JP2024075603A - Ｈｌａ遺伝子のｒｎａガイドゲノム編集を使用して関節リウマチを処置する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】改変された造血細胞を作製する方法を提供する。【解決手段】一態様として：ａ）コドン７１を含む、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１対立遺伝子の少なくとも一部分を含む鋳型核酸を造血細胞に導入すること；ここで、前記鋳型核酸のコドン７１の核酸配列がグルタミン酸をコードし、かつ前記造血細胞が前記鋳型核酸で置換されるコドン７１でリジンをコードするゲノムＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１対立遺伝子を含む；ｂ）ゲノムＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１対立遺伝子においてリジンをコードするコドン７１を少なくとも前記鋳型核酸のコドン７１で置換すること、を含む、方法とする。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４９１，４８７号の利益を主張するものであり、その開示内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

関節リウマチ（ＲＡ）は、関節および周囲組織の自己免疫性破壊を特徴とする慢性疾患である。この疾患に対する感受性にはいくつかの遺伝要素があるが、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座が明らかに最も重要である（Barton A, Worthington J. Genetic susceptibility to rheumatoid arthritis: an emerging picture. Arthritis Rheum 2009;61:1441-46）。いくつかのＤＲ４対立遺伝子、特に、ＤＲＢ１^＊０４：０１、^＊０４：０４、および^＊０４：０５は、ＲＡに強く関連しているが、ＤＲＢ１^＊０４：０２にこれは当てはまらない（これらの対立遺伝子は、ファミリーおよび対立遺伝子がコロンによって区切られる新しく承認されたＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎの命名法［hla.alleles.org］によって名付けられている；よって、ＤＲＢ１^＊０４：０１は、先行文献におけるＤＲＢ１^＊０４０１に対応する）。加えて、ＤＲＢ１^＊０１：０１、^＊０１：０２、^＊１０：０１、および^＊１４：０２が、場合により、特に非ヨーロッパ人において、ＲＡと関連付けられている。これらの異種の対立遺伝子は、ペプチド結合溝の７０～７４位における共通のアミノ酸セットである「共通エピトープ」の存在を介して、ＲＡに寄与すると仮定されている。ＨＬＡ－ＤＲＢ１分子に対するペプチドの結合は、数百万の潜在的なペプチド結合エピトープを作り出す複数の多型アミノ酸をそれぞれが有する６つのポケットによって制御される。一見すると異種のＨＬＡ対立遺伝子（例えばＤＲＢ１^＊０４：０１および^＊１６：０２）が、密接に関係している対立遺伝子（例えばＤＲＢ１^＊０４：０１および^＊０４：０２）が共有しないエピトープを共有する場合がある。ＲＡに対する感受性における共通エピトープの概念は現在は広く受け入れられているが、エピトープの正確な性質および疾患におけるその役割は、大きな議論の対象となっている（Zanelli E, Breedveld FC, de Vries RR. HLA class II association with rheumatoid arthritis: facts and interpretations. Hum Immunol. 2000;61:1254-61、Weyand CM, Goronzy JJ. Association of MHC and rheumatoid arthritis: HLA polymorphisms in phenotypic variants of rheumatoid arthritis. Arthritis Res 2000;2:212-16）。７０位におけるアスパラギン酸（Ｄ７０）単独の存在が保護作用を有することが報告されており（Mattey DL, Dawes PT, Gonzales-Gay MA, Garcia-Porrua C, Thomson W, Hajeer AH, et al. HLA-DRB1 alleles encoding an aspartic residue at position 70 protect against development of rheumatoid arthritis. J Rheumatol 2001;28:232-39）、残基７０～７４の外側の位置も、この疾患に関与するとされている［Debaz H, Olivo A, Vasquez Garcia MN, de la Rosa G, Hernandez A, Lina L, et al. Relevant residues or DR1 third hypervariable region contributing to the expression and to severity of rheumatoid arthritis (RA) in Mexicans. Hum Immunol 1998;59:287-94、De Vries N, Tijssen H, van Riel PL, van de Putte LB. Reshaping the shared epitope hypothesis: HLA-associated risk for rheumatoid arthritis is encoded by amino acid substitutions at positions 67-74 of the HLA-DRB1 molecule. Arthritis Rheum 2002;46:921-28］。しかしながら、これらのエピトープが、ほとんどの患者においてＲＡに関連しているシトルリン化された自己抗原にどのように結合するかに関しては、ほとんど知られていない。

本発明者らは、ＤＲＢ１^＊０４：０１における比較的少ないアミノ酸がヒトにおける関節リウマチに関連していること［Freed et al., Arthritis Rheum 2011;63(12):3733-39］、そしてこれらのうちの１つ（７１位）が、感受性対立遺伝子を抵抗性対立遺伝子のように機能させるようにペプチド結合を変化させ得ること（Anderson KM, Roark CL, Portas M, Aubrey MT, Rosloniec EF, Freed BM. A Molecular Analysis of the Shared Epitope Hypothesis: Binding of Arthritogenic Peptides to DRB1*04 Alleles. Arthritis Rheumatology 68:1627-36, 2016、Roark CL, Anderson KM, Aubrey MT, Rosloniec EF, Freed BM. Arthritogenic peptide binding to DRβ1*01 alleles correlates with susceptibility to rheumatoid arthritis. J Autoimmunity 72:25, 2016）を示した。

リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）欠損症を処置するためのアリポジーン・チパルボベック［商品名ＧＬＹＢＥＲＡ（商標）］に関してｕｎｉＱｕｉｒｅ ＢＶによって得られた、欧州において初めての遺伝子療法の承認は、遺伝子に基づく治療薬の臨床使用を目指す探求における画期的出来事であった。チパルボベック［ＡＡＶ１－ＬＰＬ（Ｓ４４７Ｘ）］は、筋肉内に送達されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター内に、インタクトなヒトＬＰＬ遺伝子変異体、すなわちＬＰＬ（Ｓｅｒ４４７Ｘ）を組み込む［Gaudet D, Methot J, Dery S, et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1LPL(S447X)) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Ther. Jun. 21, 2012］。

ゲノム編集ができるウイルス要素またはヌクレアーゼを用いて工学操作された自家細胞の使用は、標的とされるウイルスの静脈内デリバリーよりも高い安全性を可能にし得る。エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）プロトコールは、頻度またはウイルス挿入、ＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）、または他の潜在的に変異原性の事象を評価するための、操作された細胞のゲノムのスクリーニングを可能にする［Li H, Haurigot V, Doyon Y, et al. In vivo genome editing restores haemostasis in a mouse model of haemophilia. Nature. 475(7355):217-21, 2011］。臨床成績をもたらすために必要とされる遺伝的に改変された幹細胞の治療的に意義のあるレベルは、大きな細胞集団のエクスビボでの増殖および患者への再導入によって、より容易に達成され得る。

細菌および古細菌のＣＲＩＳＰＲ系は、侵入するウイルスおよびプラスミドのＤＮＡ内に存在する相補配列の分解または改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を指示するために、Ｃａｓタンパク質と複合したｃｒＲＮＡに依存する。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）再構成は、ｃｒＲＮＡにマッチする標的ＤＮＡ配列を配列特異的に切断することをＣａｓ９タンパク質に指示するのに十分である、正常にトランスコードされたｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡに依存する。

ＲＡの慢性炎症性の性質は、関節、骨、皮膚、眼、肺、心臓、および血管をはじめとする多種多様な身体系に対する損傷を引き起こし得る。新種の医薬が処置選択肢を劇的に改善してきたが、重度関節リウマチはなおも身体障害を引き起こし得る。よって、ＲＡの発症を回避し、この不治の自己免疫疾患の炎症応答を緩解させるための方法を特定する重大な必要性がある。

本発明者らは、ＨＬＡ ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子の７１位における単一のアミノ酸残基が、ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子（関節リウマチに対する感受性に関連する遺伝子）と、ＤＲＢ１^＊０４：０２対立遺伝子（関節リウマチに対する抵抗性をもたらす遺伝子）との間のペプチド結合性における差の主要因であることを発見した。本発明は、遺伝子の７１位にリジンを含有する対象のゲノムのＤＲＢ１^＊０４：０１遺伝子配列の一部分を選択的に標的とし、この位置にグルタミン酸を含有する代替配列に置き換えることによって、関節リウマチ（ＲＡ）を有するヒト対象を処置する方法を含む。結果として生じる改変されたＤＲＢ１遺伝子は、発現すると、野生型（７１位におけるリジンをコードする非改変ＤＲＢ１遺伝子）と比較して、対象におけるＲＡに対する抵抗性をもたらす。

よって、本開示は、ゲノムＤＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡと、ＲＮＡと相互作用する酵素と、ゲノムＤＮＡの少なくとも一部分を含有する鋳型核酸とを含む三成分系を用いて、真核細胞を改変する方法を提供する。ガイドＲＮＡおよび酵素は細胞によって発現される。ＲＮＡ／酵素複合体のガイドＲＮＡは、相補的なゲノムＤＮＡに結合し、ゲノムＤＮＡを切断する。酵素は、ガイドＲＮＡ配列の標的とされるゲノム配列を切断する。鋳型核酸の一部分は、ゲノムＤＮＡ中に置換され、これにより、ゲノムが変化した真核細胞を作り出す。ゲノム変化は、好ましくは、標的とされるゲノムＤＮＡにおける単一ヌクレオチドの置換を含む、ヌクレオチド配列の挿入、欠失、または置換であってよい。ガイドＲＮＡ配列の標的とされるゲノム配列は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ゲノムＤＮＡ配列であり得る。ＨＬＡ遺伝子配列は、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合性抗原、ＤＲＢ１ベータ鎖タンパク質をコードするＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子対立遺伝子であり得る。

これらの方法は、細胞がガイドＲＮＡおよび酵素を発現し、ガイドＲＮＡが相補的なゲノムＤＮＡに結合し、酵素が部位特異的様式においてゲノムＤＮＡを切断し、核酸鋳型の少なくとも一部分が標的とされるゲノムＤＮＡ中に置換されてゲノムが変化した真核細胞を作り出すように、真核細胞のゲノムＤＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡをコードする核酸を、真核細胞にトランスフェクトすることと、ガイドＲＮＡと相互作用し、かつ部位特異的様式においてゲノムＤＮＡを切断する酵素をコードする核酸を、真核細胞にトランスフェクトすることと、鋳型核酸を細胞にトランスフェクトすることとを含み得る。これらの方法は、ゲノムＤＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡをコードする核酸を細胞のゲノムに導入することにより、真核細胞を遺伝的に変化させることを含み得る。代替的に、または更に、これらの方法は、ゲノムＤＮＡを切断する酵素をコードする核酸を細胞のゲノムに導入することにより、真核細胞を遺伝的に変化させることを含んでもよい。代替的に、または更に、これらの方法は、鋳型ＤＮＡをコードする核酸を細胞に導入することにより、真核細胞を遺伝的に変化させることを含んでもよい。ゲノムＤＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡ、ゲノムＤＮＡを切断する酵素、および／もしくは鋳型ＤＮＡをコードする核酸分子のうちのいずれか１つ、または任意の組み合わせを、細胞にトランスフェクトしてよい。同様に、ゲノムＤＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡ、ゲノムＤＮＡを切断する酵素、および／もしくは鋳型ＤＮＡをコードする核酸分子のうちのいずれか１つ、または任意の組み合わせを、細胞のゲノムに挿入してよい。

これらの方法において、ゲノムＤＮＡに対して相補的なＲＮＡは、約１０ヌクレオチドから約２５０ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドを含み得る。これらの方法において、酵素は、ガイドＲＮＡが相補的なゲノムＤＮＡにハイブリダイズされるとき、部位特異的様式において、ゲノムＤＮＡの切断および／または標的とされるゲノムＤＮＡ中への鋳型核酸の一部分の置換といった所望の機能を行ない得る。これらの方法において、ガイドＲＮＡおよび酵素は、好ましくは、細菌のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の成分である。これらの方法において、酵素は、好ましくは、Ｃａｓ９、または改変されたＣａｓ９、またはＣａｓ９酵素の相同体である。これらの方法において、真核細胞は、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞であり得る。真核細胞は、好ましくはヒト細胞である。ヒト細胞は、初代血液細胞であってよいか、または血液細胞の集団である。ヒト細胞は、造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＣ）であり得る。これらの方法において、真核細胞は、循環血液細胞、動員血液細胞、骨髄細胞、骨髄系前駆細胞、複能性前駆細胞、および系列限定前駆細胞（ｌｉｎｅａｇｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）から選択され得る。

