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JP2024038517A - ライブラリー富化を改善するための組成物および方法 - Google Patents

ライブラリー富化を改善するための組成物および方法 Download PDF

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JP2024038517A JP2024014892A JP2024014892A JP2024038517A JP 2024038517 A JP2024038517 A JP 2024038517A JP 2024014892 A JP2024014892 A JP 2024014892A JP 2024014892 A JP2024014892 A JP 2024014892A JP 2024038517 A JP2024038517 A JP 2024038517A
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Abstract

【課題】ライブラリー富化を改善するための組成物および方法の提供。【解決手段】本開示は、クラウディング剤を含むハイブリダイゼーションバッファー、そのハイブリダイゼーションバッファーを使用する工程を含む方法、およびそのハイブリダイゼーションバッファーを含むキットを記載する。本開示は、ハイブリッド捕捉方法において使用するためのブロッカー、それらのブロッカーを使用する方法、およびそれらのブロッカーを含むキットも記載する。さらに、本開示は、ライブラリーメンバーの配列決定する工程の前にＰＣＲを用いてライブラリーメンバーを増幅する工程を含まない、ハイブリッド捕捉方法を記載する。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０１８年８月１５日出願の米国特許仮出願第６２／７６４，７５３号の利益を主張する。この仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
発明の要旨
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の処理量が急速に進歩しているにもかかわらず、古典的なライブラリー調製法および富化法は、多くの時間を必要とし、処理量を制限する障害となることがある。本開示は、ブロッカーおよび／またはハイブリダイゼーションバッファーを含む組成物、それらの組成物を使用するための方法、ならびに配列決定前に核酸選択の効率を改善するための方法を記載する。
１つの態様において、本開示は、クラウディング剤と、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、不安定化剤、塩およびブロッカーのうちの少なくとも１つとを含むハイブリダイゼーションバッファーを記載する。
別の態様において、本開示は、ハイブリダイゼーションバッファーを使用する工程を含む方法を記載する。本開示は、ハイブリダイゼーションバッファーを含むキットも記載する。
さらなる態様において、本開示は、オリゴヌクレオチドを含むブロッカーを記載し、そのブロッカーは、アダプターに結合することができる。そのアダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含む。アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに結合することができるブロッカーの領域は、少なくとも３つのチミン塩基またはユニバーサル塩基および少なくとも１つの非ユニバーサル塩基を含む。
なおも別の態様において、本開示は、接続されていない２つのオリゴヌクレオチドを含むブロッカーを記載する。そのブロッカーは、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、そのアダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含む。接続されていないオリゴヌクレオチドは、アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに対応しない塩基を含む。
本開示は、本明細書中に記載されるブロッカーを使用する工程を含む方法および本明細書中に記載されるブロッカーを含むキットも記載する。
さらなる態様において、本開示は、ハイブリダイゼーションバッファーの存在下においてライブラリーをブロッカーと接触させる工程；およびライブラリーをプローブと接触させる工程を含む方法を記載し、ここで、そのプローブは、ライブラリーメンバー内の目的の領域にハイブリダイズする。その方法は、ライブラリーメンバーを配列決定する前にＰＣＲを用いてライブラリーメンバーを増幅する工程を含まない。
本明細書中で使用されるとき、用語「核酸」は、当該分野における使用法と一致するように意図されており、天然に存在する核酸またはその機能的アナログを含む。特に有用な機能的アナログは、配列特異的形式で核酸にハイブリダイズすることができるか、または特定のヌクレオチド配列の複製用の鋳型として使用されることができる。天然に存在する核酸は、通常、ホスホジエステル結合を含む骨格を有する。アナログの構造は、当該分野で公知の種々のもののいずれかを含むほかの骨格結合を有し得る。天然に存在する核酸は、通常、デオキシリボース糖（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見られるもの）またはリボース糖（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）に見られるもの）を有する。核酸は、当該分野で公知であるこれらの糖部分の種々のアナログのいずれかを含み得る。核酸は、天然または非天然の塩基を含み得る。この点において、天然のデオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニンからなる群より選択される１種またはそれを超える塩基を有し得、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシンまたはグアニンからなる群より選択される１種またはそれを超える塩基を有し得る。核酸に含められ得る有用な非天然塩基は、当該分野で公知である。用語「標的」は、核酸に関して使用されるとき、本明細書中に示される方法または組成物の文脈ではその核酸に対する意味識別子として意図されており、別途明示的に示されているものを超えてその核酸の構造または機能を必ずしも限定しない。
本明細書中で使用されるとき、用語「Ｔｍ」とは、サンプルのＤＮＡ鎖の半分が二重らせん状態にあり、サンプルのＤＮＡ鎖の半分がランダムコイル状態にある温度のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「アダプター」およびその派生語（例えば、ユニバーサルアダプター、非標的アダプターなど）は、一般に、本開示の核酸分子にライゲートできる任意の直鎖状の一本鎖オリゴヌクレオチドのことを指す。いくつかの実施形態において、アダプターは、サンプル中に存在する任意の標的配列の３’末端または５’末端に対して実質的に相補的でない。いくつかの実施形態において、好適なアダプターの長さは、１０～１００ヌクレオチド、１２～６０ヌクレオチドおよび１５～５０ヌクレオチド長の範囲内である。通常、アダプターは、任意の組み合わせのヌクレオチドおよび／または核酸を含み得る。いくつかの態様において、アダプターは、１つまたはそれを超える位置に１つまたはそれを超える切断可能な基を含み得る。別の態様では、アダプターは、プライマー、例えば、ユニバーサルプライマーの少なくとも一部と実質的に同一または実質的に相補的な配列を含み得る。いくつかの実施形態において、アダプターは、下流でのエラー訂正、識別または配列決定を支援するためにインデックスまたはタグを含み得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ユニバーサル配列」とは、２つまたはそれを超える核酸分子、例えば、アダプター－標的アダプター分子に共通の配列領域のことを指し、ここで、それらの分子は、互いと異なる配列領域も有する。分子集団の中の異なるメンバーにユニバーサル配列が存在することにより、ユニバーサル配列の一部、例えば、ユニバーサル伸長プライマー結合部位に相補的なユニバーサル捕捉核酸の集団を用いて、複数の異なる核酸を捕捉することが可能になり得る。ユニバーサル伸長プライマー結合部位の非限定的な例としては、Ｐ５およびＰ７プライマーと同一または相補的な配列が挙げられる。同様に、分子集団の中の異なるメンバーにユニバーサル配列が存在することにより、ユニバーサル配列の一部、例えば、ユニバーサルプライマー結合部位に相補的なユニバーサルプライマーの集団を用いて、複数の異なる核酸を複製または増幅することが可能になり得る。したがって、ユニバーサル捕捉核酸またはユニバーサルプライマーは、ユニバーサル配列に特異的にハイブリダイズできる配列を含む。標的核酸分子は、本明細書中に記載されるようなユニバーサルアダプター、例えば、種々の標的配列の片方または両方の末端に付着するように修飾され得る。
用語「Ｐ５」および「Ｐ７」は、増幅プライマー、例えば、ユニバーサルプライマー伸長プライマーのことを指すときに使用され得る。用語「Ｐ５’」（Ｐ５プライム）および「Ｐ７’」（Ｐ７プライム）とは、それぞれＰ５およびＰ７の相補鎖のことを指す。任意の好適な増幅プライマーを本明細書中に提示される方法において使用できること、およびＰ５およびＰ７の使用は、単に例示的な実施形態であることが理解される。フローセル上でのＰ５およびＰ７などの増幅プライマーの使用は、ＷＯ２００７／０１０２５１、ＷＯ２００６／０６４１９９、ＷＯ２００５／０６５８１４、ＷＯ２０１５／１０６９４１、ＷＯ１９９８／０４４１５１およびＷＯ２０００／０１８９５７の開示によって例証されているように、当該分野で公知である。例えば、任意の好適なフォワード増幅プライマーは、固定化されているか溶液中に存在するかを問わず、相補的な配列へのハイブリダイゼーションおよび配列の増幅のための本明細書中に提示される方法において有用であり得る。同様に、任意の好適なリバース増幅プライマーも、固定化されているか溶液中に存在するかを問わず、相補的な配列へのハイブリダイゼーションおよび配列の増幅のための本明細書中に提示される方法において有用であり得る。当業者は、捕捉に適したプライマー配列および本明細書中に提示されるような核酸の増幅に適したプライマー配列をどのようにデザインするのかおよび使用するのかを理解しているだろう。
本明細書中で使用されるとき、「増幅する（ａｍｐｌｉｆｙ）」、「増幅する（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）」または「増幅反応」およびそれらの派生語は、一般に、核酸分子の少なくとも一部が少なくとも１つのさらなる核酸分子に複製またはコピーされる任意の行為またはプロセスのことを指す。そのさらなる核酸分子は、必要に応じて、鋳型核酸分子の少なくとも一部と実質的に同一または実質的に相補的な配列を含む。鋳型核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得、さらなる核酸分子は、独立して、一本鎖または二本鎖であり得る。増幅は、必要に応じて、核酸分子の直線的または指数関数的複製を含む。いくつかの実施形態において、そのような増幅は、等温条件を用いて行われ得、他の実施形態では、そのような増幅は、サーモサイクリングを含み得る。いくつかの実施形態において、増幅は、１つの増幅反応において複数の標的配列を同時に増幅することを含むマルチプレックス増幅である。いくつかの実施形態において、「増幅」には、ＤＮＡベースおよびＲＮＡベースの核酸の少なくとも一部を単独または組み合わせで増幅することが含まれる。増幅反応は、当業者に公知の任意の増幅プロセスを含み得る。いくつかの実施形態において、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。
本明細書中で使用されるとき、「増幅条件」およびその派生語は、一般に、１つまたはそれを超える核酸配列の増幅に適した条件のことを指す。そのような増幅は、直線的または指数関数的であり得る。いくつかの実施形態において、増幅条件には、等温条件が含まれ得るか、あるいはサーモサイクリング条件または等温条件とサーモサイクリング条件との組み合わせが含まれ得る。いくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える核酸配列の増幅に適した条件には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件が含まれる。代表的には、増幅条件とは、１つもしくはそれを超える標的配列などの核酸を増幅するのに十分な、または１つもしくはそれを超えるアダプターにライゲートした増幅済みの標的配列、例えば、アダプターにライゲートした増幅済み標的配列を増幅するのに十分な、反応混合物のことを指す。通常、増幅条件には、増幅または核酸合成のための触媒、例えば、ポリメラーゼ；増幅される核酸に対してある程度の相補性を有するプライマー；およびヌクレオチド、例えば、核酸にハイブリダイズしたプライマーの伸長を促進するデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が含まれる。増幅条件には、核酸へのプライマーのハイブリダイゼーションまたはアニーリング、プライマーの伸長、および伸長したプライマーを増幅中の核酸配列から分離する変性工程が必要であり得る。代表的には、増幅条件にはサーモサイクリングが含まれ得るが、必ずしもそうではなく、いくつかの実施形態では、増幅条件には、複数のサイクルが含まれ、そのサイクルでは、アニーリング、伸長および分離の工程が繰り返される。代表的には、増幅条件には、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋などの陽イオンが含まれ、イオン強度の様々な調節因子も含まれ得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）とは、クローニングまたは精製なしでゲノムＤＮＡの混合物中の目的のポリヌクレオチドのセグメントの濃度を上昇させるための方法を説明している米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されているような方法のことを指す。目的のポリヌクレオチドを増幅するためのこのプロセスは、大過剰な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の目的のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ混合物に導入した後、ＤＮＡポリメラーゼの存在下において一連の熱サイクルを行うことからなる。その２つのプライマーは、目的の二本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれの鎖に相補的である。まず、混合物を高温で変性させ、次いで、プライマーを目的分子のポリヌクレオチド内の相補的な配列にアニールさせる。アニーリングの後、ポリメラーゼによってプライマーを伸長させて、新しい相補鎖対を形成する。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の工程を何度も繰り返すことにより（サーモサイクリングと称される）、所望の目的のポリヌクレオチドの高濃度の増幅セグメントが得られる。所望の目的のポリヌクレオチドの増幅セグメント（アンプリコン）の長さは、プライマーの互いに対する相対的な位置によって決まるので、この長さは、制御可能なパラメータである。このプロセスを繰り返すため、この方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（本明細書中以後、「ＰＣＲ」）と称される。目的のポリヌクレオチドの所望の増幅セグメントは、混合物中で（濃度に関して）優勢な核酸配列になるので、「ＰＣＲ増幅された」と言われる。上で論じられた方法の変法では、標的核酸分子を、目的の標的核酸分子１つにつき複数の異なるプライマー対、いくつかの場合では１つまたはそれを超えるプライマー対を用いてＰＣＲ増幅し、それにより、マルチプレックスＰＣＲ反応物を形成することができる。
本明細書中で定義されるとき、「マルチプレックス増幅」とは、サンプル中の２つまたはそれを超える標的配列を同時に増幅することを指す。いくつかの実施形態において、マルチプレックス増幅は、標的配列の一部または全部が１つの反応容器内で増幅されるように行われる。所与のマルチプレックス増幅の「プレキシ（ｐｌｅｘｙ）」または「プレックス（ｐｌｅｘ）」とは、一般に、１回のマルチプレックス増幅中に増幅される異なる標的特異的配列の数のことを指す。増幅された標的配列をいくつかの異なる方法（例えば、ゲル電気泳動の後のデンシトメトリー、バイオアナライザーまたは定量的ＰＣＲによる定量、標識プローブによるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの組み込みの後、アビジン－酵素結合体の検出；増幅された標的配列への３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の組み込み）によって検出することもできる。
本明細書中で使用されるとき、用語「プライマー」およびその派生語は、一般に、目的の標的配列にハイブリダイズできる任意のポリヌクレオチドのことを指す。代表的には、プライマーは、ヌクレオチドがポリメラーゼによって重合できる基質として機能するが、しかしながら、いくつかの実施形態では、プライマーは、合成された核酸鎖に組み込まれるようになり得、合成された核酸分子に相補的な新しい鎖の合成を刺激するための別のプライマーがハイブリダイズし得る部位を提供し得る。プライマーは、ヌクレオチドまたはそのアナログの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、プライマーは、一本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、任意の長さの多量体型のヌクレオチドのことを指すために本明細書中で交換可能に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらのアナログまたはそれらの混合物を含み得る。これらの用語は、ヌクレオチドアナログでできたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを等価物として含み、一本鎖（例えば、センスまたはアンチセンス）ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドに適用できると解釈されるべきである。この用語は、本明細書中で使用されるとき、例えば逆転写酵素の作用によってＲＮＡ鋳型から生成された相補的なＤＮＡまたはコピーＤＮＡであるｃＤＮＡも包含する。この用語は、その分子の１次構造のみについて言及する。したがって、この用語には、三本鎖、二本鎖および一本鎖のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖のリボ核酸（「ＲＮＡ」）が含まれる。
本明細書中で使用されるとき、用語「ライゲートする」、「ライゲーション」およびそれらの派生語は、一般に、２つまたはそれを超える分子を共有結合的に繋ぐためのプロセス、例えば、２つまたはそれを超える核酸分子を互いと共有結合的に繋ぐためのプロセスのことを指す。いくつかの実施形態において、ライゲーションには、核酸の隣接ヌクレオチド間のニックの連結が含まれる。いくつかの実施形態において、ライゲーションには、第１の核酸分子の末端と第２の核酸分子の末端との間の共有結合の形成が含まれる。いくつかの実施形態において、ライゲーションには、１つの核酸の５’リン酸基と第２の核酸の３’ヒドロキシル基との間の共有結合の形成によって、ライゲートされた核酸分子を形成することが含まれ得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、アダプターにライゲートされて、アダプター－標的配列が生成され得る。当業者は、ライゲーション反応が反応物中に存在するすべての分子をつながないことがあることを認識するだろう。
本明細書中で使用されるとき、「リガーゼ」およびその派生語は、一般に、２つの基質分子のライゲーションを触媒できる任意の作用物質のことを指す。いくつかの実施形態において、リガーゼには、核酸の隣接ヌクレオチド間のニックの連結を触媒できる酵素が含まれる。いくつかの実施形態において、リガーゼには、１つの核酸分子の５’リン酸ともう１つの核酸分子の３’ヒドロキシルとの間の共有結合の形成を触媒することができ、それにより、ライゲートされた核酸分子を形成することができる酵素が含まれる。好適なリガーゼとしては、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、耐熱性Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよび大腸菌ＤＮＡリガーゼが挙げられ得るが、これらに限定されない。
用語「フローセル」は、本明細書中で使用されるとき、１つまたはそれを超える流体試薬が流れ得る固体表面を備えるチャンバーのことを指す。本開示の方法において容易に使用され得るフローセルならびに関連する流体システムおよび検出プラットフォームの例は、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）；ＷＯ０４／０１８４９７；ＷＯ９１／０６６７８；ＷＯ０７／１２３７４４；米国特許第７，０５７，０２６号；米国特許第７，２１１，４１４号；米国特許第７，３１５，０１９号；米国特許第７，３２９，４９２号；米国特許第７，４０５，２８１号；および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２に記載されている。
本明細書中で使用されるとき、用語「ライブラリー」とは、メンバーの集合のことを指す。１つの実施形態において、ライブラリーは、核酸メンバーの集合、例えば、ホールゲノムフラグメント、サブゲノムフラグメント、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡ、ＲＮＡフラグメントまたはそれらの組み合わせの集合を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリーメンバーの一部または全部が、非標的アダプター配列を含む。アダプター配列は、片方または両方の末端に位置し得る。アダプター配列は、例えば、配列決定方法（例えば、ＮＧＳ法）において、増幅、逆転写またはベクターへのクローニングのために、使用され得る。
「メンバー」または「ライブラリーメンバー」または他の類似の用語は、本明細書中で使用されるとき、ライブラリーのメンバーである、核酸分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせのことを指す。代表的には、メンバーは、ＤＮＡ分子、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。メンバーは、断片化された、例えば、剪断された、または酵素的に調製された、ゲノムＤＮＡであり得る。メンバーは、被験体由来の配列を含み、被験体に由来しない配列、例えば、非標的配列、例えば、アダプター配列、プライマー配列、および／または識別を可能にする他の配列、例えば、インデックスも含み得る。
本明細書中で使用されるとき、「インデックス」（「インデックス領域」または「インデックスアダプター」とも称される）とは、核酸材料のサンプルまたは起源を識別するために用いることができる核酸タグのことを指す。核酸サンプルが、複数の起源に由来するとき、そのサンプルの起源が識別できるように、各核酸サンプル中の核酸を種々の核酸タグでタグ化することができる。当該分野で公知であるような、ならびに米国特許第８，０５３，１９２号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０６８６５６および米国特許出願公開第２０１３／０２７４１１７の開示によって例証されるような、任意の好適なインデックスまたはインデックスセットを用いることができる。いくつかの実施形態において、インデックスは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の６塩基Ｉｎｄｅｘ１（ｉ７）配列、８塩基Ｉｎｄｅｘ１（ｉ７）配列、８塩基Ｉｎｄｅｘ２（ｉ５）配列、１０塩基Ｉｎｄｅｘ１（ｉ７）配列または１０塩基Ｉｎｄｅｘ２（ｉ５）配列を含み得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ユニーク分子識別子」または「ＵＭＩ」または「バーコード」とは、核酸分子に付着され得る分子タグのことを指す。ＵＭＩは、核酸分子に組み込まれるとき、増幅後に配列決定されるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を直接カウントすることによって、その後の増幅バイアスを補正するために用いることができる。
本明細書中で使用されるとき、用語「タグメンテーション」とは、二本鎖の認識配列（ハイブリダイズしたトランスポゾン末端配列）を含むアダプターと複合体化したトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体によるＤＮＡの修飾のことを指す。タグメンテーションによって、ＤＮＡの断片化と、二重鎖フラグメントの両鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションとが同時に生じる。トランスポザーゼ酵素を除去するための精製、ギャップフィリングおよびライゲーションの後、完全な二本鎖産物が生じる。適合されたフラグメントの末端に、例えば、ＰＣＲ、ライゲーション、または当業者に公知の他の任意の好適な方法によって、さらなる配列が付加され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１７／００４４５２５号を参照のこと。
用語「および／または」は、１つまたはそれを超える列挙されているエレメント、または列挙されているエレメントのうちのいずれか２つまたはそれを超えるものの組み合わせを意味する。
単語「好ましい」および「好ましくは」とは、ある特定の状況においてある特定の利点をもたらし得る本発明の実施形態のことを指す。しかしながら、他の実施形態も、同じまたは他の状況において好ましい場合がある。さらに、１つまたはそれを超える好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを暗示するものではなく、本発明の範囲から他の実施形態を排除することを意図するものでもない。
用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」およびその変化形は、これらの用語が明細書および請求項に現れる場合、限定の意味を有しない。
実施形態が、言語「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを用いて本明細書中に記載される場合は必ず、「～からなる」および／または「～から本質的になる」に関して記載される他の類似の実施形態も提供されると理解される。用語「～からなる」は、句「～からなる」の前のものに限定される。つまり、「～からなる」は、列挙されるエレメントが不可欠または必須であること、および他のエレメントが存在してはならないことを示す。用語「～から本質的になる」は、この句の前に列挙される任意のエレメントが含められること、および列挙されているもの以外の他のエレメントが含められる場合があるが、但し、それらのエレメントは、列挙されるエレメントに対して本開示に明記される活性または作用を干渉しないまたは寄与しないことを示す。
別段識別されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「少なくとも１つ」は、交換可能に使用され、１つまたは１つより多いことを意味する。
本明細書中で使用されるとき、用語「各（々）」は、項目の集合への言及において用いられるとき、その集合内の個々の用語を特定していると意図されているが、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、必ずしもその集合内のすべての用語のことを指すわけではない。
終点による数値範囲の記載には、その範囲内に包含されるすべての数字が含まれる（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などが含まれる）。
