JP2024506908A - インビボ療法のためのペイロードを含むｌｎｐ組成物 - Google Patents
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Abstract
本開示は、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物によりインビボで細胞または組織を改変する方法を扱う。本開示のＬＮＰ組成物は、細胞もしくは組織に関連するパラメータを改変するか、または細胞もしくは組織に関連する構成成分を改変することができる。さらに、疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象を処置する方法が開示され、該方法は、対象に、ペイロードを含む有効量のＬＮＰ組成物を投与することを含む。また、ペイロードを含むＬＮＰ組成物及びその作製方法も本明細書に開示される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本願は、２０２１年２月１２日に出願された米国仮出願６３／１４９００６、及び２０２１年５月２６日に出願された米国仮出願６３／１９３，５６５に対する優先権を主張する。前述の出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
本願は、２０２１年２月１２日に出願された米国仮出願６３／１４９００６、及び２０２１年５月２６日に出願された米国仮出願６３／１９３，５６５に対する優先権を主張する。前述の出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２２年２月８日に作成された該ＡＳＣＩＩの写しは、Ｍ２１８０－７０１０ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、５５，７０５バイトのサイズである。
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２２年２月８日に作成された該ＡＳＣＩＩの写しは、Ｍ２１８０－７０１０ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、５５，７０５バイトのサイズである。
細胞のインビボ操作、例えば、改変は、継続する医療課題に相当する。例えば、ｍＲＮＡ等の核酸分子の送達または他のペイロードの送達のために、インビボで細胞を改変することは、インビボで目的とする細胞を特異的に標的としてそれらを改変することの困難を含めて、多くの理由で困難を伴う。故に、インビボで細胞を改変するために所望の細胞を標的とし、ペイロードを送達することができる方法及び組成物を開発する必要性が存在する。特に、幹細胞または前駆細胞を改変し、それによってインビボで特定の系列内の多くの細胞種を改変することは極めて有益であろう。
本開示は、とりわけ、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物によりインビボで細胞、例えば、幹細胞または前駆細胞を改変する方法を提供する。また、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物によりインビボで組織を改変する方法も本明細書に開示される。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、細胞もしくは組織に関連するパラメータを改変し、及び／または細胞もしくは組織に関連する構成成分を改変する。さらに、疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象を処置する方法が本明細書に開示され、該方法は、対象に、ペイロードを含む有効量のＬＮＰ組成物を投与することを含む。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、対象において細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）の改変、例えば、細胞に関連する構成成分及び／または細胞に関連するパラメータの改変をもたらす。ある実施形態では、細胞へのペイロードの送達は、細胞の遺伝子型、表現型、及び／または機能に対する変化をもたらす。また、例えば、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）または組織のインビボ改変において使用するための、ペイロードを含むＬＮＰ組成物、及びその作製方法も本明細書に開示される。一実施形態では、本開示のＬＮＰは、追加の標的化部分を含まず、例えば、それは追加の標的化部分なしに（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）の幹細胞または前駆細胞（例えば、ＨＳＰＣ）にトランスフェクトする。一実施形態では、細胞は、骨髄系共通前駆細胞である。別の実施形態では、細胞は、リンパ系共通前駆細胞である。なおも別の実施形態では、細胞は、多能性幹細胞である。なおも別の実施形態では、細胞は、多能性前駆細胞である。ある実施形態では、細胞は、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。本開示の追加の態様及び実施形態が、下記にさらに詳細に記載される。
細胞または組織のインビボ改変方法及び関連する方法
ある態様では、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）を改変する、例えば、細胞に関連するパラメータまたは細胞に関連する構成成分を改変する方法が本明細書に開示され、該方法は、細胞を、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物と接触させることを含み、それによって細胞を改変する。ある実施形態では、細胞とＬＮＰとの接触（例えば、ＬＮＰ組成物の投与）は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、細胞とＬＮＰとの接触（例えば、ＬＮＰ組成物の投与）は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連する構成成分を改変する。
ある態様では、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）を改変する、例えば、細胞に関連するパラメータまたは細胞に関連する構成成分を改変する方法が本明細書に開示され、該方法は、細胞を、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物と接触させることを含み、それによって細胞を改変する。ある実施形態では、細胞とＬＮＰとの接触（例えば、ＬＮＰ組成物の投与）は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、細胞とＬＮＰとの接触（例えば、ＬＮＰ組成物の投与）は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連する構成成分を改変する。
別の態様では、組織を改変する、例えば、組織に関連するパラメータまたは組織に関連する構成成分を改変する方法が本明細書に開示され、該方法は、細胞を、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物と接触させることを含む。ある実施形態では、細胞とＬＮＰとの接触（例えば、ＬＮＰ組成物の投与）は、例えば、本明細書に記載されるような、組織に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、細胞とＬＮＰとの接触（例えば、ＬＮＰ組成物の投与）は、例えば、本明細書に記載されるような、組織に関連する構成成分を改変する。
なおも別の態様では、疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象を処置する方法が本明細書で提供され、該方法は、対象に、ペイロードを含む有効量のＬＮＰ組成物を投与することを含み、該ＬＮＰ組成物が、対象において細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）の改変、例えば、細胞に関連する構成成分または細胞に関連するパラメータの改変をもたらし、それによって対象を処置する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連する構成成分を改変する。
ある態様では、本開示は、疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象の症状を改善する方法を提供し、該方法は、対象に、ペイロードを含む有効量のＬＮＰ組成物を投与することを含み、該ＬＮＰ組成物が、対象において細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）の改変、例えば、細胞に関連する構成成分または細胞に関連するパラメータの改変をもたらし、それによって対象の症状を改善する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連する構成成分を改変する。
なおも別の態様では、ペイロードを含むＬＮＰ組成物を、例えば、対象において、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）または組織に送達する方法が本明細書で提供され、該方法は、細胞または組織をＬＮＰ組成物と接触させることを含む。
ある態様では、本開示は、例えば、対象において、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）または組織を接触させる方法を提供し、該方法は、細胞または組織を、ペイロードを含むＬＮＰ組成物と接触させることを含む。ある実施形態では、ＬＮＰは、追加の標的化部分を含まない。
別の態様では、幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、多能性前駆細胞、または多能性幹細胞のパラメータまたは構成成分に影響を及ぼすペイロードを含むＬＮＰ組成物が本明細書で提供される。ある実施形態では、ＬＮＰは、追加の標的化部分を含まず、例えば、それは追加の標的化部分なしに（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）の幹細胞または前駆細胞（例えば、ＨＳＰＣ）にトランスフェクトする。ある実施形態では、前駆細胞は、ＨＳＰＣ、例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣである。好ましい実施形態では、ペイロードは、対象において異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、または免疫細胞障害に変化を生じさせる。
ある実施形態では、ペイロードは、ＨＳＰＣ、例えば、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、または多能性造血幹細胞もしくは前駆細胞の遺伝子型パラメータ、表現型パラメータ、及び／または機能パラメータに影響を及ぼす（例えば、改変する）。ある実施形態では、ペイロードは、ヘモグロビン分子の産生、構造、及び／または活性を改変し、それによって異常ヘモグロビン症に変化を生じさせる。ある実施形態では、ペイロードは、凝固因子の産生、構造、及び／または活性を改変し、それによって凝固因子障害に変化を生じさせる。ある実施形態では、ペイロードは、血液細胞障害に関連する分子の産生、構造、及び／または活性を改変し、それによって血液細胞障害に変化を生じさせる。ある実施形態では、ペイロードは、免疫細胞障害に関連する分子の産生、構造、及び／または活性を改変し、それによって免疫細胞障害に変化を生じさせる。
一実施形態では、ペイロードは、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。ある実施形態では、ペイロードは、遺伝子モジュレーター、後成的モジュレーター、またはＲＮＡモジュレーターを含む。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、ＤＮＡ分子における核酸配列を改変する、例えば、挿入、欠失、変異（例えば、ミスセンス変異、サイレント変異、またはナンセンス変異）、重複、もしくは逆位、またはそれらの任意の組み合わせを導入する、システムを含む。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、ＤＮＡ塩基エディター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、メガヌクレアーゼシステム、もしくはトランスポザーゼシステム、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、クロマチン構造を改変する、ＤＮＡをメチル化する、及び／またはヒストンを修飾する分子を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＲＮＡ分子の発現及び／または活性、安定性または区画化を変化させる分子を含む。
好ましい実施形態では、ＬＮＰ組成物は、式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含むアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式（ＶＩ－Ｄ）の化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
別の態様では、本明細書に記載の方法に従って作製された改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ（例えば、改変ＨＳＣまたは改変ＨＰＣ）が本明細書で提供される。
なおも別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法に従って作製された改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ（例えば、改変ＨＳＣまたは改変ＨＰＣ）の凍結調製物を提供する。
ある態様では、疾患または障害、例えば、本明細書に記載の疾患または障害を有する対象の処置において使用するための、本明細書に記載の改変細胞を含む組成物、または本明細書に記載の改変細胞の凍結調製物が本明細書で提供される。
ある態様では、疾患または障害、例えば、本明細書に記載の疾患または障害を有する対象の症状の改善において使用するための、本明細書に記載の改変細胞を含む組成物、または本明細書に記載の改変細胞の凍結調製物が本明細書で提供される。
ある実施形態では、改変細胞は、対象にとって自家である。ある実施形態では、改変細胞は、対象にとって同種異系である。
なおも別の態様では、本開示は、（ａ）幹細胞または前駆細胞、例えば、ＨＳＰＣの集団（例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、またはそれらの組み合わせ）と、（ｂ）例えば、本明細書に記載されるような、幹細胞または前駆細胞、例えば、幹細胞もしくは前駆細胞に関連する構成成分または幹細胞もしくは前駆細胞に関連するパラメータを改変することができるペイロードを含むＬＮＰ組成物とを含む、組成物または反応混合物を提供する。ある実施形態では、ＬＮＰは、追加の標的化部分を含まない。
ある態様では、改変細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ（例えば、改変ＨＳＣまたは改変ＨＰＣ）と、例えば、本明細書に記載されるような、該細胞、例えば、該細胞に関連する構成成分または該細胞に関連するパラメータを改変することができるペイロードを含むＬＮＰとを含む、薬学的組成物が本明細書で提供される。ある実施形態では、ＬＮＰは、追加の標的化部分を含まない。
別の態様では、改変細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ（例えば、改変ＨＳＣまたは改変ＨＰＣ）と、例えば、本明細書に記載されるような、該細胞、例えば、該細胞に関連する構成成分または該細胞に関連するパラメータを改変することができるペイロードを含むＬＮＰとを含む、キットが本明細書で提供される。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与または送達は、細胞または組織、例えば、細胞もしくは組織に関連する構成成分、または細胞もしくは組織に関連するパラメータの改変をもたらす。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与または送達は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与または送達は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連する構成成分を改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、例えば、本明細書に記載されるような、例えば、細胞に関連するパラメータまたは構成成分を改変することによって、細胞の遺伝子型、表現型、及び／または機能を改変するペイロードを含む。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、追加の標的化部分を含まず、例えば、それは追加の標的化部分なしに（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）の幹細胞または前駆細胞（例えば、ＨＳＰＣ）にトランスフェクトする。
ある実施形態では、細胞もしくは組織に関連する構成成分は、（１）細胞に関連する核酸もしくはその断片、例えば、ＤＮＡ（例えば、エクソン、イントロン、遺伝子間、テロメア、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、リプレッサー、コーディング、またはノンコーディング）もしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））、（２）細胞に関連するペプチドもしくはタンパク質またはその断片、（３）細胞に関連する脂質成分もしくはその断片、またはそれらの組み合わせを含む。ある実施形態では、構成成分は、（１）細胞に関連する核酸もしくはその断片、例えば、ＤＮＡ（例えば、エクソン、イントロン、遺伝子間、テロメア、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、リプレッサー、コーディング、またはノンコーディング）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））を含む。ある実施形態では、構成成分は、ＤＮＡを含む。ある実施形態では、構成成分は、ＲＮＡを含む。ある実施形態では、構成成分は、（２）細胞に関連するペプチドもしくはタンパク質またはその断片を含む。ある実施形態では、構成成分は、（３）細胞に関連する脂質成分またはその断片を含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、構成成分は、細胞にとって内因性である。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、構成成分は、細胞にとって外因性であり、例えば、当該技術分野で既知の方法、例えば、エレクトロポレーション、形質転換、ベクターベースの送達、ウイルス送達、または脂質ベースの送達によって細胞に導入されたものである。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、細胞もしくは組織に関連するパラメータは、遺伝子型パラメータ、表現型パラメータ、機能パラメータ、発現パラメータ、シグナル伝達パラメータ、またはそれらの組み合わせを含む。ある実施形態では、細胞もしくは組織に関連するパラメータは、遺伝子型パラメータ、例えば、細胞の遺伝子型を含む。ある実施形態では、細胞もしくは組織に関連するパラメータは、表現型パラメータ、例えば、細胞の表現型を含む。別の実施形態では、細胞もしくは組織に関連するパラメータは、機能パラメータ、例えば、細胞の機能（例えば、タンパク質を産生する能力または分裂する能力）を含む。ある実施形態では、細胞もしくは組織に関連するパラメータは、発現パラメータを含む。ある実施形態では、細胞もしくは組織に関連するパラメータは、シグナル伝達パラメータを含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、遺伝子型パラメータは、細胞の遺伝子型を含む。ある実施形態では、遺伝子型は、遺伝子もしくはアレルの存在もしくは不在、または遺伝子もしくはアレルの改変、例えば、遺伝子もしくはアレルにおける生殖細胞系列変異もしくは体細胞変異または遺伝子多型を含む。ある実施形態では、遺伝子型は、細胞の表現型、例えば、本明細書に記載の表現型に関連する。ある実施形態では、遺伝子型は、細胞の機能、例えば、本明細書に記載の機能に関連する。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、表現型パラメータは、細胞の表現型を含む。ある実施形態では、表現型は、細胞の表面上の分子、例えば、細胞表面タンパク質、脂質、または接着分子の発現及び／または活性を含む。ある実施形態では、表現型は、細胞の遺伝子型、例えば、本明細書に記載の遺伝子型に関連する。ある実施形態では、表現型は、細胞の機能、例えば、本明細書に記載の機能に関連する。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、機能パラメータは、細胞の機能を含む。ある実施形態では、機能は、細胞がタンパク質またはＲＮＡを産生する能力を含む。ある実施形態では、機能は、細胞が増殖する、分裂する、及び／または複製する能力を含む。ある実施形態では、機能は、細胞が、例えば、系列内の１つまたは複数の細胞種に分化する能力を含む。ある実施形態では、機能は、細胞の遺伝子型、例えば、本明細書に記載の遺伝子型に関連する。ある実施形態では、機能は、細胞の表現型、例えば、本明細書に記載の表現型に関連する。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、発現パラメータは、以下：（ａ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベル、（ｂ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性、（ｃ）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾、（ｄ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）折り畳み、及び／または（ｅ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性、のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む。ある実施形態では、発現パラメータは、（ａ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベルを含む。ある実施形態では、発現パラメータは、（ｂ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性を含む。ある実施形態では、発現パラメータは、（ｃ）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾を含む。ある実施形態では、発現パラメータは、（ｄ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）折り畳みを含む。ある実施形態では、発現パラメータは、（ｅ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性を含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、以下：（１）シグナル伝達経路、例えば、細胞シグナル伝達経路の調節、（２）細胞運命の調節、（３）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベルの調節、（４）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性の調節、及び／または（５）例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性の調節、のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む。ある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、（１）シグナル伝達経路、例えば、細胞シグナル伝達経路の調節を含む。ある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、（２）細胞運命の調節を含む。ある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、（３）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベルの調節を含む。ある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、（４）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性の調節を含む。ある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、（５）例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性の調節を含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、細胞は、ＬＮＰ組成物とインビトロ、インビボ、またはエクスビボで接触させられる。ある実施形態では、細胞は、ＬＮＰ製剤とインビトロで接触させられる。ある実施形態では、細胞は、ＬＮＰ製剤とエクスビボで接触させられる。ある実施形態では、細胞は、ＬＮＰ製剤とインビボで接触させられる。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物により改変された細胞または組織、例えば、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ（例えば、改変ＨＳＣまたは改変ＨＰＣ）は、本明細書に開示される特性を有する。ある実施形態では、ＬＮＰは、追加の標的化部分を含まず、例えば、それは追加の標的化部分なしに（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）の幹細胞または前駆細胞（例えば、ＨＳＰＣ）にトランスフェクトする。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、以下の機能特性：（ｉ）自己複製する能力、（ｉｉ）無限の増殖能、（ｉｉｉ）休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、（ｉｖ）任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、（ｖ）例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、及び／または（ｖｉ）コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する。ある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、（ｉ）自己複製する能力を有する。ある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、（ｉｉ）無限の増殖能を有する。ある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、（ｉｉｉ）休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力を有する。ある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、（ｉｖ）任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力を有する。ある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、（ｖ）例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力を有する。ある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、（ｖｉ）コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力を有する。
ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、例えば、実施例２に記載されるように、例えば、エクスビボコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにおいて測定したとき、ＣＦＵを形成する能力を有する。ある実施形態では、ＣＦＵ能力は、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＣと比較される。
ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、例えば、実施例２に記載されるように、例えば、エクスビボコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにおいて測定したとき、または例えば、実施例３に記載されるように（例えば、図３Ｄ）、系列追跡実験において測定したとき、骨髄系細胞に分化する能力を有する。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣが骨髄系細胞に分化する能力は、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＣと比較される。
ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、例えば、実施例３に記載されるように（例えば、図３Ｃ）、例えば、系列追跡実験において測定したとき、リンパ系細胞に分化する能力を有する。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣがリンパ系細胞に分化する能力は、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較される。
ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、例えば、実施例３に記載されるように（例えば、図３Ａ～３Ｂ）、赤血球細胞または血小板に分化する能力を有する。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣが赤血球細胞または血小板に分化する能力は、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＣと比較される。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、インビボで赤血球細胞または血小板に分化する。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、インビトロで赤血球細胞または血小板に分化する。
ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、例えば、インビボで、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、もしくは３６５日間、またはそれよりも長く存続する。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣのインビボでの存続は、例えば、実施例３に示されるように、１つまたは複数の細胞、例えば、骨髄系列の細胞及び／またはリンパ系列の細胞への分化をもたらす。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ）は、ヒト細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉｉ）ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、（ｖ）ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、（ｖｉｉ）原始前駆細胞、例えば、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、巨核球・赤芽球前駆細胞（ＭＥＰ）、顆粒球・マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）、及び／またはリンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）に関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｉｉ）ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｖ）ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、または全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である。
ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか１つを発現する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか２つを発現する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか３つを発現する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）の全てを発現する。
ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の両方の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、該ヒトＨＳＰＣは、細胞系列陰性ＨＳＰＣである。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ）は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉｉ）ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の検出可能な発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の細胞表面発現、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、（ｖ）ＣＤ１２３の発現、例えば、ＣＤ１２３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１２３の細胞表面発現、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する。
ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｉｉ）ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の検出可能な発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖ）ＣＤ１２３の発現、例えば、ＣＤ１２３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１２３の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、または全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である。
ある実施形態では、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか１つを発現する。ある実施形態では、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか２つを発現する。ある実施形態では、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか３つを発現する。ある実施形態では、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）の全てを発現する。
ある実施形態では、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の両方の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、該ＮＨＰ ＨＳＰＣは、細胞系列陰性ＨＳＰＣである。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ）は、改変マウス細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ１５０の発現、例えば、ＣＤ１５０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１５０の細胞表面発現、（ｉｉｉ）Ｓｃａ－１の発現、例えば、Ｓｃａ－１の検出可能な発現、例えば、Ｓｃａ－１の細胞表面発現、（ｉｖ）ｃ－ｋｉｔの発現、例えば、ｃ－ＫＩＴの検出可能な発現、例えば、ｃ－ｋｉｔの細胞表面発現、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、ＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｖｉｉｉ）（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、または全てを有する。
ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｉｉ）ＣＤ１５０の発現、例えば、ＣＤ１５０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１５０の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｉｉｉ）Ｓｃａ－１の発現、例えば、Ｓｃａ－１の検出可能な発現、例えば、Ｓｃａ－１の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｉｖ）ｃ－ｋｉｔの発現、例えば、ｃ－ＫＩＴの検出可能な発現、例えば、ｃ－ｋｉｔの細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、ＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｖｉｉｉ）（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちの１つ、２つ、または全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である。
ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｉｖ）のうちのいずれか１つを発現する。ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｉｖ）のうちのいずれか２つを発現する。ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｉｖ）のうちのいずれか３つを発現する。ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｉｖ）の全てを発現する。
ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか２つの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）の全ての検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、該マウスＨＳＰＣは、細胞系列陰性ＨＳＰＣである。
ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、ｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１を発現し、例えば、ｃ－ＫＩＴ＋及びＳｃａ－１＋ ＨＳＣである。ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、ｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１を発現し、例えば、ｃ－ＫＩＴ＋及びＳｃａ－１＋ ＨＳＣであり、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ、２つ、または全ての検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ）は、改変ヒト細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）ＮＨＰ ＣＤ４５のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉ）ＮＨＰ ＣＤ３４のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉｉ）ＮＨＰ ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｖ）ＮＨＰ ＣＤ９０のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖ）ＮＨＰ ＣＤ１２３のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖｉ）ＮＨＰ ＣＤ４５ＲＡのヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＮＨＰ ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＮＨＰ ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカー、またはそのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ）は、改変ヒト細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）マウスＣＤ３４のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉ）マウスＣＤ１５０のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉｉ）マウスＳｃａ－１のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｖ）マウスｃ－ｋｉｔのヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、マウスＣＭＰ及び／またはＣＬＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、マウスＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、マウスＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｖｉｉｉ）（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカー、またはそのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、または全てを有する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、マウスｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１のヒトオルソログまたは同等物を発現する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、マウスｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１のヒトオルソログまたは同等物を発現し、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ、２つ、または全ての検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。
インビボ改変に向けた造血幹細胞・前駆細胞
ある実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれも、幹細胞または前駆細胞、例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）のインビボ改変を含む。ある実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれも、幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えば、造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）のインビボ遺伝子編集を含む。ある実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣの集団（例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣの集団、またはそれらの組み合わせ）を含む。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、胚性幹細胞もしくは前駆細胞に由来するＨＳＰＣまたは人工多能性幹細胞もしくは前駆細胞に由来するＨＳＰＣを含む。
ある実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれも、幹細胞または前駆細胞、例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）のインビボ改変を含む。ある実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれも、幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えば、造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）のインビボ遺伝子編集を含む。ある実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣの集団（例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣの集団、またはそれらの組み合わせ）を含む。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、胚性幹細胞もしくは前駆細胞に由来するＨＳＰＣまたは人工多能性幹細胞もしくは前駆細胞に由来するＨＳＰＣを含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、細胞は、ＨＳＰＣ、例えば、多能性ＨＳＣまたは多能性ＨＰＣである。本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、細胞は、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、多能性前駆細胞、または多能性幹細胞である。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＨＳＰＣは、以下の機能特性：（ｉ）自己複製する能力、（ｉｉ）無限の増殖能、（ｉｉｉ）休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、（ｉｖ）任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、（ｖ）例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、及び／または（ｖｉ）コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、（ｉ）自己複製する能力を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、（ｉｉ）無限の増殖能を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、（ｉｉｉ）休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、（ｉｖ）任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、（ｖ）例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、（ｖｉ）コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力を有する。
本明細書に開示される方法または組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、以下の発現特性：（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉｉ）ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、（ｖ）ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する。
ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｉｉ）ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｖ）ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、または全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である。
ある実施形態では、ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか１つを発現する。ある実施形態では、ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか２つを発現する。ある実施形態では、ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか３つを発現する。ある実施形態では、ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）の全てを発現する。
ある実施形態では、ヒトＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ヒトＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の両方の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、該ヒトＨＳＰＣは、細胞系列陰性ＨＳＰＣである。
本明細書に開示される方法及び組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、以下の発現特性：（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉｉ）ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の検出可能な発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の細胞表面発現、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、（ｖ）ＣＤ１２３の発現、例えば、ＣＤ１２３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１２３の細胞表面発現、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する。
ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｉｉ）ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の検出可能な発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖ）ＣＤ１２３の発現、例えば、ＣＤ１２３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１２３の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、または全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である。
ある実施形態では、ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか１つを発現する。ある実施形態では、ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか２つを発現する。ある実施形態では、ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか３つを発現する。ある実施形態では、ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）の全てを発現する。
ある実施形態では、ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の両方の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、該ＮＨＰ ＨＳＰＣは、細胞系列陰性ＨＳＰＣである。
本明細書に開示される方法及び組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、以下の発現特性：（ｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ１５０の発現、例えば、ＣＤ１５０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１５０の細胞表面発現、（ｉｉｉ）Ｓｃａ－１の発現、例えば、Ｓｃａ－１の検出可能な発現、例えば、Ｓｃａ－１の細胞表面発現、（ｉｖ）ｃ－ｋｉｔの発現、例えば、ｃ－ＫＩＴの検出可能な発現、例えば、ｃ－ｋｉｔの細胞表面発現、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、ＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉｉ）～（ｘ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、または全てを有する。
ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｉｉ）ＣＤ１５０の発現、例えば、ＣＤ１５０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１５０の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｉｉｉ）Ｓｃａ－１の発現、例えば、Ｓｃａ－１の検出可能な発現、例えば、Ｓｃａ－１の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｉｖ）ｃ－ｋｉｔの発現、例えば、ｃ－ＫＩＴの検出可能な発現、例えば、ｃ－ｋｉｔの細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、ＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｖｉｉｉ）（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちの１つ、２つ、または全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか２つの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）の全ての検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、該ＨＳＰＣは、細胞系列陰性ＨＳＰＣである。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、マウスＨＳＰＣは、ｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１を発現し、例えば、ｃ－ＫＩＴ＋及びＳｃａ－１＋ ＨＳＣである。本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、マウスＨＳＰＣは、ｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１を発現し、例えば、ｃ－ＫＩＴ＋及びＳｃａ－１＋ ＨＳＣであり、マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、または全ての検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、改変ヒト細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）ＮＨＰ ＣＤ４５のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉ）ＮＨＰ ＣＤ３４のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉｉ）ＮＨＰ ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｖ）ＮＨＰ ＣＤ９０のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖ）ＮＨＰ ＣＤ１２３のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖｉ）ＮＨＰ ＣＤ４５ＲＡのヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＮＨＰ ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＮＨＰ ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカー、またはそのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ）は、改変ヒト細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）マウスＣＤ３４のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉ）マウスＣＤ１５０のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉｉ）マウスＳｃａ－１のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｖ）マウスｃ－ｋｉｔのヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、マウスＣＭＰ及び／またはＣＬＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、マウスＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、マウスＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｖｉｉｉ）（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカー、またはそのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、または全てを有する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、マウスｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１のヒトオルソログまたは同等物を発現する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、マウスｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１のヒトオルソログまたは同等物を発現し、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ、２つ、または全ての検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、細胞とＬＮＰ組成物との接触前に、細胞（例えば、細胞の集団）は、対象から単離され、インビトロで拡大、濃縮、及び／または培養される。本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、拡大、濃縮、及び／または培養された細胞、例えば、細胞の集団は、宿主、例えば、自家または同種異系宿主内に投与される。
細胞または組織のインビボ改変のためのペイロード
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、例えば、本明細書に記載されるような、ペイロードを含む。ある実施形態では、ペイロードは、細胞または組織に関連する構成成分またはパラメータを改変、例えば、増加または減少させて、改変細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ、または組織をもたらす。ある実施形態では、ペイロードは、核酸分子、ペプチド分子、脂質分子、低分子量分子、またはそれらの組み合わせを含む。ある実施形態では、ペイロードは、幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、多能性前駆細胞、または多能性幹細胞のパラメータまたは構成成分に影響を及ぼす。ある実施形態では、前駆細胞は、ＨＳＰＣ、例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣである。好ましい実施形態では、ペイロードは、対象において異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、または免疫細胞障害に変化を生じさせる。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、例えば、本明細書に記載されるような、ペイロードを含む。ある実施形態では、ペイロードは、細胞または組織に関連する構成成分またはパラメータを改変、例えば、増加または減少させて、改変細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ、または組織をもたらす。ある実施形態では、ペイロードは、核酸分子、ペプチド分子、脂質分子、低分子量分子、またはそれらの組み合わせを含む。ある実施形態では、ペイロードは、幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、多能性前駆細胞、または多能性幹細胞のパラメータまたは構成成分に影響を及ぼす。ある実施形態では、前駆細胞は、ＨＳＰＣ、例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣである。好ましい実施形態では、ペイロードは、対象において異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、または免疫細胞障害に変化を生じさせる。
ある実施形態では、ペイロードは、ＤＮＡ分子、例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはプラスミドＤＮＡを含む核酸分子を含む。ある実施形態では、ペイロードは、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型（ｓｈＲＮＡ）を含む核酸分子を含む。ある実施形態では、ペイロードは、ｍＲＮＡを含む。ある実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む。ある実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される。ある実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある実施形態では、化学修飾は、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。ある実施形態では、ｍＲＮＡは、完全に修飾されたＮ１－メチルシュードウリジンを含む。
ある実施形態では、ペイロードは、例えば、本明細書に記載されるような、ペプチド分子を含む。
ある実施形態では、ペイロードは、例えば、本明細書に記載されるような、脂質分子を含む。ある実施形態では、ペイロードは、例えば、本明細書に記載されるような、低分子量分子を含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ペイロードは、遺伝子モジュレーター（例えば、細胞または組織の遺伝子を変化させるモジュレーター）、後成的モジュレーター（例えば、細胞または組織を後成的に変化させるモジュレーター）、ＲＮＡモジュレーター（例えば、細胞または組織におけるＲＮＡ分子を変化させるモジュレーター）、ペプチドモジュレーター（例えば、細胞または組織におけるペプチド分子を変化させるモジュレーター）、脂質モジュレーター（例えば、細胞または組織における脂質分子を変化させるモジュレーター）、またはそれらの組み合わせを含む。
ある実施形態では、ペイロードは、遺伝子モジュレーター（例えば、細胞または組織の遺伝子を変化させるモジュレーター）を含む。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、例えば、核酸塩基を変化させること、例えば、挿入、欠失、変異（例えば、ミスセンス変異、サイレント変異、またはナンセンス変異）、重複、もしくは逆位、またはそれらの任意の組み合わせを導入することによって、ＤＮＡ分子における核酸配列を改変する、システムを含む。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、ＤＮＡ塩基エディター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、メガヌクレアーゼシステム、もしくはトランスポザーゼシステム、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、鋳型ＤＮＡを含む。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、鋳型ＤＮＡを含まない。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、鋳型ＲＮＡを含む。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、鋳型ＲＮＡを含まない。
ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムである。ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子と、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質またはその断片もしくはバリアント、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、その断片もしくはバリアント、Ｃａｓ３タンパク質、その断片もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ａタンパク質、その断片もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ｅタンパク質、その断片もしくはバリアント、Ｃａｓ１３タンパク質、その断片もしくはバリアント、またはＣａｓ１４タンパク質、その断片もしくはバリアントとを含む。
ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡ分子と、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質またはその断片もしくはバリアント、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、その断片もしくはバリアント、Ｃａｓ３タンパク質、その断片もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ａタンパク質、その断片もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ｅタンパク質、その断片もしくはバリアント、Ｃａｓ１３タンパク質、その断片もしくはバリアント、またはＣａｓ１４タンパク質、その断片もしくはバリアントをコードする核酸とを含む。
ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９タンパク質、その断片もしくはバリアントとを含む。
ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９タンパク質、その断片もしくはバリアントをコードする核酸とを含む。
ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、鋳型ＤＮＡをさらに含む。ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、鋳型ＲＮＡをさらに含む。ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、逆転写酵素をさらに含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムである。ある実施形態では、ＺＦＮシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、その断片もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む。ある実施形態では、ＺＦＮシステムは、ＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドを含む。ある実施形態では、Ｚｎフィンガー結合ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれよりも多くのジンクフィンガーを含む。ある実施形態では、ＺＦＮシステムは、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するペプチドは、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。ある実施形態では、ＺＦＮシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、その断片もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む。
ある実施形態では、ＺＦＮシステムは、ＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドをコードする核酸を含む。ある実施形態では、Ｚｎフィンガー結合ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれよりも多くのジンクフィンガーを含む。ある実施形態では、ＺＦＮシステムは、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するペプチドは、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。
ある実施形態では、該システムは、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをさらに含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムである。ある実施形態では、該システムは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む。ある実施形態では、該システムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片もしくはバリアントを有するペプチドを含む。ある実施形態では、該システムは、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するペプチドは、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。
ある実施形態では、該システムは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む。ある実施形態では、該システムは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片もしくはバリアントを有するペプチドをコードする核酸を含む。ある実施形態では、該システムは、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するペプチドは、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。
ある実施形態では、該システムは、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをさらに含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、メガヌクレアーゼシステムである。ある実施形態では、メガヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡ結合ドメイン、及びヌクレアーゼ活性、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼを有するペプチドを含む。ある実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｓｉｌｖａ Ｇ．ｅｔ ａｌ，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（１）：１１－２７に記載されるような、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ（配列番号２７０）、ＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスエンドヌクレアーゼ、もしくはＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫエンドヌクレアーゼ、またはその断片もしくはバリアントを含む。
ある実施形態では、メガヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡ結合ドメイン、及びヌクレアーゼ活性、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼを有するペプチドをコードする核酸を含む。ある実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｓｉｌｖａ Ｇ．ｅｔ ａｌ，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（１）：１１－２７に記載されるような、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ（配列番号２７０）、ＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスエンドヌクレアーゼ、もしくはＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫエンドヌクレアーゼ、またはその断片もしくはバリアントを含む。
ある実施形態では、該システムは、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをさらに含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、トランスポザーゼシステムである。ある実施形態では、トランスポザーゼシステムは、逆転写酵素及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、レトロトランスポゾン、例えば、ＬＴＲレトロトランスポゾンまたは非ＬＴＲレトロトランスポゾンを有するペプチドをコードする核酸配列を含む。ある実施形態では、トランスポザーゼシステムは、鋳型、例えば、ＲＮＡ鋳型を含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ペイロードは、後成的モジュレーター（例えば、細胞または組織を後成的に変化させるモジュレーター）を含む。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、クロマチン構造を改変する、ＤＮＡをメチル化する、及び／またはヒストンを修飾する分子を含む。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、クロマチン構造を改変する分子、例えば、ＳＷＩ／ＳＮＦリモデリング複合体またはその構成要素である。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、ＤＮＡをメチル化する分子、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、その断片もしくはバリアント（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、またはＭ．ＳｓｓＩ）；ポリコーム抑制複合体もしくはその構成要素、例えば、ＰＲＣ１もしくはＰＲＣ２、もしくはＰＲ－ＤＵＢ、またはその断片もしくはバリアント；デメチラーゼ、またはその断片もしくはバリアント（例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２、またはＴｅｔ３）である。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、ヒストンを修飾する、例えば、ヒストンをメチル化する及び／またはアセチル化する分子、例えば、ヒストン修飾酵素またはその断片もしくはバリアント、例えば、ＨＭＴ、ＨＤＭ、ＨＡＴ、またはＨＤＡＣである。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ペイロードは、ＲＮＡモジュレーター（例えば、細胞または組織におけるＲＮＡ分子を変化させるモジュレーター）を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＲＮＡ分子の発現及び／または活性、安定性または区画化を変化させる分子を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＤＮＡ分子を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、低分子量分子を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ペプチド、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質、その断片もしくはバリアント；あるいは酵素、またはその断片もしくはバリアントを含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＲＮＡ塩基エディターシステムを含む。ある実施形態では、ＲＮＡ塩基エディターシステムは、デアミナーゼ、例えば、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）；Ｃａｓタンパク質、その断片もしくはバリアント；及び／またはガイドＲＮＡを含む。ある実施形態では、ＲＮＡ塩基エディターシステムは、鋳型、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型をさらに含む。
本明細書に開示される方法のうちのいずれかのある実施形態では、ペイロードは、ペプチドモジュレーター（例えば、細胞または組織におけるペプチド分子を変化させるモジュレーター）を含む。ある実施形態では、ペイロードは、脂質モジュレーター（例えば、細胞または組織における脂質分子を変化させるモジュレーター）、またはそれらの組み合わせを含む。
ある実施形態では、ペイロードは、治療ペイロードまたは予防ペイロードを含む。ある実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、膜結合型タンパク質、もしくは細胞間タンパク質；または分泌タンパク質、膜結合型タンパク質、もしくは細胞間タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。ある実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む。
本明細書に開示される組成物及び方法の追加の特徴
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、該ＬＮＰを含む薬学的組成物、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかの追加の特徴は、以下の実施形態を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、該ＬＮＰを含む薬学的組成物、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかの追加の特徴は、以下の実施形態を含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、疾患または障害は、異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、及び免疫細胞障害からなる群から選択される。
本明細書に開示される方法のうちのいずれかのある実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトである。
本明細書に開示される方法または組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ）の化合物を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ－ＩＩ）の化合物を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ－ＩＩＩ）の化合物を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ－ＩＶ）の化合物を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉａ）の化合物を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉｂ）の化合物を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉｃ）の化合物を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（ＩＩ）の化合物を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（ＩＩ－Ｉ）の化合物を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、例えば、本明細書に記載されるような、少なくとも１つの化学修飾を含む。ある実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される。ある実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある実施形態では、化学修飾は、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。ある実施形態では、脂質ナノ粒子中の各ｍＲＮＡは、完全に修飾されたＮ１－メチルシュードウリジンを含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、ＬＮＰは、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼内、または経肺送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、静脈内送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、皮下送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、筋肉内送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、鼻腔内送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、眼内送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、経肺送達用に製剤化される。ある実施形態では、送達は、単回送達である。ある実施形態では、送達は、反復送達である。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、ＬＮＰは、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び任意選択で（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミノ脂質を含むイオン化可能な脂質を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ）、（Ｉ－Ｉ）、（Ｉ－ＩＩ）、（Ｉ－ＩＩＩ）、（Ｉ－ＩＶ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（ＩＩ）、または（ＩＩ－Ｉ）のうちのいずれか１つの化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ）の化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ－ＩＩ）の化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ－ＩＩＩ）の化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ－ＩＶ）の化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉａ）の化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉｂ）の化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉｃ）の化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（ＩＩ）の化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（ＩＩ－Ｉ）の化合物を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－リンコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－リンコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（Ｃ１６リゾＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リン－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。ある実施形態では、リン脂質は、ＤＳＰＣ、例えば、ＤＳＰＣのバリアント、例えば、式（ＩＶ）の化合物である。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、構造脂質を含む。一実施形態では、構造脂質は、植物ステロール、または植物ステロール及びコレステロールの組み合わせである。一実施形態では、植物ステロールは、β－シトステロール、スチグマステロール、β－シトスタノール、カンペステロール、ブラシカステロール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、植物ステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。一部の実施形態では、構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義されるとき、「ステロール」とは、ステロイドアルコールからなるステロイドの下位群である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。
一実施形態では、構造脂質は、β－シトステロール及びコレステロールから選択される。ある実施形態では、構造脂質は、β－シトステロールである。ある実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＰＥＧ脂質を含む。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質からなる群から選択される。ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧである。
ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（Ｖ）、式（ＶＩ－Ａ）、式（ＶＩ－Ｂ）、式（ＶＩ－Ｃ）、または式（ＶＩ－Ｄ）の化合物から選定される。ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ａ）の化合物である。ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ｂ）の化合物である。ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ｃ）の化合物である。ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ｄ）の化合物である。
ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含むアミノ脂質及び式（ＶＩ－Ｄ）の化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。好ましい実施形態では、ＬＮＰ組成物は、式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含むアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式（ＶＩ－Ｄ）の化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、約２０モル％～約６０モル％のイオン化可能な脂質、約５モル％～約２５モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約２５モル％～約５５モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約０．５モル％～約１５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約３５モル％～約５５モル％のイオン化可能な脂質、約５モル％～約２５モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０モル％～約４０モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約０モル％～約１０モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％のイオン化可能な脂質、約１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３８．５モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約１．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％のイオン化可能な脂質、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、約４５モル％～約５０モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４５．５モル％～約４９．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４６モル％～約４９モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４６．５モル％～約４８．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４７モル％～約４８モル％のイオン化可能な脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、約４５モル％～約４９．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４５モル％～約４９モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４５モル％～約４８．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４５モル％～約４８モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４５モル％～約４７．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４５モル％～約４７モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４５モル％～約４６．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４５モル％～約４６モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４５モル％～約４５．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、約４５．５モル％～約５０モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４６モル％～約５０モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４６．５モル％～約５０モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４７モル％～約５０モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４７．５モル％～約５０モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４８モル％～約５０モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４８．５モル％～約５０モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９モル％～約５０モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．５モル％～約５０モル％のイオン化可能な脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、約４５モル％～約４６モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４５．５モル％～約４６．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４６モル％～約４７モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４６．５モル％～約４７．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４７モル％～約４８モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４７．５モル％～約４８．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４８モル％～約４９モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４８．５モル％～約４９．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９モル％～約５０モル％のイオン化可能な脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、約４５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４５．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４６モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４６．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４７モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４７．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４８モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４８．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．５モル％のイオン化可能な脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％のイオン化可能な脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、約１モル％～約５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約１．５モル％～約４．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約２モル％～約４モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約２．５モル％～約３．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、約１モル％～約４．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約１モル％～約４モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約１モル％～約３．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約１モル％～約３モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約１モル％～約２．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約１モル％～約２モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約１モル％～約１．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、約１．５モル％～約５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約２モル％～約５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約２．５モル％～約５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約３モル％～約５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約３．５モル％～約５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４モル％～約５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４．５モル％～約５モル％のＰＥＧ脂質を含む。
本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約１モル％～約２モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約１．５モル％～約２．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約２モル％～約３モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約３．５モル％～約４．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４モル％～約５モル％のＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、約１モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約１．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約２モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約２．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約３モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約３．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５モル％のＰＥＧ脂質を含む。
一実施形態では、ステロールまたは他の構造脂質のモル％は、植物ステロール１８．５％であり、構造脂質の総モル％は、３８．５％である。一実施形態では、ステロールまたは他の構造脂質のモル％は、植物ステロール２８．５％であり、構造脂質の総モル％は、３８．５％である。
本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％の式（Ｉ）の化合物及び約１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％の式（Ｉ－Ｉ）の化合物及び約１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％の式（Ｉ－ＩＩ）の化合物及び約１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％の式（Ｉ－ＩＩＩ）の化合物及び約１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％の式（Ｉ－ＩＶ）の化合物及び約１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、５０モル％の式（Ｉａ）の化合物及び約１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％の式（Ｉｂ）の化合物及び１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、５０モル％の式（Ｉｃ）の化合物及び１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。
本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、５０モル％の式（ＩＩ）の化合物及び１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、５０モル％の式（ＩＩ－Ｉ）の化合物及び１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。
本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％の式（Ｉ）の化合物、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％の式（Ｉ－Ｉ）の化合物、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％の式（Ｉ－ＩＩ）の化合物、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％の式（Ｉ－ＩＩＩ）の化合物、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％の式（Ｉ－ＩＶ）の化合物、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％の式（Ｉａ）の化合物、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％の式（Ｉｂ）の化合物、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％の式（Ｉｃ）の化合物、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。
本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％の式（ＩＩ）の化合物、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％の式（ＩＩ－Ｉ）の化合物、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。
ある実施形態では、本開示のＬＮＰは、追加の標的化部分を含まず、例えば、それは追加の標的化部分なしに（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）の幹細胞または前駆細胞（例えば、ＨＳＰＣ）にトランスフェクトする。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、静脈内、皮下、筋肉内、眼内、鼻腔内、または経肺送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、静脈内送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、皮下送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、筋肉内送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、眼内送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、鼻腔内送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、経肺送達用に製剤化される。ある実施形態では、送達は、単回送達である。ある実施形態では、送達は、反復送達である。
前述のＬＮＰ組成物または該ＬＮＰ組成物の使用方法のうちのいずれかの追加の特徴は、以下の列挙される実施形態のうちの１つまたは複数を含む。当業者であれば、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはほんの日常的な実験を使用して確認することができる。かかる均等物は、以下の列挙される実施形態よって包含されることが意図される。
本開示の他の実施形態
１．例えば、対象において、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）を改変する、例えば、前記細胞に関連するパラメータまたは前記細胞に関連する構成成分を改変する方法であって、前記細胞を、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物と接触させることを含み、それによって前記細胞を改変する、方法。
１．例えば、対象において、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）を改変する、例えば、前記細胞に関連するパラメータまたは前記細胞に関連する構成成分を改変する方法であって、前記細胞を、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物と接触させることを含み、それによって前記細胞を改変する、方法。
２．例えば、対象において、組織を改変する、例えば、前記組織に関連するパラメータまたは前記組織に関連する構成成分を改変する方法であって、前記細胞を、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物と接触させることを含む、方法。
３．疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、ペイロードを含む有効量のＬＮＰ組成物を投与することを含み、前記ＬＮＰ組成物が、前記対象において細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）の改変、例えば、前記細胞に関連する構成成分または前記細胞に関連するパラメータの改変をもたらし、それによって前記対象を処置する、方法。
４．疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象の症状を改善する方法であって、前記対象に、ペイロードを含む有効量のＬＮＰ組成物を投与することを含み、前記ＬＮＰ組成物が、前記対象において細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）の改変、例えば、前記細胞に関連する構成成分または前記細胞に関連するパラメータの改変をもたらし、それによって前記対象の前記症状を改善する、方法。
５．ペイロードを含むＬＮＰ組成物を、例えば、対象において、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）または組織に送達する方法であって、前記細胞または前記組織を前記ＬＮＰ組成物と接触させることを含む、方法。
６．例えば、対象において、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）または組織を接触させる方法であって、前記細胞または前記組織を、ペイロードを含むＬＮＰ組成物と接触させることを含む、方法。
７．前記ＬＮＰ組成物が、前記細胞または前記組織の遺伝子型、表現型、及び／または機能の改変をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８．前記ＬＮＰ組成物が、前記細胞または前記組織、例えば、前記細胞もしくは前記組織に関連する構成成分、または前記細胞もしくは前記組織に関連するパラメータの改変をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９．前記構成成分が、（１）前記細胞に関連する核酸もしくはその断片、例えば、ＤＮＡ（例えば、エクソン、イントロン、遺伝子間、テロメア、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、リプレッサー、コーディング、またはノンコーディング）もしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、（２）前記細胞に関連するペプチドもしくはタンパク質またはその断片、（３）前記細胞に関連する脂質成分もしくはその断片、またはそれらの組み合わせを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０．前記構成成分が、ＤＮＡを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１１．前記構成成分が、ＲＮＡを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記構成成分が、前記細胞に関連するペプチドもしくはタンパク質またはその断片を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３．前記構成成分が、前記細胞に関連する脂質成分もしくはその断片を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４．前記構成成分が、前記細胞にとって内因性である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記構成成分が、前記細胞にとって外因性であり、例えば、当該技術分野で既知の方法、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、ウイルスベースの送達または脂質ベースの送達によって前記細胞に導入されたものである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１６．前記パラメータが、遺伝子型パラメータ、表現型パラメータ、機能パラメータ、発現パラメータ、シグナル伝達パラメータ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１７．前記遺伝子型パラメータが、前記細胞の遺伝子型、例えば、遺伝子もしくはアレルの存在もしくは不在、または遺伝子もしくはアレルの改変、例えば、前記遺伝子もしくは前記アレルにおける生殖細胞系列変異もしくは体細胞変異または遺伝子多型を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１８．前記表現型パラメータが、前記細胞の表現型、例えば、前記細胞の前記表面上の分子、例えば、細胞表面タンパク質、脂質、または接着分子の発現及び／または活性を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１９．前記機能パラメータが、前記細胞の機能、例えば、前記細胞が遺伝子産物（例えば、タンパク質）を産生する能力、前記細胞が増殖する、分裂する、及び／または複製する能力、及び／または前記細胞が、例えば、系列内の１つもしくは複数の細胞種に分化する能力を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２０．前記発現パラメータが、以下：
（ａ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）発現レベル、
（ｂ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）活性、
（ｃ）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾、
（ｄ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）折り畳み、及び／または
（ｅ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）安定性、
のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
（ａ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）発現レベル、
（ｂ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）活性、
（ｃ）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾、
（ｄ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）折り畳み、及び／または
（ｅ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）安定性、
のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２１．前記シグナル伝達パラメータが、以下：
（１）シグナル伝達経路、例えば、細胞シグナル伝達経路の調節、
（２）細胞運命の調節、
（３）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）発現レベルの調節、
（４）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）活性の調節、及び／または
（５）例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）安定性の調節、
のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
（１）シグナル伝達経路、例えば、細胞シグナル伝達経路の調節、
（２）細胞運命の調節、
（３）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）発現レベルの調節、
（４）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）活性の調節、及び／または
（５）例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）安定性の調節、
のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２２．前記細胞が、前記ＬＮＰ組成物とインビトロ、インビボ、またはエクスビボで接触させられる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２３．前記細胞が、前記ＬＮＰ製剤とインビボで接触させられる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記細胞が、前記ＬＮＰ製剤とエクスビボで接触させられる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２５．前記細胞が、幹細胞または前駆細胞、例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えば、胚性幹細胞もしくは前駆細胞に由来するＨＳＰＣまたは人工多能性幹細胞もしくは前駆細胞に由来するＨＳＰＣである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２６．前記細胞が、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、多能性前駆細胞、または多能性幹細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２７．前記細胞が、ＨＳＰＣ、例えば、多能性ＨＳＣまたは多能性ＨＰＣである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２８．前記ＨＳＰＣが、以下の機能特性：
ｉ．自己複製する能力、
ｉｉ．無限の増殖能、
ｉｉｉ．休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、
ｉｖ．任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、
ｖ．例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、
ｖｉ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、
のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する、実施形態２７に記載の方法。
ｉ．自己複製する能力、
ｉｉ．無限の増殖能、
ｉｉｉ．休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、
ｉｖ．任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、
ｖ．例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、
ｖｉ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、
のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する、実施形態２７に記載の方法。
２９．前記ＨＳＰＣが、以下の発現特性：
ｉ．ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、
ｉｉ．ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、
ｉｉｉ．ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、
ｉｖ．ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、
ｖ．ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、
ｖｉ．ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、
ｖｉｉ．原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、
ｖｉｉｉ．系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または
ｉｘ．（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、
のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する、実施形態２７または２８に記載の方法。
ｉ．ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、
ｉｉ．ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、
ｉｉｉ．ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、
ｉｖ．ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、
ｖ．ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、
ｖｉ．ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、
ｖｉｉ．原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、
ｖｉｉｉ．系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または
ｉｘ．（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、
のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する、実施形態２７または２８に記載の方法。
３０．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか１つを有する、実施形態２９に記載の方法。
３１．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか２つを有する、実施形態２９に記載の方法。
３２．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか３つを有する、実施形態２９に記載の方法。
３３．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）の全てを有する、実施形態２９に記載の方法。
３４．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、実施形態２９～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の両方の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、前記ヒトＨＳＰＣが、細胞系列陰性ＨＳＰＣである、実施形態２９～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．前記ＨＳＰＣが、実施形態２８に記載の機能特性のうちのいずれか１つ、または全て、またはそれらの組み合わせを有し、前記ＨＳＰＣが、実施形態２９に記載の発現特性のうちのいずれか１つ、または全て、またはそれらの組み合わせを有する、実施形態２８または２９に記載の方法。
３７．前記細胞と前記ＬＮＰ組成物との接触前に、前記細胞（例えば、細胞の集団）が、対象から単離され、インビトロで拡大、濃縮、及び／または培養される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３８．前記拡大、濃縮、及び／または培養された細胞、例えば、細胞の集団が、宿主、例えば、自家または同種異系宿主内に投与される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３９．前記改変細胞（例えば、改変細胞の集団）が、改変ＨＳＰＣ（例えば、改変ＨＳＰＣの集団）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４０．前記改変ＨＳＰＣが、以下の機能特性：
ｉ．自己複製する能力、
ｉｉ．無限の増殖能、
ｉｉｉ．休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、
ｉｖ．任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、
ｖ．例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、または
ｖｉ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、
のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する、実施形態３９に記載の方法。
ｉ．自己複製する能力、
ｉｉ．無限の増殖能、
ｉｉｉ．休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、
ｉｖ．任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、
ｖ．例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、または
ｖｉ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、
のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する、実施形態３９に記載の方法。
４１．前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例２に記載されるように、例えば、エクスビボコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにおいて測定したとき、または例えば、実施例３に記載されるように、系列追跡実験において測定したとき、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較して、ＣＦＵを形成する前記能力を有する、実施形態３９または４０に記載の方法。
４２．前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例２に記載されるように、例えば、エクスビボコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにおいて測定したとき、または例えば、実施例３に記載されるように、系列追跡実験において測定したとき、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＣと比較して、骨髄系細胞に分化する前記能力を有する、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例３に記載されるように、例えば、系列追跡実験において測定したとき、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＣと比較して、リンパ系細胞に分化する前記能力を有する、実施形態３９～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例３に示されるように、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較して、赤血球細胞または血小板に分化する前記能力を有する、実施形態３９～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．前記改変ＨＳＰＣが、インビボで赤血球細胞または血小板に分化する、実施形態４４に記載の方法。
４６．前記改変ＨＳＰＣが、インビトロで赤血球細胞または血小板に分化する、実施形態４４に記載の方法。
４７．前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例３に示されるように、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較して、好中球、単球、Ｂ細胞、またはＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞）に分化する前記能力を有する、実施形態３９～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．前記改変ＨＳＰＣが、インビボで好中球、単球、Ｂ細胞、またはＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞）に分化する、実施形態４７に記載の方法。
４９．前記改変ＨＳＰＣが、インビトロで好中球、単球、Ｂ細胞、またはＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞）に分化する、実施形態４７に記載の方法。
５０．前記改変ＨＳＰＣが、例えば、インビボで、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、もしくは３６５日間、またはそれよりも長く存続する、実施形態３９～４９のいずれかに記載の方法。
５１．前記改変ＨＳＰＣの前記インビボでの存続が、例えば、実施例３に示されるように、１つまたは複数の細胞、例えば、前記骨髄系列の細胞及び／または前記リンパ系列の細胞への分化をもたらす、実施形態５０に記載の方法。
５２．前記改変ＨＳＰＣが、以下の発現特性：
ｉ．ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、
ｉｉ．ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、
ｉｉｉ．ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、
ｉｖ．ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、
ｖ．ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、
ｖｉ．ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、
ｖｉｉ．原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、
ｖｉｉｉ．系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または
ｉｘ．（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、
のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、または全てを有する、実施形態３９～５１のいずれか１つに記載の方法。
ｉ．ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、
ｉｉ．ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、
ｉｉｉ．ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、
ｉｖ．ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、
ｖ．ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、
ｖｉ．ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、
ｖｉｉ．原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、
ｖｉｉｉ．系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または
ｉｘ．（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、
のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、または全てを有する、実施形態３９～５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか１つを有する、実施形態５２に記載の方法。
５４．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか２つを有する、実施形態５２に記載の方法。
５５．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか３つを有する、実施形態５２に記載の方法。
５６．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）の全てを有する、実施形態５２に記載の方法。
５７．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、実施形態５２～５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の両方の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、前記ヒトＨＳＰＣが、細胞系列陰性ＨＳＰＣである、実施形態５２～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．前記改変ＨＳＰＣが、実施形態４０に記載の機能特性のうちのいずれか１つ、または全て、またはそれらの組み合わせを有し、前記改変ＨＳＰＣが、実施形態５２に記載の発現特性のうちのいずれか１つ、または全て、またはそれらの組み合わせを有する、実施形態３９～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．前記ペイロードを含む前記ＬＮＰ組成物が、前記細胞または前記組織の遺伝子型、表現型、及び／または機能を改変、例えば、増加または減少させて、改変細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ、または組織をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６１．前記ペイロードを含む前記ＬＮＰ組成物が、前記細胞または前記組織の前記構成成分またはパラメータを改変、例えば、増加または減少させて、改変細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ、または組織をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６２．前記ペイロードが、核酸分子、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド分子、脂質分子、低分子量分子、またはそれらの組み合わせを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６３．前記ペイロードが、ＤＮＡ分子、例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む核酸分子を含む、実施形態６２に記載の方法。
６４．前記ペイロードが、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む核酸分子を含む、実施形態６２または６３に記載の方法。
６５．前記ペイロードが、ｍＲＮＡを含む、実施形態６２または６３に記載の方法。
６６．前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学修飾を含む、実施形態６５に記載の方法。
６７．前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、実施形態６６に記載の方法。
６８．前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態６６に記載の方法。
６９．前記化学修飾が、Ｎ１－メチルシュードウリジンである、実施形態６６に記載の方法。
７０．前記ｍＲＮＡが、完全に修飾されたＮ１－メチルシュードウリジンを含む、実施形態６５～６９のいずれかに記載の方法。
７１．前記ペイロードが、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド分子を含む、実施形態６２～７０のいずれかに記載の方法。
７２．前記ペイロードが、例えば、本明細書に記載されるような、脂質分子を含む、実施形態６２～７１のいずれかに記載の方法。
７３．前記ペイロードが、例えば、本明細書に記載されるような、低分子量分子を含む、実施形態６２～７２のいずれかに記載の方法。
７４．前記ペイロードが、遺伝子モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織の遺伝子を変化させるモジュレーター）、後成的モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織を後成的に変化させるモジュレーター）、ＲＮＡモジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織におけるＲＮＡ分子を変化させるモジュレーター）、ペプチドモジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織におけるペプチド分子を変化させるモジュレーター）、脂質モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織における脂質分子を変化させるモジュレーター）、またはそれらの組み合わせを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７５．前記ペイロードが、遺伝子モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織の遺伝子を変化させるモジュレーター）を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７６．前記遺伝子モジュレーターが、例えば、核酸塩基を変化させること、例えば、挿入、欠失、変異（例えば、ミスセンス変異、サイレント変異、またはナンセンス変異）、重複、もしくは逆位、またはそれらの任意の組み合わせを導入することによって、ＤＮＡ分子における核酸配列を改変する、システムを含む、実施形態７４または７５に記載の方法。
７７．前記遺伝子モジュレーターが、ＤＮＡ塩基エディター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、メガヌクレアーゼシステム、もしくはトランスポザーゼシステム、またはそれらの任意の組み合わせ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム及びトランスポザーゼシステムの組み合わせを含む、実施形態７４～７６のいずれか１つに記載の方法。
７８．前記遺伝子モジュレーターが、鋳型ＤＮＡを含む、実施形態７４～７７のいずれか１つに記載の方法。
７９．前記遺伝子モジュレーターが、鋳型ＤＮＡを含まない、実施形態７４～７７のいずれか１つに記載の方法。
８０．前記遺伝子モジュレーターが、鋳型ＲＮＡを含む、実施形態７４～７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．前記遺伝子モジュレーターが、鋳型ＲＮＡを含まない、実施形態７４～７９のいずれか１つに記載の方法。
８２．前記遺伝子モジュレーターが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムを含む、実施形態７４～８１のいずれか１つに記載の方法。
８３．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子と、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ３タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ａタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ｅタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１３タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、またはＣａｓ１４タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントとを含む、実施形態８２に記載の方法。
８４．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡ分子と、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ３タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ａタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ｅタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１３タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、またはＣａｓ１４タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントをコードする核酸とを含む、実施形態８２または８３に記載の方法。
８５．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントとを含む、実施形態８２または８３に記載の方法。
８６．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントをコードする核酸とを含む、実施形態８２または８３に記載の方法。
８７．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、鋳型ＤＮＡをさらに含む、実施形態８２～８６のいずれか１つに記載の方法。
８８．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、鋳型ＲＮＡをさらに含む、実施形態８２～８７のいずれか１つに記載の方法。
８９．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、逆転写酵素をさらに含む、実施形態８２～８８のいずれか１つに記載の方法。
９０．前記遺伝子モジュレーターが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムを含む、実施形態７４～８１のいずれか１つに記載の方法。
９１．前記ＺＦＮシステムが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む、実施形態９０に記載の方法。
９２．前記ＺＦＮシステムが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドを含む、実施形態９０または９１に記載の方法。
９３．前記ジンクフィンガー結合ドメインが、１、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれよりも多くのジンクフィンガー、例えば、３つまたは６つのジンクフィンガーを含む、実施形態９２に記載の方法。
９４．前記ＺＦＮシステムが、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む、実施形態９０～９３のいずれか１つに記載の方法。
９５．前記ヌクレアーゼ活性を有するペプチドが、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである、実施形態９４に記載の方法。
９６．前記ＺＦＮシステムが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態９０に記載の方法。
９７．前記ＺＦＮシステムが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態９６に記載の方法。
９８．前記ジンクフィンガー結合ドメインが、１、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれよりも多くのジンクフィンガー、例えば、３つまたは６つのジンクフィンガーを含む、実施形態９７に記載の方法。
９９．前記ＺＦＮシステムが、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態９６または９７に記載の方法。
１００．前記ヌクレアーゼ活性を有するペプチドが、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである、実施形態９９に記載の方法。
１０１．前記ＺＦＮシステムが、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをさらに含む、実施形態９０～１００のいずれか１つに記載の方法。
１０２．前記遺伝子モジュレーターが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムである、実施形態７４～８１に記載の方法。
１０３．前記ＴＡＬＥＮシステムが、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む、実施形態１０２に記載の方法。
１０４．前記ＴＡＬＥＮシステムが、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを有するペプチドを含む、実施形態１０２または１０３に記載の方法。
１０５．前記ＴＡＬＥＮシステムが、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む、実施形態１０２または１０３に記載の方法。
１０６．前記ヌクレアーゼ活性を有するペプチドが、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである、実施形態１０５に記載の方法。
１０７．前記ＴＡＬＥＮシステムが、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態１０２に記載の方法。
１０８．前記ＴＡＬＥＮシステムが、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態１０７に記載の方法。
１０９．前記ＴＡＬＥＮシステムが、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態１０７に記載の方法。
１１０．前記ヌクレアーゼ活性を有するペプチドが、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである、実施形態１０９に記載の方法。
１１１．前記ＴＡＬＥＮシステムが、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをさらに含む、実施形態１０２～１１０のいずれか１つに記載の方法。
１１２．前記遺伝子モジュレーターが、メガヌクレアーゼシステムを含む、実施形態７４～８１のいずれか１つに記載の方法。
１１３．前記メガヌクレアーゼシステムが、ＤＮＡ結合ドメイン、及びヌクレアーゼ活性、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼを有するペプチドを含む、実施形態１１２に記載の方法。
１１４．前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、例えば、Ｓｉｌｖａ Ｇ．ｅｔ ａｌ，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（１）：１１－２７に記載されるような、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ（配列番号２７０）、ＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスエンドヌクレアーゼ、もしくはＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫエンドヌクレアーゼ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを含む、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．前記メガヌクレアーゼシステムが、ＤＮＡ結合ドメイン、及びヌクレアーゼ活性、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼを有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態１１２に記載の方法。
１１６．前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、例えば、Ｓｉｌｖａ Ｇ．ｅｔ ａｌ，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（１）：１１－２７に記載されるような、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ（配列番号２７０）、ＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスエンドヌクレアーゼ、もしくはＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫエンドヌクレアーゼ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを含む、実施形態１１５に記載の方法。
１１７．前記システムが、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをさらに含む、実施形態１１２～１１６のいずれか１つに記載の方法。
１１８．前記遺伝子モジュレーターが、トランスポザーゼシステムを含む、実施形態７４～１１７のいずれか１つに記載の方法。
１１９．前記トランスポザーゼシステムが、逆転写酵素及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、レトロトランスポゾン、例えば、ＬＴＲレトロトランスポゾンまたは非ＬＴＲレトロトランスポゾンを有するペプチドをコードする核酸配列を含む、実施形態１１８に記載の方法。
１２０．前記トランスポザーゼシステムが、鋳型、例えば、ＲＮＡ鋳型を含む、実施形態１１８または１１９に記載の方法。
１２１．前記ペイロードが、後成的モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織を後成的に変化させるモジュレーター）を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２２．前記後成的モジュレーターが、クロマチン構造を改変する、ＤＮＡをメチル化する、及び／またはヒストンを修飾する分子を含む、実施形態１２１に記載の方法。
１２３．前記後成的モジュレーターが、クロマチン構造を改変する分子、例えば、ＳＷＩ／ＳＮＦリモデリング複合体またはその構成要素を含む、実施形態１２１または１２２に記載の方法。
１２４．前記後成的モジュレーターが、ＤＮＡをメチル化する分子、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、またはＭ．ＳｓｓＩ）；ポリコーム抑制複合体もしくはその構成要素、例えば、ＰＲＣ１もしくはＰＲＣ２、もしくはＰＲ－ＤＵＢ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；デメチラーゼ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント（例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２、またはＴｅｔ３）を含む、実施形態１２１～１２３のいずれか１つに記載の方法。
１２５．前記後成的モジュレーターが、ヒストンを修飾する、例えば、ヒストンをメチル化する及び／またはアセチル化する分子、例えば、ヒストン修飾酵素またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、例えば、ＨＭＴ、ＨＤＭ、ＨＡＴ、またはＨＤＡＣを含む、実施形態１２１～１２４のいずれか１つに記載の方法。
１２６．前記ペイロードが、ＲＮＡモジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織におけるＲＮＡ分子を変化させるモジュレーター）を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２７．前記ＲＮＡモジュレーターが、ＲＮＡ分子の発現及び／または活性、安定性または区画化を変化させる分子を含む、実施形態１２６に記載の方法。
１２８．前記ＲＮＡモジュレーターが、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む、実施形態１２６または１２７に記載の方法。
１２９．前記ＲＮＡモジュレーターが、ＤＮＡ分子を含む、実施形態１２６～１２８のいずれかに記載の方法。
１３０．前記ＲＮＡモジュレーターが、低分子量分子を含む、実施形態１２６～１２９のいずれかに記載の方法。
１３１．前記ＲＮＡモジュレーターが、ペプチド、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；あるいは酵素、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを含む、実施形態１２６～１３０のいずれかに記載の方法。
１３２．前記ＲＮＡモジュレーターが、ＲＮＡ塩基エディターシステムを含む、実施形態１２６～１３１のいずれかに記載の方法。
１３３．前記ＲＮＡ塩基エディターシステムが、デアミナーゼ、例えば、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）；Ｃａｓタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはガイドＲＮＡを含む、実施形態１３２に記載の方法。
１３４．前記ＲＮＡ塩基エディターシステムが、鋳型、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型をさらに含む、実施形態１３２または１３３に記載の方法。
１３５．ペイロードが、ペプチドモジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織におけるペプチド分子を変化させるモジュレーター）を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３６．前記ペイロードが、脂質モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織における脂質分子を変化させるモジュレーター）、またはそれらの組み合わせを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３７．前記ペイロードが、治療ペイロードまたは予防ペイロードを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３８．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、分泌タンパク質、膜結合型タンパク質、もしくは細胞間タンパク質；または分泌タンパク質、膜結合型タンパク質、もしくは細胞間タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、実施形態１３７に記載の方法。
１３９．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む、実施形態１３７または１３８に記載の方法。
１４０．前記ＬＮＰが、追加の標的化部分を含まず、例えば、それが追加の標的化部分なしに（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）の幹細胞または前駆細胞（例えば、ＨＳＰＣ）にトランスフェクトする、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４１．前記対象が、異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、及び免疫細胞障害からなる群から選択される疾患または障害を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４２．前記対象が、ヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）遺伝子における変異を有し、及び／またはヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）遺伝子の異常な発現を有する、実施形態１４１に記載の方法。
１４３．前記対象が、凝固因子をコードする遺伝子における変異を有し、及び／または凝固因子をコードする遺伝子の異常な発現を有する、実施形態１４１に記載の方法。
１４４．前記対象が、哺乳動物、例えば、ヒトである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４５．先行実施形態のいずれか１つに記載の方法において使用するためのＬＮＰ組成物。
１４６．実施形態１４５に記載のＬＮＰ組成物を含む薬学的組成物。
１４７．前記ＬＮＰ組成物が、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む、実施形態１４５に記載のＬＮＰ組成物、または実施形態１４６に記載の薬学的組成物。
１４８．前記イオン化可能な脂質が、アミノ脂質を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１４９．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ）、（Ｉ－Ｉ）、（Ｉ－ＩＩ）、（Ｉ－ＩＩＩ）、（Ｉ－ＩＶ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（ＩＩ）、または（ＩＩ－Ｉ）のうちのいずれかの化合物を含む、実施形態１４８に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１５０．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ）の化合物を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１５１．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉａ）の化合物を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１５２．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉｂ）の化合物を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１５３．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉｃ）の化合物を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１５４．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１５５．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ－ＩＩ）の化合物を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１５６．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ－ＩＩＩ）の化合物を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１５７．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ－ＩＶ）の化合物を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１５８．前記イオン化可能な脂質が、式（ＩＩ）の化合物を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１５９．前記イオン化可能な脂質が、式（ＩＩ－Ｉ）の化合物を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１６０．前記非カチオン性ヘルパー脂質または前記リン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、またはＤＯＰＣからなる群から選択される化合物を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１６１．前記リン脂質が、ＤＳＰＣ、例えば、ＤＳＰＣのバリアント、例えば、式（ＩＶ）の化合物である、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１６２．前記構造脂質が、アルファ－トコフェロール、β－シトステロール、またはコレステロールから選定される、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１６３．前記構造脂質が、アルファ－トコフェロールである、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１６４．前記構造脂質が、β－シトステロールである、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１６５．前記構造脂質が、コレステロールである、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１６６．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１６７．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質からなる群から選択される、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１６８．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－ＤＭＧである、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１６９．前記ＰＥＧ脂質が、式（Ｖ）、式（ＶＩ－Ａ）、式（ＶＩ－Ｂ）、式（ＶＩ－Ｃ）、または式（ＶＩ－Ｄ）の化合物から選定される、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１７０．前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ａ）の化合物である、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１７１．前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ｂ）の化合物である、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１７２．前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ｃ）の化合物である、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１７３．前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ｄ）の化合物である、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１７４．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含み、前記リン脂質が、ＤＳＰＣを含み、前記構造脂質が、コレステロールを含み、前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ｄ）の化合物を含む、実施形態１４７に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１７５．前記ＬＮＰが、約２０～６０％のイオン化可能な脂質：５～２５％のリン脂質：２５～５５％のコレステロール；及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、実施形態１４５～１７４のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１７６．前記ＬＮＰが、約５０％のイオン化可能な脂質：約１０％のリン脂質：約３８．５％のコレステロール；及び約１．５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、実施形態１７５に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１７７．前記ＬＮＰが、約４９．８３％のイオン化可能な脂質：約９．８３％のリン脂質：約３０．３３％のコレステロール；及び約２．０％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、実施形態１７５に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１７８．前記ＬＮＰ組成物が、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼内、または経肺送達（例えば、単回または反復送達）用に製剤化される、実施形態１４５～１７７のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１７９．前記ＬＮＰ組成物が、静脈内送達（例えば、単回または反復送達）用に製剤化される、実施形態１４４～１７８のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１８０．前記ＬＮＰ組成物が、追加の標的化部分を含まず、例えば、それが追加の標的化部分なしに（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）の幹細胞または前駆細胞（例えば、ＨＳＰＣ）にトランスフェクトする、実施形態１４４～１７９のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物。
１８１．実施形態１～１４４のいずれか１つに記載の方法に従って、または実施形態１４５～１８０のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物もしくは薬学的組成物によって作製された、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ（例えば、改変ＨＳＣまたはＨＰＣ）。
１８２．実施形態１～１４４のいずれか１つに記載の方法に従って、または実施形態１４５～１８０のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物もしくは薬学的組成物によって作製された、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ（例えば、改変ＨＳＣまたはＨＰＣ）の凍結調製物。
１８３．疾患または障害を有する対象の処置において使用するための、１８１に記載の改変細胞、または１８２に記載の改変細胞の凍結調製物。
１８４．疾患または障害を有する対象の症状の改善において使用するための、１８１に記載の改変細胞、または１８２に記載の改変細胞の凍結調製物。
１８５．前記疾患または前記障害が、異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、または免疫細胞障害からなる群から選択される、請求項１８３または１８４に記載の使用のための改変細胞、または改変細胞の凍結調製物。
１８６．前記改変細胞が、前記対象にとって自家である、請求項１８３～１８５のいずれか１項に記載の使用のための改変細胞、または改変細胞の凍結調製物。
１８７．前記改変細胞が、前記対象にとって同種異系である、請求項１８３～１８６のいずれか１項に記載の使用のための改変細胞、または改変細胞の凍結調製物。
１８８．
（ａ）幹細胞または前駆細胞、例えば、ＨＳＰＣの集団（例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣの集団、またはそれらの組み合わせ）と、
（ｂ）前記幹細胞または前記前駆細胞、例えば、前記幹細胞に関連する構成成分または前記幹細胞もしくは前記前駆細胞に関連するパラメータを改変することができるペイロードを含むＬＮＰ組成物と、
を含む、組成物または反応混合物。
（ａ）幹細胞または前駆細胞、例えば、ＨＳＰＣの集団（例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣの集団、またはそれらの組み合わせ）と、
（ｂ）前記幹細胞または前記前駆細胞、例えば、前記幹細胞に関連する構成成分または前記幹細胞もしくは前記前駆細胞に関連するパラメータを改変することができるペイロードを含むＬＮＰ組成物と、
を含む、組成物または反応混合物。
１８９．改変細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ（例えば、改変ＨＳＣまたはＨＰＣ）と、例えば、本明細書に記載されるような、前記細胞を改変することができるペイロードを含むＬＮＰとを含む、薬学的組成物。
１９０．前記ＬＮＰ組成物が、追加の標的化部分を含まず、例えば、それが追加の標的化部分なしに（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）の幹細胞または前駆細胞（例えば、ＨＳＰＣ）にトランスフェクトする、請求項１８８に記載の組成物もしくは反応混合物、または請求項１８９に記載の薬学的組成物。
１９１．改変細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ（例えば、改変ＨＳＣまたはＨＰＣ）と、例えば、本明細書に記載されるような、前記細胞を改変することができるペイロードを含むＬＮＰとを含む、キット。
１９２．ペイロードを含むＬＮＰ組成物であって、例えば、対象（例えば、疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象）において、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）と接触させられたときに、前記ＬＮＰ組成物が、前記細胞の改変、例えば、前記細胞に関連するパラメータまたは前記細胞に関連する構成成分の改変をもたらし、任意選択で前記ＬＮＰ組成物が、追加の標的化部分を含まない、ＬＮＰ組成物。
１９３．ペイロードを含むＬＮＰ組成物であって、対象（例えば、疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象）に投与されたときに、前記ＬＮＰ組成物が、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）の改変、例えば、前記細胞に関連するパラメータまたは前記細胞に関連する構成成分の改変をもたらし、任意選択で前記ＬＮＰ組成物が、追加の標的化部分を含まず、例えば、それが追加の標的化部分なしに（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）の幹細胞または前駆細胞（例えば、ＨＳＰＣ）にトランスフェクトする、ＬＮＰ組成物。
１９４．前記疾患または前記障害が、異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、及び免疫細胞障害からなる群から選択される、実施形態１９２または１９３に記載のＬＮＰ組成物。
１９５．前記変異または前記ＳＮＰが、異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、及び免疫細胞障害からなる群から選択される疾患または障害に関連するか、またはそれを引き起こす、実施形態１９２～１９４のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
１９６．前記ペイロードが、前記疾患または前記障害、例えば、異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、及び免疫細胞障害からなる群から選択される疾患または障害を変化させる（例えば、改善する）、実施形態１９２～１９５のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
１９７．式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含むアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式（ＶＩ－Ｄ）の化合物を含むＰＥＧ脂質を含む、実施形態１９２～１９６のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
１９８．前記ＬＮＰ組成物が、前記細胞または前記組織の遺伝子型、表現型、及び／または機能の改変をもたらす、実施形態１９２～１９７のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
１９９．前記構成成分が、（１）前記細胞に関連する核酸もしくはその断片、例えば、ＤＮＡ（例えば、エクソン、イントロン、遺伝子間、テロメア、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、リプレッサー、コーディング、またはノンコーディング）もしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、（２）前記細胞に関連するペプチドもしくはタンパク質またはその断片、（３）前記細胞に関連する脂質成分もしくはその断片、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１９２～１９８のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２００．前記構成成分が、ＤＮＡを含む、実施形態１９２～１９９のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２０１．前記構成成分が、ＲＮＡを含む、実施形態１９２～２００のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２０２．前記構成成分が、前記細胞に関連するペプチドもしくはタンパク質またはその断片を含む、実施形態１９２～２０１のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２０３．前記構成成分が、前記細胞に関連する脂質成分もしくはその断片を含む、実施形態１９２～２０２のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２０４．前記構成成分が、前記細胞にとって内因性である、実施形態１９２～２０３のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２０５．前記構成成分が、前記細胞にとって外因性であり、例えば、当該技術分野で既知の方法、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、ウイルスベースの送達または脂質ベースの送達によって前記細胞に導入されたものである、実施形態１９２～２０４のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２０６．前記パラメータが、遺伝子型パラメータ、表現型パラメータ、機能パラメータ、発現パラメータ、シグナル伝達パラメータ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１９２～２０５のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２０７．前記遺伝子型パラメータが、前記細胞の遺伝子型、例えば、遺伝子もしくはアレルの存在もしくは不在、または遺伝子もしくはアレルの改変、例えば、前記遺伝子もしくは前記アレルにおける生殖細胞系列変異もしくは体細胞変異または遺伝子多型を含む、実施形態２０６に記載のＬＮＰ組成物。
２０８．前記表現型パラメータが、前記細胞の表現型、例えば、前記細胞の前記表面上の分子、例えば、細胞表面タンパク質、脂質、または接着分子の発現及び／または活性を含む、実施形態２０６または２０７に記載のＬＮＰ組成物。
２０９．前記機能パラメータが、前記細胞の機能、例えば、前記細胞が遺伝子産物（例えば、タンパク質）を産生する能力、前記細胞が増殖する、分裂する、及び／または複製する能力、及び／または前記細胞が、例えば、系列内の１つもしくは複数の細胞種に分化する能力を含む、実施形態２０６～２０８のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２１０．前記発現パラメータが、以下：
（ａ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）発現レベル、
（ｂ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）活性、
（ｃ）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾、
（ｄ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）折り畳み、及び／または
（ｅ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）安定性、
のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む、実施形態２０６～２０９のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
（ａ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）発現レベル、
（ｂ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）活性、
（ｃ）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾、
（ｄ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）折り畳み、及び／または
（ｅ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）安定性、
のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む、実施形態２０６～２０９のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２１１．前記シグナル伝達パラメータが、以下：
（１）シグナル伝達経路、例えば、細胞シグナル伝達経路の調節、
（２）細胞運命の調節、
（３）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）発現レベルの調節、
（４）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）活性の調節、及び／または
（５）例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）安定性の調節、
のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む、実施形態２０６～２１０のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
（１）シグナル伝達経路、例えば、細胞シグナル伝達経路の調節、
（２）細胞運命の調節、
（３）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）発現レベルの調節、
（４）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）活性の調節、及び／または
（５）例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の）安定性の調節、
のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む、実施形態２０６～２１０のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２１２．前記細胞が、前記ＬＮＰ組成物とインビトロ、インビボ、またはエクスビボで接触させられる、実施形態１９２～２１１のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２１３．前記細胞が、前記ＬＮＰ製剤とインビボで接触させられる、実施形態１９２～２１２のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２１４．前記細胞が、前記ＬＮＰ製剤とエクスビボで接触させられる、実施形態１９２～２１３のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２１５．前記細胞が、幹細胞または前駆細胞、例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えば、胚性幹細胞もしくは前駆細胞に由来するＨＳＰＣまたは人工多能性幹細胞もしくは前駆細胞に由来するＨＳＰＣである、実施形態１９２～２１４のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２１６．前記細胞が、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、多能性前駆細胞、または多能性幹細胞である、実施形態１９２～２１５のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２１７．前記細胞が、ＨＳＰＣ、例えば、多能性ＨＳＣまたは多能性ＨＰＣである、実施形態１９２～２１６のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２１８．前記ＨＳＰＣが、以下の機能特性：
ｉ．自己複製する能力、
ｉｉ．無限の増殖能、
ｉｉｉ．休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、
ｉｖ．任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、
ｖ．例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、または
ｖｉ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、
のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する、実施形態２１７に記載のＬＮＰ組成物。
ｉ．自己複製する能力、
ｉｉ．無限の増殖能、
ｉｉｉ．休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、
ｉｖ．任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、
ｖ．例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、または
ｖｉ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、
のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する、実施形態２１７に記載のＬＮＰ組成物。
２１９．前記ＨＳＰＣが、以下の発現特性：
ｉ．ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、
ｉｉ．ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、
ｉｉｉ．ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、
ｉｖ．ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、
ｖ．ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、
ｖｉ．ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、
ｖｉｉ．原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、
ｖｉｉｉ．系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または
ｉｘ．（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、
のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する、実施形態２１７または２１８に記載のＬＮＰ組成物。
ｉ．ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、
ｉｉ．ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、
ｉｉｉ．ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、
ｉｖ．ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、
ｖ．ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、
ｖｉ．ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、
ｖｉｉ．原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、
ｖｉｉｉ．系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または
ｉｘ．（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、
のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する、実施形態２１７または２１８に記載のＬＮＰ組成物。
２２０．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか１つを有する、実施形態２１９に記載のＬＮＰ組成物。
２２１．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか２つを有する、実施形態２１９に記載のＬＮＰ組成物。
２２２．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか３つを有する、実施形態２１９に記載のＬＮＰ組成物。
２２３．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）の全てを有する、実施形態２１９に記載のＬＮＰ組成物。
２２４．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、実施形態２１９～２２３のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２２５．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の両方の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、前記ヒトＨＳＰＣが、細胞系列陰性ＨＳＰＣである、実施形態２１９～２２４のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２２６．前記ＨＳＰＣが、実施形態２８に記載の機能特性のうちのいずれか１つ、または全て、またはそれらの組み合わせを有し、前記ＨＳＰＣが、実施形態２９に記載の発現特性のうちのいずれか１つ、または全て、またはそれらの組み合わせを有する、実施形態２１８または２１９に記載のＬＮＰ組成物。
２２７．前記細胞と前記ＬＮＰ組成物との接触前に、前記細胞（例えば、細胞の集団）が、対象から単離され、インビトロで拡大、濃縮、及び／または培養される、実施形態１９２～２２６のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２２８．前記拡大、濃縮、及び／または培養された細胞、例えば、細胞の集団が、宿主、例えば、自家または同種異系宿主内に投与される、実施形態１９２～２２７のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２２９．前記改変細胞（例えば、改変細胞の集団）が、改変ＨＳＰＣ（例えば、改変ＨＳＰＣの集団）である、実施形態１９２～２２８のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２３０．前記改変ＨＳＰＣが、以下の機能特性：
ｉ．自己複製する能力、
ｉｉ．無限の増殖能、
ｉｉｉ．休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、
ｉｖ．任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、
ｖ．例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、または
ｖｉ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、
のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する、実施形態２２９に記載のＬＮＰ組成物。
ｉ．自己複製する能力、
ｉｉ．無限の増殖能、
ｉｉｉ．休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、
ｉｖ．任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、
ｖ．例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、または
ｖｉ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、
のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する、実施形態２２９に記載のＬＮＰ組成物。
２３１．前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例２に記載されるように、例えば、エクスビボコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにおいて測定したとき、または例えば、実施例３に記載されるように、系列追跡実験において測定したとき、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較して、ＣＦＵを形成する前記能力を有する、実施形態２２９または２３０に記載のＬＮＰ組成物。
２３２．前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例２に記載されるように、例えば、エクスビボコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにおいて測定したとき、または例えば、実施例３に記載されるように、系列追跡実験において測定したとき、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＣと比較して、骨髄系細胞に分化する前記能力を有する、実施形態２２９～２３１のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２３３．前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例３に記載されるように、例えば、系列追跡実験において測定したとき、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＣと比較して、リンパ系細胞に分化する前記能力を有する、実施形態２２９～２３２のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２３４．前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例３に示されるように、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較して、赤血球細胞または血小板に分化する前記能力を有する、実施形態２２９～２３３のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２３５．前記改変ＨＳＰＣが、インビボで赤血球細胞または血小板に分化する、実施形態２３４に記載のＬＮＰ組成物。
２３６．前記改変ＨＳＰＣが、インビトロで赤血球細胞または血小板に分化する、実施形態２３４に記載のＬＮＰ組成物。
２３７．前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例３に示されるように、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較して、好中球、単球、Ｂ細胞、またはＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞）に分化する前記能力を有する、実施形態２２９～２３６のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２３８．前記改変ＨＳＰＣが、インビボで好中球、単球、Ｂ細胞、またはＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞）に分化する、実施形態２３７に記載のＬＮＰ組成物。
２３９．前記改変ＨＳＰＣが、インビトロで好中球、単球、Ｂ細胞、またはＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞）に分化する、実施形態２３８に記載のＬＮＰ組成物。
２４０．前記改変ＨＳＰＣが、例えば、インビボで、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、もしくは３６５日間、またはそれよりも長く存続する、実施形態２２９～２３９のいずれかに記載のＬＮＰ組成物。
２４１．前記改変ＨＳＰＣの前記インビボでの存続が、例えば、実施例３に示されるように、１つまたは複数の細胞、例えば、前記骨髄系列の細胞及び／または前記リンパ系列の細胞への分化をもたらす、実施形態２４０に記載のＬＮＰ組成物。
２４２．前記改変ＨＳＰＣが、以下の発現特性：
ｉ．ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、
ｉｉ．ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、
ｉｉｉ．ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、
ｉｖ．ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、
ｖ．ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、
ｖｉ．ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、
ｖｉｉ．原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、
ｖｉｉｉ．系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または
ｉｘ．（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、
のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、または全てを有する、実施形態２２９～２４１のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
ｉ．ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、
ｉｉ．ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、
ｉｉｉ．ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、
ｉｖ．ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、
ｖ．ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、
ｖｉ．ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、
ｖｉｉ．原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、
ｖｉｉｉ．系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または
ｉｘ．（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、
のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、または全てを有する、実施形態２２９～２４１のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２４３．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか１つを有する、実施形態２４２に記載のＬＮＰ組成物。
２４４．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか２つを有する、実施形態２４２に記載のＬＮＰ組成物。
２４５．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか３つを有する、実施形態２４２に記載のＬＮＰ組成物。
２４６．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｉ）～（ｖｉ）の全てを有する、実施形態２４２に記載のＬＮＰ組成物。
２４７．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、実施形態２４２～２４６のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２４８．前記ヒトＨＳＰＣが、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の両方の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、前記ヒトＨＳＰＣが、細胞系列陰性ＨＳＰＣである、実施形態２４２～２４７のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２４９．前記改変ＨＳＰＣが、実施形態２３０に記載の機能特性のうちのいずれか１つ、または全て、またはそれらの組み合わせを有し、前記改変ＨＳＰＣが、実施形態２４２に記載の発現特性のうちのいずれか１つ、または全て、またはそれらの組み合わせを有する、実施形態２２９～２４８のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２５０．前記ペイロードが、核酸分子、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド分子、脂質分子、低分子量分子、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１９２～２４９のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２５１．前記ペイロードが、ＤＮＡ分子、例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む核酸分子を含む、実施形態２５０に記載のＬＮＰ組成物。
２５２．前記ペイロードが、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む核酸分子を含む、実施形態２５０または２５１に記載のＬＮＰ組成物。
２５３．前記ペイロードが、ｍＲＮＡを含む、実施形態２５０または２５１に記載のＬＮＰ組成物。
２５４．前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学修飾を含む、実施形態２５３に記載のＬＮＰ組成物。
２５５．前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、実施形態２５４に記載のＬＮＰ組成物。
２５６．前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態２５４に記載のＬＮＰ組成物。
２５７．前記化学修飾が、Ｎ１－メチルシュードウリジンである、実施形態２５４に記載のＬＮＰ組成物。
２５８．前記ｍＲＮＡが、完全に修飾されたＮ１－メチルシュードウリジンを含む、実施形態２５３～２５７のいずれかに記載のＬＮＰ組成物。
２５９．前記ペイロードが、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド分子を含む、実施形態２５３～２５８のいずれかに記載のＬＮＰ組成物。
２６０．前記ペイロードが、例えば、本明細書に記載されるような、脂質分子を含む、実施形態２５３～２５９のいずれかに記載のＬＮＰ組成物。
２６１．前記ペイロードが、例えば、本明細書に記載されるような、低分子量分子を含む、実施形態２５３～２６０のいずれかに記載のＬＮＰ組成物。
２６２．前記ペイロードが、遺伝子モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織の遺伝子を変化させるモジュレーター）、後成的モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織を後成的に変化させるモジュレーター）、ＲＮＡモジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織におけるＲＮＡ分子を変化させるモジュレーター）、ペプチドモジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織におけるペプチド分子を変化させるモジュレーター）、脂質モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織における脂質分子を変化させるモジュレーター）、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１９２～２６１のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２６３．前記ペイロードが、遺伝子モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織の遺伝子を変化させるモジュレーター）を含む、実施形態１９２～２６２のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２６４．前記遺伝子モジュレーターが、例えば、核酸塩基を変化させること、例えば、挿入、欠失、変異（例えば、ミスセンス変異、サイレント変異、またはナンセンス変異）、重複、もしくは逆位、またはそれらの任意の組み合わせを導入することによって、ＤＮＡ分子における核酸配列を改変する、システムを含む、実施形態２６２または２６３に記載のＬＮＰ組成物。
２６５．前記遺伝子モジュレーターが、ＤＮＡ塩基エディター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、メガヌクレアーゼシステム、もしくはトランスポザーゼシステム、またはそれらの任意の組み合わせ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム及びトランスポザーゼシステムの組み合わせを含む、実施形態２６２～２６４のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２６６．前記遺伝子モジュレーターが、鋳型ＤＮＡを含む、実施形態２６２～２６５のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２６７．前記遺伝子モジュレーターが、鋳型ＤＮＡを含まない、実施形態２６２～２６５のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２６８．前記遺伝子モジュレーターが、鋳型ＲＮＡを含む、実施形態２６２～２６７のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２６９．前記遺伝子モジュレーターが、鋳型ＲＮＡを含まない、実施形態２６２～２６７のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２７０．前記遺伝子モジュレーターが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムを含む、実施形態２６２～２６９のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２７１．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子と、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ３タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ａタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ｅタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１３タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、またはＣａｓ１４タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントとを含む、実施形態２７０に記載のＬＮＰ組成物。
２７２．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡ分子と、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ３タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ａタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ｅタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１３タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、またはＣａｓ１４タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントをコードする核酸とを含む、実施形態２７０または２７１に記載のＬＮＰ組成物。
２７３．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントとを含む、実施形態２７０または２７１に記載のＬＮＰ組成物。
２７４．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントをコードする核酸とを含む、実施形態２７０または２７１に記載のＬＮＰ組成物。
２７５．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、鋳型ＤＮＡをさらに含む、実施形態２７０または２７４のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２７６．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、鋳型ＲＮＡをさらに含む、実施形態２７０または２７５のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２７７．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムが、逆転写酵素をさらに含む、実施形態２７０または２７６のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２７８．前記遺伝子モジュレーターが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムを含む、実施形態２６２～２６９のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２７９．前記ＺＦＮシステムが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む、実施形態２７８に記載のＬＮＰ組成物。
２８０．前記ＺＦＮシステムが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドを含む、実施形態２７８または２７９に記載のＬＮＰ組成物。
２８１．前記ジンクフィンガー結合ドメインが、１、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれよりも多くのジンクフィンガー、例えば、３つまたは６つのジンクフィンガーを含む、実施形態２８０に記載のＬＮＰ組成物。
２８２．前記ＺＦＮシステムが、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む、実施形態２７８～２８１のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２８３．前記ヌクレアーゼ活性を有するペプチドが、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである、実施形態２８２に記載のＬＮＰ組成物。
２８４．前記ＺＦＮシステムが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態２７８に記載のＬＮＰ組成物。
２８５．前記ＺＦＮシステムが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態２８４に記載のＬＮＰ組成物。
２８６．前記ジンクフィンガー結合ドメインが、１、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれよりも多くのジンクフィンガー、例えば、３つまたは６つのジンクフィンガーを含む、実施形態２８５に記載のＬＮＰ組成物。
２８７．前記ＺＦＮシステムが、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態２８４または２８５に記載のＬＮＰ組成物。
２８８．前記ヌクレアーゼ活性を有するペプチドが、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである、実施形態２８７に記載のＬＮＰ組成物。
２８９．前記ＺＦＮシステムが、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをさらに含む、実施形態２７８～２８８のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
２９０．前記遺伝子モジュレーターが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムである、実施形態２６２～２８９に記載のＬＮＰ組成物。
２９１．前記ＴＡＬＥＮシステムが、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む、実施形態２９０に記載のＬＮＰ組成物。
２９２．前記ＴＡＬＥＮシステムが、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを有するペプチドを含む、実施形態２９０または２９１に記載のＬＮＰ組成物。
２９３．前記ＴＡＬＥＮシステムが、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む、実施形態２９０または２９１に記載のＬＮＰ組成物。
２９４．前記ヌクレアーゼ活性を有するペプチドが、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである、実施形態２９３に記載のＬＮＰ組成物。
２９５．前記ＴＡＬＥＮシステムが、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態２９０に記載のＬＮＰ組成物。
２９６．前記ＴＡＬＥＮシステムが、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態２９５に記載のＬＮＰ組成物。
２９７．前記ＺＦＮシステムが、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態２９５に記載のＬＮＰ組成物。
２９８．前記ヌクレアーゼ活性を有するペプチドが、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである、実施形態２９７に記載のＬＮＰ組成物。
２９９．前記ＴＡＬＥＮシステムが、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをさらに含む、実施形態２９０～２９８のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３００．前記遺伝子モジュレーターが、メガヌクレアーゼシステムを含む、実施形態２６２～２６９のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３０１．前記メガヌクレアーゼシステムが、ＤＮＡ結合ドメイン、及びヌクレアーゼ活性、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼを有するペプチドを含む、実施形態３００に記載のＬＮＰ組成物。
３０２．前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、例えば、Ｓｉｌｖａ Ｇ．ｅｔ ａｌ，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（１）：１１－２７に記載されるような、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ（配列番号２７０）、ＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスエンドヌクレアーゼ、もしくはＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫエンドヌクレアーゼ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを含む、実施形態３０１に記載のＬＮＰ組成物。
３０３．前記メガヌクレアーゼシステムが、ＤＮＡ結合ドメイン、及びヌクレアーゼ活性、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼを有するペプチドをコードする核酸を含む、実施形態３００に記載のＬＮＰ組成物。
３０４．前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、例えば、Ｓｉｌｖａ Ｇ．ｅｔ ａｌ，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（１）：１１－２７に記載されるような、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ（配列番号２７０）、ＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスエンドヌクレアーゼ、もしくはＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫエンドヌクレアーゼ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを含む、実施形態３０３に記載のＬＮＰ組成物。
３０５．前記システムが、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをさらに含む、実施形態３００～３０４のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３０６．前記遺伝子モジュレーターが、トランスポザーゼシステムを含む、実施形態２６２～３０５のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３０７．前記トランスポザーゼシステムが、逆転写酵素及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、レトロトランスポゾン、例えば、ＬＴＲレトロトランスポゾンまたは非ＬＴＲレトロトランスポゾンを有するペプチドをコードする核酸配列を含む、実施形態３０６に記載のＬＮＰ組成物。
３０８．前記トランスポザーゼシステムが、鋳型、例えば、ＲＮＡ鋳型を含む、実施形態３０６または３０７に記載のＬＮＰ組成物。
３０９．前記ペイロードが、後成的モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織を後成的に変化させるモジュレーター）を含む、実施形態１９２～３０８のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３１０．前記後成的モジュレーターが、クロマチン構造を改変する、ＤＮＡをメチル化する、及び／またはヒストンを修飾する分子を含む、実施形態３０９に記載のＬＮＰ組成物。
３１１．前記後成的モジュレーターが、クロマチン構造を改変する分子、例えば、ＳＷＩ／ＳＮＦリモデリング複合体またはその構成要素を含む、実施形態３０９または３１０に記載のＬＮＰ組成物。
３１２．前記後成的モジュレーターが、ＤＮＡをメチル化する分子、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、またはＭ．ＳｓｓＩ）；ポリコーム抑制複合体もしくはその構成要素、例えば、ＰＲＣ１もしくはＰＲＣ２、もしくはＰＲ－ＤＵＢ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；デメチラーゼ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント（例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２、またはＴｅｔ３）を含む、実施形態３０９～３１１のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３１３．前記後成的モジュレーターが、ヒストンを修飾する、例えば、ヒストンをメチル化する及び／またはアセチル化する分子、例えば、ヒストン修飾酵素またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、例えば、ＨＭＴ、ＨＤＭ、ＨＡＴ、またはＨＤＡＣを含む、実施形態３０９～３１２のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３１４．前記ペイロードが、ＲＮＡモジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織におけるＲＮＡ分子を変化させるモジュレーター）を含む、実施形態１９２～３１３のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３１５．前記ＲＮＡモジュレーターが、ＲＮＡ分子の発現及び／または活性、安定性または区画化を変化させる分子を含む、実施形態３１４に記載のＬＮＰ組成物。
３１６．前記ＲＮＡモジュレーターが、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む、実施形態３１４または３１５に記載のＬＮＰ組成物。
３１７．前記ＲＮＡモジュレーターが、ＤＮＡ分子を含む、実施形態３１４～３１６のいずれかに記載のＬＮＰ組成物。
３１８．前記ＲＮＡモジュレーターが、低分子量分子を含む、実施形態３１４～３１７のいずれかに記載のＬＮＰ組成物。
３１９．前記ＲＮＡモジュレーターが、ペプチド、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；あるいは酵素、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを含む、実施形態３１４～３１８のいずれかに記載のＬＮＰ組成物。
３２０．前記ＲＮＡモジュレーターが、ＲＮＡ塩基エディターシステムを含む、実施形態３１４～３１９のいずれかに記載のＬＮＰ組成物。
３２１．前記ＲＮＡ塩基エディターシステムが、デアミナーゼ、例えば、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）；Ｃａｓタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはガイドＲＮＡを含む、実施形態３２０に記載のＬＮＰ組成物。
３２２．前記ＲＮＡ塩基エディターシステムが、鋳型、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型をさらに含む、実施形態３２０または３２１に記載のＬＮＰ組成物。
３２３．ペイロードが、ペプチドモジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織におけるペプチド分子を変化させるモジュレーター）を含む、実施形態１９２～３２２のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３２４．前記ペイロードが、脂質モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織における脂質分子を変化させるモジュレーター）、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１９２～３２３のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３２５．前記ペイロードが、治療ペイロードまたは予防ペイロードを含む、実施形態１９２～３２４のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３２６．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、分泌タンパク質、膜結合型タンパク質、もしくは細胞間タンパク質；または分泌タンパク質、膜結合型タンパク質、もしくは細胞間タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、実施形態３２５に記載のＬＮＰ組成物。
３２７．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む、実施形態３２５または３２６に記載のＬＮＰ組成物。
３２８．前記対象が、ヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）遺伝子における変異を有し、及び／またはヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）遺伝子の異常な発現を有する、実施形態１９２～３２７のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３２９．前記対象が、凝固因子をコードする遺伝子における変異を有し、及び／または凝固因子をコードする遺伝子の異常な発現を有する、実施形態１９２～３２８のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３３０．前記対象が、哺乳動物、例えば、ヒトである、実施形態１９２～３２９のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３３１．前記ＬＮＰ組成物が、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む、実施形態１９２～１９６または１９８～３２０のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３３２．前記イオン化可能な脂質が、アミノ脂質を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３３３．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ）、（Ｉ－Ｉ）、（Ｉ－ＩＩ）、（Ｉ－ＩＩＩ）、（Ｉ－ＩＶ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（ＩＩ）、または（ＩＩ－Ｉ）のうちのいずれかの化合物を含む、実施形態３３２に記載のＬＮＰ組成物。
３３４．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ）の化合物を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３３５．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉａ）の化合物を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３３６．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉｂ）の化合物を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３３７．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉｃ）の化合物を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３３８．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３３９．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ－ＩＩ）の化合物を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３４０．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ－ＩＩＩ）の化合物を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３４１．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ－ＩＶ）の化合物を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３４２．前記イオン化可能な脂質が、式（ＩＩ）の化合物を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３４３．前記イオン化可能な脂質が、式（ＩＩ－Ｉ）の化合物を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３４４．前記非カチオン性ヘルパー脂質または前記リン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、またはＤＯＰＣからなる群から選択される化合物を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３４５．前記リン脂質が、ＤＳＰＣ、例えば、ＤＳＰＣのバリアント、例えば、式（ＩＶ）の化合物である、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３４６．前記構造脂質が、アルファ－トコフェロール、β－シトステロール、またはコレステロールから選定される、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３４７．前記構造脂質が、アルファ－トコフェロールである、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３４８．前記構造脂質が、β－シトステロールである、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３４９．前記構造脂質が、コレステロールである、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３５０．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３５１．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質からなる群から選択される、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３５２．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－ＤＭＧである、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３５３．前記ＰＥＧ脂質が、式（Ｖ）、式（ＶＩ－Ａ）、式（ＶＩ－Ｂ）、式（ＶＩ－Ｃ）、または式（ＶＩ－Ｄ）の化合物から選定される、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３５４．前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ａ）の化合物である、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３５５．前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ｂ）の化合物である、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３５６．前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ｃ）の化合物である、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３５７．前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ｄ）の化合物である、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３５８．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含み、前記リン脂質が、ＤＳＰＣを含み、前記構造脂質が、コレステロールを含み、前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ｄ）の化合物を含む、実施形態３３１に記載のＬＮＰ組成物。
３５９．前記ＬＮＰが、約２０～６０％のイオン化可能な脂質：５～２５％のリン脂質：２５～５５％のコレステロール；及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、実施形態３３１～３５８のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３６０．前記ＬＮＰが、約５０％のイオン化可能な脂質：約１０％のリン脂質：約３８．５％のコレステロール；及び約１．５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、実施形態３５９に記載のＬＮＰ組成物。
３６１．前記ＬＮＰが、約４９．８３％のイオン化可能な脂質：約９．８３％のリン脂質：約３０．３３％のコレステロール；及び約２．０％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、実施形態３５９に記載のＬＮＰ組成物。
３６２．前記ＬＮＰ組成物が、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼内、または経肺送達（例えば、単回または反復送達）用に製剤化される、実施形態３３１～３６１のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
３６３．前記ＬＮＰ組成物が、静脈内送達（例えば、単回または反復送達）用に製剤化される、実施形態３３１～３６２のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
細胞、例えば、幹細胞もしくは前駆細胞、または組織のインビボ改変は、疾患または障害を処置するための貴重なツールであり得る。造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）の遺伝子編集は、生命を脅かす多数の重篤な病態を処置するための有望な手法である。
現在のところ、異なる病態に対してＨＳＰＣ遺伝子編集を試験する１５０件を超える臨床試験が進行しているが、それらの全てはエクスビボ遺伝子編集を用いる。かかるエクスビボ手順は、費用がかかり、技術的に複雑であり、ＨＳＰＣを動員するためのサイトカインでの患者の前処置、次いでひとたび編集されたＨＳＰＣが患者に再び移植された際に遺伝子編集されたＨＳＰＣの生着を可能にするための骨髄破壊を必要とすることから、相当な病的状態に関連する。ＨＳＰＣのインビボ遺伝子編集を可能にすることは大きな前進であろう。インビボでＨＳＰＣにトランスフェクトするために使用される、カーゴ、例えば、核酸カーゴを運搬するＬＮＰにより、ＨＳＰＣの単離、エクスビボ遺伝子編集、及び従来の骨髄（ＢＭ）移植の必要性は除去されよう。
本明細書では、とりわけ、ペイロードを含むＬＮＰ組成物が細胞のインビボ改変、例えば、細胞、例えば、幹細胞または前駆細胞、例えば、造血幹細胞・前駆細胞におけるインビボ遺伝子編集をもたらすことができるという発見が開示される。一部の実施形態では、本開示は、インビボで細胞、例えば、幹細胞もしくは前駆細胞、または組織を改変することができるペイロードを含むＬＮＰ組成物を提供する。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、追加の標的化部分を含まず、例えば、それは追加の標的化部分なしに（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）の本明細書に記載の細胞、例えば、幹細胞または前駆細胞（例えば、ＨＳＰＣ）にトランスフェクトする。理論に拘束されることを望むものではないが、一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞または組織のインビボ改変方法により、細胞（例えば、ＨＳＰＣ）の単離、エクスビボ遺伝子編集、及び／または骨髄移植の必要性が除去されると考えられる。本明細書に開示される発見は、細胞のインビボ改変、例えば、インビボ遺伝子編集における前進を提供し、ある実施形態では、数多くの壊滅的な疾患の処置を可能にする。
ペイロードを含むＬＮＰ組成物の例示的なインビボ遺伝子編集効果が、実施例１～３で提供される。実施例１は、造血幹細胞またはその前駆細胞が、ペイロードを含むＬＮＰ組成物によりインビボで遺伝子編集され得ることを実証する。実施例２～３は、ペイロードを含むＬＮＰ組成物によりインビボで遺伝子編集された造血幹細胞・前駆細胞の効果を示す。実施例２は、インビボで遺伝子編集された造血幹細胞・前駆細胞からのＨＳＰＣ由来コロニー形成単位（ＣＦＵ）の生成を示し、実施例３は、インビボで遺伝子編集された造血幹細胞・前駆細胞がインビボで血小板、赤血球、好中球、単球、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を生じさせることができることを示す。実施例４は、インビボで遺伝子編集されたＨＳＰＣの幹細胞らしさ（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の潜在能の評価について記載する。
したがって、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物によりインビボで細胞、例えば、幹細胞または前駆細胞を改変する方法が本明細書に開示される。また、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物によりインビボで組織を改変する方法も本明細書に開示される。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、細胞もしくは組織に関連するパラメータを改変するか、または細胞もしくは組織に関連する構成成分を改変する。さらに、疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象を処置する方法が本明細書に開示され、該方法は、対象に、ペイロードを含む有効量のＬＮＰ組成物を投与することを含む。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、対象において細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）の改変、例えば、細胞に関連する構成成分または細胞に関連するパラメータの改変をもたらす。また、例えば、細胞または組織のインビボ改変において使用するための、ペイロードを含むＬＮＰ組成物、及びその作製方法も本明細書に開示される。本開示の追加の態様が、下記にさらに詳細に記載される。
定義
細胞に関連するパラメータ：本明細書で使用される「細胞または組織に関連するパラメータ」という語句は、細胞または組織に関連する遺伝子型パラメータ、表現型パラメータ、機能パラメータ、発現パラメータ、またはシグナル伝達パラメータを指す。ある実施形態では、発現パラメータは、以下：（ａ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベル、（ｂ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性、（ｃ）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾、（ｄ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）折り畳み、及び／または（ｅ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性、のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む。ある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、以下：（１）シグナル伝達経路、例えば、細胞シグナル伝達経路の調節、（２）細胞運命の調節、（３）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベルの調節、（４）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性の調節、及び／または（５）例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性の調節、のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む。ある実施形態では、表現型パラメータは、細胞の表面上の分子、例えば、細胞表面タンパク質、脂質、または接着分子の発現及び／または活性を含む。
細胞に関連するパラメータ：本明細書で使用される「細胞または組織に関連するパラメータ」という語句は、細胞または組織に関連する遺伝子型パラメータ、表現型パラメータ、機能パラメータ、発現パラメータ、またはシグナル伝達パラメータを指す。ある実施形態では、発現パラメータは、以下：（ａ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベル、（ｂ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性、（ｃ）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾、（ｄ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）折り畳み、及び／または（ｅ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性、のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む。ある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、以下：（１）シグナル伝達経路、例えば、細胞シグナル伝達経路の調節、（２）細胞運命の調節、（３）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベルの調節、（４）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性の調節、及び／または（５）例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性の調節、のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む。ある実施形態では、表現型パラメータは、細胞の表面上の分子、例えば、細胞表面タンパク質、脂質、または接着分子の発現及び／または活性を含む。
細胞に関連する構成成分：本明細書で使用される「細胞に関連する構成成分」という語句は、細胞にとって内因性である（例えば、天然型）または細胞にとって外因性である（例えば、それに導入される）構成成分を指す。ある実施形態では、細胞に関連する構成成分は、（１）細胞に関連する核酸もしくはその断片、例えば、ＤＮＡ（例えば、エクソン、イントロン、遺伝子間、テロメア、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、リプレッサー、コーディング、ノンコーディング）もしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、（２）細胞に関連するペプチドもしくはタンパク質またはその断片、（３）細胞に関連する脂質成分もしくはその断片、またはそれらの組み合わせを含む。
ウリジン含量：「ウリジン含量」または「ウラシル含量」という用語は、互換的であり、ある特定の核酸配列に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含量またはウラシル含量は、絶対値（配列内のウリジンまたはウラシルの総数）または相対的（核酸配列内の核酸塩基の総数に対するウリジンまたはウラシルのパーセンテージ）として表され得る。
代替のヌクレオシド．「代替のヌクレオシド」は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、またはポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ分子等）を参照して本明細書でこの用語が使用されるとき、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣリボヌクレオチドに対する変化を指す。一般に、本明細書では、これらの用語は、天然型のｍＲＮＡの５’末端キャップ部分におけるリボヌクレオチドの変化を指すことは意図されない。この変化は、種々の明確に異なる変化であり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合、コーディング領域、隣接領域、及び／または末端領域（例えば、３’安定化領域）は、１つ、２つ、またはそれよりも多くの（任意選択で異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド変化を含有してもよい。一部の実施形態では、細胞に導入される代替のポリヌクレオチドは、未変化のポリヌクレオチドと比較して細胞内での低減された分解を示し得る。
投与する：本明細書で使用されるとき、「投与する」とは、組成物を対象または患者に送達する方法を指す。投与方法は、身体の特定の領域または系に送達を標的化する（例えば、特異的に送達する）ように選択され得る。例えば、投与は、非経口（例えば、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、動脈内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、もしくは頭蓋内注射、ならびに任意の好適な注入技法）、経口、経皮または皮内、皮間、直腸、膣内、局所（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／または液滴による）、粘膜、鼻腔、頬側、経腸、硝子体、腫瘍内、舌下、鼻腔内；気管内注入、気管支注入、及び／または吸入による；口腔スプレー及び／または粉末、鼻腔スプレー、及び／またはエアロゾルとして、及び／または門脈カテーテルを介するものであってもよい。好ましい投与手段は、静脈内または皮下である。
およそ、約：本明細書で使用されるとき、目的とする１つまたは複数の値に適用されるような「およそ」または「約」という用語は、述べられる参照値に類似した値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別途定めのない限り、または文脈から別途明らかでない限り、述べられる参照値のいずれかの方向（それよりも大きいまたは小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に収まる値の範囲を指す（かかる数が、可能な値の１００％を超える場合を除く）。例えば、ＬＮＰの脂質成分中の所与の化合物の量の文脈で使用されるとき、「約」とは、列挙される値の＋／－１０％を意味し得る。例えば、約５０％の所与の化合物を有する脂質成分を含むＬＮＰは、４５～５５％の該化合物を含んでもよい。
接触させる：本明細書で使用されるとき、「接触させる」という用語は、２つ以上の実体間の物理的つながりを確立することを意味する。例えば、細胞をｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子組成物と接触させることは、細胞及びｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子に物理的つながりを共有させることを意味する。細胞を、インビボ、インビトロ、及びエクスビボの両方で外部実体と接触させる方法は、生物学分野で周知されている。本開示の例示的な実施形態では、哺乳類細胞を組成物（例えば、本開示のナノ粒子、または薬学的組成物）と接触させるステップは、インビボで実施される。例えば、脂質ナノ粒子組成物と、生物（例えば、哺乳動物）内に配置され得る細胞（例えば、哺乳類細胞）とを接触させることは、任意の好適な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下投与を含めた、生物への非経口投与）によって実施されてもよい。インビトロに存在する細胞については、組成物（例えば、脂質ナノ粒子）と細胞とは、例えば、組成物を細胞の培養基に添加することによって接触させられてもよく、トランスフェクションを伴い得るか、またはそれをもたらし得る。さらに、１つよりも多くの細胞が、ナノ粒子組成物により接触させられてもよい。
送達する：本明細書で使用されるとき、「送達する」という用語は、実体を目的箇所に提供することを意味する。例えば、治療薬及び／または予防薬を対象に送達することは、治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰを対象に（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、経肺、または皮下経路によって）投与することを伴い得る。哺乳動物または哺乳類細胞へのＬＮＰの投与は、１つまたは複数の細胞を脂質ナノ粒子と接触させることを伴い得る。
カプセル封入する：本明細書で使用されるとき、「カプセル封入する」という用語は、封入する、包囲する、または包むことを意味する。一部の実施形態では、化合物、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、または他の組成物は、完全にカプセル封入されるか、部分的にカプセル封入されるか、または実質的にカプセル封入されてもよい。例えば、一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子、例えば、リポソーム中にカプセル封入されてもよい。
カプセル封入効率：本明細書で使用されるとき、「カプセル封入効率」とは、ＬＮＰの調製に使用された治療薬及び／または予防薬の当初の総量に対する、ＬＮＰの一部となる治療薬及び／または予防薬の量を指す。例えば、組成物に当初提供された総計１００ｍｇの治療薬及び／または予防薬のうち、９７ｍｇの治療薬及び／または予防薬がＬＮＰ中にカプセル封入される場合、カプセル封入効率は、９７％として求められ得る。本明細書で使用されるとき、「カプセル封入」は、完全な、実質的な、または部分的な封入、閉じ込め、包囲、または包み込みを指してもよい。
有効量：本明細書で使用されるとき、薬剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果を達成するのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されている文脈に依存する。例えば、本開示の脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）中の標的細胞送達増強脂質の量の文脈において、標的細胞送達増強脂質の有効量は、標的細胞送達増強脂質を欠いた脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）と比較して有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）によって達成される有益なまたは所望の結果の非限定的な例としては、トランスフェクトされた細胞のパーセンテージの増加、及び／または脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）に会合した／それによりカプセル封入された核酸によってコードされるタンパク質の発現レベルの増加が挙げられる。対象において有効量の脂質ナノ粒子が標的細胞によって取り込まれるように、標的細胞送達増強脂質を含有する脂質ナノ粒子を投与することの文脈において、標的細胞送達増強脂質を含有するＬＮＰの有効量は、標的細胞送達増強脂質を欠いたＬＮＰと比較して有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。対象における有益なまたは所望の結果の非限定的な例としては、標的細胞送達増強脂質を欠いたＬＮＰと比較した、トランスフェクトされた細胞のパーセンテージの増加、標的細胞送達増強脂質を含有するＬＮＰに会合した／それによりカプセル封入された核酸によってコードされたタンパク質の発現レベルの増加 及び／または標的細胞送達増強脂質を含有するＬＮＰに会合した／それによりカプセル封入された核酸、またはそのコードされたタンパク質のインビボでの予防効果もしくは治療効果の増加が挙げられる。一部の実施形態では、標的細胞送達増強脂質を含有するＬＮＰの治療上有効量は、感染症、疾患、障害、及び／または病態を患っているかまたはそれに感受性がある対象に投与されたときに、感染症、疾患、障害、及び／または病態を処置する、その症状を改善する、それを診断する、それを予防する、及び／またはその発症を遅延させるのに十分である。別の実施形態では、脂質ナノ粒子の有効量は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、またはそれよりも多くの標的細胞において所望のタンパク質の発現をもたらすのに十分である。例えば、標的細胞送達増強脂質を含有するＬＮＰの有効量は、単回静脈内注射後に少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％の標的細胞のトランスフェクションをもたらす量であり得る。
発現：本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」とは、以下の事象のうちの１つまたは複数を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）、（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、及び（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
エクスビボ：本明細書で使用されるとき、「エクスビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはその細胞もしく組織）の外側で生じる事象を指す。エクスビボ事象は、天然（例えば、インビボ）環境から最小限に変化した環境で起こってもよい。
断片：本明細書で使用される「断片」とは、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された完全長タンパク質を消化することによって得られる、または組換えＤＮＡ技法により得られるポリペプチドを含んでもよい。タンパク質の断片は、例えば、タンパク質の断片が当該タンパク質の機能的活性を保持するように１つまたは複数の機能的ドメインを含む、タンパク質の一部分であり得る。
異種：本明細書で使用されるとき、「異種」とは、配列（例えば、アミノ酸配列、またはアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）が、所与のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに通常は存在しないことを示す。例えば、あるタンパク質のドメインまたはモチーフに対応するアミノ酸配列は、第２のタンパク質に対して異種であり得る。
単離された：本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、それが会合していた（自然界でまたは実験環境でのいずれを問わず）成分のうちの少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離された物質は、それらが会合していた物質に関して、様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質及び／または実体は、それらが当初会合していたその他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれよりも多くから分離され得る。一部の実施形態では、単離された作用物質は、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、または約９９％超純粋である。本明細書で使用されるとき、物質は、それが他の構成成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。
リポソーム：本明細書で使用されるとき、「リポソーム」とは、水性の内部を封入する脂質含有膜を含む構造を意味する。リポソームは、１つまたは複数の脂質膜を有してもよい。リポソームには、単層（ｓｉｎｇｌｅ－ｌａｙｅｒｅｄ）リポソーム（当該技術分野で単層（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）リポソームとしても知られている）及び多層（ｍｕｌｔｉ－ｌａｙｅｒｅｄ）リポソーム（当該技術分野で多重層（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）リポソームとしても知られている）が含まれる。
改変された：本明細書で使用されるとき、「改変された」とは、本開示の分子の変化した状態または構造、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の組成または構造の変化を指す。分子、例えば、ポリヌクレオチドは、化学的、構造的、及び／または機能的を含む様々な方式で改変され得る。例えば、分子、例えば、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のＲＮＡエレメントの組み込みによって構造的に改変され得、このＲＮＡエレメントは、１つまたは複数の機能（例えば、翻訳制御活性）を提供する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含む。したがって、本開示の分子、例えば、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の改変体から構成されてもよい（例えば、１つまたは複数の化学的、構造的、または機能的改変（それらの任意の組み合わせを含む）を含んでもよい）。一実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ分子は、非天然ヌクレオシド及び／またはヌクレオチドの導入によって改変される（例えば、それが天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣに関するとき）。キャップ構造等の非古典的ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なるものの、「改変された」とは見なされない。
ｍＲＮＡ：本明細書で使用されるとき、「ｍＲＮＡ」とは、メッセンジャーリボ核酸を指す。ｍＲＮＡは、天然型であっても非天然型であってもよい。例えば、ｍＲＮＡは、改変された及び／または非天然型の構成要素、例えば、１つまたは複数の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含んでもよい。ｍＲＮＡは、キャップ構造、連鎖停止ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。ｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有してもよい。ｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳類細胞の内部でのｍＲＮＡのインビボ翻訳は、ポリペプチドを産生し得る。慣例では、ｍＲＮＡ分子の基本的構成要素には、少なくともコーディング領域、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリＡ配列が含まれる。ある実施形態では、ｍＲＮＡは、環状ｍＲＮＡである。
ナノ粒子：本明細書で使用されるとき、「ナノ粒子」とは、同じ材料のバルク試料と比較して新規の特性を示す、約１０００ｎｍ未満のスケールでの任意の１つの構造的特徴を有する粒子を指す。通例では、ナノ粒子は、約５００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、または約１００ｎｍのスケールでの任意の１つの構造的特徴を有する。同じく通例では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約７０～約１２０ｎｍのスケールでの任意の１つの構造的特徴を有する。例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１～１０００ｎｍ程度の１つまたは複数の寸法を有する粒子である。他の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍ程度の１つまたは複数の寸法を有する粒子である。他の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約５０～２００ｎｍ程度の１つまたは複数の寸法を有する粒子である。球状ナノ粒子は、例えば、約５０～１００または７０～１２０ナノメートルの直径を有するであろう。ナノ粒子は、その輸送及び特性の点で、単位として挙動することが最も多い。対応するバルク材料からナノ粒子を差別化する新規の特性は、典型的には、１０００ｎｍ未満のサイズスケールで、または約１００ｎｍのサイズで現れるが、ナノ粒子は、例えば、長円形、管状等である粒子の場合、より大きなサイズのものであり得ることに留意されたい。ほとんどの分子のサイズは上記の外形に収まろうが、個々の分子は通常、ナノ粒子とは称されない。
核酸：本明細書で使用されるとき、「核酸」という用語は、最も広義に使用され、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を包含する。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと称される場合が多い。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドには、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含めたＬＮＡ）、またはそれらのハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。
核酸塩基：本明細書で使用されるとき、「核酸塩基」（代替として「ヌクレオチド塩基」または「窒素塩基」）という用語は、核酸またはその一部分もしくはセグメントに改善された特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性）を付与する、天然型プリン及びピリミジンの任意の誘導体または類似体を含めた、核酸に見出されるプリンまたはピリミジン複素環式化合物を指す。アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルは、天然核酸に優勢的に見出される核酸塩基である。当該技術分野で既知である及び／または本明細書に記載されるような、他の天然、非天然、及び／または合成核酸塩基が、核酸に組み込まれ得る。
ヌクレオシド／ヌクレオチド：本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」という用語は、核酸塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）、またはその誘導体もしくは類似体（本明細書で同じく「核酸塩基」と称される）に共有結合性で連結された糖分子（例えば、ＲＮＡにおいてはリボース、またはＤＮＡにおいてはデオキシリボース）、またはその誘導体もしくは類似体を含有するが、ヌクレオシド間連結基（例えば、リン酸基）を欠いた化合物を指す。本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」という用語は、核酸またはその一部分もしくはセグメントに改善された化学特性及び／または機能的特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性）を付与する、ヌクレオシド間連結基（例えば、リン酸基）に共有結合されたヌクレオシド、またはその任意の誘導体、類似体、もしくは改変体を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」（「ＯＲＦ」と略称される）という用語は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子のセグメントまたは領域を指す。ＯＲＦは、開始コドンから始まり、終止コドンで終わる、重複しないインフレームコドンの連続した連なりを含み、リボソームによって翻訳される。
患者：本明細書で使用されるとき、「患者」とは、特定の疾患または病態に対して、処置を求め得るか、もしくはその必要があり得るか、処置を必要とするか、処置を受けているか、処置を受けることになる対象、またはそれに対して訓練された専門家にかかっている対象を指す。特定の実施形態では、患者は、ヒト患者である。
薬学的に許容される：「薬学的に許容される」という語句は、本明細書において、賢明な医療判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適な、化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指して用いられる。
薬学的に許容される賦形剤：本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、本明細書に記載の化合物以外（例えば、活性化合物を懸濁または溶解させることができるビヒクル）であり、患者において実質的に無毒で非炎症性である特性を有する任意の成分を指す。賦形剤には、粘着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、染料（色素）、軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはコーティング剤、香味料、香料、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（流動促進剤（ｆｌｏｗ ｅｎｈａｎｃｅｒ））、滑沢剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、及び水和水が含まれ得る。例示的な賦形剤には、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微晶質セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが含まれるが、これらに限定されない。
薬学的に許容される塩：本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される塩」とは、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって（例えば、遊離塩基を好適な有機酸と反応させることによって）親化合物が修飾されている、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、アミン等の塩基性残基の鉱塩または有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩または有機塩等が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩（ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ）、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシルスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が含まれる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等を含むがこれらに限定されない無毒のアンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオンが含まれる。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば、無毒の無機酸または有機酸から形成された、親化合物の従来の無毒の塩が含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、かかる塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水中もしくは有機溶媒中、またはこれら２つの混合物中（一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性溶媒が好ましい）で化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．ＧＷｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８、及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に見出され、同文献の各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。
ポリペプチド：本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」または「目的とするポリペプチド」という用語は、天然に（例えば、単離または精製される）または合成的に生産され得る、典型的にはペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。
ＲＮＡ：本明細書で使用されるとき、「ＲＮＡ」とは、天然型であっても非天然型であってもよいリボ核酸を指す。例えば、ＲＮＡは、改変された及び／または非天然型の構成要素、例えば、１つまたは複数の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含んでもよい。ＲＮＡは、キャップ構造、連鎖停止ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。ＲＮＡは、目的とするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有してもよい。例えば、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳類細胞の内部でのｍＲＮＡのインビボ翻訳は、コードされたポリペプチドを産生し得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及びそれらの混合物からなる非限定的な群から選択され得る。