これらの方法において、ガイドＲＮＡ分子は、ＨＬＡ ＤＲＢ１^＊０４：０１遺伝子座における標的ドメインに対して相補的である標的化ドメインを含み得る。ガイドＲＮＡは、プソイドウリジン、５－メチルシトシン（５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｄｉｎｅ）、２－チオウリジン、５－メチルウリジン－５’－三リン酸、４－チオウリジン－５’－三リン酸、５，６－ジヒドロウリジン－５’－三リン酸、および５－アザウリジン－５’－三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含み得る。ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＧＡＣＣＵＣＧＵＣＵＵＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号１）を含み得る。ガイドＲＮＡ配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ融合体であってよく、その場合、ｃｒＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＧＡＣＣＵＣＧＵＣＵＵＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号１）を含み得る。

これらの方法において、鋳型核酸は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列を含み得る。鋳型核酸は、コドン７１においてＡからＴの点突然変異を含むＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子のヌクレオチド配列を含み得る。ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座中に置換された鋳型核酸は、ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子の７１位におけるグルタミン酸をコードし得る。鋳型核酸は、Ｇで始まるヌクレオチド配列であってよく、Ｃａｓ酵素によって認識されるＮＧＧモチーフの直前に存在する。鋳型核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。ｓｓＯＤＮは、５’ホスホロチオエート修飾、および／または３’ホスホロチオエート修飾、および／または５’ホスホロチオエート修飾と３’ホスホロチオエート修飾との両方を含み得る。

これらの方法において、ガイドＲＮＡ分子およびＣａｓ９ポリペプチドは、細胞に、予め形成されたリボヌクレオチド複合体として導入され得る。代替的に、または更に、Ｃａｓ９分子は、細胞に、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸として導入されてもよい。代替的に、または更に、ガイドＲＮＡは、細胞に、ガイドＲＮＡをコードする核酸として導入されてもよく、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞に、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸として導入されてもよく、細胞は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を発現する。これらの方法において、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質、および鋳型核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または組込み欠損レンチウイルス（ＩＬＤＶ：ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）中で細胞に導入されてもよい。

これらの方法は、導入する工程の後に細胞をエクスビボで増殖させて、標的とされるゲノムＤＮＡ中に置換された、鋳型核酸によってコードされる、ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子またはその一部分を含む単離された細胞集団を形成することを含んでもよい。これらの方法は、細胞集団を自家骨髄移植片として対象に投与することを更に含んでもよい。

本開示は、ＨＬＡ遺伝子に１つまたは複数のゲノム改変を含む単離された哺乳動物血液細胞も提供する。ゲノム改変は、好ましくは、標的とされるゲノムＤＮＡにおける単一ヌクレオチドの置換を含む、ヌクレオチド配列の挿入、欠失、または置換であってよい。ゲノム改変は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ゲノムＤＮＡ配列におけるものであってもよい。改変されるＨＬＡ遺伝子配列は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子対立遺伝子であってもよい。遺伝子改変は、コドン７１においてＡからＴの点突然変異を含むＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子のヌクレオチド配列を含み得る。遺伝子改変は、ＤＲＢ１^＊０４：０１遺伝子座の７１位におけるグルタミン酸をコードするＤＮＡ配列を含み得る。

遺伝的に改変された単離された哺乳動物血液細胞は、初代血液細胞であってよいか、または、循環血液細胞、動員血液細胞、骨髄細胞、骨髄系前駆細胞、複能性前駆細胞、および系列限定前駆細胞からなる群から選択される血液細胞の集団、もしくは造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＣ）、もしくは血液細胞である。これらの遺伝的に改変された単離された哺乳動物血液細胞は、上述の三成分系を用いて真核細胞を改変する方法によって産生され得る。

本開示は、これらの遺伝的に改変された、単離された哺乳動物血液細胞を含む、組成物も提供する。これらの組成物は、対象の関節リウマチを処置または防止する方法において有用な医薬組成物であって、かかる処置を必要とする対象に、遺伝的に改変された単離された哺乳動物血液細胞、またはそれらを含有する組成物を投与することによる方法において有用な医薬組成物であり得る。

本開示は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１特異的プロトスペーサードメインを含むＣＲＩＳＰＲ活性化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含むガイドＲＮＡと複合した単一のＣａｓヌクレアーゼも提供する。ｃｒＲＮＡは、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であってよいか、またはｔｒａｃｒＲＮＡに連結したｃｒＲＮＡを含む人工キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含んでもよい。ｃｒＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＧＡＣＣＵＣＧＵＣＵＵＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号１）を含み得る。ｃｒＲＮＡは、約１７ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドのＨＬＡ－ＤＲＢ１特異的プロトスペーサードメインを含んでもよい。ｃｒＲＮＡは、約１２ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドを含むｔｒａｃｒＲＮＡ結合性ドメインに連結していてもよい。ｃｒＲＮＡは、リボース修飾、末端基修飾、およびヌクレオチド間結合修飾から選択される修飾を有する化学修飾ヌクレオチドから選択される少なくとも１つの化学修飾を含んでもよい。ｃｒＲＮＡは、プソイドウリジン、５－メチルシトシン、２－チオウリジン、５－メチルウリジン－５’－三リン酸、４－チオウリジン－５’－三リン酸、５，６－ジヒドロウリジン－５’－三リン酸、および５－アザウリジン－５’－三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含んでもよい。

本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子に対するＣａｓ９ヌクレアーゼの結合を媒介するガイドＲＮＡとを含む、ベクターも提供する。これらのベクターにおいて、ガイドＲＮＡ配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ融合体をコードし得る。ベクターは、アデノウイルスベクター、または組込み欠損性レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）、または組込み欠損性泡沫状ウイルスベクター（ＩＤＦＶ：ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏａｍｙｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）であり得る。

本開示は、対象の関節リウマチを処置または防止する方法であって、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座内の標的核酸配列に対して相補的であるガイドＲＮＡ配列を対象の細胞に導入することと、Ｃａｓ９タンパク質を対象の細胞に導入することと、ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の少なくとも一部分を含む鋳型核酸を対象の細胞に導入することとを含む、方法も提供する。対象の細胞において、ガイドＲＮＡ配列は、標的核酸配列に結合し、Ｃａｓ９タンパク質は、標的核酸配列を切断し、ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の一部分は、標的核酸中に置換される。これにより、対象の細胞は、好ましくは、標的とされるゲノムＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子への単一ヌクレオチドの置換を含む、ヌクレオチド配列の挿入、欠失、または置換によって遺伝的に改変される。遺伝子改変は、コドン７１においてＡからＴの点突然変異を含むＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子のヌクレオチド配列を含み得る。遺伝子改変は、ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子の７１位におけるグルタミン酸をコードするＤＮＡ配列を含み得る。

対象の関節リウマチを処置または防止するこれらの方法において、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ ９タンパク質、および鋳型核酸は、ウイルス形質導入によって細胞に導入され得る。ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ ９タンパク質、および鋳型核酸は、対象から単離されている細胞にエクスビボで導入されてもよい。ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の一部分が標的核酸中に置換されている、遺伝的に改変された細胞が、自家骨髄移植片として対象に投与されてもよい。

本開示は、関節リウマチの処置または防止のための、本開示の遺伝的に改変された細胞を含む薬物を製造する方法も提供する。

本開示は、本開示の遺伝的に改変された細胞、またはそれらの細胞を含む組成物を、関節リウマチの処置または防止のために使用する方法も提供する。

当業者には、本明細書を読めば、更なる実施形態が明らかとなるであろう。

図１は、本開示のＤＲＢ１^＊０４：０１ガイド配列をコードするレンチウイルスプラスミドのマップである。 図２は、本開示のＤＲＢ１^＊０４：０１ガイド配列をコードする別のレンチウイルスプラスミドのマップである。 図３Ａ～３Ｄは、本開示のＣＲＩＳＰＲコンストラクトを使用したインビトロトランスフェクション効率分析における、ＨＬＡ－ＤＲ発現を喪失した細胞に関する分取のフローサイトメトリーの結果を示す。図３Ａは、トランスフェクトされなかったＤＲＢ１^＊０４：０１を発現するＴ２細胞についてのフローサイトメトリーの結果を示し、図３Ｂは、スクランブルＲＮＡを使用してトランスフェクトされたＤＲＢ１^＊０４：０１を発現するＴ２細胞についてのフローサイトメトリーの結果を示す。図３Ｃは、本開示の２０８／ｆｗｄガイドＲＮＡがトランスフェクトされたＤＲＢ１^＊０４：０１を発現するＴ２細胞についてのフローサイトメトリーの結果を示し、図３Ｄは、本開示の１８５／ｒｅｖガイドＲＮＡがトランスフェクトされたＤＲＢ１^＊０４：０１を発現するＴ２細胞についてのフローサイトメトリーの結果を示す。 同上。

本開示は、ＨＬＡ ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子のアミノ酸７１にリジンを含有する対象のＨＬＡ ＤＲＢ１遺伝子配列の一部分を選択的に標的とし、代替配列に置き換えることによって、関節リウマチ（ＲＡ）を有する対象を処置する方法を提供する。結果として生じる、代替配列を含有する改変されたＤＲＢ１遺伝子は、発現すると、ＨＬＡ ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子を有する対象と比較して、対象におけるＲＡの発症および進行に対する抵抗性をもたらす。好ましくは、改変されたＨＬＡ ＤＲＢ１^＊０４：０１の存在は、ＨＬＡ ＤＲＢ１^＊０４：０２対立遺伝子を有する対象と同様に、対象における医薬または他のＲＡ処置の必要をなくすかまたは低減させるのに十分である。

本開示は、ＲＡに関連する対立遺伝子を含有するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲＢ１遺伝子の一部分を標的とするヌクレアーゼ（このヌクレアーゼは、ＤＲＢ１遺伝子において二本鎖切断を作り出す）をコードする１つまたは複数の核酸と、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座内の標的核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ分子と、ＤＲＢ１遺伝子における二本鎖切断の上流および下流の核酸配列と相同である核酸配列が隣接してもよいＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の少なくとも一部分を含む核酸を含む単離された鋳型核酸とを、対象の細胞に導入することにより、対象のＲＡを処置する方法であって、結果として生じる改変されたＤＲＢ１遺伝子は、発現すると、ＤＲＢ１^＊０４：０２対立遺伝子を発現する対象と比較可能な、対象におけるＲＡの発症に対する抵抗性または対象におけるＲＡの進行の低減をもたらす、方法を提供する。改変された細胞が投与される対象は、ＥＬＩＳＡまたはＢｅｔｈｅｓｄａアッセイによって検知した場合、ヒト主要組織適合性複合体クラスＩＩ、ＤＲ４タンパク質またはタンパク質複合体を認識する抗体を有しなくてもよい。

定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、直鎖状または環状の高次構造であり、かつ一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかにおける、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的において、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であるものと解釈されないものとする。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分（例えばホスホロチオエート骨格）において修飾されているヌクレオチドを包含し得る。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有する。すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対を形成する。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すように交換可能に使用される。この用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。随所で使用される対象とは、個体を意味する。好ましくは、対象は、霊長類動物などの哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。非ヒト霊長類動物も対象である。対象という用語は、ネコ、イヌなどの家庭用動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、および実験動物（例えば、フェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモットなど）を含む。よって、本明細書では、獣医学的使用および医学的製剤が想定される。

「ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の少なくとも一部分」という用語は、完全長未満のＤＲＢ１対立遺伝子を含有するヌクレオチド配列を指す。ＤＲＢ１ヌクレオチドの一部分は、ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子のコドン７１をコードする配列を含み得る。この部分は、ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子のコドン７１をコードする配列を中心としてよい。別の態様において、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または防止するための方法を提供する。

本明細書においてより詳細に記載されるように、本発明は、対象のＲＡを処置または防止するための方法を提供する。「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、細胞に適用される場合、細胞を任意の種類のプロセスもしくは条件に供すること、または任意の種類の操作もしくは手順を細胞に対して行なうことを含む。対象に適用される場合、これらの用語は、本明細書に記載される方法に従ってエクスビボで標的ポリヌクレオチド配列が改変されている細胞を、個体に提供することを指す。対象は通常、病気もしくは傷害を負っているか、または集団の平均的メンバーと比べて病気になるリスクが高く、かかる配慮、ケア、もしくは管理を必要とする。例えば、対象は、ＲＡを患っているか、または集団の平均的メンバーと比べてＲＡを発症するリスクが高く、かかる配慮、ケア、もしくは管理を必要とする場合がある。

