JP2024133197A - Amino acid quantification method - Google Patents
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Abstract
【課題】アミノ酸の定量に有用な手段および方法を提供すること。【解決手段】以下を含む、アミノ酸の定量方法：（１）以下の反応（ｉ）および（ｉｉ）を行うこと：（ｉ）アミノ酸およびＡＴＰをＡＴＰ依存性酵素に接触させて、アミノ酸量依存的にＡＴＰを消費させる反応；および（ｉｉ）ＡＴＰ量依存的にシグナルを発生する反応；ならびに（２）シグナルを検出すること。【選択図】なし[Problem] To provide a means and method useful for quantifying amino acids. [Solution] A method for quantifying amino acids, comprising: (1) carrying out the following reactions (i) and (ii): (i) a reaction in which an amino acid and ATP are brought into contact with an ATP-dependent enzyme to consume ATP in an amino acid amount-dependent manner; and (ii) a reaction in which a signal is generated in an ATP amount-dependent manner; and (2) detecting the signal. [Selected Figures] None
Description
本発明は、アミノ酸の定量方法に関する。 The present invention relates to a method for quantifying amino acids.
血中アミノ酸濃度は、健康状態の指標となり得ることが知られている（例えば、非特許文献１）。アミノ酸の測定方法としては、アミノ酸アナライザー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やＬＣ－ＭＳなどの機器を用いた方法、蛍光分析法（例えば、特許文献１）が知られている。 It is known that blood amino acid concentrations can be an indicator of health status (e.g., Non-Patent Document 1). Methods for measuring amino acids include methods using instruments such as amino acid analyzers, high performance liquid chromatography (HPLC) and LC-MS, and fluorescence analysis (e.g., Patent Document 1).
別のアミノ酸定量技術として、アミノ酸と作用する酵素を用いる方法が知られている（特許文献２～４）。アミノ酸と作用する酵素としては、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）が挙げられる。ＡＡＲＳは、ほとんどすべての生物が保有している酵素であり、以下の反応式１および２に従ってタンパク質合成に関与する。それぞれ１９種類のＬ－アミノ酸またはグリシンを特異的に認識するＡＡＲＳが存在するので、個々のＬ－アミノ酸またはグリシンの選択的検出が可能であると考えられている。 Another amino acid quantification technique known is a method that uses an enzyme that acts on amino acids (Patent Documents 2 to 4). An example of an enzyme that acts on amino acids is aminoacyl-tRNA synthetase (AARS). AARS is an enzyme that is possessed by almost all living organisms, and is involved in protein synthesis according to the following reaction formulas 1 and 2. Since there are AARS that specifically recognize 19 types of L-amino acids or glycine, respectively, it is believed that selective detection of individual L-amino acids or glycine is possible.
特許文献１には、ヒスチジンを蛍光試薬と結合させて蛍光分析することによるヒスチジンの分析方法が記載されている。 Patent document 1 describes a method for analyzing histidine by binding histidine to a fluorescent reagent and performing fluorescent analysis.
特許文献２には、上記反応式１を含む、ＡＡＲＳを用いた反応経路により得られた反応生成物を定量することによるアミノ酸の定量方法が記載されている。特許文献２の方法では、上記反応式１で生成するアミノアシルＡＭＰ－ＡＡＲＳ複合体をアミン類（求核剤）の添加により分解させ、反応全体により得られる生成物を定量することにより、アミノ酸が定量される。アミノアシルＡＭＰ－ＡＡＲＳ複合体では、アミノアシルＡＭＰがＡＡＲＳに強く結合しているので、ｔＲＮＡもしくはアミン等の求核剤を加えて複合体を分解しない限り、反応式２は進行しないと考えられている。特許文献２の方法によるアミノ酸の定量範囲は５μＭ～２００μＭであると考えられており、低濃度のアミノ酸を定量することができない。さらにこの方法では反応式１および２によって生成したピロリン酸を２段階の酵素反応によって検出しているため、煩雑であるとともに測定試料中の夾雑物やその他の外部要因による影響が懸念される。 Patent Document 2 describes a method for quantifying amino acids by quantifying reaction products obtained by a reaction pathway using AARS, including the above reaction formula 1. In the method of Patent Document 2, the aminoacyl AMP-AARS complex generated in the above reaction formula 1 is decomposed by adding amines (nucleophiles), and the products obtained by the entire reaction are quantified to quantify amino acids. In the aminoacyl AMP-AARS complex, since the aminoacyl AMP is strongly bound to the AARS, it is believed that reaction formula 2 will not proceed unless the complex is decomposed by adding a nucleophile such as tRNA or an amine. The quantification range of amino acids by the method of Patent Document 2 is believed to be 5 μM to 200 μM, and low-concentration amino acids cannot be quantified. Furthermore, in this method, pyrophosphate generated by reaction formulas 1 and 2 is detected by a two-step enzyme reaction, which is cumbersome and raises concerns about the influence of impurities in the measurement sample and other external factors.
特許文献３には、上記反応式１を含む、ＡＡＲＳを用いた反応経路により得られた反応生成物を定量することによるアミノ酸の定量方法が記載されている。特許文献３では、低濃度のアミノ酸を定量するために、ＡＡＲＳ反応系にヌクレオチドを添加してアミノアシルＡＭＰ－ＡＡＲＳ複合体を分解することで遊離したアミノ酸およびＡＡＲＳを再利用することによって高感度化したことを特徴としている。この方法のアミノ酸定量方法では、測定対象のアミノ酸の再利用によって、試料中に含まれているアミノ酸よりも多くのモル数の反応生成物が産生することによりアミノ酸量が増幅されるので、アミノ酸の検出には適用可能であるが、定量性の著しい低下が懸念される。そのため、アミノ酸濃度を正確に定量する必要がある場面においては使用が困難と考えられる。 Patent Document 3 describes a method for quantifying amino acids by quantifying reaction products obtained by a reaction pathway using AARS, including the above-mentioned reaction formula 1. Patent Document 3 is characterized in that, in order to quantify low-concentration amino acids, nucleotides are added to the AARS reaction system to decompose the aminoacyl AMP-AARS complex, and the released amino acids and AARS are reused, thereby achieving high sensitivity. In this amino acid quantification method, the amount of amino acids is amplified by producing a reaction product with a number of moles greater than the number of amino acids contained in the sample by reusing the amino acid to be measured, so that it is applicable to detection of amino acids, but there is a concern that the quantitativeness may be significantly reduced. Therefore, it is considered difficult to use in situations where it is necessary to accurately quantify the amino acid concentration.
特許文献４には、上記反応式１を含む、ＡＡＲＳを用いた反応経路により得られた反応生成物を検出することによるアミノ酸の検出方法が記載されている。 Patent Document 4 describes a method for detecting amino acids by detecting reaction products obtained through a reaction pathway using AARS, including the above-mentioned reaction formula 1.
非特許文献１には、血漿アミノ酸プロファイルを健康状態の指標として用いることが記載されている。 Non-Patent Document 1 describes the use of plasma amino acid profiles as an indicator of health status.
従来の方法では大型で高価な機器を使う必要があり、しかも機器の維持とオペレーションに専門知識と習熟を必要とするため、導入、維持、利用に高額のコストを必要とする。また、原理上、各検体を多段階で分析する必要があるため、多検体を分析する際には長時間を必要とする。また、従来の方法は、５μＭ未満の濃度のアミノ酸の正確な定量には困難であると考えられる。 Conventional methods require the use of large, expensive equipment, and because maintenance and operation of the equipment require specialized knowledge and proficiency, they are expensive to install, maintain, and use. In principle, each sample must be analyzed in multiple stages, so analyzing multiple samples requires a long time. Furthermore, conventional methods are considered difficult to accurately quantify amino acids at concentrations less than 5 μM.