ＲＮＡエレメント：本明細書で使用されるとき、「ＲＮＡエレメント」という用語は、生物学的機能を提供する、及び／または生物学的活性（例えば翻訳制御活性）を有する、ＲＮＡ分子の一部分、断片、またはセグメントを指す。本明細書に記載のＲＮＡエレメント等の１つまたは複数のＲＮＡエレメントの組み込みによるポリヌクレオチドの改変は、改変されたポリヌクレオチドに１つまたは複数の望ましい機能的特性を提供する。本明細書に記載されるＲＮＡエレメントは、天然型、非天然型、合成、操作型、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、制御活性を提供する天然型ＲＮＡエレメントには、ウイルス、原核生物及び真核生物（例えば、ヒト）のトランスクリプトーム全体にわたって見出されるエレメントが含まれる。特定の真核生物ｍＲＮＡ及び翻訳されたウイルスＲＮＡにおけるＲＮＡエレメントは、細胞内の多くの機能の媒介に関与することが示されている。例示的な天然ＲＮＡエレメントには、翻訳開始エレメント（例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｋｉｅｆｔ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＲＮＡ７（２）：１９４－２０６を参照されたい）、翻訳エンハンサーエレメント（例えば、ＡＰＰ ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４（１０）：６４２１－６４３１を参照されたい）、ｍＲＮＡ安定性エレメント（例えば、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、Ｇａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８（２）：１１３－１２６を参照されたい）、翻訳抑制エレメント（例えば、Ｂｌｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １１０（１－２）：９７－１１２を参照されたい）、タンパク質結合ＲＮＡエレメント（例えば、鉄応答性エレメント、Ｓｅｌｅｚｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２５（１８）：３３０１－３３１０を参照されたい）、細胞質ポリアデニル化エレメント（Ｖｉｌｌａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２１（４）：４５２－４５７）、及び触媒ＲＮＡエレメント（例えば、リボザイム、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７８９（９－１０）：６３４－６４１を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
特異的送達：本明細書で使用されるとき、「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」という用語は、ナノ粒子による治療薬及び／または予防薬の、目的とする標的細胞（例えば、哺乳類標的細胞）への、オフターゲット細胞（例えば、非標的細胞）と比較してより多くの（例えば、少なくとも１０％多く、少なくとも２０％多く、少なくとも３０％多く、少なくとも４０％多く、少なくとも５０％多く、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多くの）送達を意味する。特定の細胞へのナノ粒子の送達レベルは、標的細胞対非標的細胞において産生されたタンパク質の量の比較（例えば、フローサイトメトリーを使用した平均蛍光強度によって）、タンパク質を発現している標的細胞対非標的細胞の％の比較（例えば、定量的フローサイトメトリーによって）、標的細胞対非標的細胞において産生されたタンパク質の量と、該標的細胞対非標的細胞における総タンパク質の量との比較、または標的細胞対非標的細胞における治療薬及び／または予防薬の量と、該標的細胞対非標的細胞における総計の治療薬及び／または総予防薬の量との比較によって測定され得る。ナノ粒子が標的細胞に特異的に送達する能力は、処置されている対象において決定される必要はなく、動物モデル（例えば、マウスまたはＮＨＰモデル）等の代理において決定されてもよいことが理解されよう。
実質的に：本明細書で使用されるとき、「実質的に」という用語は、目的とする特徴または特性の総範囲もしくは程度またはほぼ総範囲もしくは程度を示す定性的条件を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的現象及び化学的現象が、完全に達する及び／または完全性まで進行する、または絶対的な結果を達成もしくは回避することは、たとえあったとしても稀であることを理解しよう。「実質的に」という用語は、したがって、多くの生物学的現象及び化学的現象に本質的に存在する、完全性の欠如の可能性を捕捉するように本明細書で使用される。
患っている：疾患、障害、及び／または病態を「患っている」個体は、疾患、障害、及び／または病態であると診断されたか、またはその１つもしくは複数の症状を呈する。
標的化部分：本明細書で使用されるとき、「標的化部分」とは、ナノ粒子を特定の細胞、組織、及び／または臓器の種類に標的化し得る化合物または薬剤である。一部の実施形態では、本開示のＬＮＰは、追加の標的化部分を含まず、例えば、それは追加の標的化部分なしに（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）の幹細胞または前駆細胞（例えば、ＨＳＰＣ）にトランスフェクトする。
治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与されたとき、治療、診断、及び／または予防効果を有し、及び／または所望の生物学的及び／または薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。一部の実施形態では、治療剤は、治療ペイロードを含むか、または治療ペイロードである。一部の実施形態では、治療剤は、低分子もしくは生物学的薬剤（例えば、抗体分子）を含むか、または低分子もしくは生物学的薬剤（例えば、抗体分子）である。
トランスフェクション：本明細書で使用されるとき、「トランスフェクション」という用語は、種（例えば、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド）を細胞に導入する方法を指す。
翻訳制御活性：本明細書で使用されるとき、「翻訳制御活性」（「翻訳制御機能」と互換的に使用される）という用語は、ＰＩＣ及び／またはリボソームの活性を含めた、翻訳装置の活性を調節する（例えば、制御する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）、影響を与える、制御する（ｃｏｎｔｒｏｌ）、変化させる）生物学的機能、機構、またはプロセスを指す。一部の態様では、所望の翻訳制御活性は、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実性を促進及び／または強化する。一部の態様では、所望の翻訳制御活性は、読み漏らしを低減及び／または阻害する。
対象：本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、本開示による組成物が、例えば、実験、診断、予防、及び／または治療目的で投与され得る、任意の生物を指す。典型的な対象には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒト等の哺乳動物）及び／または植物が含まれる。一部の実施形態では、対象は、患者であってもよい。
処置する：本明細書で使用されるとき、「処置する」という用語は、特定の感染症、疾患、障害、及び／または病態の１つまたは複数の症状または特徴を部分的にまたは完全に軽減する、回復させる、改善する、緩和する、その発症を遅延させる、その進行を阻害する、その重症度を低減する、及び／またはその発生率を低減することを指す。処置は、疾患、障害、及び／または病態に関連する病理の発症リスクを減少させる目的で、疾患、障害、及び／または病態の徴候を呈していない対象、及び／または疾患、障害、及び／または病態の早期徴候のみを呈する対象に施され得る。
予防する：本明細書で使用されるとき、「予防する」という用語は、特定の感染症、疾患、障害、及び／または病態の１つまたは複数の症状または特徴の発症を部分的にまたは完全に阻害することを指す。
未改変：本明細書で使用されるとき、「未改変」とは、任意の方式で変化させられる前の任意の物質、化合物、または分子を指す。未改変は、生体分子の野生型または天然型を指してもよいが、常にそうではない。分子は、一連の改変を経てもよく、そうすることで、各改変分子が、後続の改変のための「未改変」の出発分子として機能し得る。
バリアント：本明細書で使用されるとき、「バリアント」という用語は、例えば、当該技術分野で認識されるアッセイによって測定したとき、野生型分子の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の活性、またはそれに対する構造的類似性を有する分子を指す。
細胞または組織のインビボ改変方法及び関連する方法
ある態様では、細胞（例えば、幹細胞もしくは前駆細胞または細胞の系列）を改変する、例えば、細胞に関連するパラメータまたは細胞に関連する構成成分を改変する方法が本明細書に開示され、該方法は、細胞を、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物と接触させることを含み、それによって細胞を改変する。ある実施形態では、細胞とＬＮＰとの接触（例えば、ＬＮＰ組成物の投与）は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、細胞とＬＮＰとの接触（例えば、ＬＮＰ組成物の投与）は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連する構成成分を改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、追加の標的化部分を含まない。
ある態様では、細胞（例えば、幹細胞もしくは前駆細胞または細胞の系列）を改変する、例えば、細胞に関連するパラメータまたは細胞に関連する構成成分を改変する方法が本明細書に開示され、該方法は、細胞を、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物と接触させることを含み、それによって細胞を改変する。ある実施形態では、細胞とＬＮＰとの接触（例えば、ＬＮＰ組成物の投与）は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、細胞とＬＮＰとの接触（例えば、ＬＮＰ組成物の投与）は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連する構成成分を改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、追加の標的化部分を含まない。
別の態様では、組織を改変する、例えば、組織に関連するパラメータまたは組織に関連する構成成分を改変する方法が本明細書に開示され、該方法は、細胞を、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物と接触させることを含む。ある実施形態では、細胞とＬＮＰとの接触（例えば、ＬＮＰ組成物の投与）は、例えば、本明細書に記載されるような、組織に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、細胞とＬＮＰとの接触（例えば、ＬＮＰ組成物の投与）は、例えば、本明細書に記載されるような、組織に関連する構成成分を改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、追加の標的化部分を含まない。
なおも別の態様では、疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象を処置する方法が本明細書で提供され、該方法は、対象に、ペイロードを含む有効量のＬＮＰ組成物を投与することを含み、該ＬＮＰ組成物が、対象において細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）の改変、例えば、細胞に関連する構成成分または細胞に関連するパラメータの改変をもたらし、それによって対象を処置する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、追加の標的化部分を含まない。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連する構成成分を改変する。
ある態様では、本開示は、疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象の症状を改善する方法を提供し、該方法は、対象に、ペイロードを含む有効量のＬＮＰ組成物を投与することを含み、該ＬＮＰ組成物が、対象において細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）の改変、例えば、細胞に関連する構成成分または細胞に関連するパラメータの改変をもたらし、それによって対象の症状を改善する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、追加の標的化部分を含まない。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連する構成成分を改変する。
造血幹細胞・前駆細胞
造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、造血と呼ばれるプロセスを介して他の血液細胞を生じさせる幹細胞・前駆細胞である。造血は、骨髄及び／または他の免疫部位、例えば、脾臓、肝臓、胸腺、リンパ節において起こる。理論に拘束されることを望むものではないが、造血中に、多能性であり自己複製することができるＨＳＣは、前駆細胞に分化し、これが骨髄系列及びリンパ系列の成熟血液細胞を生じさせると考えられる。骨髄系細胞には、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、及び血小板が含まれる。リンパ系細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、及び自然リンパ球が含まれる。本明細書で使用される、「ＨＳＰＣ」という用語は、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び造血前駆細胞（ＨＰＣ）の両方を包含する。
造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、造血と呼ばれるプロセスを介して他の血液細胞を生じさせる幹細胞・前駆細胞である。造血は、骨髄及び／または他の免疫部位、例えば、脾臓、肝臓、胸腺、リンパ節において起こる。理論に拘束されることを望むものではないが、造血中に、多能性であり自己複製することができるＨＳＣは、前駆細胞に分化し、これが骨髄系列及びリンパ系列の成熟血液細胞を生じさせると考えられる。骨髄系細胞には、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、及び血小板が含まれる。リンパ系細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、及び自然リンパ球が含まれる。本明細書で使用される、「ＨＳＰＣ」という用語は、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び造血前駆細胞（ＨＰＣ）の両方を包含する。
ある実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれも、幹細胞または前駆細胞、例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）のインビボ改変を含む。ある実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれも、幹細胞または前駆細胞、例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）のインビボ遺伝子編集を含む。ある実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣの集団を含む。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、胚性幹細胞に由来するＨＳＰＣまたは人工多能性幹細胞に由来するＨＳＰＣを含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、細胞は、ＨＳＰＣ、例えば、多能性ＨＳＣまたは多能性ＨＰＣである。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＨＳＣである。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＨＰＣである。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＨＳＰＣは、以下の機能特性：（ｉ）自己複製する能力、（ｉｉ）無限の増殖能、（ｉｉｉ）休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、（ｉｖ）任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、（ｖ）例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、及び／または（ｖｉ）コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、（ｉ）自己複製する能力を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、（ｉｉ）無限の増殖能を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、（ｉｉｉ）休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、（ｉｖ）任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、（ｖ）例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、（ｖｉ）コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力を有する。
本明細書に開示される方法または組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、以下の発現特性：（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉｉ）ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、（ｖ）ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｉｉ）ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｖ）ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ヒトＨＳＰＣであり、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、または全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である。
ある実施形態では、ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか１つを発現する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか２つを発現する。ある実施形態では、ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか３つを発現する。ある実施形態では、ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）の全てを発現する。
ある実施形態では、ヒトＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ヒトＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の両方の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、該ヒトＨＳＰＣは、細胞系列陰性ＨＳＰＣである。
本明細書に開示される方法及び組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、以下の発現特性：（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉｉ）ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の検出可能な発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の細胞表面発現、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、（ｖ）ＣＤ１２３の発現、例えば、ＣＤ１２３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１２３の細胞表面発現、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｉｉ）ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の検出可能な発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖ）ＣＤ１２３の発現、例えば、ＣＤ１２３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１２３の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、または全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である。
ある実施形態では、ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか１つを発現する。ある実施形態では、ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか２つを発現する。ある実施形態では、ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか３つを発現する。ある実施形態では、ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）の全てを発現する。
ある実施形態では、ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の両方の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、該ＮＨＰ ＨＳＰＣは、細胞系列陰性ＨＳＰＣである。
本明細書に開示される方法及び組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、以下の発現特性：（ｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ１５０の発現、例えば、ＣＤ１５０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１５０の細胞表面発現、（ｉｉｉ）Ｓｃａ－１の発現、例えば、Ｓｃａ－１の検出可能な発現、例えば、Ｓｃａ－１の細胞表面発現、（ｉｖ）ｃ－ｋｉｔの発現、例えば、ｃ－ＫＩＴの検出可能な発現、例えば、ｃ－ｋｉｔの細胞表面発現、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、ＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉｉ）～（ｘ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、または全てを有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｉｉ）ＣＤ１５０の発現、例えば、ＣＤ１５０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１５０の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｉｉｉ）Ｓｃａ－１の発現、例えば、Ｓｃａ－１の検出可能な発現、例えば、Ｓｃａ－１の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｉｖ）ｃ－ｋｉｔの発現、例えば、ｃ－ＫＩＴの検出可能な発現、例えば、ｃ－ｋｉｔの細胞表面発現を有する。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、ＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、ＨＳＰＣは、マウスＨＳＰＣであり、（ｖｉｉｉ）（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちの１つ、２つ、または全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか２つの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）の全ての検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、該マウスＨＳＰＣは、細胞系列陰性ＨＳＰＣである。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、マウスＨＳＰＣは、ｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１を発現し、例えば、ｃ－ＫＩＴ＋及びＳｃａ－１＋ ＨＳＣである。本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、マウスＨＳＰＣは、ｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１を発現し、例えば、ｃ－ＫＩＴ＋及びＳｃａ－１＋ ＨＳＣであり、マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、または全ての検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、マウスＨＳＰＣは、本明細書に開示される機能特性のうちのいずれか１つ、または全て、またはそれらの組み合わせを有し、ＨＳＰＣは、本明細書に開示される発現特性のうちのいずれか１つ、または全て、またはそれらの組み合わせを有する。ある実施形態では、機能特性は、（ｉ）自己複製する能力、（ｉｉ）無限の増殖能、（ｉｉｉ）休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、（ｉｖ）任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、（ｖ）例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、及び／または（ｖｉ）コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力を含む。ある実施形態では、発現特性は、（ｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ１５０の発現、例えば、ＣＤ１５０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１５０の細胞表面発現、（ｉｉｉ）Ｓｃａ－１の発現、例えば、Ｓｃａ－１の検出可能な発現、例えば、Ｓｃａ－１の細胞表面発現、（ｉｖ）ｃ－ｋｉｔの発現、例えば、ｃ－ＫＩＴの検出可能な発現、例えば、ｃ－ｋｉｔの細胞表面発現、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低いこと、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、ＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低いこと、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低いこと、または（ｖｉｉｉ）（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低いこと、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）であること、を含む。
一実施形態では、本明細書に記載の例示的なマーカーは、本明細書に記載の例示的なＮＨＰまたはマウスマーカーの他の哺乳類（例えば、ヒト）オルソログまたは同等物を包含することが理解されよう。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、改変ヒト細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）ＮＨＰ ＣＤ４５のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉ）ＮＨＰ ＣＤ３４のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉｉ）ＮＨＰ ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｖ）ＮＨＰ ＣＤ９０のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖ）ＮＨＰ ＣＤ１２３のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖｉ）ＮＨＰ ＣＤ４５ＲＡのヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＮＨＰ ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＮＨＰ ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカー、またはそのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ）は、改変ヒト細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）マウスＣＤ３４のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉ）マウスＣＤ１５０のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉｉ）マウスＳｃａ－１のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｖ）マウスｃ－ｋｉｔのヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、マウスＣＭＰ及び／またはＣＬＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、マウスＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、マウスＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｖｉｉｉ）（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカー、またはそのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、または全てを有する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、マウスｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１のヒトオルソログまたは同等物を発現する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、マウスｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１のヒトオルソログまたは同等物を発現し、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ、２つ、または全ての検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＨＳＰＣは、本明細書に開示される機能特性のうちのいずれか１つ、または全て、またはそれらの組み合わせを有し、ＨＳＰＣは、本明細書に開示される発現特性のうちのいずれか１つ、または全て、またはそれらの組み合わせを有する。ある実施形態では、機能特性は、（ｉ）自己複製する能力、（ｉｉ）無限の増殖能、（ｉｉｉ）休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、（ｉｖ）任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、（ｖ）例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、及び／または（ｖｉ）コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力を含む。ある実施形態では、発現特性は、（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉｉ）ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、（ｖ）ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低いこと、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低いこと、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低いこと、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）であること、を含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、細胞とＬＮＰ組成物との接触前に、細胞（例えば、細胞の集団）は、対象から単離され、インビトロで拡大、濃縮、及び／または培養される。本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、拡大、濃縮、及び／または培養された細胞、例えば、細胞の集団は、宿主、例えば、自家または同種異系宿主内に投与される。
細胞または組織に関連する構成成分またはパラメータの改変
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与または送達は、細胞または組織、例えば、細胞もしくは組織に関連する構成成分、または細胞もしくは組織に関連するパラメータの改変をもたらす。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与または送達は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与または送達は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連する構成成分を改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与または送達は、細胞、例えば、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、多能性前駆細胞、または多能性幹細胞の遺伝子型、表現型、及び／または機能を改変する。ある実施形態では、細胞は、ＨＳＰＣである。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与または送達は、細胞または組織、例えば、細胞もしくは組織に関連する構成成分、または細胞もしくは組織に関連するパラメータの改変をもたらす。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与または送達は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連するパラメータを改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与または送達は、例えば、本明細書に記載されるような、細胞に関連する構成成分を改変する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与または送達は、細胞、例えば、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、多能性前駆細胞、または多能性幹細胞の遺伝子型、表現型、及び／または機能を改変する。ある実施形態では、細胞は、ＨＳＰＣである。
ある実施形態では、細胞もしくは組織に関連する構成成分は、（１）細胞に関連する核酸もしくはその断片、例えば、ＤＮＡ（例えば、エクソン、イントロン、遺伝子間、テロメア、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、リプレッサー、コーディング、またはノンコーディング）もしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、（２）細胞に関連するペプチドもしくはタンパク質またはその断片、（３）細胞に関連する脂質成分もしくはその断片、またはそれらの組み合わせを含む。ある実施形態では、構成成分は、（１）細胞に関連する核酸もしくはその断片、例えば、ＤＮＡ（例えば、エクソン、イントロン、遺伝子間、テロメア、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、リプレッサー、コーディング、またはノンコーディング）もしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））を含む。ある実施形態では、構成成分は、ＤＮＡを含む。ある実施形態では、構成成分は、ＲＮＡを含む。ある実施形態では、構成成分は、（２）細胞に関連するペプチドもしくはタンパク質またはその断片を含む。ある実施形態では、構成成分は、（３）細胞に関連する脂質成分またはその断片を含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、構成成分は、細胞にとって内因性である。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、構成成分は、細胞にとって外因性であり、例えば、当該技術分野で既知の方法、例えば、エレクトロポレーション、形質転換、ベクターベースの送達、ウイルス送達、または脂質ベースの送達によって細胞に導入されたものである。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、細胞もしくは組織に関連するパラメータは、発現パラメータ、表現型パラメータ、またはシグナル伝達パラメータを含む。ある実施形態では、細胞もしくは組織に関連するパラメータは、発現パラメータを含む。ある実施形態では、細胞もしくは組織に関連するパラメータは、表現型パラメータを含む。ある実施形態では、細胞もしくは組織に関連するパラメータは、シグナル伝達パラメータを含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、発現パラメータは、以下：（ａ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベル、（ｂ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性、（ｃ）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾、（ｄ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）折り畳み、及び／または（ｅ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性、のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む。ある実施形態では、発現パラメータは、（ａ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベルを含む。ある実施形態では、発現パラメータは、（ｂ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性を含む。ある実施形態では、発現パラメータは、（ｃ）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾を含む。ある実施形態では、発現パラメータは、（ｄ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）折り畳みを含む。ある実施形態では、発現パラメータは、（ｅ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性を含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、以下：（１）シグナル伝達経路、例えば、細胞シグナル伝達経路の調節、（２）細胞運命の調節、（３）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベルの調節、（４）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性の調節、及び／または（５）例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性の調節、のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む。ある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、（１）シグナル伝達経路、例えば、細胞シグナル伝達経路の調節を含む。ある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、（２）細胞運命の調節を含む。ある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、（３）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベルの調節を含む。ある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、（４）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性の調節を含む。ある実施形態では、シグナル伝達パラメータは、（５）例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性の調節を含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、表現型パラメータは、細胞の表面上の分子、例えば、細胞表面タンパク質、脂質、または接着分子の発現及び／または活性を含む。
ＬＮＰ組成物によるインビボでのＨＳＣの改変の効果
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物により改変された細胞または組織、例えば、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、本明細書に開示される特性を有する。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物により改変された細胞または組織、例えば、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、本明細書に開示される特性を有する。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、以下の機能特性：（ｉ）自己複製する能力、（ｉｉ）無限の増殖能、（ｉｉｉ）休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、（ｉｖ）任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、（ｖ）例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、及び／または（ｖｉ）コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する。ある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、（ｉ）自己複製する能力を有する。ある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、（ｉｉ）無限の増殖能を有する。ある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、（ｉｉｉ）休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力を有する。ある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、（ｉｖ）任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力を有する。ある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、（ｖ）例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力を有する。ある実施形態では、改変細胞、例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、（ｖｉ）コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力を有する。
ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、例えば、実施例２に記載されるように、例えば、エクスビボコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにおいて測定したとき、ＣＦＵを形成する能力を有する。ある実施形態では、ＣＦＵ能力は、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較される。
ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、例えば、実施例２に記載されるように、例えば、エクスビボコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにおいて測定したとき、または例えば、実施例３に記載されるように（例えば、図３Ｄ）、系列追跡実験において測定したとき、骨髄系細胞に分化する能力を有する。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣが骨髄系細胞に分化する能力は、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較される。
ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、例えば、実施例３に記載されるように（例えば、図３Ｃ）、例えば、系列追跡実験において測定したとき、リンパ系細胞に分化する能力を有する。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣがリンパ系細胞に分化する能力は、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較される。
ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、例えば、実施例３に記載されるように（例えば、図３Ａ～３Ｂ）、赤血球細胞または血小板に分化する能力を有する。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣが赤血球細胞または血小板に分化する能力は、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較される。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、インビボで赤血球細胞または血小板に分化する。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、インビトロで赤血球細胞または血小板に分化する。
ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、例えば、インビボで、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、または３０日間存続する。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣは、例えば、インビボで、１～３０、２～３０、３～３０、４～３０、５～３０、６～３０、７～３０、１０～３０、１５～３０、２０～３０、２５～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２日間存続する。ある実施形態では、改変ＨＳＰＣのインビボでの存続は、例えば、実施例３に示されるように、１つまたは複数の細胞、例えば、骨髄系列の細胞及び／またはリンパ系列の細胞への分化をもたらす。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ）は、ヒト細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉｉ）ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、（ｖ）ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｉｉ）ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｖ）ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変ヒトＨＳＰＣであり、（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、または全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である。
ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか１つを発現する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか２つを発現する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか３つを発現する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）の全てを発現する。
ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の両方の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、該ヒトＨＳＰＣは、細胞系列陰性ＨＳＰＣである。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ）は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉｉ）ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の検出可能な発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の細胞表面発現、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、（ｖ）ＣＤ１２３の発現、例えば、ＣＤ１２３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１２３の細胞表面発現、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉ）ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｉｉ）ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の検出可能な発現、例えば、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｖ）ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖ）ＣＤ１２３の発現、例えば、ＣＤ１２３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１２３の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣであり、（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、または全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である。
ある実施形態では、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか１つを発現する。ある実施形態では、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか２つを発現する。ある実施形態では、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）のうちのいずれか３つを発現する。ある実施形態では、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｖｉ）の全てを発現する。
ある実施形態では、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変ＮＨＰ ＨＳＰＣは、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の両方の検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、該ＮＨＰ ＨＳＰＣは、細胞系列陰性ＨＳＰＣである。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ）は、改変マウス細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、（ｉｉ）ＣＤ１５０の発現、例えば、ＣＤ１５０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１５０の細胞表面発現、（ｉｉｉ）Ｓｃａ－１の発現、例えば、Ｓｃａ－１の検出可能な発現、例えば、Ｓｃａ－１の細胞表面発現、（ｉｖ）ｃ－ｋｉｔの発現、例えば、ｃ－ＫＩＴの検出可能な発現、例えば、ｃ－ｋｉｔの細胞表面発現、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、ＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｖｉｉｉ）（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、または全てを有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｉ）ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｉｉ）ＣＤ１５０の発現、例えば、ＣＤ１５０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１５０の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｉｉｉ）Ｓｃａ－１の発現、例えば、Ｓｃａ－１の検出可能な発現、例えば、Ｓｃａ－１の細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｉｖ）ｃ－ｋｉｔの発現、例えば、ｃ－ＫＩＴの検出可能な発現、例えば、ｃ－ｋｉｔの細胞表面発現を有する。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、ＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変細胞は、改変マウスＨＳＰＣであり、（ｖｉｉｉ）（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちの１つ、２つ、または全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である。
ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｉｖ）のうちのいずれか１つを発現する。ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｉｖ）のうちのいずれか２つを発現する。ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｉｖ）のうちのいずれか３つを発現する。ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｉ）～（ｉｖ）の全てを発現する。
ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか２つの検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、（ｖ）～（ｖｉｉ）の全ての検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低く、例えば、該マウスＨＳＰＣは、細胞系列陰性ＨＳＰＣである。
ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、ｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１を発現し、例えば、ｃ－ＫＩＴ＋及びＳｃａ－１＋ ＨＳＣである。ある実施形態では、改変マウスＨＳＰＣは、ｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１を発現し、例えば、ｃ－ＫＩＴ＋及びＳｃａ－１＋ ＨＳＣであり、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ、２つ、または全ての検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣは、改変ヒト細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）ＮＨＰ ＣＤ４５のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉ）ＮＨＰ ＣＤ３４のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉｉ）ＮＨＰ ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｖ）ＮＨＰ ＣＤ９０のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖ）ＮＨＰ ＣＤ１２３のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖｉ）ＮＨＰ ＣＤ４５ＲＡのヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖｉｉ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＮＨＰ ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＮＨＰ ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｉｘ）（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカー、またはそのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、改変細胞（例えば、改変幹細胞または前駆細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ）は、改変ヒト細胞であり、以下の発現特性：（ｉ）マウスＣＤ３４のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉ）マウスＣＤ１５０のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｉｉ）マウスＳｃａ－１のヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｉｖ）マウスｃ－ｋｉｔのヒトオルソログもしくは同等物の発現（例えば、検出可能な発現、例えば、細胞表面発現）、（ｖ）原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、マウスＣＭＰ及び／またはＣＬＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉ）系列決定された前駆体細胞に関連するマーカー、例えば、マウスＭＥＰ、ＧＭ、ＴＮＫ、及び／またはＢＣＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、（ｖｉｉ）系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、マウスＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または（ｖｉｉｉ）（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカー、またはそのヒトオルソログもしくは同等物の検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、または全てを有する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、マウスｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１のヒトオルソログまたは同等物を発現する。ある実施形態では、改変ヒトＨＳＰＣは、マウスｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ１のヒトオルソログまたは同等物を発現し、（ｖ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ、２つ、または全ての検出可能な発現が不在であるかまたはその発現が低い。
ペイロード
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、例えば、本明細書に記載されるような、ペイロードを含む。ある実施形態では、ペイロードは、細胞または組織に関連する構成成分またはパラメータを改変、例えば、増加または減少させて、改変細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ、または組織をもたらす。ある実施形態では、ペイロードは、核酸分子、ペプチド分子、脂質分子、低分子量分子、またはそれらの組み合わせを含む。ある実施形態では、ペイロードは、幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、多能性前駆細胞、または多能性幹細胞のパラメータまたは構成成分に影響を及ぼす。ある実施形態では、前駆細胞は、ＨＳＰＣ、例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣである。好ましい実施形態では、ペイロードは、対象において異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、または免疫細胞障害に変化を生じさせる。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、例えば、本明細書に記載されるような、ペイロードを含む。ある実施形態では、ペイロードは、細胞または組織に関連する構成成分またはパラメータを改変、例えば、増加または減少させて、改変細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ、または組織をもたらす。ある実施形態では、ペイロードは、核酸分子、ペプチド分子、脂質分子、低分子量分子、またはそれらの組み合わせを含む。ある実施形態では、ペイロードは、幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、多能性前駆細胞、または多能性幹細胞のパラメータまたは構成成分に影響を及ぼす。ある実施形態では、前駆細胞は、ＨＳＰＣ、例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣである。好ましい実施形態では、ペイロードは、対象において異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、または免疫細胞障害に変化を生じさせる。
ある実施形態では、ペイロードは、ＤＮＡ分子、例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはプラスミドＤＮＡを含む核酸分子を含む。ある実施形態では、ペイロードは、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む核酸分子を含む。ある実施形態では、ペイロードは、ｍＲＮＡを含む。ある実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む。ある実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－０－メチルウリジンからなる群から選択される。ある実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある実施形態では、化学修飾は、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。ある実施形態では、ｍＲＮＡは、完全に修飾されたＮ１－メチルシュードウリジンを含む。
ある実施形態では、ペイロードは、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド分子を含む
ある実施形態では、ペイロードは、例えば、本明細書に記載されるような、脂質分子を含む。
ある実施形態では、ペイロードは、例えば、本明細書に記載されるような、脂質分子を含む。
ある実施形態では、ペイロードは、例えば、本明細書に記載されるような、低分子量分子を含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ペイロードは、遺伝子モジュレーター（例えば、細胞または組織の遺伝子を変化させるモジュレーター）、後成的モジュレーター（例えば、細胞または組織を後成的に変化させるモジュレーター）、ＲＮＡモジュレーター（例えば、細胞または組織におけるＲＮＡ分子を変化させるモジュレーター）、ペプチドモジュレーター（例えば、細胞または組織におけるペプチド分子を変化させるモジュレーター）、脂質モジュレーター（例えば、細胞または組織における脂質分子を変化させるモジュレーター）、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に開示される方法のうちのいずれかのある実施形態では、ペイロードは、ペプチドモジュレーター（例えば、細胞または組織におけるペプチド分子を変化させるモジュレーター）を含む。
ある実施形態では、ペイロードは、脂質モジュレーター（例えば、細胞または組織における脂質分子を変化させるモジュレーター）、またはそれらの組み合わせを含む。
遺伝子モジュレーター
ある実施形態では、ペイロードは、遺伝子モジュレーター（例えば、細胞または組織の遺伝子を変化させるモジュレーター）を含む。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、例えば、核酸塩基を変化させること、例えば、
挿入、欠失、変異（例えば、ミスセンス変異、サイレント変異、またはナンセンス変異）、重複、もしくは逆位、またはそれらの任意の組み合わせを導入することによって、ＤＮＡ分子における核酸配列を改変する、システムを含む。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、ＤＮＡ塩基エディター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、メガヌクレアーゼシステム、もしくはトランスポザーゼシステム、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
ある実施形態では、ペイロードは、遺伝子モジュレーター（例えば、細胞または組織の遺伝子を変化させるモジュレーター）を含む。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、例えば、核酸塩基を変化させること、例えば、
挿入、欠失、変異（例えば、ミスセンス変異、サイレント変異、またはナンセンス変異）、重複、もしくは逆位、またはそれらの任意の組み合わせを導入することによって、ＤＮＡ分子における核酸配列を改変する、システムを含む。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、ＤＮＡ塩基エディター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、メガヌクレアーゼシステム、もしくはトランスポザーゼシステム、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、鋳型ＤＮＡを含む。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、鋳型ＤＮＡを含まない。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、鋳型ＲＮＡを含む。ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、鋳型ＲＮＡを含まない。
ある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムである。ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子と、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ３タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ａタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ｅタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１３タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、またはＣａｓ１４タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントとを含む。
ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡ分子と、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ３タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ａタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１２ｅタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、Ｃａｓ１３タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、またはＣａｓ１４タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントをコードする核酸とを含む。
ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントとを含む。
ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、標的遺伝子の配列に特異的な標的化配列を含むｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントをコードする核酸とを含む。
ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、鋳型ＤＮＡをさらに含む。ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、鋳型ＲＮＡをさらに含む。ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは、逆転写酵素をさらに含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムである。ある実施形態では、ＺＦＮシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む。ある実施形態では、ＺＦＮシステムは、ＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドを含む。ある実施形態では、Ｚｎフィンガー結合ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれよりも多くのジンクフィンガーを含む。ある実施形態では、ＺＦＮシステムは、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するペプチドは、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。ある実施形態では、ＺＦＮシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む。
ある実施形態では、ＺＦＮシステムは、ＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドをコードする核酸を含む。ある実施形態では、Ｚｎフィンガー結合ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれよりも多くのジンクフィンガーを含む。ある実施形態では、ＺＦＮシステムは、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するペプチドは、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。
ある実施形態では、該システムは、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをさらに含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムである。ある実施形態では、該システムは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む。ある実施形態では、該システムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを有するペプチドを含む。ある実施形態では、該システムは、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドを含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するペプチドは、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。
ある実施形態では、該システムは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む。ある実施形態では、該システムは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを有するペプチドをコードする核酸を含む。ある実施形態では、該システムは、ヌクレアーゼ活性、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸を含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するペプチドは、ＩＩ型制限１様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。
ある実施形態では、該システムは、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをさらに含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、メガヌクレアーゼシステムである。ある実施形態では、メガヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡ結合ドメイン、及びヌクレアーゼ活性、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼを有するペプチドを含む。ある実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｓｉｌｖａ Ｇ．ｅｔ ａｌ，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（１）：１１－２７に記載されるような、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ（配列番号２７０）、ＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスエンドヌクレアーゼ、もしくはＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫエンドヌクレアーゼ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを含む。
ある実施形態では、メガヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡ結合ドメイン、及びヌクレアーゼ活性、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼを有するペプチドをコードする核酸を含む。ある実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｓｉｌｖａ Ｇ．ｅｔ ａｌ，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（１）：１１－２７に記載されるような、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ（配列番号２７０）、ＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスエンドヌクレアーゼ、もしくはＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫエンドヌクレアーゼ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを含む。
ある実施形態では、該システムは、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをさらに含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、遺伝子モジュレーターは、トランスポザーゼシステムである。ある実施形態では、トランスポザーゼシステムは、逆転写酵素及び／またはヌクレアーゼ活性、例えば、レトロトランスポゾン、例えば、ＬＴＲレトロトランスポゾンまたは非ＬＴＲレトロトランスポゾンを有するペプチドをコードする核酸配列を含む。ある実施形態では、トランスポザーゼシステムは、鋳型、例えば、ＲＮＡ鋳型を含む。
後成的モジュレーター
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ペイロードは、後成的モジュレーター（例えば、細胞または組織を後成的に変化させるモジュレーター）を含む。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、クロマチン構造を改変する、ＤＮＡをメチル化する、及び／またはヒストンを修飾する分子を含む。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、クロマチン構造を改変する分子、例えば、ＳＷＩ／ＳＮＦリモデリング複合体またはその構成要素である。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、ＤＮＡをメチル化する分子、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、またはＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＳｓｓＩ））；ポリコーム抑制複合体もしくはその構成要素、例えば、ＰＲＣ１またはＰＲＣ２、またはＰＲ－ＤＵＢ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；デメチラーゼ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント（例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３）である。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、ヒストンを修飾する、例えば、ヒストンをメチル化する及び／またはアセチル化する分子、例えば、ヒストン修飾酵素またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、例えば、ＨＭＴ、ＨＤＭ、ＨＡＴ、またはＨＤＡＣである。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ペイロードは、後成的モジュレーター（例えば、細胞または組織を後成的に変化させるモジュレーター）を含む。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、クロマチン構造を改変する、ＤＮＡをメチル化する、及び／またはヒストンを修飾する分子を含む。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、クロマチン構造を改変する分子、例えば、ＳＷＩ／ＳＮＦリモデリング複合体またはその構成要素である。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、ＤＮＡをメチル化する分子、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、またはＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＳｓｓＩ））；ポリコーム抑制複合体もしくはその構成要素、例えば、ＰＲＣ１またはＰＲＣ２、またはＰＲ－ＤＵＢ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；デメチラーゼ、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント（例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３）である。ある実施形態では、後成的モジュレーターは、ヒストンを修飾する、例えば、ヒストンをメチル化する及び／またはアセチル化する分子、例えば、ヒストン修飾酵素またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント、例えば、ＨＭＴ、ＨＤＭ、ＨＡＴ、またはＨＤＡＣである。
ＲＮＡモジュレーター
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ペイロードは、ＲＮＡモジュレーター（例えば、細胞または組織におけるＲＮＡ分子を変化させるモジュレーター）を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＲＮＡ分子の発現及び／または活性、安定性または区画化を変化させる分子を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＤＮＡ分子を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、低分子量分子を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ペプチド、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；あるいは酵素、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＲＮＡ塩基エディターシステムを含む。ある実施形態では、ＲＮＡ塩基エディターシステムは、デアミナーゼ、例えば、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）；Ｃａｓタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはガイドＲＮＡを含む。ある実施形態では、ＲＮＡ塩基エディターシステムは、鋳型、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型をさらに含む。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、ペイロードは、ＲＮＡモジュレーター（例えば、細胞または組織におけるＲＮＡ分子を変化させるモジュレーター）を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＲＮＡ分子の発現及び／または活性、安定性または区画化を変化させる分子を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＤＮＡ分子を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、低分子量分子を含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ペプチド、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；あるいは酵素、またはその断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアントを含む。ある実施形態では、ＲＮＡモジュレーターは、ＲＮＡ塩基エディターシステムを含む。ある実施形態では、ＲＮＡ塩基エディターシステムは、デアミナーゼ、例えば、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）；Ｃａｓタンパク質、その断片（例えば、生物学的に活性な断片）もしくはバリアント；及び／またはガイドＲＮＡを含む。ある実施形態では、ＲＮＡ塩基エディターシステムは、鋳型、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型をさらに含む。
治療ペイロードまたは予防ペイロード
ある実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物は、ペイロード、例えば、ペイロードまたはペプチドペイロードをコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを含む。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、１つのペイロードを含む。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、１つよりも多くのペイロード、例えば、２、３、４、５、６つ、またはそれよりも多くのペイロード、例えば、同じまたは異なるペイロードを含む。ある実施形態では、ペイロードは、治療ペイロードである。ある実施形態では、ペイロードは、予防ペイロードである。
ある実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物は、ペイロード、例えば、ペイロードまたはペプチドペイロードをコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを含む。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、１つのペイロードを含む。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、１つよりも多くのペイロード、例えば、２、３、４、５、６つ、またはそれよりも多くのペイロード、例えば、同じまたは異なるペイロードを含む。ある実施形態では、ペイロードは、治療ペイロードである。ある実施形態では、ペイロードは、予防ペイロードである。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、膜結合型タンパク質、または細胞間タンパク質、またはそれらのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、またはそのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、膜結合型タンパク質、またはそのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、細胞内タンパク質、またはそのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む。
疾患／障害
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、疾患または障害は、異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、及び免疫細胞障害からなる群から選択される。本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、対象は、異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、及び免疫細胞障害からなる群から選択される疾患または障害に関連するか、またはそれを引き起こす変異またはＳＮＰを有する。
本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、疾患または障害は、異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、及び免疫細胞障害からなる群から選択される。本明細書に開示される方法、組成物、または細胞のうちのいずれかのある実施形態では、対象は、異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、及び免疫細胞障害からなる群から選択される疾患または障害に関連するか、またはそれを引き起こす変異またはＳＮＰを有する。