本明細書において使用される場合、「処置すること」および「処置」という用語は、対象において、疾患の少なくとも１つの症状における低減、または疾患（例えばＲＡ）における改善、例えば有益なまたは所望の臨床結果があるように、本明細書に記載される方法に従ってエクスビボで標的ポリヌクレオチド配列が改変された細胞を有効量で対象に投与することを指す。本発明の目的において、有益なまたは所望の臨床結果は、検知可能か検知不可能かを問わず、１つまたは複数の症状の軽減、疾患の広がりの減少、安定化した（すなわち悪化しない）疾患の状態、疾患進行の遅延または減速、病状の寛解または緩和、および軽快（部分的か全体的かを問わない）を含むが、これらに限定されない。処置することは、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することを指す場合がある。よって、当業者は、処置が、疾患の状態を改善し得るが、疾患の完全な治癒でない場合があることを了解する。本明細書において使用される場合、「処置」という用語は、予防を含む。代替的に、処置は、疾患の進行が低減または停止した場合に「有効」である。「処置」もまた、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することを意味し得る。処置を必要とするものには、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害の診断を既に受けているものだけでなく、遺伝的感受性または他の要因のためにかかる障害を発症する可能性が高いものも含まれる。

疾患または障害の「処置」、「防止」、または「寛解」とは、かかる疾患または障害（例えばＲＡ）の発生を遅延または防止すること、かかる疾患または障害に関連する状態の進行または重症度の進行、増悪もしくは悪化を逆転、軽減、寛解、阻害、減速、または停止させることを意味する。一実施形態において、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％軽減される。

対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または防止するための例示的な方法は、ヌクレアーゼ［例えば、クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート関連（Ｃａｓ：ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質］および１つから２つのリボ核酸とポリヌクレオチド配列を接触させることにより、エクスビボで細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変化させることであって、リボ核酸が、ヌクレアーゼを標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導き、かつハイブリダイズさせ、標的ポリヌクレオチド配列が、切断および改変される、変化させることと、改変された細胞を対象に導入することにより、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または防止することとを含む。

ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子改変
ＤＲＢ１分子は高度に多型性であり、ＤＲＢ１^＊０４：０１は、関節リウマチに対する感受性に関連する遺伝子である。対照的に、ＤＲＢ１^＊０４：０２は、関節リウマチに対する抵抗性がある。本発明者らは、これら２つの対立遺伝子間のＲＡ感受性における差の主要因である７１位における単一アミノ酸残基を特定した。この単一点突然変異は、７１位におけるリジンをグルタミン酸に変化させる（ＤＲＢ１^＊０４：０１^Ｋ７１Ｅ）。よって、一態様において、本発明は、本明細書に記載される方法を使用した、ＲＡを患う対象におけるＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子の標的化および改変に関する。いくつかのＤＲ４対立遺伝子、特にＤＲＢ１^＊０４：０１、^＊０４：０４、および^＊０４：０５は、ＲＡに強く関連しているが、ＤＲＢ１^＊０４：０２にこれは当てはまらない。加えて、ＤＲＢ１^＊０１：０１、^＊０１：０２、^＊１０：０１、および^＊１４：０２が、場合により、特に非ヨーロッパ人において、ＲＡと関連付けられている。これらの異種の対立遺伝子は、ペプチド結合溝の７０～７４位における共通のアミノ酸セットである「共通エピトープ」の存在を介して、ＲＡに寄与すると仮定されている。

ＲＡ対象のＤＲ４対立遺伝子型の特定は、当技術分野において公知の技術を使用して容易に行なうことができる。例えば、対象のＤＮＡを全血中の白血球から抽出することができ、内因性コード領域を、制限分析、直接的なＤＮＡ配列分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、化学的ミスマッチ切断（ＣＭＣ）、および変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）によって分析することができる。

これらの本開示の方法による修復の標的とされる遺伝子改変は、単一ヌクレオチド改変（すなわち、点突然変異またはＳＮＰ）であり得る。改変は、ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子のアミノ酸７１をコードするコドンの改変であり得る。改変は、ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子のアミノ酸７１をコードするコドンをリジンからグルタミン酸に変更する改変であり得る。

標的化ヌクレアーゼ
本開示のＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子を標的化および改変する方法において、ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子は、ヌクレアーゼによって直接的に改変の標的とされ得る。本開示の方法および組成物において、ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子を、例えばコドン７１において、改変の標的とするヌクレアーゼをコードする１つまたは複数の核酸は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート）関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。好ましくは、コードされるヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼは、短いＲＮＡを使用してヌクレアーゼをＤＮＡ標的にガイドするゲノム編集系である。この系は、ＣＲＩＳＰＲ技術と呼ばれている［Mali P, Yang L, Esvelt K M, Aach J, Guell M, DiCarlo J E, Norville J E, Church G M. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013 Feb. 15; 339(6121):823-6、Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Sep. 25; 109(39):E2579-86. Epub 2012 Sep. 4］。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系は、細菌において発見され、ウイルスまたはプラスミドのいずれかで、外来性ＤＮＡに対する防御として機能する。細菌においては、内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的ＤＮＡ配列に局在化させる短い相補的な一本鎖ＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を用いて、外来性ＤＮＡを標的とする。ＤＮＡ標的配列は、プラスミド上にあってもよいし、細菌ゲノム内に組込まれてもよい。ｃｒＲＮＡは、ＤＮＡのいずれか鎖にも結合することができ、Ｃａｓ９は、両方の鎖を切断する（二本鎖切断、ＤＳＢ）。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のインビトロ再構成は、正常にトランスコードされたｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡが、ｃｒＲＮＡにマッチする標的ＤＮＡ配列を配列特異的に切断することをＣａｓ９タンパク質に指示するのに十分であることを示した。この二成分系の十分に定義された性質は、これが酵母、植物、および哺乳動物などの真核生物の細胞において機能することを可能にする。ＲＮＡ配列の標的とされるゲノム配列を切断することにより、かかる系は、ゲノム工学操作の容易さを大幅に向上させる。Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９ポリペプチドであり得る。Ｃａｓ９ポリペプチドは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドであってもよい。Ｃａｓ９ポリペプチドは、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９ポリペプチドであってもよい。Ｃａｓ９ポリペプチドは、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９ポリペプチドであってもよい。ガイドＲＮＡ分子およびＣａｓ９ポリペプチドは、予め形成されたリボヌクレオチド複合体において関連していてもよい。

ｃｒＲＮＡ標的化配列は、プロトスペーサーとして公知のＤＮＡ配列から転写される。プロトスペーサーは、細菌ゲノムにおいて、ＣＲＩＳＰＲアレイと呼ばれる群にクラスター化される。プロトスペーサーは、短い回文配列リピートによって分離され、将来の遭遇に対する記録のように保たれる、既知の外来性ＤＮＡの短い配列（およそ２０ｂｐ）である。ＣＲＩＳＰＲ標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を作り出すためには、アレイを転写し、ＲＮＡをプロセシングして、リピート間の個々の認識配列を分離させる。ＩＩ型系において、ＣＲＩＳＰＲアレイ転写物（プレｃｒＲＮＡ）の個々のｃｒＲＮＡへのプロセシングは、回文配列リピートに対して相補的な配列を有するトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の存在に依存する。ｔｒａｃｒＲＮＡが短い回文配列リピートにハイブリダイズすると、これは、細菌の二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるプロセシングを誘発する。これで、任意のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方がＣａｓ９ヌクレアーゼに結合することができ、これが次いで活性化され、ｃｒＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ配列に対して特異的になる［Mali P, Science. 2013（上記）、Gasiunas G, Proc Natl Acad Sci USA. 2012（上記）］。よって、本開示は、約１７ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドのＨＬＡ－ＤＲＢ１特異的プロトスペーサードメインを含有する単離されたｃｒＲＮＡを含む。これらの単離されたｃｒＲＮＡは、ヌクレオチド配列：ＧＧＡＣＣＵＣＧＵＣＵＵＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号１）を含み得る。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ゲノムの部位特異的編集のための強力なツールとして浮上している工学操作されたヌクレアーゼである。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、転写因子内に存在するジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメインと、エンドヌクレアーゼＦｏｋ１の非特異的切断ドメインとを含有するハイブリッドタンパク質である［Li et al., In vivo genome editing restores haemostasis in a mouse model of haemophilia, Nature 2011 Jun. 26; 475(7355):217-21］。

上記に詳述される、ＣＲＩＳＰＲアプローチの標的とされるものと同じ配列は、ゲノム編集のためのジンクフィンガーヌクレアーゼアプローチの標的にもなり得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、使用者が指定した場所においてＤＮＡ内に二本鎖切断を作り出すことによってゲノムの標的化編集を容易にする、工学操作されたＤＮＡ結合性タンパク質のクラスである。各ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、１）それぞれがＤＮＡの独特の六量体（６ｂｐ）配列を認識する、２フィンガーモジュールの鎖からなるＤＮＡ結合性ドメイン（ここで、２フィンガーモジュールは、それぞれ２４ｂｐ以上の特異性をもち、ひとつにまとまってジンクフィンガータンパク質を形成している）、および２）Ｆｏｋ ＩのヌクレアーゼドメインからなるＤＮＡ切断ドメインという、２つの機能的ドメインからなる。ＤＮＡ結合性ドメインおよびＤＮＡ切断ドメインはひとつに融合しており、標的とされるゲノム配列を認識し、Ｆｏｋ１ドメインに、二本鎖切断を作り出すことによってＤＮＡを切断するヘテロ二量体の酵素を形成させる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、当技術分野において公知の技術を使用して容易に作製することができる［Wright D A, et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nat Protoc. 2006; 1(3):1637-52］。工学操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼは、動物およびヒト細胞内の特定のゲノム遺伝子座における遺伝子の標的化を刺激することができる。モジュラーアセンブリーを使用した人工ジンクフィンガーアレイの構築については説明されている。目的の遺伝子における潜在的なジンクフィンガー標的部位を特定するための、相補的なウェブベースのソフトウェアと併せた、１４０より多くの十分に特性評価されたジンクフィンガーモジュールをコードするプラスミドのアーカイブについても説明されている。これらの試薬は、ジンクフィンガー配列の専門知識または複雑なオリゴヌクレオチド設計の必要なく、モジュールの簡単な混合およびマッチング、ならびにアセンブルされたアレイの発現ベクターへの移行を可能にする（Wright D A, Nat Protoc. 2006、上記）。適切に設計された一対のＺＦＮを用いれば、任意の生物における任意の遺伝子を標的とすることができる。ジンクフィンガーの認識は、標的ＤＮＡ配列とのマッチのみに依存する［Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics Society of America, 2011, 188(4), pp 773-782］。

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ある特定の種類のゲノム編集のための、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に対する好ましい代替物として浮上している。ＴＡＬＥＮ成分のＣ末端は、タンパク質の核への移入を可能にする核移行シグナル（ＮＬＳ）を有する。ＮＬＳの下流には、宿主の転写機構の動員におそらく関与している、酸性活性化ドメイン（ＡＤ）も存在する。中心領域は、タンデム反復する一連のほぼ同一な３４／３５アミノ酸モジュールを内包する。１２位および１３位における残基は、高度に可変性であり、反復可変性二残基（ＲＶＤ：ｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ）と称される。特定のＴＡＬＥのリピートにおける各ＲＶＤは、単一ヌクレオチドとの相互作用を決定する。ＴＡＬＥ間のバリエーションのほとんどは、準同一のリピートの数（５．５から３３．５に及ぶ）および／または順序に依存する。天然に存在するＴＡＬＥの特質から誘導される設計判断基準を使用した推定は、平均して、ゲノムＤＮＡ内の３５塩基対毎に１つの好適なＴＡＬＥＮ標的部位が見出され得ることを示唆する。ＺＦＮと比較すると、ＴＡＬＥＮのクローニングプロセスは簡単であり、認識される標的配列の特異性は高く、オフターゲット効果は低い。１つの研究では、ＣＣＲ５を標的とするように設計されたＴＡＬＥＮが、高度に相同なＣＣＲ２遺伝子座において、これら２つの部位において同様な活性を有したＣＣＲ５特異的ＺＦＮと比較すると非常にわずかな活性を有することが示された。

ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡが細胞に導入された後、ヌクレアーゼは、ＤＮＡにおけるそれらの結合性部位間の二本鎖切断を触媒する。二本鎖切断が、例えば、切断点に隣接する領域の天然染色体ＤＮＡの５’および３’におけるものと同一のＤＮＡ配列を有する左相同性アーム（ＨＬ）および右相同性アーム（ＨＲ）を含むＤＮＡの区間を含有する、鋳型プラスミド（ＤＰ）の存在下で起こる場合、相同組換えは、非常に効率的に起こる。したがって、本発明は、特に、コドン７１をコードする部分を含む、対象のＤＲＢ１遺伝子の一部分を置き換え、したがって改変する、ＤＲＢ１^＊０４：０２対立遺伝子の一部分を含む、相同組換え中に鋳型配列として働く核酸配列の導入を含む。