本発明者らは、鋭意検討した結果、ＡＡＲＳ等のＡＴＰ依存性酵素をアミノ酸に作用させた触媒反応の際にアミノ酸量依存的に消費されるＡＴＰの量を測定することにより、アミノ酸を定量できること、および、ルシフェラーゼ等のＡＴＰ依存的に基質を発光性物質に変換する能力を有する変換酵素を用いることにより、ＡＴＰの量を触媒反応の生成物よりも高精度で測定できることを着想し、さらに、Ｄ－アミノ酸を基質とするＡＴＰ依存性酵素を用いることによりＤ－アミノ酸の定量も可能となることを着想し、本発明を完成するに至った。 After extensive research, the inventors came up with the idea that amino acids can be quantified by measuring the amount of ATP consumed in an amino acid amount-dependent manner during a catalytic reaction in which an ATP-dependent enzyme such as AARS acts on an amino acid, and that the amount of ATP can be measured with higher accuracy than the product of the catalytic reaction by using a conversion enzyme such as luciferase that has the ability to convert a substrate into a luminescent substance in an ATP-dependent manner. They also came up with the idea that D-amino acids can be quantified by using an ATP-dependent enzyme that uses D-amino acids as substrates, and thus completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、アミノ酸の定量方法：
（１）以下の反応（ｉ）および（ｉｉ）を行うこと：
（ｉ）アミノ酸およびＡＴＰをＡＴＰ依存性酵素に接触させて、アミノ酸量依存的にＡＴＰを消費させる反応；および
（ｉｉ）ＡＴＰ量依存的にシグナルを発生する反応；ならびに
（２）シグナルを検出すること。
〔２〕アミノ酸が、Ｌ－アミノ酸またはグリシンであり、
ＡＴＰ依存性酵素が、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素である、
〔１〕の方法。
〔３〕アミノ酸が、Ｌ－アルギニン、Ｌ－システイン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－リジン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－アラニン、およびグリシンからなる群から選ばれ、
ＡＴＰ依存性酵素が、前記アミノ酸に対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素である、
〔２〕の方法。
〔４〕アミノ酸が、Ｄ－アミノ酸であり、
ＡＴＰ依存性酵素が、Ｄ－アミノ酸リガーゼまたはＤ－アミノ酸キナーゼである、
〔１〕の方法。
〔５〕アミノ酸が、Ｄ－アルギニン、Ｄ－システイン、Ｄ－イソロイシン、Ｄ－ロイシン、Ｄ－メチオニン、Ｄ－バリン、Ｄ－グルタミン酸、Ｄ－グルタミン、Ｄ－リジン、Ｄ－チロシン、Ｄ－トリプトファン、Ｄ－ヒスチジン、Ｄ－プロリン、Ｄ－セリン、Ｄ－スレオニン、Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－アスパラギン、Ｄ－フェニルアラニン、およびＤ－アラニンからなる群から選ばれ、
ＡＴＰ依存性酵素が、前記アミノ酸に対応するＤ－アミノ酸リガーゼまたはＤ－アミノ酸キナーゼである、
〔４〕の方法。
〔６〕反応（ｉ）が、２０～９０℃で行われる、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕シグナルが、蛍光シグナルまたは発光シグナルである、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕シグナルが、発光シグナルであり、反応（ｉｉ）が、ＡＴＰを基質とする発光酵素により行われる、〔７〕の方法。
〔９〕ＡＴＰを基質とする発光酵素が、ルシフェラーゼである、〔８〕の方法。
〔１０〕１００ｍＭ以下のアミノ酸が分析される、〔１〕～〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕以下を含む、アミノ酸分析用キット：
（ａ）ＡＴＰ依存性酵素；
（ｂ）ＡＴＰ；ならびに
（ｃ）ＡＴＰを基質とする発光酵素およびその発光素基質。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for quantifying an amino acid, comprising:
(1) carrying out the following reactions (i) and (ii):
(i) a reaction in which an amino acid and ATP are contacted with an ATP-dependent enzyme to consume ATP in an amino acid amount-dependent manner; and (ii) a reaction in which a signal is generated in an ATP amount-dependent manner; and (2) detecting the signal.
[2] The amino acid is an L-amino acid or glycine;
The ATP-dependent enzyme is an aminoacyl-tRNA synthetase;
Method [1]
[3] the amino acid is selected from the group consisting of L-arginine, L-cysteine, L-isoleucine, L-leucine, L-methionine, L-valine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-lysine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-histidine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-aspartic acid, L-asparagine, L-phenylalanine, L-alanine, and glycine;
the ATP-dependent enzyme is an aminoacyl-tRNA synthetase corresponding to the amino acid;
Method [2]
[4] The amino acid is a D-amino acid;
The ATP-dependent enzyme is a D-amino acid ligase or a D-amino acid kinase.
Method [1]
[5] the amino acid is selected from the group consisting of D-arginine, D-cysteine, D-isoleucine, D-leucine, D-methionine, D-valine, D-glutamic acid, D-glutamine, D-lysine, D-tyrosine, D-tryptophan, D-histidine, D-proline, D-serine, D-threonine, D-aspartic acid, D-asparagine, D-phenylalanine, and D-alanine;
the ATP-dependent enzyme is a D-amino acid ligase or a D-amino acid kinase corresponding to the amino acid;
Method [4]
[6] Any of the methods according to [1] to [5], wherein the reaction (i) is carried out at 20 to 90° C.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the signal is a fluorescent signal or a luminescent signal.
[8] The method according to [7], wherein the signal is a luminescent signal, and the reaction (ii) is carried out by a luminescent enzyme which uses ATP as a substrate.
[9] The method according to [8], wherein the luminescent enzyme which uses ATP as a substrate is luciferase.
[10] The method according to any one of [1] to [9], wherein 100 mM or less of amino acids are analyzed.
[11] A kit for amino acid analysis, comprising:
(a) ATP-dependent enzyme;
(b) ATP; and (c) a luminescent enzyme that uses ATP as a substrate and a luminescent substrate thereof.
本発明の方法は、従来法と比較してアミノ酸を迅速かつ高感度に測定することができる。本発明の方法はまた、Ｌ体のみならずＤ体アミノ酸を特異的に測定することができる。本発明の方法はさらに、種々のＤ体、Ｌ体アミノ酸を測定できるため汎用性が高い。 The method of the present invention can measure amino acids more quickly and with higher sensitivity than conventional methods. The method of the present invention can also specifically measure not only L-amino acids but also D-amino acids. Furthermore, the method of the present invention is highly versatile because it can measure various D- and L-amino acids.
本発明は、アミノ酸の定量方法を提供する。本発明の方法は、以下を含む：
（１）以下の反応（ｉ）および（ｉｉ）を行うこと：
（ｉ）アミノ酸およびＡＴＰをＡＴＰ依存性酵素に接触させて、アミノ酸量依存的にＡＴＰを消費させる反応；および
（ｉｉ）ＡＴＰ量依存的にシグナルを発生する反応；ならびに
（２）シグナルを検出すること。
The present invention provides a method for quantifying amino acids. The method of the present invention includes:
(1) carrying out the following reactions (i) and (ii):
(i) a reaction in which an amino acid and ATP are contacted with an ATP-dependent enzyme to consume ATP in an amino acid amount-dependent manner; and (ii) a reaction in which a signal is generated in an ATP amount-dependent manner; and (2) detecting the signal.
本発明の方法で定量されるアミノ酸は、そのアミノ酸を基質とするＡＴＰ依存性酵素が存在するアミノ酸であればいずれでもよい。アミノ酸としては、例えば、α－アミノ酸、β－アミノ酸、およびγ－アミノ酸が挙げられる。α－アミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンが挙げられる。β－アミノ酸としては、例えば、β－アラニンが挙げられる。γ－アミノ酸としては、例えば、γ－アミノ酪酸が挙げられる。アミノ酸のアミノ基は、窒素原子が２個の水素原子と結合したアミノ基、窒素原子が１個の水素原子と結合したアミノ基、および窒素原子が水素原子と結合していないアミノ基のいずれであってもよい。窒素原子が１個の水素原子と結合したアミノ基を含有するアミノ酸としては、例えば、サルコシン、Ｎ－メチル－β－アラニン、Ｎ－メチルタウリン、プロリンが挙げられる。アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸またはＤ－アミノ酸のいずれであってもよい。 The amino acid quantified by the method of the present invention may be any amino acid for which there exists an ATP-dependent enzyme that uses that amino acid as a substrate. Examples of amino acids include α-amino acids, β-amino acids, and γ-amino acids. Examples of α-amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, tryptophan, serine, threonine, asparagine, glutamine, tyrosine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine, and arginine. Examples of β-amino acids include β-alanine. Examples of γ-amino acids include γ-aminobutyric acid. The amino group of an amino acid may be any of an amino group in which the nitrogen atom is bound to two hydrogen atoms, an amino group in which the nitrogen atom is bound to one hydrogen atom, and an amino group in which the nitrogen atom is not bound to a hydrogen atom. Examples of amino acids containing an amino group in which a nitrogen atom is bonded to one hydrogen atom include sarcosine, N-methyl-β-alanine, N-methyltaurine, and proline. The amino acid may be either an L-amino acid or a D-amino acid.
