において十分な相補性を有することを確保するだけである。
本発明において、実質的に相同な配列とは、高ストリンジェンシー条件下で、適合した核酸分子の相補鎖に特異的にハイブリダイズすることができる核酸分子のことである。DNAのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェントな条件は当業者に周知であり、例えば、適切なストリンジェントな条件は、約45℃の条件下で6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(sodium chloride/sodium citrate:SSC)で処理し、次いで50℃の条件下、2.0×SSCで洗浄することによって達成され得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、約2.0×SSCで50℃の低ストリンジェンシー条件から、約0.2×SSCで50℃の高ストリンジェンシー条件までで選択することができる。また、洗浄工程の温度条件は、室温(約22℃)の低ストリンジェンシー条件から約65℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇させることができる。温度条件と塩濃度のどちらも変えることができ、その2つのうちの一方を変えずに、他方を変えることも可能である。好ましくは、本発明におけるストリンジェントな条件は、65℃の6×SSC、0.5%のSDS溶液中で、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズさせ、次いで、2×SSC、0.1%のSDS、および1×SSC、0.1%のSDSで1回ずつ、膜を洗浄することによって達成され得る。
本明細書において、「ハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」という用語は、複雑な混合物(例えば全細胞)のDNAまたはRNAの中に特定のポリヌクレオチド配列が存在する場合に、ストリンジェントな条件下で、その配列のみに分子が結合、二本鎖化、またはハイブリダイズすることを指す。
遺伝コドンの縮重により、様々な異なるDNA配列が同じアミノ酸配列をコードしてもよい。同じまたは実質的に同じタンパク質をコードするこれらの代替DNA配列を生成することは、当業者の技術範囲内である。これらの異なるDNA配列は、本発明の範囲に含まれる。「実質的に同じ」配列とは、除草剤耐性活性に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入を有する配列を指し、除草剤耐性活性を保持している断片を含む。
本発明における「機能的活性」または「活性」という用語は、本発明で用いるタンパク質/酵素が(単独で、または他のタンパク質と組み合わさって)除草剤を分解する能力、または除草剤活性を低下させる能力を有することを意味する。本発明のタンパク質を生成する植物は、好ましくは「有効量」の当該タンパク質を生成し、そのため、除草剤で植物を処理する場合、当該タンパク質の発現レベルは、(特に明記しない限り、一般的な量で)除草剤に対する完全または部分的な耐性を前記植物に付与するのに十分である。除草剤は、標的植物を普通は枯死させる量、または通常の圃場の量および濃度で用いることができる。好ましくは、本発明の植物細胞および植物は、除草剤を用いた処理によって生じる成長抑制または損傷から保護される。本発明の形質転換された植物および植物細胞は、好ましくは、PPO阻害除草剤に対して耐性があり、すなわち、形質転換された植物および植物細胞は、有効量のPPO阻害除草剤の存在下で成長することができる。
本発明における遺伝子およびタンパク質は、特定の例示的な配列を含むだけでなく、その特定の例示的なタンパク質に特徴的な活性を保持する部分および/または断片(全長タンパク質と比較した場合の内部欠失および/または末端欠失を含む)、変異体、突然変異体、変異タンパク質、置換体(置換アミノ酸を有するタンパク質)、キメラ、および融合タンパク質を含む。
本発明における「変異体」という用語は、実質的に同様の配列を意味することを意図している。ポリヌクレオチドの場合、変異体は、参照ポリヌクレオチド内の1つまたは複数の内部部位における1つまたは複数のヌクレオチドの欠失および/または付加、ならびに/または、除草剤耐性遺伝子の1つまたは複数の部位における1つまたは複数のヌクレオチドの置換を含む。本明細書において、「参照のポリヌクレオチドまたはポリペプチド」という用語はそれぞれ、除草剤耐性のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。本明細書において、「天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチド」という用語はそれぞれ、天然起源のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。核酸分子の場合、保存的変異体には、遺伝コードの縮重により、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの1つをコードする複数のポリヌクレオチド配列が含まれる。上記のような天然起源の対立遺伝子変異体は、周知の分子生物学的技術を用いて、例えば、下記に概説するポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction:PCR)およびハイブリダイゼーション技術を用いて特定することができる。変異核酸分子には、合成的に誘導された核酸分子も含まれ、例えば、部位指定突然変異誘発法を用いて産生されてもなお、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのヌクレオチド配列をコードしているものなどがある。一般に、本発明の特定の核酸分子の変異体は、配列アラインメントのプログラムおよびパラメータによって決定されるその特定の核酸分子と、少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を有することになる。
本発明における「変異タンパク質」とは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの1つまたは複数の内部部位における1つまたは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加、および/またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの1つまたは複数の部位における1つまたは複数のアミノ酸の置換によって、参照タンパク質から誘導されるタンパク質を意味することを意図している。本発明に包含される変異タンパク質は生物学的に活性であり、すなわち、それらは本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの所望の生物活性、すなわち、本明細書に記載するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性および/または除草剤耐性を引き続き有している。このような変異体は、例えば遺伝子多型または人為的な操作によって生じてもよい。本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの生物学的に活性な変異体は、配列アラインメントのプログラムおよびパラメータによって決定されるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのアミノ酸配列全体と、少なくとも約88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を有することになる。本発明のタンパク質の生物学的に活性な変異体は、本発明のタンパク質と、わずか1~15個のアミノ酸残基、わずか1~10個のアミノ酸残基、例えば6~10個、わずか5個、わずか4個、3個、2個、またはただ1個のアミノ酸残基の数だけ異なっていてもよい。
ある実施例では、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードし、またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を保持するその変異体のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするヌクレオチド配列を、所望の形質を有する植物を作製するために、目的のヌクレオチド配列の任意の組合せとスタッキングすることができる。「形質」という用語は、特定の配列または配列群に由来する表現形質を指す。例えば、当該アミノ酸/本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードし、またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を保持するその変異体をコードするポリヌクレオチドは、望ましい形質を付与するポリペプチドをコードする任意の他のヌクレオチドとスタッキングしてもよい。望ましい形質としては、以下に限定されないが、病害、昆虫および除草剤に対する抵抗性、熱および干ばつに対する耐性、作物の成熟までの期間の短縮、例えばデンプンまたはバイオマスを発酵可能な糖に変換するための工業的処理の改善、ならびに、例えば、油分およびタンパク質を高含量にするといった農学的品質の向上が挙げられる。
防除される雑草のスペクトルの向上、および/または、天然でより耐性のある種もしくは抵抗性のある雑草種の防除において、2つ以上の作用機序を組み合わせる利点を、PPO耐性作物の他に、人為的方法(遺伝子導入または非遺伝子導入のいずれか)によって作物の除草剤耐性を可能にした化学物質にも拡大適用し得ることは、当業者に周知である。実際、以下の抵抗因子をコードする形質を単独で、または複数の組合せで重ね合わせて、除草剤に対する雑草の変化を効果的に防除または防止する能力を提供することができる。上記の抵抗因子とは、グリホサート抵抗因子(抵抗性植物または細菌からのEPSPS、GOX、およびGATなど)、グルホシネート抵抗因子(PATおよびBarなど)、アセト乳酸合成酵素(ALS)阻害剤に対する除草剤抵抗因子(イミダゾリノン、スルホニル尿素、トリアゾールピリミジン、スルホン化アニリン、ピリミジニルチオ安息香酸などの化学物質の抵抗性遺伝子など、例えば、AHAS、Csrl、およびSurA)、フェノキシオーキシン除草剤抵抗因子(アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ-12(AAD-12)など)、ジカンバ除草剤抵抗因子(ジカンバモノオキシゲナーゼ(DMO)など)、ブロモキシニル抵抗因子(Bxnなど)、フィトエン不飽和化酵素(phytoene desaturase:PDS)阻害剤抵抗因子、光化学系II阻害剤に対する除草剤抵抗因子(psbAなど)、光化学系I阻害剤に対する除草剤抵抗因子、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)阻害剤に対する除草剤抵抗因子(PPO-1など)、フェニル尿素除草剤抵抗因子(CYP76B1など)、およびジクロロメトキシ安息香酸分解酵素である。
グリホサートは、非常に広域なスペクトルの広葉およびイネ科の雑草種を防除するので、広く用いられている。しかし、グリホサート耐性作物および非作物への施用においてグリホサートを繰り返し用いることにより、雑草が、天然でより耐性のある種やグリホサート抵抗性バイオタイプに変化している(引き続きそうである)。ほとんどの除草剤抵抗性管理プログラムでは、抵抗性雑草の出芽を遅らせる手段として、タンク混合された除草剤類を有効量用いることが提案されており、前記除草剤類とは、同じ種を防除するものの、作用機序が異なるものである。本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子とグリホサート耐性形質(および/または他の除草剤耐性形質)とを重ね合わせることによって、グリホサート耐性作物において、グリホサート除草剤およびPPO阻害除草剤(オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、およびフルミオキサジンなど)の同作物における選択的使用を可能にすることにより、グリホサート抵抗性雑草種(1つまたは複数のPPO阻害除草剤によって防除される広葉雑草種)の防除を達成することができる。これらの除草剤は、作用機序の異なる2つ以上の除草剤を含有するタンク混合物で同時に施用することができ、または、単一の除草剤組成物において単独の逐次施用で(例えば、植栽前、または出芽前もしくは出芽後)(2時間から3ヶ月の範囲の施用間隔で)施用することができる。あるいは、これらの除草剤の施用は、施用可能な各化合物カテゴリーを代表する任意の数の除草剤を、任意の時期(作物の植栽後7ヶ月から、作物が収穫される時期(または、単一の除草剤については収穫前の間隔で、最も短い間隔))に組み合わせて用いることにより、施用することができる。
広葉雑草の防除においては、施用時期、単一除草剤の施用量、頑固な雑草または抵抗性雑草を防除する能力の点から、柔軟性が非常に重要である。グリホサート抵抗性遺伝子/本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子を重ねたグリホサートの作物における施用範囲は、250から2500g ae/haまでであり得る。PPO阻害除草剤(1つまたは複数)の施用範囲は、10から1000g ai/haまでであり得る。これらの施用に最適な時期の組合せは、特定の条件、種および環境に依拠する。
除草剤製剤(例えば、エステル、酸もしくは塩の製剤、または可溶性濃縮物、乳化性濃縮物もしくは可溶性液体)、およびタンク混合添加剤(例えば、アジュバントまたは相溶化剤)が、所与の除草剤の雑草防除、または1つもしくは複数の除草剤を組み合わせた雑草防除に著しく影響を与える可能性がある。前述の除草剤のいずれかの任意の化学的組合せは、本発明の範囲内である。
また、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを、単独で、または除草剤抵抗性作物の他の特性とスタッキングされた状態でコードする遺伝子は、1つまたは複数の他の入力形質(例えば、昆虫抵抗性、真菌抵抗性、もしくはストレス耐性など)、または出力形質(例えば、収量の増加、油量の向上、繊維品質の向上など)とスタッキングされ得る。したがって、本発明を用いると、いかなる数の農業害虫をも柔軟かつ経済的に防除する能力で作物の品質を向上させるために、完全な農業解決策を提供することができる。
上記のスタッキングされた組合せは任意の方法によって作製することができ、その方法としては、以下に限定されないが、従来もしくはTopCrossの方法論による交配植物、または遺伝子形質転換が挙げられる。遺伝的に植物を形質転換することによって配列をスタッキングする場合、目的のポリヌクレオチド配列はいつでも、どのような順序でも組み合わせることができる。例えば、1つまたは複数の所望の形質を含む遺伝子導入植物を標的として用い、その後の形質転換によってさらなる形質を導入することができる。その形質は、形質転換カセットの任意の組合せによって提供される目的のポリヌクレオチドと、共形質転換プロトコールで同時に導入することができる。例えば、2つの配列が導入される場合、それら2つの配列は別々の形質転換カセット(trans)に含めることもできるし、または同じ形質転換カセット(cis)に含めることもできる。それらの配列の発現は、同じプロモーターまたは異なるプロモーターによって推進することができる。場合によっては、目的のポリヌクレオチドの発現を抑制する形質転換カセットを導入することが望ましいこともある。これを、他の抑制カセットまたは過剰発現カセットの任意の組合せと組み合わせて、植物において所望の形質の組合せを産生してもよい。さらに、部位特異的組換え系を用いると、所望のゲノム位置にポリヌクレオチド配列をスタッキングし得ることが認識されている。
本発明によるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子は、PPO阻害除草剤に対してより高い耐性を有し、このことは、除草剤耐性作物および選択性マーカー形質の可能性の重要な基礎となる。
本明細書における「発現カセット」という用語は、適切な宿主細胞において特定のポリヌクレオチド配列の発現を指示することができる核酸分子を意味し、目的のポリヌクレオチド配列(すなわち、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードし、またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を保持するその変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、単独であるか、または望ましい形質を付与するポリペプチドをコードする1つまたは複数の付加的な核酸分子との組合せであるポリヌクレオチド)に効果的に連結されるプロモーターを含み、その目的のポリヌクレオチド配列は、終結シグナルに効果的に連結される。コード領域は普通、目的のタンパク質についてコードするが、目的の機能性RNA、例えばアンチセンスRNAまたは非翻訳RNAについても、センスまたはアンチセンスの方向でコードしてもよい。目的のポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってもよく、このことは、その構成要素の少なくとも1つが、他の構成要素の少なくとも1つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然起源のものであってもよいが、異種発現に有用な組換え型で得られたものである。しかし、通常は、発現カセットは宿主に対して異種であり、すなわち、発現カセットの特定のDNA配列は、宿主細胞で天然に生じるのではなく、形質転換イベントによって新しい宿主細胞に導入されていなければならない。発現カセット中のポリヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、または、宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。さらに、プロモーターはまた、特定の組織もしくは器官または発生段階に、特異的であり得る。