別々の工程を含む本明細書中に開示されるいずれの方法についても、それらの工程は、任意の実行可能な順序で行うことができる。また、適宜、２つまたはそれを超える工程の任意の組み合わせを同時に行うこともできる。
本発明の上記の要旨は、開示される各実施形態または本発明の全実施態様を記載することを目的としていない。以下の説明において、例証的な実施形態をより詳細に例証する。本願全体にわたるいくつかの箇所において、例のリストによって指針が提供され、それらの例は、様々な組み合わせで用いられ得る。各場合において、記載のリストは、単に代表的な群として働くだけであって、排他的なリストとして解釈されるべきものではない。
本明細書全体にわたって、「１つの実施形態」、「実施形態」、「ある特定の実施形態」または「いくつかの実施形態」などに対する言及は、当該実施形態に関連して記載されている特定の特長、配置、組成または特徴が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含められることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な箇所におけるそのような句の出現は、必ずしも本開示の同じ実施形態に言及しているわけではない。さらに、特定の特長、配置、組成または特徴は、１つまたはそれを超える実施形態において任意の好適な様式で組み合わされる場合がある。
別段示されない限り、明細書および請求項において用いられる構成要素、分子量などの量を表現するすべての数字が、すべての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、別段それとは反対のことが示されない限り、明細書および請求項において示される数値パラメータは、本発明が得ようとしている所望の特性に応じて変動し得る近似値である。最低でも、また、均等論を請求項の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告される有効数字の数値に照らして、かつ通常の丸め法を適用することによって、解釈されるべきである。
すべての見出しは、読み手の都合のためにあるのであって、その見出しに続く本文の意味を限定すると明記されていない限り、その見出しに続く本文の意味を限定するために用いられるべきではない。
本発明の広い範囲を示す数値範囲および数値パラメータは、近似値ではあるが、具体的な例に示される数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、すべての数値が、それらのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる範囲を本質的に含む。
図１Ａ～図１Ｂは、富化中のハイブリッド捕捉および比較されるオフターゲット捕捉の例示的な実施形態を示している概略図である。図１Ａ．プローブは、標的ゲノム内の目的の領域にハイブリダイズするようにデザインされた領域、およびその後のプローブの捕捉を可能にするリガンド（例えば、ビオチン基）を含む。ハイブリダイゼーションが完了し、ＤＮＡ鋳型－プローブハイブリッドが形成されたら、捕捉手段（すなわち、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズなどの、プローブに対して親和性を有する構成要素）を用いることにより、ＤＮＡ標的にハイブリダイズしたプローブに結合し、オリゴヌクレオチドのプールから標的を取り出す。図１Ｂ．標的配列における末端のアダプター配列と、オフターゲットのライブラリー調製生成物における末端のアダプター配列との間の相互作用に起因して、望まれないまたはオフターゲットオリゴヌクレオチドが、ハイブリッド捕捉中に回収され得る。 同上。
図２は、ブロッカーがアダプター配列間のハイブリダイゼーションを防ぎ、オフターゲット捕捉を防ぐ例示的なメカニズムを示している。
図３Ａ～図３Ｉは、例示的なブロッカーの図を示している。図３Ａ．アダプターの８または１０塩基インデックス領域に相補的な塩基を含むＮＥＸＴＥＲＡブロッカーの図。図３Ｂ．アダプターのインデックス領域と対応するブロッカーの領域において８または１０個のデオキシイノシン塩基で修飾されたＮＥＸＴＥＲＡブロッカーの図。図３Ｃ．アダプターのインデックス領域と対応するブロッカーの領域において６、８または１０個のデオキシイノシン塩基で修飾されたＴＲＵＳＥＱブロッカーの図。図３Ｄ．アダプターのインデックス領域と対応するブロッカーの領域において６または８つのチミンを含むＮＥＸＴＥＲＡおよびＴＲＵＳＥＱブロッカーの図。図３Ｅ．８または１０塩基インデックス領域に対して５’の領域に対応する構成要素およびそのインデックス領域に対して３’の領域に対応する構成要素を含むスプリットＮＥＸＴＥＲＡブロッカーの図。これらの構築物は、アダプターのインデックス領域と対応するいかなる塩基も含まない（インデックス領域に対応する８または１０塩基ギャップによって示されている）。図３Ｆ．８または１０塩基インデックス領域に対して５’の領域に対応する構成要素およびインデックス領域に対して３’の領域に対応する構成要素を含むスプリットＴＲＵＳＥＱブロッカーの図。これらの構築物は、アダプターのインデックス領域と対応するいかなる塩基も含まない（インデックス領域と対応する８または１０塩基ギャップによって示されている）。図３Ｇ．インデックス領域の３’のアダプター領域の一部にのみ対応するＮＥＸＴＥＲＡブロッカーの図。図３Ｈ．インデックス領域の３’のアダプター領域の一部だけと対形成するＴＲＵＳＥＱブロッカーの図。図３Ｉ．インデックス領域の５’のアダプター領域の一部（例えば、ｐ５またはｐ７配列）にのみ対応するＮＥＸＴＥＲＡまたはＴＲＵＳＥＱブロッカーの図。 同上。 同上。
図４は、実施例２に記載されるようなブロッカーを用いて得られたＰａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（捕捉されたオンターゲットＤＮＡの量の尺度）の結果のグラフである。
図５は、実施例３に記載されるように、インデックス配列に対応するブロッカー配列の一部の５番目の位置に修飾Ｇ（＋Ｇ）またはランダム（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）（Ｎ）ヌクレオチドを含むブロッカーの図を示している。
図６Ａ～図６Ｂは、実施例４に記載されるようなブロッカー構築物および結果を示している。図６Ａは、（１）インデックス領域の５’の２５～３０ｍｅｒ領域に相補的な第１の配列およびインデックス領域の３’の３４～３５ｍｅｒ領域に相補的な第２の配列を含むスプリットブロッカーの対、（２）アダプターの３’部分だけと対形成するブロッカー（「Ｉｎｎｅｒ」ブロッカー）、（３）アダプターの５’部分だけと対形成するブロッカー（「Ｏｕｔｅｒ」ブロッカー）、および（４）インデックス領域と対応する短い（８ヌクレオチド）ブロッカー（「Ｓｈｏｒｔ８ｎｔ」）を含む様々なブロッカー構築物の図を示している。図６Ｂは、ＸＧＥＮ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｌｉｇｏ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）、スプリットブロッカー、またはアダプターの一部にだけ結合するブロッカーを用いて達成されたＰａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの結果を示している。
図７Ａ～図７Ｆは、実施例５に記載されるように、デキストラン硫酸を含む強化ハイブリダイゼーションバッファーを用いたときの結果を示している。図７Ａは、ハイブリダイゼーションバッファーにおいて種々の濃度のデキストラン硫酸を用いて達成されたＰａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの結果を示している。図７Ｂは、１００μＬのハイブリダイゼーション体積および４つの異なるプローブパネルおよび３つの異なるバッファー条件（ＩＤＴハイブリダイゼーションバッファー、Ｉｌｌｕｍｉｎａ非強化ハイブリダイゼーションバッファーおよびＩｌｌｕｍｉｎａ強化ハイブリダイゼーションバッファー）を用いて達成されたＰａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの結果を示している。図７Ｃは、さらなる温度勾配工程ありおよびなしで、種々のハイブリダイゼーションインキュベーション時間における、４つすべてのプローブパネルに対するＰａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔおよびカバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）均一性の結果を示している。左のパネルの黒色の点線は、デキストラン硫酸を含まないバッファーにおけるハイブリダイゼーションの結果を示している。ＮＯＶＡＳＥＱ（図７Ｄ）、ＮＥＸＴＳＥＱ（図７Ｅ）およびＩＳＥＱ（図７Ｆ）を含む３セットの配列決定結果（ＮＯＶＡＳＥＱおよびＮＥＸＴＳＥＱの場合は識別されたリードパーセント（ＰＦ）、ならびにＩＳＥＱの場合はインデックスパーセント（％））、ならびにデキストラン硫酸ハイブリダイゼーションバッファーおよび３０μＬのライブラリー体積を用いたランに対する関連する変動係数（ＣＶ）が示されている。 同上。 同上。 同上。 同上。
図８Ａ～図８Ｃは、実施例６に記載されるハイブリダイゼーションアッセイの結果を示している。図８Ａは、修飾ブロッカー、洗浄温度上昇、および／またはハイブリダイゼーションバッファー中にクラウディング剤（デキストラン硫酸）を用いたときの、Ｐａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの結果を示している。図８Ｂは、ＩＤＴ ＸＧＥＮ ＬＯＣＫＤＯＷＮキットプロトコルを用いたときのＩＤＴエクソームパネルの結果と比べて、ｘＧＥＮブロッカーを含む強化ハイブリダイゼーションバッファーを用いて９プローブパネルにおいて実施例６に記載される方法を用いて達成されたＰａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの結果を示している。図８Ｃは、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ＨＤ７０１定量的マルチプレックス（ＱＭ）ＤＮＡ標準物質から生成されたライブラリーを富化するために１２遺伝子５３５プローブパネルを用いる単一ハイブリダイゼーション富化プロトコルによる体細胞バリアントの検出を示している。 同上。 同上。
図９Ａ～図９Ｄは、例示的なワークフローの概略図を示している。ｅＢＢＮは、ビーズに結合したトランスポソーム複合体を用いたビーズベースのタグメンテーションを示しており；Ｈは、ハイブリダイゼーションを示しており；Ｃは、捕捉を示しており；Ｗは、洗浄を示しており；Ｅは、溶離を示しており；ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅を示しており；Ｓは、配列決定を示しており；Ｑは、定量を示しており；ＳｐＶａｃは、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ濃縮を示している。図９Ａは、ビーズベースのタグメンテーションプロトコルを用いたライブラリー調製を示しているハイブリッド捕捉に対する例示的なワークフローの概略図を示している。富化の前に任意の好適なライブラリー調製方法を用いてよい。注目すべきことに、たった１回のハイブリダイゼーションおよび捕捉しか含まれていない。図９Ｂは、ハイブリッド捕捉に対する例示的なワークフローの概略図を示している。図９Ｃは、ＰＣＲなしのハイブリッド捕捉に対する例示的なワークフローの概略図を示している。図９Ｄは、ハイブリダイゼーション時間を短縮した、ＰＣＲなしのハイブリッド捕捉に対する例示的なワークフローの概略図を示している。 同上。
図１０は、実施例８に記載されるように、ＢＮ００１およびＢＮ００２（非修飾ブロッカー）；ＢＸ００３およびＢＸ００７（Ｇ－Ｃｌａｍｐ修飾ブロッカー）；ＢＮ００７およびＢＮ００８（ＢＮＡおよびデオキシイノシンで修飾されたブロッカー）；ＢＮ００５およびＢＮ００６（ＢＮＡおよび配列特異的修飾ブロッカー）；またはＢＮ０２３、ＢＮ０２４、ＢＮ０２５、およびＢＮ０２６（ＬＮＡで修飾されたスプリットブロッカー）を用いて達成されたＰａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの結果を示している。
図１１は、対応するアダプターが、実施例９に記載されるように８ヌクレオチドインデックスまたは１０ヌクレオチドインデックスを含むときに、ＢＮ００１およびＢＮ００２（非修飾ブロッカー）またはＢＮ０２３、ＢＮ０２４、ＢＮ０２５およびＢＮ０２６（ＬＮＡ修飾スプリットブロッカー）を用いて達成されたＰａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの結果を示している。
例示の実施形態の詳細な説明
本開示は、ブロッカーおよび／またはハイブリダイゼーションバッファーを含む組成物、ならびに配列決定前に核酸選択の効率を改善するための方法を記載し、その方法には、それらの組成物を使用する方法およびハイブリッド捕捉を含む方法が含まれる。
ハイブリッド捕捉による富化
核酸の複合体プールから所望の配列を富化するために、種々の方法を用いることができる。これらの方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、分子反転プローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ）（ＭＩＰ）またはハイブリッド形成による配列捕捉（「ハイブリッド捕捉」）が挙げられる。例えば、Ｍａｍａｎｏｖａら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：１１１－１１８（２０１０））；米国特許出願公開第２０１４／００３１２４０；および米国特許出願公開第２０１７／０１１４４０４を参照のこと。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）での用途では、通常、ハイブリッド捕捉方法による富化を用いる。調製されたＮＧＳ鋳型プール、つまりライブラリーを熱変性し、捕捉プローブオリゴヌクレオチド（「プローブ」）のプールと混合する。それらのプローブは、標的ゲノム内の目的の領域にハイブリダイズするようにデザインされており、通常、６０～２００塩基長であり、結合したプローブを後で捕捉できるようにするリガンドを含むようにさらに修飾される。一般的な捕捉方法では、ビオチン基をプローブ上に組み込む。図１Ａにおける１つの実施形態に示されるように、ＤＮＡ鋳型－プローブハイブリッドを形成するためのハイブリダイゼーションが完了した後、プローブだけに対して親和性を有する構成要素を用いて捕捉を行う。例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを用いることにより、ライブラリー由来の所望のＤＮＡ標的にハイブリダイズしたビオチン化プローブのビオチン部分に結合することができる。洗浄により未結合の核酸を除去して、保持されている材料の複雑度を低下させる。次いで、保持されている材料を磁気ビーズから溶離し、自動配列決定プロセスに投入する。
プローブとのＤＮＡハイブリダイゼーションは、非常に特異的であり得るが、ハイブリッド捕捉方法の完了後に、望まれない配列が富化プールに残存する。これらの望まれない配列の大部分は、プローブに対して相補性を有しないライブラリーメンバーとプローブに対して相補性を有するライブラリーメンバー（すなわち、オンターゲットライブラリーメンバー）との間の望まれないハイブリダイゼーション事象に起因して存在する。２つのタイプの配列が、ハイブリッド捕捉方法の間に、望まれないハイブリダイゼーションをもたらす：（１）内在性ゲノムＤＮＡに見られる高反復ＤＮＡエレメント；および（２）各ライブラリーメンバーに入るように操作された末端のアダプター配列。
複合体プール中の１つのＤＮＡフラグメントに存在する反復性の内在性ＤＮＡエレメント（例えば、Ａｌｕ配列または長散在型反復配列（ＬＩＮＥ））が、別の無関係なＤＮＡフラグメントに存在する別の類似のエレメントにハイブリダイズし得る。これらのフラグメントは、元々ゲノム内の全く異なる位置に由来し得、ハイブリッド捕捉方法のハイブリダイゼーションプロセス中に連結されるようになる。これらのＤＮＡフラグメントのうちの１つが、プローブに対する結合部位を含む所望のフラグメントである場合、望まれないフラグメントも、所望のフラグメントとともに捕捉されることになる。このクラスのオフターゲットライブラリーメンバーは、過剰な反復エレメントをハイブリダイゼーション反応のハイブリダイゼーションバッファーに加えることによって減少させることができる。最も一般的には、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ（標的におけるＡｌｕ、ＬＩＮＥおよび他の反復部位に結合し、それに基づいて、ＮＧＳ鋳型が互いと相互作用する能力を阻止する）をハイブリダイゼーションバッファーに加える。
個々のライブラリーメンバーにおける末端のアダプター配列間の相互作用に起因して、オフターゲット（非標的とも称される）ライブラリーメンバーも捕捉され得る。代表的には、ライブラリーメンバーは、目的の遺伝子の配列セグメント、例えば、配列決定用のセグメントを含む。あるメンバーがオンターゲットである場合、目的の遺伝子の配列は、捕捉プローブと二重鎖を形成する。オンターゲット配列としては、例えば、エキソンまたはイントロン（またはそのフラグメント）、コード領域または非コード領域、エンハンサー、非翻訳領域、特定のＳＮＰなどが挙げられ得る。代表的には、ライブラリーメンバーは、１つまたはそれを超える非標的配列も含む。これらの非標的配列は、通常、目的の標的配列を含まないが、例えば、アダプターを含む。ライブラリーメンバーのプールは、通常、少なくともいくつかの同一の末端アダプター配列を含むので、それらのアダプター配列は、ハイブリダイゼーション溶液中に非常に高い有効濃度で存在する。その結果として、図１Ｂにおける１つの実施形態に示されているように、オフターゲット配列を含むライブラリーメンバーは、付加されたアダプター配列の一部を介して、捕捉された標的配列にアニールでき、それにより、オンターゲットライブラリーメンバーとともにオフターゲット配列が捕捉される（例えば、一緒に連結される配列の鎖状体形成または「デイジー鎖」によって）。アニールした標的配列は、プローブに対する結合部位を含むので、デイジー鎖全体が捕捉され得る。このように、単一の所望のフラグメントの捕捉は、多数の望まれないフラグメントを連れてくるため、所望のセグメントに対する富化の全効率を低下させ得る。
いくつかの態様において、本開示は、ハイブリッド捕捉によってオフターゲット核酸が選択されるのを最小限に抑えるための方法および組成物を記載する。
ブロッカーオリゴヌクレオチド
１つの態様において、本開示は、「ブロッカーオリゴヌクレオチド」（本明細書中では「ブロッカー」とも称される）、およびブロッカーを使用してアダプター配列の少なくとも一部に結合する（例えば、アダプター配列の少なくとも一部と二重鎖を形成する）ことによってハイブリッド捕捉中にオフターゲット核酸の選択を防ぐ方法を記載する。使用されるとき、図２における１つの実施形態に示されるように、アダプター配列へのブロッカーの結合は、ハイブリッド捕捉中に回収される望まれないライブラリーメンバーをもたらし得る、オフターゲットライブラリー調製産物中のアダプター配列間の相互作用（例えば、連鎖状鎖の形成）を防ぐ。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのブロッカーが使用され得、第１のブロッカーは、第１のアダプター配列に結合し（例えば、第１のアダプター配列と二重鎖を形成し）、第２のブロッカーは、第２のアダプター配列に結合する（例えば、第２のアダプター配列と二重鎖を形成する）。いくつかの実施形態において、第１のアダプター配列は、ライブラリーメンバーの５’末端に存在し得、第２のアダプター配列は、ライブラリーメンバーの３’末端に存在し得る。いくつかの実施形態では、複数の異なるブロッカーが使用され得る。
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００または少なくとも２００個のライブラリーメンバーのアダプター配列と二重鎖を形成し、得られる二重鎖は、バックグラウンド核酸（例えば、アダプター配列の相補鎖など）とアダプター配列とによって形成される二重鎖のＴｍより高いＴｍを有する。
いくつかの実施形態において、ブロッカー－アダプター複合体は、アダプター－アダプター複合体より高いＴｍを示す。そのような高いＴｍは、ブロッカー－アダプター複合体がアダプター－アダプター複合体より先に形成する可能性が高く、それにより、オフターゲット捕捉が妨げられ得る（例えば、デイジー鎖の形成が妨げられることによって）ことを意味する。いくつかの実施形態において、ブロッカー－アダプターオリゴヌクレオチド二重鎖のＴｍは、その厳密な相補鎖とのアダプター二重鎖のＴｍよりも少なくとも１．５℃、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、少なくとも２０℃または少なくとも２５℃高い。いくつかの実施形態において、ブロッカー－アダプターオリゴヌクレオチド二重鎖のＴｍは、その厳密な相補鎖とのアダプター二重鎖のＴｍよりも最大２℃、最大３℃、最大４℃、最大５℃、最大１０℃、最大１５℃、最大２０℃、最大２５℃または最大３０℃高い。
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドと、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００または少なくとも２００個のライブラリーメンバーのアダプター配列との会合速度は、バックグラウンド核酸（例えば、アダプター配列の相補鎖など）とアダプター配列との会合速度より高い。いくつかの実施形態において、その会合速度は、少なくとも２倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも８倍高いか、または少なくとも１０倍高い。いくつかの実施形態において、その会合速度は、最大４倍高い、最大６倍高い、最大８倍高い、最大１０倍高い、または最大１２倍高い。
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドと、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００または少なくとも２００個のライブラリーメンバーのアダプター配列との解離速度は、バックグラウンド核酸（例えば、アダプター配列の相補鎖など）とアダプター配列との解離速度より低い。いくつかの実施形態において、その解離速度は、少なくとも２倍低い、少なくとも４倍低い、少なくとも６倍低い、少なくとも８倍低いか、または少なくとも１０倍低い。いくつかの実施形態において、会合速度は、最大４倍低い、最大６倍低い、最大８倍低い、最大１０倍低いまたは最大１２倍低い。
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドと、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００または少なくとも２００個のライブラリーメンバーのアダプター配列との間で形成された二重鎖は、アダプター配列とその相補鎖との間で形成された二重鎖、例えば、二本鎖アダプターのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ鎖の間で形成された二重鎖よりも長い。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドとアダプター配列との間の二重鎖は、アダプター配列とその相補鎖との間で形成された二重鎖よりも少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０ヌクレオチド長い。
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、好ましくは、ブロッカーと同じ配列を有する修飾を含まないオリゴヌクレオチドと比べてそのブロッカーＴｍを上昇させる修飾を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ブロッカーは、「Ｔｍ高温化オリゴヌクレオチド」であり得、このオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションパートナーとして含む二重鎖核酸の熱融解温度値を、同一の核酸塩基組成および無修飾の基を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションパートナーとして含む二重鎖核酸と比べて上昇させる少なくとも１つの修飾基を含む。「Ｔｍ高温化オリゴヌクレオチド」は、米国特許出願公開第２０１４／００３１２４０にさらに記載されている。
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、１つまたはそれを超える天然に存在しないヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、天然に存在しないヌクレオチドを有するブロッキングオリゴヌクレオチドと、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００または少なくとも２００個のライブラリーメンバーのアダプター配列との間で形成された二重鎖は、バックグラウンド核酸（例えば、他の相補的な非標的核酸配列）と非標的核酸配列とに対する結合相互作用に関するパラメータの値（例えば、親和性、会合速度、解離速度の逆数またはＴｍ）より高いそのパラメータの値を有する。