本明細書に開示される方法のうちのいずれかのある実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトである。
ＬＮＰの脂質含量
上述したように、脂質に関して、本明細書に開示されるＬＮＰは、（ｉ）イオン化可能な脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び任意選択で（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。これらのカテゴリーの脂質は、下記により詳細に述べられる。
上述したように、脂質に関して、本明細書に開示されるＬＮＰは、（ｉ）イオン化可能な脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び任意選択で（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。これらのカテゴリーの脂質は、下記により詳細に述べられる。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物として製剤化される。脂質ナノ粒子は典型的には、目的とする核酸カーゴと共にアミノ脂質、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質成分を含む。本発明の脂質ナノ粒子は、当該技術分野で一般に既知であるような構成要素、組成物、及び方法を使用して生成され得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２２７１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９３、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６６２４２を参照されたく、同文献の全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して２０～６０％のアミノ脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２０～５０％、２０～４０％、２０～３０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～６０％、４０～５０％、または５０～６０％のアミノ脂質のモル比を含んでもよい。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０％、３０％、４０％、５０、または６０％のアミノ脂質のモル比を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して５～２５％のリン脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～３０％、５～１５％、５～１０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２５％、１５～２０％、２０～２５％、または２５～３０％のリン脂質のモル比を含んでもよい。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％の非カチオン性脂質のモル比を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して２５～５５％の構造脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、１０～５５％、２５～５０％、２５～４５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～５５％、３０～５０％、３０～４５％、３０～４０％、３０～３５％、３５～５５％、３５～５０％、３５～４５％、３５～４０％、４０～５５％、４０～５０％、４０～４５％、４５～５５％、４５～５０％、または５０～５５％の構造脂質のモル比を含んでもよい。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５５％の構造脂質のモル比を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、０．５～１０％、０．５～５％、１～１５％、１～１０％、１～５％、２～１５％、２～１０％、２～５％、５～１５％、５～１０％、または１０～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含んでもよい。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０％のアミノ脂質、５～２５％のリン脂質、２５～５５％の構造脂質、及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０％のアミノ脂質、５～３０％のリン脂質、１０～５５％の構造脂質、及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む。
アミノ脂質
一部の態様では、本開示のイオン化可能な脂質（例えば、アミノ脂質）は、式（Ｉ）：
の化合物、またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体のうちの１つまたは複数であり得、式中、
Ｒ’ａが、Ｒ’分岐状であり、Ｒ’分岐状が、
であり、式中、
が、結合点を表し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδが各々独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、Ｒ’が、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルであり、
Ｒ２及びＲ３が各々独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＯＨ及び
からなる群から選択され、式中、
が、結合点を表し、Ｒ１０が、Ｎ（Ｒ）２であり、各Ｒが独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択され、ｎが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－及び－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択され、
ｌが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択される。
一部の態様では、本開示のイオン化可能な脂質（例えば、アミノ脂質）は、式（Ｉ）：
の化合物、またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体のうちの１つまたは複数であり得、式中、
Ｒ’ａが、Ｒ’分岐状であり、Ｒ’分岐状が、
であり、式中、
が、結合点を表し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδが各々独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、Ｒ’が、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルであり、
Ｒ２及びＲ３が各々独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＯＨ及び
からなる群から選択され、式中、
が、結合点を表し、Ｒ１０が、Ｎ（Ｒ）２であり、各Ｒが独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択され、ｎが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－及び－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択され、
ｌが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ’ａは、Ｒ’分岐状であり、Ｒ’分岐状は、
であり、
は、結合点を表し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは５であり、ｍは７である。
であり、
は、結合点を表し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは５であり、ｍは７である。
一部の実施形態では、Ｒ’ａは、Ｒ’分岐状であり、Ｒ’分岐状は、
であり、
は、結合点を表し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは３であり、ｍは７である。
であり、
は、結合点を表し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは３であり、ｍは７である。
一部の実施形態では、Ｒ’ａは、Ｒ’分岐状であり、Ｒ’分岐状は、
であり、
は、結合点を表し、Ｒａαは、Ｃ２－１２アルキルであり、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、
であり、Ｒ１０は、Ｎ（Ｒ）２であり、一方のＲは、Ｈであり、他方のＲは、Ｃ１－６アルキルであり、ｎ２は２であり、Ｒ５は、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは５であり、ｍは７である。
であり、
は、結合点を表し、Ｒａαは、Ｃ２－１２アルキルであり、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、
であり、Ｒ１０は、Ｎ（Ｒ）２であり、一方のＲは、Ｈであり、他方のＲは、Ｃ１－６アルキルであり、ｎ２は２であり、Ｒ５は、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは５であり、ｍは７である。
一部の実施形態では、Ｒ’ａは、Ｒ’分岐状であり、Ｒ’分岐状は、
であり、
は、結合点を表し、Ｒａα、Ｒａβ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒａγは、Ｃ２－１２アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは５であり、ｍは７である。
であり、
は、結合点を表し、Ｒａα、Ｒａβ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒａγは、Ｃ２－１２アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは５であり、ｍは７である。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
から選択される。
から選択される。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物（Ｉ－Ｉ）：
である。
である。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物（Ｉ－ＩＩ）：
である。
である。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物（Ｉ－ＩＩＩ）：
である。
である。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物（Ｉ－ＩＶ）：
である。
である。
一部の態様では、本開示は、式（Ｉａ）：
の化合物、またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、式中、
Ｒ’ａが、Ｒ’分岐状であり、式中、Ｒ’分岐状が、
であり、式中、
が、結合点を表し、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδが各々独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、Ｒ’が、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルであり、
Ｒ２及びＲ３が各々独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＯＨ及び
からなる群から選択され、式中、
が、結合点を表し、Ｒ１０が、Ｎ（Ｒ）２であり、各Ｒが独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択され、ｎが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－及び－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択され、
ｌが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択される。
の化合物、またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、式中、
Ｒ’ａが、Ｒ’分岐状であり、式中、Ｒ’分岐状が、
であり、式中、
が、結合点を表し、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδが各々独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、Ｒ’が、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルであり、
Ｒ２及びＲ３が各々独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＯＨ及び
からなる群から選択され、式中、
が、結合点を表し、Ｒ１０が、Ｎ（Ｒ）２であり、各Ｒが独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択され、ｎが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－及び－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択され、
ｌが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択される。
一部の態様では、本開示は、式（Ｉｂ）：
の化合物、またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、式中、
Ｒ’ａが、Ｒ’分岐状であり、式中、Ｒ’分岐状が、
であり、式中、
が、結合点を表し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδが各々独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、Ｒ’が、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルであり、
Ｒ２及びＲ３が各々独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、式中、ｎが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－及び－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択され、
ｌが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択される。
の化合物、またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、式中、
Ｒ’ａが、Ｒ’分岐状であり、式中、Ｒ’分岐状が、
であり、式中、
が、結合点を表し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδが各々独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、Ｒ’が、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルであり、
Ｒ２及びＲ３が各々独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、式中、ｎが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－及び－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択され、
ｌが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ’ａは、Ｒ’分岐状であり、Ｒ’分岐状は、
であり、
は、結合点を表し、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ；ｎは２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは５であり、ｍは７である。
であり、
は、結合点を表し、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨ；ｎは２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは５であり、ｍは７である。
一部の実施形態では、Ｒ’ａは、Ｒ’分岐状であり、Ｒ’分岐状は、
であり、
は、結合点を表し、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは３であり、ｍは７である。
であり、
は、結合点を表し、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは３であり、ｍは７である。
一部の実施形態では、Ｒ’ａは、Ｒ’分岐状であり、Ｒ’分岐状は、
であり、
は、結合点を表し、Ｒａβ及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒａγは、Ｃ２－１２アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは５であり、ｍは７である。
であり、
は、結合点を表し、Ｒａβ及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒａγは、Ｃ２－１２アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＯＨであり、ｎは２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、ｌは５であり、ｍは７である。
一部の態様では、本開示は、式（Ｉｃ）：
の化合物、またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、式中、
Ｒ’ａが、Ｒ’分岐状であり、式中、Ｒ’分岐状が、
であり、式中、
が、結合点を表し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδが各々独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、Ｒ’が、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルであり、
Ｒ２及びＲ３が各々独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ４が、
であり、式中、
が、結合点を表し、Ｒ１０が、Ｎ（Ｒ）２であり、各Ｒが独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－及び－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択され、
ｌが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択される。
の化合物、またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、式中、
Ｒ’ａが、Ｒ’分岐状であり、式中、Ｒ’分岐状が、
であり、式中、
が、結合点を表し、Ｒａα、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδが各々独立して、Ｈ、Ｃ２－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、Ｒ’が、Ｃ１－１２アルキルまたはＣ２－１２アルケニルであり、
Ｒ２及びＲ３が各々独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ４が、
であり、式中、
が、結合点を表し、Ｒ１０が、Ｎ（Ｒ）２であり、各Ｒが独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、ｎ２が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－及び－ＯＣ（Ｏ）－からなる群から選択され、
ｌが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ’ａは、Ｒ’分岐状であり、Ｒ’分岐状は、
であり、
は、結合点を表し、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒａαは、Ｃ２－１２アルキルであり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、
であり、
は、結合点を表し、Ｒ１０は、Ｎ（Ｒ）２であり、一方のＲは、Ｈであり、他方のＲは、Ｃ１－６アルキルであり、ｎ２は２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、ｌは５であり、ｍは７である。
であり、
は、結合点を表し、Ｒａβ、Ｒａγ、及びＲａδは各々独立して、Ｈであり、Ｒａαは、Ｃ２－１２アルキルであり、Ｒ’は、Ｃ１－１２アルキルであり、Ｒ２及びＲ３は各々独立して、Ｃ１－１４アルキルであり、Ｒ４は、
であり、
は、結合点を表し、Ｒ１０は、Ｎ（Ｒ）２であり、一方のＲは、Ｈであり、他方のＲは、Ｃ１－６アルキルであり、ｎ２は２であり、各Ｒ５は独立して、Ｈであり、各Ｒ６は独立して、Ｈであり、Ｍ及びＭ’は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、ｌは５であり、ｍは７である。
一部の実施形態では、式（Ｉｃ）の化合物は、化合物（Ｉ－ＩＩＩ）：
である。
である。
一部の態様では、本開示のイオン化可能な脂質（例えば、アミノ脂質）は、式（ＩＩ）、
の化合物、またはその塩もしくは異性体のうちの１つまたは複数であり得、式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が各々独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍが独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３が各々独立して、結合、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択され、ここで、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つが、－ＣＨ２－ではなく、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つが、－Ｒ”ＭＲ’である。
の化合物、またはその塩もしくは異性体のうちの１つまたは複数であり得、式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が各々独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍが独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３が各々独立して、結合、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択され、ここで、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つが、－ＣＨ２－ではなく、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つが、－Ｒ”ＭＲ’である。
一部の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、Ｃ５－２０アルキルであり、Ｘ１は、－ＣＨ２－であり、Ｘ２及びＸ３は各々独立して、－Ｃ（Ｏ）－である。
一部の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、化合物（ＩＩ－Ｉ）：
である。
である。
式（Ｉ）、（Ｉ－Ｉ）、（Ｉ－ＩＩ）、（Ｉ－ＩＩＩ）、（Ｉ－ＩＶ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（ＩＩ）、または（ＩＩ－Ｉ）のうちのいずれか１つに従ったイオン化可能な脂質（例えば、アミノ脂質）のアミン部分（例えば、中心アミン部分）は、生理的ｐＨでプロトン化され得る。故に、脂質は、生理的ｐＨで正電荷または部分的に正の電荷を有してもよい。
リン脂質
本明細書に開示される脂質ナノ粒子組成物の脂質組成物は、１つまたは複数のリン脂質、例えば、１つもしくは複数の飽和もしくは（多価）不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つまたは複数の脂肪酸部分を含む。
本明細書に開示される脂質ナノ粒子組成物の脂質組成物は、１つまたは複数のリン脂質、例えば、１つもしくは複数の飽和もしくは（多価）不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つまたは複数の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
特定のリン脂質は、膜への融合を容易にし得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つまたは複数の負に帯電したリン脂質と相互作用し得る。リン脂質の膜への融合により、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つまたは複数の要素（例えば、治療剤）が膜を通過して、例えば、１つまたは複数の要素が標的組織に送達されるのを可能にすることができる可能性がある。
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含めた修飾及び置換を有する天然種を含む非天然のリン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１つまたは複数のアルキン（例えば、１つまたは複数の二重結合が三重結合と置き換えられているアルケニル基）で官能基化、またはそれに架橋され得る。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドに曝露されると銅触媒環化付加を経ることができる。かかる反応は、膜透過もしくは細胞認識を容易にするようにナノ粒子組成物の脂質二重層を官能基化する際、またはナノ粒子組成物を標的化もしくはイメージング部分（例えば、色素）等の有用な成分にコンジュゲートする際に有用であり得る。
リン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸等のグリセロリン脂質が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質にはまた、スフィンゴミエリン等のリンスフィンゴ脂質も含まれる。
一部の実施形態では、本発明のリン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－リンコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－リンコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（Ｃ１６リゾＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リン－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物を含む。
ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または有用な可能性があるリン脂質は、ＤＳＰＣの類似体またはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または有用な可能性があるリン脂質は、式（ＩＶ）：
の化合物、またはその塩であり、式中、
各Ｒ１が独立して、任意選択で置換されるアルキルであるか、または任意選択で、２つのＲ１が、介在原子と一緒に連結されて、任意選択で置換される単環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、または任意選択で、３つのＲ１が、介在原子と一緒に連結されて、任意選択で置換される二環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換される二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａが、式：
のものであり、
Ｌ２の各出現例が独立して、結合、または任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位が、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）により任意選択で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例が独立して、任意選択で置換されるＣ１－３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１－３０アルキニルであり、ここで、任意選択で、Ｒ２の１つまたは複数のメチレン単位が独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各出現例が独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂが、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐが、１または２であるが、
但し、該化合物が、式：
のものではないことを条件とし、式中、Ｒ２の各出現例が独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
の化合物、またはその塩であり、式中、
各Ｒ１が独立して、任意選択で置換されるアルキルであるか、または任意選択で、２つのＲ１が、介在原子と一緒に連結されて、任意選択で置換される単環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、または任意選択で、３つのＲ１が、介在原子と一緒に連結されて、任意選択で置換される二環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換される二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａが、式：
のものであり、
Ｌ２の各出現例が独立して、結合、または任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位が、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）により任意選択で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例が独立して、任意選択で置換されるＣ１－３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１－３０アルキニルであり、ここで、任意選択で、Ｒ２の１つまたは複数のメチレン単位が独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各出現例が独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂが、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐが、１または２であるが、
但し、該化合物が、式：
のものではないことを条件とし、式中、Ｒ２の各出現例が独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
一部の実施形態では、リン脂質は、米国出願第６２／５２０，５３０号、または２０１８年６月１５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３７９２２に記載されるリン脂質のうちの１つまたは複数であり得、同文献の各々の内容全体は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
構造脂質
本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、１つまたは複数の構造脂質を含み得る。本明細書で使用されるとき、「構造脂質」という用語は、ステロール、及びまたステロール部分を含有する脂質を指す。
本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、１つまたは複数の構造脂質を含み得る。本明細書で使用されるとき、「構造脂質」という用語は、ステロール、及びまたステロール部分を含有する脂質を指す。
脂質ナノ粒子中の構造脂質の組み込みは、粒子中の他の脂質の凝集を軽減するのに役立ち得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、植物ステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。一部の実施形態では、構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義されるとき、「ステロール」とは、ステロイドアルコールからなるステロイドの下位群である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。
一部の実施形態では、構造脂質は、米国出願第１６／４９３，８１４号に記載される構造脂質のうちの１つまたは複数であり得る。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質
本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、１つもしくは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、１つもしくは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
本明細書で使用されるとき、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。かかる脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質には、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（別称、ＰＥＧ－ＤＯＭＧ）、ＰＥＧ－ＤＳＧ、及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。
一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質の脂質部分は、約Ｃ１４～約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４～約Ｃ１６の長さを有するものを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分、例えばｍＰＥＧ－ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ－ＤＳＧ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥが挙げられる。
ＰＥＧ脂質は、例えば、米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４Ａ２号に記載されるもの等、当該技術分野で既知であり、同文献は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
一般に、本明細書に記載の種々の式の他の脂質成分（例えば、ＰＥＧ脂質）のうちのいくつかは、２０１６年１２月１０日に出願された、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」と題される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号に記載されるように合成されてもよく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質等、ポリエチレングリコールを含む１つまたは複数の分子を含んでもよい。かかる種は、代替的にＰＥＧ化脂質と称され得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であってもよい。
一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ－ＤＭＧは、以下の構造を有する。
一実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載されるＰＥＧ化脂質であり得、同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。本明細書に記載のこれらの例示的なＰＥＧ脂質のうちのいずれかは、ＰＥＧ鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾されてもよい。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。本明細書で一般に定義されるとき、「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」（本明細書で「ヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質」とも称される）とは、脂質上に１つまたは複数のヒドロキシル（－ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨ脂質は、ＰＥＧ鎖上に１つまたは複数のヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（Ｖ）の化合物である。本明細書では、式（Ｖ）：
の化合物、またはその塩が提供され、式中、
Ｒ３が、－ＯＲＯであり、
ＲＯが、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒが、１～１００（端点値を含む）の整数であり、
Ｌ１が、任意選択で置換されるＣ１－１０アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されるＣ１－１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンが独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられ、
Ｄが、クリックケミストリーによって得られる部分、または生理学的条件下で切断可能な部分であり、
ｍが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａが、式：
のものであり、
Ｌ２の各出現例が独立して、結合、または任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位が、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）により任意選択で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例が独立して、任意選択で置換されるＣ１－３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１－３０アルキニルであり、ここで、任意選択で、Ｒ２の１つまたは複数のメチレン単位が独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各出現例が独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂが、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐが、１または２である。
の化合物、またはその塩が提供され、式中、
Ｒ３が、－ＯＲＯであり、
ＲＯが、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒが、１～１００（端点値を含む）の整数であり、
Ｌ１が、任意選択で置換されるＣ１－１０アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されるＣ１－１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンが独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられ、
Ｄが、クリックケミストリーによって得られる部分、または生理学的条件下で切断可能な部分であり、
ｍが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａが、式：
のものであり、
Ｌ２の各出現例が独立して、結合、または任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位が、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）により任意選択で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例が独立して、任意選択で置換されるＣ１－３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１－３０アルキニルであり、ここで、任意選択で、Ｒ２の１つまたは複数のメチレン単位が独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各出現例が独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂが、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐが、１または２である。
ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である（すなわち、Ｒ３は、－ＯＲＯであり、ＲＯは、水素である）。ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖ－ＯＨ）：
のもの、またはその塩である。
のもの、またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ）の化合物である。本明細書では、式（ＶＩ－Ａ）：
の化合物、またはその塩が提供され、式中、
Ｒ３が、－ＯＲＯであり、
ＲＯが、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒが、１～１００（端点値を含む）の整数であり、
Ｒ５が、任意選択で置換されるＣ１０－４０アルキル、任意選択で置換されるＣ１０－４０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１０－４０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ５の１つまたは複数のメチレン基が、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各出現例が独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基である。
の化合物、またはその塩が提供され、式中、
Ｒ３が、－ＯＲＯであり、
ＲＯが、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒが、１～１００（端点値を含む）の整数であり、
Ｒ５が、任意選択で置換されるＣ１０－４０アルキル、任意選択で置換されるＣ１０－４０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１０－４０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ５の１つまたは複数のメチレン基が、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各出現例が独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－ＯＨ）：
のもの、またはその塩である。一部の実施形態では、ｒは、４０～５０である。
のもの、またはその塩である。一部の実施形態では、ｒは、４０～５０である。
なおも他の実施形態では、式（ＶＩ－Ｃ）の化合物は、
またはその塩である。
またはその塩である。
一実施形態では、式（ＶＩ－Ｄ）の化合物は、
である。
である。
一部の態様では、本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、米国出願第ＵＳ１５／６７４，８７２号に記載されるＰＥＧ脂質のうちの１つまたは複数であり得る。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのうちのいずれかのアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ－ＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのうちのいずれかのアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ脂質、式ＩＶを有するリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含むアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式（ＶＩ－Ｄ）の化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約２：１～約３０：１のＮ：Ｐの比を含む。一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐの比を含む。一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約３：１、４：１、または５：１のＮ：Ｐの比を含む。一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約１０：１～約１００：１のアミノ脂質成分対ＲＮＡの重量／重量比を含む。一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約２０：１のアミノ脂質成分対ＲＮＡの重量／重量比を含む。一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約１０：１のアミノ脂質成分対ＲＮＡの重量／重量比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約６０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均直径を有する。
例示的な追加のＬＮＰ構成成分
界面活性剤
ある特定の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、任意選択で、１つまたは複数の界面活性剤を含む。
界面活性剤
ある特定の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、任意選択で、１つまたは複数の界面活性剤を含む。
ある特定の実施形態では、界面活性剤は、両親媒性ポリマーである。本明細書で使用されるとき、両親媒性「ポリマー」とは、オリゴマーまたはポリマーを含む両親媒性化合物である。例えば、両親媒性ポリマーは、２つ以上のＰＥＧモノマー単位等のオリゴマー断片を含み得る。例えば、本明細書に記載の両親媒性ポリマーは、ＰＳ ２０であり得る。
例えば、両親媒性ポリマーは、ブロックコポリマーである。例えば、両親媒性ポリマーは、凍結保護剤である。
例えば、両親媒性ポリマーは、約３０℃及び大気圧で、水中で２×１０－４Ｍ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
例えば、両親媒性ポリマーは、約３０℃及び大気圧で、水中で約０．１×１０－４Ｍ～約１．３×１０－４Ｍの範囲の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、例えば、凍結または凍結乾燥の前に、製剤中で、およそそのＣＭＣからＣＭＣの約３０倍（例えば、そのＣＭＣの最大約２５倍、約２０倍、約１５倍、約１０倍、約５倍、または約３倍）の範囲である。
例えば、両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポロキサミン（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。
例えば、両親媒性ポリマーは、ポロキサマーである。例えば、両親媒性ポリマーは、以下の構造：
のものであり、式中、ａは、１０～１５０の整数であり、ｂは、２０～６０の整数である。例えば、ａは約１２であり、ｂは約２０であるか、またはａは約８０であり、ｂは約２７であるか、またはａは約６４であり、ｂは約３７であるか、またはａは約１４１であり、ｂは約４４であるか、またはａは約１０１であり、ｂは約５６である。
のものであり、式中、ａは、１０～１５０の整数であり、ｂは、２０～６０の整数である。例えば、ａは約１２であり、ｂは約２０であるか、またはａは約８０であり、ｂは約２７であるか、またはａは約６４であり、ｂは約３７であるか、またはａは約１４１であり、ｂは約４４であるか、またはａは約１０１であり、ｂは約５６である。
例えば、両親媒性ポリマーは、Ｐ１２４、Ｐ１８８、Ｐ２３７、Ｐ３３８、またはＰ４０７である。
例えば、両親媒性ポリマーは、Ｐ１８８（例えば、ポロキサマー１８８、ＣＡＳ番号９００３－１１－６、別名、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８）である。
例えば、両親媒性ポリマーは、ポロキサミン、例えば、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ ３０４またはＴｅｔｒｏｎｉｃ ９０４である。
例えば、両親媒性ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、例えば、３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２９ｋＤａの分子量を有するＰＶＰである。
例えば、両親媒性ポリマーは、ＰＳ ２０等のポリソルベートである。
ある特定の実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、界面活性剤を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、両親媒性ポリマーである。一部の実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。
例えば、非イオン性界面活性剤は、ポリエチレングリコールエーテル（Ｂｒｉｊ）、ポロキサマー、ポリソルベート、ソルビタン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。
例えば、ポリエチレングリコールエーテルは、式（ＶＩＩＩ）：
の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
ｔが、１～１００の整数であり、
Ｒ１ＢＲＩＪが独立して、Ｃ１０～４０アルキル、Ｃ１０～４０アルケニル、またはＣ１０～４０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ５ＰＥＧの１つまたは複数のメチレン基が独立して、Ｃ３～１０カルボシクリレン、４員～１０員のヘテロシクリレン、Ｃ６～１０アリーレン、４員～１０員のヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ、
ＲＮの各出現例が独立して、水素、Ｃ１～６アルキル、または窒素保護基である。
の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
ｔが、１～１００の整数であり、
Ｒ１ＢＲＩＪが独立して、Ｃ１０～４０アルキル、Ｃ１０～４０アルケニル、またはＣ１０～４０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ５ＰＥＧの１つまたは複数のメチレン基が独立して、Ｃ３～１０カルボシクリレン、４員～１０員のヘテロシクリレン、Ｃ６～１０アリーレン、４員～１０員のヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ、
ＲＮの各出現例が独立して、水素、Ｃ１～６アルキル、または窒素保護基である。
一部の実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪは、Ｃ１８アルキルである。例えば、ポリエチレングリコールエーテルは、式（ＶＩＩＩ－ａ）：
の化合物、またはその塩もしくは異性体である。
の化合物、またはその塩もしくは異性体である。
一部の実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪは、Ｃ１８アルケニルである。例えば、ポリエチレングリコールエーテルは、式（ＶＩＩＩ－ｂ）：
の化合物、またはその塩もしくは異性体である。
の化合物、またはその塩もしくは異性体である。
一部の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、及びポロキサマー４０７からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ポリソルベートは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０である。
一部の実施形態では、ソルビタンの誘導体は、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、またはＳｐａｎ（登録商標）８５である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中の非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．００００１ｗ／ｖ％～約１ｗ／ｖ％、例えば、約０．００００５ｗ／ｖ％～約０．５ｗ／ｖ％、または約０．０００１ｗ／ｖ％～約０．１ｗ／ｖ％の範囲である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中の非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．０００００１重量％～約１重量％、例えば、約０．０００００２重量％～約０．８重量％、または約０．０００００５重量％～約０．５重量％の範囲である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のＰＥＧ脂質の濃度は、約０．０１モル％～約５０モル％、例えば、約０．０５モル％～約２０モル％、約０．０７モル％～約１０モル％、約０．１モル％～約８モル％、約０．２モル％～約５モル％、または約０．２５モル％～約３モル％の範囲である。
アジュバント
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、任意選択で、１つまたは複数のアジュバント、例えば、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、クラスＡまたはＢ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、水酸化アルミニウム、及びＰａｍ３ＣＳＫ４を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、任意選択で、１つまたは複数のアジュバント、例えば、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、クラスＡまたはＢ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、水酸化アルミニウム、及びＰａｍ３ＣＳＫ４を含む。
他の構成成分
本発明のＬＮＰは、任意選択で、先の節に記載されたものに加えて１つまたは複数の構成成分を含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、ビタミン（例えば、ビタミンＡまたはビタミンＥ）またはステロール等の１つまたは複数の小さい疎水性分子を含んでもよい。
本発明のＬＮＰは、任意選択で、先の節に記載されたものに加えて１つまたは複数の構成成分を含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、ビタミン（例えば、ビタミンＡまたはビタミンＥ）またはステロール等の１つまたは複数の小さい疎水性分子を含んでもよい。
脂質ナノ粒子はまた、１つまたは複数の透過促進剤分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤、または他の構成成分を含んでもよい。透過促進剤分子は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号により記載される分子であってもよい。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖類（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体）を含んでもよい。
ポリマーは、脂質ナノ粒子に含まれても、及び／または脂質ナノ粒子をカプセル封入するもしくは部分的にカプセル封入するために使用されてもよい。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であってもよい。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。例えば、ポリマーには、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＥＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＰＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレン及びポリプロピレン等のポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）等のポリアルキレングリコール、ポリ（エチレンテレフタレート）等のポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）等のポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）等のハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリシロキサン、ポリスチレン、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の誘導体化セルロース、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ならびにそれらのコポリマー及び混合物等のアクリル酸のポリマー、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、トリメチレンカーボネート、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）（ＰＡｃＭ）、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）（ＰＭＯＸ）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ならびにポリグリセロールが含まれ得る。
表面改質剤には、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル－臭化アンモニウム等のカチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、アセチルシステイン、マグワート、ブロメライン、パパイン、クレロデンドルム、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシン、β４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、及びエルドステイン）、及びＤＮａｓｅ（例えば、ｒｈＤＮａｓｅ）が含まれ得るが、これらに限定されない。表面改質剤は、ナノ粒子内及び／またはＬＮＰの表面上に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによって）配置されてもよい。
脂質ナノ粒子はまた、１つまたは複数の官能基化脂質を含んでもよい。例えば、脂質は、適切な反応条件下でアジドに曝露されたときに環化付加反応を経ることができる、アルキン基で官能基化されてもよい。特に、脂質二重層は、この様式で、膜透過、細胞認識、またはイメージングを容易にする際に有用な１つまたは複数の基で官能基化されてもよい。ＬＮＰの表面はまた、１つまたは複数の有用な抗体とコンジュゲートされてもよい。標的細胞送達、イメージング、及び膜透過において有用な官能基及びコンジュゲートは、当該技術分野で周知されている。
これらの構成成分に加えて、脂質ナノ粒子は、薬学的組成物において有用な任意の物質を含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、限定されないが、１つまたは複数の溶媒、分散媒、希釈剤、分散補助剤、懸濁補助剤、造粒補助剤、崩壊剤、充填剤、流動促進剤、液体ビヒクル、結合剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、緩衝剤、滑沢剤、油、防腐剤、及び他の種等の、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または副成分を含んでもよい。ワックス、バター、着色剤、コーティング剤、香味剤、及び芳香剤等の賦形剤もまた含まれてもよい。薬学的に許容される賦形剤は、当該技術分野で周知されている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照されたい）。
希釈剤の例としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉末糖、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。造粒剤及び分散剤は、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類パルプ、寒天、ベントナイト、セルロース及び木材製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル－ピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微晶質デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物、及び／またはそれらの組み合わせからなる非限定的なリストから選択され得る。
表面活性剤及び／または乳化剤には、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドルックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］及びＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸マグネシウムアルミニウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、及びモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、及びカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、モノパルミチン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、モノステアリン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、トリステアリン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、及びＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル－ピロリドン）、モノラウリン酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウム、及び／またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
結合剤は、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン及びデンプンペースト）、ゼラチン、糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、天然及び合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワーガム（ｐａｎｗａｒ ｇｕｍ）、ガティガム（ｇｈａｔｔｉ ｇｕｍ）、イサポールハスク（ｉｓａｐｏｌ ｈｕｓｋｓ）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微晶質セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル－ピロリドン）、ケイ酸マグネシウムアルミニウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標）、及びカラマツアラビノガラクタン（ｌａｒｃｈ ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））、アルギネート、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、無機カルシウム塩、ケイ酸、ポリメタクリレート、ワックス、水、アルコール、ならびにそれらの組み合わせ、または任意の他の好適な結合剤であってもよい。
防腐剤の例としては、酸化防止剤、キレート剤、抗菌防腐剤、抗真菌防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、及び／または他の防腐剤が挙げられ得るが、これらに限定されない。酸化防止剤の例としては、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び／または亜硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。キレート剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、及び／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。抗菌防腐剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、及び／またはチメロサールが挙げられるが、これらに限定されない。抗真菌防腐剤の例としては、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、及び／またはソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。アルコール防腐剤の例としては、エタノール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、及び／またはフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。酸性防腐剤の例としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ－カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、及び／またはフィチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の防腐剤には、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、及び／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない。
緩衝剤の例としては、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、アミノスルホン酸緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質不含水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる非限定的な群から選択され得る。
油の例としては、アーモンド、アンズ核、アボカド、ババス、ベルガモット、クロスグリの種、ボラージ、カデ、カモミール、カノーラ、キャラウェイ、カルナウバ、ヒマシ、シナモン、ココアバター、ココナッツ、タラ肝、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、ツキミソウ、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ヒョウタン、グレープシード、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイナッツ、ラバンジン、ラベンダー、レモン、アオモジ、マカデミアナッツ、ゼニアオイ、マンゴーシード、メドウフォームシード、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、トウニン、ピーナッツ、ポピーシード、パンプキンシード、ナタネ、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、サンダルウッド、サザンカ（ｓａｓｑｕａｎａ）、セイバリー、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、大豆、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチバー、クルミ、及び小麦胚芽油、ならびにステアリン酸ブチル、トリカプリル酸グリセリル（ｃａｐｒｙｌｉｃ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、トリカプリン酸グリセリル（ｃａｐｒｉｃ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、シメチコン、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本開示のＬＮＰは、追加の標的化部分を含まず、例えば、それは追加の標的化部分なしに（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）の幹細胞または前駆細胞（例えば、ＨＳＰＣ）にトランスフェクトする。
ＬＮＰ組成物の使用方法
本開示は、例えば、インビトロまたはインビボで、細胞、例えば、標的細胞に送達され得る、ＬＮＰ組成物を提供する。インビボでのタンパク質発現の場合、細胞は、ＬＮＰを対象に投与することによってＬＮＰと接触させられ、それによって対象内の細胞におけるまたは細胞上でのタンパク質発現が増加または誘導される。例えば、一実施形態では、ＬＮＰは、静脈内に投与される。別の実施形態では、ＬＮＰは、筋肉内に投与される。なおも他の実施形態では、ＬＮＰは、皮下、結節内、及び腫瘍内からなる群から選択される経路によって投与される。
本開示は、例えば、インビトロまたはインビボで、細胞、例えば、標的細胞に送達され得る、ＬＮＰ組成物を提供する。インビボでのタンパク質発現の場合、細胞は、ＬＮＰを対象に投与することによってＬＮＰと接触させられ、それによって対象内の細胞におけるまたは細胞上でのタンパク質発現が増加または誘導される。例えば、一実施形態では、ＬＮＰは、静脈内に投与される。別の実施形態では、ＬＮＰは、筋肉内に投与される。なおも他の実施形態では、ＬＮＰは、皮下、結節内、及び腫瘍内からなる群から選択される経路によって投与される。
一実施形態では、細胞は、単回の処理／トランスフェクションでＬＮＰと接触させられる。別の実施形態では、細胞は、複数回の処理／トランスフェクション（例えば、同じ細胞の２回、３回、４回、またはそれを超える処理／トランスフェクション）でＬＮＰと接触させられる。
別の実施形態では、インビボ送達の場合、細胞は、ＬＮＰを対象に投与することによってＬＮＰと接触させられ、それによってペイロードが対象内の細胞に送達される。例えば、一実施形態では、ＬＮＰは、静脈内に投与される。別の実施形態では、ＬＮＰは、筋肉内に投与される。なおも他の実施形態では、ＬＮＰは、皮下、結節内、及び腫瘍内からなる群から選択される経路によって投与される。
関連する態様では、対象において細胞または組織を改変する方法において使用するための、ＬＮＰ組成物（例えば、本明細書に記載のＬＮＰ組成物）が本明細書で提供される。
なおも別の態様では、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物を送達する方法が本明細書で提供される。
関連する態様では、例えば、インビボで、ＬＮＰ組成物を細胞または組織に送達する方法において使用するための、ＬＮＰ組成物（例えば、本明細書に記載のＬＮＰ組成物）が本明細書で提供される。
ある実施形態では、該方法または該使用は、細胞をインビトロ、インビボ、またはエクスビボでＬＮＰ組成物と接触させることを含む。
ある実施形態では、本開示のＬＮＰ組成物は、例えば、エクスビボまたはインビボで、細胞と接触させられ、ペイロード、例えば、分泌ポリペプチド、細胞内ポリペプチド、または膜貫通型ポリペプチドを対象に送達するために使用することができる。
ある実施形態では、本開示のＬＮＰ組成物は、対象への単回投与用に製剤化される。別の実施形態では、本開示のＬＮＰ組成物は、対象への反復投与用に製剤化される。
併用療法
一部の実施形態では、本明細書に開示される処置方法または使用に向けた組成物は、追加の薬剤と組み合わせて本明細書に開示されるＬＮＰを投与することを含む。ある実施形態では、追加の薬剤は、疾患または障害に対する標準治療薬である。ある実施形態では、追加の薬剤は、核酸、例えば、ｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、本明細書に開示される処置方法または使用に向けた組成物は、追加の薬剤と組み合わせて本明細書に開示されるＬＮＰを投与することを含む。ある実施形態では、追加の薬剤は、疾患または障害に対する標準治療薬である。ある実施形態では、追加の薬剤は、核酸、例えば、ｍＲＮＡである。
一部の態様では、本方法または本組成物に対する対象は、１つまたは複数の標準治療法で処置されたことがある。他の態様では、本方法または本組成物に対する対象は、１つまたは複数の標準治療法に対して応答性でなかった。
配列最適化及びその方法
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列、例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、このＯＲＦは、配列最適化されている。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列、例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、このＯＲＦは、配列最適化されている。
本明細書に開示される配列最適化されたヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列、及び他の既知の配列最適化されたヌクレオチド配列とは明確に異なり、例えば、これらの配列最適化された核酸は、固有の組成特性を有する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ウラシル修飾配列を含む。一部の実施形態では、ウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、本開示のウラシル修飾配列中の核酸塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％が、修飾核酸塩基である。一部の実施形態では、ウラシル修飾配列中のウラシルの少なくとも９５％が、５－メトキシウラシルである。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列最適化されている。
配列最適化されたヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列は、本明細書で「核酸」とも称される）は、参照配列（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードする野生型配列）に対して少なくとも１つのコドン修飾を含む。故に、配列最適化された核酸において、少なくとも１つのコドンが、参照配列（例えば、野生型配列）中の対応するコドンとは異なる。
一般に、配列最適化された核酸は、少なくとも参照配列中のコドンを同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）で置換することを含むステップによって生成される。かかる置換は、例えば、コドン置換マップ（すなわち、コドン最適化された配列中の各アミノ酸をコードするコドンを提供する表）を適用することによって、または一組の規則（例えば、グリシンが中性アミノ酸の隣にある場合、グリシンはある特定のコドンによってコードされるが、それが極性アミノ酸の隣にある場合、それは別のコドンによってコードされる）を適用することによって達成され得る。コドン置換（すなわち、「コドン最適化」）に加えて、本明細書に開示される配列最適化方法は、有害なモチーフの除去（不安定化モチーフ置換）等の、厳密にコドン最適化を目的とするのではない追加の最適化ステップを含む。これらの配列最適化された核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含む組成物及び製剤は、治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードする機能的に活性なもののインビボ発現を容易にするために、それを必要とする対象に投与され得る。
配列最適化の追加の例示的な方法は、２０１７年５月１８日に出願された国際出願公開第ＷＯ２０１７／２０１３２５号に開示され、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、制御エレメント、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子に対する疑似受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、かかる制御エレメントを含む核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、「センサー配列」を含むと称される。
本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、制御エレメント、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子に対する疑似受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、かかる制御エレメントを含む核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、「センサー配列」を含むと称される。
一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、目的とするポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）をさらに含む。ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の包含または組み込みは、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）、及びひいては、それからコードされるポリペプチドの、天然型ｍｉＲＮＡの組織特異的及び／または細胞種特異的発現に基づいた制御を可能にする。
本発明はまた、上述の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）のうちのいずれかを含む薬学的組成物及び製剤も提供する。一部の実施形態では、組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物または製剤は、目的とするポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化された核酸配列を含む、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。一部の実施形態では、組成物または製剤は、目的とするポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化された核酸配列に対して顕著な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含む、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡに結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
ｍｉＲＮＡ、例えば、天然型ｍｉＲＮＡは、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に結合し、ポリヌクレオチドの安定性を低減することによってまたはその翻訳を阻害することによってのいずれかで遺伝子発現を下方制御する、１９～２５ヌクレオチド長のノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位の領域にある配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位または２～７位を含み得る。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７個のヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ結合部位におけるシード相補的部位には、ｍｉＲＮＡの１位に対向するアデノシン（Ａ）が隣接する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６個のヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ結合部位におけるシード相補的部位には、ｍｉＲＮＡの１位に対向するアデノシン（Ａ）が隣接する。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ，Ｆａｒｈ ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ，Ｌｉｍ ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００７ Ｊｕｌ ６；２７（１）：９１－１０５を参照されたい。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングを実施して、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡの存否を決定することができる。一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ相補的配列、またはマイクロＲＮＡシード相補的配列を含む。かかる配列は、米国公開ＵＳ２００５／０２６１２１８及び米国公開ＵＳ２００５／００５９００５に教示されるもの等の任意の既知のマイクロＲＮＡに対応する、例えば、それに対して相補性を有する可能性があり、同文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
マイクロＲＮＡは、ＲＮＡ転写物の領域がそれら自体に折り重なって、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（前駆体ｍｉＲＮＡ）と称される場合が多い短いヘアピン構造を形成することにより、酵素的に派生する。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、典型的には、その３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有し、３’ヒドロキシル基及び５’リン酸基を有する。この前駆体ｍＲＮＡは、核内でプロセシングされ、その後、細胞質に輸送され、そこでそれがＤＩＣＥＲ（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素）によってさらにプロセシングされて、およそ２２ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡを形成する。次いで、成熟マイクロＲＮＡは、リボ核粒子に組み込まれて、遺伝子サイレンシングを媒介するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体ＲＩＳＣを形成する。成熟ｍｉＲＮＡに対する当該技術分野で認識される命名法は、典型的には、成熟ｍｉＲＮＡが派生するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのアームを指定する。すなわち、「５ｐ」とは、マイクロＲＮＡがｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンの５プライムアームからのものであることを意味し、「３ｐ」とは、マイクロＲＮＡがｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンの３プライム末端からのものであることを意味する。本明細書で数によって言及されるｍｉＲは、同じｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのそれぞれ反対のアームを起源とする２つの成熟マイクロＲＮＡのうちのいずれか（例えば、３ｐまたは５ｐマイクロＲＮＡのいずれか）を指し得る。本明細書で言及される全てのｍｉＲは、３ｐまたは５ｐ表記によって特に明記されない限り、３ｐアーム／配列及び５ｐアーム／配列の両方を含むことが意図される。
本明細書で使用されるとき、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡの全てまたはある領域に対して、ｍｉＲＮＡと相互作用する、それと会合する、またはそれに結合するのに十分な相補性を有する、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ中を含めた核酸分子内、例えば、ＤＮＡ内またはＲＮＡ転写物内の配列を指す。一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、目的とするポリペプチドをコードするＯＲＦを含み、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）をさらに含む。例示的な実施形態では、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲが、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）のｍｉＲＮＡ媒介性制御、例えば、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）のｍｉＲＮＡ媒介性翻訳抑制またはその分解を容易にするのに十分な程度の相補性を指す。本開示の例示的な態様では、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）のｍｉＲＮＡ媒介性分解、例えば、ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡガイドによるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断を容易にするのに十分な程度の相補性を指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９～２５ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列に対して、１９～２３の長さのヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列に対して、または２２ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部分のみに対して、例えば、完全長の天然型ｍｉＲＮＡ配列の１、２、３、もしくは４ヌクレオチド未満の部分に対して、または天然型ｍｉＲＮＡ配列よりも１、２、３、もしくは４ヌクレオチド未満だけ短い部分に対して相補的であり得る。所望の制御がｍＲＮＡ分解である場合、完全な（ｆｕｌｌ）または完全な（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）相補性（例えば、天然型ｍｉＲＮＡの全長の全てまたは大部分にわたる完全な（ｆｕｌｌ）相補性または完全な（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）相補性）が好ましい。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、１、２、または３ヌクレオチドの置換、末端付加、及び／または切詰めを除いてｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有する。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、または両方にて、対応するｍｉＲＮＡよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチド（複数可）だけ短い。依然として他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、または両方にて、対応するマイクロＲＮＡよりも２ヌクレオチドだけ短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、依然として、ｍｉＲＮＡ結合部位のうちの１つもしくは複数を組み込むｍＲＮＡを分解することができるか、またはｍＲＮＡの翻訳を阻止することができる。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、活性ＲＩＳＣ含有Ｄｉｃｅｒの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ＲＩＳＣにおける対応するｍｉＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合部位の結合は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含有するｍＲＮＡを分解するか、またはｍＲＮＡが翻訳されるのを阻止する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を切断するように、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に不安定性を誘導するように、不完全な相補性を有する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の転写を抑制するように、不完全な相補性を有する。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のミスマッチ（複数可）を有する。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡのそれぞれ少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、または少なくとも約２１個の連続ヌクレオチドに相補的な、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、または少なくとも約２１個の連続ヌクレオチドを有する。
