JP2024503019A - 細胞療法用ヒドロゲル - Google Patents

Abstract

２つの異なるポリマー鎖に属するデキストランの少なくとも２つの糖類単位が、少なくとも１つの少なくとも二価のラジカルによって共有結合的に連結され、この少なくとも二価のラジカルは、少なくとも１５個の炭素原子及び任意選択で酸素、窒素、又は硫黄等のヘテロ原子を含む直鎖、分岐、又は環状アルキルラジカルである、カルボキシレート基を有する架橋デキストランポリマー。【選択図】なし

Description

本発明のドメインは、療法、特に細胞療法である。より具体的には、本発明は、以下を組み込み得るヒドロゲルを含む埋込物に関するものである。
－ペプチド、ホルモン若しくはタンパク質等の活性原理、又は
－ペプチド若しくはホルモンを分泌する細胞であり得る分泌細胞。

目的は、疾患を予防、治療、又は治癒することである。特に、これは、患者に欠乏している自然発生細胞の機能を完全に又は部分的に置き換えることによって、慢性疾患の予防及び／又は治療を可能にし得る。本発明はまた、架橋ポリマー、その前駆体、架橋ポリマーを得るためのプロセス、及びヒドロゲル、特にヒドロゲル含有細胞を得るためのプロセスに関する。

細胞は、単離されても又は凝集されてもよく、１つのタイプ又は異なるタイプであってもよい。

ヒドロゲルは、次のような複数のシステムで使用できる；
－制御薬物又は活性医薬品成分放出システムとしての足場、又は
－細胞を含む埋め込み可能なデバイスとして使用される足場。

ヒドロゲルは、３Ｄネットワーク内で架橋されたポリマーを含むか又はそれからなる。これらは、天然又は合成、ホモポリマー又はコポリマーのいずれかであり得る。これらは、大量の水を吸収し、保持する能力を持っている。これは、ヒドロゲルの膨張として知られている。

長期的に活発な原理を送達できる埋込物であり得るシステムを有するためには、多くの特徴を得なければならない。

これらの特徴の中で、以下のように引用され得る：
－細胞が患者の生物体内に入らないようにするための低分解性、特に低生分解性又は良好なインビボ安定性、
－活性原理、例えばホルモン、ペプチド、又はタンパク質の通過を可能にしながら、組み込まれた細胞を宿主の免疫系から完全に又は部分的に単離することによって、低い、又は更により良くは無免疫応答を可能にする良好な透過選択性、
－異物応答の良好な緩和、又は良好な生体適合性、特に低い細胞毒性及び良好な局所耐性、
－細胞の近くに良好な血管形成を有する等、細胞が高い生存率を有することを可能にすること、
－細胞がヒドロゲル内で良好な機能性を有することを可能にすること。

細胞の制御放出系又は足場として使用されるためには、ヒドロゲルは、上記に開示されるような所望の特性の全部又は一部、並びに良好な機械的及びレオロジー的特性を示すように、特定の特性を有しなければならない。

ヒドロゲルにとって高い関心のあるレオロジー的及び機械的特性の中で、以下のように引用され得る：
－良好な透明性又は半透明性に結びつけることができる良好な均質性、
－特に取り扱われ、埋め込まれるとき、応力及びひずみ機構に対する適切な抵抗及び柔軟性、
－酸素及び栄養素の交換、制御された輸送の特性及び透過選択制を最大にする定義されたメッシュサイズ
－インビボでの良好な安定性、すなわち、酵素又は酸化分解に対する耐性。

レオロジー的及び機械的所望の特性に関する指示を与えることができるパラメータの中で、以下のように引用され得る：
－機械的特性を示すｔａｎδ（損失タンジェントと呼ばれる）、
－メッシュサイズ及び弾性特性を示すＧ'、
－ヒドロゲルの弾性及び耐性を示す、破断時の圧縮及び／又は牽引変形、
－機械的特性を示す膨張性。

ヒドロゲルに関する以下の先行技術：
－Ｎｅｓｔｏｒ Ｌｏｐｅｒ Ｍｏｒａ ｅｔ ａｌ，"ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｘｔｒａｎ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ） ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｆｉｌｍｓ ｆｏｒ ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｌｉｐｉｄ ｖｅｓｉｃｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ，Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒｓ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１７，Ｖｏｌ．１３，ｎ°３３，ｐｐ ５５８０－５５８５、
－Ｈａｎｗｅｉ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎ ｓｉｔｕ ｇｅｌａｂｌｅ ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｄｏｕｂｌｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｉｎａｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ： ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ"，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１１，Ｖｏｌ．１２，ｎ°５，ｐｐ １４２８－１４３７、
－Ｒｏｎｇｓｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ａ ｎｏｖｅｌ ｐＨ ａｎｄ ｉｏｎｉｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｄｅｘｔｒａｎ ｈｙｄｒｏｇｅｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００５，Ｖｏｌ．２６，ｎ°２２，ｐｐ ４６７７－４６８３、及び
－Ｔａｉｃｈｉ Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｅｘｔｒａｎ－ｂａｓｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ"，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００７，Ｖｏｌ．２８，ｎ°２３，ｐｐ ３４１８－３４２６
は、本発明のヒドロゲルが起こすような技術的な問題を起こすことができないヒドロゲルを開示する。

比較例は、上記先行技術のヒドロゲルと比較して、本発明に従うヒドロゲルの優位性を示す。

根本的な問題は、埋め込み可能なデバイスの製造及び細胞の生存を可能にする生体適合性特性を可能にする物理化学的特性を提示するゲルの提供によって解決される。

更に、多くの先行技術とは反対に、本発明は、使用される前駆体及び架橋が行われる方法を考慮して、調整可能な特徴を有するヒドロゲルの調製を可能にする。これは、制御された組み込み及びヒドロゲルからの特定の物体の放出を有するヒドロゲルをもたらすことができる。

ヒドロゲルの適合性は、そのバルク構造に依存するため、本発明に従うヒドロゲルのネットワーク構造を特徴付けるために使用される重要なパラメータは、膨潤状態におけるポリマー体積分率、２つの隣接する架橋点間のポリマー鎖の分子量、及び対応するメッシュサイズである。

この問題は、カルボキシレート基を有する新しい架橋デキストランポリマーの提供によって解決され、ここで、２つの異なるポリマー鎖に属するデキストランの少なくとも２つの糖類単位は、少なくとも１つの二価のラジカルによって共有結合的に連結され、この少なくとも二価のラジカルは、少なくとも１５個の炭素原子及び任意選択で酸素、窒素、又は硫黄等のヘテロ原子を含む直鎖、分岐、又は環状アルキルラジカルである。

図１は、Ｃ１５－４（正方形）及びＣ１５－５（三角形）におけるカプセル化された一次ヒト膵島と比較した、裸の一次ヒト膵島（円）の洗い流しで測定されたグルコース刺激に対するインスリン分泌応答を示す。Ｇ３は３ｍＭグルコースクレブス緩衝液であり、Ｇ１５は１５ｍＭグルコースクレブス緩衝液である。Ｎ＝１独立した実験、ｎ＝１試料。ｘ軸は時間（分単位）、ｙ軸は信号（倍率増加）である。

このヒドロゲルファミリーの特性は、架橋反応条件、デキストラン及び架橋剤の置換度及び分子量を選択及び適合することによって、用途に合わせて調整及び調整可能である。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、カルボキシレート基を有するデキストランポリマーであり、少なくとも二価のラジカルＬ（－）_ｉはｉ－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－－ラジカルでデキストランポリマー骨格に共有結合され、
－Ｌ（－）_ｉは、その末端に、酸素、窒素又は硫黄等のヘテロ原子を有する直鎖又は分岐のポリエーテルであり、
－ｉは、Ｌの原子価であり、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－_－ラジカルの数であり、２～８（２≦ｉ≦８）からなる整数であり、
－ｍは、０又は１に等しい整数であり、
－－Ｒ_１－は、１～６個の炭素原子及び任意選択で酸素、窒素又は硫黄等のヘテロ原子を含む直鎖又は分岐アルキル二価ラジカルであり、
－－Ｇ_１－は、１～６個の炭素原子を含む直鎖又は分岐又は環状アルキル二価ラジカルであり、酸素、窒素、又は硫黄等のヘテロ原子を含み得る。

一実施形態において、ｍが１である場合、－Ｒ_１－はデキストランに連結され、－Ｇ_１－はリンカーに連結される。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、その末端に酸素、窒素、又は硫黄等の少なくとも２個のヘテロ原子を有する直鎖ポリエーテルラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、その末端に酸素、窒素、又は硫黄等の少なくとも２個のヘテロ原子を有する分岐ポリエーテルラジカルである。

分岐ポリエーテルとは、リンカーによって接続されたいくつかのポリエーテルアームを意味する。リンカーは、２～２０個の炭素原子、及び任意選択で、酸素、窒素、又は硫黄等のヘテロ原子を含むアルキルであってもよい。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、その末端に最大８本のアームを含む酸素、窒素、又は硫黄等の少なくとも２個のヘテロ原子を有する、直鎖又は分岐のポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ｉ＝２を有するＬ（－）_ｉは、その末端に２本のアームを含む酸素、窒素、又は硫黄等の２個のヘテロ原子を有する分岐又は直鎖ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ｉ＝３を有するＬ（－）_ｉは、その末端に、３本のアームを含む、酸素、窒素、又は硫黄等の３個のヘテロ原子を有する分岐ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ｉ＝４を有するＬ（－）_ｉは、その末端に、４本のアームを含む、酸素、窒素、又は硫黄等の４個のヘテロ原子を有する分岐ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ｉ＝５を有するＬ（－）_ｉは、その末端に、５本のアームを含む、酸素、窒素、又は硫黄等の５個のヘテロ原子を有する分岐ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ｉ＝６を有するＬ（－）_ｉは、その末端に、６本のアームを含む、酸素、窒素、又は硫黄等の６個のヘテロ原子を有する分岐ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ｉ＝７を有するＬ（－）_ｉは、その末端に、７本のアームを含む、酸素、窒素、又は硫黄等の７個のヘテロ原子を有する分岐ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ｉ＝８を有するＬ（－）_ｉは、その末端に、８本のアームを含む、酸素、窒素、又は硫黄等の８個のヘテロ原子を有する分岐ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ｉ＝２を有するＬ（－）_ｉは、その末端に２個の硫黄原子を有する直鎖ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ｉ＝４を有するＬ（－）_ｉは、その末端に最大４個の硫黄原子を有する分岐ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、その末端に硫黄原子を有し、最大８本のアームを含む分岐ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、その末端に２個の硫黄原子を有し、２本のアームを含む分岐ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ｉ＝３を有するＬ（－）_ｉは、その末端に３個の硫黄原子を有し、３本のアームを含む分岐ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ｉ＝４を有するＬ（－）_ｉは、その末端に４個の硫黄原子を有し、４本のアームを含む分岐ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ｉ＝８を有するＬ（－）_ｉは、その末端に８個の硫黄原子を有し、８本のアームを含む分岐ポリエーテルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、少なくとも２個の硫黄原子を含み、最大８本のアームを含む、直鎖又は分岐メルカプトポリエチレングリコールから由来するラジカルであり、
－数平均分子量（Ｍｎ）は、５００～４００００ｇ／ｍｏｌ（５００≦Ｍｎ≦４００００ｇ／ｍｏｌ）からなるか、又は
－重合度（ＤＰ）は８～１０００（８≦ＤＰ≦１０００）からなる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、少なくとも２個の硫黄原子を含み、最大８本のアームを含む、直鎖又は分岐メルカプトポリエチレングリコールから由来するラジカルであり、
－Ｍｎは１０００～２５０００ｇ／ｍｏｌ（１０００≦Ｍｎ≦２５０００ｇ／ｍｏｌ）からなるか、又は
－重合度（ＤＰ）は、１５～６００（１５≦ＤＰ≦６００）からなる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、式ＩＩ
－Ｓ－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ）_ｐ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－
式ＩＩ
（式中、ｐは、８～１０００（８≦ｐ≦１０００）からなる整数である）に従う、メルカプトポリエチレングリコールに由来するラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、メルカプトエチルポリオキシエチレンに由来する式ＩＩＩ'

（式中、
－Ｑは、炭素原子又は２～１０個の炭素原子を含むアルキル鎖のいずれかであり、アルキル鎖は、酸素、硫黄及び窒素からなる群から選択されるヘテロ原子を含み得、
－ｐは、８～１０００（８≦ｐ≦１０００）からなる整数であり、
－ｑは、２～８（２≦ｑ≦８）からなる整数であり、
－ｗは、１又は２であり、
－Ｚは、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｏ）_ｐ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－である）に従うラジカルである。

一実施形態において、ｗは１である。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、メルカプトエチルポリオキシエチレンに由来する式ＩＩＩ

（式中、
－Ｑは、炭素原子又は２～１０個の炭素原子を含むアルキル鎖のいずれかであり、アルキル鎖は、酸素、硫黄及び窒素からなる群から選択されるヘテロ原子を含み得、
－ｐは、８～１０００（８≦ｐ≦１０００）からなる整数であり、
－ｑは、２～８（２≦ｑ≦８）からなる整数であり、
－Ｚは、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｏ）_ｐ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－である）に従うラジカルである。

一実施形態において、Ｑは、２～８個の炭素原子及び１個又は２個の酸素原子を含むアルキル鎖である。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉはｑ＝４で式ＩＩＩ'に対応し、Ｑは炭素原子であり、式ＶＩＩ

（式中、
－Ｚは、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｏ）_ｐ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－であり、
－ｐは、８～１０００（８≦ｐ≦１０００）からなり、
－ｗは、１～２（１≦ｗ≦２）からなる）に従うラジカルである。

一実施形態において、ｗは１である。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、式ＶＩＩ'

（式中、
－ｐは、８～１０００（８≦ｐ≦１０００）からなり、
－Ｚは、－（ＣＨ２－ＣＨ_２Ｏ）_ｐ－ＣＨ２－ＣＨ_２－Ｓ－である）に従うラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ'、ＶＩＩ又はＶＩＩ'に従うラジカルであり、次の表に引用するチオールポリエチレングリコール又はメルカプトポリオキシエチレンに由来する：