本発明は、目的のポリヌクレオチド(すなわち、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードし、またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を保持するその変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、単独であるか、または望ましい形質を付与するポリペプチドをコードする1つまたは複数の付加的な核酸分子との組合せであるポリヌクレオチド)を発現することができる発現カセットを用いた植物の形質転換を包含する。発現カセットは、転写の5’-3’方向に、転写および翻訳の開始領域(すなわちプロモーター)ならびにポリヌクレオチド・オープン・リーディング・フレームを含むことになる。発現カセットは、任意選択で、植物において機能的な転写および翻訳の終結領域(すなわち終結領域)を含んでもよい。いくつかの実施形態において、発現カセットは、安定な形質転換体の選択を可能にする選択性マーカー遺伝子を含む。本発明の発現構築物はまた、リーダー配列、および/または目的のポリヌクレオチドの誘導性発現を可能にする配列を含んでもよい。
発現構築物の調節配列は、目的のポリヌクレオチドに効果的に連結される。本発明における調節配列には、以下に限定されないが、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、輸送ペプチド、ターミネーター、エンハンサー、リーダー配列、イントロンなどの調節配列が含まれる。
プロモーターは、植物発現性プロモーターである。「植物発現性プロモーター」とは、植物細胞において、そのプロモーターに連結されたコード配列の発現を確実にするプロモーターを指す。植物発現性プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。植物において構成的発現を指示するプロモーターの例としては、以下に限定されないが、カリフラワー・モザイク・ウイルスに由来する35Sプロモーター、トウモロコシUbiプロモーター、イネGOS2遺伝子プロモーターなどが挙げられる。あるいは、植物発現性プロモーターは組織特異的プロモーターであり得、組織特異的プロモーターとは、すなわち、緑色組織などのいくつかの組織において、植物の他の組織よりも高いレベル(従来のRNA試験によって測定することができる)で、コード配列の発現を指示するプロモーターであり、例えば、PEPカルボキシラーゼプロモーターがある。あるいは、植物発現性プロモーターは、創傷誘導性プロモーターであり得る。創傷誘導性プロモーター、または創傷誘導性発現パターンを指示するプロモーターとは、力学的要因、または昆虫のかじり取りによって生じる創傷を植物が被った場合に、プロモーターの調節下にあるコード配列の発現が、通常の成長条件と比較して著しく向上することを意味する。創傷誘導性プロモーターの例としては、以下に限定されないが、ジャガイモおよびトマトのプロテアーゼ阻害遺伝子(pin Iおよびpin II)、ならびにトウモロコシのプロテアーゼ阻害遺伝子(MPI)のプロモーターが挙げられる。
輸送ペプチド(分泌シグナル配列またはターゲティング配列としても既知である)は、遺伝子導入産物を特定のオルガネラまたは細胞コンパートメントに導く。レセプタータンパク質の場合、輸送ペプチドは異種であってもよく、例えば、葉緑体輸送ペプチドをコードする配列を用いて葉緑体をターゲティングするもの、または「KDEL」保持配列を用いて小胞体をターゲティングするもの、またはオオムギの植物性凝集素遺伝子のCTPPを用いて液胞をターゲティングするものがある。
リーダー配列には、以下に限定されないが、EMCVリーダー配列(脳心筋炎ウイルス(encephlomyocarditis virus)の5’非コード領域)などの小型RNAウイルスリーダー配列、MDMV(トウモロコシ矮性モザイクウイルス(Maize Dwarf Mosaic Virus)リーダー配列などのジャガイモウイルスY群リーダー配列、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)、アルファルファ・モザイク・ウイルス(alfalfa mosaic virus)のコートタンパク質mRNAの非翻訳リーダー配列(AMV RNA4)、およびタバコ・モザイク・ウイルス(tobacco mosaic virus:TMV)リーダー配列が含まれる。
エンハンサーには、以下に限定されないが、カリフラワー・モザイク・ウイルス(cauliflower mosaic virus:CaMV)エンハンサー、ゴマノハグサ・モザイク・ウイルス(figwort mosaic virus:FMV)エンハンサー、カーネーション・エッチドリング・ウイルス(carnation etched ring virus:CERV)エンハンサー、キャッサバ葉脈モザイクウイルス(cassava vein mosaic virus:CsVMV)エンハンサー、ミラビリス・モザイク・ウイルス(mirabilis mosaic virus:MMV)エンハンサー、ケストルム黄化葉巻ウイルス(cestrum yellow leaf curling virus:CmYLCV)エンハンサー、ワタ葉巻Multanウイルス(cotton leaf curl Multan virus:CLCuMV)エンハンサー、ツユクサ黄色斑紋ウイルス(commelina yellow mottle virus:CoYMV)エンハンサー、およびピーナッツクロロティック条斑カリモウイルス(peanut chlorotic streak caulimovirus:PCLSV)エンハンサーが含まれる。
単子葉植物で用いる場合、イントロンには、以下に限定されないが、トウモロコシhsp70イントロン、トウモロコシ・ユビキチン・イントロン、Adhイントロン1、ショ糖合成酵素イントロン、またはイネAct1イントロンが含まれる。双子葉植物で用いる場合、イントロンには、以下に限定されないが、CAT-1イントロン、pKANNIBALイントロン、PIV2イントロン、および「スーパーユビキチン」イントロンが含まれる。
ターミネーターは、植物において機能する適切なポリアデニル化シグナル配列であり得、適切なポリアデニル化シグナル配列には、以下に限定されないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)ノパリン合成酵素(nopaline synthetase:NOS)遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列、プロテアーゼ阻害剤II(pinII)遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列、エンドウマメssRUBISCO E9遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列、およびα-チューブリン遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列が含まれる。
本発明における「効果的に連結する」とは、核酸配列の一方が、それに連結された配列に必要な機能を提供することを可能にする核酸配列の結合を表す。本発明における「効果的な連結」により、プロモーターが目的の配列に連結することができ、その結果、目的の配列の転写がプロモーターによって制御および調節される。目的の配列がタンパク質をコードしており、そしてそのタンパク質の発現が所望される場合、「効果的に連結する」とは、結果として生じる転写物が効果的に翻訳されるような様式で、プロモーターが前記配列に連結されることを意味する。プロモーターのコード配列への連結が転写物融合であり、そしてコードされたタンパク質が発現される場合、そのような連結は、結果として生じる転写物の最初の翻訳開始コドンがコード配列の開始コドンであるように作製される。あるいは、プロモーターのコード配列への連結が翻訳融合であり、そしてコードされたタンパク質が発現される場合、そのような連結は、5’非翻訳配列に含まれる最初の翻訳開始コドンが、結果として生じる翻訳産物と所望のタンパク質をコードする翻訳オープン・リーディング・フレームとの関係がインフレームであるような様式で、プロモーターに連結されるように作製される。「効果的に連結され」得る核酸配列としては、以下に限定されないが、遺伝子発現機能を提供する配列(すなわち、プロモーター、5’非翻訳領域、イントロン、タンパク質コード領域、3’非翻訳領域、ポリアデニル化部位および/または転写ターミネーターなどの遺伝子発現エレメント)、DNA転移および/または組込み機能を提供する配列(すなわち、T-DNA境界配列、部位特異的リコンビナーゼ認識部位、およびインテグラーゼ認識部位)、選択的機能を提供する配列(すなわち、抗生物質抵抗性マーカーおよび生合成遺伝子)、マーカースコアリング機能を提供する配列、in vitroまたはin vivoでの配列操作を補助する配列(すなわち、ポリリンカー配列および部位特異的組換え配列)、および複製機能を提供する配列(すなわち、細菌性複製起点、自己複製配列、およびセントロメア配列)が挙げられる。
本発明における植物、植物組織または植物細胞のゲノムとは、植物、植物組織または植物細胞の中の任意の遺伝物質を指し、細胞核、色素体およびミトコンドリアのゲノムを含む。
本明細書において、「植物部分」または「植物組織」という用語には、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生され得る植物細胞組織培養物、植物カルス、植物凝集塊、および、植物または植物の部分において無傷である植物細胞が含まれ、植物の部分としては、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、コブ、外皮、茎、根、根端、葯などがある。
本発明の突然変異PPOタンパク質は、様々な種類の植物に適用することができる。双子葉植物には、以下に限定されないが、アルファルファ、マメ、カリフラワー、キャベツ、ニンジン、セロリ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ズッキーニ、ダイコン、アブラナ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ、トマト、シロイヌナズナ、ピーナッツ、またはスイカが含まれる。好ましくは、双子葉植物は、キュウリ、ダイズ、シロイヌナズナ、タバコ、ワタ、アブラナを指す。単子葉植物には、以下に限定されないが、トウモロコシ、イネ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、キビ、サトウキビ、カラスムギ、またはシバクサが含まれる。好ましくは、単子葉植物は、トウモロコシ、イネ、モロコシ、コムギ、オオムギ、キビ、サトウキビ、またはカラスムギを指す。
本明細書において、「植物形質転換」という用語は、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする除草剤抵抗性または除草剤耐性の核酸分子を、単独で、または望ましい形質を付与するポリペプチドをコードする1つまたは複数の付加的な核酸分子と組み合わせて、発現系にクローニングした後、植物細胞に形質転換することを意味する。本発明のレセプターおよび標的発現カセットは、当技術分野で認識されている複数の手法で植物細胞に導入することができる。例えば、目的のヌクレオチド構築物であるポリヌクレオチドの文脈における「導入」という用語は、ポリヌクレオチドが植物の細胞内部に到達するような様式での、ポリヌクレオチドの植物への提示を意味することを意図している。2つ以上のポリヌクレオチドが導入される場合、これらのポリヌクレオチドを、単一のヌクレオチド構築物の一部として、または別々のヌクレオチド構築物として組み立てることができ、同じまたは異なる形質転換ベクターに配置することができる。したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換イベントにおいて、別々の形質転換イベントにおいて、または、例えば植物において育種プロトコールの一部として、目的の宿主細胞に導入することができる。本発明の方法は、1つまたは複数のポリヌクレオチドを植物に導入する特定の方法に依拠せず、(1つまたは複数の)ポリヌクレオチドが植物の少なくとも1つの細胞の内部に到達することのみに依拠する。1つまたは複数のポリヌクレオチドを植物に導入する方法は当技術分野で既知であり、その方法としては、以下に限定されないが、一過性形質転換法、安定形質転換法、およびウイルス媒介法またはゲノム編集技術が挙げられる。
「安定形質転換」という用語は、外来遺伝子が植物のゲノムに導入されて、その植物またはその植物のどの継代のゲノムにも安定的に組み込まれ、その結果、前記外来遺伝子が安定的に遺伝することを意味する。
「一過性形質転換」という用語は、核酸分子またはタンパク質が植物細胞に導入されて機能が実行されるものの、その植物のゲノムには組み込まれず、その結果、外来遺伝子が安定的に遺伝しないことを意味する。
「ゲノム編集技術」とは、ゲノムを改変するために用いられる技術であって、ゲノム配列を正確に操作して、部位指定遺伝子の突然変異、挿入および欠失などの操作を実現することができる技術を指す。現在のところ、ゲノム編集技術としては主に、ホーミングエンドヌクレアーゼ(homing endonuclease:HE)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(Zinc-finger nuclease:ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(transcription activator-like effector nuclease:TALEN)、およびクリスパー(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat(クラスター化した規則的間隔配置の短回文反復配列):CRISPR)の技術が挙げられる。
植物の形質転換に利用可能な多数の形質転換ベクターが当業者に既知であり、本発明に関係する遺伝子は、任意のそのようなベクターと組み合わせて用いることができる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術、および形質転換のための標的種に依拠する。ある複数の標的種については、異なる抗生物質または除草剤の選択マーカーが好ましい場合がある。形質転換で日常的に用いられる選択マーカーとしては、カナマイシンおよび関連する抗生物質または除草剤に対する抵抗性を付与するnptII遺伝子(Bevan et al.,Nature 304:184-187(1983)に発表された);除草剤グルホシネート(ホスフィノトリシンとも呼ばれる)に対する抵抗性を付与するpat遺伝子およびbar遺伝子(White et al.,Nucl.Acids Res 18:1062(1990)、Spencer et al.Theon.Appl.Genet.79:625-631(1990)、ならびに米国特許第5,561,236号および5,276,268号明細書を参照されたい);抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するhph遺伝子(Blochinger & Diggelmann,Mol.Cell.Biol.4:2929-2931);メトトレキサートに対する抵抗性を付与するdhfr遺伝子(Bourouis et al.,EMBO J. 2(7):1099-1104(1983));グリホサートに対する抵抗性を付与するEPSPS遺伝子(米国特許第4,940,935号および第5,188,642号明細書);同じくグリホサートに対する抵抗性を付与するグリホサートN-アセチル基転移酵素(GAT)遺伝子(Castle et al.(2004)Science,304:1151-1154;米国特許出願公開第20070004912号、第20050246798号および第20050060767号明細書);およびマンノースを代謝する能力を提供するマンノース-6-リン酸イソメラーゼ遺伝子(米国特許第5,767,378号および第5,994,629号明細書)が挙げられる。植物の再生方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、Tiプラスミドベクターが外来DNAの送達に利用されており、DNAの直接的取込み、リポソーム、電気穿孔、微量注入、および微粒子銃も同様である。
本発明において、雑草とは、農地で栽培される遺伝子導入植物と競合する植物を指す。
本発明における「防除」および/または「予防」という用語は、有効量のPPO阻害除草剤を農地に少なくとも直接(例えば散布により)施用することによって、雑草の発生を最小限に抑え、かつ/または雑草の成長を停止させることを指す。同時に、栽培される遺伝子導入植物は形態学的に正常であるべきであり、産物の消費および/または産生のために従来の方法で栽培することができる。そして好ましくは、栽培される植物は、非遺伝子導入野生型植物と比較して、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多い。植物損傷の低減には、以下に限定されないが、茎の抵抗性の向上および/または穀物重量の増加などが含まれる。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼには、独立的に、雑草に対する「防除」および/または「予防」の効果があり、その効果は、雑草を「防除」および/または「予防」し得る他の物質の存在によって、減少および/または消失することはない。具体的には、(本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子を含む)遺伝子導入植物のいずれかの組織が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、および/または雑草を防除し得る別の物質を、同時にかつ/または別々に、有しかつ/または生成する場合、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの雑草に対する「防除」および/または「予防」の効果が、その別の物質の存在によって影響を受けることもなく、また、「防除」および/または「予防」の効果が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼに関係なく、結果的に、その別の物質によって完全および/または部分的に達成されることもない。