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、修飾塩基を含む。任意の好適な修飾塩基をブロッカーに含めてよい。いくつかの実施形態において、その修飾には、好ましくは、Ｔｍを高める修飾、つまり、同じ配列を有するが修飾塩基を含まないブロッカー－アダプター複合体のＴｍと比べて、修飾塩基を含むブロッカー－アダプター複合体のＴｍを上昇させる修飾が含まれる。このようなＴｍを高める修飾としては、例えば、低ＧＣ領域を捕捉するように修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド；架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン（５－メチル－ｄｃ）；２，６－ジアミノプリン；ロック核酸（ＬＮＡ）；架橋型核酸（二環式核酸またはＢＮＡとも称される）；三環式核酸；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；Ｃ５修飾ピリミジン塩基；プロピニルピリミジン；モルホリノ；ホスホルアミダイト；５’－ピレンキャップ；などが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＡは、２’酸素と４’炭素とを接続する追加の架橋で修飾されたヌクレオチドのリボース部分を含む。例示的なＢＮＡは、例えば、米国特許第７，３９９，８４５号、米国特許第７，４２７，６７２号、米国特許第７，５４７，６８４号、米国特許第７，６９６，３４５号、米国特許第７，７４１，４５７号、米国特許第８，０２２，１９３号、米国特許第８，２６８，９８０号、米国特許第８，２７８，４２５号、米国特許第８，２７８，４２６号、米国特許第８，８４６，６３７号、米国特許第８，８４６，６３９号および米国特許第９，５４６，３６８号に開示されている。いくつかの実施形態において、ＢＮＡには、Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の拘束エチル核酸またはＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）の２’－Ｏ，４’－アミノエチレン架橋型核酸が含まれ得る。いくつかの実施形態において、ＰＮＡには、ペプチド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）－グリシン反復単位が含まれる。いくつかの実施形態において、三環式核酸には、例えば、米国特許第９，２２１，８６４号に開示されている三環式核酸が含まれる。例示的なホスホルアミダイトとしては、１－［５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル］－９－（２－トリフルオロアセトアミドエトキシ）－１，３－ジアザ－２－オキソフェノキサジン，３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］ホスホルアミダイト（ＡＰ－ｄＣ－ＣＥホスホルアミダイト）、５’－ジメトキシトリチル－ウリジン，２’－Ｏ－メチル，３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（２’－ＯＭｅ－Ｕ－ＣＥホスホルアミダイト）、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ－アセチル－５－メチル－シチジン，２’－Ｏ－メチル，３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（２’－ＯＭｅ－５－Ｍｅ－Ｃ－ＣＥホスホルアミダイト）、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ－アセチル－シチジン，２’－Ｏ－メチル，３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（２’－ＯＭｅ－Ａｃ－Ｃ－ＣＥホスホルアミダイト）などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾を含まないブロッカーと同じ配列を有するオリゴヌクレオチドと比べて上記ブロッカーのＴｍを上昇させる修飾には、非塩基修飾が含まれ得る。そのような修飾としては、例えば、マイナーグローブバインダー（ＭＧＢ）、スペルミン、Ｇ－クランプまたはＵａｑアントラキノンキャップが挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、最大４５、最大５０、最大５５、最大６０、最大７０、最大８０、最大９０、最大１００、最大１５０または最大２００ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、そのブロッカーのＴｍを上昇させる複数の修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、好ましい修飾数は、１本の相補鎖として修飾を含む二重鎖ＤＮＡに対して、少なくとも約１．４℃というストリンジェントな条件下（０．１×ＳＳＣ）における最適なＴｍ値の上昇（「最適な高温化Ｔｍ値」）をもたらす数である。いくつかの実施形態において、Ｔｍ高温化ブロッキングオリゴヌクレオチドにおける好ましい修飾数は、ブロッカー－アダプターオリゴヌクレオチド二重鎖のＴｍが、その厳密な相補鎖とのアダプター二重鎖のＴｍよりも少なくとも１．５℃、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、少なくとも２０℃または少なくとも２５℃高くなるような数である。いくつかの実施形態において、Ｔｍ高温化ブロッキングオリゴヌクレオチドにおける好ましい修飾数は、ブロッカー－アダプターオリゴヌクレオチド二重鎖のＴｍが、その厳密な相補鎖とのアダプター二重鎖のＴｍよりも最大２℃、最大３℃、最大４℃、最大５℃、最大１０℃、最大１５℃、最大２０℃、最大２５℃または最大３０℃高くなるような数である。
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドにおける塩基の少なくとも２パーセント（％）、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドにおける塩基の最大５％、最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％または最大１００％の修飾を含む。
いくつかの実施形態において、ブロッカーに対する修飾は、特定のパターンで含められ得る。例えば、修飾塩基が、２塩基ごと（例えば、表２Ａ、ＢＮ０２１およびＢＮ０２２を参照のこと）、３塩基ごと（例えば、表２Ａ、ＢＮ０３５およびＢＮ０３６を参照のこと）、４塩基ごともしくは５塩基ごとまたはそれらのいくつかの組み合わせ（例えば、表２Ａ、ＢＮ０３６を参照のこと）に含められ得る。いくつかの実施形態では、ブロッカーにおける各塩基が修飾され得る（例えば、表２Ａ、ＢＮ０２７およびＢＮ０２８を参照のこと）。いくつかの実施形態において、修飾される場合、他のヌクレオチドよりも親和性が高くなるグアニンが、優先的に修飾され得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＬＮＡまたはＢＮＡ型のグアニンが、ブロッカーに含められ得る。
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、末端修飾を含み得る。例えば、ブロッカーは、そのブロッカーがＤＮＡ合成用のプライマーとして働く利用可能性を妨げる３’末端基を含み得る。そのような３’末端基としては、例えば、３’－ｄＣ、２’，３’－ｄｄＣ（本明細書中では３ｄｄｃとも称される）、反転ｄＴ、３’－スペーサーＣ３（本明細書中では３ＳｐＣ３とも称される）などが挙げられ得る。
ブロッカーは、任意の好適なアダプター配列（その任意の一部を含む）に結合し得る（例えば、任意の好適なアダプター配列と二重鎖を形成し得る）。本明細書中で使用されるとき、アダプター配列の一部に結合する（例えば、アダプター配列の一部と二重鎖を形成する）ブロッカー配列の一部は、アダプター配列の一部に「対応する」ブロッカー配列の一部と称される。いくつかの実施形態において、その対応する配列は、アダプター配列の厳密な相補鎖であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、その対応する配列の中の最大１、最大２、最大３、最大４、最大５、最大６、最大７、最大８、最大９または最大１０塩基が、相補的でない可能性がある。
いくつかの例示的な実施形態において、ブロッカーは、表１に示されているようなアダプターに結合し得る。（アダプター配列が表１Ａに示されており、配列の構成要素に関するさらなる情報が表１Ｂに示されている。）いくつかの例示的な実施形態において、ブロッカーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ａｄａｐｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｓｕｐｐｏｒｔ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｉｌｌｕｍｉｎａ－ｓｕｐｐｏｒｔ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＿ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ／ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ－ｄｅｓｉｇｎ／ｉｌｌｕｍｉｎａ－ａｄａｐｔｅｒ－ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ－１００００００００２６９４－０７．ｐｄｆのワールドワイドウェブにて入手可能）に開示されている配列を含むアダプターに結合し得る。
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、アダプターに結合し、そのアダプターは、例えば、ユニバーサルアダプターおよび／またはユニバーサルプライマー配列などの、ユニバーサル配列を含む。いくつかの実施形態において、ユニバーサルプライマー配列は、Ｐ５、Ｐ７、Ｐ５’および／またはＰ７’を含み得る。いくつかの実施形態において、ユニバーサルプライマー配列は、Ｖ２．Ａ１４．ＭＥＴＳ配列、Ｖ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳ配列、Ｖ２．Ａ１４．ＭＥＴＳ配列の相補鎖および／またはＶ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳ配列の相補鎖を含み得る。例えば、表２Ａに示されているようなＢＮ００１は、Ｐ５およびＶ２．Ａ１４．ＭＥＴＳ配列を含み；表２Ａに示されているようなＢＮ００２は、Ｐ７およびＶ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳ配列を含み；表２Ａに示されているようなＢＮ００３は、Ｐ５’およびＶ２．Ａ１４．ＭＥＴＳ配列の逆相補を含み；表２Ａに示されているようなＢＮ００４は、Ｐ７’およびＶ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳ配列の逆相補を含む。
いくつかの配列決定用途では、ライブラリーメンバーが少なくとも１つのインデックスおよび／またはＵＭＩ配列を含むことが望ましい。したがって、いくつかの実施形態において、ブロッカーは、アダプターに結合し、そのアダプターは、インデックスおよびＵＭＩのうちの少なくとも１つを含む。米国特許出願公開第２０１４／００３１２４０では、インデックス（米国特許出願公開第２０１４／００３１２４０では「バーコードドメイン」と称する）を含むアダプターについて、「３つのアプローチを用いることにより、ブロッキングオリゴヌクレオチドを作製することができる」と説明している：「１）各アダプターと完全一致する一連のブロッカーの合成、２）アダプターのバーコードドメインと対形成するＮ－ｍｅｒのドメインを有する単一ブロッカーの合成、または３）アダプターのバーコードドメインと対形成するユニバーサル塩基ドメインを有する単一ブロッカーの合成」。それぞれ異なるインデックスおよび／またはＵＭＩは、ユニーク配列を有するので、アプローチ１におけるような完全に相補的なブロッカーは、存在する各インデックスおよび／またはＵＭＩ配列に対して完全一致の相補性を含む配列であり得る（図３Ａを参照のこと）。しかしながら、多くの異なるインデックスおよび／またはＵＭＩが用いられる場合、完全一致の相補性を有するブロッカーを含めるためには、マルチプレックス増幅用に数十または数百のユニークブロッカーが必要になり得、つまり費用効果が低いアプローチとなり得る。
いくつかの態様において、本開示は、インデックスおよび／またはＵＭＩを含むアダプターに対するブロッカーおよびそのようなブロッカーの使用方法、例えば、インデックスおよび／またはＵＭＩに対応するブロッカーの領域にチミンを含むブロッカー（図３Ｄおよび実施例２）；ユニバーサル塩基および少なくとも１つの非ユニバーサル塩基を含むブロッカー（図５および実施例３）；またはインデックス領域を含まないブロッカー（例えば、「スプリットブロッカー」またはアダプターの一部のみと対形成するブロッカーを含む）（図３Ｅ～図３Ｉ、図６Ａならびに実施例４、８および９）を記載する。
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃまたは表３の配列の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、表２Ａの配列は、タグメンテーション（例えば、ＮＥＸＴＥＲＡ）ライブラリー調製物（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って使用され得る。いくつかの実施形態において、表２Ｂの配列は、ライゲーションベースのライブラリー調製物および／またはＴＲＵＳＥＱ調製物（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って使用され得る。いくつかの実施形態において、表２Ｃの配列は、タグメンテーション（例えば、ＮＥＸＴＥＲＡ）ライブラリー調製物（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って使用され得る。いくつかの実施形態において、表２の配列が、ＢＮＡ修飾核酸を含む場合、そのＢＮＡ修飾核酸は、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）の２’－Ｏ，４’－アミノエチレン架橋型核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、表２の配列が、ＬＮＡ修飾核酸を含む場合、そのＬＮＡ修飾核酸は、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドを含み得る。表２Ａ、表２Ｂおよび表２Ｃの配列の構成要素に関するさらなる情報は、表１Ｂおよび表２Ｄに見られ得る。
別の態様では、本開示は、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含むキットを記載する。そのブロッキングオリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載されるようなブロッカーを含み得る。いくつかの実施形態において、そのブロッキングオリゴヌクレオチドは、複数のブロッキングオリゴヌクレオチドである。そのキットは、ハイブリダイゼーションバッファー、プローブ、プローブのパネルおよびフローセルのうちの１つまたはそれを超えるものをさらに含み得る。そのハイブリダイゼーションバッファーには、本開示の他の箇所に記載されているようなハイブリダイゼーションバッファーが含まれ得る。いくつかの実施形態において、そのプローブは、本開示の他の箇所に記載されているとおりである。いくつかの実施形態において、それらの構成要素は、別個の容器に提供され得る。例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドが第１の容器に提供され得、別の構成要素、例えば、ハイブリダイゼーションバッファー、またはプローブもしくはプローブのパネルが、異なる容器に提供され得る。あるいは、ブロッキングオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションバッファーとが、第１の容器に提供され得、プローブまたはプローブのパネルが、異なる容器に提供され得る。
表１Ａ－例示的アダプター配列

表２Ａ－例示的ブロッカー配列

表２Ｂ－例示的ブロッカー配列

表２Ｃ－例示的ブロッカー配列

チミンを含むブロッカー
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、アダプターのインデックス領域および／またはアダプターのＵＭＩに対応するブロッカーの領域（例えば、アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに結合するブロッカーの領域）に、少なくとも３つのチミン塩基、少なくとも４つのチミン塩基、少なくとも５つのチミン塩基、少なくとも６つのチミン塩基、少なくとも７つのチミン塩基、少なくとも８つのチミン塩基、少なくとも９つのチミン塩基または少なくとも１０個のチミン塩基を含み得る。
いくつかの実施形態において、アダプターのインデックス領域および／またはアダプターのＵＭＩに対応する（例えば、アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに結合する）ブロッカーの領域は、アダプターのインデックス領域および／またはアダプターのＵＭＩにおける塩基の数と同数のチミン塩基を含む。
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃまたは表３の少なくとも１つの配列を含む。そのようなブロッカーのいくつかの例示的な実施形態は、実施例２に記載されている。
ユニバーサル塩基および少なくとも１つの非ユニバーサル塩基を含むブロッカー
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、インデックス領域に対応するブロッカーの領域に、ユニバーサル塩基および少なくとも１つの非ユニバーサル塩基を含み得る。本明細書中で使用されるとき、「ユニバーサル塩基」は、一般的な塩基（例えば、デオキシアデノシン（Ａ）、デオキシチミジン（Ｔ）、デオキシシチジン（Ｃ）、デオキシグアノシン（Ｇ）およびウリジン（Ｕ））のうちの少なくとも２種にハイブリダイズする、修飾された核酸塩基である。いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基は、一般的な塩基のいずれかにハイブリダイズする。本明細書中で使用されるとき、「非ユニバーサル塩基」は、従来のワトソン－クリック塩基対相互作用（例えば、デオキシアデノシン（Ａ）－デオキシチミジン（Ｔ）またはデオキシグアノシン（Ｇ）－デオキシシチジン（Ｃ））でのみハイブリダイズする核酸塩基（いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基を含む）である。
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つの非ユニバーサル塩基は、インデックス領域に対応するブロッカー配列の３塩基ごとに含められ得る。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つの非ユニバーサル塩基は、インデックス領域に対応するブロッカー配列の（５’末端から）３番目および／または５番目の位置に存在し得る。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つの非ユニバーサル塩基は、インデックス領域に対応するブロッカー配列の２番目および／または４番目の位置に存在し得る。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つの非ユニバーサル塩基は、修飾グアニンを含む。いくつかの実施形態において、修飾グアニンは、ＬＮＡで修飾されていてもよいし、ＢＮＡで修飾されていてもよい。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つの非ユニバーサル塩基は、ランダム（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）ヌクレオチドを含む。
理論に拘束されることを望むものではないが、インデックス領域に対応するブロッカーの領域に、ユニバーサル塩基に加えて修飾グアニンまたはランダムヌクレオチドを含むことにより（図５における１つの実施形態に示されるように）、ライブラリーメンバーに対するブロッカーの親和性が改善されると考えられる。そのようなブロッカーのいくつかの例示的な実施形態は、実施例３に記載されている。
ユニバーサル塩基には、任意の公知のユニバーサル塩基が含まれ得る。いくつかの実施形態において、インデックス領域において用いられるユニバーサル塩基としては、例えば、２’－デオキシイノシン、２’－デオキシネブラリン、３－ニトロピロール２’－デオキシヌクレオシドまたは５－ニトロインドール２’－デオキシヌクレオシドが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基の組み合わせが、インデックス領域において用いられ得る。
修飾グアニンは、任意の好適な方法で修飾されたグアニン（例えば、ＬＮＡ修飾グアニン、ＢＮＡ修飾グアニンなどを含む）であり得る。いくつかの実施形態において、修飾グアニンは、好ましくは、ＬＮＡ修飾グアニンである。
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃまたは表４の少なくとも１つの配列を含む。
スプリットブロッカー
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、接続されていない少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み得、その接続されていないオリゴヌクレオチドは、アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに対応しない塩基を含む（例えば、アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに結合しない塩基を含む）か、またはアダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに部分的にしか対応しない塩基を含む（例えば、アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩの一部にのみ結合する塩基を含む）。いくつかの実施形態において、ブロッカーは、接続されていない４つのオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、接続されていない少なくとも２つのオリゴヌクレオチドは、標的配列の同じ鎖にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ブロッカーの少なくとも一部は、アダプターの５’末端に対応し、ブロッカーの少なくとも一部は、同じアダプターの３’末端に対応し得る。例えば、ブロッカーが、接続されていない４つのオリゴヌクレオチドを含む場合などの、いくつかの実施形態では、接続されていない２つのオリゴヌクレオチドが、第１の標的配列の同じ鎖にハイブリダイズし得、接続されていない２つのオリゴヌクレオチドが、第２の標的配列の同じ鎖にハイブリダイズし得る。そのようなブロッカーの例示的な実施形態は、図３Ｅ～図３Ｉおよび図６Ａに示されており、実施例４、８および９に記載されている。
いくつかの実施形態において、ブロッカーの少なくとも一部は、ユニバーサル伸長プライマーに対応し得る。いくつかの実施形態において、ブロッカーの少なくとも一部は、Ｐ５、Ｐ７、Ｐ５’および／またはＰ７’に対応し得る。いくつかの実施形態において、ブロッカーの少なくとも一部は、Ｖ２．Ａ１４．ＭＥＴＳ、Ｖ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳ、Ｖ２．Ａ１４．ＭＥＴＳの相補鎖および／またはＶ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳの相補鎖に対応し得る。
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩの塩基を含むアダプターの一部を除くアダプターと同じ数の塩基を含み得る。いくつかの実施形態において、ブロッカーは、アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩの塩基を除くアダプターの一部を構成している塩基の数よりも１塩基少ない、２塩基少ない、３塩基少ない、４塩基少ないか、または５塩基少ない塩基を含み得る。
いくつかの実施形態では、より多い塩基を含むブロッカーが好ましい場合（例えば、高い富化性能が望まれるときなど）がある。いくつかの実施形態では、より少ない塩基を含むブロッカーが好ましい場合（例えば、ブロッカーのコスト、合成純度および／または収率が要因であるときなど）がある。
いくつかの実施形態において、ブロッカーの最大５塩基、ブロッカーの最大４塩基、ブロッカーの最大３塩基、ブロッカーの最大２塩基またはブロッカーの１塩基だけが、アダプターのインデックス領域および／またはアダプターのＵＭＩと対形成し得るか、またはブロッカーの塩基は、アダプターのインデックス領域および／またはアダプターのＵＭＩと対形成しないことがある。
いくつかの実施形態において、ブロッカーは、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃまたは表５の少なくとも１つの配列（または配列の一部）を含む。いくつかの実施形態において、ブロッカーは、表２ＡのＢＮ０２３、ＢＮ０２４、ＢＮ０２５およびＢＮ０２６のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、ブロッカーは、表２ＡのＢＮ０２３およびＢＮ０２５を含む。いくつかの実施形態において、ブロッカーは、表２ＡのＢＮ０２４およびＢＮ０２６を含む。
ハイブリダイゼーションバッファー
別の態様において、本開示は、クラウディング剤を含むハイブリダイゼーションバッファーおよびそのハイブリダイゼーションバッファーを使用する方法を記載する。本明細書中で使用されるとき、「クラウディング剤」には、分子のクラウディングを可能にするか、増強するか、または促進する化合物が含まれる。いくつかの実施形態において、クラウディング剤には、ＤＮＡ－タンパク質相互作用を変化させる濃度で使用される、不活性な高分子が含まれる。「ハイブリダイゼーションバッファー」は、ハイブリッド捕捉アッセイの一部としてヌクレオチド－プローブハイブリッドが形成され得る任意のバッファーと定義される。
いくつかの実施形態において、クラウディング剤は、デキストラン、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール、グリセロール、ベタインなどのうちの少なくとも１つを含み得る。デキストランおよびデキストラン硫酸には、高分子量デキストラン（例えば、少なくとも５００，０００Ｄａの分子量を有するデキストラン）および／または低分子量デキストラン（例えば、最大１０，０００Ｄａ、最大５０，０００Ｄａまたは最大１００，０００Ｄａの分子量を有するデキストラン）が含まれ得る。いくつかの実施形態において、クラウディング剤は、好ましくは、デキストラン硫酸を含む。
いくつかの実施形態において、クラウディング剤は、ハイブリダイゼーションバッファー中に少なくとも０．５％重量／体積（ｗ／ｖ）、少なくとも１％（ｗ／ｖ）、少なくとも１．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも２％（ｗ／ｖ）、少なくとも３％（ｗ／ｖ）または少なくとも４％（ｗ／ｖ）の量で含められ得る。いくつかの実施形態において、クラウディング剤は、ハイブリダイゼーションバッファー中に最大１％（ｗ／ｖ）、最大１．５％（ｗ／ｖ）、最大２％（ｗ／ｖ）、最大３％（ｗ／ｖ）、最大４％（ｗ／ｖ）、最大５％（ｗ／ｖ）、最大６％（ｗ／ｖ）、最大８％（ｗ／ｖ）または最大１０％（ｗ／ｖ）の量で含められ得る。
実施例５におけるいくつかの実施形態に記載されるように（例えば、図７Ｄ～７Ｆを参照のこと）、クラウディング剤（例えば、デキストラン硫酸）をハイブリダイゼーションバッファー中に含めることにより、いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション時間を短縮すること、および／またはクラウディング剤を含まないハイブリダイゼーションバッファーよりも大きな体積のハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイゼーションを行うこと（例えば、標的オリゴヌクレオチドの希釈度を高めること）が可能になり得る。例えば、デキストラン硫酸をハイブリダイゼーションバッファー中に含めることにより、ハイブリダイゼーション時間を、単一温度では一晩からおよそ８０分にまで、またはさらなる温度勾配工程を伴う場合は６０分にまで、短縮することができ得る。
いくつかの実施形態において、クラウディング剤を含めることにより、富化特異性が改善し得る。例えば、１つの実施形態が実施例５に示されており（図８Ａを参照のこと）、ここで、その富化特異性は、４５％から８０～９５％に高まった。いくつかの実施形態において、クラウディング剤を含めたことに起因する富化特異性の改善は、インキュベーション時間が短くなるほど顕著になり得る。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファー中にクラウディング剤を含めることにより、富化反応をより低濃度のＤＮＡでより迅速に生じさせることができる（例えば、より大きな相対体積のハイブリダイゼーションバッファー中での反応など）。そのような増加を用いることにより、「体積に基づいたプール（ｐｏｏｌｉｎｇ－ｂｙ－ｖｏｌｕｍｅ）」および／またはサンプル濃縮工程の廃止が容易になり得る。一般に、迅速なハイブリダイゼーション反応を達成するためには、ライブラリー調製物に由来する高濃度のＤＮＡおよび高濃度のプローブを使用することが必要であるので、いくつかの実施形態では、それに対応して少量のハイブリダイゼーションバッファー（例えば、２０μＬ未満）が必要になる。この少量を達成するためには、ライブラリー調製の後にサンプル濃縮工程が必要である（その結果、アッセイ全体の時間が長くなり、コストが高くなる）。ハイブリダイゼーションバッファー中にクラウディング剤を含めることにより、富化反応が、より低いＤＮＡ濃度および／またはプローブ濃度で（かついくつかの実施形態では、より大きな体積で）より迅速に達成され得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファー中にクラウディング剤を含めることにより、ハイブリダイゼーションの前に濃縮工程を行うことなく、複数のライブラリー調製サンプルを組み合わせることが可能になる。いくつかの実施形態において、種々のライブラリー調製物に由来するサンプルは、本開示にさらに記載されるように、体積に基づいてプールされ得、マルチプレックス富化が可能になる。所与のマルチプレックス富化の「プレキシ」または「プレックス」とは、富化（例えば、ハイブリダイゼーションおよび捕捉）の前に組み合わされる異なるライブラリー調製物の数のことを指す。いくつかの実施形態において、マルチプレックス富化のプレキシは、最大２プレックス、最大４プレックス、最大６プレックス、最大１２プレックス、最大２４プレックス、最大４８プレックス、最大９６プレックスまたはそれを超えるプレックスであり得る。
