JP2024501884A

JP2024501884A - ヒトｍａｃ－１に対するモノクローナル抗体及びその使用

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Publication number: JP2024501884A
Application number: JP2023540621A
Authority: JP
Inventors: フランク・ウェン－チ・リー; イェン－タ・ル; チア－ミン・チャン; ピン－イェン・ファン; イ－ファン・ツァイ
Original assignee: ASCENDO BIOTECHNOLOGY, INC.
Current assignee: ASCENDO BIOTECHNOLOGY, INC.
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2024-01-16
Also published as: WO2022147338A1; CA3203552A1; EP4271413A1; KR20230140448A; BR112023013052A2; AU2021413899A1; US20240084017A1; CN116963772A; TW202325340A

Abstract

ヒトMac-1に対するモノクローナル抗体が、提供される。これら抗体は、Mac-1の生体機能を改変するように異なる状態のMac-1に結合することができる。これら抗体は、TLR活性化された免疫細胞によるTh1/Th2サイトカイン分泌をモジュレートすることができ、感染性疾患並びにがん等の急性及び慢性炎症性障害と関連する疾患の処置に使用されうる。

Description

本発明は、ヒトMac-1に対するモノクローナル抗体を提供する。これら抗体は、Mac-1の生体機能を改変するように異なる状態のMac-1に結合することができる。これら抗体は、TLR活性化された免疫細胞によるTh1/Th2サイトカイン分泌をモジュレートすることができ、感染性疾患並びにがん等の急性及び慢性炎症性障害と関連する疾患の処置に使用されうる。

マクロファージ-1抗原(Mac-1、インテグリンαMβ2)は、主に自然免疫細胞(単球、好中球、NK細胞、等を含む)の表面で発現される。Mac-1は、非共有結合性インテグリンαM(CD11b、CR3A、ITGAM)及びインテグリンβ2(CD18、ITGB2)を含むヘテロ二量体糖タンパク質である。CD11bは、大きい細胞外ドメイン及び短い細胞質尾部を持つ膜貫通タンパク質である。CD11bの細胞外ドメインは、Iドメイン、βプロペラドメイン、Thighドメイン、calf-1ドメイン、及びcalf-2ドメインを含む。CD11bのIドメインは、およそ179アミノ酸を有し、βプロペラドメインに挿入されている。このIドメインは、無差別(promiscuous)なリガンド(例えば、iC3b、フィブリノゲン、ICAM-1、CD40L、等)への結合に関与し、細胞接着、遊走、走化性及び貪食作用に関わり、自然免疫細胞の炎症応答を調節する。

他のインテグリンのように、Mac-1は、異なるリガンド結合親和性を持つ固有の構造で存在する。図1に示すように、CD11b及びCD18は、膜近くにIドメインがあるV字形状に曲がって、不活性Mac-1(低親和性)を形成する。インサイドアウトシグナル伝達は、Mac-1を開構造に変化させ、最適なリガンド結合のためにIドメインを膜から離す。CD18のI-EGF2上に位置するエピトープの1つは、曲がった構造内に隠れており(不活性又は閉鎖状態);伸長又は開状態においてこのエピトープは露出し、モノクローナル抗体(KIM127)によって認識されうる(J. Immunol. 2001年; 166: 5629～5637頁)。Iドメイン部位が、リガンド結合のための高親和性部位になり、mAb m24結合のためのエピトープを形成するように、この立体構造の変化は、Iドメイン部位の再編成ももたらす(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2004年; 101: 2333～2338頁)。リガンドの結合親和性の変化を伴うそのような立体構造の変化は、Mac-1機能に関係する。

WO 2020/033929 A1 WO 2019/177669 A1 WO 2016/197974 A1

J. Immunol. 2001年; 166: 5629～5637頁 Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2004年; 101: 2333～2338頁 Proc Natl Acad Sci USA. 2008年4月1日;105(13):5195～200頁 Nat Immunol.2010年8月;11(8):734～42頁 C. Orlandiら、"A comparative analysis of unintegrated HIV-1 DNA measurement as a potential biomarker of the cellular reservoir in the blood of patients controlling and non-controlling viral replication," J. Transl. Med. 18, 204 (2020年). Doi: 10.1186/s12967-020-02368-y

本発明の実施形態は、Mac-1に特異的に結合し、免疫細胞機能をモジュレートすることができる抗体に関する。これら抗体は、感染性疾患又はがん等、様々なMac-1関連疾患若しくは状態を処置するために使用されうる。

本発明の一態様は、ヒトMac-1に対する抗体に関する。本発明の一実施形態によるヒトMac-1に対する抗体は、Table I(表1)に示した配列番号1～配列番号158から選択される軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を含む。

