JP2024516364A - タンパク質工場としての膵島オルガノイド - Google Patents

Abstract

膵島細胞では内因的に発現されないポリペプチドをコードする遺伝子改変膵島オルガノイドおよびポリペプチドの発現の低下または不在に関連する疾患および障害を処置するためにそれらを使用するための方法が提供される。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２０２１年４月１２日に出願した米国仮特許出願第６３／１７３６２２号に対して優先権を主張する。

配列記載書ステートメント
コンピュータ読み取り可能な形式の配列表は、本出願とともに電子出願により出願され、参照によりその全体が本出願に組み込まれている。配列表は、ファイル名が「２０－１７１９－ＷＯ－ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、サイズが３ｋｂである、２０２２年４月５日に作成されたファイルに含まれる。

膵臓のランゲルハンス島は、膵臓の内分泌部分を形成する微小器官である。それらは、それぞれ、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、グレリン、および膵臓ポリペプチドを産生し分泌する内分泌アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、イプシロン細胞およびＰＰ細胞からなる。膵島細胞の自己集合、それに続く分離および遺伝子操作により形成される膵島オルガノイド（偽膵島とも呼ばれる）は、本来の膵島と類似の挙動をする。

一態様において、本開示は、組換え発現ベクターを含む遺伝子改変膵島オルガノイドを提供し、組換え発現ベクターは、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列、および（ｂ）核酸配列に動作可能に結合した適切な制御配列を含む。一実施形態において、組換え発現ベクターは、ポリペプチドを内因的に発現しない膵島オルガノイド細胞に存在する。別の実施形態において、ポリペプチドは、膵島細胞では内因的に発現しない。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、治療用ポリペプチド、またはその類縁体である。いくらかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、ポリペプチドホルモンおよび酵素補充タンパク質からなる群より選択される。他の実施形態において、治療用ポリペプチドは、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、プロラクチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、レプチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、および成長ホルモン（ＧＨ）、またはそれらの類縁体からなる群より選択されるポリペプチドホルモンを含む。いくらかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、レニン、ガストリン、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、バソプレシン（ＡＤＨ）、オキシトシン（ＯＸＹ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、カルシトニン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、アンジオテンシン、アミリン、および副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、またはそれらの類縁体からなる群より選択されるポリペプチドホルモンを含む。他の実施形態において、治療用ポリペプチドは、酵素補充タンパク質を含み、酵素補充タンパク質は、第ＶＩＩ因子（エプタコグアルファ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子（カトリデカコグ）、フォン・ヴィレブランド因子、タリグルセラーゼアルファ、アガルシダーゼアルファもしくはベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、アルグルコシダーゼアルファ、ガルスルファーゼ、ドルナーゼアルファ、ラロニダーゼ、コネスタットアルファ（Ｃ１エステラーゼ阻害剤）、ペグロティカーゼアルファ－１－プロテイナーゼ阻害剤、アスホターゼアルファ（ストレンジック）、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼアルファ、バリアーゼ（valiase）、セベリパーゼアルファ（selbelipase alfa）、エポエチンシータ（epoetin teta）（エポラチオ（Eporatio））、ベータ（ネオレコルモン（NeoRecormon））、ゼータ（レタクリット（Retacrit））、ダルベポエチンアルファ（アラネスプ（Aranesp））、ルスパテルセプト（レブロジル（Reblozyl））、フィルグラスチム、レノグラスチム、およびフォン・ヴィレブランド因子－切断プロテアーゼ、またはそれらの類縁体からなる群より選択される。種々の実施形態において、治療用ポリペプチドは、エンケファリン、エンドルフィン、サブスタンスＰ、ニューロテンシン、ニューロペプチド－Ｙ、ボンベシン、脳由来神経栄養因子（neutrophic factor）（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン（neuotrophin）－３、ニューロトロフィン－４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、コリン作働性分化因子、カルジオトロフィン－１、オンコスタチンＭ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｎｅｕ分化因子、ヘレグリン、アセチルコリン受容体誘導活性、グリア細胞増殖因子（ＧＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アルテミン、ニュールツリン、ペルセフィン、骨形成タンパク質－１（ＯＰ－１）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長分化因子、エフリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、セリンプロテアーゼ阻害剤、プロテアーゼネキシン－１、誘導タンパク質のヘッジホッグファミリー、アグリン、ラミニン２、ニューロイムノフィリン、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、活性依存性神経保護タンパク質（ＡＤＮＰ）、ニューリチン（neuritin）（活性誘導神経栄養因子）、血管新生増殖因子、脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、ペプチド－６、ダブネチド（davunetide）（ＡＤＮＰ由来）、およびセレブロリシンからなる群より選択される神経栄養因子を含む。

いくらかの実施形態において、組換え発現ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ベクター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されないウイルスベクターを含む。他の実施形態において、発現ベクターは、非ウイルスベクターを含む。

いくらかの実施形態において、適切な制御配列は、膵臓組織特異的であり、ミッドカイン（ＭＫ）プロモータ、シクロオキシゲナーゼ－２（Ｃｏｘ２）Ｍプロモータ、Ｃｏｘ ２Ｌプロモータ、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）プロモータ、カベオリン１プロモータ、ｆｍｓ様受容体チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ－１）プロモータ、スロッピーペアード１（sloppy paired1）（ＳＬＰ－１）プロモータ、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）プロモータ、上皮性糖タンパク質２（ＥＧＰ－２）プロモータ、インスリンプロモータ、およびグルカゴンプロモータからなる群より選択される。他の実施形態において、組換え発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターを含み、インスリンプロモータは、ＲＩＰ１またはＲＩＰ２である。さらなる実施形態において、適切な制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、チキンβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、哺乳動物伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）プロモータ、およびテトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）－ｔｉｇｈｔプロモータからなる群より選択される。

別の実施形態において、本開示は、本明細書における任意の実施形態または実施形態の組み合わせの遺伝子改変膵島オルガノイドおよびシルクマトリックスを含む組成物を提供する。一実施形態において、シルクは、スパイダーシルクである。別の実施形態において、シルクは、細胞結合モチーフで官能化されている。

別の態様において、本開示は、障害を処置するために、本明細書における任意の実施形態もしくは実施形態の組み合わせの遺伝子改変膵島オルガノイド、またはその組成物を投与することを含む、障害を処置するための使用および方法を提供する。一実施形態において、遺伝子改変膵島オルガノイドまたは組成物は、それを必要とする被験体の眼、脳下垂体、膵臓、小腸、胃、脳、腎臓、副甲状腺、十二指腸、甲状腺、肝臓、心臓、卵巣、睾丸、脂肪、および／または皮膚に移植される。別の実施形態において、核酸配列は、表１の左手の列に列記されているポリペプチドをコードし、被験体は、ポリペプチドと同じ行で表１の右手側の列に列記されている障害を有する。

別の態様において、本開示は、（ａ）（ｉ）膵島細胞で内因的に発現しないポリペプチドをコードする核酸配列、および（ｉｉ）その核酸配列に動作可能に結合した適切な制御配列を含む組換え発現ベクターを膵島細胞に導入するステップ；ならびに（ｂ）組換え発現ベクターを含む膵島細胞をインビトロで培養して膵島細胞を含む遺伝子改変膵島オルガノイドを形成するステップを含む、膵島細胞を含む遺伝子改変膵島オルガノイドを産生するためのプロセスを提供する。一実施形態において、導入するステップ（ａ）はさらに、（ａ１）水不溶性マクロ構造に集合することができ、任意選択でさらにラミニンを含む絹タンパク質を用い、組換え発現ベクターを含む膵島細胞の水性混合物を調製するステップ；（ａ２）組換え発現ベクターを含む膵島細胞の存在下で絹タンパク質が水不溶性マクロ構造に集合するのを可能にし、それによって、組換え発現ベクターを含む膵島細胞の３Ｄシルクマトリックスを形成するステップを含み；培養するステップ（ｂ）は、組換え発現ベクターを含む膵島細胞をシルクマトリックス内のインビトロで培養し、膵島細胞を含む遺伝子改変膵島オルガノイドを形成するステップを含む。別の実施形態において、そのプロセスはさらに、（ｃ）膵島細胞を含む遺伝子改変膵島オルガノイドを、絹タンパク質の水不溶性マクロ構造からなり、任意選択でさらにラミニンを含む３Ｄシルクマトリックス上に配置するステップ；ならびに（ｄ）膵島細胞を含む遺伝子改変膵島オルガノイドを３Ｄシルクマトリックスに付着させることを可能にするステップを含む。

図１ａ～図１ｃは、レプチン発現膵島オルガノイドのインビトロ特徴づけを示す。（ａ）ｖＡｄ－ＲＩＰ－レプチン－ＯＦＦの概略図。ラットインスリン－１プロモータ（ｒＩｎｓ－１）は、膵臓ベータ細胞での合成転写因子ｒＴＡ（Ｔｅｔ－ｏｆｆ）および緑色蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）の発現を促進する。ＴＲＥ－ｔｉｇｈｔプロモータは、マウスレプチンおよび赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の発現を促進する。２つの発現カセットは、転写ブロッカー配列（ＴＢ）により分離される。ｒＴＡのＴＲＥ－ｔｉｇｈｔプロモータへの結合は、ドキシサイクリンの不在下、レプチンおよびｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の発現を誘導するが、ドキシサイクリンの添加は、その２つのタンパク質の発現を停止する。エレメント間のＩＲＥＳエレメントは、同じプロモータ下で２つのタンパク質の化学量論的発現を保証する。（ｂ）反射、ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の発現およびそれらのオーバーレイを示す、インビトロで４週間培養したレプチン発現膵島オルガノイドの３Ｄスタック（第１の実験セット）の共焦点イメージングの代表的な最大投影図。スケールバー：５０μｍ。（ｃ）反射、ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の発現およびそれらのオーバーレイを示す、インビトロで４週間培養したレプチン発現膵島オルガノイドの３Ｄスタック（第２の実験セット）の共焦点イメージングの代表的な最大投影図。スケールバー：５０μｍ。 図２ａ～図２ｇは、第１の実験セットからのレプチン発現膵島オルガノイドのインビト特徴づけを示す。（ａ）移植後９週間のレプチン発現膵島オルガノイド移植片（赤矢印）を含む眼の写真。（ｂ）移植後９週間の共焦点イメージングにより得られたレプチン発現膵島オルガノイド移植片（赤矢印）の３Ｄスタックの最大投影図；（ｂａ）反射、（ｂｂ）ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）蛍光、（ｂｃ）ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）蛍光、（ｂｄ）オーバーレイ画像；スケールバーは５００μｍ。（ｃ）実験期間中の移植および対照のマウスの体重。（ｄ）実験期間中の移植および対照のマウスのｉｐＧＴＴについての曲線下面積（ＡＵＣ）。（ｅ）実験期間中の移植および対照のマウスの空腹時血糖。（ｆ）実験終了時の移植および対照のマウスの血漿インスリンレベル。（ｇ）実験終了時の移植および対照のマウスの血漿Ｃ－ペプチドレベル。（ｄ、ｅ）＊ｐ＜０．０５。（ｃ～ｇ）ｎ＝３。 図３ａ～図３ｇは、第２の実験セットからのレプチン発現膵島オルガノイドのインビボ特徴づけを示す。（ａ）移植後６週間のレプチン発現膵島オルガノイド移植片（赤矢印）を含む眼の写真。（ｂ）移植後１２週間の共焦点イメージングにより得られたレプチン発現膵島オルガノイド移植片（赤矢印）の３Ｄスタックの最大投影図；（ｂａ）反射、（ｂｂ）ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）蛍光、（ｂｃ）ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）蛍光、（ｂｄ）オーバーレイ画像；スケールバーは３００μｍ。（ｃ）体重、（ｄ）ｉｐＧＴＴについての曲線下面積（ＡＵＣ）、（ｅ）空腹時血糖、（ｆ）血漿インスリンレベルおよび（ｇ）実験期間中の移植および対照のマウスの血漿Ｃ－ペプチドレベル。（ｃ～ｇ）＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；移植群についてはｎ＝７であり、対照群については５である。 図４ａ～図４ｄは、ドキシサイクリンで処置され、実験終了時に除去された動物からのレプチン発現膵島オルガノイド移植片の特徴づけを示す。（ａ）移植された非ドキシサイクリン処置動物からのレプチン発現膵島オルガノイド移植片の蛍光顕微鏡画像；（ａａ）ＤＡＰＩ染色；（ａｂ）ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）蛍光；（ａｃ）ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）蛍光；（ａｄ）オーバーレイ。（ｂ）移植されたドキシサイクリン処置動物からのレプチン発現膵島オルガノイド移植片の蛍光顕微鏡画像；（ｂａ）ＤＡＰＩ染色、（ｂｂ）ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）蛍光、（ｂｃ）ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）蛍光、（ｂｄ）オーバーレイ。（ｃ）移植された非ドキシサイクリン処置動物からのレプチン発現膵島オルガノイド移植片の免疫組織化学画像；（ｃａ）ＤＡＰＩ染色、（ｃｂ）Ｃ－ペプチド染色、（ｃｃ）レプチン染色、（ｃｄ）オーバーレイ。（ｄ）移植されたドキシサイクリン処置動物からのレプチン発現膵島オルガノイド移植片の免疫組織化学画像；（ｄａ）ＤＡＰＩ染色、（ｄｂ）Ｃ－ペプチド染色、（ｄｃ）レプチン染色、（ｄｄ）オーバーレイ。（ａ～ｄ）すべてスケールバーは５０μｍ。