１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に導入操作することによって、当該ｍｉＲＮＡが利用可能である限り、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を分解または低減された翻訳に向けて標的化することができる。これは、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の送達時のオフターゲット効果を低減し得る。例えば、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）が、ある組織または細胞に送達されることが意図されないが、結果的に該組織または該細胞に到達する場合、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ内にｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位が導入操作されていると、その組織または細胞に豊富に存在するｍｉＲＮＡが、目的とする遺伝子の発現を阻害し得る。故に、一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡへの１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位の組み込みは、核酸分子送達に対するオフターゲット効果の危険を低減し、及び／またはｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現の組織特異的制御を可能にし得る。なおも他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡへの１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位の組み込みは、インビボでの核酸送達時の免疫応答を調節し得る。さらなる実施形態では、本開示のｍＲＮＡへの１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位の組み込みは、本明細書に記載の脂質含有化合物及び組成物の加速血液クリアランス（ＡＢＣ）を調節し得る。
例えば、当業者であれば、リンパ系細胞以外の細胞種における発現を最小限に抑えるために、１つまたは複数のｍｉＲ結合部位を核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に含めることができることを理解しよう。一実施形態では、ｍｉＲ１２２結合部位が使用され得る。別の実施形態では、ｍｉＲ１２６結合部位が使用され得る。依然として別の実施形態では、これらのｍｉＲ結合部位の複数のコピーまたは組み合わせが使用されてもよい。
逆に、特定の組織におけるタンパク質発現を増加させるために、ｍｉＲＮＡ結合部位を、それらが天然に存在する核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）配列から除去することができる。例えば、ｍｉＲＮＡを含有する組織または細胞におけるタンパク質発現を改善するために、特定のｍｉＲＮＡのための結合部位を核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）から除去することができる。
複数の組織における発現の制御は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、１つまたは複数の別々のｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去により遂行することができる。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するかまたは挿入するかのどちらかの決定は、発生及び／または疾患における組織及び／または細胞中のｍｉＲＮＡ発現パターン及び／またはそれらのプロファイリングに基づいて行うことができる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位の特定、ならびに生物学におけるそれらの発現パターン及び役割が報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１０ １１：９４３－９４９、Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ａｎｄ Ｒａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３（２０１１ Ｄｅｃ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ ２００９ １３６：２１５－２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７ １２９：１４０１－１４１４、Ｇｅｎｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２ ８０：３９３－４０３、及びその中の全ての参考文献（同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される））。
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、米国公開第２０１４／０２００２６１号、同第２００５／０２６１２１８号、及び同第２００５／００５９００５号に記載される非限定的な例を含めた、任意の既知の配列に対応し得、同文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
ｍｉＲＮＡが、ｍＲＮＡ、及びそれによってタンパク質発現を制御することが知られている組織の例としては、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄系細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（別称、造血細胞）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及び単球）、単球、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞等において差次的に発現することが知られている。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染症に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子療法及び組織／臓器移植後の望まれない免疫応答に関与する。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化、及びアポトーシスの多くの側面も制御する。例えば、ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１４６は、免疫細胞に限って発現し、特に骨髄系樹状細胞に豊富に発現する。核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に対する免疫応答は、ｍｉＲ－１４２結合部位をポリヌクレオチドの３’－ＵＴＲに付加することによって遮断され得、これにより組織及び細胞中のより安定な遺伝子導入が可能となることが実証されている。ｍｉＲ－１４２は、抗原提示細胞において外因性核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を効率的に分解し、形質導入された細胞の細胞傷害性排除を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２－５１６１、Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５－５９１、Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４－４１５２（同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される））。
抗原媒介性免疫応答は、外来性抗原によって誘発される免疫応答を指すことができ、外来性抗原は、生物に進入すると、抗原提示細胞によってプロセシングされ、抗原提示細胞の表面上に提示される。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識して、抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導することができる。
ｍｉＲ－１４２結合部位を本開示の核酸分子の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに導入することにより、ｍｉＲ－１４２媒介性分解を通して抗原提示細胞における遺伝子発現を選択的に抑制して、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それによって核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の送達後の抗原媒介性免疫応答を阻止することができる。すると核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、細胞傷害性排除を誘発することなく標的組織または細胞で安定して発現される。
一実施形態では、免疫細胞、特に抗原提示細胞で発現することが知られているｍｉＲＮＡに対する結合部位を本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）内に導入操作して、ｍｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡ分解を通して抗原提示細胞における核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の発現を抑制することにより、抗原媒介性免疫応答を抑えることができる。核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の発現は、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現していない非免疫細胞においては維持される。例えば、一部の実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を阻止するために、いずれのｍｉＲ－１２２結合部位も除去され得、ｍｉＲ－１４２（及び／またはｍｉｒＲ－１４６）結合部位が本開示の核酸分子の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ内に導入操作され得る。
ＡＰＣ及びマクロファージにおいて選択的分解及び抑制をさらに駆動するために、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、単独で、またはｍｉＲ－１４２及び／またはｍｉＲ－１４６結合部位と組み合わせてのいずれかで、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにさらなる負の制御エレメントを含み得る。非限定的な例として、さらなる負の制御エレメントは、構成的分解エレメント（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｄｅｃａｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＣＤＥ）である。
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡには、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈｓａ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７９、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４７ａ、ｍｉＲ－１４７ｂ、ｍｉＲ－１４８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ｂ、ｍｉＲ－１５５－３ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１６－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－２－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９７－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－２２３－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｍｉＲ－２８－５ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３３１－５ｐ、ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｍｉＲ－３４５－３ｐ、ｍｉＲ－３４５－５ｐ、ｍｉＲ－３４６、ｍｉＲ－３４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７２、ｍｉＲ－３７７－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、ｍｉＲ－５４２、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｊ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５９８、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９３５、ｍｉＲ－９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム解析により新規のｍｉＲＮＡが免疫細胞において特定され得る（例えば、Ｊｉｍａ ＤＤ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８－ｅ１２７、Ｖａｚ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８（同文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される））。
一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、ここで、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ結合部位配列のうちのいずれか１つまたは複数の１つまたは複数のコピーを含む、表３Ｃまたは表４Ａから選択される１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、表３Ｃまたは表４Ａから選択される同じまたは異なるｍｉＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよりも多く（それらの任意の組み合わせを含む）をさらに含む。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合するか、またはｍｉＲ－１４２に相補的である。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１４２は、配列番号１１４を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐに結合する。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位は、配列番号２０２を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位は、配列番号２０４を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号２０２または配列番号２０４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６に結合するか、またはｍｉＲ－１２６に相補的である。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１２６は、配列番号２０５を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐに結合する。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位は、配列番号２０７を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１２６－５ｐ結合部位は、配列番号２０９を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号１２１または配列番号１２３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、３’ＵＴＲは、２つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、ここで、第１のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合し、第２のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６に結合する。具体的な実施形態では、ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１２６に結合する３’ＵＴＲは、配列番号２４９の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）において、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の任意の位置（例えば、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ）で挿入される。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）における挿入部位は、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）におけるｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が、対応するｍｉＲＮＡの不在下で機能的ポリペプチドの翻訳を妨害せず、かつｍｉＲＮＡの存在下で、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）におけるｍｉＲＮＡ結合部位の挿入及び対応するｍｉＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合部位の結合が、ポリヌクレオチドを分解するか、または核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を阻止することができる限り、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の任意の箇所であることができる。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）において、ＯＲＦの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドにおいて、ＯＲＦの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）において、ＯＲＦの終止コドンから約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約６５ヌクレオチド下流に挿入される。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）内で、３’ＵＴＲ内においてコーディング領域の終止コドンの直後に挿入される。一部の実施形態では、構築物に終止コドンの複数のコピーが存在する場合、ｍｉＲＮＡ結合部位は、最後の終止コドンの直後に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、終止コドンのさらに下流に挿入され、その場合、終止コドンとｍｉＲ結合部位（複数可）との間に３’ＵＴＲ塩基が存在する。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ内のｍｉＲのための可能な挿入部位の３つの非限定的な例が、配列番号２４８、２４９、及び２５０に示され、これらは、ｍｉＲ－１４２－３ｐ部位が３’ＵＴＲ内の３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つにそれぞれ挿入されている３’ＵＴＲ配列を示す。
一部の実施形態では、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位は、５’ＵＴＲ内において１つまたは複数の可能な挿入部位に位置付けられ得る。例えば、５’ＵＴＲ内のｍｉＲのための可能な挿入部位の３つの非限定的な例が、配列番号２５１、２５２、または２５３に示され、これらは、ｍｉＲ－１４２－３ｐ部位が５’ＵＴＲ内の３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つの中にそれぞれ挿入されている５’ＵＴＲ配列を示す。
一実施形態では、目的とするポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲ内において終止コドンから１～１００ヌクレオチド後に位置する。一実施形態では、目的とするポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲ内において終止コドンから３０～５０ヌクレオチド後に位置する。別の実施形態では、目的とするポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲ内において終止コドンから少なくとも５０ヌクレオチド後に位置する。他の実施形態では、目的とするポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲ内において終止コドンの直後に、または３’ＵＴＲ内において終止コドンから１５～２０ヌクレオチド後に、または３’ＵＴＲ内において終止コドンから７０～８０ヌクレオチド後に位置する。他の実施形態では、３’ＵＴＲは、１つよりも多くのｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２～４つのｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位の間には（例えば、１０～１００、２０～７０、または３０～５０ヌクレオチド長の）スペーサー領域が存在し得る。別の実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の末端とポリＡテールヌクレオチドとの間にスペーサー領域を含む。例えば、１０～１００、２０～７０、または３０～５０ヌクレオチド長のスペーサー領域が、ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の末端とポリＡテールの始まりとの間に位置を定められ得る。
一実施形態では、目的とするポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、５’ＵＴＲ内において開始コドンより１～１００ヌクレオチド前（上流）に位置する。一実施形態では、目的とするポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、５’ＵＴＲ内において開始コドンより１０～５０ヌクレオチド前（上流）に位置する。別の実施形態では、目的とするポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、５’ＵＴＲ内において開始コドンより少なくとも２５ヌクレオチド前（上流）に位置する。他の実施形態では、目的とするポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、５’ＵＴＲ内において開始コドンの直前、または５’ＵＴＲ内において開始コドンより１５～２０ヌクレオチド前、または５’ＵＴＲ内において開始コドンより７０～８０ヌクレオチド前に位置する。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、１つよりも多くのｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２～４つのｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位の間には（例えば、１０～１００、２０～７０、または３０～５０ヌクレオチド長の）スペーサー領域が存在し得る。
一実施形態では、３’ＵＴＲは、１つよりも多くの終止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が、終止コドンの下流に位置付けられる。例えば、３’ＵＴＲは、１つ、２つ、または３つの終止コドンを含み得る。使用され得る三重終止コドンの非限定的な例としては、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧ（配列番号２１０）、ＵＧＡＵＡＧＵＡＡ（配列番号２１１）、ＵＡＡＵＧＡＵＡＧ（配列番号２７７）、ＵＧＡＵＡＡＵＡＡ（配列番号２１３）、ＵＧＡＵＡＧＵＡＧ（配列番号２１４）、ＵＡＡＵＧＡＵＧＡ（配列番号２１５）、ＵＡＡＵＡＧＵＡＧ（配列番号２１６）、ＵＧＡＵＧＡＵＧＡ（配列番号２１７）、ＵＡＡＵＡＡＵＡＡ（配列番号２１８）、及びＵＡＧＵＡＧＵＡＧ（配列番号２１９）が挙げられる。３’ＵＴＲ内で、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位が、終止コドン（複数可）に直接隣接して、または最後の終止コドンの任意の数のヌクレオチドだけ下流に位置付けられ得る。３’ＵＴＲが複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含む場合、これらの結合部位は、構築物中で互いに直接隣り合って（すなわち、次々に）位置付けられ得るか、または代替として、スペーサーヌクレオチドが各結合部位の間に位置付けられ得る。
一実施形態では、３’ＵＴＲは、３つの終止コドンを含み、このうち単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位が第３の終止コドンの下流に位置する。３つの終止コドンを有し、単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位が最後の終止コドンの下流の異なる位置に位置する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例が、配列番号２３７、２４８、２４９、及び２５０に示される。
一実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、５’ＵＴＲ、目的とするポリペプチドをコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム、免疫細胞で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、及び連結されたヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。種々の実施形態では、３’ＵＴＲは、免疫細胞で発現する、好ましくは免疫細胞で豊富にまたは優先的に発現するｍｉＲのための１～４つ、少なくとも２つ、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
一実施形態では、免疫細胞で発現する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号２０２に示される配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号２２０に示される配列を含む。
一実施形態では、免疫細胞で発現する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号２０７に示される配列を含む。ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む本発明のｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号２３５に示される配列を含む。
本開示のマイクロＲＮＡ結合部位（複数可）が結合し得るｍｉＲの非限定的な例示的配列には、以下が含まれる：ｍｉＲ－１４２－３ｐ（配列番号２０１）、ｍｉＲ－１４２－５ｐ（配列番号２０３）、ｍｉＲ－１４６－３ｐ（配列番号２２１）、ｍｉＲ－１４６－５ｐ（配列番号２２２）、ｍｉＲ－１５５－３ｐ（配列番号２２３）、ｍｉＲ－１５５－５ｐ（配列番号２２４）、ｍｉＲ－１２６－３ｐ（配列番号２０６）、ｍｉＲ－１２６－５ｐ（配列番号２０８）、ｍｉＲ－１６－３ｐ（配列番号２２５）、ｍｉＲ－１６－５ｐ（配列番号２２６）、ｍｉＲ－２１－３ｐ（配列番号２２７）、ｍｉＲ－２１－５ｐ（配列番号２２８）、ｍｉＲ－２２３－３ｐ（配列番号１４３）、ｍｉＲ－２２３－５ｐ（配列番号２３０）、ｍｉＲ－２４－３ｐ（配列番号２３１）、ｍｉＲ－２４－５ｐ（配列番号２３２）、ｍｉＲ－２７－３ｐ（配列番号２３３）、及びｍｉＲ－２７－５ｐ（配列番号２３４）。免疫細胞で発現する（例えば、免疫細胞で豊富にまたは優先的に発現する）他の好適なｍｉＲ配列は既知であり、当該技術分野で、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＭａｎｃｈｅｓｔｅｒのマイクロＲＮＡデータベース、ｍｉＲＢａｓｅにて入手可能である。前述のｍｉＲのうちのいずれかに結合する部位は、本明細書に記載されるように、ｍｉＲに対するワトソン・クリック相補性、典型的にはｍｉＲに対する１００％の相補性に基づいて設計し、本開示のｍＲＮＡ構築物に挿入することができる。
別の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、その３’ＵＴＲ）は、例えば、Ｂ細胞によるＩｇＭの産生（例えばＰＥＧに対する）を低減もしくは阻害することによって、及び／またはｐＤＣの増殖及び／または活性化を低減もしくは阻害することによって、加速血液クリアランスを低減または阻害するための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得、また、コードされる目的とするタンパク質の組織発現を調節するための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
ｍｉＲＮＡ遺伝子制御は、限定されないが、周囲の配列の種、配列の種類（例えば、異種、同種、外因性、内因性、または人工）、周囲の配列内の制御エレメント及び／または周囲の配列内の構造エレメント等の、ｍｉＲＮＡの周囲の配列によって影響を受け得る。ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲによって影響を受け得る。非限定的な例として、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列の種類のヒト３’ＵＴＲと比較して、目的とするポリペプチドの発現に対するｍｉＲＮＡ配列の制御効果を増加させ得る。
一実施形態では、５’ＵＴＲの他の制御エレメント及び／または構造エレメントが、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子制御に影響を及ぼし得る。制御エレメント及び／または構造エレメントの一例は、タンパク質翻訳を開始するための翻訳伸長因子の結合に必要である、５’ＵＴＲ内の構造化ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）である。５’－ＵＴＲ内のこの二次構造化エレメントへのＥＩＦ４Ａ２の結合は、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子発現に必要である（Ｍｅｉｊｅｒ ＨＡ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２－８５（参照によりその全体が本明細書に援用される））。本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、マイクロＲＮＡ媒介性遺伝子制御を強化するために、この構造化５’ＵＴＲをさらに含み得る。
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ内に導入操作され得る。この文脈において、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、またはそれよりも多くのｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲ内に導入操作され得る。例えば、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、２個、または１個のｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲ内に導入操作され得る。一実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、同じであることもできるし、または異なるｍｉＲＮＡ部位であることもできる。本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれる異なるｍｉＲＮＡ結合部位の組み合わせは、異なるｍｉＲＮＡ部位のうちのいずれかの１つよりも多くのコピーが組み込まれる組み合わせを含み得る。別の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じまたは異なる組織を標的とすることができる。非限定的な例として、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の３’－ＵＴＲ内の組織特異的、細胞種特異的、または疾患特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入により、特定の細胞種（例えば、骨髄系細胞、リンパ系細胞、免疫細胞、血液細胞等）における発現の程度が低減され得る。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）において３’ＵＴＲの５’末端の近くに、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間のおよそ中間に、及び／または３’ＵＴＲの３’末端の近くに導入操作され得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端の近く及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間のおよそ中間に導入操作され得る。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの３’末端の近く及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間のおよそ中間に導入操作され得る。なおも別の非限定的な例では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端の近く及び３’ＵＴＲの３’末端の近くに導入操作され得る。
別の実施形態では、３’ＵＴＲは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、及び／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に相補的であり得る。
一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の発現は、ポリヌクレオチドに少なくとも１つのセンサー配列を組み込むこと、及びポリヌクレオチドを投与用に製剤化することによって制御することができる。非限定的な例として、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むこと、及び本明細書に記載の脂質のうちのいずれかを含めたイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子にポリヌクレオチドを製剤化することによって、組織または細胞に標的化することができる。
本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、異なる組織、細胞種、または生物学的条件でのｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞種、または生物学的条件でのより標的化された発現に向けて操作され得る。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入により、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、組織もしくは細胞、または生物学的条件の関連における最適なタンパク質発現に向けて設計され得る。
一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、既知のｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％の同一性を有するか、またはｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％未満の同一性を有するかのいずれかであるｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むように設計され得る。一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、既知のｍｉＲＮＡシード配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むように設計され得る。ｍｉＲＮＡシード配列は、ｍｉＲＮＡ結合親和性を減少させ、こうして核酸分子の低減された下方調節をもたらすように、部分的に変異させられ得る。本質的に、ｍｉＲＮＡ結合部位とｍｉＲＮＡシードとの間のマッチまたはミスマッチの程度が、ｍｉＲＮＡがタンパク質発現を調節する能力をより微調整するための可変抵抗器として作用し得る。加えて、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域における変異もまた、ｍｉＲＮＡがタンパク質発現を調節する能力に影響を与え得る。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、ステムループのループに組み込まれ得る。
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡシード配列は、ステムループのループに組み込まれ得、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ステムループの５’または３’ステムに組み込まれ得る。
一実施形態では、５’ＵＴＲ内のｍｉＲＮＡ配列を使用して、本明細書に記載の本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を安定化することができる。
別の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の５’ＵＴＲ内のｍｉＲＮＡ配列を使用して、限定されないが、開始コドン等の翻訳開始部位の接近性を減少させることができる。例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０ １１（５）：ｅ１５０５７（参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照されたく、これは開始コドンの周りで（－４～＋３７、ここでＡＵＧコドンのＡは＋１である）アンチセンスロックト核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエクソン接合部複合体（ＥＪＣ）を使用して、最初の開始コドン（ＡＵＧ）への接近性を減少させた。Ｍａｔｓｕｄａは、開始コドンの周りの配列をＬＮＡまたはＥＪＣにより変化させることがポリヌクレオチドの効率、長さ、及び構造的安定性に影響を及ぼすことを示した。本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、翻訳開始部位への接近性を減少させるために、翻訳開始部位の近くに、Ｍａｔｓｕｄａらにより記載されるＬＮＡまたはＥＪＣ配列の代わりにｍｉＲＮＡ配列を含み得る。翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前、後、または内部にあることができる。非限定的な例として、翻訳開始部位は、シード配列または結合部位等のｍｉＲＮＡ配列内に位置し得る。
一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、抗原提示細胞による抗原提示を弱めるために少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡシード配列、シードを含まないｍｉＲＮＡ配列、またはそれらの組み合わせであり得る。非限定的な例として、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれるｍｉＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例として、抗原提示を弱めるために本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐである。
一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、目的とする組織または細胞におけるコードされたポリペプチドの発現を弱めるために少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。非限定的な例として、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－３ｐシード配列、シードを含まないｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐシード配列、シードを含まないｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４６結合部位、ｍｉＲ－１４６シード配列、及び／またはシード配列を含まないｍｉＲ－１４６結合部位を含み得る。
一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、治療薬送達によって引き起こされる望まれない免疫原性反応を抑えるように免疫細胞においてｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解するために、３’ＵＴＲ内に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、抗原提示細胞において本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）をより不安定にし得る。これらのｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、ｍｉｒ－１４２－５ｐ、ｍｉｒ－１４２－３ｐ、ｍｉｒ－１４６ａ－５ｐ、及びｍｉｒ－１４６－３ｐが挙げられる。
一実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用し得る核酸分子の領域に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、（ｉ）目的とするポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、ならびに（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
ＩＶＴポリヌクレオチドアーキテクチャ
一部の実施形態では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするｍＲＮＡを含む本開示のポリヌクレオチドは、ＩＶＴポリヌクレオチドである。慣例では、ｍＲＮＡ分子の基本的構成要素には、少なくともコーディング領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリ－Ａテールが含まれる。本開示のＩＶＴポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能し得るが、例えば、核酸ベースの治療薬を使用した有効なポリペプチド産生の既存の問題を克服する役目を果たすそれらの機能的及び／または構造的設計特徴において、野生型ｍＲＮＡとは区別される。
一部の実施形態では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするｍＲＮＡを含む本開示のポリヌクレオチドは、ＩＶＴポリヌクレオチドである。慣例では、ｍＲＮＡ分子の基本的構成要素には、少なくともコーディング領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリ－Ａテールが含まれる。本開示のＩＶＴポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能し得るが、例えば、核酸ベースの治療薬を使用した有効なポリペプチド産生の既存の問題を克服する役目を果たすそれらの機能的及び／または構造的設計特徴において、野生型ｍＲＮＡとは区別される。
ＩＶＴポリヌクレオチドの一次構築物は、第１の隣接領域及び第２の隣接領域が隣接する、連結されたヌクレオチドの第１の領域を含む。この第１の領域には、コードされた治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子が含まれ得るが、これらに限定されない。第１の隣接領域は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、ポリペプチドの天然５’ＵＴＲ、または限定されないが、異種５’ＵＴＲもしくは合成５’ＵＴＲ等の非天然５’ＵＴＲをコードする核酸のうちのいずれかの５’ＵＴＲとして機能する、連結されたヌクレオシドの配列を含み得る。治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするＩＶＴは、その５末端に、１つまたは複数のシグナル配列をコードするシグナル配列領域を含み得る。隣接領域は、１つまたは複数の完全または不完全な５’ＵＴＲ配列を含む、連結されたヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域はまた、５’末端キャップも含み得る。第２の隣接領域は、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子の天然３’ＵＴＲ、あるいは限定されないが、異種３’ＵＴＲまたは合成３’ＵＴＲ等の非天然３’ＵＴＲをコードし得る１つまたは複数の完全または不完全な３’ＵＴＲを含む、連結されたヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域はまた、３’テーリング配列も含み得る。３’テーリング配列は、ポリＡテール、ポリＡ－Ｇカルテット、及び／またはステムループ配列であり得るが、これらに限定されない。
ＩＶＴポリヌクレオチドアーキテクチャの追加の例示的な特徴は、２０１７年５月１８日に出願された国際ＰＣＴ出願ＷＯ２０１７／２０１３２５に開示され、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ
ＵＴＲは、ポリヌクレオチドにおけるコーディング領域に対して同種または異種であり得る。一部の実施形態では、ＵＴＲは、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするＯＲＦに対して同種である。一部の実施形態では、ＵＴＲは、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするＯＲＦに対して異種である。
ＵＴＲは、ポリヌクレオチドにおけるコーディング領域に対して同種または異種であり得る。一部の実施形態では、ＵＴＲは、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするＯＲＦに対して同種である。一部の実施形態では、ＵＴＲは、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするＯＲＦに対して異種である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲまたはそれらの機能的断片を含み、これらの各々は、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の３’ＵＴＲまたはそれらの機能的断片を含み、これらの各々は、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、配列最適化される。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの化学修飾核酸塩基、例えば、Ｎ１－メチルシュードウラシルまたは５－メトキシウラシルを含む。
ＵＴＲは、制御的役割、例えば、増加または減少した安定性、局在化、及び／または翻訳効率を提供する特徴を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドを細胞、組織、または生物に投与することができ、通例の方法を使用して１つまたは複数の制御的特徴を測定することができる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの機能的断片は、それぞれ完全長の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの１つまたは複数の制御的特徴を含む。
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす特徴をもつ。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般的に知られているコザック配列のようなシグネチャを保有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号２７５）を有し、配列中、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、開始コドンの後には別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
特定の標的臓器の豊富に発現する遺伝子に典型的に見出される特徴を操作することによって、ポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質産生を強化することができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子等の肝臓で発現するｍＲＮＡの５’ＵＴＲを導入することで、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を強化することができる。同様に、他の組織特異的ｍＲＮＡからの５’ＵＴＲを使用してその組織における発現を改善することが、筋肉で（例えば、ＭｙｏＤ、Ｍｙｏｓｉｎ、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｈｅｒｃｕｌｉｎ）、内皮細胞で（例えば、Ｔｉｅ－１、ＣＤ３６）、骨髄系細胞で（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、ｉ－ＮＯＳ）、白血球で（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織で（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、及び肺上皮細胞で（例えば、ＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）可能である。
一部の実施形態では、ＵＴＲは、転写物のタンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、コードされたポリペプチドは、特定の細胞、組織で、または発生中の何らかの時点で発現する、あるファミリーのタンパク質（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する）に属することができる。遺伝子またはｍＲＮＡのうちのいずれかからのＵＴＲを、同じまたは異なるファミリーのタンパク質の任意の他のＵＴＲと交換して、新たなポリヌクレオチドを作出することができる。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、異種であり得る。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、３’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。
権利が共有された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（公開第ＷＯ／２０１４／１６４２５３号（参照によりその全体が本明細書に援用される））は、本発明のポリヌクレオチドにおいてＯＲＦの隣接領域として利用され得る例示的なＵＴＲの一覧を提供する。
本願の追加の例示的なＵＴＲには、グロビン、例えば、α－またはβ－グロビン（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン）；強力なコザック翻訳開始シグナル；ＣＹＢＡ（例えば、ヒトシトクロムｂ－２４５ αポリペプチド）；アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）；ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ）；ウイルス（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス）；熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）；翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）；グルコース輸送体（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））；アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）；ＧＡＰＤＨ；チューブリン；ヒストン；クエン酸回路酵素；トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰ（オリゴピリミジントラクト）モチーフを欠いたＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ）；リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ ３２（Ｌ３２）；リボソームタンパク質（例えば、ヒトまたはマウスリボソームタンパク質、例えば、ｒｐｓ９等）；ＡＴＰ合成酵素（例えば、ミトコンドリアＨ＋－ＡＴＰ合成酵素のＡＴＰ５Ａ１またはβサブユニット）；成長ホルモン（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））；伸長因子（例えば、伸長因子１ α１（ＥＥＦ１Ａ１））；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）；筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）；β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、アルファ２（Ｃｏｌ１Ａ２）、Ｉ型コラーゲン、アルファ１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲン、アルファ２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲン、アルファ１（Ｃｏｌ６Ａ１））；リボホリン（例えば、リボホリンＩ（ＲＰＮＩ））；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）；カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）：カルレチクリン（Ｃａｌｒ）；プロコラーゲン－リジン、２－オキソグルタール酸５－ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；及びヌクレオバインディン（例えば、Ｎｕｃｂ１）の核酸配列に由来する１つまたは複数の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲが含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、β－グロビン５’ＵＴＲ；強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する５’ＵＴＲ；シトクロムｂ－２４５ αポリペプチド（ＣＹＢＡ）５’ＵＴＲ；ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）５’ＵＴＲ；タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ；ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）５’ＵＴＲ；非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム；デング熱ウイルス（ＤＥＮ）５’ＵＴＲ；熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）５’ＵＴＲ；ｅＩＦ４Ｇ ５’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１ ５’ＵＴＲ；それらの機能的断片及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、β－グロビン３’ＵＴＲ；ＣＹＢＡ ３’ＵＴＲ；アルブミン３’ＵＴＲ；成長ホルモン（ＧＨ）３’ＵＴＲ；ＶＥＥＶ ３’ＵＴＲ；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）３’ＵＴＲ；α－グロビン３’ＵＴＲ；ＤＥＮ ３’ＵＴＲ；ＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）３’ＵＴＲ；伸長因子１ α１（ＥＥＦ１Ａ１）３’ＵＴＲ；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）３’ＵＴＲ；ミトコンドリアＨ（＋）－ＡＴＰ合成酵素のβサブユニット（β－ｍＲＮＡ）３’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１ ３’ＵＴＲ；ＭＥＦ２Ａ ３’ＵＴＲ；β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ ３’ＵＴＲ；それらの機能的断片及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
任意の遺伝子またはｍＲＮＡに由来する野生型ＵＴＲが、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。一部の実施形態では、ＵＴＲを、例えば、ＯＲＦに対するＵＴＲの配向もしくは位置を変更することによって、または追加のヌクレオチドの組み込み、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって、野生型または天然ＵＴＲに対して変化させて、バリアントＵＴＲを生産することができる。一部の実施形態では、５’または３’ＵＴＲのバリアント、例えば、野生型ＵＴＲの変異体、または１つもしくは複数のヌクレオチドがＵＴＲの末端に付加されるもしくはそこから除去されるバリアントを利用することができる。
追加として、１つまたは複数の合成ＵＴＲを１つまたは複数の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用することができる。例えば、Ｍａｎｄａｌ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ ８（３）：５６８－８２を参照されたく、同文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
ＵＴＲまたはその一部分は、それらが選択された転写物の場合と同じ配向で配置され得るか、または配向もしくは位置を変化させることができる。よって、５’及び／または３’ＵＴＲは、反転、短縮、延長されるか、または１つもしくは複数の他の５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲと組み合わせることができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば、二重、三重、または四重５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。例えば、二重ＵＴＲは、直列でまたは実質的に直列でのいずれかで同じＵＴＲの２つのコピーを含む。例えば、二重ベータ－グロビン３’ＵＴＲを使用することができる（ＵＳ２０１０／０１２９８７７を参照されたく、同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列は、本明細書に（例えば、表Ａまたは表Ｂに）開示される５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ配列のうちのいずれかを含む５’ＵＴＲ配列、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される提供される配列と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、特徴の組み合わせを含み得る。例えば、ＯＲＦには、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ及び／またはポリ－Ａテールの鋳型依存性付加（ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ）のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲが隣接し得る。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なるＵＴＲからの第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含み得る（例えば、ＵＳ２０１０／０２９３６２５を参照されたい（参照によりその全体が本明細書に援用される））。
他の非ＵＴＲ配列を本発明のポリヌクレオチド内の領域または部分領域として使用することができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部分が、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生ならびにポリヌクレオチド発現レベルを増加させ得る。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりにまたはそれに加えて内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、Ｙａｋｕｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ ３９４（１）：１８９－１９３を参照されたく、同文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ及びウイルスカプシド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、非合成３’ＵＴＲと組み合わせて合成５’ＵＴＲを含む。
一部の実施形態では、ＵＴＲはまた、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサーエレメント（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）、または翻訳エンハンサーエレメント（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（総称的に「ＴＥＥ」、これはポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す）も含み得る。非限定的な例として、ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＴＥＥを含む。
一態様では、ＴＥＥは、限定されないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳等の、核酸の翻訳活性を促進することができるＵＴＲ内の保存されたエレメントである。
ａ．５’ＵＴＲ配列
５’ＵＴＲ配列は、ｍＲＮＡへのリボソーム動員に重要であり、翻訳において役割を果たすことが報告されている（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ Ａ，ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２：６２９２：１４１３－６）。
５’ＵＴＲ配列は、ｍＲＮＡへのリボソーム動員に重要であり、翻訳において役割を果たすことが報告されている（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ Ａ，ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２：６２９２：１４１３－６）。
本明細書では、とりわけ、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子（例えば、本明細書に記載されるようなもの）をコードするオープンリーディングフレームを含む、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡが開示され、該ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、またはポリヌクレオチド自体の増加した半減期、増加した発現、及び／または増加した活性を付与する５’ＵＴＲを有する。ある実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、（ａ）５’－ＵＴＲ（例えば、表Ａで提供されるようなものまたはそのバリアントもしくは断片）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載されるようなもの）を含むコーディング領域、及び（ｃ）３’－ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載されるようなもの）を含み、それらを含むＬＮＰ組成物を構成する。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、表Ａで提供される配列を含む５’－ＵＴＲまたはそのバリアントもしくは断片（例えば、その機能的バリアントもしくは断片）を含む。
ある実施形態では、表Ａで提供される５’ＵＴＲ配列またはそのバリアントもしくは断片を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの半減期の増加、例えば、ポリヌクレオチドの半減期の約１．５～２０倍の増加を有する。ある実施形態では、半減期の増加は、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０倍、またはそれを超える。ある実施形態では、半減期の増加は、約１．５倍以上である。ある実施形態では、半減期の増加は、約２倍以上である。ある実施形態では、半減期の増加は、約３倍以上である。ある実施形態では、半減期の増加は、約４倍以上である。ある実施形態では、半減期の増加は、約５倍以上である。
ある実施形態では、表Ａで提供される５’ＵＴＲ配列またはそのバリアントもしくは断片を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの増加したレベル及び／または活性、例えば、生産量をもたらす。ある実施形態では、５’ＵＴＲは、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのレベル及び／または活性、例えば、生産量の約１．５～２０倍の増加をもたらす。ある実施形態では、レベル及び／または活性の増加は、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０倍、またはそれを超える。ある実施形態では、レベル及び／または活性の増加は、約１．５倍以上である。ある実施形態では、レベル及び／または活性の増加は、約２倍以上である。ある実施形態では、レベル及び／または活性の増加は、約３倍以上である。ある実施形態では、レベル及び／または活性の増加は、約４倍以上である。ある実施形態では、レベル及び／または活性の増加は、約５倍以上である。
ある実施形態では、増加は、５’ＵＴＲを有しないか、異なる５’ＵＴＲを有するか、または表Ａに記載される５’ＵＴＲまたはそのバリアントもしくは断片を有しない、その他の点では類似のポリヌクレオチドと比較される。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドの半減期の増加は、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイ、例えば、本明細書に記載のアッセイに従って測定される。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのレベル及び／または活性、例えば、生産量の増加は、ポリペプチドのレベル及び／または活性を測定するアッセイ、例えば、本明細書に記載のアッセイに従って測定される。
ある実施形態では、５’ＵＴＲは、表Ａで提供される配列、または表Ａで提供される５’ＵＴＲ配列またはそのバリアントもしくは断片に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、または配列番号７８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号１５０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号７８の配列を含む。ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号７８の配列からなる。
ある実施形態では、表Ａで提供される５’ＵＴＲ配列は、Ａである第１のヌクレオチドを有する。ある実施形態では、表Ａで提供される５’ＵＴＲ配列は、Ｇである第１のヌクレオチドを有する。
ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５０のバリアントを含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、式Ａ：Ｇ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ｕ Ｃ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ａ （Ｎ２）Ｘ （Ｎ３）Ｘ Ｃ Ｕ （Ｎ４）Ｘ （Ｎ５）Ｘ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｕ Ｕ Ａ Ｇ Ａ Ｕ Ｕ Ｕ Ｃ Ｕ Ｕ Ｕ Ｕ Ａ Ｇ Ｕ Ｕ Ｕ Ｕ Ｃ Ｕ Ｎ６ Ｎ７ Ｃ Ａ Ａ Ｃ Ｕ Ａ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｕ Ｕ Ｕ Ｕ Ｕ Ｇ Ｕ Ｕ Ｃ Ｕ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ （Ｎ８ Ｃ Ｃ）ｘ（配列番号５９）の核酸配列を含み、式中、
（Ｎ２）ｘは、ウラシルであり、ｘは、０～５の整数であり、例えば、配列中、ｘ＝３または４であり、
（Ｎ３）ｘは、グアニンであり、ｘは、０～１の整数であり、
（Ｎ４）ｘは、シトシンであり、ｘは、０～１の整数であり、
（Ｎ５）ｘは、ウラシルであり、ｘは、０～５の整数であり、例えば、配列中、ｘ＝２または３であり、
Ｎ６は、ウラシルまたはシトシンであり、
Ｎ７は、ウラシルまたはグアニンであり、
Ｎ８は、アデニンまたはグアニンであり、ｘは、０～１の整数である。
（Ｎ２）ｘは、ウラシルであり、ｘは、０～５の整数であり、例えば、配列中、ｘ＝３または４であり、
（Ｎ３）ｘは、グアニンであり、ｘは、０～１の整数であり、
（Ｎ４）ｘは、シトシンであり、ｘは、０～１の整数であり、
（Ｎ５）ｘは、ウラシルであり、ｘは、０～５の整数であり、例えば、配列中、ｘ＝２または３であり、
Ｎ６は、ウラシルまたはシトシンであり、
Ｎ７は、ウラシルまたはグアニンであり、
Ｎ８は、アデニンまたはグアニンであり、ｘは、０～１の整数である。
ある実施形態では、（Ｎ２）ｘは、ウラシルであり、ｘは０である。ある実施形態では、（Ｎ２）ｘは、ウラシルであり、ｘは１である。ある実施形態では、（Ｎ２）ｘは、ウラシルであり、ｘは２である。ある実施形態では、（Ｎ２）ｘは、ウラシルであり、ｘは３である。ある実施形態では、（Ｎ２）ｘは、ウラシルであり、ｘは４である。ある実施形態では、（Ｎ２）ｘは、ウラシルであり、ｘは５である。
ある実施形態では、（Ｎ３）ｘは、グアニンであり、ｘは０である。ある実施形態では、（Ｎ３）ｘは、グアニンであり、ｘは１である。
ある実施形態では、（Ｎ４）ｘは、シトシンであり、ｘは０である。ある実施形態では、（Ｎ４）ｘは、シトシンであり、ｘは１である。
ある実施形態では、（Ｎ５）ｘは、ウラシルであり、ｘは０である。ある実施形態では、（Ｎ５）ｘは、ウラシルであり、ｘは１である。ある実施形態では、（Ｎ５）ｘは、ウラシルであり、ｘは２である。ある実施形態では、（Ｎ５）ｘは、ウラシルであり、ｘは３である。ある実施形態では、（Ｎ５）ｘは、ウラシルであり、ｘは４である。ある実施形態では、（Ｎ５）ｘは、ウラシルであり、ｘは５である。
ある実施形態では、Ｎ６は、ウラシルである。ある実施形態では、Ｎ６は、シトシンである。
ある実施形態では、Ｎ７は、ウラシルである。ある実施形態では、Ｎ７は、グアニンである。
ある実施形態では、Ｎ８は、アデニンであり、ｘは０である。ある実施形態では、Ｎ８は、アデニンであり、ｘは１である。
ある実施形態では、Ｎ８は、グアニンであり、ｘは０である。ある実施形態では、Ｎ８は、グアニンであり、ｘは１である。
ある実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５０のバリアントを含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、配列番号５０に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、配列番号５０に対して少なくとも５０％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、配列番号５０に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、配列番号５０に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、配列番号５０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、配列番号５０に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、配列番号５０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、配列番号５０に対して少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、配列番号５０に対して少なくとも９７％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、配列番号５０に対して少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、配列番号５０に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％のウリジン含量を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、少なくとも５％のウリジン含量を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、少なくとも１０％のウリジン含量を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、少なくとも２０％のウリジン含量を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、少なくとも３０％のウリジン含量を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、少なくとも４０％のウリジン含量を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、少なくとも５０％のウリジン含量を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、少なくとも６０％のウリジン含量を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、少なくとも７０％のウリジン含量を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、少なくとも８０％のウリジン含量を含む。
ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、少なくとも２、３、４、５、６、または７個の連続したウリジン（例えば、ポリウリジントラクト）を含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントにおけるポリウリジントラクトは、少なくとも１～７、２～７、３～７、４～７、５～７、６～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、または３～５個の連続したウリジンを含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントにおけるポリウリジントラクトは、４個の連続したウリジンを含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントにおけるポリウリジントラクトは、５個の連続したウリジンを含む。
ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のポリウリジントラクトを含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、３個のポリウリジントラクトを含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、４個のポリウリジントラクトを含む。ある実施形態では、配列番号５０のバリアントは、５個のポリウリジントラクトを含む。
ある実施形態では、ポリウリジントラクトのうちの１つまたは複数は、異なるポリウリジントラクトに隣接する。ある実施形態では、ポリウリジントラクトの各々、例えば、全てが互いに隣接し、例えば、ポリウリジントラクトの全てが連続している。
ある実施形態では、ポリウリジントラクトのうちの１つまたは複数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、または６０個のヌクレオチドによって隔てられる。ある実施形態では、ポリウリジントラクトの各々、例えば、その全てが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、または６０個のヌクレオチドによって隔てられる。
ある実施形態では、第１のポリウリジントラクト及び第２のポリウリジントラクトは、互いに隣接する。
ある実施形態では、後続の、例えば、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のポリウリジントラクトが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、または６０個のヌクレオチドによって、第１のポリウリジントラクト、第２のポリウリジントラクト、または後続のポリウリジントラクトのうちのいずれか１つから隔てられる。
ある実施形態では、第１のポリウリジントラクトが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、または６０個のヌクレオチドによって、後続のポリウリジントラクト、例えば、第２、第３、第４、第５、第６または第７、第８、第９、または第１０のポリウリジントラクトから隔てられる。ある実施形態では、後続のポリウリジントラクトのうちの１つまたは複数は、異なるポリウリジントラクトに隣接する。
ある実施形態では、５’ＵＴＲは、コザック配列、例えば、ＧＣＣＲＣＣヌクレオチド配列（配列番号７９）を含み、配列中、Ｒは、アデニンまたはグアニンである。ある実施形態では、コザック配列は、５’ＵＴＲ配列の３’末端に配置される。
ある態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子（例えば、本明細書に開示されるようなもの）をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ本明細書に開示される５’ＵＴＲ配列を含む、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。
ｂ．３’ＵＴＲ配列
３’ＵＴＲ配列は、ｍＲＮＡの翻訳、半減期、及び細胞内局在化に影響を及ぼすことが示されている（Ｍａｙｒ Ｃ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐ Ｂｉｏｌ ２０１９ Ｏｃｔ １；１１（１０）：ａ０３４７２８）。
３’ＵＴＲ配列は、ｍＲＮＡの翻訳、半減期、及び細胞内局在化に影響を及ぼすことが示されている（Ｍａｙｒ Ｃ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐ Ｂｉｏｌ ２０１９ Ｏｃｔ １；１１（１０）：ａ０３４７２８）。
本明細書では、とりわけ、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子（例えば、本明細書に記載されるようなもの）をコードするオープンリーディングフレームを含む、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）が開示され、その核酸分子は、該核酸分子によってコードされるポリペプチド、または核酸分子自体の増加した半減期、増加した発現、及び／または増加した活性を付与する３’ＵＴＲを有する。ある実施形態では、本明細書に開示される核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、（ａ）５’－ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載されるようなもの）、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載されるようなもの）を含むコーディング領域、及び（ｃ）３’－ＵＴＲ（例えば、表Ｂで提供されるようなものまたはそのバリアントもしくは断片）を含み、それらを含むＬＮＰ組成物を構成する。ある実施形態では、核酸分子は、表Ｂで提供される配列を含む３’－ＵＴＲまたはそのバリアントもしくは断片を含む。
ある実施形態では、表Ｂで提供される３’ＵＴＲ配列またはそのバリアントもしくは断片を有する核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、核酸分子の増加した半減期、例えば、核酸分子の半減期の約１．５～１０倍の増加をもたらす。ある実施形態では、半減期の増加は、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０倍、またはそれを超える。ある実施形態では、半減期の増加は、約１．５倍以上である。ある実施形態では、半減期の増加は、約２倍以上である。ある実施形態では、半減期の増加は、約３倍以上である。ある実施形態では、半減期の増加は、約４倍以上である。ある実施形態では、半減期の増加は、約５倍以上である。ある実施形態では、半減期の増加は、約６倍以上である。ある実施形態では、半減期の増加は、約７倍以上である。ある実施形態では、半減期の増加は、約８倍である。ある実施形態では、半減期の増加は、約９倍以上である。ある実施形態では、半減期の増加は、約１０倍以上である。
ある実施形態では、表Ｂで提供される３’ＵＴＲ配列またはそのバリアントもしくは断片を有する核酸分子は、１０超の平均半減期スコアを有するポリヌクレオチドをもたらす。
ある実施形態では、表Ｂで提供される３’ＵＴＲ配列またはそのバリアントもしくは断片を有する核酸分子は、核酸分子によってコードされるポリペプチドの増加したレベル及び／または活性、例えば、生産量をもたらす。
ある実施形態では、増加は、３’ＵＴＲを有しないか、異なる３’ＵＴＲを有するか、または表Ｂの３’ＵＴＲまたはそのバリアントもしくは断片を有しない、その他の点では類似の核酸分子と比較される。
ある実施形態では、核酸分子は、表Ｂで提供される３’ＵＴＲ配列、または表Ｂで提供される３’ＵＴＲ配列もしくはその断片に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号２７６、配列番号１１５、または配列番号１３６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１００の配列、または配列番号１００に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１０１の配列、または配列番号１０１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１０２の配列、または配列番号１０２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１０３の配列、または配列番号１０３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１０４の配列、または配列番号１０４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１０５の配列、または配列番号１０５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１０６の配列、または配列番号１０６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１０７の配列、または配列番号１０７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１０８の配列、または配列番号１０８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１０９の配列、または配列番号１０９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１１０の配列、または配列番号１１０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１１１の配列、または配列番号１１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１１２の配列、または配列番号１１２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１１３の配列、または配列番号１１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号２７６の配列、または配列番号２７６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１１５の配列、または配列番号１１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１３６の配列、または配列番号１３６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