本発明における「植物繁殖体」には、以下に限定されないが、植物有性繁殖体および植物栄養繁殖体が含まれる。植物有性繁殖体としては、限定されないが植物の種子が挙げられ、栄養繁殖体とは、ex vivo条件下で新しい植物を産生し得る植物の栄養器官または特定の組織を指す。栄養器官または特定の組織としては、以下に限定されないが、根、茎、および葉が挙げられ、例えば、イチゴ、サツマイモなどの根を栄養繁殖体とする植物;サトウキビ、ジャガイモ(塊茎)などの茎を栄養繁殖体とする植物;およびアロエ、ベゴニアなどの葉を栄養繁殖体とする植物が挙げられる。
本発明により、新規な除草剤抵抗性形質が植物に付与され得、(収量などの)表現形質への悪影響は観察されない。本発明における植物は、試験した少なくとも1つの除草剤の一般的な施用レベルの、例えば、2×、3×、4×、または5×に耐性を示し得る。これらの耐性レベルの向上は、本発明の範囲内である。例えば、所与の遺伝子の発現を増大させるために、当技術分野で既知の様々な技術について、予見可能な最適化とさらなる開発を行うことができる。
本発明は、以下の利点を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用を提供する。
1.除草剤に対する広範な耐性。本発明はまず、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1~PPO14が、PPO阻害除草剤に対してより高い耐性を示し、そのため、植物における広範な施用の見込みがあることを開示する。
2.除草剤に対する強耐性。本発明が開示するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1~PPO14は、PPO阻害除草剤に対して強い耐性を示し、圃場濃度4倍のオキシフルオルフェン、サフルフェナシルおよびフルミオキサジン、ならびに圃場濃度2倍のスルフェントラゾンに対して、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1~PPO14のほぼ全てが高い抵抗性を示す。
3.ほとんど影響を受けない収量。除草剤に対する植物の耐性には、植物の収量と直接的な相関関係がある。高抵抗性植物は除草剤の影響を受けず、除草剤は植物の収量に影響を及ぼさない。しかし、中抵抗性および低抵抗性の植物の収量は、高抵抗性の植物の収量よりもはるかに低くなる。
本発明の技術的解決策について、下記の図面および実施例により、さらに詳細に説明する。
本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用に関する技術的解決法について、以下の実施例により、さらに説明する。
遺伝子導入シロイヌナズナ植物の取得と検証
1.プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子の取得
微生物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1、PPO2、PPO3、PPO4、PPO5、PPO6、PPO7、PPO8、PPO9、PPO10、PPO11、PPO12、PPO13およびPPO14のアミノ酸配列を、配列表の配列番号1~14として記載する。PPO1~PPO14のヌクレオチド配列は、対応するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1~PPO14をコードするものであり、配列表の配列番号15~28として記載する。PPO1A~PPO14Aのヌクレオチド配列は、対応するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1~PPO14をコードし、シロイヌナズナ/ダイズ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号29~42として記載する。PPO1B、PPO6BおよびPPO12Bのヌクレオチド配列は、対応するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1、PPO6およびPPO12をコードし、トウモロコシ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号62~64として記載する。
1.プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子の取得
微生物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1、PPO2、PPO3、PPO4、PPO5、PPO6、PPO7、PPO8、PPO9、PPO10、PPO11、PPO12、PPO13およびPPO14のアミノ酸配列を、配列表の配列番号1~14として記載する。PPO1~PPO14のヌクレオチド配列は、対応するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1~PPO14をコードするものであり、配列表の配列番号15~28として記載する。PPO1A~PPO14Aのヌクレオチド配列は、対応するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1~PPO14をコードし、シロイヌナズナ/ダイズ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号29~42として記載する。PPO1B、PPO6BおよびPPO12Bのヌクレオチド配列は、対応するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1、PPO6およびPPO12をコードし、トウモロコシ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号62~64として記載する。
大腸菌プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO-ECのアミノ酸配列を、配列表の配列番号43として記載する。PPO-ECヌクレオチド配列は、対応する大腸菌プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO-ECをコードするものであり、配列表の配列番号44として記載する。PPO-ECAヌクレオチド配列は、対応する大腸菌プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO-ECをコードし、シロイヌナズナ/ダイズ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号45として記載する。
シロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO-ATのアミノ酸配列を、配列表の配列番号46として記載する。PPO-ATヌクレオチド配列は、対応するシロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO-ATをコードするものであり、配列表の配列番号47として記載する。PPO-ATAヌクレオチド配列は、対応するシロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO-ATをコードし、シロイヌナズナ/ダイズ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号48として記載する。
アルセノフォヌス(Arsenophonus)のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO-APのアミノ酸配列を、配列表の配列番号65として記載する。PPO-APヌクレオチド配列は、対応するアルセノフォヌスのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO-APをコードするものであり、配列表の配列番号66として記載する。PPO-APAヌクレオチド配列は、対応するアルセノフォヌスのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO-APをコードし、シロイヌナズナ/ダイズ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号67として記載する。PPO-APBヌクレオチド配列は、対応するアルセノフォヌスのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO-APをコードし、トウモロコシ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号68として記載する。
2.前述のヌクレオチド配列の合成
PPO1A~PPO14Aヌクレオチド配列、PPO-ECAヌクレオチド配列、PPO-ATAヌクレオチド配列およびPPO-APAヌクレオチド配列(配列番号29~42、配列番号45、配列番号48、および配列番号67)の5’末端および3’末端をそれぞれ、ユニバーサルアダプタープライマー1に連結した。
PPO1A~PPO14Aヌクレオチド配列、PPO-ECAヌクレオチド配列、PPO-ATAヌクレオチド配列およびPPO-APAヌクレオチド配列(配列番号29~42、配列番号45、配列番号48、および配列番号67)の5’末端および3’末端をそれぞれ、ユニバーサルアダプタープライマー1に連結した。
5’末端用ユニバーサルアダプタープライマー1:配列表の配列番号49に記載の5’-taagaaggagatatacatatg-3’
3’末端用ユニバーサルアダプタープライマー1:配列表の配列番号50に記載の5’-gtggtggtggtgctcgag-3’
3.シロイヌナズナ用のPPO1A~PPO14Aヌクレオチド配列、PPO-ECAヌクレオチド配列、PPO-ATAヌクレオチド配列およびPPO-APAヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターの構築
制限酵素Spe IおよびAsc Iを用い、植物発現ベクターDBNBC-01を二重消化して線状化した。消化産物を精製して、線状化DBNBC-01発現ベクターバックボーン(ベクターバックボーン:pCAMBIA2301(CAMBIAから入手可能))を得、次いで、Takara In-Fusion products seamless connection kit(Clontech、米国カリフォルニア州、CAT:121416)の説明書の手順に従って、ユニバーサルアダプタープライマー1に連結したPP01Aヌクレオチド配列(配列番号29)と組換え反応を行い、図1に示す概略構造を有する組換え発現ベクターDBN12337を構築した(Spec:スペクチノマイシン(spectinomycin)遺伝子、RB:右境界(right border)、eFMV:ゴマノハグサ・モザイク・ウイルスの34Sエンハンサー(enhancer of Figwort mosaic virus)(配列番号51)、prBrCBP:アブラナ真核生物伸長因子遺伝子1α(Tsf1)のプロモーター(配列番号52)、spAtCTP2:シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド(配列番号53)、EPSPS:5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素遺伝子(配列番号54)、tPsE9:エンドウマメRbcS遺伝子のターミネーター(配列番号55)、prAtUbi10:シロイヌナズナのユビキチン10遺伝子のプロモーター(配列番号56)、spAtCLP1:シロイヌナズナの白色または薄緑色の葉緑体の輸送ペプチド(配列番号57)、PPO1A:PPO1Aヌクレオチド配列(配列番号29)、tNos:ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター(terminator of a nopaline synthase gene)(配列番号58)、pr35S:カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sプロモーター(配列番号59)、cPAT:ホスフィノトリシンアセチル基転移酵素遺伝子(配列番号60)、t35S:カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sターミネーター(配列番号61)、LB:左境界(left border))。
3’末端用ユニバーサルアダプタープライマー1:配列表の配列番号50に記載の5’-gtggtggtggtgctcgag-3’
3.シロイヌナズナ用のPPO1A~PPO14Aヌクレオチド配列、PPO-ECAヌクレオチド配列、PPO-ATAヌクレオチド配列およびPPO-APAヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターの構築
制限酵素Spe IおよびAsc Iを用い、植物発現ベクターDBNBC-01を二重消化して線状化した。消化産物を精製して、線状化DBNBC-01発現ベクターバックボーン(ベクターバックボーン:pCAMBIA2301(CAMBIAから入手可能))を得、次いで、Takara In-Fusion products seamless connection kit(Clontech、米国カリフォルニア州、CAT:121416)の説明書の手順に従って、ユニバーサルアダプタープライマー1に連結したPP01Aヌクレオチド配列(配列番号29)と組換え反応を行い、図1に示す概略構造を有する組換え発現ベクターDBN12337を構築した(Spec:スペクチノマイシン(spectinomycin)遺伝子、RB:右境界(right border)、eFMV:ゴマノハグサ・モザイク・ウイルスの34Sエンハンサー(enhancer of Figwort mosaic virus)(配列番号51)、prBrCBP:アブラナ真核生物伸長因子遺伝子1α(Tsf1)のプロモーター(配列番号52)、spAtCTP2:シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド(配列番号53)、EPSPS:5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素遺伝子(配列番号54)、tPsE9:エンドウマメRbcS遺伝子のターミネーター(配列番号55)、prAtUbi10:シロイヌナズナのユビキチン10遺伝子のプロモーター(配列番号56)、spAtCLP1:シロイヌナズナの白色または薄緑色の葉緑体の輸送ペプチド(配列番号57)、PPO1A:PPO1Aヌクレオチド配列(配列番号29)、tNos:ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター(terminator of a nopaline synthase gene)(配列番号58)、pr35S:カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sプロモーター(配列番号59)、cPAT:ホスフィノトリシンアセチル基転移酵素遺伝子(配列番号60)、t35S:カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sターミネーター(配列番号61)、LB:左境界(left border))。
大腸菌T1コンピテント細胞を、以下の熱ショック条件下で熱ショック法を用いることにより、組換え発現ベクターDBN12337で形質転換した。大腸菌T1コンピテント細胞50μLとプラスミドDNA(組換え発現ベクターDBN12337)10μLとを42℃で30秒間水浴させ、37℃で1時間振盪培養し(振盪には振盪機を回転数100rpmで使用)、次いで、温度37℃の条件下で、スペクチノマイシン50mg/Lを含有するLB固体プレート(トリプトン10g/L、酵母エキス5g/L、NaCl10g/Lおよび寒天15mg/L;NaOHでpH7.5に調整)で12時間培養した。白色の細菌コロニーを取り出し、LB液体培地(トリプトン10g/L、酵母エキス5g/L、NaCl10g/Lおよびスペクチノマイシン50mg/L;NaOHでpH7.5に調整)で、温度37℃の条件下で一晩培養した。細胞内のプラスミドをアルカリ法で抽出した。菌液を回転速度12,000rpmで1分間遠心分離し、上清を除去し、沈殿した菌糸体を、氷で予冷した溶液I(25mMのTris-HCl、10mMのエチレンジアミン四酢酸(ethylenediaminetetraacetic acid:EDTA)および50mMのグルコース、pH8.0)100μLに懸濁した。新たに調製した溶液II(0.2MのNaOH、1%のドデシル硫酸ナトリウム(sodium dodecyl sulfate:SDS)200μLを添加し、チューブを4回反転させて混合し、氷上に3~5分間置いた。氷冷した溶液III(3Mの酢酸カリウム、5Mの酢酸)150μLを添加し、直ちに均一に混合し、氷上に5~10分間置いた。温度4℃、回転数12,000rpmの条件下で混合物を5分間遠心分離し、2倍量の無水エタノールを上清に添加し、均一に混合し、室温で5分間置いた。温度4℃、回転数12,000rpmの条件下で混合物を5分間遠心分離し、上清を捨て、濃度70%(V/V)のエタノールで沈殿物を洗浄した後、風乾した。RNase(20μg/mL)を含有するTE(10mMのTris-HClおよび1mMのEDTA、pH8.0)30μLを添加して、沈殿物を溶解した。得られた産物を温度37℃で30分間水浴させてRNAを消化し、使用に備えて温度-20℃で保存した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターDBN12337のSpeI部位とAscI部位との間のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号29に記載のもの、すなわちPPO1Aヌクレオチド配列であることが示された。
組換え発現ベクターDBN12337を構築する上記の方法に従い、ユニバーサルアダプタープライマー1に連結したPPO2A~PPO14Aヌクレオチド配列、PPO-ECAヌクレオチド配列、PPO-ATAヌクレオチド配列およびPPO-APAヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化DBNBC-01発現ベクターバックボーンと組換え反応を行って、組換え発現ベクターDBN12338~DBN12353を順に構築した。塩基配列決定法により、上述の各ヌクレオチド配列が、組換え発現ベクターDBN12338~DBN12353に正しく挿入されたことを確認した。