本発明の一態様は、Mac-1と関連する障害を処置するための方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、必要とする対象に本発明の抗体の有効量を投与する工程を含む。障害は、急性又は慢性炎症である。障害は、感染症又はがんでありうる。

本発明の他の態様は、以下の説明及び関連する図面から明らかになろう。

図1は、Mac-1の2種の構造及び活性化感受性mAbに対するそのエピトープを示す図である。図2は、様々な抗体を使用したHEK293/Mac-1の特徴付けの結果を示す図である。HEK293細胞は、PBS(模擬)又はPBS/MnCl₂(Mn²⁺)中でインキュベートされた。アイソタイプ対照IgG、CD11b特異的mAb(クローンICRF44)、CD18特異的mAb(クローン6.7)又はβ2活性化依存的mAb(KIM127及びm24)の結合を、フローサイトメトリーを使用して検出した。図3Aは、本発明の代表的な抗Mac-1抗体(DF3M-5、H4L2、m2396、24G05及び28E07-HH)が、骨髄性免疫細胞(単球及び好中球)に主に結合することを示す図である。本発明の他の抗体は、類似の特性を示す。図3Bは、クローンm2396、DF3M-5及び24G05が、マウスMac-1発現細胞株Raw264.7に結合することを示す図である。図4は、PBS(模擬)又はPBS/MnCl₂(Mn²⁺)条件下でMac-1の立体構造の変化をモジュレートしうる抗Mac-1抗体の例を示す図である。図5は、抗Mac-1抗体処置が、in vivoでマウスのTLR4アゴニスト誘導性Th1/Th2サイトカイン応答をモジュレートしうることを示す図である。データを平均±SEM(群当たり4匹のマウス)として示す。図6は、抗Mac-1抗体が、in vivoでA549ヒト肺腫瘍を保有するヒト化NOG-EXLマウスモデルの腫瘍成長を減少させることを示す図である。データを平均±SEM(群当たり10匹のマウス)として示す。図7Aは、抗Mac-1抗体が、HIV患者から単離された骨髄性細胞において機能的マーカーの発現を増強させたことを示す図である。図7Bは、抗Mac-1抗体が、HIV患者由来のPBMCにおいてウイルス量を減少させたことを示す図である。

ヒト抗体及びマウス抗体のファージディスプレイライブラリを構築し、スクリーニングして、Mac-1を認識できる特異的抗体遺伝子を保有するクローンを単離した。これら抗Mac-1抗体は、HEK293/Mac-1細胞及び自然免疫細胞上のMac-1を結合することが示されている。これら抗体は、異なる状態のMac-1(曲がった又は伸長/開構造)に選択的に結合し、Mac-1の立体構造の変化をモジュレートすることができる。これら抗Mac-1抗体は、TLR誘導性サイトカイン産生をモジュレートし、したがって、感染性疾患(参照: WO 2020/033929 A1)並びにがん(参照: WO 2019/177669 A1及びWO 2016/197974 A1)等の急性及び慢性炎症性障害を処置するために使用されうることが示されている。

以下では、本発明の様々な態様の特定の例について記述する。当業者は、これら特定の例が単なる例示であり、他の修正及び変更が本発明の範囲から逸脱することなく可能であることを認識する。

材料及び方法
試薬及び抗体
フローサイトメトリーに使用した抗体及び試薬は、KIM127(ATCCからのハイブリドーマ)、m24-PE(BioLegend社)、抗CD11b-APC(クローンICRF44、BioLegend社)、抗CD18-APC(クローン6.7、BD社)、BSA(BioShop社)、ラットIgG1κ-APC(BioLegend社)及びラットIgG1κ-PE(BioLegend社)である。KIM127抗体及びBSAは、CF647とコンジュゲートされた、すなわち、CF647標識キット(CF Dye & Biotin SE Protein Labeling Kits、Biotium社)で標識された。