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、Ｌ（－）_ｉは、特にペンタエリスリトールテトラ（メルカプトエチル）ポリオキシエチレン、ＣＡＳ＃１８８４９２－６８－４に由来するｗ＝１又は式ＶＩＩ'を有する式ＶＩＩに従うラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、－Ｒ_１－は、１～６個の炭素原子、及び任意選択で酸素、窒素、又は硫黄等のヘテロ原子を含む直鎖又は分岐アルキル二価ラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、－Ｒ_１－は、窒素原子を含む直鎖又は分岐アルキル二価ラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、－Ｒ_１－は、１～６個の炭素原子及び窒素原子を含む直鎖アルキルラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、－Ｒ_１－は、２～５個の炭素原子及び窒素原子を含む直鎖アルキルラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、－Ｒ_１－は、３～４個の炭素原子及び窒素原子を含む直鎖アルキルラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、－Ｒ_１－は、２個の炭素原子及び窒素原子を含む直鎖アルキルラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、－Ｒ_１－は、２～５個の炭素原子及び式ＸＩＩＩ
－ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２－ 式ＸＩＩＩ
に従う窒素原子を含む直鎖アルキルラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ラジカル－Ｒ_１－が、デキストランが有するカルボキシレート基と、アミン官能基を有する１つの－Ｒ_１－前駆体又は－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－前駆体との反応によって生じるアミド官能基によって共有結合されている。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ラジカル－Ｒ_１－が、デキストランが有するヒドロキシル官能基と、離脱基、特にハロゲン原子を有する、１つの－Ｒ_１－前駆体又は－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－前駆体、との反応によって生じるエーテル官能基によって共有結合されている。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ラジカル－Ｇ_１－は、式Ｖ

（式中、－＊は、デキストラン骨格及びリンカーへの結合部位を表す）に従う二価ラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、ラジカル－Ｇ_１－が式Ｖ'
－Ｓ－ＣＨ_２－ＳＯ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ 式Ｖ'
に従うラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格が有するカルボキシレート基に共有結合した－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－は、式ＶＩ

（式中、－＊は、デキストラン骨格及びリンカーへの結合部位を表す）に従う二価ラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格が有するカルボキシレート基に共有結合した－（Ｒ_１）_ｍＧ_１は、式ＶＩＩＩ

（式中、－＊は、デキストラン骨格及びリンカーへの結合部位を表す）に従う二価ラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格が有するヒドロキシル官能基に共有結合した－（Ｒ_１）_ｍＧ_１は、式Ｘ

（式中、－＊は、デキストラン骨格及びリンカーへの結合部位を表す）に従う二価ラジカルである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格を有するヒドロキシル官能基に共有結合した－（Ｒ_１）ｍＧ_１は、式ＸＩ

（式中、－＊は、デキストラン骨格及びリンカーへの結合部位を表す）に従う二価ラジカルである。

式ＶＩ及びＸの一実施形態において、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－は、上部結合、すなわち、－Ｒ_１－又はＮ－エチル結合を介してデキストランに連結され、下部結合、すなわち、飽和環からの結合を介してリンカーに連結される。

式ＶＩＩＩ及びＸＩの一実施形態において、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－は、－Ｒ_１－を介して左結合を介してデキストランに連結され、右結合を介してリンカーに連結される。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、糖類単位に結合したカルボキシレート基がエーテル結合によって結合し、少なくともカルボキシレート基を有する直鎖又は分岐アルキルラジカルの中から選択される。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、糖類単位に結合したカルボキシレート基がエーテル結合によって結合し、式Ｉ
－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯＸ 式Ｉ
（式中、
－ｎは、１～７（１≦ｎ≦７）からなる整数であり
－Ｘは、－ＯＨ、－ＯＮａ、－ＯＫ、又は－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－ラジカルの中から選択される）に従うカルボキシレート基の中から選択される。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、式Ｉ－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯＸに従うカルボキシレート基は、デキストランが有するヒドロキシル官能基と、脱離基、特にハロゲン原子を有する１つの－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯＸ前駆体との反応によって生じるエーテル官能基によってデキストランポリマー骨格に共有結合される。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－ラジカルに結合していない－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯＸ－は、塩形態であり、Ｘは、ＯＮａ又はＯＫの中から選択される。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、式Ｉに従うカルボキシレート基を有するデキストランポリマーであり、式中、ｎは１～７からなる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、式Ｉに従うカルボキシレート基を有するデキストランポリマーであり、式中、ｎは１～６からなる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、式Ｉに従うカルボキシレート基を有するデキストランポリマーであり、式中、ｎは１～５からなる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、式Ｉに従うカルボキシレート基を有するデキストランポリマーであり、式中、ｎは１～４からなる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、式Ｉに従うカルボキシレート基を有するデキストランポリマーであり、式中、ｎは１～３からなる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、式Ｉに従うカルボキシレート基を有するデキストランポリマーであり、式中、ｎは１～２からなる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、式Ｉに従うカルボキシレート基を有するデキストランポリマーであり、式中、ｎは１である。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は式ＸＩＩ

（式中、Ｒは、以下の中から選択される
－－Ｈ、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯＸ又は－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－；ｎ、ｍ、Ｘ、－Ｒ_１－、－Ｇ_１－並びにＬ（－）_ｉは上記のように定義され、Ｌ（－）_ｉは－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－ラジカルを有する別のデキストランポリマー骨格に共有結合し、
－ｌは２０～５０００（２０≦ｌ≦５０００）からなる）に従う。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に５～１０００ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランである。

言い換えれば、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、５～１０００ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有する天然デキストランポリマーの置換及び架橋後に得られる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に５～２５０ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に５～１００ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に５～５０ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に５～２５ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に２５０～１０００ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に１０～５００ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に２０～５００ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に２０～１００ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に２０～５０ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に４０～２５０ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に４０～１００ｋＤａからなる重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランである。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_１）は、０．００１～０．４（０．００１≦ＤＳ_１≦０．４）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_１）は、０．０１～０．４（０．０１≦ＤＳ_１≦０．４）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_１）は、０．１～０．４（０．１≦ＤＳ_１≦０．４）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前の重量平均分子量（Ｍｗ）が５～２５０ｋＤａであるデキストランであり、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_１）は、０．１～０．４（０．１≦ＤＳ_１≦０．４）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前の重量平均分子量（Ｍｗ）が２０～１００ｋＤａであるデキストランであり、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_１）は、０．２～０．４（０．２≦ＤＳ_１≦０．４）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前の重量平均分子量（Ｍｗ）が２０～１００ｋＤａであるデキストランであり、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_１）は、０．２～０．３（０．２≦ＤＳ_１≦０．３）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前の重量平均分子量（Ｍｗ）が２５０～１０００ｋＤａであるデキストランであり、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_１）は、０．００１～０．４（０．００１≦ＤＳ_１≦０．４）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に２５０～１０００ｋＤａの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランであり、－（Ｒ１）_ｍＧ_１－基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_１）は、０．０１～０．４（０．０１≦ＤＳ_１≦０．４）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、デキストランポリマー骨格は、架橋及び置換前に２５０～１０００ｋＤａの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランであり、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_１）は、０．１～０．４（０．１≦ＤＳ_１≦０．４）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、式Ｉに従うカルボキシレート基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_２）は、０．５～３（０．５≦ＤＳ_２≦３）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、式Ｉに従うカルボキシレート基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_２）は、１～２．７５（１≦ＤＳ_２≦２．７５）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、式Ｉに従うカルボキシレート基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_２）は、１．５～２．５（１．５≦ＤＳ_２≦２．５）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、架橋デキストランポリマーであり、式Ｉに従うカルボキシレート基でのデキストラン骨格の置換度（ＤＳ_２）は、１．７５～２．２５（１．７５≦ＤＳ_２≦２．２５）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－ラジカルのモル濃度と架橋剤Ｌ（－）_ｉの反応官能基のモル濃度との間にモル比（ＤＣ）を有する架橋デキストランポリマーであり、０．５～１．５（０．５≦ＤＣ≦１．５）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－ラジカルのモル濃度と架橋剤Ｌ（－）_ｉの反応官能基のモル濃度との間にモル比を有する架橋デキストランポリマーであり、０．８～１．２（０．８≦ＤＣ≦１．２）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－ラジカルのモル濃度と架橋剤Ｌ（－）_ｉの反応機能のモル濃度との間にモル比を有する架橋デキストランポリマーであり、０．９～１．１（０．９≦ＤＣ≦１．１）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－ラジカルのモル濃度と架橋剤Ｌ（－）_ｉの反応官能基のモル濃度との間のモル比を有する架橋デキストランポリマーであり、０．９５～１．０５（０．９５≦ＤＣ≦１．０５）の範囲に含まれる。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－ラジカルのモル濃度と架橋剤Ｌ（－）_ｉの反応官能基のモル濃度との間のモル比を有する架橋デキストランポリマーであり、１（ＤＣ＝１）である。

本発明はまた、本発明に従う架橋デキストランポリマーを含むヒドロゲルに関する。

一実施形態において、ヒドロゲルは透明である。

「透明」とは、目視検査のために実施例Ｃ２１に開示された条件において、観察者が、標準２（６ＮＴＵ）及び／又は実施例Ｃ２１で測定されたヒドロゲルのＵＶ吸光度と比較して、試料が透明であると見なし、０．０６（吸光度単位）未満であることを意味する。

一実施形態において、ヒドロゲルは視覚的に透明であり、ＵＶ吸光度＜０．０６（Ａｂｓ．単位）を有する。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、Ｔａｎδが１未満であることを特徴とする。

本明細書において、ｔａｎδは、貯蔵弾性率（弾性率とも呼ばれる）Ｇ'と損失弾性率Ｇ''との比率である（ｔａｎδ＝Ｇ'／Ｇ''）。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、Ｔａｎδが０．５以下であることを特徴とする。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、Ｔａｎδが０．１以下であることを特徴とする。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、Ｔａｎδが０．０５以下であることを特徴とする。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、Ｔａｎδが０．０１以下であることを特徴とする。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、水中で膨張した後、架橋デキストランポリマー濃度が０．０１～０．２ｇ／ｇからなることを特徴とする。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、水中で膨張した後、架橋デキストランポリマー濃度が０．０３～０．１ｇ／ｇからなることを特徴とする。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、水中で膨張した後、架橋デキストランポリマー濃度が０．０５～０．１ｇ／ｇからなることを特徴とする。

一実施形態において、ヒドロゲルは半透明である。

別の実施形態において、ヒドロゲルは透明である。

一実施形態において、ヒドロゲルは、１～２００ｋＰａで構成されるヤング係数を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、５～２００ｋＰａで構成されるヤング係数を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、２０～２００ｋＰａで構成されるヤング係数を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、３０～２００ｋＰａで構成されるヤング係数を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、５０～２００ｋＰａで構成されるヤング係数を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、３０～１８０ｋＰａで構成されるヤング係数を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、５０～１５０ｋＰａで構成されるヤング係数を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、０．５～７０ｋＰａからなるＧ'を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に１０％以上の圧縮変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に１５％以上の圧縮変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に２０％以上の圧縮変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に２５％以上の圧縮変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に３０％以上の圧縮変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に３５％以上の圧縮変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に４０％以上の圧縮変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に４５％以上の圧縮変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破壊時に５０％以上の圧縮変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に５５％以上の圧縮変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に６０％以上の圧縮変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に１０％以上の牽引変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に１５％以上の牽引変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に２０％以上の牽引変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に２５％以上の牽引変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に３０％以上の牽引変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に３５％以上の牽引変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、破断時に４０％以上の牽引変形を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、１を超える膨張比を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、１．１を超える膨張比を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、１．２以上の膨張比を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、１．３以上の膨張比を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、１．４以上の膨張比を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、１．５以上の膨張比を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、１．６以上の膨張比を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、５以下の膨張比を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、４以下の膨張比を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、３以下の膨張比を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、２．８以下の膨張比を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、少なくとも８０重量％の水分含有量を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、少なくとも８５重量％の水分含有量を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、少なくとも９０重量％の水分含有量を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、少なくとも９７重量％の水分含有量を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、少なくとも９６重量％の水分含有量を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、少なくとも９５重量％の水分含有量を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、少なくとも９４重量％の水分含有量を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、少なくとも９３重量％の水分含有量を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、最大９９重量％の水分含有量を有する。

一実施形態において、ヒドロゲルは、最大９８重量％の水分含有量を有する。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、生体細胞を更に含むことを特徴とする。

一実施形態において、細胞は、ヒト又は動物由来の細胞である。

一実施形態において、細胞は、細胞株である。

一実施形態において、細胞は、幹細胞由来である。

一実施形態において、幹細胞は、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、又は間葉系幹細胞から選択される。

一実施形態において、細胞は初代細胞である。

一実施形態において、細胞は、タンパク質、ホルモン、又はペプチド分泌細胞である。

一実施形態において、細胞は、
－糖尿病治療のためのインスリン分泌細胞、
－血友病治療のための第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子分泌細胞、並びに
－ゴーシェ病のためのβ－グルコセレブロシダーゼ分泌細胞、から選択される。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、インスリン分泌細胞が膵臓細胞の群に選択されることを特徴とする。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、インスリン分泌細胞がランゲラン島であることを特徴とする。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、生体細胞が疑似膵島であることを特徴とする。

本発明はまた、本発明に従う架橋デキストランコポリマーの、細胞組成物を調製するためのヒドロゲルの形態への使用に関する。

一実施形態において、細胞は、単離又は凝集したのいずれかの１つ又は複数のタイプの細胞の中から選択され、活性原理を分泌し得る。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、カルボキシレート基を有するデキストランポリマーであり、少なくとも二価のラジカルＬ（－）_ｉは、ｉ－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－_－ラジカルでデキストランポリマー骨格に共有結合し、ここでｉは２、４、又は８である。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、カルボキシレート基を有するデキストランポリマーであり、ここで、少なくとも二価のラジカルＬ（－）_ｉは、ｉ －（Ｒ_１）_ｍＧ_１－_－ラジカルでデキストランポリマー骨格に共有結合し、ここで、ｉは２である。

一実施形態において、本発明に従う架橋デキストランポリマーは、カルボキシレート基を有するデキストランポリマーであり、少なくとも二価のラジカルＬ（－）_ｉは、ｉ－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－_－ラジカルでデキストランポリマー骨格に共有結合し、式中、ｉは４である。

本発明はまた、－（Ｒ_１）_ｍＧ_２一価ラジカルに共有結合したカルボキシレート基を有するデキストランポリマーであり、ラジカル－Ｇ_１－の前駆体である－Ｇ_２はＭｉｃｈａｅｌ受容体である架橋デキストランポリマーの前駆体に関する。

一実施形態において、前駆体は、－Ｇ_２が、マレイミド若しくはビニルスルホン、又はマレイミド若しくはビニルスルホンを含む基の中から選択される、上記に定義される架橋デキストランポリマーである。

一実施形態において、前駆体は、－Ｇ_２がマレイミドである、上記に定義される架橋デキストランポリマーである。

本発明はまた、カルボキシレート基及び少なくとも１つの－（Ｒ_１）_ｍＧ_２置換基を有するデキストランを合成するプロセスに関し、
（－式中、Ｍｉｃｈａｅｌ受容体であり、－Ｇ_１の前駆体である－Ｇ_２は、１～６個の炭素原子を含む直鎖又は分岐又は環状アルキル一価ラジカルの中から選択され、酸素、窒素又は硫黄等のヘテロ原子を含んでよく）
－Ｒ_１は上記のように定義される）
以下のステップを含む：
ａ）カルボキシレート基を有するデキストランの溶液の調製、
ｂ）カルボキシレート基のヒドロキシルの－（Ｒ_１）_ｍＧ_２での置換。