ガイドＲＮＡは、細胞のゲノムＤＮＡに対して相補的な標的化配列、好ましくは、細胞内のＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子配列を特に含み得る、細胞内のＤＲＢ１遺伝子配列を含む、ＲＮＡである。ガイドＲＮＡは、約１０から約２５０ヌクレオチド、または約２０から約１００ヌクレオチドを含み得る。ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列：ＧＧＡＣＣＵＣＧＵＣＵＵＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号１）を含み得る。

ガイドＲＮＡは、リボース修飾、末端修飾基、およびヌクレオチド間修飾結合からなる群から選択される修飾を有する１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含み得る。ガイドＲＮＡは、プソイドウリジン、５－メチルシトシン、２－チオウリジン、５－メチルウリジン－５’－三リン酸、４－チオウリジン－５’－三リン酸、５，６－ジヒドロウリジン－５’－三リン酸、および５－アザウリジン－５’－三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含み得る。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系では、「スペーサー」単位からなる短いガイドＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、スペーサー配列に対して相補的なＤＮＡの切断を指示する。細菌において、ＩＩ型エフェクター系は、スペーサーを含有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写された長いプレｃｒＲＮＡ、多機能性Ｃａｓ９タンパク質、およびｇＲＮＡプロセシングに重要なｔｒａｃｒＲＮＡからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡのスペーサーを分離するリピート領域にハイブリダイズし、内因性ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるｄｓＲＮＡの切断を開始し、これに、Ｃａｓ９による各スペーサーにおける第２の切断事象が続き、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９と関連した状態を保つ成熟したｃｒＲＮＡが産生される。本開示の方法において使用されるヌクレアーゼ酵素（例えばＣａｓ９）は、ＤＮＡの二重鎖をほどき、切断するためのｃｒＲＮＡにマッチする配列を探す。標的認識は、標的ＤＮＡにおける「プロトスペーサー」配列と、ｃｒＲＮＡにおける残りのスペーサー配列との間の相補性の検知に際して起こる。重要なことに、Ｃａｓ９は、３’末端に正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）も存在する場合にのみ、ＤＮＡを切断する。ある特定の態様によれば、異なるプロトスペーサー隣接モチーフを用いてもよい。例えば、Ｓ．ピオゲネス系は、ＮＧＧ配列を必要とし、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであってよい。Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＩＩ型系は、それぞれＮＧＧＮＧおよびＮＮＡＧＡＡＷを必要とし、一方、異なるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）系は、ＮＧＧまたはＮＡＡＲを許容する。生物情報学分析は、更なる有用なＰＡＭを特定し、ＣＲＩＳＰＲ標的化可能配列のセットを拡大するために役立ち得る、種々の細菌におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の膨大なデータベースを生成している。Ｓ．サーモフィラスにおいて、Ｃａｓ９は、プロトスペーサーの３’末端の３ｂｐ前で平滑末端の二本鎖切断を発生させ、これは、Ｃａｓ９タンパク質における２つの触媒ドメイン：ＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメイン、および非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインによって媒介されるプロセスである。Ｓ．ピオゲネス系は同レベルの精度まで特性評価されていないが、ＤＳＢの形成は同様に、プロトスペーサーの３’末端に向かって起こる。２つのヌクレアーゼドメインのうちの１つが不活性化された場合、Ｃａｓ９は、インビトロではニッカーゼとして、そしてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）ではヒト細胞において機能する。

したがって、本開示の方法において使用されるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体であり得る。これらの方法において、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合転写物は、プロモーター（ヒトＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなど）から発現される。かかるガイドＲＮＡは、細胞によって直接的に転写されてもよい。この態様は、好都合には、細菌ＣＲＩＳＰＲ系により用いられるＲＮＡプロセシング機構の再構成を回避する。これらの方法において、ｃｒＲＮＡは、ヌクレオチド配列：ＧＧＡＣＣＵＣＧＵＣＵＵＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号１）を含み得る。

ヌクレアーゼタンパク質（例えばＣａｓ９タンパク質）は、対象に投与されるか、または細胞に送達されるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するために、ｇＲＮＡ分子と組み合わされ得る。ヌクレアーゼ－ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体の細胞への直接的なデリバリーにより、核酸からの発現（例えば、ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードするプラスミドのトランスフェクション）の必要性がなくなる。また、核酸のデリバリー（例えば、ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードするプラスミドのトランスフェクション）に由来するＤＮＡセグメントの不要な組込みもなくなる。したがって、このＲＮＰ複合体は、急速な作用、速い代謝回転、高いオンターゲット改変率、低減されたオフターゲット効果、および細胞に対する比較的低い毒性をもたらす、本開示の方法において使用するための代替的なデリバリーアプローチを提供する。これはまた、トランスフェクション困難な細胞（例えば、トランスフェクション困難な初代細胞および多能性幹細胞）に、ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡ複合体を送達するために用いられ得る。ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、通常、投与の前に形成される（すなわち、予め形成される）。複数の（１つより多くの）ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が関与する場合、それらは、同時または順次に送達（または投与）され得る。ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、電気穿孔によって細胞に送達されてもよい。

代替的に、または更に、ヌクレアーゼ分子は、細胞に、ヌクレアーゼタンパク質（例えばＣａｓ９タンパク質）をコードする核酸として導入される。同様に、ガイドＲＮＡは、細胞に、ガイドＲＮＡをコードする核酸として導入され得る。同様に、ヌクレアーゼタンパク質は、細胞に、ヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸として導入されてもよく、細胞は、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼタンパク質を発現する。ヌクレアーゼタンパク質（ならびにガイドＲＮＡおよび／または鋳型核酸）は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または組込み欠損レンチウイルス中で細胞に導入されてもよい。

鋳型核酸配列
「鋳型核酸」とは、標的とされる核酸（例えば、ＤＲＢ１ゲノムＤＮＡ）の構造を変化させるために、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９分子）およびガイドＲＮＡ分子と併せて使用され得る核酸配列を指す。標的とされる核酸は、典型的に、切断部位またはその付近において、鋳型核酸の配列の一部または全てを有するように改変される。鋳型核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。鋳型核酸は、ＤＮＡ（例えば、二本鎖ＤＮＡ）、または一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡ（例えば、二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ）であってもよい。鋳型核酸は、ヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡと同じベクター骨格（例えば、ＡＡＶゲノム、プラスミドＤＮＡ）上でコードされてよく、鋳型核酸は、ベクター骨格からインビボで切除されてよい（例えば、これにガイドＲＮＡ認識配列が隣接する）。鋳型ＤＮＡは、ＩＬＤＶにおいてコードされてもよい。鋳型核酸は、外因性核酸配列であってもよい。鋳型核酸配列は、内因性核酸配列（例えば、内因性相同領域）であってもよい。鋳型核酸は、核酸配列のプラス鎖またはマイナス鎖に対応する一本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。

ドナーまたは「鋳型」核酸配列は、ＤＲＢ１^＊０４：０２対立遺伝子の一部分をコードする核酸を含む。鋳型配列には、ＤＲＢ１^＊０４遺伝子と相同である核酸の領域が各側に隣接していてよい。これらの相同領域のそれぞれは、対象のＤＲＢ１遺伝子と相同な約２０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、またはそれより多くのヌクレオチドを含み得る。鋳型配列に隣接する相同領域のそれぞれは、約２００から約１，２００ヌクレオチド、４００から約１０００ヌクレオチド、または約６００から約９００ヌクレオチドであってよい。一実施形態において、各相同領域は、約８００から約９００ヌクレオチドである。よって、各鋳型核酸配列は、対象の内因性ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子を置き換えるかまたは改変する配列、ならびにＤＲＢ１遺伝子の一部分と相同である５’および３’の隣接配列を含み得る。

鋳型配列は、置き換えまたは改変の標的とされる対象のＤＲＢ１遺伝子内の特定のヌクレオチド、またはコドン、または部分、または領域に基づいて誘導される。したがって、鋳型配列の長さは様々であり得る。例えば、ＤＲＢ１^＊０４対立遺伝子におけるコドン７１をコードする配列の変化などの点突然変異を修復するとき、鋳型配列は、例えば逆位など、例えば、ＤＲＢ１遺伝子のうちより大きな一部分または領域を置き換えるかまたは修復するように設計された鋳型配列と比較して、ごく少数の代替ヌクレオチド配列を含み得る。したがって、鋳型配列は、任意の長さ、例えば２～１０，０００ヌクレオチド長（またはその間もしくはそれを超える任意の整数値）、好ましくは約１００～１，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、より好ましくは約２００～５００ヌクレオチド長であってよい。鋳型配列核酸の設計は、当技術分野において公知である［例えば、Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acid Res. 2011 Sep. 1; 39 (17):7879を参照されたい］。例示的な本開示の方法において、鋳型配列は、ＤＲＢ１^＊０４：０２対立遺伝子のコドン７１のヌクレオチド配列を含む。

本開示の方法において、改変の標的とされる遺伝子配列は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であり、鋳型配列は、ＳＮＰを、「野生型」遺伝子配列とみなされる配列、またはその同じ部位における異なる対立遺伝子のバリエーション、例えば、その同じ部位におけるＤＲＢ１^＊０４：０２対立遺伝子配列で改変するかまたは置き換える、核酸配列を含む。関連する本開示の方法において、改変の標的とされる遺伝子配列は、欠失および鋳型配列を含むか、または、欠失を含まない配列、例えば野生型ＤＲＢ１配列、もしくはＤＲＢ１^＊０４：０２対立遺伝子配列に、欠失を置き換える核酸配列を含む。

関連する本開示の方法において、改変の標的とされる遺伝子配列は、挿入であり、標的配列は、挿入を除去するＤＲＢ１遺伝子の一部分をコードし、機能的なＤＲＢ１遺伝子産物の産生をもたらす核酸配列を含む。

これらの本開示の方法において、鋳型配列は、目的の領域におけるゲノム配列と相同であるが同一ではない配列を含有する（例えば、野生型アミノ酸または異なるｎｓ－ＳＮＰアミノ酸をコードする核酸配列を含有する）ことにより、相同組換えを刺激して、目的の領域に非同一配列を挿入することができる。よって、鋳型配列のうち目的の領域における配列と相同な部分は、置き換えられるゲノム配列に対して約８０から約９９％の配列同一性を呈し得る。例えば、１００超の連続する塩基対のうち、鋳型とゲノム配列との間で１つのヌクレオチドのみが異なる場合、鋳型とゲノム配列との間の相同性は９９％より高い。鋳型配列の非相同部分は、新たな配列が目的の領域に導入されるように、目的の領域内に存在しない配列を含有し得る。これらの事例において、非相同配列には、概して、目的の領域における配列と相同または同一である、５０から１，０００の塩基対、または１，０００を超える任意の数の塩基対からなる配列が隣接している。他の実施形態では、鋳型配列は、第１の配列と非相同であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。

鋳型核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。ｓｓＯＤＮは、５’ホスホロチオエート修飾を含んでもよい。ｓｓＯＤＮは、３’ホスホロチオエート修飾を含んでもよい。ｓｓＯＤＮは、５’ホスホロチオエート修飾および３’ホスホロチオエート修飾を含んでもよい。

ＤＲＢ１遺伝子を改変するための鋳型核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチド［例えば、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）］として使用されるように設計され得る。ｓｓＯＤＮを使用する場合、５’および３’の相同性アームは、最長約２００塩基対（ｂｐ）の長さ、例えば少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｂｐの長さに及び得る。オリゴヌクレオチド合成の改善が継続して行なわれているため、より長いｓｓＯＤＮの相同性アームも想定される。より長い相同性アームは、化学合成以外の方法によって、例えば、長い二本鎖核酸を変性させ、鎖の一方を、例えば固体基質に固定された鎖特異的配列に対する親和性によって精製することによって、作製され得る。

標的とされる細胞
上述の異なるヌクレアーゼを使用した遺伝子の標的化および改変の技術は、多くの異なる標的細胞を使用して行なうことができる。例えば、形質導入細胞は、内皮細胞、肝細胞、または幹細胞を含み得る。一実施形態において、細胞は、インビボで標的とされ得る。一実施形態において、細胞は、エクスビボのアプローチを使用して標的とされ、対象に再導入され得る。