ある実施形態では、３’ＵＴＲは、ヒト細胞に存在するｍｉＲに結合する、例えば、本明細書に記載されるような、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号２１２、配列番号１７４、配列番号１５２、またはそれらの組み合わせのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ある実施形態では、３’ＵＴＲは、複数のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、２、３、４、５、６、７、または８つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ある実施形態では、複数のｍｉＲＮＡ結合部位は、同じまたは異なるｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
ｍｉＲ１２２結合部位＝ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＵＵＧＵＣＡＣＡＣＵＣＣＡ（配列番号２１２）
ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位＝ＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡ（配列番号１７４）
ｍｉＲ－１２６結合部位＝ＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡ（配列番号１５２）
ｍｉＲ１２２結合部位＝ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＵＵＧＵＣＡＣＡＣＵＣＣＡ（配列番号２１２）
ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位＝ＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡ（配列番号１７４）
ｍｉＲ－１２６結合部位＝ＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡ（配列番号１５２）
ある態様では、ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）が本明細書に開示され、該核酸分子は、（ａ）例えば、本明細書に記載されるような５’－ＵＴＲ、（ｂ）終止エレメント（例えば、本明細書に記載されるようなもの）を含むコーディング領域、及び（ｃ）３’－ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載されるようなもの）を含む。
ある態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ本明細書に開示される３’ＵＴＲを含む、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含む、ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。
５’キャップを有する領域
本開示はまた、５’キャップ及び本発明のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）も含む。
本開示はまた、５’キャップ及び本発明のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）も含む。
天然ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外搬出に関与して、ｍＲＮＡ安定性を増加させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）（これはＣＢＰがポリ（Ａ）結合タンパク質と会合して、成熟した環状ｍＲＮＡ種を形成することにより、細胞内のｍＲＮＡ安定性及び翻訳能力を担う）に結合する。キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシング中に５’近位のイントロンの除去を補助する。
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端がキャップ付加されて、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端の転写センスヌクレオチドとの間に５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸結合を生成し得る。次いで、この５’－グアニル酸キャップがメチル化されて、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成し得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端及び／または末端前（ａｎｔｅ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）転写ヌクレオチドのリボース糖もまた、任意選択で、２’－Ｏ－メチル化され得る。加水分解による５’－キャップ除去及びグアニル酸キャップ構造の切断は、分解に向けてｍＲＮＡ分子等の核酸分子を標的とすることができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ部分を組み込む。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ除去を阻止し、ひいてはｍＲＮＡ半減期を増加させる、非加水分解性キャップ構造を含む。キャップ構造の加水分解は、５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合の切断を必要とするため、キャップ付加反応中に修飾ヌクレオチドが使用され得る。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）からのワクシニアキャップ付加酵素を、製造業者の説明書に従ってα－チオ－グアノシンヌクレオチドと共に使用して、５’－ｐｐｐ－５’キャップにホスホロチオエート結合を作出することができる。α－メチル－ホスホン酸ヌクレオチド及びセレノリン酸ヌクレオチド等の追加の修飾グアノシンヌクレオチドを使用することができる。
追加の修飾には、ポリヌクレオチドの５’末端及び／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の、糖環の２’－ヒドロキシル基上での２’－Ｏ－メチル化（上述した通り）が含まれるが、これらに限定されない。複数の別々の５’－キャップ構造を使用して、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチド等の核酸分子の５’－キャップを生成することができる。本明細書で合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも称される、キャップ類似体は、キャップ機能を保持しつつも、天然（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）５’－キャップとはそれらの化学構造が異なる。キャップ類似体は、本発明のポリヌクレオチドに化学的に（すなわち、非酵素的に）または酵素的に合成及び／または連結され得る。
例えば、アンチリバースキャップ類似体（Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸基によって連結された２つのグアニンを含有し、ここで、一方のグアニンは、Ｎ７メチル基ならびに３’－Ｏ－メチル基を含有する（すなわち、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン（ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ；これは同等に３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと表記され得る）。他方の未修飾グアニンの３’－Ｏ原子は、キャップ付加ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに連結されるようになる。Ｎ７－メチル化及び３’－Ｏ－メチル化グアニンは、キャップ付加ポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
別の例示的なキャップはｍＣＡＰであり、これはＡＲＣＡに類似しているが、グアノシン上に２’－Ｏ－メチル基を有する（例えば、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。別の例示的なキャップは、ｍ７Ｇ－ｐｐｐ－Ｇｍ－Ａ（すなわち、Ｎ７，グアノシン－５’－三リン酸－２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－アデノシン）である。
一部の実施形態では、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップ類似体は、米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号（同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されるジヌクレオチドキャップ類似体等、異なるリン酸位置にて、ボラノリン酸基またはホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）基で修飾され得る。
別の実施形態では、キャップは、当該技術分野で既知及び／または本明細書に記載のキャップ類似体のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態である、キャップ類似体である。キャップ類似体のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態の非限定的な例としては、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ及びＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０－４５７４に記載される種々のキャップ類似体及びキャップ類似体の合成方法を参照されたく、同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。別の実施形態では、本発明のキャップ類似体は、４－クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
キャップ類似体は、ポリヌクレオチドまたはその領域の同時に起こるキャップ付加を許容するが、インビトロ転写反応では、最大２０％の転写物がキャップ付加されないままである可能性がある。このこと、ならびに内因性の細胞転写機構によって生産される核酸の内因性５’－キャップ構造とのキャップ類似体の構造的差異は、低減された翻訳能力及び低減された細胞安定性につながる可能性がある。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）はまた、酵素を使用して、製造後（ＩＶＴまたは化学合成を問わず）にキャップ付加して、より真正の５’－キャップ構造を生成することもできる。本明細書で使用されるとき、「より真正の」という語句は、構造的にまたは機能的にのいずれかで、内因性または野生型の特徴を厳密に反映または模倣する特徴を指す。つまり、「より真正の」特徴は、先行技術の合成的特徴もしくは類似体等と比較して内因性、野生型、天然、もしくは生理学的な細胞機能及び／または構造をよりよく表すか、または１つもしくは複数の点で対応する内因性、野生型、天然、もしくは生理学的特徴よりも優れている。本発明のより真正の５’キャップ構造の非限定的な例は、当該技術分野で既知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然、もしくは生理学的５’キャップ構造）と比較して、とりわけ、キャップ結合タンパク質の結合が強化されたもの、半減期が増加したもの、５’エンドヌクレアーゼへの感受性が低減されたもの、及び／または５’キャップ除去が低減されたものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャップ付加酵素及び組換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に古典的５’－５’－三リン酸結合を作出することができ、ここで、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含有し、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルを含有する。かかる構造は、キャップ１構造と称される。このキャップは、例えば、当該技術分野で既知の他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳能力及び細胞安定性、ならびに細胞炎症促進性サイトカインの活性化の低減をもたらす。キャップ構造には、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が含まれるが、これらに限定されない。キャップ１は、本明細書でキャップＣ１と称されることがある。一部の実施形態では、キャップＣ１は任意選択で、キャップの３’末端に追加のＧを含み得る。一部の実施形態では、キャップＣ１において、Ｎ２は、５’ＵＴＲの第１のヌクレオチドを含んでもよい。
非限定的な例として、製造後のキメラポリヌクレオチドのキャップ付加は、ほぼ１００％のキメラポリヌクレオチドがキャップ付加され得るため、より効率的であり得る。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応中にキメラポリヌクレオチドに連結される場合の約８０％の効率と対照的である。
本発明によれば、５’末端キャップには、内因性キャップまたはキャップ類似体が含まれ得る。本発明によれば、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体には、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンが含まれるが、これらに限定されない。
また、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、野生型ＲＮＡポリメラーゼまたはそのバリアント、例えば、本明細書に記載のバリアント等を使用した、リボ核酸（ＲＮＡ）合成のための共転写キャッピング（ｃｏ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃａｐｐｉｎｇ）法において使用され得るものを含めた例示的なキャップも本明細書で提供される。一実施形態では、キャップは、別個のキャップ付加反応の必要性なしに、ＲＮＡが「ワンポット」反応で生産されるときに付加され得る。故に、該方法は、一部の実施形態では、ＲＮＡ転写物を生産するためのインビトロ転写反応条件下でポリヌクレオチド鋳型をＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む。
キャップ類似体は、例えば、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップであってもよい。一部の実施形態では、キャップ類似体は、ジヌクレオチドキャップである。一部の実施形態では、キャップ類似体は、トリヌクレオチドキャップである。一部の実施形態では、キャップ類似体は、テトラヌクレオチドキャップである。本明細書で使用されるとき、「キャップ」という用語は、反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）Ｇヌクレオチドを含み、反転Ｇヌクレオチドの３’側に１つまたは複数の追加のヌクレオチド、例えば、反転Ｇヌクレオチドの３’側、及び５’ＵＴＲ、例えば、本明細書に記載の５’ＵＴＲの５’側に１つ、２つ、またはそれよりも多くのヌクレオチドを含み得る。
例示的なキャップは、ＧＧ、ＧＡ、またはＧＧＡの配列を含み、配列中、下線付きで斜体のＧは、反転Ｇヌクレオチドであり、５’－５’－三リン酸基がこれに続く。
トリヌクレオチドキャップは、一部の実施形態では、式（Ｉ）
の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を含み、式中、
環Ｂ１が、修飾または未修飾グアニンであり、
環Ｂ２及び環Ｂ３が各々独立して、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
Ｘ２が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｐ、ＮＲ２４、またはＣＲ２５Ｒ２６であり、ここで、ｐが、０、１、または２であり、
Ｙ０が、ＯまたはＣＲ６Ｒ７であり、
Ｙ１が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、ここで、ｎが、０、１、または２であり、
各－－－が、単結合または不在であり、ここで、各－－－が単結合である場合、Ｙ１はＯ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、各－－－が不在である場合、Ｙ１は欠けており、
Ｙ２が、（ＯＰ（Ｏ）Ｒ４）ｍ（ここで、ｍは、０、１、もしくは２である）、または－Ｏ－（ＣＲ４０Ｒ４１）ｕ－Ｑ０－（ＣＲ４２Ｒ４３）ｖ－（ここで、Ｑ０は、結合、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｒ、ＮＲ４４、またはＣＲ４５Ｒ４６であり、ｒは、０、１、または２であり、ｕ及びｖの各々は独立して、１、２、３、または４である）であり、
各Ｒ２及びＲ２’が独立して、ハロ、ＬＮＡ、またはＯＲ３であり、
各Ｒ３が独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルであり、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルである場合のＲ３が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、及び１つもしくは複数のＯＨもしくはＯＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキルにより任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルコキシルのうちの１つまたは複数で置換され、
各Ｒ４及びＲ４’が独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３－であり、
Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の各々が独立して、－Ｑ１－Ｔ１であり、ここで、Ｑ１が、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシのうちの１つもしくは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ１が、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、シアノ、またはＲｓ１であり、ここで、Ｒｓ１が、Ｃ１～Ｃ３アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ１が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５員または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換され、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、及びＲ１５の各々が独立して、－Ｑ２－Ｔ２であり、ここで、Ｑ２が、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシのうちの１つもしくは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ２が、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、Ｒｓ２、またはＯＲｓ２であり、ここで、Ｒｓ２が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ２が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５員もしくは６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されるか、または代替として、Ｒ１２がＲ１４と一緒に、オキソであるか、もしくはＲ１３がＲ１５と一緒に、オキソであり、
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３の各々が独立して、－Ｑ３－Ｔ３であり、ここで、Ｑ３が、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシのうちの１つもしくは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ３が、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、ＲＳ３、またはＯＲＳ３であり、ここで、ＲＳ３が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキル、モノ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ３が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５員または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換され、
Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６の各々が独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２７及びＲ２８の各々が独立して、ＨもしくはＯＲ２９であるか、またはＲ２７及びＲ２８が一緒に、Ｏ－Ｒ３０－Ｏを形成し、各Ｒ２９が独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルであり、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルである場合のＲ２９が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、及び１つもしくは複数のＯＨもしくはＯＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキルにより任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルコキシルのうちの１つまたは複数で置換され、
Ｒ３０が、ハロ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシルのうちの１つまたは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３の各々が独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、
Ｒ４０、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３の各々が独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、シアノ、Ｎ３、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つもしくは複数のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルキルであるか、あるいは、１つのＲ４１及び１つのＲ４３が、それらが結合している炭素原子及びＱ０と一緒に、Ｃ４～Ｃ１０シクロアルキル、４員～１４員のヘテロシクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、または５員～１４員のヘテロアリールを形成し、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、フェニル、または５員～６員のヘテロアリールの各々が、任意選択で、ＯＨ、ハロ、シアノ、Ｎ３、オキソ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルコキシル、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、及びジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノのうちの１つまたは複数で置換され、
Ｒ４４が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、またはアミン保護基であり、
Ｒ４５及びＲ４６の各々が独立して、Ｈ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つもしくは複数のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４７及びＲ４８の各々が独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３である。
の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を含み、式中、
環Ｂ１が、修飾または未修飾グアニンであり、
環Ｂ２及び環Ｂ３が各々独立して、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
Ｘ２が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｐ、ＮＲ２４、またはＣＲ２５Ｒ２６であり、ここで、ｐが、０、１、または２であり、
Ｙ０が、ＯまたはＣＲ６Ｒ７であり、
Ｙ１が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、ここで、ｎが、０、１、または２であり、
各－－－が、単結合または不在であり、ここで、各－－－が単結合である場合、Ｙ１はＯ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、各－－－が不在である場合、Ｙ１は欠けており、
Ｙ２が、（ＯＰ（Ｏ）Ｒ４）ｍ（ここで、ｍは、０、１、もしくは２である）、または－Ｏ－（ＣＲ４０Ｒ４１）ｕ－Ｑ０－（ＣＲ４２Ｒ４３）ｖ－（ここで、Ｑ０は、結合、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｒ、ＮＲ４４、またはＣＲ４５Ｒ４６であり、ｒは、０、１、または２であり、ｕ及びｖの各々は独立して、１、２、３、または４である）であり、
各Ｒ２及びＲ２’が独立して、ハロ、ＬＮＡ、またはＯＲ３であり、
各Ｒ３が独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルであり、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルである場合のＲ３が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、及び１つもしくは複数のＯＨもしくはＯＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキルにより任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルコキシルのうちの１つまたは複数で置換され、
各Ｒ４及びＲ４’が独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３－であり、
Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の各々が独立して、－Ｑ１－Ｔ１であり、ここで、Ｑ１が、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシのうちの１つもしくは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ１が、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、シアノ、またはＲｓ１であり、ここで、Ｒｓ１が、Ｃ１～Ｃ３アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ１が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５員または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換され、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、及びＲ１５の各々が独立して、－Ｑ２－Ｔ２であり、ここで、Ｑ２が、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシのうちの１つもしくは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ２が、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、Ｒｓ２、またはＯＲｓ２であり、ここで、Ｒｓ２が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ２が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５員もしくは６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されるか、または代替として、Ｒ１２がＲ１４と一緒に、オキソであるか、もしくはＲ１３がＲ１５と一緒に、オキソであり、
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３の各々が独立して、－Ｑ３－Ｔ３であり、ここで、Ｑ３が、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシのうちの１つもしくは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ３が、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、ＲＳ３、またはＯＲＳ３であり、ここで、ＲＳ３が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキル、モノ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ３が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５員または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換され、
Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６の各々が独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２７及びＲ２８の各々が独立して、ＨもしくはＯＲ２９であるか、またはＲ２７及びＲ２８が一緒に、Ｏ－Ｒ３０－Ｏを形成し、各Ｒ２９が独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルであり、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルである場合のＲ２９が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、及び１つもしくは複数のＯＨもしくはＯＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキルにより任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルコキシルのうちの１つまたは複数で置換され、
Ｒ３０が、ハロ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシルのうちの１つまたは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３の各々が独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、
Ｒ４０、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３の各々が独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、シアノ、Ｎ３、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つもしくは複数のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルキルであるか、あるいは、１つのＲ４１及び１つのＲ４３が、それらが結合している炭素原子及びＱ０と一緒に、Ｃ４～Ｃ１０シクロアルキル、４員～１４員のヘテロシクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、または５員～１４員のヘテロアリールを形成し、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、フェニル、または５員～６員のヘテロアリールの各々が、任意選択で、ＯＨ、ハロ、シアノ、Ｎ３、オキソ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルコキシル、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、及びジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノのうちの１つまたは複数で置換され、
Ｒ４４が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、またはアミン保護基であり、
Ｒ４５及びＲ４６の各々が独立して、Ｈ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つもしくは複数のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４７及びＲ４８の各々が独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３である。
本明細書で提供されるキャップ類似体は、２０１７年４月２０日に公開された国際公開ＷＯ２０１７／０６６７９７（参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されるキャップ類似体のうちのいずれを含んでもよいことを理解されたい。
一部の実施形態では、中央位置のＢ２は、アラビノース等の非リボース分子であり得る。
一部の実施形態では、Ｒ２は、エチルに基づく。
故に、一部の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む。
他の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む。
なおも他の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む。
依然として他の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む。
ジヌクレオチドキャップは、一部の実施形態では、式（Ｉ－ｂ）
の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を含み、式中、
環Ｂ１が、修飾または未修飾グアニンであり、
環Ｂ２が、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
Ｘ２が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｐ、ＮＲ２４、またはＣＲ２５Ｒ２６であり、ここで、ｐが、０、１、または２であり、
Ｙ０が、ＯまたはＣＲ６Ｒ７であり、
Ｙ１が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、ここで、ｎが、０、１、または２であり、
各－－－が、単結合または不在であり、ここで、各－－－が単結合である場合、Ｙ１はＯ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、各－－－が不在である場合、Ｙ１は欠けており、
Ｙ２が、（ＯＰ（Ｏ）Ｒ４）ｍ（ここで、ｍは、０、１、もしくは２である）、または－Ｏ－（ＣＲ４０Ｒ４１）ｕ－Ｑ０－（ＣＲ４２Ｒ４３）ｖ－（ここで、Ｑ０は、結合、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｒ、ＮＲ４４、またはＣＲ４５Ｒ４６であり、ｒは、０、１、または２であり、ｕ及びｖの各々は独立して、１、２、３、または４である）であり、
Ｒ２が、ハロ、ＬＮＡ、またはＯＲ３であり、
各Ｒ３が独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルであり、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルである場合のＲ３が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、及び１つもしくは複数のＯＨもしくはＯＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキルにより任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルコキシルのうちの１つまたは複数で置換され、
Ｒ４が、Ｈ、ハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３－であり、
Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の各々が独立して、－Ｑ１－Ｔ１であり、ここで、Ｑ１が、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシのうちの１つもしくは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ１が、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、シアノ、またはＲｓ１であり、ここで、Ｒｓ１が、Ｃ１～Ｃ３アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ１が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５員または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換され、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、及びＲ１５の各々が独立して、－Ｑ２－Ｔ２であり、ここで、Ｑ２が、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシのうちの１つもしくは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ２が、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、Ｒｓ２、またはＯＲｓ２であり、ここで、Ｒｓ２が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ２が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５員もしくは６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されるか、または代替として、Ｒ１２がＲ１４と一緒に、オキソであるか、もしくはＲ１３がＲ１５と一緒に、オキソであり、
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３の各々が独立して、－Ｑ３－Ｔ３であり、ここで、Ｑ３が、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシのうちの１つもしくは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ３が、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、ＲＳ３、またはＯＲＳ３であり、ここで、ＲＳ３が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキル、モノ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ３が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５員または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換され、
Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６の各々が独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２７及びＲ２８の各々が独立して、ＨもしくはＯＲ２９であるか、またはＲ２７及びＲ２８が一緒に、Ｏ－Ｒ３０－Ｏを形成し、各Ｒ２９が独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルであり、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルである場合のＲ２９が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、及び１つもしくは複数のＯＨもしくはＯＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキルにより任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルコキシルのうちの１つまたは複数で置換され、
Ｒ３０が、ハロ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシルのうちの１つまたは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３の各々が独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、
Ｒ４０、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３の各々が独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、シアノ、Ｎ３、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つもしくは複数のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルキルであるか、あるいは、１つのＲ４１及び１つのＲ４３が、それらが結合している炭素原子及びＱ０と一緒に、Ｃ４～Ｃ１０シクロアルキル、４員～１４員のヘテロシクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、または５員～１４員のヘテロアリールを形成し、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、フェニル、または５員～６員のヘテロアリールの各々が、任意選択で、ＯＨ、ハロ、シアノ、Ｎ３、オキソ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルコキシル、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、及びジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノのうちの１つまたは複数で置換され、
Ｒ４４が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、またはアミン保護基であり、
Ｒ４５及びＲ４６の各々が独立して、Ｈ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つもしくは複数のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４７及びＲ４８の各々が独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３である。
の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を含み、式中、
環Ｂ１が、修飾または未修飾グアニンであり、
環Ｂ２が、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
Ｘ２が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｐ、ＮＲ２４、またはＣＲ２５Ｒ２６であり、ここで、ｐが、０、１、または２であり、
Ｙ０が、ＯまたはＣＲ６Ｒ７であり、
Ｙ１が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、ここで、ｎが、０、１、または２であり、
各－－－が、単結合または不在であり、ここで、各－－－が単結合である場合、Ｙ１はＯ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、各－－－が不在である場合、Ｙ１は欠けており、
Ｙ２が、（ＯＰ（Ｏ）Ｒ４）ｍ（ここで、ｍは、０、１、もしくは２である）、または－Ｏ－（ＣＲ４０Ｒ４１）ｕ－Ｑ０－（ＣＲ４２Ｒ４３）ｖ－（ここで、Ｑ０は、結合、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｒ、ＮＲ４４、またはＣＲ４５Ｒ４６であり、ｒは、０、１、または２であり、ｕ及びｖの各々は独立して、１、２、３、または４である）であり、
Ｒ２が、ハロ、ＬＮＡ、またはＯＲ３であり、
各Ｒ３が独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルであり、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルである場合のＲ３が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、及び１つもしくは複数のＯＨもしくはＯＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキルにより任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルコキシルのうちの１つまたは複数で置換され、
Ｒ４が、Ｈ、ハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３－であり、
Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の各々が独立して、－Ｑ１－Ｔ１であり、ここで、Ｑ１が、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシのうちの１つもしくは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ１が、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、シアノ、またはＲｓ１であり、ここで、Ｒｓ１が、Ｃ１～Ｃ３アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ１が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５員または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換され、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、及びＲ１５の各々が独立して、－Ｑ２－Ｔ２であり、ここで、Ｑ２が、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシのうちの１つもしくは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ２が、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、Ｒｓ２、またはＯＲｓ２であり、ここで、Ｒｓ２が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ２が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５員もしくは６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されるか、または代替として、Ｒ１２がＲ１４と一緒に、オキソであるか、もしくはＲ１３がＲ１５と一緒に、オキソであり、
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３の各々が独立して、－Ｑ３－Ｔ３であり、ここで、Ｑ３が、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシのうちの１つもしくは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ３が、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、ＲＳ３、またはＯＲＳ３であり、ここで、ＲＳ３が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキル、モノ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ３が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、及び５員または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換され、
Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６の各々が独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２７及びＲ２８の各々が独立して、ＨもしくはＯＲ２９であるか、またはＲ２７及びＲ２８が一緒に、Ｏ－Ｒ３０－Ｏを形成し、各Ｒ２９が独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルであり、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルである場合のＲ２９が、任意選択で、ハロ、ＯＨ、及び１つもしくは複数のＯＨもしくはＯＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６アルキルにより任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルコキシルのうちの１つまたは複数で置換され、
Ｒ３０が、ハロ、ＯＨ、及びＣ１～Ｃ６アルコキシルのうちの１つまたは複数により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３の各々が独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、４～１２員のヘテロシクロアルキル、または５員もしくは６員のヘテロアリールであり、
Ｒ４０、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３の各々が独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、シアノ、Ｎ３、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つもしくは複数のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルキルであるか、あるいは、１つのＲ４１及び１つのＲ４３が、それらが結合している炭素原子及びＱ０と一緒に、Ｃ４～Ｃ１０シクロアルキル、４員～１４員のヘテロシクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、または５員～１４員のヘテロアリールを形成し、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、フェニル、または５員～６員のヘテロアリールの各々が、任意選択で、ＯＨ、ハロ、シアノ、Ｎ３、オキソ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルコキシル、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノ、及びジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノのうちの１つまたは複数で置換され、
Ｒ４４が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、またはアミン保護基であり、
Ｒ４５及びＲ４６の各々が独立して、Ｈ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つもしくは複数のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８により任意選択で置換されるＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４７及びＲ４８の各々が独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３である。
故に、一部の実施形態では、ジヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む。
３’安定化領域
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、例えば、本明細書に記載されるような、３’安定化領域、例えば、安定化テールをさらに含む。３’安定化領域（例えば、代替の核酸塩基、糖、及び／または骨格を含む３’安定化領域）を含有するポリヌクレオチドは、増加した安定性、高い発現レベルから益を受け得るため、治療用組成物において使用するのに特に有効であり得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、例えば、本明細書に記載されるような、３’安定化領域、例えば、安定化テールをさらに含む。３’安定化領域（例えば、代替の核酸塩基、糖、及び／または骨格を含む３’安定化領域）を含有するポリヌクレオチドは、増加した安定性、高い発現レベルから益を受け得るため、治療用組成物において使用するのに特に有効であり得る。
ある実施形態では、３’安定化領域は、ポリＡテール、例えば、８０～１５０個、例えば、１２０個のアデニンを含む、ポリＡテールを含む。ある実施形態では、ポリＡテールは、ＵＣＵＡＧ配列（配列番号９２）を含む。ある実施形態では、ポリＡテールは、配列番号９２の上流に約８０～１２０個、例えば、１００個のアデニンを含む。ある実施形態では、ポリＡテールは、配列番号９２の下流に約１～４０個、例えば、２０個のアデニンを含む。
ある実施形態では、３’安定化領域は、少なくとも１つの代替のヌクレオシドを含む。ある実施形態では、代替のヌクレオシドは、反転チミジン（ｉｄＴ）である。ある実施形態では、代替のヌクレオシドは、３’安定化領域の３’末端に配置される。
ある実施形態では、３’安定化領域は、式ＶＩＩ：
の構造、またはその塩を含み、式中、各Ｘが独立して、ＯまたはＳであり、Ａが、アデニンを表し、Ｔが、チミンを表す。
の構造、またはその塩を含み、式中、各Ｘが独立して、ＯまたはＳであり、Ａが、アデニンを表し、Ｔが、チミンを表す。
ある態様では、本明細書に開示される安定化領域を含むポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。
別の態様では、本開示のＬＮＰ組成物は、疾患または障害を処置する方法において使用される。
別の態様では、本開示のＬＮＰ組成物は、細胞（例えば、幹細胞）を改変する、例えば、細胞に関連するパラメータまたは細胞に関連する構成成分を改変するために使用される。
ある態様では、例えば、本明細書に記載されるような治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物は、例えば、本明細書に記載されるような追加の薬剤と共に投与することができる。
テール、例えば、ポリＡテール
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、テール、例えば、ポリ－Ａテールをさらに含む。さらなる実施形態では、安定化のためにポリ－Ａテール上の末端基が組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリ－Ａテールは、デス－３’ヒドロキシルテールを含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、テール、例えば、ポリ－Ａテールをさらに含む。さらなる実施形態では、安定化のためにポリ－Ａテール上の末端基が組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリ－Ａテールは、デス－３’ヒドロキシルテールを含む。
ＲＮＡプロセシング中に、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリ－Ａテール）をｍＲＮＡ分子等のポリヌクレオチドに付加して、安定性を増加させることができる。転写直後に、転写物の３’末端が切断されて、３’ヒドロキシルを遊離させ得る。次いで、ポリ－Ａポリメラーゼが、アデニンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、例えば、およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０残基長を含む、およそ８０からおよそ２５０残基長であり得る、ポリ－Ａテールを付加する。一実施形態では、ポリ－Ａテールは、１００ヌクレオチド長である（配列番号２５）。
ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ（配列番号２５）
ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ（配列番号２５）
ポリＡテールはまた、構築物が核から搬出された後に付加することもできる。
本発明によれば、安定化のためにポリＡテール上の末端基が組み込まれ得る。本発明のポリヌクレオチドは、デス－３’ヒドロキシルテールを含み得る。それらはまた、Ｊｕｎｊｉｅ Ｌｉらにより教示されるような構造部分または２’－Ｏメチル修飾も含み得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１－１５０７，Ａｕｇｕｓｔ ２３，２００５（同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される））。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含む代替のポリＡテール構造を有する転写物をコードするように設計され得る。Ｎｏｒｂｕｒｙによれば、「末端ウリジル化もまた、ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡ上で検出されている。これらのｍＲＮＡの代謝回転は、染色体ＤＮＡ複製の完了または阻害に次ぐ毒性の可能性があるヒストン蓄積の阻止に重要であると考えられている。これらのｍＲＮＡは、それらに３’ポリ（Ａ）テールが欠如していることで区別され、その機能は、代わりに、安定なステム－ループ構造及びその同系のステム－ループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）によって引き受けられ、このうち後者は、ポリアデニル化ｍＲＮＡ上のＰＡＢＰの機能と同じ機能を実行する」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＲＮＡ：ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｗａｇｇｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ａｕｇｕｓｔ ２０１３；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）（同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
固有のポリ－Ａテール長は、本発明のポリヌクレオチドにある特定の利点を提供する。一般に、存在する場合、ポリ－Ａテールの長さは、３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、ポリ－Ａテールは、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチドであるか、またはそれらを超える）。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその領域は、約３０～約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５００～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，０００、２，０００～２，５００、及び２，５００～３，０００）を含む。
一部の実施形態では、ポリ－Ａテールは、全体的なポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの特定の領域の長さに比例して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づくか、またはポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づくことができる。
この文脈において、ポリ－Ａテールは、長さが、ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長いことが可能である。ポリ－Ａテールはまた、それが属するポリヌクレオチドの分数として設計することもできる。この文脈において、ポリ－Ａテールは、構築物、構築物領域の全長、またはポリ－Ａテールを差し引いた構築物の全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％以上であることが可能である。さらに、導入操作された結合部位及びポリ－Ａ結合タンパク質のためのポリヌクレオチドのコンジュゲーションにより、発現を強化することができる。
追加として、複数の別々のポリヌクレオチドを、ポリ－Ａテールの３’末端で修飾ヌクレオチドを使用して、３’末端へＰＡＢＰ（ポリ－Ａ結合タンパク質）を介して一緒に連結することができる。関連する細胞株においてトランスフェクション実験を実施することができ、トランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び７日目でタンパク質産生をＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ－Ｇカルテット領域を含むように設計される。Ｇ－カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方においてＧリッチ配列によって形成され得る、環状の水素結合した４つのグアニンヌクレオチドのアレイである。この実施形態では、Ｇ－カルテットは、ポリ－Ａテールの末端にて組み込まれる。結果として得られるポリヌクレオチドは、種々の時点で安定性、タンパク質産生、及び半減期を含めた他のパラメータに関してアッセイされる。ポリＡ－Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリ－Ａテールのみ（配列番号２６）を使用して見られるタンパク質産生の少なくとも７５％に相当する、ｍＲＮＡからのタンパク質産生をもたらすことが発見されている。
ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ（配列番号２６）
ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ（配列番号２６）
開始コドン領域
本開示はまた、開始コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＭＡ）も含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似しているか、またはそのように機能する領域を有することができる。
本開示はまた、開始コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＭＡ）も含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似しているか、またはそのように機能する領域を有することができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドンで開始することができる。ポリヌクレオチドの翻訳は、限定されないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧ等の代替の開始コドンで開始することができる（Ｔｏｕｒｉｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９５（２００３）１６９－１７８及びＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたく、同文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＡＣＧで始まる。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチド翻訳は、代替の開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧで始まる。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧで始まる。
限定されないが、開始コドンまたは代替の開始コドン等の翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ、及び／または構造に影響を及ぼすことが知られている（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたく、同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのうちのいずれかのマスキングを使用して、ポリヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ、及び／または構造を変化させることができる。
一部の実施形態では、開始コドンまたは代替の開始コドンの近くでマスキング剤を使用して、コドンをマスクまたは隠して、マスクされた開始コドンまたは代替の開始コドンでの翻訳開始の確率を低減することができる。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックト核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド及びエクソン接合部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｍａｓｋｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ＬＮＡ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ＥＪＣｓ（ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１）を参照されたく、同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
別の実施形態では、マスキング剤を使用して、ポリヌクレオチドの開始コドンをマスクして、代替の開始コドンで翻訳が開始する見込みを増加させることができる。一部の実施形態では、マスキング剤を使用して、最初の開始コドンまたは代替の開始コドンをマスクして、マスクされた開始コドンまたは代替の開始コドンの下流の開始コドンまたは代替の開始コドンで翻訳が開始する機会を増加させることができる。
一部の実施形態では、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全な相補鎖内に位置し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補鎖は、マスキング剤と同様に、ポリヌクレオチドの翻訳、長さ、及び／または構造を制御するのに役立ち得る。非限定的な例として、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補鎖の中間に位置し得る。開始コドンまたは代替の開始コドンは、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、第４のヌクレオチド、第５のヌクレオチド、第６のヌクレオチド、第７のヌクレオチド、第８のヌクレオチド、第９のヌクレオチド、第１０のヌクレオチド、第１１のヌクレオチド、第１２のヌクレオチド、第１３のヌクレオチド、第１４のヌクレオチド、第１５のヌクレオチド、第１６のヌクレオチド、第１７のヌクレオチド、第１８のヌクレオチド、第１９のヌクレオチド、第２０のヌクレオチド、または第２１のヌクレオチドの後に位置し得る。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの開始コドンをポリヌクレオチド配列から除去して、ポリヌクレオチドの翻訳が開始コドンではないコドンで始まるようにすることができる。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンに続くコドン、または下流の開始コドンもしくは代替の開始コドンで始まることができる。非限定的な例では、下流の開始コドンまたは代替の開始コドンで翻訳を開始させるように、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧがポリヌクレオチド配列の最初の３ヌクレオチドとして除去される。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ、及び／またはポリヌクレオチドの構造を制御するまたは制御しようとするために、下流の開始コドン及び／または代替の開始コドンに対する少なくとも１つのマスキング剤をさらに含み得る。
終止コドン領域
本開示はまた、終止コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＭＡ）も含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＤＮＡの場合はＴＧＡ、ＴＡＡ、及びＴＡＧから、またはＲＮＡの場合はＵＧＡ、ＵＡＡ、及びＵＡＧから選択され得る。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合は終止コドンＴＧＡ、またはＲＮＡの場合は終止コドンＵＧＡ、及び１つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、３つの連続した終止コドン、４つの終止コドン、またはそれよりも多くを含む。
本開示はまた、終止コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＭＡ）も含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＤＮＡの場合はＴＧＡ、ＴＡＡ、及びＴＡＧから、またはＲＮＡの場合はＵＧＡ、ＵＡＡ、及びＵＡＧから選択され得る。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合は終止コドンＴＧＡ、またはＲＮＡの場合は終止コドンＵＧＡ、及び１つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、３つの連続した終止コドン、４つの終止コドン、またはそれよりも多くを含む。
ポリヌクレオチドの作製方法
本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の作製方法も提供する。一部の態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、インビトロ転写を使用して構築することができる。
本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の作製方法も提供する。一部の態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、インビトロ転写を使用して構築することができる。
他の態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用した化学合成によって構築することができる。他の態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、宿主細胞を使用することによって作製される。ある特定の態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞発現、または当該技術分野で既知の任意の他の方法の１つまたは複数の組み合わせによって作製される。
天然型ヌクレオシド、非天然型ヌクレオシド、またはそれらの組み合わせは、候補ヌクレオチド配列に存在する天然型ヌクレオシドを全体的または部分的に置き換えることができ、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ）に組み込むことができる。次いで、結果として得られるｍＲＮＡを、それらがタンパク質を産生する及び／または治療成果を生み出す能力に関して検査することができる。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドの例示的な作製方法には、２０１７年５月１８日に出願された国際ＰＣＴ出願ＷＯ２０１７／２０１３２５に開示されるインビトロ転写の酵素的合成及び化学合成が含まれ、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
精製
他の態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、精製され得る。本明細書に記載の治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の精製は、ポリヌクレオチドクリーンアップ、品質保証及び品質管理を含み得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、限定されないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリ－Ｔビーズ、ＬＮＡＴＭオリゴ－Ｔ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）等の当該技術分野で既知の方法、または限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）等のＨＰＬＣベースの精製方法によって実施することができる。「精製ポリヌクレオチド」等、ポリヌクレオチドに関連して使用されるときの「精製」という用語は、少なくとも１つの夾雑物から分離されているポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるとき、「夾雑物」とは、別の物質を不適当、不純、または劣るものにする任意の物質である。故に、精製ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが自然界で見出されるものとは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在していたものとは異なる形態もしくは環境に存在する。
他の態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、精製され得る。本明細書に記載の治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の精製は、ポリヌクレオチドクリーンアップ、品質保証及び品質管理を含み得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、限定されないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリ－Ｔビーズ、ＬＮＡＴＭオリゴ－Ｔ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）等の当該技術分野で既知の方法、または限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）等のＨＰＬＣベースの精製方法によって実施することができる。「精製ポリヌクレオチド」等、ポリヌクレオチドに関連して使用されるときの「精製」という用語は、少なくとも１つの夾雑物から分離されているポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるとき、「夾雑物」とは、別の物質を不適当、不純、または劣るものにする任意の物質である。故に、精製ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが自然界で見出されるものとは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在していたものとは異なる形態もしくは環境に存在する。
一部の実施形態では、本開示の治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の精製は、不純物を除去し、これにより望まれない免疫応答が低減または除去され得る（例えば、サイトカイン活性の低減）。
一部の実施形態では、本開示の治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して、投与前に精製される。一部の実施形態では、本明細書に開示される治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））で精製されたポリヌクレオチドは、異なる精製方法によって精製された治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするポリヌクレオチドと比較して、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子の発現を増加させる。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））で精製されたポリヌクレオチドは、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする。一部の実施形態では、精製ポリヌクレオチドは、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする。
一部の実施形態では、精製ポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９６％純粋、少なくとも約９７％純粋、少なくとも約９８％純粋、少なくとも約９９％純粋、または約１００％純粋である。
品質保証及び／または品質管理チェックは、限定されないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析ＨＰＬＣ等の方法を使用して実施することができる。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素－ＰＣＲを含むがこれらに限定されない方法によってシーケンシングすることができる。
ポリヌクレオチドの化学修飾
本開示は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」とは、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書で同じく「核酸塩基」と称される）と組み合わせて糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾または非天然ヌクレオシドを含むように、例えば、化学的、酵素的、または組換え等の、任意の有用な方法によって合成されてもよい。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（単数または複数）を含み得る。かかる領域は、可変の骨格結合を有してもよい。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むことになろう。
本開示は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」とは、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書で同じく「核酸塩基」と称される）と組み合わせて糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾または非天然ヌクレオシドを含むように、例えば、化学的、酵素的、または組換え等の、任意の有用な方法によって合成されてもよい。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（単数または複数）を含み得る。かかる領域は、可変の骨格結合を有してもよい。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むことになろう。
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、ヌクレオチド及び／または非標準塩基もしくは修飾塩基を含む修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対もまた包含し、ここで、水素結合ドナー及び水素結合アクセプターの配置構成が、例えば、少なくとも１つの化学修飾を有する核酸等において、非標準塩基と標準塩基との間、または２つの相補的な非標準塩基構造間の水素結合を可能にする。かかる非標準塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせが、本開示の核酸に組み込まれてもよい。
一部の実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）における修飾核酸塩基は、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはシュードウリジン（ψ）を含む。一部の実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）における修飾核酸塩基は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルシュードウリジン、５－メチルシチジン、及び／または５－メトキシシチジンを含む。一部の実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、化学修飾を含むがこれらに限定されない、前述の修飾核酸塩基のうちのいずれかの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数または全てのウリジン位置にＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数または全てのウリジン位置にＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）置換、及び核酸の１つもしくは複数または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換を含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換、及び核酸の１つもしくは複数または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数または全てのウリジン位置にウリジンを含む。
一部の実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）は、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体を通して修飾される）。例えば、核酸は、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで均一に修飾され得、つまり、ｍＲＮＡ配列内の全てのウリジン残基が、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで置き換えられる。同様に、核酸は、上述した残基等の修飾残基との置き換えによって、配列内に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について均一に修飾され得る。
本開示の核酸は、分子の全長に沿って部分的または完全に修飾されてもよい。例えば、本開示の核酸内、またはその既定の配列領域内（例えば、ポリＡテールを含むまたは除くｍＲＮＡ内）で、１つもしくは複数または全てのヌクレオチドあるいは所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、あるいはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つもしくは複数または全て）が、均一に修飾されてもよい。一部の実施形態では、本開示の核酸内（またはその配列領域内）の全てのヌクレオチドＸは、修飾ヌクレオチドであり、ここで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか１つであり得る。
核酸は、約１％～約１００％（全体的なヌクレオチド含量に関して、または１つもしくは複数の種類のヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのうちのいずれか１つもしくは複数に関してのいずれか）、または介在する任意のパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）の修飾ヌクレオチドを含有してもよい。任意の残りのパーセンテージは、未修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって占められることが理解されよう。
核酸は、最小１％かつ最大１００％の修飾ヌクレオチド、または介在する任意のパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含有してもよい。例えば、核酸は、修飾ウラシルまたはシトシン等の修飾ピリミジンを含有してもよい。一部の実施形態では、核酸内の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは１００％のウラシルが、修飾ウラシルで置き換えられる（例えば、５－置換ウラシル）。修飾ウラシルは、単一の固有の構造を有する化合物に置き換えられ得るか、または、異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多くの固有の構造）を有する複数の化合物に置き換えられ得る。一部の実施形態では、核酸内の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは１００％のシトシンが、修飾シトシンで置き換えられる（例えば、５－置換シトシン）。修飾シトシンは、単一の固有の構造を有する化合物に置き換えられ得るか、または、異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多くの固有の構造）を有する複数の化合物に置き換えられ得る。
薬学的組成物
本開示は、本明細書に開示されるシステムまたはＬＮＰ組成物のうちのいずれか、例えば、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子、及び（２）結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、システムまたはＬＮＰ組成物を含む、薬学的製剤を提供する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、追加の標的化部分を含まない。本開示の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた組成物及び複合体に製剤化される。薬学的組成物は、任意選択で、１つまたは複数の追加の活性物質、例えば、治療上及び／または予防上活性な物質を含み得る。本開示の薬学的組成物は、滅菌及び／または発熱性物質不含であり得る。薬学的薬剤の製剤化及び／または製造における一般考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５に見出すことができる。
本開示は、本明細書に開示されるシステムまたはＬＮＰ組成物のうちのいずれか、例えば、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子、及び（２）結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、システムまたはＬＮＰ組成物を含む、薬学的製剤を提供する。ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、追加の標的化部分を含まない。本開示の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた組成物及び複合体に製剤化される。薬学的組成物は、任意選択で、１つまたは複数の追加の活性物質、例えば、治療上及び／または予防上活性な物質を含み得る。本開示の薬学的組成物は、滅菌及び／または発熱性物質不含であり得る。薬学的薬剤の製剤化及び／または製造における一般考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５に見出すことができる。
一部の実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的で、「活性成分」という語句は一般に、本明細書に記載されるように送達されるポリヌクレオチドを指す。
