JP2024073614A - プラスミドを用いないａａｖベクター産生細胞株 - Google Patents

Abstract

【課題】アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ１Ａが構成的に発現されるパッケージング細胞株を提供する。【解決手段】この細胞株は、組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子も含む。本パッケージング細胞株は、ヘルパーウイルス機能、例えば、アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ４、Ｅ２Ａ及び／又はＶＡ ＲＮＡが、例えば、Ａｄ・ＡＡＶハイブリッドウイルスなどのウイルス、ベクター又はプラスミドを用いた細胞の形質導入によって供給されるまで、発現されたＲｅｐタンパク質をほとんど示さない乃至全く示さない。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、Ｅ１Ａがプロモーターを活性化できず、ｒｅｐ遺伝子の実質的な転写を活性化できず、ひいては、Ｒｅｐタンパク質を産生できない程十分離れたｒｅｐコード配列の上流（５’）に配置することができる。【選択図】図１

Description

本発明は、プラスミドを用いないＡＡＶベクター産生細胞株に関する。

[0002]現在、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、Ｈｅｌａ産生細胞株、ＢＨＫ２１プラットフォームのプラスミド一過性トランスフェクションなどのｒＡＡＶベクターを産生するために使用されるいくつかのｒＡＡＶ産生系、及びバキュロウイルスベースの産生系が存在する。これらの方法はそれぞれ、強みと弱みがある。

[0003]増殖の容易さ及び懸濁液における増殖に対する適合性を含む、ＨＥＫ２９３細胞などのＥ１ａ発現細胞の特定の特徴は、ｒＡＡＶの産生に対してＥ１ａ発現細胞を魅力的なものにする。ＨＥＫ２９３細胞などの細胞において安定で継代可能なＡＡＶパッケージング細胞株を作り出す努力は、Ｅ１Ａによって活性化されるＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が原因となる細胞毒性によって妨害されてきた。

[0004]本明細書中で開示されている本発明は、Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子をヒト細胞株、ＨＥＫ２９３Ｆに首尾よく導入した。この細胞系によってもたらされるｒＡＡＶ粒子収率は、現行のトリプルプラスミドトランスフェクション法を用いて得られる収率よりも大きい可能性がある。さらに、本細胞は、トランスフェクション試薬又はｒＤＮＡによる汚染の可能性が低減されたｒＡＡＶベクター粒子を産生し、一過性トランスフェクション法に必須のｒＤＮＡのために必要とされるコストが削減され、さらに本細胞は、トリプルトランスフェクション法よりも堅牢で、スケーラブルで、任意のＡＡＶ血清型に導入可能な、ＡＡＶベクター粒子産生プロセスであるプラットフォームをもたらす。

[0005]アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ１が構成的に発現される安定なパッケージング細胞株が本明細書中で開示され、この細胞株は、組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子も含むが、ヘルパーウイルス機能、例えば、アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ４、Ｅ２Ａ及び／又はＶＡ ＲＮＡがベクター又はＡｄ・ＡＡＶハイブリッドウイルスなどのウイルスを用いた細胞の形質導入によって供給されるまで、Ｒｅｐタンパク質の発現がほとんどない乃至全くない。一実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐの発現を駆動するプロモーターは、Ｅ１がプロモーターを活性化できず、ｒｅｐの実質的な転写、ひいてはＲｅｐタンパク質の実質的な翻訳を活性化できない程十分に離れたｒｅｐコード配列の上流に配置される。ヘルパーウイルス機能、例えば、Ｅ２Ａ、Ｅ４及び／又はＶＡのこれらのパッケージング細胞への導入が、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子転写及びそれに続くＲｅｐタンパク質発現を駆動又は刺激することができる。

[0006]本発明によると、アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ１Ａタンパク質を発現する哺乳動物細胞株が提供され、この細胞株中では、プロモーターと機能可能に連結されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐ遺伝子が組み込まれ、核酸スペーサーがｒｅｐ遺伝子とプロモーターとの間に配置され、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子も組み込まれる。

[0007]さまざまな実施形態において、本発明の細胞株は、細胞株中でＥ１Ａタンパク質を発現しながら、少なくとも約５継代、少なくとも約１０継代、少なくとも約１５継代、又は少なくとも約２０継代、継代可能である。

[0008]さまざまな実施形態において、本発明の細胞株は、細胞株の実質的な死滅なしに少なくとも約５継代、少なくとも約１０継代、少なくとも約１５継代、又は少なくとも約２０継代、継代可能である。

[0009]さまざまな実施形態において、本発明の細胞株中でＲｅｐタンパク質が、増殖培地において培養される場合に細胞株の実質的な死滅を引き起こさないレベルでｒｅｐ遺伝子から発現される。

[0010]さまざまな実施形態において、本発明の細胞株中におけるｒｅｐ遺伝子からのＲｅｐタンパク質の発現が、ヘルパーウイルス機能の存在下において増加する。

[0011]さまざまな実施形態において、本発明の細胞株中でプロモーターが、ヘルパーウイルス機能の存在下においてのみｒｅｐ遺伝子の発現を駆動する。

[0012]アデノウイルス５（Ａｄ５）のＥ４、Ｅ２Ａ及びＶＡのそれぞれが、例示されるヘルパーウイルス機能であるが、他のＡｄ型及び／又は他のヘルパーウイルス機能も適合する。例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びハイブリッドウイルスなどの他のウイルスを使用することができる。例えば、Ａｄ・ＡＡＶハイブリッドウイルスがヘルパーウイルス機能を供給するために使用されてもよく、さらに任意選択でＩＴＲが両側に位置する目的の導入遺伝子も供給する。

[0013]さまざまな実施形態において、ヘルパーウイルス機能が、ヘルパーウイルス機能を供給する１つ以上のウイルス、ベクター若しくはプラスミドを含むか、又はヘルパーウイルス機能を供給する１つ以上のウイルス、ベクター若しくはプラスミドによって供給される。

[0014]さまざまな実施形態において、ヘルパーウイルス機能が、アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つを含む。

[0015]特定の態様において、Ａｄ Ｅ２Ａ、Ａｄ Ｅ４及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つが、Ａｄ Ｅ２Ａ、Ａｄ Ｅ４及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド配列からの転写によって発現される。

[0016]さまざまな態様において、Ａｄ Ｅ２Ａ、Ａｄ Ｅ４及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド配列が、１つ以上のベクターを構成する。

[0017]さまざまな態様において、Ａｄ Ｅ２Ａ、Ａｄ Ｅ４及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド配列が、１つ以上のプラスミドを構成する。

[0018]さまざまな態様において、ヘルパーウイルス機能が、１つ以上のウイルス、ウイルスベクター、又はプラスミドによって供給される。

[0019]さまざまな態様において、ヘルパーウイルス機能が、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つを含むハイブリッドＡｄ・ＡＡＶウイルスによって供給される。

[0020]さまざまな態様において、ハイブリッドＡｄ・ＡＡＶウイルスが、任意選択でＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する、異種核酸配列をさらに含む。

[0021]さまざまな実施形態において、ｒＡＡＶ産生細胞株を形成するために選択される親クローンは、シャトルベクターとしてレンチウイルスを使用してＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を挿入することよってＨＥＫ２９３Ｆ細胞（無血清の浮遊培養に適合したＨＥＫ２９３細胞）から作りかえられる。本発明のヒト細胞株は、Ａｄ Ｅ１遺伝子及びＥ１ａタンパク質の発現がある状態でも、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が少ない又は検出できないため、複数の継代にわたって生存可能である。

[0022]一実施形態において、これらの細胞株からのｒＡＡＶ粒子産生は、Ａｄ・ＡＡＶハイブリッドウイルス（例えば、Ｅ１／Ｅ３遺伝子が欠失したアデノウイルス５及び目的の導入遺伝子に隣接するＡＡＶ ＩＴＲなどのＡＡＶ配列から構成されるハイブリッドウイルス）による単一の形質導入によって誘発される。本発明の細胞は、例えば、Ａｄ・ＡＡＶハイブリッドウイルスにより形質導入される（又は感染させられる）と、それらの細胞は、効果的に「産生」細胞になり、ｒＡＡＶベクター粒子を産生して、最終的にそのプロセスにおいて死滅する。

[0023]一実施形態において、ＡＡＶ ｐ５プロモーターなどの構成型プロモーターの減衰によってＲｅｐタンパク質がほとんど発現しないか又は全く発現しないようにされる。プロモーター活性の減衰が、発現されたＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が原因となる細胞毒性を回避するか、又は最小限にする。

[0024]特定の実施形態において、機能可能に連結されるか又は本発明のパッケージング細胞においてＡＡＶ ｒｅｐの発現を駆動するプロモーターは、核酸スペーサーにより、Ｅ１Ａがプロモーターを活性化できず、ｒｅｐの実質的な転写、ひいては、Ｒｅｐタンパク質の実質的な翻訳を駆動できない程十分に離れたｒｅｐコード配列の上流に配置される。

[0025]一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨＥＫ２９３バックグラウンドにＲｅｐを有し、アデノウイルスＥ１Ａの構成的発現があるにもかかわらず、実質的なＲｅｐ毒性が回避される。

[0026]一実施形態において、ｐ５プロモーターは、Ｅ１ａがｐ５プロモーターを活性化できず、ｒｅｐの実質的な転写を駆動できない程十分に離れたｒｅｐコード配列の上流（５’）に配置される。アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡの、Ａｄ・ＡＡＶハイブリッドウイルス又はその他のウイルス、ベクター及び／若しくはプラスミドによるこれらの細胞への導入は、ｒｅｐ遺伝子発現及びそれに続くＲｅｐタンパク質の翻訳を駆動することができる。

[0027]さまざまな実施形態において、プロモーターが、構成的活性化型プロモーターである。

[0028]さまざまな実施形態において、プロモーターが、非誘導性プロモーターである。

[0029]さまざまな実施形態において、プロモーターが、配列番号２の配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

[0030]さまざまな実施形態において、プロモーターが、ＡＡＶ１ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ３ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ４ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ５ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ６ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ７ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ８ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ９ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ１０ ｐ５プロモーター、又はＡＡＶ１１ ｐ５プロモーターと少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

[0031]さまざまな実施形態において、ｒｅｐ遺伝子が、ＡＡＶ１ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ３ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ４ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ５ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ６ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ７ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ８ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ９ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ１０ Ｒｅｐタンパク質、又はＡＡＶ１１ Ｒｅｐタンパク質をコードする。

[0032]さまざまな実施形態において、ｃａｐ遺伝子が、プロモーターに機能可能に連結される。

[0033]特定の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子が、細胞株の染色体の核酸にタンデムに組み込まれる。

[0034]特定の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐ遺伝子と機能可能に連結されたプロモーターとの間にスペーサーが存在することを除いて、本質的に天然のＡＡＶゲノム中のとおりに配置される。ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子がタンデムな配置で配置されるそのような例となる配置が図２に示されている。

[0035]特定の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が、本質的に天然のＡＡＶゲノム中のとおりに配置されない。例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が、タンデムな配置で配置される必要はなく、互いに離れていてもよい。

[0036]特定の実施形態において、Ｒｅｐタンパク質が、ｒｅｐ遺伝子とプロモーターとの間に配置されている核酸スペーサーの非存在下においてよりも少なくとも５倍低いレベルで、又はｒｅｐ遺伝子とプロモーターとの間に配置されている核酸スペーサーの非存在下においてよりも少なくとも１０倍低いレベルで、又はｒｅｐ遺伝子とプロモーターとの間に配置されている核酸スペーサーの非存在下においてよりも少なくとも１５倍低いレベルで、又はｒｅｐ遺伝子とプロモーターとの間に配置されている核酸スペーサーの非存在下においてよりも少なくとも２０倍低いレベルで、又はｒｅｐ遺伝子とプロモーターとの間に配置されている核酸スペーサーの非存在下においてよりも少なくとも２５倍低いレベルで、又はｒｅｐ遺伝子とプロモーターとの間に配置されている核酸スペーサーの非存在下においてよりも２５～１００倍低いレベルで、又はｒｅｐ遺伝子とプロモーターとの間に配置されている核酸スペーサーの非存在下においてよりも５０～１，０００倍低いレベルで、ｒｅｐ遺伝子から発現される。

[0037]特定の実施形態において、本発明の細胞株が、任意選択でＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する、異種核酸配列をさらに含む。

[0038]特定の態様において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ－３Ｂ ＡＡＶ血清型又はそれらの組み合わせのいずれかのうちの１つ以上のＩＴＲを含む。

[0039]特定の実施形態において、本発明の細胞株は、アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ１Ａタンパク質を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）パッケージング哺乳動物細胞株であって、本細胞株は、約１７００～約１８００ヌクレオチドの核酸スペーサーがｒｅｐ遺伝子とｐ５プロモーターとの間に配置された、ＡＡＶ ｐ５プロモーターと機能可能に連結された組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と、組み込まれたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子とを含み、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡによって供給されるヘルパーウイルス機能の存在下においてのみＲｅｐタンパク質がｒｅｐ ｒｅｐ遺伝子から発現される。

[0040]特定の実施形態において、発明の細胞クローンが、シャトルベクターとしてレンチウイルスを使用して所望の／選択された血清型のそれぞれのＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子をＨＥＫ２９３Ｆ細胞ゲノムに挿入することによってＨＥＫ２９３Ｆ細胞から作りかえられる。ヒト細胞の翻訳後修飾を含む、ヒト細胞のプロセスを有するＨＥＫ２９３Ｆ細胞などのヒト細胞において組み換えＡＡＶウイルス粒子を産生するのが有利であり、それによって最終製品の安全性及び生物活性が向上する。

