JP2024081796A

JP2024081796A - 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法

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Publication number: JP2024081796A
Application number: JP2024062119A
Authority: JP
Inventors: ベンソンマイカ; Benson Micah; マーキンジェイソン; J Merkin Jason; ブイ．クリュコフグレゴリー; V Kryukov Gregory; マーティンシェンカーソロモン; Martin Shenker Solomon; シュラバックマイケル; Schlabach Michael; トゥボノア; Tubo Noah; マーティンカベルナザセカンドジェイムズ; Martin Kaberna Ii James
Original assignee: KSQ Therapeutics Inc
Current assignee: KSQ Therapeutics Inc
Priority date: 2018-03-15
Filing date: 2024-04-08
Publication date: 2024-06-18
Also published as: EP3765092A4; BR112020018620A2; WO2019178420A1; US11459544B2; CA3093915A1; CN112040986A; KR20200133219A; US20190284530A1; US20220267727A1; JP2021518160A; US12084682B2; EP3765092A1; US20230340411A1; AU2019234926A1; US12123021B2; US20220220442A1; US11261428B2

Abstract

【課題】免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法の提供。【解決手段】本開示は、免疫エフェクター細胞を改変して、治療有効性を向上させることに関する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させるか、または内在性タンパク質の１つ以上の機能を低下させて、免疫細胞のエフェクター機能が増強されるように改変した免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のように、抗原特異性を付与する導入遺伝子を導入することによってさらに改変した免疫エフェクター細胞を提供する。本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を用いて、がんのような細胞増殖性障害を治療する方法も提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／６４３，５７８号、２０１８年６月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／６９２，０１０号、２０１８年１１月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／７６８，４２８号、２０１８年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／６４３，５８４号、２０１８年６月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／６９２，０１６号、２０１８年１１月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／７６８，４４１号、２０１９年１月９日に出願された米国特許仮出願第６２／７９０，１７９号、２０１９年２月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／８０４，２６１号、２０１８年９月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／７３６，１８５号、及び２０１９年１月９日に出願された米国特許仮出願第６２／７９０，１９２号に対する優先権を主張するものであり、これらの仮出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

電子的に提出したテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出したテキストファイル、すなわち、配列表のコンピューター可読形式のコピー（ファイル名：ＫＳＱＴ＿００６＿０５ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１９年３月１４日、ファイルサイズ２６６キロバイト）の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

分野
本開示は、標的核酸配列を編集するか、または標的核酸配列の発現を調節するための方法、組成物及び構成成分、ならびに、細胞増殖性疾患、炎症性疾患及び／または感染症の治療において、受容体導入免疫エフェクター細胞とともに使用する用途を含め、それらの免疫療法関連用途に関するものである。

遺伝子改変Ｔ細胞、特にＣＡＲ－Ｔ細胞を利用する養子細胞移入は、固形悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍に対する療法として、臨床試験段階に入っている。これまでの成果は、まちまちである。血液悪性腫瘍（特に、リンパ腫、ＣＬＬ及びＡＬＬ）では、いくつかの第１相試験及び第２相試験の患者の大半で、少なくとも部分奏効が見られ、一部では、完全奏効が見られた（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒｅｔａｌ．，２０１２Ｂｌｏｏｄ１１９，２７０９－２７２０）。２０１７年には、ＦＤＡは、Ｋｙｍｒｉａｈ（商標）及びＹｅｓｃａｒｔａ（商標）という２つのＣＡＲ－Ｔ療法剤を認可し、両方とも、血液癌の治療用であった。しかしながら、大半の種類の腫瘍（メラノーマ、腎細胞癌及び大腸癌を含む）では、血液悪性腫瘍よりも低い奏効が観察された（Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．，２００９Ｂｌｏｏｄ１１４，５３５－５４６、Ｌａｍｅｒｓｅｔａｌ．，２０１３Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１，９０４－９１２、Ｗａｒｒｅｎｅｔａｌ．，１９９８ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．５，Ｓ１－Ｓ２）。したがって、成果は大方、Ｂ細胞系の血液悪性腫瘍を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞のアプローチに限定されているので、養子Ｔ細胞療法には、改良の余地がかなりある。

Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒｅｔａｌ．，２０１２Ｂｌｏｏｄ１１９，２７０９－２７２０Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．，２００９Ｂｌｏｏｄ１１４，５３５－５４６Ｌａｍｅｒｓｅｔａｌ．，２０１３Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１，９０４－９１２Ｗａｒｒｅｎｅｔａｌ．，１９９８ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．５，Ｓ１－Ｓ２

上記の種類の腫瘍（メラノーマ、腎細胞癌及び大腸癌、Ｙｏｎｇ，２０１７，ＩｍｍＣｅｌｌＢｉｏｌ．，９５：３５６－３６３）では、奏効の低下が観察されたことから、がん治療での改変免疫細胞の養子移入の有効性を向上させるニーズ、特に、固形悪性腫瘍に対する養子細胞療法の有効性を向上させるニーズが存在する。加えて、養子移入の有益性が観察された血液悪性腫瘍でも、すべての患者が奏効を示すわけではなく、おそらくは、養子移入Ｔ細胞の機能の低下により、望ましい頻度を上回る頻度で再発が見られる。
がん治療剤としての遺伝子改変免疫細胞の有効性を制限する要因としては、（１）細胞の増殖性、例えば、養子移入後のＴ細胞の限られた増殖、（２）細胞の生存性、例えば、腫瘍環境における因子によるＴ細胞のアポトーシスの誘発、ならびに（３）細胞の機能、例えば、宿主免疫細胞及びがん細胞によって分泌される抑制因子による、細胞傷害性Ｔ細胞の機能の阻害と、製造プロセス中及び／または移入後における免疫細胞の疲弊が挙げられる。

免疫細胞の抗腫瘍作用を向上させると考えられる具体的な特徴としては、細胞が、１）養子移入後に、宿主内で増殖する能力、２）腫瘍に浸潤する能力、３）宿主内に存続し、及び／または免疫細胞の疲弊に対する耐性を示す能力、ならびに４）腫瘍細胞を殺傷できる形で機能する能力が挙げられる。本開示は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された免疫細胞を提供し、その改変免疫細胞では、増殖性の向上、腫瘍への浸潤性の向上、対象における免疫細胞の存続、及び／または免疫細胞の疲弊に対する耐性の向上を含め、１つ以上のエフェクター機能の増強が見られる。本開示は、免疫エフェクター細胞を改変して、腫瘍細胞に対する免疫細胞活性の増強を誘導するための方法及び組成物、ならびに養子免疫細胞移入療法との関連で使用するのに適する方法及び組成物も提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、または（ｂ）ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１からなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞を提供し、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１からなる群から選択した２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞を提供し、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群から選択され、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、または（ｂ）ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１からなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１からなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１及びＢＣＯＲの発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＡＮＫＲＤ１１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＡＮＫＲＤ１１及びＢＣＯＲの発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＡＮＫＲＤ１１及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＡＮＫＲＤ１１及びＳＯＣＳ１の発現及び／または機能を低下させることができる。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）１つ以上の核酸分子、（ｉｉ）１つ以上の酵素タンパク質または（ｉｉｉ）１つ以上のガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択されている。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号１５４～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＡＮＫＲＤ１１であり、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含むとともに、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢである。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つはＣＢＬＢ、ＴＮＦＡＩＰ３またはＢＣＯＲである。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢである。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ、ＴＮＦＡＩＰ３またはＢＣＯＲである。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢである。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ、ＴＮＦＡＩＰ３またはＢＣＯＲである。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１である。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、酵素タンパク質を含み、その酵素タンパク質は、その内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含み、その核酸分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、その酵素タンパク質は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、そのｇＲＮＡ分子は、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、そのｇＲＮＡ分子は、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、そのｇＲＮＡ分子は、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＡＮＫＲＤ１１であり、そのｇＲＮＡ分子は、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、複数のｇＲＮＡ分子を含むとともに、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢである。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つはＣＢＬＢ、ＴＮＦＡＩＰ３またはＢＣＯＲである。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢである。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、ターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ、ＴＮＦＡＩＰ３またはＢＣＯＲである。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢである。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ、ＴＮＦＡＩＰ３またはＢＣＯＲである。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１である。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、Ｃａｓタンパク質を含み、そのＣａｓタンパク質は、酵素活性ドメインを２つ含む野生型Ｃａｓタンパク質であり二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるか、そのＣａｓタンパク質は、酵素活性ドメインを１つ含むＣａｓニッカーゼ変異体であり一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるか、またはそのＣａｓタンパク質は、不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）でありその１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節できる異種タンパク質と結合している。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、その異種タンパク質は、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）及びｍＳｉｎ３４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その１つ以上の内在性標的遺伝子に不活性化変異を導入する。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、その２つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む。いくつかの実施形態では、その欠失は、その２つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、その２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーション、またはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって、免疫エフェクター細胞に導入されている。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド、タンパク質またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＳＯＣＳ１または（ｃ）ＡＮＫＲＤ１１から選択した１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ及びＡＮＫＲＤ１１の発現及び／または機能が低下されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｉｋｚｆ１、Ｉｋｚｆ３、ＧＡＴＡ３、Ｂｃｌ３、Ｔｎｉｐ１、Ｔｎｆａｉｐ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、Ｔｇｆｂｒ１、Ｔｇｆｂｒ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、Ｃｂｌｂ、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｎｒｐ１、Ｈａｖｃｒ２、Ｌａｇ３、Ｔｉｇｉｔ、Ｃｔｌａ４、Ｐｔｐｎ６、Ｐｄｃｄ１及びＢＣＯＲから選択した２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、その２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、その２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、少なくとも１つの標的遺伝子がＣＢＬＢである、改変免疫エフェクター細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、その２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＡＮＫＲＤ１１であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、その２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＡＮＫＲＤ１１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＡＮＫＲＤ１１及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＡＮＫＲＤ１１及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、または（ｂ）ＳＯＣＳ１または（ｃ）ＡＮＫＲＤ１１から選択した１つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１に不活性化変異を含む。

Ｉｋｚｆ１、Ｉｋｚｆ３、ＧＡＴＡ３、Ｂｃｌ３、Ｔｎｉｐ１、Ｔｎｆａｉｐ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、Ｔｇｆｂｒ１、Ｔｇｆｂｒ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、Ｃｂｌｂ、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｎｒｐ１、Ｈａｖｃｒ２、Ｌａｇ３、Ｔｉｇｉｔ、Ｃｔｌａ４、Ｐｔｐｎ６、Ｐｄｃｄ１及びＢＣＯＲから選択した２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＣＢＬＢ遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている改変免疫エフェクター細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、少なくとも１つの標的遺伝子がＣＢＬＢである、改変免疫エフェクター細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１遺伝子及びＴＮＦＡＩＰ３遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＡＮＫＲＤ１１であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子及びＴＮＦＡＩＰ３遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、その２つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む。いくつかの実施形態では、その欠失は、その２つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、その２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子の発現は、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下する。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子の機能は、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下する。

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、その細胞表面に提示された操作免疫受容体をさらに含む。いくつかの実施形態では、その操作免疫受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態では、その操作免疫受容体は、操作ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、その操作免疫受容体は、標的細胞上に発現した抗原に特異的に結合し、その抗原は、腫瘍関連抗原である。

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、免疫活性化分子を発現する外来性導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、その免疫活性化分子は、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、活性化ペプチド、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その抗体またはその結合断片は、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４またはＰＤＣＤ１によってコードされるタンパク質に特異的に結合して、そのタンパク質の機能を阻害する。

いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞。いくつかの実施形態では、そのリンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。

いくつかの実施形態では、そのエフェクター機能は、細胞増殖性、細胞生存能、腫瘍への浸潤性、細胞傷害性、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、その組成物は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、改変免疫エフェクター細胞を少なくとも１×１０^４個、１×１０^５個または１×１０^６個含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、その組成物が必要な対象に投与するのに適している。いくつかの実施形態では、その組成物は、その組成物が必要な対象に由来する自己免疫エフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、ドナー対象に由来する同種異系免疫エフェクター細胞を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素分子、または（ｉｉｉ）ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む遺伝子調節システムを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＳＯＣＳ１、または（ｂ）ＡＮＫＲＤ１１から選択した、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素分子、または（ｉｉｉ）ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む遺伝子調節システムを提供する。

いくつかの実施形態では、そのシステムは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されているか、またはＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、そのｇＲＮＡ分子は、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と相補的であるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されており、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１５４～４９８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１５４～４９８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号４９９～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号４９９～８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択されており、そのｇＲＮＡ分子は、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１を含み、そのｇＲＮＡ分子は、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＡＮＫＲＤ１１を含み、そのｇＲＮＡ分子は、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されているか、またはＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されており、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号１５４～４９８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号４９９～８１３から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択されており、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８１４～１０６４から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１を含み、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号１０８８～１２３２から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＡＮＫＲＤ１１を含み、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号１０６５～１０８７から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＳＯＣＳ１、または（ｂ）ＡＮＫＲＤ１１から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、そのシステムが、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素分子、または（ｉｉｉ）ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む遺伝子調節システムを提供する。

いくつかの実施形態では、このシステムは、複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢである。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢである。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＡＩＰ３である。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＯＲである。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４から選択した標的核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢである。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＡＩＰ３である。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＯＲである。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４から選択した標的核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１である。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２から選択した標的核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、酵素活性ドメインを２つ含み二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質、酵素活性ドメインを１つ含み一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体、その１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）である。いくつかの実施形態では、その異種タンパク質は、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン及びｍＳｉｎ３４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。

いくつかの実施形態では、そのシステムは、核酸分子を含み、その核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのシステムは、複数のｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子を含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢである。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢである。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢである。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１である。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、そのシステムは、ＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含み、そのタンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするベクターを含む遺伝子調節システムであって、その１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０６５～１０８７、配列番号１０８８～１２３２、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、複数のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするベクターを含む遺伝子調節システムであって、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０６５～１０８７及び１０８８～１２３２から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む遺伝子調節システムであって、その１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０６５～１０８７、配列番号１０８８～１２３２、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、複数のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む遺伝子調節システムであって、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０６５～１０８７及び１０８８～１２３２から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を含む遺伝子調節システムであって、その１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０６５～１０８７、配列番号１０８８～１２３２、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その１つ以上のｇＲＮＡと、そのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が複合化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する遺伝子調節システムを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、複数のｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を含む遺伝子調節システムであって、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０６５～１０８７及び配列番号１０８８～１２３２から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その１つ以上のｇＲＮＡと、そのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が複合化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する遺伝子調節システムを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている遺伝子調節システムを含むキットを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ核酸分子であって、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＳＯＣＳ１、（ｃ）ＡＮＫＲＤ１１、（ｄ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｅ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した内在性標的遺伝子内の標的配列と相補的であるターゲティングドメイン核酸配列を含むｇＲＮＡ核酸分子を提供する。

いくつかの実施形態では、その内在性遺伝子は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、そのｇＲＮＡは、表６Ａ及び表６Ｂに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列と相補的であるターゲティングドメイン配列を含むか、その内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、そのｇＲＮＡは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列と相補的であるターゲティングドメイン配列を含むか、その内在性遺伝子は、ＡＮＫＲＤ１１であり、そのｇＲＮＡは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列と相補的であるターゲティングドメイン配列を含むか、その内在性遺伝子は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群から選択されており、そのｇＲＮＡは、表５Ａ及び表５Ｂに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列と相補的であるターゲティングドメイン配列を含むか、またはその内在性遺伝子は、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、そのｇＲＮＡは、表５Ａ及び表５Ｂに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列と相補的であるターゲティングドメイン配列を含む。

いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０８８～１２３２、配列番号１０６５～１０８７、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０８８～１２３２、配列番号１０６５～１０８７、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その標的配列は、ＰＡＭ配列を含む。

いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、モジュラーｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、デュアルｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメインは、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長またはそれを上回るヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、その５’末端またはその５’末端近傍（例えば、その５’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドもしくは１～２ヌクレオチド以内）に改変を含み、及び／またはその３’末端またはその３’末端近傍（例えば、その３’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドまたは１～２ヌクレオチド以内）に改変を含む。いくつかの実施形態では、その改変ｇＲＮＡは、Ｔ細胞に導入すると、ヌクレアーゼに対する安定性が向上する。いくつかの実施形態では、その改変ｇＲＮＡは、Ｔ細胞に導入すると、自然免疫応答が軽減される。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されているｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている１つ以上のｇＲＮＡ分子、またはそのｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されているｇＲＮＡ分子、またはそのｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むキットを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、免疫エフェクター細胞を対象から採取すること、請求項１５７～２４４のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞に導入すること、及びその免疫エフェクター細胞を培養して、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下するようにすることを含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、請求項１５７～２４４のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞に導入することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＡＲ及びＴＣＲから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システム及び／またはその操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチドは、免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列として、タンパク質として、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入する。

いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、免疫エフェクター細胞集団を培養液で増殖させること、及び本明細書に記載されている遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞集団に導入することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その方法は、免疫エフェクター細胞集団を対象から採取することをさらに含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、増殖前、増殖中または増殖後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞集団の増殖は、第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンドの増殖前、第１ラウンドの増殖中または第１ラウンドの増殖後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第２ラウンドの増殖前、第２ラウンドの増殖中または第２ラウンドの増殖後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の前に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンドの増殖後、かつ第２ラウンドの増殖前に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。

いくつかの実施形態では、本開示は、治療の必要な対象の疾患または障害の治療方法であって、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物を有効量投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その疾患または障害は、細胞増殖性障害、炎症性障害または感染症である。いくつかの実施形態では、その疾患または障害は、がんまたはウイルス感染症である。いくつかの実施形態では、がんは、白血病、リンパ腫または固形腫瘍から選択される。いくつかの実施形態では、その固形腫瘍は、メラノーマ、膵臓腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍もしくは肺転移、大腸癌、または頭頸部癌である。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１耐性またはＰＤ１非感受性のがんである。いくつかの実施形態では、その対象は以前に、ＰＤ１阻害剤またはＰＤＬ１阻害剤による治療を受けたことがある。いくつかの実施形態では、その方法は、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４またはＰＤＣＤ１によってコードされるタンパク質に特異的に結合して、そのタンパク質の機能を阻害する抗体またはその結合断片をその対象に投与することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、その対象に対して自家である。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、その対象に対して同種異系である。

いくつかの実施形態では、本開示は、がん細胞の殺傷方法であって、そのがん細胞を、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物に暴露することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その暴露は、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏでの暴露である。

いくつかの実施形態では、本開示は、免疫エフェクター細胞の１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、本明細書に記載されている遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞に導入することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、免疫エフェクター細胞の１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、本明細書に記載されている遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞に導入することを含み、その改変免疫エフェクター細胞において、１つ以上のエフェクター機能が、改変していないその免疫エフェクター細胞と比べて増強される方法を提供する。いくつかの実施形態では、その１つ以上のエフェクター機能は、細胞増殖性、細胞生存能、細胞傷害性、腫瘍への浸潤性、サイトカイン産生の増加、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、または（ｂ）ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１からなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、
前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目２)
前記遺伝子調節システムが、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１からなる群から選択した内在性標的遺伝子のうちの２つ以上の発現及び／または機能を低下させることができる、項目１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目３)
ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、
前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目４)
前記遺伝子調節システムが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した内在性標的遺伝子のうちの２つ以上の発現及び／または機能を低下させることができる、項目３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目５)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目６)
前記遺伝子調節システムがさらに、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、項目１または項目２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目７)
前記遺伝子調節システムが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、項目６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目８)
前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１からなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、項目６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目９)
前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる、項目８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１０)
前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１及びＢＣＯＲの発現及び／または機能を低下させることができる、項目８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１１)
前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能を低下させることができる、項目８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１２)
前記遺伝子調節システムが、ＡＮＫＲＤ１１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる、項目８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１３)
前記遺伝子調節システムが、ＡＮＫＲＤ１１及びＢＣＯＲの発現及び／または機能を低下させることができる、項目８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１４)
前記遺伝子調節システムが、ＡＮＫＲＤ１１及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能を低下させることができる、項目８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１５)
前記遺伝子調節システムが、ＡＮＫＲＤ１１及びＳＯＣＳ１の発現及び／または機能を低下させることができる、項目１または項目２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１６)
前記遺伝子調節システムが、（ｉ）１つ以上の核酸分子、（ｉｉ）１つ以上の酵素タンパク質または（ｉｉｉ）１つ以上のガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む、項目１～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１７)
前記１つ以上の核酸分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択されている、項目１６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１８)
前記遺伝子調節システムが、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含む、項目１６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１９)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目２０)
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号１５４～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目２１)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目２２)
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目２３)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目２４)
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目２５)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目２６)
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目２７)
前記遺伝子調節システムが、複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含むとともに、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、項目１６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目２８)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目２９)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目３０)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２８または２９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目３１)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢである、項目２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目３２)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目３１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目３３)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢ、ＴＮＦＡＩＰ３またはＢＣＯＲである、項目２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目３４)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目３５)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目３４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目３６)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目３５または項目３５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目３７)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢである、項目２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目３８)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目３７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目３９)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢ、ＴＮＦＡＩＰ３またはＢＣＯＲである、項目２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目４０)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目４１)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目４０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目４２)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目４０または項目４１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目４３)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢである、項目２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目４４)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目４２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目４５)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢ、ＴＮＦＡＩＰ３またはＢＣＯＲである、項目２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目４６)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１である、項目２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目４７)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目４６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目４８)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目４６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目４９)
前記遺伝子調節システムが、酵素タンパク質を含み、前記酵素タンパク質が、前記内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている、項目１６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目５０)
前記タンパク質が、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである、項目４９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目５１)
前記遺伝子調節システムが、ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含み、前記核酸分子が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、前記酵素タンパク質が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである、項目１６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目５２)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目５１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目５３)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目５２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目５４)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目５２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目５５)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目５１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目５６)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目５５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目５７)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目５５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目５８)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ｃ及び６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目５１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目５９)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目５８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目６０)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目５８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目６１)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ｅ及び６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目５１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目６２)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目６１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目６３)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目６１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目６４)
前記遺伝子調節システムが、複数のｇＲＮＡ分子を含むとともに、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、項目５１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目６５)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目６６)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目６５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目６７)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目６６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目６８)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目６６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目６９)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢである、項目６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目７０)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目６９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目７１)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目６９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目７２)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢ、ＴＮＦＡＩＰ３またはＢＣＯＲである、項目６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目７３)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目７４)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目７３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目７５)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目７４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目７６)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目７４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目７７)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢである、項目６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目７８)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目７７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目７９)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目７７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目８０)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢ、ＴＮＦＡＩＰ３またはＢＣＯＲである、項目６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目８１)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目８２)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目８１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目８３)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目８２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目８４)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目８２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目８５)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢである、項目６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目８６)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、８５の改変免疫エフェクター細胞。
(項目８７)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、８５の改変免疫エフェクター細胞。
(項目８８)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢ、ＴＮＦＡＩＰ３またはＢＣＯＲである、項目６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目８９)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１である、項目６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目９０)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目４６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目９１)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目４６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目９２)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目４６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目９３)
ａ．前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを２つ含むとともに、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質であるか、
ｂ．前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを１つ含むとともに、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体であるか、または
ｃ．前記Ｃａｓタンパク質が、不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している、
項目５１～９２のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目９４)
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目５１～９３のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目９５)
前記異種タンパク質が、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）及びｍＳｉｎ３４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている、項目９３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目９６)
前記遺伝子調節システムが、前記１つ以上の内在性標的遺伝子に不活性化変異を導入する、項目４９～９５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目９７)
前記不活性化変異が、前記２つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む、項目９６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目９８)
前記欠失が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である、項目９７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目９９)
前記不活性化変異が、フレームシフト変異である、項目９７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１００)
前記不活性化変異によって、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下する、項目９６～９９のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１０１)
前記遺伝子調節システムが、前記免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入されている、項目１～１００のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１０２)
前記遺伝子調節システムが、前記システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド、タンパク質またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入されている、項目１０１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１０３)
ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、
前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目１０４)
（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、
前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目１０５)
（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＳＯＣＳ１または（ｃ）ＡＮＫＲＤ１１から選択した１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、
前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目１０６)
ＳＯＣＳ及びＡＮＫＲＤ１１の発現及び／または機能が低下された、項目１０５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１０７)
ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、
前記２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目１０８)
ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下された、項目１０７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１０９)
２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、
少なくとも１つの標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、
少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、
前記２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目１１０)
２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、
少なくとも１つの標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、少なくとも１つの標的遺伝子がＣＢＬＢである、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目１１１)
２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、
少なくとも１つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、前記２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目１１２)
ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下された、項目１１１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１１３)
ＳＯＣＳ１及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能が低下された、項目１１１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１１４)
ＳＯＣＳ１及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下された、項目１１１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１１５)
２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、
少なくとも１つの標的遺伝子が、ＡＮＫＲＤ１１であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、前記２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目１１６)
ＡＮＫＲＤ１１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下された、項目１１５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１１７)
ＡＮＫＲＤ１１及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能が低下された、項目１１５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１１８)
ＡＮＫＲＤ１１及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下された、項目１１５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１１９)
ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む、改変免疫エフェクター細胞。
(項目１２０)
（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む、改変免疫エフェクター細胞。
(項目１２１)
（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、または（ｂ）ＳＯＣＳ１または（ｃ）ＡＮＫＲＤ１１から選択した１つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む、改変免疫エフェクター細胞。
(項目１２２)
ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１遺伝子に不活性化変異を含む、項目１２１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１２３)
ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む、改変免疫エフェクター細胞。
(項目１２４)
前記ＣＢＬＢ遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む、項目１２３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１２５)
２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、
少なくとも１つの標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目１２６)
２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、
少なくとも１つの標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＣＢＬＢである、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目１２７)
２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、
少なくとも１つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目１２８)
前記ＳＯＣＳ１遺伝子及びＴＮＦＡＩＰ３遺伝子に不活性化変異を含む、項目１２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１２９)
前記ＳＯＣＳ１遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む、項目１２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１３０)
前記ＳＯＣＳ１遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子に不活性化変異を含む、項目１２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１３１)
２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、
少なくとも１つの標的遺伝子が、ＡＮＫＲＤ１１であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、前記改変免疫エフェクター細胞。
(項目１３２)
前記ＡＮＫＲＤ１１遺伝子及びＴＮＦＡＩＰ３遺伝子に不活性化変異を含む、項目１３１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１３３)
前記ＡＮＫＲＤ１１遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む、項目１３１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１３４)
前記ＡＮＫＲＤ１１遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子に不活性化変異を含む、項目１３１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１３５)
前記不活性化変異が、前記２つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む、項目１１９～１３２のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１３６)
前記欠失が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である、項目１３５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１３７)
前記不活性化変異が、フレームシフト変異である、項目１３５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１３８)
前記不活性化変異によって、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下する、項目１１９～１３７のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１３９)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現が、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下する、項目１～１３８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１４０)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子の機能が、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下する、項目１～１３８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１４１)
細胞表面に提示された操作免疫受容体をさらに含む、項目１～１４０のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１４２)
前記操作免疫受容体が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲである、項目１４１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１４３)
前記操作免疫受容体が、操作ＴＣＲである、項目１４１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１４４)
前記操作免疫受容体が、標的細胞上に発現する抗原に特異的に結合し、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、項目１４１～１４３のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１４５)
免疫活性化分子を発現する外来性導入遺伝子をさらに含む、項目１～１４４のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１４６)
前記免疫活性化分子が、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、活性化ペプチド、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択されている、項目１４５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１４７)
前記抗体またはその結合断片が、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４またはＰＤＣＤ１によってコードされるタンパク質に特異的に結合し、前記タンパク質の機能を阻害する、項目１４６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１４８)
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞から選択したリンパ球である、項目１～１４７のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１４９)
前記リンパ球が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、項目１４８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１５０)
前記エフェクター機能が、細胞増殖性、細胞生存能、腫瘍への浸潤性、細胞傷害性、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択されている、項目１～１４９のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
(項目１５１)
項目１～１５０のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞を含む組成物。
(項目１５２)
薬学的に許容可能な担体または希釈剤をさらに含む、項目１５１に記載の組成物。
(項目１５３)
改変免疫エフェクター細胞を少なくとも１×１０^４個、１×１０^５個または１×１０^６個含む、項目１５１または１５２に記載の組成物。
(項目１５４)
前記組成物が必要な対象に投与するのに適する、項目１５１～１５３のいずれか１項に記載の組成物。
(項目１５５)
前記組成物が必要な前記対象に由来する自己免疫エフェクター細胞を含む、項目１５１～１５４のいずれか１項に記載の組成物。
(項目１５６)
ドナー対象に由来する同種異系免疫エフェクター細胞を含む、項目１５１～１５４のいずれか１項に記載の組成物。
(項目１５７)
（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、
（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素分子、または（ｉｉｉ）ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む、前記システム。
(項目１５８)
（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＳＯＣＳ１または（ｂ）ＡＮＫＲＤ１１から選択した細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、
（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素分子、または（ｉｉｉ）ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む、前記システム。
(項目１５９)
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、項目１５７または項目１５８に記載の遺伝子調節システム。
(項目１６０)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されているか、またはＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と相補的であるターゲティングドメイン配列を含む、項目１５９に記載の遺伝子調節システム。
(項目１６１)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５４～４９８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１６０に記載の遺伝子調節システム。
(項目１６２)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５４～４９８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１６０または項目１６１に記載の遺伝子調節システム。
(項目１６３)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４９９～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１６０に記載の遺伝子調節システム。
(項目１６４)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４９９～８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１６０または項目１６３に記載の遺伝子調節システム。
(項目１６５)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１５９に記載の遺伝子調節システム。
(項目１６６)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１６５に記載の遺伝子調節システム。
(項目１６７)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１６５または項目１６６に記載の遺伝子調節システム。
(項目１６８)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１を含み、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１５９に記載の遺伝子調節システム。
(項目１６９)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１６８に記載の遺伝子調節システム。
(項目１７０)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１６８または項目１６９に記載の遺伝子調節システム。
(項目１７１)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＡＮＫＲＤ１１を含み、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１５９に記載の遺伝子調節システム。
(項目１７２)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１７１に記載の遺伝子調節システム。
(項目１７３)
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１７１または項目１７２に記載の遺伝子調節システム。
(項目１７４)
ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含む、項目１５７または項目１５８に記載の遺伝子調節システム。
(項目１７５)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されているか、またはＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１７４に記載の遺伝子調節システム。
(項目１７６)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されており、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号１５４～４９８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１７５に記載の遺伝子調節システム。
(項目１７７)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号４９９～８１３から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１７５に記載の遺伝子調節システム。
(項目１７８)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択されており、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１７４に記載の遺伝子調節システム。
(項目１７９)
前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号８１４～１０６４から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１７８に記載の遺伝子調節システム。
(項目１８０)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１を含み、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１７４に記載の遺伝子調節システム。
(項目１８１)
前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号１０８８～１２３２から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１８０に記載の遺伝子調節システム。
(項目１８２)
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＡＮＫＲＤ１１を含み、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１７４に記載の遺伝子調節システム。
(項目１８３)
前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号１０６５～１０８７から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１８２に記載の遺伝子調節システム。
(項目１８４)
細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＳＯＣＳ１または（ｂ）ＡＮＫＲＤ１１から選択されており、
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、
（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素分子、または（ｉｉｉ）ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む、前記システム。
(項目１８５)
複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、項目１８４に記載の遺伝子調節システム。
(項目１８６)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目１８５に記載の遺伝子調節システム。
(項目１８７)
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する、項目１８６に記載の遺伝子調節システム。
(項目１８８)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１８６または項目１８７に記載の遺伝子調節システム。
(項目１８９)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１８６または項目１８７に記載の遺伝子調節システム。
(項目１９０)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢである、項目１８５に記載の遺伝子調節システム。
(項目１９１)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１９０に記載の遺伝子調節システム。
(項目１９２)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１９０に記載の遺伝子調節システム。
(項目１９３)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目１８５に記載の遺伝子調節システム。
(項目１９４)
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する、項目１９３に記載の遺伝子調節システム。
(項目１９５)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１９３または項目１９４に記載の遺伝子調節システム。
(項目１９６)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１９３または項目１９４に記載の遺伝子調節システム。(項目１９７)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢである、項目１８５に記載の遺伝子調節システム。
(項目１９８)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＡＩＰ３である、項目１８５に記載の遺伝子調節システム。
(項目１９９)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＯＲである、項目１８５に記載の遺伝子調節システム。
(項目２００)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した標的核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４から選択した標的核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１９７に記載の遺伝子調節システム。
(項目２０１)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１９７に記載の遺伝子調節システム。
(項目２０２)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目１８５に記載の遺伝子調節システム。
(項目２０３)
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する、項目２０２に記載の遺伝子調節システム。
(項目２０４)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目２０２または項目２０３に記載の遺伝子調節システム。
(項目２０５)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目２０２または項目２０３に記載の遺伝子調節システム。
(項目２０６)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢである、項目１８５に記載の遺伝子調節システム。
(項目２０７)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＡＩＰ３である、項目１８５に記載の遺伝子調節システム。
(項目２０８)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＯＲである、項目１８５に記載の遺伝子調節システム。
(項目２０９)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４から選択した標的核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目２０６に記載の遺伝子調節システム。
(項目２１０)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目２０６に記載の遺伝子調節システム。
(項目２１１)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１である、項目１８５に記載の遺伝子調節システム。
(項目２１２)
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する、項目２１１に記載の遺伝子調節システム。
(項目２１３)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択した標的核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２から選択した標的核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目２１１に記載の遺伝子調節システム。
(項目２１４)
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目２１１に記載の遺伝子調節システム。
(項目２１５)
前記Ｃａｓタンパク質が、
ａ．酵素活性ドメインを２つ含み、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質、
ｂ．酵素活性ドメインを１つ含み、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体、
ｃ．前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）である、
項目１５７～２１４のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
(項目２１６)
前記異種タンパク質が、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン及びｍＳｉｎ３４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている、項目２１５に記載の遺伝子調節システム。
(項目２１７)
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目２１５または項目２１６に記載の遺伝子調節システム。
(項目２１８)
前記システムが、核酸分子を含み、前記核酸分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡである、項目１８４に記載の遺伝子調節システム。
(項目２１９)
複数のｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子を含む、項目２１８に記載の遺伝子調節システム。
(項目２２０)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目２１９に記載の遺伝子調節システム。
(項目２２１)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２２０に記載の遺伝子調節システム。(項目２２２)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２２０または項目２２１に記載の遺伝子調節システム。
(項目２２３)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢである、項目２１９に記載の遺伝子調節システム。
(項目２２４)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２２３に記載の遺伝子調節システム。
(項目２２５)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目２１９に記載の遺伝子調節システム。
(項目２２６)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２２５に記載の遺伝子調節システム。
(項目２２７)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２２５または項目２２６に記載の遺伝子調節システム。
(項目２２８)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢである、項目２１９に記載の遺伝子調節システム。
(項目２２９)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２２８に記載の遺伝子調節システム。
(項目２３０)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、項目２１９に記載の遺伝子調節システム。
(項目２３１)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２３０に記載の遺伝子調節システム。
(項目２３２)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２３０または項目２３１に記載の遺伝子調節システム。
(項目２３３)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢである、項目２１９に記載の遺伝子調節システム。
(項目２３４)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９～５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２１９に記載の遺伝子調節システム。
(項目２３５)
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＳＯＣＳ１である、項目２１９に記載の遺伝子調節システム。
(項目２３６)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２３５に記載の遺伝子調節システム。
(項目２３７)
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０８８～１２３２からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５～１０８７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目２３５に記載の遺伝子調節システム。
(項目２３８)
前記システムが、ＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されている、項目１５７、１５８または１８４に記載の遺伝子調節システム。
(項目２３９)
１つ以上のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするベクターを含む遺伝子調節システムであって、
前記１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０６５～１０８７、配列番号１０８８～１２３２、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、前記遺伝子調節システム。
(項目２４０)
複数のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするベクターを含む遺伝子調節システムであって、
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０６５～１０８７または配列番号１０８８～１２３２から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、前記遺伝子調節システム。
(項目２４１)
１つ以上のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む遺伝子調節システムであって、
前記１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０６５～１０８７、配列番号１０８８～１２３２、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、前記遺伝子調節システム。
(項目２４２)
複数のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む遺伝子調節システムであって、
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０６５～１０８７または配列番号１０８８～１２３２から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、前記遺伝子調節システム。
(項目２４３)
１つ以上のｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を含む遺伝子調節システムであって、
前記１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０６５～１０８７、配列番号１０８８～１２３２、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記１つ以上のｇＲＮＡと、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が複合化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する、前記遺伝子調節システム。
(項目２４４)
複数のｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を含む遺伝子調節システムであって、
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０６５～１０８７または配列番号１０８８～１２３２から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記１つ以上のｇＲＮＡと、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が複合化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する、前記遺伝子調節システム。
(項目２４５)
項目１５７～２４４のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを含むキット。
(項目２４６)
（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＳＯＣＳ１、（ｃ）ＡＮＫＲＤ１１、（ｄ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｅ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した内在性標的遺伝子内の標的配列と相補的であるターゲティングドメイン核酸配列を含むｇＲＮＡ核酸分子。
(項目２４７)
ａ．前記内在性遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記ｇＲＮＡが、表６Ａ及び６Ｂに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列と相補的であるターゲティングドメイン配列を含むか、
ｂ．前記内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記ｇＲＮＡが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列と相補的であるターゲティングドメイン配列を含むか、
ｃ．前記内在性遺伝子が、ＡＮＫＲＤ１１であり、前記ｇＲＮＡが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列と相補的であるターゲティングドメイン配列を含むか、
ｄ．前記内在性遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群から選択されており、前記ｇＲＮＡが、表５Ａ及び表５Ｂに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列と相補的であるターゲティングドメイン配列を含むか、または
ｅ．前記内在性遺伝子が、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、前記ｇＲＮＡが、表５Ａ及び表５Ｂに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列と相補的であるターゲティングドメイン配列を含む、
項目２４６に記載のｇＲＮＡ分子。
(項目２４８)
前記ｇＲＮＡが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０８８～１２３２、配列番号１０６５～１０８７、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目２４６～２５２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
(項目２４９)
前記ｇＲＮＡが、配列番号８１４～１０６４、配列番号１０８８～１２３２、配列番号１０６５～１０８７、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３から選択した配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目２４６～２５２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
(項目２５０)
前記標的配列が、ＰＡＭ配列を含む、項目２４６～２４９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
(項目２５１)
前記ｇＲＮＡが、モジュラーｇＲＮＡ分子である、項目２４６～２５０のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
(項目２５２)
前記ｇＲＮＡが、デュアルｇＲＮＡ分子である、項目２４６～２５０のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
(項目２５３)
前記ターゲティングドメインが、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長またはそれを上回るヌクレオチド長である、項目２４６～２５２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
(項目２５４)
その５’末端もしくはその５’末端近傍（例えば、その５’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドもしくは１～２ヌクレオチド以内）の改変、及び／またはその３’末端もしくはその３’末端近傍（例えば、その３’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドもしくは１～２ヌクレオチド以内）の改変を含む、項目２４６～２５３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
(項目２５５)
前記改変ｇＲＮＡをＴ細胞に導入すると、ヌクレアーゼに対する安定性が向上する、項目２５４に記載のｇＲＮＡ分子。
(項目２５６)
前記改変ｇＲＮＡをＴ細胞に導入すると、自然免疫応答が軽減される、項目２５４または項目２５５に記載のｇＲＮＡ分子。
(項目２５７)
項目２４６～２５６のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子。
(項目２５８)
項目２４６～２５６のいずれか１項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子、または項目２５７に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
(項目２５９)
項目２４６～２５６のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子、または項目２５７に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
(項目２６０)
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
ａ．免疫エフェクター細胞を対象から採取すること、
ｂ．項目１５７～２４４のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入すること、ならびに
ｃ．前記免疫エフェクター細胞を培養して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて低下するようにすること、
を含む、前記方法。
(項目２６１)
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
項目１５７～２４４のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することを含む、前記方法。
(項目２６２)
ＣＡＲ及びＴＣＲから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む、項目２６０または２６１に記載の方法。
(項目２６３)
前記遺伝子調節システム及び／または前記操作免疫受容体をコードする前記ポリヌクレオチドを、前記免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入する、項目２６２に記載の方法。
(項目２６４)
前記遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列として、タンパク質として、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として、前記システムを導入する、項目２６０～２６３のいずれか１項に記載の方法。
(項目２６５)
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
ａ．免疫エフェクター細胞集団を培養液で増殖させること、
ｂ．項目１５７～２４４のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞集団に導入すること、
を含む、前記方法。
(項目２６６)
前記免疫エフェクター細胞集団を対象から採取することをさらに含む、項目２６５に記載の方法。
(項目２６７)
増殖前、増殖中または増殖後に、前記遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、項目２６５または項目２６６に記載の方法。
(項目２６８)
前記免疫エフェクター細胞集団の前記増殖が、第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖を含む、項目２６５または項目２６６に記載の方法。
(項目２６９)
前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンドの増殖前、前記第１ラウンドの増殖中、または前記第１ラウンドの増殖後に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、項目２６８に記載の方法。
(項目２７０)
前記遺伝子調節システムを、前記第２ラウンドの増殖前、前記第２ラウンドの増殖中、または前記第２ラウンドの増殖後に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、項目２６８に記載の方法。
(項目２７１)
前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンド及び前記第２ラウンドの増殖の前に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、項目２６８に記載の方法。
(項目２７２)
前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンド及び前記第２ラウンドの増殖の後に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、項目２６８に記載の方法。
(項目２７３)
前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンドの増殖後、かつ前記第２ラウンドの増殖前に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、項目２６８に記載の方法。
(項目２７４)
治療の必要な対象の疾患または障害の治療方法であって、
項目１～１５０のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞、または項目１５１～１５６のいずれか１項に記載の組成物を有効量投与することを含む、前記方法。
(項目２７５)
前記疾患または障害が、細胞増殖性障害、炎症性障害または感染症である、項目２７４に記載の方法。
(項目２７６)
前記疾患または障害が、がんまたはウイルス感染症である、項目２７４に記載の方法。
(項目２７７)
前記がんが、白血病、リンパ腫または固形腫瘍から選択される、項目２７６に記載の方法。
(項目２７８)
前記固形腫瘍が、メラノーマ、膵臓腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍もしくは肺転移、大腸癌または頭頸部癌である、項目２７７に記載の方法。
(項目２７９)
前記がんが、ＰＤ１耐性またはＰＤ１非感受性のがんである、項目２７６～２７８のいずれか１項に記載の方法。
(項目２８０)
前記対象が以前に、ＰＤ１阻害剤またはＰＤＬ１阻害剤による治療を受けたことがある、項目２７６～２７９のいずれか１項に記載の方法。
(項目２８１)
ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４またはＰＤＣＤ１によってコードされるタンパク質に特異的に結合して、前記タンパク質の機能を阻害する抗体またはその結合断片を前記対象に投与することをさらに含む、項目２７６～２８０のいずれか１項に記載の方法。
(項目２８２)
前記改変免疫エフェクター細胞が、前記対象に対して自家である、項目２７４～２８１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２８３)
前記改変免疫エフェクター細胞が、前記対象に対して同種異系である、項目２７４～２８１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２８４)
がん細胞の殺傷方法であって、
項目１～１５０のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞、または項目１５１～１５６のいずれか１項に記載の組成物に、前記がん細胞を暴露することを含む、前記方法。
(項目２８５)
前記暴露が、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏでの暴露である、項目２８４に記載の方法。
(項目２８６)
免疫エフェクター細胞の１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、
項目１５７～２４４のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することを含む、前記方法。
(項目２８７)
免疫エフェクター細胞の１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、
項目１５７～２４４のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することを含み、前記改変された免疫エフェクター細胞において、１つ以上のエフェクター機能が、改変しなかった前記免疫エフェクター細胞と比べて増強される、前記方法。
(項目２８８)
前記１つ以上のエフェクター機能が、細胞増殖性、細胞生存能、細胞傷害性、腫瘍への浸潤性、サイトカイン産生の増加、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択される、項目２８７に記載の方法。