記載されたすべての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている。本出願内で、別段の断りがない限り、利用された技術は：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌにより編集，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，ｅｄ．，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９－１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、およびｔｈｅ Ａｍｂｉｏｎ １９９８ Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）などのいくつかの周知の参考文献のいずれかに認めることができる。

本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上それ以外を指すことが明らかな場合を除いて、複数の指示物を含む。

本開示の任意の態様のすべての実施形態は、文脈上それ以外を指すことが明らかな場合を除いて、組み合わせて使用することができる。

第１の態様において、本開示は、組換え発現ベクターを含む遺伝子改変膵島オルガノイドを提供し、組換え発現ベクターは、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列、および（ｂ）核酸配列に動作可能に結合した適切な制御配列を含む。

本開示は、膵島オルガノイドが、非膵臓ポリペプチド（通常膵島では産生されないポリペプチドとして定義される）を含む、任意のポリペプチドを発現するように遺伝子改変され得るという、またこれらの遺伝子改変膵島オルガノイドが、被験体に移植可能であり、遺伝子改変膵島オルガノイドにより産生されるポリペプチドを使用して処置可能である疾患の長期間処置のためにタンパク質工場として使用することができるという新規で驚くべき知見を提供する。遺伝子改変膵島オルガノイドは、ミニチュアの臓器を模倣する。遺伝子改変膵島オルガノイドは、ポリペプチドを被験体の血流に排泄するのに十分適した構造および機能性を有しており、この機能性は、個々の細胞型の外科的移植と比較して、長期間に渡って維持することができる。膵島オルガノイドは、他の臓器の中または隣接して移植することができ、事実上、「別の臓器内の完全な臓器」となる。これは、遺伝子改変膵島オルガノイドの独特な特徴である。

ポリペプチドの治療的効果は、疾患に応じて、インプラントの特定の移植部位を選択することにより、局所効果を高めるためにさらに調整することができる。本明細書で開示されている組成物および方法は、レプチンを発現するように遺伝子改変された膵島オルガノイドの作成により、非限定的な方法で例示される。レプチンは、通常膵島により産生されないポリペプチドである。レプチン産生遺伝子改変膵島オルガノイドは、その後、実施例に示すように、ｏｂ／ｏｂ（レプチン欠損ノックアウト）マウスの代謝表現型を奪回するために使用することに成功した。

本明細書で使用されるように、「遺伝子改変膵島オルガノイド」は、膵臓のランゲルハンス島の構造および機能（インスリングルカゴン、アミリン、ソマトスタチン、グレリンおよび膵臓ポリペプチド分泌）を模倣するインビトロで生成される細胞クラスターであり、細胞クラスターは、少なくとも膵臓ベータ細胞を含むが、膵臓アルファ細胞、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）細胞、イプシロン細胞およびデルタ－細胞を含むことができる。種々の実施形態において、遺伝子改変膵島オルガノイドは、少なくともベータ細胞およびアルファ細胞を含む；他の実施形態において、遺伝子改変膵島オルガノイドは、少なくとも膵臓ベータ細胞、アルファ細胞、ならびにＰＰ細胞、イプシロン細胞およびデルタ細胞のうち１つ、２つ、または３つすべてを含む。

膵臓のランゲルハンス島は、膵臓の内分泌部分を形成する多細胞の微小器官である。膵島は、穴あき血管を含み、血液由来因子の効率的な交換を可能にし、膵島を刺激することができ、結果として、一般的な血液循環に、膵島により産生されたポリペプチドホルモンを放出することとなる。

一実施形態において、膵島オルガノイド細胞は、ヒトなどの任意の哺乳動物を含むがこれらに限定されない、使用に適した膵臓のランゲルハンス島を有する任意の動物から得られる膵島から遺伝子改変され得る。他の実施形態において、遺伝子改変膵島オルガノイドは、参照によりその全体が組み込まれている米国特許出願公開第２０１９０２１１３１０号明細書に開示されているものを含むがこれらに限定されない、任意の適切な技術を使用して、人工多能性幹細胞または任意の源由来の幹細胞から生成することができる。１つの非限定の実施形態において、遺伝子改変膵島オルガノイドは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来またはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）ベータ様細胞、および任意選択で構造成分を三次元マトリックス中で培養することにより生成することができる。種々の実施形態において、膵島オルガノイドは、ｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）ベータ様細胞を脂肪由来幹細胞および／または内皮細胞とともに培養することにより生成することができる。種々の実施形態において、膵島オルガノイドは、ｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）ベータ様細胞をｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）アルファ様細胞、ｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）デルタ様細胞、ｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）イプシロン細胞、ｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）ＰＰ細胞、ならびに／またはｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）導管様細胞とともに培養することにより生成することができる。

種々の非限定の実施形態において、本開示の遺伝子改変膵島オルガノイドは、以下の細胞型：ｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）ベータ様細胞、ｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来の）アルファ様細胞、ｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）デルタ様細胞、ｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）ＰＰ細胞、ｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）イプシロン細胞、およびｉＰＳＣ由来（もしくはヒト胚由来もしくは死体もしくはヒト由来の）導管様細胞のいずれか１つまたは複数を含むことができる。いくらかの実施形態において、ｉＰＳＣは、ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である。いくらかの実施形態において、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む。いくらかの実施形態において、膵島オルガノイドは、脂肪由来幹細胞および／または内皮細胞を含む。

アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、イプシロン細胞または導管様細胞を含むがこれらに限定されない遺伝子改変膵島オルガノイド内の細胞はいずれも、組換え発現ベクターを含むように遺伝子改変され得る。一実施形態において、ベータ細胞は、組換え発現ベクターを含み、ベータ細胞により内因的に発現されないポリペプチドおよび／または非膵臓ポリペプチドを発現する。

ウイルスおよび非ウイルスベクターを含む組換え発現ベクターは、膵島オルガノイドでの発現に適した任意のベクターであり得る。適切なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ベクター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。１つの非限定例において、組換え発現ベクターは、アデノウイルスベクターである。

膵島での発現のためのポリペプチドをコードする任意の適切な核酸配列を使用する場合がある。本明細書で使用されるように、用語「核酸配列」は、ＤＮＡ分子（例えば組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチド類縁体を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類縁体を指す。

いくらかの実施形態において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば遺伝暗号の縮退による核酸配列における変化；膵島オルガノイドにおける発現のための核酸配列のコドン最適化；少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、欠失および／または付加を導入するための核酸配列における変化；１つもしくは複数のイントロンの除去；１つもしくは複数の異種イントロンの挿入；１つもしくは複数の上流もしくは下流の制御領域の欠失；１つもしくは複数の異種の上流もしくは下流の制御領域の挿入；５’および／または３’未翻訳領域の欠失；異種５’および／または３’未翻訳領域の挿入；ならびにポリアデニル化部位の修飾により、既知のコード配列から改変される場合がある。

本出願全体で使用されるように、用語「ポリペプチド」は、任意の長さのサブユニットアミノ酸の配列を指すように幅広い意味で使用される。本発明のポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸（インビボでＬ－アミノ酸特異的プロテアーゼに耐性がある）、またはＤ－およびＬ－アミノ酸の組み合わせを含む場合がある。

組換え発現ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列に動作可能に結合した適切な制御配列を含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の発現に影響を及ぼすことができる任意の制御配列であり得る。制御配列は、膵臓組織特異的、膵島細胞特異的（すなわち：ベータ細胞特異的；アルファ細胞特異的；デルタ細胞特異的；など）または非膵臓組織特異的（すなわち、一般的な制御配列）のいずれかであり得る。膵臓組織特異的制御配列の非限定例には、ミッドカイン（ＭＫ）プロモータ、Ｃｏｘ２Ｍプロモータ、Ｃｏｘ ２Ｌプロモータ、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）プロモータ、カベオリン１プロモータ、ｆｍｓ様受容体チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ－１）プロモータ、スロッピーペアード－１（sloppy paired-1）（ＳＬＰ－１）プロモータ、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）プロモータ、上皮性糖タンパク質２（ＥＧＰ－２）プロモータ、ラットインスリンプロモータ（ＲＩＰ１またはＲＩＰ２）（ベータ細胞特異的）、インスリンプロモータ（ベータ細胞特異的）、グルカゴンプロモータ（アルファ細胞特異的）、およびソマトスタチンプロモータ（デルタ細胞特異的）が含まれる。非組織特異的制御配列の非限定例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、チキンβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、哺乳動物伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）プロモータ、およびテトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）－ｔｉｇｈｔプロモータが含まれる。一実施形態において、プロモータは、Ｔｅｔ－ＯＮ／ＯＦＦプロモータ、ｐＬａｃプロモータ、またはｐＢａｄプロモータなどの誘導性プロモータであり得る。１つの非限定例において、制御配列は、ｐＴＲＥ－ｔｉｇｈｔプロモータを含む。一実施形態において、プロモータは、上述したプロモータの転写調節因子を含む合成プロモータであり得る。