いくつかの実施形態において、クラウディング剤を含むハイブリダイゼーションバッファーはさらに、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、不安定化剤、塩およびブロッカーのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーの構成要素、例えば、Ｃｏｔ－１ＤＮＡおよびブロッカーは、ハイブリダイゼーション反応を行うまで、不安定化剤およびクラウディング剤を含むハイブリダイゼーションバッファーの構成要素から分離された状態で維持される。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡを少なくとも０．０５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬの量で含み得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡを最大０．１ｍｇ／ｍＬ、最大０．２ｍｇ／ｍＬ、最大０．３ｍｇ／ｍＬまたは最大０．５ｍｇ／ｍＬの量で含み得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、好ましくは、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡを０．２ｍｇ／ｍＬの量で含み得る。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、不安定化剤を含み得る。いくつかの実施形態において、その不安定化剤としては、ホルムアミドおよび／または尿素が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、少なくとも１％（ｖ：ｖ）、少なくとも５％（ｖ：ｖ）または少なくとも１０％（ｖ：ｖ）のホルムアミドを含み得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、最大５％（ｖ：ｖ）、最大１０％（ｖ：ｖ）または最大１５％（ｖ：ｖ）のホルムアミドを含み得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、少なくとも１Ｍの尿素、少なくとも２Ｍの尿素または少なくとも４Ｍの尿素を含み得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、最大２Ｍの尿素、最大４Ｍの尿素または最大６Ｍの尿素を含み得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、好ましくは、１０％のホルムアミドを含み得る。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、バッファーを含み得る。任意の好適なバッファーを使用してよい。いくつかの実施形態において、そのバッファーとしては、リン酸塩（例えば、リン酸カリウムまたはリン酸ナトリウムを含む）；Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）；ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（３－プロパンスルホン酸）（ＰＩＰＰＳ）；２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）；（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）などが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも５５ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも６５ｍＭまたは少なくとも７０ｍＭのリン酸塩を含み得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、最大５０ｍＭ、最大５５ｍＭ、最大６０ｍＭ、最大６５ｍＭ、最大７０ｍＭ、最大７５ｍＭまたは最大８０ｍＭのリン酸塩を含み得る。いくつかの実施形態において、リン酸塩を含むバッファーには、リン酸二水素塩および／またはリン酸一水素塩が含まれ得る。いくつかの実施形態において、リン酸塩を含むバッファーには、ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯが含まれ得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、好ましくは、６６．６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４を含み得る。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、塩を含み得る。任意の好適な塩を含めてよい。いくつかの実施形態において、その塩は、例えば、ＮａＣｌまたはクエン酸ナトリウム（例えば、クエン酸三ナトリウム）などであり得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．２Ｍ、少なくとも０．３Ｍ、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．７Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも０．９Ｍまたは少なくとも１Ｍの塩を含み得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、最大０．２Ｍ、最大０．３Ｍ、最大０．４Ｍ、最大０．５Ｍ、最大０．６Ｍ、最大０．７Ｍ、最大０．８Ｍ、最大０．９Ｍ、最大１Ｍ、最大２Ｍ、最大３Ｍまたは最大４Ｍの塩を含み得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、好ましくは、０．８ＭのＮａＣｌを含み得る。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、界面活性剤（例えば、陰イオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、スルホン酸塩、アルコール硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、リン酸エステルまたはカルボン酸塩）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンまたはグリコシド界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎまたはＢｒｉｊ界面活性剤）、陽イオン性界面活性剤（例えば、第四級アンモニウム陽イオン性界面活性物質）または双性イオン性界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ）など）を含み得る。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などである。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ハイブリダイゼーションバッファーの少なくとも０．００１％体積／体積（ｖ／ｖ）、少なくとも０．０１％（ｖ／ｖ）、少なくとも０．０５％（ｖ／ｖ）、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）、少なくとも１％（ｖ／ｖ）または少なくとも５％（ｖ／ｖ）を構成し得る。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ハイブリダイゼーションバッファーの最大０．０１％（ｖ／ｖ）、最大０．０５％（ｖ／ｖ）、最大０．１％（ｖ／ｖ）、最大１％（ｖ／ｖ）、最大５％（ｖ／ｖ）または最大１０％（ｖ／ｖ）を構成し得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、好ましくは、０．０４％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含み得る。
例えば、いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、０．５％～１０％デキストラン硫酸、０．０５ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、１％～１５％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、４０ｍＭ～８０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４、０．１Ｍ～４Ｍ ＮａＣｌ、および０．００１％～１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含み得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、（例えば、最終的な反応物中に）１．５％デキストラン硫酸、０．２ｍｇ／ｍＬ Ｃｏｔ－１、１０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、６６．６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４、０．８Ｍ ＮａＣｌ、および０．０４％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含み得る。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、ブロッカーを含み得る。いくつかの実施形態において、そのブロッカーは、本開示の他の箇所に記載されているとおりのものである。いくつかの実施形態において、そのブロッカーは、少なくとも０．００１ｍＭ、少なくとも０．００５ｍＭ、少なくとも０．０１ｍＭ、少なくとも０．０５ｍＭまたは少なくとも０．１ｍＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、そのブロッカーは、最大０．０１ｍＭ、最大０．０５ｍＭ、最大０．１ｍＭ、最大０．２ｍＭまたは最大０．５ｍＭの濃度で存在する。
別の態様では、本開示は、ハイブリダイゼーションバッファー、例えば、本明細書中に記載されるようなハイブリダイゼーションバッファーを含むキットを記載する。ある実施形態では、そのキットは、ブロッカーおよびプローブのうちの少なくとも１つをさらに含む。実施形態では、構成要素は、別個の容器に提供される。例えば、ハイブリダイゼーションバッファーが、第１の容器に提供され得、別の構成要素、例えば、ブロッカーまたはプローブが、異なる容器に提供され得る。いくつかの実施形態において、そのブロッカーおよび／またはプローブは、本開示の他の箇所に記載されているとおりのものである。
ハイブリッド捕捉
さらなる態様において、本開示は、ハイブリッド捕捉の方法を記載する。いくつかの実施形態において、その方法は、プローブをライブラリーメンバーにハイブリダイズすることおよびプローブを捕捉することを含む工程を含む。いくつかの実施形態において、その方法はさらに、プローブをハイブリダイズする前にライブラリーをプールする工程を含む。いくつかの実施形態において、その方法はさらに、捕捉後に、捕捉された配列を増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、その方法は、本開示に記載されているようなブロッカーオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いられ得る。いくつかの実施形態において、その方法は、本開示に記載されているようなクラウディング剤を含むハイブリダイゼーションバッファーを使用することを含み得る。
ライブラリーのプール
いくつかの実施形態において、異なるライブラリー調製物に由来するサンプルが、ハイブリダイゼーションの前に組み合わされる。いくつかの実施形態において、組み合わされる各ライブラリーは、好ましくは、組み合わされる他の任意のライブラリー中の配列のインデックス領域と識別可能なインデックス領域を含む配列を含む。
いくつかの実施形態において、異なるライブラリー調製物に由来するサンプルが、体積に基づいてプールされることにより、マルチプレックス富化が可能になり得る。所与のマルチプレックス富化の「プレキシ」または「プレックス」とは、富化（例えば、ハイブリダイゼーションおよび捕捉）の前に組み合わされる異なるライブラリー調製物の数のことを指す。いくつかの実施形態において、マルチプレックス富化のプレキシは、最大２プレックス、最大４プレックス、最大６プレックス、最大１２プレックス、最大２４プレックス、最大４８プレックス、最大９６プレックスまたはそれを超えるプレックスであり得る。
いくつかの実施形態において、あるライブラリー調製物に由来するサンプルは、タグメンテーション反応に由来する。例えば、米国特許第９，５７４，２２６号を参照のこと。いくつかの実施形態において、ライブラリー調製物に由来するサンプルは、ＮＥＸＴＥＲＡライブラリー調製物（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に由来する。いくつかの実施形態において、ライブラリー調製物は、ハイブリダイゼーション反応物に直接加えられ得る。
いくつかの実施形態において、組み合わされるライブラリー調製物に由来する各サンプルのＤＮＡ濃度は、少なくとも０．１ｎｇ／μＬ、少なくとも０．３ｎｇ／μＬ、少なくとも０．４ｎｇ／μＬ、少なくとも０．５ｎｇ／μＬ、少なくとも１ｎｇ／μＬ、少なくとも２ｎｇ／μＬ、少なくとも４ｎｇ／μＬ、少なくとも６ｎｇ／μＬ、少なくとも８ｎｇ／μＬ、少なくとも１０ｎｇ／μＬ、少なくとも１２ｎｇ／μＬ、少なくとも２０ｎｇ／μＬ、少なくとも５０ｎｇ／μＬ、少なくとも６０ｎｇ／μＬ、少なくとも１００ｎｇ／μＬまたは少なくとも２００ｎｇ／μＬであり得る。いくつかの実施形態において、組み合わされるライブラリー調製物に由来する各サンプルのＤＮＡ濃度は、最大０．４ｎｇ／μＬ、最大０．５ｎｇ／μＬ、最大１ｎｇ／μＬ、最大２ｎｇ／μＬ、最大４ｎｇ／μＬ、最大６ｎｇ／μＬ、最大８ｎｇ／μＬ、最大１０ｎｇ／μＬ、最大１２ｎｇ／μＬ、最大１５ｎｇ／μＬ、最大２０ｎｇ／μＬ、最大５０ｎｇ／μＬ、最大１００ｎｇ／μＬ、最大１２０ｎｇ／μＬ、最大２００ｎｇ／μＬ、最大３００ｎｇ／μＬまたは最大４００ｎｇ／μＬであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ライブラリー調製物に由来する各サンプルのＤＮＡ濃度は、０．３ｎｇ／μＬ～４００ｎｇ／μＬの範囲内であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ライブラリー調製物に由来する各サンプルのＤＮＡ濃度は、０．１ｎｇ／μＬ～１２０ｎｇ／μＬの範囲内であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ライブラリー調製物に由来するサンプルの組み合わせのＤＮＡ濃度は、０．１ｎｇ／μＬ～１２０ｎｇ／μＬ（例えば、１００μＬにおいて）の範囲内であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ライブラリー調製物に由来する各サンプルのＤＮＡ濃度は、０．５ｎｇ／μＬ～１２ｎｇ／μＬの範囲内であり得る。いくつかの実施形態において、ライブラリー調製物に由来するサンプルの組み合わせのＤＮＡ濃度は、０．５ｎｇ／μＬ～１２ｎｇ／μＬ（例えば、１００μＬにおいて）の範囲内であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ライブラリー調製物に由来する各サンプルのＤＮＡ濃度は、０．５ｎｇ／μＬ～１２０ｎｇ／μＬの範囲内であり得る。いくつかの実施形態において、ライブラリー調製物に由来するサンプルの組み合わせのＤＮＡ濃度は、０．５ｎｇ／μＬ～１２０ｎｇ／μＬ（例えば、１００μＬにおいて）の範囲内であり得る。
いくつかの実施形態において、少なくとも１μＬ、少なくとも２μＬ、少なくとも３μＬ、少なくとも５μＬ、少なくとも１０μＬ、少なくとも１５μＬ、少なくとも２０μＬまたは少なくとも２５μＬの、ライブラリー調製物に由来する各サンプルが、組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、最大２μＬ、最大３μＬ、最大５μＬ、最大１０μＬ、最大１５μＬ、最大２０μＬ、最大２５μＬ、最大３０μＬ、最大４０μＬまたは最大５０μＬの、ライブラリー調製物に由来する各サンプルが、組み合わされ得る。
いくつかの実施形態において、少なくとも１０ｎｇ、少なくとも１５ｎｇ、少なくとも２５ｎｇ、少なくとも５０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも２００ｎｇ、少なくとも５００ｎｇ、少なくとも１，０００ｎｇまたは少なくとも５，０００ｎｇの、各ライブラリー調製物由来のＤＮＡが、組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、最大１５ｎｇ、最大２５ｎｇ、最大５０ｎｇ、最大１００ｎｇ、最大２００ｎｇ、最大５００ｎｇ、最大１，０００ｎｇ、最大５，０００ｎｇ、最大１０，０００ｎｇまたは最大１２，０００ｎｇの、各ライブラリー調製物由来のＤＮＡが、組み合わされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、１０ｎｇ～１２，０００ｎｇの、各ライブラリー調製物由来のＤＮＡが、組み合わされ得る。
プローブのハイブリダイズ
いくつかの態様において、ハイブリッド捕捉の方法は、ライブラリーをプローブと接触させる工程を含み、ここで、そのプローブは、ライブラリーメンバー内の目的の領域にハイブリダイズする。その目的の領域は、アダプター領域から離れており、目的のゲノム材料を含んでいる。そのプローブは、そのプローブを後で捕捉できるようにするリガンドを含む。いくつかの実施形態において、リガンドは、好ましくは、ビオチン基を含む。
上記ライブラリーを、ハイブリダイゼーションバッファーの存在下においてプローブと接触させる。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、本開示に記載されているように、クラウディング剤を含み得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションバッファーは、本開示に記載されているように、ブロッカーを含み得る。
いくつかの実施形態において、ハイブリッド捕捉の方法は、熱変性工程を含む。例えば、ハイブリダイゼーションバッファー中にライブラリーメンバー、ブロッカーおよびプローブを含むハイブリダイゼーション混合物が、少なくとも９０℃、少なくとも９２℃または少なくとも９５℃に加熱され得る。いくつかの実施形態において、そのハイブリダイゼーション混合物は、最大９２℃、最大９５℃、最大９７℃または最大１００℃に加熱され得る。いくつかの実施形態において、そのハイブリダイゼーション混合物は、好ましくは、Ｃｏｔ－１ＤＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのハイブリダイゼーションバッファーは、ハイブリダイゼーション混合物に加える前に、ブロッカーを含み得る。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションバッファーとは独立に、ブロッカーがハイブリダイゼーション混合物に加えられ得る。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション混合物（例えば、最終的なハイブリダイゼーション反応物）中のＤＮＡ濃度は、少なくとも０．１ｎｇ／μＬ、少なくとも０．３ｎｇ／μＬ、少なくとも０．４ｎｇ／μＬ、少なくとも０．５ｎｇ／μＬ、少なくとも１ｎｇ／μＬ、少なくとも２ｎｇ／μＬ、少なくとも４ｎｇ／μＬ、少なくとも６ｎｇ／μＬ、少なくとも８ｎｇ／μＬ、少なくとも１０ｎｇ／μＬ、少なくとも１２ｎｇ／μＬ、少なくとも１５ｎｇ／μＬ、少なくとも２０ｎｇ／μＬ、少なくとも５０ｎｇ／μＬ、少なくとも７５ｎｇ／μＬ、少なくとも１００ｎｇ／μＬ、少なくとも１２０ｎｇ／μＬ、少なくとも１５０ｎｇ／μＬ、少なくとも２００ｎｇ／μＬであり得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション混合物（例えば、最終的なハイブリダイゼーション反応物）中のＤＮＡ濃度は、最大０．３ｎｇ／μＬ、最大０．４ｎｇ／μＬ、最大０．５ｎｇ／μＬ、最大１ｎｇ／μＬ、最大２ｎｇ／μＬ、最大４ｎｇ／μＬ、最大６ｎｇ／μＬ、最大８ｎｇ／μＬ、最大１０ｎｇ／μＬ、最大１２ｎｇ／μＬ、最大１５ｎｇ／μＬ、最大２０ｎｇ／μＬ、最大５０ｎｇ／μＬ、最大７５ｎｇ／μＬ、最大１００ｎｇ／μＬ、最大１２０ｎｇ／μＬ、最大１５０ｎｇ／μＬ、最大２００ｎｇ／μＬまたは最大５００ｎｇ／μＬであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション混合物（例えば、最終的なハイブリダイゼーション反応物）中のＤＮＡ濃度は、０．１ｎｇ／μＬ～１２０ｎｇ／μＬの範囲内であり得る。
いくつかの実施形態において、上記方法は、最大１５０μＬ、最大１４０μＬ、最大１３０μＬ、最大１２０μＬ、最大１１０μＬ、最大１００μＬ、最大９０μＬ、最大８０μＬ、最大７０μＬ、最大６０μＬまたは最大５０μＬの体積のハイブリダイゼーション混合物の使用を含み得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、少なくとも１０μＬ、少なくとも２０μＬ、少なくとも３０μＬ、少なくとも４０μＬ、少なくとも５０μＬ、少なくとも６０μＬまたは少なくとも７０μＬの体積のハイブリダイゼーション混合物の使用を含み得る。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション混合物は、少なくとも１℃／分、少なくとも１．５℃／分、少なくとも２℃／分、少なくとも２．５℃／分、少なくとも３℃／分または少なくとも５℃／分の速度で加熱され得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション混合物は、最大１．５℃／分、最大２℃／分、最大２．５℃／分、最大３℃／分、最大５℃／分または最大１０℃／分の速度で加熱され得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション混合物は、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間または少なくとも２０分間、熱変性のための温度で維持され得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション混合物は、最大２分間、最大５分間、最大１０分間、最大２０分間またはそれより長く、熱変性のための温度で維持され得る。
熱変性工程の後、ハイブリッド捕捉の方法は、ハイブリダイゼーション混合物を冷却する工程を含む。ハイブリダイゼーション混合物が、熱変性工程温度からハイブリダイゼーション温度に冷却されると、プローブ：標的ハイブリッド（すなわち、プローブ：ライブラリーメンバーハイブリッド）が形成される。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション温度は、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５７℃、少なくとも５８℃、少なくとも５９℃、少なくとも６０℃、少なくとも６１℃、少なくとも６２℃、少なくとも６３℃、少なくとも６４℃、少なくとも６５℃または少なくとも７０℃であり得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション温度は、最大５６℃、最大５８℃、最大６０℃、最大６１℃、最大６２℃、最大６３℃、最大６４℃、最大６５℃または最大７０℃であり得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションは、変性温度からハイブリダイゼーション温度への温度の低下を含み得る。いくつかの実施形態において、その温度勾配は、少なくとも－５℃／分、少なくとも－２℃／分、少なくとも－１℃／分、少なくとも－０．５℃／分または少なくとも－０．２℃／分の速度を含み得る。
いくつかの実施形態において、上記方法は、ライブラリーをプローブと接触させたまま維持する工程、および／またはハイブリダイゼーション混合物をハイブリダイゼーション温度で最大３日間、最大２日間、最大２４時間、最大２０時間、最大１６時間、最大１２時間、最大６時間、最大３時間、最大２時間、最大９０分間、最大１時間もしくは最大３０分間維持する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、ライブラリーをプローブと接触させたまま維持する工程、および／またはハイブリダイゼーション混合物をハイブリダイゼーション温度で少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間、少なくとも９０分間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間もしくは少なくとも２４時間維持する工程を含み得る。ブロッカーのＴｍがアダプターのＴｍより高い場合を含むいくつかの実施形態では、アダプター：アダプターハイブリッドが形成する前にブロッカー：アダプターハイブリッドが形成することにより、アダプター：アダプターハイブリッドの「デイジー鎖」の形成または鎖状体形成が妨げられる。
捕捉
いくつかの態様において、ハイブリッド捕捉の方法は、ライブラリーのメンバーにハイブリダイズしたプローブを、捕捉手段を用いて捕捉する工程を含む。そのプローブは、任意の好適な手段によって捕捉され得る。例えば、プローブが、ビオチン基を含むとき、そのプローブは、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズなどの、ストレプトアビジンビーズを用いて捕捉され得る。いくつかの実施形態において、プローブは、ＦＩＴＣを含み得、捕捉手段は、抗ＦＩＴＣを含み得る。いくつかの実施形態において、プローブは、ハプテンを含み得、捕捉手段は、そのハプテンに結合する分子（例えば、抗体）を含み得る。他の捕捉するための手段、例えば、等速電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、磁性手段などを用いることもできる。
例えば、捕捉手段が、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを含む場合などの、いくつかの実施形態において、上記方法は、プローブ（例えば、プローブ：標的ハイブリッドなど）および捕捉手段を含む捕捉混合物を形成する工程を含み得る。
いくつかの実施形態において、上記方法は、捕捉混合物を捕捉温度で維持する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、その捕捉温度は、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５７℃、少なくとも５８℃、少なくとも５９℃、少なくとも６０℃、少なくとも６１℃、少なくとも６２℃、少なくとも６３℃、少なくとも６４℃、少なくとも６５℃または少なくとも７０℃であり得る。いくつかの実施形態において、その捕捉温度は、最大５６℃、最大５８℃、最大６０℃、最大６１℃、最大６２℃、最大６３℃、最大６４℃、最大６５℃または最大７０℃であり得る。いくつかの実施形態において、捕捉混合物は、捕捉温度で少なくとも２分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間または少なくとも１５分間維持され得る。いくつかの実施形態において、捕捉混合物は、捕捉温度で最大５分間、最大１０分間、最大１５分間、最大２０分間、最大３０分間、最大４５分間またはそれより長く、維持され得る。いくつかの実施形態において、および／または振盪混合が、５または１０分ごとに追加され得る。
いくつかの実施形態において、上記方法は、捕捉されたプローブを洗浄する工程をさらに含み得る（捕捉されたプローブは、例えば、プローブ：標的ハイブリッドおよび／または捕捉されたライブラリーメンバーを含み得る）。いくつかの実施形態において、捕捉されたプローブは、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回またはそれより多く、洗浄され得る。いくつかの実施形態において、捕捉されたプローブは、最大１回、最大２回、最大３回または最大５回、洗浄され得る。