本明細書に記載されている方法によって改変できる内在性標的遺伝子の組み合わせを示している。本明細書に記載されている方法によって改変できる内在性標的遺伝子の組み合わせを示している。本明細書に記載されている方法によって改変できる内在性標的遺伝子の組み合わせを示している。本明細書に記載されている方法によって改変できる内在性標的遺伝子の組み合わせを示している。本明細書に記載されている方法によって改変できる内在性標的遺伝子の組み合わせを示している。本明細書に記載されている方法によって改変できる内在性標的遺伝子の組み合わせを示している。Ａ～Ｄは、本明細書に記載されている方法を用いて、ＴＲＡＣ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子を編集した結果を示している。Ａ～Ｂは、初代ヒトＴ細胞におけるＣＢＬＢの編集に関するＴＩＤＥ解析データを示している。ＣＢＬＢｓｇＲＮＡを用いて編集した初代ヒトＴ細胞（Ｄ６５５１－ＣＢＬＢ）内のＣＢＬＢタンパク質のウエスタンブロット結果を未編集のコントロール（Ｄ６５５１－ＷＴ）と比較したものを示している。マウスＢ１６／Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおける腫瘍の経時的成長を示している。Ａは、Ｃｂｌｂ編集ＯＴ１Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の成長をコントロールの編集ＯＴ１Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。Ｂは、Ｓｏｃｓ１編集ＯＴ１Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の成長をコントロールの編集ＯＴ１Ｔ細胞及びＰｄ１編集ＯＴ１Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。マウスＭＣ３８／ｇｐ１００同系腫瘍モデルにおける腫瘍の経時的成長を示している。Ａは、Ｓｏｃｓ１編集ＰＭＥＬＴ細胞で処置したマウスの腫瘍の成長をコントロールの編集Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。Ｂは、Ａｎｋｒｄ１１編集ＰＭＥＬＴ細胞で処置したマウスの腫瘍の成長をコントロールの編集Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。ＣＢＬＢ編集Ｔ細胞で処置したマウスについて、マウスＡ３７５異種移植モデルにおける腫瘍の経時的成長をコントロールの編集Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。ＢＣＯＲ編集抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞、ＣＢＬＢ編集抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞、またはＢＣＯＲ／ＣＢＬＢデュアル編集抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞で処置したマウスの腫瘍の経時的成長を示している。ｉｎｖｉｔｒｏ培養系における、ＢＣＯＲ編集ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞またはＢＣＯＲ／ＣＢＬＢ編集ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の集積を示している。ｉｎｖｉｔｒｏ培養系における、ＢＣＯＲ編集ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞またはＢＣＯＲ／ＣＢＬＢ編集ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞によるＩＬ－２の産生を示している。ｉｎｖｉｔｒｏ培養系における、ＢＣＯＲ編集ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞またはＢＣＯＲ／ＣＢＬＢ編集ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞によるＩＦＮγの産生を示している。マウスＢ１６／Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおいて、Ｃｂｌｂ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集ＯＴ１Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の経時的成長を示している。Ｂ１６－Ｏｖａマウス腫瘍モデルにおける、ＰＤ１／Ｌａｇ３デュアル編集トランスジェニックＴ細胞の抗腫瘍有効性を示している。ＳＯＣＳ１の欠失後、ＩＬ－２シグナル伝達に応答して、初代ヒトＣＤ８Ｔ細胞内のｐＳＴＡＴ５のレベルが上昇したことを示している。ＳＯＣＳ１タイリングスクリーンによるｇＲＮＡの濃縮を示している。ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡによるＣＤ４＋ヒトＴ細胞及びＣＤ８＋ヒトＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの集積を示している。ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡまたはＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡによるＣＤ４＋ヒトＴ細胞及びＣＤ８＋ヒトＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの集積を、Ｔ細胞機能の既知の制御因子であるＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＣＢＬ及びＳＯＣＳ３を標的とするガイドの場合と比較したものを示している。ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡによるマウスＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの集積を示している。ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡによるマウスＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの集積を、Ｔ細胞機能の他の制御因子であるＰＤＣＤ１及びＴａｒｇｅｔ－Ａを標的とするガイドの場合と比較したものを示している。抗原特異的刺激に応答した、ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢを標的とするガイドによるヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの集積を示している。ＳＯＣＳ１編集腫瘍浸潤リンパ球及びコントロールの編集腫瘍浸潤リンパ球上のＰＤ１及びＣＤ２５の表面発現を示している。ＳＯＣＳ１編集腫瘍浸潤リンパ球及びコントロールの編集腫瘍浸潤リンパ球上の４－１ＢＢの表面発現を示している。

本開示は、免疫エフェクター細胞を改変して、免疫療法との関連において、その細胞の治療有効性を向上させることに関する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞を本開示の方法によって改変して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させるか、または内在性タンパク質の１つ以上の機能を低下させて、その免疫細胞の１つ以上のエフェクター機能が増強されるようにする。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）発現コンストラクトまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクトの導入のように、抗原特異性を付与する導入遺伝子の導入によって、さらに改変する。いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子調節システムの組成物のように、免疫エフェクター細胞を改変するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、がんのような細胞増殖性障害の治療方法であって、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を、治療の必要な対象に投与することを含む方法を提供する。

Ｉ．定義
本明細書及び添付の請求項で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、文脈上明らかに別段に示されていない限り、複数の言及物が含まれる。

本明細書で使用する場合、「及び／または」という用語は、本開示では、別段に示されていない限り、「及び」または「または」のいずれかを意味する目的で使用する。

本明細書の全体を通じて、文脈上別段に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形表現は、示されている要素もしくは完全体、または要素もしくは完全体の群が含まれるが、いずれの他の要素もしくは完全体、または要素もしくは完全体の群も排除されないことを示唆していると理解するものとする。

本願で使用する場合、「約」及び「およそ」という用語は、同義語として使用する。本願で用いられている数字であって、約／およそが付されているかまたは付されていないいずれの数字も、当業者によって認識されるあらゆる通常の変動を網羅するように意図されている。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載のない限り、または文脈から別段に明らかでない限り、いずれかの方向（示されている言及値を上回るかまたは下回る方向）で、示されている言及値から２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれらを下回る割合以内に入る値の範囲を指す（ただし、その数が、考え得る値の１００％を上回る場合を除く）。

「減少する」または「低下する」とは、特定の値が少なくとも５％減少または低下すること、例えば、参照値と比べて、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％減少することを指す。特定の値の減少または低下は、その値を参照値と比較した場合の変化倍率として、例えば、参照値と比べて、少なくとも１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１、２００分の１、５００分の１、１０００分の１またはそれを上回る割合に減少するとして表されることもある。

「増加する」とは、特定の値が少なくとも５％増加すること、例えば、参照値と比べて、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれを上回る割合増加することを指す。特定の値の増加は、その値を参照値と比較した場合の変化倍率として、例えば、参照値のレベルと比べて、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、またはそれを上回る割合で増加するとして表されることもある。

「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、その形態としては、コードアミノ酸、非コードアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、及び改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを挙げることができる。

「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）のポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基及びピリミジン塩基、その他の天然の塩基、化学的に改変された塩基、生化学的に改変された塩基、非天然塩基もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限らない。「オリゴヌクレオチド」とは概して、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的では、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離しても、当該技術分野において知られている方法によって化学的に合成してもよい。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語には、記載されている実施形態に適用可能なように、一本鎖ポリヌクレオチド（センス鎖またはアンチセンス鎖など）及び二本鎖ポリヌクレオチドが含まれると理解すべきである。

「断片」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の全体よりも少ない配列を含むポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子の部分を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの断片は、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片またはポリヌクレオチド断片は、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個またはこれを上回る数のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。

「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間で、同じであるとともに、同じ相対的位置にある塩基またはアミノ酸の割合（％）を指す。したがって、一方のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対する配列同一性が、ある特定の割合（％）である。配列比較の際には、典型的には、１つの配列が、試験配列と比較する参照配列としての役割を果たす。「参照配列」という用語は、試験配列と比較する分子を指す。

「相補的」とは、天然の塩基もしくは非天然の塩基、またはそのアナログを含む２つの配列間で、塩基スタッキング及び特異的水素結合を通じて対合する能力を指す。例えば、核酸のある１つの位置の塩基が、標的の対応する位置の塩基と水素結合できる場合には、それらの塩基は、その位置において、互いに相補的であるとみなす。核酸は、ユニバーサル塩基、または水素結合に対してプラスまたはマイナスに寄与しない不活性な無塩基スペーサーを含むことができる。塩基対形成には、カノニカルなワトソン－クリック塩基対形成及び非ワトソン－クリック型塩基対形成（例えば、ゆらぎ塩基対形成及びフーグスティーン塩基対形成）の両方を含めてよい。相補的塩基対合では、アデノシン型塩基（Ａ）は、チミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）と相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）は、グアノシン型塩基（Ｇ）と相補的であり、３－ニトロピロールまたは５－ニトロインドールのようなユニバーサル塩基は、Ａ、Ｃ、ＵまたはＴのいずれともハイブリダイズでき、これらと相補的であるとみなすことができることがわかる。Ｎｉｃｈｏｌｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４；３６９：４９２－４９３及びＬｏａｋｅｓｅｔ
ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９４；２２：４０３９－４０４３。イノシン（Ｉ）も、当該技術分野において、ユニバーサル塩基であるとみなされてきており、Ａ、Ｃ、ＵまたはＴのいずれとも相補的であるとみなされている。ＷａｔｋｉｎｓａｎｄＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００５；３３（１９）：６２５８－６２６７を参照されたい。

本明細書で言及されている場合、「相補的核酸配列」は、ｉｎｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎｖｉｖｏでの適切な温度条件及び溶液イオン強度条件下で、配列特異的かつ逆平行な形で、その配列が別の核酸に非共有結合する（すなわち、核酸が相補的核酸に特異的に結合する）ようにできるヌクレオチド配列を含む核酸配列である。

比較するとともに、配列同一性パーセント及び相補性パーセントを求めるための配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のために、配列を最適にアラインメントするのは、例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性検索法によって、コンピューターによる、これらのアルゴリズムの実施（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、マニュアルアラインメント及び目視確認（例えば、Ｂｒｅｎｔｅｔａｌ．，（２００３）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＢＬＡＳＴ、及びＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載されているＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含め、当該技術分野において知られているアルゴリズムを用いることによって行うことができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて、公的に入手可能である。

本明細書では、「ハイブリダイズする」という用語は、相補的ヌクレオチド塩基間が対合して（例えば、アデニン（Ａ）は、ＤＮＡ分子ではチミン（Ｔ）と、ＲＮＡ分子ではウラシル（Ｕ）と塩基対を形成し、グアニン（Ｇ）は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方で、シトシン（Ｃ）と塩基対を形成する）、二本鎖核酸分子を形成することを指す（例えば、ＷａｈｌａｎｄＢｅｒｇｅｒ（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。加えて、当該技術分野においては、２つのＲＮＡ分子のハイブリダイゼーション（例えばｄｓＲＮＡ）では、グアニン（Ｇ）が、ウラシル（Ｕ）と塩基対を形成することも知られている。例えば、Ｇ／Ｕという塩基対の形成は、ｍＲＮＡ内のコドンとのｔＲＮＡのアンチコドンの塩基対の形成に関しては、遺伝暗号の縮退（すなわち冗長性）の部分的な要因となっている。本開示との関連においては、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（二本鎖ｄｓＲＮＡ）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）と相補的であるとみなされ、Ｕは、そのＧと相補的であるとみなされる。したがって、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（二本鎖ｄｓＲＮＡ）の所定のヌクレオチド位置で、Ｇ／Ｕ塩基対を形成できるときには、その位置は、非相補的であるとはみなされず、むしろ相補的であるとみなされる。当該技術分野では、ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能となるには、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないと理解されている。さらに、ポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズして、介在セグメントまたは隣接セグメントが、ハイブリダイゼーション事象に関与しないようにし得る（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。ポリヌクレオチドは、その標的となる標的核酸配列内の標的領域との配列相補性が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％であることができる。

「改変」という用語は、対応する非改変物質または化合物と比べて、変質または変更された物質または化合物（例えば、細胞、ポリヌクレオチド配列及び／またはポリペプチド配列）を指す。

「天然の」という用語は、本明細書で使用する場合、核酸、ポリペプチド、細胞または生物に適用されている際には、自然界で見られる核酸、ポリペプチド、細胞または生物を指す。例えば、天然の供給源から単離できる生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列であって、実験室において人間が意図的に改変していないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然のものである。

「単離」とは、天然の状態で見られる場合には通常、その物質に付随している構成成分から、様々な程度で遊離されている物質を指す。

「発現カセット」または「発現コンストラクト」とは、プロモーターに機能可能に連結されたＤＮＡポリヌクレオチド配列を指す。「機能可能に連結された」とは、機能可能に連結されていると記載されている構成成分が、意図した形で機能できる関係にある並置状態を指す。例えば、プロモーターが、ポリヌクレオチド配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターは、そのポリヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。

「組み換えベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、そのベクターに挿入された別のポリヌクレオチドを移入または輸送できるポリヌクレオチド分子を指す。その挿入されたポリヌクレオチドは、発現カセットであってよい。いくつかの実施形態では、組み換えベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（例えばプラスミド）であってよい。

「試料」という用語は、解析及び／または遺伝子改変を行う生物学的組成物（例えば、細胞、または組織の一部）を指す。いくつかの実施形態では、試料は、対象から直接採取するという点で、「一次試料」であり、いくつかの実施形態では、「試料」は、例えば、ある特定の構成成分を除去し、及び／または対象とする、ある特定の構成成分を単離もしくは精製する目的で、一次試料を処理して得られたものである。

「対象」という用語には、例えば哺乳動物のような動物が含まれる。いくつかの実施形態では、その哺乳動物は、霊長類動物である。いくつかの実施形態では、その哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ブタなどのような家畜、またはイヌ及びネコのような飼育動物である。いくつかの実施形態では（例えば、特に研究環境では）、対象は、齧歯類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類動物、または近交系ブタのようなブタなどである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では同義的に用いられている。

「投与」とは、本明細書では、薬剤または組成物を対象に導入することを指す。

「治療」とは、本明細書で使用する場合、生理学的転帰に影響を及ぼすために、薬剤または組成物を対象に送達することを指す。

本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、特定の生理作用をもたらすのに必要な薬剤または組成物の最小量を指す。特定の薬剤の有効量は、その薬剤の性質に基づき、質量／体積、細胞数／体積、粒子／体積、（薬剤の質量）／（対象の質量）、細胞数／（対象の質量）、または粒子／（対象の質量）といった様々な方法で表してよい。特定の薬剤の有効量は、半最大効果濃度（ＥＣ_５０）として表してもよく、この値は、基準レベルと最大応答レベルの中間の、特定の生理応答をもたらす薬剤濃度を指す。

細胞の「集団」は、２個以上のいずれの数の細胞も指すが、好ましくは、少なくとも１×１０^３個の細胞、少なくとも１×１０^４個の細胞、少なくとも１×１０^５個の細胞、少なくとも１×１０^６個の細胞、少なくとも１×１０^７個の細胞、少なくとも１×１０^８個の細胞、少なくとも１×１０^９個の細胞、少なくとも１×１０^１０個の細胞、またはこれを上回る数の細胞である。細胞集団とは、ｉｎｖｉｔｒｏ集団（例えば、培養液中の細胞集団）またはｉｎｖｉｖｏ集団（例えば、特定の組織に存在する細胞集団）を指してよい。

分子細胞生化学における一般的な方法は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄＥｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＨａＲＢｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ２００１）、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈＥｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．ｅｄｓ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９９）、ＰｒｏｔｅｉｎＭｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇｅｔａｌ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓ１９９６）、ＮｏｎｖｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
１９９９）、ＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１９９５）、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＭｅｔｈｏｄｓＭａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓｅｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１９９７）及びＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９８）のような標準的な教科書に見ることができ、その開示内容は、参照により、本明細書に援用される。

ＩＩ．改変免疫エフェクター細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞を提供する。本明細書では、「改変免疫エフェクター細胞」という用語には、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる１つ以上のゲノム改変を含む免疫エフェクター細胞、ならびに１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む免疫エフェクター細胞が含まれる。本明細書では、「非改変免疫エフェクター細胞」または「コントロールの免疫エフェクター細胞」は、ゲノムが改変されておらず、遺伝子調節システムを含まないか、またはコントロール遺伝子調節システム（例えば、空ベクターコントロール、非ターゲティングｇＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡなど）を含む細胞または細胞集団を指す。

「免疫エフェクター細胞」という用語は、自然免疫応答及び適応免疫応答の惹起に関与する細胞を指し、リンパ球（Ｔ細胞（胸腺細胞を含む）及びＢ細胞など）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好塩基球、好中球、樹状細胞、ならびにマスト細胞が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞もしくはＣＴＬともいう）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞またはＴｈ１７細胞のようなＴ細胞である。

いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、腫瘍試料から単離したＴ細胞（本明細書では、「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」という）である。理論に束縛されることを望まないが、ＴＩＬは、腫瘍抗原に対する特異性が向上しており（Ｒａｄｖａｎｙｉｅｔａｌ．，２０１２ＣｌｉｎＣａｎｃＲｅｓ１８：６７５８－６７７０）、したがって、外因性の操作受容体の導入なしに、腫瘍抗原特異的免疫応答（例えば、活性化、増殖及びがん細胞に対する細胞傷害活性）を媒介して、がん細胞を破壊させることができる（Ｂｒｕｄｎｏｅｔａｌ．，２０１８ＮａｔＲｅｖＣｌｉｎＯｎｃ１５：３１－４６）と考えられる。すなわち、いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、対象の腫瘍から単離し、ｅｘｖｉｖｏで増殖させ、対象に再注入する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、自己腫瘍抗原に対して特異的な１つ以上の外因性受容体を発現するように改変し、ｅｘｖｉｖｏで増殖させ、対象に再注入する。このような実施形態は、ｉｎｖｉｖｏマウスモデルを用いてモデル化でき、そのマウスには、がん抗原（例えばＣＤ１９）を発現するがん細胞株が移植されており、そのがん抗原に特異的である外因性受容体を発現する改変Ｔ細胞でそのマウスを処置する（例えば、実施例１０及び１１を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、動物細胞であるか、または、無脊椎動物及び脊椎動物を含む動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥または哺乳動物）の細胞に由来するものである。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、哺乳動物細胞であるか、または哺乳動物細胞に由来するものである（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類動物、ヒト以外の霊長類動物、ヒトなど）。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、齧歯類動物細胞であるか、または齧歯類動物細胞に由来するものである（例えば、ラットまたはマウス）。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来するものである。

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、内在性標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に、その内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させる１つ以上の改変（例えば、１つ以上の核酸の挿入、欠失または変異）を含む。このような改変は、本明細書では「不活性化変異」といい、不活性化変異を含む内在性遺伝子は、「改変内在性標的遺伝子」という。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ｍＲＮＡの転写を減少させるかまたは阻害することによって、コードされるｍＲＮＡ転写物及びタンパク質の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ｍＲＮＡの翻訳を減少させるかまたは阻害することによって、コードされるタンパク質の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、非改変型（すなわち野生型）の内在性タンパク質と比べて、機能が低下または変更された改変内在性タンパク質（例えば、下記のドミナントネガティブ変異体）をコードする。

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、内在性標的遺伝子以外のゲノム位置に、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させるか、あるいは改変型の内在性タンパク質を発現させる１つ以上のゲノム改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子調節システムをコードするポリヌクレオチド配列をゲノム内の１つ以上の位置に挿入することによって、その遺伝子調節システムの発現の際に、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる。いくつかの実施形態では、改変型の内在性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が、ゲノム内の１つ以上の位置に挿入されており、その改変型のタンパク質の機能が、非改変型または野生型のタンパク質と比べて低下する（例えば、下記のドミナントネガティブ変異体）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、改変された内在性標的遺伝子を１つ以上含み、その１つ以上の改変によって、その内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡ転写物またはタンパク質）の発現及び／または機能が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて低下する。例えば、いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、ｍＲＮＡ転写物の発現が低下し、及び／またはタンパク質の発現が低下する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現は、非改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現と比べて、少なくとも５％低下する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現は、非改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを上回る程度低下する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、複数（例えば２つ以上）の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現及び／または機能が、非改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現と比べて低下する。例えば、いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子に由来する遺伝子産物の発現及び／または機能が、非改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現と比べて低下する。

いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞であって、１つ以上の内在性標的遺伝子またはその一部が欠失（すなわち「ノックアウト」）されており、そのｍＲＮＡ転写物またはタンパク質を発現しないようになっている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、複数の内在性標的遺伝子またはその一部の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の欠失を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、１つ以上の改変内在性標的遺伝子を含み、その標的ＤＮＡ配列に対する１つ以上の改変によって、非改変免疫エフェクター細胞で発現する対応するタンパク質（例えば「非改変内在性タンパク質」）の機能と比べて、機能が低下または変更されたタンパク質（例えば「改変内在性タンパク質」）が発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の改変内在性タンパク質をコードする２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の改変内在性標的遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、その改変内在性タンパク質では、その改変免疫エフェクター細胞によって発現されるかもしくは別の細胞によって発現される別のタンパク質に対する結合親和性が低下もしくは変化するか、シグナル伝達能が低下もしくは変化するか、酵素活性が低下もしくは変化するか、ＤＮＡ結合活性が低下もしくは変化するか、または足場タンパク質として機能する能力が低下もしくは変化する。

いくつかの実施形態では、その改変内在性標的遺伝子は、１つ以上のドミナントネガティブ変異を含む。本明細書で使用する場合、「ドミナントネガティブ変異」とは、標的遺伝子の１つ以上のヌクレオチドが置換、欠失または挿入されていて、そのコードされたタンパク質が、非改変標的遺伝子によってコードされるタンパク質に対して拮抗的に作用するようになっていることを指す。このネガティブな表現型は、対応する非改変遺伝子のポジティブな表現型に対して、遺伝的に優位となるので、その変異は、ドミナントネガティブである。１つ以上のドミナントネガティブ変異を含む遺伝子、及びその遺伝子によってコードされるタンパク質は、「ドミナントネガティブ変異体」、例えば、ドミナントネガティブ遺伝子及びドミナントネガティブタンパク質という。いくつかの実施形態では、そのドミナントネガティブ変異体タンパク質は、その免疫エフェクター細胞のゲノム内の１つ以上の位置に挿入した外来性導入遺伝子によってコードされる。

ドミナントネガティブの機序は、様々なものが知られている。典型的には、ドミナントネガティブ変異体の遺伝子産物は、非改変遺伝子産物の機能をいくつか保持しているが、非改変遺伝子産物の他の重要な機能を１つ以上欠損している。これにより、ドミナントネガティブ変異体は、非改変遺伝子産物を拮抗阻害する。例えば、例示的な実施形態として、転写因子のドミナントネガティブ変異体は、機能活性化ドメインを欠損しているが、機能性ＤＮＡ結合ドメインを保持し得る。この例では、ドミナントネガティブ転写因子は、非改変転写因子のようにＤＮＡの転写を活性化することはできず、ドミナントネガティブ転写因子は、非改変転写因子の転写因子結合部位への結合を阻止することによって、遺伝子の発現を間接的に阻害できる。別の例示的な実施形態として、二量体として機能するタンパク質のドミナントネガティブ変異が知られている。このような二量体タンパク質のドミナントネガティブ変異体は、非改変タンパク質と二量体を形成する能力を保持し得るが、それ以外は機能できないことがある。ドミナントネガティブ単量体は、非改変単量体と二量体を形成することによって、ヘテロ二量体を形成し、非改変単量体の機能的なホモ二量体の形成を阻止する。

いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む。その遺伝子調節システムは、（例えば、ゲノムＤＮＡ配列内の１つ以上の核酸の挿入、欠失もしくは変異によって）内在性標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を改変すること、内在性標的遺伝子の転写を調節すること（例えば、ｍＲＮＡの転写の阻害もしくは抑制）、及び／または（例えば、ｍＲＮＡの分解によって）内在性標的遺伝子の翻訳を調節することによる機序を含む様々な機序によって、内在性標的遺伝子改変部の発現及び／または機能を低下させることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、遺伝子調節システム（例えば、核酸ベースの遺伝子調節システム、タンパク質ベースの遺伝子調節システム、またはタンパク質／核酸複合ベースの遺伝子調節システム）を含む。このような実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞に含まれる遺伝子調節システムは、１つ以上の内在性標的遺伝子を改変することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、
（ａ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる１つ以上の核酸分子、
（ｂ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｃ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる１つ以上のタンパク質、
（ｄ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができるタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｅ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
（ｆ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｇ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｈ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｉ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
（ｊ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｋ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｌ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｍ）内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡ、
（ｎ）内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｏ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｐ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、または
（ｑ）上記をいずれかに組み合わせたものを含む遺伝子調節システム、
を含む。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、その免疫エフェクター細胞のゲノムに挿入されている。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、エピソーマルに発現され、その免疫エフェクター細胞のゲノムに挿入されていない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されており、１つ以上のゲノム遺伝子座に挿入された１つ以上の外因性導入遺伝子をさらに含む（例えば遺伝子「ノックイン」）。いくつかの実施形態では、その１つ以上の外因性導入遺伝子は、検出可能なタグ、安全スイッチシステム、キメラスイッチ受容体及び／または操作型抗原特異的受容体をコードする。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、検出可能なタグをコードする外来性導入遺伝子をさらに含む。検出可能なタグの例としては、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ（例えば６×Ｈｉｓ）、ＳＮＡＰタグ、Ｈａｌｏタグ、ｃＭｙｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ、アビジン、酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質、化学発光タンパク質、生物発光タンパク質及びリン光タンパク質が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、その蛍光タンパク質は、青色／ＵＶタンパク質（ＢＦＰ、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅなど）、シアンタンパク質（ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ＭｏｎｏｍｅｒｉｃＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ及びｍＴＦＰ１など）、緑色タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｍｅＧＦＰ（Ａ２０８Ｋ変異）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＳｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒＧＦＰ、ＭｏｎｏｍｅｒｉｃＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ及びｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎなど）、黄色タンパク質（ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２及びＴａｇＹＦＰなど）、オレンジ色タンパク質（ＭｏｎｏｍｅｒｉｃＫｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ及びｍＯｒａｎｇｅ２など）、赤色タンパク質（ＲＦＰ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ及びｍＲｕｂｙ２など）、遠赤色タンパク質（ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ及びＮｉｒＦＰなど）、近赤外蛍光タンパク質（ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４及びｉＲＦＰなど）、ストークスシフトの長いタンパク質（ｍＫｅｉｍａＲｅｄ、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ１、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ２及びｍＢｅＲＦＰなど）、光活性化可能なタンパク質（ＰＡ－ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１及びＰＡＴａｇＲＦＰなど）、光変換可能なタンパク質（Ｋａｅｄｅ（ｇｒｅｅｎ）、Ｋａｅｄｅ（ｒｅｄ）、ＫｉｋＧＲ１（ｇｒｅｅｎ）、ＫｉｋＧＲ１（ｒｅｄ）、ＰＳ－ＣＦＰ２、ＰＳ－ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ２（ｒｅｄ）、ｍＥｏｓ３．２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ３．２（ｒｅｄ）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ及びＰＳｍＯｒａｎｇｅなど）、ならびに光で切り替え可能なタンパク質（Ｄｒｏｎｐａなど）からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その検出可能なタグは、ＡｍＣｙａｎ、ＡｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄＥｘｐｒｅｓｓ、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、ＨｃＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＤｓＲｅｄＭｏｎｏｍｅｒ及び／またはＡｃＧＦＰから選択でき、これらはいずれも、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、安全スイッチシステムをコードする外来性導入遺伝子をさらに含む。安全スイッチシステム（当該技術分野においては、自殺遺伝子システムともいう）は、改変免疫エフェクター細胞を対象に投与した後に、その細胞を除去可能にする１つ以上のタンパク質をコードする外因性導入遺伝子を含む。安全スイッチシステムの例は、当該技術分野において知られている。例えば、安全スイッチシステムは、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Ｈｓｖ－ｔｋ）及びガンシクロビル（ＧＣＶ）システム（Ｈｓｖ－ｔｋ／ＧＣＶ）のような、非傷害性のプロドラッグを傷害性化合物に変換するタンパク質をコードする遺伝子を含む。Ｈｓｖ－ｔｋは、非傷害性のＧＣＶを、細胞アポトーシスに導く傷害性化合物に変換する。したがって、Ｈｓｖ－ｔｋタンパク質をコードする導入遺伝子を含む改変免疫エフェクター細胞で治療した対象にＧＣＶを投与すると、その改変免疫エフェクター細胞を選択的に除去できる一方で、内在性免疫エフェクター細胞は影響を受けない。（例えば、Ｂｏｎｉｎｉ
ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７６（５３１９）：１７１９－１７２４、Ｃｉｃｅｒｉｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００７，１０９（１１）：１８２８－１８３６、Ｂｏｎｄａｎｚａｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ２００６，１０７（５）：１８２８－１８３６を参照されたい）。

追加の安全スイッチシステムは、細胞表面マーカーをコードする遺伝子を含み、その細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体の投与によって、ＡＤＣＣを介して、改変免疫エフェクター細胞を除去できるようになっている。いくつかの実施形態では、その細胞表面マーカーは、ＣＤ２０であり、その改変免疫エフェクター細胞は、リツキシマブのような抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の投与によって除去できる（例えば、Ｉｎｔｒｏｎａｅｔａｌ．，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ，２０００，１１（４）：６１１－６２０、Ｓｅｒａｆｉｎｉｅｔａｌ．，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ，２００４，１４，６３－７６、ｖａｎＭｅｅｒｔｅｎｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ，２００６，１３，７８９－７９７を参照されたい）。ＥＧＦ－Ｒ及びセツキシマブまたはパニツムマブを用いる同様のシステムが、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号に記載されている。追加の安全スイッチシステムは、二量化の化学誘導物質（ＣＩＤ）に対する結合部位を１つ以上含むプロアポトーシス分子をコードする導入遺伝子を含み、そのプロアポトーシス分子のオリゴマー化及びアポトーシス経路の活性化を誘導するＣＩＤの投与によって、改変免疫エフェクター細胞を除去できるようになっている。いくつかの実施形態では、そのプロアポトーシス分子は、Ｆａｓ（ＣＤ９５としても知られている）である（Ｔｈｏｍｉｓｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００１，９７（５），１２４９－１２５７）。いくつかの実施形態では、そのプロアポトーシス分子は、カスパーゼ－９である（Ｓｔｒａａｔｈｏｆｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５（１１），４２４７－４２５４）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、キメラスイッチ受容体をコードする外来性導入遺伝子をさらに含む。キメラスイッチ受容体は、内在性細胞表面受容体に由来する細胞外ドメイン、及び異種の細胞内シグナル伝達ドメインを含む操作型細胞表面受容体であり、その細胞外ドメインによってリガンドが認識されると、野生型の細胞表面受容体によって活性化されるシグナル伝達カスケードとは異なるシグナル伝達カスケードが活性化されるようになっている。いくつかの実施形態では、そのキメラスイッチ受容体は、細胞内ドメインに融合された抑制性の細胞表面受容体の細胞外ドメインを含み、その細胞内ドメインは、その抑制性の細胞表面受容体によって通常伝達される阻害シグナルではなく、活性化シグナルを伝達させるものである。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞の活性化を阻害することが知られている細胞表面受容体に由来する細胞外ドメインは、細胞内の活性化ドメインに融合できる。そして、対応するリガンドが結合すると、その免疫エフェクター細胞の活性化を阻害するのではなく、その活性化を増大させるシグナル伝達カスケードが活性化することになる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、ＰＤ１－ＣＤ２８スイッチ受容体をコードする導入遺伝子を含み、ＰＤ１の細胞外ドメインが、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインに融合されている（例えば、Ｌｉｕｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７６：６（２０１６），１５７８－１５９０及びＭｏｏｎｅｔ
ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２２（２０１４），Ｓ２０１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン及びＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする導入遺伝子を含む（Ｏｄａｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１３０：２２（２０１７），２４１０－２４１９を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、腫瘍細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）のような標的細胞によって発現されるタンパク質標的を認識する操作型抗原特異的受容体をさらに含む（本明細書では「改変受容体導入細胞」または「改変ＲＥ細胞」という）。「操作抗原受容体」という用語は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような非天然の抗原特異的受容体を指す。いくつかの実施形態では、その操作抗原受容体は、ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを介して、シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインに融合された細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、標的細胞によって発現される抗原に、ＭＨＣに依存しない形で結合し、ＲＥ細胞を活性化及び増殖させる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体またはその抗原結合断片に融合されたタグを認識する。このような実施形態では、ＣＡＲの抗原特異性は、標識抗体の抗原特異性に依存しており、その結果、ある１つの抗体を別の抗体に置き換えることによって、単一のＣＡＲコンストラクトを用いて、複数の異なる抗原を標的とすることができる（例えば、米国特許第９，２３３，１２５号及び同第９，６２４，２７９号、米国特許出願公開第２０１５０２３８６３１号及び同第２０１８０１０４３５４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体に由来する抗原結合断片を含んでよい。本開示において有用である抗原結合ドメインとしては、例えば、ｓｃＦｖ、抗体、抗体の抗原結合領域、重鎖／軽鎖の可変領域、及び一本鎖抗体が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体ζ鎖ドメイン（ＣＤ３ξシグナル伝達ドメインなど）、ＦｃγＲＩＩＩドメイン、ＦｃεＲＩドメインまたはＴリンパ球活性化ドメインに由来してよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、ＭｙＤ８８ドメインまたはＣＤ７０ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、ＭｙＤ８８ドメインまたはＣＤ７０ドメインのうちのいずれか２つを含む。例示的なＣＡＲの構造及び細胞内シグナル伝達ドメインは、当該技術分野において知られている（例えば、ＷＯ２００９／０９１８２６、ＵＳ２０１３０２８７７４８、ＷＯ２０１５／１４２６７５、ＷＯ２０１４／０５５６５７及びＷＯ２０１５／０９０２２９（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）。

様々な腫瘍抗原に特異的なＣＡＲが、当該技術分野において知られており、例えば、ＣＤ１７１特異的ＣＡＲ（Ｐａｒｋｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ（２００７）１５（４）：８２５－８３３）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ（Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ．，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ（２０１２）２３（１０）：１０４３－１０５３）、ＥＧＦ－Ｒ特異的ＣＡＲ（Ｋｏｂｏｌｄｅｔａｌ．，ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ（２０１４）１０７（１）：３６４）、炭酸脱水酵素Ｋ特異的ＣＡＲ（Ｌａｍｅｒｓ
ｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＳｏｃＴｒａｎｓ（２０１６）４４（３）：９５１－９５９）、ＦＲ－α特異的ＣＡＲ（Ｋｅｒｓｈａｗｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ（２００６）１２（２０）：６１０６－６０１５）、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ（Ａｈｍｅｄｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ（２０１５）３３（１５）１６８８－１６９６、Ｎａｋａｚａｗａｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ（２０１１）１９（１２）：２１３３－２１４３、Ａｈｍｅｄｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ（２００９）１７（１０）：１７７９－１７８７、Ｌｕｏｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＲｅｓ（２０１６）２６（７）：８５０－８５３、Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ（２０１０）１８（４）：８４３－８５１、Ｇｒａｄａｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ（２０１３）９（２）：３２）、ＣＥＡ特異的ＣＡＲ（Ｋａｔｚｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ（２０１５）２１（１４）：３１４９－３１５９）、ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲ（Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｃｎｅｒＲｅｓ（２０１５）２１（１８）：４０６２－４０７２）、ＧＤ２特異的ＣＡＲ（Ｌｏｕｉｓｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１８（２３）：６０５０－６０５６、Ｃａｒｕａｎａｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｄ（２０１５）２１（５）：５２４－５２９）、ＥｒｂＢ２特異的ＣＡＲ（Ｗｉｌｋｉｅｅｔａｌ．，Ｊ
ＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ（２０１２）３２（５）：１０５９－１０７０）、ＶＥＧＦＦ－Ｒ特異的ＣＡＲ（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ（２０１６）２２（２）：４３６－４４７）、ＦＡＰ特異的ＣＡＲ（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ（２０１４）２（２）：１５４－１６６）、ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ（Ｍｏｏｎｅｔａｌ，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ（２０１１）１７（１４）：４７１９－３０）、ＮＫＧ２Ｄ特異的ＣＡＲ（ＶａｎＳｅｇｇｅｌｅｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ（２０１５）２３（１０）：１６００－１６１０）、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（アキシカブタジンシロルーセル（Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標））及びチサゲンレクルユーセル（Ｋｙｍｒｉａｈ（登録商標））である。腫瘍特異的ＣＡＲの臨床試験について論評しているＬｉｅｔａｌ．，ＪＨｅｍａｔｏｌａｎｄ
Ｏｎｃｏｌ（２０１８）１１（２２）も参照されたい。

いくつかの実施形態では、操作抗原受容体は、操作ＴＣＲである。操作ＴＣＲは、特定の標的抗原を認識するＴ細胞集団から単離及びクローニングしたＴＣＲα鎖及び／またはＴＣＲβ鎖を含む。例えば、ＴＣＲα遺伝子及び／またはＴＣＲβ遺伝子（すなわち、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ）は、特定の悪性腫瘍を有する個体から単離したＴ細胞集団、または所定の腫瘍抗原もしくは腫瘍細胞で免疫したヒト化マウスから単離したＴ細胞集団からクローニングできる。操作ＴＣＲは、その内在性対応物と同じ機序を通じて（例えば、標的細胞の表面に発現した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質との関連において提示されたその同種抗原を認識することによって）、抗原を認識する。この抗原と結合すると、内在性シグナル伝達経路が刺激され、それにより、ＴＣＲ操作細胞が活性化及び増殖する。

