JP2024544386A - Ｐｄ－ｌ１抗原結合タンパク質及びその使用 - Google Patents
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Abstract
ＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質及びその使用である。抗原結合タンパク質は、次の性質のうちの１つ又は複数を有する：０．０７μｇ／ｍｌ又はより高いＥＣ５０値でＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することができること、ＰＤ－Ｌ１タンパク質とＰＤ－１タンパク質との間の結合を遮断することができること、Ｔ細胞の活性化を促進することができること、及び体内腫瘍の体積の増加を阻害することができること。腫瘍を治療する薬物の製造における抗原結合タンパク質の応用である。
Description
本願は、生物医薬分野に関し、具体的には、ＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質及びその使用に関する。
プログラム細胞死受容体－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＤ－１）は、負の共刺激分子であり、ＣＤ２８免疫グロブリンスーパーファミリーである。ＰＤ－１には、プログラム死リガンド－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤ－Ｌ１）及びＰＤ－Ｌ２という２つの天然リガンドがある。ここで、ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ７－Ｈ１とも呼ばれるＰＤ－１の重要な負の免疫調節因子であり、ＰＤ－１との結合によりＴ細胞活性化の共阻害シグナルを媒介し、Ｔ細胞の活性化及び増殖を阻害し、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を標的とする免疫調節は、抗腫瘍に重要な意味を有する。ＰＤ－Ｌ１は、様々な腫瘍細胞の表面で過剰発現し、Ｔ細胞上のＰＤ－１分子に結合し、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導することで、腫瘍の免疫逃避に役立つ。近年、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１を標的とする１０種類の単一抗体薬物が次々と市販されている。
ところが、ますます多くの臨床データは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤がＴ細胞、マクロファージなどの十分な浸潤を伴う「熱腫瘍」において有効な作用を果たし、その臨床平均有効率が２０％～３０％の間であることを示し、ＰＤ－Ｌ１阻害剤の適応症及び治療計画が依然として改善の余地があることが分かっている。
［発明の内容］
本願は、ＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質及びその使用を提供する。
一態様によれば、本願は、次の性質のうちの１つ又は複数を有する、単離された抗原結合タンパク質を提供する：
（１）０．０７μｇ／ｍｌ又はより高いＥＣ５０値でＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することができること、
（２）ＰＤ－Ｌ１タンパク質とＰＤ－１タンパク質との間の結合を遮断することができること、
（３）Ｔ細胞の活性化を促進することができること、及び
（４）体内腫瘍の体積の増加を阻害することができること。
本願は、ＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質及びその使用を提供する。
一態様によれば、本願は、次の性質のうちの１つ又は複数を有する、単離された抗原結合タンパク質を提供する：
（１）０．０７μｇ／ｍｌ又はより高いＥＣ５０値でＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することができること、
（２）ＰＤ－Ｌ１タンパク質とＰＤ－１タンパク質との間の結合を遮断することができること、
（３）Ｔ細胞の活性化を促進することができること、及び
（４）体内腫瘍の体積の増加を阻害することができること。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片を含む。
幾つかの実施形態において、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ＶＨＨ及び／又はｄＡｂを含む。
幾つかの実施形態において、前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体からなる群より選ばれる。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域ＶＨ及び軽鎖可変領域ＶＬを含む参照抗体と前記ＰＤ－Ｌ１タンパク質に競合的に結合し、前記参照抗体のＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記参照抗体のＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、且つ前記参照抗体のＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＨＣＤＲ２は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＨＣＤＲ３は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＬＣＤＲ２は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含み、及び前記参照抗体のＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号３又は５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号１１～１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨを含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ定常領域に由来する重鎖定常領域を含む。
幾つかの実施形態において、前記重鎖定常領域は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１定常領域に由来する。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号７、９又は１０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、そのうち前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
そのうち前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
そのうち前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
そのうち前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
そのうち前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号１７～２０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖定常領域を含む。
幾つかの実施形態において、前記単離された抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域ＶＨ及び軽鎖可変領域ＶＬ、ここで、
前記ＶＨは配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む。
前記ＶＨは配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む。
別の態様によれば、本願は、前記単離された抗原結合タンパク質を含むポリペプチドを提供する。
別の態様によれば、本願は、前記単離された抗原結合タンパク質又は前記ポリペプチドを含む免疫複合体を提供する。
別の態様によれば、本願は、前記単離された抗原結合タンパク質をコードする単離された１つ又は複数の核酸分子を提供する。
別の態様によれば、本願は、前記核酸分子を含む担体を提供する。
別の態様によれば、本願は、前記核酸分子又は前記担体を含む細胞を提供する。
別の態様によれば、本願は、前記単離された抗原結合タンパク質を製造する方法であって、前記単離された抗原結合タンパク質の発現が可能な条件で、前記細胞を培養することを含む、方法を提供する。
別の態様によれば、本願は、前記単離された抗原結合タンパク質、前記核酸分子、前記担体及び／又は前記細胞と、任意選択的に薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。
別の態様によれば、本願は、腫瘍の予防、緩和及び／又は治療に使用される薬物の製造における、前記単離された抗原結合タンパク質、前記核酸分子、前記担体、前記細胞及び／又は前記医薬組成物の使用を提供する。
別の態様によれば、本願は、腫瘍を予防、緩和又は治療する方法であって、前記単離された抗原結合タンパク質、前記核酸分子、前記担体、前記細胞及び／又は前記医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
別の態様によれば、本願は、腫瘍の予防、緩和又は治療に使用するための前記単離された抗原結合タンパク質を提供する。
幾つかの実施形態において、前記腫瘍は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１高発現の腫瘍を含む。
幾つかの実施形態において、前記腫瘍は、固形腫瘍を含む。
幾つかの実施形態において、前記腫瘍は、結腸がんを含む。
別の態様によれば、本願は、ＰＤ－１タンパク質とＰＤ－Ｌ１タンパク質との結合を阻害する方法であって、前記単離された抗原結合タンパク質及び／又は前記ポリペプチドを投与することを含む、方法を提供する。
別の態様によれば、本願は、Ｔ細胞の活性化を促進する方法であって、前記単離された抗原結合タンパク質及び／又は前記ポリペプチドを投与することを含む、方法を提供する。
別の態様によれば、本願は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の存在及び／又は含有量を検出するための方法であって、前記単離された抗原結合タンパク質及び／又は前記ポリペプチドを投与することを含む、方法を提供する。
別の態様によれば、本願は、前記単離された抗原結合タンパク質、前記ポリペプチド、前記免疫複合体、前記核酸分子、前記担体、前記細胞及び／又は前記医薬組成物を含む、キットを提供する。
当業者は、以下の詳細な説明から、本願の他の態様及び利点を容易に理解することができる。以下の詳細な説明において、本願の例示的な実施形態のみが示され、説明される。当業者が認識されるように、本願の内容により、当業者は、本願に関する発明の精神や範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施形態を変更することができる。対応的には、本願の図面及び明細書における説明は例示的なものに過ぎず、限定するものではない。
本願に関する発明の具体的な特徴は、添付の特許請求の範囲に示される。以下に詳しく説明される例示的な実施形態及び図面を参照することによって、本願に関する発明の特徴及び利点をより良く理解することができる。図面を以下の通り簡単に説明する。
候補キメラ抗体による、遊離ＰＤ－１と細胞表面ＰＤ－Ｌ１との結合への遮断作用を示す。
候補キメラ抗体による、遊離ＰＤ－１と細胞表面ＰＤ－１との結合への遮断作用を示す。
本願に記載の抗原結合タンパク質の、細胞表面ＰＤ－Ｌ１への結合結果を示す。
本願に記載の抗原結合タンパク質によるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用への遮断を示す。
本願に記載の抗原結合タンパク質によるＴ細胞活性化への促進を示す。
本願に記載の抗原結合タンパク質によるマウス動物モデルの治療後の腫瘍体積を示す。
本願に記載の抗原結合タンパク質によるマウス動物モデルの治療後の体重変化を示す。
以下、特定の具体的な実施例により、本願の発明の実施形態を説明し、当業者は、本明細書により開示される内容から、本願の発明の他の利点及び効果を容易に理解することができる。
用語の定義
本願において、「ＰＤ－Ｌ１」という用語は一般に、プログラム死リガンド１タンパク質を指す。ＰＤ－Ｌ１は、分化クラスター２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７相同体１（Ｂ７－Ｈ１）とも呼ばれ、また（ヒトにおいて）ＣＤ２７４遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤ－Ｌ１は、プログラム死１（ＰＤ－１）などのその受容体に結合することができる。ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との複合は、Ｔ細胞増殖を阻害し、サイトカインＩＬ－２及びＩＦＮ－γを産生することによって免疫阻害作用を発揮する。「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、霊長類（例えば、ヒト又はサル）及び齧歯類（例えば、マウス又はラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物に由来する任意の天然ＰＤ－Ｌ１又は修飾されたＰＤ－１を包含する。前記用語には、「完全長」、加工されていないＰＤ－Ｌ１及び細胞内での加工により産生されたあらゆる形態のＰＤ－Ｌ１が含まれる。ＰＤ－Ｌ１は、膜貫通タンパク質又は可溶性タンパク質として存在することができる。前記用語には、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体などの、天然に存在するＰＤ－Ｌ１の変異体も含まれる。ＰＤ－Ｌ１の基本的な構造には、細胞外Ｉｇ様Ｖ型ドメイン、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの４つのドメインが含まれる。ＰＤ－Ｌ１配列は、当該分野で公知である。例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ．２９１２６で、ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（ゲノムＤＮＡ配列を含む）に関連する情報を見つけることができる。例示的な完全長ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿０５４８６２又はＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ９ＮＺＱ７で見つけることができる。
本願において、「ＰＤ－Ｌ１」という用語は一般に、プログラム死リガンド１タンパク質を指す。ＰＤ－Ｌ１は、分化クラスター２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７相同体１（Ｂ７－Ｈ１）とも呼ばれ、また（ヒトにおいて）ＣＤ２７４遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤ－Ｌ１は、プログラム死１（ＰＤ－１）などのその受容体に結合することができる。ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との複合は、Ｔ細胞増殖を阻害し、サイトカインＩＬ－２及びＩＦＮ－γを産生することによって免疫阻害作用を発揮する。「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、霊長類（例えば、ヒト又はサル）及び齧歯類（例えば、マウス又はラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物に由来する任意の天然ＰＤ－Ｌ１又は修飾されたＰＤ－１を包含する。前記用語には、「完全長」、加工されていないＰＤ－Ｌ１及び細胞内での加工により産生されたあらゆる形態のＰＤ－Ｌ１が含まれる。ＰＤ－Ｌ１は、膜貫通タンパク質又は可溶性タンパク質として存在することができる。前記用語には、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体などの、天然に存在するＰＤ－Ｌ１の変異体も含まれる。ＰＤ－Ｌ１の基本的な構造には、細胞外Ｉｇ様Ｖ型ドメイン、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの４つのドメインが含まれる。ＰＤ－Ｌ１配列は、当該分野で公知である。例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ．２９１２６で、ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（ゲノムＤＮＡ配列を含む）に関連する情報を見つけることができる。例示的な完全長ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿０５４８６２又はＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ９ＮＺＱ７で見つけることができる。