細胞培養及び安定なトランスフェクション
HEK293細胞(BCRC)におけるヒトインテグリンMac-1の安定なトランスフェクションは、jetPRIME(登録商標)(PolyPlus社)トランスフェクションプロトコールを使用して実行された。簡潔には、HEK293細胞は、10%熱不活化ウシ胎仔血清(Gibco社)並びに50IU/mLペニシリン及びストレプトマイシン(Corning社)で補充されたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Corning社)中で、37℃で培養された。細胞は、6ウェルプレート(Coster社)上に8×10⁵個細胞/ウェルで播種された。翌日、jetPRIME(登録商標)試薬と、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子を保有するpcDNA3.1/ヒトCD18発現プラスミド2μgとの混合体が細胞に添加され、細胞は24時間培養された。選択抗生物質、ハイグロマイシンB(InvivoGen社)が、濃度200μg/mLで添加され、抗生物質を含有する培養培地の半分が、2～3日間毎に交換された。3週間後、CD18高発現細胞を選ぶためにCell Sorter(SH800Z、ソニー社)を使用してCD18発現細胞が採取され、24ウェルプレート(Coster社)及び6ウェルプレートに単一細胞/ウェル及び5000個細胞/ウェルで播種された。細胞は、10%熱不活化ウシ胎仔血清、50IU/mLペニシリン及びストレプトマイシン並びに200μg/mLハイグロマイシンBを含むDMEM培地中で、37℃で維持された。細胞が濃縮された後、ヒトCD18発現が、抗ヒトCD18 APC(クローン6.7、BD社)抗体を用いてフローサイトメトリーによって分析された。永久HEK293/ヒトCD18細胞(クローン2B4)が、6ウェルプレート上に6×10⁵個細胞/ウェルで播種された。ヒトCD11bのためのトランスフェクションプロトコールは、上と同じであった。簡潔には、pcDNA3.1/ヒトCD11bプラスミド2μgがjetPRIME(登録商標)試薬と混合され、細胞に添加された。翌日、選択抗生物質、1mg/mL G418(InvivoGen社)及び200μg/mLハイグロマイシンBが添加され、選択抗生物質を含有する培地が、2～3日間毎に交換された。Mac-1発現は、抗ヒトCD11b-APC(クローンICRF44、BioLegend社)及び抗hCD18-APCを用いてフローサイトメトリーによって測定された。安定なクローン1～4が選ばれた。

フローサイトメトリー
HEK293/Mac-1細胞(クローン1～4)が計数され、染色緩衝液(1% FBS及び0.1%アジ化ナトリウムを含有するPBS)で2回洗浄された。細胞は、染色緩衝液中に濃度1×10⁵個細胞/mLで調整され、0.25mM MnCl₂(Sigma社)の有り無しで処置された。細胞は、抗Mac-1抗体及び蛍光コンジュゲート抗ヒトIgG4抗体で処置され、15分間インキュベートされた。染色緩衝液での洗浄後、細胞はフローサイトメトリーによって分析された。一部の例において、これら細胞は、10μg/mL抗Mac-1抗体の有り無しで抗体(ICRF44、KIM127、m24又はアイソタイプ対照)で処置された。細胞は、37℃で30分間次いでインキュベートされた。染色緩衝液での洗浄後、細胞はフローサイトメトリーによって分析された。

サイトカイン測定
Balb/cマウス(n=4/群)は、5mg/kg LPS及び10mg/kg抗Mac-1抗体で4時間腹膜内注射された。血清中のマウスTh1及びTh2サイトカインが、製造業者の指示にしたがってProcartaPlex MS(Thermo Fisher Scientific社)によって検出された。

がん処置のプロトコール
ヒト臍帯血由来CD34+細胞が、尾静脈を介してNOG-EXLマウスに移植された。移植の約10週間後、末梢血が、麻酔下でヒト化NOG-EXL動物から採取され、FACS分析に使用された。免疫細胞(T細胞、B細胞、樹状細胞及び単球細胞)の型、割合、蛍光強度及び絶対数が、分析された。平均hCD45⁺%>15%、hCD45⁺のうちhCD3⁺%>3%、及びhCD45⁺のうちhCD14⁺%>5%の場合に、ヒト化NOG-EXL動物は、抗がん研究に使用された。

ヒト肺がんA549細胞が、F-12K培地中の10% FBSと共に5% CO₂を含有する37℃のインキュベーター内で培養された。細胞は、マウスに接種される前に10継代以内で継代培養された。A549細胞(5×10⁶個細胞)は、皮下注射の直前に容積200μLでマトリゲル(容積/容積1:1)と混合された。接種前に、マウスは2～5%イソフルランで麻酔された。

腫瘍容積が20～50mm³に達したら、腫瘍担持動物が、ヒトCD45⁺細胞中のマクロファージの頻度、ヒトCD45⁺細胞中のCD3⁺細胞の頻度及び腫瘍容積に基づいて3群に群分けされ、各群は、10匹のマウスを含有する。群分けの日を、0日目とした。マウスは、0日目に処置された。

腫瘍容積:腫瘍容積は、以下の通りに算出された: V=(長さ×幅²)/2。腫瘍容積は、接種、群分けの間、及び用量期間の間に週2回測定され、記録された。腫瘍成長阻害(TGI)は、以下の通りに算出された: TGI=(1-(T/C))×100%; T及びCは、測定日における処置及び対照群それぞれの平均腫瘍容積である。