腫瘍抗原に特異的な操作ＴＣＲは、当該技術分野において知られており、例えば、ＷＴ１特異的ＴＣＲ（ＪＴＣＲ０１６（ＪｕｎｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、米国特許出願公開第２０１６００８３４４９号に記載されているＷＴ１－ＴＣＲｃ４）、ＭＡＲＴ－１特異的ＴＣＲ（Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１４（２００６）１２６－１２９に記載されているＤＭＦ４Ｔクローン、Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１１４（２００９）５３５－５４６に記載されているＤＭＦ５Ｔクローン、及びｖａｎｄｅｎＢｅｒｇｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３（２０１５）１５４１－１５５０に記載されているＩＤ３Ｔクローンを含む）、ｇｐ１００特異的ＴＣＲ（Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１１４（２００９）５３５－５４６）、ＣＥＡ特異的ＴＣＲ（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ．１９（２０１１）６２０－６２６）、ＮＹ－ＥＳＯ及びＬＡＧＥ－１特異的ＴＣＲ（Ｒｏｂｂｉｎｓ
ｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２６（２０１１）９１７－９２４、Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２１（２０１５）１０１９－１０２７及びＲａｐｏｐｏｒｔｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２１（２０１５）９１４－９２１に記載されている１Ｇ４Ｔクローン）、ならびにＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ（Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ３６（２０１３）１３３－１５１及びＬｉｎｅｔｔｅｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１２２（２０１３）２２７－２４２）である。（Ｄｅｂｅｔｓｅｔａｌ．，ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２３（２０１６）１０－２１も参照されたい。）

いくつかの実施形態では、その操作抗原受容体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ７８、ＣＤ８０（Ｂ７－１としても知られている）、ＣＤ８６（Ｂ７－２としても知られている）、ＣＤ９６、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７１（ＣＬＬ１としても知られている）のような分化クラスター分子、５Ｔ４、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９及びＴＮＦＲＳＦ１７としても知られている。ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ０２２２３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸまたはＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２など）、ＥＬＦ２Ｍ、導管上皮ムチン、エフリンＢ２、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＦＣＲＬ５（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ６８ＳＮ８）、ＦＫＢＰ１１（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＹＬ４）、神経膠腫関連抗原、スフィンゴ糖脂質、ｇｐ３６、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＺＤ１）、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、腸カルボキシルエステラーゼ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＩＴＧＡ８（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ５３７０８）、ＫＡＭＰ３、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ、メソセリン、好中球エラスターゼ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｋｐ３０、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＡＰ、プロスターゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＭＡ、プロステイン、ＲＡＧＥ－１、ＲＯＲ１、ＲＵ１（ＳＦＭＢＴ１）、ＲＵ２（ＤＣＤＣ２）、ＳＬＡＭＦ７（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＱ２５）、サバイビン、タグ－７２及びテロメラーゼのような腫瘍関連表面抗原、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）のような腫瘍間質抗原、テネイシン－ＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣＡ１）及び線維芽細胞関連タンパク質（ＦＡＰ）、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＴＦＧβ－Ｒまたはその構成成分（エンドグリンなど）のようなサイトカイン受容体、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、ＨＩＶ特異的抗原（ＨＩＶｇｐ１２０など）、ＥＢＶ特異的抗原、ＣＭＶ特異的抗原、ＨＰＶ特異的抗原、ラッサウイルス特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原のようなウイルス特異的表面抗原、及びこれらの表面抗原のいずれかの誘導体またはバリアントから選択した標的抗原に対するものである。

Ａ．エフェクター機能
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、１つ以上の免疫細胞エフェクター機能が上昇する。本明細書では、「エフェクター機能」という用語は、免疫細胞の機能のうち、標的細胞または標的抗原に対する免疫応答の発生、維持及び／または増強に関連する機能を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞では、非改変免疫エフェクター細胞と比べて、腫瘍への浸潤性もしくは遊走性が向上する特徴、増殖性が向上する特徴、細胞生存能が向上もしくは延長する特徴、周囲の微小環境における抑制因子耐性が向上して、その細胞の活性化状態が延長または増大するようになる特徴、炎症誘発性免疫因子（例えば、炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン及び／または酵素）の産生が増加する特徴、細胞傷害性が向上する特徴、及び／または疲弊耐性が向上する特徴のうちの１つ以上が見られる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、非改変免疫エフェクター細胞と比べて、腫瘍への浸潤性が向上する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞による腫瘍への浸潤性の向上とは、所定の期間において腫瘍に浸潤する改変免疫エフェクター細胞の数が、同じ期間において腫瘍に浸潤する非改変免疫エフェクター細胞の数と比べて増加することを指す。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、腫瘍への浸潤性が、非改変免疫細胞と比べて１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度向上する。腫瘍への浸潤性は、対象から１つ以上の腫瘍を単離し、フローサイトメトリー、免疫組織化学及び／または免疫蛍光法によって、その試料中の改変免疫細胞の数を評価することによって測定できる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、細胞増殖性が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて向上する。これらの実施形態では、その結果は、所定の期間の経過後、存在する改変免疫エフェクター細胞の数が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて増加することである。例えば、いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、増殖速度が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて上昇し、この場合、改変免疫エフェクター細胞は、非改変免疫エフェクター細胞よりも速い速度で分裂する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、増殖速度が、非改変免疫細胞と比べて１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度上昇する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、増殖期間が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて長く、この場合、その改変免疫エフェクター細胞及び非改変免疫エフェクター細胞は、同じ速度で分裂するが、改変免疫エフェクター細胞の方が、長い期間にわたって増殖状態を維持する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、非改変免疫細胞よりも、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度長い時間、増殖状態を維持する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、細胞生存能が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて向上するかまたは延長される。このような実施形態では、その結果は、所定の期間の経過後、存在する改変免疫エフェクター細胞の数が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて増加することである。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、非改変免疫細胞よりも、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度長い時間、生存状態を維持して存続する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、抑制因子耐性が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて向上する。例示的な抑制因子としては、免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＩＤＯ）及び／または抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ）によるシグナル伝達が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔ細胞は、Ｔ細胞疲弊に対する耐性が、非改変Ｔ細胞と比べて向上する。Ｔ細胞疲弊は、エフェクター機能が低下し、その後、抗原特異的Ｔ細胞が枯渇することによって特徴付けられる抗原特異的Ｔ細胞機能障害の状態である。いくつかの実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、抗原に応答して増殖する能力が欠損し、サイトカインの産生が減少し、及び／または腫瘍細胞のような標的細胞に対する細胞傷害性が低下する。いくつかの実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、ＣＤ１２２及びＣＤ１２７の細胞表面での発現の減少、ＰＤ１、Ｌａｇ３、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＭ３及び／またはＣＴＬＡ４のような抑制性細胞表面マーカーの発現の増加、及び／またはＢｌｉｍｐ１、ＮＦＡＴ及び／またはＢＡＴＦのような転写因子の発現の増加のような、細胞表面マーカー及び転写因子の発現の変化によって特定する。いくつかの実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、ＴＧＦβのシグナル伝達に対する感受性の上昇及び／またはＩＬ－７及びＩＬ－１５のシグナル伝達に対する感受性の低下のような、サイトカインのシグナル伝達に対する感受性の変化が見られる。Ｔ細胞疲弊は、例えば、そのＴ細胞を標的細胞集団と共培養し、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生及び／または標的細胞の溶解を測定することによって判断することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を標的細胞（例えば、標的腫瘍抗原を発現するように操作した自己腫瘍細胞または自己腫瘍細胞株）の集団と共培養し、エフェクター細胞の増殖、サイトカインの産生及び／または標的細胞の溶解を測定する。続いて、これらの結果と、標的細胞をコントロールの免疫細胞（非改変免疫エフェクター細胞、またはコントロールの改変が施された免疫エフェクター細胞）集団と共培養することによって得られた結果を比較する。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、改変免疫エフェクター細胞による１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦαまたはＩＬ－２）の産生が、コントロールの免疫細胞集団で観察されるサイトカインの産生と比べて増加することによって示される。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞によるサイトカインの産生が、コントロールの免疫細胞集団によるサイトカインの産生と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度増加することによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、改変免疫エフェクター細胞の増殖性が、コントロールの免疫細胞集団で観察される増殖性と比べて向上することによって示される。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の増殖性が、コントロールの免疫細胞集団の増殖性と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度向上したことによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、改変免疫エフェクター細胞による標的細胞の溶解が、コントロールの免疫細胞集団で観察される標的細胞の溶解と比べて増大することによって示される。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞による標的細胞の溶解が、コントロールの免疫細胞集団による標的細胞の溶解と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを超える程度増大することによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。

いくつかの実施形態では、コントロールの免疫細胞集団と比較した場合の改変免疫エフェクター細胞の疲弊は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏでの製造プロセス中に測定する。例えば、いくつかの実施形態では、腫瘍断片から単離したＴＩＬを、本明細書に記載されている方法に従って改変してから、１ラウンド以上増殖させて、改変ＴＩＬ集団を作製する。このような実施形態では、その改変ＴＩＬの疲弊は、回収直後及び第１ラウンドの増殖の前、第１ラウンドの増殖後かつ第２ラウンドの増殖の前、及び／または第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の後に判断することができる。いくつかの実施形態では、コントロールの免疫細胞集団と比べた場合の改変免疫エフェクター細胞の疲弊は、改変免疫エフェクター細胞を対象に移入した後、１つ以上の時点に測定する。例えば、いくつかの実施形態では、その改変細胞を、本明細書に記載されている方法に従って作製し、対象に投与する。続いて、移入後、様々な時点に、試料を対象から採取して、ｉｎｖｉｖｏでの改変免疫エフェクター細胞の経時的な疲弊を判断することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、炎症誘発性免疫因子の発現または産生が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて増加する。炎症誘発性免疫因子の例としては、グランザイムＢ、パーフォリン及びグラニュライシンのような細胞溶解因子、ならびにインターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、ＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＣＸＣＬ８及び／またはＩＬ－６のような炎症誘発性サイトカインが挙げられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対する細胞傷害性が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて上昇する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対する細胞傷害性が、非改変免疫細胞と比べて、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度上昇する。

免疫エフェクター機能を測定するためのアッセイは、当該技術分野において知られている。例えば、腫瘍への浸潤性は、対象から腫瘍を単離し、その腫瘍に存在するリンパ球の総数及び／または表現型をフローサイトメトリー、免疫組織化学及び／または免疫蛍光法によって求めることによって測定できる。細胞表面受容体の発現は、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、ウエスタンブロット及び／またはｑＰＣＲによって求めることができる。サイトカイン及びケモカインの発現及び産生は、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ及び／またはｑＰＣＲによって測定できる。細胞外の刺激（例えば、サイトカイン、抑制性リガンドまたは抗原）に対する応答性または感受性は、その刺激に応答する細胞増殖及び／または下流のシグナル伝達経路の活性化（例えば、下流のシグナル伝達中間体のリン酸化）をアッセイすることによって測定できる。細胞傷害性は、実施例全体を通じて説明されているような改変免疫エフェクター細胞と標的細胞とのｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏでの共培養及びｉｎｖｉｖｏマウス腫瘍モデルを含め、当該技術分野において知られている標的細胞溶解アッセイによって測定できる。

Ｂ．内在性の経路及び遺伝子の調節
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現もしくは機能が低下され、及び／または１つ以上の内在性標的遺伝子（下に記載されている）の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、エフェクター細胞応答の活性化及び調節に関連する経路に存在する。このような実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子の発現または機能の低下により、その免疫細胞の１つ以上のエフェクター機能が増強される。

本明細書に記載されている方法によって調節するのに適する例示的な経路は、表１に示されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞において、特定の経路内の内在性標的遺伝子の発現が低下する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞において、特定の経路内の複数（例えば２つ以上）の内在性標的遺伝子の発現が低下する。例えば、特定の経路における２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の発現が低下し得る。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞において、ある１つの経路内の内在性標的遺伝子の発現、及び別の経路内の内在性標的遺伝子の発現が低下する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞において、ある１つの経路内の複数の内在性標的遺伝子の発現、及び別の経路内の複数の内在性標的遺伝子の発現が低下する。例えば、ある１つの経路内の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の発現が低下してよく、別の特定の経路内の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の発現が低下してよい。

いくつかの実施形態では、複数の経路内の複数の内在性標的遺伝子の発現が低下する。例えば、複数の経路（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の経路）のそれぞれに由来する１つの内在性遺伝子が低下してよい。追加の態様では、複数の経路（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の経路）のそれぞれに由来する複数の内在性遺伝子（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の遺伝子）が低下してよい。
表１：例示的な内在性経路

例示的な内在性標的遺伝子は、下記の表２及び３に示されている。

いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲのうちの１つ以上（例えば、表２から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲのうちの１つ以上の発現及び／または機能が低下されている。

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した少なくとも２つの遺伝子（例えば、表２から選択した少なくとも２つの遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。例えば、いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図１Ａ～図１Ｂに示されているような１～６００番の組み合わせから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＢＣＯＲの発現及び／または機能の低下、ならびにＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及び／またはＢＣＯＲの発現を改変するための例示的な方法は、本明細書に記載されているが、これらの内在性標的遺伝子の発現は、当該技術分野において知られている方法によって改変してもよい。例えば、ＰＤ１（ＰＤＣＤ１によってコードされる）、ＮＲＰ１、ＨＡＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ及びＣＴＬＡ４に対する阻害抗体が、当該技術分野において知られており、腫瘍の適応症で、ＦＤＡの承認を受けているものもある（例えば、ＰＤ１に対するニボルマブ及びペムブロリズマブ）。

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１のうちの１つ以上（例えば、表３から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＣＤ１０８としても知られているセマフォリン７Ａ（ＳＥＭＡ７Ａ）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＳＥＭＡ７Ａ遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＲＮＡ結合タンパク質３９（ＲＢＭ３９）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＲＢＭ３９タンパク質は、核に存在し、核内で、コアスプライセオソームタンパク質と共局在する。このタンパク質との配列類似性が高いマウスタンパク質の研究により、このタンパク質が、ＪＵＮ／ＡＰ－１及びエストロゲン受容体に対する転写コアクチベーターとして機能し得ることが示唆されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＲＢＭ３９遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、一般的にはＢＩＭとも呼ばれているＢｃｌ－２様タンパク質１１（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、転写因子ＥＲＧＢとしても知られているフレンド白血病インテグレーション１転写因子（ＦＬＩ１）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＦＬＩ１遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、カルモジュリン２（ＣＡＬＭ２）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＣＡＬＭ２遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤＨＯＤＨ）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＤＨＯＤＨタンパク質は、ミトコンドリア内膜の外面にあるミトコンドリアタンパク質であり、ｄｅｎｏｖｏピリミジン生合成において、ユビキノンの媒介によるジヒドロオロト酸塩のオロト酸塩への酸化を触媒する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＤＨＯＤＨ遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼまたはオロチジン－５’－デカルボキシラーゼともいうウリジンモノリン酸シンターゼ（ＵＭＰＳ）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＵＭＰＳタンパク質は、多くの重要な生合成経路において、エネルギーを運ぶ分子であるウリジンモノリン酸（ＵＭＰ）の形成を触媒する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＵＭＰＳ遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、システインリッチ疎水性ドメイン２（ＣＨＩＣ２）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。コードされたＣＨＩＣ２タンパク質は、システインリッチ疎水性（ＣＨＩＣ）モチーフを含み、小胞構造及び細胞膜に局在するとともに、急性骨髄性白血病の一部の症例と関連付けられている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＣＨＩＣ２遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ポリ（ｒＣ）結合タンパク質１（ＰＣＢＰ１）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＰＣＢＰ１遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＢＲＧ１関連因子１８０（ＢＡＦ１８０）としても知られているタンパク質ポリブロモ－１（ＰＢＲＭ１）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＰＢＲＭ１は、クロマチン再構築複合体ＳＷＩ／ＳＮＦ－Ｂの構成成分であり、多くのサブタイプのがんにおける腫瘍抑制因子遺伝子である。変異は特に、明細胞腎細胞癌で多く見られる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＰＢＲＭ１遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、成体組織及び胎児組織で遍在して発現するＷＤリピートタンパク質ファミリーのメンバーであるＷＤリピート含有タンパク質６（ＷＤＲ６）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＷＤリピートは、最小限に保存された領域であって、典型的にはｇｌｙ－ｈｉｓ及びｔｒｐ－ａｓｐ（ＧＨ－ＷＤ）をひとまとまりとする、およそ４０アミノ酸の領域であり、ヘテロ三量体複合体または複数タンパク質の複合体の形成を促進し得る。このファミリーのメンバーは、細胞周期の進行、シグナル伝達、アポトーシス及び遺伝子の調節を含む様々な細胞プロセスに関与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＷＤＲ６遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、Ｅ２Ｆ転写因子８（Ｅ２Ｆ８）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。コードされたＥ２Ｆ８タンパク質は、核が適切な時点に分裂するようにすることによって、Ｇ１期からＳ期への進行を調節する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、Ｅ２Ｆ８遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、セルピンファミリーＡメンバー３（ＳＥＲＰＩＮＡ３）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＳＥＲＰＩＮＡ３は、α１－アンチキモトリプシン（α１ＡＣ、Ａ１ＡＣまたはａ１ＡＣＴ）タンパク質をコードし、このタンパク質は、カテプシンＧ及びキマーゼのような特定のプロテアーゼの活性を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＧＮＡＳ複合遺伝子座（ＧＮＡＳ）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。これは、多くのシグナル伝達経路の重要な構成成分である刺激性Ｇタンパク質αサブユニット（Ｇｓ－α）である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＧＮＡＳ遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子の発現が低下されている。ＡＮＫＲＤ１１タンパク質は、未知の機序によりリガンド依存性転写活性化を阻害すると考えられる、アンキリンリピートドメイン含有タンパク質である。ＡＮＫＲＤ１１タンパク質は、ＫＢＧ症候群と関連していると考えられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、サイトカインシグナル伝達抑制因子ＳＯＣＳ１（ＳＯＣＳ１）遺伝子の発現が低下されている。ＳＯＣＳ１タンパク質は、Ｃ末端ＳＯＣＳボックスモチーフ、ＳＨ２ドメイン、ＥＳＳドメイン及びＮ末端ＫＩＲドメインを含む。キナーゼ阻害領域（ＫＩＲ）と呼ばれる１２個のアミノ酸残基が、ＪＡＫ１、ＴＹＫ２及びＪＡＫ２チロシンキナーゼの機能を負に調節するＳＯＣＳ１の能力において極めて重要であることが判明している。

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１のうちの少なくとも２つの遺伝子（例えば、表３から選択した２つ以上の遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。例えば、いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図３Ａ～図３Ｂに示されているような１００１～１２４０番の組み合わせから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図３Ａに示されているような１００１～１２１０番の組み合わせから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図３Ｂに示されているような１２１１～１２４０番の組み合わせから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図３Ｂに示されているような１２１１～１２２５番の組み合わせから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図３Ｂに示されているような１２２６～１２４０番の組み合わせから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１の発現及び／または機能が低下されている。

いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１のうちの１つ以上（例えば、表３から選択した１つ以上の遺伝子）、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲのうちの１つ以上（例えば、表２から選択した１つ以上の遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。例えば、その改変免疫エフェクター細胞は、６０１～１０００番の組み合わせから選択した組み合わせの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されていてよい。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、６０１～９５０番の組み合わせ（図２Ａに示されているような組み合わせ）から選択した組み合わせの２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されていてよい。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、９５１～１０００番の組み合わせ（図２Ｂに示されているような組み合わせ）から選択した組み合わせの２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されていてよい。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、９５１～９７５番の組み合わせ（図２Ｂに示されているような組み合わせ）から選択した組み合わせの２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されていてよい。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、９５１～１０００番の組み合わせ（図２Ｂに示されているような組み合わせ）から選択した組み合わせの２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されていてよい。

いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した少なくとも１つの遺伝子の発現及び／または機能の低下、ならびにＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢもしくはＢＣＯＲから選択した少なくとも１つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１及びＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲから選択した少なくとも１つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１及びＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲから選択した少なくとも１つの遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＡＮＫＲＤ１１及びＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲから選択した少なくとも１つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＡＮＫＲＤ１１及びＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲから選択した少なくとも１つの遺伝子に不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１から選択した少なくとも１つの遺伝子の発現及び／または機能の低下、ならびにＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した少なくとも１つの遺伝子の発現及び／または機能の低下、ならびにＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢに不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＡＮＫＲＤ１１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＡＮＫＲＤ１１及びＣＢＬＢに不活性化変異を含む。

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した遺伝子（例えば、表２から選択した１つ以上の遺伝子）の発現及び／または機能の低下、ならびにＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１から選択した２つの遺伝子（例えば、表３から選択した１つ以上の遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。例えば、いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、１１７６～１６８１番の組み合わせ（図３Ａ～図３Ｂに示されているような組み合わせ）から選択した組み合わせの２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下に加えて、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１から選択した遺伝子（例えば、表３から選択した遺伝子）の発現及び／または機能の低下、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した２つの遺伝子（例えば、表２から選択した１つ以上の遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。例えば、いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図１Ａ～図１Ｂに示されている１～６００番の組み合わせから選択した２つの内在性標的遺伝子の組み合わせの発現及び／または機能の低下に加えて、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１のうちのいずれか１つの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図１Ａ～図１Ｂに示されている１～６００番の組み合わせから選択した２つの内在性標的遺伝子の組み合わせの発現及び／または機能の低下に加えて、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図１Ａ～図１Ｂに示されている１～６００番の組み合わせから選択した２つの内在性標的遺伝子の組み合わせの発現及び／または機能の低下に加えて、ＳＯＣＳ１の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図１Ａ～図１Ｂに示されている１～６００番の組み合わせから選択した２つの内在性標的遺伝子の組み合わせの発現及び／または機能の低下に加えて、ＡＮＫＲＤ１１の発現及び／または機能が低下されている。

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、表２から選択した複数の遺伝子の発現及び／または機能の低下、ならびに表３から選択した複数の遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、表２から選択した２つの遺伝子の発現及び／または機能の低下、ならびに表３から選択した２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。例えば、いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図３Ａ～図３Ｂに示されているような１１７６～１６８１番の組み合わせから選択した組み合わせの２つの遺伝子、ならびに図１Ａ～図１Ｂに示されているような１～６００番の組み合わせから選択した組み合わせの２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲのうちの３つ以上の発現及び／または機能の低下、ならびにＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１のうちの３つ以上の発現及び／または機能が低下されていてよい。
表２：例示的な内在性遺伝子
表３：新規調節のための例示的な遺伝子

ＩＩＩ．遺伝子調節システム
本明細書では、「遺伝子調節システム」という用語は、細胞に導入したときに、内在性標的ＤＮＡ配列を改変することによって、コードされる遺伝子産物の発現または機能を調節することができるタンパク質、核酸またはそれらを組み合わせたものを指す。本開示の方法で使用するのに適する多くの遺伝子編集システムが、当該技術分野において知られており、そのシステムとしては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステム及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが挙げられるが、これらに限らない。

本明細書で使用する場合、遺伝子調節システムが内在性標的遺伝子に及ぼす作用に関連して「調節する」を使用するときには、「調節する」には、その内在性標的遺伝子の配列のいずれの変化、その内在性標的遺伝子のエピジェネティックな状態のいずれの変化、及び／またはその内在性標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは機能のいずれの変化も含まれる。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、例えば、内在性標的配列において１つ以上の核酸を挿入するかまたは欠失させることによるなど、１つ以上の変異をその内在性標的配列に導入することによって、その内在性標的遺伝子の配列の変化を媒介し得る。その内在性標的配列の変化を媒介できる例示的な機序としては、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）（例えば古典的または代替的）、マイクロホモロジー媒介性末端結合（ＭＭＥＪ）、相同配向型修復（例えば内在性ドナーテンプレート媒介性）、ＳＤＳＡ（合成依存的一本鎖アニーリング）、一本鎖アニーリングまたは一本鎖侵入が挙げられるが、これらに限らない。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的配列のエピジェネティックな状態の変化を媒介し得る。例えば、いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的遺伝子のＤＮＡの共有結合の改変（例えば、シトシンのメチル化及びヒドロキシメチル化）、または関連ヒストンタンパク質の改変（例えば、リシンのアセチル化、リシン及びアルギニンのメチル化、セリン及びトレオニンのリン酸化、ならびにリシンのユビキチン化及びＳＵＭＯ化）を媒介し得る。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の変化を媒介し得る。このような実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的ＤＮＡ配列を改変することによって、またはそのＤＮＡ配列によってコードされるｍＲＮＡ産物に作用することによって、そのコードタンパク質の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムによって、改変内在性タンパク質を発現させ得る。このような実施形態では、その遺伝子調節システムの媒介により、内在性ＤＮＡ配列が改変されると、非改変免疫エフェクター細胞における対応する内在性タンパク質と比べて機能が低下した内在性タンパク質が発現される。このような実施形態では、その改変内在性タンパク質の発現レベルは、非改変免疫細胞における対応する内在性タンパク質の発現レベルよりも上昇しても低下してもよく、あるいは、その対応する内在性タンパク質の発現レベルと同じであっても実質的に同程度であってもよい。

Ａ．核酸ベースの遺伝子調節システム
本明細書で使用する場合、核酸ベースの遺伝子調節システムは、外因性タンパク質を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を調節できる１つ以上の核酸分子を含むシステムである。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、標的核酸配列と相補的であるＲＮＡ干渉分子またはアンチセンスＲＮＡ分子を含む。

「アンチセンスＲＮＡ分子」とは、長さを問わず、ｍＲＮＡ転写物と相補的であるＲＮＡ分子を指す。アンチセンスＲＮＡ分子とは、細胞、組織または対象に導入でき、内在性遺伝子のサイレンシング経路に依存するのではなく、ＲＮａｓｅＨの媒介による、標的ｍＲＮＡ転写物の分解に依存する機序を通じて、内在性標的遺伝子産物の発現を低下させる、一本鎖ＲＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、改変された主鎖、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは当該技術分野において知られているその他の主鎖を含み、あるいは、非天然のヌクレオシド間結合を含んでもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、ロックト核酸（ＬＮＡ）を含むことができる。

「ＲＮＡ干渉分子」とは、本明細書で使用する場合、内在性遺伝子のサイレンシング経路（例えば、ダイサー及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））を通じて、標的ｍＲＮＡを分解することによって、内在性標的遺伝子産物の発現の低下を媒介するＲＮＡポリヌクレオチドを指す。例示的なＲＮＡ干渉剤としては、マイクロＲＮＡ（本明細書では「ｍｉＲＮＡ」ともいう）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー及びモルホリノが挙げられる。

いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のｍｉＲＮＡを含む。ｍｉＲＮＡとは、約２１～２５ヌクレオチド長で天然の、小分子の非コードＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは、１つ以上の標的ｍＲＮＡ分子と少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡは、翻訳の抑制、ｍＲＮＡの切断及び／または脱アデニル化を通じて、内在性標的遺伝子産物の発現をダウンレギュレートする（例えば低下させる）ことができる。

いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のｓｈＲＮＡを含む。ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を形成するとともに、相補的なｍＲＮＡ配列を分解させる約５０～７０ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、細胞内に導入されるプラスミドまたは非複製型の組み換えウイルスベクターにクローニングして、ｓｈＲＮＡコード配列がゲノムに組み込まれるようにできる。したがって、ｓｈＲＮＡは、内在性標的遺伝子の翻訳及び発現を安定的かつ着実に抑制させることができる。

いくつかの実施形態では、核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡとは、典型的には約２１～２３ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）という複数タンパク質複合体と会合し、その会合の際に、「パッセンジャー」センス鎖が酵素的に切断される。そして、活性化ＲＩＳＣに含まれるアンチセンス「ガイド」鎖が、配列相同性によって、対応するｍＲＮＡにＲＩＳＣを導き、同じヌクレアーゼが標的ｍＲＮＡを切断し、その結果、特異的な遺伝子サイレンシングが行われる。最適には、ｓｉＲＮＡは、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長または２４ヌクレオチド長であり、その３’末端に、２塩基のオーバーハングを有する。ｓｉＲＮＡは、個々の細胞及び／または培養系に導入して、標的ｍＲＮＡ配列を分解させることができる。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡについては、Ｆｉｒｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：１９，１９９８、ならびに米国特許第７，７３２，４１７号、同第８，２０２，８４６号及び同第８，３８３，５９９号にさらに記載されている。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のモルホリノを含む。「モルホリノ」は、本明細書で使用する場合、標準的な核酸塩基がモルホリン環に結合しているとともに、ホスホロジアミデート結合を通じて連結されている改変核酸オリゴマーを指す。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡと同様に、モルホリノは、相補的なｍＲＮＡ配列に結合する。しかしながら、モルホリノは、相補的なｍＲＮＡ配列を分解させるために標的とするのではなく、ｍＲＮＡの翻訳を立体的に阻害し、ｍＲＮＡスプライシングを変化させることを通じて機能する。

いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲ（すなわち、表２に列挙されている遺伝子）から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。本願の全体を通じて、参照ゲノム座標は、ＧｅｎｏｍｅＲｅｆｅｒｅｎｃｅＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍから得たヒトゲノムのＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８ともいう）アセンブリーのゲノムアノテーションに基づくものであり、このアセンブリーは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトで入手可能である。ある１つのアセンブリーと別のアセンブリーとの間でゲノム座標を変換するツール及び方法は、当該技術分野において知られており、そのツール及び方法を用いて、本明細書に示されているゲノム座標を、ヒトゲノムの別のアセンブリーにおける対応する座標に変換できる（同じ機関によってまたは同じアルゴリズムを用いて作製された以前のアセンブリーに変換すること（例えば、ＧＲＣｈ３８からＧＲＣｈ３７に変換すること）、及び異なる機関またはアルゴリズムによって作製されたアセンブリーを変換すること（例えば、ＧＲＣｈ３８から、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって作製されたＮＣＢＩ３３に変換すること）を含む）。当該技術分野において知られている利用可能な方法及びツールとしては、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトで利用可能なＮＣＢＩＧｅｎｏｍｅＲｅｍａｐｐｉｎｇＳｅｒｖｉｃｅ、ＵＣＳＣＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｅｒのウェブサイトで利用可能なＵＣＳＣＬｉｆｔＯｖｅｒ、及びＥｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇのウェブサイトで利用可能なＡｓｓｅｍｂｌｙＣｏｎｖｅｒｔｅｒが挙げられるが、これらに限らない。

いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができ、配列番号４９９～５２４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＢＣＯＲの発現及び／または機能を低下させることができ、配列番号７０８～７７２または配列番号７０８～７６４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能を低下させることができ、配列番号３４８～３９６または配列番号３４８～３８６のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒなどのような市販業者から入手可能なｓｉＲＮＡコンストラクト及びｓｈＲＮＡコンストラクトなど、当該技術分野において知られているｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子から選択したｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＣＢＬＢであり、その核酸分子は、配列番号４１～４４から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第２０１８１５６８８６号を参照されたい）または配列番号４５～５３から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開ＷＯ２０１７１２０９９８号を参照されたい）である。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＣＢＬＢであり、その核酸分子は、配列番号５４～６３から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号を参照されたい）または配列番号６４～７３から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８１２０９９８号及び同第ＷＯ２０１８１３７２９３号を参照されたい）である。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＴＮＦＡＩＰ３であり、その核酸分子は、配列番号７４～９５から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ（米国特許第８，３２４，３６９号を参照されたい）である。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＴＮＦＡＩＰ３であり、その核酸分子は、配列番号９６～１０５から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号を参照されたい）である。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＣＴＬＡ４であり、その核酸分子は、配列番号１２８～１３３から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７１２０９９６号を参照されたい）である。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＣＴＬＡ４であり、その核酸分子は、配列番号１３４～１４３から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７１２０９９６号、同第ＷＯ２０１７１２０９９８号、同第ＷＯ２０１８１３７２９５号及び同第ＷＯ２０１８１３７２９３号を参照されたい）または配列番号１４４～１５３から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号を参照されたい）である。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＰＤＣＤ１であり、その核酸分子は、配列番号１０６～１０７から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７１２０９９６号を参照されたい）である。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＰＤＣＤ１であり、その核酸分子は、配列番号１０８～１１７から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７１２０９９６号、同第ＷＯ２０１７１２９９８号、同第ＷＯ２０１８１３７２９５号及び同第ＷＯ２０１８１３７２９３号を参照されたい）または配列番号１１８～１５３から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号を参照されたい）である。

いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１（すなわち、表３に列挙されている遺伝子）から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表６Ａ～表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号８１４～１２３２のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。

いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表６Ａまたは表６Ｂのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。

いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表６Ｃまたは表６Ｄのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１０８８～１２００のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１０８８～１１４０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１０８８～１１２０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１０８８～１１１０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１１０２，１１０３，１１０５～１１０８、１１１５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１１０６、１１１０、１１１５、１１１６、１１１８、１１２６、１１２９、１１４１、１１５７、１１７４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。

いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＡＮＫＲＤ１１の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表６Ｅまたは表６Ｆのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、その核酸分子は、配列番号１２３６～１２５５から選択した標的配列に結合するｓｈＲＮＡ（米国特許第９，９４４，９３１号を参照されたい）である。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、その核酸分子は、配列番号１２５８～１２６０から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ（米国特許第８，３２４，３６９号を参照されたい）である。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、その核酸分子は、配列番号１２６１～１２７０から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡである（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７１２０９９６号、同第ＷＯ２０１８１３７２９５号、同第ＷＯ２０１７１２０９９８号及び同第ＷＯ２０１８１３７２９３号を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＡＮＫＲＤ１１であり、その核酸分子は、配列番号１２３３～１２３５から選択した標的配列に結合するｓｈＲＮＡである（Ｇａｌｌａｇｈｅｒｅｔａｌ．，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＣｅｌｌ（２０１５），３２（１）；３１－４２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＡＮＫＲＤ１１であり、その核酸分子は、配列番号１２５６～１２５７から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡである（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ（２００７）３５８（４）：１０３４－１０４０を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒなどのような市販業者から入手可能なｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子など、当該技術分野において知られているｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子から選択したｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。例示的なｓｉＲＮＡコンストラクト及びｓｈＲＮＡコンストラクトは、下記の表４Ａ及び表４Ｂに記載されている。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表４Ａに記載されているｓｉＲＮＡコンストラクトなど、当該技術分野において知られているｓｉＲＮＡ分子から選択した２つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表４Ｂに記載されているｓｈＲＮＡコンストラクトなど、当該技術分野において知られているｓｈＲＮＡ分子から選択した２つ以上のｓｈＲＮＡ分子を含む。
表４Ａ：例示的なｓｉＲＮＡコンストラクト
表４Ｂ：例示的なｓｈＲＮＡコンストラクト

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子（例えば、２つ以上のｓｉＲＮＡ、２つ以上のｓｈＲＮＡ、２つ以上のＲＮＡアプタマーまたは２つ以上のモルホリノ）を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子（例えば、表２から選択した遺伝子）のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１から選択した標的遺伝子（例えば、表３から選択した遺伝子）のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表６Ａ～表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１２３２のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表６Ａまたは表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢのＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２、配列番号１０８８～１２００、配列番号１０８８～１１４０または配列番号１０８８～１１２０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１１０６、１１１０、１１１５、１１１６、１１１８、１１２６、１１２９、１１４１、１１５７、１１７４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１１０２，１１０３，１１０５～１１０８、１１１５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｅまたは表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。

Ｂ．タンパク質ベースの遺伝子調節システム
いくつかの実施形態では、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、核酸ガイド分子を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を配列特異的な形で調節することができる１つ以上のタンパク質を含むシステムである。いくつかの実施形態では、そのタンパク質ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質ベースの遺伝子調節システムは、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。このような実施形態は、本明細書では「ＴＡＬＥＮ」という。

１．ジンクフィンガーシステム
ジンクフィンガーベースのシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインという２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、１つ以上のジンクフィンガーを通じて、ＤＮＡと配列特異的な形で結合するタンパク質、またはより巨大なタンパク質内のドメインであり、その結合ドメイン内のアミノ酸配列領域のうち、亜鉛イオンへの配位を通じて構造が安定化している領域である。ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列に結合することによって、その配列近傍の酵素ドメインの活性を誘導し、その結果、標的配列近傍の内在性標的遺伝子の改変を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的にいずれの所望の配列にも結合するように操作できる。したがって、切断または組み換えを行いたい標的ＤＮＡ配列を含む標的遺伝子座（例えば、表２または３で言及されている標的遺伝子内の標的座位）を特定した後、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを操作して、その標的遺伝子座内の１つ以上の標的ＤＮＡ配列に結合するようにできる。ジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含む融合タンパク質が細胞内で発現すると、その標的遺伝子座で改変が行われる。

いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを含む。Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４：１６０９－１６１４、Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎＦｅｂｕａｒｙ：５６－６５、米国特許第６，４５３，２４２号。典型的には、単一のジンクフィンガードメインは、約３０個のアミノ酸の長さである。個々のジンクフィンガーは、３つのヌクレオチド（すなわちトリプレット）配列（または隣接するジンクフィンガーの４つのヌクレオチド結合部位と、１つのヌクレオチドが重複し得る４つのヌクレオチド配列）に結合する。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインを操作して、結合するようにする配列（例えば標的配列）の長さによって、操作ジンクフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガーの数が決まることになる。例えば、フィンガーモチーフが、重複するサブ部位には結合しないＺＦＰの場合には、６個のヌクレオチド標的配列には、２つのフィンガー結合ドメインが結合し、９個のヌクレオチド標的配列には、３つの結合ドメインが結合するなどである。標的部位における、個々のジンクフィンガーの結合部位（すなわちサブ部位）は、マルチフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガー間（すなわち、フィンガー間のリンカー）のアミノ酸配列の長さ及び性質に応じて、連続している必要はなく、１つまたは数個のヌクレオチドによって隔てられていることができる。いくつかの実施形態では、個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、個別のジンクフィンガーリピートを３～６個含み、それぞれ、９～１８塩基対を認識できる。

ジンクフィンガー結合ドメインは、所定の配列に結合するように操作できる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉｅｔａｌ．（２００２）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏｅｔａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎｅｔａｌ．（２００１）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌｅｔａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏｅｔａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６を参照されたい。操作ジンクフィンガー結合ドメインは、天然のジンクフィンガータンパク質と比べて、新規な結合特異性を有することができる。操作方法としては、合理的設計及び様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限らない。

ジンクフィンガードメインによる結合について標的ＤＮＡ配列を選択することは、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号に開示されている方法に従って行うことができる。標的ＤＮＡ配列の選択を行うために、ヌクレオチド配列を単に目視確認することも利用できることは、当業者には明らかであろう。したがって、本明細書に記載されている方法では、標的ＤＮＡ配列を選択するためのいずれの手段も用いることができる。標的部位は概して、少なくとも９ヌクレオチドの長さであるので、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインと結合する。しかしながら、例えば、４つのフィンガーの結合ドメインと１２ヌクレオチドの標的部位との結合、５つのフィンガーの結合ドメインと１５ヌクレオチドの標的部位との結合、または６つのフィンガーの結合ドメインと１８ヌクレオチドの標的部位との結合も可能である。明らかなように、上記よりも大きい結合ドメイン（例えば、７個、８個、９個以上のフィンガー）と、上記よりも長い標的部位との結合も可能である。

いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子（例えば、表２から選択した遺伝子）の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢの標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＢＣＯＲの標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７０８～７７２または配列番号７０８～７６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＴＮＦＡＩＰ３の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３４８～３９６または配列番号３４８～３８６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１から選択した標的遺伝子（例えば、表３から選択した遺伝子）の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表６Ａ～表６Ｆのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８１４～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表６Ａまたは表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表６Ｅまたは表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガーシステムは、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈのような市販業者から入手可能なジンクフィンガーシステムなど、当該技術分野において知られているジンクフィンガーシステムから選択する。例えば、いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガーシステムは、下記の表７に記載されているジンクフィンガーシステムなど、当該技術分野において知られているジンクフィンガーシステムから選択する。
表７：例示的なジンクフィンガーシステム

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表６Ａ～表６Ｆのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表６Ａまたは表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｄまたは表６Ｅに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、選択したＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

そのジンクフィンガー融合タンパク質の酵素ドメイン部分は、いずれのエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼからも得ることができる。酵素ドメインの由来元とし得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限らない。例えば、２００２－２００３Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．及びＢｅｌｆｏｒｔｅｔａｌ．（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ。Ｌｉｎｎｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上を切断ドメインの供給源として用いることができる。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｅまたは表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