対象由来の標的細胞は、血液増生内皮細胞（ＢＯＥＣ：ｂｌｏｏｄ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）などの内皮細胞であり得る。ＢＯＥＣを遺伝子改変およびデリバリーのために魅力的なものとする特徴としては、（ｉ）血液から単離された前駆細胞から増殖する能力、（ｉｉ）成熟内皮細胞、安定性、表現型、および正常なセネッセンス（約６５回の分裂）、（ｉｉｉ）単一の血液試料から１０００個以上のＢＯＥＣへの大量増殖、（ｉｖ）他の内皮細胞とは異なり、凍結保存を可能にし、したがって単一の患者に対して複数の用量が単回の単離から調製されるようにする復元力が挙げられる。末梢血の培養が、血液増生内皮細胞とも称される自家性で高度に増殖性の内皮細胞の豊富な供給をもたらす、ＢＯＥＣの単離方法が公知である［Bodempudi V, et al., Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Ther. 2010 December; 17(12):855-63］。

動物モデルにおける研究は、エクスビボ遺伝子改変戦略において使用するのに好適であることを示す血液増生内皮細胞の特性を明らかにしている。例えば、イヌ血液増生内皮細胞（ｃＢＯＥＣ）の挙動に関する主要な所見は、ｃＢＯＥＣが注入後にイヌの肝臓内で持続し増殖することである［Milbauer L C, et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. 2009 April; 153(4):179-89］。ＨＡモデルにおける全血凝固時間（ＷＢＣＴ）も、工学操作されたｃＢＯＥＣの投与後に改善された。ＷＢＣＴは、６０分未満の処置前の値から、４０分未満、場合によっては３０分未満まで低下した。

これらの方法において、対象由来の標的細胞は、真核細胞であり、これは幹細胞、特に造血幹細胞（ＨＳＣ）であってよい。これは、造血細胞が、改変されたペプチドを提示し、ＲＡを誘発するＤＲＢ１遺伝子産物の主な細胞源となる可能性が高いためである。

細胞（または細胞集団）は、初代血液細胞、または初代血液細胞の集団であり得る。細胞または細胞集団は、骨髄細胞、末梢血細胞、もしくは誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、内皮細胞、骨髄系前駆細胞、循環血液細胞、動員血液細胞、複能性前駆細胞、および系列限定前駆細胞から生成された細胞、またはこれらの細胞の任意の集団であってよい。細胞集団は、異種細胞集団であっても同種細胞集団であってもよい。

幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、胚性幹細胞の決定的な特性を維持するのに重要な特定の遺伝子および因子の発現を誘導することにより、非多能性細胞、典型的には成体体細胞から人工的に誘導される、一種の多能性幹細胞である。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、いくつかの例において、ヌクレアーゼによる部位特異的遺伝子標的化ができることが示されている（Ru, R. et al. Targeted genome engineering in human induced pluripotent stem cells by penetrating TALENs. Cell Regeneration. 2013, 2:5、Sun N, Zhao H. Seamless correction of the sickle cell disease mutation of the HBB gene in human induced pluripotent stem cells using TALENs. Biotechnol Bioeng. 2013. Aug 8）。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、当技術分野において公知の方法を使用して単離することができる［例えば、Lorenzo, I M. Generation of Mouse and Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) from Primary Somatic Cells. Stem Cell Rev. 2013 August; 9(4):435-50を参照されたい］。

いくつかの事例において、一部の細胞型の純粋な集団は、改変されたＤＲＢ１遺伝子の長期かつ十分な発現をもたらすために、形質導入細胞を対象に再導入した際に十分なホーミングおよび移植を促進しない場合がある。したがって、一部の細胞型は、細胞特性（すなわち、骨髄内に生着する細胞の能力）の促進を助けるために、異なる細胞型と共培養され得る。

細胞デリバリー
核酸デリバリーの方法は、当技術分野において周知である（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０５１３４３号を参照されたい）。本開示の方法において、記載されるヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖として細胞に導入されてよく、直鎖状または環状の形態で細胞に導入されてよい。一実施形態において、ヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡとして細胞に導入される。鋳型配列は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡとして細胞に導入されてよく、直鎖状または環状の形態で細胞に導入されてよい。直鎖状形態で導入される場合、核酸の末端は、当業者に公知の方法によって保護されていてもよい（例えばエキソヌクレアーゼによる分解から）。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖状分子の３’末端に付加され、かつ／または自己相補的オリゴヌクレオチドが一方または両方の末端にライゲートされる［例えば、Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963、Nehls et al. (1996) Science 272:886-889を参照されたい］。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための更なる方法は、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、およびＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの、末端アミノ基の付加、および修飾されたヌクレオチド間結合の使用を含むが、これらに限定されない。

核酸は、複製起点、プロモーター、および抗生物質抵抗性をコードする遺伝子などの更なる配列を有するベクター分子の一部として、細胞に導入され得る。更に、核酸は、ネイキッド核酸として、リポソームもしくはポロクサマーなどの薬剤と複合された核酸として導入されてもよく、またはウイルス（例えばアデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）によって送達されてもよい。よって、本開示は、ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ）、ガイドＲＮＡ（これはｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ融合体としてコードされ得る）、および鋳型核酸のうちの１つまたは複数をコードし得るベクターを含む。ベクターは、アデノウイルスベクター、組込み欠損性レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）、または組込み欠損性泡沫状ウイルスベクター（ＩＤＦＶ）であり得る。

核酸は、任意の好適な手段により、インビボまたはエクスビボで送達され得る。核酸を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に記載されており、これらはそれぞれ、この参照により本明細書に組み込まれる。

プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含むがこれらに限定されない、任意のベクター系を使用してよい（例えば、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号を参照されたい）。更に、これらのベクターのいずれも、ＲＡの処置に必要な配列のうちの１つまたは複数を含み得る。よって、１つまたは複数の核酸が細胞に導入される場合、ヌクレアーゼおよび／または鋳型配列核酸は、同じベクターに搭載されても、異なるベクターに搭載されてもよい。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、ヌクレアーゼをコードする配列、または鋳型核酸配列を含み得る。代替的に、核酸のうちの２つ以上が単一のベクターに含有されてもよい。

核酸をコードする核酸を細胞（例えば哺乳動物細胞）および標的組織に導入するためには、従来のウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法を使用することができる。非ウイルスベクターデリバリー系としては、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロクサマーなどのデリバリー媒体と複合された核酸が挙げられる。ウイルスベクターデリバリー系としては、細胞へのデリバリー後にエピソームゲノムまたは組込みゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。核酸の非ウイルスデリバリーの方法としては、ソノポレーション、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤によるＤＮＡの取り込み強化（ａｇｅｎｔ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ＤＮＡ）が挙げられる。

更なる例示的な核酸デリバリー系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものが挙げられる（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）。リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている［例えばＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）］。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質としては、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７４２４号および同第ＷＯ９１／１６０２４号に記載されているものが挙げられる。

イムノリピド（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ）複合体などの標的化リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である［例えば、Crystal, Science 270:404-410 (1995)、Blaese et al, Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995)、Behr et al, Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)、Remy et al, Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994)、Gao et al, Gene Therapy 2:710-722 (1995)、Ahmad et al, Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照されたい］。

更なるデリバリー方法としては、送達しようとする核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣデリバリー媒体（ＥＤＶ）にパッケージングすることの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方がＥＤＶに対する特異性を有する、二特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いでＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞内に運ばれる。細胞内に入ると、内容物が放出される［MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643を参照されたい］。

核酸のデリバリーのためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベース系の使用は、体内の特定の細胞をウイルスの標的とし、ウイルスペイロードを核に輸送するための、高度に進化したプロセスを活用する。ウイルスベクターは、患者に直接（インビボ）投与されてもよいし、または細胞をインビトロで処置するために使用されてもよく、改変された細胞は、患者に（エクスビボ）投与される。核酸のデリバリーのための従来のウイルスベース系は、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニア、および単純ヘルペスウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。

レトロウイルスの指向性は、外来性エンベロープタンパク質を組み込み、潜在的な標的細胞の集団を増殖させることによって変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的に高いウイルス力価をもたらすことができる、レトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来性配列に対するパッケージング能を有するシス作用性（ｃｚ’ｓ－ａｃｔｉｎｇ）の長い末端リピートからなる。最小のシス作用性ＬＴＲがベクターの複製およびパッケージングに十分であり、ベクターは次いで、治療遺伝子を標的細胞に組込んで恒久的な導入遺伝子発現をもたらすために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合わせに基づくものが挙げられる［例えば、Buchscher et al, J. Virol. 66:2731-2739 (1992)、Johann et al, J. Virol. 66:1635-1640 (1992)、Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990)、Wilson et al, J. Virol. 63:2374-2378 (1989)、Miller et al, J. Virol. 65:2220-2224 (1991)、ＰＣＴ ＵＳ９４／０５７００を参照されたい］。

一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスベース系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高い力価および高いレベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系において大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、また、インビボおよびエクスビボの遺伝子療法手順のために、標的核酸を細胞に形質導入するためにも使用される［例えば、West et al, Virology 160:38-47 (1987)、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)、Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照されたい］。組換え型ＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Tratschin et al, Mol Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)、Tratschin, et al, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984)、Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984)、およびSamulski et al, J. Virol. 63:03822-3828 (1989)を含む、いくつかの公開文献において記載されている。

臨床治験における遺伝子移入のためには、形質導入剤を生成するために、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの補完が関わるアプローチを用いる、種々のウイルスベクターアプローチが現在利用可能である。ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床治験において使用されているレトロウイルスベクターの例である［Dunbar et al, Blood 85:3048-305 (1995)、Kohn et al, Nat. Med. 1 :1017-102 (1995)、Malech et al, PNAS 94:22 12133-12138 (1997)］。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法治験において使用された初めての治療用ベクターであった［Blaese et al, Science 270:475-480 (1995)］。ＭＦＧ－Ｓパッケージベクターでは、５０％以上の形質導入効率が観察されている［Ellem et al, Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997)、Dranoff et al, Hum. Gene Ther. 1 :111-2 (1997)］。組換え型アデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型かつ非病原性のパルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく代替的な遺伝子デリバリー系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆位末端リピートのみを保持するプラスミドから誘導される。形質導入細胞のゲノムへの組込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子デリバリーは、このベクター系の主要な特質である［Wagner et al, Lancet 351: 9117 1702-3 (1998)、Kearns et al, Gene Ther. 9:748-55 (1996)］。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ．１０、ならびに任意の新規のＡＡＶ血清型を含む他のＡＡＶ血清型を、本開示の方法において使用してもよい。

複製欠損組換え型アデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高い力価で産生され、いくつかの異なる細胞型に容易に感染し得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅｌ ａ、Ｅｌ ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように工学操作され、その後、複製欠損ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉において見出されるものなどの非分裂性の分化細胞を含め、複数の種類の組織にインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い搭載量を有する。臨床治験におけるＡｄベクターの使用の一例では、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法が用いられた［Sterman et al, Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)］。臨床治験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用の更なる例としては、Rosenecker et ah, Infection 24:1 5-10 (1996)、Sterman et ah, Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998)、Welsh et ah, Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995)、Alvarez et al, Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997)、Topf et al, Gene Ther. 5:507-513 (1998)、Sterman et al, Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)が挙げられる。

パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは典型的に、パッケージングおよび後続の宿主への組込み（該当する場合）に必要とされる最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させようとするタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは典型的に、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠如しているヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージングされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のため、有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えばＡＡＶよりもアデノウイルスのほうが感受性が高い熱処理によって低減させることができる。

ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上にウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてのリガンドを発現させることにより、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知である受容体に対する親和性を有するように選択される［例えば、モロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変され得ることと、組換え型ウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することとを報告する、Han et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)を参照されたい］。これは、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス－標的細胞の対において使用することができる。例えば、繊維状ファージは、事実上すべての選択された細胞受容体に対して特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように工学操作され得る。上記の説明は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用してもよい。かかるベクターは、特定の標的細胞による取り込みを優先する特異的取り込み配列を含有するように工学操作され得る。

ベクターは、後述するように、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所適用による、個々の患者への投与によってインビボ送達され得る。代替的に、ベクターは、個々の対象から外植された細胞（例えばリンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）、または万能ドナーの造血幹細胞などの細胞にエクスビボ送達され、その後、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、対象に細胞が再移植されてもよい。

本開示の核酸を含有するベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与されてもよい。

代替的に、ネイキッドＤＮＡを投与してもよい。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔を含むがこれらに限定されない、分子を導入して最終的に血液または組織細胞と接触させるために通常使用されるルートのうちのいずれによるものであってもよい。かかる核酸を投与する好適な方法は、当業者にとって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上のルートを使用してもよいが、多くの場合、特定のルートは、別のルートと比べて、より即時的かつより効果的な反応をもたらすことができる。