[0041]本発明の魅力の１つは、これらのクローンからのｒＡＡＶ産生が、例えば、（Ｅ１／Ｅ３遺伝子が除去された）アデノウイルス５及びＡＡＶの組み換えハイブリッドウイルス（ハイブリッドＡｄ・ＡＡＶウイルス）による単一の形質導入によって誘発することができることであり、このハイブリッドウイルスは、ヘルパー機能（Ａｄ５由来のＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ）並びにＡＡＶ ＩＴＲが両側に位置する目的の遺伝子（異種核酸）を供給して、異種核酸配列を含む組み換えＡＡＶゲノムのｒＡＡＶ粒子へのパッケージングを可能にする。

[0042]したがって、ＡＡＶベクターパッケージング系も本明細書中で開示される。一実施形態において、ＡＡＶベクターパッケージング系は、本明細書中に記載されている哺乳動物細胞株と、ヘルパーウイルス機能及び任意選択でＡＡＶベクターゲノムを含む、少なくとも１つのウイルス、ベクター又はプラスミドとを含む。

[0043]さまざまな実施形態において、本発明のパッケージング系では、少なくとも１つのウイルスが、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、任意選択でＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する、異種核酸配列とを含む、アデノウイルス・ＡＡＶハイブリッドを含む。

[0044]特定の態様において、少なくとも１つのウイルスが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はポックスウイルスを含む。

[0045]特定の実施形態において、少なくとも１つのベクターが、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、任意選択でＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する、異種核酸配列とを含み、（ａ）のポリヌクレオチド配列及び（ｂ）の異種核酸配列が、同じベクター中にあるか、又は（ａ）のポリヌクレオチド配列及び（ｂ）の異種核酸配列が、別個のベクター中にある。

[0046]特定の態様において、少なくともの１つのベクターが、少なくとも１つのウイルスベクターを含む。

[0047]特定の実施形態において、少なくとも１つのプラスミドが、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、任意選択でＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する、異種核酸配列とを含み、（ａ）のポリヌクレオチド配列及び（ｂ）の異種核酸配列が、同じプラスミド中にあるか、又は（ａ）のポリヌクレオチド配列及び（ｂ）の異種核酸配列が、別個のプラスミド中にある。

[0048]特定の実施形態において、ＡＡＶベクターゲノムが、異種核酸配列を含み、異種核酸配列は、任意選択でＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する。

[0049]特定の実施形態において、異種核酸配列は、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する。

[0050]特定の実施形態において、ＡＡＶベクターゲノム又は異種核酸配列は、ウイルス、ベクター又はプラスミドを構成する。

[0051]特定の実施形態において、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が、ウイルス、ベクター又はプラスミドによって細胞株に導入されたか、又は導入される。

[0052]特定の態様において、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が、レンチウイルスベクターによって細胞株に導入されたか、又は導入される。

[0053]特定の実施形態において、ウイルス、ベクター又はプラスミドは、Ａｄ Ｅ１Ａ及び／又はＥ３タンパク質をコードする遺伝子が欠如している。

[0054]特定の実施形態において、細胞株が、ＨｅＬａ細胞株又はＡ５４９細胞株ではない。

[0055]特定の実施形態において、細胞株が、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞を含む。

[0056]特定の実施形態において、細胞株が、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｆ細胞を含む。

[0057]特定の実施形態において、細胞株が、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現しない。

[0058]特定の実施形態において、細胞株が、懸濁細胞株又は接着細胞株である。

[0059]特定の実施形態において、細胞株が、少なくとも約１×１０^６、少なくとも約５×１０^６、少なくとも約１×１０^７又は少なくとも約２×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度で培養することができる。

[0060]特定の実施形態において、細胞株が、約１×１０^６～５×１０^６、約５×１０^６～１×１０^７、又は約１×１０^７～２×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度で培養することができる。

[0061]特定の実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐの発現が、ＡＡＶ ｐ４０プロモーターによって駆動される。

[0062]特定の実施形態において、細胞株においてＥ１Ａ、ｒｅｐ及び／若しくはｃａｐ遺伝子又はタンパク質発現を維持することが、選択マーカーの発現又は選択圧を必要としない。

[0063]特定の態様において、選択マーカーが、抗生剤耐性遺伝子を含み、選択圧が、薬物又は抗生剤を含む。

[0064]特定の実施形態において、Ａｄ Ｅ１Ａ及び／又はｒｅｐ遺伝子をコードする遺伝子が、ｌｏｘ Ｐ部位が両側に位置する転写終結配列を有するイントロンによって妨害されない。

[0065]特定の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子の発現が、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約５，０００ヌクレオチド未満５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される。

[0066]特定の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子の発現が、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約２５～５，０００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される。

[0067]特定の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子の発現が、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約２５０～２，５００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される。

[0068]特定の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子の発現が、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約５００～２，０００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される。

[0069]特定の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子の発現が、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約１，０００～１，９００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される。

[0070]特定の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子が、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの少なくとも約１，５００～１，９００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される。

[0071]特定の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子の発現が、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの少なくとも約１，６００～１，８００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される。

[0072]特定の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子の発現が、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの少なくとも約１，７００～１，８００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される。

[0073]特定の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子の発現が、ＡＡＶ ｐ５プロモーターの３’末端とｒｅｐ遺伝子開始コドンの５’末端との間に位置するスペーサー配列が存在するＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動され、スペーサー配列が、約２５０～約５，０００ヌクレオチドの長さを有する。

[0074]本発明はまた、培養若しくは増殖培地又は保管に適した培地中の細胞株及びパッケージング系を提供する。

[0075]特定の実施形態において、細胞株は、細胞生存性の長期保管及び保存に適した培地中にある。

[0076]特定の態様において、細胞株は、０℃以下で、－３０℃以下で、－８０℃以下で、又は－１６０℃以下での長期保管に適した培地中にある。

[0077]本明細書中に記載されている発明の細胞株を作製する方法も本明細書中で開示される。一実施形態において、方法は、本明細書中に記載されるとおり遺伝子の導入並びに遺伝子及び／又はタンパク質の発現を可能にする条件下において哺乳動物細胞にトランスフェクションするステップを含む。特定の態様において、哺乳動物細胞は、Ａｄ Ｅ１Ａを発現し、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子でトランスフェクションされ、ｒｅｐ遺伝子が、プロモーターに機能可能に連結され、スペーサー配列がｒｅｐ遺伝子と機能可能に連結されたプロモーターとの間に配置される。トランスフェクションされた哺乳動物細胞が、組み込まれたｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子に関して選択される。

[0078]ＡＡＶ粒子を作製する方法が本明細書中でさらに開示される。そのようなＡＡＶ粒子は、ＡＡＶベクター粒子並びに空のＡＡＶ粒子を含む。

[0079]一実施形態において、ｒＡＡＶベクター粒子を作製する方法が、本明細書中に記載されている細胞株を、（ａ）ウイルス、ベクター又は喘息が、ＡＡＶ ＩＴＲが５’及び／又は３’末端の両側に位置する異種核酸配列を含むｒＡＡＶベクターゲノムと、（ｂ）ヘルパーウイルス機能とを含む１つ以上のウイルス、ベクター又はプラスミドを用いてトランスフェクションし、それによって、異種核酸配列を含むＡＡＶベクターゲノムとヘルパーウイルス機能とを有するトランスフェクション細胞を作製するステップ、並びにｒＡＡＶベクター粒子の産生を可能にする条件下においてトランスフェクション細胞を培養するステップを含む。

[0080]特定の態様において、ｒＡＡＶベクター粒子を作製する方法では、（ａ）のＡＡＶベクターゲノム及び（ｂ）のヘルパーウイルス機能が、単一のウイルス、ベクター又はプラスミドによって供給される。

[0081]別の特定の態様において、ｒＡＡＶベクター粒子を作製する方法では、（ａ）のＡＡＶベクターゲノム及び（ｂ）のヘルパーウイルス機能が、２つ以上のウイルス、ベクター又はプラスミドによって供給される。

[0082]別の実施形態において、ｒＡＡＶベクター粒子を作製する方法は、Ｅ１Ａを発現し、組み込まれたｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を有し、ＡＡＶ ＩＴＲが５’及び／又は３’末端の両側に位置する異種核酸配列を含むＡＡＶベクターゲノムを含む本発明の細胞株を、Ａｄ Ｅ２Ａ、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むウイルス、ベクター又はプラスミドを用いてトランスフェクションし、それによって、トランスフェクション細胞を作製するステップ、並びにｒＡＡＶベクター粒子の産生を可能にする条件下においてトランスフェクション細胞を培養するステップを含む。

[0083]本明細書中に記載されるとおり、本発明の細胞株及び方法によって作製されるＡＡＶ粒子は、空のＡＡＶ粒子を含む。そのような空のＡＡＶ粒子は、完全なＡＡＶベクターゲノム及び異種核酸配列がない。一実施形態において、空のＡＡＶ粒子は、単にＡＡＶベクターゲノム及び／又は異種核酸配列を排除することによって作製され、Ｅ１Ａを発現し、組み込まれたｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を有する細胞株は、ヘルパーウイルス機能が供給されると、完全なＡＡＶベクターゲノム及び異種核酸配列がないＡＡＶ粒子を構築することになる。そのような空のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ中和抗体を吸収するデコイとして有用であり、それによって、遺伝子療法用のｒＡＡＶベクターが投与される前、それと同時又はその後、ＡＡＶ中和抗体を持つようになったか又は持つようになるリスクがある患者の処置を可能にする。産生される空のＡＡＶ粒子の量は、異種核酸配列を有するＡＡＶベクターゲノムを有するｒＡＡＶベクター粒子の量と同等である場合もある。

[0084]したがって、本発明は、空のＡＡＶ粒子を作製する方法を提供する。

[0085]一実施形態において、空のＡＡＶ粒子を作製する方法は、（ａ）本発明の細胞株を、ヘルパーウイルス機能を含む１つ以上のウイルス、ベクター又はプラスミドを用いてトランスフェクションし、それによって、ヘルパーウイルス機能を有するトランスフェクション細胞を作製するステップ、及び（ｂ）空のＡＡＶ粒子の産生を可能にする条件下においてトランスフェクション細胞を培養するステップを含む。

[0086]ｒＡＡＶベクター粒子及び空のＡＡＶ粒子を作製する方法の特定の実施形態において、トランスフェクション細胞が、約１×１０^１０～約５×１０^１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの収率でｒＡＡＶベクター粒子を産生するか、又は約１×１０^１０～約５×１０^１２粒子／ｍＬの収率で空のＡＡＶ粒子を産生し、トランスフェクション細胞が、約５×１０^１０～約３×１０^１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの収率でＡＡＶベクター粒子を産生するか、又は約５×１０^１０～約３×１０^１２粒子／ｍＬの収率で空のＡＡＶ粒子を産生し、トランスフェクション細胞が、約１×１０^１１～約２×１０^１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの収率でｒＡＡＶベクター粒子を産生するか、又は約１×１０^１１～約２×１０^１２粒子／ｍＬの収率で空のＡＡＶ粒子を産生する。

[0087]ｒＡＡＶベクター粒子及び空のＡＡＶ粒子を作製する方法の特定の実施形態において、本方法が、細胞及び／又はｒＡＡＶベクター粒子若しくは空のＡＡＶ粒子を含む細胞培養培地を回収するステップを含む。

[0088]ｒＡＡＶベクター粒子及び空のＡＡＶ粒子を作製する方法の特定の実施形態において、本方法が、ｒＡＡＶベクター粒子又は空のＡＡＶ粒子を回収するステップ、単離するステップ、又は精製するステップを含む。

[0089]本明細書における異種核酸配列（複数可）としては、治療用タンパク質（複数可）又は阻害核酸配列（複数可）をコードする核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。

[0090]一実施形態において、治療用タンパク質（複数可）が、血液凝固因子又は免疫グロブリン配列を含む。

[0091]一実施形態において、阻害核酸配列が、低分子（ｓｍａｌｌ若しくはｓｈｏｒｔ）ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子（ｓｍａｌｌ若しくはｓｈｏｒｔ）干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡを含む。

[0092]一実施形態において、異種核酸配列が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３及びＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン－１及びネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子産物をコードする。

[0093]一実施形態において、異種核酸配列が、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１からＩＬ－３６）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞レセプター、キメラＴ細胞レセプター、単鎖Ｔ細胞レセプター、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子からなる群から選択される遺伝子産物をコードする。

[0094]一実施形態において、異種核酸配列が、酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）；ＡＴＰ７Ｂ（銅輸送ＡＴＰａｓｅ２）；アルファガラクトシダーゼ；ＡＳＳ１（アルギニノコハク酸シンターゼ）；ベータ－グルコセレブロシダーゼ；ベータヘキソサミニダーゼＡ；セルピンＧ１（Ｃ１プロテアーゼインヒビター）；グルコース－６－ホスファターゼ；エリスロポエチン（ＥＰＯ；インターフェロン－アルファ；インターフェロン－ベータ；インターフェロン－ガンマ；インターロイキン（ＩＬ）；インターロイキン１～３６（ＩＬ－１～ＩＬ－３６）のうちのいずれか１つ；インターロイキン（ＩＬ）レセプター；ケモカイン；ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＸＣＬ５）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）；ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）；単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター；アルファ－１アンチトリプシン；アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ；オルニチントランスカルバモイラーゼ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）；リポタンパク質リパーゼ；アポリポタンパク質；低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬ－Ｒ）；アルブミン；レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）；カルバモイルシンテターゼＩ；アルギニノコハク酸シンテターゼ；アルギニノコハク酸リアーゼ；アルギナーゼ；フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ；ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ；シスタチオニンベータ－シンターゼ；分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ；イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ；メチルマロニルＣｏＡムターゼ；グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；インスリン；ピルビン酸カルボキシラーゼ；肝ホスホリラーゼ；ホスホリラーゼキナーゼ；グリシンデカルボキシラーゼ；Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）；ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー４（ＡＢＣＡ４）；及びジストロフィンからなる群から選択されるタンパク質をコードする。

ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子が組み込まれたＥ１ａ発現哺乳動物細胞の図、並びにヘルパーウイルス機能（アデノウイルスＥ２Ａ及びＥ４タンパク質並びにＶＡ ＲＮＡ）並びに任意選択で異種核酸配列（「ＧＯＩ」と呼ばれる）、１つ以上のＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）導入遺伝子が両側に位置する）を導入するためにＡｄ・ＡＡＶハイブリッドウイルスを使用するプロセスの概略図である。ｐ５プロモーターは、スペーサー配列によってｒｅｐ遺伝子から離される。Ａｄ・ＡＡＶハイブリッドウイルスによって供給されるヘルパーウイルス機能は、ｒｅｐ遺伝子発現、ひいては、Ｒｅｐタンパク質発現を駆動し、したがって、細胞による組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター粒子（ビリオン）の産生を可能にする。 ｐ５プロモーターとＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子との間に例となるスペーサー配列（配列番号１）を有するＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐレンチウイルスシャトルベクター（図２Ａ）、及び例となるＡｄ・ＡＡＶハイブリッドベクター（図２Ｂ）を示す図である。 ｐ５プロモーターとＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子との間に例となるスペーサー配列（配列番号１）を有するＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐレンチウイルスシャトルベクター（図２Ａ）、及び例となるＡｄ・ＡＡＶハイブリッドベクター（図２Ｂ）を示す図である。 一過性トリプル（３つのプラスミド）トランスフェクション法（陽性対照）又は例となる発明の細胞株を使用した第ＶＩＩＩ因子異種核酸配列を有するｒＡＡＶベクター粒子産生の比較を示す図である。細胞は、以下のとおり作製した：ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の冷凍ストックを解凍し、１度継代し（「ｐ１」）、組織培養プレートのウェルに播いた。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を播いた１日後（「１日目」）に、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を持つレンチウイルスを用いて、４つの異なる多重感染度（ｍｏｉ）を使用して細胞に形質導入した。ここでは、ｃａｐは、ＬＫ０３（配列番号３、「ＬＫ０３レンチウイルス」）をコードする。２日目に、２つのプラスミド：ＡＡＶ ＩＴＲが５’及び３’の両側に位置する第ＶＩＩＩ因子に関する発現コンストラクトを持つ第１のプラスミド、及びＡｄ２ヘルパーウイルス機能を持つ第２のプラスミドを用いて細胞をトランスフェクションした。５日目である３日後に、ＤＮＡｓｅＩ処理された細胞ライセート上清に対してｑＰＣＲを行って、ＡＡＶベクター産生を反映する第ＶＩＩＩ因子コード核酸の存在を検出し、ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬとして報告した。 一過性トリプル（３つのプラスミド）トランスフェクション法（陽性対照）又は例示的な本発明の細胞株を使用した第ＶＩＩＩ因子異種核酸配列を有するｒＡＡＶベクター粒子産生の比較を示す図である。この調査は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞が解凍後、３継代目（「ｐ３」）であったことを除いて、実質的に図３に関して記載されるとおりに実施した。ｑＰＣＲ手順をプラスミドトランスフェクションの３日後に行い、「３日目」（調査の５日目である５日目ではなく、図４に記載されている調査と同じ日）とした。

[0099]文献から理解され、本明細書において理解されるとおり、「パッケージング」は、目的のＡＡＶ血清型のｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子のみを有し、そのため、（典型的には、野生型Ａｄ５などのヘルパーウイルスによる）ヘルパーウイルス機能及び（ＡＡＶ ＩＴＲが両側に位置する）目的の異種核酸が供給されると、ｒＡＡＶビリオン／ベクター／粒子をパッケージングすることだけができる細胞を指すために使用することができる。パッケージング細胞は、複数回継代可能であり、長期間にわたり生存可能なままにできる。さらに、パッケージング細胞は、必要とされる場合、使用のために適切な保管条件下において冷凍するなど、適切な条件下において保管することができる。したがって、パッケージング細胞は、ｒＡＡＶベクター粒子の産生のための細胞バンクとして適切である。

[0100]本明細書中で使用される場合、「ヘルパーウイルス機能（複数可）」という用語は、（Ｒｅｐ及びＣａｐとともに）ＡＡＶベクターゲノム複製及びパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにコードされた機能（複数可）を指す。本明細書中で開示されているとおり、「ヘルパーウイルス機能」は、多数のさまざまな方法で供給されてもよい。例えば、ヘルパーウイルス機能は、トランスに細胞にウイルスによって供給されても、又は例えば、必要なヘルパー機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列によって供給されてもよい。別の例において、１つ以上のウイルス（例えば、アデノウイルス）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミド又は他の発現ベクターは、ｒＡＡＶベクターゲノムと一緒の本発明の細胞株へのトランスフェクションがｒＡＡＶベクターゲノム複製及びｒＡＡＶベクター粒子へのパッケージングを可能にした後に、ヘルパー機能を供給する。

[0101]本明細書中で使用される場合、「継代」及び「継代（複数）」という用語は、細胞培養が継代された回数、すなわち、細胞培養物が回収され、次の増殖のために娘細胞培養物に再び播かれた回数を指す。一般に、本発明の細胞株は、発現されたＡｄ Ｅ１Ａの存在下において実質的な細胞死なしに複数回の継代、例えば、少なくとも１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０以上の継代を経験する場合がある。

[0102]本明細書中で使用される場合、「集団倍加数」は、作製又は単離以来、細胞培養が経験した倍加の数である。一般に、本発明の細胞株は、発現されたＡｄ Ｅ１Ａの存在下において実質的な細胞死なしに、複数の倍加、例えば、少なくとも１～５、少なくとも５～１０、少なくとも１０～１５、少なくとも１５～２０、又は少なくとも２０以上の倍加を経験する場合がある。

[0103]「産生株」という用語は、ｒＡＡＶベクターのパッケージングに必要とされるすべての構成要素を有し、ｒＡＡＶベクター粒子を産生することができる細胞を指すために使用することができる。産生細胞は、一般にｒＡＡＶ産生中、ｒｅｐ毒性のため時間とともに死ぬ。長期生存性ではないため、その結果、産生細胞は、細胞バンクとして理想的には適していない。

[0104]ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｆ及びＰＥＲＣ６細胞を含む、アデノウイルスＥ１ａタンパク質を発現する任意の哺乳動物細胞を、本発明の細胞及び方法に使用することができる。

[0105]本発明のパッケージング細胞において、プロモーターとｒｅｐ遺伝子との間に核酸スペーサーが配置されるため、ｒｅｐ遺伝子と機能可能に連結されるプロモーターは、ｒｅｐ遺伝子からのＲｅｐタンパク質の発現を駆動又は刺激しない。プロモーターとｒｅｐ遺伝子との間に十分な長さの核酸スペーサーを挿入することによって、Ｒｅｐタンパク質の発現は、構成的に発現されるＥ１ａタンパク質の存在下であっても効果的に減少した。

[0106]任意のプロモーターを本発明の細胞株及び方法に使用することができる。プロモーターは、真核生物、原核生物、又はウイルスのプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、非誘導性プロモーター及び非組織特異的プロモーターが挙げられる。特定の実施形態において、プロモーターは、ＡＡＶ ｐ５プロモーターであり、天然状態ではｒｅｐ遺伝子からのＲｅｐタンパク質の発現を駆動する。プロモーターのさらなる非限定例としては、多くのさまざまな細胞タイプにおいてポリヌクレオチドの発現を駆動することができるユビキタス又は無差別プロモーター／エンハンサーが挙げられる。そのようなエレメントとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列及びさまざまな哺乳動物細胞タイプにおいて活性なその他のウイルスプロモーター／エンハンサー、又は合成エレメント（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１ ：５２１～５３０ページ（１９８５年）を参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β－アクチンプロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

[0107]本発明に使用される核酸スペーサーは、そうでなければ、ｒｅｐ遺伝子と機能可能に連結され、遺伝子の発現を駆動するプロモーターを、ｒｅｐ遺伝子の開始コドンから遠くに（遠位に）空間的に移動させる目的を果たす。「核酸スペーサー」又は「スペーサー」又は「スペーサー配列」は、転写されない、発現されない、タンパク質、ポリペプチド又は阻害核酸をコードしない、基本的に不活性なポリヌクレオチド配列である。スペーサー配列はまた、一般にステム／ループ構造ではなく、プロモーターをｒｅｐ遺伝子から空間的に離すために使用される以外、転写に実質的な影響がない。特定の実施形態において、核酸スペーサーは、ＡＡＶ ｐ５プロモーターの３’末端と、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子開始（イニシエーション）コドンの５’末端との間に配置されるか又は位置する。

[0108]プロモーターとｒｅｐ遺伝子との間のスペーサー配列の存在は、細胞中にＥ１ａタンパク質が存在しても、ｒｅｐ遺伝子の発現を効果的に制限するか又は妨げる。ヘルパーウイルス機能、或いはアデノウイルスＥ２Ａタンパク質、Ｅ４タンパク質及び／又はＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つの導入は、ｒｅｐ遺伝子の発現を活性化、駆動又は刺激する。いかなる特定のメカニズムによっても縛られることを望まないが、供給されたヘルパーウイルス機能は、スペーサーが存在する場合でも、効果的にプロモーターがｒｅｐ遺伝子の発現を駆動又は刺激することができるようにする。

[0109]特定の実施形態において、スペーサーは、約５０００ヌクレオチド長未満、又は約２５～約４０００ヌクレオチド長、又は約２５０～約３０００ヌクレオチド長、又は約５００～約２５００ヌクレオチド長、又は約７５０～約２４００ヌクレオチド長、又は約９００ヌクレオチド～約２３００ヌクレオチド長、又は約１０００ヌクレオチド～約２２００ヌクレオチド長、又は約１１００ヌクレオチド～約２１００ヌクレオチド長、又は約１２００ヌクレオチド～約２０００ヌクレオチド長、又は約１３００ヌクレオチド～約１９００ヌクレオチド長、又は約１４００ヌクレオチド～約１８００ヌクレオチド長、又は約１５００ヌクレオチド～約１８００ヌクレオチド長、又は約１６００ヌクレオチド～約１８００ヌクレオチド長、又は約１７００ヌクレオチド～約１８００ヌクレオチド長、又は約１７２５ヌクレオチド～約１７７５ヌクレオチド長、又は約１７３０ヌクレオチド～約１７７０ヌクレオチド長、又は約１７４０ヌクレオチド～約１７６５ヌクレオチド長、又は約１７４５ヌクレオチド～約１７６０ヌクレオチド長、又は約１７４５ヌクレオチド～約１７５５ヌクレオチド長、又は約１７４５ヌクレオチド～約１７５０ヌクレオチド長、又は約１７４６ヌクレオチド～約１７５０ヌクレオチド長、又は約１７４７ヌクレオチド～約１７５０ヌクレオチド長、又は約１７４８ヌクレオチド～約１７５０ヌクレオチド長、又は約１７４９ヌクレオチド～約１７５０ヌクレオチド長、又は約１７４９ヌクレオチド長である。

[0110]特定の実施形態において、スペーサー配列は、配列番号１の配列と少なくとも約８０％の同一性、又は配列番号１の配列と少なくとも約８５％の同一性、又は配列番号１の配列と少なくとも約９０％の同一性、又は配列番号１の配列と少なくとも約９５％の同一性、又は配列番号１の配列と少なくとも約９６％の同一性、又は配列番号１の配列と少なくとも約９７％の同一性、又は配列番号１の配列と少なくとも約９８％の同一性、又は配列番号１の配列と少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。

[0111]特定の実施形態において、スペーサー配列は、配列番号１の配列と約８０％～約１００％の同一性、又は配列番号１の配列と約８５％～約１００％の同一性を有する配列、又は配列番号１の配列と約９０％～約１００％の同一性を有する配列、又は配列番号１の配列と約９５％～約１００％の同一性を有する配列、又は配列番号１の配列と約９６％～約１００％の同一性を有する配列、又は配列番号１の配列と約９７％～約１００％の同一性を有する配列、又は配列番号１の配列と約９８％～約１００％の同一性を有する配列、又は配列番号１の配列と約９９％～約１００％の同一性を有する配列を含む。

[0112]本発明の細胞は、染色体に組み込まれたｒｅｐ遺伝子を持つが、Ｒｅｐタンパク質を発現するためにヘルパーウイルス機能を必要とする。「ヘルパーウイルス」又は「ヘルパーウイルス機能」は、本明細書中で使用される場合、アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つ、又はヘルペスウイルス及びポックスウイルスなどの他のウイルスの対応する機能を指し、ＡＡＶベクターゲノムの複製及びパッケージングを助けるヘルパー機能を与えることができる。特定の実施形態において、ハイブリッドウイルスは、Ｅ１／Ｅ３が欠失しているがヘルパーウイルス機能を供給するＡｄ Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡを含むアデノウイルス並びに異種核酸の両側に位置するＡＡＶ ＩＴＲで作製される。他の実施形態において、ハイブリッドウイルスは、異種核酸の両側に位置するＡＡＶ ＩＴＲとともに、ヘルペスウイルス又はポックスウイルスからのヘルパーウイルス機能を含む。

[0113]「ベクター」という用語は、キャリア核酸小分子、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）、又は核酸の挿入若しくは組み込みによって操作することができるその他の媒体を指す。そのようなベクターは、ポリヌクレオチドを細胞に導入／運搬するため、及び細胞において挿入されたポリヌクレオチドを転写又は翻訳するための遺伝子操作（すなわち、「クローニングベクター」）に使用することができる。「発現ベクター」は、宿主細胞での発現に必要とされる必須の調節領域とともに遺伝子又は核酸配列を含む特殊化されたベクターである。ベクター核酸配列は、細胞における増殖のための少なくとも複製開始点及び任意選択で付加的なエレメント、例えば、異種ポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、選択マーカー（例えば、抗生剤耐性）、ポリアデニル化シグナルを一般に含む。