一実施形態において、本発明に従う、カルボキシレート基及び少なくとも１つの－（Ｒ_１）_ｍＧ_２置換基を有するデキストランは、－Ｇ_２が、マレイミド若しくはビニルスルホン、又はマレイミド若しくはビニルスルホンを含む基の中から選択されるデキストランポリマーである。

特定の実施形態において、カルボキシレート基及び少なくとも１つの－（Ｒ_１）_ｍＧ_２置換基を有するデキストランは、リンカーＬ（－）_ｉの前駆体と架橋される。

架橋ステップは、カルボキシレート基及び少なくとも１つの－（Ｒ_１）_ｍＧ_２置換基を有するデキストランを含む溶液と、リンカーＬ（－）_ｉの前駆体の溶液とを混合することによって行われる。

一実施形態において、リンカーＬ（－）_ｉの前駆体は、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応においてビニルスルホン又はマレイミド基を含む－（Ｒ_１）_ｍＧ_２基と反応して、本発明の架橋デキストランポリマーを得る官能基、すなわち－ＳＨ基を有する。

一実施形態において、架橋ステップは、デキストランカルボキシレートの前駆体の１～１５０ｍＭ、好ましくは１０～１００ｍＭの反応性官能基－（Ｒ_１）_ｍＧ_２を含む溶液を用いて行われる。

一実施形態において、架橋ステップは、１～１５０ｍＭ、好ましくは１０～１００ｍＭのリンカーＬ（－）_ｉの前駆体の反応性官能基を含む溶液を用いて行われる。

一実施形態において、架橋ステップでは、反応性官能基－（Ｒ_１）_ｍＧ_２を有するデキストランポリマー前駆体の溶液及びリンカーＬ（－）_ｉ前駆体の溶液は、等モル比（１：１）で使用される。

一実施形態において、反応性官能基－（Ｒ_１）_ｍＧ_２とＬ（－）_ｉの前駆体の反応性官能基との比は、０．８～１．２からなる。

一実施形態において、反応性官能基－（Ｒ_１）_ｍＧ_２とＬ（－）_ｉの前駆体の反応性官能基との比は、０．９～１．１からなる。

一実施形態において、反応性官能基－（Ｒ_１）_ｍＧ_２とＬ（－）_ｉの前駆体の反応性官能基との比は１である。

架橋ステップは、本発明に従うヒドロゲルの形成につながるゲル化ステップである。

ヒドロゲル形成速度論は温度の関数であり、反応物の濃度、ｐＨ及び温度によって調節することができる。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルを得る時間は、１分～６時間からなる。

一実施形態において、架橋ステップを１時間実施する。

一実施形態において、架橋ステップの温度は、４℃～室温（２０～２５℃）からなり、混合ステップとゲル化及び成形ステップとの間で変化し得る。

一実施形態において、混合は４℃で実施され、ゲル化は室温（２０～２５℃）で１時間行われる。

一実施形態において、混合は、室温（２０～２５℃）で行われる。

一実施形態において、混合は４℃又は室温（２０～２５℃）で行われ、ゲル化は室温（２０～２５℃）で１時間実施される。

一実施形態において、ゲル化は、３７℃で実施される。

一実施形態において、架橋又はゲル化後、ヒドロゲルを緩衝液中に膨潤し、緩衝液のｐＨは、５～８、好ましくは６～８、より好ましくは６．８～７．５からなる。

一実施形態において、緩衝液は、ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液である。

一実施形態において、緩衝液は、ｐＨ７．４のＴｒｉｓ溶液である。

一実施形態において、緩衝液は、ｐＨ８でのＴｒｉｓ溶液である。

一実施形態において、膨張は、ヒドロゲル質量を、その初期質量と比較して、１、２、３又は４増加させることを可能にする。

本発明はまた、以下のステップを含む、本発明に従う架橋デキストランポリマーをヒドロゲルの形態に合成するプロセスに関する：
ａ）式Ｉに従うメチルカルボキシレート基を有するデキストラン、及び少なくとも２つの－（Ｒ_１）_ｍＧ_２ラジカルを含む滅菌溶液を調製するステップと、
ｂ）式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ'、ＶＩＩ又はＶＩＩ'によるメルカプトポリエチレングリコール又はメルカプトエチルポリオキシエチレンの滅菌溶液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂから得られた滅菌溶液をステップａから得られた溶液に添加するステップと、
ｄ）添加がモールド内で直接行われるか、又は溶液が混合された後にモールド内に導入されるステップと、
ｅ）例えば室温（２０～２５℃）又は３７℃でのＭｉｃｈａｅｌ反応による架橋及びゲル化するステップと、
ｆ）ヒドロゲルを得るために成形を取り外し、膨張させるステップ。

一実施形態において、ステップｃ）及びｄ）は、同時に行われる。

一実施形態において、膨潤は、ｐＨ７，４でＰＢＳ溶液中にて行われる。

本発明に従うプロセスの一実施形態において、活性医薬成分（ＡＰＩ）が、ヒドロゲル内に捕捉される。

本発明はまた、哺乳動物にＡＰＩを投与するための治療用埋込物としての本発明に従うヒドロゲルの治療的使用に関する。

本発明はまた、以下のステップを含む、生体細胞を含むヒドロゲルを調製するプロセスに関する：
ａ）式Ｉに従うカルボキシレート基を有するデキストラン、及び少なくとも２つの－（Ｒ_１）_ｍＧ_２ラジカルを含む滅菌溶液を調製するステップと、
ｂ）式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ'、ＶＩＩ又はＶＩＩ'によるメルカプトポリエチレングリコール又はメルカプトエチルポリオキシエチレンの滅菌溶液を調製するステップと、
ｃ）生体細胞の懸濁液の調製するステップと、
ｄ）ステップｃから得られた生体細胞懸濁液と、ステップｂ又はａから得られた溶液とを混合するステップと、
ｅ）ステップｄで使用されないステップａ又はｂから得られた滅菌溶液を、ステップｄから得られた溶液に添加するステップと、
ｆ）ステップｅの添加がモールド内で直接行われるか、又は溶液が混合された後にモールド内に導入されるステップのいずれかと、
ｇ）室温（２０～２５℃）でのＭｉｃｈａｅｌ反応による架橋及びゲル化するステップと、
ｈ）生体細胞を含むヒドロゲルを得るために成形を取り外し、膨潤させるステップ。

一実施形態において、膨潤は、ｐＨ７，４でＰＢＳ溶液中にて行われる。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、生体細胞を更に含むことを特徴とする。

一実施形態において、細胞は、ヒト又は動物由来の細胞である。

一実施形態において、細胞は、細胞株である。

一実施形態において、細胞は、幹細胞由来である。

一実施形態において、幹細胞は、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、又は間葉系幹細胞から選択される。

一実施形態において、細胞は初代細胞である。

一実施形態において、細胞は、タンパク質、ホルモン又はペプチド分泌細胞である。

一実施形態において、細胞は、
－糖尿病治療のためのインスリン分泌細胞、
－血友病治療のための第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子分泌細胞、並びに
－ゴーシェ病のためのβ－グルコセレブロシダーゼ分泌細胞、から選択される。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、インスリン分泌細胞が膵臓細胞の群に選択されることを特徴とする。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、インスリン分泌細胞がランゲラン島であることを特徴とする。

一実施形態において、本発明に従うヒドロゲルは、生体細胞が疑似膵島であることを特徴とする。

本発明はまた、哺乳動物における障害又は疾患を治療するための本発明に従うヒドロゲルの治療的使用に関するものであり、この障害又は疾患は、膵臓器官の内分泌機能の欠如又は機能不全によるものである。

本発明はまた、薬剤として使用するためのヒドロゲルに関する。

本発明はまた、糖尿病等の疾患の治療に使用されるヒドロゲルに関する。

本発明はまた、本発明に従い、本発明の方法に従って得られる少なくともヒドロゲルを含む埋め込み可能なデバイスに関する。

本発明はまた、本発明に従うヒドロゲルからなる埋込物に関する。

本発明はまた、本発明に従うヒドロゲルを含む埋込物に関する。

一実施形態において、ヒドロゲルの表面の少なくとも５０％は、それが埋め込みされる媒体と直接接触する。

一実施形態において、ヒドロゲルの表面の少なくとも７５％は、それが埋め込みされる媒体と直接接触する。

一実施形態において、ヒドロゲルの表面の少なくとも９０％は、それが埋め込みされる媒体と直接接触する。

一実施形態において、ヒドロゲルの表面の少なくとも９５％は、それが埋め込みされる媒体と直接接触する。

一実施形態において、ヒドロゲルの表面の少なくとも９９％は、それが埋め込みされる媒体と直接接触する。

一実施形態において、ヒドロゲルの表面の少なくとも５０％は、デバイス又は埋込物の外部と直接接触している。

＜＜外部と直接接触する＞＞ことにより、ヒドロゲルと外部との間に分離はなく、例えば、ヒドロゲルとデバイス又は埋込物の外部との間に非ヒドロゲル材料で作られた壁はない。

一実施形態において、ヒドロゲルの表面の少なくとも７５％は、デバイス又は埋込物の外部と直接接触している。

一実施形態において、ヒドロゲルの表面の少なくとも９０％は、デバイス又は埋込物の外部と直接接触している。

一実施形態において、ヒドロゲルの表面の少なくとも９５％は、デバイス又は埋込物の外部と直接接触している。

一実施形態において、ヒドロゲルの表面の少なくとも９９％は、デバイス又は埋込物の外部と直接接触している。

一実施形態において、ヒドロゲルの表面の１００％は、デバイス又は埋込物の外部と直接接触する。

細胞又はＡＰＩは、架橋デキストランヒドロゲルの迷路に閉じ込められる。

本明細書では、単語「捕捉された」は、「カプセル化された」又は「カプセル化」と同等である。

ヒドロゲルマトリックスは、小分子、例えば、栄養素及びＡＰＩの通過を可能にし、ＡＰＩは、ヒドロゲルに捕捉されるか、又は捕捉された細胞によって分泌される。

典型的には、ＡＰＩは、ＰＴＨタンパク質、インスリン及び凝固因子の中から選択されるホルモン及びペプチド薬物である。

一実施形態において、マトリックスのメッシュサイズは、免疫隔離のものであり、細胞を保存するためにＴリンパ球を停止させる。

一実施形態において、このメッシュサイズは、１μｍ未満である。

別の実施形態において、１００ナノメートル未満、好ましくは１０ナノメートル未満、及びより好ましくは約５ナノメートルである。

パートＡ－化学
実施例Ａ１：置換デキストランメチルカルボキシレート－マレイミド（ＤＭＣＭａｌ）及びデキストランメチルカルボキシレート－ビニルスルホン（ＤＭＣＶＳ）の合成

多糖類ＤＭＣＭａｌ－１
多糖類ＤＭＣ－１：
４０ｋｇ／ｍｏｌの重量平均モル質量を有するデキストラン６５ｇ（０．４ｍｏｌのグルコシド単位、ヒドロキシル官能基１．２ｍｏｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ、重合度ｎ＝２０５）を水（２８５ｇ／Ｌ）に３０℃で溶解し、ＮａＢＨ_４（７４ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を加え、３０℃で２時間撹拌する。この溶液にクロロ酢酸ナトリウム（１４０ｇ、１．２ｍｏｌ）を加え、混合物を６５℃で１時間加熱する。次いで、１０ＮのＮａＯＨ（２００ｍＬ、２ｍｏｌ）を１．５時間かけてゆっくりと添加し、混合物を６５℃で１時間撹拌する。混合物を水（１２０ｍＬ）で希釈し、室温に冷却し、酢酸で中和し、次いで、リン酸緩衝液ｐＨ７に対してＰＥＳ膜（ＭＷＣＯ ５ｋＤａ）上での限外濾過によって精製し、次いで水で濾過した。最終溶液の多糖類ＤＭＣ－１濃度は、乾燥抽出物によって決定され、次いで、カルボン酸メチルでの置換度を決定するために、酸／塩基アッセイが実施される。

乾燥抽出物によれば、［多糖類ＤＭＣ－１］＝５０．６ｍｇ／ｇである

酸／塩基アッセイによれば、メチルカルボキシレートでの置換度（ＤＳ_２）＝１．２である

多糖類ＤＭＣＭａｌ－１：
上記で得られた多糖類ＤＭＣ－１溶液１５８ｇ（５０．６ｍｇ／ｇ、ＤＳ_２＝１．２、多糖類ＤＭＣ－１ １０．０ｇ、３８．７３ｍｍｏｌのグルコシド単位）に、２－ヒドロキシピリジン１－オキシド（ＨＯＰＯ）（４．３０ｇ、３８．７３ｍｍｏｌ）を加え、４℃まで冷却した。この溶液に、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミド塩酸塩（Ｍａｌ）（２．０５ｇ、１１．６２ｍｍｏｌ）、Ｅｔ_３Ｎ（１．６２ｍＬ、１１．６２ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－Ｎ'－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（７．４２ｇ、３８．７３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を４℃で４時間撹拌する。２つの追加の添加のＥＤＣ（７．４２ｇ、３８．７３ｍｍｏｌ）を４時間ごとに処理する。混合物をリン酸緩衝液ｐＨ７で希釈し、次いで、ＰＥＳ膜（ＭＷＣＯ ５ｋＤａ）上で、水中リン酸緩衝液ｐＨ７、ＮａＣｌ（９ｇ／Ｌ）に対して、次いで水中で限外濾過することによって精製する。最終溶液の多糖類ＤＭＣＭａｌ－１濃度は、乾燥抽出物によって決定され、マレイミドでの置換度は、Ｄ_２Ｏ中の^１Ｈ ＮＭＲによって決定される。最終溶液を－２０℃で保管するか、凍結乾燥させて保管する。

乾燥抽出物によれば、［多糖類ＤＭＣＭａｌ－１］＝１８．０ｍｇ／ｇである

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）によれば、マレイミドでの置換度（ＤＳ_１）＝０．２４である

多糖類ＤＭＣＭａｌ－２
多糖類ＤＭＣ－２：
凍結乾燥多糖類ＤＭＣ－１ ９０ｇ（０．３５ｍｏｌのグルコシド単位）を水（２６０ｇ／Ｌ）に６５℃で溶解し、次いでクロロ酢酸ナトリウム（２０４ｇ、１．７５ｍｏｌ）を添加し、混合物を６５℃で１時間維持する。次いで、１０ＮのＮａＯＨ（１７５ｍＬ、１．７５ｍｏｌ）を１時間かけてゆっくりと添加し、混合物を６５℃で更に１時間撹拌する。次いで、クロロ酢酸ナトリウム（１２２ｇ、１．０５ｍｏｌ）の別の部分を添加し、混合物を６５℃で０．５時間維持する。次いで、１０ＮのＮａＯＨ（１０５ｍＬ、１．０５ｍｏｌ）を１時間かけてゆっくりと添加し、混合物を６５℃で更に１時間撹拌する。混合物を水で希釈し、室温に冷却し、酢酸で中和し、次いで、リン酸緩衝液ｐＨ７に対してＰＥＳ膜（ＭＷＣＯ ５ｋＤａ）上での限外濾過によって精製し、次いで水で精製した。最終溶液の多糖類ＤＭＣ－２濃度は、乾燥抽出物によって決定され、次いで、カルボン酸メチルでの置換度を決定するために、酸／塩基アッセイが実施される。