上記の組換え発現ベクターDBN12337の構築方法に従い、組換え発現ベクターDBN12337Nを対照として構築し、その構造を図2に示した(Spec:スペクチノマイシン遺伝子、RB:右境界、eFMV:ゴマノハグサ・モザイク・ウイルスの34Sエンハンサー(配列番号51)、prBrCBP:アブラナ真核生物伸長因子遺伝子1α(Tsf1)のプロモーター(配列番号52)、spAtCTP2:シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド(配列番号53)、EPSPS:5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素遺伝子(配列番号54)、tPsE9:エンドウマメRbcS遺伝子のターミネーター(配列番号55)、pr35S:カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sプロモーター(配列番号59)、cPAT:ホスフィノトリシンアセチル基転移酵素遺伝子(配列番号60)、t35S:カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sターミネーター(配列番号61)、LB:左境界)。
4.シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
正しく構築された組換え発現ベクターDBN12337~DBN12350、DBN12352、DBN12353、および上述の対照組換え発現ベクターDBN12337Nをそれぞれ、液体窒素法を用い、以下の形質転換条件下でアグロバクテリウムGV3101に形質転換した。100μLのアグロバクテリウムGV3101と、3μLのプラスミドDNA(組換え発現ベクターDBN12337~DBN12350、DBN12352、DBN12353およびDBN12337N)を液体窒素に10分間入れ、37℃の温水に10分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムGV3101をLBチューブに接種し、温度28℃、回転数200rpmの条件下で2時間培養し、リファンピシン50mg/Lおよびスペクチノマイシン50mg/Lを含有するLB固体プレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを取り出して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターDBN12337~DBN12350、DBN12352、DBN12353およびDBN12337Nの構造が、完全に正しいことが示された。
正しく構築された組換え発現ベクターDBN12337~DBN12350、DBN12352、DBN12353、および上述の対照組換え発現ベクターDBN12337Nをそれぞれ、液体窒素法を用い、以下の形質転換条件下でアグロバクテリウムGV3101に形質転換した。100μLのアグロバクテリウムGV3101と、3μLのプラスミドDNA(組換え発現ベクターDBN12337~DBN12350、DBN12352、DBN12353およびDBN12337N)を液体窒素に10分間入れ、37℃の温水に10分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムGV3101をLBチューブに接種し、温度28℃、回転数200rpmの条件下で2時間培養し、リファンピシン50mg/Lおよびスペクチノマイシン50mg/Lを含有するLB固体プレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを取り出して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターDBN12337~DBN12350、DBN12352、DBN12353およびDBN12337Nの構造が、完全に正しいことが示された。
5.遺伝子導入シロイヌナズナ植物の取得
野生型シロイヌナズナの種子を0.1%(w/v)のアガロース溶液に懸濁した。同調的種子発芽を確実にするために、懸濁した種子を4℃で2日間保存して、休眠要求を満たした。バーミキュライトを馬糞堆肥土と混合し、その混合物を底部灌水して、混合土壌から24時間かけて水を排出した。上記の前処理した種子をその混合土壌に播種し、7日間保湿カバーで覆った。種子を発芽させ、恒温(22℃)、恒湿(40~50%)、光強度120~150μmol/m2s-1の長日光条件下(16時間明期/8時間暗期)の温室で栽培した。最初はホーグランド栄養溶液で灌水し、次いで脱イオン水で灌水して、湿っているが水はしみ通らない状態に土壌を保った。
野生型シロイヌナズナの種子を0.1%(w/v)のアガロース溶液に懸濁した。同調的種子発芽を確実にするために、懸濁した種子を4℃で2日間保存して、休眠要求を満たした。バーミキュライトを馬糞堆肥土と混合し、その混合物を底部灌水して、混合土壌から24時間かけて水を排出した。上記の前処理した種子をその混合土壌に播種し、7日間保湿カバーで覆った。種子を発芽させ、恒温(22℃)、恒湿(40~50%)、光強度120~150μmol/m2s-1の長日光条件下(16時間明期/8時間暗期)の温室で栽培した。最初はホーグランド栄養溶液で灌水し、次いで脱イオン水で灌水して、湿っているが水はしみ通らない状態に土壌を保った。
シロイヌナズナは、花浸漬法で形質転換した。スペクチノマイシン(50mg/L)およびリファンピシン(10mg/L)を含有するLB培養液の1つまたは複数の前培養物15~30mLに、採取したアグロバクテリウムのコロニーを接種した。その前培養物を温度28℃、回転数220rpmで一晩、一定速度で振盪しながらインキュベートした。各前培養物を用いて、スペクチノマイシン(50mg/L)およびリファンピシン(10mg/L)を含有するYEP培養液の培養物500mLを2つ接種し、その培養物を28℃で一晩、連続振盪しながらインキュベートした。回転数約4,000rpmの遠心分離を20分間、室温で行って細胞を沈殿させ、生じた上清を捨てた。細胞沈殿物を、1/2×MS塩/B5ビタミン、10%(w/v)ショ糖、0.044μMのベンジルアミノプリン(10μL/L(1mg/mLのDMSO保存溶液))および300μL/LのSilvet L-77を含有した浸透圧培養液500mLに穏やかに再懸濁した。月齢約1ヵ月のシロイヌナズナ植物を、再懸濁した細胞を含有する浸透圧培養液に15秒間漬けて、最新の花序を確実に浸漬した。次いで、シロイヌナズナ植物を横向きに置いて蓋をし、24時間暗所で湿潤状態を保った。そのシロイヌナズナ植物を、通常、22℃で16時間明期/8時間暗期の光周期で栽培した。約4週間後に種子を収穫した。
この新たに収穫した(PPO1A~PPO14Aヌクレオチド配列、PPO-ATAヌクレオチド配列、PPO-APAヌクレオチド配列、および対照ベクターDBN12337N)のT1種子を、室温で7日間乾燥させた。この種子を26.5cm×51cmの発芽ディスクに播種し、ディスク1枚当たり200mgのT1種子(約10,000粒)を入れた。ここでの種子は、同調的種子発芽を確実にするために、あらかじめ蒸留水に懸濁し、4℃で2日間保存して休眠要求を満たしたものである。
バーミキュライトを馬糞堆肥土と混合し、その混合物を底部灌水して、重力で水を排出した。ピペットを用いて、前処理した種子を混合土壌に均等に播種し、4~5日間保湿カバーで覆った。初期形質転換体を選択するため、(共形質転換PAT遺伝子の選択に用いた)グルホシネートを出芽後散布施用する1日前に、カバーを外した。
リバティ(Liberty)除草剤(グルホシネート200g ai/L)の0.2%溶液を、植栽して7日後(days after planting:DAP)および11DAP(それぞれ、子葉期、および2~4枚の葉期)に、10mL/ディスク(703L/ha)の散布量で、デビルビス圧縮空気ノズルによってT1植物に散布し、1回の施用につき、有効量280g ai/haのグルホシネートを提供した。最終散布の4~7日後に生存植物(活発に成長している植物)を特定し、馬糞堆肥土およびバーミキュライトで作製した7cm×7cmの正方形の鉢に移植した(3~5株/ディスク)。移植した植物は、3~4日間保湿カバーで覆い、22℃の培養庫に置くか、上記の温室に直接移した。次いで、カバーを外し、PPO阻害除草剤に対する耐性をもたらすPPO1A~PPO14Aヌクレオチド配列、PPO-ATAヌクレオチド配列、PPO-APAヌクレオチド配列および対照ベクターの能力を試験する少なくとも1日前に、植物を温室(22±5℃、50±30%RH、14時間明期:10時間暗期、最低500μE/m2s-1の自然光+補助光)で植栽した。
6.遺伝子導入シロイヌナズナ植物の除草剤耐性の検出
形質転換したシロイヌナズナT1植物を、最初に、グルホシネート除草剤を用いて選択した。PPO1Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO1A)、PPO2Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO2A)、PPO3Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO3A)、PPO4Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO4A)、PPO5Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO5A)、PPO6Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO6A)、PPO7Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO7A)、PPO8Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO8A)、PPO9Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO9A)、PPO10Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO10A)、PPO11Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO11A)、PPO12Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO12A)、PPO13Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO13A)、PPO14Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO14A)、PPO-ATAヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO-ATA)、PPO-APAヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO-APA)、対照ベクターが導入されたシロイヌナズナT1植物(対照ベクター)、および野生型シロイヌナズナ植物(CK)(各遺伝子型には24株が含まれる)に、(播種して18日後に)オキシフルオルフェンを3つの濃度(180g ai/ha(圃場濃度1倍、1×)、720g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、サフルフェナシルを3つの濃度(25g ai/ha(圃場濃度1倍、1×)、100g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、フルミオキサジンを3つの濃度(60g ai/ha(圃場濃度1倍、1×)、240g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、ならびにスルフェントラゾンを3つの濃度(450g ai/ha(圃場濃度1倍、1×)、900g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、および0g ai/ha(水、0×))で散布して、除草剤に対するシロイヌナズナの耐性を判定した。散布の7日後(7DAT)に、除草剤によって生じた各植物の損傷レベルを、植物の損傷レベルの平均(%)(植物の損傷レベルの平均(%)=傷害を受けた葉の面積/全体の葉の面積×100%)に従って評価した。すなわち、農薬損傷の等級:等級0は、植物の成長状態が本質的にブランク溶媒(水)を散布したものと同じであることを意味し、等級1は、植物の損傷レベルの平均が10%未満であることを意味し、等級2は、植物の損傷レベルの平均が10%超であることを意味し、等級3は、植物の損傷レベルの平均が100%であることを意味する。成長状態が等級0および等級1に該当する植物を高抵抗性植物、等級2に該当するものを低抵抗性植物、等級3に該当するものを非抵抗性植物に分類する。実験結果を表1~4に示す。
形質転換したシロイヌナズナT1植物を、最初に、グルホシネート除草剤を用いて選択した。PPO1Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO1A)、PPO2Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO2A)、PPO3Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO3A)、PPO4Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO4A)、PPO5Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO5A)、PPO6Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO6A)、PPO7Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO7A)、PPO8Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO8A)、PPO9Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO9A)、PPO10Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO10A)、PPO11Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO11A)、PPO12Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO12A)、PPO13Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO13A)、PPO14Aヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO14A)、PPO-ATAヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO-ATA)、PPO-APAヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナT1植物(PPO-APA)、対照ベクターが導入されたシロイヌナズナT1植物(対照ベクター)、および野生型シロイヌナズナ植物(CK)(各遺伝子型には24株が含まれる)に、(播種して18日後に)オキシフルオルフェンを3つの濃度(180g ai/ha(圃場濃度1倍、1×)、720g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、サフルフェナシルを3つの濃度(25g ai/ha(圃場濃度1倍、1×)、100g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、フルミオキサジンを3つの濃度(60g ai/ha(圃場濃度1倍、1×)、240g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、ならびにスルフェントラゾンを3つの濃度(450g ai/ha(圃場濃度1倍、1×)、900g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、および0g ai/ha(水、0×))で散布して、除草剤に対するシロイヌナズナの耐性を判定した。散布の7日後(7DAT)に、除草剤によって生じた各植物の損傷レベルを、植物の損傷レベルの平均(%)(植物の損傷レベルの平均(%)=傷害を受けた葉の面積/全体の葉の面積×100%)に従って評価した。すなわち、農薬損傷の等級:等級0は、植物の成長状態が本質的にブランク溶媒(水)を散布したものと同じであることを意味し、等級1は、植物の損傷レベルの平均が10%未満であることを意味し、等級2は、植物の損傷レベルの平均が10%超であることを意味し、等級3は、植物の損傷レベルの平均が100%であることを意味する。成長状態が等級0および等級1に該当する植物を高抵抗性植物、等級2に該当するものを低抵抗性植物、等級3に該当するものを非抵抗性植物に分類する。実験結果を表1~4に示す。
シロイヌナズナでは、オキシフルオルフェン除草剤180g ai/haが、感受性植物と抵抗性が平均レベルの植物とを識別する有効量である。表1の結果から、対照ベクターおよびCKと比較して、遺伝子型PPO1A~PPO14Aは全て、オキシフルオルフェンに対して異なる濃度で高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-APAおよびPPO-ATAはいずれも、基本的に耐性を示さなかったことがわかる。
シロイヌナズナでは、サフルフェナシル除草剤25g ai/haが、感受性植物と抵抗性が平均レベルの植物とを識別する有効量である。表2の結果から以下のことがわかる。対照ベクターおよびCKと比較して、(1)遺伝子型PPO1A~PPO14Aは全て、圃場濃度1倍のサフルフェナシルに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-APAおよびPPO-ATAはいずれも耐性を示さず、(2)遺伝子型PPO1A~PPO7AおよびPPO9A~PPO14Aは全て、圃場濃度4倍のサフルフェナシルに対して高い抵抗耐性を示したが(遺伝子型PPO8Aでは2株のみが中程度または低い抵抗耐性を示し、他の22株は全て、高い抵抗耐性を示した)、遺伝子型PPO-APAおよびPPO-ATAはいずれも、耐性を示さなかった。