[0114]ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む１つ以上の核酸エレメント由来であるか、又はそのような核酸エレメントに基づく。特定のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

[0115]組み換えＡＡＶベクターなどのベクターの修飾語、並びに組み換えポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの配列の修飾語としての「組み換え」という用語は、組成物が一般に自然界では起こらない方法で操作された（すなわち、作りかえられた）ことを意味する。組み換えＡＡＶベクターの特定の例は、野生型ＡＡＶゲノムには通常存在しないクリック酸配列（例えば、異種核酸配列）がＡＡＶゲノムに挿入される場合である。「組み換え」という用語は本明細書中で、ＡＡＶベクター、並びにポリヌクレオチドなどの配列に対する言及に常に使用される訳ではないが、ポリヌクレオチドを含む組み換え型は、いかなるそのような省略にもかかわらず、明白に含まれる。

[0116]「組み換えＡＡＶベクター」又は「ｒＡＡＶ」は、ＡＡＶゲノムから野生型ゲノムを除去するために分子的な方法を使用すること、及び異種核酸と呼ばれる非天然核酸配列で置き換えることによってＡＡＶの野生型（ｗｔ又は野生型）ゲノムから誘導される。一般に、ＡＡＶに関して、ＡＡＶゲノムの末端逆位（ＩＴＲ）配列の一方又は両方がＡＡＶベクター中に保持される。ＡＡＶゲノム核酸に対してすべて又は一部のＡＡＶゲノムが非天然配列で置き換えられているため、ｒＡＡＶはＡＡＶゲノムとは区別される。したがって、非天然配列の組み込みは、ＡＡＶベクターを、「組み換え」ベクターとして定義し、「ｒＡＡＶベクター」とも呼ぶことができる。

[0117]ｒＡＡＶ配列は、エクスビボ、インビトロ又はインビボにおいて、次の細胞の感染（形質導入）のためにパッケージングされてもよく、本明細書において「粒子」と言及される。組み換えＡＡＶベクター配列がカプシドで包まれるか、又はパッケージングされてＡＡＶ粒子にされる場合、この粒子は、「ｒＡＡＶベクター」又は「ｒＡＡＶ粒子」と呼ぶこともできる。そのようなｒＡＡＶ粒子は、ベクターゲノムをカプシドで包むか、又はパッケージングするタンパク質を含む。ＡＡＶの場合、タンパク質は、カプシドタンパク質と呼ばれる。

[0118]ベクター「ゲノム」は、最終的にパッケージングされるか又はカプシドで包まれてウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を形成する、組み換えプラスミド配列の部分を指す。組み換えベクターを構築又は製造するために組み換えプラスミドが使用される場合、ベクターゲノムは、組み換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。組み換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」と呼ばれ、プラスミドのクローニング及び増幅、増殖及び組み換えウイルス産生に必要とされるプロセスに重要であるが、それ自体はパッケージングされるか又はカプシドで包まれてウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子にはされない。したがって、ベクター「ゲノム」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によってパッケージングされるか又はカプシドで包まれる核酸を指す。

[0119]「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では同義に使用されて、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、核酸、オリゴヌクレオチドのあらゆる形態を指す。核酸としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、並びにスプライシングされたｍＲＮＡ又はスプライシングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び阻害ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子（ｓｍａｌｌ若しくはｓｈｏｒｔ）ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子（ｓｍａｌｌ若しくはｓｈｏｒｔ）干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）が挙げられる。核酸としては、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド及び意図的に修飾されたポリヌクレオチド又は改変されたポリヌクレオチド（例えば、変異型核酸）が挙げられる。ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそのフラグメントなどの核酸は、単鎖であっても、又は二本鎖であってもよい。

[0120]ポリヌクレオチドは、単鎖、二重鎖又は三重鎖で、直線又は環状が可能であり、任意の長さが可能である。ポリヌクレオチドを論じる際、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’方向に配列を示す規則に従って本明細書に記載されることもある。

[0121]「導入遺伝子」は、細胞又は生物に導入されることが意図されるか又は導入された異種核酸を便宜的に指すために本明細書中で使用される。導入遺伝子としては、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードするか、又は阻害ＲＮＡをコードする遺伝子などの任意の異種核酸が挙げられる。

[0122]異種核酸は、細胞へのＡＡＶなどのベクター「形質導入」又は「トランスフェクション」により導入／運搬可能である。「形質導入する」という用語及びその文法的変形は、ｒＡＡＶベクターなどの分子の細胞又は宿主生物への導入を指す。導入された異種核酸はまた、レシピエント細胞又は宿主生物の染色体外に、又は一時的にのみ存在してもよい。

[0123]「形質導入された細胞」は、導入遺伝子が導入された細胞である。したがって、（例えば、細胞又は組織又は臓器細胞などの、哺乳動物における）「形質導入された」細胞は、外来性分子、例えば、核酸（例えば、導入遺伝子）の細胞への組み込み後の細胞中の遺伝子変化を意味する。したがって、「形質導入された」細胞は、外来性核酸が導入された細胞、又はその後代である。細胞（複数可）が増殖させられるか、導入されたタンパク質が発現されるか、又は核酸が転写されてもよい。遺伝子療法の使用及び方法のために、形質導入された細胞は、対象中に存在してもよい。

[0124]「発現制御エレメント」は、機能可能に連結された核酸の発現に影響を与える核酸配列（複数可）を指す。制御エレメントは、プロモーター及びエンハンサーなどの本明細書中に記載されている発現制御エレメントを含む。ＡＡＶベクターを含む、ベクター配列は、１つ以上の「発現制御エレメント」を含んでもよい。一般に、そのようなエレメントは、適切な異種ポリヌクレオチド転写及び適切であれば翻訳を促進するために含まれる（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレームの翻訳を可能にする遺伝子の正しい読み枠の維持、及び終止コドンなど）。そのようなエレメントは、「シス作用」エレメントと呼ばれ、一般にシスに作用するが、トランスに作用してもよい。

[0125]発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルでもたらされてもよい。一般に、転写を調節する発現制御エレメントは、転写される核酸の５’末端（すなわち、「上流」）に近接している。発現制御エレメントはまた、転写される配列の３’末端（すなわち、「下流」）又は転写物（例えば、イントロン）中に位置することができる。

[0126]機能上、機能可能に連結された核酸の発現は、エレメントが核酸の転写、必要に応じて転写物の翻訳を調節するよう、エレメント（例えば、プロモーター）によって少なくとも部分的に制御可能である。発現制御エレメントの特定の例は、プロモーターであり、通常、転写される核酸配列の５’に位置する。プロモーターは、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して、機能可能に連結された核酸から発現される量を一般に増加させる。

[0127]「エンハンサー」は、本明細書中で使用される場合、異種核酸に近接して位置する配列を指す場合がある。エンハンサーエレメントは、一般にプロモーターエレメントの上流に位置するが、配列の下流又は配列内で機能し、そこに位置する場合もある。エンハンサーエレメントは、一般に、プロモーターエレメントによってもたらされる発現を超えて機能可能に連結された核酸の発現を増加させる。

[0128]プロモーターなどの本明細書における発現制御エレメントは、一般に、転写される配列から離れて配置される。特定の実施形態において、プロモーターなどの発現制御エレメントは、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの少なくとも約２５ヌクレオチド５’に配置され、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約２５～５，０００ヌクレオチド５’に配置され、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約２５０～２，５００ヌクレオチド５’に配置され、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約５００～２，０００ヌクレオチド５’に配置され、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約１，０００～１，９００ヌクレオチド５’に配置され、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約１，５００～１，９００ヌクレオチド５’に配置され、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約１，６００～１，８００ヌクレオチド５’に配置され、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約１，７００～１，８００ヌクレオチド５’に配置され、又はｒｅｐ遺伝子開始コドンの約１，７５０ヌクレオチド５’に配置される。

[0129]発現制御エレメントとしては、多くのさまざまな細胞タイプにおいてポリヌクレオチドの発現を駆動することができるユビキタス又は無差別プロモーター／エンハンサーが挙げられる。そのようなエレメントとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列及びさまざまな哺乳動物細胞タイプにおいて活性なその他のウイルスプロモーター／エンハンサー、又は合成エレメント（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１～５３０ページ（１９８５年）を参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β－アクチンプロモーター並びにホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

[0130]発現制御エレメントとしては、異種ポリヌクレオチドに関する天然エレメント（複数可）も挙げられる。天然制御エレメント（例えば、プロモーター）は、異種ポリヌクレオチドの発現が天然の発現を模倣すべきことが望まれる場合に使用されてもよい。イントロン、ポリアデニル化部位又はＫｏｚａｋ共通配列などの他の天然制御エレメントも、使用することができる。

[0131]「機能可能に連結される」という用語は、核酸配列の発現に必要な調節配列が、核酸配列の発現を引き起こすよう、配列に対して適切な位置に置かれることを意味する。この同じ定義が、発現ベクター、例えば、ｒＡＡＶベクター中の核酸配列及び転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び終止エレメント）の配置に対して適用される場合もある。

[0132]核酸と機能可能に結合した発現制御エレメントの例では、この関係は、制御エレメントが核酸の発現を調節するようにされる。さらに詳細には、例えば、機能可能に連結された２つのＤＮＡ配列とは、それらのＤＮＡ配列のうちの少なくとも一方が、生理的な効果を他方の配列に発揮することができるような関係で２つのＤＮＡが（シス又はトランス）配置されることを意味する。

[0133]本明細書中で開示されているとおり、発現制御エレメントとＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子との間に配置される核酸スペーサー配列は、ｒｅｐ遺伝子の発現を実質的に低減又は排除することができ、それによって、ひいては、Ｒｅｐタンパク質の発現を低減又は排除し、細胞がアデノウイルスＥ１ａタンパク質も発現しても、細胞が生存できる。ハイブリッドウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス又はヘルペスウイルスによって供給されるなどの、そのような細胞へのヘルパーウイルス機能の付加は、スペーサー核酸のｒｅｐ遺伝子発現を減弱する効果に打ち勝ち、ひいては、ｒｅｐ遺伝子の発現を駆動し、それによって、Ｒｅｐタンパク質発現をもたらすことができる。

[0134]ｒＡＡＶベクターに対する付加的なエレメントとしては、以下に限定されないが、転写終結シグナル若しくは終止コドン、配列に隣接する５’若しくは３’非翻訳領域（例えば、ポリアデニル化（ポリＡ）配列）、例えば、１つ以上のコピーのＡＡＶ ＩＴＲ配列、又はイントロンが挙げられる。

[0135]さらなるエレメントとしては、例えば、パッケージングを向上させ、汚染核酸の存在を低減するための、例えば、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列が挙げられる。ＡＡＶベクターは、典型的には、一般に約４ｋｂ～約５．２ｋｂ、又はそれよりやや大きいサイズの範囲を有するＤＮＡの挿入を受容する。したがって、それより短い配列には、長さを、ウイルス粒子へのＡＡＶベクターパッケージングに許容されるウイルスゲノム配列の通常のサイズの長さ又はそれに近い長さに調節するために、スタッファー又はフィラーを含めること。さまざまな実施形態において、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（非タンパク質コード）セグメントである。４．７ｋｂ未満の核酸配列に対して、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わされる（例えば、ベクターに挿入される）場合に、約３．０～５．５ｋｂの間、約４．０～５．０ｋｂの間、約４．３～４．８ｋｂの間の合計長さを有する、長さを有する。

[0136]野生型異種核酸又は導入遺伝子がＡＡＶベクター粒子内にパッケージングされるには大き過ぎる場合、異種核酸は、治療用タンパク質若しくは核酸産物などの機能性タンパク質又は核酸産物が最終的にもたらされるよう、ＡＡＶベクターへのパッケージング及びＡＡＶベクターによる送達のために修飾、断片化又は切断形態として提供されてもよい。

[0137]いくつかの実施形態において、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）をコードする異種核酸は、修飾又は切断形態として提供されるか、又は異種核酸は、別々の複数のＡＡＶベクターによって送達される複数のコンストラクトとして提供される。

[0138]特定の態様において、異種核酸は、コード異種ポリヌクレオチドが、ＡＡＶベクターへのパッケージングのためにサイズが小さくなるよう、機能に不要な部分を除去した、コード化タンパク質（例えば、治療用タンパク質）の機能性を維持する切断型バリアントとして提供される。

[0139]特定の態様において、異種核酸は、それぞれがタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の異なる部分をコードする核酸を供給する分割されたＡＡＶベクターとして提供されるため、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）の複数の部分を送達し、その複数の部分が細胞中で集まり、機能する。

[0140]他の態様において、異種核酸は、重複、トランススプライシング又はハイブリッドトランススプライシング二重ベクター技術を使用した二重ＡＡＶベクターによって供給される。特定の実施形態において、細胞中で結合して、完全長タンパク質（例えば、治療用タンパク質）が発現される完全な発現カセットを生じる２つの重複ＡＡＶベクターが使用される。

[0141]「止血関連障害」とは、血友病Ａ、阻害抗体を伴う血友病Ａ、血友病Ｂ、阻害抗体を伴う血友病Ｂ、凝固因子：ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、Ｖ、ＸＩＩ、ＩＩ、フォン・ヴィレブランド因子いずれかの欠乏、ＦＶ／ＦＶＩＩＩ複合欠乏、サラセミア、ビタミンＫエポキシド還元酵素Ｃ１欠乏、又はガンマ－カルボキシラーゼ欠乏などの出血障害；外傷、損傷、血栓症、血小板減少症、卒中、凝固障害、又は播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関連する出血；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖、ワルファリン、又は小分子抗血栓薬（すなわち、ＦＸａ阻害剤）に関連する過剰抗凝固；並びにベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症、及び貯蔵プール欠乏症などの血小板障害を指す。