感染性疾患処置のプロトコール
HIV患者からのPBMCの単離
定期的な高活性抗レトロウイルス療法(ART)処置を受けており、血漿ウイルス量が検出不能であり(HIV-1 RNA<50コピー/mL)、CD4細胞が計数可能である(計数>200個/mm³)HIV-1感染患者15名が、国立台湾大学病院(台湾国、台北市)で募集された。臨床及び実験室データが、医療記録から収集され、取得された。各血液試料は、採取後24時間内に処理され、白血球が、更なる検査のために単離された。本研究は、国立台湾大学病院(台湾国、台北市)の施設内倫理委員会によって承認され、書面による同意書が各参加者から得られた。

末梢血単核細胞(PBMC)は、Ficoll-Paque(Amersham Biosciences社、スウェーデン)勾配遠心分離により全血液試料から単離された。細胞は、96ウェルU底培養プレート中で培養され(2×10⁵個細胞/ウェル)、10μg/mLヒトIgG4抗体(BioLegend社)又は抗Mac-1抗体(クローンH4L2)の存在下で10%ウシ胎仔血清(FBS)、100nMエルビテグラビル(Cayman社)、及び100nMエファビレンツ(Cayman社)を含むRPMI-1640培地に3日間再懸濁された。

HIV患者のPBMCの機能的マーカーの検出
蛍光色素標識抗体で染色する前に、細胞懸濁液は、1% FBS及び0.1%アジ化ナトリウムを含有するPBS中でFc遮断薬(BD Bioscience社)とインキュベートされた。CD11b(クローンICRF44、BioLegend社)、CD86(クローン2331、BioLegend社)、HLA-DR(クローンL243、BioLegend社)、及びCD80(クローンL307、BD社)に対する抗体を使用してマーカーを染色した。FVS786生存率染色を使用して、分析から死細胞を除外した。染色細胞の平均蛍光強度は、CytoFlexフローサイトメトリーによって測定され、Kaluzaソフトウェア(Beckman Coulter社)によって分析された。

細胞内HIVウイルスの検出-2本の長い末端反復(LTR)-DNA環の定量化
ヒトIgG4抗体(BioLegend社)又は抗Mac-1抗体(H4L2、10μg/mL)の存在下で、PMA(100ng/mL)及びイオノマイシン(1μg/mL)による処置の有り無しで3日間培養されたPBMC(24ウェル培養プレート中で3×10⁶個細胞/ウェル)のDNAが、QIAamp DNA Bloodミニキット(Qiagen社、MD、USA)で抽出され、DNAは、ヌクレアーゼ不含水50μLによって溶出された。デジタルPCRは、QX100(商標)Droplet Digital(商標)PCRプラットフォーム(Bio-Rad社、Hercules、カリフォルニア)を用いて実行された。ddPCR混合物は、最終容積20μL中に、2×ddPCR(商標)supermix for probes(Bio-Rad社)10μL、EcoR 1μL、500nMプライマー及び250nMプローブに試料1～5μLを添加することによって作製された。混合物は、8チャネルカートリッジ内に置かれ、ドロップレット生成油(Bio-Rad社)70μLが添加され、ドロップレットは、QX100(商標)ドロップレットジェネレーター(Bio-Rad社)中で生成された。油懸濁液中のドロップレットは、ddPCR 96ウェルプレート(Bio-Rad社)へ移され、PCRが、T100(商標)Thermal Cycler(Bio-Rad社)において実行された。ddPCR増幅反応は、95℃で10分間の開始変性、続いて95℃で15秒間の変性と60℃で60秒間のアニーリング/伸長温度を40サイクル、及び98℃で10分間の酵素不活化からなった。各ステップのランプ速度は、2℃/秒である。プライマー対の配列は、Table VI(表6)に挙げられる。

統計分析
結果は、カテゴリ変数についてはフィッシャーの正確確率検定によって、及び連続変数については、必要に応じて対応のあるt検定又は対応のないt-検定によって比較された。データは、平均±SEMとして報告される。統計分析は、Prism 9.0ソフトウェアを使用して実行された。両側検定が使用され、p値<0.05が統計的に有意と考えられた。