本願において、「抗原結合タンパク質」という用語は一般に、抗原結合部分、及び任意選択的に抗原に結合する部分が抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進する立体構造を使用できる足場又は骨格部分を含むタンパク質を指す。抗原結合タンパク質は典型的には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）又は上記の両方、及びその機能的断片を含んでもよい。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれる。抗原結合タンパク質の実例は、必要な抗原結合活性を示す限り、抗体、抗原結合断片、免疫複合体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、抗体断片、抗体誘導体、抗体類似体又は融合タンパク質などを含むが、これらに限定されない。
本願において、「抗体」という用語は一般に、指定されたタンパク質又はペプチド又はその断片と反応する免疫グロブリンを指す。抗体は、任意の種類に由来する抗体であってもよい。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、並びに任意のサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に由来する抗体を含むが、これらに限定されない。抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４から選ばれる重鎖定常領域を有してもよい。抗体はまた、例えばｋａｐｐａ（κ）又はｌａｍｂｄａ（λ）から選ばれる軽鎖を有してもよい。本願の抗体は、任意の種に由来してもよい。
本願において、「抗原結合断片」という用語は一般に、抗原と相互作用し、抗原に対する抗体の特異性及び親和性を与えるアミノ酸残基を含む抗体分子のある部分を指す。抗原結合断片の実例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ及び／又はｄＡｂを含んでもよいが、これらに限定されない。本願において、「Ｆａｂ」という用語は一般に、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含むと共に、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む断片を指す。「Ｆａｂ’」という用語は一般に、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ基末端に少量の残基（抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む）を付加することでＦａｂとは異なる断片を指す。「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は一般に、Ｆａｂ’の二量体、ヒンジ領域上のジスルフィド架橋によって接続された２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。「Ｆｖ」という用語は一般に、完全な抗原識別及び結合部位を含む最小の抗体断片を指す。幾つかの場合において、当該断片は、１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域が緊密に非共有結合する二量体で構成することができる。「ｄｓＦｖ」という用語は一般に、ジスルフィドで安定化されたＦｖ断片を指し、その単一の軽鎖可変領域と単一の重鎖可変領域との間の結合はジスルフィド結合である。「ｄＡｂ断片」という用語は一般に、ＶＨドメインからなる抗体断片を指す。本願において、「ｓｃＦｖ」という用語は一般に、抗体の１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインがフレキシブルペプチドリンカーを介して共有結合してペアリングして形成された一価分子を指し、このようなｓｃＦｖ分子は、一般構造ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有してもよい。
本願において、「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は一般に、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。本願において、「可変」という用語は一般に、抗体の可変ドメインの配列のある部分が大きく変化し、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合及び特異性をもたらすことを意味する。変異性は、抗体の可変領域全体に均一に分布するわけではない。それは、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３である、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、４つのＦＲ領域（Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、Ｈ－ＦＲ４、Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、Ｌ－ＦＲ４）を含み、大部分がβ－シート構造を採用し、３つのＣＤＲ構造ループ領域によって接続される。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって緊密に保持され、別の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位を形成する。
当該分野において、例えば配列可変性に基づくＫａｂａｔ番号付け方法及び定義規則（Ｋａｂａｔら、免疫学のタンパク質配列、第５版、米国国立衛生研究院、メリーランド州ベセスダ（１９９１）を参照）、構造ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｈｉａ番号付け方法及び定義規則（Ａ１－Ｌａｚｉｋａｎｉら、ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ２７３：９２７－４８、１９９７を参照）、ｅｆｒａｎｃらの生殖系Ｖ遺伝子に基づくアミノ酸配列アラインメントに基づくＩＭＧＴ番号付け方法及び定義規則、及びＨｏｎｎｅｇｅｒ’ｓ番号付け方法（ＡＨｏ’ｓ）、Ｍａｒｔｉｎ番号付け方法、Ｇｅｌｆａｎｄ番号付け方法（Ｍａｔｈｉｅｕ Ｄｏｎｄｅｌｉｎｇｅｒら、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｕｒｆａｃｅ／Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ、Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１８を参照）などの、様々な方法によって抗体の可変領域をコードするか、又は抗体のＣＤＲを分割することができる。
本願において、「モノクローナル抗体」という用語は一般に、基本的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、集団を構成する各抗体は、極めて小量で存在する可能性のある天然に存在する変異及び／又は翻訳後修飾（例えば異性化、アミド化）を除いて同じである。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一抗原部位を標的とする。
本願において、「キメラ抗体」という用語は一般に、可変領域がある種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体を指す。一般に、可変領域は、齧歯動物などの実験動物の抗体（「親抗体」）に由来し、且つ定常領域がヒト抗体に由来するため、得られたキメラ抗体は親（例えばマウス由来）抗体と比較して、ヒト個体において不良な免疫反応を引き起こす可能性が低下する。き起こす可能性が低下する。
本願において、「ヒト化抗体」という用語は一般に、非ヒト抗体（例えばマウス抗体）のＣＤＲ領域外の一部又は全てのアミノ酸がヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換される抗体を指す。ＣＤＲ領域において、アミノ酸の付加、欠失、挿入、置換又は修飾も、特定の抗原に対する抗体結合能力を保持する限り、許容される。ヒト化抗体は、任意選択的にヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。「ヒト化抗体」は、元の抗体と類似する抗原特異性を保持する。非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限に含むキメラ抗体であってもよい。幾つかの場合において、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）のＣＤＲ領域残基を、所望の性質、親和性及び／又は能力を有する非ヒト種（供与体抗体）（マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類動物など）のＣＤＲ領域残基で置き換えることができる。幾つかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦＲ領域残基を、対応する非ヒト残基で置き換えることができる。また、ヒト化抗体は、受容体抗体又は供与体抗体に存在しないアミノ酸修飾を含んでもよい。
本願において、「完全ヒト抗体」という用語は一般に、全ての部分（抗体の可変領域及び定常領域を含む）がいずれも、ヒト由来の遺伝子によってコードされる抗体を指す。当該分野で完全ヒト抗体を得る方法には、ファージディスプレイ技術、トランスジェニックマウス技術、リボソームディスプレイ技術及びＲＮＡ－ポリペプチド技術などが含まれてもよい。
本願において、「結合」、「特異的結合」又は「…に対して特異的」という用語は一般に、測定可能であると共に、再現可能である相互作用を指す。例えば、抗原と抗体との間の結合は、分子（生体分子を含む）が存在する異質集団における標的の存在を決定することができる。例えば、抗体は、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、又は当該結合には抗原結合ドメインとエピトープとの間のある程度の相補性が必要である。例えば、標的（エピトープであってもよい）に特異的に結合する抗体は、他の標的とより高い親和性、結合力で、より容易に、及び／又はより長い持続時間でこの標的に結合する抗体を指す。抗体が、結合されるランダムな、無関係なエピトープよりも、その抗原結合ドメインを介してエピトープに容易に結合する場合、抗体は、当該抗原に「特異的に結合する」と呼ばれる。
本願において、「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は互換的に使用され、一般に、アミノ酸残基のポリマーを指す。当該用語は、その１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の類似体又は模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用される。当該用語には、糖残基の付加による糖タンパク質の形成又はリン酸化による修飾など、修飾されたアミノ酸ポリマーが含まれてもよい。ポリペプチド及びタンパク質は、天然に存在する細胞及び非組換え細胞から、或いは、遺伝子工学改変された細胞若しくは組換え細胞から産生することができ、また、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、或いは、天然配列の１つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換を有する分子を含んでもよい。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は特に、本願に記載の抗原結合タンパク質の１つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換を有する配列を含む。
本願において、「相同体」という用語は一般に、野生型アミノ酸配列及び野生型ヌクレオチド配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を指す。「相同性」という用語は、配列「同一性」と同一であると見なされてもよい。相同配列には、主題配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％同じであるアミノ酸配列が含まれてもよい。一般に、相同体には、主題アミノ酸配列と同じの活性部位などが含まれる。相同性は、類似性（即ち、類似する化学性質／機能を有するアミノ酸残基）から考慮してもよく、配列同一性の観点から相同性を表現してもよい。本願において、言及されるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の配列番号のいずれか１つが百分率同一性を有する配列とは、言及される配列番号の全長にわたって前記百分率同一性を有する配列を指す。
本願において、「単離された」という用語は一般に、天然に存在する環境において通常付随又は相互作用する成分を実質的に含まない生体材料（例えばウイルス、核酸又はタンパク質）を指す。前記単離された生体材料は、任意選択的にその天然環境（例えば、核酸又はタンパク質）中の前記生体材料に判明されていない別の材料を含む。本願において、タンパク質に言及する場合、「単離された」とは一般に、前記分子が、当該分子の天然存在を見出した生物全体から単離と分離するか、或いは、基本的に他の同じ種類の生体大分子が存在しないことを意味する。核酸分子に言及する場合、それに天然に結合する配列から完全又は部分的に単離するか、又は当該核酸はそれに結合する異種配列を有するか、又は当該核酸は染色体から単離する。
本願において、「免疫複合体」という用語は一般に、抗原結合タンパク質が他の活性剤に結合して形成された物質を指し、他の活性剤は、化学療法剤、毒素、免疫療法剤、イメージングプローブ又は分光プローブなどの小分子活性剤であってもよい。
本願において、「核酸」分子という用語は一般に、その天然環境から単離された又は人工的に合成された任意の長さの単離形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はそれらの類似体を指す。
本願において、「担体」という用語は一般に、挿入された核酸分子を宿主細胞内及び／又は宿主細胞間に移転させる、適切な宿主内で自己複製できる核酸分子を指す。前記担体は、細胞へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入に主に使用される担体、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製に主に使用される担体、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳の発現に主に使用される担体を含んでもよい。前記担体は、様々な上記機能を有する担体を更に含む。前記担体は、適切な宿主細胞が導入される場合、ポリペプチドへの転写及び翻訳を可能にするポリヌクレオチドであってもよい。一般に、前記担体を含む適切な宿主細胞を培養することによって、前記担体は、所望の発現産物を産生することができる。