本開示の発現ベクターは、ベクターとの使用に適した任意の他の成分を含むことができる。制御配列は、その発現を指示するように機能している限り、核酸配列に隣接している必要はない。このため、例えば、介在する未翻訳であるが転写されている配列は、プロモータ配列と核酸配列との間に存在することができ、プロモータ配列は、依然として核酸に「動作可能に結合」しているとみなすことができる。発現ベクターは、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、およびリボソーム結合部位を含むがこれらに限定されない他の制御配列を含む場合がある。本開示の核酸配列の発現を促進するために使用される制御配列は、構成的または誘導性（テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド反応性を含むがこれらに限定されない多数の誘導性プロモータのいずれかにより促進される）である場合がある。一実施形態において、膵島オルガノイドにおける発現ベクターは、宿主染色体ＤＮＡへの統合により複製可能である。

さらなる実施形態において、ポリペプチドをコードする核酸配列、または発現プロモータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの他のヌクレアーゼ、または他の適切な遺伝子編集システムを使用して膵島細胞に導入される場合がある。

第１の態様の一実施形態において、遺伝子改変膵島オルガノイドの組換え発現ベクターは、ポリペプチドを内因的に発現しない膵島オルガノイド細胞に存在する。本実施形態において、組換え発現ベクターは、ポリペプチドを内因的に発現しない膵臓細胞型にのみ存在する；これは、組換え発現ベクターを含む細胞が、細胞が通常産生しないポリペプチドを産生することを可能にする。

１つの非限定例において、遺伝子改変膵島オルガノイドは、膵臓ベータ細胞により内因的に発現されないが、他の膵島細胞により内因的に発現される場合があるポリペプチドをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを含むベータ細胞を含む。さらなる例において、遺伝子改変膵島オルガノイドは、アルファ細胞により内因的に発現されないが、他の膵島細胞により内因的に発現される場合があるポリペプチドをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを含むアルファ細胞を含む。さらなる例において、遺伝子改変膵島オルガノイドは、デルタ細胞により内因的に発現されないが、他の膵島細胞により内因的に発現される場合があるポリペプチドをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを含むデルタ細胞を含む。異なる膵臓細胞型において差次的に発現される膵臓ポリペプチドの例には、グルカゴン、インスリン、アミリン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、ソマトスタチン、および血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）が含まれるがこれらに限定されない。本実施形態は、例えば、遺伝子改変膵島オルガノイドが、膵島細胞では通常非常に低濃度で産生されるポリペプチドをより高濃度で産生することを可能にする、および／またはある特定の条件下でポリペプチドの分泌を可能にする膵島細胞型での発現を可能にする場合がある。一例において、遺伝子改変膵島オルガノイドは、主に腸で産生されるが、膵島細胞では低濃度で産生され得るＶＩＰを発現するように遺伝子改変され得る。したがって、本実施形態において、ＶＩＰを発現する遺伝子改変膵島オルガノイドは、膵島細胞により発現されたＶＩＰの濃度を高めるために使用することができる。別の非限定の実施形態において、ＧＬＰ－１を発現することができる組換え発現ベクターは、遺伝子改変膵島オルガノイドの膵島ベータ細胞に存在する；ＧＬＰ－１の発現および分泌は、高グルコース条件に応じてＧＬＰ－１のベータ細胞への急速な局所送達を可能にし、したがって、改善された糖尿病治療を提供する。実施形態の種々の例において、組換え発現ベクターは、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターを含み、適切な制御配列は、ＣＭＶプロモータまたは遺伝子発現を指示することができるその機能的部分のヒトインスリンプロモータ、およびＲＩＰ１およびＲＩＰ２などのインスリンプロモータを含むがこれらに限定されないインスリンプロモータを含む。

非限定例において、コードされたポリペプチドは、合成（非天然型）ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、非ヒトポリペプチドおよび天然または合成ポリペプチド類縁体を含むことができる。

第１の態様のさらなる実施形態において、遺伝子改変膵島オルガノイドにより発現されたポリペプチドは、任意の膵島細胞型で内因的に発現されない。本実施形態において、コードされたポリペプチドは、非遺伝子改変膵島細胞により内因的に発現されない。

これらの実施形態すべてにおいて、ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである場合がある。そのような治療用ポリペプチドの例には、ポリペプチドホルモンまたは酵素補充タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。

一実施形態において、治療用ポリペプチドは、膵島では内因的に発現されないポリペプチドホルモンを含む。膵島では内因的に発現されないポリペプチドホルモンの非限定例には、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、レプチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、レニン、ガストリン、バソプレッシン（ＡＤＨ）、オキシトシン（ＯＸＹ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、カルシトニン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、アンジオテンシン、黄体化（leutinizing）ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、および副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）が含まれる。ポリペプチドホルモンが発現後に処理される実施形態において、核酸は、ポリペプチドホルモンの成熟形態またはプレ（プロ）タンパク質バージョンを発現する場合がある。本明細書で使用されるように、ポリペプチドホルモンの成熟形態は、最終の処理後のポリペプチドホルモンの形態である。一実施形態において、核酸は、ポリペプチドホルモンの成熟形態をコードする。

別の実施形態において、治療用ポリペプチドは、インクレチンまたは酵素補充タンパク質を含む。核酸は、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、オキシントモジュリン（ＯＸＭ）、グルコース依存性インスリン分泌刺激（insulinotrophic）ペプチド（ＧＩＰ）、ＧＬＰ－１受容体結合ポリペプチド、ＧＩＰ受容体結合ポリペプチド、グルカゴン受容体結合ポリペプチド、およびグルカゴン、ＧＩＰ、グルカゴン受容体結合ポリペプチドの二重または三重複合体を含むがこれらに限定されない任意のそのようなインクレチンをコードする場合がある。核酸は、第ＶＩＩ因子（エプタコグアルファ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子（カトリデカコグ）、フォン・ヴィレブランド因子、タリグルセラーゼアルファ、アガルシダーゼアルファもしくはベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、アルグルコシダーゼアルファ、ガルスルファーゼ、ドルナーゼアルファ、ラロニダーゼ、コネスタットアルファ（Ｃ１エステラーゼ阻害剤）、ペグロティカーゼアルファ－１－プロテイナーゼ阻害剤、アスホターゼアルファ（ストレンジック）、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼアルファ、バリアーゼ（valiase）、セベリパーゼアルファ（selbelipase alfa）、エポエチンシータ（epoetin teta）（エポラチオ（Eporatio））、ベータ（ネオレコルモン（NeoRecormon））、ゼータ（レタクリット（Retacrit））、ダルベポエチンアルファ（アラネスプ（Aranesp））、ルスパテルセプト（レブロジル（Reblozyl））、フィルグラスチム、レノグラスチム、およびフォン・ヴィレブランド因子－切断プロテアーゼを含むがこれらに限定されない任意のそのような酵素補充タンパク質をコードする場合がある。

さらなる実施形態において、治療用ポリペプチドはさらに、膵島では内因的に発現されない神経ペプチドおよび神経栄養因子を含むことができる。核酸は、エンケファリン、エンドルフィン、サブスタンスＰ、ニューロテンシン、ニューロペプチド－Ｙ、ボンベシン、脳由来神経栄養因子（neutrophic factor）（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン（neuotrophin）－３、ニューロトロフィン－４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、コリン作働性分化因子、カルジオトロフィン－１、オンコスタチンＭ、成長促進活性因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｎｅｕ分化因子、ヘレグリン、アセチルコリン受容体誘導活性、グリア細胞増殖因子（ＧＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アルテミン、ニュールツリン、ペルセフィン、骨形成タンパク質－１（ＯＰ－１）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長分化因子、エフリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦαおよびＴＧＦβ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、セリンプロテアーゼ阻害剤、プロテアーゼネキシン－１、誘導タンパク質のヘッジホッグファミリー、アグリン、ラミニン２、ＡＣｈ－誘導活性（ＡＲＩＡ）、ニューロイムノフィリン、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、活性依存性神経保護タンパク質（ＡＤＮＰ）、ニューリチン（neuritin）（活性誘導神経栄養因子）、血管新生増殖因子、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、ペプチド－６、ダブネチド（davunetide）（ＡＤＮＰ由来）、およびセレブロリシンを含むがこれらに限定されない任意のそのような神経ペプチドまたは神経栄養因子をコードする場合がある。

遺伝子改変膵島オルガノイドが、同じまたは異なるポリペプチドを発現することができる複数の組換え発現ベクターを含む場合があることが理解されるであろう。種々の実施形態において、遺伝子改変膵島オルガノイドは、２個、３個、またはそれより多くの異なる組換え発現ベクターを含む場合があり、それぞれ同じまたは異なるポリペプチドを発現することができる。異なる組換え発現ベクターは、そのオルガノイドにおいて同じ細胞型にすべて存在する場合があるか、そのオルガノイドにおいて異なる細胞型に存在する場合がある。１つの非限定の実施形態において、オルガノイドは、すべてが同じポリペプチドを発現するが、異なる発現ベクターが異なる条件下ならびに／またはプロモータおよび／もしくは調節エレメントが有効であるオルガノイド細胞型に存在する場合にのみポリペプチドを発現するようにそれぞれ異なるプロモータもしくは他の適切な調節エレメントの制御下にある、２個またはそれより多くの異なる発現ベクターを含む場合がある。別の非限定の実施形態において、オルガノイドは、すべてが異なるポリペプチドを発現する２個またはそれより多くの異なる発現ベクターを含む場合があり、異なる発現ベクターが同じ条件下（同じプロモータおよび／または調節エレメントを使用する場合）、異なる条件下（異なるプロモータおよび／または調節エレメントを使用する場合）、ならびに／またはプロモータおよび／もしくは調節エレメントが有効であるオルガノイド細胞型に存在する場合にのみ異なるポリペプチドを発現する場合があるように、各異なるポリペプチドが同じもしくは異なるプロモータまたは他の適切な調節エレメントの制御下にある場合がある。１つの特定の実施形態において、オルガノイドは、以下：（１）発現がインスリンプロモータの制御下にあり、ベータ細胞への発現を限定する、第１の発現ベクター；（２）発現がグルカゴンプロモータの制御下にあり、アルファ細胞への発現を限定する、第２の発現ベクター；および（３）発現がソマトスタチンプロモータの制御下にあり、デルタ細胞への発現を限定する、第３の発現ベクターのうち２つまたは３つを含む場合がある。他の例において、オルガノイドは、発現は、ＣＭＶプロモータおよび／またはラットインスリンプロモータ、ＲＩＰ１もしくはＲＩＰ２の制御下にある、１個または複数個の発現ベクターを含む場合がある。

第２の態様において、本開示は、本明細書に開示されている任意の実施形態または実施形態の組み合わせの遺伝子改変膵島オルガノイドおよびシルクマトリックスを含む組成物を提供する。遺伝子改変膵島オルガノイドは、シルクマトリックス上に付着またはシルクマトリックス内に統合される場合がある。シルクマトリックスは、繊維、泡、フィルム、繊維メッシュ、カプセル、ネット、またはゲル、好ましくは繊維または泡の形状を有する場合がある。シルクマトリックスは、絹タンパク質を含むことができる。絹タンパク質は、蚕フィブロインなどのフィブロイン、またはスパイダーシルクタンパク質が好ましい。

スパイダーシルクは生体適合性材料であり、組換えＤＮＡ技術を通じて製造することができる。スパイダーシルクは、真核細胞の培養のための細胞足場材料として機能することができる。絹タンパク質のポリマーは、細胞足場として細胞により使用され得る。クモは、最大７つの異なる腺を有しており、ドラグライン絹を含むがこれに限定されない、異なる機械的特性および機能を有する多種多様のシルク型を産生する。