乾燥抽出物によれば、［多糖類ＤＭＣ－２］＝４８．８ｍｇ／ｇである

酸／塩基アッセイによれば、メチルカルボキシレートでの置換度（ＤＳ_２）＝２．２５である

多糖類ＤＭＣＭａｌ－２：
多糖類ＤＭＣＭａｌ－１の調製に使用されるものと同様のプロセスを使用して、多糖類ＤＭＣ－２（４８．８ｍｇ／ｇ、ＤＳ_２＝２．２５、１０．０ｇ、２９．２２ｍｍｏｌのグルコシド単位）及びＮ－（２－アミノエチル）マレイミド塩酸塩（１．５５ｇ、８．７７ｍｍｏｌ）から開始して、多糖類ＤＭＣＭａｌ－２を得る。

乾燥抽出物によれば、［多糖類ＤＭＣＭａｌ－２］＝１７．９ｍｇ／ｇである

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）によれば、マレイミドでの置換度（ＤＳ_１）＝０．２４である。

多糖類ＤＭＣＭａｌ－３
多糖類ＤＭＣ－３：
多糖類ＤＭＣ－１の調製に使用されるものと同様のプロセスを使用して、５００ｋｇ／ｍｏｌの重量平均モル質量を有するデキストランから出発して、多糖類ＤＭＣ－３を得た。

乾燥抽出物によれば、［多糖類ＤＭＣ－３］＝３４．３ｍｇ／ｇである

酸／塩基アッセイによれば、メチルカルボキシレートでの置換度（ＤＳ_２）＝１．０である

多糖類ＤＭＣＭａｌ－３：
多糖類ＤＭＣＭａｌ－１の調製に使用されるものと同様のプロセスを使用して、多糖類ＤＭＣ－３（３４．３ｍｇ／ｇ、ＤＳ_２＝１．０、１０．０ｇ、４１．２９ｍｍｏｌのグルコシド単位）及びＮ－（２－アミノエチル）マレイミド塩酸塩（２．１９ｇ、１２．３９ｍｍｏｌ）から開始して、多糖類ＤＭＣＭａｌ－３を得た。

乾燥抽出物によれば、［多糖類ＤＭＣＭａｌ－３］＝１２．０ｍｇ／ｇである

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）によれば、マレイミドでの置換度（ＤＳ_１）＝０．２５である

多糖類ＤＭＣＭａｌ－４
多糖類ＤＭＣＭａｌ－１の調製に使用されるものと同様のプロセスを使用して、多糖類ＤＭＣ－３（３４．３ｍｇ／ｇ、ＤＳ_２＝１．０、１０．０ｇ、４１．２９ｍｍｏｌのグルコシド単位）及びＮ－（２－アミノエチル）マレイミド塩酸塩（７２９ｍｇ、４．１３ｍｍｏｌ）から開始して、多糖類ＤＭＣＭａｌ－４を得た。

乾燥抽出物によれば、［多糖類ＤＭＣＭａｌ－４］＝１８．０ｍｇ／ｇである

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）によれば、マレイミドでの置換度（ＤＳ_１）＝０．０９である。

多糖類ＤＭＣＭａｌ－５
多糖類ＤＭＣ－５：
多糖類ＤＭＣ－２の調製に使用されるものと同様の方法を使用して、２５０ｋｇ／ｍｏｌの重量平均モル質量を有するデキストランから出発して、多糖類ＤＭＣ－５を得た。

乾燥抽出物によれば、［多糖類ＤＭＣ－５］＝４７．６ｍｇ／ｇである

酸／塩基アッセイによれば、メチルカルボキシレートでの置換度（ＤＳ_２）＝２．０である

多糖類ＤＭＣＭａｌ－５：
多糖類ＤＭＣＭａｌ－１の調製に使用されるものと同様のプロセスを使用して、多糖類ＤＭＣ－５（４７．６ｍｇ／ｇ、ＤＳ_２＝２．０、１０．３ｇ、３１．９８ｍｍｏｌのグルコシド単位）及びＮ－（２－アミノエチル）マレイミド塩酸塩（１．６９ｇ、９．５９ｍｍｏｌ）から開始して、多糖類ＤＭＣＭａｌ－５を得る。

乾燥抽出物によれば、［多糖類ＤＭＣＭａｌ－５］＝１８．３ｍｇ／ｇである

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）によれば、マレイミドでの置換度（ＤＳ_１）＝０．２５である

多糖類ＤＭＣＶＳ－１
多糖類ＤＭＣ－２溶液２０５ｇ（４８．８ｍｇ／ｇ、ＤＳ_２＝２．２５、１０．０ｇの多糖類ＤＭＣ－２、２９．２２ｍｍｏｌのグルコシド単位）に、２－ヒドロキシピリジン１－オキシド（ＨＯＰＯ）（３．２５ｇ、２９．２２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を４℃に冷却する。この溶液に、２－［［２－（エテニルスルホニル）エチル］チオ］エタンアミン塩酸塩（ＶＳ）（２．０３ｇ、８．７７ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（１．８_３ｍＬ、１３．１５ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－Ｎ'－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（５．６０ｇ、２９．２２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を４℃で４時間撹拌する。２つの追加の添加のＥＤＣ（５．６０ｇ、２９．２２ｍｍｏｌ）を４時間ごとに処理する。混合物を炭酸緩衝液ｐＨ９～１０で希釈し、３時間撹拌した後、ＰＥＳ膜（ＭＷＣＯ ５ｋＤａ）上で、炭酸緩衝液ｐＨ９～１０、水中のＮａＣｌ（９ｇ／Ｌ）、リン酸緩衝液ｐＨ７、水中のＮａＣｌ（９ｇ／Ｌ）、及び次に水に対する限外濾過によって精製する。最終溶液の多糖類ＤＭＣＶＳ－１濃度は、乾燥抽出物によって決定され、ビニルスルホンでの置換度は、Ｄ_２Ｏ中の^１Ｈ ＮＭＲによって決定される。最終溶液を－２０℃で保管するか、凍結乾燥させて保管する。

乾燥抽出物によれば、［多糖類ＤＭＣＶＳ－１］＝２０．７ｍｇ／ｇである

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）によれば、ビニルスルホンでの置換度（ＤＳ_１）＝０．２５である

実施例Ａ２：少なくとも２つのチオール官能基を含むポリエチレングリコール誘導体（本明細書では「ＰＥＧ－ＳＨ」と称される）
チオール（ＳＨ）基で官能化された市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体を購入した。異なる分子量を有する線形ホモ二官能性ＰＥＧ－ＳＨ及び多アームホモ官能性ＰＥＧ－ＳＨを使用し、次の表２に示す。

比較実施例Ａ３多糖類デキストランマレイミド（ＤｅｘｔｒａｎＭａｌ Ａ３）
マレイミド（Ｍａｌ）基で官能化された商業用デキストラン誘導体は、Ｃｅｌｌｅｎｄｅｓから購入した。生成物は、３０ｍｍｏｌ／Ｌ及び１３０ｍｇ／ｍＬのポリマー（再構成後の濃度）のマレイミド官能基濃度を有する、１７０μＬ（再構成後の体積）のデキストラン－Ｍａｌを含有するキットである。供給者によると、マレイミドでの置換度は０．０４６であった。

パートＢ－生物学
実施例Ｂ１：疑似膵島の調製
ベータ－ＴＣ－ｔｅｔ細胞株（ＡＴＣＣ）又はＭｉｎ－６細胞株（Ｃａｌｔａｇ Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）を、表３に示される培養培地中、３７℃及び５％ＣＯ_２のインキュベーター中で培養した。細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて週３回再培養して細胞を分離し、培養培地中で５回希釈した。

平均直径１５０μｍの疑似膵島を、Ｍｉｃｒｏｔｉｓｓｕｅ（登録商標）テンプレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で形成されたアガロース３００μｍマイクロウェルモールドを使用するベータ－ＴＣ－ｔｅｔ細胞株を使用して、マイクロウェル当たり２００個の細胞を播種し、３７℃及び５％ＣＯ_２で３日間インキュベートすることによって形成した。次いで、疑似膵島を収集し、遠心分離によって濃縮し、最終的に０．９％のＮａＣｌ中に懸濁した。

平均直径１５０μｍの疑似膵島を、４００μｍマイクロウェルＥｐｌａｓｉａプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用するＭｉｎ－６細胞株を使用して、マイクロウェルあたり５００個の細胞を播種し、３７℃及び５％ＣＯ_２で３日間インキュベートすることによって形成した。次いで、疑似膵島を収集し、遠心分離によって濃縮し、最終的に０．９％のＮａＣｌ中に懸濁した。

実施例Ｂ２：初代ヒト膵島の分離
膵臓は、ヒト脳死ドナーから得た。膵島を、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｐａｔｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｃｈｉｒ ２００５．に記載の方法に従って調製した。簡潔に述べると、膵臓を組織から単離し、膵島の放出を確実にするために、コラゲナーゼＩ及びＩＩの混合物（Ｌｉｂｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ、フランス）を消化のためにＷｉｒｓｕｎｇ ｃａｎａｌに洗い流した。次いで、密度勾配遠心分離（ＥｕｒｏＦｉｃｏｌｌ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を使用して膵島を精製した。精製した島を最終的に、以下の培地のいずれかで、５％ＣＯ２下で３７℃で培養フラスコ内で培養した。
●培地１：０．１％ＢＳＡを添加したＣＭＲＬ培地（Ｇｉｂｃｏ）。
●培地２：０．６２５％ＢＳＡ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＣＭＲＬ培地
培養培地を２～３日ごとに交換した。

実施例Ｂ３：初代ラット膵島単離
膵島を雄Ｗｉｓｔａｒラット（近似体重：３００ｇ）から単離し、Ａ Ｐｒａｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｒｏｄｅｎｔ Ｉｓｌｅｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ｏｎｌｉｎｅ ２００９．に記載されているのと同様の方法に従って行った。

簡潔に述べると、膵臓は、総胆管を介して注入されたコラゲナーゼを洗い流した。洗い流し後、膵臓を切除し、消化を３７℃で１０分間行った。次いで、膵島を密度勾配遠心分離によって精製した。精製された膵島を、３７℃及び５％ＣＯ２で１０％のウシ胎児血清、２ｇ／Ｌのグルコース及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中の非接着培養フラスコ中で培養した。培養培地を２～３日ごとに交換した。

実施例Ｂ４：膵島換算カウント
各実験で使用される膵島の量を正規化するために、膵島又は疑似膵島をカウントして、膵島等価数（ＩＥＱ）を決定した。１つのＩＥＱは、直径１５０μｍの完全に球形の膵島の体積に相当する。カウント中に、そのサイズに応じて各膵島に乗算係数が適用された。膵島の直径の変化に対するこの数学的補償は、膵島調製物間の正規化を可能にする（ＮＩＨ ＣＩＴ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ； Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｓｌｅｔ：Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｓｌｅｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｄｉｔｈｉｚｏｎｅ （ＤＴＺ）：Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＮＩＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｓｌｅｔ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．ＣｅｌｌＲ４ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｐｌａｃｅ Ｒｅｇｅｎ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍを参照されたい）。

各膵島又は疑似膵島バッチからの２つの５０μＬの試料を、５０μｍのグリッドを有するガラススライド上でカウントした。膵島又は疑似膵島を、表４に従ってサイズによって分類した。

島当量カウントは、２つの独立した試料からのカウント結果を平均することによって決定した。

パートＣ－物理化学
実施例Ｃ１：濃縮多糖類ＤＭＣＭａｌの溶液の調製
パートＡ１に従って得られた滅菌凍結乾燥多糖類の適切な重量を量り、滅菌脱イオン水の適切な重量を添加することにより、濃縮多糖類溶液を調製した。この溶液を軌道シェーカー上に７０ｒｐｍで一晩置き、完全な可溶化を行った。濃縮ＨＣｌ（４ｍｏｌ／Ｌ）を添加することにより、溶液のｐＨをｐＨ３、ｐＨ４又はｐＨ５に調整した。多糖類ＤＭＣＭａｌ溶液の質量濃度（ｍｇ／ｇ）を、乾燥精度によって決定した。多糖類ＤＭＣＭａｌ（ｍｇ／ｍＬ）の溶液の体積濃度を、１００μＬの溶液を３回秤量する密度測定によって決定した。この溶液を－２０℃で使用するまで凍結した。

実施例Ｃ１Ａ：濃縮多糖類ＤＭＣＶＳの溶液の調製
パートＡ１に従って得られた滅菌凍結乾燥多糖類の適切な重量を量り、滅菌脱イオン水の適切な重量を添加することにより、濃縮多糖類溶液を調製した。この溶液を軌道シェーカー上に７０ｒｐｍで一晩置き、完全な可溶化を行った。ＮａＯＨを添加することにより、溶液のｐＨをｐＨ７．４に調整した。多糖類ＤＭＣＶＳ溶液の質量濃度（ｍｇ／ｇ）を乾燥抽出物によって決定した。多糖類ＤＭＣＶＳ溶液の体積濃度（ｍｇ／ｍＬ）を、１００μＬの溶液を３回秤量する密度測定によって決定した。この溶液を－２０℃で使用するまで凍結した。

実施例Ｃ２：濃縮ＰＥＧ－ＳＨ溶液の調製
適切な重量のＰＥＧ－ＳＨ粉末を計量し、適切な重量の滅菌脱イオン水を添加することによって、ＰＥＧ－ＳＨの濃縮溶液（表２によるリストから）を調製した。滅菌濾過（０．２２μｍ）前に、この溶液を１５ｒｐｍで２時間ローラーシェーカー上に置いて完全に可溶化した。ＰＥＧ－ＳＨ溶液の質量濃度（ｍｇ／ｇ）を、乾燥抽出物によって決定した。ＰＥＧ－ＳＨ溶液（ｍｇ／ｍＬ）の体積濃度を、密度測定によって決定し、１００μＬの溶液を３回秤量した。この溶液を－２０℃で使用するまで凍結した。

実施例Ｃ３：ヒドロゲル調製－１
ヒドロゲルの調製は、無菌環境下で行った。

実施例Ｃ１及びＣ２に従ってそれぞれ調製した多糖類ＤＭＣＭａｌ及びＰＥＧ－ＳＨ濃縮滅菌溶液を、室温（２０～２５℃）又は４℃のいずれかで平衡化した。

２２５μＬのＰＥＧ－ＳＨ濃縮溶液を、２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ中の２２５μＬの多糖ＤＭＣＭａｌ濃縮溶液に添加した。溶液をピペットで混合し、２００μＬの混合物を長方形のシリコーンモールド（ＩＢＩＤＩ １２×７．７５ｍｍ）に導入した。ゲル化を、室温（２０～２５℃）で１時間実施した。ヒドロゲルを成形から取り外し、１０ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液中に、ｐＨ７．４で２時間、３７℃で導入した。任意選択で、ＰＢＳ溶液は、１０ｍＭのシステインを含有する。ヒドロゲルをシステインを含まない１０ｍＬのＰＢＳ溶液ですすぎ、更に３７℃で２０ｍＬのＰＢＳ溶液に一晩浸漬した。次いで、ヒドロゲル片を、使用するまで４℃で１０ｍＬのＰＢＳ溶液中に保管した。