本開示の核酸の導入に好適なベクターとしては、非組込みレンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が挙げられる。例えば、Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388、Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880、Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222、米国特許公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。

投与は、ポリヌクレオチドが所望の標的細胞に送達される任意の手段によるものであってよい。例えば、インビボおよびエクスビボの両方の方法が想定される。一実施形態において、核酸は、対象から外植された対象の細胞に導入され、ＤＲＢ１遺伝子改変後に再導入される。

エクスビボの方法では、改変される細胞は、好ましくは自家細胞、すなわち、１つの細胞または複数の細胞におけるＤＲＢ１標的ポリヌクレオチド配列を変化させることを必要とする対象から得られた１つの細胞または複数の細胞である（すなわちドナーおよびレシピエントは同じ個体である）。自家細胞は、免疫に基づく細胞のいかなる拒絶反応をも回避するという利点を有する。代替的に、細胞は異種性、例えばドナーから得られたものであってもよい。第２の対象は、同じ種であっても異なる種であってもよい。典型的に、細胞がドナーから得られる場合、免疫抑制の必要性を低めるかまたはなくすために、細胞は、レシピエントと十分な免疫学的適合性がある、すなわち移植拒絶反応を起こしにくいドナーから得られる。一部の実施形態では、細胞は、異種源、すなわち、レシピエントまたはレシピエントの種と十分な免疫学的適合性があるように遺伝工学操作された非ヒト哺乳動物から得られる。免疫学的適合性を判定するための方法は当技術分野において公知であり、ＨＬＡおよびＡＢＯ決定因子に関するドナーとレシピエントの適合性を評価するための組織適合試験を含む［例えば、Transplantation Immunology, Bach and Auchincloss, Eds. (Wiley, John & Sons, Incorporated 1994)を参照されたい］。改変された自家細胞の投与は、好都合には、改変された細胞の集団を自家骨髄移植片として対象に投与することによって達成され得る。

エクスビボ方法が用いられる場合、細胞または組織は、当技術分野において周知の標準的なプロトコールに従って、体外に取り出され、増殖され、維持され得る。組成物は、上述した任意の遺伝子移入機構、例えば、リン酸カルシウム媒介性遺伝子デリバリー、電気穿孔、マイクロインジェクション、プロテオリポソーム、またはウイルスベクターデリバリーなどによって細胞に導入され得る。形質導入細胞は次いで、その細胞型または組織型に対して標準的な方法によって対象に注入される（例えば、薬学的に許容される担体において）か、または同位置に再移植され得る。対象に様々な細胞を移植または注入するための標準的な方法は公知である。

これらの方法では、ＲＡを有するかまたはＲＡを発症するリスクのある対象の細胞において、ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子が特定され、ＤＲＢ１^＊０４対立遺伝子が、ＤＲＢ１^＊０４：０２対立遺伝子に類似するように改変される。例えば、ＢＯＥＣまたはｉＰＳＣが、上述のヌクレアーゼアプローチを使用して特定および改変され、ＤＲＢ１^＊０４：０２対立遺伝子の一部分と同一の鋳型配列が、細胞内のＤＲＢ１^＊０４対立遺伝子中に置換される。一実施形態において、細胞、例えばＢＯＥＣまたはｉＰＳＣが、上述のように対象から外植され、改変され、対象に再導入されるため、改変は、エクスビボで行なわれる。改変後、細胞は、７１位にグルタミン酸残基を含むＤＲＢ１^＊０４遺伝子産物を産生することができる。ＤＲＢ１^＊０４遺伝子産物のインビボでの発現は、ＤＲＢ１抗原もしくはエピトープに特異的な望まれない免疫応答の低減、遅延、または阻害、および対象のＲＡの低減、寛解、または抑制をもたらす。低減された免疫応答は、ＭＨＣクラスＩＩの制限された提示および／もしくはＢ細胞の提示、または改変されたＤＲＢ１遺伝子産物の免疫原性の最小化もしくは低減をもたらす何らかの他の提示の結果であり得る。

ＤＲＢ１遺伝子産物に対する自己免疫応答における低減は、インビボで測定することもできるし、またはインビトロで測定してもよい。当業者は、かかるインビボまたはインビトロの測定に精通している。免疫応答は、例えば、免疫細胞の数および／または機能を評価する方法、四量体分析、ＥＬＩＳＰＯＴ、サイトカイン発現のフローサイトメトリーに基づく分析、サイトカイン分泌、サイトカイン発現プロファイリング、遺伝子発現プロファイリング、タンパク質発現プロファイリング、細胞表面マーカーの分析、免疫細胞受容体遺伝子使用のＰＣＲに基づく検知［T. Clay et al., "Assays for Monitoring Cellular Immune Response to Active Immunotherapy of Cancer" Clinical Cancer Research 7:1127-1135 (2001)を参照されたい］などを使用してモニタリングすることができる。免疫応答は、例えば、血漿または血清におけるタンパク質レベルを評価する方法、免疫細胞増殖および／または機能的アッセイなどを使用してモニタリングすることもできる。ＦｏｘＰ３の誘導を評価することにより、免疫寛容原性免疫応答をモニタリングすることもできる。臨床エンドポイント、臨床有効性、臨床症状、疾患バイオマーカーおよび／または臨床スコアを判定することにより、望まれない免疫応答の低減を評価することもできる。免疫寛容原性免疫応答は、阻害剤の存在または非存在を評価するための診断試験を用いて評価することもできる。

これらの方法において、対象由来の細胞は、採取され、改変され、次いで対象への将来の投与のために保管され得る。細胞は、有効量、例えば本明細書の他所に記載される有効量において投与され得る。組成物中に存在する発現細胞の量または剤形は、発現されるＤＲＢ１遺伝子産物の性質および量、達成しようとする治療的利益、ならびに他のかかるパラメータに従って異なってよい。細胞によって発現される改変されたＤＲＢ１ペプチドの最適な治療量を確立するためには、用量決定試験が実施され得る。細胞は、対象に投与した際にＤＲＢ１エピトープに対する免疫応答を有意に低減または排除するのに効果的な量において、改変されたＤＲＢ１遺伝子産物を発現すべきである。剤形は、種々の頻度において投与され得る。改変されたＤＲＢ１を発現する細胞の少なくとも１回の投与が、薬理学的に意義のある応答を発生させるために十分であり得る。代替的に、薬理学的に意義のある応答を確実にするために、改変されたＤＲＢ１を発現する細胞の少なくとも２回の投与、少なくとも３回の投与、または少なくとも４回以上の投与が用いられてもよい。

本明細書に記載される方法は、改変された細胞または細胞集団を、エクスビボで、細胞が改変された後、かつ対象への投与の前に増殖させることを更に含み得る。改変された細胞［例えば、改変された造血幹細胞（ＨＳＣ）］のエクスビボ増殖は、改変された細胞の効率的な生着、ならびにスクリーニングおよび臨床適用のための誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の使用を可能にする。よって、本開示は、自家ＨＳＣ、自家遺伝子改変ＨＳＣ、ＥＳ、およびｉＰＳＣ由来ＨＳＣの効率的な増殖のための組成物および方法を提供する。臍帯血増殖の方法論を用いてもよく、この方法論は、正常なドナーから得られた動員末梢血ＣＤ３４＋を使用し、造血成長因子を補充した無血清培地中のデルタ１を用いる。これらの組成物および方法は、改変された造血幹細胞／前駆細胞の生存および増殖を向上させるために、１つまたは複数の更なる試薬と組み合わせて使用してもよい。これらの組成物および方法は、修正されたｉＰＳＣに由来するＨＳＣを含む長期再増殖細胞の増殖の向上のために内皮細胞共培養を用いてもよい。

改変された自家ＨＳＣのエクスビボ増殖は、より多くの数の適切に改変された再増殖細胞の移植を可能にし、急速な再増殖を可能にすることにより、ＨＳＣベースの遺伝子療法の安全性および有効性を向上させ、インビボでの改変された細胞の優性を確実にする。

これらの方法において、分化を阻害する薬剤（例えば、Ｎｏｔｃｈリガンド）を、初期幹細胞／前駆細胞の増殖および生存を向上させる組成物および方法と組み合わせることにより、改善されたＮｏｔｃｈ媒介性エクスビボ増殖を達成することができる。臍帯血幹細胞／前駆細胞の向上した増殖は、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ１を、造血前駆細胞の増殖および自己再生を向上させるためにアリール炭化水素受容体阻害剤（ＳＲＩ）［Boitano et al., Science 329:1345-8 (2011)］またはＨｏｘＢ４［Watts et al., Blood 116:5859-66 (2010)およびZhang et al., PLoS Med 3:e173 (2006)］と組み合わせ、また、それらの生存を向上させるためにアンジオポエチン様５と組み合わせることにより、達成され得る。遺伝子療法の臨床適用のために必須なのは、改変された再増殖細胞を長期にわたって増殖させ、修正された細胞移植片の長寿命を保証する能力である。

改変された細胞の増殖を確認するために、共培養系においてＡｋｔ活性化内皮細胞を用いてもよい［Butler et al., Cell Stem Cell 6:251-64 (2011)を参照されたい］。遺伝子修正細胞の増殖は、造血前駆細胞におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の内皮細胞誘導性活性化に依存する。臨床適用に関する第２の重大な態様は、インビボでの適切な挙動および発癌能の欠如を確実にするための、誘導された細胞の、それらの正常な対応物と比較した遺伝的および後成的な忠実度である。重要なことに、増殖された臍帯血幹細胞／前駆細胞のゲノムワイド評価は、単離された初代細胞と比較して、トランスクリプトーム、クロマチン構造、およびＤＮＡメチロームの忠実度を呈する。

臍帯血増殖の方法論は、正常なドナーから得られた動員末梢血を使用し、造血成長因子を補充した無血清培地中のデルタ１を用い得る。確立されたインビトロアッセイ（免疫表現型検査、増殖など）を使用して最適化されたエクスビボ増殖条件、およびインビボ再増殖能力は、ＮＳＧマウスモデルを使用して評価され得る。初期幹細胞／前駆細胞の増殖および生存を向上させるために、ＳＲＩ（アリール炭化水素受容体阻害剤）、Ｈｏｘタンパク質、またはアンジオポエチンを含む組成物と組み合わせて、最適化された条件を使用してもよい。有望な組み合わせを前駆細胞インビトロアッセイおよび免疫不全マウスモデル（ＮＳＧマウス）において評価し、次いで、正常な個体に由来するＨＳＣ細胞の増殖から拡大して、ＲＡを有する対象に由来するＨＳＣ細胞の増殖に関して、これらの方法を評価してもよい。

増殖された細胞の、それらの正常な対応するＨＳＣに対する転写的、遺伝的、および後成的な忠実度は、生成された細胞の発癌能を評価するためのゲノムワイドアプローチを使用して評価され得る。インビボでの増殖後（注入後）、細胞を使用して、いずれかの影響されたクローンのインビボ増殖を向上させる機能的に有意な異常があるかどうかを判定し、それにより、稀な細胞の選択的な増殖および検知を可能にしてもよい。

ＲＡの発生前に発現細胞の予防的投与を開始してもよいし、または対象においてＲＡが発症した後に治療的投与を開始してもよい。初回投与が対象におけるＤＲＢ１自己免疫応答の低減をもたらした後、例えば、初回用量後に達成されたＲＡの抑制を維持するため、対象における望まれない免疫反応を防止するため、または、対象が、望まれない免疫応答もしくは望まれないレベルの免疫応答を経験するリスクのある対象になることを防止するために、「維持」用量を対象に投与してもよい。維持用量は、対象が受けた初回用量と同じ用量であってよい。代替的に、維持用量は、例えば、初回用量の約３／４、約２／３、約１／２、約１／３、約１／４、約１／８、約１／１０、約１／２０、約１／２５、約１／５０、約１／１００、約１／１，０００、約１／１０，０００、約１／１００，０００、または約１／１，０００，０００（重量／重量）である維持用量を含め、初回用量よりも低い用量であってもよい。