本発明の方法で定量されるアミノ酸の量は、本発明の方法で検出することができる限り特に限定されないが、反応（ｉ）におけるアミノ酸の濃度として、例えば１００ｍＭ以下、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、さらにより好ましくは１００μＭ以下、なおさらにより好ましくは１０μＭ以下、特に好ましくは５μＭ未満、４μＭ以下、３μＭ以下、２μＭ以下、または１μＭ以下であってもよい。また、このようなアミノ酸の濃度としては、例えば１ｎＭ以上、好ましくは２ｎＭ以上、より好ましくは２．５ｎＭ以上、さらにより好ましくは３ｎＭ以上、なおさらにより好ましくは４ｎＭ以上、特に好ましくは、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、または１０００ｎＭ以上であってもよい。より具体的には、このようなアミノ酸の濃度としては、例えば、１ｎＭ～１００ｍＭ、好ましくは２ｎＭ～１０ｍＭ、より好ましくは２．５ｎＭ～１ｍＭ、さらにより好ましくは３ｎＭ～１００μＭ、なおさらにより好ましくは４ｎＭ～１０μＭ、特に好ましくは５ｎＭ～４μＭ、１０ｎＭ～３μＭ、または１００ｎＭ～２μＭであってもよい。 The amount of the amino acid quantified by the method of the present invention is not particularly limited as long as it can be detected by the method of the present invention, but the concentration of the amino acid in reaction (i) may be, for example, 100 mM or less, preferably 10 mM or less, more preferably 1 mM or less, even more preferably 100 μM or less, even more preferably 10 μM or less, particularly preferably less than 5 μM, 4 μM or less, 3 μM or less, 2 μM or less, or 1 μM or less. In addition, the concentration of such an amino acid may be, for example, 1 nM or more, preferably 2 nM or more, more preferably 2.5 nM or more, even more preferably 3 nM or more, even more preferably 4 nM or more, particularly preferably 5 nM or more, 10 nM or more, 100 nM or more, or 1000 nM or more. More specifically, the concentration of such amino acids may be, for example, 1 nM to 100 mM, preferably 2 nM to 10 mM, more preferably 2.5 nM to 1 mM, even more preferably 3 nM to 100 μM, even more preferably 4 nM to 10 μM, and particularly preferably 5 nM to 4 μM, 10 nM to 3 μM, or 100 nM to 2 μM.
反応（ｉ）は、ＡＴＰ依存性酵素の触媒作用により、定量されるアミノ酸がＡＴＰ依存的に変換される反応である。逆の視点では、反応（ｉ）では、ＡＴＰ依存性酵素の触媒作用により、ＡＴＰが、定量されるアミノ酸の量に依存的に消費される。ＡＴＰ消費量はアミノ酸量の指標となり、後述する反応（ｉｉ）を利用して検出することができる。 Reaction (i) is a reaction in which the amino acid to be quantified is converted in an ATP-dependent manner by the catalytic action of an ATP-dependent enzyme. From the opposite perspective, in reaction (i), ATP is consumed in a manner dependent on the amount of the amino acid to be quantified by the catalytic action of an ATP-dependent enzyme. The amount of ATP consumed is an indicator of the amount of amino acid, and can be detected using reaction (ii) described below.
反応（ｉ）では、例えば上記反応式１のように、アミノアシルＡＭＰと酵素の複合体が形成する場合が考えられる。しかし、本発明は、ＡＴＰの消費量を指標としてアミノ酸を定量することを特徴とするので、複合体を分解させる工程がなくても、アミノ酸を定量することができる。 In reaction (i), for example, as shown in reaction formula 1 above, a complex between aminoacyl AMP and an enzyme may be formed. However, the present invention is characterized in that the amount of amino acid is quantified using the amount of ATP consumed as an indicator, so that the amount of amino acid can be quantified without the need for a step of decomposing the complex.
本発明の方法で用いられるＡＴＰ依存性酵素は、定量されるアミノ酸をＡＴＰ依存的に変換する酵素であればよく、アミノ酸の種類に応じて公知のものから適宜選択することができる。定量されるアミノ酸がＬ－アミノ酸またはグリシンである場合は、ＡＴＰ依存性酵素として、例えば、そのアミノ酸を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）を用いることができる。定量されるアミノ酸がＤ－アミノ酸である場合は、ＡＴＰ依存性酵素として、例えば、そのアミノ酸を基質とするＤ－アミノ酸リガーゼまたはＤ－アミノ酸キナーゼを用いることができる。 The ATP-dependent enzyme used in the method of the present invention may be any enzyme that converts the amino acid to be quantified in an ATP-dependent manner, and may be appropriately selected from known enzymes depending on the type of amino acid. When the amino acid to be quantified is an L-amino acid or glycine, the ATP-dependent enzyme may be, for example, an aminoacyl-tRNA synthetase (AARS) that uses that amino acid as a substrate. When the amino acid to be quantified is a D-amino acid, the ATP-dependent enzyme may be, for example, a D-amino acid ligase or D-amino acid kinase that uses that amino acid as a substrate.
Ｌ－アミノ酸またはグリシンに対応するＡＡＲＳは、公知のものから適宜選択することができる。ＡＡＲＳは、タンパク質合成に関与する、生物に必須の酵素である。したがって、ＡＡＲＳは、微生物（例、好熱菌）、植物、魚類、動物（例、哺乳動物）、または昆虫等の任意の生物に広く見出されるため、これらの生物由来の天然酵素を利用することができる。また、ＡＡＲＳとしては、変異体を利用してもよい。このような変異体としては、ＡＡＲＳ活性を維持する限り、１以上のアミノ酸残基が修飾（例、置換、欠失、挿入、付加）されていてもよい。例えば、変異体は、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例、タグ部分）が付加されていてもよい。このような他のペプチド成分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ－ｔａｇ）が挙げられる。 The AARS corresponding to L-amino acids or glycine can be appropriately selected from known ones. AARS is an enzyme involved in protein synthesis and essential for living organisms. Therefore, since AARS is widely found in any organism such as microorganisms (e.g., thermophiles), plants, fish, animals (e.g., mammals), or insects, natural enzymes derived from these organisms can be used. In addition, mutants may be used as AARS. As such mutants, one or more amino acid residues may be modified (e.g., substituted, deleted, inserted, added) as long as the AARS activity is maintained. For example, the mutant may have another peptide component (e.g., a tag portion) added to the C-terminus or N-terminus. Examples of such other peptide components include peptide components that facilitate the purification of the target protein (e.g., tag moieties such as histidine tags and Strep-tag II; proteins commonly used in the purification of target proteins such as glutathione-S-transferase and maltose-binding protein), and peptide components that improve the solubility of the target protein (e.g., Nus-tag).
ＡＡＲＳとしては、上述したような種々のＡＡＲＳを用いることができるが、好ましくは、好熱菌由来ＡＡＲＳまたはその変異体を用いてもよい。好熱菌由来ＡＡＲＳとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ属（例、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属（例、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属（例、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属（例、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属（例、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＡＡＲＳまたはその変異体が挙げられる。より具体的には、以下の表１に示される好熱菌由来ＡＡＲＳまたはその変異体を用いてもよい。 As the AARS, various AARSs as described above can be used, but preferably, an AARS derived from a thermophilic bacterium or a mutant thereof can be used. Examples of AARS derived from thermophilic bacteria include AARS derived from the genus Thermus (e.g., Thermus thermophilus), the genus Thermotoga (e.g., Thermotoga maritima), the genus Pyrococcus (e.g., Pyrococcus horikoshii), the genus Thermococcus (e.g., Thermococcus kodakarensis), the genus Sulfolobus (e.g., Sulfolobus acidocaldarius), and the genus Geobacillus (Geobacillus stearothermophilus), or mutants thereof. More specifically, the thermophilic bacterium-derived AARS or its mutants shown in Table 1 below may be used.
ＡＡＲＳは、構造および機能に基づいて、２つのクラス（クラスＩおよびＩＩ）さらに６つのサブクラス（クラスＩａ、Ｉｂ、Ｉｃ、ＩＩａ、ＩＩｂ、およびＩＩｃ）に分類することができる（日本結晶学会誌４８、３２７－３３６（２００６））。ＡＡＲＳのクラスおよびサブクラスの分類を表１に示す。 AARS can be classified into two classes (classes I and II) and six subclasses (classes Ia, Ib, Ic, IIa, IIb, and IIc) based on their structure and function (Journal of the Crystallographic Society of Japan 48, 327-336 (2006)). The classification of AARS classes and subclasses is shown in Table 1.
Ｄ－アミノ酸に対応するＤ－アミノ酸リガーゼまたはＤ－アミノ酸キナーゼは、公知のものから適宜選択することができる。Ｄ－アミノ酸リガーゼまたはＤ－アミノ酸キナーゼは、微生物の細胞壁の合成に関与する必須の酵素である。したがって、Ｄ－アミノ酸リガーゼまたはＤ－アミノ酸キナーゼは、様々な微生物（例、好熱菌）に広く見出されるため、微生物由来の天然酵素を利用することができる。また、ＡＡＲＳとしては、変異体を利用してもよい。このような変異体としては、Ｄ－アミノ酸リガーゼまたはＤ－アミノ酸キナーゼ活性を維持する限り、１以上のアミノ酸残基が修飾（例、置換、欠失、挿入、付加）されていてもよい。例えば、変異体は、Ｃ末端またはＮ末端に、上述したような他のペプチド成分（例、タグ部分）が付加されていてもよい。 The D-amino acid ligase or D-amino acid kinase corresponding to the D-amino acid can be appropriately selected from known ones. D-amino acid ligase or D-amino acid kinase is an essential enzyme involved in the synthesis of the cell wall of a microorganism. Therefore, since D-amino acid ligase or D-amino acid kinase is widely found in various microorganisms (e.g., thermophiles), natural enzymes derived from a microorganism can be used. In addition, a mutant may be used as the AARS. As such a mutant, one or more amino acid residues may be modified (e.g., substituted, deleted, inserted, added) as long as the D-amino acid ligase or D-amino acid kinase activity is maintained. For example, the mutant may have another peptide component (e.g., a tag portion) as described above added to the C-terminus or N-terminus.