いくつかの実施形態において、捕捉されたライブラリーメンバーを洗浄する工程は、捕捉されたプローブを洗浄バッファー中で洗浄温度に加熱する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、洗浄バッファーは、界面活性剤を含み得る。任意の好適なバッファーを使用してよく、それらとしては、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）；ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（３－プロパンスルホン酸）（ＰＩＰＰＳ）；２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）；（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）などが挙げられる。任意の好適な界面活性剤を使用してよく、それらとしては、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などが挙げられる。いくつかの実施形態において、洗浄バッファーは、例えばベタインなどの、ＧＣリッチ領域において二次構造の形成を減少させることを目的とする化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、洗浄バッファーは、例えば、デフェロキサミンメシル酸塩、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡなどをはじめとした、鉄キレート剤を含み得る。
洗浄温度は、少なくとも２０℃、少なくとも２３℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５７℃、少なくとも５８℃、少なくとも５９℃、少なくとも６０℃、少なくとも６１℃、少なくとも６２℃、少なくとも６３℃、少なくとも６４℃、少なくとも６５℃または少なくとも７０℃であり得る。いくつかの実施形態において、洗浄温度は、最大３０℃、最大３５℃、最大４０℃、最大４５℃、最大５０℃、最大５５℃、最大５６℃、最大６０℃、最大６１℃、最大６２℃、最大６３℃、最大６４℃、最大６５℃または最大７０℃であり得る。
いくつかの実施形態において、上記方法は、捕捉されたライブラリーメンバーを捕捉手段および／またはプローブから溶離する工程をさらに含み得る。例えば、捕捉されたライブラリーメンバーは、ストレプトアビジンビーズおよび／またはビオチン化プローブから溶離され得る。ストレプトアビジンビーズがストレプトアビジン磁気ビーズを含む実施形態では、溶離は、磁石の使用を含み得る。いくつかの実施形態において、溶離は、例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２などをはじめとした、強塩基の使用を含み得る。
いくつかの実施形態において、捕捉手段として固体支持体が使用され得、その固体支持体としては、例えば、ストレプトアビジンを含む固体支持体が挙げられる。いくつかの実施形態において、その捕捉手段は、連続的にストリンジェンシーを高めた条件下で、プローブ：標的の推定Ｔｍ値より低い温度かつ／またはアダプターのＴｍ値より高い温度において洗浄され得る。
いくつかの実施形態において、捕捉されたライブラリーメンバーは、リガンドから溶離（例えば、ビオチン化プローブから溶離）され得るか、または捕捉手段から溶離（例えば、ストレプトアビジンビーズから溶離）され得、フローセル上に直接ロードされ得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも６０フェムトモル、少なくとも８０フェムトモル、少なくとも９０フェムトモル、少なくとも１００フェムトモルまたは少なくとも１５０フェムトモルのＤＮＡが、溶離され得る。いくつかの実施形態では、最大１５０フェムトモル、最大５００フェムトモル、最大１ピコモル、最大２ピコモルまたは最大３ピコモルのＤＮＡが、溶離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、１００フェムトモル～２ピコモルのＤＮＡが、溶離され得る。
いくつかの実施形態において、溶離されたライブラリーメンバーは、１００μＬ未満の体積、９０μＬ未満の体積、８０μＬ未満の体積、７０μＬ未満の体積または６０μＬ未満の体積でフローセル上にロードされ得る。いくつかの実施形態において、捕捉されたライブラリーメンバーは、およそ５５μＬの体積でフローセル上にロードされ得る。
いくつかの実施形態において、溶離後、溶離液は、少なくとも１．１ピコモル濃度（ｐＭ）、少なくとも１．２ｐＭ、少なくとも１．３ｐＭ、少なくとも１０ｐＭまたは少なくとも１００ｐＭのＤＮＡ濃度を有し得る。いくつかの実施形態において、溶離液は、最大１００ｐＭ、最大２００ｐＭ、最大２５０ｐＭまたは最大３００ｐＭのＤＮＡ濃度を有し得る。例えば、いくつかの実施形態において、溶離液は、１．３ｐＭ～２５０ｐＭの範囲内のＤＮＡ濃度を有し得る。いくつかの実施形態において、溶離液は、さらに希釈することなく、かつ／またはＤＮＡ濃度を変更することなく、フローセル上にロードされ得る。
増幅
別の態様において、本開示は、ハイブリッド捕捉後ではあるが、捕捉されたライブラリーメンバーを配列決定する前に、ＰＣＲを用いてライブラリーメンバーを増幅する工程を含む方法を記載する。あるいは、本開示は、ハイブリッド捕捉後かつライブラリーメンバーを配列決定する前に、捕捉されたライブラリーメンバーを増幅条件に供する工程を含まない方法（例えば、ライブラリーメンバーを配列決定する前に、捕捉されたライブラリーメンバーをＰＣＲ工程に供して、捕捉されたライブラリーメンバーを増幅する工程を含まない方法）を記載する。捕捉されたライブラリーメンバーを配列決定する方法は、通常、前記ライブラリーメンバーを配列決定する前に、ライブラリーメンバーを増幅する（例えば、ＰＣＲ工程を用いて）工程を含む。
ハイブリダイゼーションおよびハイブリッド捕捉の間に捕捉されたＤＮＡの量は、蛍光測定法または分析法（例えば、バイオアナライザー）によって直接定量するには少なすぎることがある。ライブラリーの増幅により、プロセスの定量および品質管理が可能になる。
さらに、ハイブリッド捕捉後かつ配列決定前に、ＰＣＲを用いて増幅されたサンプルを希釈するのが一般的である。例えば、ＰＣＲ後の、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．のＮＥＸＴＥＲＡ Ｒａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅサンプルの代表的な定量は、中ナノモル濃度範囲において行われるのに対して、配列決定濃度は、低ピコモル濃度範囲である。したがって、捕捉されたライブラリーメンバーを増幅することによって、配列決定のために必要な量より数桁多い分子が生成される。
いくつかの実施形態において、本開示は、ハイブリッド捕捉後に、捕捉されたライブラリーメンバーを配列決定する方法を記載する。そのような方法は、捕捉されたライブラリーメンバーおよび／または溶離されたライブラリーメンバーをフローセル上に直接ロードする工程（例えば、２０１７年９月２８日出願の米国特許仮出願第６２／５６４，４６６に記載されているような、例えばダイレクトフローセルローディングジグを用いて）を含み得る。
いくつかの実施形態において、方法は、ハイブリッド捕捉後に、捕捉されたライブラリーメンバーを配列決定する工程をさらに含み得る。
実施形態
例示的なブロッカー実施形態
１．オリゴヌクレオチドを含むブロッカーであって、
そのブロッカーは、アダプターに結合することができ、そのアダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み；
アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに結合することができるブロッカーの領域は、
少なくとも３つのチミン塩基、少なくとも４つのチミン塩基、少なくとも５つのチミン塩基、少なくとも６つのチミン塩基、少なくとも７つのチミン塩基、少なくとも８つのチミン塩基、少なくとも９つのチミン塩基もしくは少なくとも１０個のチミン塩基；または
ユニバーサル塩基および少なくとも１つの非ユニバーサル塩基を含む、ブロッカー。
２．前記アダプターのインデックス領域またはＵＭＩに結合することができるブロッカーの領域が、前記アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩにおける塩基数と同数のチミン塩基を含む、ブロッカー実施形態１に記載のブロッカー。
３．前記少なくとも１つの非ユニバーサル塩基が、前記インデックス領域および／またはＵＭＩに対応するブロッカー配列の領域に位置し、前記非ユニバーサル塩基が、インデックス領域の５’末端を基準としてブロッカー配列の３番目もしくは５番目の位置またはその両方に存在する、ブロッカー実施形態１に記載のブロッカー。
４．前記少なくとも１つの非ユニバーサル塩基が、修飾グアニンを含む、ブロッカー実施形態１またはブロッカー実施形態３に記載のブロッカー。
５．前記少なくとも１つの非ユニバーサル塩基が、ランダムヌクレオチドを含む、ブロッカー実施形態１、３または４のいずれか１つに記載のブロッカー。
６．前記ユニバーサル塩基が、２’－デオキシイノシン、２’－デオキシネブラリン、３－ニトロピロール２’－デオキシヌクレオシドまたは５－ニトロインドール２’－デオキシヌクレオシドを含む、ブロッカー実施形態１、３、４または５のいずれか１つに記載のブロッカー。
７．前記ユニバーサルプライマー配列が、Ｐ５、Ｐ７、Ｐ５’、Ｐ７’、Ｖ２．Ａ１４．ＭＥＴＳ、Ｖ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳ、Ｖ２．Ａ１４．ＭＥＴＳの相補鎖およびＶ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳの相補鎖のうちの少なくとも１つを含む、前述のブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカー。
８．前記ブロッカーが、修飾を含まない同じブロッカーと比べて前記ブロッカーのＴｍを上昇させる修飾を含む、前述のブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカー。
９．前記ブロッカーが、低ＧＣ領域を捕捉するように修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド；架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン（５－メチル－ｄｃ）；２，６－ジアミノプリン；ロック核酸（ＬＮＡ）；架橋型核酸（ＢＮＡ）；三環式核酸；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；Ｃ５修飾ピリミジン塩基；プロピニルピリミジン；モルホリノ；ホスホルアミダイト；および５’－ピレンキャップのうちの少なくとも１つを含む、前述のブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカー。
１０．前記ブロッカーが、１塩基ごと、少なくとも２塩基ごと、少なくとも３塩基ごと、少なくとも４塩基ごとまたは少なくとも５塩基ごとに修飾塩基を含む、前述のブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカー。
１１．前記ブロッカーが、そのブロッカーがＤＮＡ合成用のプライマーとして働く利用可能性を妨げる３’末端基を含む、前述のブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカー。
１２．前記３’末端基が、３’－ｄＣ、２’，３’－ｄｄＣ、反転ｄＴまたは３’－スペーサーＣ３を含む、ブロッカー実施形態１１に記載のブロッカー。
１３．前記ブロッカーが、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃまたは表３の配列を含む、前述のブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカー。
１４．前述のブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカーを含む、キット。
例示的なスプリットブロッカー実施形態
１．接続されていない２つのオリゴヌクレオチドを含むブロッカーであって、
前記ブロッカーは、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み；
前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに対応しない塩基を含む、ブロッカー。
２．前記接続されていないオリゴヌクレオチドが、前記アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに対応する塩基を含まない、スプリットブロッカー実施形態１に記載のブロッカー。
３．前記ユニバーサルプライマー配列が、Ｐ５、Ｐ７、Ｐ５’、Ｐ７’、Ｖ２．Ａ１４．ＭＥＴＳ、Ｖ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳ、Ｖ２．Ａ１４．ＭＥＴＳの相補鎖およびＶ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳの相補鎖のうちの少なくとも１つを含む、前述のスプリットブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカー。
４．前記ブロッカーが、修飾を含まない同じブロッカーと比べて前記ブロッカーのＴｍを上昇させる修飾を含む、前述のスプリットブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカー。
５．前記ブロッカーが、低ＧＣ領域を捕捉するように修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド；架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン（５－メチル－ｄｃ）；２，６－ジアミノプリン；ロック核酸（ＬＮＡ）；架橋型核酸（ＢＮＡ）；三環式核酸；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；Ｃ５修飾ピリミジン塩基；プロピニルピリミジン；モルホリノ；ホスホルアミダイト；および５’－ピレンキャップのうちの少なくとも１つを含む、前述のスプリットブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカー。
６．前記ブロッカーが、１塩基ごと、少なくとも２塩基ごと、少なくとも３塩基ごと、少なくとも４塩基ごとまたは少なくとも５塩基ごとに修飾塩基を含む、前述のスプリットブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカー。
７．前記ブロッカーが、そのブロッカーがＤＮＡ合成用のプライマーとして働く利用可能性を妨げる３’末端基を含む、前述のスプリットブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカー。
８．前記３’末端基が、３’－ｄＣ、２’，３’－ｄｄＣ、反転ｄＴまたは３’－スペーサーＣ３を含む、スプリットブロッカー実施形態１１に記載のブロッカー。
９．前記ブロッカーが、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃまたは表３の配列を含む、前述のスプリットブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカー。
１０．前記ブロッカーが、表２ＡのＢＮ０２３、ＢＮ０２４、ＢＮ０２７およびＢＮ０２８のうちの少なくとも１つを含む、前記スプリットブロッカー実施形態のいずれかに記載のブロッカー。
１１．前述のスプリットブロッカー実施形態のいずれか１つに記載のブロッカーを含む、キット。
例示的なハイブリダイゼーションバッファー実施形態
１．クラウディング剤を含むハイブリダイゼーションバッファー。
２．前記クラウディング剤が、デキストラン、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール、グリセロールおよびベタインのうちの少なくとも１つを含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態１に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
３．前記クラウディング剤が、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％または少なくとも４％の量で前記ハイブリダイゼーションバッファーに含められる、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
４．前記クラウディング剤が、最大１％、最大１．５％、最大２％、最大３％、最大４％、最大５％、最大６％、最大８％または最大１０％の量で前記ハイブリダイゼーションバッファーに含められる、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
５．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、不安定化剤、塩およびブロッカーのうちの少なくとも１つを含む、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
６．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、少なくとも０．０５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬの量でＣｏｔ－１ＤＮＡを含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態５に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
７．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、最大０．１ｍｇ／ｍＬ、最大０．２ｍｇ／ｍＬ、最大０．３ｍｇ／ｍＬまたは最大０．５ｍｇ／ｍＬの量でＣｏｔ－１ＤＮＡを含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態５または６に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
８．前記不安定化剤が、前記ハイブリダイゼーションバッファーの少なくとも１％（ｖ／ｖ）、少なくとも５％（ｖ／ｖ）または少なくとも１０％（ｖ／ｖ）を構成する、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態５～７のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
９．前記不安定化剤が、前記ハイブリダイゼーションバッファーの最大５％（ｖ／ｖ）、最大１０％（ｖ／ｖ）または最大１５％（ｖ／ｖ）を構成する、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態５～８のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
１０．前記不安定化剤が、ホルムアミドを含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態５～９のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
１１．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．２Ｍ、少なくとも０．３Ｍ、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．７Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも０．９Ｍまたは少なくとも１Ｍの塩を含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態５～１０のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
１２．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、最大０．２Ｍ、最大０．３Ｍ、最大０．４Ｍ、最大０．５Ｍ、最大０．６Ｍ、最大０．７Ｍ、最大０．８Ｍ、最大０．９Ｍ、最大１Ｍ、最大２Ｍ、最大３Ｍまたは最大４Ｍの塩を含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態５～１１のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
１３．前記塩が、ＮａＣｌを含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態５～１１のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
１４．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、リン酸塩を含む、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
１５．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも５５ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも６５ｍＭまたは少なくとも７０ｍＭのリン酸塩を含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態１４に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
１６．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、最大５０ｍＭ、最大５５ｍＭ、最大６０ｍＭ、最大６５ｍＭ、最大７０ｍＭ、最大７５ｍＭまたは最大８０ｍＭのリン酸塩を含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態１４または（ｏｆ）１５に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
１７．前記リン酸塩が、ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４を含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態１４～１６のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
１８．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、界面活性剤を含む、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
１９．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、少なくとも０．００１％（ｖ／ｖ）、少なくとも０．０１％（ｖ／ｖ）、少なくとも０．０５％（ｖ／ｖ）、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）、少なくとも１％（ｖ／ｖ）または少なくとも５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態１８に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
２０．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、最大０．０１％（ｖ／ｖ）、最大０．０５％（ｖ／ｖ）、最大０．１％（ｖ／ｖ）、最大１％（ｖ／ｖ）、最大５％（ｖ／ｖ）または最大１０％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態１８または１９に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
２１．前記界面活性剤が、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態１８～２０のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
２２．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、
０．５％～１０％デキストラン硫酸、
０．０５ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、
１％～１５％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、
４０ｍＭ～８０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４、
０．１Ｍ～４Ｍ ＮａＣｌ、および
０．００１％～１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０
を含む、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
２３．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、
１．５％デキストラン硫酸、
０．２ｍｇ／ｍＬヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、
１０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、
６６．６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４、
０．２ｍＭ 強化アダプターブロッカー（各アダプターに対して０．１ｍＭ）
０．８Ｍ ＮａＣｌ、および
０．０４％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
２４．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、ブロッカーを含む、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
２５．前記ブロッカーが、Ｔｍ高温化オリゴヌクレオチドを含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態２４に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
２６．前記ブロッカーが、Ｔｍを高める複数の修飾を含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態２４または２５に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
２７．前記ブロッカーのＴｍを上昇させる複数の修飾が、架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン（５－メチル－ｄｃ）；２，６－ジアミノプリン；ロック核酸（ＬＮＡ）；架橋型核酸（ＢＮＡ）；三環式核酸；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；Ｃ５修飾ピリミジン塩基；プロピニルピリミジン；モルホリノ；ホスホルアミダイト；および５’－ピレンキャップのうちの少なくとも１つを含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態２６に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
２８．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、ブロッカーを含み、
前記ブロッカーは、オリゴヌクレオチドを含み；