シロイヌナズナでは、フルミオキサジン除草剤60g ai/haが、感受性植物と抵抗性が平均レベルの植物とを識別する有効量である。表3の結果から、対照ベクターおよびCKと比較して、遺伝子型PPO1A~PPO14Aは全て、フルミオキサジンに対して異なる濃度で高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-APAおよびPPO-ATAはいずれも、基本的に耐性を示さなかったことがわかる。
シロイヌナズナでは、スルフェントラゾン除草剤450g ai/haが、感受性植物と抵抗性が平均レベルの植物とを識別する有効量である。表4の結果から、対照ベクターおよびCKと比較して、遺伝子型PPO1A~PPO14Aは全て、スルフェントラゾンに対して異なる濃度で高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-APAおよびPPO-ATAはいずれも、耐性を示さなかったことがわかる。
遺伝子導入ダイズ植物の取得と検証
1.組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
組換え発現ベクターDBN12337、DBN12342、DBN12348、DBN12351およびDBN12353(それぞれ、PPO1Aヌクレオチド配列、PPO6Aヌクレオチド配列、PPO12Aヌクレオチド配列、PPO-ECAヌクレオチド配列、およびPPO-APAヌクレオチド配列を含む)、ならびに実施例1の項目3に記載した対照組換え発現ベクターDBN12337Nをそれぞれ、液体窒素法を用い、以下の形質転換条件下で、アグロバクテリウムLBA4404(Invitrogen、米国、シカゴ、CAT:18313-015)に形質転換した。100μLのアグロバクテリウムLBA4404、および3μLのプラスミドDNA(組換え発現ベクター)を液体窒素に10分間入れ、37℃の温水に10分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムLBA4404をLBチューブに接種し、温度28℃、回転数200rpmの条件下で2時間培養した後、リファンピシン50mg/Lおよびスペクチノマイシン50mg/Lを含有するLBプレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを採取して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターDBN12337、DBN12342、DBN12348、DBN12351、DBN12353、および対照組換え発現ベクターDBN12337Nの構造が、完全に正しいことが示された。
1.組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
組換え発現ベクターDBN12337、DBN12342、DBN12348、DBN12351およびDBN12353(それぞれ、PPO1Aヌクレオチド配列、PPO6Aヌクレオチド配列、PPO12Aヌクレオチド配列、PPO-ECAヌクレオチド配列、およびPPO-APAヌクレオチド配列を含む)、ならびに実施例1の項目3に記載した対照組換え発現ベクターDBN12337Nをそれぞれ、液体窒素法を用い、以下の形質転換条件下で、アグロバクテリウムLBA4404(Invitrogen、米国、シカゴ、CAT:18313-015)に形質転換した。100μLのアグロバクテリウムLBA4404、および3μLのプラスミドDNA(組換え発現ベクター)を液体窒素に10分間入れ、37℃の温水に10分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムLBA4404をLBチューブに接種し、温度28℃、回転数200rpmの条件下で2時間培養した後、リファンピシン50mg/Lおよびスペクチノマイシン50mg/Lを含有するLBプレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを採取して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターDBN12337、DBN12342、DBN12348、DBN12351、DBN12353、および対照組換え発現ベクターDBN12337Nの構造が、完全に正しいことが示された。
2.遺伝子導入ダイズ植物の取得
従来のアグロバクテリウム感染法に従い、無菌培養したダイズ変種Zhonghuang13の子葉節組織を、本実施例の項目1に記載のアグロバクテリウムと共培養して、組換え発現ベクターDBN12337、DBN12342、DBN12348、DBN12351、DBN12353、および対照組換え発現ベクターDBN12337NのT-DNAを、ダイズ染色体に導入した(T-DNAは、ゴマノハグサ・モザイク・ウイルスの34Sエンハンサー配列、アブラナ真核生物伸長因子遺伝子1α(Tsf1)のプロモーター配列、シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド配列、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素遺伝子、エンドウマメRbcS遺伝子のターミネーター配列、シロイヌナズナユビキチン10遺伝子のプロモーター配列、シロイヌナズナの白色または薄緑色の葉緑体の輸送ペプチド、PPO1Aヌクレオチド配列、PPO6Aヌクレオチド配列、PPO12ヌクレオチド配列、PPO-ECAヌクレオチド配列、PPO-APAヌクレオチド配列、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配列、カリフラワー・モザイク・ウイルスの35Sプロモーター配列、ホスフィノトリシン-N-アセチル基転移酵素遺伝子、およびカリフラワー・モザイク・ウイルスの35Sターミネーター配列を含む)。それにより、PPO1Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO6Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO12Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO-ECAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO-APAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、および対照ベクターDBN12337Nが導入されたダイズ植物をそれぞれ得た。
従来のアグロバクテリウム感染法に従い、無菌培養したダイズ変種Zhonghuang13の子葉節組織を、本実施例の項目1に記載のアグロバクテリウムと共培養して、組換え発現ベクターDBN12337、DBN12342、DBN12348、DBN12351、DBN12353、および対照組換え発現ベクターDBN12337NのT-DNAを、ダイズ染色体に導入した(T-DNAは、ゴマノハグサ・モザイク・ウイルスの34Sエンハンサー配列、アブラナ真核生物伸長因子遺伝子1α(Tsf1)のプロモーター配列、シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド配列、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素遺伝子、エンドウマメRbcS遺伝子のターミネーター配列、シロイヌナズナユビキチン10遺伝子のプロモーター配列、シロイヌナズナの白色または薄緑色の葉緑体の輸送ペプチド、PPO1Aヌクレオチド配列、PPO6Aヌクレオチド配列、PPO12ヌクレオチド配列、PPO-ECAヌクレオチド配列、PPO-APAヌクレオチド配列、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配列、カリフラワー・モザイク・ウイルスの35Sプロモーター配列、ホスフィノトリシン-N-アセチル基転移酵素遺伝子、およびカリフラワー・モザイク・ウイルスの35Sターミネーター配列を含む)。それにより、PPO1Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO6Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO12Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO-ECAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO-APAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、および対照ベクターDBN12337Nが導入されたダイズ植物をそれぞれ得た。
アグロバクテリウム媒介のダイズ形質転換では、簡単に述べると、ダイズ発芽培地(B5塩3.1g/L、B5ビタミン、ショ糖20g/L、および寒天8g/L、pH5.6)でダイズ成熟種子を発芽させ、次いで、温度25±1℃、光周期(明期/暗期)16時間/8時間の条件下で培養した。発芽の4~6日後に、明緑色の子葉節で膨らんだダイズ無菌実生を採取し、子葉節から3~4ミリメータ下の胚軸を切り取り、子葉下軸を縦に切断し、頂芽、側芽、および種子根を除去した。メスの背を用いて子葉節に創傷を作り、創傷子葉節組織にアグロバクテリウム懸濁液を接触させた。ここで、アグロバクテリウムは、PPO1Aヌクレオチド配列、PPO6Aヌクレオチド配列、PPO12Aヌクレオチド配列、PPO-ECAヌクレオチド配列、またはPPO-APAヌクレオチド配列をそれぞれ、創傷子葉節組織に転移させることができる(工程1:感染工程)。この工程において、好適に、アグロバクテリウム懸濁液(OD660=0.5~0.8、感染培地(MS塩2.15g/L、B5ビタミン、ショ糖20g/L、グルコース10g/L、アセトシリンゴン(acetosyringone:AS)40mg/L、2-モルホリンエタンスルホン酸(2-morpholine ethanesulfonic acid:MES)4g/L、およびゼアチン(zeatin:ZT)2mg/L、pH5.3))に子葉節組織を浸漬して、接種を開始した。その子葉組織を、アグロバクテリウムと一定期間(3日間)、共培養した(工程2:共培養工程)。好適に、感染工程の後、固体培地(MS塩4.3g/L、B5ビタミン、ショ糖20g/L、グルコース10g/L、MES4g/L、ZT2mg/L、寒天8g/L;pH5.6)で子葉組織を培養した。この共培養段階の後、任意選択で「回収」工程を設けることができ、この工程では、アグロバクテリウムの増殖を阻害するために少なくとも1つの抗生物質(セファロスポリン150~250mg/L)を添加し、植物形質転換体のための選択剤を添加していない回収培地(B5塩3.1g/L、B5ビタミン、MES1g/L、ショ糖30g/L、ZT2mg/L、寒天8g/L、セファロスポリン150mg/L、グルタミン酸100mg/L、およびアスパラギン酸100mg/L、pH5.6)を用いた(工程3:回収工程)。好適に、子葉節から再生された組織塊を、抗生物質を含むが選択剤を含まない固体培地で培養することによって、アグロバクテリウムを排除し、感染細胞のための回収期間を提供した。その後、子葉節から再生した組織塊を、選択剤(グリホサート)を含有する培地で培養し、増殖途中の形質転換カルスを選択した(工程4:選択工程)。好適に、選択剤を含有するスクリーニング固体培地(B5塩3.1g/L、ビタミンB5、MES1g/L、ショ糖30g/L、6-ベンジルアデニン(6-benzyladenine:6-BAP)1mg/L、寒天8g/L、セファロスポリン150mg/L、グルタミン酸100mg/L、アスパラギン酸100mg/L、およびN-(ホスホノメチル)グリシン0.25mol/L、pH5.6)において、子葉節から再生した組織塊を培養することによって、形質転換細胞を選択的に増殖させた。次いで、形質転換細胞から植物を再生させた(工程5:再生工程)。好適に、選択剤を含有する培地で増殖させた子葉節から再生した組織塊を、固体培地(B5分化培地およびB5発根培地)で培養して、植物を再生した。
スクリーニングした抵抗性組織をB5分化培地(B5塩3.1g/L、B5ビタミン、MES1g/L、ショ糖30g/L、ZT1mg/L、寒天8g/L、セファロスポリン150mg/L、グルタミン酸50mg/L、アスパラギン酸50mg/L、ジベレリン1mg/L、オーキシン1mg/L、およびN-(ホスホノメチル)グリシン0.25mol/L、pH5.6)に移し、分化のため25℃で培養した。分化した実生をB5発根培地(B5塩3.1g/L、B5ビタミン、MES1g/L、ショ糖30g/L、寒天8g/L、セファロスポリン150mg/L、インドール-3-酪酸(indole-3-butyric acid:IBA)1mg/L)に移し、その発根培地において25℃で培養して高さ約10cmにした後、ガラス温室に移して結実させた。温室では、26℃で16時間、当該植物を培養し、次いで20℃で1日8時間培養した。
3.TaqManを用いた遺伝子導入ダイズ植物の検証
PPO1Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO6Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO12Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO-ECAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO-APAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、および対照ベクターDBN12337Nが導入されたダイズ植物から葉を約100mg、試料として採取した。QiagenのDNeasy Plant Maxi Kitで上記のダイズ植物のゲノムDNAを抽出し、Taqmanプローブ蛍光定量PCR法によりEPSPS遺伝子のコピー数を検出することによって、PPO遺伝子のコピー数を決定した。同時に、対照として野生型ダイズ植物を用い、上述の方法に従って検出および解析を行った。実験は3回繰り返し、平均値を算出した。
PPO1Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO6Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO12Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO-ECAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO-APAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、および対照ベクターDBN12337Nが導入されたダイズ植物から葉を約100mg、試料として採取した。QiagenのDNeasy Plant Maxi Kitで上記のダイズ植物のゲノムDNAを抽出し、Taqmanプローブ蛍光定量PCR法によりEPSPS遺伝子のコピー数を検出することによって、PPO遺伝子のコピー数を決定した。同時に、対照として野生型ダイズ植物を用い、上述の方法に従って検出および解析を行った。実験は3回繰り返し、平均値を算出した。
EPSPS遺伝子のコピー数を検出する具体的な方法は、以下の通りである。
工程11:PPO1Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO6Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO12Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO-ECAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO-APAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、対照ベクターDBN12337Nが導入されたダイズ植物、および野生型ダイズ植物の葉を100mg採取し、液体窒素を用い、乳鉢で磨砕してホモジネートにし、各試料について3回の繰り返しを行った。
工程12:QiagenのDNeasy Plant Mini Kitを用い、製品マニュアルに記載された特定の方法で、上述の試料のゲノムDNAを抽出した。
工程13:上述の試料のゲノムDNAの濃度を、NanoDrop 2000(Thermo Scientific)を用いて検出した。
工程14:上述の各試料のゲノムDNAの濃度を、80から100ng/μLまでの範囲の同じ値に調整した。
工程15:Taqmanプローブ蛍光定量PCR法を用いて、試料のコピー数を特定した。ここでは、コピー数が既知で特定されている試料を標準とし、野生型ダイズ植物の試料を対照とし、各試料について3回の繰り返しを行って、平均した。蛍光定量PCRプライマーおよびプローブの配列は、以下の通りである。
EPSPS遺伝子配列の検出には、以下のプライマーおよびプローブを用いた。
プライマー1:配列表の配列番号69に記載のctggaaggcgaggacgtcatcaata
プライマー2:配列表の配列番号70記載のtggcggcattgccgaaatcgag
プローブ1:配列表の配列番号71に記載のatgcaggcgatgggcgcccgcatccgta
PCR反応系:
JumpStart(商標)Taq ReadyMix(商標)(Sigma) 10μL
50×プライマー/プローブ混合物 1μL
ゲノムDNA 3μL
水(ddH2O) 6μL
50×プライマー/プローブ混合物は、濃度1mMの各プライマー45μL、濃度100μMのプローブ50μL、1×TE緩衝液860μLを含み、アンバーチューブに入れて4℃で保存した。
プライマー2:配列表の配列番号70記載のtggcggcattgccgaaatcgag
プローブ1:配列表の配列番号71に記載のatgcaggcgatgggcgcccgcatccgta
PCR反応系:
JumpStart(商標)Taq ReadyMix(商標)(Sigma) 10μL
50×プライマー/プローブ混合物 1μL
ゲノムDNA 3μL
水(ddH2O) 6μL
50×プライマー/プローブ混合物は、濃度1mMの各プライマー45μL、濃度100μMのプローブ50μL、1×TE緩衝液860μLを含み、アンバーチューブに入れて4℃で保存した。