本明細書に記載されているＺＦＰの酵素ドメインとして用いるのに適する例示的な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的に結合して、結合部位でまたは結合部位の近傍でＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えばタイプＩＩＳ）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、離れていることのできる結合ドメイン及び切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素であるＦｏｋＩは、一方の鎖では、その認識部位から９ヌクレオチドの位置で、もう一方の鎖では、その認識部位から１３ヌクレオチドの位置で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号及び同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉｅｔａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５－４２７９、Ｌｉｅｔａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４－２７６８、Ｋｉｍ
ｅｔａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３－８８７、Ｋｉｍｅｔａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのタイプＩＩＳ制限酵素に由来する酵素ドメイン、及び１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。

切断ドメインが結合ドメインから離れていることのできる例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特有の酵素は、二量体として活性を有する。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅｅｔａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１０，５７０－１０，５７５。したがって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合体を用いて、二本鎖ＤＮＡの標的切断を行うには、ＦｏｋＩ酵素ドメインをそれぞれ含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒活性を持つ切断ドメインを再構成できる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ酵素ドメインを含む単一のポリペプチド分子を用いることもできる。ＦｏｋＩ酵素ドメインを含む例示的なＺＦＰは、米国特許第９，７８２，４３７号に記載されている。

２．ＴＡＬＥＮシステム
ＴＡＬＥＮベースのシステムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。このシステムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製する。上記のＦｏｋＩ制限酵素は、ＴＡＬＥＮベースの遺伝子調節システムで用いるのに適する例示的な酵素ドメインである。

ＴＡＬエフェクターは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌が植物に感染するときに、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌によって、そのタイプＩＩＩ分泌システムを介して分泌されるタンパク質である。上記のＤＮＡ結合ドメインは、高度に保存された３３～３４個のアミノ酸の反復配列を含むが、１２番目と１３番目のアミノ酸は異なる。これらの２つの位置は、反復可変二残基（ＲＶＤ）といい、可変性が高く、特異的なヌクレオチドの認識と密接に相関する。したがって、適切なＲＶＤを含む反復セグメントの組み合わせを選択することによって、ＴＡＬエフェクタードメインを操作して、特定の標的ＤＮＡ配列と結合するようにできる。ＲＶＤの組み合わせの核酸特異性は、以下のとおりである。すなわち、ＨＤは、シトシンを標的とし、ＮＩは、アデニンを標的とし、ＮＧは、チミンを標的とし、ＮＮは、グアニンを標的とする（ただし、いくつかの実施形態では、ＮＮは、グアニンよりも低い特異性で、アデニンとも結合し得る）。

いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子（例えば、表２から選択した遺伝子）の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＣＯＲ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、配列番号７０８～７７２または配列番号７０８～７６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＴＮＦＡＩＰ３の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、配列番号３４８～３９６または配列番号３４８～３８６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１から選択した標的遺伝子（例えば、表３から選択した遺伝子）の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表６Ａ～表６Ｆのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８１４～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表６Ａまたは表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表６Ｅまたは表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表６Ａ～表６Ｆのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表６Ａまたは表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインを含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢの標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｄまたは表６Ｅに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、選択したＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｅまたは表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

ＴＡＬエフェクターリピートをアセンブルするための方法及び組成物は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｃｅｒｍａｋｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，３９：１２，２０１１，ｅ８２を参照されたい。ＴＡＬエフェクターリピートを構築するためのプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから市販されている。

Ｃ．核酸／タンパク質複合体ベースの遺伝子調節システム
複合型遺伝子調節システムは、部位特異的改変ポリペプチド及び核酸ガイド分子を含む。本明細書では、「部位特異的改変ポリペプチド」とは、核酸ガイド分子に結合し、標的核酸配列（例えば、内在性標的ＤＮＡ配列または内在性標的ＲＮＡ配列）に結合するその核酸ガイド分子によってその標的核酸配列に導かれ、（例えば、その標的核酸配列の切断、変異またはメチル化によって）その標的核酸配列を改変するポリペプチドを指す。

部位特異的改変ポリペプチドは、核酸ガイドと結合する部分及び活性部分という２つの部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、部位特異的な酵素活性（例えば、ＤＮＡのメチル化、ＤＮＡまたはＲＮＡの切断、ヒストンのアセチル化、ヒストンのメチル化など）を呈する活性部分を含み、その酵素活性の部位は、ガイド核酸によって決定される。いくつかの場合では、部位特異的改変ポリペプチドは、内在性標的核酸配列を改変する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性）を有する活性部分を含む。別の場合では、部位特異的改変ポリペプチドは、内在性標的核酸配列と関連するポリペプチド（例えばヒストン）を改変する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボース化活性、脱リボース化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡ配列の転写を調節する（例えば、転写を増減させる）活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＲＮＡ配列の発現または翻訳を調節する（例えば、転写を増減させる）活性部分を含む。

その核酸ガイドは、内在性標的核酸配列と相補的であり、内在性標的核酸配列と結合できる第１の部分（本明細書では「核酸結合セグメント」という）、及び部位特異的改変ポリペプチドと相互作用できる第２の部分（本明細書では「タンパク質結合セグメント」という）という２つの部分を含む。いくつかの実施形態では、核酸ガイドの核酸結合セグメント及びタンパク質結合セグメントは、単一のポリヌクレオチド分子内に含まれている。いくつかの実施形態では、核酸ガイドの核酸結合セグメント及びタンパク質結合セグメントはそれぞれ、別々のポリヌクレオチド分子内に含まれており、その核酸ガイドは、会合し合って機能的ガイドを形成する２つのポリヌクレオチド分子を含むようになっている。

その核酸ガイドは、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズすることによって、タンパク質／核酸複合型の遺伝子調節システムの標的特異性を媒介する。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物内に含まれるＲＮＡ配列のようなＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、標的遺伝子のＤＮＡ配列内に含まれるＤＮＡ配列である。本明細書で標的遺伝子に言及する場合には、複数の標的遺伝子座（すなわち、特定の標的遺伝子配列の一部（例えば、エキソンまたはイントロン））を含むその特定の遺伝子の完全長ＤＮＡ配列が含まれる。各標的遺伝子座内にあるのは、本明細書に記載されている遺伝子調節システムによって改変できる、より短い領域のＤＮＡ配列（本明細書では「標的ＤＮＡ配列」という）である。さらに、各標的遺伝子座は、「標的改変部位」を含み、その標的改変部位とは、遺伝子調節システムによって誘導される改変の正確な位置（例えば、挿入、欠失もしくは変異の位置、ＤＮＡ切断の位置、またはエピジェネティックな改変の位置）を指す。

本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、単一の核酸ガイドを含んでも、複数の核酸ガイド（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の核酸ガイド）を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、タンパク質／核酸複合型の遺伝子調節システムは、アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓＡｇｏ、すなわちＴｔＡｇｏ）に由来する部位特異的改変ポリペプチドを含む。このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓＡｇｏＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、その核酸ガイドは、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である（Ｓｗａｒｔｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５０７（２０１４），２５８－２６１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＤＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、本開示は、部位特異的改変ポリペプチドＴｔＡｇｏまたはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドＴｔＡｇｏをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼシステムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、クラス２システムである。クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＩ型システム、Ｖ型システム及びＶＩ型システムという３つの型に分類される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９タンパク質を用いるクラス２ＩＩ型システムである。このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ９（またはそのバリアント）であり、その核酸ガイド分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られている）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１としても知られている）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３としても知られている）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹとしても知られている）及びＣａｓ１２ｅ（ＣａｓＸとしても知られている））を用いるクラス２Ｖ型システムである。このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ１２（またはそのバリアント）であり、その核酸ガイド分子は、ｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１３タンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２としても知られている）、Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｃ）を用いるクラス２のＶＩ型システムである。（Ｐｙｚｏｃｈａｅｔａｌ．，ＡＣＳＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ，１３（２），３４７－３５６を参照されたい。）このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、ＲＮＡリボエンドヌクレアーゼであるＣａｓ１３であり、その核酸ガイド分子は、ｇＲＮＡである。

Ｃａｓポリペプチドとは、ｇＲＮＡ分子と相互作用するとともに、ｇＲＮＡ分子に呼応して、標的ＤＮＡ配列または標的ＲＮＡ配列に誘導または局在化されることができるポリペプチドを指す。Ｃａｓポリペプチドには、天然のＣａｓタンパク質、及び操作、変更または別段に改変されたＣａｓタンパク質であって、天然のＣａｓ配列とは１つ以上のアミノ酸残基が異なるＣａｓタンパク質が含まれる。

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ＤＮＡ結合セグメント及びタンパク質結合セグメントという２つのセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、１つのＲＮＡ分子に含まれ、そのＤＮＡ結合セグメントは、別の異なるＲＮＡ分子に含まれる。このような実施形態は、本明細書では、「二重分子ｇＲＮＡ」、「二分子ｇＲＮＡ」または「デュアルｇＲＮＡ」という。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子であり、本明細書では、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」という。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、包括的な用語であり、二分子ガイドＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの両方を指す。

ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部分的に、ハイブリダイズし合って二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する２つの相補的ヌクレオチド領域を含み、そのｄｓＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質への結合を促す。ｇＲＮＡの核酸結合セグメント（または「核酸結合配列」）は、特異的な標的核酸配列と相補的であり、その配列に結合できるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓポリペプチドと相互作用し、ｇＲＮＡ分子と部位特異的改変ポリペプチドとの相互作用によって、Ｃａｓが内在性核酸配列に結合し、標的核酸配列内または標的核酸配列内周辺で、１つ以上の改変が行われる。標的改変部位の正確な位置は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的核酸配列との塩基対形成の相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ配列内にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）という短いモチーフの位置（標的ＲＮＡ配列内では、プロトスペーサー隣接配列（ＰＦＳ）という）の両方によって決定される。Ｃａｓが標的核酸配列に結合するには、ＰＡＭ／ＰＦＳ配列が必要となる。様々なＰＡＭ／ＰＦＳ配列が当該技術分野において知られており、特定のＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）とともに使用するのに適する（例えば、ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ．２０１３Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６－１１２１及びＳｃｉＲｅｐ．２０１４；４：５４０５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列内の標的改変部位から５０塩基対以内に位置する。いくつかの実施形態では、そのＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列内の標的改変部位から１０塩基対以内に位置する。本発明の方法によって標的にすることができるＤＮＡ配列は、ＰＡＭ配列と標的改変部位との相対的な距離、及び配列特異的かつｇＲＮＡ媒介性のＣａｓ結合を媒介するための特有の２０塩基対の配列の存在によってのみ制限される。いくつかの実施形態では、そのＰＦＳ配列は、標的ＲＮＡ配列の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、その標的改変部位は、標的座位の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、その標的改変部位は、標的座位の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、その標的改変部位は、標的座位のイントロンまたはエキソン内に位置する。

いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、本開示は、部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。

１．Ｃａｓタンパク質
いくつかの実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質である。本明細書に記載されている方法及び組成物では、様々な種のＣａｓ分子を使用でき、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｓｐ．、Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｐ．、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｘｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｓｐｕｔｏｍｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓｓｐ．、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍｓｐ．、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍｓｐ．、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ
ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｐ．またはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒｅｉｓｅｎｉａｅに由来するＣａｓ分子が挙げられる。

いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、天然のＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、そのＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａともいう）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３及びＣｓｆ４からなる群から選択する。

いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質のようなエンドリボヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ａタンパク質（Ａｂｕｄａｙｙｅｈｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５５０（２０１７），２８０－２８４）、Ｃａｓ１３ｂタンパク質（Ｃｏｘｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）３５８：６３３６，１０１９－１０２７）、Ｃａｓ１３ｃタンパク質（Ｃｏｘｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）３５８：６３３６，１０１９－１０２７）またはＣａｓ１３ｄタンパク質（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１７５（２０１８），２１２－２２３）である。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型または天然のＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オルソログである。野生型Ｃａｓ９は、ＤＮＡの標的鎖を切断するためのＨＮＨヌクレアーゼドメイン、及び非標的鎖を切断するためのＲｕｖＣ様ドメインを用いるマルチドメイン酵素である。ｇＲＮＡの特異性に基づき、野生型Ｃａｓ９がＤＮＡに結合すると、二本鎖ＤＮＡが切断され、この切断部は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同配向型修復（ＨＤＲ）によって修復できる。例示的な天然のＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉｅｔａｌ．，ＲＮＡＢｉｏｌｏｇｙ２０１３１０：５，７２７－７３７に記載されており、追加のＣａｓ９オルソログは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号に記載されている。このようなＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスター３細菌ファミリー、クラスター４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラスター６細菌ファミリー、クラスター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、クラスター９細菌ファミリー、クラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファミリー、クラスター１２細菌ファミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１４細菌ファミリー、クラスター１５細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラスター１７細菌ファミリー、クラスター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミリー、クラスター２０細菌ファミリー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２細菌ファミリー、クラスター２３細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラスター２５細菌ファミリー、クラスター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミリー、クラスター２８細菌ファミリー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０細菌ファミリー、クラスター３１細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラスター３３細菌ファミリー、クラスター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミリー、クラスター３６細菌ファミリー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８細菌ファミリー、クラスター３９細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラスター４１細菌ファミリー、クラスター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミリー、クラスター４４細菌ファミリー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６細菌ファミリー、クラスター４７細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、クラスター４９細菌ファミリー、クラスター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミリー、クラスター５２細菌ファミリー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４細菌ファミリー、クラスター５５細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラスター５７細菌ファミリー、クラスター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミリー、クラスター６０細菌ファミリー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２細菌ファミリー、クラスター６３細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラスター６５細菌ファミリー、クラスター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミリー、クラスター６８細菌ファミリー、クラスター６９細菌ファミリー、クラスター７０細菌ファミリー、クラスター７１細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラスター７３細菌ファミリー、クラスター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミリー、クラスター７６細菌ファミリー、クラスター７７細菌ファミリーまたはクラスター７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子が挙げられる。

いくつかの実施形態では、天然のＣａｓ９ポリペプチドは、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９及びＮｍｅＣａｓ９からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉｅｔａｌ．，ＲＮＡＢｉｏｌｏｇｙ２０１３１０：５，７２７－７３７、Ｈｏｕｅｔａｌ．，ＰＮＡＳＥａｒｌｙＥｄｉｔｉｏｎ２０１３，１－６に記載されているＣａｓ９アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、
（ａ）ニッカーゼ活性、すなわち、一本鎖、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖を切断する能力、
（ｂ）二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断を起こす能力（一実施形態では、２つのニッカーゼ活性の存在である）、
（ｃ）エンドヌクレアーゼ活性、
（ｄ）エキソヌクレアーゼ活性及び／または
（ｅ）ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力、
という活性のうちの１つ以上を含む。

いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、様々な修復機序による、標的配列の修復の可能性または修復率をさらに向上させるために、ＤＮＡ損傷シグナル伝達タンパク質、エキソヌクレアーゼまたはホスファターゼを動員する異種タンパク質に融合されている。いくつかの実施形態では、相同配向型修復による外因性核酸配列の導入を促すために、野生型Ｃａｓポリペプチドを核酸修復鋳型と共発現させる。

いくつかの実施形態では、（例えば、それぞれに異なるＰＡＭ配列選択性、酵素活性の向上または低下、細胞傷害性レベルの上昇または低下、ＮＨＥＪ、相同配向型修復、一本鎖切断、二本鎖切断などのバランスの変更のために）それぞれに異なるＣａｓタンパク質の様々な酵素特性を活用するためには、それぞれに異なるＣａｓタンパク質（すなわち、様々な種に由来するＣａｓ９タンパク質）が、提供する各種方法で用いるものとして有益である場合がある。

いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡというＰＡＭ配列モチーフを認識する（Ｍａｌｉｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１３；３３９（６１２１）：８２３－８２６）。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧＮＧ及び／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｈｏｒｖａｔｈｅｔ
ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０；３２７（５９６２）：１６７－１７０及びＤｅｖｅａｕｅｔａｌ，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ２００８；１９０（４）：１３９０－１４００を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧ及び／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｄｅｖｅａｕｅｔａｌ，ＪＢＡＣＴＥＲＩＯＬ２００８；１９０（４）：１３９０－１４００を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＡＴＴまたはＮＧＣＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｈｏｕｅｔａｈ，ＰＮＡＳ２０１３，１－６を参照されたい）。上記の実施形態では、Ｎは、いずれのヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれであることもできる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｓｈａｈｉｉに由来するＣａｓ１３タンパク質であり、３’の単一のＡ、ＵまたはＣというＰＦＳ配列モチーフを認識する。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉｅｔａｌ．，ＲＮＡＢｉｏｌｏｇｙ２０１３１０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９０％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉｅｔａｌ．，ＲＮＡＢｉｏｌｏｇｙ２０１３１０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ，ＲＮＡＢｉｏｌｏｇｙ２０１３１０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と１００％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。

２．Ｃａｓ変異体
いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、Ｃａｓポリペプチドの１つ以上の特性を改変させるために操作されている。例えば、いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、酵素特性が改変されており、例えば、（天然のＣａｓ分子もしくは他の参照Ｃａｓ分子と比べて）ヌクレアーゼ活性が改変されているか、またはヘリカーゼ活性が改変されている。いくつかの実施形態では、操作Ｃａｓポリペプチドは、その大きさを改変させる改変、例えば、そのＣａｓポリペプチドの別の特性に有意な影響を及ぼさずに、その大きさを縮小させる、アミノ酸配列の欠失を有することができる。いくつかの実施形態では、操作Ｃａｓポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす改変を含む。例えば、操作Ｃａｓポリペプチドは、対応する野生型Ｃａｓタンパク質によって認識されるＰＡＭ配列以外のＰＡＭ配列を認識するように改変させることができる。

所望の特性を有するＣａｓポリペプチドは、いくつかの方法で作製することができ、その方法としては、所望の特性を有する変異体または改変型のＣａｓポリペプチドを得られるように、天然のＣａｓポリペプチドまたは親Ｃａｓポリペプチドを改変することが挙げられる。例えば、１つ以上の変異を親Ｃａｓポリペプチド（例えば、天然のＣａｓポリペプチドまたは操作Ｃａｓポリペプチド）の配列に導入できる。このような変異及び相違は、置換（例えば、保存的置換もしくは重要ではないアミノ酸の置換）、挿入または欠失を含んでよい。いくつかの実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、親Ｃａｓポリペプチドに対して１個以上の変異（例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個または５０個の変異）を含む。

一実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、天然のＣａｓポリペプチドとは異なる切断特性を含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓは、不活性型Ｃａｓ（ｄＣａｓ）変異体である。このような実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、いずれの内在性酵素活性も含まず、標的核酸切断を媒介できない。このような実施形態では、そのｄＣａｓは、非切断ベースの形式で標的核酸を改変できる異種タンパク質と融合してよい。例えば、いくつかの実施形態では、ｄＣａｓタンパク質は、転写活性化因子または転写抑制因子のドメイン（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ
ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤまたはＳＩＤ４Ｘ）、ＥＲＦ抑制ドメイン（ＥＲＤ）、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）など）に融合されている。いくつかのこのような場合では、そのｄＣａｓ融合タンパク質は、ｇＲＮＡによって、標的核酸における所定の位置（すなわち配列）に導かれて、座位特異的な調節（ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターへの結合のブロック（それにより、転写活性化因子の機能を選択的に阻害する）及び／または局在的なクロマチンの状態の改変（例えば、標的ＤＮＡを改変するか、もしくは標的ＤＮＡと関連するポリペプチドを改変する融合配列を用いる場合）など）を行う。いくつかのケースでは、その変化は、一過性である（例えば、転写の抑制または活性化）。いくつかのケースでは、その変化は、遺伝性である（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡと関連するタンパク質、例えばヌクレオソームヒストンに、エピジェネティックな改変を加える場合）。

いくつかの実施形態では、そのｄＣａｓは、ｄＣａｓ１３変異体である（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１７３（２０１８），６６５－６７６）。そして、これらのｄＣａｓ１３変異体は、ＲＮＡを改変する酵素に融合でき、その酵素としては、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２）が挙げられる。アデノシンデアミナーゼは、アデニンをイノシンに変換し、そのイノシンを翻訳機構がグアニンのように扱うことにより、ＲＮＡ配列において、機能上はＡ→Ｇという変更が行われる。いくつかの実施形態では、そのｄＣａｓは、ｄＣａｓ９変異体である。

いくつかの実施形態では、その変異体のＣａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体である。Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体は、触媒活性を持つドメインを１つだけ含む（ＨＮＨドメインまたはＲｕｖＣドメインのいずれか）。このＣａｓ９ニッカーゼ変異体は、ｇＲＮＡ特異性に基づくＤＮＡ結合性を保持するが、切断できるのは、ＤＮＡの一方の鎖のみであることから、一本鎖切断（例えば「ニック」）が生じる。いくつかの実施形態では、同じ細胞内で、２つの相補的Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（例えば、ＲｕｖＣドメインが不活化された１つのＣａｓ９ニッカーゼ変異体、及びＨＮＨドメインが不活化された１つのＣａｓ９ニッカーゼ変異体）が、２つのそれぞれの標的配列（ＤＮＡセンス鎖上の１つの標的配列、及びＤＮＡアンチセンス鎖上の１つの標的配列）に対応する２つのｇＲＮＡとともに発現する。このデュアルニッカーゼシステムにより、ずれた位置で二本鎖切断が行われ、二本鎖切断を起こすのに充分なほど近くで２つのオフターゲットニックが生じる可能性が低くなるので、標的特異性を向上させることができる。いくつかの実施形態では、相同配向型修復による外因性核酸配列の導入を促すために、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体を核酸修復鋳型と共発現させる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＣａｓポリペプチドを操作して、そのＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性を改変できる。いくつかの実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、ＰＡＭ／ＰＦＳ特異性が、親ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性とは異なる。例えば、オフターゲット部位を減少させるか、特異性を向上させるか、またはＰＡＭ／ＰＦＳ認識要件を排除するために、天然のＣａｓタンパク質を改変して、その変異体Ｃａｓポリペプチドが認識するＰＡＭ／ＰＦＳ配列を改変できる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を改変して、ＰＡＭ／ＰＦＳ認識配列の長さを長くできる。いくつかの実施形態では、そのＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１５個のアミノ酸の長さである。指向性進化法を用いて、異なるＰＡＭ／ＰＦＳ配列を認識する、及び／またはオフターゲット活性が低減されたＣａｓポリペプチドを作製できる。Ｃａｓポリペプチドの指向性進化法で使用できる例示的な方法及びシステムは、例えば、Ｅｓｖｅｌｔｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ２０１１，４７２（７３４４）：４９９－５０３に記載されている。

例示的なＣａｓ変異体は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１６１２７６号及びＫｏｎｅｒｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１７３（２０１８），６６５－６７６に記載されており、これらは、参照により、その全体が本明細書に援用される。

３．ｇＲＮＡ
本開示は、部位特異的改変ポリペプチドを所定の標的核酸配列に誘導するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ｇＲＮＡは、「核酸ターゲティングドメイン」または「ターゲティングドメイン」、及びタンパク質結合セグメントを含む。そのターゲティングドメインは、「スペーサー」配列と称することもあり、標的核酸配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、ｇＲＮＡのターゲティングドメインセグメントは、配列特異的な形で、ハイブリダイゼーション（すなわち塩基対形成）によって標的核酸と相互作用し、ｇＲＮＡが結合する、標的核酸内の位置を決定する。ｇＲＮＡのターゲティングドメインセグメントを（例えば遺伝子操作によって）改変して、標的核酸配列内の所望の配列にハイブリダイズさせることができる。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、約１３～約２２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、約１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１または２２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、約２０ヌクレオチド長である。

ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部位特異的改変ポリペプチド（例えばＣａｓタンパク質）と相互作用して、そのｇＲＮＡ及びその部位特異的改変ポリペプチドを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。そして、ｇＲＮＡのターゲティングドメインセグメントが、結合した部位特異的改変ポリペプチドを、上記のスペーサー配列によって、標的核酸内の所定のヌクレオチド配列に導く。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるとともに、二本鎖ＲＮＡを形成する少なくとも２つのヌクレオチド領域を含む。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、「足場」セグメントまたは「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と称することもある。いくつかの実施形態では、そのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約３０～約１８０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約４０～約９０ヌクレオチド長、約５０～約９０ヌクレオチド長、約６０～約９０ヌクレオチド長、約６５～約８５ヌクレオチド長、約７０～約８０ヌクレオチド長、約６５～約７５ヌクレオチド長または約７５～約８５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７０ヌクレオチド長、７１ヌクレオチド長、７２ヌクレオチド長、７３ヌクレオチド長、７４ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、７６ヌクレオチド長、７７ヌクレオチド長、７８ヌクレオチド長、７９ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、８１ヌクレオチド長、８２ヌクレオチド長、８３ヌクレオチド長、８４ヌクレオチド長、８５ヌクレオチド長、８６ヌクレオチド長、８７ヌクレオチド長、８８ヌクレオチド長または約９０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号３４（Ｍａｌｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３３９（６１２１）：８２３－８２６を参照されたい）、配列番号３５～３６（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１０６２３６号を参照されたい）、配列番号３７～３９（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１Ｍａｒ３１；４７１（７３４０）：６０２－６０７を参照されたい）または配列番号４０（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３；１５５（７）；１４７９－１４９１を参照されたい）のＤＮＡ配列によってコードされる核酸配列を含む。上記のｔｒａｃｒ配列のいずれも、本明細書に記載されているｇＲＮＡターゲティングドメインの実施形態のいずれかと組み合わせて用いるのに適している。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む（すなわち、「デュアルｇＲＮＡ」）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子を含む（すなわち、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」）。本明細書では、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語を使用する際には、デュアルｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの両方が含まれる。デュアルｇＲＮＡは、「ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ」（または「ｃｒＲＮＡ」）及び「ｔｒａｃｒＲＮＡ」という２つの別個のＲＮＡ分子を含む。ｃｒＲＮＡ分子は、「ｔｒａｃｒメイト」配列に共有結合したスペーサー配列を含む。そのトレーサーメイト配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子内の対応する配列と相補的であるヌクレオチド領域を含む。このｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒ配列とトレーサーメイト配列の相補性によって、互いにハイブリダイズする。

いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。このような実施形態では、その核酸ターゲティング配列及びタンパク質結合配列は、スペーサー配列がｔｒａｃｒＲＮＡ配列に融合されていることによって、単一のＲＮＡ分子に存在する。いくつかの実施形態では、そのｓｇＲＮＡは、約５０～約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｓｇＲＮＡは、約７５～約１５０または約１００～約１２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｓｇＲＮＡは、約１００ヌクレオチド長である。

いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡは、標的座位内の標的核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相補的であるか、または１００％相補的であるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、ＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、ＤＮＡ標的配列である。

いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子（例えば、表２から選択した遺伝子）の配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。ＣＢＬＢを標的とするのに適する追加のｇＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１７／０１７５１２８号に記載されている。

いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、配列番号３４８～３９６または配列番号３４８～３８６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＢＣＯＲ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、配列番号７０８～７７２または配列番号７０８～７６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１から選択した標的遺伝子（例えば、表３から選択した遺伝子）の配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、表６Ａ～表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号８１４～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号８１４～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。

いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、表６Ａまたは表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号８１４～１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号８１４～１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。

いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＳＯＣＳ１遺伝子の配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１０８８～１２００のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１０８８～１２００のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。

いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＳＯＣＳ１遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１０８８～１１４０のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１０８８～１１４０のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１０８８～１１２０のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１０８８～１１２０のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１１０６、１１１０、１１１５、１１１６、１１１８、１１２６、１１２９、１１４１、１１５７、１１７４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１１０６、１１１０、１１１５、１１１６、１１１８、１１２６、１１２９、１１４１、１１５７、１１７４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１１０２、１１０３、１１０５～１１０８、１１１５のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１１０２、１１０３、１１０５～１１０８、１１１５のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。

いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子の配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、表６Ｅまたは表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子（例えば、表２から選択した遺伝子）の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１から選択した標的遺伝子（例えば、表３から選択した遺伝子）の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。

いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ａ～表６Ｆのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ａまたは表６Ｂのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢの標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４～１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｃまたは表６Ｄのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｅまたは表６Ｆのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４～４９８または配列番号４９９～８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９～５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。

いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｅまたは表６Ｆのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０８８～１２３２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５～１０８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、特定の標的座位または標的遺伝子に特有である標的配列を特定するための、当該技術分野において知られているアルゴリズム（例えばＣａｓ－ＯＦＦｆｉｎｄｅｒ）を用いて、オフターゲット結合を最小限にするように設計されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を付与する１つ以上の改変ヌクレオシドまたは改変ヌクレオチドを含むことができる。このような実施形態では、これらの改変ｇＲＮＡは、非改変ｇＲＮＡと比べて、自然免疫の低下を誘発し得る。「自然免疫応答」という用語には、概ねウイルスまたは細菌由来の一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞応答が含まれ、その応答には、サイトカイン、特にインターフェロンの発現及び放出、ならびに細胞死の誘導が伴う。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡは、５’末端または５’末端近傍（例えば、その５’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドまたは１～２ヌクレオチド以内）が改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端は、真核ｍＲＮＡのキャップ構造またはキャップアナログ（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというキャップアナログまたは３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ））を含めることによって改変されている。いくつかの実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏで転写させたｇＲＮＡが、ホスファターゼ（例えば仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）で処理して５’三リン酸基を除去することによって改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その３’末端またはその３’末端近傍（例えば、その３’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドまたは１～２ヌクレオチド以内）に改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端は、１つ以上（例えば、２５～２００個）のアデニン（Ａ）残基を付加することによって改変されている。

いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドは、ｇＲＮＡに存在できるが、他の遺伝子調節システム、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡベースのシステムにも存在し得る。いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドは、
（ａ）結合していないリン酸酸素及び／またはホスホジエステル骨格結合において結合しているリン酸酸素のうちの１つ以上のうちの一方または両方の改変、例えば置換、
（ｂ）リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変、例えば置換、
（ｃ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーへの大幅な置換、
（ｄ）天然の核酸塩基の改変または置換、
（ｅ）リボース－リン酸骨格の置換または改変、
（ｆ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変、例えば、末端のリン酸基の除去、改変もしくは置換、またはある部分のコンジュゲーション、ならびに
（ｇ）糖の改変、
のうちの１つ以上を含むことができる。

いくつかの実施形態では、上に列挙した改変を組み合わせて、改変を２個、３個、４個または５個以上有し得る改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドをもたらすことができる。例えば、いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシドまたは改変ヌクレオチドは、改変糖及び改変核酸塩基を有することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのすべての塩基が改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基のすべてが、それぞれホスホロチオエート基に置き換わっている。

いくつかの実施形態では、例えば、ゲノム全体における総オフターゲット活性を最小限にするために、ソフトウェアツールを用いて、ユーザーの標的配列内におけるｇＲＮＡの選択を最適化することができる。オフターゲット活性は、切断以外であってもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９を用いる場合の考え得る各ｇＲＮＡの選択を行う際には、ソフトウェアツールによって、ゲノム全体において、ある特定の数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）以下のミスマッチ塩基対を含むすべての潜在的オフターゲット配列（ＮＡＧまたはＮＧＧのいずれかのＰＡＭの直前に位置する）を特定できる。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験によって導出した重み付けスキームを用いて予測することができる。そして、考え得る各ｇＲＮＡをオフターゲット切断の総予測数によってランク付けし、上位のｇＲＮＡは、オンターゲット切断の可能性が最も高く、オフターゲット切断の可能性が最も低いｇＲＮＡとなる。そのツールには、他の機能、例えば、ｇＲＮＡベクターの構築用試薬の自動設計、オンターゲットＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ用プライマーの設計、次世代シーケンシングによってオフターゲット切断のハイスループットの検出及び定量を行うためのプライマーの設計の機能も含まれていることがある。

ＩＶ．ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている遺伝子調節システムをコードするポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってよく、組み換えたもの、合成したもの、単離したもののいずれかであってよい。ポリヌクレオチドとしては、プレメッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡまたは組み換えＤＮＡが挙げられるが、これらに限らない。ポリヌクレオチドとは、少なくとも５ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長、少なくとも１５ヌクレオチド長、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも２５ヌクレオチド長、少なくとも３０ヌクレオチド長、少なくとも４０ヌクレオチド長、少なくとも５０ヌクレオチド長、少なくとも１００ヌクレオチド長、少なくとも２００ヌクレオチド長、少なくとも３００ヌクレオチド長、少なくとも４００ヌクレオチド長、少なくとも５００ヌクレオチド長、少なくとも１０００ヌクレオチド長、少なくとも５０００ヌクレオチド長、少なくとも１００００ヌクレオチド長、少なくとも１５０００ヌクレオチド長、またはこれを上回るヌクレオチド長のヌクレオチドポリマー形態（リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの改変形態のいずれか）、ならびにあらゆる中間の長さのものを指す。この文脈においては、「中間の長さ」とは、示されている値の間のいずれの長さ（６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長など、１０１ヌクレオチド長、１０２ヌクレオチド長、１０３ヌクレオチド長など、１５１ヌクレオチド長、１５２ヌクレオチド長、１５３ヌクレオチド長など、２０１ヌクレオチド長、２０２ヌクレオチド長、２０３ヌクレオチド長など）も意味することは容易にわかるであろう。

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されていてよい。本明細書で使用する場合、「コドン最適化」という用語は、ポリペプチドの発現、安定性及び／または活性を向上させるために、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド内のコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響を及ぼす要因としては、（ｉ）２つ以上の生物もしくは遺伝子間または合成的に構築したバイアス表間におけるコドンバイアスのばらつき、（ｉｉ）生物、遺伝子または遺伝子セットにおけるコドンバイアスの程度のばらつき、（ｉｉｉ）コドンコンテクストを含むコドンの系統的なばらつき、（ｉｖ）コドンをデコードするｔＲＮＡによる、コドンのばらつき、（ｖ）トリプレット全体またはトリプレットの１つの位置のいずれかのＧＣ％による、コドンのばらつき、（ｖｉ）参照配列、例えば天然の配列との類似性の程度のばらつき、（ｖｉｉ）コドン頻度カットオフのばらつき、（ｖｉｉｉ）そのＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの構造的特性、（ｉｘ）コドン置換セットの設計のベースとなるＤＮＡ配列の機能に関する予備知識、（ｘ）各アミノ酸に対するコドンセットの系統的なばらつき、（ｘｉ）偽翻訳開始部位の単離除去、及び／または（ｘｉｉ）偶発性のポリアデニル化部位の除去（除去しなければ、短縮型ＲＮＡ転写産物が合成される）のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限らない。

「配列同一性」という記載、または例えば、「～と５０％同一である配列」を含む記載は、本明細書で使用する場合、配列が、比較ウィンドウにわたって、ヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を指す。「比較ウィンドウ」とは、ある配列と、連続した位置が同じ数である参照配列とを最適にアラインメントした後に、その２つの配列を比較する際の概念上のセグメントであって、連続した位置が少なくとも６個、一般的には約５０～約１００個、より一般的には約１００～約１５０個である概念上のセグメントを指す。したがって、「配列同一性（％）」は、最適にアラインメントした２つの配列を比較ウィンドウにわたって比較し、両方の配列において、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が同一であるかまたはアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が同一である位置の数を決定して、一致した位置の数を求め、その一致した位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で除し、その結果に１００を乗じて、配列同一性（％）を求めることによって算出し得る。

本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列との配列同一性が充分な値であるポリヌクレオチド、または下に定義されているストリンジェントな条件で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語には、参照ポリヌクレオチドと比べて、１つ以上のヌクレオチドを付加もしくは欠失させたか、または異なるヌクレオチドに置換したポリヌクレオチドが含まれる。これに関しては、変異、付加、欠失及び置換を含む、ある特定の改変を参照ポリヌクレオチドに加えることによって、その改変ポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的な機能または活性を保持するようにできることは、当該技術分野において充分に理解されているであろう。

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列との配列同一性が、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。

さらに、本明細書に記載されているように、遺伝暗号の縮退により、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその断片もしくはバリアントが数多く存在することは、当業者には明らかであろう。これらのポリヌクレオチドには、いずれの天然型遺伝子のヌクレオチド配列との相同性も最小限であるものもある。それにもかかわらず、特定の実施形態では、コドン使用頻度の違いにより様々であるポリヌクレオチド、例えば、ヒトコドン及び／または霊長類動物コドンの選択のために最適化されているポリヌクレオチドが具体的に企図されている。さらに、本発明で提供するポリヌクレオチド配列を含む対立遺伝子を用いてもよい。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加及び／または置換のような１つ以上の変異によって改変されている内在性遺伝子である。

本発明で企図されているポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書の別の箇所に開示されているか、または当該技術分野において知られているように、プロモーター及び／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、マルチクローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、ならびに自己切断ポリペプチド、エピトープタグをコードするポリヌクレオチドといった他のＤＮＡ配列と組み合わせてよく、そのため、全体の長さは、かなり異なることがある。したがって、特定の実施形態では、ほぼあらゆる長さのポリヌクレオチド断片を使用し得るが、好ましくは、全長は、意図されている組み換えＤＮＡのプロトコールでの調製及び使用のしやすさによって制限されることが想定される。

ポリヌクレオチドは、充分に確立され、当該技術分野において知られているとともに利用可能である様々な技法のうちのいずれかを用いて、調製、操作及び／または発現できる。

ベクター
本明細書に記載されている遺伝子調節システムを細胞内で発現させるために、その遺伝子調節システムをコードする発現カセットを適切なベクターに挿入できる。「核酸ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移入または輸送できる核酸分子を指す目的で用いられている。移入される核酸は概して、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入されている。核酸ベクターは、細胞内での自己複製を誘導する配列を含んでも、宿主細胞のＤＮＡへの組み込みを可能にするのに充分な配列を含んでもよい。

「発現カセット」という用語は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡを発現させた後に、タンパク質を発現させることができる、ベクター内の遺伝子配列を指す。その核酸カセットは、対象とする遺伝子、例えば遺伝子調節システムを含む。その核酸カセットは、ベクター内に位置的かつ順次的に配置されており、そのカセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要な場合には、タンパク質またはポリペプチドに翻訳され、その形質転換細胞内での活性のために必要となる適切な翻訳後修飾が施され、適切な細胞内区画に誘導されるか、または細胞外区画に分泌されることによって、生物学的活性のために適切な区画に移行することができるようになっている。好ましくは、そのカセットは、ベクターに挿入しやすいように適合された３’末端及び５’末端を有し、例えば、それぞれの末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。そのカセットは、単一のユニットとして取り出して、プラスミドまたはウイルスベクターに挿入することができる。

特定の実施形態では、ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、トランスポゾン、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージのようなバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、本発明で開示する遺伝子調節システムを哺乳動物細胞内で発現させるために、その遺伝子調節システムのコード配列を上記のようなベクターにライゲーションできる。

いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターを用いて、本発明で企図されている１つ以上のポリヌクレオチドを免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に送達する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、プラスミドである。数多くの好適なプラスミド発現ベクターが当業者に知られており、多くは市販されている。例えば、真核宿主細胞用では、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）というベクターが供給されている。しかしながら、宿主細胞と適合するものであれば、いずれの他のプラスミドベクターも使用し得る。使用する細胞の種類及び遺伝子調節システムに応じて、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、多くの好適な転写調節エレメント及び翻訳調節エレメントのうちのいずれかを発現ベクターで用いてよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒｅｔａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、ウイルスベクターである。好適なウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉｅｔａｌ．，ＩｎｖｅｓｔＯｐｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ３５：２５４３２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ６：５１５５２４，１９９９、ＬｉａｎｄＤａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ９２：７７００７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏｅｔａｌ．，ＨＧｅｎｅＴｈｅｒ５：１０８８１０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４及びＷＯ９５／００６５５を参照されたい）、アデノ随伴ウイルス（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号、Ａｌｉｅｔａｌ．，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ９：８１８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ９４：６９１６６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔｅｔａｌ．，ＩｎｖｅｓｔＯｐｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ３８：２８５７２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ４：６８３６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇｅｔａｌ．，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ１０：６４１６４８，１９９９、Ａｌｉｅｔａｌ．，ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ５：５９１５９４，１９９６、ＳｒｉｖａｓｔａｖａによるＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２－３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４－１６５及びＦｌｏｔｔｅｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３－１０６１７を参照されたい）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ９４：１０３１９２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ７３：７８１２７８１６，１９９９を参照されたい）をベースとするウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス及び乳癌ウイルスのようなレトロウイルスに由来するベクター）などが挙げられるが、これらに限らない。ベクターの例は、哺乳動物細胞での発現用のｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞内でレンチウイルスの媒介によって遺伝子の移入及び発現を行うためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。