スパイダーシルクタンパク質は、膵島オルガノイドのものなど付着および／または統合した細胞とフィルムおよび泡を含むマクロ構造を形成することができ、このため遺伝子改変膵島オルガノイド細胞のための内部３Ｄ支持体を提供することができる。これらのマクロ構造は高い播種効率を与え、迅速に生着した膵島オルガノイドを生じる。他の細胞足場での培養と比較して、スパイダーシルク内の細胞は、シルクの足場に統合される場合、より組織様の拡がりを達成する。これは、移植された膵島オルガノイドの機能性および生存率を改善する場合がある。

官能化シルクは、医療およびバイオテクノロジーに関連する用途のために機能性が高められた生物活性シルクベース物質である。本明細書で使用されるように、「官能化スパイダーシルク」は、細胞結合モチーフを含み、官能基またはドメインに共有結合するように修飾された組換えスパイダーシルクを意味する。官能化スパイダーシルクおよびそれを産生および使用する方法の例には、参照によりそれらの全体が組み込まれている国際公開第２００７０７８２３９号、米国特許出願公開第２０１６００２４４６４号明細書、米国特許第１０３１６０６９号明細書、および米国特許出願公開第２０１９０１４４８１９号明細書に開示されているものが含まれるがこれらに限定されない。これらおよび他の態様のある特定の好ましい実施形態において、絹タンパク質は、ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ（配列番号１）、ＹＩＧＳＲ（配列番号２）、ＥＰＤＩＭ（配列番号３）、ＮＫＤＩＬ（配列番号４）、ＧＲＫＲＫ（配列番号５）、ＫＹＧＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ（配列番号６）、ＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ（配列番号７）、ＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭ（配列番号８）、ＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳ（配列番号９）、ＴＧＲＧＤＳＰＡ（配列番号１０）、ＣＴＧＲＧＤＳＰＡＣ（配列番号１１）およびＦＮ_ｃｃから；好ましくはＦＮ_ｃｃ、ＧＲＫＲＫ、ＩＫＶＡＶ、ＲＧＤおよびＣＴＧＲＧＤＳＰＡＣ、より好ましくはＦＮ_ｃｃおよびＣＴＧＲＧＤＳＰＡＣから選択される細胞結合モチーフなどの細胞結合モチーフを含み、ここで、ＦＮ_ｃｃは、Ｃ^１Ｘ^１Ｘ^２ＲＧＤＸ^３Ｘ^４Ｘ^５Ｃ^２であり；各Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４およびＸ^５は、独立して、システイン以外の天然アミノ酸残基から選択され；Ｃ^１およびＣ^２は、ジスルフィド結合を介して接続される。細胞結合モチーフの好ましい群は、ＦＮ_ｃｃ、ＧＲＫＲＫ、ＩＫＶＡＶ、およびＲＧＤ、特にＦＮ_ｃｃ、例えばＣＴＧＲＧＤＳＰＡＣである。

官能化スパイダーシルクは、追加の機能特性、例えば電気コンダクタンス、細胞結合能、増殖因子の生物活性、分子親和性、抗微生物特性および酵素活性を含む場合がある。そのような追加の機能特性は、例えばディップコーティング、遺伝子工学、および／または官能化スパイダーシルクの酵素カップリングにより追加される場合がある。（特許国際公開第２０１７１３７６１１号からの絹タンパク質の特性の例。）いくらかの実施形態において、官能化スパイダーシルクは、免疫応答から遺伝子改変膵臓オルガノイドを保護するために、ＰＤ－Ｌ１などの免疫抑制タンパク質または他の免疫調節剤を含むことができる。官能化スパイダーシルクはまた、血管新生を高める因子または他の増殖因子、例えばフィブロネクチン、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＧＬＰ－１を含むことができる。

遺伝子改変膵島オルガノイドおよびシルクマトリックスを含む組成物は、種々の方法で調製することができる。遺伝子改変膵島オルガノイドは、最初に別個に調製することができ、その後、シルクマトリックス上に配置され、付着させることを可能にする。代わりに、遺伝子改変膵島オルガノイドは、最初に別個に調製することができ、その後、シルク溶液内に配置され、遺伝子改変膵島オルガノイドを包含するシルクマトリックスを形成することを可能にする。さらに好ましい実施形態において、遺伝子改変膵島オルガノイドおよびシルクマトリックスを含む組成物を提供するための方法は：（ｉ）水不溶性マクロ構造に集合することができる絹タンパク質の水溶液を提供するステップ；（ｉｉ）任意選択でさらにラミニンを含む絹タンパク質を用いて遺伝子改変膵島細胞の試料の水性混合物を調製するステップ；（ｉｉｉ）膵島細胞の存在下で絹タンパク質が水不溶性マクロ構造に集合するのを可能にし、それによって真核細胞のための３Ｄシルクマトリックスを形成するステップ；ならびに（ｉｖ）遺伝子改変膵島オルガノイドを得るのに適した条件下、シルクマトリックス内で遺伝子改変膵島細胞を維持および分化させるステップを含む。さらなる実施形態において、方法は、遺伝子改変膵島オルガノイドがシルクマトリックスから離れ、所望により懸濁液内で増殖させることができるステップを含むことができる。

第３の態様において、本開示は、障害の処置のための、本開示の第１の態様の遺伝子改変膵島オルガノイドまたは本開示の第２の態様の組成物の使用を提供する。第４の態様において、本開示は、障害を有する被験体に、本開示の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの遺伝子改変膵島オルガノイドまたは組成物を、その障害を処置するのに有効量で移植することを含む、障害の処置のための方法を提供する。上で議論したように、本開示は、膵島オルガノイドが、非膵臓ポリペプチドを含む、任意のポリペプチドを発現するように遺伝子改変され得るという、またこれらの遺伝子改変膵島オルガノイドが、遺伝子改変膵島オルガノイドにより産生される非膵臓ポリペプチドを含む任意のポリペプチドを使用して処置可能である疾患を処置するために使用することができるという新規で驚くべき知見を提供する。

本明細書で使用されるように、用語「被験体」は、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウシ、ウマなどを含むがこれらに限定されない哺乳動物の被験体などの処置が望まれる任意の被験体である。一実施形態において、被験体は、ヒトである。本明細書で定義されるように、「それを必要とする被験体」は、膵島により内因的に発現されないポリペプチドの発現レベルの低下、または発現の不在に関連する障害に罹患している被験体である。

本開示の使用および方法の一実施形態において、遺伝子改変膵島オルガノイドまたは組成物は、被験体に移植される場合がある。移植は、任意の適切な手順を通じて達成することができ、遺伝子改変膵島オルガノイドは、被験体の眼、脳下垂体、膵臓、小腸、胃、脳、腎臓、副甲状腺、十二指腸、甲状腺、肝臓、心臓、卵巣、睾丸、脂肪、または皮膚を含むがこれらに限定されない被験体の任意の適切な領域に移植され得る。一実施形態において、遺伝子改変膵島オルガノイドは、被験体の眼に移植される。

使用および方法は、循環するポリペプチドの発現レベルの低下、または完全な不在に関連するか、それにより引き起こされる任意の障害を処置するために使用することができる。種々の実施形態において、処置される障害および障害を処置するために本開示の遺伝子改変膵島オルガノイドにより発現されたポリペプチドは、以下の表１の同じ行に列記されている。したがって、例えば、遺伝子改変膵島オルガノイドが甲状腺刺激ホルモンを発現する場合、使用および方法は、甲状腺機能低下症を有する被験体を処置することを含む場合がある（表１の第２行を参照されたい）。同様に、遺伝子改変膵島オルガノイドがプロラクチンを発現する場合、使用および方法は、低プロラクチン血症を有する被験体を処置することを含む場合がある（表１の第３行を参照されたい）。したがって、表１の各行を表示することにより、どのポリペプチドを発現する遺伝子改変膵島オルガノイドがどの障害を処置する可能性があるかを判断する方法は、当業者に明らかになるであろう。

特定の実施形態において、障害には、低プロラクチン血症、低カルシウム血症、プラダー－ウィリー症候群、肥満症、高トリグリセリド血症、脂肪異栄養症（ベラルディネリ－セイプ症候群、ローレンス症候群、およびバラケル－ジーモンス症候群）、血友病、ゴーシェ病、ファブリー病、ポンペ病、ムコ多糖症、ウォルマン病、遺伝性血管性浮腫、慢性好中球減少症、腎性貧血、サラセミアベータ、血友病ＡおよびＢを含む血友病様疾患、フォン・ヴィレブランド病、第ＸＩＩＩ因子欠乏症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、フェニルケトン尿症、肺気腫、低ホスファターゼ症、嚢胞性線維症、抑鬱症、疼痛、神経伝達関連疾患、パーキンソン病、ＡＤＤ、不安症、記憶喪失、関節リウマチ（ＲＡ）、クリオピン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、およびアルツハイマー病、糖尿病、代謝症候群、精神分裂病、自閉症、発作関連疾患、摂食障害、ストレス障害、胃腸疾患、白血病、癌、循環器疾患、ライム病、熱帯病、脳癌、壊死性腸炎、ゾリンジャー－エリソン症候群、消化管潰瘍および先天性微絨毛萎縮症、脊椎すべり症、後側方関節固定術、骨粗鬆症、脊椎固定術、骨折治癒、免疫異常、自己免疫異常、循環器疾患、血液凝固障害、アルポート症候群、表皮水疱症、１型および２型糖尿病、重度インスリン抵抗症候群、クローン病、関節炎、若年性慢性関節炎、嚢胞性線維症、眼の新生血管形成、成長ホルモン欠乏症、創傷治癒、組織修復、好中球減少症、神経線維腫、糖尿病性ニューロパチー、神経変性および神経筋疾患、ハンチントン病、慢性炎症性疾患、虚血性および出血性脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、認知症、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、運動失調症、筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、脳卒中、脊髄損傷、シャルコー－マリー－トゥース病、ならびに進行性核上性麻痺が含まれる。他の特定の実施形態において、処置されるこれらの障害および障害を処置するための本開示の遺伝子改変膵島オルガノイドにより発現されたポリペプチドは、表１の同じ行に列記されている。

１つの特定の実施形態において、オルガノイドは、組換え発現ベクターを含む膵臓ベータ細胞を含む場合があり、発現ベクターは、インスリンプロモータの制御下でレプチンをコードする核酸を含む。オルガノイドは、例えば、前眼房または脳へ外科的に移植される場合がある。オルガノイドの移植は、結果として、通常レプチンを発現しない膵臓ベータ細胞からのレプチンの産生および放出となる。本実施形態は、結果として、血糖を低下させることができ、インスリンレベルは、肥満症、高トリグリセリド血症、脂肪異栄養症（ベラルディネリ－セイプ症候群、ローレンス症候群、およびバラケル－ジーモンス症候群を処置するために使用することができる。