本開示の治療方法において、本明細書において提供される細胞および組成物は、ＲＡを処置する確立された手段と併せて使用され得る。ＲＡ処置プロトコールは、当技術分野において公知であり、例えば、arthritis.org/about-arthritis/types/rheumatoid-arthritis/treatment.phpにおいて大まかに説明されている。本明細書に記載される改変された細胞の投与は、確立されたＲＡ処置プロトコールの前、後、および／またはそれと同時に、および／またはそのバリエーションで実施してよい。例えば、本開示の方法は、確立されたＲＡ処置プロトコールの有効性（例えば、処置成功の程度および／または可能性）を増加させ、かつ／または関連するコストもしくは副作用を低減させ得る。本開示の方法は、確立されたＲＡ処置プロトコールの有益な改変、例えば、ＲＡ処置投与の頻度、持続期間、および／または用量の減少を可能にし得る。

本開示の改変された細胞は、適応性調節性Ｔ細胞を誘導することができる免疫抑制性化合物と組み合わされるか、またはそれと共に投与されてもよい。一実施形態において、免疫抑制性化合物は、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、および／もしくはラパマイシン、ならびに／またはバイオリムスＡ９、エベロリムス、タクロリムス、およびゾタロリムスを含むがこれらに限定されない他の「リムス」化合物、ならびに／またはこれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。

実施例１
エクスビボ遺伝子改変
ウイルスベクターを使用せずに行なわれ得るエクスビボ遺伝子改変戦略の例を提供する。電気穿孔およびＣａｓ９ヌクレアーゼを使用して、ヒトＲＡ患者から誘導されたＨＳＣにおいて、７１位にグルタミン酸残基を有するタンパク質（ＤＲＢ１^＊０４：０１^Ｋ７１Ｅ）を発現するようにＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子を改変するために、遺伝子材料を送達する。

自家細胞の使用は、臨床的に意義のあるレベルのＤＲＢ１タンパク質が、エクスビボで大きな細胞集団の増殖によってより容易に産生され、続いて患者に再導入され得るため、魅力的な療法である。ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子に関連する重度ＲＡを有する患者から誘導されたＨＳＣ中に存在するＤＲＢ１^＊０４対立遺伝子におけるコドン７１の改変は、対象のＨＳＣ細胞に、（ｉ）ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子の少なくとも一部分に対して相補的なガイドＲＮＡ配列、（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の少なくとも一部分を含む鋳型核酸を導入するために、電気穿孔を使用して行なわれ、ここで、ガイドＲＮＡ配列は、標的核酸配列（ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子の一部分）に結合し、Ｃａｓ９タンパク質は、標的核酸配列を切断し、鋳型核酸におけるＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の一部分は、標的核酸中に置換される。

様々な表現型の自家細胞を誘導し、遺伝子情報をゲノムに安定に導入するための、ウイルスを用いない方法の使用は魅力的である。これらの方法は、ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子を首尾よく改変して、対象のＲＡを防止または処置するために、効果的に使用され得る。

標的とされ得る配列の例としては、リジン残基をコードするコドン７１を含むＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子内の配列が挙げられる。

ＨＳＣ細胞のためのトランスフェクション方法としては、電気穿孔（ＡＭＡＸＡヌクレオフェクションシステム）および化学的トランスフェクション（この細胞型に対して最適化された市販の試薬を用いる）が使用される。両方法を使用して、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するプラスミドを細胞に導入する。トランスフェクション効率の概算を得るため、蛍光顕微鏡によって細胞を分析し、通常の光学顕微鏡によって細胞を観察して、トランスフェクト細胞の健康を判定する。ＨＳＣ細胞における高いトランスフェクション効率および細胞の健康の保全の望ましいバランスをもたらす任意のトランスフェクション方法を使用してよい。次いで、トランスフェクション方法を使用して、ガイドＲＮＡおよび遺伝子改変プラスミドをＨＳＣ細胞に導入する。

改変されたＤＲＢ１遺伝子を有するＨＳＣを造血細胞に分化させ、十分に確立されたプロトコールを使用して増殖させる。

改変されたＤＲＢ１遺伝子座におけるゲノムＤＮＡ、ならびにＨＳＣ細胞により合成されたｍＲＮＡおよび発現産物の特性評価を、電気穿孔の前および後に行なう。

改変されたＤＲＢ１^＊０４遺伝子産物の発現および分泌に関するトランスフェクション効率は、トランスフェクションの前および後の様々な細胞型において評価することができる。トランスフェクションの前および後に、細胞からゲノムＤＮＡを単離する。精製されたゲノムＤＮＡをＰＣＲのための鋳型として使用する。未改変の細胞ではＤＲＢ１特異的プライマーのみによる増幅のために、そして改変された細胞では改変特異的プライマーのみによる増幅のために、プライマーを設計する。ＲＴ－ＰＣＲは、正常な細胞および改変された細胞からのｍＲＮＡ ＤＢＲ１転写物を特異的に検知し、定量化することができる。処置された細胞の集団におけるＤＲＢ１^＊０４：０１遺伝子産物について、フローサイトメトリーに基づくアッセイを使用してもよい。

実施例２
ヒトにおける第ＶＩＩＩ因子遺伝子改変のためのプロトコール
血液試料の取得：血液増生内皮細胞（ＢＯＥＣ）におけるＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子の改変のためのプロトコールを、以下の実施例に記載する。まず、静脈切開術のための標準的な医学的ガイドラインに従い、静脈穿刺を行ない、抗凝固試薬を含む市販の医療用収集デバイスに収集することにより、５０～１００ｍＬの患者血液試料を得ることで、血液試料を得る。使用される抗凝固試薬は、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、および／またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。血液収集後、無菌技術に関する標準的な臨床的慣行を用いて、すべての工程を進める。

適切な細胞集団の血液試料からの単離：血液増生内皮細胞（ＢＯＥＣ）を単離し増殖させるための手順は、Ｈｅｂｂｅｌおよび共同研究者らによって詳細に説明されている［Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A. & Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest 105, 71-77 (2000)］。密度培地ベースの分離試薬を使用した分画遠心分離により、全血試料から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製する。かかる分離試薬の例としては、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ、およびＰｅｒｃｏｌｌが挙げられる。これらのＰＢＭＣから、ＢＯＥＣを含む複数の細胞集団を単離することができる。更なる細胞亜集団の濃縮手順を用いずに、ＰＢＭＣをＥＧＭ－２培地中に再懸濁し、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた６ウェルプレートの１つのウェルに入れる。この混合物を、５％のＣＯ２を含む加湿環境において、３７℃でインキュベートする。培養培地は毎日交換する。２４時間後、培地で洗浄することにより、未結合の細胞およびデブリを除去する。この手順により、約２０個の結合した内皮細胞と、１００～２００個の他の単核細胞が残る。これらの非内皮性単核細胞は、培養の初めの２～３週間以内に死ぬ。

標的細胞集団を増殖させるための細胞培養：培地は毎日交換するが継代は行なわない４週間にわたる培養下で、ＢＯＥＣ細胞を確立する。およそ１００倍の増殖後、４週間時点で第１の継代を行なう。次の工程では、細胞、および基質としてのコラーゲン－Ｉでコーティングされた組織培養プレートを継代するために、０．０２５％のトリプシンを使用する。この初めの４週間にわたる培養細胞の確立の後、４日後（３２日目）、またその４日後（３６日目）にＢＯＥＣを再び継代し、その後、細胞は、細胞数１００万以上になるはずである。

インビトロ遺伝子改変：ＢＯＥＣにおける遺伝子改変を行なうため、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、鋳型核酸と、ＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１^＊０４：０１におけるコドン７１を標的とするコード配列ＧＧＡＣＣＵＣＧＵＣＵＵＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号１）を含むｃｒＲＮＡをコードするガイドＲＮＡとをコードするベクターを、細胞１００万個当たり０．１～１０マイクログラムで細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションは、電気穿孔、リポソーム媒介性トランスフェクション、ポリカチオン媒介性トランスフェクション、トランスフェクションのための市販の専売試薬、または標準的なプロトコールを使用した他のトランスフェクション方法によって行なう。トランスフェクション後、上述のようにＢＯＥＣを３日間培養する。

遺伝子改変されたクローンの選択：限界段階希釈の方法を使用し、改変されたＢＯＥＣをクローンの継代培養物中に分配し、上述のように増殖させる。細胞を毎日検査して、どの継代培養物が単一クローンを含有するかを判定する。継代培養物１つ当たり＞１００細胞の密度まで継代培養物が増殖したら、細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁し、１／１０容量の細胞をコロニーＰＣＲに使用する。残りの９／１０の細胞は培養に戻す。生産的に改変されたＤＲＢ１遺伝子を検知するプライマーを使用し、各１／１０容量のコロニーを生産的な遺伝子改変についてＰＣＲによってスクリーニングする。生産的なＤＲＢ１遺伝子改変を呈するコロニーを更に培養して、細胞数を増加させる。コロニーのそれぞれは、有害なオフサイト突然変異の可能性についてスクリーニングすることにより、更なる培養のために選択され得る。最も少ない数のオフサイト突然変異を呈するコロニーが、更なる培養のために選択される。

馴化および／または増生による患者への再導入のための細胞の調製：細胞を患者に再導入する前に、ＢＯＥＣを培養下で増殖させて、細胞数を増加させる。

患者への遺伝子改変されたＢＯＥＣの注射：患者への注射のために選択されたＢＯＥＣを、患者の体重および年齢に適切な用量および濃度において、無菌食塩水中に再懸濁する。標準的な臨床的慣行を使用し、自家骨髄移植片として細胞試料の投与を行なう。

実施例３
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のためのガイド配列の設計および試験
本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のためのガイド配列を設計し、評価し、クローニングするために、ＣＲＩＳＰＯＲ（crispor.tefor.net）を使用した。ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ゲノム、およびＳｐＣａｓ ９に対して特異的なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を使用して（ガイドの２０塩基対配列には、ＮＧＧが続く必要がある）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４：０１の配列を分析した。５０超の特異性スコアを有するガイド配列は複数特定されたが、ＤＲＢ１^＊０４：０１の標的領域にわたったガイドは３つのみであった。１つのガイドは高いＧＣ含量を有したため除外したが、他の２つのガイド配列（１８５／ｒｅｖおよび２０８／ｆｗｄ）を更なる評価のために選択した：
ガイド１８５／ｒｅｖ：５’ｃｇｇｃｃｃｇｃｔｔｃｔｇｃｔｃｃａｇｇ ３’（配列番号２）
ガイド２０８／ｆｗｄ：５’ｃｃｔｇｇａｇｃａｇａａｇｃｇｇｇｃｃｇ ３’（配列番号３）

ガイド１８５／ｒｅｖは７０の特異性スコアを有し、予想されるオフターゲットは１４２であった。ガイド２０８／ｆｗｄは６８の特異性スコアを有し、予想されるオフターゲットは２５２であった。各ガイドをｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃５２９６１）にクローニングした。レンチウイルスｖ２ ＤＲＢ１^＊０４：０１ １８５ｒｅｖおよび２０８ｆｗｄプラスミド（それぞれ図１および２）を増殖させ、精製し、検証のためにシーケンシングした。

ＴｒａｎｓＩＴ－Ｌｅｎｔｉ－ＬＴ－１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）を使用してレンチウイルス粒子を調製した。簡潔に述べると、抗生物質を含まない１０ｍｌのＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳ中に、２９３ＴＮ細胞を２．５×１０^６で播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞のトランスフェクションを行なった（細胞が７０％コンフルエンスのとき）。プラスミドＤＮＡおよびＬＴ－１試薬を室温にし、ＯｐｔｉＭＥＭ培地を３７℃に温めた。１５μｌのＬＴ－１試薬を、別個の１．５ｍｌのエッペンドルフ管内の５００μｌのＯｐｔｉＭＥＭに滴加した。この管を混合し、５分間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭを使用し、５０μｌの最終容量において、２μｇのレンチベクターＤＮＡ、３μｇのｐｓＰＡＸ２ヘルパープラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）、１．５μｇのｐＭＤ２．Ｇヘルパープラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を含む１．５ｍｌのエッペンドルフ管内に、トランスフェクション反応物を準備した。ＤＮＡを含有する５０μｌをＬＴ－１管に滴加し、混合し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、２９３ＴＮ細胞を含んだ１０ｃｍディッシュに管の内容物を滴加した。プレートを振動させて混合し、二次的な格納容器において３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を撹乱することなく培地を変え、新鮮な培地に交換した。４日目に上清を採取し、０．５ｍｌのアリコートを－８０℃で保管した。

ポリブレンを使用し、ＤＲＢ１^＊０４：０１、^＊０１：０１、^＊０８：０１、または^＊０４：０２を発現するＴ２細胞にレンチウイルスを形質導入した。簡潔に述べると、２×１０^６個のＴ２細胞を６ウェルプレートにおける１ｍｌの培地中に播種した。２００μｌのウイルスを１２μｌの１００Ｘポリブレンと共にウェルに添加した。細胞を６～１０時間インキュベートし、次いで３ｍｌの完全培地を添加して、細胞の最終濃度を０．５×１０^６／ｍｌにした。翌日、１μｇ／ｍｌの最終濃度において培養物にピューロマイシンを添加した。抗生物質抵抗性細胞を増殖させ、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体で染色して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集および非相同末端結合修復に起因するＨＬＡ発現の喪失があるかを調べた。