Ｄ－アミノ酸リガーゼまたはＤ－アミノ酸キナーゼとしては、上述したような種々のＤ－アミノ酸リガーゼまたはＤ－アミノ酸キナーゼを用いることができるが、好ましくは、好熱菌由来Ｄ－アミノ酸リガーゼもしくはＤ－アミノ酸キナーゼまたはそれらの変異体を用いてもよい。好熱菌由来Ｄ－アミノ酸リガーゼまたはＤ－アミノ酸キナーゼとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ属（例、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属（例、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属（例、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属（例、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属（例、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＤ－アミノ酸リガーゼもしくはＤ－アミノ酸キナーゼまたはその変異体が挙げられる。より具体的には、以下の表２に示される好熱菌由来Ｄ－アミノ酸リガーゼもしくはＤ－アミノ酸キナーゼまたはその変異体を用いてもよい。 As the D-amino acid ligase or D-amino acid kinase, various D-amino acid ligases or D-amino acid kinases as described above can be used, but preferably, D-amino acid ligase or D-amino acid kinase derived from a thermophile or a mutant thereof can be used. Examples of D-amino acid ligases or D-amino acid kinases derived from thermophiles include D-amino acid ligases or D-amino acid kinases derived from the genus Thermus (e.g., Thermus thermophilus), Thermotoga (e.g., Thermotoga maritima), Pyrococcus (e.g., Pyrococcus horikoshii), Thermococcus (e.g., Thermococcus kodakarensis), Sulfolobus (e.g., Sulfolobus acidocaldarius), and Geobacillus (Geobacillus stearothermophilus), or mutants thereof. More specifically, the thermophilic D-amino acid ligase or D-amino acid kinase or a mutant thereof shown in Table 2 below may be used.
ＡＴＰ依存性酵素は、同酵素を発現する形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。ＡＴＰ依存性酵素を発現する形質転換体は、例えば、同酵素の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。 The ATP-dependent enzyme can be prepared using a transformant that expresses the enzyme, or using a cell-free system, etc. A transformant that expresses an ATP-dependent enzyme can be prepared, for example, by creating an expression vector for the enzyme and then introducing the expression vector into a host.
ＡＴＰ依存性酵素を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。 Hosts for expressing ATP-dependent enzymes include various prokaryotic cells, such as Escherichia bacteria, Corynebacterium bacteria (e.g., Corynebacterium glutamicum), and Bacillus bacteria (e.g., Bacillus subtilis), Saccharomyces bacteria (e.g., Saccharomyces cerevisiae), Pichia bacteria (e.g., Pichia stipitis), Aspergillus bacteria (e.g., Aspergillus oryzae), and the like. Various eukaryotic cells, including E. oryzae, can be used. A strain lacking a specific gene may be used as the host. Examples of transformants include a transformant that has an expression vector in the cytoplasm and a transformant in which a target gene has been introduced into the genome.
ＡＴＰ依存性酵素を回収するには、以下の方法などがある。ＡＴＰ依存性酵素は、本発明の形質転換体を培養し、回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、ＡＴＰ依存性酵素を得ることができる。ＡＴＰ依存性酵素は、精製タンパク質が好ましい。 The ATP-dependent enzyme can be recovered by the following methods. The ATP-dependent enzyme can be obtained as a disrupted or lysed product by culturing the transformant of the present invention, recovering the transformant, and then disrupting (e.g., sonication or homogenization) or dissolving (e.g., lysozyme treatment) the cells. The ATP-dependent enzyme can be obtained by subjecting such disrupted or lysed products to extraction, precipitation, filtration, column chromatography, or other techniques. The ATP-dependent enzyme is preferably a purified protein.
反応（ｉ）におけるＡＴＰ依存性酵素の濃度は、本発明の方法でアミノ酸を定量することができる限り特に限定されず、反応系に含まれるアミノ酸が十分に変換される濃度が好ましい。このようなＡＴＰ依存性酵素の濃度としては、例えば０．００１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ以上であってもよい。また、このようなＡＴＰ依存性酵素の濃度としては、例えば１０ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。より具体的には、このようなＡＴＰ依存性酵素の濃度としては、例えば０．００１～１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１～５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１～２ｍｇ／ｍＬであってもよい。 The concentration of the ATP-dependent enzyme in reaction (i) is not particularly limited as long as the amino acids can be quantified by the method of the present invention, and is preferably a concentration at which the amino acids contained in the reaction system are sufficiently converted. The concentration of such an ATP-dependent enzyme may be, for example, 0.001 mg/mL or more, preferably 0.01 mg/mL or more, and more preferably 0.1 mg/mL or more. The concentration of such an ATP-dependent enzyme may be, for example, 10 mg/mL or less, preferably 5 mg/mL or less, and more preferably 2 mg/mL or less. More specifically, the concentration of such an ATP-dependent enzyme may be, for example, 0.001 to 10 mg/mL, preferably 0.01 to 5 mg/mL, and more preferably 0.1 to 2 mg/mL.
反応（ｉ）におけるＡＴＰの濃度は、本発明の方法でアミノ酸を定量することができる限り特に限定されない。このようなＡＴＰの濃度は、反応系に含まれるアミノ酸が十分に変換されるために、反応系に含まれるアミノ酸のモル数に対して過剰量であることが好ましい。また、このようなＡＴＰの濃度は、反応（ｉ）におけるＡＴＰの変化量が検出可能となる程度であることが好ましい。このようなＡＴＰの濃度としては、例えば０．００１μＭ以上、好ましくは０．０１μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上、さらにより好ましくは１μＭ以上、なおさらにより好ましくは５μＭ以上であってもよい。また、このようなＡＴＰの濃度としては、例えば１００００μＭ以下、好ましくは５０００μＭ以下、より好ましくは１０００μＭ以下、さらにより好ましくは５００μＭ以下、なおさらにより好ましくは２００μＭ以下であってもよい。より具体的には、このようなＡＴＰの濃度としては、例えば０．００１～１００００μＭ、好ましくは０．０１～５０００μＭ、より好ましくは０．１～１０００μＭ、さらにより好ましくは１～５００μＭ、なおさらにより好ましくは５～２００μＭであってもよい。 The concentration of ATP in reaction (i) is not particularly limited as long as the amino acid can be quantified by the method of the present invention. The concentration of ATP is preferably an excess amount relative to the number of moles of amino acids contained in the reaction system so that the amino acids contained in the reaction system are sufficiently converted. In addition, the concentration of ATP is preferably such that the change in ATP in reaction (i) is detectable. The concentration of ATP may be, for example, 0.001 μM or more, preferably 0.01 μM or more, more preferably 0.1 μM or more, even more preferably 1 μM or more, and even more preferably 5 μM or more. In addition, the concentration of ATP may be, for example, 10,000 μM or less, preferably 5,000 μM or less, more preferably 1,000 μM or less, even more preferably 500 μM or less, and even more preferably 200 μM or less. More specifically, the concentration of such ATP may be, for example, 0.001 to 10,000 μM, preferably 0.01 to 5,000 μM, more preferably 0.1 to 1,000 μM, even more preferably 1 to 500 μM, and even more preferably 5 to 200 μM.
反応（ｉ）を行う反応系としては、水溶液が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｇｌｙ―ＫＣｌ―ＫＯＨ緩衝液が挙げられる。ｐＨは、例えば２～１２、好ましくは４～１２、より好ましくは５～１１であってもよい。 The reaction system in which reaction (i) is carried out may be an aqueous solution, preferably a buffer solution. Examples of the buffer solution include phosphate buffer, HEPES buffer, Tris buffer, carbonate buffer, acetate buffer, citrate buffer, MOPS buffer, MES buffer, and Gly-KCl-KOH buffer. The pH may be, for example, 2 to 12, preferably 4 to 12, and more preferably 5 to 11.