本明細書で提供される薬学的組成物の説明は、原則として、ヒトへの投与に好適な薬学的組成物を対象とするものの、かかる組成物は、一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者には理解されよう。ヒトへの投与に好適な薬学的組成物を種々の動物への投与に好適なものとするための、組成物の改変は、十分に理解されており、通常の知識を有する獣医薬理学者は、たとえあるとしても通例にすぎない実験により、かかる改変を設計及び／または実施することができる。薬学的組成物の投与が企図される対象には、ヒト及び／または他の霊長類、哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病巣内、頭蓋内、脳室内、経口、吸入スプレー、経肺、局所、直腸、鼻腔、頬側、膣内、または埋め込みリザーバー、筋肉内、皮下、または皮内送達用に製剤化される。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、皮下または静脈内送達用に製剤化される。
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学分野で既知の任意の、または今後開発される方法によって調製することができる。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つもしくは複数の他の補助成分と会合させ、次いで、必要であれば及び／または望ましければ、生成物を所望の単回または複数回投与単位に分割、成形、及び／または包装するステップを含む。
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の固有性、サイズ、及び／または状態に応じて、またさらに組成物が投与されることになる経路に応じて様々であろう。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５％～５０％、１％～３０％、５％～８０％、または少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
製剤及び送達
本開示のｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、１つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化され得る。
本開示のｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、１つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化され得る。
１つまたは複数の賦形剤の機能は、例えば、（１）安定性を増加させる、（２）細胞トランスフェクションを増加させる、（３）持続放出もしくは遅延放出を可能にする（例えば、ポリヌクレオチドのデポー製剤から）、（４）体内分布を変化させる（例えば、ポリヌクレオチドを特定の組織または細胞種に標的化する）、（５）コードされたタンパク質のインビボでの翻訳を増加させる、及び／または（６）コードされたタンパク質のインビボでの放出プロファイルを変化させることである。ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル等の慣習的な賦形剤に加えて、本開示の分散補助剤または懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、賦形剤には、限定されないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、及びそれらの組み合わせが含まれ得る。したがって、本開示の製剤には、１つまたは複数の賦形剤が、各々合わせてポリヌクレオチドの安定性を増加させる、ポリヌクレオチドによる細胞トランスフェクションを増加させる、ポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質の発現を増加させる、及び／またはポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質の放出プロファイルを変化させる量で含まれ得る。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、自己組織化した核酸ナノ粒子を使用して製剤化され得る。
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学分野で既知の任意の、または今後開発される方法によって調製することができる。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つもしくは複数の他の補助成分と会合させるステップを含む。
本開示による薬学的組成物は、バルクで、単一の単位用量として、及び／または複数の単一の単位用量として調製、包装、及び／または販売され得る。本明細書で使用されるとき、「単位用量」とは、既定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別的な量を指す。活性成分の量は、一般に、対象に投与される活性成分の投薬量及び／またはかかる投薬量の好都合な分数、例えば、かかる投薬量の２分の１もしくは３分の１等に等しい。
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、処置されている対象の固有性、サイズ、及び／または状態に応じて、またさらに組成物が投与されることになる経路に応じて様々であり得る。例えば、組成物は、０．１％～９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の製剤は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する。非限定的な例として、製剤は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのポリヌクレオチドを含有する。
薬学的製剤は、追加として薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、本明細書で使用されるとき、これには、所望の特定の剤形に適するような、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散補助剤または懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤等が含まれるが、これらに限定されない。薬学的組成物を製剤化するための種々の賦形剤、及び組成物を調製する技法は、当該技術分野で既知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照されたい）。任意の従来の賦形剤媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的効果を生み出すか、さもなければ薬学的組成物の任意の他の成分（複数可）と有害な様態で相互作用することによって、物質またはその誘導体と不適合性であり得る場合を除き、従来の賦形剤媒体の使用が本開示の範囲内で企図され得る。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子の粒径は、増加及び／または減少させられる。粒径の変化は、限定されないが炎症等の生物学的反応に対抗するのに役立つことができる可能性があるか、または哺乳動物に送達される修飾ｍＲＮＡの生物学的効果を増加させ得る。
薬学的組成物の製造において使用される薬学的に許容される賦形剤には、不活性希釈剤、表面活性剤、及び／または乳化剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、及び／または油が含まれるが、これらに限定されない。かかる賦形剤を、任意選択で、本開示の薬学的製剤に含めることができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コレステロール等の分子を隔離し得るナノ構造体でもしくはそれと共に投与されるか、ナノ構造体に製剤化されるか、またはそれと共に送達される。これらのナノ構造体の非限定的な例及びこれらのナノ構造体の作製方法は、米国出願公開第ＵＳ２０１３／０１９５７５９号に記載される。これらのナノ構造体の例示的な構造は、米国出願公開第ＵＳ２０１３／０１９５７５９号に示され、コア及びコアを取り囲むシェルを含み得る。
本開示のｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して細胞に送達することができる。例えば、本開示のｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、脂質ベースの送達、例えば、トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって、細胞に送達することができる。
均等物及び範囲
当業者であれば、本明細書に記載される本開示による具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはほんの日常的な実験を使用して確認することができる。本開示の範囲は、以下の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されるようなものである。
当業者であれば、本明細書に記載される本開示による具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはほんの日常的な実験を使用して確認することができる。本開示の範囲は、以下の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されるようなものである。
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」等の冠詞は、反対の指示がない限り、または文脈から別途明らかでない限り、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。群の１つまたは複数の成員間に「または」を含む請求項または説明は、反対の指示がない限り、または文脈から別途明らかでない限り、群の成員のうちの１つ、１つよりも多く、または全てが所与の生成物またはプロセスに存在するか、用いられるか、または別様にそれと関連性がある場合、満たされるとみなされる。本開示は、群の厳密に１つの成員が所与の生成物またはプロセスに存在するか、用いられるか、または別様にそれと関連性がある実施形態を含む。本開示は、群の成員のうちの１つよりも多く、または全てが所与の生成物またはプロセスに存在するか、用いられるか、または別様にそれと関連性がある実施形態を含む。
また、「含む」という用語は、開放形式であることが意図され、追加の要素またはステップの包含を許容するが、それを必要とするものではないことにも留意されたい。故に、「含む」という用語が本明細書で使用されるとき、「からなる」という用語もまた包含及び開示される。
範囲が与えられている場合、端点が含まれる。さらに、別途指示されない限り、または文脈及び当業者の理解から別途明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、本開示の異なる実施形態において述べられる範囲内の任意の具体的な値または部分範囲を、範囲の下限の単位の１０分の１までとることができることを理解されたい。
全ての引用元、例えば、本明細書で引用される参照文献、刊行物、データベース、データベースエントリー、及び技術は、たとえ引用文に明示的に述べられていなくても、参照により本明細書に援用される。引用元及び本願の記述が矛盾する場合、本願の記述が優先するものとする。
本開示は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されよう。しかしながら、それらは、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示目的のものにすぎないこと、ならびにそれらに照らして種々の修正または変更が当業者に示唆され、本願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
実施例１：ＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰによるＨＳＰＣのインビボ遺伝子編集
この実施例は、Ｃｒｅ－ｍＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰ（ＬＮＰｃｒｅ）の投与時の造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）のインビボトランスフェクション及びＣｒｅ媒介遺伝子編集について記載する。
この実施例は、Ｃｒｅ－ｍＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰ（ＬＮＰｃｒｅ）の投与時の造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）のインビボトランスフェクション及びＣｒｅ媒介遺伝子編集について記載する。
簡潔に述べると、赤色蛍光タンパク質（Ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ）をコードするサイレント遺伝子座を含有するＡｉ１４マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰｃｒｅの静脈内投与を与えた。対照として、別個のマウスのコホートにトリス／スクロースビヒクルを注射した。各ＬＮＰｃｒｅ群には３匹の動物が存在した（ｎ＝３）。ＬＮＰまたはビヒクル対照の投与から４８時間後、マウスを安楽死させ、骨髄細胞を採取し、示されるマーカーを用いたフローサイトメトリーのために処理した。
この実験では、「Ｃｒｅ」リコンビナーゼによって活性化され得る赤色蛍光タンパク質（Ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ）をコードするサイレント遺伝子座を含有するＡｉ１４マウスを利用して、細胞系列追跡を実施した。これらのマウスにおいて、細胞は、Ｃｒｅ ｍＲＮＡで成功裏にトランスフェクトされる場合にのみ、Ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏを発現する。故に、どの細胞種が特定の製剤及び投与経路（ＲＯＡ）により成功裏にトランスフェクトされたかについての生物全体にわたる情報を提供することに加えて、この手法はまた、どの細胞が遺伝子編集可能であるかも明らかにした。
図１Ａ～１Ｃに示されるように、Ｃｒｅ－ｍＲＮＡ ＬＮＰの投与は、ＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光の増加によって測定したとき、インビボでＣｒｅ媒介遺伝子編集をもたらした。図１Ａ～１Ｃは、ＬＳＫゲート、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）細胞、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、及び長期ＨＳＣを含めた骨髄ＨＳＰＣサブセットにおける、ＴｄＴｏｍａｔｏの蛍光／発現を示すフローサイトメトリープロット／ヒストグラムを図示する。
要約すると、Ａｉ１４マウス及びＣｒｅ－ｍＲＮＡ ＬＮＰを使用したデータは、ＨＳＰＣ（ＬＳＫゲート）において及びＨＳＣが濃縮された前駆細胞集団においてＣｒｅ媒介遺伝子編集事象を誘発することが可能であったことを示し、このことはマウスにおける効率的なインビボＨＳＰＣ／ＨＳＣ遺伝子編集を実証する。
実施例２：ＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを投与したＡｉ１４マウスからの骨髄細胞によるＨＳＰＣ由来コロニー形成単位（ＣＦＵ）の生成
この実施例は、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ（ＬＮＰｃｒｅ）を投与したマウスからの骨髄細胞のエクスビボプレーティング時のＨＳＰＣ由来ＣＦＵの生成について記載する。
この実施例は、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ（ＬＮＰｃｒｅ）を投与したマウスからの骨髄細胞のエクスビボプレーティング時のＨＳＰＣ由来ＣＦＵの生成について記載する。
この実施例で使用した動物モデルは、実施例１で使用したものに類似する。「Ｃｒｅ」リコンビナーゼによって活性化され得る赤色蛍光タンパク質（Ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ）をコードするサイレント遺伝子座を含有するＡｉ１４マウスを使用した。これらのマウスにおいて、細胞は、Ｃｒｅ ｍＲＮＡで成功裏にトランスフェクトされる場合にのみ、Ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏを発現する。Ａｉ１４マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰｃｒｅの静脈内投与を与えた。対照として、マウスにトリス／スクロースを注射した。ＬＮＰまたは対照の投与から４８時間後、マウスを安楽死させ、骨髄細胞を採取し、組換えサイトカイン／成長因子（インターロイキン－３、インターロイキン－６、インスリン、エリスロポエチン、幹細胞因子、トランスフェリン）で強化したメチルセルロースベースの培地中でプレートした。プレーティング後２、５、７、９、１２、及び１４日目に共焦点顕微鏡を使用してコロニーの出現に関してプレートを撮像した。
この実施例では、エクスビボコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイを機能的ＨＳＰＣの読み出しとして使用した。このアッセイでは、ＨＳＰＣは、多細胞骨髄系、顆粒球、及び／または赤血球系／巨核球コロニーを生じさせ、これを顕微鏡観察によって定量し、特性評価することができる。
図２Ａに示されるように、プレーティング後７日目から開始して、ＬＮＰｃｒｅを投与したマウスからの骨髄細胞における赤色蛍光性（ＴｄＴｏｍａｔｏ）ＣＦＵの数の漸進的増加が観察された。対照においてＴｄＴｏｍａｔｏ発現細胞またはＴｄＴｏｍａｔｏ発現コロニーは何ら見られなかった。このデータは、ＬＮＰｃｒｅの投与時にＨＳＰＣがインビボで成功裏に遺伝子編集され、エクスビボでＴｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニーの形成をもたらしたことを実証する。異なる時点でのコロニー形成単位（ＣＦＵ）数及びＴｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の％を図２Ｂに図示する。
実施例３：インビボで遺伝子編集された造血前駆体細胞はインビボで骨髄系細胞及びリンパ系細胞を生じさせる
この実施例は、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ（ＬＮＰｃｒｅ）を投与したＡｉ１４マウスの末梢血中を循環しているインビボでの蛍光性（ＴｄＴｏｍａｔｏ）の血小板及び赤血球（ＲＢＣ）、ならびに免疫細胞サブセット（好中球、単球、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞）の頻度の漸進的増加について記載する。
この実施例は、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ（ＬＮＰｃｒｅ）を投与したＡｉ１４マウスの末梢血中を循環しているインビボでの蛍光性（ＴｄＴｏｍａｔｏ）の血小板及び赤血球（ＲＢＣ）、ならびに免疫細胞サブセット（好中球、単球、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞）の頻度の漸進的増加について記載する。
実施例１及び２で使用したのと類似の動物モデルをこの実施例で使用した。赤色蛍光タンパク質（Ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ）をコードするサイレント遺伝子座を含有するＡｉ１４マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰｃｒｅの静脈内投与を与えた。投与後約２４０日または約８ヶ月までの示される日にマウスから連続採血し、血液をフローサイトメトリーのために処理した。
図３Ａ～３Ｃは、この実験の結果を示す。図３Ａにおいて、ベースライン（ＬＮＰなしの群）での０．０１％から９１日目までで約３０％へのＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光性血小板のパーセントの増加が観察された。ベースライン（ＬＮＰなしの群）での０．０１％から９１日目までで約２７％へのＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光性赤血球のパーセントの類似した増加が観察された（図３Ｂ）。ＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光性血小板及び赤血球の増加は、少なくとも８ヶ月まで維持された。他の例では、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光性血小板及び赤血球の頻度は、ＬＮＰｃｒｅ投薬後１年まで維持された。赤血球及び血小板は核を有せず、Ｃｒｅリコンビナーゼは、ゲノムＤＮＡが存在する場合にのみ作用し得るため、このデータは、前駆細胞種（赤血球及び血小板の上流）がインビボでＬＮＰｃｒｅにより成功裏にトランスフェクトされ、遺伝子編集されたことを示す。また、血液中で観察されたＴｄＴｏｍａｔｏ＋血小板及び赤血球の存在（約９０日）は、それぞれ約５～１０日及び約４５日であるマウスにおける血小板及び赤血球の寿命を超えるため（図３Ｃ）、それは前駆細胞活性を有する細胞がＬＮＰｃｒｅによって標的化され、こうしてＴｄＴｏｍａｔｏ＋血小板及び赤血球を生じさせたことをさらに示す。
図３Ｄ～３Ｅは、ＬＮＰｃｒｅ投与後約９０日までの好中球（２７±５％、平均値±ＳＤ）及び単球（３０±５％、平均値±ＳＤ）を含めたＴｄＴｏｍａｔｏ＋骨髄系細胞の頻度を示す。循環している好中球及び単球は、血中で比較的短い寿命を有するため、９０日までで最大約３０％のＴｄＴｏｍａｔｏ＋好中球及び単球の存在（血小板及び赤血球に類似する）は、新たに産生された骨髄系細胞がＴｄＴｏｍａｔｏ＋として末梢中で出現していること、及びこれらの細胞の上流のＨＳＰＣがＬＮＰによって標的化されたことを示す。ＴｄＴｏｍａｔｏ＋細胞のレベルは、８ヶ月まで維持された。他の例では、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光性骨髄系細胞の頻度は、ＬＮＰｃｒｅ投薬後１年まで維持された。図３Ｆ～３Ｇは、ＬＮＰｃｒｅ投与後約９０日までのＢ細胞（１３±４％、平均値±ＳＤ）、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（１３±２％、平均値±ＳＤ）、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（８±１％、平均値±ＳＤ）を含めたＴｄＴｏｍａｔｏ＋リンパ系細胞の頻度の漸進的増加を示す。漸進的増加は、ＬＮＰｃｒｅ投与後少なくとも８ヶ月まで維持された。他の例では、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光性リンパ系細胞の頻度は、ＬＮＰｃｒｅ投薬後１年まで維持された。循環している骨髄系細胞とは異なり、リンパ球は長い寿命を有し、それらは徐々に入れ替わるため、これらのデータは、新たに産生されたリンパ球が増加する速度でＴｄＴｏｍａｔｏ＋として末梢中で出現していることを示す。このデータは、ＬＮＰによる造血幹細胞及び前駆体細胞（ＨＳＰＣ）のインビボ遺伝子編集をさらに支持する。
実施例４：インビボで遺伝子編集されたＨＳＰＣの幹細胞らしさの潜在能の評価
この実施例では、インビボで遺伝子編集されたＨＳＰＣの幹細胞らしさの潜在能を決定することができる。
この実施例では、インビボで遺伝子編集されたＨＳＰＣの幹細胞らしさの潜在能を決定することができる。
この実験のために、一次及び二次骨髄移植を実施した。一次ＢＭ移植については、７、１４、２１、２８、及び３５日目に、ＬＮＰｃｒｅを投与したＡｉ１４マウスから連続採血した。次いで、マウスをＬＮＰｃｒｅ投与後５週間（３５日目）で屠殺し、骨髄（ＢＭ）を含めた種々の造血器を採取することになる。Ａｉ１４マウスから単離したＢＭ細胞を、致死量の放射線を照射して宿主の造血区画を枯渇させたＣＤ４５．１宿主に移植する。ドナーＡｉ１４マウスからの造血細胞の再増殖を監視するために、１４、２８、４２、５６、８４、１１２、１４０日目、及び２０週間までレシピエントＣＤ４５．１マウスから連続採血した。一部の例では、ＢＭ移植後１年までレシピエントＣＤ４５．１マウスから採血した。一部の例では、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光性血小板、赤血球、骨髄系、及びリンパ系細胞の頻度は、一次ＢＭ移植後１年まで維持された。
二次移植については、Ａｉ１４ ＢＭ細胞の一次ＢＭ移植を与えたＣＤ４５．１レシピエントマウスの第１のコホートのサブセットを投与後８週間（または最大２０週間）で屠殺し、骨髄を含めた種々の造血器を採取した。ＣＤ４５．１一次移植マウス（元のＡｉ１４ドナーからの生着したＨＳＰＣを保有する）から単離したＢＭ細胞を、致死量の放射線を照射した二次ＣＤ４５．１宿主に移植した。ドナーＣＤ４５．１一次移植マウスからの造血細胞の再増殖を監視するために、１４、２８、４２、及び５６日目にレシピエントＣＤ４５．１マウスから連続採血した。
図４Ａ～４Ｃに示されるように、連続骨髄移植時の完全な造血再構築は、真正のＬＴ－ＨＳＣへのインビボＬＮＰｃｒｅ送達の証拠を提供する。
この実施例に記載される方法を使用して、インビボで遺伝子編集されたＨＳＰＣの幹細胞らしさの潜在能を評価することができる。
実施例５：ＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰの複数回投薬はＡｉ１４マウスにおいてＨＳＰＣ送達に対する相加累積効果をもたらす
この実施例は、Ｃｒｅ－ｍＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰ（ＬＮＰｃｒｅ）の反復投薬による造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）のインビボトランスフェクション及びＣｒｅ媒介遺伝子編集について記載する。Ａｉ１４マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰｃｒｅの１、３、または５回の静脈内投与を与えた。
この実施例は、Ｃｒｅ－ｍＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰ（ＬＮＰｃｒｅ）の反復投薬による造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）のインビボトランスフェクション及びＣｒｅ媒介遺伝子編集について記載する。Ａｉ１４マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰｃｒｅの１、３、または５回の静脈内投与を与えた。
ＬＮＰの最終投与後７日、１４日、２１日、２８日、３５日、５６日、７０日、９０日、１２７日、１５５日、約１９５日または６ヶ月までで、全てのマウスから連続採血し、血液をフローサイトメトリーのために処理した。一部の例では、ＬＮＰの複数回投薬後１年でマウスから採血した。図５Ａ～５Ｃの頻度プロットは、血小板及び赤血球（図５Ａ）、単球、好中球、及び好酸球を含めた骨髄系細胞（図５Ｂ）、ならびにＢ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、及びＣＤ８ Ｔ細胞を含めたリンパ球（図５Ｃ）の間の循環しているｔｄＴ＋細胞％を図示する。一部の例では、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光性血小板、赤血球、骨髄系、及びリンパ系細胞の頻度は、ＬＮＰの複数回投薬後１年まで維持された。
実施例６：非ヒト霊長類における骨髄ＨＳＰＣへのＬＮＰ－ｍＯＸ４０Ｌ ｍＲＮＡの送達
この実施例は、ｍＯＸ４０Ｌ ｍＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰの投与による非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるインビボトランスフェクションについて記載する。
この実施例は、ｍＯＸ４０Ｌ ｍＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰの投与による非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるインビボトランスフェクションについて記載する。
各非ヒト霊長類に、０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ－ｍＯＸ４０Ｌ ｍＲＮＡまたはＯＸ４０Ｌビヒクル単独の静脈内注射を投与した。注射後２４時間で骨髄を収集し、フローサイトメトリーのために処理した。
図６は、ＬＮＰ送達後の骨髄細胞の間のＨＳＰＣサブセットにおけるｍＯＸ４０Ｌの頻度（％）を要約する。
実施例７：ヒト化マウスにおけるヒトＨＳＰＣへのＬＮＰ－ｍＯＸ４０Ｌ ｍＲＮＡの送達
この実施例は、ヒト化マウスにおけるヒトＨＳＰＣへの、ｍＯＸ４０Ｌ ｍＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰのインビボ送達について記載する。
この実施例は、ヒト化マウスにおけるヒトＨＳＰＣへの、ｍＯＸ４０Ｌ ｍＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰのインビボ送達について記載する。
ＮＯＧ－ＥＸＬマウスは、ヒト化マウスを生み出すようにヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞で再構築された。生着後１２～１４週間で、ヒト化マウスにＬＮＰ－ｍＯＸ４０Ｌ ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射によって投与した。投与後２４時間で分析のためにマウスを屠殺した。
図７Ａは、ヒトＨＳＰＣサブセットにおけるＯＸ４０Ｌ発現の頻度（％）を要約する。各点は、単一のヒト化マウスからのデータを表す。図７Ｂは、ＬＮＰを注射したヒト化マウスの骨髄からＦＡＣＳで選別したｍＯＸ４０Ｌ＋及びｍＯＸ４０Ｌ－ヒトＣＤ３４＋前駆細胞をプレートした後のＣＦＵアッセイの代表的な画像である。図７Ｃは、ＣＦＵアッセイの結果をグラフで要約する。
実施例８：イオン化可能な脂質の調製
本開示のイオン化可能な脂質（例えば、アミノ脂質）は、既知の方法を使用して調製した。例えば、化合物（Ｉ－Ｉ）及び（Ｉ－ＩＩ）は、ＷＯ２０１７／０４９２４５（例えば、段落［００４２６］、［００４２７］、及び［００４３４］を参照されたい）（同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載される方法に従って調製した。化合物（Ｉ－ＩＩＩ）は、ＷＯ２０１８／１７０３０６（例えば、段落［０２５９］、［０２６０］、及び［０３８７］を参照されたい）（同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載される方法に従って調製した。化合物（ＩＩ－Ｉ）は、ＷＯ２０１７／１１２８６５（例えば、段落［０５７５］～［０５８３］を参照されたい）（同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載される方法に従って調製した。
本開示のイオン化可能な脂質（例えば、アミノ脂質）は、既知の方法を使用して調製した。例えば、化合物（Ｉ－Ｉ）及び（Ｉ－ＩＩ）は、ＷＯ２０１７／０４９２４５（例えば、段落［００４２６］、［００４２７］、及び［００４３４］を参照されたい）（同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載される方法に従って調製した。化合物（Ｉ－ＩＩＩ）は、ＷＯ２０１８／１７０３０６（例えば、段落［０２５９］、［０２６０］、及び［０３８７］を参照されたい）（同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載される方法に従って調製した。化合物（ＩＩ－Ｉ）は、ＷＯ２０１７／１１２８６５（例えば、段落［０５７５］～［０５８３］を参照されたい）（同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載される方法に従って調製した。
化合物（Ｉ－ＩＶ）は、以下の方法及び代表的な手順に従って調製した。
化合物ｄ１の代表的な合成
８－ブロモオクタン酸をアルコールａ１（例えば、ヘプタデカン－９－オール）と反応させて、エステルｂ１（例えば、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノエート）を得た。ステップ１は、有機溶媒（例えば、ジクロロメタン）中、例えば、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、及びＤＭＡＰの存在下で行うことができる。ステップ１は、室温で１８時間行うことができる。次に、エステルｂ１を２－アミノエタン－１－オールと反応させて、アミンｃ１（例えば、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート）を得ることができる。ステップ２は、エタノール中、例えば、約６０℃の温度で行うことができる。次いで、アミンｃ１をブロモアルキルＲ１－Ｂｒ（例えば、１－ブロモテトラデカン）と反応させて、化合物ｄ１（例えば、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（テトラデシル）アミノ）オクタノエート）を得ることができる。ステップ３は、エタノール中、塩基（例えば、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）の存在下で行うことができる。
８－ブロモオクタン酸をアルコールａ１（例えば、ヘプタデカン－９－オール）と反応させて、エステルｂ１（例えば、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノエート）を得た。ステップ１は、有機溶媒（例えば、ジクロロメタン）中、例えば、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、及びＤＭＡＰの存在下で行うことができる。ステップ１は、室温で１８時間行うことができる。次に、エステルｂ１を２－アミノエタン－１－オールと反応させて、アミンｃ１（例えば、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート）を得ることができる。ステップ２は、エタノール中、例えば、約６０℃の温度で行うことができる。次いで、アミンｃ１をブロモアルキルＲ１－Ｂｒ（例えば、１－ブロモテトラデカン）と反応させて、化合物ｄ１（例えば、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（テトラデシル）アミノ）オクタノエート）を得ることができる。ステップ３は、エタノール中、塩基（例えば、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）の存在下で行うことができる。
２－オクチルデカン酸の合成
テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のジイソプロピルアミン（２．９２ｍＬ、２０．８ｍｍｏｌ）を－７８℃まで冷却し、溶液をｎ－ＢｕＬｉ（７．５ｍＬ、１８．９ｍｍｏｌ、ヘキサン中２．５Ｍ）で処理し、次いで混合物を０℃まで温めることによって、溶液ＬＤＡを調製した。次いで、０℃のＴＨＦ（２０ｍＬ）中のデカン酸（２．９６ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）及びＮａＨ（７５４ｍｇ、１８．９ｍｍｏｌ、６０ｗ／ｗ％）の別個の溶液をＬＤＡの溶液に添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。この時間の後、１－ヨードオクタン（５ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を４５℃で６時間加熱した。反応物を１ＮのＨＣｌ（１０ｍＬ）で反応停止処理した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空蒸発させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０－２０％の酢酸エチル）によって精製して、２－オクチルデカン酸（１．９ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ２．３８ （ｂｒ． ｍ， １Ｈ）；１．７４－１．０３ （ｂｒ． ｍ， ２８Ｈ）；０．９１ （ｍ， ６Ｈ）．
テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のジイソプロピルアミン（２．９２ｍＬ、２０．８ｍｍｏｌ）を－７８℃まで冷却し、溶液をｎ－ＢｕＬｉ（７．５ｍＬ、１８．９ｍｍｏｌ、ヘキサン中２．５Ｍ）で処理し、次いで混合物を０℃まで温めることによって、溶液ＬＤＡを調製した。次いで、０℃のＴＨＦ（２０ｍＬ）中のデカン酸（２．９６ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）及びＮａＨ（７５４ｍｇ、１８．９ｍｍｏｌ、６０ｗ／ｗ％）の別個の溶液をＬＤＡの溶液に添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。この時間の後、１－ヨードオクタン（５ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を４５℃で６時間加熱した。反応物を１ＮのＨＣｌ（１０ｍＬ）で反応停止処理した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空蒸発させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０－２０％の酢酸エチル）によって精製して、２－オクチルデカン酸（１．９ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ２．３８ （ｂｒ． ｍ， １Ｈ）；１．７４－１．０３ （ｂｒ． ｍ， ２８Ｈ）；０．９１ （ｍ， ６Ｈ）．
２－オクチルデカノールの合成
脱水ＴＨＦ（１２ｍＬ）中の２－オクチルデカン酸（７４６ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液を、脱水ＴＨＦ（６ｍＬ）中のＬＡＨの撹拌した溶液（５．２ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中１Ｍ溶液）に窒素下、０℃で添加した。反応物を室温まで温め、１２時間撹拌した。飽和Ｎａ２ＳＯ４＊１０Ｈ２Ｏ溶液（１０ｍＬ）の溶液を添加した。固体をセライトのプラグに通して濾過した。濾液を真空蒸発させ、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０－２０％の酢酸エチル）によって精製して、２－オクチルデカン－１－オール（６３５ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ３．５５ （ｄ， ２Ｈ）；１．５７－１．１８ （ｍ， ３０Ｈ）；０．９１ （ｍ， ６Ｈ）．
脱水ＴＨＦ（１２ｍＬ）中の２－オクチルデカン酸（７４６ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液を、脱水ＴＨＦ（６ｍＬ）中のＬＡＨの撹拌した溶液（５．２ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中１Ｍ溶液）に窒素下、０℃で添加した。反応物を室温まで温め、１２時間撹拌した。飽和Ｎａ２ＳＯ４＊１０Ｈ２Ｏ溶液（１０ｍＬ）の溶液を添加した。固体をセライトのプラグに通して濾過した。濾液を真空蒸発させ、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０－２０％の酢酸エチル）によって精製して、２－オクチルデカン－１－オール（６３５ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ３．５５ （ｄ， ２Ｈ）；１．５７－１．１８ （ｍ， ３０Ｈ）；０．９１ （ｍ， ６Ｈ）．
３－ブチルノニル８－ブロモオクタノエートの代表的な合成
０℃のジクロロメタン（３０ｍＬ）中の３－ブチルノナン－１－オール（４５８ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ）、８－ブロモオクタン酸（６１１．９ｍｇ、２．７４ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（５５．９ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣＩ（６５７．３ｍｇ、３．４３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を０℃まで冷却し、１Ｎの塩酸（３ｍＬ）をゆっくりと添加し、次いで、混合物をジエチルエーテル（１００ｍＬ）で抽出し、層を分離させた。有機層を飽和重炭酸ナトリウム（１００ｍＬ）、水、及びブラインで洗浄した。有機層を分離させ、濃縮した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ヘキサン／ジエチルエーテル０－１００％）によって精製して、３－ブチルノニル８－ブロモオクタノエート（６８０ｍｇ、７３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ４．０７ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）；３．３９ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）；２．２８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）；１．８８－１．７９ （ｍ， ２Ｈ）；１．７０－１．４２ （ｍ， ６Ｈ）；１．３８－１．１７ （ｍ， ２１Ｈ）；０．８８－０．８２ （ｍ， ６Ｈ）．
０℃のジクロロメタン（３０ｍＬ）中の３－ブチルノナン－１－オール（４５８ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ）、８－ブロモオクタン酸（６１１．９ｍｇ、２．７４ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（５５．９ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣＩ（６５７．３ｍｇ、３．４３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を０℃まで冷却し、１Ｎの塩酸（３ｍＬ）をゆっくりと添加し、次いで、混合物をジエチルエーテル（１００ｍＬ）で抽出し、層を分離させた。有機層を飽和重炭酸ナトリウム（１００ｍＬ）、水、及びブラインで洗浄した。有機層を分離させ、濃縮した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ヘキサン／ジエチルエーテル０－１００％）によって精製して、３－ブチルノニル８－ブロモオクタノエート（６８０ｍｇ、７３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ４．０７ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）；３．３９ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）；２．２８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）；１．８８－１．７９ （ｍ， ２Ｈ）；１．７０－１．４２ （ｍ， ６Ｈ）；１．３８－１．１７ （ｍ， ２１Ｈ）；０．８８－０．８２ （ｍ， ６Ｈ）．
３－プロピルヘキシル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエートの代表的な合成
撹拌子を装着した丸底フラスコに、３－プロピルヘキシル８－ブロモオクタノエート（２．８２ｇ、８．０６ｍｍｏｌ）、エタノールアミン（１４．６ｍＬ、２４２ｍｍｏｌ）、及びエチルアルコール（６ｍＬ）を添加した。得られた混合物を４０℃で１６時間撹拌した。反応物をジクロロメタンで希釈し、水（２回）で洗浄し、層を分離させた。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０－５－１０－２５－５０－１００％（ジクロロメタン中１％のＮＨ４ＯＨ、２０％のＭｅＯＨの混合物））によって精製して、３－プロピルヘキシル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート（８７６ｍｇ、２．６６ｍｍｏｌ、３３％）を油として得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．０８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；３．６３ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．７７ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．６１ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．２８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．９１ （ｂｒ． ｓ， ２Ｈ）；１．６８－１．３９ （ｍ， ７Ｈ）；１．３８－１．１８ （ｍ， １４Ｈ）；０．８８ （ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
撹拌子を装着した丸底フラスコに、３－プロピルヘキシル８－ブロモオクタノエート（２．８２ｇ、８．０６ｍｍｏｌ）、エタノールアミン（１４．６ｍＬ、２４２ｍｍｏｌ）、及びエチルアルコール（６ｍＬ）を添加した。得られた混合物を４０℃で１６時間撹拌した。反応物をジクロロメタンで希釈し、水（２回）で洗浄し、層を分離させた。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０－５－１０－２５－５０－１００％（ジクロロメタン中１％のＮＨ４ＯＨ、２０％のＭｅＯＨの混合物））によって精製して、３－プロピルヘキシル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート（８７６ｍｇ、２．６６ｍｍｏｌ、３３％）を油として得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．０８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；３．６３ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．７７ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．６１ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．２８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．９１ （ｂｒ． ｓ， ２Ｈ）；１．６８－１．３９ （ｍ， ７Ｈ）；１．３８－１．１８ （ｍ， １４Ｈ）；０．８８ （ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
３－ブチルヘプタン－１－オールの合成
Ｎ２下、０℃の脱水エーテル（２３ｍＬ）中の水素化リチウムアルミニウム（８５０ｍｇ、２２．４ｍｍｏｌ）の混合物に、脱水エーテル（１５ｍＬ）中の３－ブチルヘプタン酸エチル（４．００ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を室温で２．５時間撹拌してから０℃まで冷却した。水（１ｇのＬｉＡｌＨ４当たり１ｍＬ）を溶液に滴加し、続いて１５％水酸化ナトリウム（１ｇのＬｉＡｌＨ４当たり１ｍＬ）及び水（１ｇのＬｉＡｌＨ４当たり３ｍＬ）をゆっくりと添加した。溶液を室温で数分間撹拌し、セライトパッドに通して濾過した。セライトパッドをジエチルエーテルで洗浄し、濾液を濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー（０－４０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって精製して、３－ブチルヘプタン－１－オール（３．１９ｇ、１８．５ｍｍｏｌ、９９％）を油として得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ３．６６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．５３ （ｑ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．４６－１．３６ （ｍ， １Ｈ）；１．３５－１．２１ （ｍ， １２Ｈ）；１．１８ （ｂｒ． ｓ， １Ｈ）；０．８９ （ｂｒ． ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
Ｎ２下、０℃の脱水エーテル（２３ｍＬ）中の水素化リチウムアルミニウム（８５０ｍｇ、２２．４ｍｍｏｌ）の混合物に、脱水エーテル（１５ｍＬ）中の３－ブチルヘプタン酸エチル（４．００ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を室温で２．５時間撹拌してから０℃まで冷却した。水（１ｇのＬｉＡｌＨ４当たり１ｍＬ）を溶液に滴加し、続いて１５％水酸化ナトリウム（１ｇのＬｉＡｌＨ４当たり１ｍＬ）及び水（１ｇのＬｉＡｌＨ４当たり３ｍＬ）をゆっくりと添加した。溶液を室温で数分間撹拌し、セライトパッドに通して濾過した。セライトパッドをジエチルエーテルで洗浄し、濾液を濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー（０－４０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって精製して、３－ブチルヘプタン－１－オール（３．１９ｇ、１８．５ｍｍｏｌ、９９％）を油として得た。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ３．６６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．５３ （ｑ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．４６－１．３６ （ｍ， １Ｈ）；１．３５－１．２１ （ｍ， １２Ｈ）；１．１８ （ｂｒ． ｓ， １Ｈ）；０．８９ （ｂｒ． ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
３－ブチルヘプチル８－ブロモオクタノエートの合成
０℃の塩化メチレン（３２ｍＬ）中の３－ブチルヘプタン－１－オール（３．１９ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）、８－ブロモオクタン酸（４．９６ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（４５３ｍｇ、３．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣＩ（５．３３ｇ、２７．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合物を０℃まで冷却し、１０％塩酸の溶液（１５０ｍＬ）を２０分間にわたってゆっくりと添加した。層を分離させ、有機層を真空濃縮して粗製油を得た。油をヘキサン（１５０ｍＬ）に溶解させ、アセトニトリル（１５０ｍＬ）及び５％重炭酸ナトリウム（１５０ｍＬ）の混合物で洗浄した。ヘキサン層を分離させ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過した。溶媒を真空下で除去して、３－ブチルヘプチル８－ブロモオクタノエート（６．９０ｇ、１８．３ｍｍｏｌ、９９％）を油として得た。化合物をさらに精製することなく次のステップに進めた。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．０８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；３．４０ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．２９ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．８５ （五重線， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．６９－１．５２ （ｍ， ４Ｈ）；１．４９－１．２０ （ｍ， １９Ｈ）；０．８９ （ｂｒ． ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
０℃の塩化メチレン（３２ｍＬ）中の３－ブチルヘプタン－１－オール（３．１９ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）、８－ブロモオクタン酸（４．９６ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（４５３ｍｇ、３．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣＩ（５．３３ｇ、２７．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合物を０℃まで冷却し、１０％塩酸の溶液（１５０ｍＬ）を２０分間にわたってゆっくりと添加した。層を分離させ、有機層を真空濃縮して粗製油を得た。油をヘキサン（１５０ｍＬ）に溶解させ、アセトニトリル（１５０ｍＬ）及び５％重炭酸ナトリウム（１５０ｍＬ）の混合物で洗浄した。ヘキサン層を分離させ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過した。溶媒を真空下で除去して、３－ブチルヘプチル８－ブロモオクタノエート（６．９０ｇ、１８．３ｍｍｏｌ、９９％）を油として得た。化合物をさらに精製することなく次のステップに進めた。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．０８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；３．４０ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；２．２９ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．８５ （五重線， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）；１．６９－１．５２ （ｍ， ４Ｈ）；１．４９－１．２０ （ｍ， １９Ｈ）；０．８９ （ｂｒ． ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
３－ブチルノニル８－（（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエートの代表的な合成
冷却器に接続した５００ｍＬ丸底フラスコ中、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート（６０１ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）、３－ブチルノニル８－ブロモオクタノエート（６０６ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（６７６ｍｇ、４．９ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（２４８．４ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）をシクロペンチルメチルエーテル（３０ｍＬ）及びアセトニトリル（３０ｍＬ）中に混合し、反応混合物を８５℃まで１８時間加熱した。ＭＳにより、クリーンな変換が示され、混合物を室温まで冷却し、ヘキサンで希釈した。混合物をセライトパッドに通して濾過した。ヘキサンで洗浄した後、濾液を濃縮して茶色の油を得、それをフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ヘキサン／ジエチルエーテル０－１００％）によって精製して、３－ブチルノニル８－（（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエートを油（５８８ｍｇ、５６％）として得た。ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ７．０７分。ＭＳ （ＣＩ）： ｍ／ｚ （ＭＨ＋） ７６６．７ ｆｏｒ Ｃ４８Ｈ９５ＮＯ５． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．８５ （五重線， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ）；４．０７ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ）；３．５０ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ）；２．９８ （ｂｓ， １Ｈ）；２．５５ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ）；２．４１ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ）；２．２６ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ）；１．６５－１．４８ （ｍ， １９Ｈ）；１．２６ （ｂｒ． ｍ， ４８Ｈ）；０．８８－０．８４ （ｍ， １２Ｈ）．
冷却器に接続した５００ｍＬ丸底フラスコ中、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート（６０１ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）、３－ブチルノニル８－ブロモオクタノエート（６０６ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（６７６ｍｇ、４．９ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（２４８．４ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）をシクロペンチルメチルエーテル（３０ｍＬ）及びアセトニトリル（３０ｍＬ）中に混合し、反応混合物を８５℃まで１８時間加熱した。ＭＳにより、クリーンな変換が示され、混合物を室温まで冷却し、ヘキサンで希釈した。混合物をセライトパッドに通して濾過した。ヘキサンで洗浄した後、濾液を濃縮して茶色の油を得、それをフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ヘキサン／ジエチルエーテル０－１００％）によって精製して、３－ブチルノニル８－（（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエートを油（５８８ｍｇ、５６％）として得た。ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ７．０７分。ＭＳ （ＣＩ）： ｍ／ｚ （ＭＨ＋） ７６６．７ ｆｏｒ Ｃ４８Ｈ９５ＮＯ５． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．８５ （五重線， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ）；４．０７ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ）；３．５０ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ）；２．９８ （ｂｓ， １Ｈ）；２．５５ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ）；２．４１ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ）；２．２６ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ）；１．６５－１．４８ （ｍ， １９Ｈ）；１．２６ （ｂｒ． ｍ， ４８Ｈ）；０．８８－０．８４ （ｍ， １２Ｈ）．
ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエートの合成
エタノール（５ｍＬ）中のヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノエート（１０ｇ、２１．６７ｍｍｏｌ）及びエタノールアミン（３９．７ｇ、６５０ｍｍｏｌ）の溶液を６５℃まで１６時間加熱した。反応物を室温まで冷却し、酢酸エチルに溶解させ、水（４回）で抽出した。有機層を分離させ、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム乾燥させ、濾過し、溶媒を真空蒸発させた。残渣を、２０％メタノール／８０％ジクロロメタン／１％水酸化アンモニウム及びジクロロメタンの溶液（０－１００％の勾配）で溶出させながらフラッシュクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ）によって精製して、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート（７．８５ｇ、８２％）を得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ２．０６分。ＭＳ （ＥＳ）： Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ３に対するｍ／ｚ （ＭＨ＋） ４４２．６８９． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．８９ （ｐ， １Ｈ）；３．６６ （ｔ， ２Ｈ）；２．７９ （ｔ， ２Ｈ）；２．６３ （ｍ， ２Ｈ）；２．３０ （ｔ， ２Ｈ）；１．７７－１．２０ （ｍ， ４０Ｈ）；０．９０ （ｍ， ６Ｈ）．
エタノール（５ｍＬ）中のヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノエート（１０ｇ、２１．６７ｍｍｏｌ）及びエタノールアミン（３９．７ｇ、６５０ｍｍｏｌ）の溶液を６５℃まで１６時間加熱した。反応物を室温まで冷却し、酢酸エチルに溶解させ、水（４回）で抽出した。有機層を分離させ、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム乾燥させ、濾過し、溶媒を真空蒸発させた。残渣を、２０％メタノール／８０％ジクロロメタン／１％水酸化アンモニウム及びジクロロメタンの溶液（０－１００％の勾配）で溶出させながらフラッシュクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ）によって精製して、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート（７．８５ｇ、８２％）を得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ： ＲＴ ＝ ２．０６分。ＭＳ （ＥＳ）： Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ３に対するｍ／ｚ （ＭＨ＋） ４４２．６８９． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．８９ （ｐ， １Ｈ）；３．６６ （ｔ， ２Ｈ）；２．７９ （ｔ， ２Ｈ）；２．６３ （ｍ， ２Ｈ）；２．３０ （ｔ， ２Ｈ）；１．７７－１．２０ （ｍ， ４０Ｈ）；０．９０ （ｍ， ６Ｈ）．
３－ブチルヘプチル８－（（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート（Ｉ－ＩＶ）の合成
シクロペンチルメチルエーテル（１５ｍＬ）及びアセトニトリル（６ｍＬ）の混合物中の３－ブチルヘプチル８－ブロモオクタノエート（６．１５ｇ、１６．３１ｍｍｏｌ）及びヘプタデカン－９－イル８－［（２－ヒドロキシエチル）アミノ］オクタノエート（６．８６ｇ、１５．５３ｍｍｏｌ）の溶液を炭酸カリウム（８．５９ｇ、６２．１２ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（２．８４ｇ、１７．０８ｍｍｏｌ）で処理し、反応物を７７℃で１６時間撹拌した。反応物を冷却し、濾過し、揮発性物質を真空蒸発させた。残渣を、ジクロロメタン中２０％メタノール／８０％ジクロロメタン／１％水酸化アンモニウムの溶液（０－１００％の勾配）で溶出させながらフラッシュクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ）によって精製して、３－ブチルヘプチル８－（（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート（４．５３ｇ、３７．８％）を得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ：ＲＴ ＝ ３．０４分。Ｃ４６Ｈ９１ＮＯ５に対するＭＳ（ＥＳ）：ｍ／ｚ（ＭＨ＋）７３９．４６４． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．８９ （ｐ， １Ｈ）；４．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｂｍ， ２Ｈ）；２．７３－２．３９ （ｍ， ６Ｈ）；２．３０ （ｍ， ４Ｈ）；１．７２－１．１７ （ｍ， ６４Ｈ）；０．９２ （ｍ， １２Ｈ）．
シクロペンチルメチルエーテル（１５ｍＬ）及びアセトニトリル（６ｍＬ）の混合物中の３－ブチルヘプチル８－ブロモオクタノエート（６．１５ｇ、１６．３１ｍｍｏｌ）及びヘプタデカン－９－イル８－［（２－ヒドロキシエチル）アミノ］オクタノエート（６．８６ｇ、１５．５３ｍｍｏｌ）の溶液を炭酸カリウム（８．５９ｇ、６２．１２ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（２．８４ｇ、１７．０８ｍｍｏｌ）で処理し、反応物を７７℃で１６時間撹拌した。反応物を冷却し、濾過し、揮発性物質を真空蒸発させた。残渣を、ジクロロメタン中２０％メタノール／８０％ジクロロメタン／１％水酸化アンモニウムの溶液（０－１００％の勾配）で溶出させながらフラッシュクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ）によって精製して、３－ブチルヘプチル８－（（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）（２－ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート（４．５３ｇ、３７．８％）を得た。ＵＰＬＣ／ＥＬＳＤ：ＲＴ ＝ ３．０４分。Ｃ４６Ｈ９１ＮＯ５に対するＭＳ（ＥＳ）：ｍ／ｚ（ＭＨ＋）７３９．４６４． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ： ｐｐｍ ４．８９ （ｐ， １Ｈ）；４．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｂｍ， ２Ｈ）；２．７３－２．３９ （ｍ， ６Ｈ）；２．３０ （ｍ， ４Ｈ）；１．７２－１．１７ （ｍ， ６４Ｈ）；０．９２ （ｍ， １２Ｈ）．
他の実施形態
本開示はその詳細な説明と併せて記載されているが、上記の説明は例示説明を意図しており、本開示の範囲を限定することは意図しておらず、本開示の範囲は添付の特許請求によって定義されることを理解されたい。他の態様、利点、及び変更形態が、添付の特許請求の範囲内にある。本明細書に記載の全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が援用される。
本開示はその詳細な説明と併せて記載されているが、上記の説明は例示説明を意図しており、本開示の範囲を限定することは意図しておらず、本開示の範囲は添付の特許請求によって定義されることを理解されたい。他の態様、利点、及び変更形態が、添付の特許請求の範囲内にある。本明細書に記載の全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が援用される。
Claims (57)
- 幹細胞または前駆細胞、例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）を改変する、例えば、前記細胞に関連するパラメータまたは前記細胞に関連する構成成分を改変する方法であって、前記細胞を、ペイロードを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物と接触させることを含み、それによって前記細胞を改変する、方法。
- 疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、ペイロードを含む有効量のＬＮＰ組成物を投与することを含み、前記ＬＮＰ組成物が、前記対象において幹細胞、例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）の改変、例えば、前記細胞に関連する構成成分または前記細胞に関連するパラメータの改変をもたらし、それによって前記対象を処置する、方法。
- 疾患、障害、変異、または一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象の症状を改善する方法であって、前記対象に、ペイロードを含む有効量のＬＮＰ組成物を投与することを含み、前記ＬＮＰ組成物が、前記対象において幹細胞、例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）の改変、例えば、前記細胞に関連する構成成分または前記細胞に関連するパラメータの改変をもたらし、それによって前記対象の前記症状を改善する、方法。
- ペイロードを含むＬＮＰ組成物を、例えば、対象において、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）または組織に送達する方法であって、前記細胞または前記組織を前記ＬＮＰ組成物と接触させることを含む、方法。
- 前記ＬＮＰ組成物が、前記細胞または前記組織、例えば、前記細胞もしくは前記組織に関連する構成成分、または前記細胞もしくは前記組織に関連するパラメータの改変をもたらす、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記構成成分が、（１）前記細胞に関連する核酸もしくはその断片、例えば、ＤＮＡ（例えば、エクソン、イントロン、遺伝子間、テロメア、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、リプレッサー、コーディング、またはノンコーディング）もしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール体特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、（２）前記細胞に関連するペプチドもしくはタンパク質またはその断片、（３）前記細胞に関連する脂質成分もしくはその断片、またはそれらの組み合わせを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記構成成分が、前記細胞にとって内因性である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記構成成分が、前記細胞にとって外因性であり、例えば、当該技術分野で既知の方法、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、ウイルスベースの送達または脂質ベースの送達によって前記細胞に導入されたものである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記パラメータが、遺伝子型パラメータ、表現型パラメータ、機能パラメータ、発現パラメータ、またはシグナル伝達パラメータを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記遺伝子型パラメータが、前記細胞の遺伝子型、例えば、遺伝子もしくはアレルの存在もしくは不在、または遺伝子もしくはアレルの改変、例えば、前記遺伝子もしくは前記アレルにおける生殖細胞系列変異もしくは体細胞変異または遺伝子多型を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記表現型パラメータが、前記細胞の表現型、例えば、前記細胞の前記表面上の分子、例えば、細胞表面タンパク質、脂質、または接着分子の発現及び／または活性を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記機能パラメータが、前記細胞の生物学的機能、例えば、前記細胞が遺伝子産物（例えば、タンパク質）を産生する能力、前記細胞が増殖する、分裂する、及び／または複製する能力、及び／または前記細胞が、例えば、系列内の１つもしくは複数の細胞種に分化する能力を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記発現パラメータが、以下：
（ａ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベル、
（ｂ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性、
（ｃ）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾、
（ｄ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）折り畳み、及び／または
（ｅ）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性、
のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。 - 前記シグナル伝達パラメータが、以下：
（１）シグナル伝達経路、例えば、細胞シグナル伝達経路の調節、
（２）細胞運命の調節、
（３）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）発現レベルの調節、
（４）（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）活性の調節、及び／または
（５）例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはポリヌクレオチドもしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡの）安定性の調節、
のうちの１、２、３、４つ、または全てを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。 - 前記細胞が、前記ＬＮＰ組成物とインビトロ、インビボ、またはエクスビボで接触させられる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞が、前記ＬＮＰ製剤とインビボで接触させられる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞が、幹細胞または前駆細胞、例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えば、胚性幹細胞もしくは前駆細胞に由来するＨＳＰＣまたは人工多能性幹細胞もしくは前駆細胞に由来するＨＳＰＣである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞が、ＨＳＰＣ、例えば、多能性ＨＳＣまたは多能性ＨＰＣである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＨＳＰＣが、以下の機能特性：
ｉ．自己複製する能力、
ｉｉ．無限の増殖能、
ｉｉｉ．休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、
ｉｖ．任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、
ｖ．例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、
ｖｉ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、
のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。 - 前記ＨＳＰＣが、以下の発現特性：
ｉ．ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、
ｉｉ．ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、
ｉｉｉ．ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、
ｉｖ．ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、
ｖ．ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、
ｖｉ．ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、
ｖｉｉ．原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、
ｖｉｉｉ．系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または
ｉｘ．（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、
のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。 - 前記改変細胞（例えば、改変細胞の集団）が、改変ＨＳＰＣ（例えば、改変ＨＳＰＣの集団）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記改変ＨＳＰＣが、以下の機能特性：
ｉ．自己複製する能力、
ｉｉ．無限の増殖能、
ｉｉｉ．休止状態、例えば、増殖が起こらない細胞状態、例えば、細胞周期のＧ０期に入る及び／またはそれから出る能力、
ｉｖ．任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞に分化する能力、
ｖ．例えば、生物において、任意の造血系列、例えば、骨髄系列及び／またはリンパ系列、例えば、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）もしくはその分化細胞、及び／または骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）もしくはその分化細胞を再増殖させる能力、または
ｖｉ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力、
のうちの１、２、３、４、５つ、または全てを有する、請求項２１に記載の方法。 - 前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例２に記載されるように、例えば、エクスビボコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにおいて測定したとき、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較して、ＣＦＵを形成する前記能力を有する、請求項２２に記載の方法。
- 前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例２に記載されるように、例えば、エクスビボコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにおいて測定したとき、または例えば、実施例３に記載されるように、系列追跡実験において測定したとき、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較して、骨髄系細胞に分化する前記能力を有する、請求項２２に記載の方法。
- 前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例３に記載されるように、例えば、系列追跡実験において測定したとき、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較して、リンパ系細胞に分化する前記能力を有する、請求項２２に記載の方法。
- 前記改変ＨＳＰＣが、インビボで骨髄系細胞またはリンパ系細胞に分化する、請求項２２に記載の方法。
- 前記改変ＨＳＰＣが、インビトロで骨髄系細胞またはリンパ系細胞に分化する、請求項２２に記載の方法。
- 前記改変ＨＳＰＣが、例えば、実施例３に記載されるように、例えば、系列追跡実験において測定したとき、例えば、ＬＮＰと接触させられていないかまたは異なるＬＮＰと接触させられた、その他の点では類似のＨＳＰＣと比較して、赤血球細胞または血小板に分化する前記能力を有する、請求項２２に記載の方法。
- 前記改変ＨＳＰＣが、インビボで赤血球細胞または血小板に分化する、請求項２２に記載の方法。
- 前記改変ＨＳＰＣが、インビトロで赤血球細胞または血小板に分化する、請求項２２に記載の方法。
- 前記改変ＨＳＰＣが、例えば、インビボで、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２４０、３６０、３６５日間、またはそれよりも長く存続する、請求項２２に記載の方法。
- 前記改変ＨＳＰＣの前記インビボでの存続が、例えば、実施例３に示されるように、１つまたは複数の細胞、例えば、前記骨髄系列の細胞及び／または前記リンパ系列の細胞への分化をもたらす、請求項３１に記載の方法。
- 前記改変ＨＳＰＣが、以下の発現特性：
ｉ．ＣＤ４５の発現、例えば、ＣＤ４５の検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５の細胞表面発現、
ｉｉ．ＣＤ３４の発現、例えば、ＣＤ３４の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３４の細胞表面発現、
ｉｉｉ．ＣＤ３８の発現、例えば、ＣＤ３８の検出可能な発現、例えば、ＣＤ３８の細胞表面発現、
ｉｖ．ＣＤ９０の発現、例えば、ＣＤ９０の検出可能な発現、例えば、ＣＤ９０の細胞表面発現、
ｖ．ＣＤ１３３の発現、例えば、ＣＤ１３３の検出可能な発現、例えば、ＣＤ１３３の細胞表面発現、
ｖｉ．ＣＤ４５ＲＡの発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの検出可能な発現、例えば、ＣＤ４５ＲＡの細胞表面発現、
ｖｉｉ．原始前駆細胞に関連するマーカー、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、及び／またはＣＬＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、
ｖｉｉｉ．系列決定細胞に関連するマーカー、例えば、ＴＣＰ、ＮＫＰ、ＧＰ、ＭＰ、ＥＰ、及び／またはＭｋＰの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、または
ｉｘ．（ｖｉｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、もしくは全ての細胞系列マーカーに関連するマーカーの検出可能な発現が不在であるかもしくはその発現が低い、例えば、細胞系列陰性（Ｌｉｎ－）である、
のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、または全てを有する、請求項２１～３２のいずれか１項に記載の方法。 - 前記ペイロードを含む前記ＬＮＰ組成物が、前記細胞または前記組織に関連する前記構成成分または前記パラメータを改変、例えば、増加または減少させて、改変細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ、または組織をもたらす、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ペイロードが、核酸分子、ペプチド分子、脂質分子、低分子量分子、またはそれらの組み合わせを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ペイロードが、ポリヌクレオチドまたは核酸、例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む、請求項３５に記載の方法。
- 前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項３６に記載の方法。
- 前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
- 前記ペイロードが、遺伝子モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織の遺伝子を変化させるモジュレーター）、後成的モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織を後成的に変化させるモジュレーター）、ＲＮＡモジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織におけるＲＮＡ分子を変化させるモジュレーター）、ペプチドモジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織におけるペプチド分子を変化させるモジュレーター）、脂質モジュレーター（例えば、前記細胞または前記組織における脂質分子を変化させるモジュレーター）、またはそれらの組み合わせを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記疾患または前記障害が、異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、及び免疫細胞障害からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＬＮＰが、追加の標的化部分を含まない、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- 先行請求項のいずれか１項に記載の方法において使用するためのＬＮＰ組成物。
- 請求項４２に記載のＬＮＰ組成物を含む薬学的組成物。
- 前記ＬＮＰ組成物が、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む、請求項４２に記載のＬＮＰ組成物、または請求項４３に記載の薬学的組成物。
- 前記ＬＮＰ組成物が、式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含むアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式（ＶＩ－Ｄ）の化合物を含むＰＥＧ脂質を含む、請求項４２もしくは４３に記載のＬＮＰ組成物、または請求項４３もしくは４４に記載の薬学的組成物。
- 請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法に従って作製された改変細胞、例えば、改変幹細胞、例えば、改変ＨＳＰＣ。
- 請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法に従って作製された改変細胞、例えば、改変幹細胞、例えば、改変ＨＳＰＣの凍結調製物。
- 疾患または障害を有する対象の処置において使用するための、４６に記載の改変細胞、または４７に記載の改変細胞の凍結調製物。
- 疾患または障害を有する対象の症状の改善において使用するための、４６に記載の改変細胞、または４７に記載の改変細胞の凍結調製物。
- 前記疾患または前記障害が、異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、及び免疫細胞障害からなる群から選択される、請求項４８または４９に記載の使用のための改変細胞、または改変細胞の凍結調製物。
- 前記改変細胞が、前記対象にとって自家である、請求項４８～５０のいずれかに記載の使用のための改変細胞、または改変細胞の凍結調製物。
- 前記改変細胞が、前記対象にとって同種異系である、請求項４８～５０のいずれかに記載の使用のための改変細胞、または改変細胞の凍結調製物。
- （ａ）幹細胞または前駆細胞、例えば、ＨＳＰＣの集団と、
（ｂ）前記幹細胞または前記前駆細胞、例えば、前記幹細胞に関連する構成成分または前記幹細胞もしくは前記前駆細胞に関連するパラメータを改変することができるペイロードを含むＬＮＰ組成物と、を含み、任意選択で前記ＬＮＰ組成物が、追加の標的化部分を含まない、組成物または反応混合物。 - 改変細胞、例えば、改変ＨＳＰＣと、前記幹細胞、例えば、前記幹細胞もしくは前記前駆細胞に関連する構成成分または前記幹細胞もしくは前記前駆細胞に関連するパラメータを改変することができるペイロードを含むＬＮＰと、を含み、任意選択で前記ＬＮＰ組成物が、追加の標的化部分を含まない、薬学的組成物。
- （ｉ）ペイロード、（ｉｉ）式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含むアミノ脂質、（ｉｉｉ）ＤＳＰＣを含むリン脂質、（ｉｖ）コレステロールを含む構造脂質、及び（ｖ）式（ＶＩ－Ｄ）の化合物を含むＰＥＧ脂質を含む、ＬＮＰ組成物であって、
対象に投与されたときに、前記ＬＮＰ組成物が、ＨＳＰＣの改変、例えば、前記ＨＳＰＣの遺伝子型、表現型、または機能の改変をもたらし、それによって前記対象において異常ヘモグロビン症、凝固因子障害、血液細胞障害、及び免疫細胞障害からなる群から選択される疾患または障害を変化させる（例えば、改善する）、ＬＮＰ組成物。 - （ｉ）ペイロード、（ｉｉ）式（Ｉ－Ｉ）の化合物を含むアミノ脂質、（ｉｉｉ）ＤＳＰＣを含むリン脂質、（ｉｖ）コレステロールを含む構造脂質、及び（ｖ）式（ＶＩ－Ｄ）の化合物を含むＰＥＧ脂質を含む、ＬＮＰ組成物であって、
前記ペイロードが、例えば、対象において、ＨＳＰＣを改変する、例えば、前記ＨＳＰＣの遺伝子型、表現型、または機能を改変する、ＬＮＰ組成物。 - 前記ＬＮＰ組成物が、追加の標的化部分を含まない、請求項５５または５６に記載のＬＮＰ組成物。
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