実施例Ｃ３Ａ：ヒドロゲル調製－２
ヒドロゲルの調製は、無菌環境で行った。

それぞれ実施例Ｃ１又はＣ１Ａ及び実施例Ｃ２に従って調製した多糖類ＤＭＣＭａｌ又はＤＭＣＶＳ及びＰＥＧ－ＳＨ濃縮滅菌溶液を濃縮ＮａＣｌ溶液で調整して等張性ストック溶液（３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）を得、室温（２０～２５℃）又は４℃で平衡化した。任意選択で、ＤＭＣＶＳ濃縮溶液を、ｐＨ７，４又はｐＨ８のｔｒｉｓ緩衝液によって補充した。

ＰＥＧ－ＳＨの濃縮溶液２０μＬを、２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ中の多糖類ＤＭＣＭａｌ又はＤＭＣＶＳの濃縮溶液２０μＬに添加した。溶液をピペットと混合し、制御された体積の混合物（３２μＬ）を、ガラススライドに接着する円形シリコーンアイソレーター（９ｍｍ直径／０．５ｍｍ厚、Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏｌａｂから）に導入した。

ゲル化を、室温（２０～２５℃）又は３７℃で１時間実施した。ヒドロゲルを成形から取り外し、Ｔｒｉｓ１５０ｍＭ／ＮａＣｌ３０ｍＭ／システイン１０ｍＭ溶液（２ｍＬ）中で、ｐＨ８で１時間１５分の間、３７℃で導入した。ヒドロゲルをシステインを含まない２０ｍＬのＰＢＳ溶液ですすぎ、更に３７℃で１０ｍＬのＰＢＳ溶液に一晩浸漬した。次いで、ヒドロゲル片を、使用するまで４℃で１０ｍＬのＰＢＳ溶液中に保管した。

実施例Ｃ４：ヒドロゲル組成物－１
異なるヒドロゲル組成物を、実施例Ｃ３（表３）に記載のプロトコルに従って調製した。反応性基（マレイミド（Ｍａｌ）及びチオール（ＳＨ））並びにポリマー（多糖類ＤＭＣＭａｌ及びＰＥＧ－ＳＨ）の濃度は、ポリマー溶液の混合時の最終濃度に対応する。

固体の長方形のヒドロゲル片を得た。１２×７．７５×２．１ｍｍのヒドロゲル片を容易に成形から取り外し、特性評価のためにピンセットで取り扱った。

実施例Ｃ４Ａ：ヒドロゲル組成物－２
異なるヒドロゲル組成物を、実施例Ｃ３Ａ（表３）に記載のプロトコルに従って調製した。反応性基（マレイミド（Ｍａｌ）又はビニルスルホン（ＶＳ）及びチオール（ＳＨ））及びポリマー（多糖類ＤＭＣＭａｌ又はＤＭＣＶＳ及びＰＥＧ－ＳＨ）の濃度は、ポリマー溶液の混合時の最終濃度に対応する。

固体円盤状のヒドロゲル片を得た。ヒドロゲル片（直径９ｍｍ／厚さ０．５ｍｍ）を容易に成形から取り外し、特性評価のためにピンセットで取り扱った。

実施例Ｃ４'：ヒドロゲルのレオロジー的特性評価
コーンプレート形状を備えた回転レオメータ（ＡＲ２０００、ＴＡ器具）を用いて振動せん断試験を実施した。ゲル化を「インサイチュ」で行った。すなわち、振動測定を開始する前に、コーン１とプレートとの間に多糖類及びＰＥＧ濃縮溶液の滴を導入し、幾何学的形状の回転によって混合した。振動時間スイープ試験は、２５℃又は３７℃で実施し、一定のひずみは０．１％、一定の振動周波数は１Ｈｚであった。貯蔵弾性率Ｇ'（すなわち、弾性係数）及びＴａｎδ（比Ｇ'／Ｇ''）値は、時間の関数として、（Ｇ'、Ｇ''）の測定値の平坦な領域において１６００秒で報告された。

ヒドロゲルは、固体弾性材料として挙動する化学的に架橋されたヒドロゲルの典型的な特性であるＧ''よりもＧ'がはるかに高かったことを意味するＴａｎδの値が低い（Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１６ Ｐａｎ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｐｔｅ．Ｌｔｄ．； Ｃｈａｐｔｅｒ ３，ｐａｇｅ ９７を参照されたい）。Ｍａｌ：ＳＨ中の濃度の増加は、弾性率Ｇ'の値の増加をもたらす。

温度及びｐＨを上げることは、ＤＭＣＶＳ及びＰＥＧ－ＳＨから調製されたヒドロゲルのゲル化を加速する２つの方法であった。例えば、中性ｐＨからｐＨ８に移行すること、及び／又は温度を２５℃から３７℃に上昇させることは、より速いゲル化をもたらす。

これは、高速ゲル化が細胞沈降を回避するのに有益であり得るのに対し、遅いゲル化がゲル化前のポリマーミックスをキャスティングするのに有益であり得るため、便利であり得るゲル化速度の微調整を可能にすることができる。

実施例Ｃ５：ヒドロゲルの膨張及び含水量
ヒドロゲル片を、ＰＢＳ溶液中での成形から取り外した直後（ｗ_０）及び一晩膨潤した後（ｗ_{ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ}）に計量した。膨張比を、ｗ_{ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ}／ｗ_０の質量比として定義した。膨潤状態におけるヒドロゲル質量の測定及びヒドロゲルを合成するために実施したポリマー前駆体濃度の制御から、ヒドロゲルの含水量を差し引いた。

ヒドロゲルは含水量が高い。水分含有量は、ポリマー前駆体の構造及び濃度によって変化する。

実施例Ｃ６：生理学的培地中３７℃でのヒドロゲル安定性
ヒドロゲル片をｐＨ７．４のＰＢＳ中又は３７℃の血清（ＦＢＳウシ胎児血清）中に保管し、異なる期間で計量した。

実施例Ｃ６－１及びＣ６－２では、１２×８×２．１ｍｍの長方形ヒドロゲル片を使用した。実施例では、直径９ｍｍ、厚さ１．６ｍｍのＣ６－３ディスク形状のヒドロゲルを試験した。

ヒドロゲルを無傷で回収し、その質量は生理学的媒体中で３７℃で貯蔵すると有意に進化しない。ヒドロゲルの膨張（質量増加）又は溶解（質量減少）は、例えば加水分解副反応の場合にネットワーク構造の変更の場合に予想される。これは、ヒドロゲルが生理学的条件下で安定していたことを示す。

実施例Ｃ７：ヒドロゲル内の巨大分子プローブのカプセル化
市販の蛍光デキストラン－ＦＩＴＣ ３ｋＤａ及びデキストラン－ＦＩＴＣ ７０ｋＤａをそれぞれ水に可溶化し、濃縮ストック溶液を得た。

実施例Ｃ１及びＣ２に従って調製した多糖類ＤＭＣＭａｌ及びＰＥＧ－ＳＨ濃縮滅菌溶液を、それぞれ４℃で平衡化した。ＤＭＣＶＳベースのヒドロゲルについては、実施例Ｃ１Ａ及びＣ２に従ってそれぞれ調製した多糖ＤＭＣＭａｌ及びＰＥＧ－ＳＨ濃縮溶液を２０～２５℃で平衡化した。

多糖類ＤＭＣＭａｌ又はＤＭＣＶＳの溶液を蛍光デキストランと混合した。ＰＥＧ－ＳＨの濃縮溶液１００μＬを、多糖類ＤＭＣＭａｌ又はＤＭＣＶＳ及び蛍光デキストランの濃縮溶液１００μＬに添加した。溶液をピペットで混合し、２００μＬの後者の混合物を長方形のシリコーンモールド（ＩＢＩＤＩ １２×７．７５ｍｍ）中に導入した。ＤＭＣＭａｌ系ヒドロゲルについては室温（２０～２５℃）で１時間、ＤＭＣＶＳ系ヒドロゲルについては３７℃で１時間、ゲル化を実施した。

ヒドロゲル片を成形から取り外し、ウェル（１２ウェルマルチプレート）に導入し、同じ濃度のカプセル化された蛍光デキストランを含有するｐＨ８で、１．３ｍＬのＴｒｉｓ（２００ｍＭ）／ＮａＣｌ（５０ｍＭ）の緩衝液を浸漬した。ヒドロゲル膨張を３７℃で一晩行い、上清を称量して、膨張の程度及びヒドロゲル体積中の量（ｍｇ）を推定した。

ヒドロゲルを、放出実験（実施例Ｃ８に示される）の前に、ｐＨ８のＴｒｉｓ（２００ｍＭ）／ＮａＣｌ（５０ｍＭ）の緩衝液１ｍＬで迅速に２回すすいだ。

実施例Ｃ８：ヒドロゲル内の巨大分子プローブの放出
実施例Ｃ７で作製したカプセル化蛍光プローブを有するヒドロゲルを、それぞれウェル（１２ウェルマルチプレート）に導入し、２ｍＬのＴｒｉｓ（２００ｍＭ）／ＮａＣｌ（５０ｍＭ）の緩衝液ｐＨ８で浸漬した。プレートをフィルムで覆い、３７℃のオーブンで導入した。２００μＬの緩衝液を異なる時点でサンプリングし、新鮮な緩衝液に置き換えた。検量線を使用して、試料中の蛍光プローブ濃度を蛍光（蛍光プレートリーダーＳＡＦＡＳ）によって決定した。各時点で放出される蛍光プローブの累積分画は、腫れたヒドロゲル中の初期量の蛍光プローブに対する放出される蛍光プローブの累積量の比率に対応する。

巨大分子プローブのサイズを大きくすると、放出の速度が遅くなる。これは、ヒドロゲルのネットワーク構造の選択透過性を示している。

実施例Ｃ９：ヒドロゲル中のベータ－ＴＣ－ｔｅｔ 疑似膵島のカプセル化
疑似膵島カプセル化を無菌環境下で行った。

それぞれ実施例Ｃ１及びＣ２に従って調製した多糖類ＤＭＣＭａｌ及びＰＥＧ－ＳＨ濃縮無菌溶液を濃縮ＮａＣｌ溶液で調整して等張ストック溶液（３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）を得た。溶液を室温（２０～２５℃）又は４℃のいずれかで平衡化した。

等量の等張ＰＥＧ－ＳＨ溶液と疑似膵島懸濁液（実施例Ｂ１に従って調製）を混合することにより、ＰＥＧ－ＳＨと疑似膵島の濃縮混合物を調製した。次いで、ＰＥＧ－ＳＨ及び疑似膵島を含有する混合物を、ピペットを使用して、等量の等張濃縮多糖類ＤＭＣＭａｌ溶液と穏やかに混合した。

多糖類ＤＭＣＭａｌ、ＰＥＧ－ＳＨ及び疑似膵島を含有する混合物を、長方形のシリコーンモールド（ＩＢＩＤＩ １２×７．７５ｍｍ）等のモールド又はマルチウェルプレート中に導入した。

ゲル化を、室温（２０～２５℃）で３０分間実施した。長方形のヒドロゲル片を成形から取り外し、マルチウェルプレートに導入した。マルチウェルプレートに形成されたゲルを室温に保った。

中和のために、２ｍＬのｐＨ８のＴｒｉｓ（２００ｍＭ）／ＮａＣｌ（５０ｍＭ）の緩衝液を、ゲルを含有するウェルに室温（２０～２５℃）で１５分間添加した。

Ｔｒｉｓ緩衝液を、１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する２ｍＬの培養培地に置き換えて、細胞増殖を停止させた。更に使用する前に、ヒドロゲルを３７℃及び５％ＣＯ_２でインキュベートした。

この方法に従って、異なるヒドロゲル組成物を調製した。反応性基（マレイミド及びチオール）及びポリマー（多糖類ＤＭＣＭａｌ及びＰＥＧ－ＳＨ）の濃度は、疑似膵島の存在下でのポリマー溶液の混合時の最終濃度に対応する。

実施例Ｃ１０：薄いヒドロゲルディスクの成形
例えばＣ３に記載のプロトコルに従って、濃縮ポリマー溶液を４℃で平衡化した。溶液をピペットで混合し、制御された体積の混合物を、ガラススライドに接着した円形のシリコーンアイソレーター（直径９ｍｍ／厚さ０．５ｍｍ、Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏｌａｂから）に導入した。

２０～２５℃での１５分間のゲル化の後、ヒドロゲルディスクを成形から取り外し、成形から取り外した直後（ｗ_０）、及び３７℃ＰＢＳ中で一晩膨潤した後（ｗ_{ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ}）に計量した。膨張比は、ｗ_{ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ}／ｗ_０の質量比として定義される。腫れたヒドロゲルの直径をキャリパーで測定した。厚さは、ディスクの測定された直径及び重量から推定された。

この方法は、モールドの直径及びヒドロゲルの体積を調整することによって、制御された直径及び厚さのヒドロゲルディスクを得ることを可能にする。

実施例Ｃ１１：ヒドロゲルの機械抵抗の決定。
圧縮のために、実施例Ｃ３に記載の腫れた長方形のヒドロゲル片を平板ガラス結晶器に導入し、ＰＢＳに浸漬した。平坦な圧縮プレートを装備したＡＲ２０００レオメータの軸力センサを使用して、２０～２５℃のＰＢＳで０．６ｍｍ／分の速度で一軸圧縮を行った。試料の初期厚さは、力が増加し始めるときに、プレートとヒドロゲルとの接触から決定された。変形は、圧縮変位（ｍｍ）と初期厚さ（ｍｍ）の比率によって定義される。破断時の変形は力・変位曲線から求めた。破断は、変位に対する力の減少が観察されたときに定義される。

牽引のために、イヌ骨型のシリコーンモールドでヒドロゲルを成形することによって、イヌ骨型のヒドロゲル片を調製した。単軸牽引は、スクリューグリップを装備したユニバーサルメカニカルテスター装置（Ｉｎｓｔｒｏｎ又はＺｗｉｃｋｒｏｅｌｌ）を使用して、２０～２５℃ａの空気中で３ｍｍ／分の速度で行った。試料の初期長さは、ルーラーとのグリップ間で測定した。変形は、牽引変位（ｍｍ）と初期長さ（ｍｍ）の比率によって定義される。破断時の変形は力・変位曲線から求めた。破断は、変位に対する力の減少が観察されたときに定義される。ヤング率は、真のひずみ／変形曲線の勾配から決定した。真ひずみ（ｋＰａ）は、圧縮下の試料の瞬間表面積（ｍｍ^２）に対する力（Ｎ）の比に対応する。