ＡＴＰ依存性酵素が補因子要求性である場合、反応（ｉ）を行う反応系は、ＡＴＰ依存性酵素の補因子を含んでいてもよい。ＡＡＲＳおよびＤ－アミノ酸リガーゼもしくはＤ－アミノ酸キナーゼは、補因子としてマグネシウムイオン要求性である場合が多いので、ＡＴＰ依存性酵素がＡＡＲＳまたはＤ－アミノ酸リガーゼもしくはＤ－アミノ酸キナーゼである場合、反応（ｉ）を行う反応系は、マグネシウムイオン供給源（例、塩化マグネシウム）を含んでいてもよい。反応（ｉ）におけるマグネシウムイオン供給源の濃度は、ＡＴＰ依存性酵素が十分に活性化する限り特に限定されないが、例えば１μＭ以上、好ましくは１０μＭ以上、より好ましくは１００μＭ以上、さらにより好ましくは１０００μＭ以上であってもよい。また、このようなマグネシウムイオン供給源の濃度としては、例えば１００ｍＭ以下、好ましくは５０ｍＭ以下、より好ましくは２０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１０ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、このようなマグネシウムイオン供給源の濃度としては、例えば１μＭ～１００ｍＭ、好ましくは１０μＭ～５０ｍＭ、より好ましくは１００μＭ～２０ｍＭ、さらにより好ましくは１０００μＭ～１０ｍＭであってもよい。 When the ATP-dependent enzyme requires a cofactor, the reaction system in which reaction (i) is carried out may contain a cofactor for the ATP-dependent enzyme. Since AARS and D-amino acid ligase or D-amino acid kinase often require magnesium ions as a cofactor, when the ATP-dependent enzyme is AARS or D-amino acid ligase or D-amino acid kinase, the reaction system in which reaction (i) is carried out may contain a magnesium ion source (e.g., magnesium chloride). The concentration of the magnesium ion source in reaction (i) is not particularly limited as long as the ATP-dependent enzyme is sufficiently activated, but may be, for example, 1 μM or more, preferably 10 μM or more, more preferably 100 μM or more, and even more preferably 1000 μM or more. In addition, the concentration of such a magnesium ion source may be, for example, 100 mM or less, preferably 50 mM or less, more preferably 20 mM or less, and even more preferably 10 mM or less. More specifically, the concentration of such a magnesium ion source may be, for example, 1 μM to 100 mM, preferably 10 μM to 50 mM, more preferably 100 μM to 20 mM, and even more preferably 1000 μM to 10 mM.
反応（ｉ）を行う反応系は、ＡＴＰ依存性酵素による反応を促進するために求核剤を含んでいてもよい。求核剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、メチルアミン等のアミン類が挙げられる。反応（ｉ）における求核剤の濃度は、ＡＴＰ依存性酵素が十分に活性化する限り特に限定されないが、例えば１μＭ以上、好ましくは１０μＭ以上、より好ましくは１００μＭ以上、さらにより好ましくは１０００μＭ以上であってもよい。また、このような求核剤の濃度としては、例えば５０００ｍＭ以下、好ましくは２０００ｍＭ以下、より好ましくは１０００ｍＭ以下、さらにより好ましくは５００ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、このような求核剤の濃度としては、例えば１μＭ～５０００ｍＭ、好ましくは１０μＭ～２０００ｍＭ、より好ましくは１００μＭ～１０００ｍＭ、さらにより好ましくは１０００μＭ～５００ｍＭであってもよい。 The reaction system in which reaction (i) is carried out may contain a nucleophile to promote the reaction by the ATP-dependent enzyme. Examples of nucleophiles include amines such as hydroxylamine and methylamine. The concentration of the nucleophile in reaction (i) is not particularly limited as long as the ATP-dependent enzyme is sufficiently activated, but may be, for example, 1 μM or more, preferably 10 μM or more, more preferably 100 μM or more, and even more preferably 1000 μM or more. The concentration of such a nucleophile may be, for example, 5000 mM or less, preferably 2000 mM or less, more preferably 1000 mM or less, and even more preferably 500 mM or less. More specifically, the concentration of such a nucleophile may be, for example, 1 μM to 5000 mM, preferably 10 μM to 2000 mM, more preferably 100 μM to 1000 mM, and even more preferably 1000 μM to 500 mM.
反応（ｉ）は、ＡＴＰ依存性酵素による反応が進行し、反応系に含まれる各成分が変質せず、かつ反応系が凍結または蒸発しない限りにおいていずれの温度で行ってもよい。高温ではＡＴＰ依存性酵素の反応性が高いこと、および、検量線の直線性が良好になる傾向となることにより、反応（ｉ）は、高温で行うことが好ましい。反応（ｉ）は、例えば２０℃以上、好ましくは３０℃以上、より好ましくは４０℃以上、さらにより好ましくは５０℃以上、なおさらにより好ましくは５５℃以上で行ってもよい。また、反応（ｉ）は、例えば９０℃以下、好ましくは８５℃以下、より好ましくは８０℃以下、さらにより好ましくは７７℃以下、なおさらにより好ましくは７５℃以下で行ってもよい。より具体的には、反応（ｉ）は、例えば２０～９０℃、好ましくは３０～８５℃、より好ましくは４０～８０℃、さらにより好ましくは５０～７７℃、なおさらにより好ましくは５５～７５℃で行ってもよい。 Reaction (i) may be carried out at any temperature as long as the reaction by the ATP-dependent enzyme proceeds, the components contained in the reaction system are not altered, and the reaction system does not freeze or evaporate. At high temperatures, the reactivity of the ATP-dependent enzyme is high, and the linearity of the calibration curve tends to be good, so reaction (i) is preferably carried out at high temperatures. Reaction (i) may be carried out, for example, at 20°C or higher, preferably 30°C or higher, more preferably 40°C or higher, even more preferably 50°C or higher, and even more preferably 55°C or higher. Reaction (i) may also be carried out, for example, at 90°C or lower, preferably 85°C or lower, more preferably 80°C or lower, even more preferably 77°C or lower, and even more preferably 75°C or lower. More specifically, reaction (i) may be carried out, for example, at 20 to 90°C, preferably 30 to 85°C, more preferably 40 to 80°C, even more preferably 50 to 77°C, and even more preferably 55 to 75°C.
反応（ｉｉ）で発生するシグナルは、ＡＴＰ量を反映するパラメータを有し、そのパラメータを評価することによりＡＴＰ量を測定することができるシグナルである限り特に限定されない。反応（ｉｉ）で発生するシグナルとしては、例えば、発光シグナルおよび蛍光シグナルが挙げられる。発光シグナルおよび蛍光シグナルにおいて、ＡＴＰ量を反映するパラメータとしては、例えば、発光量（例、相対発光量；ＲＬＵ）、蛍光波長（例、相対蛍光量；ＲＦＵ）が挙げられる。 The signal generated in reaction (ii) is not particularly limited as long as it has a parameter that reflects the amount of ATP and the amount of ATP can be measured by evaluating the parameter. Examples of signals generated in reaction (ii) include luminescence signals and fluorescent signals. In luminescence signals and fluorescent signals, parameters that reflect the amount of ATP include, for example, the amount of luminescence (e.g., relative luminescence unit; RLU) and the fluorescence wavelength (e.g., relative fluorescence unit; RFU).
反応（ｉｉ）で発生するシグナルが発光シグナルまたは蛍光シグナルである場合、反応（ｉｉ）は、ＡＴＰ量依存的に化学発光または生物発光を引き起こす反応であってもよい。ＡＴＰ量依存的に化学発光または生物発光を引き起こす反応としては、例えば、ＡＴＰを基質とする発光酵素、蛍光プローブ、蛍光標識ヌクレオチド、蛍光タンパク質、または会合誘起発光化合物を用いた反応が挙げられる。反応（ｉｉ）は、ＡＴＰを基質とする発光酵素により行われることが好ましい。 When the signal generated in reaction (ii) is a luminescent signal or a fluorescent signal, reaction (ii) may be a reaction that induces chemiluminescence or bioluminescence depending on the amount of ATP. Examples of reactions that induce chemiluminescence or bioluminescence depending on the amount of ATP include reactions using a luminescent enzyme that uses ATP as a substrate, a fluorescent probe, a fluorescently labeled nucleotide, a fluorescent protein, or an association-induced luminescent compound. Reaction (ii) is preferably carried out using a luminescent enzyme that uses ATP as a substrate.
ＡＴＰを基質とする発光酵素とは、ＡＴＰを補酵素として、発光素基質を発光性物質に変換する反応を触媒する酵素をいう。変換酵素としては、例えば、ルシフェラーゼが挙げられる。発光素基質とは、ＡＴＰを基質とする発光酵素の触媒作用により発光性物質に変換される基質をいう。発光素基質としては、例えば、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンが挙げられる。 A luminescent enzyme that uses ATP as a substrate is an enzyme that catalyzes a reaction that converts a luminescent substrate into a luminescent substance using ATP as a coenzyme. An example of a conversion enzyme is luciferase. A luminescent substrate is a substrate that is converted into a luminescent substance by the catalytic action of a luminescent enzyme that uses ATP as a substrate. An example of a luminescent substrate is luciferin, which is a substrate for luciferase.