前記ブロッカーは、アダプターに結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み；
前記アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに結合することができるブロッカーの領域は、
少なくとも３つのチミン塩基、少なくとも４つのチミン塩基、少なくとも５つのチミン塩基、少なくとも６つのチミン塩基、少なくとも７つのチミン塩基、少なくとも８つのチミン塩基、少なくとも９つのチミン塩基もしくは少なくとも１０個のチミン塩基；または
ユニバーサル塩基および少なくとも１つの非ユニバーサル塩基
を含む、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
２９．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、ブロッカーを含み、
前記ブロッカーは、接続されていない２つのオリゴヌクレオチドを含み；
前記ブロッカーは、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み；
前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、アダプターのインデックス領域および／またはアダプターのＵＭＩに対応しない塩基を含む、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
３０．前記ブロッカーが、Ｔｍを高める複数の修飾を含む、ハイブリダイゼーションバッファー実施形態２８または２９に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
３１．前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファーを含む、キット。
ハイブリダイゼーションバッファーを使用する例示的な方法（バッファー方法実施形態）
１．ハイブリッド捕捉のためにクラウディング剤を含むハイブリダイゼーションバッファーを使用する工程を含む、方法。
２．前記クラウディング剤が、デキストラン、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール、グリセロールおよびベタインのうちの少なくとも１つを含む、バッファー方法実施形態１に記載の方法。
３．前記クラウディング剤が、少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１％（ｗ／ｖ）、少なくとも１．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも２％（ｗ／ｖ）、少なくとも３％（ｗ／ｖ）または少なくとも４％（ｗ／ｖ）の量で前記ハイブリダイゼーションバッファーに含められる、前述のバッファー方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４．前記クラウディング剤が、最大１％（ｗ／ｖ）、最大１．５％（ｗ／ｖ）、最大２％（ｗ／ｖ）、最大３％（ｗ／ｖ）、最大４％（ｗ／ｖ）、最大５％（ｗ／ｖ）、最大６％（ｗ／ｖ）、最大８％（ｗ／ｖ）または最大１０％（ｗ／ｖ）の量で前記ハイブリダイゼーションバッファーに含められる、前述のバッファー方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、不安定化剤および塩のうちの少なくとも１つを含む、前述のバッファー方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、少なくとも０．０５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬの量でヒトＣｏｔ－１ＤＮＡを含む、バッファー方法実施形態５に記載の方法。
７．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、最大０．１ｍｇ／ｍＬ、最大０．２ｍｇ／ｍＬ、最大０．３ｍｇ／ｍＬまたは最大０．５ｍｇ／ｍＬの量でヒトＣｏｔ－１ＤＮＡを含む、バッファー方法実施形態５または６に記載の方法。
８．前記不安定化剤が、前記ハイブリダイゼーションバッファーの少なくとも１％（ｖ／ｖ）、少なくとも５％（ｖ／ｖ）または少なくとも１０％（ｖ／ｖ）を構成する、バッファー方法実施形態５～７のいずれか１つに記載の方法。
９．前記不安定化剤が、前記ハイブリダイゼーションバッファーの最大５％（ｖ／ｖ）、最大１０％（ｖ／ｖ）または最大１５％（ｖ／ｖ）を構成する、バッファー方法実施形態５～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．前記不安定化剤が、ホルムアミドを含む、バッファー方法実施形態５～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．２Ｍ、少なくとも０．３Ｍ、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．７Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも０．９Ｍまたは少なくとも１Ｍの塩を含む、バッファー方法実施形態５～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、最大０．２Ｍ、最大０．３Ｍ、最大０．４Ｍ、最大０．５Ｍ、最大０．６Ｍ、最大０．７Ｍ、最大０．８Ｍ、最大０．９Ｍ、最大１Ｍ、最大２Ｍ、最大３Ｍまたは最大４Ｍの塩を含む、バッファー方法実施形態５～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．前記塩が、ＮａＣｌを含む、バッファー方法実施形態５～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、リン酸塩を含む、前述のバッファー方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも５５ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも６５ｍＭまたは少なくとも７０ｍＭのリン酸塩を含む、バッファー方法実施形態１４に記載の方法。
１６．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、最大５０ｍＭ、最大５５ｍＭ、最大６０ｍＭ、最大６５ｍＭ、最大７０ｍＭ、最大７５ｍＭまたは最大８０ｍＭのリン酸塩を含む、バッファー方法実施形態１４または１５に記載の方法。
１７．前記リン酸塩が、ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４を含む、バッファー方法実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、界面活性剤を含む、前述のバッファー方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１９．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、少なくとも０．００１％（ｖ／ｖ）、少なくとも０．０１％（ｖ／ｖ）、少なくとも０．０５％（ｖ／ｖ）、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）、少なくとも１％（ｖ／ｖ）または少なくとも５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、バッファー方法実施形態１７に記載の方法。
２０．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、最大０．０１％（ｖ／ｖ）、最大０．０５％（ｖ／ｖ）、最大０．１％（ｖ／ｖ）、最大１％（ｖ／ｖ）、最大５％（ｖ／ｖ）または最大１０％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む、バッファー方法実施形態１８または１９に記載の方法。
２１．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む、バッファー方法実施形態１８～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、
０．５％～１０％デキストラン硫酸、
０．０５ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬ Ｃｏｔ－１、
１％～１５％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、
４０ｍＭ～８０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４、
０．１Ｍ～４Ｍ ＮａＣｌ、および
０．００１％～１０％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０
を含む、前述のバッファー方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２３．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、
１．５％デキストラン硫酸、
０．２ｍｇ／ｍＬ Ｃｏｔ－１、
１０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、
６６．６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４、
０．８Ｍ ＮａＣｌ、および０．０４％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０
を含む、前述のバッファー方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、ブロッカーを含む、前述のバッファー方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２５．前記ブロッカーが、少なくとも０．００１ｍＭ、少なくとも０．００５ｍＭ、少なくとも０．０１ｍＭ、少なくとも０．０５ｍＭまたは少なくとも０．１ｍＭの濃度で存在する、バッファー方法実施形態２４に記載の方法。
２６．前記ブロッカーが、最大０．０１ｍＭ、最大０．０５ｍＭ、最大０．１ｍＭ、最大０．２ｍＭまたは最大０．５ｍＭの濃度で存在する、バッファー方法実施形態２４または２５に記載の方法。
２７．前記方法が、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡおよびブロッカーを含む第１の組成物ならびにホルムアミドおよびデキストラン硫酸を含む第２の組成物から前記ハイブリダイゼーションバッファーを形成する工程を含む、前述のバッファー方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２８．前記方法が、ライブラリーを前記ハイブリダイゼーションバッファーと接触させる工程を含み、前記ハイブリダイゼーションバッファーは、ブロッカーを含む、前述のバッファー方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２９．前記方法が、前記ハイブリダイゼーションバッファーの存在下において前記ライブラリーを前記ブロッカーと接触させる前に、少なくとも２つのライブラリー調製物由来のサンプルを合わせる工程を含む、バッファー方法実施形態２８に記載の方法。
３０．少なくとも１μＬ、少なくとも２μＬ、少なくとも３μＬ、少なくとも５μＬ、少なくとも１０μＬ、少なくとも１５μＬまたは少なくとも２０μＬの、各ライブラリー調製物に由来するサンプルを合わせる、バッファー方法実施形態２９に記載の方法。
３１．最大２μＬ、最大３μＬ、最大５μＬ、最大１０μＬ、最大１５μＬ、最大２０μＬ、最大２５μＬ、最大３０μＬ、最大４０μＬまたは最大５０μＬの、各ライブラリー調製物に由来するサンプルを合わせる、バッファー方法実施形態２９または３０に記載の方法。
３２．各ライブラリー調製物由来の少なくとも１０ｎｇ、少なくとも１５ｎｇ、少なくとも２５ｎｇ、少なくとも５０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも２００ｎｇ、少なくとも５００ｎｇ、少なくとも１，０００ｎｇまたは少なくとも５，０００ｎｇのＤＮＡを合わせる、バッファー方法実施形態２９～３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．各ライブラリー調製物由来の最大１５ｎｇ、最大２５ｎｇ、最大５０ｎｇ、最大１００ｎｇ、最大２００ｎｇ、最大５００ｎｇ、最大１，０００ｎｇ、最大５，０００ｎｇ、最大１０，０００ｎｇまたは最大１２，０００ｎｇのＤＮＡを合わせる、バッファー方法実施形態２９～３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．合わせられるライブラリー調製物由来の各サンプルのＤＮＡ濃度が、少なくとも０．１ｎｇ／μＬ、少なくとも０．３ｎｇ／μＬ、少なくとも０．４ｎｇ／μＬ、少なくとも０．５ｎｇ／μＬ、少なくとも１ｎｇ／μＬ、少なくとも２ｎｇ／μＬ、少なくとも４ｎｇ／μＬ、少なくとも６ｎｇ／μＬ、少なくとも８ｎｇ／μＬ、少なくとも１０ｎｇ／μＬ、少なくとも１２ｎｇ／μＬ、少なくとも２０ｎｇ／μＬ、少なくとも５０ｎｇ／μＬ、少なくとも６０ｎｇ／μＬ、少なくとも１００ｎｇ／μＬまたは少なくとも２００ｎｇ／μＬである、バッファー方法実施形態２９～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．合わせられるライブラリー調製物由来の各サンプルのＤＮＡ濃度が、最大０．４ｎｇ／μＬ、最大０．５ｎｇ／μＬ、最大１ｎｇ／μＬ、最大２ｎｇ／μＬ、最大４ｎｇ／μＬ、最大６ｎｇ／μＬ、最大８ｎｇ／μＬ、最大１０ｎｇ／μＬ、最大１２ｎｇ／μＬ、最大１５ｎｇ／μＬ、最大２０ｎｇ／μＬ、最大５０ｎｇ／μＬ、最大１００ｎｇ／μＬ、最大１２０ｎｇ／μＬ、最大２００ｎｇ／μＬ、最大３００ｎｇ／μＬまたは最大４００ｎｇ／μＬである、バッファー方法実施形態２９～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．前記ライブラリー調製物を合わせた後のＤＮＡ濃度が、０．３ｎｇ／μＬ～４００ｎｇ／μＬの範囲内である、バッファー方法実施形態２９～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．前記方法が、ライブラリーメンバーをプローブと接触させる工程をさらに含み、前記プローブは、ライブラリーメンバー内の目的の領域にハイブリダイズし、前記プローブは、リガンドを含む、バッファー方法実施形態２９～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．前記リガンドが、ビオチン基を含む、バッファー方法実施形態３７に記載の方法。
３９．前記方法が、ライブラリーメンバー、前記ハイブリダイゼーションバッファー（ここで、前記ハイブリダイゼーションバッファーはブロッカーを含む）およびプローブを含むハイブリダイゼーション混合物を形成する工程を含む、バッファー方法実施形態２９～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．前記ハイブリダイゼーション混合物が、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡをさらに含む、バッファー方法実施形態３９に記載の方法。
４２．前記方法が、最大１５０μＬ、最大１４０μＬ、最大１３０μＬ、最大１２０μＬ、最大１１０μＬ、最大１００μＬ、最大９０μＬ、最大８０μＬ、最大７０μＬ、最大６０μＬまたは最大５０μＬの体積のハイブリダイゼーション混合物を使用する工程を含む、バッファー方法実施形態３９または４０に記載の方法。
４２．前記方法が、少なくとも１０μＬ、少なくとも２０μＬ、少なくとも３０μＬ、少なくとも４０μＬ、少なくとも５０μＬ、少なくとも６０μＬまたは少なくとも７０μＬの体積のハイブリダイゼーション混合物を使用する工程を含む、バッファー方法実施形態３９～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．前記ハイブリダイゼーション混合物中のＤＮＡ濃度が、少なくとも少なくとも０．１ｎｇ／μＬ、少なくとも０．３ｎｇ／μＬ、少なくとも０．４ｎｇ／μＬ、少なくとも０．５ｎｇ／μＬ、少なくとも１ｎｇ／μＬ、少なくとも２ｎｇ／μＬ、少なくとも４ｎｇ／μＬ、少なくとも６ｎｇ／μＬ、少なくとも８ｎｇ／μＬ、少なくとも１０ｎｇ／μＬ、少なくとも１２ｎｇ／μＬ、少なくとも１５ｎｇ／μＬ、少なくとも２０ｎｇ／μＬ、少なくとも５０ｎｇ／μＬ、少なくとも７５ｎｇ／μＬ、少なくとも１００ｎｇ／μＬ、少なくとも１２０ｎｇ／μＬ、少なくとも１５０ｎｇ／μＬ、少なくとも２００ｎｇ／μＬである、バッファー方法実施形態３９～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．前記ハイブリダイゼーション混合物中のＤＮＡ濃度が、最大０．３ｎｇ／μＬ、最大０．４ｎｇ／μＬ、最大０．５ｎｇ／μＬ、最大１ｎｇ／μＬ、最大２ｎｇ／μＬ、最大４ｎｇ／μＬ、最大６ｎｇ／μＬ、最大８ｎｇ／μＬ、最大１０ｎｇ／μＬ、最大１２ｎｇ／μＬ、最大１５ｎｇ／μＬ、最大２０ｎｇ／μＬ、最大５０ｎｇ／μＬ、最大７５ｎｇ／μＬ、最大１００ｎｇ／μＬ、最大１２０ｎｇ／μＬ、最大１５０ｎｇ／μＬ、最大２００ｎｇ／μＬまたは最大５００ｎｇ／μＬである、バッファー方法実施形態３９～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．前記ライブラリーが、前記プローブと最大３日間、最大２日間、最大２４時間、最大２０時間、最大１６時間、最大１２時間、最大６時間、最大３時間、最大２時間、最大９０分間、最大１時間または最大３０分間接触する、バッファー方法実施形態３７～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．前記ライブラリーが、前記プローブと少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間、少なくとも９０分間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間または少なくとも２４時間接触する、バッファー方法実施形態３７～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．方法が、前記ハイブリダイゼーション混合物をハイブリダイゼーション温度で維持する工程を含み、前記ハイブリダイゼーション温度は、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５７℃、少なくとも５８℃、少なくとも５９℃、少なくとも６０℃、少なくとも６１℃、少なくとも６２℃、少なくとも６３℃、少なくとも６４℃、少なくとも６５℃または少なくとも７０℃である、バッファー方法実施形態３９～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．方法が、前記ハイブリダイゼーション混合物をハイブリダイゼーション温度で維持する工程を含み、前記ハイブリダイゼーション温度は、最大５６℃、最大５８℃、最大６０℃、最大６１℃、最大６２℃、最大６３℃、最大６４℃、最大６５℃または最大７０℃である、バッファー方法実施形態３９～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．前記方法が、前記ハイブリダイゼーション混合物をハイブリダイゼーション温度で最大３日間、最大２日間、最大２４時間、最大２０時間、最大１６時間、最大１２時間、最大６時間、最大３時間、最大２時間、最大９０分間、最大１時間または最大３０分間維持する工程を含む、バッファー方法実施形態３９～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．前記方法が、前記ハイブリダイゼーション混合物をハイブリダイゼーション温度で少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間、少なくとも９０分間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間または少なくとも２４時間維持する工程を含む、バッファー方法実施形態３９～４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．前記方法が、ハイブリダイズした後の前記プローブを、捕捉手段を用いて捕捉する工程をさらに含む、バッファー方法実施形態３７～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．前記プローブを捕捉する工程が、ストレプトアビジンビーズを使用する工程を含む、バッファー方法実施形態５１に記載の方法。
５３．前記方法が、前記プローブおよび捕捉手段を含む捕捉混合物を形成する工程を含む、バッファー方法実施形態３７～５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．前記方法が、前記捕捉混合物を少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５７℃、少なくとも５８℃、少なくとも５９℃、少なくとも６０℃、少なくとも６１℃、少なくとも６２℃、少なくとも６３℃、少なくとも６４℃、少なくとも６５℃または少なくとも７０℃の捕捉温度で維持する工程を含む、バッファー方法実施形態５３に記載の方法。
５５．前記方法が、前記捕捉混合物を最大５６℃、最大５８℃、最大６０℃、最大６１℃、最大６２℃、最大６３℃、最大６４℃、最大６５℃または最大７０℃の捕捉温度で維持する工程を含む、バッファー方法実施形態５３または５４に記載の方法。
５６．前記方法が、前記捕捉混合物を捕捉温度で少なくとも２分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間または少なくとも１５分間維持する工程を含む、バッファー方法実施形態５３～５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．前記方法が、前記捕捉混合物を捕捉温度で最大５分間、最大１０分間、最大１５分間、最大２０分間、最大３０分間または最大４５分間維持する工程を含む、バッファー方法実施形態５３～５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．前記方法が、前記捕捉されたプローブを洗浄する工程を含む、バッファー方法実施形態５３～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．前記方法が、前記捕捉されたライブラリーメンバーを前記捕捉手段から溶離液に溶離する工程をさらに含む、バッファー方法実施形態５３～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．前記方法が、前記捕捉されたライブラリーメンバーを前記プローブから溶離液に溶離する工程をさらに含む、バッファー方法実施形態５３～５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．少なくとも６０フェムトモル、少なくとも８０フェムトモル、少なくとも９０フェムトモル、少なくとも１００フェムトモルまたは少なくとも１５０フェムトモルのＤＮＡが溶離される、バッファー方法実施形態６０に記載の方法。
６２．最大１５０フェムトモル、最大５００フェムトモル、最大１ピコモル、最大２ピコモルまたは最大３ピコモルのＤＮＡが溶離される、バッファー方法実施形態６０または６１に記載の方法。
６３．前記溶離液のＤＮＡ濃度が、少なくとも１．１ｐＭ、少なくとも１．２ｐＭ、少なくとも１．３ｐＭ、少なくとも１０ｐＭまたは少なくとも１００ｐＭである、バッファー方法実施形態６０～６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．前記溶離液のＤＮＡ濃度が、最大１００ｐＭ、最大２００ｐＭ、最大２５０ｐＭまたは最大３００ｐＭである、バッファー方法実施形態６０～６３のいずれか１つに記載の方法。
６５．前記溶離液のＤＮＡ濃度が、１．３ｐＭ～２５０ｐＭの範囲内である、バッファー方法実施形態６０～６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．前記方法が、前記ライブラリーメンバーを配列決定する工程をさらに含む、バッファー方法実施形態３７～６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．前記方法が、前記ライブラリーメンバーを配列決定する前に前記ライブラリーメンバーを増幅する工程を含む、バッファー方法実施形態６６に記載の方法。
６８．前記方法が、前記ライブラリーメンバーを配列決定する前に前記ライブラリーメンバーを増幅する工程を含まない、バッファー方法実施形態６６に記載の方法。
６９．前記ブロッカーが、Ｔｍ高温化オリゴヌクレオチドを含む、バッファー方法実施形態２４～６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．前記ブロッカーが、Ｔｍを高める複数の修飾を含む、バッファー方法実施形態２４～６９のいずれかに記載の方法。
７１．前記ブロッカーのＴｍを上昇させる前記複数の修飾が、架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン（５－メチル－ｄｃ）；２，６－ジアミノプリン；ロック核酸（ＬＮＡ）；架橋型核酸（ＢＮＡ）；三環式核酸；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；Ｃ５修飾ピリミジン塩基；プロピニルピリミジン；モルホリノ；ホスホルアミダイト；および５’－ピレンキャップのうちの少なくとも１つを含む、バッファー方法実施形態７０に記載の方法。
７２．前記ブロッカーが、オリゴヌクレオチドを含み；
前記ブロッカーが、アダプターに結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み；
前記アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに結合することができるブロッカーの領域は、
少なくとも３つのチミン塩基、少なくとも４つのチミン塩基、少なくとも５つのチミン塩基、少なくとも６つのチミン塩基、少なくとも７つのチミン塩基、少なくとも８つのチミン塩基、少なくとも９つのチミン塩基もしくは少なくとも１０個のチミン塩基；または
ユニバーサル塩基および少なくとも１つの非ユニバーサル塩基
を含む、バッファー方法実施形態２４～７１のいずれかに記載の方法。
７３．前記ブロッカーが、接続されていない２つのオリゴヌクレオチドを含み；
前記ブロッカーが、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み；
前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、前記アダプターのインデックス領域および／または前記アダプターのＵＭＩに対応しない塩基を含む、バッファー方法実施形態２４～７２のいずれかに記載の方法。
ＰＣＲなしのハイブリッド捕捉の例示的な方法（捕捉方法実施形態）
１．ハイブリダイゼーションバッファーの存在下においてライブラリーをブロッカーと接触させる工程；
および前記ライブラリーをプローブと接触させる工程
を含む、方法であって、前記プローブは、ライブラリーメンバー内の目的の領域にハイブリダイズし；
前記方法は、前記ライブラリーメンバーを配列決定する前にＰＣＲを用いて前記ライブラリーメンバーを増幅する工程を含まない、方法。
２．前記プローブが、リガンドをさらに含み、前記ライブラリーメンバーが、前記ライブラリーメンバーを配列決定する前に前記リガンドから溶離される、捕捉方法実施形態１に記載の方法。
３．前記リガンドが、ビオチンを含む、捕捉方法実施形態２に記載の方法。
４．前記方法が、前記リガンドからの溶離後に前記ライブラリーメンバーをフローセル上にロードする工程を含む、捕捉方法実施形態２または３のいずれかに記載の方法。
５．前記方法が、ハイブリダイズした後の前記プローブを、捕捉手段を用いて捕捉する工程をさらに含む、捕捉方法実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．前記捕捉手段が、ストレプトアビジンを含む、捕捉方法実施形態５に記載の方法。
７．前記方法が、前記捕捉手段からの溶離後に前記ライブラリーメンバーをフローセル上にロードする工程を含む、捕捉方法実施形態５または６のいずれかに記載の方法。