他の非限定の実施形態において、ＤＰＰ４による分解に耐性があるＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１類縁体、ならびにＧＬＰ－１受容体および他の受容体（ＧＩＰ受容体よびグルカゴン受容体を含む）と相互作用することができるリガンドの１つまたは複数は、移植、例えば眼または脳への移植の後に遺伝子改変膵島オルガノイドから発現および放出され得る。ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１類縁体、ＧＬＰ－１受容体および他の受容体と相互作用することができるリガンドの例には、デュラグルチド、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、セマグルチド、ＬＹ２９４４８７６／ＴＴ４０１、ＳＡＲ４２５８９９、ＭＥＤＩ０３８２、ＨＭ１２５２５Ａ／ＪＮＪ－６４５６５１１１、ＺＰ２９２９／ＢＩ ４５６９０６、ＭＫ－８５２１、ＮＮ９２７７、ＲＧ７６９７／ＮＮＣ００９０－２７４６、ＤＡ２ＧＩＰ－Ｏｘｍ、［ｄＡ２］ＧＬＰ－１／グルカゴン、Ｙ１－ｄＡ２－Ｉ１２－Ｎ１７－Ｖ１８－Ｉ２７－Ｇ２８、２９－グルカゴン、ＭＡＲ４２３、およびＨＭ１５２１１が含まれるがこれらに限定されない。そのような実施形態は、糖尿病、肥満症、代謝症候群、およびパーキンソン病を含むがこれに限定されない神経障害を含むがこれらに限定されない、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ、グルカゴン、および／またはオキシモジュリン（oxymodulin）と関連する任意の病気を処置するために使用することができる。

他の非限定例において、膵臓オルガノイドは、組換え発現ベクターを含むベータ細胞を含むことができ、発現ベクターは、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１類縁体、および／またはＧＬＰ－１受容体と相互作用することができるリガンドの１つまたは複数をコードする核酸を含む。本実施形態の種々の例において、ＧＬＰ－１またはＧＬＰ－１類縁体を発現するベータ細胞を含む組換え膵臓オルガノイドは、前眼房または脳を含む任意の場所へ外科的に移植することができる。脳への外科的移植は、硬膜に隣接した場所、その外側もしくは内側のいずれか、硬膜への移植を含むことができる。本実施形態の種々の例において、組換え発現ベクターは、インスリンおよびグルカゴンプロモータを含むがこれらに限定されない任意の適切なプロモータを含むことができる。本実施形態において、ベータ細胞は、ＧＬＰ－１を分泌するように遺伝子改変され、したがって、血糖濃度が高い場合、ベータ細胞からのインスリン分泌を増加させることになる正の自己分泌フィードバックシグナルとして機能することができる。１つの特定の実施形態において、遺伝子改変膵臓オルガノイドは、組換え発現ベクターを含む膵臓ベータ細胞を含み、発現ベクターは、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１類縁体、および／またはインスリンプロモータの制御下でＧＬＰ－１受容体と相互作用することができるリガンドの１つまたは複数をコードする核酸を含む。この特定の実施形態において、遺伝子改変膵臓オルガノイドは、脳に移植して、糖尿病、肥満症、代謝症候群およびパーキンソン病を含む神経障害を処置するために使用することができる。

被験体におけるポリペプチドの任意の適切な発現は、障害の処置において利益（すなわち：障害を有していない被験体における発現レベルの割合として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高い）を与えることができる。

実施例１：血液由来ペプチド／タンパク質のための産生部位としての眼内の遺伝子改変膵島オルガノイド
方法
動物。両方ともＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグランドを有するメスＢ６．Ｃｇ－Ｌｅｐ^ｏｂ／Ｊ（ｏｂ／ｏｂ）マウスおよびＢ６．ＢＫＳ（Ｄ）－Ｌｅｐｒ^ｄｂ／Ｊマウスを、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（ウィルミントン、ＭＡ、ＵＳＡ）から２ヶ月齢で購入した。納入後、実験開始前の１週間、マウスを動物実験施設に順応させた。飼料（ラントマンネン、ストックホルム、スウェーデンからのチャウ飼料Ｒ７０）および水に自由にアクセスできる状態で、動物をすべて、１２／１２時間の明／暗サイクルで群飼した。実験はすべて、研究における動物のケアおよび使用についてカロリンスカ研究所のガイドラインにしたがって実行し、動物倫理委員会により承認された。

ｏｂ／ｏｂマウスのレプチン処置：ｏｂ／ｏｂマウスを、到着の日から５週間、組換えヒトレプチンタンパク質（１．５μｇ／ｇ体重、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＵＳＡ）の１回の腹腔内注射で毎日処置した。

発現ベクター構築：マウスレプチンｃＤＮＡを、ｐＣＭＶ６．マウスレプチン（ＯｒｉＧｅｎｅ、＃ＭＣ２０８８７６）から取得し、ｐＴＲＥ－ｔｉｇｈｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）にサブクローニングして、ｐＴＲＥ－ｔｉｇｈｔ．ｍレプチンを作成した。次に、ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）配列をｍレプチンｃＤＮＡの下流に挿入し、ｐＴＲＥ－ｔｉｇｈｔ．ｍレプチン－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）を得た。ｐＥＮＴＲ．ＴＲＥ－ｔｉｇｈｔ．ｍレプチン－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）／ＲＩＰ１．ＤｓＲｅｄ２（商標）を作成するため、ＴＲＥ－ｔｉｇｈｔ．ｍレプチン－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）により、ｐＥＮＴＲ．ｒｂＧＫ．ＥＧＦＰ／ＲＩＰ１．ＤｓＲｅｄ２（商標）（Ｐａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０１９）内でｒｂＧＫ．ＥＧＦＰカセットを交換した。次に、ｐＴｅｔＯＦＦ－Ｄｕａｌ（緑色）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から取得したＴｅｔＯＦＦ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）カセットにより、ｐＥＮＴＲ．ＴＲＥ－ｔｉｇｈｔ．ｍレプチン－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）／ＲＩＰ１．ＤｓＲｅｄ２（商標）内でＤｓＲｅｄ（商標）ｃＤＮＡを交換し、このようにｐＥＮＴＲ．ＴＲＥ－ｔｉｇｈｔ．ｍレプチン－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）／ＲＩＰ１．ＴｅｔＯＦＦ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）を生成した。すべての構築物をＤＮＡ配列分析により確認した。Ｇａｔｅｗａｙ技術により、ＴＲＥ－ｔｉｇｈｔ．ｍレプチン－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）／ＲＩＰ１．ＴｅｔＯＦＦ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）カセットを、プロモータがないアデノウイルスプラスミドｐＡｄ／ＰＬ－ＤＥＳＴ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に移した。ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）アデノウイルス発現システム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して、細胞の形質導入に使用された、ｖＡｄ／ＲＩＰ－ｍレプチン－ＯＦＦと呼ばれるレプリコン欠損アデノウイルスを生成した。

膵島の単離：膵島をＢ６．ＢＫＳ（Ｄ）－Ｌｅｐｒ^ｄｂ／Ｊマウス（ｄｂ／ｄｂ）から単離した。膵島を、コラゲナーゼ（エフ・ホフマン・ラ・ロシュ、バーゼル、スイス）の膵管注射によりマウスから調製し、消化後、実体顕微鏡ＭＺ６（ライカマイクロシステムズ、ヴェツラー、ドイツ）下で厳選した。その後、膵島を、最終濃度１０％の非働化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＲＰＭＩ培地）を有するＲＰＭＩ－１６４０培地（ＲＰＭＩ培地）中、５％ＣＯ_２および３７℃で培養した。

膵島オルガノイド産生：膵島を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに回収し（２５０個の膵島／チューブ）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（シグマ－アルドリッチ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて１０分間、３７℃で消化させ、５００ｒｐｍで遠心分離した。ＲＰＭＩ培地中、懸濁培養ディッシュで１時間、５％ＣＯ_２および３７℃で、１ｍｌあたりレプチンコードアデノウイルス４×１０^６個のプラーク形成単位で膵島細胞に形質導入し、その後、２回、過剰のＲＰＭＩ培地で洗浄し、過剰のアデノウイルスを除去した。

２５００個の膵島細胞を、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ（商標）９６Ｕ底プレート（サーモサイエンティフィック、レスターシャー、ＵＫ）の各ウェルに播種した。膵島オルガノイドは、５日間かけて形成され、その後、オルガノイドを懸濁培養ディッシュに移した。

眼内膵島オルガノイドのインビトロイメージング：倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８；ライカマイクロシステムズ）を使用して、３μｍのステップサイズで三次元スタックとして膵島オルガノイドを撮像した。ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）蛍光タンパク質を４８８ｎｍで励起し、蛍光を５０５～５３５ｎｍで検出し、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）を５６１ｎｍで励起し、蛍光を５８０～６５０ｎｍで検出した。５６１ｎｍの励起からのバックスキャッタシグナル（反射）を５５５～５６５ｎｍで回収した。

インビトロでの膵島オルガノイドからのレプチン分泌：膵島オルガノイドを、ＲＰＭＩ培地中、懸濁培養ディッシュでインビトロ培養した。グルコース依存性レプチン分泌測定のため、オルガノイドを、３ｍＭグルコースを有するＲＰＭＩ培地を含む４ウェルプレート懸濁ディッシュに１．５時間配置した。その後、最初に３ｍＭグルコースを有する培地を含む新しいウェルにオルガノイドを３０分間配置し、その後、１６ｍＭグルコースを含む新しいウェルに３０分間配置した。その後、オルガノイドを通常のＲＰＭＩ培地を含む懸濁培養ディッシュに戻し、培養を継続した。４ウェルプレートのウェルからの培地をエッペンドルフチューブに回収し、１分間遠心分離して、実行可能なオルガノイド断片をペレット化した。上清を新しいチューブに回収し、分析まで－２０℃で維持した。

膵島オルガノイドのＡＣＥへの移植：Ｓｐｅｉｅｒらにより以前説明された技術（Ｓｐｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００８）を使用して、膵島オルガノイドを、ｏｂ／ｏｂレシピエント３匹（第１の実験セット）および７匹（第２の実験セット）のＡＣＥに移植した。簡潔に言うと、麻酔下で、２７ゲージ針を用いて角膜に小穴を作成した後、ガラスカニューレを用いてオルガノイドをＡＣＥに移植した。出血および虹彩への損傷を回避するため、細心の注意が払われた。術後鎮痛のために、Ｔｅｍｇｅｓｉｃ（商標）（０．１ｍｌ／ｋｇ；ＲＢファーマシューティカルズ、バークシャー、イギリス）をマウスに皮下注射した。移植群の各マウスは、オルガノイド１００個／眼を受けた。３匹のｏｂ／ｏｂマウス（第１の実験セット）および５匹のｏｂ／ｏｂマウス（第２の実験セット）を対照として使用し、移植しなかった。

眼内膵島オルガノイド移植片のインビボイメージング：移植後９週間目から膵島オルガノイド移植片をインビボで撮像した。長作動距離液浸対物レンズ（ＨＸＣ－ＡＰＯ１０３／０．３０開口数；ライカマイクロシステムズ）および特注の定位固定ヘッドホルダを備え、移植された膵島を含むマウスの眼を対物レンズに向かって配置することを可能にする正立型共焦点レーザー走査顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ５；ライカマイクロシステムズ）を使用した。Ｖｉｓｃｏｔｅａｒ（商標）ｓ（Ｔｈｅａ Ｎｏｒｄｉｃ、エレブルー、スウェーデン）を眼と対物レンズとの間の浸漬液として使用し、インビボイメージングの間、マウスに麻酔をかけるためにイソフルランを使用した。移植片を３μｍのステップサイズで三次元スタックとして撮像した。ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）蛍光タンパク質を４８８ｎｍで励起し、蛍光を５０５～５３５ｎｍで検出した。ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）を５６１ｎｍで励起し、蛍光を５８０～６５０ｎｍで検出した。５６１ｎｍの励起からのバックスキャッタシグナル（反射）を５５５～５６５ｎｍで回収した。撮像後、マウスを麻酔から回復させた。さらに、移植後６週間目から開始して、マウスが麻酔下にある間、ライカＭ６０実体顕微鏡に接続したデジタルカメラを使用して移植片の概観画像を得た。