本願において、「細胞」という用語は一般に、本願に記載の核酸分子を含むプラスミド又は担体を含み得るか又は既に含有する、或いは、本願に記載の抗原結合タンパク質を発現することができる、個体細胞、細胞株又は細胞培養物を指す。前記細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含んでもよい。天然的、偶発的又は意図的な変異により、子孫細胞は、形態上又はゲノム上で元の親細胞と必ずしも完全に同じであるとは限らないが、本願に記載の抗体又はその抗原結合断片を発現することができればよい。前記細胞は、本願に記載の担体を使用して体外で細胞をトランスフェクトすることによって得ることができる。前記細胞は、原核細胞（例えば大腸菌）であってもよく、真核細胞（例えば酵母細胞、例えばＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＮＳ０細胞又は骨髄腫細胞）であってもよい。幾つかの場合において、前記細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。例えば、前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞であってもよい。
本願において、「医薬組成物」という用語は一般に、活性成分の生物学的活性が許容される有効な形態で存在すると共に、前記組成物に投与される対象に対して許容されない毒性を有する追加の成分を含まない製剤を指す。
本願において、「治療」という用語は一般に、治療される個体の自然経過の変更を所望し、且つ臨床病変過程における予防又は治療の臨床介入であってもよいことを意味する。必要を満たした治療効果は、疾患の発症や再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の軽減、移転の防止、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び予後の緩和又は改善を含むが、これらに限定されない。幾つかの場合において、本願の抗原結合タンパク質（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）は、疾患の発症を遅延するか、又は疾患の進行を緩和するために使用することができる。
本願において、「投与」という用語は一般に、一定の用量の化合物（例えば、抗がん治療薬）又は医薬組成物（例えば、抗がん治療薬を含む医薬組成物）を対象（例えば、患者）に投与する方法を指す。投与は、胃腸外、肺内及び鼻内、及び（局所治療が必要である場合）病巣内投与を含む、任意の適切な方法によって行うことができる。胃腸外注入には、例えば筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内又は皮下投与が含まれる。
本願において、「腫瘍」という用語は一般に、全ての新生物細胞の成長及び増殖（悪性又は良性に無関係）並びに全ての前癌性及び癌性細胞と組織を指す。本願において、前記腫瘍は、細胞及び組織のＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１高発現の腫瘍であってもよい。腫瘍は、固形腫瘍及び／又は非固形腫瘍を含んでもよい。
本願において、「含む」という用語は一般に、包含、総括、含有又は網羅の意味を指す。幾つかの場合において、「である」、「……からなる」の意味も表す。
本願において、「約」という用語は一般に、指定された数値の０．５％～１０％上下の範囲内での変動、例えば指定された数値の０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、又は１０％上下の範囲内での変動を意味する。
発明の詳細 本願は、組換え発現したヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を抗原として、マウスを４回免疫し、血清力価の高いマウス脾臓細胞を単離し、ＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させる。酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＳＩＡ）、蛍光活性化セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）、生物大分子相互作用表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）による親和性測定及び限界希釈法によるモノクローナル播種などの手段を使用し、ＰＤ－Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を発現するモノクローナルハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする。次に、候補細胞株からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、プライマーＰＣＲ方法により抗体重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を増幅し、配列決定により遺伝子配列が得られる。続いて同じモデリングを使用してデータベースと比較し、元のマウス配列をヒト由来に変異させ、最終的に高度にヒト化された、生物学的活性が高く、免疫原性が低いＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質が得られる。
ＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質
一態様によれば、本願は、次の性質のうちの１つ又は複数を有する、単離された抗原結合タンパク質を提供する：
（１）０．０７μｇ／ｍｌ又はより高いＥＣ５０値でＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することができること、
（２）ＰＤ－Ｌ１タンパク質とＰＤ－１タンパク質との間の結合を遮断することができること、
（３）Ｔ細胞の活性化を促進することができること、及び
（４）体内腫瘍の体積の増加を阻害することができること。
一態様によれば、本願は、次の性質のうちの１つ又は複数を有する、単離された抗原結合タンパク質を提供する：
（１）０．０７μｇ／ｍｌ又はより高いＥＣ５０値でＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することができること、
（２）ＰＤ－Ｌ１タンパク質とＰＤ－１タンパク質との間の結合を遮断することができること、
（３）Ｔ細胞の活性化を促進することができること、及び
（４）体内腫瘍の体積の増加を阻害することができること。
本願において、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合親和性は、当該分野で公知の任意の方法によって測定することができる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、結合抗原沈殿法、平衡透析法、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）によって結合親和性を測定することができる。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、０．０７μｇ／ｍｌ又はより高いＥＣ５０値でＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することができる。例えば、前記ＥＣ５０値は、約０．０７５μｇ／ｍｌ以上、約０．０８０μｇ／ｍｌ以上、約０．０８５μｇ／ｍｌ以上、約０．０９０μｇ／ｍｌ以上、約０．０９５μｇ／ｍｌ以上、約０．１μｇ／ｍｌ以上、約０．２μｇ／ｍｌ以上、約０．５μｇ／ｍｌ以上又は約１．０μｇ／ｍｌ以上であってもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、８×１０－１１Ｍ又はより低いＫＤ値でＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することができる。例えば、約７．５×１０－１１Ｍ以下、約７×１０－１１Ｍ以下、約６×１０－１１Ｍ以下、約５×１０－１１Ｍ以下、約４×１０－１１Ｍ以下、約３×１０－１１Ｍ以下、約２×１０－１１Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、約５×１０－１２Ｍ以下、約１×１０－１２Ｍ以下の前記ＫＤ値でヒトに由来するＰＤ－Ｌ１に結合することができる。例えば、ＦｏｒｔｉｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ分子相互作用アナライザーにより検出される。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合を遮断することができる。例えば、前記抗原結合タンパク質によるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合への遮断は、フローサイトメトリーＦＡＣＳ、酵素結合免疫吸着測定法ＥＬＩＳＡによって測定することができる。
例えば、まず、ヒトＰＤ－Ｌ１を安定的に発現する宿主細胞（ＣＨＯ－Ｋ１細胞など）を、標識されていない漸減量の前記抗原結合タンパク質と共にインキュベートし、次にビオチン標識されたＰＤ－１タンパク質を用いてインキュベートする。次に、前記抗原結合タンパク質によるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合への遮断を実証するために、ＦＡＣＳを使用して細胞を分析する。例えば、約０．００１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬの間、約０．００１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬの間、約０．０１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬの間、約０．０１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬの間、約０．００１μｇ／ｍＬ～約０．１μｇ／ｍＬの間である。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、Ｔ細胞の活性化を促進することができる。例えば、前記抗原結合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１を発現することができる標的細胞が存在する場合では（例えば、前記標的細胞は、ヒトＰＤ－Ｌ１を安定的に発現することができ、例えば、前記標的細胞はＣＨＯ－Ｋ１－ＯＳ８－ＰＤ－Ｌ１－８Ｄ６細胞であってもよい）、ヒトＰＤ－１を安定的に発現することができるＴ細胞（例えば、ヒトＰＤ－１及びＮＦＡＴ誘導性ルシフェラーゼのＪｕｒｋａｔを安定的に発現することができるＴ細胞）を活性化することができる。前記Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞のマイクロプレートリーダーの全波長の読取値を検出することによって得ることができる。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片を含んでもよい。
本願において、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ＶＨＨ及び／又はｄＡｂを含んでもよい。
本願において、前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体からなる群より選ばれる。
本願において、前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体からなる群より選ばれる。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、参照抗体と前記ＰＤ－Ｌ１タンパク質に競合的に結合し、そのうち前記参照抗体は、重鎖可変領域ＶＨ及び軽鎖可変領域ＶＬを含んでもよく、前記参照抗体のＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含んでもよく、前記参照抗体のＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記参照抗体のＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記参照抗体のＨＣＤＲ２は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記参照抗体のＨＣＤＲ３は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記参照抗体のＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記参照抗体のＬＣＤＲ２は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、及び前記参照抗体のＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗原結合タンパク質は、前記参照抗体と前記ＰＤ－Ｌ１タンパク質に競合的に結合することができ、即ち前記参照抗体と少なくとも一部が同じのＰＤ－Ｌ１エピトープに競合的に結合することができる。
本願において、前記ＣＤＲ配列はいずれも、特定のＣＤＲ分割基準（例えばＫａｂａｔ法）に基づいて分割する。説明すべきことは、あるＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質のアミノ酸配列が、特定のＣＤＲ分割基準（例えばＫａｂａｔ法）に基づいて分割して得られたＣＤＲは、本願にかかるＣＤＲ配列と同じである場合、当該ＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質のアミノ酸配列も本願の請求範囲内に含まれる。異なるＣＤＲ分割標準によって、ＣＤＲ位置の正確な標識は僅かに異なる可能性があるため、本願には、配列表に示されるＣＤＲが含まれるだけでなく、他の番号付けシステムのＶＨ及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲが含まれる。また、これらのＶＨ及びＶＬ配列は、ｓｃＦｖ形態又はＦａｂ形態で使用することができる。
本願において、前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質は、配列番号１１～１６のいずれか１つに示される重鎖可変領域に含まれた、任意のＣＤＲ分割形態で分割されたＨＣＤＲ１～３のうちの少なくとも１つを有する。
本願において、前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質は、配列番号１７～２０のいずれか１つに示される軽鎖可変領域に含まれた、任意のＣＤＲ分割形態で分割されたＬＣＤＲ１～３のうちの少なくとも１つを有する。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＨＣＤＲ１を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＨＣＤＲ２を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ２は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。前記ＨＣＤＲ２は、ＷＩＹＬＧＳＧＮＡＫＹＸ１Ｘ２ＫＦＸ３Ｇ（配列番号２１）に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、ここで、Ｘ１はＮ又はＳであってもよく、Ｘ２はＥ又はＱであってもよく、Ｘ３はＫ又はＱであってもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＨＣＤＲ２を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ２は配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＨＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。前記ＨＣＤＲ３は、Ｘ１ＶＧＴＹＷＹＦＤＶ（配列番号２２）に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、ここで、ここで、Ｘ１はＣ又はＳであってもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＨＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３又は５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含んでもよく、そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