結果
HEK293細胞の表面におけるヘテロ二量体CD11b/CD18(Mac-1)の発現
内因性Mac-1を発現しないHEK293細胞が、リポソームトランスフェクションを使用してpcDNA3.1/ヒトCD11b及びpcDNA3.1/ヒトCD18プラスミドでトランスフェクトされた。G418及びハイグロマイシン選択後に、CD18特異的mAb(クローン6.7)及びCD11b特異的mAb(クローンICRF44)を使用するFACSソーティングによって、細胞の表面でヒトMac-1を安定して発現する単一細胞クローンをいくつか入手した。1つのクローン(1～4と指定)が、本説明に示した全ての例のために選択された。他のクローンも、類似の特性を示す。

フローサイトメトリーによって検出されたHEK293細胞におけるCD11b及びCD18の発現が、図2に示される。2種の活性化感受性抗体mAb、KIM127及びm24を使用してHEK293/Mac-1細胞の表面における立体構造の状態を検証した。KIM127は、HEK293/Mac-1に十分に結合でき、これは、Mac-1が伸長した構造にあることを示唆する。PBS(模擬)中ではHEK293/Mac-1細胞へのm24の結合が低いことが観察された、これはMac-1が低親和性状態にあることを示唆している。PBS中でHEK293/Mac-1は、部分的に活性化される。対照的に、Mn²⁺処置は、Mac-1分子の100%を、伸長している高親和性構造の形をとるように誘導した。したがって、これら細胞は、ヒトMac-1のモノクローナル抗体をスクリーニングするための優れたプラットフォームを提供する。

抗Mac-1抗体は、HEK293/Mac-1細胞の表面上の異なる状態のMac-1に選択的に結合する
ヒト抗体及びマウス抗体のファージディスプレイライブラリを構築し、次いでスクリーニングし、Mac-1を認識できる特異的抗体遺伝子を保有するクローンを単離した。合計79個のクローンが、選択の各ラウンドのファージプールから選ばれた。これらクローンの可変領域のアミノ酸配列が、Table I(表1)及びTable VII(表7)に挙げられる。これらクローンが天然の構造でMac-1に結合できることを検証するために、ヒトIgG4骨格を持つこれらクローンから組換え抗体を生成した。組換え抗Mac-1抗体は、HEK293/Mac-1細胞のフローサイトメトリーによる分析に使用された。Table II(表2)に挙げたように、これら抗体は、HEK293/Mac-1細胞の表面上のMac-1を実際に認識できる。

Mac-1の立体構造の変化は、その機能の調節に関係する。これら抗体が、Mac-1の異なる構造を認識できるかどうか検査する。Table II(表2)に挙げたように、一部のクローンは、Mn²⁺による刺激後にHEK293/Mac-1細胞のMac-1分子上の活性化特異的エピトープに選択的に結合する(模擬/MnCl₂比<1)。それに対し、一部のクローンは、休止形態のMac-1を優先的に認識する(模擬/MnCl₂比>1)。選択したクローンのCDR及びフレームワーク領域の推定アミノ酸配列が、Table I(表1)に示される。

抗Mac-1抗体は、自然免疫細胞の表面のMac-1に主に結合する
単球(CD14⁺細胞)及び好中球(CD66b⁺細胞)等の自然免疫細胞は、細胞の表面にMac-1を発現する主要な細胞である。B細胞の一部の集団も、細胞の表面にMac-1を発現した(Proc Natl Acad Sci USA. 2008年4月1日;105(13):5195～200頁)。選択的抗Mac-1抗体の特異性が、ヒト全血を使用してフローサイトメトリーによって決定された。図3Aに示すように、本例における抗Mac-1抗体は、自然免疫細胞(CD14⁺及びCD66b⁺細胞)及びB細胞(CD19⁺細胞)の小さい集団に結合できた。対照的に、これら抗体は、T細胞(CD3⁺リンパ球)に結合しなかった。総合すると、これら結果は、抗Mac-1抗体が、免疫細胞のMac-1エピトープに特異的に結合しうることを示す。ヒトMac-1に対して検証された抗Mac-1抗体が、マウスMac-1と交差反応することになるかどうか決定するために、細胞の表面にマウスMac-1を発現しているRaw 264.7マウスマクロファージ細胞株を使用する。図3Bに示すように、DF3M-5、m2396及び24G05等いくつかのクローンが、Raw 264.7の表面に結合しうることは、これらクローンが、マウスMac-1と交差反応しうることを示唆している。