ＡＴＰを基質とする発光酵素の反応機構として、例えば、ルシフェラーゼは、ＡＴＰ量依存的にルシフェリンを発光性物質であるオキシルシフェリンに変換する反応を触媒する。 As an example of the reaction mechanism of luminescent enzymes that use ATP as a substrate, luciferase catalyzes a reaction that converts luciferin into oxyluciferin, a luminescent substance, in an ATP-dependent manner.
反応（ｉｉ）がＡＴＰを基質とする発光酵素により行われる場合、反応（ｉｉ）は、変換酵素の触媒作用により、反応（ｉ）での残存ＡＴＰ量依存的に基質が発光性物質に変換される反応である。例えば、ルシフェラーゼが触媒する反応は、残存ＡＴＰ量依存的にルシフェリンを発光性物質であるオキシルシフェリンに変換する反応である。この反応機構により、発光性物質の生成量を、反応（ｉ）でのＡＴＰ消費量（残存ＡＴＰ量と表裏一体となる値）の指標とすることができ、結果として、アミノ酸量の指標とすることができる。 When reaction (ii) is carried out by a luminescent enzyme that uses ATP as a substrate, reaction (ii) is a reaction in which the substrate is converted into a luminescent substance in a manner dependent on the amount of ATP remaining in reaction (i) by the catalytic action of a conversion enzyme. For example, the reaction catalyzed by luciferase is a reaction in which luciferin is converted into the luminescent substance oxyluciferin in a manner dependent on the amount of remaining ATP. This reaction mechanism allows the amount of luminescent substance produced to be an index of the amount of ATP consumed in reaction (i) (a value that is inextricably linked to the amount of remaining ATP), and as a result, can be used as an index of the amount of amino acids.
反応（ｉｉ）は、変換酵素の一般的な反応条件下で行ってもよい。 Reaction (ii) may be carried out under typical reaction conditions for the converting enzyme.
反応（ｉ）および（ｉｉ）は、共役して行ってもよく、逐次行ってもよい。反応（ｉ）および（ｉｉ）を共役して行う場合、反応（ｉ）および（ｉｉ）は、これらの反応に必要な構成要素が混合された単一の反応系で行ってもよい。 Reactions (i) and (ii) may be carried out either in a coupled manner or sequentially. When reactions (i) and (ii) are carried out in a coupled manner, reactions (i) and (ii) may be carried out in a single reaction system in which the components required for these reactions are mixed.
（２）では、反応（ｉｉ）で発生したシグナルが検出される。シグナルの検出において、ＡＴＰ量を反映するパラメータを評価され、評価されたパラメータに基づいてＡＴＰ量が測定される。例えば、反応（ｉｉ）がＡＴＰを基質とする発光酵素により行われる場合、ＡＴＰに依存して生成された発光性物質の量が、発光シグナルとして検出される。発光シグナルは、例えば、発光量（例、相対発光量；ＲＬＵ）、蛍光波長（例、相対蛍光量；ＲＦＵ）として検出される。検出された発光シグナルは、アミノ酸量の指標となる。 In (2), the signal generated in reaction (ii) is detected. In detecting the signal, a parameter reflecting the amount of ATP is evaluated, and the amount of ATP is measured based on the evaluated parameter. For example, when reaction (ii) is performed by a luminescent enzyme that uses ATP as a substrate, the amount of luminescent substance generated in a manner dependent on ATP is detected as a luminescent signal. The luminescent signal is detected, for example, as the amount of luminescence (e.g., relative luminescence unit; RLU) or fluorescence wavelength (e.g., relative fluorescence unit; RFU). The detected luminescent signal is an index of the amount of amino acid.
シグナルが蛍光シグナルまたは発光シグナルである場合、シグナルの検出は、例えば、光検出装置（例、ルミノメーター、フォトセンサー、プレートリーダー）を用いて行うことができる。 When the signal is a fluorescent signal or a luminescent signal, the signal can be detected, for example, using a light detection device (e.g., a luminometer, a photosensor, a plate reader).
本発明の方法で定量されるアミノ酸は、被検試料に含まれる。被検試料は、アミノ酸を含有すると疑われる試料である限り特に限定されず、例えば、生体由来試料（例、血液、尿、唾液、涙）、食品（例、栄養ドリンク、アミノ酸飲料）、培養液（例、菌体、細胞）が挙げられる。被検試料中のアミノ酸は、低濃度（例、１μＭ以上１ｍＭ未満等の１ｍＭ未満の濃度）であっても、高濃度（例、１ｍＭ以上１Ｍ未満等の１ｍＭ以上の濃度）であってもよい。本発明の方法は、アミノ酸標準試料を用いて作成された検量線を用いて行ってもよい。 The amino acids quantified by the method of the present invention are contained in a test sample. The test sample is not particularly limited as long as it is a sample suspected of containing amino acids, and examples thereof include biological samples (e.g., blood, urine, saliva, tears), foods (e.g., nutritional drinks, amino acid drinks), and culture solutions (e.g., bacteria, cells). The amino acids in the test sample may be at low concentrations (e.g., less than 1 mM, such as 1 μM or more and less than 1 mM) or at high concentrations (e.g., 1 mM or more and less than 1 M). The method of the present invention may be performed using a calibration curve created using an amino acid standard sample.
別の実施形態では、本発明は、以下を含む、アミノ酸分析用キットを提供する：
（ａ）ＡＴＰ依存性酵素；
（ｂ）ＡＴＰ；ならびに
（ｃ）ＡＴＰを基質とする発光酵素およびその発光素基質。
In another embodiment, the present invention provides a kit for amino acid analysis comprising:
(a) ATP-dependent enzyme;
(b) ATP; and (c) a luminescent enzyme that uses ATP as a substrate and a luminescent substrate thereof.
本発明のキットは、ＡＴＰ依存性酵素による触媒反応を進行させるために、緩衝液、金属イオン、および求核剤の少なくとも一つをさらに含むことができる。緩衝液、ＡＴＰ依存性酵素の補因子、および求核剤の種類および濃度の例としては、上述したものが挙げられる。 The kit of the present invention may further include at least one of a buffer, a metal ion, and a nucleophile to promote the catalytic reaction by the ATP-dependent enzyme. Examples of the types and concentrations of the buffer, the cofactor for the ATP-dependent enzyme, and the nucleophile are those described above.
以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
〔実施例１〕各酵素の発現用プラスミドの構築
大腸菌を用いた各酵素の組換え発現系を構築した。ここではＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＴｙｒＲＳの組換え発現用プラスミドの構築法を示す。ｐＥＴ－２８ａの相補配列として５’末端にＤＮＡ（ＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧ）および３’末端にＤＮＡ（ＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴ）を付加したＴｙｒＲＳ（配列番号１）の遺伝子断片を化学合成にて作成した。ＮｄｅＩ（タカラバイオ株式会社）およびＢａｍＨＩ（タカラバイオ株式会社）にて制限酵素消化したｐＥＴ－２８ａベクター（Ｍｅｒｃｋ社）をＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて除タンパク質および不要なＤＮＡ断片を除去した。得られた産物とＴｙｒＲＳの遺伝子断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＣ社）を用いてライゲーションし、ライゲーション産物による大腸菌ＸＬ－１０ Ｇｏｌｄの形質転換体を取得した。大腸菌ＸＬ－１０ Ｇｏｌｄの形質転換体からプラスミドを抽出し、ＤＮＡ配列を解析することで、プラスミドへの目的遺伝子の挿入を確認した。
Example 1: Construction of Plasmids for Expression of Each Enzyme A recombinant expression system for each enzyme was constructed using Escherichia coli. Here, a method for constructing a plasmid for recombinant expression of TyrRS derived from Thermus thermophilus is shown. A gene fragment of TyrRS (SEQ ID NO: 1) was prepared by chemical synthesis, with DNA (GTGCCGCGCGGCAGCCATATG) added to the 5' end and DNA (GGATCCGAATTCGAGCTCCGT) added to the 3' end as a complementary sequence of pET-28a. The pET-28a vector (Merck) was digested with restriction enzymes NdeI (Takara Bio Inc.) and BamHI (Takara Bio Inc.), and protein and unnecessary DNA fragments were removed using Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega). The resulting product was mixed with a gene fragment of TyrRS and ligated using GeneArt (registered trademark) Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix (ThermoFisher SCIENTIC), and a transformant of E. coli XL-10 Gold was obtained using the ligation product. A plasmid was extracted from the transformant of E. coli XL-10 Gold, and the DNA sequence was analyzed to confirm the insertion of the target gene into the plasmid.