そのうち前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＨ－ＦＲ１を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端は前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接的又は間接的に連結し、且つ前記Ｈ－ＦＲ１は配列番号４８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記Ｈ－ＦＲ１は配列番号２４～２７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２との間に位置するＨ－ＦＲ２を含んでもよく、且つ前記Ｈ－ＦＲ２は配列番号４９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記Ｈ－ＦＲ２は配列番号２８～２９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３との間に位置するＨ－ＦＲ３を含んでもよく、且つ前記Ｈ－ＦＲ３は配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記Ｈ－ＦＲ２は配列番号３０～３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＨ－ＦＲ４を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ４の位置するＮ末端は前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に連結し、且つ前記Ｈ－ＦＲ４は配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記Ｈ－ＦＲ２は配列番号３４～３５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３及びＨ－ＦＲ４は、
（１）Ｈ－ＦＲ１：配列番号２４、Ｈ－ＦＲ２：配列番号２８、Ｈ－ＦＲ３：配列番号３０及びＨ－ＦＲ４：配列番号３４、又は、
（２）Ｈ－ＦＲ１：配列番号２５、Ｈ－ＦＲ２：配列番号２９、Ｈ－ＦＲ３：配列番号３１及びＨ－ＦＲ４：配列番号３５、又は、
（３）Ｈ－ＦＲ１：配列番号２６、Ｈ－ＦＲ２：配列番号２９、Ｈ－ＦＲ３：配列番号３２及びＨ－ＦＲ４：配列番号３５、又は、
（４）Ｈ－ＦＲ１：配列番号２７、Ｈ－ＦＲ２：配列番号２９、Ｈ－ＦＲ３：配列番号３３及びＨ－ＦＲ４：配列番号３５、という任意のアミノ酸配列からなる群より選ばれる。
（１）Ｈ－ＦＲ１：配列番号２４、Ｈ－ＦＲ２：配列番号２８、Ｈ－ＦＲ３：配列番号３０及びＨ－ＦＲ４：配列番号３４、又は、
（２）Ｈ－ＦＲ１：配列番号２５、Ｈ－ＦＲ２：配列番号２９、Ｈ－ＦＲ３：配列番号３１及びＨ－ＦＲ４：配列番号３５、又は、
（３）Ｈ－ＦＲ１：配列番号２６、Ｈ－ＦＲ２：配列番号２９、Ｈ－ＦＲ３：配列番号３２及びＨ－ＦＲ４：配列番号３５、又は、
（４）Ｈ－ＦＲ１：配列番号２７、Ｈ－ＦＲ２：配列番号２９、Ｈ－ＦＲ３：配列番号３３及びＨ－ＦＲ４：配列番号３５、という任意のアミノ酸配列からなる群より選ばれる。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域ＶＨを含んでもよく、前記ＶＨは配列番号１１～１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、重鎖定常領域を含んでもよく、前記重鎖定常領域はＩｇＧに由来することができる。例えば、前記重鎖定常領域はヒトＩｇＧに由来することができる。前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に由来することができる。例えば、前記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１に由来することができる。例えば、前記ヒトＩｇＧ１定常領域は配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ１を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ２を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ２は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。前記ＬＣＤＲ３は、ＤＴＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｓ（配列番号２３）に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、そのうちＸ１はＮ又はＳであってもよく、Ｘ２はＬ又はＶであってもよく、Ｘ１はＡ又はＱであってもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ２を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ２は配列番号７、９又は１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ３を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含んでもよく、そのうち前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
そのうち前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
そのうち前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
そのうち前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
そのうち前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含んでもよく、ここで、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、また、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＬ－ＦＲ１を含んでもよく、前記Ｌ－ＦＲ１のＣ末端は前記ＬＣＤＲ１のＮ末端に直接的又は間接的に連結し、且つ前記Ｌ－ＦＲ１は配列番号３６～３８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、前記ＬＣＤＲ１と前記ＬＣＤＲ２との間に位置するＬ－ＦＲ２を含んでもよく、且つ前記Ｌ－ＦＲ２は配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記Ｌ－ＦＲ２は配列番号３９～４１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、前記ＬＣＤＲ２と前記ＬＣＤＲ３との間に位置するＬ－ＦＲ３を含んでもよく、且つ前記Ｌ－ＦＲ３は配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記Ｌ－ＦＲ２は配列番号４２～４５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＬ－ＦＲ４を含んでもよく、前記Ｌ－ＦＲ４の位置するＮ末端は前記ＬＣＤＲ３のＣ末端に連結し、且つ前記Ｌ－ＦＲ４は配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記Ｌ－ＦＲ２は配列番号４６～４７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３及びＬ－ＦＲ４は、
（１）Ｌ－ＦＲ１：配列番号３６、Ｌ－ＦＲ２：配列番号３９、Ｌ－ＦＲ３：配列番号４２及びＬ－ＦＲ４：配列番号４６、又は、
（２）Ｌ－ＦＲ１：配列番号３７、Ｌ－ＦＲ２：配列番号４０、Ｌ－ＦＲ３：配列番号４３及びＬ－ＦＲ４：配列番号４７、又は、
（３）Ｌ－ＦＲ１：配列番号３８、Ｌ－ＦＲ２：配列番号４０、Ｌ－ＦＲ３：配列番号４４及びＬ－ＦＲ４：配列番号４７、又は、
（４）Ｌ－ＦＲ１：配列番号３８、Ｌ－ＦＲ２：配列番号４１、Ｌ－ＦＲ３：配列番号４５及びＬ－ＦＲ４：配列番号４７、という任意のアミノ酸配列からなる群より選ばれる。
（１）Ｌ－ＦＲ１：配列番号３６、Ｌ－ＦＲ２：配列番号３９、Ｌ－ＦＲ３：配列番号４２及びＬ－ＦＲ４：配列番号４６、又は、
（２）Ｌ－ＦＲ１：配列番号３７、Ｌ－ＦＲ２：配列番号４０、Ｌ－ＦＲ３：配列番号４３及びＬ－ＦＲ４：配列番号４７、又は、
（３）Ｌ－ＦＲ１：配列番号３８、Ｌ－ＦＲ２：配列番号４０、Ｌ－ＦＲ３：配列番号４４及びＬ－ＦＲ４：配列番号４７、又は、
（４）Ｌ－ＦＲ１：配列番号３８、Ｌ－ＦＲ２：配列番号４１、Ｌ－ＦＲ３：配列番号４５及びＬ－ＦＲ４：配列番号４７、という任意のアミノ酸配列からなる群より選ばれる。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、軽鎖可変領域ＶＬを含んでもよく、そのうち前記ＶＬは、配列番号１７～２０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、軽鎖定常領域を含んでもよく、前記軽鎖定常領域は軽鎖λ及び軽鎖κに由来することができる。例えば、前記軽鎖定常領域は配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域ＶＨ及び軽鎖可変領域ＶＬを含んでもよく、ここで、
前記ＶＨは配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
前記ＶＨは配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、又は、
前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記抗原結合タンパク質のＣＤＲは、命名規則に従って分割することができる。例えば、Ｋａｂａｔ規則に従って分割することができる。
本願において、前記抗原結合タンパク質の各重鎖又は軽鎖アミノ酸配列の一部は、特定の種に由来する抗体の対応するアミノ酸配列と同じであるか、又は特定の種類に属する。例えば、軽鎖及び重鎖の可変領域及び定常部分はいずれも、１つの動物種（例えばヒト）に由来する抗体の可変領域及び定常領域である。本願において、前記相同体は、前記タンパク質及び／又は前記ポリペプチド（例えば、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異的に結合する抗体又はその断片）のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はより高い）の配列相同性を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
本願において、前記相同性は一般に、２つ又は複数の配列間の類似性、類似又は関連を指す。配列相同性百分率を決定するためのアラインメントは、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用するなど、当該分野で公知の様々な方法により実現することができる。当業者は、比較されている全長配列範囲内又は目的配列領域内で最大限のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。前記相同性は、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴという方法によって測定することもできる。ＦＡＳＴＡアルゴリズムに対する説明は、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎの「生物学的配列比較のための改善されたツール」、米国国家科学院紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、８５：２４４４～２４４８、１９８８、並びに、Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ及びＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎの「高速且つ高感度のタンパク質類似性検索」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７：１４３５～１４４１、１９８９を参照することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムに対する説明は、Ｓ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｗ．Ｇｉｓｈ、Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅ．Ｗ．Ｍｙｅｒｓ及びＤ．Ｌｉｐｍａｎの「基本的な局所アラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）検索ツール」、分子生物学雑誌、２１５：４０３～４１０、１９９０を参照することができる。
検出方法
当該分野で公知の様々な測定によって、本願に記載されるＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質の物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性を同定、スクリーニング又は特徴付けすることができる。
当該分野で公知の様々な測定によって、本願に記載されるＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質の物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性を同定、スクリーニング又は特徴付けすることができる。
一態様において、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット（例えば、ウェスタンブロット）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）、免疫組織化学、免疫蛍光などの、公知の方法によって本願の抗原結合タンパク質の抗原結合活性を試験することができる。
核酸、担体、宿主細胞及び製造方法
別の態様において、本願は、単離された１つ又は複数の核酸分子を更に提供する。前記１つ又は複数の核酸分子は、本願に記載の抗原結合タンパク質をコードすることができる。例えば、前記１つ又は複数の核酸分子におけるそれぞれの核酸分子は、完全な前記抗原結合タンパク質をコードすることができ、そのうちの一部（例えば、ＨＣＤＲ１－３、ＬＣＤＲ１－３、ＶＬ、ＶＨ、軽鎖又は重鎖の１つ又は複数）をコードすることもできる。
別の態様において、本願は、単離された１つ又は複数の核酸分子を更に提供する。前記１つ又は複数の核酸分子は、本願に記載の抗原結合タンパク質をコードすることができる。例えば、前記１つ又は複数の核酸分子におけるそれぞれの核酸分子は、完全な前記抗原結合タンパク質をコードすることができ、そのうちの一部（例えば、ＨＣＤＲ１－３、ＬＣＤＲ１－３、ＶＬ、ＶＨ、軽鎖又は重鎖の１つ又は複数）をコードすることもできる。
本願に記載の核酸分子は単離されたものであってもよい。例えば、（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの体外での増幅による産生、（ｉｉ）クローン組換えによる産生、（ｉｉｉ）酵素切断及びゲル電気泳動分画による精製、或いは（ｉｖ）化学合成などの合成という方法によって産生又は合成することができる。幾つかの実施形態において、前記単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術により製造された核酸分子である。
本願において、制限性断片操作の使用又は合成オリゴヌクレオチドによるオーバーラップエクステンションＰＣＲの使用を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の様々な方法によって前記抗体、その抗原結合断片をコードする核酸を製造することができる。