抗Mac-1抗体は、Mac-1における立体構造の変化を誘導する
インサイドアウトシグナル伝達が、Mac-1の全体的な立体構造の変化を誘導してアウトサイドインシグナル伝達をもたらすことは周知である。どの抗Mac-1抗体が、Mac-1における立体構造の変化を誘導するかについてスクリーニングするために、立体構造の変化を検出するためのレポータとして、伸長構造のMac-1に優先的に結合するKIM127及びm24抗体を使用した。図4左パネルに示すように、PBS緩衝液(模擬)中での抗体とHEK293/Mac-1細胞とのインキュベーションによって、KIM127及びm24結合の基礎レベルを得られた。対照的に、MnCl₂/PBS緩衝液(Mn²⁺)中での抗体とHEK293/Mac-1細胞とのインキュベーションは、KIM127及びm24結合の最大レベルを誘導した(図4右パネル)。模擬条件でのDF3M-5とのインキュベーションが、KIM127結合の小さい増大及びm24結合の大きい増大(図4左パネル)を誘導することは、このDF3M-5クローンが、Mac-1の立体構造の変化を増強させるアゴニストとして機能しうることを示した。アゴニストとして機能しうる(IgG4対照に対するm24相対表現>1に基づく)他のクローンが、Table III(表3)に挙げられる。対照的に、Mn²⁺条件での28E07とのインキュベーションが、KIM127結合の小さい低下及びm24結合の大きい低下(図4右)を誘導することは、この28E07クローンが、Mac-1の立体構造の変化を減少させるアンタゴニストとして機能しうることを示す。アンタゴニストとして機能しうる(IgG4対照に対するm24相対表現<1に基づく)他のクローンが、Table IV(表4)に挙げられる。これら研究の結果は、本発明の抗体を選択的に使用して、Mac-1の立体構造の変化を制御し、それによりMac-1の機能を調節しうることを示す。

抗Mac-1抗体は、in vivoでTLR活性化された免疫細胞によるTh1/Th2サイトカイン分泌をモジュレートする
これまでの研究は、活性なCD11bインテグリンが、MyD88及びTRIF経路とのクロストークに係わり、自然免疫応答においてTLRシグナル伝達をモジュレートすることを示している(Nat Immunol.2010年8月;11(8):734～42頁)。本発明の抗Mac-1抗体が、in vivoでTLR活性化された免疫細胞におけるTh1/Th2サイトカイン分泌をモジュレートできるかどうか検査するために、Balb/cマウス(n=4/群)が、5mg/kg LPS及び10mg/kg抗Mac-1抗体で腹膜内注射された。4時間後、血清Th1/Th2サイトカインが、ProcartaPlex(商標)MSによって測定された。図5に示すように、m2396及びDF3M-5処置は、血清中のTLR4誘導性Th1サイトカイン(IFN-γ、IL-1β及びTNF-α等)を増強し、TLR4誘導性Th2サイトカイン(IL-5及びIL-13等)をわずかに増強する。これら結果は、抗Mac-1抗体(クローンm2396及びDF3M-5)処置が、TLR誘導性Th1/Th2応答を歪めうることを示唆する。対照的に、24G05処置は、Th1/Th2サイトカインプロファイルを改変しなかった。

抗Mac-1抗体処置は、腫瘍成長を減少させる
本発明の抗Mac-1抗体(例えば、m2396及び28E07-HH)の抗がん活性が、雌のNOG-EXLヒト化マウスにおけるA549がんモデルの処置において更に評価された。

平均腫瘍容積が約41mm³に達したら、腫瘍を有するマウスは、3つの群(ヒトIgG4、m2396及び28E07-HH)にランダム化され、処置が開始された。群分けの35日後にマウスの平均腫瘍サイズは、ヒトIgG4群において172.59mm³、m2396群において132.51mm³及び28E07-HH群において109.88mm³に達した(図6)。図6は、代表的な抗体m2396及び28E07-HHの結果を示す。本発明の他の抗体は、類似の特性を有する。m2396群及び28E07-HH群の腫瘍成長阻害(TGI)%は、それぞれ23.59%及び35.93%であった。異なる時点における異なる群のTGIが、Table V(表5)に示された。これら結果は、これら抗Mac-1抗体が、ヒトのがんを処置するための治療的抗体として機能しうることを示す。

HIV患者における抗Mac-1抗体処置は、HIVウイルス量を減少させ、PBMCの免疫抑制表現型を逆転させる
HIVに対する抗Mac-1抗体に媒介される阻害作用の有効性を試験するために、15名の潜在的なHIV感染患者から単離したPBMCが、in vitroにおいて抗Mac-1抗体で3日間処置された。図7Aに示すように、抗Mac-1抗体(抗Mac-1抗体の代表例として示されるH4L2)は、HIV患者の骨髄性細胞において機能的マーカーCD86及びMHCクラスIIの発現を有意に増強させた。これら結果は、HIV患者におけるT細胞活性化の増強及び樹状細胞(DC)の成熟が、本発明の抗Mac-1抗体で達成されうることを示す。これら免疫応答の増強は、HIV感染の処置において本発明の抗体を潜在的に応用しうることを示唆する。