本発明に従うヒドロゲルは、外科的埋め込みに適した変形性及び剛性を組み合わせた非常に良好な機械的抵抗特性を示す。

実施例Ｃ１５：ヒドロゲル中のインスリン産生細胞島のカプセル化
細胞膵島のカプセル化を無菌環境下で行った。

それぞれ実施例Ｃ１又はＣ１Ａ及びＣ２に従って調製した多糖類ＤＭＣＭａｌ又はＤＭＣＶＳ及びＰＥＧ－ＳＨ濃縮無菌溶液を濃縮ＮａＣｌ溶液で調整して等張ストック溶液（３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）を得た。溶液を、ＤＭＣＶＳベースのヒドロゲルの場合は室温（２０～２５℃）、ＤＭＣＭａｌヒドロゲルの場合は４℃のいずれかで平衡化した。

等量の等張ＰＥＧ－ＳＨ溶液膵島懸濁液を混合することによって、ＰＥＧ－ＳＨと膵島との濃縮混合物を調製した（実施例Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、及び／又はＢ４に従って調製した）。次いで、ＰＥＧ－ＳＨ及び膵島を含有する混合物を、等張濃縮溶液の多糖類ＤＭＣＭａｌ又はＤＭＣＶＳと、７０：３０体積：膵島懸濁液の体積比／ＰＥＧ－ＳＨ：多糖類で穏やかに混合した。

溶液をピペットで穏やかに混合し、制御された体積の混合物をＧｒａｃｅ Ｂｉｏｌａｂからの円形シリコーンアイソレーターに導入し、ガラススライドに接着した。体積及びシリコーンモールドの直径に応じて、異なるヒドロゲルサイズを作製した。

ゲル化を、室温（２０～２５℃）又は３７℃で１時間実施した。ヒドロゲルを組み込んだ膵島を成形から取り外し、室温で１５分間、ｐＨ８でＴｒｉｓ１５０ｍＭ／ＮａＣｌ３０ｍＭ／システイン１０ｍＭ溶液に導入した。次に、ヒドロゲルを１０ｍＭのシステインを含む培養培地に３７℃で１時間浸した。１時間後、システインを含有する培養培地を除去し、培養培地に置き換えた。細胞を含有する滅菌ヒドロゲルを、更なるインビトロ試験又はインビボ埋め込みの前に、３７℃及び５％ＣＯ_２で貯蔵した。

異なるヒドロゲル組成物を、疑似膵島又は初代膵島のいずれかを用いて、この方法に従って調製した。反応性基（マレイミド又はビニルスルホン及びチオール）及びポリマー（多糖類ＤＭＣＭａｌ及びＰＥＧ－ＳＨ）の濃度は、膵島の存在下でのポリマー溶液の混合時の最終濃度に対応する。

比較例ＣＥ１６：ＥＤＣと架橋したカルボキシメチルデキストラン系ヒドロゲルの調製
パートＡ１に従って得られた滅菌凍結乾燥多糖類ＤＭＣ－３の適切な重量を量り、適切な重量の脱イオン水を添加することにより、濃縮多糖類溶液を調製した。

脱イオン水中にＥＤＣ及びＮＨＳ粉末を溶解させることにより、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング剤の濃縮溶液を調製した。

３ｍＬのガラスバイアル内の多糖の濃縮溶液にＥＤＣ／ＮＨＳ濃縮溶液を添加して、所望の組成物を得た（表１５）。透明で非粘性の溶液が得られた。バイアルをローラーシェーカー上に３０分間、室温（２０～２５℃）で置いた。粘性溶液を得た。制御体積の混合物（１００μＬ）を、ガラススライドに接着した円形シリコーンアイソレーター（直径９ｍｍ／厚さ２ｍｍ、Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏｌａｂから）に導入した。ゲル化を３７℃で４５分間続行した。

ヒドロゲルを成形から取り外し、Ｔｒｉｓ１５０ｍＭ／ＮａＣｌ３０ｍＭ（２ｍＬ）のｐＨ８にて３７℃で１時間導入した。Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌをＰＢＳに置き換え、ヒドロゲルを３７℃で一晩保存した後、機械的試験を行った。

実施例Ｃ１７：ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、比較例、又はＰＥＧ－ＳＨと架橋したＤＭＣ－Ｍａｌ系ヒドロゲルの調製
それぞれ実施例Ｃ１及び実施例Ｃ２に従って調製した多糖類ＤＭＣＭａｌ及びＰＥＧ－ＳＨ濃縮溶液を濃縮ＮａＣｌ溶液で調整して等張ストック溶液（３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）を得、４℃で平衡化した。

水中にＤＴＴ粉末及び濃縮ＮａＣｌ溶液を溶解させることにより、濃縮ＤＴＴ溶液を調製し、等張ストック溶液（３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）を得、４℃で平衡化した。

ＤＴＴ又はＰＥＧ－ＳＨの濃縮溶液１１２μＬを、２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ中の多糖類ＤＭＣＭａｌの濃縮溶液１１２μＬに添加した。溶液をピペットと混合し、制御された体積の混合物（１００μＬ）を、ガラススライドに接着する円形シリコーンアイソレーター（９ｍｍ直径／２ｍｍ厚、Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏｌａｂから）に導入した。ゲル化を、室温（２０～２５℃）で１時間実施した。ヒドロゲルを成形から取り外し、Ｔｒｉｓ１５０ｍＭ／ＮａＣｌ３０ｍＭ（２ｍＬ）のｐＨ８にて３７℃で１時間導入した。Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌをＰＢＳに置き換え、ヒドロゲルを３７℃で一晩保存した後、機械的試験を行った。

実施例Ｃ１８：ＥＤＣ／ＮＨＳ又はＤＴＴ、比較例、又はＰＥＧ－ＳＨと架橋したヒドロゲルのヤング率
実施例ＣＥ１６及びＣ１７に記載されているような円形のヒドロゲル片を平坦なガラス結晶器に導入し、ＰＢＳに浸漬した。平坦な圧縮プレートを備えたユニバーサルメカニカルテスター装置（Ｚｗｉｃｋｒｏｅｌｌ）の軸力センサを使用して、２０～２５℃のＰＢＳ中で０．２ｍｍ／分の速度で一軸圧縮を行った。試料の初期厚さは、力が増加し始めるときに、プレートとヒドロゲルとの接触から決定された。変形は、圧縮変位（ｍｍ）と初期厚さ（ｍｍ）の比によって定義された。ヤング係数は、真のひずみ／変形曲線の勾配から決定した。真ひずみ（ｋＰａ）は、圧縮下の試料の瞬間表面積（ｍｍ^２）に対する力（Ｎ）の比に対応する。

ＥＤＣ／ＮＨＳと架橋したカルボキシメチルデキストランベースのヒドロゲル、又はＤＴＴと架橋したカルボキシメチルデキストランマレイミドベースのヒドロゲルは、ＰＥＧ－ＳＨと架橋したカルボキシメチルデキストランマレイミドベースのヒドロゲルよりも小さいヤング率値を示す。ヤング率は材料の剛性を表すため、ＰＥＧリンカーがより硬いヒドロゲルをもたらすことを意味し、これは外科的埋め込みを可能にするためにより適切であった。

実施例Ｃ１９：濃縮多糖類デキストランＭａｌ Ａ３の溶液の調製
ｐＨ４で適切な体積のリン酸緩衝液５００ｍＭを比較例Ａ３に記載の滅菌凍結乾燥多糖類に添加することにより、濃縮多糖類溶液を調製した。

溶液を完全な可溶化のために軌道シェーカー１時間上に置き、同日にゲル調製に使用するまで２０～２５℃で保管した。

比較例ＣＥ２０：デキストランＭａｌ Ａ３からのヒドロゲルの調製
ヒドロゲルの調製は、無菌環境下で行った。

実施例Ｃ１９及びＣ２に従って調製した多糖類ＤｅｘｔｒａｎＭａｌ Ａ３及びＰＥＧ－ＳＨ濃縮滅菌溶液を、それぞれ室温（２０～２５℃）で平衡化した。
４５μＬのＰＥＧ－ＳＨ濃縮溶液を、１３３μＬの多糖類ＤｅｘｔｒａｎＭａｌ濃縮溶液及び２１μＬのリン酸緩衝液５００ｍＭ（ｐＨ４）を２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ中に添加した。溶液をピペットで混合し、２００μＬの混合物を長方形のシリコーンモールド（ＩＢＩＤＩ １２×７．７５ｍｍ）に導入した。ゲル化を、室温（２０～２５℃）で１時間実施した。ヒドロゲルを成形から取り外し１晩、ｐＨ７．４で１０ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液中に導入した。次にＰＢＳ緩衝液を再生し、ヒドロゲル片を使用するまで４℃保存した。

実施例Ｃ２１：ヒドロゲル透明度の測定
実施例Ｃ４及びＣ４Ａに記載のヒドロゲル組成物、並びに実施例Ｃに開示される他のヒドロゲルは、水又はＰＢＳ培地と同様に、視覚的に透明である。

ヒドロゲルの透明性特性を定量化するために、１０ｍｍ経路長のＵＶキュベット中にヒドロゲルを鋳造し（Ｂｒａｎｄｔ（登録商標））、ヨーロッパの薬局方標準と比較して５００ｎｍで吸光度を測定することによって、ＵＶ吸光度測定（Ｊａｓｃｏ（登録商標）ＵＶ分光光度計Ｖ５３０）を行った（ＨＡＣＨ（登録商標）によって供給されるＳｔａｂｌＣａｌ Ｆｏｒｍａｚｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）。５００ｎｍでの吸光度測定を使用して、試料の濁度レベルを定量化する。以下の表の試料も、２，０００～３，７５０ルクス（Ａｄｅｌｐｈｉ（登録商標）Ａｐｏｌｌｏ ＩＩ Ｌｉｑｕｉｄ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ）の光レベルを有する黒色パネルの前の標準化された条件で目視検査された。

組成物Ｃ４Ａ－１のヒドロゲルを、実施例Ｃ３Ａと同様に調製した。それぞれ実施例Ｃ１及び実施例Ｃ２に従って調製した多糖類ＤＭＣＭａｌ及びＰＥＧ－ＳＨ濃縮滅菌溶液を濃縮ＮａＣｌ溶液で調整して等張ストック溶液（３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）を得、４℃で平衡化した。

２５０μＬのＰＥＧ－ＳＨ濃縮溶液を、２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ中の２５０μＬの多糖類ＤＭＣＭａｌ又はＤＭＣＶＳ濃縮溶液に添加した。溶液をピペットと混合し、制御された体積の混合物（４００μＬ）をＵＶキュベットに導入した。

ゲル化を、室温（２０～２５℃）で１時間実施した。１時間後、目視検査及びＵＶ吸光度測定を行い、１．２ｍＬのＰＢＳをＵＶキュベットに加えた。１時間後の腫れ、３７℃のＵＶ測定、及び目視検査を繰り返した。

これらの結果は、本発明に従うヒドロゲルが透明であることを示す。

パートＤ－ヒドロゲルの生物学的評価
実施例Ｄ１：抽出物試験によるヒドロゲル細胞毒性プロファイルの評価
ヒドロゲルの細胞毒性プロファイルを、ＩＳＯ１０９９３－５に従った抽出方法を使用して評価した。医療デバイスの推奨事項の生物学的評価。

ヒドロゲルを、２４ウェルプレート中３ｃｍ^２／ｍｌの培養培地（１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＭＥＭ）に入れた。それらを軌道撹拌（７０ｒｐｍ）下、３７℃及び５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートして、ヒドロゲル抽出培地を得た。並行して、ＨＤＦａ細胞を９６ウェルプレートの培養培地中に７５００細胞／ウェルに入れ、３７℃及び５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、細胞の培地を除去し、ヒドロゲルインキュベーション培地に置き換えた。抽出培地を用いたＨＤＦａ細胞の３７℃及び５％ＣＯ_２でのインキュベーションの２４時間後、生存率を、製造業者の指示に従って、ＡＴＰＬｉｔｅキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた細胞内ＡＴＰ濃度の定量化によって測定した。
生存率を、以下の式を使用して計算した：

この抽出物試験により、ヒドロゲル組成物Ｃ４－２、Ｃ４－４、Ｃ４－９、Ｃ４－１０、Ｃ４Ａ－１及びＣ４Ａ－２の細胞毒性を評価した。その結果を以下の表２０に示す。生存率パーセンテージを未処理対照と比較した。３重のウェルの平均生存率の標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を計算した（ｎ＝２ヒドロゲル、各抽出を３重の細胞ウェルに堆積させた）。

抽出培地のいずれも、未処理の対照と比較して細胞毒性を示さなかった（表２０を参照）。ＤＭＣＭａｌポリマーの長さの変化、反応性基、すなわちマレイミド又はビニルスルホンの性質、ＰＥＧ－ＳＨポリマーの長さの変化、チオール及びマレイミド又はビニルスルホン反応性基中の濃度、並びに架橋化学のタイプは、ヒドロゲルのインビトロ生体適合性に影響を及ぼさない。結論として、本プロトコルによれば、ヒドロゲルは、インビトロでの細胞毒性を示さなかった。

実施例Ｄ２：カプセル化された疑似膵島のインビトロ生存率及び基礎分泌
ａ）カプセル化された疑似膵島の生存率
実施例Ｃ９－１に従って調製したカプセル化された疑似膵島を、１μＭのカルセイン－ＡＭ及び８μＭの臭化エチジウムを３０分間培養培地に補充することにより、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色した。洗浄ステップの後、次いで、５倍の倍率でエピ蛍光顕微鏡を使用して疑似膵島を撮像した。

生存率スコアを、以下の式を使用して計算した：

Ｄ＋１からＤ＋１０までのカプセル化された疑似膵島の生存可能性について得られた結果を表２１に示す。

１０日間のカプセル化後、疑似膵島の９０％以上が依然として生存可能であった（表２１）。

ｂ）基礎インスリン分泌定量
基礎インスリン分泌を異なる時点で培養培地中で測定し、２つのモノクローナル抗体を用いたインスリン定量のためのサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量化した。結果は、カプセル化前の裸の膵島の基礎インスリン分泌によって正規化された。

Ｄ＋３からＤ＋１０までのカプセル化された疑似膵島の基礎インスリン分泌について得られた結果を表２２に示す。

これらの結果は、細胞の基礎インスリン分泌が維持されたことを示している（表２２）。

総合すると、これらの結果により、カプセル化された疑似膵島が、カプセル化後少なくとも１０日間、基礎生理学の大きな変化なしに生存することが実証される。

実施例Ｄ３：カプセル化された疑似膵島のインビトロ機能性
ａ）疑似膵島カプセル化
疑似膵島を、実施例Ｃ９－２、Ｃ９－３及びＣ９－４に記載されるようにカプセル化した。