別の態様において、本願は、本願に記載の１つ又は複数の核酸分子を含む１つ又は複数の担体を提供する。各種類の担体には、１つ又は複数の前記核酸分子が含まれてもよい。また、前記担体には、適切な宿主細胞内及び適切な条件で、当該担体の選択を可能にするマーカー遺伝子などの、他の遺伝子が含まれてもよい。また、前記担体は、適切な宿主におけるコード領域の正しい発現を可能にする発現制御要素を更に含んでもよい。例えば、前記担体は発現担体である。
別の態様において、本願は、本願に記載の１つ又は複数の核酸分子及び／又は本願に記載の１つ又は複数の担体を含んでもよい宿主細胞を提供する。幾つかの実施形態において、各種又はそれぞれの宿主細胞は、本願に記載の１つ又は１種の核酸分子又は担体を含んでもよい。幾つかの実施形態において、各種又はそれぞれの宿主細胞は、本願に記載の複数（例えば、２つ以上）又は複数種（例えば、２種以上）の核酸分子又は担体を含んでもよい。
別の態様において、本願は、前記抗体又はその抗原結合断片を製造する方法を提供する。前記方法は、前記抗体又はその抗原結合断片の発現が可能な条件で、本願に記載の前記宿主細胞を培養することを含んでもよい。例えば、適切な培地の使用、適切な温度及び培養時間などによる、これらの方法は当業者に理解されるものである。
医薬組成物、方法、使用
別の態様において、本願は、本願に記載の抗原結合タンパク質、前記ポリペプチド、前記核酸分子、前記担体、前記宿主細胞と、任意選択的に薬学的に許容される担体と、を含んでもよい医薬組成物を提供する。前記薬学的に許容されるアジュバントは、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒である。本願における医薬組成物は、１種以上の活性化合物、一般に互いに悪影響を与えない相補活性を有する活性化合物を更に含んでもよい。このような薬物の種類及び有効量は、例えば製剤に存在する拮抗薬の量及び種類、並びに対象の臨床パラメータに依存する。
別の態様において、本願は、本願に記載の抗原結合タンパク質、前記ポリペプチド、前記核酸分子、前記担体、前記宿主細胞と、任意選択的に薬学的に許容される担体と、を含んでもよい医薬組成物を提供する。前記薬学的に許容されるアジュバントは、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒である。本願における医薬組成物は、１種以上の活性化合物、一般に互いに悪影響を与えない相補活性を有する活性化合物を更に含んでもよい。このような薬物の種類及び有効量は、例えば製剤に存在する拮抗薬の量及び種類、並びに対象の臨床パラメータに依存する。
前記医薬組成物は、腫瘍成長を阻害するために使用することができる。例えば、本願の医薬組成物は、疾患の発症又は進行を阻害又は遅延することができ、腫瘍のサイズを縮小することができ（基本的に腫瘍を除去することさえ）、及び／又は疾患状態を軽減及び／又は安定化させることができる。
本願に記載の医薬組成物は、予防及び／又は治療有効量の前記抗体、その抗原結合断片を含んでもよい。前記予防及び／又は治療有効量は、疾患又は病状及び／又はその任意の合併症に罹患している又は発症のリスクがある対象を予防及び／又は治療（少なくとも部分的に治療）するのに必要な用量である。
別の態様によれば、本願は、薬物の製造における前記抗原結合タンパク質及び／又は前記融合タンパク質の使用を提供する。前記薬物は、がんの治療、腫瘍成長の阻害及び／又は腫瘍細胞増殖の阻害に使用される。幾つかの実施形態において、前記腫瘍又はがんは、ＰＤ－Ｌ１発現異常の腫瘍又はがんである。本願において、前記腫瘍は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１高発現の腫瘍を含んでもよい。本願において、前記腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１高発現の腫瘍を含んでもよい。本願において、前記腫瘍は、固形腫瘍を含んでもよい。本願において、前記腫瘍は結腸がんを含んでもよい。
別の態様によれば、本願は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合を阻害する方法であって、本願に記載の抗原結合タンパク質及び／又は前記ポリペプチドを投与することを含む、方法を提供する。例えば、前記方法は、インビトロ又は体外方法であってもよい。例えば、前記方法は、非治療目的の方法であってもよい。幾つかの場合において、前記方法は、ＰＤ－Ｌ１への前記抗原結合タンパク質及び／又はＰＤ－１の結合を可能にする条件で、生体サンプルを本願に記載の抗原結合タンパク質及び／又はＰＤ－Ｌ１と接触させること、前記抗原結合タンパク質とＰＤ－Ｌ１との間に複合体が形成されるか否かを検出すること、及び、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間に複合体が形成されるか否かを検出することを含んでもよい。
別の態様によれば、本願は、Ｔ細胞の活性化を促進する方法であって、前記単離された抗原結合タンパク質及び／又は前記ポリペプチドを投与することを含む、方法を提供する。例えば、前記方法は、インビトロ又は体外方法であってもよい。例えば、前記方法は、非治療目的の方法であってもよい。
別の態様によれば、本願は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の存在及び／又は含有量を検出するための方法であって、前記単離された抗原結合タンパク質及び／又は前記ポリペプチドを投与することを含む、方法を提供する。例えば、前記方法は、インビトロ又は体外方法であってもよい。例えば、前記方法は、非治療目的の方法であってもよい。
本願は、腫瘍又はがんに罹患している対象を診断する方法における、抗原結合タンパク質の使用であって、前記方法が、サンプルを本願の抗原結合タンパク質と接触させ、結合される抗体の存在を検出することで、対象サンプルから取得したＰＤ－Ｌ１の存在又は発現レベルを決定することを含む、使用を更に提供する。
別の態様によれば、本願は、本願に記載の核酸分子又は本願に記載の抗原結合タンパク質を含んでもよい、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
別の態様によれば、本願は、前記抗原結合断片を含んでもよい、抗体薬物複合体を提供する。
別の態様によれば、本願は、本願に記載の抗原結合タンパク質、キメラ抗原受容体、遺伝子修飾された細胞、抗体薬物複合体、及び／又は本願に記載の医薬組成物を含んでもよい、キットを提供する。単一の一般的な容器には、本願に記載の抗原結合タンパク質、キメラ抗原受容体、遺伝子修飾された細胞、及び／又は抗体薬物複合体が含まれてもよく、任意選択的に１つ又は複数の治療薬と組み合わせ、任意選択的に医薬組成物に調製されてもよい。
別の態様によれば、本願は、本願に記載の抗原結合タンパク質又はその医薬組成物を投与するために使用できる、投与装置を提供する。
いかなる理論によって制限されることを意図することなく、以下の実施例は、本願の抗原結合タンパク質、製造方法及び使用などを説明するものに過ぎず、本願の発明の範囲を限定するものではない。
実施例
実施例１モノクローナル抗体のスクリーニング
１．１動物の免疫
１日目に初回免疫を行い、５０μｇ／マウスの用量で抗原を複数の箇所に皮下注射した。抗原は、組換えヒトＰＤ－Ｌ１（製品番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）をフロイントの完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ、ＣＦＡ）で乳化させた後のタンパク質であった。続いて三回追加免疫を行い、ＥＬＩＳＡ方法によりマウス血清中の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の力価が検出された。血清中の抗体力価が比較的高いマウスを脾細胞融合のために選択した。
実施例１モノクローナル抗体のスクリーニング
１．１動物の免疫
１日目に初回免疫を行い、５０μｇ／マウスの用量で抗原を複数の箇所に皮下注射した。抗原は、組換えヒトＰＤ－Ｌ１（製品番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）をフロイントの完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ、ＣＦＡ）で乳化させた後のタンパク質であった。続いて三回追加免疫を行い、ＥＬＩＳＡ方法によりマウス血清中の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の力価が検出された。血清中の抗体力価が比較的高いマウスを脾細胞融合のために選択した。
１．２ハイブリドーマ融合及びスクリーニング
ハイブリドーマ融合のために、力価が比較的高い４匹のマウスの脾臓を摘出した。マウス脾臓を細胞懸濁液に粉砕し、赤血球を除去した後、脾リンパ球と骨髄腫細胞Ｓｐ２／０とを混合し、電気融合装置を介して脾リンパ球と骨髄腫細胞Ｓｐ２／０とを融合し、ＨＡＴを含有する培地を加えて培養してスクリーニングした後、ハイブリドーマ細胞を得た。抗原抗体間接ＥＬＳＩＡ検出を用いてハイブリドーマ細胞の初回スクリーニングを行った。３０４個のポリクローナル細胞株を選び出して限界希釈法を使用してモノクローナル化を行った。細胞クローンが生成した後、モノクローナル細胞株の培養上清を取り出し、ＥＬＩＳＡ方法を使用してヒトとアカゲザルＰＤ－Ｌ１との結合活性を検出し、フローサイトメーターでＰＤ－Ｌ１を発現するＥＳ－２細胞の結合活性を検出し、その中から高い結合活性を有する細胞株を選び出し、更にＢｉａｃｏｒｅを使用してその培養上清の親和性検出を実施し、最終的に３７個の高い結合活性、高い親和性を有する細胞株を抗体可変領域遺伝子クローンのためにスクリーニングした。
ハイブリドーマ融合のために、力価が比較的高い４匹のマウスの脾臓を摘出した。マウス脾臓を細胞懸濁液に粉砕し、赤血球を除去した後、脾リンパ球と骨髄腫細胞Ｓｐ２／０とを混合し、電気融合装置を介して脾リンパ球と骨髄腫細胞Ｓｐ２／０とを融合し、ＨＡＴを含有する培地を加えて培養してスクリーニングした後、ハイブリドーマ細胞を得た。抗原抗体間接ＥＬＳＩＡ検出を用いてハイブリドーマ細胞の初回スクリーニングを行った。３０４個のポリクローナル細胞株を選び出して限界希釈法を使用してモノクローナル化を行った。細胞クローンが生成した後、モノクローナル細胞株の培養上清を取り出し、ＥＬＩＳＡ方法を使用してヒトとアカゲザルＰＤ－Ｌ１との結合活性を検出し、フローサイトメーターでＰＤ－Ｌ１を発現するＥＳ－２細胞の結合活性を検出し、その中から高い結合活性を有する細胞株を選び出し、更にＢｉａｃｏｒｅを使用してその培養上清の親和性検出を実施し、最終的に３７個の高い結合活性、高い親和性を有する細胞株を抗体可変領域遺伝子クローンのためにスクリーニングした。
１．３抗ＰＤ－Ｌ１ヒト－マウスキメラ抗体の製造
ハイブリドーマスクリーニングによって得られた３７個のクローン細胞株に対して、まずＱＩＡＧＥＮ社のＲＮＡ抽出キット（製品番号：７４１０６）を使用して製造業者の取扱説明書に従って細胞総ＲＮＡを抽出し、更にＴａｋａｒａ社の５’ｃＤＮＡ末端高速増幅（５’ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ、５’ＲＡＣＥ）技術により、マウス抗体を発現するｃＤＮＡ配列を含有するハイブリドーマ細胞をクローンした。更に２ラウンドのＰＣＲにより抗体可変領域配列を増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を分析した。重鎖及び軽鎖の両方の可変領域アンプリコンの予期サイズは約５００塩基対であった。反応により得られた適切なバンドサイズの増幅ＰＣＲ産物を担体ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ Ｓｉｍｐｌｅ ｖｅｃｔｏｒ（製品番号：ＣＢ１１１－０２、北京全式金生物技術有限公司））にクローンし、またＳｔｅｌｌａｒ大腸菌コンピテント細胞（製品番号：６３６７６３、ＴＡＫＡＲＡ）に変換した。ユニバーサルＭ１３フォワード又はリバースプライマーのコロニーＰＣＲによりクローンをスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定分析のために各反応から２～３個のクローンを選択した。Ｅｘｐａｓｙ－ｔｒａｎｓｌａｔｅ ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｒａｎｓｌａｔｅ／）を用いて各クローンの各配列決定反応の結果を分析した。最終的に３０個のマウスモノクローナル抗体可変領域配列の抽出に成功した。３０個の正しいクローンに対して、ＰＣＲにより重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を増幅し、ヒトＩｇＧ１定常領域配列を含有する担体及びヒトＩｇκ定常領域配列の担体にそれぞれ接続し、キメラ抗体の重鎖発現担体及び軽鎖発現担体を構築した。ここで、重鎖定常領域ＣＨ２の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付けシステム）のロイシンは、抗体Ｆｃ断片によって媒介されたＡＤＣＣ／ＣＤＣ／ＡＤＣＰなどの機能活性を弱めるために、アラニンに変異した。発現担体は、ポリエーテルイミド（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｉｍｉｄｅ、ＰＥＩ）と混合してリポソーム複合体を形成した後、ＣＨＯ－Ｓ細胞（製品番号：Ｒ８０００７、賽黙飛世爾科技（中国）有限公司）にトランスフェクトし、７日間培養した後、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて抗体を精製した。得られたキメラ抗体を体外、体内の生物学的活性について測定した。
ハイブリドーマスクリーニングによって得られた３７個のクローン細胞株に対して、まずＱＩＡＧＥＮ社のＲＮＡ抽出キット（製品番号：７４１０６）を使用して製造業者の取扱説明書に従って細胞総ＲＮＡを抽出し、更にＴａｋａｒａ社の５’ｃＤＮＡ末端高速増幅（５’ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ、５’ＲＡＣＥ）技術により、マウス抗体を発現するｃＤＮＡ配列を含有するハイブリドーマ細胞をクローンした。更に２ラウンドのＰＣＲにより抗体可変領域配列を増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を分析した。重鎖及び軽鎖の両方の可変領域アンプリコンの予期サイズは約５００塩基対であった。反応により得られた適切なバンドサイズの増幅ＰＣＲ産物を担体ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ Ｓｉｍｐｌｅ ｖｅｃｔｏｒ（製品番号：ＣＢ１１１－０２、北京全式金生物技術有限公司））にクローンし、またＳｔｅｌｌａｒ大腸菌コンピテント細胞（製品番号：６３６７６３、ＴＡＫＡＲＡ）に変換した。ユニバーサルＭ１３フォワード又はリバースプライマーのコロニーＰＣＲによりクローンをスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定分析のために各反応から２～３個のクローンを選択した。Ｅｘｐａｓｙ－ｔｒａｎｓｌａｔｅ ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｒａｎｓｌａｔｅ／）を用いて各クローンの各配列決定反応の結果を分析した。最終的に３０個のマウスモノクローナル抗体可変領域配列の抽出に成功した。３０個の正しいクローンに対して、ＰＣＲにより重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を増幅し、ヒトＩｇＧ１定常領域配列を含有する担体及びヒトＩｇκ定常領域配列の担体にそれぞれ接続し、キメラ抗体の重鎖発現担体及び軽鎖発現担体を構築した。ここで、重鎖定常領域ＣＨ２の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付けシステム）のロイシンは、抗体Ｆｃ断片によって媒介されたＡＤＣＣ／ＣＤＣ／ＡＤＣＰなどの機能活性を弱めるために、アラニンに変異した。発現担体は、ポリエーテルイミド（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｉｍｉｄｅ、ＰＥＩ）と混合してリポソーム複合体を形成した後、ＣＨＯ－Ｓ細胞（製品番号：Ｒ８０００７、賽黙飛世爾科技（中国）有限公司）にトランスフェクトし、７日間培養した後、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて抗体を精製した。得られたキメラ抗体を体外、体内の生物学的活性について測定した。
１．４抗ＰＤ－Ｌ１ヒト－マウスキメラ抗体のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断活性の検出