抗レトロウイルス療法(ART)の併用は、HIVの複製を抑制することができるが、HIV-1は、安定に組み込まれたゲノム、並びに直鎖状、1-LTR及び2-LTR環状DNAを含むより不安定な組み込まれていないDNAとして感染細胞内に残存する。あまり豊富でないが、2-LTR環DNAは、最近の感染事象の代替マーカーと考えられており、診断用ツールとして現在使用されている。(C. Orlandiら、"A comparative analysis of unintegrated HIV-1 DNA measurement as a potential biomarker of the cellular reservoir in the blood of patients controlling and non-controlling viral replication," J. Transl. Med. 18, 204 (2020年). Doi: 10.1186/s12967-020-02368-y)。

細胞内HIVウイルスの量を検出するために、マーカーとして2つの長い末端反復(LTR)DNA環を使用してHIVウイルスDNAリザーバーが定量化された。これらHIV-1感染患者15名は、定期的な高活性抗レトロウイルス療法(ART)処置を受けていたので、患者15名のうちの3名だけが、LTRアッセイによって検出可能なレベルのHIV DNAを有した。それにもかかわらず、HIV 2LTR DNAレベルの下落が、抗Mac-1抗体で又は抗Mac-1抗体とホルボール12-ミリスタート13-アセタート(PMA)及びイオノマイシンとの併用で処置したこれら3名の患者のPBMC試料に観察された(図7B)。

本発明について、限定数の例と共に記述されてきたが、当業者は、これら例が単なる例示であり、他の修正及び変更が本発明の範囲から逸脱することなく可能であることを認識する。したがって、保護の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。