動物のドキシサイクリン処置：膵島オルガノイド移植片からのレプチン産生を停止するために、移植群の３匹の動物を、ドキシサイクリンで処置した。ＰＢＳに溶解した滅菌ドキシサイクリン塩酸塩を、１０日間かけて５回腹腔内（ｉｐ）投与した（５０μｇ／ｋｇ／マウス）。

体重ならびに空腹時および非空腹時血糖：食餌の６時間の拒否後、体重および空腹時血糖を測定した。食事に完全にアクセスできる状態で午後４時に非空腹時血糖を測定した。

腹腔内のブドウ糖負荷試験（ｉｐＧＴＴ）：耐糖能を決定するために、６時間給餌されなかったマウスで、基底状態（０分）ならびにグルコース注射（２ｇ／ｋｇ体重ｉｐ、ＰＢＳに溶解）後１０分、３０分、６０分、および１２０分に血糖値を測定した。結果をｉｐＧＴＴの曲線下面積（ＡＵＣ）として表した。Ａｃｃｕ－Ｃｈｅｋ（商標）アビバモニタリングシステム（エフ・ホフマン・ラ・ロシュ、バーゼル、スイス）を用いて、グルコース濃度を測定した。

血漿および水性体液試料：血液試料を非空腹動物から採取し、Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ３００ ＥＤＴＡ／ＰＫ１００チューブ（ザルスタット、ニュームブレヒト、ドイツ）に回収し、遠心分離して血漿を得、使用するまで－２０℃で保存した。水性体液試料を実験の最後で取得し、使用するまで－２０℃で維持した。

インスリンおよびＣ－ペプチド測定：超高感度マウスＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ、エルクグローブビレッジ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して、血漿中のインスリンおよびＣ－ペプチドレベルを分析した。

レプチン測定：細胞培養培地、血漿および水性体液試料中、マウス／ラットレプチンＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＵＳＡ）を使用してレプチンを測定した。

組織抽出および切片化：眼を取得し、切片化してインビボで得られたデータを確認および補完した。イソフルランを用いてマウスに麻酔をかけ、頚椎脱臼により屠殺した。眼を抽出し、４％パラホルムアルデヒドで１週間固定した。冷凍保存の前、眼をショ糖密度勾配［０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）アジ化ナトリウムおよび０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）バシトラシンを含むＰＢＳ中１０～３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のショ糖］で処理し、ＯＣＴ－コンパウンド（ティシュー－テック、サクラファインテック、トーランス、ＣＡ、ＵＳＡ）に埋め込み、ドライアイスで凍結させ、使用するまで－８０℃で保存した。その後、眼の前部の２０μｍの厚みの凍結切片をＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ（商標）プラス顕微鏡スライド（ＶＷＲインターナショナル、ラドノール、ＰＡ、ＵＳＡ）上で回収し、使用するまで－２０℃で維持した。

眼の切片における免疫蛍光：免疫染色のため、眼の切片を室温に平衡化、洗浄、ブロックし、その後、０．１％トリトンＸ－１００および１０％血清の存在下、一次抗体、ヤギ抗ｍ－レプチン（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＵＳＡ）およびウサギ抗Ｃ－ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ダンバース、ＭＡ、ＵＳＡ）とインキュベートした。洗浄後、二次抗体、抗ヤギＡｌｅｘａ６３３および抗ウサギＡｌｅｘａ５９４それぞれ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を適用し、洗浄を繰り返した後、核対比染色のためのＤＡＰＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を含む培地を用いる固定を実行した。以下の励起設定：ＤＡＰＩ－励起４０５ｎｍ、検出４５０～４７０ｎｍ；ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）励起４８８ｎｍ、検出５００～５２５ｎｍ；ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）５４８ｎｍ、検出５６０～５８０ｎｍ；Ａｌｅｘａ５９４（Ｃ－ペプチド染色）励起５９４ｎｍ、検出６００～６２０ｎｍ；Ａｌｅｘａ６３３（レプチン染色）励起６３３ｎｍ、検出６４０～６８０ｎｍを用い、共焦点レーザー走査顕微鏡（ライカＴＣＳ ＳＰ８、ライカマイクロシステムズ）を使用して撮像を実行した。スペクトルの重複を回避するため、フレーム間連続撮像を使用して、撮像を実行した。

統計：平均±ＳＥＭで値を表す。両側の対応のないｔ検定を使用して、異なる処置群間の統計的有意性を決定した。統計的有意性は、以下のように使用した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計解析には、Ｏｒｉｇｉｎ ２０１５ ６４ビット（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、ノーザンプトン、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＥｘｃｅｌ（マイクロソフト、レドモンド、ＷＡ、ＵＳＡ）を使用した。

結果
マウスレプチンおよびそのインビトロ評価のためのＴｅｔ－ｏｆｆベースのベータ細胞特異的アデノウイルス発現構築物の生成：反対方向に位置し、独立した発現を可能にするために「転写ブロック」配列により分離された２つの発現カセットを含むアデノウイルスベクター、ｖＡｄ－ＲＩＰ－レプチン－ＯＦＦ（図１Ａ）を生成した。第１の発現カセットは、膵臓ベータ細胞における合成転写因子ｒＴＡ（Ｔｅｔ－ｏｆｆ）および緑色蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）のラットインスリン－１プロモータ駆動発現を可能にする。第２の発現カセットは、ＴＲＥ－ｔｉｇｈｔプロモータ駆動マウスレプチン－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）カセットからなる。ｒＴＡのＴＲＥ－ｔｉｇｈｔプロモータへの結合は、ドキシサイクリンの不在下、ベータ細胞においてレプチンおよび赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の発現を誘導するが、ドキシサイクリンの添加は、２つのタンパク質の発現を停止する。２つの発現カセットにおけるＩＲＥＳエレメントは、ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）とのｒＴＡおよびｍＣｈｅｒｒｙ（商標）とのレプチンの同時発現を可能にする。したがって、「緑色」および「赤色」は、ベータ細胞において、それぞれｒＴＡおよびレプチンの発現についての視覚的な読み出しとして役立つ。

インビトロ評価のため、Ｂ６．ＢＫＳ（Ｄ）－Ｌｅｐｒ^ｄｂ／Ｊマウス（移植に使用したものと同じバッチから）の膵島から作成した形質導入オルガノイドを使用した。膵島オルガノイドのレーザー走査共焦点顕微鏡による緑色および赤色蛍光の検出により、ベータ細胞において、両方の発現カセットが活性化されていたことが示された（図１Ｂおよび図１Ｃ）。オルガノイドは、培養培地中でレプチンを分泌し、分泌は、グルコース濃度が高いほど高い：３ｍＭグルコースで７．０２＋／１．７６ｐｇ／オルガノイド／時に対して１６ｍＭグルコースでは１２．９４＋／－２．８３ｐｇ／オルガノイド／時（刺激指数：１．９３＋／－０．１４）。

ＡＣＥにおける膵島オルガノイド移植片による異所的レプチン産生は、ｏｂ／ｏｂマウスにおける代謝表現型を改善する。膵島オルガノイドによる眼内レプチン産生がｏｂ／ｏｂマウスにおける代謝表現型に影響を及ぼすかどうかをテストするため、以下の点を考慮した。離乳後のレプチン欠損が、本来の原位置にある膵島およびＡＣＥに移植された膵島の両方で、強力なベータ細胞の増殖を含むｏｂ／ｏｂ表現型の急速な発達をもたらし、レプチン処置がこのプロセスを減速させる（Ｉｌｅｇｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１３）ので、ｏｂ／ｏｂマウスは、ベンダーから到着した直後、膵島オルガノイド移植片の移植後４週間まで、すなわちそれらの完全な生着後まで、レプチンの毎日の腹腔内注射（１．５μｇ／ｇ体重／日）で処置された。オルガノイド生成のためにレプチン受容体欠損マウス由来の膵島、すなわちｏｂ／ｏｂレシピエントマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｌｅｐ^ｏｂ／Ｊ）のＢ６背景と一致するようにＢ６遺伝的背景があるｄｂ／ｄｂマウス（Ｂ６．ＢＫＳ（Ｄ）－Ｌｅｐｒ^ｄｂ／Ｊ）由来の膵島を使用することにより、ベータ細胞産生レプチンの潜在的な負のフィードバックが無効にされた。したがって、ｄｂ／ｄｂマウス由来の膵島を単離し、それらを脱凝集させ、ｖＡｄ－ＲＩＰ－レプチン－ＯＦＦを用いて膵島細胞を形質転換し、自己集合により膵島オルガノイドを形成した。

第１の実験セットにおいて、移植前１５日目から移植後２８日目までレプチンで処置された１３０個のレプチン発現ｄｂ／ｄｂ膵島オルガノイドをメスｏｂ／ｏｂマウスのＡＣＥに移植し（ｎ＝３、図２Ａ、図２Ｂを参照されたい）、対照群として膵島オルガノイドが移植されなかったレプチン処置済みメスｏｂ／ｏｂ（ｎ＝３）を使用した。移植について非形質転換膵島を対照として使用する初期の研究により、倫理的な理由のために実験の終了が必要とされる、これらの膵島移植片の過剰増殖を示した（図２Ｃ）ので、非形質転換膵島オルガノイドを対照群で使用しなかった。インビトロで維持された膵島オルガノイド（図１Ｂ）、同様にインビボでＡＣＥに移植されたオルガノイド（図２Ｂ）の検査では、緑色および赤色蛍光タンパク質の両方の発現を示し、ｒＴＡ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）およびレプチン－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）発現カセットが両方ともベータ細胞で発現されたことが示唆された。両群間のマウスの体重の差異（図２Ｄ）は観察されなかった。しかし、ブドウ糖負荷試験（ｉｐＧＴＴ）での変化は観察され、それはレプチン処置の停止後１０日目に始まり、レプチン処置の停止後２５日目に顕著になった（図２Ｅ）。さらに、レプチン産生オルガノイドが移植された群において、レプチン処置の停止後３５日目に顕著であった空腹時血糖の低下に向かう傾向（図２Ｆ）が観察され、両方とも実験の最後に測定された血漿インスリン（図２Ｇ）およびインスリンＣ－ペプチド（図２Ｈ）レベルの低下に向かう傾向が観察された。最後に、移植群において実験の最後で水性体液中のレプチン（１１．３７５＋／－３．２１１ｎｇ／ｍｌ）が検出されたが、対照群ではレプチンは検出できなかった。両群からの血漿中にはレプチンは検出できなかった。