いくつかの実施形態では、そのベクターは、非組み込み型ベクターであり、そのベクターとしては、エピソーマルベクター、または染色体外に保持されるベクターが挙げられるが、これらに限らない。本明細書で使用する場合、「エピソーマル」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれなくても、分裂宿主細胞から徐々に喪失することなく複製できるベクターを指し、前記ベクターが、染色体外でまたはエピソーマルに複製することも意味する。このベクターは、リンパ指向性ヘルペスウイルスもしくはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、または酵母に由来するＤＮＡ複製開始点、すなわち「ｏｒｉ」、特には、リンパ指向性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルスの複製開始点であって、ＥＢＶのｏｒｉＰに対応する複製開始点をコードする配列を有するように操作されている。特定の態様では、そのリンパ指向性ヘルペスウイルスは、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、リスザルヘルペスウイルス（ＨＳ）またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であってよい。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）は、ガンマヘルペスウイルスの例でもある。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トランスポゾンベクターシステムを用いて、標的細胞または宿主細胞に導入する。ある特定の実施形態では、そのトランスポゾンベクターシステムは、転移因子、及び本発明で企図されているポリヌクレオチド、ならびにトランスポザーゼを含むベクターを含む。一実施形態では、そのトランスポゾンベクターシステムは、単一のトランスポザーゼベクターシステムであり、例えば、ＷＯ２００８／０２７３８４を参照されたい。例示的なトランスポザーゼとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、Ｍｏｓ１、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ－Ｔｏｌ２、Ｔｃ３、ＭｕＡ、ＨｉｍａｒＩ、ＦｒｏｇＰｒｉｎｃｅ及びこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限らない。ｐｉｇｇｙＢａｃのトランスポゾン及びトランスポザーゼは、例えば米国特許第６，９６２，８１０号に記載されており、この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙのトランスポゾン及びトランスポザーゼは、例えばＩｚｓｖａｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０２：９３－１０２（２０００）に記載されており、この文献は、参照により、その全体が本明細書に援用される。Ｔｏｌ２のトランスポゾンは、メダカであるＯｒｙｚｉａｓｌａｔｉｐｅｓから初めて単離されたものであり、トランスポゾンのｈＡＴファミリーに属するが、このトランスポゾンは、Ｋａｗａｋａｍｉｅｔａｌ．（２０００）に記載されている。ｍｉｎｉ－Ｔｏｌ２は、Ｔｏｌ２のバリアントであり、Ｂａｌｃｉｕｎａｓｅｔａｌ．（２００６）に記載されている。Ｔｏｌ２及びｍｉｎｉ－Ｔｏｌ２のトランスポゾンは、Ｔｏｌ２のトランスポザーゼと共作用すると、導入遺伝子が生物のゲノムに組み込まれるように促す。ＦｒｏｇＰｒｉｎｃｅのトランスポゾン及びトランスポザーゼは、例えばＭｉｓｋｅｙｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：６８７３－６８８１（２００３）に記載されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、調節エレメント、例えば、プロモーターのような転写調節エレメントに機能可能に連結されている。「調節エレメント」とは、ベクターの非翻訳領域のうち、転写及び翻訳を行うために宿主細胞タンパク質と相互作用する非翻訳領域（例えば、複製開始点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（ＳｈｉｎｅＤａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’の非翻訳領域）を指す。このようなエレメントは、強度及び特異性が様々であり得る。この転写調節エレメントは、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または原核細胞（例えば、細菌細胞もしくは古細菌細胞）のいずれかで機能するものであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞及び真核細胞の両方でポリヌクレオチドの発現を可能にする複数の調節エレメントに機能可能に連結されている。

使用する細胞の種類及び遺伝子調節システムに応じて、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、多くの好適な転写調節エレメント及び翻訳調節エレメントのうちのいずれかを発現ベクターで用いてよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒｅｔａｌ．（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照されたい）。「プロモーター」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の部位のうち、ＲＮＡポリメラーゼが結合する認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに機能可能に連結されたポリヌクレオチドを開始させ、転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞で機能するプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチな領域、及び／または転写開始部位から７０～８０塩基上流に見られる別の配列、すなわちＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは、いずれのヌクレオチドであってもよい）を含む。「エンハンサー」という用語は、転写を増大させることができる配列を含むとともに、いくつかの場合では、別のコントロール配列に対するその配向とは無関係に機能し得るＤＮＡセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーター及び／または他のエンハンサーエレメントと連携する形、あるいはプロモーター及び／または他のエンハンサーエレメントに付加される形で機能し得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結されている。「機能可能に連結された」という用語は、記載されている構成成分が、意図されたとおりに機能できる関係で並置されていることを指す。一実施形態では、この用語は、核酸発現コントロール配列（プロモーター及び／またはエンハンサーなど）と、第２のポリヌクレオチド配列、例えば、遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドが機能的に連結されていることを指し、その発現コントロール配列は、その第２の配列に対応する核酸の転写を誘導する。

好適な真核生物プロモーター（真核細胞で機能するプロモーターを含む）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター（例えば、初期ＳＶ４０プロモーター及び後期ＳＶ４０プロモーター）、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、レトロウイルスに由来する長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーターまたはラウス肉腫ウイルス（ＲＡＶ）ＬＴＲプロモーター）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルスに由来するＨ５、Ｐ７．５及びＰ１１プロモーター、伸長因子１－α（ＥＦ１α）プロモーター、初期成長応答１（ＥＧＲ１）プロモーター、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）プロモーター、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）プロモーター、ヒートショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）プロモーター、ヒートショックタンパク質９０ｋＤａ βメンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）プロモーター、ヒートショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）プロモーター、β－キネシン（β－ＫＩＮ）プロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６座プロモーター（Ｉｒｉｏｎｓｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２５，１４７７－１４８２（２００７））、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーター及び骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー（ネガティブコントロール領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換）（ＭＮＤ）プロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は充分に、当業者のレベルの範囲内である。その発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターも含んでよい。その発現ベクターは、発現を増幅させるための適切な配列も含んでよい。その発現ベクターは、部位特異的改変ポリペプチドに融合されるタンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列も含み、それにより、キメラポリペプチドが得られるようになっていてもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに機能可能に連結されている。このような実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするそのポリヌクレオチドは、細胞内で構成的に及び／または遍在的に発現する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに機能可能に連結されている。このような実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドは、条件的に発現する。本明細書で使用する場合、「条件的発現」とは、いずれの種類の条件的発現も指してよく、条件的発現としては、誘導性発現、抑制的発現、特定の生理学的状態、生物学的状態または病態を有する細胞または組織内での発現（例えば、細胞の種類または組織に特異的な発現）などが挙げられるが、これらに限らない。誘導性プロモーター／誘導性システムの実例的な例としては、ステロイド誘導性プロモーター（グルココルチコイド受容体またはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター（対応するホルモンによる処理によって誘導可能）など）、メタロチオネインプロモーター（様々な重金属による処理によって誘導可能）、ＭＸ－１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、ミフェプリストン調節性システム「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」（Ｓｉｒｉｎｅｔａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅｓ，３２３：６７）、キュメート誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節システムなどが挙げられるが、これらに限らない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、転写終結シグナルをさらに含む。異種の核酸転写産物の効率的な終結及びポリアデニル化を誘導するエレメントが、異種の遺伝子の発現を増加させる。転写終結シグナルは概して、ポリアデニル化シグナルの下流に見られる。特定の実施形態では、ベクターは、発現させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’側に、ポリアデニル化配列を含む。「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結及びポリアデニル化の両方を誘導するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリＡテールをコード配列の３’末端に付加することによって、ｍＲＮＡの安定性を促進することで、翻訳効率の向上に寄与することができる。切断及びポリアデニル化は、ＲＮＡ内のポリ（Ａ）配列によって誘導される。哺乳動物ｐｒｅ－ｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断－ポリアデニル化部位を挟み込んでいる２つの認識エレメントを有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡという六量体が、Ｕ残基またはＧＵ残基に富む、より可変性の高いエレメントから２０～５０ヌクレオチド上流に存在する。新生転写物の切断は、これらの２つのエレメントの間で行われ、最大で２５０個のアデノシンを５’切断産物に付加することと共役している。特定の実施形態では、コアポリ（Ａ）配列は、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、これらのバリアント、または当該技術分野において知られている別の好適な異種もしくは内在性のポリＡ配列である。

いくつかの実施形態では、ベクターは、シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のためのシグナルペプチド）をコードする配列が、本発明のシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドに融合されたものも含んでよい。例えば、ベクターは、本発明のシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドに融合された核局在化配列（例えば、ＳＶ４０に由来する核局在化配列）を含んでよい。

ポリヌクレオチド及び組み換えベクターを宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において知られており、いずれかの既知の方法を用いて、遺伝子調節システムの構成成分を細胞に導入できる。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、バクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）仲介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン仲介トランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子仲介核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍｅｔａｌ．，ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ．２０１２Ｓｅｐ１３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９を参照されたい）、マイクロフルイディクス送達方法（例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０５９３４３号を参照されたい）などが挙げられる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションによる送達は、細胞と、遺伝子調節システムの構成成分とをカートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で混合すること、ならびに電気的刺激を所定の期間及び振幅で１回以上加えることを含む。いくつかの実施形態では、細胞と、遺伝子調節システムの構成成分との混合物をカートリッジ、チャンバーまたはキュベットに送る装置（例えばポンプ）に連結した反応容器で、細胞を遺伝子調節システムの構成成分と混合し、電気的刺激を１回以上、所定の期間及び振幅で加えた後、その細胞を第２の反応容器に送る。特定の実施形態で想定されている特定の実施形態で用いるのに適するポリヌクレオチド送達システムの実例的な例としては、ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｏｎ（商標）ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ．によって供給されているものが挙げられるが、これらに限らない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的なリポフェクションに適するカチオン性脂質及び中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕｅｔａｌ．（２００３）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．１０：１８０－１８７及びＢａｌａｚｓｅｔａｌ．（２０１１）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１－１２を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、ウイルスによる送達方法、例えばウイルストランスダクションによって、細胞に導入する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、ウイルス以外による送達方法によって、細胞に導入する。特定の実施形態で想定されている、ウイルス以外によってポリヌクレオチドを送達する実例的な方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ－デキストラン仲介移入、遺伝子銃（ｇｅｎｅｇｕｎ）及びヒートショックが挙げられるが、これらに限らない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分または遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、トランスポゾン、ナノ粒子（例えば脂質ナノ粒子）、リポソーム、エクソソーム、弱毒化細菌またはウイルス様粒子のようなウイルス以外の送達ビヒクルで、細胞に導入する。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、弱毒化細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ある特定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ及び改変Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉを含め、天然の細菌または人工的に操作されて、侵襲性であるが、発病を防ぐように弱毒化されている細菌）、標的特異的な細胞に対して栄養特異的及び組織特異的なトロピズムを有する細菌、標的細胞特異性を変化させるために、表面タンパク質が改変された細菌である。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、遺伝子改変バクテリオファージ（例えば、パッケージング能が大きく、免疫原性が小さめであり、哺乳動物のプラスミド保持配列を含み、ターゲティングリガンドが組み込まれた操作ファージ）である。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、哺乳動物のウイルス様粒子である。例えば、（例えば、「空の」粒子を精製してから、ｅｘｖｉｖｏでウイルスを所望のカーゴとともにアセンブルすることによって）改変ウイルス粒子を作製できる。そのビヒクルを操作して、ターゲティングリガンドを組み込んで、標的組織特異性を改変することもできる。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、生体リポソームである。例えば、その生体リポソームは、ヒト細胞に由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、赤血球ゴースト（対象に由来する赤血球を溶血させ、球体構造にしたものであり、組織ターゲティングは、様々な組織特異的または細胞特異的リガンドの結合によって実現できる））、分泌エクソソーム、すなわち、対象から得られる、エンドサイトーシス由来の膜結合型ナノベシクル（３０～１００ｎｍ）（例えば、様々な種類の細胞から産生され得るので、ターゲティングリガンドを必要とすることなく、細胞に取り込ませることができる）である。

ＩＶ．改変免疫エフェクター細胞の作製方法
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、その方法は、遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞集団に導入することを含み、その遺伝子調節システムは、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。

本明細書に記載されている遺伝子調節システム、例えば、核酸ベース、タンパク質ベースまたは核酸／タンパク質ベースのシステムの構成成分は、様々な送達方法及び製剤を用いて、様々な形態で標的細胞に導入できる。いくつかの実施形態では、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを組み換えベクター（例えば、上記のウイルスベクターまたはプラスミド）によって送達する。いくつかの実施形態では、そのシステムが、２つ以上の構成成分を含む場合には、ベクターは、そのシステムの構成成分をそれぞれコードする複数のポリヌクレオチドを含んでよい。いくつかの実施形態では、そのシステムが、２つ以上の構成成分を含む場合には、複数のベクターを用いてもよく、その各ベクターは、そのシステムの特定の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｉｎｖｉｔｒｏで行う。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｉｎｖｉｖｏで行う。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｅｘｖｉｖｏで行う。

特定の実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで行う。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、培養でさらなる操作を行わずに、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで改変する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞の作製方法は、さらなる活性化ステップ及び／または増殖ステップなしに、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで遺伝子調節システムを導入することを含む。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞には、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで、改変及びさらなる操作を行う。例えば、いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、遺伝子調節システムの導入前に、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで活性化及び／または増殖させる。いくつかの実施形態では、遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞に導入してから、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで、活性化及び／または増殖させる。いくつかの実施形態では、改変に成功した細胞を、改変に失敗した細胞から（例えばフローサイトメトリーによって）選別及び／または単離して、改変免疫エフェクター細胞の精製集団を作製できる。続いて、改変に成功したこれらの細胞をさらに増殖させて、改変細胞数を増加させ、及び／または将来使用するために凍結保存することができる。

いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、免疫エフェクター細胞集団を得ることを含む方法を提供する。免疫エフェクター細胞集団をｉｎｖｉｔｒｏにおいて、成長を支えるのに必要な様々な培養条件下、例えば、適切な温度（例えば３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ_２）、ならびに適切な培養培地で培養してよい。細胞培養培地の実例的な例としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及びビタミンが添加されており、無血清であるか、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）または所定のホルモン群、及び／またはその免疫エフェクター細胞を成長及び増殖させるのに十分な量のサイトカイン（複数可）が添加されている最小必須培地（ＭＥＭ）、イスコブ改変ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、クリック培地、ＡＩＭ－Ｖ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５、Ｘ－Ｖｉｖｏ２０及びＯｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられる。

培養培地には、増殖及び生存能に必要な１つ以上の因子を添加してもよく、その因子としては、血清（例えば、約５％～１０％のウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ及びＴＮＦ－αのような成長因子が挙げられるが、これらに限らない。Ｔ細胞を増殖させるための他の添加剤の実例的な例としては、界面活性剤、プラスマネート、ＨＥＰＥＳのようなｐＨ緩衝剤、ならびにＮ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールのような還元剤、あるいはＬ－グルタミン、チオール、特に２－メルカプトエタノールなど、細胞を成長させるのに適するいずれかの他の添加剤であって、当業者に知られているいずれかの他の添加剤、及び／または抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンが挙げられるが、これらに限らない。典型的には、抗生物質は、実験培養液のみに含め、対象に注入することになる細胞の培養液には含めない。

いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、対象に由来する試料から得る。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団を第１の対象から得て、本明細書に記載されている方法によって作製した改変免疫エフェクター細胞集団を第２の異なる対象に投与する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団を対象から得て、本明細書に記載されている方法によって作製した改変免疫エフェクター細胞集団を同じ対象に投与する。いくつかの実施形態では、その試料は、組織試料、流体試料、細胞試料、タンパク質試料、ＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料である。いくつかの実施形態では、組織試料は、いずれの種類の組織に由来してもよく、その組織としては、皮膚、毛髪（毛根を含む）、骨髄、骨、筋肉、唾液腺、食道、胃、小腸（例えば、十二指腸、空腸もしくは回腸の組織）、大腸、肝臓、胆嚢、膵臓、肺、腎臓、膀胱、子宮、卵巣、膣、胎盤、精巣、甲状腺、副腎、心臓組織、胸腺、脾臓、リンパ節、脊髄、脳、眼、耳、舌、軟骨、白色脂肪組織または褐色脂肪組織が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、組織試料は、がん性腫瘍、前がん性腫瘍または非がん性腫瘍に由来してもよい。いくつかの実施形態では、流体試料は、口腔スワブ、血液、血漿、口腔粘膜、膣粘膜、末梢血、臍帯血、唾液、精液（ｓｅｍｅｎ）、尿、腹水、胸膜液、髄液、肺洗浄液、涙、汗、精液（ｓｅｍｅｎ）、精液（ｓｅｍｉｎａｌｆｌｕｉｄ）、精漿、前立腺液、射精前液（クーパー液）、排泄物、脳脊髄液、リンパ、１つ以上の細胞集団を含む細胞培養培地、１つ以上の細胞集団を含む緩衝化液などを含む。

いくつかの実施形態では、その試料を処理して、免疫エフェクター細胞集団をその試料の残部から濃縮または単離する。ある特定の実施形態では、その試料は末梢血試料であり、その末梢血試料に対しては、後で白血球アフェレーシスを行って、赤血球及び血小板を分離するとともに、リンパ球を単離する。いくつかの実施形態では、その試料は、免疫エフェクター細胞を単離または濃縮できるロイコパックである。いくつかの実施形態では、その試料は、腫瘍試料であって、さらに処理して（すなわち、その腫瘍を断片化し、酵素によって消化して、腫瘍浸潤リンパ球の細胞懸濁液を得ることによってさらに処理して）、その腫瘍に存在するリンパ球を単離する腫瘍試料である。

いくつかの実施形態では、本発明で企図されている改変免疫エフェクター細胞の製造方法は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、ならびに米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されているように、免疫エフェクター細胞集団を活性化及び／または増殖させることを含む。

各種実施形態では、本発明で企図されている改変免疫エフェクター細胞の製造方法は、免疫エフェクター細胞を含む細胞集団を活性化させることを含む。特定の実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞の活性化は、（例えば、Ｔ細胞のＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するか、または表面タンパク質ＣＤ２の刺激を介して）第１の刺激シグナルを供給すること、及びアクセサリー分子を介して第２の共刺激シグナルを供給することによって行うことができる。

いくつかの実施形態では、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞と、好適なＣＤ３結合剤、例えば、ＣＤ３リガンドまたは抗ＣＤ３モノクローナル抗体とを接触させることによって刺激してよい。ＣＤ３抗体の実例的な例としては、ＯＫＴ３、Ｇ１９－４、ＢＣ３、ＣＲＩＳ－７及び６４．１が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、ＣＤ２結合剤を用いて、第１の刺激シグナルをＴ細胞に供給してもよい。ＣＤ２結合剤の実例的な例としては、ＣＤ２リガンド及び抗ＣＤ２抗体、例えば、Ｔ１１．１またはＴ１１．２抗体と組み合わせたＴ１１．３抗体（Ｍｅｕｅｒ，Ｓ．Ｃ．ｅｔａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ３６：８９７－９０６）、及び９－１抗体と組み合わせた９．６抗体（Ｔ１１．１と同じエピトープを認識する）（Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｙ．ｅｔａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７－１１００）が挙げられるが、これらに限らない。

Ｔ細胞応答の誘導には、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を介して供給される刺激シグナルに加えて、典型的には、Ｔ細胞上の共刺激分子と特異的に結合するリガンドによって供給される第２の共刺激シグナルが必要とされ、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって供給される第１のシグナルに加えて、その第２のシグナルによって、共刺激シグナルが供給され、その共刺激シグナルが、所望のＴ細胞応答を媒介する。好適な共刺激リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体と結合するアゴニストまたは抗体、及びＢ７－Ｈ３と特異的に結合するリガンドが挙げられるが、これらに限らない。

いくつかの実施形態では、共刺激リガンドは、Ｔ細胞に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、その分子としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、ＣＤ２８結合剤を用いて、共刺激シグナルを供給できる。ＣＤ２８結合剤の実例的な例としては、天然のＣＤ２８リガンド、例えば、ＣＤ２８の天然のリガンド（例えば、Ｂ７－１（ＣＤ８０）及びＢ７－２（ＣＤ８６）のような、Ｂ７ファミリータンパク質のメンバー、ＣＤ２８分子と架橋できる抗ＣＤ２８モノクローナル抗体またはその断片、例えば、モノクローナル抗体９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８、ＫＯＬＴ－２、１５Ｅ８、２４８．２３．２及びＥＸ５．３Ｄ１０が挙げられるが、これらに限らない。

ある特定の実施形態では、刺激シグナル及び共刺激シグナルを供給する結合剤は、細胞の表面に局在化させる。この局在化は、その細胞表面でその結合剤を発現させるのに適する形で、その結合剤をコードする核酸を細胞にトランスフェクションもしくはトランスダクションすることによって、あるいは、結合剤をその細胞表面に結合させることによって行うことができる。いくつかの実施形態では、共刺激シグナルは、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）のような抗原提示細胞上に提示させた共刺激リガンドによって供給する。Ｋ５６２細胞、Ｕ９３７細胞、７２１．２２１細胞、Ｔ２細胞またはＣ１Ｒ細胞を操作して、様々な共刺激分子及びサイトカインを安定的に発現及び／または分泌するようにすることによって人工ＡＰＣを作製して、遺伝子改変Ｔ細胞のｅｘｖｉｖｏでの成長及び長期的な増殖を補佐することができる。特定の実施形態では、Ｋ３２ａＡＰＣまたはＵ３２ａＡＰＣを用いて、抗体ベースの刺激分子が１つ以上、ａＡＰＣ細胞表面上に提示されるように誘導する。様々な共刺激分子を発現するａＡＰＣによって、Ｔ細胞集団を増殖でき、その分子としては、ＣＤ１３７Ｌ（４－１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）及び／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６が挙げられるが、これらに限らない。例示的なａＡＰＣは、ＷＯ０３／０５７１７１及びＵＳ２００３／０１４７８６９で提供されており、これらの特許は、参照により、その全体が援用される。

いくつかの実施形態では、活性化シグナル及び共刺激シグナルを供給する結合剤は、固体表面（例えば、ビーズまたはプレート）に局在化させる。いくつかの実施形態では、活性化シグナル及び共刺激シグナルを供給する結合剤は両方とも、可溶性の形態で供給する（溶液で供給する）。

いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、１つ以上の増殖フェーズに培養増殖させる。「増殖」とは、免疫エフェクター細胞の数を増加させるために、免疫エフェクター細胞集団を所定の期間にわたって培養することを指す。免疫エフェクター細胞の増殖は、上記の活性化因子のうちの１つ以上を加える、及び／またはサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及び／またはＩＬ－７）のような１つ以上の成長因子を加えて、細胞の増殖及び／または生存を増強または促進することを含んでよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の増殖フェーズの間に、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及び／またはＩＬ－２１を組み合わせたものを培養液に加えることができる。いくつかの実施形態では、その１つ以上の増殖フェーズの間にＩＬ－２を加える量は、６０００Ｕ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態では、その１つ以上の増殖フェーズの間にＩＬ－２を加える量は、約５５００Ｕ／ｍＬ、約５０００Ｕ／ｍＬ、約４５００Ｕ／ｍＬ、約４０００Ｕ／ｍＬ、約３５００Ｕ／ｍＬ、約３０００Ｕ／ｍＬ、約２５００Ｕ／ｍＬ、約２０００Ｕ／ｍＬ、約１５００Ｕ／ｍＬ、約１０００Ｕ／ｍＬまたは約５００Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、その１つ以上の増殖フェーズの間にＩＬ－２を加える量は、約５００Ｕ／ｍＬ～約５５００Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、増殖プロセスの際に、フィーダー細胞と共培養してよい。

いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、所定の期間にわたって増殖させ、その所定の期間は、約３０日未満である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、３０日未満、２５日未満、２０日未満、１８日未満、１５日未満または１０日未満である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、４週間未満、３週間未満、２週間未満、または１週間未満である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、約７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日または２１日である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、約５日～約２５日、約１０～約２８日、約１０～約２５日、約１０～約２１日、約１０～約２０日、約１０～約１９日、約１１～約２８日、約１１～約２５日、約１１～約２１日、約１１～約２０日、約１１～約１９日、約１２～約２８日、約１２～約２５日、約１２～約２１日、約１２～約２０日、約１２～約１９日、約１５～約２８日、約１５～約２５日、約１５～約２１日、約１５～約２０日または約１５～約１９日である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、約５日～約１０日、約１０日～約１５日、約１５日～約２０日または約２０日～約２５日である。

いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、細胞数が所定の閾値に達するまで増殖させる。例えば、いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、培養物に少なくとも５×１０^６個、１×１０^７個、５×１０^７個、１×１０^８個、５×１０^８個、１×１０^９個、５×１０^９個、１×１０^１０個、５×１０^１０個、１×１０^１１個、５×１０^１１個、１×１０^１２個、５×１０^１２個、１×１０^１３個または少なくとも５×１０^１３個の総細胞数が含まれるようになるまで増殖させる。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、培養物に約１×１０^９～約１×１０^１１個の総細胞数が含まれるようになるまで増殖させる。

いくつかの実施形態では、本発明で提供する方法は、少なくとも２つの増殖フェーズを含む。例えば、いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、試料から単離した後に増殖させ、増殖を休止させてから、再び増殖させることができる。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ある一連の増殖条件で増殖させた後に、第２の異なる一連の増殖条件で、第２ラウンドの増殖を行う。免疫細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１８－０２０７２０１号、同第２０１８０２８２６９４号及び同第２０１７０１５２４７８号、ならびに米国特許第８，３８３，０９９号及び同第８，０３４，３３４号に記載されているように、当該技術分野において知られており、これらの特許は、参照により本明細書に援用される。

活性化プロセス及び／または増殖プロセスのいずれかの時点に、本明細書に記載されている遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞に導入して、改変免疫エフェクター細胞集団を作製できる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、試料から免疫エフェクター細胞を濃縮した直後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、１つ以上の増殖プロセスの前、そのプロセスの最中またはそのプロセスの後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、免疫エフェクター細胞を試料から濃縮するかまたは対象から採取するかした直後、かつあらゆる増殖ラウンドの前に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンドの増殖の後であるが、第２ラウンドの増殖の前に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。

いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞集団の製造方法であって、免疫エフェクター細胞集団を得ること、本明細書に記載されている遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞集団に導入すること、及びその免疫エフェクター細胞集団を１ラウンド以上の増殖で増殖させることを含む方法を提供する。この実施形態のいくつかの態様では、その免疫エフェクター細胞集団は、遺伝子調節システムの導入前に、第１ラウンドの増殖で増殖させ、遺伝子調節システムの導入後に、第２ラウンドの増殖で増殖させる。この実施形態のいくつかの態様では、その免疫エフェクター細胞集団は、遺伝子調節システムの導入前に、第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖で増殖させる。この実施形態のいくつかの態様では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の前に、その免疫エフェクター細胞集団に導入する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法は、対象から腫瘍を取り出し、その腫瘍試料を処理して、（例えば、その腫瘍を断片化し、酵素によって消化して、細胞懸濁液を得ることによって）腫瘍浸潤リンパ球集団を得ること、本明細書に記載されている遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞集団に導入すること、及びその免疫エフェクター細胞集団を１ラウンド以上の増殖で増殖させることを含む。この実施形態のいくつかの態様では、その腫瘍浸潤リンパ球集団は、遺伝子調節システムの導入前に、第１ラウンドの増殖で増殖させ、遺伝子調節システムの導入後に、第２ラウンドの増殖で増殖させる。この実施形態のいくつかの態様では、その腫瘍浸潤リンパ球集団は、遺伝子調節システムの導入前に、第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖で増殖させる。この実施形態のいくつかの態様では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の前に、その腫瘍浸潤リンパ球集団に導入する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法によって作製した改変免疫エフェクター細胞は、直ちに使用してよい。いくつかの実施形態では、本発明で企図されている製造方法は、保存及び／または対象に使用する際の調製のために、改変免疫細胞を凍結保存することをさらに含んでもよい。本明細書で使用する場合、「凍結保存」とは、（典型的には）７７Ｋ、すなわち－１９６℃（液体窒素の沸点）のような氷点下の温度まで冷却することによって、細胞を保存することを指す。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の保存方法は、解凍時に免疫エフェクター細胞が生存し続けているように、免疫エフェクター細胞を凍結保存することを含む。必要な場合には、凍結保存した改変免疫エフェクター細胞を解凍し、さらなる改変免疫エフェクター細胞を得るために、成長及び増殖させることができる。保存される細胞が、低温での凍結または室温への昇温により損傷するのを防ぐために、凍結保護剤を氷点下の温度で用いる場合が多い。凍結保存剤及び最適な冷却速度によって、細胞の損傷から保護することができる。使用できる凍結保護剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＬｏｖｅｌｏｃｋａｎｄＢｉｓｈｏｐ，Ｎａｔｕｒｅ，１９５９；１８３：１３９４－１３９５、Ａｓｈｗｏｏｄ－Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６１；１９０：１２０４－１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリジン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９６０；８５：５７６）及びポリエチレングリコール（ＳｌｏｖｉｔｅｒａｎｄＲａｖｄｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６２；１９６：４８）が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、その細胞は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝化媒体、または細胞を同様の凍結温度で保存する目的で当該技術分野において一般的に用いられているような何らかの他の同様の溶液で凍結させ、凍結した培養細胞を解凍するためのものとして当該技術分野において一般的に知られている方式で解凍する。

Ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた、改変免疫エフェクター細胞の作製
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の作製方法は、標的ＤＮＡ配列と、ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドを含む複合体とを接触させることを伴う。上で論じたように、ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドが複合体を形成し、そのｇＲＮＡのＤＮＡ結合ドメインが、その複合体を標的ＤＮＡ配列に導き、そのＣａｓタンパク質（または酵素活性が不活性なＣａｓタンパク質に融合された異種タンパク質）が、標的ＤＮＡ配列を改変する。いくつかの実施形態では、この複合体は、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質（またはｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド）を細胞に導入した後に、細胞内で形成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ核酸であり、細胞にトランスダクションによって導入する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムのＣａｓ９及びｇＲＮＡの構成成分は、単一のポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡの構成成分をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターに含まれており、ウイルストランスダクションによって細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムのＣａｓ９及びｇＲＮＡの構成成分は、異なるポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第１のウイルスベクターに含まれ、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、第２のウイルスベクターに含まれる。この実施形態のいくつかの態様では、第２のウイルスベクターよりも前に、第１のウイルスベクターを細胞に導入する。この実施形態のいくつかの態様では、第１のウイルスベクターよりも前に、第２のウイルスベクターを細胞に導入する。このような実施形態では、それらのベクターが組み込まれることにより、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡの構成成分の発現が持続する。しかしながら、一部の種類の細胞では、Ｃａｓ９の発現の持続により、オフターゲット変異及びオフターゲット切断が増加し得る。したがって、いくつかの実施形態では、トランスフェクションによって、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ核酸配列を細胞集団に導入してもよい。このような実施形態では、Ｃａｓ９の発現は、時間とともに減少することになり、オフターゲット変異部位またはオフターゲット切断部位の数を減少し得る。

いくつかの実施形態では、この複合体は、ｇＲＮＡ分子及びＣａｓタンパク質を一緒に混合し、複合体を形成させるのに充分な期間にわたってインキュベートすることによって、無細胞システムで形成させる。続いて、標的ＤＮＡ配列を改変する目的で、予め形成したこの複合体であって、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含む複合体（本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ－リボ核タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ）という）を細胞に導入できる。いくつかの実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰは、細胞にエレクトロポレーションによって導入する。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、改変免疫エフェクター細胞を作製する上記の実施形態のいずれにおいても、そのシステムは、例えば単一編集型の改変免疫エフェクター細胞を作製するために、単一の内在性標的遺伝子を標的とする１つ以上のｇＲＮＡを含んでよい。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、改変免疫エフェクター細胞を作製する上記の実施形態のいずれにおいても、そのシステムは、例えばデュアル編集型の改変免疫エフェクター細胞を作製するために、２つ以上の内在性標的遺伝子を標的とする２つ以上のｇＲＮＡを含んでよい。

Ｂ．ｓｈＲＮＡシステムを用いた、改変免疫エフェクター細胞の作製
いくつかの実施形態では、本開示は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物と相補的である配列を有する１つ以上のｓｈＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドを細胞に導入することによって、改変免疫エフェクター細胞を作製する方法を提供する。小さな遺伝子カセットを介して、所定のＤＮＡ配列を細胞核に導入することによって、免疫エフェクター細胞を改変して、ｓｈＲＮＡを作製することができる。レトロウイルス及びレンチウイルスの両方を用いて、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを免疫エフェクター細胞に導入することができる。導入されたＤＮＡは、細胞自体のＤＮＡの一部となることも、または核内に存続することもでき、その細胞機構に対して、ｓｈＲＮＡを産生するように命令する。ｓｈＲＮＡは、その細胞内のダイサーまたはＡｇｏ２の媒介によるスライサー活性によって処理して、ＲＮＡｉの媒介による遺伝子ノックダウンを誘導し得る。

Ｃ．ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤を用いた、改変免疫エフェクター細胞の作製
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の製造方法であって、本明細書に記載されている遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞集団に導入すること、ＳＯＣＳ１の阻害剤及び／またはＣＢＬＢの阻害剤をその免疫エフェクター細胞集団に導入すること、その免疫エフェクター細胞集団を増殖させてその改変免疫エフェクター細胞集団を作製することを含む方法を提供する。このような実施形態では、製造プロセス中のそのＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤の導入により、リンパ球のｉｎｖｉｔｒｏ製造もしくはｅｘｖｉｖｏ製造の方法に１つ以上の改善がもたらされる。例えば、その改善は、その製造方法から得られる細胞数を増加させることによって（治療に用いるのに十分な細胞数を作製するために、そのリンパ球集団の増殖に必要な時間を減少させることなどによって）、治療に用いるのに十分な細胞数を作製するために必要な外因性の活性化因子及び／または成長因子の量を減少させることによって、及び／または製造プロセス中のそのリンパ球の疲弊に対する耐性を向上させることによってもたらされる。本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞の製造における、ＳＯＣＳ１阻害及び／またはＣＢＬＢ阻害を用いる例示的な方法が提供されているが、これらの方法は、あらゆる治療用のリンパ球集団の製造に適用可能である。

いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤を添加することによって、下流の治療用途に用いるのに十分な数の免疫エフェクター細胞を作製するために必要な増殖期間が短縮される。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、３０日未満、２５日未満、２０日未満、１８日未満、１５日未満または１０日未満である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、４週間未満、３週間未満、２週間未満、または１週間未満である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、約７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日または２１日である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、約５日～約２５日、約１０～約２８日、約１０～約２５日、約１０～約２１日、約１０～約２０日、約１０～約１９日、約１１～約２８日、約１１～約２５日、約１１～約２１日、約１１～約２０日、約１１～約１９日、約１２～約２８日、約１２～約２５日、約１２～約２１日、約１２～約２０日、約１２～約１９日、約１５～約２８日、約１５～約２５日、約１５～約２１日、約１５～約２０日または約１５～約１９日である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、約５日～約１０日、約１０日～約１５日、約１５日～約２０日または約２０日～約２５日である。

いくつかの実施形態では、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤を添加することを含む製造方法によって作製した細胞の総数は、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤なしの製造方法によって作製した細胞の総数より、少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、または５倍多い。いくつかの実施形態では、増殖リンパ球集団中の細胞の総数は、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤なしで作製した増殖リンパ球集団中の細胞の総数より、約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、または５倍多い。いくつかの実施形態では、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤を添加することを含む製造方法によって作製した細胞の総数は、ＳＯＣＳまたはＣＢＬＢ以外の内在性遺伝子の阻害剤が存在する製造方法によって作製した細胞の総数より、少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、または５倍多い。理論に束縛されることを望まないが、ＳＯＣＳ１阻害剤またはＣＢＬＢ阻害剤が存在する製造方法によって作製した細胞の数の増加は、その阻害剤の存在下におけるその免疫エフェクター細胞の増殖性の向上（すなわち、増殖速度の向上）またはその阻害剤の存在下におけるその免疫エフェクター細胞の生存性の向上などの様々な機序によって生じ得る。

いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤の導入により、製造プロセス中及び／または製造プロセス後におけるそのリンパ球集団の疲弊に対する耐性が向上する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤の製造プロセス中の導入により、そのＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤なしでの製造と比べて、そのＴ細胞集団のＴ細胞疲弊に対する耐性が向上する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、またはＩＬ－２）の産生が増加することによって示される。いくつかの実施形態では、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤の存在下で作製したリンパ球集団によるサイトカインの産生が、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤なしで作製したリンパ球集団によるサイトカインの産生と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度増加することによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤の存在下で作製したリンパ球集団の増殖性が、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤なしで作製したリンパ球集団の増殖性と比べて向上することによって示される。いくつかの実施形態では、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤の存在下で作製したリンパ球集団の増殖性が、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤なしで作製したリンパ球集団による増殖性と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度増加することによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤の存在下で作製したリンパ球集団の標的細胞の溶解が、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤なしで作製したリンパ球集団において観察される標的細胞の溶解と比べて増大することによって示される。いくつかの実施形態では、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤の存在下で作製したリンパ球集団による標的細胞の溶解が、ＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤なしで作製したリンパ球集団による標的細胞の溶解と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度増大することによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊は、ｉｎｖｉｔｒｏ製造プロセスまたはｅｘｖｉｖｏ製造プロセス中に、１つ以上の時点で測定する。例えば、いくつかの実施形態では、リンパ球を１ラウンド以上増殖させて、改変ＴＩＬ集団を作製する。このような実施形態では、その改変ＴＩＬの疲弊は、回収直後及び第１ラウンドの増殖の前、第１ラウンドの増殖後かつ第２ラウンドの増殖の前、及び／または第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の後に判断することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊は、ｉｎｖｉｔｒｏ製造プロセスまたはｅｘｖｉｖｏ製造プロセスの完了後、１つ以上の時点で測定する。

いくつかの実施形態では、製造プロセス中のそのＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤の添加により、その増殖リンパ球集団を作製するために必要なサイトカイン及び／または活性化因子の量が減少する。例えば、いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤を、その製造プロセスの１つ以上のステップで添加することにより、その増殖リンパ球集団を作製するために培養液中に必要なＩＬ－２、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、及び／または抗ＣＤ３の量が減少する。いくつかの実施形態では、その増殖リンパ球集団を作製するために必要なＩＬ－２の量は、その製造プロセスの１つ以上のステップでそのＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤を添加した場合、６０００Ｕ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って、その増殖リンパ球集団を作製するために必要なＩＬ－２の量は、約５５００Ｕ／ｍＬ、約５０００Ｕ／ｍＬ、約４５００Ｕ／ｍＬ、約４０００Ｕ／ｍＬ、約３５００Ｕ／ｍＬ、約３０００Ｕ／ｍＬ、約２５００Ｕ／ｍＬ、約２０００Ｕ／ｍＬ、約１５００Ｕ／ｍＬ、約１０００Ｕ／ｍＬまたは約５００Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って、その増殖リンパ球集団を作製するために必要なＩＬ－２の量は、約５００Ｕ／ｍＬ～約５５００Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製造プロセス中のそのＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤の添加により、その増殖リンパ球集団を作製するための１つ以上のサイトカイン及び／または活性化因子の添加が不要になる。例えば、いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤を、その製造プロセスの１つ以上のステップ中に添加することにより、培養液中の外因性のＩＬ－２及び／または抗ＣＤ３抗体が不要になる。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１及び／またはＣＢＬＢの阻害は一時的なものである。このような実施形態では、最終リンパ球集団中のそのＳＯＣＳ１遺伝子及び／またはＣＢＬＢ遺伝子の発現あるいはそのＳＯＣＳ１タンパク質及び／またはＣＢＬＢタンパク質の機能が、そのＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤に暴露されていない細胞において観察されるものと実質的に同じになるように、そのＳＯＣＳ１阻害剤及び／またはＣＢＬＢ阻害剤を、リンパ球集団の培養液から除去するか、またはリンパ球集団の培養中に分解する。

そのＳＯＣＳ１の阻害剤及び／またはＣＢＬＢの阻害剤は、製造プロセス全体を通じて、いずれの時点においても培養液に添加することができる。例えば、いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１の阻害剤及び／またはＣＢＬＢの阻害剤を、腫瘍試料の処理後、かつすべての増殖フェーズの前に培養液に添加し、その阻害剤は、残りの製造プロセス全体を通じて残留する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１の阻害剤及び／またはＣＢＬＢの阻害剤を、第１の増殖フェーズの前、または第１の増殖フェーズの間に培養液に添加し、第２の増殖フェーズの前に除去する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１の阻害剤及び／またはＣＢＬＢの阻害剤を、第１の増殖フェーズの前、または第１の増殖フェーズの間に培養液に添加し、その阻害剤は、残りの製造プロセス全体を通じて残留する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１の阻害剤及び／またはＣＢＬＢの阻害剤を、第１の増殖フェーズの後、かつ第２の増殖フェーズの前または第２の増殖フェーズの間に培養液に添加し、その阻害剤は、残りの製造プロセス全体を通じて残留する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１の阻害剤及び／またはＣＢＬＢの阻害剤を、第２の増殖フェーズの前、または第２の増殖フェーズの間に培養液に添加し、第２の増殖フェーズの完了後に除去する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１の阻害剤及び／またはＣＢＬＢの阻害剤を、第１の増殖フェーズの前に培養液に添加し、その阻害剤は、残りの製造プロセス全体を通じて残留する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１の阻害剤及び／またはＣＢＬＢの阻害剤を、第２の増殖フェーズの間に培養液に添加し、その阻害剤は、製造プロセスの完了後も残留する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１の阻害剤及び／またはＣＢＬＢの阻害剤を、製造プロセスのいずれかのステップの前、ステップの間またはステップの後に培養液に添加し、その製造した集団を患者に注入する前に除去する。