２つの側面からの抗体の遮断活性の検出：
（１）抗体による遊離ＰＤ－１と細胞表面ＰＤ－Ｌ１との結合の遮断作用を検出し、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞を、２×１０４／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、ヒトＰＤ－１－ｈｉｓ ｔａｇ（製品番号：１０３７７－Ｈ０８Ｈ－１００、北京義翹神州生物技術有限公司）組換えタンパク質を、培地で６μｇ／ｍＬに希釈して２０μｌ／ウェルで９６ウェルに加え、均一に混合し、室温で３０ｍｉｎインキュベートした後、希釈した測定されるサンプル２０μｌを加え、均一に混合し、室温で３０ｍｉｎインキュベートした。３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで細胞を２回洗浄し、ａｎｔｉ－ｈｉｓ－ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８（製品番号：ａｂ１１７５１２、Ａｂｃａｍ）二次抗体を１：５００で希釈した後に加え、均一に混合し、室温で１５ｍｉｎインキュベートした。細胞を３回洗浄した後、細胞表面の蛍光強度を装置で検出し、結果を図１に示した。
２つの側面からの抗体の遮断活性の検出：
（１）抗体による遊離ＰＤ－１と細胞表面ＰＤ－Ｌ１との結合の遮断作用を検出し、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞を、２×１０４／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、ヒトＰＤ－１－ｈｉｓ ｔａｇ（製品番号：１０３７７－Ｈ０８Ｈ－１００、北京義翹神州生物技術有限公司）組換えタンパク質を、培地で６μｇ／ｍＬに希釈して２０μｌ／ウェルで９６ウェルに加え、均一に混合し、室温で３０ｍｉｎインキュベートした後、希釈した測定されるサンプル２０μｌを加え、均一に混合し、室温で３０ｍｉｎインキュベートした。３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで細胞を２回洗浄し、ａｎｔｉ－ｈｉｓ－ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８（製品番号：ａｂ１１７５１２、Ａｂｃａｍ）二次抗体を１：５００で希釈した後に加え、均一に混合し、室温で１５ｍｉｎインキュベートした。細胞を３回洗浄した後、細胞表面の蛍光強度を装置で検出し、結果を図１に示した。
（２）抗体による遊離ＰＤ－Ｌ１と細胞表面ＰＤ－１との結合の遮断作用を検出し、ヒトＰＤ－１を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕＰＤ－１細胞を２×１０４／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、ヒトＰＤ－Ｌ１－ｍｏＦｃ組換えタンパク質（配列番号５７）を、培地で１５μｇ／ｍｌに希釈して２０μｌ／ウェルで９６ウェルに加え、均一に混合し、室温で１５ｍｉｎインキュベートした後、希釈した測定されるサンプル２０μｌを加え、均一に混合し、室温で１５ｍｉｎインキュベートした。３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、Ａｎｔｉ－ｍｏＦｃ－ａｌｅｘａ ４８８（製品番号：１１５－５４５－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ）二次抗体を１：３００で希釈した後に加え、均一に混合し、室温で１５ｍｉｎインキュベートした。細胞を３回洗浄した後、細胞表面の蛍光強度を装置で検出し、結果を図２に示した。
遮断実験では、検出値が低いほど、ＰＤ－Ｌ１抗体の遮断効果が高いことを示し、図１及び図２の結果から分かるように、９００２４５抗体の遮断効果が最も強く、且つ対照抗体と比較して非劣性を有した。
１．５ ＳＰＲ法による抗ＰＤ－Ｌ１抗体の親和性の検出
Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｒｕｅ Ｋｉｔ（製品番号：ＢＲ－１００８－３９、ＧＥ）及びアミノカップリングキット（製品番号：ＢＲ－１０００－５０、ＧＥ）カップリング法に従ってＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｃａｐｔｕｒｅ－ＣＭ５チップ（製品番号：ＢＲ－１００５－３０、ＧＥ）を準備した。チップを室温で２０～３０ｍｉｎ平衡させ、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器に取り付け、平衡緩衝液でＢ５Ｄ１を実験作動濃度に希釈し、抗原を平衡緩衝液で５０ｎＭに希釈し、更に７濃度勾配で３倍希釈し、２個のゼロ濃度（即ち平衡緩衝液）及び１個の反復濃度（一般に最低濃度の反復）を設定し、抗体、抗原ｈｕＰＤ－Ｌ１（製品番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）の再生順位に従って、繰り返して１０個の抗原濃度（２個のゼロ濃度、７個の勾配濃度及び１個の反復濃度）を実験分析し、抗原の注入流速は３０μｌ／分間、結合時間は１２０秒、解離時間は６００秒であり、分析完了後、対応する分析プログラムを選択してデータを分析し、明らかなｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇがないことを確認した後、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、１：１のｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを選択してデータをフィッティングし、ヒト－マウスキメラ抗体及び対照抗体の動態関連パラメータＫａ、Ｋｄ及びＫＤ値を取得し、結果を表１に示した。キメラ抗体９００２４５は、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原に対して非常に強い親和性を有し、且つ他の製造業者の対照抗体（ＭＤＸ １１０５、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ及びＡｖｅｌｕｍａｂ、それぞれＢＭＳ、ロッシュ、アストラゼネカ及びファイザーに開示された配列、合成遺伝子の発現及び精製により得られた）よりも優れた。
Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｒｕｅ Ｋｉｔ（製品番号：ＢＲ－１００８－３９、ＧＥ）及びアミノカップリングキット（製品番号：ＢＲ－１０００－５０、ＧＥ）カップリング法に従ってＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｃａｐｔｕｒｅ－ＣＭ５チップ（製品番号：ＢＲ－１００５－３０、ＧＥ）を準備した。チップを室温で２０～３０ｍｉｎ平衡させ、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器に取り付け、平衡緩衝液でＢ５Ｄ１を実験作動濃度に希釈し、抗原を平衡緩衝液で５０ｎＭに希釈し、更に７濃度勾配で３倍希釈し、２個のゼロ濃度（即ち平衡緩衝液）及び１個の反復濃度（一般に最低濃度の反復）を設定し、抗体、抗原ｈｕＰＤ－Ｌ１（製品番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）の再生順位に従って、繰り返して１０個の抗原濃度（２個のゼロ濃度、７個の勾配濃度及び１個の反復濃度）を実験分析し、抗原の注入流速は３０μｌ／分間、結合時間は１２０秒、解離時間は６００秒であり、分析完了後、対応する分析プログラムを選択してデータを分析し、明らかなｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇがないことを確認した後、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、１：１のｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを選択してデータをフィッティングし、ヒト－マウスキメラ抗体及び対照抗体の動態関連パラメータＫａ、Ｋｄ及びＫＤ値を取得し、結果を表１に示した。キメラ抗体９００２４５は、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原に対して非常に強い親和性を有し、且つ他の製造業者の対照抗体（ＭＤＸ １１０５、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ及びＡｖｅｌｕｍａｂ、それぞれＢＭＳ、ロッシュ、アストラゼネカ及びファイザーに開示された配列、合成遺伝子の発現及び精製により得られた）よりも優れた。
実施例２ 抗体のヒト化
９００２４５の可変領域（ＶＨ：配列番号１１、ＶＬ：配列番号１７）をヒト化し、マウス配列をヒト化配列に変異させた。９００２４５抗体の元の重鎖ｍＶＨ配列を５個のヒト化配列（ｈｕＶＨ１、ｈｕＶＨ２、ｈｕＶＨ３、ｈｕＶＨ４、ｈｕＶＨ５）に設計し、９００２４５抗体の元の軽鎖ｍＶＬを３個のヒト化配列（ｈｕＶＬ１、ｈｕＶＬ２、ｈｕＶＬ３）に設計し、その後の発現を検証するために、設計された８つの配列を１２対のヒト化抗体に組み合わせた。９００２４５マウス可変領域配列：下線部はＣＤＲ領域（Ｋａｂａｔ定義）であった。
９００２４５の可変領域（ＶＨ：配列番号１１、ＶＬ：配列番号１７）をヒト化し、マウス配列をヒト化配列に変異させた。９００２４５抗体の元の重鎖ｍＶＨ配列を５個のヒト化配列（ｈｕＶＨ１、ｈｕＶＨ２、ｈｕＶＨ３、ｈｕＶＨ４、ｈｕＶＨ５）に設計し、９００２４５抗体の元の軽鎖ｍＶＬを３個のヒト化配列（ｈｕＶＬ１、ｈｕＶＬ２、ｈｕＶＬ３）に設計し、その後の発現を検証するために、設計された８つの配列を１２対のヒト化抗体に組み合わせた。９００２４５マウス可変領域配列：下線部はＣＤＲ領域（Ｋａｂａｔ定義）であった。
そのうちｈｕＶＨ１－５のアミノ酸配列は順に、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６に示され、そのうちｈｕＶＬ１－３のアミノ酸配列は順に、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０に示された。
５個のヒト化重鎖可変領域遺伝子をヒトＩｇＧ１定常領域遺伝子（そのアミノ酸配列は配列番号５５に示される）に連結し、３個のヒト化軽鎖可変領域遺伝子をヒトＩｇκ定常領域遺伝子（そのアミノ酸配列は配列番号５６に示される）に連結し、ｐｃＤＮＡ３．４発現担体に構築し、プラスミドをＥｘｐｉＣＨＯ－ｓ細胞にトランスフェクトし、一過性発現を行い、タンパク質はＰｒｏｔｅｉｎ Ａにより精製された後、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳにより結合活性が検出され、ＳＰＲにより親和性が検出された後にスクリーニングし、結果のまとめを表２に示した。ここで、９００２４５Ａｂ－Ｈ１Ｌ１は、ＶＨがｈｕＶＨ１、且つＶＬがｈｕＶＬ１である場合、上記定常領域を連結して得られたヒト化抗体であった。
結果は、Ｈ５Ｌ１（ＣｏＡＤ１４４５）の結合活性及び親和性が高く、ヒト化程度が高く、発現純度及び発現量が最も優れることを示した。ｈｕＶＨ５及びｈｕＶＬ１の可変領域遺伝子を、抗体発現担体にそれぞれ構築し、ＣＨＯ－Ｓ細胞に一過的にトランスフェクトし、３２℃で７日間発現培養した後、遠心分離して上清を収集し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムにより精製され、番号が９００７６０であるヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体を得た。
実施例３ヒト化抗体の体外性質の測定
３．１細胞表面ＰＤ－Ｌ１抗原への結合
ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞を、２×１０４／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、３倍勾配シリーズで希釈した測定されるサンプルを２０μｌ／ウェルで加え、細胞と共に室温で３０ｍｉｎインキュベートした。遠心分離して洗浄し、未結合の抗体を除去し、各ウェルに２０μｌのＲ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（製品番号：１０９－１１５－０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ－ＰＢＳ１：２００で希釈）蛍光二次抗体を加えて１５分間インキュベートした。次に細胞を２回洗浄し、１００μｌの１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ－ＰＢＳで再懸濁させ、フローサイトメトリー（ＢＤ、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏｌｌ）により４８８ｎｍ励起で５８５ｎｍでの蛍光強度を検出した。結果は図３に示すように、ヒト化抗体９００７６０及び親キメラ抗体のＥＣ５０がそれぞれ、０．０７５μｇ／ｍｌ及び０．１２５μｇ／ｍｌであり、ロッシュの対照抗体ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのＥＣ５０が０．０５６μｇ／ｍｌであり、抗原に対するヒト化抗体の結合活性が高くなり、対照抗体に近いことを示した。
３．１細胞表面ＰＤ－Ｌ１抗原への結合
ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕＰＤ－Ｌ１細胞を、２×１０４／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、３倍勾配シリーズで希釈した測定されるサンプルを２０μｌ／ウェルで加え、細胞と共に室温で３０ｍｉｎインキュベートした。遠心分離して洗浄し、未結合の抗体を除去し、各ウェルに２０μｌのＲ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（製品番号：１０９－１１５－０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ－ＰＢＳ１：２００で希釈）蛍光二次抗体を加えて１５分間インキュベートした。次に細胞を２回洗浄し、１００μｌの１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ－ＰＢＳで再懸濁させ、フローサイトメトリー（ＢＤ、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏｌｌ）により４８８ｎｍ励起で５８５ｎｍでの蛍光強度を検出した。結果は図３に示すように、ヒト化抗体９００７６０及び親キメラ抗体のＥＣ５０がそれぞれ、０．０７５μｇ／ｍｌ及び０．１２５μｇ／ｍｌであり、ロッシュの対照抗体ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのＥＣ５０が０．０５６μｇ／ｍｌであり、抗原に対するヒト化抗体の結合活性が高くなり、対照抗体に近いことを示した。
３．２ ＳＰＲ法によるヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の親和性の検出
Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｒｕｅ Ｋｉｔ（製品番号：ＢＲ－１００８－３９、ＧＥ）及びアミノカップリングキット（製品番号：ＢＲ－１０００－５０、ＧＥ）カップリング法に従ってＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｃａｐｔｕｒｅ－ＣＭ５チップ（製品番号：ＢＲ－１００５－３０、ＧＥ）を準備した。チップを室温で２０～３０ｍｉｎ平衡させ、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器に取り付け、平衡緩衝液でＢ５Ｄ１を実験作動濃度に希釈し、抗原を平衡緩衝液で５０ｎＭに希釈し、更に７濃度勾配で３倍希釈し、２個のゼロ濃度（即ち平衡緩衝液）及び１個の反復濃度（一般に最低濃度の反復）を設定し、抗体、抗原ｈｕＰＤ－Ｌ１（製品番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）の再生順位に従って、繰り返して１０個の抗原濃度（２個のゼロ濃度、７個の勾配濃度及び１個の反復濃度）を実験分析し、抗原の注入流速は３０μｌ／分間、結合時間は１２０秒、解離時間は６００秒であり、分析完了後、対応する分析プログラムを選択してデータを分析し、明らかなｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇがないことを確認した後、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、１：１のｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを選択してデータをフィッティングし、ヒト化抗体及び対照抗体の動態関連パラメータＫａ、Ｋｄ及びＫＤ値を取得し、結果を表３に示した。結果は、ヒト化抗体９００７６０がヒトＰＤ－Ｌ１抗原に対して非常に強い親和性を有し、且つ他の製造業者の対照抗体（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）よりも優れることを示した。
Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｒｕｅ Ｋｉｔ（製品番号：ＢＲ－１００８－３９、ＧＥ）及びアミノカップリングキット（製品番号：ＢＲ－１０００－５０、ＧＥ）カップリング法に従ってＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｃａｐｔｕｒｅ－ＣＭ５チップ（製品番号：ＢＲ－１００５－３０、ＧＥ）を準備した。チップを室温で２０～３０ｍｉｎ平衡させ、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器に取り付け、平衡緩衝液でＢ５Ｄ１を実験作動濃度に希釈し、抗原を平衡緩衝液で５０ｎＭに希釈し、更に７濃度勾配で３倍希釈し、２個のゼロ濃度（即ち平衡緩衝液）及び１個の反復濃度（一般に最低濃度の反復）を設定し、抗体、抗原ｈｕＰＤ－Ｌ１（製品番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）の再生順位に従って、繰り返して１０個の抗原濃度（２個のゼロ濃度、７個の勾配濃度及び１個の反復濃度）を実験分析し、抗原の注入流速は３０μｌ／分間、結合時間は１２０秒、解離時間は６００秒であり、分析完了後、対応する分析プログラムを選択してデータを分析し、明らかなｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇがないことを確認した後、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、１：１のｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを選択してデータをフィッティングし、ヒト化抗体及び対照抗体の動態関連パラメータＫａ、Ｋｄ及びＫＤ値を取得し、結果を表３に示した。結果は、ヒト化抗体９００７６０がヒトＰＤ－Ｌ１抗原に対して非常に強い親和性を有し、且つ他の製造業者の対照抗体（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）よりも優れることを示した。
３．３ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用への有効な遮断
抗体による遊離ＰＤ－Ｌ１と細胞表面ＰＤ－１との結合の遮断作用を検出し、ヒトＰＤ－Ｌ１－ｍｏＦｃ組換えタンパク質を、培地で１５μｇ／ｍｌに希釈して２０μｌ／ウェルで９６ウェルに加え、測定される抗体を３倍勾配希釈した後、抗原が加えられた上記の９６ウェルプレートに２０μｌ／ウェルで加え、均一に混合し、室温で１５ｍｉｎインキュベートした。ヒトＰＤ－１を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕＰＤ－１細胞を、２×１０４／ウェルで抗原－抗体プレインキュベートした９６ウェルプレートに加え、均一に混合し、室温で１５ｍｉｎインキュベートした。３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで細胞を２回洗浄し、Ａｎｔｉ－ｍｏＦｃ－Ａｌｅｘａ ４８８（製品番号：１１５－５４５－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ）二次抗体を１：３００で希釈した後に加え、均一に混合し、室温で１５ｍｉｎインキュベートした。細胞を３回洗浄した後、細胞表面の蛍光強度を装置で検出した。結果は、図４に示すように、ヒト化抗体９００７６０及び親キメラ抗体のＩＣ５０がそれぞれ、２．２７２μｇ／ｍｌ及び２．８３８μｇ／ｍｌであり、ロッシュの対照抗体ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのＩＣ５０が１．３１１μｇ／ｍｌであり、ヒト化抗体がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用への遮断活性を良好に維持し、且つ対照抗体に近いことを示した。
抗体による遊離ＰＤ－Ｌ１と細胞表面ＰＤ－１との結合の遮断作用を検出し、ヒトＰＤ－Ｌ１－ｍｏＦｃ組換えタンパク質を、培地で１５μｇ／ｍｌに希釈して２０μｌ／ウェルで９６ウェルに加え、測定される抗体を３倍勾配希釈した後、抗原が加えられた上記の９６ウェルプレートに２０μｌ／ウェルで加え、均一に混合し、室温で１５ｍｉｎインキュベートした。ヒトＰＤ－１を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕＰＤ－１細胞を、２×１０４／ウェルで抗原－抗体プレインキュベートした９６ウェルプレートに加え、均一に混合し、室温で１５ｍｉｎインキュベートした。３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで細胞を２回洗浄し、Ａｎｔｉ－ｍｏＦｃ－Ａｌｅｘａ ４８８（製品番号：１１５－５４５－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ）二次抗体を１：３００で希釈した後に加え、均一に混合し、室温で１５ｍｉｎインキュベートした。細胞を３回洗浄した後、細胞表面の蛍光強度を装置で検出した。結果は、図４に示すように、ヒト化抗体９００７６０及び親キメラ抗体のＩＣ５０がそれぞれ、２．２７２μｇ／ｍｌ及び２．８３８μｇ／ｍｌであり、ロッシュの対照抗体ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのＩＣ５０が１．３１１μｇ／ｍｌであり、ヒト化抗体がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用への遮断活性を良好に維持し、且つ対照抗体に近いことを示した。
３．４ Ｔ細胞活性化の促進
検出システムは遺伝子工学的に改変された２つの細胞株からなる：Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ－１－５Ｂ８細胞（ＰＤ－１エフェクター細胞）は、ヒトＰＤ－１及びＮＦＡＴ誘導性ルシフェラーゼを安定的に発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞であり、ＣＨＯ－Ｋ１－ＯＳ８－ＰＤ－Ｌ１－８Ｄ６細胞は標的細胞として、ヒトＰＤ－Ｌ１及びＴ細胞活性化抗体ＯＫＴ３単鎖抗体を細胞表面に安定的に発現することができる。検出抗体を培地で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、２倍勾配希釈して使用に備え、エフェクター細胞Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ－１－５Ｂ８をカウントし、５×１０５／ｍｌに再懸濁させ、３０μｌ／ウェルで９６ウェルホワイトボトムプレートに播種し、標的細胞ＣＨＯ－Ｋ１－ＯＳ８－ＰＤ－Ｌ１－８Ｄ６をカウントし、５×１０５／ｍｌに３０μｌ／ウェルで再懸濁させ、希釈した測定されるサンプルを３０μｌ／ウェルで加えた。均一に混合した後、ＣＯ２インキュベータに置いて、３７℃で６時間インキュベートした。インキュベート終了後、培養プレートを室温で少なくとも１５ｍｉｎ平衡させた後、平衡したＢｉｏ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ試薬を９０μｌ／ウェルで９６ウェルホワイトプレートに加え、室温で暗所で５ｍｉｎ反応させ、ＭＤ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３ｘマイクロプレートリーダーの全波長の値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアで、ＲＬＵ値ｖｓ抗体作動濃度をもって４パラメータ方程式を使用してデータをフィッティングして分析した。結果は図５に示すように、ヒト化抗体９００７６０及び親キメラ抗体のＥＣ５０がそれぞれ、０．４１６μｇ／ｍｌ及び０．２８７μｇ／ｍｌであり、ロッシュの対照抗体ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのＥＣ５０が０．２２２μｇ／ｍｌであり、本発明におけるヒト化抗体がＴ細胞の活性化を効果的に促進することができ、効果が対照抗体に同等であった。
検出システムは遺伝子工学的に改変された２つの細胞株からなる：Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ－１－５Ｂ８細胞（ＰＤ－１エフェクター細胞）は、ヒトＰＤ－１及びＮＦＡＴ誘導性ルシフェラーゼを安定的に発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞であり、ＣＨＯ－Ｋ１－ＯＳ８－ＰＤ－Ｌ１－８Ｄ６細胞は標的細胞として、ヒトＰＤ－Ｌ１及びＴ細胞活性化抗体ＯＫＴ３単鎖抗体を細胞表面に安定的に発現することができる。検出抗体を培地で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、２倍勾配希釈して使用に備え、エフェクター細胞Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ－１－５Ｂ８をカウントし、５×１０５／ｍｌに再懸濁させ、３０μｌ／ウェルで９６ウェルホワイトボトムプレートに播種し、標的細胞ＣＨＯ－Ｋ１－ＯＳ８－ＰＤ－Ｌ１－８Ｄ６をカウントし、５×１０５／ｍｌに３０μｌ／ウェルで再懸濁させ、希釈した測定されるサンプルを３０μｌ／ウェルで加えた。均一に混合した後、ＣＯ２インキュベータに置いて、３７℃で６時間インキュベートした。インキュベート終了後、培養プレートを室温で少なくとも１５ｍｉｎ平衡させた後、平衡したＢｉｏ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ試薬を９０μｌ／ウェルで９６ウェルホワイトプレートに加え、室温で暗所で５ｍｉｎ反応させ、ＭＤ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３ｘマイクロプレートリーダーの全波長の値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアで、ＲＬＵ値ｖｓ抗体作動濃度をもって４パラメータ方程式を使用してデータをフィッティングして分析した。結果は図５に示すように、ヒト化抗体９００７６０及び親キメラ抗体のＥＣ５０がそれぞれ、０．４１６μｇ／ｍｌ及び０．２８７μｇ／ｍｌであり、ロッシュの対照抗体ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのＥＣ５０が０．２２２μｇ／ｍｌであり、本発明におけるヒト化抗体がＴ細胞の活性化を効果的に促進することができ、効果が対照抗体に同等であった。
実施例４ ヒト化抗体の体内抗腫瘍活性
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の体内抗腫瘍の薬効試験のために、ＰＤ－Ｌ１ヒト化のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｈＰＤ－Ｌ１－Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）にＰＤ－Ｌ１ヒト化のＭＣ３８結腸がん細胞株（ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）移植腫瘍モデルを構築した。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞懸濁液を６～８週齢の雌マウスの右側皮下に接種し、腫瘍体積サイズが約１００ｍｍ３になった時点で、６匹／群で群分けし、投与を開始した。各群ではいずれも、週に２回、連続３週間、合計６回腹腔内投与した。週に２回腫瘍径を測定し、動物の体重を量り、動物の生活状態を観察し、異常を記録した。腫瘍体積（Ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＴＶ）の計算方法は、ＴＶ＝１／２×ａ×ｂ２であり、ここで、ａは腫瘍長径を表し、ｂは腫瘍短径を表した。腫瘍体積の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）の計算方法は、ＴＧＩ＝［１－（ＴＶｔ－ＴＶｉｎｉｔｉａｌ）／（ＣＶｔ－ＣＶｉｎｉｔｉａｌ）］×１００％であり、ここで、ＴＶｔは治療群の毎回測定時の腫瘍体積を表し、ＴＶｉｎｉｔｉａｌは群分け投与時の治療群の腫瘍体積を表し、ＣＶｔは対照群の毎回測定時の腫瘍体積を表し、ＣＶｉｎｉｔｉａｌは群分け投与時の腫瘍体積を表した。元のデータに基づいて分析処理を行い、結果の分析は、平均数及び標準偏差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表し、Ｔ－ｔｅｓｔを使用して対照群及び投与群の腫瘍体積の差を分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異があることを示した。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の体内抗腫瘍の薬効試験のために、ＰＤ－Ｌ１ヒト化のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｈＰＤ－Ｌ１－Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）にＰＤ－Ｌ１ヒト化のＭＣ３８結腸がん細胞株（ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）移植腫瘍モデルを構築した。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞懸濁液を６～８週齢の雌マウスの右側皮下に接種し、腫瘍体積サイズが約１００ｍｍ３になった時点で、６匹／群で群分けし、投与を開始した。各群ではいずれも、週に２回、連続３週間、合計６回腹腔内投与した。週に２回腫瘍径を測定し、動物の体重を量り、動物の生活状態を観察し、異常を記録した。腫瘍体積（Ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＴＶ）の計算方法は、ＴＶ＝１／２×ａ×ｂ２であり、ここで、ａは腫瘍長径を表し、ｂは腫瘍短径を表した。腫瘍体積の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）の計算方法は、ＴＧＩ＝［１－（ＴＶｔ－ＴＶｉｎｉｔｉａｌ）／（ＣＶｔ－ＣＶｉｎｉｔｉａｌ）］×１００％であり、ここで、ＴＶｔは治療群の毎回測定時の腫瘍体積を表し、ＴＶｉｎｉｔｉａｌは群分け投与時の治療群の腫瘍体積を表し、ＣＶｔは対照群の毎回測定時の腫瘍体積を表し、ＣＶｉｎｉｔｉａｌは群分け投与時の腫瘍体積を表した。元のデータに基づいて分析処理を行い、結果の分析は、平均数及び標準偏差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表し、Ｔ－ｔｅｓｔを使用して対照群及び投与群の腫瘍体積の差を分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異があることを示した。
投与治療後のマウスの腫瘍体積サイズ及び体重変化の結果は下記の図６及び図７に示すように、ヒト化抗体９００７６０の抗腫瘍効果が用量依存性を有し、投与量が３ｍｇ／ｋｇに達した時点で最大の腫瘍阻害効果に近く、ＴＧＩが７６．８９％に達し、１０ｍｇ／ｋｇ用量群のＴＧＩ ７８．１５％に近く（表３を参照）、効果がＴＧＩ ６９．６９％の市販対照薬Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（テセントリク）よりも優れた。各群のマウス体重は安定的に増加し続け、そのうちアイソタイプ陰性対照群のマウスは１７日目から腫瘍の体積が大きすぎるため、安楽死させられ、この群のデータに大きな変動が生じた。