第２の実験セットにおいて、移植前７日目から移植後２８日目までレプチンで処置された２００個のレプチン発現ｄｂ／ｄｂ膵島オルガノイドをメスｏｂ／ｏｂマウスのＡＣＥに移植し（ｎ＝７、図３Ａ、図３Ｂを参照されたい）、対照群として膵島オルガノイドが移植されなかったレプチン処置済みメスｏｂ／ｏｂ（ｎ＝５）を使用した。インビトロで維持された膵島オルガノイド（図１Ｃ）、同様にインビボでＡＣＥに移植されたオルガノイド（図３Ｂ）の検査では、緑色および赤色蛍光タンパク質の両方の発現を示し、ｒＴＡ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）およびレプチン－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）発現カセットが両方ともベータ細胞で発現されたことが示唆された。重要なことに、本実験において、レプチン産生オルガノイドが移植されたマウスは、レプチン処置の停止後１５日目から体重の有意な差異を示した（図３Ｃ）。レプチン処置の停止後１９日目から始まったｉｐＧＴＴにおける有意な変化（図３Ｄ）が観察された。さらに、レプチン産生オルガノイドが移植された群における空腹時血糖の減少（図３Ｅ、レプチン処置の停止後１９日目および６８日に顕著である）、血漿インスリンの有意な減少（レプチンの停止後１４日目から、図３Ｆ）、および血漿Ｃ－ペプチドレベルの有意な減少（レプチンの停止後８日目から、図３Ｇ）が観察された。最後に、その群において、実験の最後での水性体液中のレプチン（６．０５＋／－２．９１ｎｇ／ｍｌ）が検出されたが、対照群ではレプチンは検出できなかった。移植群の血漿中のレプチンの値は、レプチン処置の停止後１４日目から実験の最後まで１８５．６２±８６．１１ｐｇ／ｍｌであった。対照群の血漿中にはレプチンは検出できなかった。

ドキシサイクリン処置は、異所的レプチン発現を停止する。移植群の３匹の動物を、ドキシサイクリンで処置し（１０日間かけて５０μｇ ｄｏｘ／ｋｇ／マウスの５回の腹腔内注射）、移植されたオルガノイドからのレプチン産生を停止した。移植片におけるドキシサイクリン処置の前、ＺｓＧｒｅｅｎ（商標）およびｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の両方の発現をモニターした。ドキシサイクリン処置に続いて、これらの動物の移植片には、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）発現は移植片で検出できず（図４Ｂｃ）、免疫組織化学によりレプチン発現は検出することができなかった（図４Ｄｃ）。非ドキシサイクリン処置済み動物の移植片には、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびレプチン発現は検出可能であった（図４Ａおよび図４Ｃ）。より重要なことには、レプチンも、ドキシサイクリン処置済み動物の水性体液中で測定可能ではなかった（ｎ＝３）。

実験データから、遺伝子改変膵島オルガノイドがタンパク質／ペプチドのための産生部位として機能することができる証拠が提供される。

実験２：ＧＬＰ－１およびＧＬＰ－１類縁体、レプチン
ＤＰＰ４による分解に耐性があるＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１類縁体、ならびにＧＬＰ－１受容体、ＧＩＰ受容体およびグルカゴン受容体を含む他の受容体ならびにインクレチンと相互作用することができるリガンドは、発現することができ、遺伝子改変膵島オルガノイドから放出され得る。

前眼房、脳および腎臓被膜に移植（代謝移植およびレポータ移植の両方）された遺伝子改変膵島オルガノイドの効果を調査する。これらの移植された膵島オルガノイドは、ＧＬＰ－１またはレプチンのいずれかを分泌する。

ＧＬＰ－１は、典型的に膵島により有意な量で発現しないが、胃腸内でＬ細胞により発現される。注射、または経口で投与されたＧＬＰ－１、またはＧＬＰ－１受容体に対する合成リガンドは、ベータ細胞でのＧＬＰ－１受容体、ならびに中枢および胃のＧＬＰ－１受容体との相互作用を介して、体内でのグルコース制御に対する影響を有することができる。

局所的自己分泌フィードバックループを介して膵島内で直接的な、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１類縁体およびＧＬＰ－１受容体と相互作用することができる他のリガンドの放出が、インスリンの放出を活性化することができることを示した。

実験には、アデノウイルスの産生、偽膵島生成およびウイルス形質導入が含まれる。

方法
アデノウイルスの産生。アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターは、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）クローニングシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して調製される。ヒトＧＬＰ－１_{（７－３７）}の遺伝子配列は、ＣＭＶプロモータ下またはラットインスリンプロモータＲＩＰ１配列の下に配置され、それぞれ非細胞特異的発現をもたらすか、インスリン産生細胞での標的発現を確実にする。

ウイルス粒子定量を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５（商標）システム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）上、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）およびアデノウイルスコード配列に特異的なプライマを使用して、リアルタイムＰＣＲにより実行する。

偽膵島生成およびウイルス形質導入。偽膵島の生成のため、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（シグマ－アルドリッチ）を使用して３７℃で１０分間、酵素消化により、膵島を単一細胞まで分離する。自動セルカウンター（ＢＲＩＰｉｏ－Ｒａｄ）を使用して細胞を計数し、血清添加培養培地に１２５００個の細胞／ｍｌの密度で再懸濁する。ウェルあたり２００μｌの細胞懸濁液を使用して細胞懸濁液を超低接着９６ウェルプレート（パーキンエルマー）に分配する。プレートに分配する前に、細胞懸濁液１ｍｌあたり１×１０^６個のウイルス粒子を添加することにより、形質導入を実行する。メーカーの指示書にしたがって偽膵島を形成し、７日後に回収する。

計画された研究。グルコース恒常性に加えて、持続的な機能を示すレポータ膵島における機能を評価する。血糖値、ヘモグロビンＡ１ｃ、およびインスリン放出およびレベルを測定する。血糖値は、ＧＬＰ－１を分泌する膵島オルガノイドの移植片を受けた被験体において、そうではなかった被験体よりも低いことが示される。インスリン放出は、処置済みの動物で改善される。ＧＬＰ－１を分泌する移植された膵島オルガノイドは、糖尿病および肥満症の処置において使用される。

ＧＬＰ－１、ソマトスタチンおよびＧＩＰを含む、いくつかの異なるインクレチンを同時に発現する遺伝子改変膵島オルガノイドを、定義された割合で混合してから、異なる標的負荷でトランスフェクトされた異なる表現型の膵島細胞の再集合を可能にすることにより調製する。標的負荷に関連する所望の時間－プロファイルに応じて、食餌後（遺伝子改変ベータ細胞表現型における標的負荷）、絶食中（アルファ細胞表現型における標的負荷）の優先的な放出および基底放出を示す。

遺伝子改変膵島オルガノイドを脳に移植して、ＧＬＰ－１およびレプチンを含むポリペプチドの局所放出を示す。移植片は、脳の硬膜のすぐ外側または／および内部のいずれかに配置される。

結果
ＧＬＰ－１を分泌する移植された膵島オルガノイドを、糖尿病、肥満症、代謝症候群ならびにパーキンソン病などの神経変性疾患の処置で使用する。移植された膵島オルガノイドが、移植後、血管新生および神経支配されるようになり、ＧＬＰ－１を分泌するようになることが示される。

レプチンを分泌する脳移植膵島オルガノイドを、肥満症、高トリグリセリド血症、脂肪異栄養症（ベラルディネリ－セイプ症候群、ローレンス症候群、およびバラケル－ジーモンス症候群）の処置で使用する。

脳に移植されたレプチン分泌膵島オルガノイドの場合、実施例１と同様の測定を実行する。移植された膵島オルガノイドが、血管新生および神経支配されるようになり、レプチンを分泌するようになることが示される。さらに、この分泌が、血糖、およびインスリンレベルを低下することを含む、ｏｂ／ｏｂマウスにおける代謝表現型を改善する。

参考文献

Claims (47)