Ｖ．組成物及びキット
「組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されている遺伝子調節システムまたは改変免疫エフェクター細胞の製剤であって、対象または細胞に投与または送達できる製剤を指す。典型的には、製剤は、あらゆる生理学的に許容可能な組成物（その誘導体及び／またはプロドラッグ、溶媒和物、立体異性体、ラセミ体もしくは互変異性体を含む）を、いずれかの生理学的に許容可能な担体、希釈剤及び／または賦形剤とともに含む。「治療用組成物」または「医薬組成物」（本明細書では同義的に用いられている）は、特定の疾患もしくは障害を治療するために、対象に投与するか、または１つ以上の内在性標的遺伝子を改変するために、細胞と接触させることができる、遺伝子調節システムまたは改変免疫エフェクター細胞の組成物である。

「薬学的に許容可能な」という表現は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応またはその他の問題もしくは合併症を引き起こさずに、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適するとともに、合理的な効果／リスク比に釣り合う化合物、材料、組成物及び／または剤形を指す目的で使用する。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤」には、ヒト及び／または飼育動物での使用が認められるものとして、米国食品医薬品局から認可されているいずれのアジュバント、担体、賦形剤、流動化剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張化剤、溶媒、界面活性剤及び／または乳化剤も含まれるが、これらに限らない。例示的な薬学的に許容可能な担体としては、ラクトース、グルコース及びスクロースのような糖、コーンスターチ及びバレイショデンプンのようなデンプン、セルロース、及びナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロースのようなその誘導体、トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、カカオ脂、ワックス、動物性油脂及び植物性油脂、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛、ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油のような油、プロピレングリコールのようなグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールのようなポリオール、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルのようなエステル、寒天、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、ならびに医薬製剤で用いられるいずれかの他の適合物質が挙げられるが、これらに限らない。いずれの従来の媒体及び／または作用剤も、本開示の薬剤と適合性がない場合を除き、治療用組成物で用いることが企図されている。補助的な有効成分も、その組成物に組み込むことができる。

「薬学的に許容可能な塩」には、酸付加塩と塩基付加塩の両方が含まれる。薬学的に許容可能な塩には酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成されるもの）が含まれ、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸、及び酢酸、２，２－ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４－アセトアミド安息香酸、ショウノウ酸、カンファー－１０－スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２－オキソ－グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐトルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸など（これらに限らない）のような有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩などのような無機塩基から誘導することもできる。有機塩基から誘導される塩としては、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などのような一級、二級及び三級アミン、天然の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂の塩が挙げられるが、これらに限らない。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン及びカフェインである。

湿潤剤、乳化剤、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような潤沢剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、矯臭剤、保存剤、ならびに抗酸化剤も、その組成物に存在し得る。

薬学的に許容可能な抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロールなどのような油溶性抗酸化剤、及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート化剤が挙げられる。

様々な種類の投与に適する製剤に関するさらなる手引きは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈｅｄ．（１９８５）に見ることができる。薬物送達法の簡潔な論評については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：１５２７－１５３３（１９９０）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている方法を行うためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、
（ａ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる１つ以上の核酸分子、
（ｂ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｃ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる１つ以上のタンパク質、
（ｄ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる改変タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｅ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡ、
（ｆ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｇ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｈ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｉ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
（ｊ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｋ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｌ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｍ）内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡ、
（ｎ）内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｏ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｐ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｑ）本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞、または
（ｒ）上記をいずれかに組み合わせたもの
を含むことができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む。いくつかの免疫チェックポイント阻害剤が当該技術分野において知られており、１つ以上のがんの治療用として、ＦＤＡから認可を受けている。例えば、ＦＤＡから認可されたＰＤ－Ｌ１阻害剤としては、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）及びデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられ、ＦＤＡから認可されたＰＤ－１阻害剤としては、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）及びニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）が挙げられ、ＦＤＡから認可されたＣＴＬＡ４阻害剤としては、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）が挙げられる。今後、治療標的となり得る追加の抑制性免疫チェックポイント分子としては、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＬＡＧ３（例えば、ＢＳＭによって開発中であるＢＭＳ－９８６０１６）、ＫＩＲ（例えば、ＢＳＭによって開発中であるリリルマブ）、ＴＩＭ３、Ｔｉｇｉｔ及びＶＩＳＴＡが挙げられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）、及び当該技術分野において知られている１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤など）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）、及び抗ＰＤ１抗体（例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞（またはその集団）、及び当該技術分野において知られている１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤など）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞（またはその集団）、及び抗ＰＤ１抗体（例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブ）を含む。

いくつかの実施形態では、そのキットは、遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）、ならびにその構成成分を再構成及び／または希釈するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）を含むキットは、１つ以上の追加の試薬をさらに含み、その追加の試薬は、その遺伝子調節システムを細胞に導入するための緩衝剤、洗浄緩衝液、コントロール試薬、コントロールの発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、その遺伝子調節システムをＤＮＡからｉｎｖｉｔｒｏで作製するための試薬などから選択できる。キットの構成成分は、別々の容器に入れることも、単一の容器内で組み合わせることもできる。

上記の構成成分に加えて、いくつかの実施形態では、キットは、そのキットの構成成分を用いて、本開示の方法を実施するための説明書をさらに含む。本開示の方法を実施するための説明書は概して、好適な記録媒体に記録されている。例えば、その説明書は、紙またはプラスチックなどのような基材に印刷されていてもよい。したがって、その説明書は、添付文書としてキット内に存在しても、キットまたはその構成成分の容器のラベルに存在してもよい（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに付随していてもよい）。別の実施形態では、その説明書は、好適なコンピューター可読記憶媒体、例えばＣＲ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに別の実施形態では、実際の説明書は、キット内には存在しないが、その説明書をリモートソース、例えばインターネットから得る手段が供給されている。この実施形態の例は、その説明書を閲覧でき及び／またはその説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書に関しては、説明書を得るためのこの手段は、好適な基材に記録されている。

ＶＩ．治療方法及び用途
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子調節システムは、様々な治療用途で用いてよい。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び／または遺伝子調節システムは、例えば疾患を治療するための遺伝子療法を目的として、抗ウイルス剤として使用するため、抗病原体剤として使用するため、抗がん剤として使用するため、または生物学的研究のために、対象に投与してよい。

いくつかの実施形態では、その対象は、新生体、幼若体または成体であってよい。特に対象となるのは、哺乳動物の対象である。本発明の方法で治療し得る哺乳動物種としては、イヌ科及びネコ科の動物、ウマ科の動物、ウシ亜科の動物、ヒツジなど、ならびに霊長類動物、特にヒトが挙げられる。動物モデル、特に、小型の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなど）を実験的研究に用いてよい。

本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞、その集団及びその組成物の投与は、注射、灌注、吸入、摂食、電気浸透、血液透析、イオントフォレシス、及び当該技術分野において知られているその他の方法によって行うことができる。いくつかの実施形態では、投与経路は、局所経路または全身経路である。いくつかの実施形態では、投与経路は、動脈内経路、頭蓋内経路、皮内経路、十二指腸内経路、乳房内経路、髄膜内経路、腹腔内経路、髄腔内経路、腫瘍内経路、静脈内経路、硝子体内経路、眼内経路、非経口経路、脊髄経路、皮下経路、尿管経路、尿道経路、膣経路または子宮内経路である。

いくつかの実施形態では、投与経路は、注入（例えば、持続注入またはボーラス）による経路である。局所投与の方法、すなわち、損傷部位または疾患部位への送達方法の例としては、例えば髄腔内送達用のオンマイヤーリザーバーによる方法（例えば、米国特許第５，２２２，９８２号、同第５，３８５，５８２号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）、例えばシリンジによって、例えば関節にボーラス注射する方法、持続注入、例えば、対流を伴うような挿管による方法（例えば、米国特許出願公開第２００７－０２５４８４２号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）、またはその細胞が可逆的に添加されたデバイスを埋め込むことによる方法（例えば米国特許出願公開第２００８－００８１０６４号及び同第２００９－０１９６９０３号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）が挙げられる。いくつかの実施形態では、その投与経路は、局所投与または直接注射による経路である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、単独で、あるいは例えば、それらの細胞が移植される組織内でのその細胞の成長及び／または組織化を補助するための好適な基材またはマトリックスとともに、対象に供給してよい。

いくつかの実施形態では、少なくとも１×１０^３個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、少なくとも５×１０^３個の細胞、１×１０^４個の細胞、５×１０^４個の細胞、１×１０^５個の細胞、５×１０^５個の細胞、１×１０^６個、２×１０^６個、３×１０^６個、４×１０^６個、５×１０^６個、１×１０^７個、１×１０^８個、５×１０^８個、１×１０^９個、５×１０^９個、１×１０^１０個、５×１０^１０個、１×１０^１１個、５×１０^１１個、１×１０^１２個、５×１０^１２個、またはこれを超える数の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０^７～約１×１０^１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０^８～約１×１０^１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０^９～約１×１０^１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０^１０～約１×１０^１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０^１１～約１×１０^１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０^７～約１×１０^１１個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０^７～約１×１０^１０個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０^７～約１×１０^９個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０^７～約１×１０^８個の細胞を対象に投与する。対象に対する、治療のための投与数は、変動し得る。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の対象への導入は、１回限りであってよい。いくつかの実施形態では、このような治療には、継続的な一連の反復処置が必要となり得る。いくつかの実施形態では、効果が観察されるまでには、改変免疫エフェクター細胞の投与が複数回必要となり得る。厳密なプロトコールは、治療を受ける個々の対象の疾患または状態、病期、及びパラメーターに左右される。

いくつかの実施形態では、遺伝子療法または生物学的研究などのために、本明細書に記載されている遺伝子調節システムを用いて、細胞のＤＮＡまたはＲＮＡをｉｎｖｉｖｏで改変する。このような実施形態では、遺伝子調節システムは、上記の方法によるなどして、対象に直接投与してよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、免疫エフェクター細胞集団のｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏでの改変に用いる。このような実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、免疫エフェクター細胞を含む試料に投与する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、対象に投与する、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、自己免疫エフェクター細胞である。この関連における「自己」という用語は、投与される同じ対象から得た細胞を指す。例えば、免疫エフェクター細胞は、対象から採取して、本明細書に記載されている方法に従って、ｅｘｖｉｖｏで改変してから、疾患を治療する目的で同じ対象に投与し得る。このような実施形態では、その対象に投与する細胞は、自己免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、対象に投与する改変免疫エフェクター細胞またはその組成物は、同種異系免疫エフェクター細胞である。この関連における「同種異系」という用語は、ある対象から採取して、別の対象に投与する細胞を指す。例えば、免疫エフェクター細胞は、第１の対象から採取して、本明細書に記載されている方法に従って、ｅｘｖｉｖｏで改変してから、疾患を治療する目的で第２の対象に投与し得る。このような実施形態では、その対象に投与する細胞は、同種異系免疫エフェクター細胞である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、疾患を治療する目的で、対象に投与する。いくつかの実施形態では、治療は、細胞集団（例えば、改変免疫エフェクター細胞集団）またはその組成物を有効量、治療の必要な対象に送達することを含む。いくつかの実施形態では、治療とは、哺乳動物、例えばヒトの疾患の治療を指し、その治療には、（ａ）疾患を抑制すること、すなわち、疾患の発症を抑止するか、または疾患の進行を防止すること、（ｂ）疾患を軽減させること、すなわち、病態を好転させるか、または疾患の１つ以上の症状を軽減させること、及び（ｃ）疾患を治癒させること、すなわち、１つ以上の疾患症状を寛解させることが含まれる。いくつかの実施形態では、治療とは、１つ以上の疾患症状を短期的に（例えば、一時的に及び／または短時間）、及び／または長期的に（例えば持続的に）軽減することを指してよい。いくつかの実施形態では、治療によって、疾患の症状が改善または軽快する。この改善は、観察可能もしくは測定可能な改善であり得、または対象の体調的な感覚の改善であってもよい。

特定の対象に投与する改変免疫エフェクター細胞の有効量は、様々な要因によって決定されることになり、その要因のうちのいくつかは、患者によって異なり、その要因としては、治療する障害及びその障害の重症度、用いる具体的な薬剤（複数可）の活性、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食生活、投与のタイミング、投与経路、治療期間、併用する薬物、処方医の判断、ならびに医療技術分野において知られている類似の要因が挙げられる。

いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の有効量は、腫瘍の質量もしくは体積、腫瘍細胞数、または転移数を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る割合減少させるのに必要な細胞数であってよい。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の有効量は、平均余命の延長、無増悪生存期間もしくは無病生存期間の延長、または治療する疾患と関連する様々な生理学的な症状の改善をもたらすのに必要な細胞数であってよい。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の有効量は、少なくとも１×１０^３個の細胞、例えば、５×１０^３個の細胞、１×１０^４個の細胞、５×１０^４個の細胞、１×１０^５個の細胞、５×１０^５個の細胞、１×１０^６個、２×１０^６個、３×１０^６個、４×１０^６個、５×１０^６個、１×１０^７個、１×１０^８個、５×１０^８個、１×１０^９個、５×１０^９個、１×１０^１０個、５×１０^１０個、１×１０^１１個、５×１０^１１個、１×１０^１２個、５×１０^１２個またはこれを上回る数の細胞となる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子調節システムは、がんのような細胞増殖性障害の治療で用いてよい。本発明で開示する組成物及び方法を用いて治療し得るがんとしては、血液のがん及び固形腫瘍が挙げられる。例えば、本発明で開示する組成物及び方法を用いて治療し得るがんとしては、腺腫、癌腫、肉腫、白血病またはリンパ腫が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、そのがんは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、神経芽腫、大腸癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、メラノーマ、肉腫、前立腺癌、肺癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、星状細胞腫、中皮腫、頭頸部癌、髄芽腫及び肝臓癌である。いくつかの実施形態では、そのがんは、メラノーマ、頭頸部癌、膀胱癌、肺癌、子宮頸癌、膵臓癌、乳癌及び大腸癌から選択される。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１阻害剤による治療に対して非感受性または耐性のがんである。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１阻害剤による治療に対して非感受性または耐性のがんであり、メラノーマ、頭頸部癌、膀胱癌、肺癌、子宮頸癌、膵臓癌、乳癌及び大腸癌から選択される。

上記のように、様々な腫瘍の適応症で使用するものとして、現在、いくつかの免疫チェックポイント阻害剤が認可されている（例えば、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤ１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤など）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞を投与すると、治療効果が、免疫チェックポイント阻害剤による治療後に観察される効果よりも増強される（例えば、腫瘍の成長がさらに有意に低下する、リンパ球の腫瘍への浸潤性が向上する、無増悪生存期間が長くなるなど）。

さらに、一部の腫瘍適応症は、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して不応性（すなわち非感受性）のものである。さらに、最初は、免疫チェックポイント阻害剤による治療に応答する（すなわち、感受性を示す）腫瘍適応症の一部は、治療の過程で阻害剤耐性表現型を発現する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して耐性（もしくは部分的に耐性）または非感受性（もしくは部分的に非感受性）であるがんを治療する目的で投与する。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して耐性（もしくは部分的に耐性）または非感受性（もしくは部分的に非感受性）であるがんを罹患している対象に、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物を投与することによって、そのがんを治療する（例えば、腫瘍の成長を低下させる、無増悪生存期間を延長するなど）。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１阻害剤による治療に対して耐性（もしくは部分的に耐性）または非感受性（もしくは部分的に非感受性）のがんである。

いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞またはその組成物は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞を免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与すると、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して耐性、抵抗性または非感受性であるがんでの治療効果が、その改変免疫エフェクター細胞または免疫チェックポイント阻害剤のいずれかのみによる治療によって観察される効果よりも増強される。いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞を免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与すると、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して部分的に耐性、部分的に抵抗性または部分的に非感受性であるがんでの治療効果が、その改変免疫エフェクター細胞または免疫チェックポイント阻害剤のいずれかのみによる治療によって観察される効果よりも増強される。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１阻害剤による治療に対して耐性（もしくは部分的に耐性）、抵抗性（もしくは部分的に抵抗性）、または非感受性（もしくは部分的に非感受性）のがんである。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物を抗ＰＤ１抗体と組み合わせて投与すると、抗ＰＤ１抗体のみによる治療に対して耐性または非感受性であるがんでの治療効果が増強される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物を抗ＰＤ１抗体と組み合わせて投与すると、抗ＰＤ１抗体のみによる治療に対して部分的に耐性または部分的に非感受性であるがんでの治療効果が増強される。

免疫チェックポイント阻害剤に対して耐性または感受性を示すがんは、当該技術分野において知られており、様々なｉｎｖｉｖｏモデル及びｉｎｖｉｔｒｏモデルで試験できる。例えば、いくつかのメラノーマは、抗ＰＤ１抗体のような免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して感受性があり、ｉｎｖｉｖｏＢ１６－Ｏｖａ腫瘍モデルでモデル化できる（実施例６、１４及び１７を参照されたい）。さらに、いくつかの大腸癌は、抗ＰＤ１抗体のような免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して耐性があることが知られており、ＰＭＥＬ／ＭＣ３８－ｇｐ１００モデルでモデル化できる（実施例７及び１５を参照されたい）。さらにまた、いくつかのリンパ腫は、抗ＰＤ１抗体のような免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して非感受性があることが知られており、Ｒａｊｉ細胞のようなリンパ腫細胞株の養子移入または皮下投与によって、様々なモデルでモデル化できる（実施例１０、１２及び１３を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子調節システムは、ウイルス感染症の治療で用いてよい。いくつかの実施形態では、そのウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス及び帯状疱疹ウイルスを含む）、ポックスウイルス、パポバウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスを含む）、パピローマウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ及びＣ型インフルエンザを含む）、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、レオウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスまたはレトロウイルスのうちの１つから選択する。

参照による援用
本明細書に引用されている参照文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願はいずれも、参照により、あらゆる目的でその全体が本明細書に援用される。しかしながら、本明細書に引用されているいずれの参照文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願に言及する際も、それらが、世界のいずれの国においても、正当な先行技術を構成したり、または技術常識の一部を形成すると解釈したり、認めたりまたはいずれかの形で示唆したりするものでないとともに、そのように解釈したり、認めたりまたはいずれかの形で示唆したりすべきでもない。

実施例１：材料及び方法
本明細書に記載されている実験では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、それぞれ異なるＴ細胞集団における１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節する。

Ｉ．材料
ｇＲＮＡ：別段に示されていない限り、いずれの実験でも、単分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用する。示されているように、デュアルｇＲＮＡ分子を使用したが、そのデュアルｇＲＮＡ分子は、２００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５３４）と２００μＭの標的特異的ｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）をＮｕｃｌｅａｓｅＦｒｅｅＤｕｐｌｅｘＢｕｆｆｅｒ（ＩＤＴカタログ番号１１－０１－０３－０１）中で５分、９５℃で複合化して、１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体（ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡが１：１の比率で存在する）を形成することによって形成した。下記の実験で使用したｇＲＮＡのターゲティング配列は、下記の表１０に示されている。
表１０：実験ｇＲＮＡのターゲティング配列

Ｃａｓ９：Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質のいずれかを導入することによって、標的細胞内で発現させた。別段に示されていない限り、下記の実験では、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する、核局在化配列を含むＣａｓ９コードｍＲＮＡ（Ｃａｓ９－ＮＬＳｍＲＮＡ）（ＴｒｉｌｉｎｋＬ－７２０６）、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質（ＩＤＴカタログ番号１０７４１８２）を使用した。

ＲＮＰ：ヒトリボ核タンパク質（ＲＮＰ）について、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９ＲＮＰは、１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体１．２μＬと、２０μＭのＣａｓ９タンパク質１μＬ及びＰＢＳ０．８μＬとを混ぜ合わせることによって形成した。混合物を室温で２０分インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成した。マウスＲＮＰについて、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９ＲＮＰは、４４μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体１体積と、３６μＭのＣａｓ９１体積とを混ぜ合わせることによって形成した。混合物を室温で２０分インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成した。

マウス：野生型ＣＤ８^＋Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢａｒＨａｒｂｏｒＭＥ）から採取した。オボアルブミン（Ｏｖａ）特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞をＯＴ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）から採取した。ＯＴ１マウスは、オボアルブミン（Ｏｖａ）タンパク質の２５７～２６４位の残基を認識するトランスジェニックＴＣＲを有する。ｇｐ１００特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＭＥＬマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｈｙ１＜ａ＞／ＣｙＴｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）８Ｒｅｓｔ／Ｊ、ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢａｒＨａｒｂｏｒＭＥ、カタログ番号００５０２３）から採取した。Ｃａｓ９タンパク質を構成的に発現するマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓ（Ｂ６Ｊ．１２９（Ｃｇ）－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１．１（ＣＡＧ－ｃａｓ９＊，－ＥＧＦＰ）Ｆｅｚｈ／Ｊ、ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢａｒＨａｒｂｏｒＭＥ株番号０２６１７９）から得て、Ｃａｓ９タンパク質を構成的に発現するＴＣＲトランスジェニックマウスを、ＯＴ１マウス及びＰＭＥＬマウスとＣａｓ９マウスとを交配させることにより得た。

ｓｉＲＮＡ：マウスＣＤ８Ｔ細胞における遺伝子サイレンシングでは、自己送達ＡｃｃｅｌｌｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用する。コントロール（カタログ番号：Ｋ－００５０００－Ｇ１－０２）またはＳＯＣＳ１遺伝子を標的とするＡｃｃｅｌｌｓｉＲＮＡ（カタログ番号：Ｅ－０４３１２０－００－０００５）もしくはＡｎｋｒｄ１１遺伝子を標的とするＡｃｃｅｌｌｓｉＲＮＡ（カタログ番号：Ｅ－０６１４６２－００－０００５）をメーカーの指示に従って調製する。精製したマウスＣＤ８Ｔ細胞は、１０ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ－２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号５７５４０６）を添加した２．５％ＨｅａｔＩｎａｃｔｉｖａｔｅｄＦＢＳを含むｓｉＲＮＡ送達培地（Ｄｈａｒｍａｃｏｎカタログ番号Ｂ－００５０００－５００）において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ＭｏｕｓｅＴ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８ｆｏｒＴ－ＣｅｌｌＥｘｐａｎｓｉｏｎａｎｄＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ、カタログ番号１１４５６Ｄ）を用いて活性化させる。自己送達ＡｃｃｅｌｌｓｉＲＮＡを終濃度１μＭで加える。７２時間後、活性化ビーズを除去し、フローサイトメトリーによって、ＳＴＡＴのリン酸化について細胞を評価するか、またはＲＮＡの単離及びｑＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現解析のためにペレット化する。

ジンクフィンガー：操作ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ドメインは、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈによって、プラスミドペア（ＣＳＴＺＦＮ－１ＫＴＣＯＭＰＯＺＲ（登録商標）ＣｕｓｔｏｍＺｉｎｃＦｉｎｇｅｒＮｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）Ｒ－３２５７６０９）で作製した。マウスＡｎｋｒｄ１１遺伝子の位置Ｃｈｒ８：１２２８９９６７５－１２２８９９６６７及びＣｈｒ８：１２２８９９６１４－１２２８９９６０８、マウスＳｏｃｓ１遺伝子の位置Ｃｈｒ１６：１０７８４５７６－１０７８４５６２及びＣｈｒ１６：１０７８４３４６－１０７８４３２５、ならびにコントロールのマウス遺伝子Ｏｌｆｒ４５５の位置Ｃｈｒ６：４２５３８４４６－４２５３８４４７を認識するように、ドメインをカスタマイズした。プラスミドは、市販のＮＥＢＭｏｎａｒｃｈＭｉｎｉｐｒｅｐシステム（カタログ番号Ｔ１０１０）をメーカーのプロトコールに従って用いて調製する。全インプット量１０μｇを用いて、鋳型ＤＮＡを直鎖状にし、ＮＥＢＭｏｎａｒｃｈＰＣＲａｎｄＤＮＡＣｌｅａｎｕｐｋｉｔ（カタログ番号Ｔ１０３０）を用いて精製する。精製した鋳型ＤＮＡ６μｇ及びＰｒｏｍｅｇａＴ７ＲｉｂｏＭＡＸＬａｒｇｅＳｃａｌｅＲＮＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｐ１３００及びＰ１７１２）をメーカーの条件に従って用いて、５’にキャップを有するＲＮＡ転写産物を作製するためのｉｎｖｉｔｒｏ転写反応を行う。精製キットのＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ（カタログ番号７４１０４）を用いて、転写産物を精製する。Ａｇｉｌｅｎｔ４２００ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステムを用いて、各ＺＦＮドメイン転写物の完全性及び濃度を確認する。ＮＥＢＥ．ｃｏｌｉＰｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｍ０２７６）を用いて（精製ごとに１０ユニット使用する）、精製転写産物をポリアデニル化する。Ａｇｉｌｅｎｔ４２００ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステムを用いて、サイズシフトによって、ポリアデニル化テールの付加を確認する。成熟ＺＦＮドメインｍＲＮＡ転写物のそれぞれを、その対応するペアと組み合わせ、各ペア１０μｇを５００万個のマウスＣＤ８Ｔ細胞と混合して、マウスＴ細胞のエレクトロポレーションについて以下に記載されている方法に従ってエレクトロポレーションする。

ＣＡＲ発現コンストラクト：ヒトＣＤ１９、ＨＥＲ２／Ｅｒｂｂ２及びＥＧＦＲタンパク質に特異的なＣＡＲを作製した。簡潔に述べると、ＣＤ１９、ＨＥＲ２／Ｅｒｂｂ２またはＥＧＦＲのうちの１つに特異的に結合する抗原特異的ｓｃＦｖドメインに、ヒト顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体サブユニットα（ＧＭＳＣＦ－Ｒα）の２２個のアミノ酸シグナルペプチドを融合した。ヒトＣＤ８αストークを膜貫通ドメインとして使用した。ＣＤ３ξ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインをそのＣＤ８αストークの細胞質末端に融合した。抗ＣＤ１９ＣＡＲでは、ｓｃＦｖを抗ヒトＣＤ１９クローンＦＭＣ６３から得た。ヒトＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２に特異的なＣＡＲを作製するのには、トラスツズマブに由来する抗ヒトＨＥＲ２ｓｃＦｖを用いた。同様に、ＥＧＦＲに特異的なＣＡＲを作製するのには、セツキシマブに由来する抗ＥＧＦＲｓｃＦｖを用いた。例示的なＣＡＲコンストラクトの概要は、下に示されており、完全長ＣＡＲコンストラクトのアミノ酸配列は、配列番号２６、２８及び３０に示されており、完全長ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号２７、２９及び３１に示されている。
表１１：例示的なＣＡＲコンストラクト

操作ＴＣＲ発現コンストラクト：ＮＹ－ＥＳＯ１、ＭＡＲＴ－１及びＷＴ－１に特異的な組み換えＴＣＲを作製した。ＴＣＲ－α：ＴＣＲ－βが対になった可変領域タンパク質の配列であって、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２）に特異的な１Ｇ４ＴＣＲ、ＭＡＲＴ－１ペプチドＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号３）に特異的なＤＭＦ４ＴＣＲ及びＤＭＦ５ＴＣＲ、ならびにＷＴ－１ペプチドに特異的なＤＬＴＴＣＲ及び高親和性ＤＬＴＴＣＲ（各ペプチドは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１によって提示される）をコードする可変領域タンパク質配列を文献（Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２００８１８０：６１１６－６１３１）から特定した。ＴＣＲα鎖は、Ｖ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメント、ならびにＣＤＲ３α配列で構成させ、ＴＣＲβ鎖は、Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメント、ならびにＣＤＲ３－β配列で構成させた。天然型のＴＲＡＣタンパク質配列（配列番号２２）をα鎖可変領域のＣ末端に、ＴＲＢＣタンパク質配列（配列番号２４）をβ鎖可変領域のＣ末端に融合して、１Ｇ４－ＴＣＲα鎖（配列番号１１）／１Ｇ４－ＴＣＲβ鎖（配列番号１２）、９５：ＬＹ１Ｇ４－ＴＣＲα鎖（配列番号１４）／９５：ＬＹ１Ｇ４－ＴＣＲβ鎖（配列番号１３）、ＤＬＴ－ＴＣＲα鎖（配列番号５）／ＤＬＴ－ＴＣＲβ鎖（配列番号４）、高親和性ＤＬＴ－ＴＣＲα鎖（配列番号８）／高親和性ＤＬＴ－ＴＣＲβ鎖（配列番号７）、ＤＭＦ４－ＴＣＲα鎖（配列番号１７）／ＤＭＦ４－ＴＣＲβ鎖（配列番号１６）、及びＤＭＦ５－ＴＣＲα鎖（配列番号２０）／ＤＭＦ５－ＴＣＲβ鎖（配列番号１９）を作製した。

これらの操作ＴＣＲα鎖タンパク質及びＴＣＲβ鎖タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を作製し、その際には、ＴＣＲβ鎖及びＴＣＲα鎖をコードするＤＮＡ配列の間に、Ｐ２Ａ配列（配列番号１）を挿入して、両方のＴＣＲ鎖の発現を化学量論的に単一のプロモーターから駆動させるようにした。したがって、これらの操作ＴＣＲ鎖をコードする発現カセットは、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαという形態を含んでいた。各ＴＣＲコンストラクトの最終的なタンパク質配列は、配列番号１２（１Ｇ４）、配列番号１５（９５：ＬＹ１Ｇ４）、配列番号６（ＤＬＴ）、配列番号９（高親和性ＤＬＴ）、配列番号１８（ＤＭＦ４）及び配列番号２１（ＤＭＦ５）に示されている。

レンチウイルス発現コンストラクト：続いて、上記の操作受容体の発現を駆動するＳＦＦＶプロモーター、Ｔ２Ａ配列及びピューロマイシン耐性カセットを含むプラスミドに、上記のＣＡＲ発現コンストラクト及び操作ＴＣＲ発現コンストラクトを挿入した。別段に示されていない限り、これらのプラスミドは、１つ以上のｓｇＲＮＡの発現を駆動する、ヒトまたはマウス（Ｔ細胞の由来元である種による）のＵ６プロモーターをさらに含むものであった。操作ＴＣＲ発現コンストラクトを含むレンチウイルスコンストラクトは、上記のＴ細胞受容体のα鎖の定常領域をコードする内在性ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをさらに含んでよい。

上記の操作受容体をコードするレンチウイルスは、以下のようにして作製した。簡潔に述べると、トランスフェクションの２４時間前に、２８９×１０^６個のＬｅｎｔｉＸ－２９３Ｔ細胞を５段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫに播種した。無血清ＯｐｔｉＭＥＭ及びＴｒａｎｓＩＴ－２９３を合わせ、５分インキュベートしてから、ヘルパープラスミド（ＶＳＶＧを５８μｇ及びＰＡＸ２－Ｇａｇ－Ｐｏｌを１１５μｇ）と、上記の操作受容体及びｓｇＲＮＡ発現プラスミド２３１μｇを合わせた。２０分後、この混合物を上記のＬｅｎｔｉＸ－２９３Ｔ細胞に、新鮮な培地とともに加えた。トランスフェクションの１８時間後に、培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後に、ウイルス上清を回収した。上清をヌクレアーゼＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）で処理し、０．４５μｍのフィルターにかけて、ウイルス粒子を単離した。続いて、ウイルス粒子をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮し、小分けし、力価の測定を行い、－８０℃で保存した。

ＩＩ．方法
ヒトＴ細胞の単離及び活性化：ヒト全ＰＢＭＣを新鮮なロイコパックから、フィコール勾配遠心分離によって単離した。続いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１７９５３）を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を全ＰＢＭＣから精製した。Ｔ細胞の活性化のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を２×１０^６細胞／ｍＬで、Ｔ１７５フラスコ内のＸ－ＶＩＶＯ１５Ｔ細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ）に、６．２５μＬ／ｍＬのＴ細胞活性化因子ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＶａｎｃｏｕｖｅｒＢＣ，Ｃａｎａｄａ）及び１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ２とともに播種した。レンチウイルスコンストラクトによるトランスダクションの前に、Ｔ細胞を１８時間活性化させた。

ＴＩＬの単離及び活性化：本明細書に記載されている方法によって、腫瘍浸潤リンパ球も改変することができる。このような場合では、腫瘍をヒト患者から手術により切除し、外科用メスで１ｍｍ^３の切片に裁断し、一片の腫瘍を２４プレートの各ウェルに入れる。６０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２を添加した２ｍＬの完全ＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化男性ヒトＡＢ血清、１ｍＭのピルビン酸塩、２０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１×グルタマックス）を単離ＴＩＬの各ウェルに加える。１ｍＬの培地をウェルから除去し、必要に応じて、最大で週に３回、新鮮な培地及びＩＬ－２と交換する。ウェルがコンフルエントになったら、１：１で、新たな培地＋ＩＬ－２に分ける。４～５週間の培養後、急速増殖のために、それらの細胞を回収する。

ＴＩＬの急速増殖：２０ｍＬのＴＩＬ培地＋２０ｍＬのＡｉｍ－Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３ｍＡｂにおいて、５００，０００個のＴＩＬを２６×１０^６個の同種異系の照射（５０００ｃＧｙ）ＰＢＭＣフィーダー細胞で活性化させることによって、ＴＩＬを急速に増殖させる。４８時間後（２日目）、その培養液に６０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を加える。５日目に、２０ｍＬの培地を除去し、２０ｍＬの新鮮な培地（＋３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３）を加える。７日目に、細胞を計数し、利用可能な細胞数に応じて、６０×１０^６細胞／Ｌで、Ｇ－Ｒｅｘ６Ｍウェルプレート（ＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆ、カタログ番号８０６６０Ｍ）またはＧ－Ｒｅｘ１００Ｍ（Ｗｉｌｓｏｎ
Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）に播き直す。９日目に、６０００Ｕ／ｍＬの新鮮なＩＬ－２を加え、１２日目に、３０００Ｕ／ｍＬの新鮮なＩＬ－２を加える。１４日目に、ＴＩＬを回収する。続いて、Ｃｏｏｌｃｅｌｌ凍結容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて、増殖細胞をＣｒｙｏｓｔｏｒＣＳ－１０（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０７９３０）で低速凍結し、液体窒素中で長期保存する。

マウスＴ細胞の単離及び活性化：ＷＴマウスまたはトランスジェニックマウスの脾臓を摘出し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステムをメーカーの推奨に従って用いて、単細胞懸濁液まで解離させた。ＥａｓｙＳｅｐＭｏｕｓｅＣＤ８^＋ＴＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（カタログ番号１９８５３）を用いて、精製ＣＤ８^＋Ｔ細胞を得た。２ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ－２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号５７５４０６）を添加した完全Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化ＦＢＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭのβ－メルカプトエタノール）で、ＣＤ８Ｔ細胞を１×１０^６細胞／ｍＬで培養し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ＭｏｕｓｅＴ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ
ＣＤ３／ＣＤ２８ｆｏｒＴ－ＣｅｌｌＥｘｐａｎｓｉｏｎａｎｄＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ、カタログ番号１１４５６Ｄ）で活性化させた。

Ｔ細胞のレンチウイルストランスダクション：事前に１８時間活性化させたＴ細胞を６ウェルプレートに、１ウェル当たり５×１０^６細胞で、体積１．５ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ１５培地、ならびに１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－２及び１２．５μＬのヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ細胞活性化因子ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ中に播種した。上記の操作受容体を発現するレンチウイルスを、全細胞の８０％に感染できるＭＯＩで加えた。２５μＬのレトロネクチン（１ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加えた。ＸＶＩＶＯ－１５培地を、１ウェル当たりの最終体積が２．０ｍＬまで加えた。別段に示されていない限り、レンチウイルスは、ｓｇＲＮＡも発現するものであった。プレートを６００×ｇで１．５時間、室温で回転させた。１８時間後（２日目）に、細胞を洗浄し、１×１０^６細胞／ｍＬで、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２＋Ｔ細胞活性化因子中に播種した。

ヒトＴ細胞へのエレクトロポレーション：Ｔ細胞の活性化から３日後に、Ｔ細胞を回収し、ヌクレオフェクション緩衝液（ＡｍａｘａＰ３初代細胞４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＸキットＳの助剤１を１８％、Ｐ３緩衝液を８２％）に、１００×１０^６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させた。細胞溶液２０μＬ当たりに、１．５μＬのｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体（１２０ピコモルのｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体及び２０ピコモルのＣａｓ９ヌクレアーゼを含む）、ならびに２．１μＬ（１００ピコモル）のエレクトロポレーション促進剤を加えた。続いて、細胞／ＲＮＰ／促進剤の混合物２５μＬを各エレクトロポレーションウェルに加えた。「ＥＯ－１１５」というプログラムによって、Ｌｏｎｚａのエレクトロポレーターを用いて、細胞にエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、温めたＸ－ＶＩＶＯ１５培地８０μＬを各ウェルに加え、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＸ－ＶＩＶＯ１５培地中で、細胞を培養フラスコに、２×１０^６細胞／ｍＬの密度でプールした。４日目に、細胞を洗浄、計数し、利用可能な細胞数に応じて、Ｇ－Ｒｅｘ６ＭウェルプレートまたはＧ－Ｒｅｘ１００Ｍ内のＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＸ－ＶＩＶＯ１５培地に、５０～１００×１０^６細胞／Ｌの密度で播種した。６日目及び８日目に、その培養液に、１０ｎｇ／ｍＬの新鮮な組み換えヒトＩＬ－２を加えた。

マウスＴ細胞へのエレクトロポレーション：事前に４８時間活性化させたマウスＴ細胞を回収し、活性化ビーズを除去し、細胞を洗浄し、Ｎｅｏｎのヌクレオフェクション緩衝液Ｔに再懸濁させた。Ｎｅｏｎ（商標）の１０μＬ用チップを用いて、９μＬの緩衝液Ｔに再懸濁させた最大２×１０^６個の細胞をエレクトロポレーションでき、Ｎｅｏｎ（商標）の１００μＬ用チップを用いて、９０μＬの緩衝液Ｔに再懸濁させた２０×１０^６個の細胞をエレクトロポレーションできる。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体またはＺＦＮ
ｍＲＮＡ（１０μＬ用チップ当たり１μＬ、または１００μＬ用チップ当たり１０μＬ）、及び１０．８μＭのエレクトロポレーション促進剤（１０μＬ用チップ当たり２μＬ、または１００μＬ用チップ当たり２０μＬ）を細胞に加えた。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体またはＺＦＮｍＲＮＡと混合したＴ細胞をピペットでＮｅｏｎ（商標）チップに入れ、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（１７００Ｖ／２０ｍｓ／１パルス）を用いて、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーション直後に、２ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ－２を添加した温めた完全Ｔ細胞培地の入った培養フラスコに、細胞を１．６×１０^６細胞／ｍＬの密度で移した。ＩＬ－２を添加した完全Ｔ細胞培地中で、編集されたマウスＣＤ８Ｔ細胞をさらに、１×１０^６細胞／ｍＬで、新たに１～４日間培養した。

操作Ｔ細胞の精製及び特徴付け：Ｔ細胞の活性化から１０日後、細胞を培養フラスコから取り出し、編集された操作受容体発現ＣＤ８^＋Ｔ細胞を精製した。操作受容体の発現は、抗体染色（例えば、ＤＭＦ４ＴＣＲではＶβ１２、またはＮＹ－ＥＳＯ－１もしくは１Ｇ４ではＶβ１３／１３．１に対する抗体）によって判断できる。標的遺伝子の編集のさらなる判断は、表面タンパク質（例えばＣＤ３）のＦＡＣＳ解析、標的タンパク質のウエスタンブロット、及び／またはゲノムの切断部位のＴＩＤＥ／ＮＧＳ解析によって評価できる。続いて、Ｃｏｏｌｃｅｌｌ凍結容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて、精製細胞をＣｒｙｏｓｔｏｒＣＳ－１０（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０７９３０）で低速凍結して、将来使用するために、液体窒素中で長期保存することができる。