ｂ）グルコース刺激インスリン分泌
カプセル化の３日後、カプセル化及び非カプセル化擬膵島を洗浄し、０．１％ＢＳＡ及び１ｍＭのグルコースを含有するクレブス緩衝液中で６０分間インキュベートした（低グルコースクレブス、平衡化ステップ）。３つの洗浄ステップの後、疑似膵島を低グルコースクレブス中で６０分間再インキュベートした。次いで、インスリン含有量定量のために上清を回収した。次いで、カプセル化及び非カプセル化疑似膵島を、０．１％ＢＳＡ及び１６．６ｍＭのグルコースを含有するクレブス緩衝液中で６０分間インキュベートした。最後に、上清をインスリン含有量定量のために回収した。インスリン定量は、実施例Ｄ２ｂに記載されるＥＬＩＳＡアッセイを使用して行った。分泌指数は、高グルコースクレブで測定したインスリン濃度と低グルコースクレブ条件で測定したインスリン濃度を割ることにより算出した。得られた結果を表２３に示す。

Ｓ．Ｄは標準偏差（ｎ＝２ヒドロゲル）を表す。

インスリン分泌応答は、全ての試験したヒドロゲル組成物（表２３）について、カプセル化及び非カプセル化された疑似膵島（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ試験、ｐ＝０．２７）について類似しており、したがって、カプセル化の少なくとも３日後に、疑似膵島機能がヒドロゲル中で維持されたことを実証した。

実施例Ｄ４：カプセル化は、インビトロでの疑似膵島の生存率及び機能に影響しない
ａ）疑似膵島及び初代膵島カプセル化
Ｍｉｎ－６疑似膵島を実施例Ｃ１５－１及びＣ１５－２に記載されるようにカプセル化し、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で培養培地（実施例Ｂ１を参照）中に維持した。それらの生存率及び機能性を、カプセル化の３又は４日後に評価し、同じバッチからの裸の疑似膵島と比較した。

初代ヒト膵島を実施例Ｃ１５－４、Ｃ１５－５、Ｃ１５－７、及びＣ１５－９に記載されるようにカプセル化し、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で培養培地（実施例Ｂ２の培地１）中に維持した。それらの生存率及び機能を、カプセル化の１、２、６、又は７日後に評価し、同じバッチの裸の膵島と比較した。

ｂ）生存率評価
生／死染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、カプセル化又は裸の膵島又は疑似膵島に使用して、それらの生存可能性を決定した。方法の堅牢性を向上させるために、プロトコルは例Ｄ２ａと比較してわずかに更新された。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して試料を洗浄した。次いで、２μＭのカルセイン－ＡＭ及び８μＭの臭化エチジウムを補充したＰＢＳ中でインキュベートし、６０分間インキュベートした。最終的にそれらをＰＢＳ中で洗浄し、エピ蛍光顕微鏡法を使用して撮像した。

生存率の定量化は、画像をセグメント化することによって行った。緑色チャネル内の積分強度（面積ピクセル強度の合計）、Ｖ（生細胞）、赤色チャネル内の積分強度、Ｄ（死細胞）を算出した。

生存率は、

を計算することによって得られた。

ｃ）機能評価方法
膵島又は疑似膵島（裸又はカプセル化）の機能性を評価するために、洗い流し実験を行った。カプセル化の１、２、６、又は７日後、カプセル化に使用したバッチ（初代膵島又は疑似膵島）からの４００個のＩＥＱ（実施例Ｂ４を参照）を、カプセル化された試料と同様に、洗い流し室に導入した。次に、表２４に記載されるプロトコルのうちの１つに従って、チャンバーを模擬的に洗い流した。

フロースルー緩衝液を収集し、インスリン定量のためにＥＬＩＳＡでインスリンを定量した。

シグナル倍率増加は、第１の基礎分泌ステップ中に測定された平均インスリン濃度によって各時点で測定されたインスリン濃度を正規化することによって計算された。

各試料の分泌指数を、第１の基礎分泌ステップ中に測定された平均インスリン濃度に対する刺激ステップ中に測定された平均インスリン濃度の比率として計算した。

ｄ）培養７日後の裸の及びカプセル化された初代ヒト膵島のインビトロ機能の比較
裸の及びカプセル化された初代ヒト膵島を、カプセル化の７日後に洗い流しで評価した（図１を参照されたい）。裸の膵島は丸で表され、カプセル化された初代ヒト膵島Ｃ１５－４は四角で表され、Ｃ１５－５は三角形で表される。

図１に示される結果は、裸の膵島及びカプセル化された試料におけるグルコース刺激の開始後１０分以内のインスリン分泌の増加を示す。グルコースが基礎レベルに低下すると、インスリン分泌は基礎レベルに戻る。これらの結果は、カプセル化された膵島が、カプセル化後７日まで、裸の膵島と同様のインビトロ機能を示すことを強く示唆している。

ｅ）培養７日後の裸の及びカプセル化された一次ヒト膵島のインビトロ生存能及び機能の比較
裸の一次ヒト膵島又はＭｉｎ－６疑似膵島を洗い流しで評価し、実施例Ｄ４ｃに記載された方法を使用して、カプセル化試料Ｃ１５－１、Ｃ１５－２、Ｃ１５－４、Ｃ１５－５、Ｃ１５－７、及びＣ１５－９と比較した（デバイス：Ｃｕｓｔｏｍ Ｄｅｖｉｃｅ）。これらの組成物については、実施例Ｄ４ｂに記載されるように生存率も評価した。

表２５を参照されたい。Ｓ．Ｄ．は、標準偏差を表す。Ｎは、実験のｌｅ数を表し、ｎは、実験ごとの独立した試料の数を表す。Ｎ．Ｄ．は、決定せずを意味する。

結果は、裸の疑似膵島と比較して、Ｍｉｎ－６カプセル化された疑似膵島の生存率が１１～２２％低下し、分泌指数に有意差はなく、カプセル化の３～４日後に同様の機能性が示唆された（ウェルチ検定、ｐ＝０．１７）。

カプセル化後７日までの裸の膵島と比較して、カプセル化された一次ヒト膵島の生存率及び機能性に差は見られなかった。カプセル化の７日後のＣ１５－９試料は、単純に試料の変動性に起因する可能性がある裸の膵島と比較してわずかに低い機能性を示す。

これらの結果は、カプセル化が、ヒドロゲル中のカプセル化された一次ヒト膵島の生存率（一次ヒト膵島カプセル化条件にわたるＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．３４）及び機能性に有意に影響しないことを強く示唆している。

実施例Ｄ５：カプセル化された一次膵島の長期インビトロ生存率及び機能性
ａ）一次膵島のカプセル化
一次ラット膵島を、実施例Ｃ１５－３に記載されるように、単離の２日後にカプセル化し、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で培養培地（１０％ウシ胎児血清、２ｇ／Ｌグルコース最終濃度、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地）中に維持した。一次ヒト膵島を実施例Ｃ１５ー８に記載されるようにカプセル化し、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で培養培地（実施例Ｂ２の培地２）中に維持した。

一次ラット膵島の機能性を、カプセル化の１、５、８、１５、及び２２日後に評価した。カプセル化後３、７、１０、１４、及び２１日後にヒト膵島の一次機能性を評価した。各時点を、実施例Ｄ４ｃに記載される方法を使用して、ｎ＝２個のヒドロゲルで評価した（デバイス：Ｐｅｒｉ４，Ｂｉｏｒｅｐ）。表２６を参照のこと。Ｎ．Ｄ．は、決定せずを意味する。Ｓ．Ｄ．は標準偏差を意味する

結果は、カプセル化された一次ラット膵島の生存能が、カプセル化後少なくとも１５日までインビトロで維持されたことを示す（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．６５）。同様に、一次ヒト膵島生存率は、カプセル化の少なくとも２１日後にインビトロで維持された（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．１９）。

結果は、カプセル化された一次ラット膵島の洗い流し分泌指数が安定しており、カプセル化後少なくとも２２日まで２以上維持されており（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．３５）、カプセル化された一次ラット膵島が機能的であったことを示す。カプセル化後少なくとも２１日まで、同様の結果が一次ヒト膵島で観察された（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．４４）。

全体として、これらの結果は、カプセル化された一次ラット膵島（Ｃ１５－３）のインビトロ生存率及び機能性が、カプセル化後、それぞれ少なくとも１５日及び２２日にわたって維持されたことを示す。更に、カプセル化された一次ヒト膵島（Ｃ１５ー８）の生存能及び機能性を、インビトロで少なくとも２１日間維持した。

実施例Ｄ６：ラット網に異種移植されたカプセル化された膵島のインビボ生存及び機能性。
ａ）一次ヒト膵島カプセル化
一次ヒト膵島を実施例Ｃ１５ー６に記載されるようにカプセル化し、ラット網に３及び６日間埋め込んだ。

生体内埋め込み

体重２５０～４００ｇのＷｉｓｔａｒラットを使用した。

イソフルランを用いて麻酔を行った。

各動物を温めたパッド上で仰臥位に置いた。手術刃で手術部位から毛皮を剃った。手術部位をポビドンヨウ素溶液で消毒した。

腹部に２～３ｃｍの長さの正中線切開を行った。腸を左側に移動し、脱水を防ぐために生理食塩水浸漬ガーゼで覆った。胃は完全に露出しており、網は湿ったガーゼの上に広がっていた。２つの埋込物を網上に配置し、網で覆った（ラッピング技術）。埋込物を所定の位置に維持し、それらの滑り及び／又は重なりを避けるために、非吸収性縫合縫合糸（プロレン６／０）を網上に作製した。腹部を閉じる前に、脱水を防ぐために生理食塩水溶液２ｍＬを腹腔に分配した。筋層を有する腹膜を連続的な非吸収性縫合糸で閉じ（プロレン４／０）、次いで皮膚を中断されたシングルステッチによって縫合し（プロレン４／０）、切開部をポビドンヨウ素溶液で洗浄した。

手術後、各動物を回復領域に移動させ、胸骨臥位が達成されるまで麻酔からの回復を監視した。回復後、動物は集団飼育され、一般的な健康を観察した。

指定された時点で、動物を屠殺した。埋め込み部位を収集し、各動物からの１つの移植片を、埋め込み後の洗い流し及び生存率アッセイのために組織を含まずに解剖した。大動脈分岐レベルで全採血によって血液採取した。

ｂ）移植片評価
実施例Ｄ４ｂ及びＤ４ｃに記載されているように、移植片の生存能及び機能性を評価した（デバイス：Ｐｅｒｉ４、Ｂｉｏｒｅｐ）、インビボ埋め込みの３及び６日後。表２７を参照のこと。Ｓ．Ｄ．は、標準偏差を表す。

結果は、網へのインビボ埋め込みの少なくとも６日後に、カプセル化された膵島が７５％を超える生存率及びグルコースに応答したインスリン増加を有していたことを示す。

実施例Ｄ７：ヒドロゲルのインビボ短期局所耐性：ＤＭＣ－ＰＥＧ対デキストラン－ＰＥＧ
ヒドロゲルの局所耐性は、ガイドラインＩＳＯ １０９９３ Ｐａｒｔ６（２０１６）に基づいて評価された：埋め込み後の局所的な影響のための試験。

Ｃ４－２、Ｃ４－３（両方ともＤＭＣ－ＰＥＧ）及びＣＥ２０－１（デキストラン－ＰＥＧ）ヒドロゲルをウサギの背部皮下組織に１週間埋め込んだ。局所組織効果並びにヒドロゲルの態様を、ＩＳＯ１０９９３パート６によって推奨されるように、肉眼的に、及び組織病理学的分析（ｎ＝物品ごと及び期間ごとに５つの部位）によって、以下のように評価した：動物の屠殺及びヒドロゲルの移植後、埋め込みによって産生される組織反応性を、その種々の成分を０～４スケールでスコアリングすることによって評価した。評価された成分は、多形核細胞、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、巨大細胞、一方の部分での壊死、及び第２の部分での新生血管形成、線維化及び脂肪浸潤であった。種々の炎症性細胞型又は形態学的特徴は、存在する場合にのみ報告された。各試験試料について取得された平均スコアから、陰性対照試料ＨＤＰＥ（高密度ポリエチレン；ＩＳＯ１０９９３パート６によって推奨される）によって取得された平均スコアを差し引いたものは、組織反応性スコアを与える。

肉眼的には、Ｃ４－２及びＣ４－３ヒドロゲルは、形状、サイズ、色及び一貫性において十分に保存された。それどころか、ＣＥ２０－１ヒドロゲルは、埋め込まれた材料よりも大きかった。加えて、ＣＥ２０－１は、Ｃ４－２及びＣ４－３と比較して、より強い組織反応（びまん性赤み）を誘導した。

組織病理学的検査後、ガイドラインＩＳＯ１０９９３ Ｐａｒｔ６からの組織反応性のスコアリング尺度に従って、Ｃ４－２及びＣ４－３は「最小限から無反応」を誘導することが分かったが、ＣＥ２０－１は「中程度の反応」を誘導すると評価された。

これらの結果は、ＤＭＣを使用して形成されたヒドロゲルが、デキストランを使用するそれらの形態よりも良好な耐容性を提示することを示す。

実施例Ｄ８：ヒドロゲルのインビボ長期局所耐性
ヒドロゲルの局所耐性は、ガイドラインＩＳＯ１０９９３ Ｐａｒｔ６（２０１６）に基づいて評価された：埋め込み後の局所的な影響のための試験。

Ｃ４Ａ－１及びＣ４Ａ－２ヒドロゲル並びにディスク形状のヒドロゲルと同じサイズのディスク形状のＨＤＰＥを、ラットの背面皮下組織に１３週間埋め込んだ。局所組織効果並びにヒドロゲルの態様を、実施例Ｄ７に記載されるように、肉眼的に、及び組織病理学的分析によって評価した（ｎ＝物品ごと及び期間ごとに５つの部位）。

肉眼的には、Ｃ４Ａ－１及びＣ４Ａ－２ヒドロゲルは、形状、サイズ、色及び一貫性において十分に保存された。更に、組織反応（赤み）はめったに観察されなかった。

組織病理学的検査後、ガイドラインＩＳＯ１０９９３ Ｐａｒｔ６からの組織反応性のスコアリング尺度に従って、Ｃ４Ａ－１及びＣ４Ａ－２は「最小限から無反応」を誘導することが判明し、平均スコア反応スコアは陰性対照ＨＤＰＥより劣っていた。

したがって、両方のヒドロゲルは、ラットの皮下に埋め込んだ１３週間後に優れた局所耐性を示す。

実施例Ｄ９：ヒドロゲルのインビボ免疫単離特性
ヒドロゲルの免疫分離特性を、網膜又は背部皮下組織への異種（マウス中のヒト）又は同種（ラット中のラット）カプセル化されたランゲルハンの島の埋め込みを伴う研究の過程で評価した。マウス及びラットは免疫適格性があった。