PCR反応条件:
工程温度 温度 時間
21 95℃ 5分間
22 95℃ 30秒間
23 60℃ 1分間
24 工程22に戻り、40回繰り返す
ソフトウェアSDS2.3(Applied Biosystems)を用いてデータを解析した。
工程温度 温度 時間
21 95℃ 5分間
22 95℃ 30秒間
23 60℃ 1分間
24 工程22に戻り、40回繰り返す
ソフトウェアSDS2.3(Applied Biosystems)を用いてデータを解析した。
EPSPS遺伝子のコピー数に関する実験結果を解析することにより、さらに、PPO1Aヌクレオチド配列、PPO6Aヌクレオチド配列、PPO12Aヌクレオチド配列、PPO-ECAヌクレオチド配列、PPO-APAヌクレオチド配列、および対照ベクターDBN12337Nが全て、検出されたダイズ植物の染色体に組み込まれていることが実証され、PPO1Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO6Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO12Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO-ECAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、PPO-APAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、および対照ベクターDBN12337Nが導入されたダイズ植物の全てが、結果的に、単一コピーの遺伝子導入ダイズ植物となった。
4.遺伝子導入ダイズ植物の除草剤耐性の検出
PPO1Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物(PPO1A)、PPO6Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物(PPO6A)、PPO12Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物(PPO12A)、PPO-ECAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物(PPO-ECA)、PPO-APAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物(PPO-APA)、対照ベクターが導入されたダイズ植物(対照ベクター)、および野生型ダイズ植物(CK)(各遺伝子型には16株が含まれる)を、(播種して18日後に)採取し、サフルフェナシルを3つの濃度(50g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、100g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、オキシフルオルフェンを3つの濃度(360g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、720g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、ならびにフルミオキサジンを3つの濃度(120g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、240g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で散布して、除草剤に対するダイズ植物の耐性を判定した。実施例1の項目6の上記の方法に従い、散布の7日後(7DAT)に、除草剤によって生じた各植物の損傷レベルを、植物の損傷レベルの平均(%)に従って評価した。実験結果を表5~7に示す。
PPO1Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物(PPO1A)、PPO6Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物(PPO6A)、PPO12Aヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物(PPO12A)、PPO-ECAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物(PPO-ECA)、PPO-APAヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物(PPO-APA)、対照ベクターが導入されたダイズ植物(対照ベクター)、および野生型ダイズ植物(CK)(各遺伝子型には16株が含まれる)を、(播種して18日後に)採取し、サフルフェナシルを3つの濃度(50g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、100g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、オキシフルオルフェンを3つの濃度(360g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、720g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、ならびにフルミオキサジンを3つの濃度(120g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、240g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で散布して、除草剤に対するダイズ植物の耐性を判定した。実施例1の項目6の上記の方法に従い、散布の7日後(7DAT)に、除草剤によって生じた各植物の損傷レベルを、植物の損傷レベルの平均(%)に従って評価した。実験結果を表5~7に示す。
表5の結果から以下のことがわかる。(1)対照ベクターおよびCKと比較して、遺伝子型PPO1A、PPO6A、PPO12AおよびPPO-ECAは、サフルフェナシルに対し、異なる程度で耐性を示すことができたが、PPO-APAは基本的に耐性を示さなかった。(2)圃場濃度2倍のサフルフェナシルで処理した場合、遺伝子型PPO1A、PPO6AおよびPPO12Aの損傷レベルは等級0と評価されたが、遺伝子型PPO-ECAでは、植物の約44%が等級1と評価された。(3)遺伝子型PPO1A、PPO6AおよびPPO12Aは全て、圃場濃度4倍のサフルフェナシルに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-ECAでは、植物の約31%が中程度または低い抵抗耐性を示した。
表6の結果から以下のことがわかる。対照ベクターおよびCKと比較して、(1)遺伝子型PPO1A、PPO6A、PPO12AおよびPPO-ECAは全て、圃場濃度2倍のオキシフルオルフェンに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-APAでは、植物の50%が耐性を示さず、(2)遺伝子型PPO1A、PPO6A、PPO12AおよびPPO-ECAは全て、圃場濃度4倍のオキシフルオルフェンに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-APAは耐性を示さなかった。
表7の結果から、対照ベクターおよびCKと比較して、遺伝子型PPO1A、PPO6A、PPO12AおよびPPO-ECAは全て、フルミオキサジンに対して異なる濃度で高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-APAはフルミオキサジン耐性を示さなかったことがわかる。
遺伝子導入トウモロコシ植物の取得と検証
1.PPO遺伝子を含むトウモロコシの組換え発現ベクターの構築
実施例1の項目1に記載のPPO1Bヌクレオチド配列、PPO6Bヌクレオチド配列およびPPO12Bヌクレオチド配列、ならびにPPO-APBヌクレオチド配列の5’末端および3’末端をそれぞれ、以下のユニバーサルアダプタープライマー2に連結した。
1.PPO遺伝子を含むトウモロコシの組換え発現ベクターの構築
実施例1の項目1に記載のPPO1Bヌクレオチド配列、PPO6Bヌクレオチド配列およびPPO12Bヌクレオチド配列、ならびにPPO-APBヌクレオチド配列の5’末端および3’末端をそれぞれ、以下のユニバーサルアダプタープライマー2に連結した。
5’末端用ユニバーサルアダプタープライマー2:配列表の配列番号72に記載の5’-ccaagcggccaagctta-3’
3’末端用ユニバーサルアダプタープライマー2:配列表の配列番号73に記載の5’-tgtttgaacgatcggcgcgcc-3
制限酵素Spe IおよびAsc Iを用い、植物発現ベクターDBNBC-02を二重消化して、植物発現ベクターを線状化した。消化産物を精製して、線状化DBNBC-02発現ベクターバックボーン(ベクターバックボーン:pCAMBIA2301(CAMBIAから入手可能))を得、次いで、Takara In-Fusion products seamless connection kit(Clontech、米国カリフォルニア州、CAT:121416)の説明書の手順に従い、ユニバーサルアダプタープライマー2に連結したPPO1Bヌクレオチド配列と組換え反応を行って、図3に示すベクター構造を有する組換え発現ベクターBN12354を構築した(Spec:スペクチノマイシン遺伝子、RB:右境界、prOsAct1:イネアクチン1プロモーター(配列番号74)、cPAT:ホスフィノトリシン-N-アセチル基転移酵素遺伝子(配列番号60)、t35S:カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sターミネーター(配列番号61)、pr35S-06:カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sプロモーター(配列番号75)、iZmHSP70:トウモロコシ熱ショック70kDaタンパク質イントロン(配列番号76)、spAtCLP1:シロイヌナズナの白色または薄緑色の葉緑体の輸送ペプチド(配列番号57)、PPO1B:PPO1Bヌクレオチド配列(配列番号62)、tNos:ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター(配列番号58)、prZmUbi:トウモロコシユビキチン1遺伝子プロモーター(Zea mays ubiquitin 1 gene promoter)(配列番号77)、PMI:ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子(phosphomannose isomerase gene)(配列番号78)、tNos:ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター(terminator of a nopaline synthase gene)配列番号:58)、LB:左境界)。
3’末端用ユニバーサルアダプタープライマー2:配列表の配列番号73に記載の5’-tgtttgaacgatcggcgcgcc-3
制限酵素Spe IおよびAsc Iを用い、植物発現ベクターDBNBC-02を二重消化して、植物発現ベクターを線状化した。消化産物を精製して、線状化DBNBC-02発現ベクターバックボーン(ベクターバックボーン:pCAMBIA2301(CAMBIAから入手可能))を得、次いで、Takara In-Fusion products seamless connection kit(Clontech、米国カリフォルニア州、CAT:121416)の説明書の手順に従い、ユニバーサルアダプタープライマー2に連結したPPO1Bヌクレオチド配列と組換え反応を行って、図3に示すベクター構造を有する組換え発現ベクターBN12354を構築した(Spec:スペクチノマイシン遺伝子、RB:右境界、prOsAct1:イネアクチン1プロモーター(配列番号74)、cPAT:ホスフィノトリシン-N-アセチル基転移酵素遺伝子(配列番号60)、t35S:カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sターミネーター(配列番号61)、pr35S-06:カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sプロモーター(配列番号75)、iZmHSP70:トウモロコシ熱ショック70kDaタンパク質イントロン(配列番号76)、spAtCLP1:シロイヌナズナの白色または薄緑色の葉緑体の輸送ペプチド(配列番号57)、PPO1B:PPO1Bヌクレオチド配列(配列番号62)、tNos:ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター(配列番号58)、prZmUbi:トウモロコシユビキチン1遺伝子プロモーター(Zea mays ubiquitin 1 gene promoter)(配列番号77)、PMI:ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子(phosphomannose isomerase gene)(配列番号78)、tNos:ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター(terminator of a nopaline synthase gene)配列番号:58)、LB:左境界)。
実施例1の項目3に記載の熱ショック法に従い、大腸菌T1コンピテント細胞を形質転換し、その細胞内のプラスミドをアルカリ法によって抽出した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターDBN12354は、配列表の配列番号62に記載のヌクレオチド配列、すなわちPPO1Bヌクレオチド配列を含むことが示された。
組換え発現ベクターDBN12354を構築する上記の方法に従い、ユニバーサルアダプタープライマー2に連結したPPO6Bヌクレオチド配列、PPO12Bヌクレオチド配列およびPPO-APBヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化DBNBC-02発現ベクターバックボーンと組換え反応を行って、組換え発現ベクターDBN12355~DBN12357を順に構築した。塩基配列決定法により、PPO6Bヌクレオチド配列、PPO12Bヌクレオチド配列、およびPPO-APBヌクレオチド配列が、組換え発現ベクターDBN12355~DBN12357に正しく挿入されたことを確認した。
上記の組換え発現ベクターDBN12354を構築する方法に従い、対照として組換え発現ベクターDBN12354Nを構築し、その構造を図4に示した(Spec:スペクチノマイシン遺伝子、RB:右境界、prOsAct1:イネアクチン1プロモーター(配列番号74)、cPAT:ホスフィノトリシン-N-アセチル基転移酵素遺伝子(配列番号60)、t35S:カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sターミネーター(配列番号61)、prZmUbi:トウモロコシユビキチン1遺伝子プロモーター(配列番号77)、PMI:ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子(配列番号78)、tNos:ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター(配列番号:58)、LB:左境界)。
2.組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
正しく構築された組換え発現ベクターDBN12354~DBN12357、および上述の対照組換え発現ベクターDBN12354Nをそれぞれ、液体窒素法を用いて以下の形質転換条件下で、アグロバクテリウムLBA4404(Invitrogen、米国、シカゴ、CAT:18313-015)に形質転換した。100μLのアグロバクテリウムLBA4404、および3μLのプラスミドDNA(組換え発現ベクター)を液体窒素に10分間入れ、37℃の温水に10分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムLBA4404をLBチューブに接種し、温度28℃、回転数200rpmの条件下で2時間培養した後、リファンピシン50mg/Lおよびスペクチノマイシン50mg/Lを含有するLBプレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを採取して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターDBN12354~DBN12357、および対照ベクターDBN12354Nの構造が、完全に正しいことが示された。
正しく構築された組換え発現ベクターDBN12354~DBN12357、および上述の対照組換え発現ベクターDBN12354Nをそれぞれ、液体窒素法を用いて以下の形質転換条件下で、アグロバクテリウムLBA4404(Invitrogen、米国、シカゴ、CAT:18313-015)に形質転換した。100μLのアグロバクテリウムLBA4404、および3μLのプラスミドDNA(組換え発現ベクター)を液体窒素に10分間入れ、37℃の温水に10分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムLBA4404をLBチューブに接種し、温度28℃、回転数200rpmの条件下で2時間培養した後、リファンピシン50mg/Lおよびスペクチノマイシン50mg/Lを含有するLBプレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを採取して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターDBN12354~DBN12357、および対照ベクターDBN12354Nの構造が、完全に正しいことが示された。
3.遺伝子導入トウモロコシ植物の取得