Claims

ヒトMac-1に対する抗体であって、ヒトMac-1の特定の状態に結合し、TLR活性化された免疫細胞によるTh1及び/又はTh2サイトカイン分泌をモジュレートする、抗体。
前記Th1サイトカイン分泌が、Th2サイトカイン分泌より大きい程度に増強される、請求項1に記載の抗体。
前記抗体が、CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3配列を有する重鎖可変領域配列;並びにCDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3配列を有する軽鎖可変領域配列を含み、
前記CDR-H1が、配列番号543、549、483、369、189、159、165、171、177、183、195、201、207、213、219、225、231、237、243、249、255、261、267、273、279、285、291、297、303、309、315、321、327、333、339、345、351、357、363、375、381、387、393、399、405、411、417、423、429、435、441、447、453、459、465、471、477、489、495、501、507、513、519、525、531、又は537の配列を有し;
前記CDR-H2が、配列番号544、550、484、370、190、160、166、172、178、184、196、202、208、214、220、226、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364、376、382、388、394、400、406、412、418、424、430、436、442、448、454、460、466、472、478、490、496、502、508、514、520、526、532、又は538の配列を有し;
前記CDR-H3が、配列番号545、551、485、371、191、161、167、173、179、185、197、203、209、215、221、227、233、239、245、251、257、263、269、275、281、287、293、299、305、311、317、323、329、335、341、347、353、359、365、377、383、389、395、401、407、413、419、425、431、437、443、449、455、461、467、473、479、491、497、503、509、515、521、527、533、又は539の配列を有し;
前記CDR-L1が、配列番号546、552、486、372、192、162、168、174、180、186、198、204、210、216、222、228、234、240、246、252、258、264、270、276、282、288、294、300、306、312、318、324、330、336、342、348、354、360、366、378、384、390、396、402、408、414、420、426、432、438、444、450、456、462、468、474、480、492、498、504、510、516、522、528、534、又は540の配列を有し;
前記CDR-L2が、配列番号547、553、487、373、193、163、169、175、181、187、199、205、211、217、223、229、235、241、247、253、259、265、271、277、283、289、295、301、307、313、319、325、331、337、343、349、355、361、367、379、385、391、397、403、409、415、421、427、433、439、445、451、457、463、469、475、481、493、499、505、511、517、523、529、535、又は541の配列を有し;
前記CDR-L3が、配列番号548、554、488、374、194、164、170、176、182、188、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、266、272、278、284、290、296、302、308、314、320、326、332、338、344、350、356、362、368、380、386、392、398、404、410、416、422、428、434、440、446、452、458、464、470、476、482、494、500、506、512、518、524、530、536、又は542の配列を有する、請求項1に記載の抗体。
CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3が、配列番号159～164、又は配列番号165～170、又は配列番号171～176、又は配列番号177～182、又は配列番号183～188、又は配列番号189～194、又は配列番号195～200、又は配列番号201～206、又は配列番号207～212、又は配列番号213～218、又は配列番号219～224、又は配列番号225～230、又は配列番号231～236、又は配列番号237～242、又は配列番号243～248、又は配列番号249～254、又は配列番号255～260、又は配列番号261～266、又は配列番号267～272、又は配列番号273～278、又は配列番号279～284、又は配列番号285～290、又は配列番号291～296、又は配列番号297～302、又は配列番号303～308、又は配列番号309～314、又は配列番号315～320、又は配列番号321～326、又は配列番号327～332、又は配列番号333～338、又は配列番号339～344、又は配列番号345～350、又は配列番号351～356、又は配列番号357～362、又は配列番号363～368、又は配列番号369～374、又は配列番号375～380、又は配列番号381～386、又は配列番号387～392、又は配列番号393～398、又は配列番号399～404、又は配列番号405～410、又は配列番号411～416、又は配列番号417～422、又は配列番号423～428、又は配列番号429～434、又は配列番号435～440、又は配列番号441～446、又は配列番号447～452、又は配列番号453～458、又は配列番号459～464、又は配列番号465～470、又は配列番号471～476、又は配列番号477～482、又は配列番号483～488、又は配列番号489～494、又は配列番号495～500、又は配列番号501～506、又は配列番号507～512、又は配列番号513～518、又は配列番号519～524、又は配列番号525～530、又は配列番号531～536、又は配列番号537～542、又は配列番号543～548、又は配列番号549～554の配列を有する、請求項1に記載のヒトMac-1に対する抗体。
CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3が、配列番号543～548、又は配列番号549～554、又は配列番号483～488、又は配列番号369～374、又は配列番号189～194の配列を有する、請求項1に記載のヒトMac-1に対する抗体。
重鎖可変領域配列が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、又は157であり;軽鎖可変領域配列が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、又は158である、請求項1に記載のヒトMac-1に対する抗体。
重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列が、以下の配列対:配列番号1及び2、又は配列番号3及び4、又は配列番号5及び6、又は配列番号7及び8、又は配列番号9及び10、又は配列番号11及び12、又は配列番号13及び14、又は配列番号15及び16、又は配列番号17及び18、又は配列番号19及び20、又は配列番号21及び22、又は配列番号23及び24、又は配列番号25及び26、又は配列番号27及び28、又は配列番号29及び30、又は配列番号31及び32、又は配列番号33及び34、又は配列番号35及び36、又は配列番号37及び38、又は配列番号39及び40、又は配列番号41及び42、又は配列番号43及び44、又は配列番号45及び46、又は配列番号47及び48、又は配列番号49及び50、又は配列番号51及び52、又は配列番号53及び54、又は配列番号55及び56、又は配列番号57及び58、又は配列番号59及び60、又は配列番号61及び62、又は配列番号63及び64、又は配列番号65及び66、又は配列番号67及び68、又は配列番号69及び70、又は配列番号71及び72、又は配列番号73及び74、又は配列番号75及び76、又は配列番号77及び78、又は配列番号79及び80、又は配列番号81及び82、又は配列番号83及び84、又は配列番号85及び86、又は配列番号87及び88、又は配列番号89及び90、又は配列番号91及び92、又は配列番号93及び94、又は配列番号95及び96、又は配列番号97及び98、又は配列番号99及び100、又は配列番号101及び102、又は配列番号103及び104、又は配列番号105及び106、又は配列番号107及び108、又は配列番号109及び110、又は配列番号111及び112、又は配列番号113及び114、又は配列番号115及び116、又は配列番号117及び118、又は配列番号119及び120、又は配列番号121及び122、又は配列番号123及び124、又は配列番号125及び126、又は配列番号127及び128、又は配列番号129及び130、又は配列番号131及び132、又は配列番号133及び134、又は配列番号135及び136、又は配列番号137及び138、又は配列番号139及び140、又は配列番号141及び142、又は配列番号143及び144、又は配列番号145及び146、又は配列番号147及び148、又は配列番号149及び150、又は配列番号151及び152、又は配列番号153及び154、又は配列番号155及び156、又は配列番号157及び158を有する、請求項1に記載のヒトMac-1に対する抗体。
重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列が、以下の配列対:配列番号129及び130、又は配列番号131及び132、又は配列番号133及び134、又は配列番号71及び72、又は配列番号11及び12を有する、請求項1に記載のヒトMac-1に対する抗体。
急性及び慢性炎症又はがんに関連する疾患若しくは障害を処置するための医薬組成物であって、請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む、医薬組成物。
必要とする対象に請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与する工程を含む、急性及び慢性炎症又はがんに関連する疾患若しくは障害を処置するための方法。