８．前記方法が、前記ライブラリーメンバーを１００μＬ未満の体積、９０μＬ未満の体積、８０μＬ未満の体積、７０μＬ未満の体積または６０μＬ未満の体積でフローセル上にロードする工程を含む、捕捉方法実施形態４または７に記載の方法。
９．前記方法が、前記ライブラリーメンバーを少なくとも１．１ｐＭ、少なくとも１．２ｐＭ、少なくとも１．３ｐＭ、少なくとも１０ｐＭまたは少なくとも１００ｐＭの濃度でフローセル上にロードする工程を含む、捕捉方法実施形態４または７に記載の方法。
１０．前記方法が、前記ライブラリーメンバーを最大１００ｐＭ、最大２００ｐＭ、最大２５０ｐＭまたは最大３００ｐＭの濃度でフローセル上にロードする工程を含む、捕捉方法実施形態４、７または９に記載の方法。
１１．前記方法が、ダイレクトフローセルローディングジグを用いて前記ライブラリーメンバーをフローセル上にロードする工程を含む、捕捉方法実施形態４または７～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、クラウディング剤を含む、前述の捕捉方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、
０．５％～１０％デキストラン硫酸、
０．０５ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、
１％～１５％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、
４０ｍＭ～８０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４、
０．１Ｍ～４Ｍ ＮａＣｌ、および
０．００１％～１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０
を含む、捕捉方法実施形態１２に記載の方法。
１４．前記ブロッカーが、Ｔｍ高温化オリゴヌクレオチドを含む、前述の捕捉方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記ブロッカーが、Ｔｍを高める複数の修飾を含む、前述の捕捉方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１６．前記ブロッカーのＴｍを上昇させる前記複数の修飾が、架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン（５－メチル－ｄｃ）；２，６－ジアミノプリン；ロック核酸（ＬＮＡ）；架橋型核酸（ＢＮＡ）；三環式核酸；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；Ｃ５修飾ピリミジン塩基；プロピニルピリミジン；モルホリノ；ホスホルアミダイト；および５’－ピレンキャップのうちの少なくとも１つを含む、捕捉方法実施形態１５に記載の方法。
１７．前記ブロッカーが、オリゴヌクレオチドを含み；
前記ブロッカーが、アダプターに結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み；
前記アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに結合することができるブロッカーの領域が、
少なくとも３つのチミン塩基、少なくとも４つのチミン塩基、少なくとも５つのチミン塩基、少なくとも６つのチミン塩基、少なくとも７つのチミン塩基、少なくとも８つのチミン塩基、少なくとも９つのチミン塩基もしくは少なくとも１０個のチミン塩基；または
ユニバーサル塩基および少なくとも１つの非ユニバーサル塩基
を含む、前述の捕捉方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１８．前記ブロッカーが、接続されていない２つのオリゴヌクレオチドを含み；
前記ブロッカーが、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み；
前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、前記アダプターのインデックス領域および／または前記アダプターのＵＭＩに対応しない塩基を含む、前述の捕捉方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
本発明は、以下の例によって例証される。特定の例、材料、量および手順は、本明細書中に示される本発明の範囲および趣旨に従って広く解釈されるべきであると理解される。
実施形態
以下の番号付けされた項目は、本明細書中に記載されるような実施形態を提供するが、ここに記載される実施形態は、限定するものではない。
項目１．クラウディング剤と、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、不安定化剤、塩およびブロッカーのうちの少なくとも１つとを含むハイブリダイゼーションバッファー。
項目２．前記クラウディング剤が、デキストラン、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール、グリセロールおよびベタインのうちの少なくとも１つを含む、項目１に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
項目３．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、０．５％～１０％デキストラン硫酸、０．０５ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬ Ｃｏｔ－１、１％～１５％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、４０ｍＭ～８０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４、０．１Ｍ～４Ｍ ＮａＣｌ、および０．００１％～１０％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む、前述の項目のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
項目４．前記ブロッカーが、Ｔｍを高める複数の修飾を含む、前述の項目のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
項目５．前述の項目のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファーを使用する工程を含む、方法。
項目６．前記方法が、ライブラリーメンバー、前記ハイブリダイゼーションバッファー、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、ブロッカーおよびプローブを含むハイブリダイゼーション混合物を形成する工程を含む、項目５に記載の方法。
項目７．前記ハイブリダイゼーション混合物が、少なくとも２つのライブラリー調製物由来のサンプルを含み、各ライブラリー調製物由来の少なくとも１０ｎｇ、少なくとも２５ｎｇ、少なくとも５０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも２００ｎｇまたは少なくとも５００ｎｇのＤＮＡを合わせる、項目６に記載の方法。
項目８．前記ハイブリダイゼーション混合物のＤＮＡ濃度が、０．１ｎｇ／μＬ～１２０ｎｇ／μＬの範囲内である、項目６または項目７に記載の方法。
項目９．前記方法が、前記ライブラリーメンバーを前記プローブと接触させる工程であって、前記プローブは、ライブラリーメンバー内の目的の領域にハイブリダイズし、前記プローブは、リガンドを含む、工程、ハイブリダイズした後の前記プローブを、捕捉手段を用いて捕捉する工程、および前記捕捉されたライブラリーメンバーを前記捕捉手段から溶離液に溶離する工程であって、前記溶離液のＤＮＡ濃度は、１．３ｐＭ～２５０ｐＭの範囲内である、工程を含む、項目６～８のいずれか１つに記載の方法。
項目１０．前記方法が、前記ライブラリーメンバーを配列決定する工程をさらに含み、前記方法が、前記ライブラリーメンバーを配列決定する前に前記ライブラリーメンバーを増幅する工程を含まない、項目６～９のいずれか１つに記載の方法。
項目１１．前記方法が、ダイレクトフローセルローディングジグを用いて前記ライブラリーメンバーをフローセル上にロードする工程を含む、項目１０に記載の方法。
項目１２．オリゴヌクレオチドを含むブロッカーであって、前記ブロッカーは、アダプターに結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み、前記アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに結合することができるブロッカーの領域は、少なくとも３つのチミン塩基、少なくとも４つのチミン塩基、少なくとも５つのチミン塩基、少なくとも６つのチミン塩基、少なくとも７つのチミン塩基、少なくとも８つのチミン塩基、少なくとも９つのチミン塩基もしくは少なくとも１０個のチミン塩基；またはユニバーサル塩基および少なくとも１つの非ユニバーサル塩基を含む、ブロッカー。
項目１３．接続されていない２つのオリゴヌクレオチドを含むブロッカーであって、前記ブロッカーは、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み、前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、前記アダプターのインデックス領域および／またはＵＭＩに対応しない塩基を含む、ブロッカー。
項目１４．前記ユニバーサルプライマー配列が、Ｐ５、Ｐ７、Ｐ５’、Ｐ７’、Ｖ２．Ａ１４．ＭＥＴＳ、Ｖ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳ、Ｖ２．Ａ１４．ＭＥＴＳの相補鎖およびＶ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳの相補鎖のうちの少なくとも１つを含む、項目１２または１３に記載のブロッカー。
項目１５．前記ブロッカーが、修飾を含まない同じブロッカーと比べて前記ブロッカーのＴｍを上昇させる修飾を含む、項目１２～１４のいずれか１つに記載のブロッカー。
項目１６．前記ブロッカーが、低ＧＣ領域を捕捉するように修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド；架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン（５－メチル－ｄｃ）；２，６－ジアミノプリン；ロック核酸（ＬＮＡ）；架橋型核酸（ＢＮＡ）；三環式核酸；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；Ｃ５修飾ピリミジン塩基；プロピニルピリミジン；モルホリノ；ホスホルアミダイト；および５’－ピレンキャップのうちの少なくとも１つを含む、項目１２～１５のいずれか１つに記載のブロッカー。
項目１７．ハイブリダイゼーションバッファーの存在下においてライブラリーをブロッカーと接触させる工程；および前記ライブラリーをプローブと接触させる工程を含む方法であって、前記プローブは、ライブラリーメンバー内の目的の領域にハイブリダイズし、前記方法は、前記ライブラリーメンバーを配列決定する前にＰＣＲを用いて前記ライブラリーメンバーを増幅する工程を含まない、方法。
項目１８．前記方法が、前記ライブラリーメンバーを少なくとも１．１ｐＭ、少なくとも１．２ｐＭ、少なくとも１．３ｐＭ、少なくとも１０ｐＭまたは少なくとも１００ｐＭの濃度かつ最大１００ｐＭ、最大２００ｐＭ、最大２５０ｐＭまたは最大３００ｐＭの濃度でフローセル上にロードする工程を含む、項目１７に記載の方法。
項目１９．前記ブロッカーが、Ｔｍを高める複数の修飾を含む、項目１７または１８に記載の方法。
項目２０．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、クラウディング剤を含む、項目１７～１９のいずれか１つに記載の方法。
項目２１．前記ハイブリダイゼーションバッファーが、０．５％～１０％デキストラン硫酸、０．０５ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、１％～１５％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、４０ｍＭ～８０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４、０．１Ｍ～４Ｍ ＮａＣｌ、および０．００１％～１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む、項目１７～２０のいずれか１つに記載の方法。
項目２２．前記方法が、ダイレクトフローセルローディングジグを用いて前記ライブラリーメンバーをフローセル上にロードする工程を含む、項目１７～２１のいずれか１つに記載の方法。
項目２３．項目１～４のいずれか１つに記載のハイブリダイゼーションバッファーを含む、キット。
項目２４．項目１２～１６のいずれか１つに記載のブロッカーを含む、キット。
実施例１－ハイブリダイゼーションおよび捕捉
ハイブリダイゼーション
非強化ハイブリダイゼーションバッファーは、１００μＬのハイブリダイゼーション反応物中に以下の構成要素／最終濃度を含む：ヒトＣｏｔ－１ ０．２ｍｇ／ｍｌ、ホルムアミド １０％（ｖ／ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４ ６６．６ｍＭ、ＮａＣｌ ０．８Ｍ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０ ０．０４％（ｖ／ｖ）。
強化ハイブリダイゼーションバッファーは、１００μＬのハイブリダイゼーション反応物中に以下の構成要素／最終濃度を含む：デキストラン硫酸 １．５％（ｗ／ｖ）、ヒトＣｏｔ－１ ０．２ｍｇ／ｍｌ、ホルムアミド １０％（ｖ／ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４ ６６．６ｍＭ、ＮａＣｌ ０．８Ｍ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０ ０．０４％（ｖ／ｖ）。
各場合において、その１００μＬの最終反応物は、１プローブあたり１２５ｐＭの濃度（少なくとも３０ｎＭの総プローブ濃度）のプローブ（少なくとも５００種のプローブかつ最大５００，０００種のプローブ）、および最大３０μＬ（５０ｎｇ～６μｇ）のＤＮＡサンプルも含む。ブロッカーは、含められる場合、０．２ｍＭで存在する。
ハイブリダイゼーション反応は、サーモサイクラーまたはＨＹＢＥＸシステムにおいて正確な温度制御を用いて行う。９５℃で５分間変性した後、ハイブリダイゼーション反応物を５８℃または６２℃で９０分間（ハイブリダイゼーション時間の合計はおよそ１００分間）または最大２４時間インキュベートする。プローブのデザインに応じて、９５℃から開始して５８℃または６２℃まで１分あたり２℃の勾配（さらに２０分間）の後、５８℃または６２℃でインキュベーションを行うことができる（本明細書中に記載される実験の場合、６２℃でサンプルをインキュベートする）。
捕捉
各１００μＬのハイブリダイゼーション反応物に対して２５０μＬのストレプトアビジンビーズＳＭＢ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、ハイブリダイゼーションインキュベーション温度（例えば、ハイブリダイゼーション反応物を６２℃で９０分間インキュベートする場合、６２℃）において１５分間、標的化ＤＮＡを捕捉する。次いで、標的化ＤＮＡを、洗浄バッファーＥＥＷ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｗａｓｈバッファー，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、デフェロキサミンメシル酸塩（ＤＦＯ）、ベタインおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）２０））を用いて同じ温度（例えば、６２℃）で５分間、合計４回洗浄する。標的化ＤＮＡを、新鮮な変性溶液（０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ＥＥ１）および２Ｎ ＮａＯＨ（ＨＰ３））を用いて溶離し、ＥＴ２（Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔ Ｂｕｆｆｅｒ ２，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｔｒｉｓ塩基、Ｔｒｉｓ酢酸塩））で中和し、プライマーカクテル（ＰＰＣ；５μＭのＰ５およびＰ７プライマーを含む配列決定アダプタープライマーセット，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）およびＥｎｈａｎｃｅｄ ＰＣＲ Ｍｉｘ（ＥＰＭ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてさらに増幅し、０．９×Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）ビーズを用いてクリーンアップする。
実施例２－チミンを含むブロッカー
この実施例では、インデックスおよび／またはＵＭＩに対応するブロッカーの領域にチミンを含むブロッカーを説明する（図３Ｄを参照のこと）。
表３のブロッカーを使用し、強化ハイブリダイゼーションバッファーおよび０．２ｍＭブロッカーを用いて、ハイブリダイゼーションおよび捕捉を、実施例１に記載されたように行う。得られた捕捉ＤＮＡを配列決定し、Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｖ３．０ ＢＡＳＥＳＰＡＣＥ Ａｐｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、Ｐａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを計算する。
インデックス配列の位置に一続きのＴを含むブロッカーは、オンターゲットＤＮＡの捕捉（Ｐａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔによって測定される）を増加させるために、インデックスに対応しないブロッカーの領域に少なくとも８または１０個の修飾ヌクレオチドを必要とする。
インデックス領域に相補的な配列を含むオリゴは、必要な修飾ヌクレオチドがより少なく（８個のヌクレオチドおよび１０個のヌクレオチドを試験した）、より高いＰａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを示した。結果を図４に示す。ブロッカーに同じ数の修飾を含む場合（８または１０個のヌクレオチド）、インデックス領域に相補的な配列を含むブロッカー（最後のバー）が、インデックス領域に一続きのＴを含むブロッカー（図４において「１０個の修飾および（Ｔ）８」とラベルされている）よりも高いＰａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを示した。
実施例３－ユニバーサル塩基および修飾塩基を含むブロッカー
強化ハイブリダイゼーションバッファー中に０．２ｍＭの表４のブロッカーを使用して、ハイブリダイゼーションおよび捕捉を、実施例１に記載されたように行う。表４に示されているように、インデックス領域に対応するブロッカーの領域は、ユニバーサル塩基（デオキシイノシン）およびＬＮＡ修飾グアニンまたはランダムヌクレオチドを含む。
理論に拘束されることを望むものではないが、修飾Ｇまたはランダムヌクレオチドを、インデックス領域に対応するブロッカー配列の２塩基おき（例えば、図５における１つの実施形態に示されているようにインデックス領域に対応するブロッカー配列の（５’末端から）３番目および／もしくは５番目の位置、またはインデックス領域に対応するブロッカー配列の２番目および／もしくは４番目の位置）に含めることにより、ライブラリーメンバーに対するブロッカーの親和性が改善すると考えられている。
実施例４－スプリットブロッカー
この実施例では、スプリットＬＮＡブロッカーが、８ヌクレオチドインデックスを含んだライブラリーを用いたときうまく機能することを示す。
表５のブロッカーを使用し、強化ハイブリダイゼーションバッファーを用いて、ハイブリダイゼーションおよび捕捉を、実施例１に記載されたように行う。表５に示されているように、ブロッカーＴｉＬＮＡＳ１（ＢＮ０２５）、ＴｉＬＮＡＳ２（ＢＮ０２６）、Ｐ５ＬＮＡ（ＢＮ０２３）およびＰ７ＬＮＡ（ＢＮ０２４）は、インデックス領域に対応する領域を含まない。Ｐ５ＬＮＡ（ＢＮ０２３）およびＰ７ＬＮＡ（ＢＮ０２４）はそれぞれ、８つのＬＮＡ修飾塩基を含む。ＴｉＬＮＡＳ１（ＢＮ０２５）およびＴｉＬＮＡＳ２（ＢＮ０２６）はそれぞれ、１０個のＬＮＡ修飾塩基を含む。ＴｉＬＮＡ１７（ＢＮ０２７）およびＴｉＬＮＡ１８（ＢＮ０２８）は、インデックス領域に対応するブロッカーの領域にユニバーサル塩基（デオキシイノシン）を含むが、アダプターの他の領域に対応するブロッカーの領域が短縮されている。
得られた捕捉ＤＮＡを配列決定し、Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｖ３．０ ＢＡＳＥＳＰＡＣＥ Ａｐｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、Ｐａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを計算する。ブロッカーの図を図６Ａおよび図３Ｅ～図３Ｉに示し、結果を図６Ｂに示す。サンプル「スプリット４ｐｃ」は、表５のＴｉＬＮＡＳ１（ＢＮ０２５）、ＴｉＬＮＡＳ２（ＢＮ０２６）、Ｐ５ＬＮＡ（ＢＮ０２３）およびＰ７ＬＮＡ（ＢＮ０２４）を含み；サンプル「Ｉｎｎｅｒ」は、表５中のＴｉＬＮＡＳ１（ＢＮ０２５）およびＴｉＬＮＡＳ２（ＢＮ０２６）を含み；サンプル「Ｏｕｔｅｒ」は、表５中のＰ５ＬＮＡ（ＢＮ０２３）およびＰ７ＬＮＡ（ＢＮ０２４）を含み；サンプルＳｈｏｒｔ８ｎｔは、表５中のＴｉＬＮＡ１７（ＢＮ０２７）およびＴｉＬＮＡ１８（ＢＮ０２８）を含む。ＢＮ０２３、ＢＮ０２４、ＢＮ０２５およびＢＮ０２６を含む２つの２ピースブロッカー（「スプリットブロッカー」）は、Ｐａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔによって測定したとき、ＸＧＥＮ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）と同様に機能し、アダプターの一部のみを阻止したブロッカーを用いる実験は、同様にうまく機能することはない。
実施例５－ハイブリダイゼーションバッファー
この実施例では、非強化ハイブリダイゼーションバッファーおよび強化ハイブリダイゼーションバッファーを使用したオンターゲット捕捉の比較を示す。
ＸＧＥＮ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）、および図７Ａに示されているデキストラン硫酸濃度を有する強化ハイブリダイゼーションバッファーを用いて、ハイブリダイゼーションおよび捕捉を、実施例１に記載されたように行う。得られた捕捉ＤＮＡを配列決定し、Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｖ３．０ ＢＡＳＥＳＰＡＣＥ Ａｐｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、Ｐａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを計算する。結果を図７Ａに示す。デキストラン硫酸を含めることにより、高体積（１００μＬ）のハイブリダイゼーションバッファーにおいて迅速なハイブリダイゼーション（６０分間～９０分間）が可能になる。
１００μＬのハイブリダイゼーションバッファー体積を用いた富化を、４つの異なるプローブパネル：Ｃｏｄｉｎｇ Ｅｘｏｍｅ Ｏｌｉｇｏｓ（ＣＥＸ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＩＤＴ Ｅｘｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｎｅｌ（ＩＤＴ Ｅｘｏｍｅ）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）、ＴＲＵＳＩＧＨＴ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌ（Ｃａｎｃｅｒ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＴＲＵＳＩＧＨＴ Ｏｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐａｎｅｌ（ＴＳＯ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて評価する。３つのハイブリダイゼーションバッファー：ＸＧＥＮ ＬＯＣＫＤＯＷＮキット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）のＩＤＴバッファー、ならびに実施例１に記載されたようなデキストラン硫酸を含むおよび含まないハイブリダイゼーションバッファーにおいてハイブリダイゼーションを試験する。結果を図７Ｂに示す。強化ハイブリダイゼーションバッファーは、４つすべてのプローブパネル（４，０００～４５０，０００種に及ぶプローブ）に対して、ＩＤＴバッファーと比べて、類似またはより高いオンターゲット結果をもたらす。
４つのパネル（ＣＥＸ、ＩＤＴ Ｅｘｏｍｅ、ＣａｎｃｅｒおよびＴＳＯ）に対して２つの重要な富化測定基準（Ｐａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔおよびカバレッジ均一性）を、種々のハイブリダイゼーションインキュベーション時間において、さらなる温度勾配工程ありおよびなしで、ＩＤＴ ＸＧＥＮブロッカーを含むＩｌｌｕｍｉｎａ強化ハイブリダイゼーションバッファーを使用して、得る。結果を図７Ｃに示す。左のパネルの黒色の点線は、デキストラン硫酸を含まないバッファーにおけるハイブリダイゼーションの結果を示している。
１２プレックスのライブラリーインプットの３つのランを体積が合計３０μＬになるようにプールし、ＩＤＴ ＸＧＥＮブロッカーを含むＩｌｌｕｍｉｎａ強化ハイブリダイゼーションバッファーを用いて富化する。サンプルをＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．の様々な配列決定装置（ＮＯＶＡＳＥＱ、ＮＥＸＴＳＥＱおよびＩＳＥＱ）にかける。サンプル濃縮工程は必要ない。結果を図７Ｄ～７Ｆに示す。結果は、デキストラン硫酸を含む強化ハイブリダイゼーションバッファーを用いたとき、１つのハイブリダイゼーション反応において最大３０μＬのサンプルが収容され得ることを示している（例えば、単一の１５μＬのサンプルまたは各２．５μＬでの１２プレックスのラン）。強化ハイブリダイゼーションバッファーを使用すれば、プールの体積をさらに小さくするためにスピードバキューム（ｓｐｅｅｄ ｖａｃｕｕｍ）、遠心分離カラムまたはＳＰＲＩビーズを使用することなく、１つの反応において最大１２個のサンプルを富化することができる。
実施例６－改良型アダプター＋強化ハイブリダイゼーションバッファー
ＩＤＴエクソームパネル（Ｃａｔ＃１０５６１１４、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）の富化性能を、（１）ＸＧＥＮ ＬＯＣＫＤＯＷＮキット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）のＩＤＴバッファー（１７μＬ）；（２）小（１１μＬ）反応体積中に非強化アダプターブロッカー（表２におけるＮＥＸＴＥＲＡ Ｂｌｏｃｋｅｒ１ ｉ５（ＢＮ００１）およびＮＥＸＴＥＲＡ Ｂｌｏｃｋｅｒ２ ｉ７（ＢＮ００２））を含む非強化ハイブリダイゼーションバッファー（ＴｉＥ０）；（３）小（１１μＬ）反応体積中に強化アダプターブロッカー（ＸＧＥＮブロッカー）を含む非強化ハイブリダイゼーションバッファー（ＴｉＥ３）；（４）大（１００μＬ）反応体積中に強化アダプターブロッカー（ＸＧＥＮブロッカー）を含む非強化ハイブリダイゼーションバッファー（ＴｉＥ４）；および（５）大（１００μＬ）反応体積中に強化アダプターブロッカー（ＸＧＥＮブロッカー）を含む強化ハイブリダイゼーションバッファー（ＴｉＥ９）を用いて試験する。結果を図８Ａに示し、その結果は、修飾ブロッカー、洗浄温度上昇、および／またはハイブリダイゼーションバッファー中にクラウディング剤（デキストラン硫酸）を用いると、富化性能が改善されることを実証している。