目的遺伝子が挿入されたプラスミドを、以後、ｐＥＴ－２８ａ－ＴｙｒＲＳと呼び、ｐＥＴ－２８ａ－ＴｙｒＲＳによるＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体をｐＥＴ－２８ａ－ＴｙｒＲＳ－ＢＬ２１（ＤＥ３）と呼ぶ。表３に示す他の酵素も上記の方法に従ってプラスミドを構築した。 The plasmid into which the target gene was inserted is hereafter referred to as pET-28a-TyrRS, and the transformant of BL21(DE3) with pET-28a-TyrRS is referred to as pET-28a-TyrRS-BL21(DE3). Plasmids for the other enzymes shown in Table 3 were also constructed according to the above method.
〔実施例２〕各酵素の調製
ＴｙｒＲＳの調製は、下記のようにして行った。まず、実施例１で取得したｐＥＴ－２８ａ－ＴｙｒＲＳ－ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックから２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩、静置培養した。２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ液体培地５０ｍＬを２５０ｍＬ容量のフラスコに入れ、ＬＢプレート上のシングルコロニーを植菌し、３７℃で一晩培養した。２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ液体培地２Ｌに上記培養液２０ｍＬを添加し、３７℃でＯＤ６００の値が０．６程度になるまで旋回振盪にて培養した。２５℃の下３０分間静置し、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、１６℃で旋回振盪にて一晩培養した後に５０ｍＬチューブに集菌した。
[Example 2] Preparation of each enzyme TyrRS was prepared as follows. First, the glycerol stock of pET-28a-TyrRS-BL21 (DE3) obtained in Example 1 was inoculated onto an LB plate containing 25 μg/mL kanamycin, and cultured overnight at 37 ° C. while standing. 50 mL of LB liquid medium containing 25 μg/mL kanamycin was placed in a 250 mL flask, and a single colony on the LB plate was inoculated and cultured overnight at 37 ° C. 20 mL of the above culture solution was added to 2 L of LB liquid medium containing 25 μg/mL kanamycin, and cultured at 37 ° C. with gyratory shaking until the OD600 value reached about 0.6. The mixture was left to stand at 25 ° C. for 30 minutes, IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM, and cultured overnight at 16 ° C. with gyratory shaking, and then collected in a 50 mL tube.
破砕用バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ、久保田商事株式会社）を用いて破砕した。この破砕液を１５０００×ｇで３０分間遠心し上清を回収した後、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製を行った。精製において、洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）、および溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を使用した。溶出画分を回収し、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ＳとＨｉ ｐｒｅｐ ２６／１０ ｄｅｓａｌｔｉｎｇを用いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶液交換した。その後、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ＳとＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ ６ｍＬを用いて陰イオン交換カラムによる精製を４℃にて実施した。平衡化にはＡバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を、および溶出にはＢバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いてＮａＣｌ濃度グラジエントで溶出を行った。ＬｙｓＲＳは上記の精製方法に従って調製した。 The cells were suspended in a disruption buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0) and disrupted using an ultrasonic disrupter (INSONATOR, Kubota Shoji Co., Ltd.). The disrupted solution was centrifuged at 15,000 x g for 30 minutes to collect the supernatant, which was then purified using Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Japan Co., Ltd.). A washing buffer (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole, pH 8.0) and an elution buffer (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8.0) were used for purification. The eluted fraction was collected and exchanged into 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 using AKTA Explorer 10S and Hiprep 26/10 desalting. Then, purification was performed on an anion exchange column at 4°C using AKTA Explorer 10S and 6 mL of Resource Q. Equilibration was performed with Buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 8.0), and elution was performed with Buffer B (20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 8.0) using a NaCl concentration gradient. LysRS was prepared according to the purification method described above.
他の酵素（ＩｌｅＲＳ、ＬｅｕＲＳ、ＶａｌＲＳ、Ｄ－Ａｌａ ｌｉｇａｓｅ）も上記の方法に従って調製したが、各バッファーとして、破砕用バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）、Ａバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）およびＢバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ）を使用した。 Other enzymes (IleRS, LeuRS, ValRS, D-Ala ligase) were also prepared according to the above method, but the following buffers were used for each: disruption buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0), washing buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0), elution buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8.0), buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8.0), and buffer B (50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl).
〔実施例３〕活性の評価
実施例２で調製した各酵素の活性の評価は下記手順にて行った。ここではＴｙｒＲＳの活性評価法を示す。ＴｙｒＲＳを２．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、２０μＬのＴｙｒＲＳに対して１．０Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を１０μＬ、７５０μＭ ＡＴＰを１μＬ、１．０Ｍ ＭｇＣｌ２を０．５μＬ、２．０Ｍヒドロキシルアミン溶液、ｐＨ７．５を１０μＬ、超純水４８．５μＬ、表４に示す各濃度のチロシン溶液１０μＬを加え混合した反応溶液を６５℃、１５分間インキュベートした。この溶液９０μＬに対して界面活性剤（ＡＴＰ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、アブカム社）を４５μＬ添加し、５分インキュベート後、ルシフェラーゼおよびルシフェリンを含む基質溶液（ＡＴＰ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、アブカム社）を４５μＬ添加し、５分インキュベートした。Ｎ＝３となるように３８４ウェルプレート（コーニング社）に５０μＬ分注し、プレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＣ社）にて発光強度を測定した。図１にＴｙｒＲＳを用いた各濃度のＬ－チロシン溶液に対する検量線を示す（Ｎ＝３）。検量線のＲ２値を表４に示す。
[Example 3] Activity evaluation The activity of each enzyme prepared in Example 2 was evaluated by the following procedure. Here, the activity evaluation method of TyrRS is shown. TyrRS was prepared to 2.0 mg/mL, and 10 μL of 1.0 M HEPES, pH 7.5, 1 μL of 750 μM ATP, 0.5 μL of 1.0 M MgCl 2 , 10 μL of 2.0 M hydroxylamine solution, pH 7.5, 48.5 μL of ultrapure water, and 10 μL of tyrosine solution of each concentration shown in Table 4 were added to 20 μL of TyrRS, and the reaction solution was incubated at 65° C. for 15 minutes. To 90 μL of this solution, 45 μL of surfactant (ATP Detection Assay Kit, Abcam) was added, and after 5 minutes of incubation, 45 μL of substrate solution containing luciferase and luciferin (ATP Detection Assay Kit, Abcam) was added and incubated for 5 minutes. 50 μL was dispensed into a 384-well plate (Corning) so that N = 3, and the luminescence intensity was measured using a plate reader (Varioskan LUX, ThermoFisher SCIENTIC). Figure 1 shows the calibration curve for L-tyrosine solutions of each concentration using TyrRS (N = 3). The R2 value of the calibration curve is shown in Table 4.
他の酵素（ＩｌｅＲＳ、ＬｅｕＲＳ、ＶａｌＲＳ、ＬｙｓＲＳ、Ｄ－Ａｌａ ｌｉｇａｓｅ、ＨｉｓＲＳ）も活性評価を行った。各酵素を５．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、上述した組成に基づいて反応溶液を調製し、反応および発光強度の検出を行った。図２にＩｌｅＲＳを用いたＬ－イソロイシン溶液に対する検量線、図３にＬｅｕＲＳを用いたＬ－ロイシン溶液に対する検量線、図４にＶａｌＲＳを用いたＬ－バリン溶液に対する検量線、図５にＬｙｓＲＳを用いたＬ－リジン溶液に対する検量線、図６にＤ－Ａｌａ ｌｉｇａｓｅを用いたＤ－アラニンに対する検量線、図７にＨｉｓＲＳを用いたＬ－ヒスチジン溶液に対する検量線を示す（いずれも、Ｎ＝３）。検量線のＲ２値を表４に示す。 The activity of other enzymes (IleRS, LeuRS, ValRS, LysRS, D-Ala ligase, HisRS) was also evaluated. Each enzyme was prepared to 5.0 mg/mL, and a reaction solution was prepared based on the above-mentioned composition, and the reaction and luminescence intensity were detected. FIG. 2 shows a calibration curve for an L-isoleucine solution using IleRS, FIG. 3 shows a calibration curve for an L-leucine solution using LeuRS, FIG. 4 shows a calibration curve for an L-valine solution using ValRS, FIG. 5 shows a calibration curve for an L-lysine solution using LysRS, FIG. 6 shows a calibration curve for D-alanine using D-Ala ligase, and FIG. 7 shows a calibration curve for an L-histidine solution using HisRS (all N=3). Table 4 shows the R2 values of the calibration curves.