[0142]「単離された」という用語は、組成物の修飾語として使用される場合、組成物が、ヒトの手によって生成されたか、又は天然に存在するインビボ環境から完全に若しくは少なくとも部分的に分離されていることを意味する。一般に、単離された組成物は、通常、自然では関連する１つ以上の材料、例えば、１つ以上のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。

[0143]「単離された」という用語は、ヒトの手によって生成された組み合わせ、例えば、ｒＡＡＶ配列、又はＡＡＶベクターゲノム及び医薬製剤をパッケージングするか若しくはカプシドで包んでいるｒＡＡＶ粒子を除外しない。「単離された」という用語はまた、組成物の代替的な物理的形態、例えば、ハイブリッド／キメラ、多量体／オリゴマー、修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化）若しくは誘導体化形態、又はヒトの手によって生成された宿主細胞中で発現される形態を除外しない。

[0144]「実質的に純粋な」という用語は、目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を少なくとも５０～６０重量％含む調製物を指す。調製物は、少なくとも７５重量％、又は少なくとも８５重量％、又は約９０～９９重量％の目的の化合物を含むことができる。純度は、目的の化合物に適切な方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。

[0145]「から本質的になること」という語句は、特定のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を言及する場合、所与の配列番号の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列の言及に使用される場合、その語句は、配列それ自体並びに配列の基本的特性及び新規の特性に影響を及ぼさない分子的改変物を含む。

[0146]「同一性」、「類似性」及びその文法的変形は、「アライメントされた」配列である場合、２つ以上の言及される要素が同じであることを意味する。したがって、例として、２つのタンパク質配列が同一である場合、それらの配列は、少なくとも言及される領域又は部分内では同じアミノ酸配列を有する。２つの核酸配列が同一である場合、それらの配列は、少なくとも言及される領域又は部分内では同じ核酸配列を有する。同一性は、配列の定義される範囲（領域又はドメイン）を超えることがある。

[0147]同一性の「範囲」又は「領域」は、同じ２つ以上の言及される要素の一部を指す。したがって、２つのタンパク質又は核酸配列が１つ以上の配列範囲又は領域を超えて同一である場合、それらの配列は、その領域内で同一性を共有する。「アライメントされた」配列とは、複数のタンパク質（アミノ酸）又は核酸配列を指し、参照配列と比較した場合、欠失した又は付加的な塩基又はアミノ酸（差）に対する補正を含むことが多い。

[0148]同一性は、配列の全長又は一部を超えて延びることがある。特定の実施形態において、同一性パーセントを共有する配列の長さは、２、３、４、５以上の連続的なアミノ酸又は核酸、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などの連続的な核酸又はアミノ酸である。別の実施形態において、同一性を共有する配列の長さは、２１以上の連続的なアミノ酸又は核酸、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０などの連続的なアミノ酸又は核酸である。さらに別の実施形態において、同一性を共有する配列の長さは、４１以上の連続的なアミノ酸又は核酸、例えば、４２、４３、４４、４５、４５、４７、４８、４９、５０などの連続的なアミノ酸又は核酸である。さらに別の実施形態において、同一性を共有する配列の長さは、５０以上の連続的なアミノ酸又は核酸、例えば、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～５００、５００～１，０００などの連続的なアミノ酸又は核酸である。

[0149]２つの配列間の同一性（類似性）の程度又は「同一性パーセント」は、コンピュータプログラム及び／又は数学アルゴリズムを使用して確認することができる。本発明の目的に対して、核酸配列の比較は、ウィスコンシン州マディソンのジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）から入手可能なＧＣＧウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パッケージバージョン９．１を使用して行われる。便宜上、そのプログラムによって規定されるデフォルトパラメータ（ギャップ挿入ペナルティ＝１２、ギャップ伸長ペナルティ＝４）が、配列同一性を比較するための本明細書における使用のために意図される。交互に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供する、デフォルトパラメータを用いたギャップアライメントを使用したＢｌａｓｔｎ２．０プログラム（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／でワールドワイドウェブにおいて見出される；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３～４１０ページ）を使用して、核酸配列間及びアミノ酸配列間の同一性及び類似性のレベルを求めることができる。ポリペプチド配列比較に対して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムが、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ２５０、ＢＬＯＳＵＭ６２又はＢＬＯＳＵＭ５０などのスコア行列と組み合わせて一般に使用される。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）並びにＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムも同一性の程度を定量するために使用される（Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ページ（１９８８年）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １３２：１８５ページ（２０００年）；及びＳｍｉｔｈら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １４７：１９５ページ（１９８１年））。ドロネーに基づく位相マッピングを使用したタンパク質の構造的類似性を定量するためのプログラムも開発された（Ｂｏｓｔｉｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ３０４：３２０ページ（２００３年））。

[0150]本発明の改変された／変異型ＡＡＶカプシドをコードする核酸及び異種核酸を含む核酸分子、発現ベクター（例えば、ＡＡＶベクターゲノム）、プラスミドは、組み換えＤＮＡ技術方法を使用することによって作製されてもよい。ヌクレオチド配列情報が入手可能だと、さまざまな手段による本発明の単離核酸分子の調製が可能になる。例えば、核酸配列は、細胞発現又はインビトロにおける翻訳によりさまざまな標準的なクローニング、組み換えＤＮＡ技術及び化学合成技術を使用して作製することができる。ポリヌクレオチドの純度は、シークエンシング、ゲル電気泳動などにより求めることができる。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーション又はコンピュータベースのデータベーススクリーニング技術を使用して単離することができる。そのような技術としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：（１）同一であるヌクレオチド配列を検出するためのプローブを用いたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション；（２）例えば、発現ライブラリーを使用した、共通の構造的特徴を有するポリペプチドを検出するための抗体スクリーニング；（３）対象の核酸配列とアニーリング可能なプライマーを使用したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡに関するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；（４）関連配列に関する配列データベースのコンピュータ検索；及び（５）サブトラクション核酸ライブラリーのディファレンシャルスクリーニング。

[0151]核酸は、任意の便宜的なクローニングベクター中のＤＮＡとして保持されてもよい。クローンは、ｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）などのプラスミドクローニング／発現ベクター中に保持することができ、そのクローンは、適した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞において増殖させられる。或いは、核酸は、哺乳動物細胞における発現に適したベクター、例えば、ＡＡＶベクターに保持されてもよい。翻訳後修飾が凝血機能に影響を及ぼす場合、核酸分子は、哺乳動物細胞中で発現させられてもよい。

[0152]本明細書中で開示されているとおり、ｒＡＡＶベクターは、任意選択で宿主細胞におけるコード化タンパク質の発現を可能にするような方法で配置された細胞中の異種核酸の発現に必要な調節エレメントを含んでもよい。発現に必要とされるそのような調節エレメントとしては、本明細書中に記載され、当業者に公知のプロモーター配列、エンハンサー配列及び転写開始配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

[0153]ｒＡＡＶベクターは、処置の方法として、異種核酸によってコードされる配列を、それを必要とする対象に送達、投与又は提供する方法に有用である。この方法において、核酸は転写され、タンパク質又は阻害核酸が、対象においてインビボで産生されてもよい。対象は、タンパク質若しくは阻害核酸から利益を得るか、又はそれを必要とする場合もある。その理由は、対象はタンパク質が欠乏しているため、或いは処置の方法又は別の方法として対象におけるタンパク質若しくは阻害核酸の産生がいくらかの治療効果を与えることもあるためである。例えば、阻害核酸は、明白な又は有害なタンパク質が神経学的疾患若しくは障害などの疾患又は障害を引き起こす、対象において発現される異常な有害タンパク質の発現又は転写を低減することができる。

[0154]異種核酸とともにＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶベクターは、遺伝子疾患の処置を可能にする。欠乏状態の疾患に対して、補充療法のために正常な遺伝子を患部組織に運ぶため、及びアンチセンス変異を使用して疾患の動物モデルを作り出すために、遺伝子移入を使用することができる。不安定な疾患状態について、遺伝子移入は、モデル系において疾患状態を作り出すために使用され、その後、このモデル系は、疾患状態に対抗するために使用される。欠乏を治すために核酸配列の部位特異的な組み込みを使用することも可能である。

[0155]さまざまな実施形態において、異種核酸とともにＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶベクターは、例えば、治療薬及び／又は予防薬（タンパク質若しくは核酸）として使用されてもよい。特定の実施形態において、異種核酸は、血液凝固カスケードを調節することができるタンパク質をコードする。

[0156]例えば、コードされたＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、野生型ＦＶＩＩＩと類似の凝固活性、又は野生型ＦＶＩＩと比較して改変された凝固活性を有してもよい。ＦＶＩＩＩ－又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤコードｒＡＡＶベクターの血友病Ａの患者への投与は、凝固カスケードを正常化するのに役立つＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質の発現をもたらす。

[0157]別の実施形態において、異種核酸は、グリコーゲンの蓄積を阻害若しくは低減することができる、グリコーゲンの蓄積を予防することができる、又はグリコーゲンを分解することができるタンパク質（酵素）をコードする。例えば、コードされるＧＡＡは、野生型ＧＡＡと類似の活性を有してもよい。ＧＡＡコードｒＡＡＶベクターのポンペ病の患者への投与は、グリコーゲンの蓄積を抑制若しくは低減する、グリコーゲンの蓄積を予防する、又はグリコーゲンを分解するＧＡＡタンパク質の発現をもたらし、ひいては、ポンペ病の１つ以上の有害な影響を低減するか、若しくは減少させることができる。

[0158]ｒＡＡＶベクターを用いて処置可能な疾患の非限定例としては、肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、出血障害（例えば、インヒビターを伴う若しくは伴わない血友病Ａ若しくは血友病Ｂ）、サラセミア、血液障害（例えば、貧血）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、ライソゾーム蓄積症）例えば、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、遅発性乳児型神経セロイドリポフスチン症２型（ＣＬＮ２）、シスチン症、ファブリー病、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ型、糖原病ＩＩ（ポンペ病）、ガングリオシドモノシアル２（ＧＭ２）ガングリオシドーシスＩ型（テイ・サックス病）、ＧＭ２ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、ムコリピドーシスＩ型（シアリドーシスＩ及びＩＩ型）、ＩＩ型（Ｉ－細胞病）、ＩＩＩ型（偽性ハーラー病）及びＩＶ型、ムコ多糖蓄積症（ハーラー病及び異型、ハンター、サンフィリポＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ型、モルキオＡ及びＢ型、マロトー・ラミー及びスライ病）、ニーマン・ピック病Ａ／Ｂ、Ｃ１及びＣ２型、及びシンドラー病Ｉ及びＩＩ型）、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、銅若しくは鉄蓄積障害（例えば、ウィルソン病若しくはメンケス病）、ライソゾーム酸性リパーゼ欠損症、神経障害若しくは神経変性障害、がん、１型若しくは２型糖尿病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害（例えば、糖原病）、固形臓器の疾患（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）、又は感染性のウイルス性（例えば、Ｂ及びＣ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）など）、細菌性若しくは真菌性疾患が挙げられる。

[0159]ｒＡＡＶベクターを用いて処置可能な疾患のさらなる非限定例としては、血友病Ａ、阻害抗体を伴う血友病Ａ、血友病Ｂ、阻害抗体を伴う血友病Ｂ、凝固因子：ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、Ｖ、ＸＩＩ、ＩＩ、フォン・ヴィレブランド因子いずれかの欠乏、ＦＶ／ＦＶＩＩＩ複合欠乏、サラセミア、ビタミンＫエポキシド還元酵素Ｃ１欠乏、又はガンマ－カルボキシラーゼ欠乏などの止血関連障害又は出血障害；外傷、損傷、血栓症、血小板減少症、卒中、凝固障害、又は播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関連する出血；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖、ワルファリン、又は小分子抗血栓薬（すなわち、ＦＸａ阻害剤）に関連する過剰抗凝固；並びにベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症、及び貯蔵プール欠乏症などの血小板障害が挙げられる。