従来から用いられているアグロバクテリウム感染法に従い、無菌培養したトウモロコシ品種Zong31(Z31)の幼胚を、本実施例の項目2に記載のアグロバクテリウムと共培養して、本実施例の項目1で構築した組換え発現ベクターDBN12354~DBN12357および対照組換え発現ベクターDBN12354NのT-DNAを、トウモロコシ染色体に導入し(T-DNAは、イネアクチン1プロモーター配列、ホスフィノトリシンN-アセチル基転移酵素遺伝子、カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sターミネーター配列、カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sプロモーター配列、トウモロコシ熱ショック70kDaタンパク質イントロン配列、シロイヌナズナの白色または薄緑色の葉緑体の輸送ペプチド、PPO1Bヌクレオチド配列、PPO6Bヌクレオチド配列、PPO12Bヌクレオチド配列、PPO-APBヌクレオチド配列、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター配列、トウモロコシユビキチン1遺伝子プロモーター配列、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配列を含む)、PPO1Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO6Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO12Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO-APBヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、および対照ベクターDBN12354Nが導入されたトウモロコシ植物をそれぞれ得た。一方、対照として野生型トウモロコシ植物を用いた。
従来から用いられているアグロバクテリウム感染法に従い、無菌培養したトウモロコシ品種Zong31(Z31)の幼胚を、本実施例の項目2に記載のアグロバクテリウムと共培養して、本実施例の項目1で構築した組換え発現ベクターDBN12354~DBN12357および対照組換え発現ベクターDBN12354NのT-DNAを、トウモロコシ染色体に導入し(T-DNAは、イネアクチン1プロモーター配列、ホスフィノトリシンN-アセチル基転移酵素遺伝子、カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sターミネーター配列、カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sプロモーター配列、トウモロコシ熱ショック70kDaタンパク質イントロン配列、シロイヌナズナの白色または薄緑色の葉緑体の輸送ペプチド、PPO1Bヌクレオチド配列、PPO6Bヌクレオチド配列、PPO12Bヌクレオチド配列、PPO-APBヌクレオチド配列、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター配列、トウモロコシユビキチン1遺伝子プロモーター配列、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配列を含む)、PPO1Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO6Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO12Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO-APBヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、および対照ベクターDBN12354Nが導入されたトウモロコシ植物をそれぞれ得た。一方、対照として野生型トウモロコシ植物を用いた。
アグロバクテリウム媒介のトウモロコシ形質転換では、簡単に述べると、未熟な幼胚をトウモロコシから分離し、アグロバクテリウム懸濁液と接触させた。ここで、アグロバクテリウムは、PPO1Bヌクレオチド配列、PPO6Bヌクレオチド配列、PPO12Bヌクレオチド配列、またはPPO-APBヌクレオチド配列を、幼胚の1つの少なくとも1つの細胞に転移させることができる(工程1:感染工程)。この工程では、アグロバクテリウム懸濁液(OD660=0.4~0.6、感染培地(MS塩4.3g/L、N6ビタミン、カゼイン300mg/L、ショ糖68.5g/L、グルコース36g/L、AS40mg/L、2,4-D1mg/L;pH5.3))に幼胚を浸漬して、接種を開始した。幼胚をアグロバクテリウムと一定期間(3日間)、共培養した(工程2:共培養工程)。好適に、感染工程の後、幼胚を固体培地(MS塩4.3g/L、MSビタミン、カゼイン300mg/L、ショ糖20g/L、グルコース10g/L、AS100mg/L、2,4-D1mg/L、寒天8g/L;pH5.8)で培養した。共培養工程の後、「回収」工程を設けてもよく、この工程では、アグロバクテリウムの増殖を阻害するための少なくとも1つの抗生物質(セファマイシン)を添加し、植物形質転換体のためのいかなる選択剤も添加していない回収培地(MS塩4.3g/L、MSビタミン、カゼイン300mg/L、ショ糖30g/L、2,4-D1mg/L、植物ゲル3g/L;pH5.8)を用いた(工程3:回収工程)。好適に、抗生物質を含むが選択剤を含まない固体培地で幼胚を培養することによって、アグロバクテリウムを排除し、感染細胞のための回収期間を提供した。次いで、選択剤(マンノース)を含有する培地で、接種した幼胚を培養し、増殖途中の形質転換カルスを選択した(工程4:選択工程)。好適に、選択剤を含む固体選択培地(MS塩4.3g/L、MSビタミン、カゼイン300mg/L、ショ糖30g/L、マンノース12.5g/L、2,4-D1mg/L、植物ゲル3g/L;pH5.8)で幼胚を培養することにより、形質転換細胞を選択的に増殖させた。次いで、カルスを植物に再生した(工程5:再生工程)。好適に、選択剤を含有する培地で増殖しているカルスを固体培地(MS分化培地およびMS発根培地)で培養して、植物を再生させた。
スクリーニングで得られた抵抗性カルスをMS分化培地(MS塩4.3g/L、MSビタミン、カゼイン300mg/L、ショ糖30g/L、6-ベンジルアデニン2mg/L、マンノース5mg/L、植物ゲル3g/L;pH5.8)に移し、25℃で培養して分化させた。分化した小植物をMS発根培地(MS塩2.15g/L、MSビタミン、カゼイン300mg/L、ショ糖30g/L、インドール-3-酢酸1mg/L、植物ゲル3g/L;pH5.8)に移し、25℃で培養した。小植物の高さが約10cmに達したところで温室に移動させ、結実まで培養した。その温室で、28℃で16時間、当該植物を培養し、次いで20℃で1日8時間培養した。
4.TaqManを用いた遺伝子導入トウモロコシ植物の検証
TaqManを用いて遺伝子導入ダイズ植物を検証するための実施例2の項目3に記載の方法に従い、PPO1Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO6Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO12Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO-APBヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、および対照ベクターDBN12354Nが導入されたトウモロコシ植物を検出し、解析した。PMI遺伝子のコピー数をTaqmanプローブ蛍光定量PCR法により検出することによって、PPO遺伝子のコピー数を決定した。一方、対照として野生型トウモロコシ植物を用い、上述の方法に従って検出、解析した。実験は3回繰り返し、平均値を算出した。
TaqManを用いて遺伝子導入ダイズ植物を検証するための実施例2の項目3に記載の方法に従い、PPO1Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO6Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO12Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO-APBヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、および対照ベクターDBN12354Nが導入されたトウモロコシ植物を検出し、解析した。PMI遺伝子のコピー数をTaqmanプローブ蛍光定量PCR法により検出することによって、PPO遺伝子のコピー数を決定した。一方、対照として野生型トウモロコシ植物を用い、上述の方法に従って検出、解析した。実験は3回繰り返し、平均値を算出した。
PMI遺伝子配列の検出には、以下のプライマーおよびプローブを用いた。
プライマー3:配列表の配列番号79に記載のgctgtaagagcttactgaaaaaattaaca
プライマー4:配列表の配列番号80に記載のcgatctgcaggtcgacgg
プローブ2:配列表の配列番号81に記載のtctcttgctaagctgggagctcgatcc
PMI遺伝子のコピー数に関する実験結果を解析することにより、さらに、PPO1Bヌクレオチド配列、PPO6Bヌクレオチド配列、PPO12Bヌクレオチド配列、PPO-APBヌクレオチド配列、および対照ベクターDBN12354Nが全て、検出されたトウモロコシ植物の染色体に組み込まれていること、ならびに、PPO1Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO6Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO12Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO-APBヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、および対照ベクターDBN12354Nが導入されたトウモロコシ植物が全て、結果的に、単一コピーの遺伝子導入トウモロコシ植物となったことが確認された。
プライマー4:配列表の配列番号80に記載のcgatctgcaggtcgacgg
プローブ2:配列表の配列番号81に記載のtctcttgctaagctgggagctcgatcc
PMI遺伝子のコピー数に関する実験結果を解析することにより、さらに、PPO1Bヌクレオチド配列、PPO6Bヌクレオチド配列、PPO12Bヌクレオチド配列、PPO-APBヌクレオチド配列、および対照ベクターDBN12354Nが全て、検出されたトウモロコシ植物の染色体に組み込まれていること、ならびに、PPO1Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO6Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO12Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、PPO-APBヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、および対照ベクターDBN12354Nが導入されたトウモロコシ植物が全て、結果的に、単一コピーの遺伝子導入トウモロコシ植物となったことが確認された。
5.遺伝子導入トウモロコシ植物の除草剤耐性の検出
PPO1Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物(PPO1B)、PPO6Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物(PPO6B)、PPO12Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物(PPO12B)、PPO-APBヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物(PPO-APB)、対照ベクターが導入されたトウモロコシ植物(対照ベクター)、および野生型トウモロコシ植物(CK)(各遺伝子型には16株が含まれる)を、(播種して18日後に)採取し、サフルフェナシルを3つの濃度(50g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、100g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、オキシフルオルフェンを3つの濃度(360g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、720g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、ならびにフルミオキサジンを3つの濃度(120g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、240g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で散布して、除草剤に対するトウモロコシ植物の耐性を判定した。実施例1の項目6における上記の方法に従い、散布の7日後(7DAT)に、除草剤によって生じた各植物の損傷レベルを、植物の損傷レベルの平均(%)(植物の損傷レベルの平均(%)=傷害を受けた葉の面積/全体の葉の面積×100%)で評価した。実験結果を表8~10に示す。
PPO1Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物(PPO1B)、PPO6Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物(PPO6B)、PPO12Bヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物(PPO12B)、PPO-APBヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物(PPO-APB)、対照ベクターが導入されたトウモロコシ植物(対照ベクター)、および野生型トウモロコシ植物(CK)(各遺伝子型には16株が含まれる)を、(播種して18日後に)採取し、サフルフェナシルを3つの濃度(50g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、100g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、オキシフルオルフェンを3つの濃度(360g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、720g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で、ならびにフルミオキサジンを3つの濃度(120g ai/ha(圃場濃度2倍、2×)、240g ai/ha(圃場濃度4倍、4×)、および0g ai/ha(水、0×))で散布して、除草剤に対するトウモロコシ植物の耐性を判定した。実施例1の項目6における上記の方法に従い、散布の7日後(7DAT)に、除草剤によって生じた各植物の損傷レベルを、植物の損傷レベルの平均(%)(植物の損傷レベルの平均(%)=傷害を受けた葉の面積/全体の葉の面積×100%)で評価した。実験結果を表8~10に示す。
表8の結果から以下のことがわかる。対照ベクターおよびCKと比較して、(1)遺伝子型PPO1B、PPO6BおよびPPO12Bは全て、圃場濃度2倍のサフルフェナシルに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-APBでは植物の約56%が耐性を示さず、(2)遺伝子型PPO1B、PPO6BおよびPPO12Bは全て、圃場濃度4倍のサフルフェナシルに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-APBは基本的に耐性を示さなかった。
表9の結果から以下のことがわかる。対照ベクターおよびCKと比較して、(1)遺伝子型PPO1B、PPO6BおよびPPO12Bは全て、圃場濃度2倍のオキシフルオルフェンに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-APBでは植物の約50%が耐性を示さず、(2)遺伝子型PPO1B、PPO6BおよびPPO12Bは全て、圃場濃度4倍のオキシフルオルフェンに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-APBは耐性を示さなかった。
表10の結果から、対照ベクターおよびCKと比較して、遺伝子型PPO1B、PPO6BおよびPPO12Bは全て、フルミオキサジンに対して異なる濃度で高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型PPO-APBは、基本的にフルミオキサジンに対して耐性を示さなかったことがわかる。
まとめると、植物に関して、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1~PPO14は、シロイヌナズナ植物にPPO阻害除草剤に対する良好な耐性を付与することができ、特に、PPO1、PPO6、およびPPO12は、シロイヌナズナ、ダイズ、およびトウモロコシの植物に、PPO阻害除草剤に対する良好な耐性を付与することができる。このように、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1~PPO14は、植物に良好な耐性を付与することができる。除草剤に関して、本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼPPO1~PPO14が、少なくとも圃場濃度4倍のオキシフルオルフェン、サフルフェナシルまたはフルミオキサジン、および圃場濃度2倍のスルフェントラゾンに植物が耐えることができる程度の、PPO阻害除草剤に対するより高い耐性を植物に付与することができることを初めて開示する。したがって、本発明には、植物における広域施用の見込みがある。
最後に、上記の全ての実施例は、本発明を限定するためではなく、本発明の実施形態を説明するために用いられているに過ぎないことに留意されたい。好ましい実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、当業者であれば、本発明の実施形態は、本発明の技術的解決法の趣旨および範囲から逸脱することなく、等価的に改変または置換され得ることを理解すべきである。