富化性能（Ｐａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを用いて測定される）を、９つのプローブパネルにおいて、ＩＤＴ富化アッセイ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１０８０５８４，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を使用して、および強化ハイブリダイゼーションバッファーを用いるＩｌｌｕｍｉｎａ富化アッセイにおいて、評価する。様々なプローブパネル（５００～４５０，０００種のプローブ）を含む１００μＬの反応体積において、高Ｐａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ
Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔが達成される。プローブパネルとしては、（１）ＸＧＥＮ Ｅｘｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｎｅｌ（ＩＤＴ Ｅｘｏｍｅ）（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１０５６１１４，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）；（２）Ｔｗｉｓｔ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｅ Ｅｘｏｍｅ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１００２５４）；（３）Ｃｏｄｉｎｇ Ｅｘｏｍｅ Ｏｌｉｇｏｓ（ＣＥＸ）（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１５０３４５７５，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；（４）ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｏｎｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＦＣ－１４１－１００７；Ｐｒｏｂｅ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１５０４６６５８）；（５）ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｏｎｅ Ｅｘｐａｎｄｅｄ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＦＣ－１４１－２００７；Ｐｒｏｂｅ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２００１５６５６）；（６）ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｃａｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＦＣ－１２１－０２０２；Ｐｒｏｂｅ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１５０３５６４２）；（７）ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｃａｒｄｉｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＦＣ－１４１－１０１０；Ｐｒｏｂｅ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１５０６９６５４）；（８）ＴｒｕＳｉｇｈｔ ＲＮＡ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐａｎｅｌ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２００００９０６）；（９）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｐｏｏｌ（ＯＰＤ１）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＯＰ－１０１－１００４；Ｐｒｏｂｅ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２０００１５６５）が挙げられる。結果を図８Ｂに示す。白色のバー（カラム１）は、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｒａｐｉｄ
Ｃａｐｔｕｒｅライブラリー調製物（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いたＩＤＴロックダウン富化ワークフローにおけるＩＤＴエクソームパネルの性能を示している。灰色のバーは、強化ハイブリダイゼーションバッファーおよびＩＤＴ ｘＧＥＮアダプターブロッカーとともにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ
Ａｓｓａｙを用いたときのパネルの性能を示している。黒色の横線は、Ｔｗｉｓｔ富化アッセイ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）（カラム３）、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｒａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅライブラリー調製物（カラム４～８）、またはＯＰＤ１パネルとともにＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｔｕｍｏｒ １７０ワークフロー（カラム１０）を用いて、対応するパネルで得られた比較結果を示している。強化ハイブリダイゼーションバッファーを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｓｓａｙにおける各パネルの性能を少なくとも３回の独立した実験において評価する；エラーバーは、標準偏差を示す。
Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ＨＤ７０１定量的マルチプレックス（ＱＭ）ＤＮＡ標準物質から生成されたライブラリーを富化するために１２遺伝子５３５プローブのパネルに対して強化ハイブリダイゼーションバッファーおよびＸＧＥＮブロッカーを用いる単一ハイブリダイゼーション富化プロトコルによって、体細胞バリアントを検出する。図８Ｃに示されているデータは、コールされたバリアント頻度（ｙ軸）に対するバリアント頻度の期待値（ｘ軸）を示している。図８Ｃにおける各パネルは、種々の濃度の高親和性アダプターブロッカー（ＩＤＴ ＸＧＥＮアダプターブロッカー、０．１×（０．０２ｍＭ）および０．５×（０．１ｍＭ）およびネガティブコントロール（高親和性アダプターブロッカーなし）を表している。各点は、リードデプスによって色付けされた体細胞バリアントのコールを表している。赤色の破線は、既知のバリアント頻度とコールされたバリアント頻度との間の完璧な相関関係の予測値を表している。青色および灰色の陰影は、既知のバリアント頻度と比較したときのコールされたバリアント頻度に対する、それぞれ最適直線および９５％信頼区間を表している。バリアント頻度の期待値（ｘ軸）は、ＩＤＴ
ＸＧＥＮアダプターブロッカー（０．１×（０．０２ｍＭ）、０．５×（０．１ｍＭ））に対する既知の（コールされた）バリアント頻度（ｙ軸）と相関するが、ネガティブコントロール（高親和性アダプターブロッカーなし））とは相関しない。
実施例７Ａ－ＴＲＵＳＥＱアダプターライゲート済みライブラリーを用いたＰＣＲなしのハイブリッド捕捉
この実施例では、ＰＣＲなしのハイブリッド捕捉を示す。
以下の改変を行いつつパッケージの指示書に従って、ＸＧＥＮ ＬＯＣＫＤＯＷＮ試薬（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を用いてハイブリダイゼーションを行う。標的化ＤＮＡを、ＴＲＵＳＥＱアダプターライゲーションアプローチを用いて作製し、１００μＬのＤＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｍ－２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を用いて捕捉する。このハイブリダイゼーションは、推奨されている４時間の代わりに３０分間だけインキュベートする。次いで、以下のプロトコルに従う：
１．ビーズを１０μＬの０．１Ｎ ＮａＯＨとインキュベートし、捕捉されたライブラリーをプローブから変性させ、溶液中に放出する。
２．捕捉されたライブラリー溶液をビーズから取り出し（磁石を用いて）、１０μＬの２００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．０で中和する。
３．（必要に応じて）変性させたＰｈｉＸ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）をサンプルに、最大７．５μＬの再懸濁バッファー（ＲＳＢ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加える。
４．２７．５ｕＬの２×ＨＴ１（ハイブリダイゼーションバッファー、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加える。
得られたサンプル（５５μＬの１×ＨＴ１バッファー中）を、例えば、２０１７年９月２８日出願の米国特許仮出願第６２／５６４，４６６に記載されているように、ピペットまたはフローセルローディングジグを用いてフローセル上に直接ロードする。結果を表６Ａに示す。コントロール（カラム１）は、捕捉の後にＰＣＲを行うことを除いてはＰＣＲなしの方法と同じ条件を用いて行う。ＰＣＲなしの富化を行う最初の試みが、カラム２に示されており、これは、リードが少なすぎて、エクソームに対して許容され得るカバレッジレベルに到達できなかったことを示している。目標は、約５０×を超えることであったのに対して、約１８×という平均標的カバレッジしか達成されなかった。第２の試み（カラム３）の場合は、ダイレクトフローセルローディングジグを使用し、ハイブリダイゼーションへのＤＮＡ投入量を増加させたことにより、ＰＣＲなしの富化方法の配列決定率が、約４０×の目標より遙かに高い約１４０×に改善されたことを示している。ＰＣＲなしのデータを７０００万リードにダウンサンプリングすることにより（カラム４）、コントロールに類似（またはコントロールよりも優れた）測定基準がもたらされる。
実施例７Ｂ－ビーズベースのＮＥＸＴＥＲＡライブラリーを用いたＰＣＲなしのハイブリッド捕捉により、短いハイブリダイゼーション時間でエクソーム品質が改善される
実施例７Ａと類似の条件を用いるが、ビーズベースのタグメンテーションライブラリー調製法および対応するブロッキングオリゴヌクレオチドを用いて生成されたライブラリーを用いて、コントロール実験を行う。この実験では、ハイブリダイゼーションの持続時間とＰＣＲ増幅の両方が変数となる。フローセルへの直接のロードを行わず、ＮＥＸＴＳＥＱ装置を使用した配列決定を行い、捕捉後にＰＣＲを行う推奨の４時間のハイブリダイゼーション反応プロトコル（合計７．５時間、ＩＤＴ ＸＧＥＮプロトコルを参照のこと）を、コントロール（このワークフローの概略図を図９Ｂに示す）として用い、たった３０分間のハイブリダイゼーション（捕捉後のＰＣＲありおよびなし）およびフローセルへの直接のロードを用いる２つの条件と比較する（図９Ｃ）。ハイブリダイゼーションの持続時間を短縮し、ＰＣＲを無くすことにより、富化プロトコルがたった約２時間で行うことができる。ハイブリダイゼーション時間を短縮し、ＰＣＲを行わないこのワークフローの概略図を図９Ｄに示す。
結果を表６Ｂに示す。すべてのデータを約２３００万クラスターまでダウンサンプリングする。第１のカラム（コントロール）において、データは、良好な品質のエクソームを示しているが、これは約７．５時間という長いワークフローを用いている。ハイブリダイゼーションを３０分にまで短縮すると、プロトコルの持続時間は、合計約４時間にまで短くなる（カラム２）。しかしながら、コントロールと比較して、ＰＣＲ複製物の数が増える。ＰＣＲ複製物が増えると、ライブラリーの多様性も低下し、約２０×における対応するカバレッジも下がる。３０分間のワークフローからＰＣＲを無くすと（カラム３）、ＰＣＲ複製物がかなり減少し、コントロールを超えるレベルにまで多様性が増し、ワークフローが大幅に短くなる（７．５時間に対して２時間）。この実施例は、ＰＣＲを無くすことにより、ＰＣＲ中に鋳型が複製されるのを最小限に抑えることによってハイブリダイゼーション捕捉反応物の品質を改善できることを強調している。

実施例８－ブロッカーの比較
強化ハイブリダイゼーションバッファー中に、０．２ｍＭのブロッカーＢＮ００１およびＢＮ００２；ＢＸ００３およびＢＸ００７；ＢＮ００７およびＢＮ００８；ＢＮ００５およびＢＮ００６；またはＢＮ０２３、ＢＮ０２４、ＢＮ０２５およびＢＮ０２６（表２Ａに記載されているように）を用いて、ハイブリダイゼーションおよび捕捉を、実施例１に記載されたように行う。「非修飾」ブロッカーＢＮ００１およびＢＮ００２は、アダプターのインデックス領域と対応するブロッカーの領域にチミンを、およびアダプターの非インデックス領域と対応するブロッカーの領域に、アダプターに相補的な塩基を含む。ブロッカーＢＮ００１およびＢＮ００２は、修飾塩基を含まず、３’－ｄｄＣ末端基を含む。ブロッカーＢＸ００３およびＢＸ００７は、各々が、アダプターの非インデックス領域と対応するブロッカーの領域に２つのＡＰ－ｄＣ－ＣＥホスホルアミダイト（Ｇ－Ｃｌａｍｐ）置換を有する、ＢＮ００１およびＢＮ００２の修飾バージョンである。ブロッカーＢＮ００７およびＢＮ００８は、アダプターのインデックス領域と対応するブロッカーの領域にユニバーサル塩基（デオキシイノシン）を有し、アダプターの非インデックス領域と対応するブロッカーの領域にＢＮＡ修飾塩基を有する、ＢＮ００１およびＢＮ００２の修飾バージョンである。ブロッカーＢＮ０２３およびＢＮ０２５は、アダプターの非インデックス領域と対応するＢＮ００１の領域の修飾バージョンであり、ＬＮＡ修飾塩基を含み、これらのブロッカーは、３’－ｄｄＣの代わりに３’－スペーサーＣ３も含む。ブロッカーＢＮ０２４およびＢＮ０２６は、アダプターの非インデックス領域と対応するＢＮ００２の領域の修飾バージョンであり、ＬＮＡ修飾塩基を含み、これらのブロッカーは、３’－ｄｄＣの代わりに３’－スペーサーＣ３も含む。
得られた捕捉ＤＮＡを配列決定し、捕捉されたオンターゲットＤＮＡの量の尺度であるＰａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを計算する。結果を図１０に示し、その結果は、「非修飾」ブロッカーの様々な修飾により、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるＰａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔが改善されることを示している。
実施例９－スプリットブロッカーの比較
強化ハイブリダイゼーションバッファー中に０．２ｍＭ ＢＮ００１およびＢＮ００２；またはＢＮ０２３、ＢＮ０２４、ＢＮ０２５およびＢＮ０２６（表２Ａに記載されているような）を用いて、ハイブリダイゼーションおよび捕捉を、実施例１に記載されたように行う。対応するアダプターは、８ヌクレオチドインデックスまたは１０ヌクレオチドインデックスを含む。得られた捕捉ＤＮＡを配列決定し、Ｐａｄｄｅｄ Ｒｅａｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを計算する。結果を図１１に示し、その結果は、「スプリットブロッカー」（すなわち、アダプターのインデックス領域と対応する塩基を含まないブロッカー）を使用することにより、それらのブロッカーを、様々なインデックス配列およびインデックス長を有するアダプターとともに使用できることを示している。これらの結果は、インデックスのデザインの変更に適応することが不利になり得る状況ではスプリットブロッカーが使用され得ることを示している。
本明細書に引用されたすべての特許、特許出願および刊行物ならびに電子的に入手可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列登録、ならびに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列登録、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける注釈つきコード領域からの翻訳物など）の全開示が、参照により援用される。本願の開示と、参照により本明細書中に援用される任意の書類の開示との間に不一致が存在する場合、本願の開示が規定するものとする。前述の詳細な説明および実施例は、単に理解を明確にするために提供された。それらから不必要な限定が理解されてはならない。本発明は、請求項によって定義される本発明の範囲内に含められる当業者に明白なバリエーションについて、示されるおよび記載される厳密な詳細に限定されない。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
クラウディング剤と、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、不安定化剤、塩およびブロッカーのうちの少なくとも１つとを含むハイブリダイゼーションバッファー。
（項目２）
前記クラウディング剤が、デキストラン、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール、グリセロールおよびベタインのうちの少なくとも１つを含む、項目１に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
（項目３）
クラウディング剤およびブロッカーを含む、項目１または項目２に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
（項目４）
クラウディング剤、ヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、ブロッカー、不安定化剤、バッファー、塩および界面活性剤を含む、項目１または項目２に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
（項目５）
前記ハイブリダイゼーションバッファーが、バッファーを含み、前記バッファーは、リン酸バッファーである、項目１～４のいずれか１項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
（項目６）
前記ハイブリダイゼーションバッファーが、塩を含み、前記塩は、ＮａＣｌまたはクエン酸ナトリウムである、項目１～５のいずれか１項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
（項目７）
前記ハイブリダイゼーションバッファーが、不安定化剤を含み、前記不安定化剤は、ホルムアミドもしくは尿素またはそれらの混合物である、項目１～６のいずれか１項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
（項目８）
前記ハイブリダイゼーションバッファーが、界面活性剤を含み、前記界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、項目１～７のいずれか１項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
（項目９）
前記ハイブリダイゼーションバッファーが、
０．５％～１０％デキストラン硫酸、
０．０５ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬヒトＣｏｔ－１ＤＮＡ、
１％～１５％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、
４０ｍＭ～８０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４、
０．１Ｍ～４Ｍ ＮａＣｌ、および
０．００１％～１０％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０
を含む、項目１に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
（項目１０）
前記ハイブリダイゼーションバッファーが、ブロッカーを含み、前記ブロッカーは、
（ａ）Ｔｍを高める複数の修飾；
（ｂ）架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン（５－メチル－ｄｃ）；２，６－ジアミノプリン；ロック核酸（ＬＮＡ）；架橋型核酸（ＢＮＡ）；三環式核酸；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；Ｃ５修飾ピリミジン塩基；プロピニルピリミジン；モルホリノ；ホスホルアミダイト；および５’－ピレンキャップのうちの少なくとも１つを含む前記ブロッカーのＴｍを上昇させる複数の修飾；
（ｃ）オリゴヌクレオチドであって、ここで、前記ブロッカーは、アダプターに結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み；前記アダプターの前記インデックス領域および／またはＵＭＩに結合することができる前記ブロッカーの前記領域は、少なくとも３つのチミン塩基、少なくとも４つのチミン塩基、少なくとも５つのチミン塩基、少なくとも６つのチミン塩基、少なくとも７つのチミン塩基、少なくとも８つのチミン塩基、少なくとも９つのチミン塩基もしくは少なくとも１０個のチミン塩基；またはユニバーサル塩基および少なくとも１つの非ユニバーサル塩基を含む、オリゴヌクレオチド；または
（ｄ）接続されていない２つのオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記ブロッカーは、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列とインデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み；前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、前記アダプターの前記インデックス領域および／または前記ＵＭＩに対応しない塩基を含む、接続されていない２つのオリゴヌクレオチド
のうちの少なくとも１つを含む、項目１～９のいずれか１項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
（項目１１）
富化ライブラリーを調製する方法であって、前記方法は、ハイブリダイゼーション混合物を形成するために、ライブラリーメンバー、項目１～１０のいずれか１項に記載のハイブリダイゼーションバッファーおよびプローブを含むハイブリダイゼーション混合物を、前記プローブがライブラリーメンバー内の目的の領域にハイブリダイズするのに十分な条件下で形成する工程を含み、ここで、前記プローブは、リガンドを含む、方法。
（項目１２）
ハイブリダイズした後の前記プローブを、捕捉手段を用いて捕捉する工程、および
捕捉されたライブラリーメンバーを前記捕捉手段から富化ライブラリーメンバーを含む溶離液に溶離する工程であって、ここで、前記溶離液のＤＮＡ濃度は、１．３ｐＭ～２５０ｐＭの範囲内である、工程
を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ハイブリダイゼーション混合物が、少なくとも２つのライブラリー調製物由来のサンプルを含み、ここで、各ライブラリー調製物の少なくとも１０ｎｇ、少なくとも２５ｎｇ、少なくとも５０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも２００ｎｇまたは少なくとも５００ｎｇのＤＮＡが合わせられている、項目１１または項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ハイブリダイゼーション混合物のＤＮＡ濃度が、０．１ｎｇ／μＬ～１２０ｎｇ／μＬの範囲内である、項目１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記富化ライブラリーメンバーを配列決定する工程を含み、前記方法は、前記ライブラリーメンバーを捕捉する工程の前に前記ライブラリーメンバーを増幅する工程を含まない、項目１１～１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記配列決定する工程が、フローセル上で行われ、前記方法が、前記富化ライブラリーメンバーを少なくとも１．１ｐＭ、少なくとも１．２ｐＭ、少なくとも１．３ｐＭ、少なくとも１０ｐＭまたは少なくとも１００ｐＭの濃度かつ最大１００ｐＭ、最大２００ｐＭ、最大２５０ｐＭまたは最大３００ｐＭの濃度で前記フローセルにロードする工程を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
ダイレクトフローセルローディングジグを用いて、前記富化ライブラリーメンバーをフローセル上にロードする工程を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
項目１～１０のいずれか１項に記載のハイブリダイゼーションバッファーおよび使用説明書を含む、キット。
（項目１９）
オリゴヌクレオチドを含むブロッカーであって、前記ブロッカーは、アダプターに結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み、前記アダプターの前記インデックス領域および／またはＵＭＩに結合することができる前記ブロッカーの前記領域は、少なくとも３つのチミン塩基、少なくとも４つのチミン塩基、少なくとも５つのチミン塩基、少なくとも６つのチミン塩基、少なくとも７つのチミン塩基、少なくとも８つのチミン塩基、少なくとも９つのチミン塩基もしくは少なくとも１０個のチミン塩基；またはユニバーサル塩基および少なくとも１つの非ユニバーサル塩基を含む、ブロッカー。
（項目２０）
接続されていない２つのオリゴヌクレオチドを含むブロッカーであって、前記ブロッカーは、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）のうちの少なくとも１つとを含み、前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、前記アダプターの前記インデックス領域および／または前記ＵＭＩに対応しない塩基を含む、ブロッカー。
（項目２１）
前記ユニバーサルプライマー配列が、Ｐ５、Ｐ７、Ｐ５’、Ｐ７’、Ｖ２．Ａ１４．ＭＥＴＳ、Ｖ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳ、Ｖ２．Ａ１４．ＭＥＴＳの相補鎖およびＶ２．Ｂ１５．ＭＥＴＳの相補鎖のうちの少なくとも１つを含む、項目１９または項目２０に記載のブロッカー。
（項目２２）
前記ブロッカーが、修飾を含まない同じブロッカーと比べて前記ブロッカーのＴｍを上昇させる修飾を含む、項目１９～２１のいずれか１項に記載のブロッカー。
（項目２３）
前記ブロッカーが、低ＧＣ領域を捕捉するように修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド；架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン（５－メチル－ｄｃ）；２，６－ジアミノプリン；ロック核酸（ＬＮＡ）；架橋型核酸（ＢＮＡ）；三環式核酸；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；Ｃ５修飾ピリミジン塩基；プロピニルピリミジン；モルホリノ；ホスホルアミダイト；および５’－ピレンキャップのうちの少なくとも１つを含む、項目１９～２２のいずれか１項に記載のブロッカー。

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  1. 明細書に記載の発明。
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