[0160]本発明による有用な異種核酸コード遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質）の非限定例としては、ポンペ病の処置のためのＧＡＡ（酸性アルファグルコシダーゼ）；遅発性乳児型神経セロイドリポフスチン症２型（ＣＬＮ２）の処置のためのＴＰＰ１（トリペプチジルペプチダーゼ１）、ウィルソン病の処置のためのＡＴＰ７Ｂ（銅輸送ＡＴＰアーゼ２）；ファブリー病の処置のためのアルファガラクトシダーゼ；シトルリン血症１型の処置のためのＡＳＳ１（アルギニノコハク酸シンターゼ）；ゴーシェ病１型の処置のためのベータ－グルコセレブロシダーゼ；テイ・サックス病の処置のためのベータヘキソサミニダーゼＡ；遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）の処置のためのセルピンＧ１（Ｃ１プロテアーゼインヒビター；Ｃ１エステラーゼインヒビター）；糖原病Ｉ型（ＧＳＤＩ）の処置のためのグルコース－６－ホスファターゼ；貧血の処置のためのエリスロポエチン（ＥＰＯ）；さまざまな免疫異常、ウイルス感染及びがんの処置のためのインターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、及びインターフェロン－ガンマ；さまざまな炎症性疾患又は免疫不全の処置のための、ＩＬ－１～ＩＬ－３６のうちのいずれか１つを含むインターロイキン（ＩＬ）、及び対応するレセプター；免疫異常の処置のための、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＸＣＬ５）を含むケモカイン；クローン病などの免疫異常の処置のための顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；さまざまなヒト炎症性疾患の処置のための顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）；さまざまなヒト炎症性疾患の処置のためのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）；上皮組織損傷の処置のためのケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）；反復流産、ＨＩＶ関連合併症、及びインスリン耐性の処置のための単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）などのケモカイン；さまざまな免疫異常の処置のための腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びレセプター；肺気腫又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置のためのアルファ１－アンチトリプシン；ムコ多糖症Ｉ（ＭＰＳ Ｉ）の処置のためのアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ；ＯＴＣ欠損症の処置のためのオルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）；フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の処置のためのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）又はフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）；リポタンパク質リパーゼ欠損症の処置のためのリポタンパク質リパーゼ；アポリポタンパク質（Ａｐｏ）Ａ－Ｉ欠損症の処置のためのアポリポタンパク質；家族性高コレステロール血症（ＦＨ）の処置のための低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬ－Ｒ）；低アルブミン血症の処置のためのアルブミン；レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）；カルバモイルシンテターゼＩ；アルギニノコハク酸シンテターゼ；アルギニノコハク酸リアーゼ；アルギナーゼ；フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ；ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ；ホモシスチン尿症の処置のためのシスタチオニンベータ－シンターゼ；分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ；イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ；メチルマロニルＣｏＡムターゼ；グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；インスリン；ピルビン酸カルボキシラーゼ；肝ホスホリラーゼ；ホスホリラーゼキナーゼ；グリシンデカルボキシラーゼ；Ｈ－タンパク質；Ｔ－タンパク質；嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）；シュタルガルト病の処置のためのＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー４（ＡＢＣＡ４）；並びにジストロフィンが挙げられるが、これらに限定されない。

[0161]さらに別の実施形態において、異種ポリヌクレオチドは、抗体、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、金属輸送体（ＡＴＰ７Ａ又はＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、アリルスルファターゼＡ（セレブロシド－スルファターゼ；ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ホルモン、成長因子、インスリン様増殖因子１又は２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、神経成長因子、神経栄養因子３及び４、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来成長因子、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン－１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬剤耐タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１、ＮＦ１、フォンヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）、大腸ポリポーシス（ＡＰＣ））、免疫調節特性を有するペプチド、免疫寛容誘導又は免疫源性ペプチド又はタンパク質Ｔレジトープ（Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅ）又はｈＣＤＲ１、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ－ＧＵＣＹ２Ｄ）、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（コロイデレミア）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ－レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（脳回転状萎縮）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖性網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性ＧＴＰアーゼ、ＭＥＲがん原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、ＡＢＣＡ４、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ ２、３及び４（色覚異常）、ＰＫＤ－１又はＰＫＤ－２（多発性のう胞腎）、スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスフェートトランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２－ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク質、ゲノム編集のための１つ以上の亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、並びにゲノム編集のための修復テンプレートとして使用される１つ以上のドナー配列をコードする。

[0162]特定の実施形態において、異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、遺伝子編集ヌクレアーゼを含む。特定の態様において、遺伝子編集ヌクレアーゼは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。特定の態様において、遺伝子編集ヌクレアーゼは、機能的ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含む。

[0163]特定の実施形態において、異種ポリヌクレオチドは、阻害核酸をコードする。特定の態様において、阻害核酸は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される。特定の態様において、阻害核酸が、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症と関連する遺伝子（アトロフィン１、ＡＴＮ１）、球脊髄性筋萎縮症におけるＸ染色体上のアンドロゲンレセプター、ヒトアタキシン－１、－２、－３、及び－７、脊髄小脳変性症（１、２、３、６、７、８、１２、１７型）におけるＣａｖ２．１ Ｐ／Ｑ 電位依存性カルシウムチャネル（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質、アタキシン８逆鎖（ＡＴＸＮ８ＯＳ）、セリン／トレオニン－プロテインホスファターゼ２Ａ５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム、脆弱Ｘ症候群におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱Ｘ症候群関連疾患におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞２）又はＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２；筋強直性ジストロフィーにおけるミオトニン－プロテインキナーゼ（ＭＴ－ＰＫ）；フリートライヒ運動失調におけるフラタキシン；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の変異体；パーキンソン病及び／又はアルツハイマー病の発病に関与する遺伝子；アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）及びプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症；ＨＩＶ感染症におけるＨＩＶ Ｔａｔ、転写遺伝子のヒト免疫不全ウイルストランスアクチベーター；ＨＩＶ感染症におけるＨＩＶ ＴＡＲ、ＨＩＶ ＴＡＲ、ヒト免疫不全ウイルストランスアクチベーター応答エレメント遺伝子；ＨＩＶ感染症におけるＣ－Ｃケモカインレセプター５（ＣＣＲ５）；ＲＳＶ感染症におけるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオカプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染症における肝臓特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１２２）；ｐ５３、急性腎障害又は腎臓移植後臓器機能障害又は腎損傷急性腎不全；進行再発性又は転移性固形悪性腫瘍におけるプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）；ＬＭＰ２、プロテアソームサブユニットベータ型９（ＰＳＭＢ９）としても知られているＬＭＰ２、転移性黒色腫；ＬＭＰ７、プロテアソームサブユニットベータ型８（ＰＳＭＢ８）としても知られている、転移性黒色腫；ＭＥＣＬ１、プロテアソームサブユニットベータ型１０（ＰＳＭＢ１０）としても知られている、転移性黒色腫；固形腫瘍における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシンスピンドルタンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ－２）；固形腫瘍におけるリボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ＲＲＭ２）；固形腫瘍におけるフューリン；肝臓腫瘍におけるポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染症におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性大腸ポリポーシスにおけるベータ－カテニン；ベータ２アドレナリンレセプター、緑内障；糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）又は加齢黄斑変性におけるＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１、ＤＡＮ損傷誘導性転写物４タンパク質としても知られている；加齢黄斑変性又は脈絡膜血管新生における血管内皮増殖因子レセプターＩ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２；先天性厚硬爪甲症におけるケラチン６Ａ Ｎ１７Ｋ変異タンパク質；インフルエンザ感染症におけるインフルエンザＡウイルスゲノム／遺伝子配列；ＳＡＲＳ感染症における重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスゲノム／遺伝子配列；ＲＳウイルス感染症におけるＲＳウイルスゲノム／遺伝子配列；エボラ感染症におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；Ｂ及びＣ型肝炎感染症におけるＢ及びＣ型肝炎ウイルスゲノム／遺伝子配列；ＨＳＶ感染症における単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウイルスＢ３感染症におけるコクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列；原発性ジストニアにおけるトーシンＡ（ＴＯＲ１Ａ）のような遺伝子病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的サイレンシング）、移植において特異的な汎クラスＩ及びヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子；及び常染色体優性遺伝性網膜色素変性（ａｄＲＰ）における変異ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）を含むが、これらに限定されるものではない遺伝子、遺伝子の転写物、又はポリヌクレオチドリピート病と関連する遺伝子の転写物と結合する。

[0164]ｒＡＡＶベクターは、単独で、又は所望の治療的な、有益な、相加的な、相乗的な若しくは補足的な活性若しくは効果を有する若しくは複数の化合物、薬剤、薬物、処置又はその他の治療計画又はプロトコルと組み合わせて投与されてもよい。例となる組み合わせ組成物及び処置は、生物製剤（タンパク質）、薬剤（例えば、免疫抑制剤）及び薬物などの第２の活性物を含む。そのような生物製剤（タンパク質）、薬剤、薬物、処置及び療法は、本発明の任意のその他の方法又は使用、例えば、血友病Ａなどの血液凝固疾患又はポンペ病などのライソゾーム蓄積症に対して対象を処置する治療方法に先立って、それと実質的に同時に、又はその後に施されてもよく、又は実施されてもよい。

[0165]本発明によると、ｒＡＡＶベクター又は治療用薬剤の組み合わせは、単独で、又は薬学的に許容される組成物若しくは生物学的に適合した組成物として、対象又は患者に投与されてもよい。

[0166]本明細書中に記載されるとおり、ｒＡＡＶは、細胞に入り込み、細胞に核酸／遺伝物質を導入することができるため、遺伝子療法ベクターとして有用である。ＡＡＶは、ヒトにおける発病させる疾患とは関連しないため、ｒＡＡＶベクターは、異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用タンパク質及び薬剤）を、実質的なＡＡＶの発病又は疾患を引き起こすことなくヒト患者に送達することができる。

[0167]ｒＡＡＶベクターは、分裂細胞及び非分裂細に対する指向性を含む、そのような用途に対して多くの望ましい特徴を持つ。これらのベクターを用いた早期の臨床的経験はまた、持続性の毒性がなく、免疫応答が最低限であるか又は検出できないことを示した。ＡＡＶは、インビボ及びインビトロにおいて、レセプターが関係するエンドサイトーシスによって、又はトランスサイトーシスによって、多種多様の細胞タイプに感染することが知られている。これらのベクター系は、網膜上皮、肝臓、骨格筋、気道、脳、関節及び造血幹細胞などの多くの組織を標的としてヒトにおいて試験されてきた。

[0168]例えば、複数のコピーの所望の遺伝子、よって、さらに多くの量のその遺伝子の産物をもたらすことができるｒＡＡＶベクターを導入することが望ましい場合もある。改善されたｒＡＡＶベクター及びこれらのベクターを作製するための方法が、Ｗｒｉｇｈｔ Ｊ．Ｆ．（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０：６９８～７０６ページ、２００９年）を含む、多くの参考文献、特許及び特許出願に詳細に記載されてきた。

[0169]組み換えＡＡＶベクター、並びにその方法及び使用は、任意のウイルス株又は血清型を含む。非限定例として、組み換えＡＡＶベクターは、例えば、ＬＫ０３（配列番号３）、Ｓｐｋ１００（配列番号４）、ＡＡＶ－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０又はＡＡＶ３Ｂなどの任意のＡＡＶゲノムに基づいていてもよい。そのようなベクターは、同じ株又は血清型（又はサブグループ又はバリアント）に基づいていてもよく、或いは互いに異なってもよい。非限定例として、特定の血清型ゲノムに基づく組み換えＡＡＶベクターは、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質の血清型と同一であることがある。さらに、組み換えＡＡＶベクターゲノムは、ベクターをパッケージングするＡＡＶカプシドタンパク質の血清型とは異なるＡＡＶ血清型ゲノムに基づいていてもよい。例えば、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ２に基づいていてもよいが、３つのカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つは、本明細書中で開示されている、例えば、ＬＫ０３（配列番号３）、Ｓｐｋ１００（配列番号４）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ又はＡＡＶ－２ｉ８並びにそのバリアントである。そのようなＡＡＶカプシドバリアントとしては、国際公開第２０１２／１４５６０１号、国際公開第２０１３／１５８８７９号、国際公開第２０１５／０１３３１３号、国際公開第２０１８／１５６６５４号、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号、米国特許第９，１６９，２９９号、同第７，７４９，４９２号、及び同第９，５８７，２８２号に記載されているＡＡＶカプシドのバリアントが挙げられる。

[0170]本明細書中で使用される場合、「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型とは血清学的に異なるカプシドを有するＡＡＶを言及するために使用される特徴である。血清学的区別性は、別のＡＡＶと比較してあるＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて判断される。そのような交差反応性の差は、通常、カプシドタンパク質配列／抗原決定基の差によるものである（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列の差による）。カプシドバリアントを含むＡＡＶバリアントが参照ＡＡＶ血清型又は他のＡＡＶ血清型と血清学的に違わない場合もあるという可能性にもかかわらず、ＡＡＶバリアントは、参照ＡＡＶ血清型又は他のＡＡＶ血清型と比較して少なくとも１つヌクレオチド又はアミノ酸残基だけ異なる。

[0171]従来の定義のもとで、血清型は、対象のウイルスが、活性を中和するためのすべての既存の特徴づけられた血清型に特異的な血清に対して試験され、どの抗体も対象のウイルスを中和しないことがわかったことを意味する。さらに天然に存在するウイルス分離株が発見され、及び／又はカプシド変異体が形成されるため、任意の現在既存の血清型と血清学的な差がある場合も、又はない場合もある。したがって、新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）に血清学的な差がない場合、この新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、対応する血清型のサブグループ又はバリアントである。多くの場合、変異ウイルスが血清型の従来の定義に従って別の血清型であるかどうかを判断するために、カプシド配列改変を有する変異ウイルスに対して活性の中和に関する血清学検査が実施されなければならない。したがって、利便性のため、及び繰り返しを避けるために、「血清型」という用語は、血清学的に異なるウイルス（例えば、ＡＡＶ）並びに所与の血清型のサブグループ又はバリアント内であってもよい血清学的に異ならないウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を広く指す。

[0172]本明細書中に記載されるとおり、ＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシドタンパク質をコードする核酸としては、ＬＫ０３（配列番号３）、Ｓｐｋ１００（配列番号４）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４ ＡＡＶ３Ｂ又はＡＡＶ－２ｉ８などの参照ＡＡＶ血清型又は親ＡＡＶ血清型と１００％未満の配列同一性を有するものが挙げられる。一実施形態において、改変型／変異型ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＬＫ０３（配列番号３）、Ｓｐｋ１００（配列番号４）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ又はＡＡＶ－２ｉ８、並びにＬＫ０３（配列番号３）、Ｓｐｋ１００（配列番号４）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ及びＡＡＶ－２ｉ８のバリアントなどの参照ＡＡＶカプシドタンパク質又は親ＡＡＶカプシドタンパク質と８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など、最大９９．９％同一であるなど、少なくとも７５％以上同一である配列を含むか、又はそのような配列からなる。