Claims (17)
- 雑草の防除方法であって、前記雑草の防除方法は、少なくとも1つの遺伝子導入植物が存在する圃場に、有効量のPPO阻害剤を含有する除草剤を施用することを含み、前記遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、前記遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多く、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有し、
好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、
好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有し、
より好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有し、
さらに好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群のアミノ酸配列から選択され、
好ましくは、前記遺伝子導入植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、前記遺伝子導入植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、さらに好ましくは、前記遺伝子導入植物はグリホサート耐性植物であり、前記雑草はグリホサート抵抗性雑草であり、
好ましくは、前記PPO阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および/またはトリアジノン類の種類のPPO阻害除草剤を含み、
さらに好ましくは、前記PPO阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および/またはフルミオキサジンを含む
ことを特徴とする、雑草の防除方法。 - 前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの前記ポリヌクレオチド配列が、
(a)配列番号1~14から選択される配列と少なくとも88%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、配列番号15~28を含まないポリヌクレオチド配列、または
(b)配列番号29~42または配列番号62~64のいずれか1つに示されるポリヌクレオチド配列
を含むことを特徴とする、請求項1に記載の雑草の防除方法。 - 前記遺伝子導入植物が、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列とは異なる、第2の除草剤耐性タンパク質をコードする少なくとも1つの第2のポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の雑草の防除方法。
- 前記第2のポリヌクレオチドが、選択性マーカータンパク質、合成活性を有するタンパク質、分解活性を有するタンパク質、生物的ストレス抵抗性タンパク質、非生物的ストレス抵抗性タンパク質、雄性不稔性タンパク質、植物収量に影響を及ぼすタンパク質、および/または植物品質に影響を及ぼすタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項3に記載の雑草の防除方法。
- 前記第2のポリヌクレオチドが、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素、グリホサート酸化還元酵素、グリホサート-N-アセチル基転移酵素、グリホサート脱炭酸酵素、グルホシネートアセチル基転移酵素、アルファ-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ、ジカンバモノオキシゲナーゼ、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、および/またはチトクロム様タンパク質をコードすることを特徴とする、請求項4に記載の雑草の防除方法。
- 有効量のPPO阻害剤を含有する前記除草剤が、グリホサート除草剤、グルホシネート除草剤、オーキシン様除草剤、雑草防除剤、出芽前選択的除草剤、および/または出芽後選択的除草剤をさらに含むことを特徴とする、請求項1乃至請求項5のいずれか一項に記載の雑草の防除方法。
- 雑草の成長を抑制するための植栽組合せであって、前記植栽組合せは、PPO阻害除草剤および少なくとも1つの遺伝子導入植物を含み、有効量のPPO阻害剤を含有する前記除草剤は、前記少なくとも1つの遺伝子導入植物が存在する圃場に施用され、前記遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、前記遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多く、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有し、
好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、
好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有し、
より好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有し、
さらに好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群のアミノ酸配列から選択され、
好ましくは、前記遺伝子導入植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、前記遺伝子導入植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、さらに好ましくは、前記遺伝子導入植物はグリホサート耐性植物であり、前記雑草はグリホサート抵抗性雑草であり、
好ましくは、前記PPO阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および/またはトリアジノン類の種類のPPO阻害除草剤を含み、
さらに好ましくは、前記PPO阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および/またはフルミオキサジンを含む、
植栽組合せ。 - 請求項7に記載の、雑草の成長を抑制するための植栽組合せであって、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの前記ポリヌクレオチド配列が、
(a)配列番号1~14から選択される配列と少なくとも88%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、配列番号15~28を含まないポリヌクレオチド配列、または
(b)配列番号29~42または配列番号62~64のいずれか1つに示されるポリヌクレオチド配列
を含むことを特徴とする、植栽組合せ。 - 前記遺伝子導入植物が、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列とは異なる、第2の除草剤耐性タンパク質をコードする少なくとも1つの第2のポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項7または請求項8に記載の、雑草の成長を抑制するための植栽組合せ。
- 前記第2のポリヌクレオチドが、選択性マーカータンパク質、合成活性を有するタンパク質、分解活性を有するタンパク質、生物的ストレス抵抗性タンパク質、非生物的ストレス抵抗性タンパク質、雄性不稔性タンパク質、植物収量に影響を及ぼすタンパク質、および/または植物品質に影響を及ぼすタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項9に記載の、雑草の成長を抑制するための植栽組合せ。
- 前記第2のポリヌクレオチドが、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素、グリホサート酸化還元酵素、グリホサート-N-アセチル基転移酵素、グリホサート脱炭酸酵素、グルホシネートアセチル基転移酵素、アルファ-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ、ジカンバモノオキシゲナーゼ、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、および/またはチトクロム様タンパク質をコードすることを特徴とする、請求項10に記載の、雑草の成長を抑制するための植栽組合せ。
- 有効量のPPO阻害剤を含有する前記除草剤が、グリホサート除草剤、グルホシネート除草剤、オーキシン様除草剤、雑草防除剤、出芽前選択的除草剤、および/または出芽後選択的除草剤をさらに含むことを特徴とする、請求項7乃至請求項11のいずれか一項に記載の、雑草の成長を抑制するための植栽組合せ。
- PPO阻害除草剤に対して耐性のある植物の産生方法であって、前記方法は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を前記植物のゲノムに導入することを含み、有効量のPPO阻害剤を含有する前記除草剤が、少なくとも前記植物が存在する圃場に施用された場合に、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、前記植物は植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多く、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有し、
好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、
好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有し、
より好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有し、
さらに好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群のアミノ酸配列から選択され、
好ましくは、前記導入の方法は、遺伝子形質転換、ゲノム編集、または遺伝子変異法を含み、
好ましくは、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、前記植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、
好ましくは、前記PPO阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および/またはトリアジノン類の種類のPPO阻害除草剤を含み、
さらに好ましくは、PPO阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および/またはフルミオキサジンを含む
ことを特徴とする、産生方法。 - PPO阻害除草剤に対して耐性のある植物の栽培方法であって、前記栽培方法は、
植物繁殖体であって、前記植物繁殖体は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有する、植物繁殖体を、少なくとも1つ植栽することと、
前記植物繁殖体を植物に成長させることと、
有効量のPPO阻害剤を含む前記除草剤を、少なくとも前記植物を含む圃場に施用し、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多い前記植物を収穫することと
を含み、
好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、
好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有し、
より好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有し、
さらに好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群のアミノ酸配列から選択され、
好ましくは、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、前記植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、
好ましくは、前記PPO阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類、および/またはトリアジノン類の種類のPPO阻害除草剤を含み、
さらに好ましくは、前記PPO阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および/またはフルミオキサジンを含む
ことを特徴とする、栽培方法。 - PPO阻害除草剤によって生じる損傷から植物を保護するか、または、前記PPO阻害除草剤に対する耐性を植物に付与するための方法であって、前記方法は、少なくとも1つの遺伝子導入植物が存在する圃場に、有効量のPPO阻害剤を含む前記除草剤を施用することを含み、前記遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、前記遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多く、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有し、
好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、
好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有し、
より好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有し、
さらに好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群のアミノ酸配列から選択され、
好ましくは、前記遺伝子導入植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、前記遺伝子導入植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、
好ましくは、前記PPO阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および/またはトリアジノン類の種類のPPO阻害除草剤を含み、
さらに好ましくは、前記PPO阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および/またはフルミオキサジンを含む
ことを特徴とする、方法。 - PPO阻害除草剤に対する耐性を植物に付与するためのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用であって、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも88%の配列同一性を有し、
好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、
好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有し、
より好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有し、
さらに好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号1~14からなる群のアミノ酸配列から選択され、
好ましくは、植物にPPO阻害除草剤に対する耐性を付与するための前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの前記使用は、少なくとも1つの遺伝子導入植物が存在する圃場に、有効量のPPO阻害剤を含有する前記除草剤を施用することを含み、前記遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、前記遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ/または植物収量が多く、
好ましくは、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、前記植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、
好ましくは、前記PPO阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、N-フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および/またはトリアジノン類の種類のPPO阻害除草剤を含み、
さらに好ましくは、前記PPO阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および/またはフルミオキサジンを含む
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用。 - 請求項16に記載の、PPO阻害除草剤に対する耐性を植物に付与するためのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用であって、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの前記ポリヌクレオチド配列が、
(a)配列番号1~14から選択される配列と少なくとも88%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、配列番号15~28を含まないポリヌクレオチド配列、または
(b)配列番号29~42または配列番号62~64のいずれか1つに示されるポリヌクレオチド配列
を含むことを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用。
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