1. 組換え発現ベクターを含む、遺伝子改変膵島オルガノイドであって、前記組換え発現ベクターが、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列、および（ｂ）前記核酸配列に動作可能に結合した適切な制御配列を含む、遺伝子改変膵島オルガノイド。
2. 前記組換え発現ベクターが、前記ポリペプチドを内因的に発現しない膵島オルガノイド細胞に存在する、請求項１に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
3. 前記ポリペプチドが、膵島細胞で内因的に発現されない、請求項１または２に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
4. 前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチド、またはその類縁体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
5. 前記治療用ポリペプチドが、ポリペプチドホルモンおよび酵素補充タンパク質からなる群より選択される、請求項４に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
6. 前記治療用ポリペプチドが、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、プロラクチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、レプチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、および成長ホルモン（ＧＨ）、またはそれらの類縁体からなる群より選択されるポリペプチドホルモンを含む、請求項５に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
7. 前記治療用ポリペプチドが、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、レニン、ガストリン、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、バソプレッシン（ＡＤＨ）、オキシトシン（ＯＸＹ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、カルシトニン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、アンギオテンシン、アミリン、および副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、またはそれらの類縁体からなる群より選択されるポリペプチドホルモンを含む、請求項５に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
8. 前記治療用ポリペプチドが、酵素補充タンパク質を含み、前記酵素補充タンパク質が、第ＶＩＩ因子（エプタコグアルファ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子（カトリデカコグ）、フォン・ヴィレブランド因子、タリグルセラーゼアルファ、アガルシダーゼアルファもしくはベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、アルグルコシダーゼアルファ、ガルスルファーゼ、ドルナーゼアルファ、ラロニダーゼ、コネスタットアルファ（Ｃ１エステラーゼ阻害剤）、ペグロティカーゼアルファ－１－プロテイナーゼ阻害剤、アスホターゼアルファ（ストレンジック）、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼアルファ、バリアーゼ（valiase）、セベリパーゼアルファ（selbelipase alfa）、エポエチンシータ（epoetin teta）（エポラチオ（Eporatio））、ベータ（ネオレコルモン（NeoRecormon））、ゼータ（レタクリット（Retacrit））、ダルベポエチンアルファ（アラネスプ（Aranesp））、ルスパテルセプト（レブロジル（Reblozyl））、フィルグラスチム、レノグラスチム、およびフォン・ヴィレブランド因子－切断プロテアーゼ、またはそれらの類縁体からなる群より選択される、請求項５に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
9. 前記治療用ポリペプチドが、エンケファリン、エンドルフィン、サブスタンスＰ、ニューロテンシン、ニューロペプチド－Ｙ、ボンベシン、脳由来神経栄養因子（neutrophic factor）（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン（neuotrophin）－３、ニューロトロフィン－４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、コリン作働性分化因子、カルジオトロフィン－１、オンコスタチンＭ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｎｅｕ分化因子、ヘレグリン、アセチルコリン受容体誘導活性、グリア細胞増殖因子（ＧＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アルテミン、ニュールツリン、ペルセフィン、骨形成タンパク質－１（ＯＰ－１）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長分化因子、エフリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、セリンプロテアーゼ阻害剤、プロテアーゼネキシン－１、誘導タンパク質のヘッジホッグファミリー、アグリン、ラミニン２、ニューロイムノフィリン、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、活性依存性神経保護タンパク質（ＡＤＮＰ）、ニューリチン（neuritin）（活性誘導神経栄養因子）、血管新生増殖因子、脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、ペプチド－６、ダブネチド（davunetide）（ＡＤＮＰ由来）、およびセレブロリシンからなる群より選択される神経栄養因子を含む、請求項５に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
10. 前記組換え発現ベクターが、ウイルスベクターを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
11. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ベクター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、請求項１０に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
12. 前記発現ベクターが、非ウイルスベクターを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
13. 前記非ウイルスベクターが、遺伝子編集を含む、請求項１２に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
14. 前記遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを含む、請求項１３に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
15. 前記適切な制御配列が、膵臓組織特異的であり、ミッドカイン（ＭＫ）プロモータ、シクロオキシゲナーゼ－２（Ｃｏｘ２）Ｍプロモータ、Ｃｏｘ ２Ｌプロモータ、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）プロモータ、カベオリン１プロモータ、ｆｍｓ様受容体チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ－１）プロモータ、スロッピーペアード１（sloppy paired1）（ＳＬＰ－１）プロモータ、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）プロモータ、上皮性糖タンパク質２（ＥＧＰ－２）プロモータ、インスリンプロモータ、およびグルカゴンプロモータからなる群より選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
16. 組換え発現ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターを含み、前記インスリンプロモータが、ＲＩＰ１またはＲＩＰ２である、請求項１５に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
17. 前記適切な制御配列が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、チキンβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、哺乳動物伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）プロモータ、およびテトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）－ｔｉｇｈｔプロモータからなる群より選択される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド。
18. 請求項１から１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変膵島オルガノイドおよびシルクマトリックスを含む、組成物。
19. 前記シルクが、スパイダーシルクである、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記シルクが、細胞結合モチーフで官能化されている、請求項１８または１９に記載の組成物。
21. 障害を処置するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変膵島オルガノイド、または請求項１８から２０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
22. 前記障害が、低プロラクチン血症、低カルシウム血症、プラダー－ウィリー症候群、肥満症、高トリグリセリド血症、脂肪異栄養症（ベラルディネリ－セイプ症候群、ローレンス症候群、およびバラケル－ジーモンス症候群）、血友病、ゴーシェ病、ファブリー病、ポンペ病、ムコ多糖症、ウォルマン病、遺伝性血管性浮腫、慢性好中球減少症、腎性貧血、サラセミアベータ、血友病ＡおよびＢを含む血友病様疾患、フォン・ヴィレブランド病、第ＸＩＩＩ因子欠乏症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、フェニルケトン尿症、肺気腫、低ホスファターゼ症、嚢胞性線維症、抑鬱症、疼痛、神経伝達関連疾患、パーキンソン病、ＡＤＤ、不安症、記憶喪失、関節リウマチ（ＲＡ）、クリオピン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、およびアルツハイマー病、糖尿病、代謝症候群、精神分裂病、自閉症、発作関連疾患、摂食障害、ストレス障害、胃腸疾患、白血病、癌、循環器疾患、ライム病、熱帯病、脳癌、壊死性腸炎、ゾリンジャー－エリソン症候群、消化管潰瘍および先天性微絨毛萎縮症、脊椎すべり症、後側方関節固定術、骨粗鬆症、脊椎固定術、骨折治癒、免疫異常、自己免疫異常、循環器疾患、血液凝固障害、アルポート症候群、表皮水疱症、１型および２型糖尿病、重度インスリン抵抗症候群、クローン病、関節炎、若年性慢性関節炎、嚢胞性線維症、眼の新生血管形成、成長ホルモン欠乏症、創傷治癒、組織修復、好中球減少症、神経線維腫、糖尿病性ニューロパチー、神経変性および神経筋疾患、ハンチントン病、慢性炎症性疾患、虚血性および出血性脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、認知症、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、運動失調症、筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、脳卒中、脊髄損傷、シャルコー－マリー－トゥース病、ならびに進行性核上性麻痺からなる群より選択される、請求項２１に記載の使用。
23. 障害を有する被験体に請求項１から１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変膵島オルガノイドまたは請求項１８から２０のいずれか一項に記載の組成物を、前記障害を処置するのに有効量で移植するステップを含む、障害を処置するための方法。
24. 前記遺伝子改変膵島オルガノイドまたは組成物が、それを必要とする被験体の眼、脳下垂体、膵臓、小腸、胃、脳、腎臓、副甲状腺、十二指腸、甲状腺、肝臓、心臓、卵巣、睾丸、脂肪、および／または皮膚に移植される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記障害が、低プロラクチン血症、低カルシウム血症、プラダー－ウィリー症候群、肥満症、高トリグリセリド血症、脂肪異栄養症（ベラルディネリ－セイプ症候群、ローレンス症候群、およびバラケル－ジーモンス症候群）、血友病、ゴーシェ病、ファブリー病、ポンペ病、ムコ多糖症、ウォルマン病、遺伝性血管性浮腫、慢性好中球減少症、腎性貧血、サラセミアベータ、血友病ＡおよびＢを含む血友病様疾患、フォン・ヴィレブランド病、第ＸＩＩＩ因子欠乏症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、フェニルケトン尿症、肺気腫、低ホスファターゼ症、嚢胞性線維症、抑鬱症、疼痛、神経伝達関連疾患、パーキンソン病、ＡＤＤ、不安症、記憶喪失、関節リウマチ（ＲＡ）、クリオピン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、およびアルツハイマー病、糖尿病、代謝症候群、精神分裂病、自閉症、発作関連疾患、摂食障害、ストレス障害、胃腸疾患、白血病、癌、循環器疾患、ライム病、熱帯病、脳癌、壊死性腸炎、ゾリンジャー－エリソン症候群、消化管潰瘍および先天性微絨毛萎縮症、脊椎すべり症、後側方関節固定術、骨粗鬆症、脊椎固定術、骨折治癒、免疫異常、自己免疫異常、循環器疾患、血液凝固障害、アルポート症候群、表皮水疱症、１型および２型糖尿病、重度インスリン抵抗症候群、クローン病、関節炎、若年性慢性関節炎、嚢胞性線維症、眼の新生血管形成、成長ホルモン欠乏症、創傷治癒、組織修復、好中球減少症、神経線維腫、糖尿病性ニューロパチー、神経変性および神経筋疾患、ハンチントン病、慢性炎症性疾患、虚血性および出血性脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、認知症、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、運動失調症、筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、脳卒中、脊髄損傷、シャルコー－マリー－トゥース病、ならびに進行性核上性麻痺からなる群より選択される、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 前記核酸配列が、表１の左手の列に列記されているポリペプチドをコードし、前記被験体が、前記ポリペプチドと同じ行で表１の右手側の列に列記されている障害を有する、請求項１８から２５のいずれか一項に記載の使用または方法。
27. 前記ポリペプチドが、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含み、前記障害が、甲状腺機能低下症を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
28. 前記ポリペプチドが、レプチンを含み、前記障害が、肥満症、高トリグリセリド血症、脂肪異栄養症、ベラルディネリ－セイプ症候群、ローレンス症候群、およびバラケル－ジーモンス症候群を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
29. 前記ポリペプチドが、成長ホルモンを含み、前記障害が、成長ホルモン欠乏症、ターナー症候群、慢性腎不全、プラダー－ウィリー症候群、子宮内胎児発育遅延、または特発性低身長を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
30. 前記ポリペプチドが、アルグルセラーゼ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、および／またはタリグルセラーゼアルファを含み、前記障害が、ゴーシェ病を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
31. 前記ポリペプチドが、アガルシダーゼアルファおよび／またはベータを含み、前記障害が、ファブリー病を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
32. 前記ポリペプチドが、アルグルコシダーゼアルファを含み、前記障害が、ポンペ病を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
33. 前記ポリペプチドが、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼアルファ、および／またはガルスルファーゼを含み、前記障害が、ムコ多糖症を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
34. 前記ポリペプチドが、コネスタットアルファを含み、前記障害が、遺伝性血管性浮腫を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
35. 前記ポリペプチドが、第ＶＩＩＩ因子および／または第ＩＸ因子を含み、前記障害が、血友病様疾患を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
36. 前記ポリペプチドが、アルファ－１プロテイナーゼ阻害剤を含み、前記障害が、肺気腫を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
37. 前記ポリペプチドが、ドルナーゼアルファを含み、前記障害が、嚢胞性線維症を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
38. 前記ポリペプチドが、可溶性レプチン受容体（ｓＬＲ）を含み、前記障害が、肥満症、高トリグリセリド血症、糖尿病、または代謝症候群を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
39. 前記ポリペプチドが、ＩＬ－１受容体アンタゴニストまたはアナキンラを含み、前記障害が、関節リウマチ（ＲＡ）、自己炎症性障害、全身型若年性特発性関節炎、通風、またはクリオピン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
40. 前記ポリペプチドが、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、グルコース依存性インスリン分泌刺激（insulinotrophic）ペプチド（ＧＩＰ）、オキシントモジュリン、ＧＬＰ－１受容体結合ポリペプチド、ＧＩＰ受容体結合ポリペプチドまたはグルカゴン受容体結合ポリペプチドを含み、前記障害が、糖尿病、肥満症、または代謝症候群を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
41. 前記ポリペプチドが、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、デュラグルチド、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、セマグルチド、グルコース依存性インスリン分泌刺激（insulinotrophic）ペプチド（ＧＩＰ）、オキシントモジュリン、ＧＬＰ－１受容体結合ポリペプチド、ＧＩＰ受容体結合ポリペプチドまたはグルカゴン受容体結合ポリペプチドを含み、前記障害が、パーキンソン病を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
42. 前記組換え発現ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターを含む、請求項１８から４１のいずれか一項に記載の使用または方法。
43. 前記適切な制御配列が、ＣＭＶプロモータまたは前記インスリン特異的プロモータＲＩＰ１もしくはＲＩＰ２を含む、請求項１８から４２のいずれか一項に記載の使用または方法。
44. 前記遺伝子改変膵島オルガノイドが、被験体の前記前眼房または前記脳へ外科的に移植される、請求項１８から４３のいずれか一項に記載の使用または方法。
45. 膵島細胞を含む遺伝子改変膵島オルガノイドを産生するプロセスであって：
    （ａ）組換え発現ベクターを膵島細胞に導入するステップであって、前記組換え発現ベクターが、
    （ｉ）膵島細胞で内因的に発現しないポリペプチドをコードする核酸配列、および
    （ｉｉ）前記核酸配列に動作可能に結合した適切な制御配列
    を含む、ステップ；ならびに
    （ｂ）前記組換え発現ベクターを含む前記膵島細胞をインビトロで培養して膵島細胞を含む前記遺伝子改変膵島オルガノイドを形成するステップ
    を含む、プロセス。
46. 前記導入するステップ（ａ）が、さらに：
    （ａ１）水不溶性マクロ構造に集合することができ、任意選択でさらにラミニンを含む絹タンパク質を用い、前記組換え発現ベクターを含む前記膵島細胞の水性混合物を調製するステップ；
    （ａ２）前記組換え発現ベクターを含む前記膵島細胞の存在下で前記絹タンパク質が水不溶性マクロ構造に集合するのを可能にし、それによって、前記組換え発現ベクターを含む前記膵島細胞の３Ｄシルクマトリックスを形成するステップ
    を含み、
    前記培養するステップ（ｂ）が、前記組換え発現ベクターを含む前記膵島細胞を前記シルクマトリックス内のインビトロで培養し、膵島細胞を含む前記遺伝子改変膵島オルガノイドを形成するステップを含む、
    請求項４５に記載のプロセス。
47. さらに：
    （ｃ）膵島細胞を含む前記遺伝子改変膵島オルガノイドを、絹タンパク質の水不溶性マクロ構造からなり、任意選択でさらにラミニンを含む３Ｄシルクマトリックス上に配置するステップ；ならびに
    （ｄ）膵島細胞を含む前記遺伝子改変膵島オルガノイドを前記３Ｄシルクマトリックスに付着させることを可能にするステップ
    を含む、請求項４５から４６のいずれか一項に記載のプロセス。

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