[0173]本発明は、包装材料と、その中に１つ以上の構成要素とを含むキットを提供する。キットは、構成要素の説明又は中の構成要素のインビトロ、インビボ若しくはエクスビボにおける使用のための指示書を含む、ラベル又は包装挿入物を一般に含む。キットは、そのような構成要素の集まり、例えば、本発明の細胞株及び任意選択でウイルスヘルパー機能を供給する構成要素などの第２の構成要素を含んでもよい。

[0174]キットは、キットの１つ以上の構成要素を収容する物理的な構造を指す。包装材料は、構成要素の無菌性、安定性及び／又は純度を維持することができ、そのような目的のために一般的に使用される材料で作られてもよい（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブなど）。

[0175]ラベル又は挿入物は、本明細書中に記載されているパッケージング系又はｒＡＡＶ粒子を作製するなどキットの構成要素を使用する方法を含む、１つ以上の構成要素の識別情報を中に含んでもよい。ラベル又は挿入物は、製造業者、ロット番号、製造場所及び日付、使用期限を特定する情報を含んでもよい。ラベル又は挿入物は、製造業者情報、ロット番号、製造業者の所在地及び日付を特定する情報を含んでもよい。

[0176]ラベル又は挿入物としては、個別に、又は構成要素、キット若しくは包装材料（例えば、箱）に貼られた、又はキットの構成要素を入れているアンプル、チューブ若しくはバイアルに付けられた「印刷物」、例えば紙又は厚紙が挙げられる。ラベル又は挿入物としては、コンピュータ可読媒体、例えば、バーコード印刷ラベル、ディスク、光ディスク、例えば、ＣＤ－若しくはＤＶＤ－ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、又は電気記憶媒体、例えば、ＲＡＭ及びＲＯＭ又はこれらの混成物、例えば、磁気／光学記憶媒体、フラッシュメディア若しくはメモリ型カードをさらに挙げることができる。

[0177]別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、適した方法及び材料は、本明細書に記載されている。

[0178]本明細書中で引用されるすべての特許、特許出願、刊行物、及びその他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ引用及びＡＴＣＣ引用は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が統制することになる。

[0179]本発明の生物分子に関するさまざまな用語が、本明細書の上で、さらに明細書及び請求項全体をとおして使用されている。

[0180]本明細書中で開示されているすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書において開示されているそれぞれの特徴は、同じ、同等又は類似の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられてもよい。したがって、別のことが明白に指定されない限り、開示されている特徴は、同等又は類似の特徴の部類の例である。

[0181]本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを示さない限り、複数の指示対象も含む。したがって、例えば、「核酸（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」の言及は、複数のそのような核酸を含み、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」の言及は、複数のそのようなベクターを含み、「ウイルス（ａ ｖｉｒｕｓ）」又は「粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）」の言及は、複数のそのようなウイルス／粒子を含む。

[0182]本明細書中で使用される場合、すべての数値又は数値的な範囲は、文脈が明らかに別のことを示さない限り、そのような範囲内の整数及び範囲内の値の小数部又は整数を含む。したがって、説明するために、８０％以上同一の言及は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％など並びに８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％など、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％などを含む。

[0183]より大きい（超える）又は未満を伴う整数の言及は、それぞれ、言及する数を超える、又はそれ未満の任意の数を含む。したがって、例えば、１００未満の言及は、９９、９８、９７など、一（１）までの数すべてを含み、１０未満は、９、８、７など、一（１）までの数すべてを含む。

[0184]本明細書中で使用される場合、すべての数値又は範囲は、文脈が明らかに別のことを示さない限り、そのような範囲内の値の小数部及び整数並びにそのような範囲内の整数の小数部を含む。したがって、説明するために、１～１０などの数値的な範囲の言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５などを含む。１～５０の範囲の言及は、したがって、最大５０で５０を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０など、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５などを含む。

[0185]一連の範囲の言及は、一連の範囲内のさまざまな範囲の境界の値を組み合わせた範囲を含む。したがって、説明するために、一連の範囲、例えば、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～８５０の範囲の言及は、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、５０～７５、５０～１００、５０～１５０、５０～２００、５０～２５０、１００～２００、１００～２５０、１００～３００、１００～３５０、１００～４００、１００～５００、１５０～２５０、１５０～３００、１５０～３５０、１５０～４００、１５０～４５０、１５０～５００などの範囲を含む。

[0186]本発明は、数々の実施形態及び態様を記載するために肯定的な言い回しを使用して一般に本明細書中で開示されている。本発明はまた、特に、物質若しくは材料、方法ステップ及び条件、プロトコル、又は手順などの特定の主題が完全に又は部分的に除外されている実施形態も含む。例えば、本発明の特定の実施形態又は態様において、材料及び／又は方法ステップが除外される。したがって、本発明が本明細書において、一般に、本発明が含まないものに関して表されていなくても、本発明において明白に除外されていない態様は、やはり本明細書中で開示されている。

[0187]多くの本発明の実施形態が記載されてきた。しかしながら、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、さまざまな使用及び条件に適合させるために本発明のさまざまな変更及び改変を行うことができる。したがって、以下の実施例は、説明するためであり、特許請求される本発明の範囲を決して限定するためではないことが意図される。

実施例１
[0188]この実施例は、本発明の特定の実施形態及び態様を記載する。

[0189]ＨＥＫ２９３細胞は、接着培養及び浮遊培養の両方に対する、便利であり且つ例示的なプラットフォームである。

[0190]本発明の細胞株において、Ｒｅｐタンパク質は、アデノウイルスＥ２Ａ若しくはＥ４タンパク質及び／又はＶＡ ＲＮＡの導入前には実質的に発現しない。ｒＡＡＶ産生のためのそのようなアデノウイルスヘルパー配列は、アデノウイルス感染、アデノウイルス・ＡＡＶハイブリッドウイルス感染による感染、又は別のベクターを用いたトランスフェクション、又はプラスミドのトランスフェクションによって供給することができる。

[0191]この例となる系では、プラスミドトランスフェクションは必要とされず、このことは、プラスミドを用いずにｒＡＡＶ粒子を作製することができることを意味する。

[0192]特定の態様において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を有する細胞に形質導入する単一のＥ１／Ｅ３除去Ａｄ・ＡＡＶハイブリッドベクターがｒＡＡＶ産生を誘発する。

[0193]２０Ｅ６／ｍＬもの細胞密度を達成することができる。

[0194]この系では、ＡＡＶ遺伝子、異種核酸又はヘルパー配列のいずれかを維持するために薬物（抗生剤）選択が必要とされない。

[0195]この系に対して特定の観察がなされた：
増加したｒＡＡＶ収率；
低減されたＤＮＡ不純物；
完全なベクターに対する空のＡＡＶの割合が制御可能な場合もある；
大規模なｒＡＡＶ産生のためのスケールアップが容易；
任意のＡＡＶ血清型に適用可能；
３つの異なるプラスミドを用いた一過性トランスフェクションと比較して実質的なコスト削減；
さらに確固としたｒＡＡＶ産生プロセスを提供する；
低減された労力及び材料コスト；
有望なパッケージング／産生株クローンを選択するために薬物耐性／抗生剤マーカーを導入する必要がないため、クリーンな遺伝的バックグラウンド；
クリーンな遺伝的バックグラウンドは、ｒＡＡＶベクターのより安全な製造を提供する；
パッケージング細胞の長期生存性は、使用のためにパッケージング細胞が細胞バンクに保管されるのを可能にする；
場合によっては、産生される空のＡＡＶ粒子を減少させ、ｒＡＡＶベクターにパッケージングされるＤＮＡ不純物も減少させる。

実施例２

実施例３
例となるスペーサー配列（配列番号１）
GCGCAGCCGCCAAGCCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGACTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACTCCGTCGAGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCTAAATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGAGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGACGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGGGGGAGCTCGCAGGGTCTCCATTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCGCAGCCGCC
ＡＡＶ２ ｐ５プロモーター（配列番号２）
GAGGGGTGGAGTCGTGACGTGAATTACGTCATAGGGTTAGGGAGGTCCTGTATTAGAGGTCACGTGAGTGTTTTGCGACATTTTGCGACACCATGTGGTCACGCTGGGTATTTAAGCCCGAGTGAGCACGCAGGGTCTCCATTTTGAAGCGGGAGGTTTGAA
ＬＫ０３カプシドタンパク質（配列番号３）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
Ｓｐａｒｋ１００カプシドタンパク質（配列番号４）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

［関連出願］
[0001]本出願は、２０１８年５月７日出願の米国特許仮出願第６２／６６８，１１９号に基づく優先権を主張するものである。前述の出願のすべての文、表、配列表及び図を含めた内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (85)

1. アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ１Ａタンパク質を発現する哺乳動物細胞株であって、プロモーターと機能可能に連結された組み込まれたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐ遺伝子と、組み込まれたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子とを含み、核酸スペーサーが前記ｒｅｐ遺伝子と前記プロモーターとの間に配置された、細胞株。
2. 前記細胞株が、前記細胞株中でＥ１Ａタンパク質を発現しながら、少なくとも約５継代、少なくとも約１０継代、少なくとも約１５継代、又は少なくとも約２０継代、継代可能である、請求項１に記載の細胞株。
3. 前記細胞株が、前記細胞株の実質的な死滅なしに、少なくとも約５継代、少なくとも約１０継代、少なくとも約１５継代、又は少なくとも約２０継代、継代可能である、請求項１に記載の細胞株。
4. 増殖培地において培養される場合に細胞株の実質的な死滅を引き起こさないレベルで、Ｒｅｐタンパク質が前記ｒｅｐ遺伝子から発現される、請求項１に記載の細胞株。
5. 前記ｒｅｐ遺伝子からのＲｅｐタンパク質の発現が、ヘルパーウイルス機能の存在下において増加する、請求項１に記載の細胞株。
6. 前記プロモーターが、ヘルパーウイルス機能の存在下においてのみ前記ｒｅｐ遺伝子の発現を駆動する、請求項１に記載の細胞株。
7. 前記ヘルパーウイルス機能が、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、又はそれらのハイブリッドウイルスから選択されるウイルスによって供給される、請求項６に記載の細胞株。
8. 前記ヘルパーウイルス機能が、前記ヘルパーウイルス機能を供給する１つ以上のウイルス、ベクター又はプラスミドを含む、請求項６に記載の細胞株。
9. 前記ヘルパーウイルス機能が、アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載の細胞株。
10. 前記Ａｄ Ｅ２Ａ、Ａｄ Ｅ４及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つが、前記Ａｄ Ｅ２Ａ、Ａｄ Ｅ４及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド配列からの転写によって発現される、請求項９に記載の細胞株。
11. 前記Ａｄ Ｅ２Ａ、Ａｄ Ｅ４及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、１つ以上のベクターを構成する、請求項１０に記載の細胞株。
12. 前記Ａｄ Ｅ２Ａ、Ａｄ Ｅ４及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、１つ以上のプラスミドを構成する、請求項１０に記載の細胞株。
13. 前記ヘルパーウイルス機能が、１つ以上のウイルス、ウイルスベクター又はプラスミドによって供給される、請求項６に記載の細胞株。
14. 前記ヘルパーウイルス機能が、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つを含むハイブリッドＡｄ・ＡＡＶウイルスによって供給される、請求項６に記載の細胞株。
15. 前記ハイブリッドＡｄ・ＡＡＶウイルスが、任意選択でＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する、異種核酸配列をさらに含む、請求項１４に記載の細胞株。
16. 前記プロモーターが、構成的活性化型プロモーターを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の細胞株。
17. 前記プロモーターが、非誘導性プロモーターを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の細胞株。
18. 前記プロモーターが、配列番号２の配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の細胞株。
19. 前記プロモーターが、ＡＡＶ１ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ３ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ４ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ５ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ６ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ７ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ８ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ９ ｐ５プロモーター、ＡＡＶ１０ ｐ５プロモーター、又はＡＡＶ１１ ｐ５プロモーターと少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の細胞株。
20. 前記ｒｅｐ遺伝子が、ＡＡＶ１ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ３ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ４ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ５ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ６ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ７ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ８ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ９ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ１０ Ｒｅｐタンパク質、又はＡＡＶ１１ Ｒｅｐタンパク質をコードする、請求項１～１９のいずれか一項に記載の細胞株。
21. 前記ｒｅｐ遺伝子及び前記ｃａｐ遺伝子が、前記細胞株の染色体の核酸にタンデムに組み込まれている、請求項１～２０のいずれか一項に記載の細胞株。
22. 前記ｃａｐ遺伝子は、プロモーターと機能可能に連結されている、請求項１～２１のいずれか一項に記載の細胞株。
23. 任意選択でＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する、異種核酸配列をさらに含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の細胞株。
24. アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ１Ａタンパク質を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）パッケージング哺乳動物細胞株であって、前記細胞株が、ＡＡＶ ｐ５プロモーターと機能可能に連結された組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であり、約１７００～約１８００ヌクレオチドの核酸スペーサーが前記ｒｅｐ遺伝子と前記ｐ５プロモーターとの間に配置された、組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と、組み込まれたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子とを含み、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡによって供給されるヘルパーウイルス機能の存在下においてのみＲｅｐタンパク質が前記ｒｅｐ遺伝子から発現される、細胞株。
25. ＡＡＶベクターパッケージング系であって、
    ａ．請求項１～２４のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞株と、
    ｂ．ヘルパーウイルス機能及び任意選択でＡＡＶベクターゲノムを含む、少なくとも１つのウイルス、ベクター又はプラスミドと
    を含む、パッケージング系。
26. 前記少なくとも１つのウイルスが、
    ａ．Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、
    ｂ．任意選択でＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する、異種核酸配列と
    を含む、アデノウイルス・ＡＡＶハイブリッドを含む、請求項２５に記載のパッケージング系。
27. 前記少なくとも１つのウイルスが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はポックスウイルスを含む、請求項２５に記載のパッケージング系。
28. 前記少なくとも１つのベクターが、
    ａ．Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、
    ｂ．任意選択でＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する、異種核酸配列と、を含み、
    （ａ）の前記ポリヌクレオチド配列及び（ｂ）の前記異種核酸配列が、同じベクター中にあるか、又は（ａ）の前記ポリヌクレオチド配列及び（ｂ）の前記異種核酸配列が、別個のベクター中にある、請求項２５に記載のパッケージング系。
29. 前記少なくとも１つのベクターが、少なくとも１つのウイルスベクターを含む、請求項２８に記載のパッケージング系。
30. 前記少なくとも１つのプラスミドが、
    ａ．Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、
    ｂ．任意選択でＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する、異種核酸配列と、を含み、
    （ａ）の前記ポリヌクレオチド配列及び（ｂ）の前記異種核酸配列が、同じプラスミド中にあるか、又は（ａ）の前記ポリヌクレオチド配列及び（ｂ）の前記異種核酸配列が、別個のプラスミド中にある、請求項２５に記載のパッケージング系。
31. 前記ＡＡＶベクターゲノムが、異種核酸配列を含み、前記異種核酸配列は、任意選択でＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する、請求項２５に記載のパッケージング系。
32. 前記異種核酸配列は、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が５’及び／又は３’末端の両側に位置する、請求項２６～３０のいずれか一項に記載のパッケージング系。
33. 前記ＡＡＶベクターゲノム又は前記異種核酸配列が、ウイルス、ベクター又はプラスミドを構成する、請求項２５、３１及び３２のいずれか一項に記載のパッケージング系。
34. 前記ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が、ウイルス、ベクター又はプラスミドによって前記細胞株に導入された、請求項１～３３のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
35. 前記ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が、レンチウイルスベクターによって前記細胞株に導入された、請求項１～３３のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
36. 前記ウイルス、ベクター又はプラスミドは、Ａｄ Ｅ１Ａ及び／又はＥ３タンパク質をコードする遺伝子が欠如している、請求項２５～３３のいずれか一項に記載のパッケージング系。
37. 前記細胞株が、ＨｅＬａ細胞株又はＡ５４９細胞株ではない、請求項１～３６のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
38. 前記細胞株が、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
39. 前記細胞株が、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｆ細胞を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
40. 前記細胞株が、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現しない、請求項１～３９のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
41. 前記細胞株が、懸濁細胞株又は接着細胞株である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
42. 前記細胞株が、少なくとも約１×１０^６、少なくとも約５×１０^６、少なくとも約１×１０^７又は少なくとも約２×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度で培養することができる、請求項１～４１のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
43. 前記細胞株が、約１×１０^６～５×１０^６、約５×１０^６～１×１０^７、又は約１×１０^７～２×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度で培養することができる、請求項１～４１のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
44. 前記ＡＡＶ ｃａｐの発現が、ＡＡＶ ｐ４０プロモーターによって駆動される、請求項１～４３のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
45. 前記細胞株において前記Ｅ１Ａ、ｒｅｐ及び／若しくはｃａｐ遺伝子又はタンパク質発現を維持することが、選択マーカーの発現又は選択圧を必要としない、請求項１～４４のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
46. 前記選択マーカーが、抗生剤耐性遺伝子を含み、前記選択圧が、薬物又は抗生剤を含む、請求項４５に記載の細胞株又はパッケージング系。
47. 前記Ａｄ Ｅ１Ａ及び／又は前記ｒｅｐ遺伝子をコードする遺伝子が、ｌｏｘ Ｐ部位が両側に位置する転写終結配列を有するイントロンによって妨害されない、請求項１～４６のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
48. 前記ｒｅｐ遺伝子の発現が、前記ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約５，０００ヌクレオチド未満５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される、請求項１～４７のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
49. 前記ｒｅｐ遺伝子の発現が、前記ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約２５～５，０００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される、請求項１～４７のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
50. 前記ｒｅｐ遺伝子の発現が、前記ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約２５０～２，５００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される、請求項１～４７のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
51. 前記ｒｅｐ遺伝子の発現が、前記ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約５００～２，０００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される、請求項１～４７のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
52. 前記ｒｅｐ遺伝子の発現が、前記ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約１，０００～１，９００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される、請求項１～４７のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
53. 前記ｒｅｐ遺伝子の発現が、前記ｒｅｐ遺伝子開始コドンの少なくとも約１，５００～１，９００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される、請求項１～４７のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
54. 前記ｒｅｐ遺伝子の発現が、前記ｒｅｐ遺伝子開始コドンの少なくとも約１，６００～１，８００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される、請求項１～４７のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
55. 前記ｒｅｐ遺伝子の発現が、前記ｒｅｐ遺伝子開始コドンの少なくとも約１，７００～１，８００ヌクレオチド５’に配置されるＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動される、請求項１～４７のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
56. 前記ｒｅｐ遺伝子の発現が、ＡＡＶ ｐ５プロモーターの３’末端と前記ｒｅｐ遺伝子開始コドンの５’末端との間に位置するスペーサー配列が存在する前記ＡＡＶ ｐ５プロモーターによって駆動され、前記スペーサー配列が、約２５０～約５，０００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１～４７のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
57. 前記細胞株が、培養若しくは増殖培地中、又は保管に適した培地中にある、請求項１～５６のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
58. 前記細胞株が、細胞生存性の長期保管及び保存に適した培地中にある、請求項１～５６のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
59. 前記細胞株が、０℃以下での長期保管に適した培地中にある、請求項１～５６のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
60. 前記細胞株が、－３０℃以下での長期保管に適した培地中にある、請求項１～５６のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
61. 前記細胞株が、－８０℃以下での長期保管に適した培地中にある、請求項１～５６のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
62. 前記細胞株が、－１６０℃以下での長期保管に適した培地中にある、請求項１～５６のいずれか一項に記載の細胞株又はパッケージング系。
63. ｒＡＡＶベクター粒子を作製する方法であって、請求項１～２２及び２４のいずれか一項に記載の細胞株を、
    ａ）ＡＡＶ ＩＴＲが５’及び／又は３’末端の両側に位置する異種核酸配列を含むｒＡＡＶベクターゲノムと、
    ｂ）ヘルパーウイルス機能と
    を含む１つ以上のウイルス、ベクター又はプラスミドを用いてトランスフェクションし、それによって、異種核酸配列を含むＡＡＶベクターゲノムとヘルパーウイルス機能とを有するトランスフェクション細胞を作製するステップ、
    並びに前記ｒＡＡＶベクター粒子の産生を可能にする条件下において前記トランスフェクション細胞を培養するステップを含む、方法。
64. ａ）の前記ＡＡＶベクターゲノム及びｂ）の前記ヘルパーウイルス機能が、単一のウイルス、ベクター又はプラスミドによって供給される、請求項６３に記載の方法。
65. ａ）の前記ＡＡＶベクターゲノム及びｂ）の前記ヘルパーウイルス機能が、２つ以上のウイルス、ベクター又はプラスミドによって供給される、請求項６３に記載の方法。
66. ｒＡＡＶベクター粒子を作製する方法であって、請求項２３に記載の細胞株を、Ａｄ Ｅ２Ａ、Ａｄ Ｅ４タンパク質及びＡｄ ＶＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むウイルス、ベクター又はプラスミドを用いてトランスフェクションし、それによって、トランスフェクション細胞を作製するステップ、並びに前記ｒＡＡＶベクター粒子の産生を可能にする条件下において前記トランスフェクション細胞を培養するステップを含む、方法。
67. 空のＡＡＶ粒子を作製する方法であって、
    ａ）請求項１～２２及び２４のいずれか一項に記載の細胞株を、ヘルパーウイルス機能を含む１つ以上のウイルス、ベクター又はプラスミドを用いてトランスフェクションし、それによって、ヘルパーウイルス機能を有するトランスフェクション細胞を作製するステップ、並びに
    ｂ）前記空のＡＡＶ粒子の産生を可能にする条件下において前記トランスフェクション細胞を培養するステップ
    を含む、方法。
68. 前記トランスフェクション細胞が、約１×１０^１０～約５×１０^１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの収率でｒＡＡＶベクター粒子を産生するか、又は約１×１０^１０～約５×１０^１２粒子／ｍＬの収率で空のＡＡＶ粒子を産生する、請求項６３～６７のいずれか一項に記載の方法。
69. 前記トランスフェクション細胞が、約５×１０^１０～約３×１０^１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの収率でＡＡＶベクター粒子を産生するか、又は約５×１０^１０～約３×１０^１２粒子／ｍＬの収率で空のＡＡＶ粒子を産生する、請求項６３～６７のいずれか一項に記載の方法。
70. 前記トランスフェクション細胞が、約１×１０^１１～約２×１０^１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの収率でｒＡＡＶベクター粒子を産生するか、又は約１×１０^１１～約２×１０^１２粒子／ｍＬの収率で空のＡＡＶ粒子を産生する、請求項６３～６７のいずれか一項に記載の方法。
71. 前記細胞及び／又は前記ｒＡＡＶベクター粒子若しくは前記空のＡＡＶ粒子を含む細胞培養培地を回収するステップをさらに含む、請求項６３～７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 前記ｒＡＡＶベクター粒子又は前記空のＡＡＶ粒子を回収するステップ、単離するステップ、又は精製するステップをさらに含む、請求項６３～７０のいずれか一項に記載の方法。
73. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の細胞株を作製する方法であって、請求項１～２４に記載されるとおり前記遺伝子の導入並びに前記遺伝子及び／又はタンパク質の発現を可能にする条件下において哺乳動物細胞をトランスフェクションするステップを含む、方法。
74. 前記異種核酸配列が、治療用タンパク質又は阻害核酸配列をコードする、請求項１５～６６及び６８～７３のいずれか一項に記載の細胞株、パッケージング系又は方法。
75. 前記治療用タンパク質が、血液凝固因子又は免疫グロブリン配列を含む、請求項７４に記載の細胞株、パッケージング系又は方法。
76. 前記阻害核酸配列が、低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡを含む、請求項７４に記載の細胞株、パッケージング系又は方法。
77. 前記異種核酸配列が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３及びＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン－１及びネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子産物をコードする、請求項１５～６６及び６８～７３のいずれか一項に記載の細胞株、パッケージング系又は方法。
78. 前記異種核酸配列が、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１からＩＬ－３６）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞レセプター、キメラＴ細胞レセプター、単鎖Ｔ細胞レセプター、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子からなる群から選択される遺伝子産物をコードする、請求項１５～６６及び６８～７３のいずれか一項に記載の細胞株、パッケージング系又は方法。
79. 前記異種核酸配列が、酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）；ＡＴＰ７Ｂ（銅輸送ＡＴＰａｓｅ２）；アルファガラクトシダーゼ；ＡＳＳ１（アルギニノコハク酸シンターゼ）；ベータ－グルコセレブロシダーゼ；ベータヘキソサミニダーゼＡ；セルピンＧ１（Ｃ１プロテアーゼインヒビター）；グルコース－６－ホスファターゼ；エリスロポエチン（ＥＰＯ；インターフェロン－アルファ；インターフェロン－ベータ；インターフェロン－ガンマ；インターロイキン（ＩＬ）；インターロイキン１～３６（ＩＬ－１～ＩＬ－３６）のうちのいずれか１つ；インターロイキン（ＩＬ）レセプター；ケモカイン；ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＸＣＬ５）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）；ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）；単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター；アルファ－１アンチトリプシン；アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ；オルニチントランスカルバモイラーゼ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）；リポタンパク質リパーゼ；アポリポタンパク質；低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬ－Ｒ）；アルブミン；レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）；カルバモイルシンテターゼＩ；アルギニノコハク酸シンテターゼ；アルギニノコハク酸リアーゼ；アルギナーゼ；フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ；ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ；シスタチオニンベータ－シンターゼ；分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ；イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ；メチルマロニルＣｏＡムターゼ；グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；インスリン；ピルビン酸カルボキシラーゼ；肝ホスホリラーゼ；ホスホリラーゼキナーゼ；グリシンデカルボキシラーゼ；Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）；ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー４（ＡＢＣＡ４）；及びジストロフィンからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１５～６６及び６８～７３のいずれか一項に記載の細胞株、パッケージング系又は方法。
80. 前記ｒＡＡＶベクター粒子又は前記空のＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号３又は配列番号４ ＶＰ１カプシドタンパク質と７５％以上の配列同一性を有するＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質を含む、請求項１５～７９のいずれか一項に記載のパッケージング系又は方法。
81. 前記ｒＡＡＶベクター又は前記空のＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号３又は配列番号４ ＶＰ１カプシドタンパク質と８５％以上の配列同一性を有するＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質を含む、請求項１５～７９のいずれか一項に記載のパッケージング系又は方法。
82. 前記ｒＡＡＶベクター又は前記空のＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号３又は配列番号４ ＶＰ１カプシドタンパク質と９０％以上の配列同一性を有するＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質を含む、請求項１５～７９のいずれか一項に記載のパッケージング系又は方法。
83. 前記ｒＡＡＶベクター又は前記空のＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号３又は配列番号４ ＶＰ１カプシドタンパク質と９５％以上の配列同一性を有するＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質を含む、請求項１５～７９のいずれか一項に記載のパッケージング系又は方法。
84. 前記ｒＡＡＶベクター又は前記空のＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号３又は配列番号４ ＶＰ１カプシドタンパク質と１００％の配列同一性を有するＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質を含む、請求項１５～７９のいずれか一項に記載のパッケージング系又は方法。
85. 前記ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ－３Ｂ ＡＡＶ血清型又はそれらの組み合わせのいずれかのうちの１つ以上のＩＴＲを含む、請求項１５～８４のいずれか一項に記載の細胞株、パッケージング系又は方法。