前述の詳細な説明は、解釈や例として提供されたものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。現在、本願に列挙された実施形態の様々な変化は当業者にとって明らかであり、且つ添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内に保持される。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３との間に位置するＨ－ＦＲ３を含んでもよく、且つ前記Ｈ－ＦＲ３は配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記Ｈ－ＦＲ３は配列番号３０～３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＨ－ＦＲ４を含んでもよく、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端は前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に連結し、且つ前記Ｈ－ＦＲ４は配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記Ｈ－ＦＲ４は配列番号３４～３５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ２を含んでもよく、且つ前記ＬＣＤＲ２は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。前記ＬＣＤＲ３は、ＤＴＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｓ（配列番号２３）に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、そのうちＸ１はＮ又はＳであってもよく、Ｘ２はＬ又はＶであってもよく、Ｘ
３ はＡ又はＱであってもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質は、前記ＬＣＤＲ２と前記ＬＣＤＲ３との間に位置するＬ－ＦＲ３を含んでもよく、且つ前記Ｌ－ＦＲ３は配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記Ｌ－ＦＲ３は配列番号４２～４５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記単離された抗原結合タンパク質はＬ－ＦＲ４を含んでもよく、前記Ｌ－ＦＲ４のＮ末端は前記ＬＣＤＲ３のＣ末端に連結し、且つ前記Ｌ－ＦＲ４は配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記Ｌ－ＦＲ４は配列番号４６～４７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
Claims (42)
- 次の性質のうちの１つ又は複数を有する、単離された抗原結合タンパク質：
（１）０．０７μｇ／ｍｌ又はより高いＥＣ５０値でＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することができること、
（２）ＰＤ－Ｌ１タンパク質とＰＤ－１タンパク質との間の結合を遮断することができること、
（３）Ｔ細胞の活性化を促進することができること、及び
（４）体内腫瘍の体積の増加を阻害することができること。 - 抗体又はその抗原結合断片を含む、
請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ＶＨＨ及び／又はｄＡｂを含む、
請求項２に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体からなる群より選ばれる、
請求項２～３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 重鎖可変領域ＶＨ及び軽鎖可変領域ＶＬを含む参照抗体と前記ＰＤ－Ｌ１タンパク質に競合的に結合し、ここで、前記参照抗体のＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記参照抗体のＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、且つ前記参照抗体のＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＨＣＤＲ２は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＨＣＤＲ３は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＬＣＤＲ２は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含み、及び前記参照抗体のＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～４のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む、
請求項１～５のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む、
請求項１～６のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む、
請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、
請求項１～８のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 配列番号３又は５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、
請求項１～９のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
ここで、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
ここで、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
ここで、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
ここで、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＤＲ３は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 配列番号１１～１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨを含む、
請求項１～１１のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - ヒトＩｇＧ定常領域に由来する重鎖定常領域を含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 前記重鎖定常領域は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１定常領域に由来する、
請求項１３に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１を含む、
請求項１～１４のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２を含む、
請求項１～１５のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 配列番号７、９又は１０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２を含む、
請求項１～１６のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、
請求項１～１７のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
ここで、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
ここで、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
ここで、前記ＬＣＤＲ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～１８のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 配列番号１７～２０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む、
請求項１～１９のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖定常領域を含む、
請求項１～２０のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 重鎖可変領域ＶＨ及び軽鎖可変領域ＶＬを含み、ここで、
１）前記ＶＨは配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
２）前記ＶＨは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
３）前記ＶＨは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
４）前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
５）前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
６）前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
７）前記ＶＨは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
８）前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
９）前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
１０）前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
１１）前記ＶＨは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
１２）前記ＶＨは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、又は、
１３）前記ＶＨは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質を含む、ポリペプチド。
- 請求項１～２２の何れか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質又は請求項２３に記載のポリペプチドを含む、免疫複合体。
- 請求項１～２２の何れか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質をコードする、単離された１つ又は複数の核酸分子。
- 請求項２５に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項２５に記載の核酸分子又は請求項２６に記載のベクターを含む、細胞。
- 請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質を製造する方法であって、
請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質の発現が可能な条件で、請求項２７に記載の細胞を培養することを含む、方法。 - 請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項２５に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター及び／又は請求項２７に記載の細胞と、任意選択的に薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
- 請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項２３に記載のポリペプチド、請求項２４に記載の免疫複合体、請求項２５に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター、請求項２７に記載の細胞及び／又は請求項２９に記載の医薬組成物の使用であって、
前記薬物は腫瘍の予防、緩和及び／又は治療に用いられる、使用。 - 前記腫瘍は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１高発現の腫瘍を含む、
請求項３０に記載の使用。 - 前記腫瘍は、固形腫瘍を含む、
請求項３０～３１のいずれか１項に記載の使用。 - 前記腫瘍は、結腸がんを含む、
請求項３０～３２のいずれか１項に記載の使用。 - 腫瘍を予防、緩和又は治療する方法であって、
請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項２３に記載のポリペプチド、請求項２４に記載の免疫複合体、請求項２５に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター、請求項２７に記載の細胞及び／又は請求項２９に記載の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、方法。 - 前記腫瘍は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１高発現の腫瘍を含む、
請求項３４に記載の方法。 - 前記腫瘍は、固形腫瘍を含む、
請求項３４～３５のいずれか１項に記載の方法。 - 前記腫瘍は、結腸がんを含む、
請求項３４～３６のいずれか１項に記載の方法。 - 腫瘍の予防、緩和又は治療に使用するための、請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項２３に記載のポリペプチド、請求項２４に記載の免疫複合体、請求項２５に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター、請求項２７に記載の細胞及び／又は請求項２９に記載の医薬組成物。
- ＰＤ－１タンパク質とＰＤ－Ｌ１タンパク質との結合を阻害する方法であって、
請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項２３に記載のポリペプチド、請求項２４に記載の免疫複合体、請求項２５に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター、請求項２７に記載の細胞及び／又は請求項２９に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。 - Ｔ細胞の活性化を促進する方法であって、
請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項２３に記載のポリペプチド、請求項２４に記載の免疫複合体、請求項２５に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター、請求項２７に記載の細胞及び／又は請求項２９に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。 - ＰＤ－Ｌ１タンパク質の存在及び／又は含有量を検出するための方法であって、
請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質及び／又は請求項２３に記載のポリペプチドを投与することを含む、方法。 - 請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項２３に記載のポリペプチド、請求項２４に記載の免疫複合体、請求項２５に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター、請求項２７に記載の細胞及び／又は請求項２９に記載の医薬組成物を含む、キット。
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