実施例２：編集された受容体導入Ｔ細胞の特徴付け
編集された受容体発現細胞を、細胞表面でのＣＤ３の発現に基づき精製する実験を行った。操作前には、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＲα鎖／ＴＣＲβ鎖を含む複合体の一部として、細胞表面にＣＤ３分子を発現する（図４Ａ）。そのＴ細胞に、ＣＡＲ、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、及びＢ２Ｍ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（Ｂ２Ｍ遺伝子を用いて、標的遺伝子の編集の代わりに、非ＴＣＲ遺伝子の編集を評価した）を発現するレンチウイルスをトランスダクションした。レンチウイルスのトランスダクション及びＣａｓ９ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後、トランスダクションが成功して編集されたＴ細胞では、ＴＲＡＣ遺伝子の編集により、表面ＣＤ３の発現が欠損し、Ｂ２Ｍ遺伝子の編集により、ＨＬＡ－ＡＢＣの発現が欠損する（図４Ｂ）。ＥａｓｙＳｅｐＨｕｍａｎＣＤ３－ＰｏｓｉｔｉｖｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈカタログ番号１８０５１）を用いて、そのバルク集団（図４Ｂ）からＣＤ３発現細胞を除去した。続いて、細胞に対して、ＣＤ３について磁気による陰性選択を２ラウンド行った。このプロセスにより、高精製のＣＤ３陰性Ｔ細胞が得られた（図４Ｃ）。組み換えＣＤ１９－Ｆｃ試薬（ＣＤ１９ＣＡＲと結合する）で染色したところ、編集された細胞では、ＣＤ１９ＣＡＲの表面発現が見られるが、非編集細胞では見られないことが示された（図４Ｄ）。ＣＤ４５及びＢ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡの場合でも、同様の実験を行った。９６時間後に、ＣＤ４５及びＢ２Ｍの発現をフローサイトメトリーによって評価することによって、Ｔ細胞におけるＣａｓ９の編集活性を確認し、効率的なＣａｓ９機能は、ＦＡＣＳによって求めた場合の、Ｔ細胞表面でのＣＤ４５の発現の欠損によって示される。Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びＣａｓ９ＲＮＰの共エレクトロポレーションによって、ＣＤ４５座及びＢ２Ｍ座で大幅な編集が行われ、細胞の６６．３％で、デュアル編集が見られた。

上記実施例に記載されているようにして、標的の編集を行い、Ｔｒａｃｋｉｎｇｏｆ
ＩｎｄｅｌｓｂｙＤｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＩＤＥ）解析法及びウエスタンブロット解析の両方を用いて、単一の例示的遺伝子ＣＢＬＢの編集を確認した。ＴＩＤＥは、標的とする細胞プールのＤＮＡにおいて、編集有効性を定量し、主要なタイプの挿入及び欠失（インデル）を特定する。

ＱｉａｇｅｎＢｌｏｏｄａｎｄＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（カタログ番号１３３２３）を業者推奨のプロトコールに従って用いて、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、編集されたＴ細胞から単離し、定量した。ｇＤＮＡの単離後、遺伝子座特異的ＰＣＲプライマー（Ｆ：５’－ＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＴＧＴＴＧＣＡＴＴ－３’（配列番号３２）、Ｒ：５’－ＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＧＴＡ－３’（配列番号３３））を用いてＰＣＲを行って、編集されたＤＮＡの領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに流し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（カタログ番号：２８７０６）を用いて、抽出及び精製した。抽出産物をサンガーシーケンシングによってシーケンシングし、サンガーシーケンシングクロマトグラム配列ファイルをＴＩＤＥによって解析した。ｇＲＮＡ発現レンチウイルスによって導入したｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体またはＣａｓ９ｍＲＮＡのいずれかを用いた方法によって編集したＣＢＬＢ編集Ｔ細胞では、得られたＴＩＤＥ解析結果によって、ＣＢＬＢ標的遺伝子の編集が確認された。ＴＩＤＥに加えて、抗ＣＢＬＢ抗体（ＳＣＴカタログ番号９４９８）を用いたウエスタンブロットによって、ＣＢＬＢタンパク質レベルの消失が確認された。そのデータは、図５Ａ及び５Ｂ、ならびに図６に示されている。

遺伝子の編集を評価する別の方法は、次世代シーケンシングによるものである。この方法では、ＱｉａｇｅｎＢｌｏｏｄａｎｄＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（カタログ番号１３３２３）を業者推奨のプロトコールに従って用いて、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、編集されたＴ細胞から単離し、定量した。ｇＤＮＡの単離後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシングアダプターの付加に必要なオーバーハングを含む遺伝子座特異的ＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＲを行って、編集されたゲノムＤＮＡの領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに流して、ゲノム座位の特異的かつ充分な増幅が行われるようにしてから、業者推奨のプロトコールに従ってＭｏｎａｒｃｈＰＣＲ＆ＤＮＡＣｌｅａｎｕｐＫｉｔ（カタログ番号：Ｔ１０３０Ｓ）を用いて、ＰＣＲクリーンアップを行った。続いて、精製ＰＣＲ産物を定量し、２回目のＰＣＲを行って、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングアダプター、及びマルチプレックスに必要な試料特異的なインデックス付与配列をアニールした。この後、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに流し、サイズを評価してから、ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ（内部で作製）を用いて精製した。続いて、ＫａｐａＩｌｌｕｍｉｎａＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（カタログ番号：ＫＫ４９２３）及びＫａｐａＩｌｌｕｍｉｎａＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＤＮＡＳｔａｎｄａｒｄｓ（カタログ番号：ＫＫ４９０３）を用いたｑＰＣＲによって、精製ＰＣＲ産物を定量した。続いて、ＩｌｌｕｍｉｎａＮｅｘｔＳｅｑ５００／５５０ＭｉｄＯｕｔｐｕｔＲｅａｇｅｎｔＣａｒｔｒｉｄｇｅｖ２（カタログ番号：ＦＣ－４０４－２００３）を用いるＩｌｌｕｍｉｎａＮｅｘｔＳｅｑ５００システムに、定量した産物を充填した。生成されたシーケンシングデータの解析を行って、編集されたＴ細胞のプールのＤＮＡにおいて、予測切断部位での挿入及び欠失（インデル）を評価した。

実施例３：ＯＴ１／Ｂ１６－ＯｖａＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の機能的ゲノムスクリーニングによる、養子Ｔ細胞移入療法の標的の特定
腫瘍におけるＴ細胞の集積を調節する標的を特定するために、実験を行った。プールＣＲＩＳＰＲのスクリーニングを行い、その際には、それぞれ単一の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのプールを腫瘍特異的Ｔ細胞集団に導入して、その集団内の各細胞に、単一の遺伝子を標的とする単一のｓｇＲＮＡが含まれるようにした。腫瘍試料において、特定の遺伝子がＴ細胞の集積に及ぼす作用を明らかにするために、実験の開始時に、Ｔ細胞集団内の各ｓｇＲＮＡの頻度を求め、その実験の事後の時点における同じｓｇＲＮＡの頻度と比較した。腫瘍試料におけるＴ細胞集積を正に調節する遺伝子（例えば、Ｔ細胞の増殖性、生存能及び／または腫瘍浸潤性を正に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、時間とともに上昇すると予測されるが、腫瘍試料におけるＴ細胞集積を負に調節する遺伝子（例えば、Ｔ細胞の増殖性、生存能及び／または腫瘍浸潤性を負に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、時間とともに低下すると予測される。

実施例１に記載されている方法に従って、Ｃａｓ９を発現するＯＴ１マウスから得たＣＤ８^＋Ｔ細胞を用いて、プールＣＲＩＳＰＲのスクリーニングを行った。精製ＯＴＩＣＤ８^＋Ｔ細胞にプールｓｇＲＮＡライブラリー及びＣａｓ９ｍＲＮＡを導入しｉｎ
ｖｉｔｒｏで培養して、編集されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の集団を作製した。ｉｎｖｉｔｒｏで操作後、Ｂ１６－Ｏｖａ腫瘍を担持するＣ５６ＢＬ／６マウスに、その編集されたＯＴ１ＣＤ８^＋Ｔ細胞を静脈内（ｉｖ）投与した。ｉｎｖｉｖｏで増殖後、臓器を摘出し、ＣＤ４５＋を濃縮した。ＱｉａｇｅｎＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔを用いて、その単離ＣＤ４５＋細胞のゲノムＤＮＡを単離した。続いて、ｓｇＲＮＡライブラリーをＰＣＲによって増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いてシーケンシングした。

腫瘍担持マウスから摘出した試料中の各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度を解析し、最初のＴ細胞集団における各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度と比較した。個々のｓｇＲＮＡのそれぞれにおいて、統計解析を行って、腫瘍担持マウスから採取したＴ細胞集団において有意に濃縮されたガイドを特定したとともに、各ガイドに濃縮スコアを割り当てた。同じ遺伝子を標的とする個々のｓｇＲＮＡの濃縮スコアを集約して、複数のｓｇＲＮＡ及び複数のＯＴ１ドナーマウスにわたって、Ｔ細胞集積に対して一定かつ再現性のある作用を及ぼした標的遺伝子を特定した。これらの実験の結果は、下記の表１２に示されている。表１２のパーセンタイルは、パーセンタイルスコア＝１－（遺伝子濃縮順位／スクリーニングした遺伝子の総数）という式を用いて算出した。
表１２：標的遺伝子パーセンタイルスコア

実施例４：ｉｎｖｉｔｒｏでのＣＡＲ－Ｔ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の機能的ゲノムスクリーニングによる、養子Ｔ細胞移入療法の標的の特定
ＣＡＲ－Ｔ細胞腫瘍試料の集積を調節する標的を特定するために、実験を行った。ゲノムワイドなプールＣＲＩＳＰＲのスクリーニングを行い、その際には、それぞれ単一の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのプールを腫瘍特異的ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞集団に導入して、その集団内の各細胞に、単一の遺伝子を標的とする単一のｓｇＲＮＡが含まれるようにした。特定の遺伝子が、腫瘍試料におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の集積に及ぼす作用を明らかにするために、実験の開始時に、ＣＡＲ－Ｔ細胞集団内の各ｓｇＲＮＡの頻度を求め、その実験の事後の時点における同じｓｇＲＮＡの頻度と比較した。腫瘍試料におけるＣＡＲ－Ｔ細胞集積を正に調節する遺伝子（例えば、Ｔ細胞の増殖性、生存能及び／または腫瘍浸潤性を正に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、時間とともに上昇すると予測されるが、腫瘍試料におけるＣＡＲ－Ｔ細胞集積を負に調節する遺伝子（例えば、Ｔ細胞の増殖性、生存能及び／または腫瘍浸潤性を負に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、時間とともに低下すると予測される。

ヒトＣＤ１９に特異的なＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて、ｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングを行った。プールｓｇＲＮＡライブラリーを上記のＣＤ１９ＣＡＲＴに導入し、実施例１に記載されているように、Ｃａｓ９ｍＲＮＡを細胞にエレクトロポレーションして、Ｃａｓ９で編集されたＣＤ１９ＣＡＲＴの集団を作製した。続いて、ＣＤ１９を発現するように操作した付着大腸癌（ＣＲＣ）細胞株、または内在性ＣＤ１９を発現するバーキットリンパ腫細胞株とともに、その編集されたＣＤ１９ＣＡＲＴを共培養した。共培養期間の全体を通じて、様々な時点にＣＡＲＴを回収し、細胞ペレットを凍結した。ＱｉａｇｅｎＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔを用いて、これらの細胞ペレットからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシングを用いてシーケンシングした。

ＣＡＲＴ／腫瘍細胞共培養液から得たアリコートにおける各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度を解析し、最初の編集ＣＡＲ－Ｔ細胞集団における各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度と比較した。個々のｓｇＲＮＡのそれぞれにおいて、統計解析を行って、腫瘍細胞の共培養後に、ＣＡＲ－Ｔ細胞集団において有意に濃縮されたｓｇＲＮＡを特定したとともに、各ガイドに濃縮スコアを割り当てた。同じ遺伝子を標的とする個々のｓｇＲＮＡの濃縮スコアを集約して、複数のｓｇＲＮＡ及びＣＡＲ－Ｔ細胞集団にわたって、腫瘍試料におけるＣＡＲ－Ｔ細胞集積に対して一定かつ再現性のある作用を及ぼす標的遺伝子を特定した。標的をランク付けし、パーセンタイルに基づき、さらなる調査の対象とした。これらの実験の結果は、下記の表１３に示されている。表１３のパーセンタイルは、パーセンタイルスコア＝１－（遺伝子濃縮順位／スクリーニングした遺伝子の総数）という式を用いて算出した。
表１３：標的遺伝子パーセンタイルスコア

実施例５：ｉｎｖｉｖｏでのＣＡＲ－Ｔ／腫瘍ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の機能的ゲノムスクリーニングによる、養子Ｔ細胞移入療法の標的の特定
腫瘍の存在下で、ＣＡＲ－Ｔ細胞の集積を調節する標的を特定するために、実験を行った。プールＣＲＩＳＰＲのスクリーニングを行い、その際には、それぞれ単一の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのプールを腫瘍特異的ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞集団に導入して、その集団内の各細胞に、単一の遺伝子を標的とする単一のｓｇＲＮＡが含まれるようにした。特定の遺伝子が、腫瘍試料におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の集積に及ぼす作用を明らかにするために、実験の開始時に、ＣＡＲ－Ｔ細胞集団内の各ｓｇＲＮＡの頻度を求め、その実験の事後の時点における同じｓｇＲＮＡの頻度と比較した。腫瘍試料におけるＣＡＲ－Ｔ細胞集積を正に調節する遺伝子（例えば、Ｔ細胞の増殖性、生存能及び／または腫瘍浸潤性を正に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、時間とともに上昇すると予測されるが、腫瘍試料におけるＣＡＲ－Ｔ細胞集積を負に調節する遺伝子（例えば、Ｔ細胞の増殖性、生存能及び／または腫瘍浸潤性を負に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、時間とともに低下すると予測される。

バーキットリンパ腫モデル及び大腸癌（ＣＲＣ）モデルという２つの別々の皮下異種移植モデルで、ｉｎｖｉｖｏスクリーニングを行った。バーキットモデルでは、マトリゲル中の１×１０^６個のバーキットリンパ腫腫瘍細胞を６～８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤγ（ＮＳＧ）マウスの右側腹部に皮下注射した。接種から１３日目、腫瘍がおよそ２００ｍｍ^３の体積に達したら、マウスをモニタリングし、無作為に分けて、試験に登録した。ＣＲＣモデルでは、ＣＲＣ細胞を操作して、ＣＤ１９を発現するようにし、マトリゲル中の５×１０^６個の腫瘍細胞を６～８週齢のＮＳＧマウスの右側腹部に皮下注射した。接種から１２日目に、腫瘍がおよそ２００ｍｍ^３の体積に達したら、マウスをモニタリングし、無作為に分け、試験に登録した。Ｃａｓ９で操作したＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈から３×１０^６個及び１０×１０^６個／マウス（３Ｍ及び１０Ｍ）で静脈内投与した。ＣＡＲ－Ｔの注射から８～１０日後に、腫瘍を回収し、液体窒素で凍結した。その後、ゲノムＤＮＡの抽出のために、これらの組織を解離及び処理した。

試験の最後に得られたゲノムＤＮＡ試料における各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度を解析し、最初の編集ＣＡＲ－Ｔ細胞集団における各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度と比較した。個々のｓｇＲＮＡのそれぞれにおいて、統計解析を行って、試験の最後に得られたゲノムＤＮＡ試料において有意に濃縮されたｓｇＲＮＡを特定したとともに、各ガイドに濃縮スコアを割り当てた。同じ遺伝子を標的とする個々のｓｇＲＮＡの濃縮スコアを集約して、複数のｓｇＲＮＡ及びＣＡＲ－Ｔ細胞集団にわたって、ＣＡＲ－Ｔ細胞存在量に対して一定かつ再現性のある作用を及ぼした標的遺伝子を特定した。標的をランク付けし、パーセンタイルに基づき、さらなる調査の対象とした。これらの実験の結果は、下記の表１４に示されている。表１４のパーセンタイルは、パーセンタイルスコア＝１－（遺伝子濃縮順位／スクリーニングした遺伝子の総数）という式を用いて算出した。
表１４：標的遺伝子パーセンタイルスコア

実施例６：マウスＯＴ１／Ｂ１６Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおける単一編集型養子移入Ｔ細胞の検証
単一ガイドの形態でさらに評価を行って、腫瘍特異的Ｔ細胞において標的遺伝子を編集すると、抗腫瘍有効性が向上するか判断するために、実施例３～５においてパーセンタイルスコアが０．６以上であった標的を選択した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。

抗ＰＤ１抗体による治療に対する感受性があるＢ１６－Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、単一編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０^６個のＢ１６－Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ１００ｍｍ^３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集型マウスＯＴ１ＣＤ８＋
Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。ＯＴ１Ｔ細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）ＰＤ１を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）Ｃｂｌｂを標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｖ）Ｓｏｃｓ１を標的とする単一のｇＲＮＡ、を含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。標的遺伝子が編集された腫瘍特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団を作製するために、実施例１に記載されているように、雌のＯＴ１マウスの脾臓を回収し、ＣＤ８Ｔ細胞を単離した。続いて、その編集ＯＴ１ＣＤ８^＋Ｔ細胞をＢ１６－Ｏｖａ腫瘍担持Ｃ５６ＢＬ／６マウスに静脈内投与した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。下記の式に従って、平均腫瘍体積（ＴＶ）を用いて腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。
％ＴＧＩ＝（標的ＴＶ_最終－標的ＴＶ_初期）／（コントロールＴＶ_最終－コントロールＴＶ_初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、ＣｂｌｂＴＧＩにおける最終は、Ｔ細胞の移入から１８日目であり、Ｓｏｃｓ１ＴＧＩにおける最終は、Ｔ細胞の移入から１７日目であり、初期は、０日目（すなわちＴ細胞の移入日）である。

Ｃｂｌｂ編集Ｔ細胞の結果は、図７Ａに示されている。これらのデータにより、Ｔ細胞においてＣｂｌｂ遺伝子を編集すると、抗腫瘍有効性が得られ、１８日目にＴＧＩが８５％になったことが示されている。Ｓｏｃｓ１編集Ｔ細胞の結果は、図７Ｂに示されている。これらのデータにより、Ｔ細胞においてＳｏｃｓ１遺伝子を編集すると、そのＴ細胞の抗腫瘍有効性が向上し、１７日目にＴＧＩが６２％になったことが示されている。同様の実験を行って、Ａｎｋｒｄ１１編集Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を評価することができる。

実施例７：マウスＭＣ３８／ｇｐ１００同系腫瘍モデルにおける単一編集型養子移入Ｔ細胞の検証
単一ガイドの形態でさらに評価を行って、腫瘍特異的Ｔ細胞において標的遺伝子を編集すると、大腸癌のマウスＭＣ３８ｇｐ１００皮下同系腫瘍モデル（抗ＰＤ１抗体による治療に対して非感受性である）において抗腫瘍有効性が向上するか判断するために、実施例３～５においてパーセンタイルスコアが０．６以上であった標的を選択した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。

簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１×１０^６個のＭＣ３８ｇｐ１００腫瘍細胞を皮下注射した。そのＴ細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）Ｓｏｃｓ１を標的とする単一のｇＲＮＡ、または（ｉｉｉ）Ａｎｋｒｄ１１を標的とする単一のｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ^３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、Ｓｏｃｓ１またはＡｎｋｒｄ１１編集型マウスＰＭＥＬＣＤ８^＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。

Ｓｏｃｓ１編集Ｔ細胞の結果は、図８Ａに示されており、２１日目における腫瘍の成長が、コントロールと比べて有意に低下したことを示している。Ａｎｋｒｄ１１編集Ｔ細胞の結果は、図８Ｂに示されており、同様に、２１日目における腫瘍の成長が、コントロールと比べて有意に低下したことを示している。

実施例８：マウスＯＴ１／ＥＧ７Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルにおける単一編集型養子移入Ｔ細胞の検証
Ｅｇ７－Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、マウスにおいて、Ｓｏｃｓ１、Ａｎｋｒｄ１１及びＣｂｌｂの抗腫瘍有効性をさらに評価する。Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１×１０^６個のＥｇ７－Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射する。腫瘍が、およそ１００ｍｍ^３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集型マウスＯＴ１ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射する。これらの細胞は、注射の前に、コントロールのガイド、またはＳｏｃｓ１遺伝子、Ａｎｋｒｄ１１遺伝子もしくはＣｂｌｂ遺伝子を編集する単一のガイドのいずれかによって編集する。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定する。腫瘍体積を各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出する。

これらのデータにより、Ｔ細胞においてＳｏｃｓ１遺伝子、Ａｎｋｒｄ１１遺伝子またはＣｂｌｂ遺伝子を編集すると、そのＴ細胞の抗腫瘍有効性がコントロールと比べて向上することが予測される。

実施例９：Ａ３７５異種移植腫瘍モデルにおける単一編集型養子移入Ｔ細胞の検証
単一ガイドの形態でさらに評価を行って、腫瘍特異的Ｔ細胞において標的遺伝子を編集すると、Ａ３７５異種移植腫瘍モデルにおいて、抗腫瘍有効性が向上するか判断するために、実施例３～５においてパーセンタイルスコアが０．６以上であった標的を選択した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。

簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓから得た６～８週齢のＮＳＧマウスに、５×１０^６個のＡ３７５細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ２００ｍｍ^３の体積に達したら、マウスを８頭からなる群に無作為に分け、１８．８７×１０^６個の編集Ｔｇ－ＴＣＲ細胞を尾静脈から静脈内注射する。単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞中のＣＢＬＢ遺伝子を実施例１に記載されている方法に従って編集した。続いて、その編集ＴＣＲＣＤ８^＋Ｔ細胞をＡ３７５腫瘍担持マウスに静脈内投与した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積を各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した（図１０）。Ａ３７５異種移植モデルにおけるＳＯＣＳ１編集Ｔ細胞及びＡＮＫＲＤ１１編集Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を評価するには、同様の実験を行う。これらの実験では、編集Ｔ細胞の抗腫瘍有効性がコントロールと比べて向上することが予測される。

実施例１０：Ｒａｊｉ異種移植モデルにおける単一編集型養子移入ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞の検証
Ｒａｊｉ細胞由来の異種移植皮下腫瘍モデルにおいて、ＳＯＣＳ１編集初代ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞（ヒト）、ＡＮＫＲＤ１１編集初代ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞（ヒト）及びＣＢＬＢ編集初代ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞（ヒト）の抗腫瘍有効性を評価するために、実験を行う。Ｒａｊｉ細胞は、抗ＰＤ１抗体による治療に対して非感受性であることが知られているヒトリンパ腫細胞株である。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＮＳＧマウスに、３×１０^６個のＲａｊｉ腫瘍細胞を皮下注射する。腫瘍が、およそ２００ｍｍ^３の体積に達したら、マウスを５頭からなる群に無作為に分け、編集ヒトＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を尾静脈から静脈内注射する。そのＣＡＲ－Ｔ細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）ＳＯＣＳ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）ＡＮＫＲＤ１１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、または（ｉｖ）ＣＢＬＢ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定する。腫瘍体積を各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出する。これらの実験では、経時的な腫瘍成長抑制率の上昇及び腫瘍体積の縮小によって示した場合、ＳＯＣＳ１編集ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＡＮＫＲＤ１１編集ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍有効性が、コントロール細胞と比べて向上することが予測される。

実施例１１：デュアル編集の組み合わせに関するスクリーニング
ダブルｓｇＲＮＡライブラリーをレトロウイルス骨格で構築した。そのライブラリーは、単一のガイドＲＮＡ（ガイド＋ｔｒａｃｒ、ｓｇＲＮＡ）の発現をそれぞれ駆動する２つのＵ６プロモーター（１つのヒトＵ６プロモーター及び１つのマウスＵ６プロモーター）で構成させた。それらのガイドをプールとしてクローニングして、すべてのｓｇＲＮＡそれぞれが、他のすべてのｓｇＲＮＡそれぞれと対になるように、ガイドをランダムに組み合わせた。最終的なダブルガイドライブラリーをＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして、マウスエコトロピックレトロウイルスを作製した。Ｃａｓ９を発現するＴＣＲトランスジェニックＯＴ１細胞を、ｓｇＲＮＡ発現ウイルスに感染させて、各ｓｇＲＮＡの標的となる２つの遺伝子座を編集した。続いて、４００ｍｍ^３超のＢ１６－Ｏｖａ腫瘍同種移植片を担持するマウスに、編集されたトランスジェニックＴ細胞を移入した。２週間後、その腫瘍を切り出し、その腫瘍を消化して、その腫瘍に存在するＣＤ４５＋細胞を濃縮することによって、腫瘍浸潤Ｔ細胞を精製した。ＱｉａｇｅｎＱＵＩＡａｍｐＤＮＡｂｌｏｏｄｋｉｔを用いて、ゲノムＤＮＡをＣＤ４５＋細胞から抽出し、レトロウイルス骨格配列に対応するプライマーを用いたＰＣＲによって、レトロウイルスインサートをＰＣＲによって回収した。続いて、得られたＰＣＲ産物をシーケンシングして、移入の２週間後に腫瘍に存在するｓｇＲＮＡを特定した。最終単離細胞集団内のガイドペアの内容を、最初のプラスミド集団、及びマウスに注射する前の感染トランスジェニックＴ細胞集団と比較した。Ｔ細胞の適応性及び／または腫瘍浸潤性を向上させるｓｇＲＮＡペアの頻度は、時間とともに上昇すると予測され、一方適応性を損なう組み合わせは、時間とともに減少すると予測された。下記の表１５には、最終細胞集団におけるｓｇＲＮＡ頻度を、ｉｎｖｉｖｏ移入した最初の細胞集団におけるｓｇＲＮＡ頻度と比較した変化倍率の中央値が示されている。
表１５：組み合わせのスクリーニングにおけるｓｇＲＮＡ頻度

実施例１２：Ｒａｊｉ異種移植モデルにおけるデュアル編集型ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞の検証
異種移植腫瘍モデルにおいてＴ細胞の抗腫瘍有効性を向上させる編集遺伝子の組み合わせを求めるための併用試験で、標的をさらに評価した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。

編集の抗腫瘍有効性に関する併用作用の例として、初代ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞において、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲを単独でまたは組み合わせて編集し、Ｒａｊｉ皮下細胞由来の異種移植腫瘍モデルを用いて、マウスにおいて評価した。Ｒａｊｉ細胞は、抗ＰＤ１抗体による治療に対して非感受性であることが知られているリンパ腫細胞株である。Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＮＳＧマウスに、３×１０^６個のＲａｊｉ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ２００ｍｍ^３の体積に達したら、マウスを５頭からなる群に無作為に分け、編集ヒトＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を尾静脈から静脈内注射した。その養子移入細胞は、注射の前に、コントロールのガイド、あるいはＣＢＬＢ及び／またはＢＣＯＲを編集するガイドのいずれかで編集した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。

図１０に示されているように、コントロールのガイドと比較したところ、皮下バーキットリンパ腫Ｒａｊｉマウスモデルにおいて、示されているように標的遺伝子を単独でまたは組み合わせて編集したＢＣＯＲ及びＣＢＬＢ編集ヒトＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の養子移入によって、抗腫瘍応答が得られた。両方の標的を組み合わせて編集したときの方が、いずれかの標的を単独で編集した場合またはコントロールのガイドの場合よりも、抗腫瘍有効性が高かった。ＣＤ１９ＣＡＲ－ＴＲａｊｉ細胞異種移植モデルにおけるＳｏｃｓ１／Ａｎｋｒｄ１１デュアル編集型Ｔ細胞の有効性を評価するには、同様の実験を行う。

実施例１３：ＣＡＲ－ＴにおいてＢＣＯＲ及びＣＢＬＢを二重編集すると、腫瘍の存在下における集積及びサイトカインの産生が増大する
初代ＣＤ１９ＣＡＲ－ＴをヒトＣＤ８Ｔ細胞から作製し、ＲＮＰの形態でＣａｓ９と複合化させたガイドＲＮＡを用いたエレクトロポレーションによって、ネガティブコントロール遺伝子、ＢＣＯＲ、ＣＢＬＢ、またはＢＣＯＲ及びＣＢＬＢの両方を編集した。ＣＤ１９ＣＡＲ－ＴをＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞と、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、１：０、０．３：１、１：１、３：１及び１０：１の比率で共培養した。２４時間後、ＣＡＲ－Ｔ細胞の総細胞数を求め、サイトカインの解析のために、上清を保存した。図１１に示されているように、ＢＣＯＲ編集ＣＡＲＴ及びＢＣＯＲ＋ＣＢＬＢ編集ＣＡＲＴでは、集積性が、コントロールまたはＣＢＬＢ編集ＣＡＲＴのいずれよりも３０％高く、ＢＣＯＲを編集すると、腫瘍の存在下でＣＡＲ－Ｔ細胞が集積する能力が向上することが示された。さらに、ＣＢＬＢ編集ＣＡＲＴ及びＣＢＬＢ＋ＢＣＯＲ編集ＣＡＲＴでは、いずれのコントロール編集ＣＡＲＴと比べても、１０倍以上のＩＬ－２（図１２）及びＩＦＮγ（図１３）が産生されたことから、ＣＢＬＢの編集により、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン（Ｔ細胞の全体的な適応性及び機能的能力を向上させることが知られている）の産生が増大することが示された。ＣＤ８Ｔ細胞は典型的にはＩＬ－２を産生しないので、ＣＤ８Ｔ細胞によるＩＬ－２産生の増加は、驚くべきことである。これらのデータにより、いくつかのケースでは、エフェクター機能が増強されたＣＡＲ－Ｔ細胞の作製には、複数の遺伝子の編集が必要であることが示されている。例えば、この例では、腫瘍の存在下で集積が増大するとともに、サイトカインであるＩＬ－２及びＩＦＮγの産生が増加するＣＡＲ－Ｔ細胞の作製には、ＢＣＯＲ遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子の両方の編集が必要であった。

ＳＯＣＳ１／ＣＢＬＢデュアル編集型ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＡＮＫＲＤ１１／ＣＢＬＢデュアル編集型ＣＡＲ－Ｔ細胞が、腫瘍の存在下での集積及びサイトカインの産生に及ぼす作用を評価するには、同様の実験を行う。

実施例１４：マウスＯＴ１／Ｂ１６Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおけるデュアル編集型養子移入Ｔ細胞の検証
同系腫瘍モデルにおいてＴ細胞の抗腫瘍有効性を向上させる編集遺伝子の組み合わせを求めるための併用試験で、標的をさらに評価した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。

Ｂ１６Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、Ｓｏｃｓ１／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０^６個のＢ１６Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。全コホートのマウスにおける腫瘍の平均体積がおよそ４８５ｍｍ^３に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集型マウスＯＴ１ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）ＰＤ－１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ（配列番号５３１）、（ｉｉｉ）Ｓｏｃｓ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ（配列番号７３８）、または（ｉｖ）Ｃｂｌｂ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ（配列番号３１０）及びＳｏｃｓ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡの２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。Ｃｂｌｂ遺伝子及びＳｏｃｓ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を求めたところ、Ｃｂｌｂ遺伝子のものでは９４％、Ｓｏｃｓ１遺伝子のものでは９２％であった（ＮＧＳ法を用いて評価した）。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。下記の式に従って、平均腫瘍体積を用いて腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。
％ＴＧＩ＝（標的ＴＶ_最終－標的ＴＶ_初期）／（コントロールＴＶ_最終－コントロールＴＶ_初期）×１００
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、Ｔ細胞の移入から７日目であり、初期は、０日目（すなわちＴ細胞の移入日）である。

図１４に示されているように、Ｓｏｃｓ１／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞を移入したところ、ＴＧＩが、ＰＤ１単一編集型Ｔ細胞またはＳｏｃｓ１単一編集型Ｔ細胞を移入した場合と比べて上昇した（Ｓｏｃｓ１／ＣｂｌｂＴＧＩが７７％であったのに対して、ＰＤ１単一の編集では３０％、Ｓｏｃｓ１単一の編集では４４％であった）。Ａｎｋｒｄ１１／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を評価するには、同様の実験を行う。

実施例１５：マウスＰＭＥＬ／ＭＣ３８－ｇｐ１００腫瘍モデルにおけるデュアル編集型養子移入Ｔ細胞の検証
ＭＣ３８ｇｐ１００皮下同系腫瘍モデルを用いて、Ａｎｋｒｄ１１／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価する。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１×１０^６個のＭＣ３８ｇｐ１００腫瘍細胞を皮下注射する。腫瘍が、およそ１００ｍｍ^３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集型マウスＰＭＥＬＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射する。Ｔ細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）ＰＤ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）Ａｎｋｒｄ１１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｖ）Ｓｏｃｓ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、または（ｖ）Ａｎｋｒｄ１１遺伝子及びＳｏｃｓ１遺伝子の両方を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定する。腫瘍体積を各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出する。下記の式に従って、平均腫瘍体積を用いて腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出する。
（標的ＴＶ_最終－標的ＴＶ_初期）／（コントロールＴＶ_最終－コントロールＴＶ_初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、Ｔ細胞の移入から２１日目であり、初期は、０日目（すなわちＴ細胞の移入日）である。

これらの実験では、Ａｎｋｒｄ１１／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞の移入後に、ＴＧＩが、ＰＤ１単一編集型Ｔ細胞、Ａｎｋｒｄ１１単一編集型Ｔ細胞またはＳｏｃｓ１単一編集型Ｔ細胞の移入時と比べて上昇することが予測される。

実施例１６：マウスＢ１６－Ｆ１０同系腫瘍モデルにおけるデュアル編集型養子移入Ｔ細胞の検証
肺転移として顕在化する疾患を伴う侵襲性転移性Ｂ１６－Ｆ１０同系腫瘍モデルを用いて、Ｓｏｃｓ１／Ａｎｋｒｄ１１デュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０^６個のＢ１６－Ｆ１０腫瘍細胞を静脈内注射した。接種の前に、マウスの体重を測定し、無作為化手順を用いてマウスを処置群に割り当てた。腫瘍の接種から３日目に、マウスに、編集型マウスＰＭＥＬＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）Ｓｏｃｓ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）Ａｎｋｒｄ１１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、または（ｉｖ）Ｓｏｃｓ１遺伝子及びＡｎｋｒｄ１１遺伝子のそれぞれを標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。Ａｎｋｒｄ１１遺伝子及びＳｏｃｓ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を求めたところ、Ａｎｋｒｄ１１遺伝子のものでは７０％、Ｓｏｃｓ１遺伝子のものでは７２％であった（ＮＧＳ法を用いて評価した）。体重を少なくとも週に２回モニタリングした。腫瘍の接種から１５日目（編集型ＰＭＥＬの移入から１２日目）に、マウス肺を１０％パラホルムアルデヒドで灌流及び固定した。一晩固定後、肺をさらに保存するために７０％ＥｔＯＨに移した。肺においてがん細胞の黒色コロニーとして見ることができるＢ１６－Ｆ１０腫瘍量を目視で評価することによって、腫瘍有効性を評価した。

非処置群またはコントロールの編集型ＰＭＥＬＣＤ８＋Ｔ細胞で処置したマウスから得たすべての肺において、転移性コロニーが多く観察されたことから、疾患の著しい進行が示唆された。Ｓｏｃｓ１単一編集型細胞で処置したマウスでは、部分的有効性が見られ、Ａｎｋｒｄ１１単一編集型細胞では、有効性は最小限であった。Ｓｏｃｓ１及びＡｎｋｒｄ１１をデュアル編集したところ、Ｓｏｃｓ１を単一編集した場合と同程度の抗腫瘍有効性が得られた。この実験の結果は、下記の表１６に概括されている。
表１６：Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍モデルにおけるＡｎｋｒｄ１１及びＳｏｃｓ１の単一編集型Ｔ細胞及びデュアル編集型Ｔ細胞の有効性
（－）＝有効性が観察されなかった、（＋）＝大半のマウスで中程度の応答が見られた、（＋＋）＝大半のマウスで強い応答が見られた、（＋＋＋）＝処置した全マウスで強い応答が見られた（一部の完全奏効を含む）

Ｂ１６－Ｆ１０転移性モデルにおけるＳｏｃｓ１／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を評価するために、上記の方法に従って、同様の実験を行った。Ｔ細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）Ｓｏｃｓ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ（配列番号７３８）、（ｉｉｉ）Ｃｂｌｂ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ（配列番号３１０）、または（ｉｖ）Ｓｏｃｓ１遺伝子及びＣｂｌｂ遺伝子のそれぞれを標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。Ｃｂｌｂ遺伝子及びＳｏｃｓ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体のデュアル編集の効率を求めたところ、Ｃｂｌｂ遺伝子のものでは７４％、Ｓｏｃｓ１遺伝子のものでは７２％であった（ＮＧＳ法を用いて評価した）。非処置群またはコントロールの編集型ＰＭＥＬＣＤ８＋Ｔ細胞で処置したマウスから得たすべての肺において、転移性コロニーが多く観察されたことから、疾患の著しい進行が示唆された。Ｓｏｃｓ１単一編集型細胞で処置したマウスでは、部分的有効性が見られ、Ｃｂｌｂ単一編集型細胞では、有効性は最小限であった。しかしながら、Ｓｏｃｓ１／Ｃｂｌｂデュアル編集型細胞による処置では、腫瘍形成をほぼ完全に阻害する強力な抗腫瘍有効性が得られた。この実験の結果は、下記の表１７に概括されている。
表１７：Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍モデルにおけるＳｏｃｓ１及びＣｂｌｂの単一編集型Ｔ細胞及びデュアル編集型Ｔ細胞の有効性
（－）＝有効性が観察されなかった、（＋）＝大半のマウスで中程度の応答が見られた、（＋＋）＝大半のマウスで強い応答が見られた、（＋＋＋）＝処置した全マウスで強い応答が見られた（一部の完全奏効を含む）

実施例１７：Ｂ１６－Ｏｖａマウス腫瘍モデルにおけるＰＤ１／Ｌａｇ３デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の有効性
Ｂ１６Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、ＰＤ－１／Ｌａｇ３デュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０^６個のＢ１６Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。全コホートのマウスにおける腫瘍の平均体積がおよそ４８５ｍｍ^３に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集型マウスＯＴ１ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）ＰＤ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｌａｇ３遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）一方はＰＤ１遺伝子を標的とし、もう一方はＬａｇ３遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。下記の式を用いて、腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。
％ＴＧＩ＝（ＰＤ１／Ｌａｇ３ＴＶ_最終－ＰＤ１／Ｌａｇ３ＴＶ_初期）／（コントロールＴＶ_最終－コントロールＴＶ_初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、１０日目であり、初期は、編集型マウスＯＴ１ＣＤ８＋Ｔ細胞の移入日である。

図１５のデータには、ＰＤ１単一編集型Ｔ細胞の養子移入によって、ＴＧＩが７０％となり、Ｌａｇ３単一編集型Ｔ細胞の養子移入により、ＴＧＩが３６％となったことが示されている。驚くべきことに、ＰＤ１とＬａｇ３を組み合わせて編集したところ、腫瘍成長抑制率が上昇せず、ＴＧＩは３８％となった。

実施例１８：腫瘍浸潤リンパ球の養子Ｔ細胞移入のための標的の検証
Ｂ１６Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、Ｓｏｃｓ１、Ａｎｋｒｄ１１及びＣｂｌｂの単一編集型腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びデュアル編集型腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価する。この実験では、ドナーコホートのＣＤ４５．１ＰｅｐＢｏｙマウス（Ｂ６．ＳＪＬ－Ｐｔｐｒｃ^ａＰｅｐｃ^ｂ／ＢｏｙＪ）及びレシピエントコホートのＣＤ４５．２Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓ）という２つのマウスコホートを使用し、それぞれ、６～８週齢の雌マウスで構成される。

ＴＩＬを作製するために、ドナーであるＣＤ４５．１ＰｅｐＢｏｙマウス（Ｂ６．ＳＪＬ－Ｐｔｐｒｃ^ａＰｅｐｃ^ｂ／ＢｏｙＪ）に、０．５×１０^６個のＢ１６－Ｏｖａ細胞を皮下注射する。腫瘍細胞の接種から１４日目に、腫瘍を摘出して、第２のコホートのマウスに注入するための編集型ＣＤ４５．１腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を作製した。Ｂ１６－Ｏｖａ腫瘍（２００～６００ｍｍ^３）を摘出し、裁断し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステム及びｍｏｕｓｅＴｕｍｏｒＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＫｉｔ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈカタログ番号１３０－０９６－７３０）をメーカーの推奨に従って用いて、単細胞懸濁液まで解離させた。腫瘍懸濁液を７０μＭの細胞ストレーナーで濾過し、ＣＤ４／ＣＤ８（ＴＩＬ）Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈカタログ番号１３０－１１６－４８０）を用いて、ＴＩＬを濃縮する。３０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００－０２）を添加した完全ｍＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化ＦＢＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭのβ－メルカプトエタノール、１×グルタマックス）で、単離ＴＩＬを６ウェルプレートにおいて、１．５×１０^６細胞／ｍＬで培養する。３日目に、細胞を回収し、洗浄し、ヌクレオフェクション緩衝液Ｔに再懸濁させ、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍを用いて、ＲＮＰをエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後、３０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２を添加した完全ｍＴＩＬ培地で、ＴＩＬを６ウェルプレートにおいて、１．５×１０^６細胞／ｍＬで培養する。５日目及び７日目に、３０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２を添加した新鮮な完全ｍＴＩＬ培地に細胞を再懸濁させ、１×１０^６細胞／ｍＬの密度でフラスコに播種する。８日目に、細胞を回収し、計数し、ｉｎｖｉｖｏ注射のために、ＰＢＳに再懸濁させる。