ＨＬＡ－ＤＲ発現の喪失は、２０８／ｆｗｄまたは１８５／ｒｅｖレンチウイルスを形質導入したＴ２－ＤＲＢ１^＊０４：０１細胞において観察されたが、対照細胞株においては観察されなかった。形質導入しなかったＤＲＢ１^＊０４：０１細胞株は、９５％のＨＬＡ－ＤＲ発現から、２０８／ｆｗｄガイドまたは１８５／ｒｅｖガイドのレンチウイルス形質導入後に、それぞれ２０％または１２％まで下がった。Ｔ２－ＤＲＢ１^＊０４：０２およびＴ２－ＤＲＢ１^＊０８：０１を発現する細胞株は、ＨＬＡ－ＤＲ発現の喪失を示さず、試験されたガイドＲＮＡの特異性を示した。ＨＬＡ－ＤＲ発現の喪失は、Ｔ２－ＤＲＢ１^＊０１：０１細胞においても観察された（２０８／ｆｗｄまたは１８５／ｒｅｖについて、９４％から、それぞれ７１％または２３．５％）。ＤＲＢ１^＊０１：０１には、この領域において、ＤＲＢ１^＊０４：０１と比較して１つのヌクレオチドの差（７１位における）しかないため、このことは予想された。よって、ＤＲＢ１^＊０４：０１のために設計されたガイドＲＮＡは、ＤＲＢ１^＊０１：０１を標的とすることもできた。ＤＲＢ１^＊０１：０１対立遺伝子もＲＡ感受性に関連している。

フローサイトメトリーを使用して、ＨＬＡ－ＤＲ発現を喪失した細胞集団を分取した。ＤＲＢ１^＊０４：０１およびＤＲＢ１^＊０１：０１の両方について、この細胞集団からゲノムＤＮＡを調製し、シーケンシングした。遺伝子をフレームアウトさせ発現しないようにするヌクレオチドの欠失または挿入として、ＤＮＡレベルで発現の喪失を確認した。ＣＲＩＳＰＲレンチウイルスを受けたがＨＬＡ－ＤＲ発現の喪失を呈さなかったＤＲＢ１^＊０４：０２およびＤＲＢ１^＊０８：０１対照細胞株もシーケンシングした。ＤＮＡ配列における変化は見出されず、ガイドＲＮＡ配列が特異的であり、ＤＲＢ１^＊０４：０２またはＤＲＢ１^＊０８：０１のＣａｓ９編集を引き起こさなかったことが示された。

実施例４
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集後のＨＬＡ－ＤＲ発現
ヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ）を使用して、２０８／ｆｗｄガイドまたは１８５／ｒｅｖガイドＲＮＡおよびＣａｓ ９タンパク質を細胞株に導入した。２０８／ｆｗｄおよび１８５／ｒｅｖのための合成ガイドＲＮＡは、Ｓｙｎｔｈｅｇｏから購入した。各ガイドとＳｙｎｔｈｅｇｏ Ｃａｓ９－２ＮＬＳタンパク質を混合して、１：５．２５の比におけるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体を形成した。ＲＮＰ複合体をＴ２－ＤＲＢ１^＊０４：０１細胞株にヌクレオフェクトして、編集効率を評価した。非トランスフェクト細胞（図３Ａ）およびスクランブルｓｇＲＮＡ（図３Ｂ）を陰性対照として試験した。

２０８／ｆｗｄ：Ｃａｓ９ ＲＮＰ（図３Ｃ）または１８５／ｒｅｖ：Ｃａｓ９ ＲＮＰ（図３Ｄ）のいずれかを受けた細胞において、ＨＬＡ－ＤＲ発現の喪失が見られた。陰性対照ｓｇＲＮＡを受けた細胞は、ＨＬＡ－ＤＲ発現の喪失を示さなかった（図３Ｂ）。更に、ＤＲＢ１^＊０４：０２およびＤＲＢ１^＊０８：０１を発現するＴ２細胞株のヌクレオフェクションは、ＨＬＡ－ＤＲ発現の喪失を示さなかった。Ｔ２－ＤＲＢ１^＊０１：０１細胞は、ＨＬＡ－ＤＲ発現のいくらかの喪失を示したが、レンチウイルス形質導入で見られたものより程度は低かった。

実施例５
トランスジェニックマウス
本発明者らはまた、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４：０１トランスジェニックマウスにおける関節炎誘発性ペプチドに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４：０１^Ｋ７１Ｅトランスジェニックマウスに対して比較するために、ヒトＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４：０１^Ｋ７１Ｅのみを発現するトランスジェニックマウスを開発した。これらのマウスは、ＤＲβ１^＊０４：０１を発現する個体におけるＲＡに対する増加した感受性が、天然のペプチドの結合に干渉することによりシトルリン化されたペプチドおよびコラーゲンの結合を促進するＫ^７１の存在に起因することを示すために使用される。よって、ＤＲβ１^＊０４：０１^Ｋ７１Ｅを発現するトランスジェニックマウスは、シトルリン化されたペプチドおよびコラーゲンに対する強力なＴ細胞応答を生じない。このマウスは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４：０１マウスに移植されたＤＲＢ１^＊０４：０１^Ｋ７１Ｅマウス由来の幹細胞が移植片対宿主病を引き起こさないことも示す。

本出願全体にわたり、様々な公開文献が参照されている。これらの公開文献の開示内容は、これにより、法律が許す程度まで、その全体が参照により本出願に組み込まれる。

前述の開示内容は、当業者が本発明を実践することを可能にするのに十分である。記載された実施形態は、本発明のある特定の態様の例示として意図されるものであり、機能的に均等なあらゆるコンストラクトが本発明の範囲内であるため、本発明の範囲は、記載されるコンストラクトに限定されないものとする。

Claims (45)

1. 改変された造血細胞を作製する方法であって、
   ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲＢ１遺伝子座内の標的核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ分子を細胞に導入することと、
   Ｃａｓ９タンパク質を細胞に導入することと、
   ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の少なくとも一部分を含む鋳型核酸を細胞に導入することと
   を含み、
   ガイドＲＮＡ配列が、標的核酸配列に結合し、Ｃａｓ９タンパク質が、標的核酸配列を切断し、
   ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の一部分が、標的核酸中に置換される、方法。
2. 細胞が、真核細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 細胞が、ヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
4. 細胞が、初代血液細胞である、請求項１に記載の方法。
5. 細胞が、血液細胞の集団である、請求項１に記載の方法。
6. 細胞が、造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
7. 細胞が、循環血液細胞、動員血液細胞、骨髄細胞、骨髄系前駆細胞、複能性前駆細胞、および系列限定前駆細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
8. ガイドＲＮＡ分子が、ＨＬＡ ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子における標的ドメインに対して相補的である標的化ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
9. ガイドＲＮＡ配列が、約１０から約２５０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
10. ガイドＲＮＡが、プソイドウリジン、５－メチルシトシン、２－チオウリジン、５－メチルウリジン－５’－三リン酸、４－チオウリジン－５’－三リン酸、５，６－ジヒドロウリジン－５’－三リン酸、および５－アザウリジン－５’－三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含む、請求項１に記載の方法。
11. ガイドＲＮＡが、ＧＧＡＣＣＵＣＧＵＣＵＵＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号１）、ＣＧＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧ（配列番号２）、およびＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＣＧ（配列番号３）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
12. ガイドＲＮＡ配列が、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項１に記載の方法。
13. ｃｒＲＮＡが、ヌクレオチド配列ＧＧＡＣＣＵＣＧＵＣＵＵＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号１）を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 鋳型核酸が、Ｇで始まるヌクレオチド配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前に存在する、請求項１２に記載の方法。
15. 鋳型核酸が、ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
16. 鋳型核酸が、コドン７１においてＡからＴの点突然変異を含むＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４：０１対立遺伝子のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
17. ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座中に置換された鋳型核酸が、ＤＲＢ１^＊０４：０１遺伝子産物の７１位におけるグルタミン酸をコードする、請求項１に記載の方法。
18. 鋳型核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項１に記載の方法。
19. ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項１８に記載の方法。
20. ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項１８に記載の方法。
21. ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾および３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項１８に記載の方法。
22. ガイドＲＮＡ分子およびＣａｓ９ポリペプチドが、細胞に、予め形成されたリボヌクレオチド複合体として導入される、請求項１に記載の方法。
23. Ｃａｓ９分子が、細胞に、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸として導入される、請求項１に記載の方法。
24. ガイドＲＮＡが、細胞に、ガイドＲＮＡをコードする核酸として導入され、Ｃａｓ９タンパク質が、細胞に、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸として導入され、細胞が、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を発現する、請求項１に記載の方法。
25. ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質、および鋳型核酸が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または組込み欠損レンチウイルス（ＩＬＤＶ）中で細胞に導入される、請求項２４に記載の方法。
26. 導入する工程の後に細胞をエクスビボで増殖させて、標的核酸中に置換されたＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子を含む単離された細胞集団を形成することを更に含む、請求項１に記載の方法。
27. 細胞集団を自家骨髄移植片として対象に投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
28. 請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法によって産生された、単離されたヒト血液細胞。
29. 請求項２８に記載の単離されたヒト血液細胞を含む組成物。
30. 対象の関節リウマチを処置または防止する方法であって、請求項２８に記載の細胞または請求項２９に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
31. 約１７ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドのＨＬＡ－ＤＲＢ１特異的プロトスペーサードメインを含む、単離されたｃｒＲＮＡ。
32. 単離されたｃｒＲＮＡが、約１２ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドを含むｔｒａｃｒＲＮＡ結合性ドメインに連結している、請求項３４に記載の単離されたｃｒＲＮＡ。
33. ｃｒＲＮＡが、リボース修飾、末端基修飾、およびヌクレオチド間結合修飾から選択される修飾を有する化学修飾ヌクレオチドから選択される少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項３４に記載の単離されたｃｒＲＮＡ。
34. ｃｒＲＮＡが、プソイドウリジン、５－メチルシトシン、２－チオウリジン、５－メチルウリジン－５’－三リン酸、４－チオウリジン－５’－三リン酸、５，６－ジヒドロウリジン－５’－三リン酸、および５－アザウリジン－５’－三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含む、請求項３４に記載の単離されたｃｒＲＮＡ。
35. ｃｒＲＮＡが、ヌクレオチド配列ＧＧＡＣＣＵＣＧＵＣＵＵＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号１）を含む、請求項３４に記載の単離されたｃｒＲＮＡ。
36. Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子に対するＣａｓ９エンドヌクレアーゼの結合を媒介するガイドＲＮＡとを含む、ベクター。
37. ガイドＲＮＡ配列が、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ融合体をコードする、請求項３６に記載のベクター。
38. ｃｒＲＮＡが、請求項３１から３５のいずれか一項に記載のｃｒＲＮＡである、請求項３７に記載のベクター。
39. アデノウイルスベクター、組込み欠損性レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）、および組込み欠損性泡沫状ウイルスベクター（ＩＤＦＶ）からなる群から選択される、請求項３８に記載のベクター。
40. 対象の関節リウマチを処置または防止する方法であって、
    ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子内の標的核酸配列に対して相補的なガイドＲＮＡ配列を対象の細胞に導入することと、
    Ｃａｓ９タンパク質を細胞に導入することと、
    ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の少なくとも一部分を含む鋳型核酸を細胞に導入することと
    を含み、
    ガイドＲＮＡ配列が、標的核酸配列に結合し、Ｃａｓ９タンパク質が、標的核酸配列を切断し、
    ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の一部分が、標的核酸中に置換される、方法。
41. ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ ９タンパク質、および鋳型核酸が、ウイルス形質導入によって細胞に導入される、請求項４０に記載の方法。
42. ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ ９タンパク質、および鋳型核酸が、対象から単離されている細胞にエクスビボで導入される、請求項４０に記載の方法。
43. ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の一部分が標的核酸中に置換されている細胞が、自家骨髄移植片として対象に投与される、請求項４０に記載の方法。
44. 関節リウマチの処置または防止のための薬物の製造における、請求項２８に記載の細胞または請求項２９に記載の組成物の使用。
45. 関節リウマチの処置または防止のための、請求項２８に記載の細胞または請求項２９に記載の組成物の使用。