ａ）異種移植
体重２５～３５ｇのスイスマウスを使用した。

各動物に、約１，０００個の膵島当量（ＩＥｑ）を含有する１つの円盤状のＣ１５－１０埋込物を３３，０００ＩＥｑ／ｍＬの密度で埋め込んだ。

埋め込み前に、各マウスを、マスクを有する吸入麻酔薬（イソフルラン）上に配置した。

皮下組織（ＳＣ）への埋め込みのために、局所麻酔軟膏（キシロカイン）を外科領域に塗布した。各動物を伏せた位置に置いた。網埋め込みのために、動物を仰臥位に置いた。動物を温めたパッドの上に置いた。両眼に中性眼科用軟膏を塗布し、角膜を乾燥から保護し、必要に応じて再塗布した。手術刃で手術部位から毛皮を剃った。手術部位をポビドンヨウ素溶液で消毒した。埋込物を収容するのに十分な大きさの切開を、肩甲骨間レベルをわずかに下回り、椎骨柱に垂直な皮膚を通して行った。皮下組織の鈍的解離によりポケットを形成し、この区画に埋込物を導入した。皮膚を非吸収性糸（プロレン５／０）及び外科用接着剤（３Ｍ Ｖｅｔｂｏｎｄ）で閉じ、切開部をポビドンヨウ素溶液で洗浄した。

網埋め込みのために、腹部に２～３ｃｍの長さの正中線切開を行った。腸を左側に移動し、脱水を防ぐために生理食塩水浸漬ガーゼで覆った。綿棒の助けを借りて、胃は完全に露出し、網は鉗子を使用して配置され、慎重に展開された。胃をひっくり返して胃後腔を露出させた。１つの埋込物をこの空洞に配置し、網で覆った。その後、胃は元の位置に戻された。

手術後、各動物を回復領域に移動させ、胸骨臥位が達成されるまで麻酔からの回復を監視した。ケージ内にダイエットジェルを用意した（ダイエットジェル回復）。回復後、動物は集団飼育され、一般的な健康を観察した。

埋め込み２６日後に動物を屠殺し、埋め込み部位を肉眼的に観察した後、組織病理学のために埋込物を採取した。埋込物周辺では肉眼的な炎症反応は認められなかった。

カプセル化されたヒト膵島の組織病理学検査では、ヒドロゲルへの炎症性宿主細胞の浸潤は明らかにされず、埋め込み部位にかかわらず、埋込物周囲の組織における炎症性宿主応答の徴候は記録されなかった。これは、Ｃ１５－１０ヒドロゲルの良好な耐容性及び宿主免疫反応に対する異種膵島を免疫分離するその能力を支持する。

ｂ）同種移植
同種移植は、糖尿病の雄Ｗｉｓｔａｒラットで行った。糖尿病は、４５ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンの腹腔内投与によって誘導された。動物に、誘導後１０週間で動物を埋め込んだ。手術時、動物の体重は２５０～３５０ｇであった。

各動物に、それぞれ約２３００ＩＥｑを含有する２つの円盤状のＣ１５－１３埋込物を、３３０００ＩＥｑ／ｍＬの密度で埋め込んだ。

動物をイソフルランで麻酔し、体重を測定した後、抗炎症治療薬（メロキシカム、１ｍｇ／ｋｇ ＳＣ）及び大スペクトル抗生物質（ショタペン ０．１ｍＬ／ｋｇ ＳＣ）を注射した。更に、手術部位に麻酔軟膏（キシロカイン）を塗布した。各ラットを加熱パッド上に仰臥位に置き、手術のために準備した。

腹部に正中線切開を行った。胃を露出させるために、綿棒で腸を空洞の左側に動かした。網は限局性であり、濡れたガーゼの上に慎重に広げられた。鉗子を使用して、ポケットを作成するために網シートを分離した。２つの埋込物を作成された空間に配置し、重ね合わせを避け、網組織で覆った。ポケットの端は、必要に応じて生物学的接着剤（Ｔｉｓｓｅｅｌ、Ｂａｘｔｅｒ）で密封された。埋込物を非吸収性縫合糸（Ｍｅｒｓｉｌｋ（商標）４－０）で局在化した。胃と腸は腹腔に再配置された。

切開部を縫合する前に、腹腔内をＮａＣｌ ０．９溶液（血液量の１０％）で再水和した。腹部を再吸収性縫合糸（Ｖｉｃｒｙｌ（商標）４－０）で縫合した。

手術直後に、食事用ゲル（ダイエットゲル）を個々のケージに入れ、動物を胸骨臥位が達成されるまで観察した。動物を、回復まで（少なくとも４日間）個別に収容した後、集団飼育した。

手術後、動物は３日間連続して１日１回の抗炎症治療（メロキシカム、１ｍｇ／ｋｇ ＳＣ）と、手術後３日及び６日のショタペン（０．１ｍＬ／ｋｇ ＳＣ）の２回の注射を受けた。

２１日目に血液を採取し、血液生化学的分析を行った。結果は、埋込物に関連する炎症反応の証拠を開示しなかった。

手術の３５日後に動物を屠殺し、組織病理学のために埋込物を採取する前に、埋め込み部位を肉眼的に観察した。炎症の肉眼的徴候は認められなかった。

カプセル化されたラット膵島の組織病理学検査では、ヒドロゲルが破損により中止された場合を除き、ヒドロゲルへの炎症性宿主細胞の浸潤は開示されなかった。埋め込み部位にかかわらず、埋込物周囲の組織における炎症性宿主応答の徴候は認められなかった。これは、Ｃ１５－１３ヒドロゲルの良好な耐容性及び宿主免疫反応に対する同種異系膵島を免疫分離するその能力を支持する。

実施例Ｄ１０：カプセル化された膵島のインビボでの機能性の証明
カプセル化されたヒト膵島のインビボ機能を、ヒト膵島を含有する２つの円盤状のＣ１５－１２埋込物を網に埋め込まれたラットにおいて評価した。各動物に３８０００ＩＥｑ／ｍＬの密度で５０００ＩＥｑを埋め込んだ。

網埋め込みを実施例Ｄ９に記載されるように行った。

膵島の機能は、埋め込み後６日までの血清中のヒトＣペプチドの測定によって評価した。インスリン分泌を刺激するために、２～３日毎にグルコース投与後１５～２０分に血液を採取した。グルコース刺激を、腹腔内経路による２ｇ／ｋｇのグルコースの投与によって行った。血漿を調製し、特異的ＥＬＩＳＡイムノアッセイ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｒｅｆ．１０．１１４１．０１）を使用してＣペプチドを測定した。

Ｃペプチド血漿レベルは、カプセル化された膵島が機能的であり、ヒドロゲルがインスリンの血流への拡散を可能にしたことを示す、埋め込み後３日及び６日で全ての動物について検出可能であった。

実施例Ｄ１１：カプセル化された膵島の有効性のインビボ証明
カプセル化されたヒト膵島のインビボでの有効性を、糖尿病ラットで評価した。糖尿病を実施例Ｄ７に記載されるように誘導した。有効性は、高血糖を調節する膵島の能力によって評価され、血糖のモニタリングによって測定された。

各動物に、実施例Ｄ９ｂに記載されるように、２つの円盤状のＣ１５－１３埋込物を埋め込んだ。カプセル化された膵島の網埋め込みを、実施例Ｄ９ｂに記載されるように行った。対照として、以下のように裸の膵島を動物の別の群に埋め込んだ：数滴の生物学的接着剤（Ｔｉｓｓｅｅｌ、Ｂａｘｔｅｒ）を網に塗布し、重合させた。接着剤が重合すると、必要な数の膵島を接着剤に注入した。

血糖測定の４時間前に、動物は血糖の変動を最小限に抑えるために食物を奪われた。埋め込み前（基礎値、例えば、０日目）、１４日目に、血糖を測定した。切断された尾先端から１滴の血液を採取し、血糖を（Ｌｉｆｅｓｃａｎからの）ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）グルコースメータを使用して測定した。

血糖値は、埋め込み前の全ての糖尿病ラットで６００ｍｇ／ｄＬの検出限界を超えていた。対照ラットの血糖値は１４日目に６００ｍｇ／ｄＬを超えたままであったが、Ｃ１５～１３埋込物を埋め込んだ全てのラットで血糖値が低下し、埋め込みから１４日後に３４０ｍｇ／ｄＬ（２５２～４２２ｍｇ／ｄＬの個々の血糖値）の平均値に達した。

裸の膵島は高血糖症を制御することができず、おそらく宿主反応のために機能していないことを強く示唆していた。それどころか、カプセル化された膵島（Ｃ１５－１３）は、埋め込みから１４日後に非常に強力な血糖減少をもたらし、ヒドロゲルがその有効性を維持しながら免疫分離を提供する能力のおかげで、カプセル化された膵島が生存可能で機能的であることを示した。

Claims (17)

1. カルボキシレート基を有する架橋デキストランポリマーであって、２つの異なるポリマー鎖に属するデキストランの少なくとも２つの糖類単位が、少なくとも１つの少なくとも二価のラジカルＬ（－）_ｉによって共有結合的に連結され、この少なくとも二価のラジカルが、少なくとも１５個の炭素原子及び任意選択で酸素、窒素、又は硫黄等のヘテロ原子を含む直鎖、分岐又は環状アルキルラジカルである、架橋デキストランポリマー。
2. 前記少なくとも二価のラジカルＬ（－）_ｉがｉ－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－_－ラジカルで前記デキストランポリマー骨格に共有結合され、式中、
   －Ｌ（－）_ｉは、その末端に、酸素、窒素又は硫黄等のヘテロ原子を有する直鎖又は分岐のポリエーテルであり、
   －ｉは、Ｌの原子価であり、２～８（２≦ｉ≦８）からなる整数であり、
   －ｍは、０又は１に等しい整数であり、
   －－Ｒ_１－は、１～６個の炭素原子、及び任意選択で酸素、窒素又は硫黄等のヘテロ原子を含む直鎖又は分岐アルキル二価ラジカルであり、
   －－Ｇ_１－は、１～６個の炭素原子を含む直鎖又は分岐又は環状アルキル二価ラジカルであり、酸素、窒素、又は硫黄等のヘテロ原子を含み得る、請求項１に記載の架橋デキストランポリマー。
3. 前記糖類単位に結合した前記カルボキシレート基が、エーテル結合によって結合し、式Ｉ
   －（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯＸ 式Ｉ
   （式中、
   －ｎは、１～７（１≦ｎ≦７）からなる整数であり、
   －Ｘは、－ＯＨ、－ＯＮａ、－ＯＫ、又は－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－ラジカルの中から選択される）に従うカルボキシレート基の中から選択される、請求項１又は２に記載の架橋デキストランポリマー。
4. Ｌ（－）_ｉが、その末端に、酸素、窒素、又は硫黄等の少なくとも２個のヘテロ原子を有する直鎖ポリエーテルラジカルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の架橋デキストランポリマー
5. Ｌ（－）_ｉが、その末端に、最大８本のアームを含む酸素、窒素又は硫黄等のヘテロ原子を有する分岐ポリエーテルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の架橋デキストランポリマー。
6. ｉ＝２であり、Ｌ（－）_ｉが、式ＩＩ
   －Ｓ－（ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｏ）_ｐ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－
   式ＩＩ
   （式中、ｐは、８～１０００（８≦ｐ≦１０００）からなる整数である）に従う、メルカプトポリエチレングリコールに由来するラジカルである、請求項４に記載の架橋デキストランポリマー。
7. Ｌ（－）_ｉが、メルカプトエチルポリオキシエチレンに由来する式ＩＩＩ
   

   

   
   （式中、－Ｑは、炭素原子又は１～１０個の炭素原子を含むアルキル鎖のいずれかであり、前記アルキル鎖は、酸素、硫黄及び窒素からなる群から選択されるヘテロ原子を含み得、
   －ｐは、８～１０００（８≦ｐ≦１０００）からなる整数であり、
   －ｑは、２～８（２≦ｑ≦８）からなる整数であり、
   －Ｚは、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ）_ｐ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－である）に従うラジカルである、請求項１～６のいずれか一項に記載の架橋デキストランポリマー。
8. －Ｒ_１－が、１～６個の炭素原子、及び任意選択的で、酸素、窒素、又は硫黄等のヘテロ原子を含む直鎖又は分岐アルキル二価ラジカルである、請求項２～７のいずれか一項に記載の架橋ポリマー。
9. 前記ラジカル－Ｒ_１－が、前記デキストランが有するカルボキシレート基と、アミン官能基を有する１つの－Ｒ_１－前駆体又は－（Ｒ１）_ｍ－Ｇ_１－前駆体と、の反応によって生じるアミド官能基によって共有結合されている、請求項２～８のいずれか一項に記載の架橋デキストランポリマー。
10. ラジカル－Ｒ_１－が、前記デキストランが有するヒドロキシル官能基と、脱離基、つまりハロゲン原子を有する、１つの－Ｒ_１－前駆体又は－（Ｒ１）_ｍ－Ｇ_１－前駆体と、の反応によって生じるエーテル官能基によって共有結合されている、請求項２～８のいずれか一項に記載の架橋デキストランポリマー。
11. ラジカル－Ｇ_１－の前駆体である－Ｇ_２が、マレイミド若しくはビニルスルホン、又はマレイミド若しくはビニルスルホンを含む基の中から選択される、請求項２～１０のいずれか一項に記載の架橋デキストランポリマー。
12. 前記デキストランポリマー骨格が、式ＸＩＩ
    

    

    
    （式中、Ｒは、－Ｈ，－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯＸ、又は－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－の中から選択され、ｎ、ｍ、Ｘ、－Ｒ_１－、－Ｇ_１－、及びＬ（－）_ｉは、請求項２及び３に定義されるものであり、Ｌ（－）_ｉは、－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－_－ラジカルで別のデキストランポリマー骨格に共有結合され、
    －ｌは２０～５０００（２０≦ｌ≦５０００）からなる）に従うデキストラン骨格である、先行請求項のいずれか一項に記載の架橋デキストランポリマー
13. －前記－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－基での前記デキストラン骨格の置換度（ＤＳ_１）が、０．００１～０．４（０．００１≦ＤＳ_１≦０．４）の範囲に含まれ、かつ／又は
    －式Ｉに従う前記カルボキシレート基での前記デキストラン骨格の置換度（ＤＳ_２）が、０．５～３（０．５≦ＤＳ_２≦３）の範囲に含まれ、かつ／又は
    －前記デキストランポリマーが、前記－（Ｒ_１）_ｍＧ_１－ラジカルのモル濃度と、前記架橋剤Ｌ（－）_ｉの反応性官能基のモル濃度と、の間に、０．５～１．５（０．５≦ＤＣ≦１．５）の範囲に含まれるモル比（ＤＣ）を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の架橋デキストランポリマー。
14. 先行請求項のいずれか一項に記載の架橋デキストランポリマーを含む、ヒドロゲル。
15. 生体細胞を更に含むことを特徴とする、請求項１４に記載のヒドロゲル。
16. 哺乳動物における障害又は疾患を治療するための、請求項１４又は１５に記載のヒドロゲルの治療的使用であって、前記障害又は疾患が、膵臓臓器の内分泌機能の欠如又は機能不全に起因するものである、治療的使用
17. 請求項１４又は１５に記載のヒドロゲルを含む、埋込物

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