これらのＴＩＬ細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）Ｃｂｌｂ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｓｏｃｓ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）Ａｎｋｒｄ１１を標的とする単一のｇＲＮＡ、（５）一方はＣｂｌｂ遺伝子を標的とし、もう一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡ、（６）一方はＣｂｌｂ遺伝子を標的とし、もう一方はＡｎｋｒｄ１１遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡ、または（７）一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とし、もう一方はＡｎｋｒｄ１１遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。

レシピエントであるＣＤ４５．２Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０^６個のＢ１６－Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射する。腫瘍が、およそ１００ｍｍ^３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集型ＣＤ４５．１ＴＩＬを尾静脈から静脈内注射する。任意に、Ｔ細胞の移入前に、マウスにシクロホスファミド（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して、リンパ球除去を誘導でき、編集したＴＩＬは、最長で４日間、１日に２回、組み換えヒトＩＬ－２（７２０，０００ＩＵ／Ｋｇ）の腹腔内処置と組み合わせて静脈内投与できる。

体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定する。腫瘍体積を各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出し、下記の式に従って、％ＴＧＩを算出する。
％ＴＧＩ＝（標的ＴＶ_最終－標的ＴＶ_初期）／（コントロールＴＶ_最終－コントロールＴＶ_初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、１７日目であり、初期は、編集ＴＩＬの移入日である。

これらの結果によって、コントロールのガイドと比べて、Ｂ１６Ｏｖａ皮下マウスモデルにおいて、単一編集型またはデュアル編集型のマウスＴＩＬを養子移入すると、コントロールの編集細胞による処置と比べて、抗腫瘍応答が増強することが示されることが予測される。

実施例１９：操作Ｔ細胞療法の標的の検証
ＳＯＣＳ１、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬ１１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ及びＥＧＲ２の編集が、ＣＡＲＴ細胞及び人工ＴＣＲを発現するように操作したＴ細胞の抗腫瘍有効性に及ぼす作用を検証するために、実験を行う。その操作Ｔ細胞は、実施例１に記載されているようにして編集して、標的遺伝子の発現を低下させる。続いて、示されている種類の細胞を用いて、皮下マウス異種移植モデルにおいて、これらの操作Ｔ細胞を評価する。例えば、ＣＤ１９特異的なＣＡＲまたは人工ＴＣＲを有するように操作したＴ細胞は、実施例８で上記したように、Ｒａｊｉ細胞モデルにおいて、または表１７に示されている他の細胞株のうちのいずれかにおいて評価でき、ＭＡＲＴ１特異的なＣＡＲまたは人工ＴＣＲを有するように操作したＴ細胞は、ＳＫＭＥＬ５、ＷＭ２６６４またはＩＧＲ１細胞モデルなどで評価できる。
表１７：操作受容体の特異性及び標的細胞株

簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＮＳＧマウスに、３×１０^６個の標的細胞を皮下注射する。腫瘍が、およそ２００ｍｍ^３の体積に達したら、マウスを５頭からなる群に無作為に分け、編集した操作Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射する。その養子移入細胞は、注射の前に、コントロールのガイド、またはＳＯＣＳ１、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬ１１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ及びＥＧＲ２を編集するガイドのいずれかによって編集する。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定する。腫瘍体積を各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出する。これらの実験の結果によって、ＳＯＣＳ１、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬ１１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ及びＥＧＲ２編集型の操作Ｔ細胞の抗腫瘍有効性が、生存性及びまたは腫瘍サイズの縮小によって測定した場合に、コントロールのガイドの場合と比べて向上することが示されることが予測される。

実施例２０：受容体導入Ｔの機能に対する標的編集の検証
ＳＯＣＳ１、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬ１１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ及びＥＧＲ２の編集が、操作Ｔ細胞によるサイトカインの産生に及ぼす作用を検証するために、実験を行う。簡潔に述べると、上記の表１７に記載されている操作Ｔ細胞をヒトＣＤ８Ｔ細胞から作製し、ＲＮＰの形態でＣａｓ９と複合化したガイドＲＮＡを用いて、エレクトロポレーションによって、ＳＯＣＳ１、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬ１１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ及びＥＧＲ２のうちの１つ以上を編集する。ＣＡＲ－Ｔを、表１８に示されている対応する細胞株とｉｎｖｉｔｒｏにおいて、１：０、０．３：１、１：１、３：１及び１０：１の比率で共培養する。２４時間後、操作Ｔ細胞の総細胞数を求め、サイトカインの解析のために上清を保存する。これらの実験の結果によって、コントロールの編集細胞と比べて、集積が増大し、編集ＣＡＲＴ細胞からのサイトカインの産生のレベルが上昇することが示されることが予測される。

実施例２１：デュアル編集型腫瘍浸潤リンパ球の作製
編集ＴＩＬは、ＴＩＬを単離及び増殖するために、ＦＤＡから認可された臨床試験で以前用いられた確立済みのプロトコールに従って作製する。腫瘍組織を取り出した後、腫瘍を断片化して２ｍｍ^３の切片にし、機械的／酵素的にホモジナイズし、最長で６週間、または細胞数が１×１０^８個以上になるまで、６，０００ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２で培養する（これをＴＩＬ作製の急速増殖前フェーズ（ｐｒｅ－ＲＥＰ）とする）。ｐｒｅ－ＲＥＰの段階が完了したら、ＴＩＬに、ｃＧＭＰの条件下で、ＳＯＣＳ１遺伝子、ＡＮＫＲＤ１１遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子、ＦＬ１１遺伝子、ＣＡＬＭ２遺伝子、ＤＨＯＤＨ遺伝子、ＵＭＰＳ遺伝子、ＲＢＭ３９遺伝子、ＳＥＭＡ７Ａ遺伝子、ＣＨＩＣ２遺伝子、ＰＣＢＰ１遺伝子、ＰＢＲＭ１遺伝子、ＷＤＲ６遺伝子、Ｅ２Ｆ８遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＮＡＳ遺伝子及びＥＧＲ２遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションする。細胞には、ｐｒｅ－ＲＥＰプロセスの前またはその最中にエレクトロポレーションしてもよい。エレクトロポレーション後、１：１００の比率のＴＩＬ及び照射フィーダー細胞で、５０×１０^６個の細胞を１ＬのＧ－Ｒｅｘ（商標）培養フラスコに、およそ２週間かけて移す。この作製部分は、急速増殖フェーズ（ＲＥＰ）とする。ＲＥＰフェーズの後、ＴＩＬを回収し、洗浄し、患者に即時注入するために溶液に懸濁させる。

実施例２２：編集免疫エフェクター細胞の第Ｉ相試験
再発性であるかまたは抗ＰＤ－１療法に対して抵抗性である転移性メラノーマの患者を、本明細書に記載されている改変細胞で処置する第１相、オープンラベル、単一施設試験を行う。患者に細胞を１回注入し、疾患の進行または療法不耐性が見られるまで、試験を続ける。試験への参加を中止する前に、現場の放射線科医が放射線学的ＰＤを定める。

試験の目的：試験の主目的は、（１）最大耐用量（ＭＴＤ）、用量制限毒性（ＤＬＴ）、ならびに進行固形腫瘍を有する患者において将来試験する際に推奨することになる、細胞組成物（及び必要とされる関連併用薬）の用量を求めることと、（２）患者において、移入した編集細胞の抗がん活性のいずれかのエビデンスを観察することである。試験の二次目的は、（１）その細胞組成物の薬物動態を求めることと、（２）生体試料中の薬力学的バイオマーカーの変化によって求めた場合において、その細胞組成物のオンターゲット活性を評価することと、（３）処置後の操作ＴＩＬの存続性によって求めた場合において、その改変細胞の増殖を評価することである。試験の探査的目的は、（１）いずれかの根本的な遺伝子変異（複数可）を臨床応答と相関付けることである。

試験の評価項目：この試験の主要評価項目は、有害事象（ＡＥ）の発生率及び重症度（ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅＣｏｍｍｏｎＴｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙＣｒｉｔｅｒｉａｆｏｒＡｄｖｅｒｓｅＥｖｅｎｔｓ（ＮＣＩＣＴＣＡＥ）バージョン４．３に従って格付け）、臨床検査値異常、１２誘導心電図（ＥＣＧ）パラメーターの変化、ＲＥＣＩＳＴｖ１．１による客観的奏効率（ＯＲＲ）、ＣＮＳの応答（活動性の脳転移を有する患者における、ＲＥＣＩＳＴｖ１．１によるＯＲＲ及び無増悪生存期間［ＰＦＳ］）である。この試験の副次評価項目は、患者申告の症状及び健康関連クオリティオブライフ（ＨＲＱｏＬ）スコア、奏効までの期間、奏効期間、ＲＥＣＩＳＴｖ１．１による病勢コントロール率（完全奏効［ＣＲ］、ＰＲまたはＳＤのうちの最良の奏効が認められた患者の割合）、治療期間、免疫表現型分析結果、遺伝子操作ＴＩＬの存続性、トラフィキング及び機能、投与前及び投与後の試料中の薬力学的バイオマーカーである。この試験の探査的評価項目は、投与前の腫瘍生検標本及び／または末梢血において、ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ（登録商標）ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＰａｎｅｌまたは類似の代替策を用いて、がん関連変異及び／または遺伝子改変を評価した結果である。

治療レジメン：治療レジメンの概要は、以下のとおりである。
（ａ）７日前及び６日前：シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ（静脈内）
（ｂ）５日前～１日前：フルダラビン２５ｍｇ／ｍ^２（静脈内）
（ｃ）１日目：細胞注入
（ｄ）１日目～１５日目：ＩＬ－２（１２５，０００ＩＵ／ｋｇ／日）、最大１４回投与

細胞の１回目の投与量は、１×１０^９細胞以下の総用量となる。万が一、その患者において用量制限毒性（ＤＬＴ）が認められた場合には、２人の追加の患者を同じ用量レベルで処置する。１人目の患者において、ＤＬＴが認められることなく、ＤＬＴモニタリング期間（２１日）が経過したら、それ以降の患者は、１×１０^１１個未満のＴＩＬという用量で処置することになる。

併用処置：その試験中に発現し得る症状及び基礎病態の管理のために、その試験中に、緩和及び支持療法が認められる。

有効性評価：ＲＥＣＩＳＴｖ１．１に従い、現場の放射線科医及び／または治験責任医師が腫瘍の応答性を求めることになる。腫瘍の評価は、疾患が進行するまで６週間おきに行い、その評価は、疾患の進行以外の理由で中止となった患者では、疾患が進行するまで、または別の抗がん療法の開始まで継続することになる。その試験に最後の患者を登録してから最長で３年間、生存についても追跡することになる。

安全性評価：安全性評価には、身体診察、検査室での検査、バイタルサイン及びＥＣＧが含まれることになる。有害事象は、ＮＣＩＣＴＣＡＥｖ４．０３に従って格付けする。試験の各コホートについて、有害事象発生率、及び総体的毒性（毒性グレード（重症度）によって分類）の発生頻度を明らかにする。検体検査結果のリストも作成し、検体検査の経時的変化を概括する記述統計結果も提示する。

分子遺伝学的評価：腫瘍組織及び血漿試料の分子解析を通じて、腫瘍の生物学的作用に関与する遺伝子の変異状態を判断する。これらの試験結果は、試験手順に従って、解析後直ちに、治験責任医師及び治験依頼者に提供される。分子解析法としては、ダイレクトシーケンシング及び／またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられるが、これらに限らない。

患者申告の症状及びクオリティオブライフの評価：有効なＥｕｒｏｐｅａｎＯｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＣａｎｃｅｒ（ＥＯＲＴＣ）ＱｕａｌｉｔｙｏｆＬｉｆｅＱｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＱＬＱ）－Ｃ３０（ｖ．３．０）（世界的な臨床試験で広範囲に研究されている）を実施することによって、患者申告の症状及びＨＲＱｏＬを調べる。ＥＯＲＴＣＱＬＱ－Ｃ３０は、５つの機能の尺度（身体的機能、役割的機能、認知的機能、情緒的機能及び社会的機能）、３つの症状の尺度（倦怠感、痛み及び悪心／嘔吐）、ならびに全般的な健康状態／ＱｏＬスケールについてスコア化する。６つの単一項目の尺度も含める（呼吸困難、不眠、食欲不振、便秘、下痢及び経済的困難）。

試験評価：これらの試験の評価パラメーターには、投与前及び奇数サイクルごとの１日目に腫瘍の放射線画像診断を行った後に、ＰＫ解析のための血液試料の採取（１日目、２日目、３日目、週に１回×４、月に１回×６）及び薬力学的解析を行い、サイトカインパネル解析（１日目、２日目、３日目、週に１回×４、月に１回×６）を行うことが含まれる。

実施例２３：ＳＯＣＳ１編集型Ｔ細胞を評価するためのアッセイの開発
ＳＯＣＳ１依存性の薬理を評価するために、ＳＯＣＳ１依存性の生物学的作用を定量するアッセイを開発する。これらのアッセイは、デュアル編集型ＴＩＬにおいて、標的依存性の薬理を評価するために用いるようにも意図されている。これらのアッセイでは、ＴＩＬにおいてＳＯＣＳ１を標的とするｓｇＲＮＡの活性を評価する。

ＳＯＣＳ１は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達の負の制御因子である。したがって、ＳＯＣＳ１依存性の薬理。

ＳＯＣＳ１は、ＳＴＡＴ５のリン酸化及びサイトカインシグナル伝達に関与するキナーゼであるＪＡＫ１を阻害することによって、Ｔ細胞におけるサイトカインシグナル伝達を部分的に負に調節する。ＩＬ－２がＩＬ－２受容体複合体を介してシグナル伝達されると、ＳＴＡＴ５はＪＡＫ１依存性の方式でリン酸化される。したがって、ＩＬ－２刺激時のＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達及びｐＳＴＡＴ５のレベルの増大、ならびに下流のシグナル伝達の活性化によって測定することができる。実際、ＳＯＣＳ１の欠失によって、ＩＬ－２シグナル伝達に応答して初代ヒトＣＤ８Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５のレベルが上昇する（図１６）。

ＳＯＣＳ１の遺伝的不活性化が細胞機能に及ぼす影響をｉｎｖｉｔｒｏで明らかにするために、Ｔ細胞の機能と相関する複数のパラメーターを評価することができる。それらのパラメーターとしては、サイトカイン（例えば、ＩＬ－６及びＩＬ－１２）の産生、ベースラインの細胞表面の表現型及び活性化細胞表面の表現型、Ｔ細胞の分化状態、ならびに腫瘍殺傷能が挙げられる。

実施例２４：ＳＯＣＳ１タイリングスクリーニング及び検証アッセイ
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９タイリングスクリーニングを行って、ＳＯＣＳ１遺伝子にまたがる標的座位内の阻害剤標的位置の候補を定めた。実施例１に記載されているようにして、初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、完全長のＳＯＣＳ１遺伝子にわたるゲノム位置を標的とするように設計したｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルスライブラリーをトランスダクションした。レンチウイルスライブラリーのトランスダクションから２日後に、トランスダクションしたＣＤ８＋細胞に、Ｃａｓ９ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、さらに１０日間、培養した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後に培養してから１０日後、そのスクリーンを増殖のリードアウト及びリン酸化ＳＴＡＴ５のリードアウトという２つのアームに分けた。追加のアッセイを行って、タイリングスクリーンで特定されたｇＲＮＡを検証した。ＳＯＣＳ１を標的とする別個のｇＲＮＡを１０４個、下記のパラメーターに従ってアッセイした。

タイリングスクリーン
増殖のリードアウト：Ｃａｓ９ｍＲＮＡのエレクトロポレーションから１０日目に、細胞を回収した。ＤＮＡを抽出し、そのライブラリーにおける各種ｓｇＲＮＡの認識部位にまたがるアンプリコンをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によってシーケンシングした。その各ｓｇＲＮＡの濃縮または枯渇は、図１７に示されており、最終カウント数を参照カウント数で除したもののｌｏｇ比として表されている。Ｔ細胞を最大に濃縮させたｓｇＲＮＡを、後続の試験のためにトップヒットとして選抜した。

ガイドを検証するための追加のアッセイ
追加のアッセイを開発して、上記のタイリングスクリーンで特定されたｇＲＮＡの有効性及びオンターゲット活性をさらに特徴付けた。細胞を単離し、タイリングスクリーンで特定されたＳＯＣＳ１特異的ｇＲＮＡを含むＣａｓ９：ｇＲＮＡＲＮＰをエレクトロポレーションした。細胞をおよそ１０日間培養し、１０日の時点に、下記のアッセイを行った。

ＤＮＡ編集アッセイ：ＤＮＡ編集アッセイを開発して、個々のガイドが、そのそれぞれの標的の編集をＤＮＡレベルで誘導する能力を比較した（例えば、Ｔｓａｉｅｔａｌ．２０１５ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを参照されたい）。Ｃａｓ９：ｇＲＮＡＲＮＰをエレクトロポレーションした後、細胞をおよそ１０日間培養し、１０日目の時点に、ペレットを回収し、ＤＮＡを抽出した。ガイド特異的なプライマーセットを用いて、各種ｓｇＲＮＡにおいてゲノムの標的座にまたがるアンプリコンをＰＣＲによって増幅し、ＮＧＳによってシーケンシングした。予測されるガイド切断部位に、シーケンシングリードをアラインメントし、ＤＮＡ配列が編集されたリードの割合（％）を求めた。各オフターゲット部位の切断の割合（％）を、各Ｓｏｃｓ１ｇＲＮＡについて、オンターゲットのシーケンシングリード数と比較したオフターゲット部位のシーケンシングリード数として算出した。１）オフターゲット編集の全体的割合（％）、及び２）オフターゲット編集遺伝子の識別という２つの基準に基づき、結果を評価した。最適なガイドは、オフターゲット編集率（％）のレベルが最低であり及び／またはオフターゲット編集遺伝子プロファイルが最も無害であると特定されたガイドであった。例えば、遺伝子内領域の遺伝子編集は、無害な作用とみなし、その一方で、既知のがん遺伝子または腫瘍抑制因子の編集は、望ましくないオフターゲットプロファイルとみなした。

ウエスタンブロットアッセイ：ウエスタンブロットアッセイを用いて、個々のガイドが、そのそれぞれの標的のタンパク質の発現を減少させる能力を比較した。Ｃａｓ９：ｇＲＮＡＲＮＰをエレクトロポレーションした後、細胞をおよそ１０日間培養してから、細胞ペレットを回収し、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。抽出されたタンパク質をブラッドフォードアッセイによって定量し、自動ウエスタンブロッティング装置（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅのＷｅｓＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｏｄｕｌｅ）に、機械の標準的な１２－２３０ｋＤＷｅｓＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｏｄｕｌｅのプロトコールを用いて、１μｇ充填した。市販の標的特異的一次抗体を用いた後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体とインキュベートした。標的ガイドごとに検出されたシグナルを、ネガティブコントロールのガイド試料で見られたそれぞれのシグナルに対して正規化した。

検証結果：上記のＤＮＡ編集活性アッセイ及びタンパク質産生アッセイに基づき、ＳＯＣＳ１を標的とする１００個のｇＲＮＡ（配列番号１１０１～１２００）を最適なガイドとして特定した。これら１００個のガイドのうち、上位４０個（配列番号１１０１～１１４０）、上位２０個（配列番号１１０１～１１２０）及び上位１０個（配列番号１１０１～１１１０）のガイドを特定した。これらのサブセットのうち、ＳＯＣＳ１を標的とする７個のガイドを、特定の対象の候補として特定した（配列番号１１０２、１１０３、１１０５～１１０８、１１１５）。ＢＣＯＲ及びＴＮＦＡＩＰ３についても同様の実験を行い、５７個のＢＣＯＲｇＲＮＡ（配列番号７０８～７６４）及び３９個のＴＮＦＡＩＰ３
ｇＲＮＡ（配列番号３４８～３８６）を、最適なガイドの候補として特定した。

実施例２５：ＳＯＣＳ１阻害剤の特異的標的としてのＳＯＣＳ１ＳＨ２ドメイン
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９タイリングスクリーニングを行って、ＳＯＣＳ１遺伝子にまたがる標的座位内の阻害剤標的位置の候補を定めた。実施例２に記載されているようにして、初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、完全長のＳＯＣＳ１遺伝子にわたるゲノム位置を標的とするように設計したｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルスライブラリーをトランスダクションした。レンチウイルスライブラリーのトランスダクションから２日後に、トランスダクションしたＣＤ８＋細胞に、Ｃａｓ９ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、さらに１４日間、培養した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後に培養してから１４日後、この細胞からＤＮＡを抽出し、ライブラリーにおける各種ｓｇＲＮＡの認識部位にまたがるアンプリコンをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によってシーケンシングした。その各ｓｇＲＮＡの濃縮は、図１７に示されており、最終カウント数を参照カウント数で除したもののｌｏｇ比として表されている。示されているように、経時的に濃縮したガイドは、ＳＨ２ドメインをコードするＤＮＡ（配列番号１１０６、１１１０、１１１５、１１１６、１１１８、１１２６、１１２９、１１４１、１１５７、１１７４）を標的としていた。この結果により、ＳＯＣＳ１遺伝子を標的とするＳＯＣＳ１阻害剤は概して、例えば、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のような細胞の生存性及び／または細胞の増殖性を向上させるが、特に、ＳＯＣＳ１遺伝子のＳＨ２ドメインを標的とするＳＯＣＳ１阻害剤が、細胞の生存性及び／または細胞の増殖性を向上させることが示唆されている。

実施例２７：編集型マウスＣＤ８Ｔ細胞におけるＴ細胞活性化マーカーの発現
実施例１に記載されているように、雌のＰＭＥＬマウスの脾臓を回収し、ＣＤ８Ｔ細胞を単離した。ＣＤ８Ｔ細胞に、Ｃａｓ９タンパク質及びＡｎｋｒｄ１１遺伝子、Ｓｏｃｓ１遺伝子、またはコントロール遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを含むＲＮＰをエレクトロポレーションした。複数のガイドにわたって、Ａｎｋｒｄ１１編集の効率は５４％と測定され、Ｓｏｃｓ１編集の効率は５５％～７５％と測定された。

Ｉｆｎｇ及びＧｚｍａの発現を、ＲＮＡ－ｓｅｑにより測定した。ＷｕｘｉＮｅｘｔＣｏｄｅによって、３００万個の編集細胞のペレットからＲＮＡの抽出及びシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を行った。遺伝子発現レベルを、Ｓａｌｍｏｎ（バージョン０．１１．２、Ｐａｔｒｏｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１７））及びＧｅｎｃｏｄｅのマウス遺伝子アノテーション（バージョンＭ１５）を用いて、ＴＰＭ（Ｌｉｅｔａｌ．，ｉｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ＴｈｅＩｍｐａｃｔｏｆＡｃｃｕｒａｔｅＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｎＰｒｏｔｅｏｍｉｃａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ（２０１４））として定量した。Ｒパッケージであるｌｉｍｍａ^３（バージョン３．３８．０、Ｒｉｔｃｈｉｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１５））を用いて、差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を解析した。複数のガイドを使用して標的を阻害する場合、各ガイドの影響を取り込んで解析して、すべてのガイドの影響を受けた遺伝子のみが、著しく差次的に発現されたとみなされた。

これらの実験によって、Ａｎｋｒｄ１１編集型マウスＰＭＥＬ細胞及びＳｏｃｓ１編集型マウスＰＭＥＬ細胞が、ＩｆｎｇｍＲＮＡの著しい発現の増加（Ａｎｋｒｄ１１編集型：コントロールのｇＲＮＡと比べて２倍増加、ｐ＝４．７×１０^－２７、Ｓｏｃｓ１編集型：コントロールのｇＲＮＡと比べて１．８倍増加、ｐ＝１．４×１０^－１８）及びＧｚｍａＲＮＡの著しい発現の増加（Ａｎｋｒｄ１１編集：コントロールのｇＲＮＡと比べて２．９倍増加、ｐ＝１．９×１０^－１４１、Ｓｏｃｓ１編集：コントロールのｇＲＮＡと比べて１．６倍増加、ｐ＝２．６×１０^－２９）を示すことが明らかになった。これらのデータを総合すると、ｇＲＮＡを用いたＡｎｋｒｄ１１阻害及びＳｏｃｓ１阻害により、マウスＴ細胞が強く活性化されることが示されている。これらのデータを総合すると、Ａｎｋｒｄ１１編集ＰＭＥＬ細胞及びＳｏｃｓ１編集ＰＭＥＬ細胞では、ｍＲＮＡの発現によって測定した場合に、Ｔ細胞活性化マーカーであるＩｆｎｇ及びＧｚｍａの発現が増加することが示されている。

実施例２８：ＳＯＣＳ１阻害及びＣＢＬ－Ｂ阻害により、ｉｎｖｉｔｒｏにおけるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の増加が促進される
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの集積を調節する標的を特定するために、実験を行った。０日目に、４００×１０^６のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞または８００×１０^６のＣＤ４Ｔ細胞を、３名の別々のヒトドナー由来のロイコパックからそれぞれ精製した。Ｔ－７５フラスコ（体積１５ｍＬ）内の増殖培地（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦＴ細胞増殖培地、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈ番号１０９８１）＋１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ２に、Ｔ細胞を１×１０^６細胞／ｍＬで播種し、２５μＬ／ｍＬの抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ細胞活性化因子（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔＴ細胞活性化因子、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＶａｎｃｏｕｖｅｒＢＣ，Ｃａｎａｄａ）によって、２４時間活性化させた。１日目に、ゲノムワイドなＰｒｅｃｉｓｉｏｎＯｎｅガイドライブラリーを発現するレンチウイルスを、Ｔ細胞に形質導入した。４日目に、Ｃａｓ９ｍＲＮＡをエレクトロポレーションによって導入した。Ｃａｓ９のエレクトロポレーション後、Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ２を含有する増殖培地で培養し、隔日で生存能をモニタリングして、計数した。１０日目に、Ｔ細胞を洗浄し、増殖培地＋１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ２及びＴ細胞活性化因子に再懸濁させた。１４日目に、細胞を再度洗浄して活性化因子を除去し、増殖培地＋１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ２に再懸濁させた。２０日目に、細胞を培地から取り出し、各試料につき５０×１０^６個の細胞から、ゲノムＤＮＡを回収した。ライブラリーのガイド配列を、１００μｇのゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、ライブラリー中の個々のｓｇＲＮＡあたりおよそ５００リードの深さで、ＩｌｌｕｍｉｎａＮｅｘｔＳｅｑ５００装置でシーケンシングした。

図１８に示されているように、ＳＯＣＳ１遺伝子を標的とするガイドによって、ｉｎｖｉｔｒｏでのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の集積は、早期（１８日目）及び後期（３７日目）のどちらの時点においても、Ｔ細胞の生存に必要な遺伝子を標的とするガイド（致死性コントロール）での集積または非Ｔ細胞の嗅覚遺伝子を標的とするガイド（嗅覚）での集積と比べて増大する。

ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢ、ならびにＴ細胞機能の既知の制御因子であるＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＳＯＣＳ３及びＣＢＬを標的とするｇＲＮＡの場合でも、同様の実験を行った。図１９に示されているように、ＳＯＣＳ１遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子を標的とすると、ＣＤ４＋
Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の集積が増加した。驚くべきことに、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＳＯＣＳ３遺伝子、及びＣＢＬ遺伝子を標的とすると、ＣＤ４＋Ｔ細胞は濃縮されず、同様の条件下において、ＳＯＣＳ３遺伝子及びＣＢＬ遺伝子を標的とするガイドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の集積を増加させなかった（図１９）。

実施例２９：ＳＯＣＳ１の阻害により、ｉｎｖｉｔｒｏでのマウスＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の増加が促進される
マウスＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの集積を調節する標的を特定するために、実験を行った。マウスＣＤ８Ｔ細胞を、Ｃａｓ９×ＯＴ１トランスジェニックマウスの脾臓から単離し、実施例１に記載されているように活性化させた。活性化の２４時間後、Ｔ細胞を、５μｇ／ｍＬのレトロネクチン（ＴａｋａｒａＣｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号Ｔ１００Ｂ）をコーティングした６ウェルプレート中の、５μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン及び２μｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ－２を含有する体積２ｍＬの完全ＲＰＭＩに、１ウェルあたり３×１０^６細胞で播種した。ｓｇＲＮＡライブラリーとＴｈｙ１．１とを発現するレンチウイルスを、各ウェルに添加した。プレートを６００×ｇで１．５時間、室温で回転させた。感染の２４時間後、細胞を洗浄して、２ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ－２を添加した完全Ｔ細胞培地中で、１×１０^６細胞／ｍＬで培養した。３日目に、活性化ビーズを除去し、細胞をさらに、組み換えマウスＩＬ－２を添加した完全Ｔ細胞培地中で、１×１０^６細胞／ｍＬで計５日間培養した。トランスダクションした細胞を、ＥａｓｙＳｅｐＭｏｕｓｅＣＤ９０．１ＰｏｓｉｔｉｖｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌカタログ番号１８９５８）を用いた陽性選択によって濃縮し、ゲノムＤＮＡを、５×１０^６個の細胞から回収した。ライブラリーのガイド配列を、１００μｇのゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、ＩｌｌｕｍｉｎａＮｅｘｔＳｅｑ５００装置でシーケンシングした。

図２０のデータにより、マウスＳＯＣＳ１遺伝子を編集すると、ｉｎｖｉｔｒｏでのマウスＣＤ８＋Ｔ細胞が、非抗原特異的活性化（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８＋ＩＬ－２刺激）に応答して、致死性コントロールのガイド及び嗅覚のコントロールのガイドで観察される集積と比べて、より多く集積することが示されている。

実施例３０：単一のガイドの編集によってｉｎｖｉｔｒｏでのマウスＣＤ８Ｔ細胞の増殖の増加を促進する標的としてのＳＯＣＳ１の検証
実施例１に記載されているように、雌のＰＭＥＬマウスの脾臓を回収し、ＣＤ８Ｔ細胞を単離した。ＣＤ８Ｔ細胞に、Ａｎｋｒｄ１１遺伝子、Ｓｏｃｓ１遺伝子、ＰＤ１遺伝子またはコントロール遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションした。ＰＭＥＬＴ細胞を、ｉｎｖｉｔｒｏで計５日間、増殖させた。

最初の活性化から５日後、培養液中に存在する生存細胞の総数を求めた。図２１のデータにより、Ｓｏｃｓ１遺伝子を編集すると、コントロール遺伝子、Ｐｄｃｄ１遺伝子及びＡｎｋｒｄ１１遺伝子を標的とするガイドと比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞がより多く集積することが示されている。

実施例３１：腫瘍細胞株との共培養中にヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖の増加を促進する標的としてのＳＯＣＳ１の特定
ヒトＣＤ１９に特異的なＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて、ｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングを行った。実施例４で上記したように、ＣＤ１９ＣＡＲ－ＴにプールｓｇＲＮＡライブラリーを導入し、細胞にＣａｓ９ｍＲＮＡをエレクトロポレーションして、Ｃａｓ９編集ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔの集団を作製した。続いて、その編集ＣＤ１９ＣＡＲＴを、ヒトＣＤ１９の膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを発現するように操作した付着大腸癌（ＣＲＣ）細胞株である、短縮型ＣＤ１９を発現するＤＬＤ－１細胞と共培養した。１日前に、編集ＣＡＲ－Ｔを解凍し、増殖培地（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ，ＳｔｅｍＣｅｌｌ
Ｔｅｃｈ番号１０９８１）＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２及び１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中で、２×１０^６細胞／ｍＬまで再懸濁させ、３７℃で１８時間、インキュベートした。並行して、ＤＬＤ－１細胞を５０μｇ／ｍＬのマイトマイシン（Ｓｉｇｍａ番号Ｍ４２８７）で２０分間処理し、洗浄し、続いて一晩播種した。０日目に、その播種したＤＬＤ－１細胞に、ＣＡＲ－Ｔをエフェクター対ターゲット比（Ｅ：Ｔ）３：１で加えた。３日目に、ＣＡＲ－Ｔを洗浄し、増殖培地中で、１０^６細胞／ｍＬまで再懸濁させた。６日目に、ＤＬＤ－１細胞を、前述のとおりマイトマイシンで処置し、一晩播種した。７日目に、計２回の共培養インキュベーションに対して、ＣＡＲ－ＴをＤＬＤ－１細胞に加えた。共培養期間の全体を通じて、様々な時点にＣＡＲ－Ｔを回収し、細胞ペレットを凍結した。ＱｉａｇｅｎＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔを用いて、これらの細胞ペレットからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシングを用いてシーケンシングした。

ＣＡＲ－Ｔ／フィーダー細胞共培養液から得たアリコートにおける各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度を解析し、最初の編集ＣＡＲ－Ｔ細胞集団における各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度と比較した。個々のｓｇＲＮＡのそれぞれにおいて、統計解析を行って、腫瘍細胞の共培養後にＣＡＲ－Ｔ細胞集団において有意に濃縮されたｓｇＲＮＡを特定した。同じ遺伝子を標的とする個々のｇＲＮＡの濃縮スコアを集約して、ｉｎｖｉｔｒｏでのＣＡＲ－Ｔ細胞の集積に対して、一定かつ再現性のある作用を及ぼした標的遺伝子を特定した。

この実験の結果により、ＳＯＣＳ１遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子を標的とするガイドによって、ｉｎｖｉｔｒｏでのＣＡＲ－Ｔの集積が増加することが示された（図２２）。この結果により、Ｔ細胞増殖における既知の負の制御因子であるＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＣＢＬ遺伝子、及びＳＯＣＳ３遺伝子を標的とするガイドが、ｉｎｖｉｔｒｏでのＣＡＲ－Ｔの集積の増強を促進しなかったことも示されている。Ｔ細胞増殖における既知の負の制御因子である、ＤＧＫＡ遺伝子及びＤＧＫＺ遺伝子を標的とするガイドによっても、集積の増強は得られなかった（データは示されていない）。

実施例３２：ＳＯＣＳ１の阻害により、ｉｎｖｉｔｒｏでのヒトＴＩＬの増殖の増加が促進される
ヒト患者から手術により切除した腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球を作製し、外科用メスで１ｍｍ^３の切片に裁断し、一片の腫瘍を２４ウェルプレートの各ウェルに入れる。６０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２を添加した２ｍＬの完全ＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化男性ヒトＡＢ血清、１ｍＭのピルビン酸塩、２０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１×グルタマックス）を単離ＴＩＬの各ウェルに加える。１ｍＬの培地をウェルから除去し、必要に応じて、最大で週に３回、新鮮な培地及びＩＬ－２と交換する。ウェルがコンフルエントになったら、１：１で、新たな培地＋ＩＬ－２に分ける。４～５週間の培養後、操作及び急速増殖のために、それらの細胞を回収する。

ＳＯＣＳ１及び／またはＣＢＬＢの活性を、記載されているｇＲＮＡ／Ｃａｓ９法、ｓｈＲＮＡ、ｓｈＭＩＲ、またはドミナントネガティブＳＯＣＳ１コンストラクトもしくはドミナントネガティブＣＢＬＢコンストラクトの発現を含む様々な方法で阻害する。続いて、２０ｍＬのＴＩＬ培地＋２０ｍＬのＡｉｍ－Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３ｍＡｂにおいて、５００，０００個のＴＩＬを２６×１０^６個の同種異系の照射（５０００ｃＧｙ）ＰＢＭＣフィーダー細胞と共培養することによって、ＴＩＬを急速に増殖させる。４８時間後（２日目）、その培養液に６０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を加える。５日目に、２０ｍＬの培地を除去し、２０ｍＬの新鮮な培地（＋３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３）を加える。７日目に、細胞を計数し、利用可能な細胞数に応じて、６０×１０^６細胞／Ｌで、Ｇ－Ｒｅｘ６Ｍウェルプレート（ＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆ、カタログ番号８０６６０Ｍ）またはＧ－Ｒｅｘ１００Ｍ（ＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）に播き直す。９日目に、６０００Ｕ／ｍＬの新鮮なＩＬ－２を加え、１２日目に、３０００Ｕ／ｍＬの新鮮なＩＬ－２を加える。１４日目に、ＴＩＬを回収する。続いて、Ｃｏｏｌｃｅｌｌ凍結容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて、増殖細胞をＣｒｙｏｓｔｏｒＣＳ－１０（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０７９３０）で低速凍結し、液体窒素中で長期保存する。これらの実験では、ＴＩＬを操作してＳＯＣＳ１及び／またはＣＢＬＢの機能を低下させると、ＴＩＬのｉｎｖｉｔｒｏでの集積が増加することが予測される。

実施例３３：ＳＯＣＳ１の阻害によりＴ細胞活性化マーカーの表面発現が増加する
腫瘍浸潤リンパ球の表現型に対するＳＯＣＳ１阻害の作用を評価するために、実験を行った。３名の患者由来のＴＩＬを、実施例３２で上記したように、高用量ＩＬ－２中で酵素的に消化されたメラノーマ腫瘍の細胞懸濁液から、ｅｘｖｉｖｏで増殖させた。これらを凍結し、その後解凍して、再度高用量ＩＬ－２中に一晩載置した。続いて、およそ２００，０００～５００，０００個のＴＩＬを、プレート結合ヒト抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３）によって４８時間刺激した。ＣＤ３の刺激後、ＲＮＰの形態でＣａｓ９と複合化させたガイドＲＮＡのエレクトロポレーションによって、ＳＯＣＳ遺伝子またはネガティブコントロール遺伝子に対して細胞を編集した。編集ＴＩＬを一晩回復させ、続いて、実施例３２に記載されているように急速に増殖させた。これを、Ｇ－Ｒｅｘフラスコ中で、５名の同種異系の健康ドナーに由来する照射末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び高用量ＩＬ－２の存在下で行った。ＩＬ－２を隔日で加えた。５日目に培地を交換した。細胞を１４日間培養した。１４日目に、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１３７、及びＰＤ１に対する蛍光標識抗体で細胞を染色し、ＦＡＣＳによって解析して、細胞表面マーカーの発現を求めた。３名のドナーのうち２名の結果を、図２３に示す。

図２３Ａ及び図２３Ｂに示されているように、２名のドナーにおいて、ＳＯＣＳ１編集細胞では、コントロールの編集細胞と比べて、ＣＤ２５の発現が増加し（ドナー１では１５．９％から５８％へ、ドナー２では５２．６％から７５．３％へ増加）、かつ４－１ＢＢの発現が増加した（ドナー１では１％から２３．３％へ、ドナー２では０％から１４．２％へ増加）。各ドナーにおけるＳＯＣＳ１遺伝子の編集効率を、ｓｇＲＮＡの切断部位に由来するＰＣＲアンプリコンのＮＧＳシーケンシングによって評価した。その編集効率は、ドナー１については２７％、ドナー２については６７％であった。第３のドナー（図示せず）の編集効率は１５％であり、ＣＤ２５の発現の増加はより少なく、４－１ＢＢの発現は増加しなかった。ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬにおけるＣＤ２５及び４－１ＢＢの発現の増加により、ＳＯＣＳ１の阻害が、ＴＩＬの活性化及びＩＬ－２への応答性を増加させることが示唆される。これらの結果により、ドナー１由来のＳＯＣＳ１編集細胞が、ＴＩＬ疲弊の既知のマーカーであるＰＤ１もまた、より少なく発現したことから、ＳＯＣＳ１阻害がＴＩＬ疲弊を軽減または予防し得ることも示唆される。
表５Ａ：ヒトゲノム座標
表５Ｂ：マウスゲノム座標
表６Ａ：ヒトゲノム座標
表６Ｂ：マウスゲノム座標
表６Ｃ：ヒトゲノム座標
表６Ｄ：マウスゲノム座標
表６Ｅ：ヒトゲノム座標
表６Ｆ：マウスゲノム座標

いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、その対象に対して自家である。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、その対象に対して同種異系である。いくつかの実施形態では、対象は、改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、リンパ球除去を施されていない。いくつかの実施形態では、対象は、改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与と共に、または投与の後に高用量ＩＬ－２治療を受けていない。いくつかの実施形態では、対象は、改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与と共に、低用量ＩＬ－２治療を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与と共に、ＩＬ－２治療を受けていない。

Claims

（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、または（ｂ）ＳＯＣＳ１及びＡＮＫＲＤ１１からなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、
前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。