実施例で用いた酵素はいずれも、検量線において良好な線形を示した。この結果は、本発明の方法が、Ｌ体およびＤ体を含めたアミノ酸の高精度な定量に適していることを示す。また、この結果は、１００ｎＭ～５μＭのような比較的低濃度のアミノ酸についても正確な定量ができることを示す。 All of the enzymes used in the examples showed good linearity in the calibration curves. This result indicates that the method of the present invention is suitable for highly accurate quantification of amino acids, including L- and D-isomers. In addition, this result indicates that accurate quantification is possible even for amino acids at relatively low concentrations, such as 100 nM to 5 μM.
〔実施例４〕反応温度の評価
実施例２で調製した酵素の反応温度の評価は下記手順にて行った。ここではＩｌｅＲＳについて記載する。ＩｌｅＲＳを５．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、２０μＬのＩｌｅＲＳに対して２Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を１０μＬ、１０ｍＭ ＡＴＰを１μＬ、１．０Ｍ ＭｇＣｌ２を０．５μＬ、２．０Ｍヒドロキシルアミン溶液、ｐＨ７．５を１０μＬ、超純水４８．５μＬ、表５に示す各濃度のＬ－イソロイシン溶液１０μＬを加え混合した反応溶液を３７、４５、５５、６５、７５℃で、１５分間インキュベートした。この溶液９０μＬに対して界面活性剤（ＡＴＰ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、アブカム社）を４５μＬ添加し、５分インキュベート後、ルシフェラーゼ溶液を４５μＬ添加し、５分インキュベートした。Ｎ＝３となるように３８４ウェルプレートに５０μＬ分注し、発光強度を測定した。図８にＩｌｅＲＳの各温度における検量線を示す（Ｎ＝３）。上記の方法に従って作成したＶａｌＲＳおよびＬｅｕＲＳの各温度における検量線を図９および１０に示す（いずれも、Ｎ＝３）。検量線のＲ２値を表５に示す。
[Example 4] Evaluation of reaction temperature The reaction temperature of the enzyme prepared in Example 2 was evaluated by the following procedure. Here, IleRS is described. IleRS was prepared to 5.0 mg/mL, and 20 μL of IleRS was mixed with 10 μL of 2M HEPES, pH 7.5, 1 μL of 10 mM ATP, 0.5 μL of 1.0 M MgCl 2 , 10 μL of 2.0 M hydroxylamine solution, pH 7.5, 48.5 μL of ultrapure water, and 10 μL of L-isoleucine solution of each concentration shown in Table 5, and the reaction solution was incubated at 37, 45, 55, 65, and 75 ° C for 15 minutes. To 90 μL of this solution, 45 μL of surfactant (ATP Detection Assay Kit, Abcam) was added, and after 5 minutes of incubation, 45 μL of luciferase solution was added and incubated for 5 minutes. 50 μL was dispensed into a 384-well plate so that N=3, and the luminescence intensity was measured. FIG. 8 shows the calibration curves for IleRS at each temperature (N=3). FIGS. 9 and 10 show the calibration curves for ValRS and LeuRS at each temperature prepared according to the above method (both N=3). Table 5 shows the R2 values of the calibration curves.
実施例で用いた酵素は、いずれの反応温度においても検量線において良好な線形を示した。この結果は、本発明の方法が、２０～９０℃の反応温度での高精度なアミノ酸の定量に適していることを示す。 The enzyme used in the examples showed good linearity in the calibration curve at all reaction temperatures. This result indicates that the method of the present invention is suitable for highly accurate quantification of amino acids at reaction temperatures between 20 and 90°C.
〔実施例５〕基質特異性の評価
実施例２で調製した酵素の基質特異性の評価は下記手順にて行った。ここではＴｙｒＲＳについて記載する。ＴｙｒＲＳを２．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、２０μＬのＴｙｒＲＳに対して０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を１００μＬ、２０００μＭ ＡＴＰを２μＬ、１．０Ｍ ＭｇＣｌ２を１μＬ、２．０Ｍヒドロキシルアミン溶液、ｐＨ７．５を２０μＬ、超純水３７μＬ、１５０μＭの各アミノ酸溶液（グリシンを除き、いずれもＬ－アミノ酸）またはブランク２０μＬを加え混合した反応溶液を３７℃、６０分間インキュベートした。この溶液９０μＬに対して界面活性剤（ＡＴＰ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、アブカム社）を４５μＬ添加し、５分インキュベート後、ルシフェラーゼ溶液を４５μＬ添加し、５分インキュベートした。Ｎ＝３となるように３８４ウェルプレートに５０μＬ分注し、発光強度を測定した。各アミノ酸溶液において、ブランクに対する発光強度の減少量を活性の指標とした。Ｌ－チロシンに対する活性を基準とした各アミノ酸に対するＴｙｒＲＳの相対活性を図１１に示す（Ｎ＝３）。上記の方法に従ってＶａｌＲＳの基質特異性を評価した結果を図１２に示す（Ｎ＝３）。
[Example 5] Evaluation of substrate specificity Evaluation of the substrate specificity of the enzyme prepared in Example 2 was performed by the following procedure. Here, TyrRS is described. TyrRS was prepared to 2.0 mg/mL, and 20 μL of TyrRS was mixed with 100 μL of 0.2 M HEPES, pH 7.5, 2 μL of 2000 μM ATP, 1 μL of 1.0 M MgCl 2 , 20 μL of 2.0 M hydroxylamine solution, pH 7.5, 37 μL of ultrapure water, and 20 μL of 150 μM amino acid solution (all L-amino acids except glycine) or blank, and the reaction solution was incubated at 37 ° C. for 60 minutes. 45 μL of surfactant (ATP Detection Assay Kit, Abcam) was added to 90 μL of this solution, and after 5 minutes of incubation, 45 μL of luciferase solution was added and incubated for 5 minutes. 50 μL of each solution was dispensed into a 384-well plate so that N=3, and the luminescence intensity was measured. For each amino acid solution, the decrease in luminescence intensity relative to the blank was used as an index of activity. The relative activity of TyrRS for each amino acid based on the activity for L-tyrosine is shown in FIG. 11 (N=3). The results of evaluating the substrate specificity of ValRS according to the above method are shown in FIG. 12 (N=3).
実施例で用いた酵素はいずれも、極めて高い基質特異性を示した。この結果は、本発明の方法が、特異性の高いアミノ酸の分析に適していることを示す。 All of the enzymes used in the examples showed extremely high substrate specificity. This result indicates that the method of the present invention is suitable for analyzing highly specific amino acids.
本発明の方法は、例えば、生体研究、健康栄養、医療、食品製造など広範な分野において応用することができる。 The method of the present invention can be applied in a wide range of fields, such as biomedical research, health and nutrition, medicine, and food production.
配列番号１は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＩｌｅＲＳのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬｅｕＲＳのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＶａｌＲＳのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＬｙｓＲＳのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｄ－Ａｌａ ｌｉｇａｓｅのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＨｉｓＲＳのアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:1 shows the amino acid sequence of Thermus thermophilus TyrRS.
SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of Thermotoga maritima IleRS.
SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence of Thermus thermophilus LeuRS.
SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of Thermus thermophilus ValRS.
SEQ ID NO:5 shows the amino acid sequence of Thermotoga maritima LysRS.
SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of Thermus thermophilus D-Ala ligase.
SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence of Thermotoga maritima HisRS.
Claims (9)
（１）以下の反応（ｉ）および（ｉｉ）を行うこと：
（ｉ）アミノ酸およびＡＴＰをＡＴＰ依存性酵素に接触させて、アミノ酸量依存的にＡＴＰを消費させる反応；および
（ｉｉ）ＡＴＰ量依存的にシグナルを発生する反応；ならびに
（２）シグナルを検出すること
を含み、
アミノ酸が、Ｌ－アミノ酸またはグリシンであり、
ＡＴＰ依存性酵素が、好熱菌由来アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素であり、
反応（ｉ）が、４５～７５℃で行われる、方法。 A method for quantifying an amino acid, comprising:
(1) carrying out the following reactions (i) and (ii):
(i) a reaction in which an amino acid and ATP are contacted with an ATP-dependent enzyme to consume ATP in an amino acid amount-dependent manner; and (ii) a reaction in which a signal is generated in an ATP amount-dependent manner; and (2) a reaction in which the signal is detected,
the amino acid is an L-amino acid or glycine;
the ATP-dependent enzyme is a thermophilic aminoacyl-tRNA synthetase;
The process wherein reaction (i) is carried out at 45-75°C.
ＡＴＰ依存性酵素が、前記アミノ酸に対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素である、
請求項１記載の方法。 the amino acids are selected from the group consisting of L-arginine, L-cysteine, L-isoleucine, L-leucine, L-methionine, L-valine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-lysine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-histidine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-aspartic acid, L-asparagine, L-phenylalanine, L-alanine, and glycine;
the ATP-dependent enzyme is an aminoacyl-tRNA synthetase corresponding to the amino acid;
The method of claim 1.
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